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ADEMIR FERREIRA DA SILVA JÚNIOR
EFEITOS NEUROCOMPORTAMENTAIS DA INTOXICAÇÃO
EXPERIMENTAL COM CITRATO DE ALUMÍNIO
EM RATOS ADULTOS
Belém
2009
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ii
ADEMIR FERREIRA DA SILVA JÚNIOR
EFEITOS NEUROCOMPORTAMENTAIS DA INTOXICAÇÃO
EXPERIMENTAL COM CITRATO DE ALUMÍNIO
EM RATOS ADULTOS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação
em Neurociências e Biologia Celular da Universidade
Federal do Pará como requisito para obtenção de grau
de Mestre em Neurociências e Biologia Celular.
Área de concentração: Neurociências
Orientador: Prof. Dr. Walace Gomes Leal
Co-orientadora: Profª. Drª Maria Socorro dos Santos
Aguiar.
Data de Aprovação: _____/____/_____
Banca Examinadora
Prof. Dr. Walace Gomes Leal – Orientador
Instituto de Ciências Biológicas – ICB-UFPA
Profª. Drª Maria Socorro dos Santos Aguiar – Co-Orientadora
Instituto de Ciências Biológicas – ICB-UFPA
Prof. Dr. Ismaelino Mauro Magno – Examinador
Universidade Paranaense – UNIPAR
Profª Drª. Edna Cristina Santos Franco – Examinador
Instituto de Ciências Biológicas – ICB-UFPA
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iii
Ao meu amado Deus pela vida, saúde,
força, determinação, superação e fé para viver
a vida.
Aos meus pais,
Wilma e Ademir,
à
s
minhas irmãs, Keila e Karla por sempre
acreditarem na realização deste sonho.
Aos meus sobrinhos, Kauã e Vinícios
pelos seus lindos sorrisos que alegram meu
viver.
iv
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Walace Gomes Leal, não somente por ter aceito
minha orientação em um momento difícil, quando tive que trocar de orientador a
pedido da Pós-graduação, mas ainda pela oportunidade concedida, pelo suporte
incondicional, pelas requisições de qualidades científicas ao trabalho e pela
paciência demonstrada durante a minha caminhada acadêmica com o mesmo.
À minha “ex-orientadora”, Profª. Drª Lílian Rosana Faro, pela orientação
competente, pelas críticas ao trabalho, as quais sempre foram pertinentes, e pela
força que sempre me deu afim de eu levar ao termo esse projeto: muito obrigado.
À minha Co-orientadora, Profª. Drª Socorro Aguiar, por ter aberto as portas do
Laboratório de Psicobiologia da UFPA para que eu pudesse desenvolver a maior
parte deste trabalho, pela amizade que construímos e firmamos durante esta
empreitada, por ter me incentivado a concluir essa dissertação mesmo com todas as
dificuldades e desafios que tive de enfrentar, por todo o suporte dado durante a
execução desse projeto pioneiro em nosso Estado e por ter contribuído na minha
formação acadêmica, muito obrigado.
Ao Prof. Dr. Cristowam Diniz, por ter me permitido utilizar alguns dos seus
equipamentos e o software Any Maze Stoelting para análise de alguns testes
comportamentais.
Ao Prof. Dr. William Lee Berdel Martin, pelas horas de consultoria estatística
despendidas para me ajudar na análise dos dados.
Ao professores, Rômulo Feio, José Inácio Carvalho, Rafael Lima e Edna
Franco por todas as criticas e contribuições realizadas.
v
Ao Técnico do Laboratório de Análises Químicas do Instituto de Geociências
da UFPA, Natalino Valente, por ter contribuído na preparação da solução de citrato
de alumínio.
À Andrea Campos e Márcia Freitas, pela amizade, companheirismo e
contribuições para a realização desse projeto.
À Daisy Elane, pela grande ajuda na elaboração e formatação dos gráficos no
programa Prisma GraphPad, por todo apoio e amizade durante o curso deste
projeto.
Aos bolsistas de iniciação científica do Laboratório de Psicobiologia, Douglas,
Ketrynne, Odemir, Anna Patrycia, Jesiane e Rosemiro, pelo apoio, amizade e
colaboração durante a realização deste trabalho.
Aos Colegas do Laboratório de Neuroproteção e Neurorregeneração
Experimental da UFPA, Marcelo, Luana, Elder, Andrea e Patricy que me auxiliaram
no criostato e nas imunoistoquímicas.
Aos Bioteristas, Amarildo Melo e Osvaldo Vicente que dentro do possível
sempre atenderam as minhas solicitações.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Pará (FAPESPA) que
concedeu a minha bolsa de mestrado.
Aos Diretores científicos da FAPESPA, Professores Sanclayton Moreira e
Lourivaldo da Silva Santos e a Coordenadora de Bolsa, Sandra Perdigão, que
sempre atenderam as minhas solicitações na medida do possível durante a
execução deste projeto.
vi
O SENHOR é o meu pastor, nada me faltará.
Deitar-me faz em verdes pastos, guia-me mansamente a águas tranqüilas.
Refrigera a minha alma; guia-me pelas veredas da justiça, por amor do seu nome.
Ainda que eu andasse pelo vale da sombra da morte, não temeria mal algum, porque tu estás
comigo; a tua vara e o teu cajado me consolam.
Preparas uma mesa perante mim na presença dos meus inimigos, unges a minha cabeça com
óleo, o meu cálice transborda.
Certamente que a bondade e a misericórdia me seguirão todos os dias da minha vida; e
habitarei na casa do SENHOR por longos dias.
Salmo 23
vii
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O ALUMÍNIO...........................................
1.2 BIODISPONIBILIDADE DO ALUMÍNIO...............................................................
1.3 TOXICOLOGIA DO ALUMÍNIO...........................................................................
1.4 TOXICOCINÉTICA DO ALUMÍNIO......................................................................
1.5 TOXICODINÂMICA DO ALUMÍNIO.....................................................................
1.6 PROCESSOS NEUROBIOLÓGICOS DE MEMÓRIA.........................................
1.6.1 Considerações gerais.....................................................................................
1.6.2 Tipos de Memória............................................................................................
1.7 ALUMINOSES E SUAS POSSÍVEIS IMPLICAÇÕES SOBRE OS
PROCESSOS DE MEMÓRIA.....................................................................................
1.8 UTILIZAÇÃO DE MODELOS ANIMAIS PARA ESTUDOS EXPERIMENTAIS
ACERCA DOS EFEITOS DO ALUMÍNIO...........................................................................
15
15
16
18
20
24
26
26
29
30
32
1.9 HIPÓTESE EXPERIMENTAL..............................................................................
35
1.10 OBJETIVOS........................................................................................................
1.10.1 Geral................................................................................................................
1.10.2 Específicos.....................................................................................................
36
36
36
2 MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................
2.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS...............................................................................
2.2 PREPARO DA SOLUÇÃO DE CITRATO DE ALUMÍNIO...................................
2.3 PROCEDIMENTOS DE INTOXICAÇÃO E FORMAÇÃO DOS GRUPOS
EXPERIMENTAIS.......................................................................................................
2.4 TESTE PARA AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES BÁSICAS DE ATIVIDADES
LOCOMOTORAS E EXPLORATÓRIAS APÓS O PROTOCOLO DE
INTOXICAÇÃO............................................................................................................
37
37
37
38
40
2.4.1 Campo Aberto.................................................................................................. 40
2.4.1.1 Fundamento.................................................................................................... 40
2.4.1.2 Equipamento................................................................................................... 41
2.4.1.3 Procedimento.................................................................................................. 42
2.5 PROCEDIMENTOS DE ANÁLISE COMPORTAMENTAL PARA AVALIAÇÃO
viii
DE APRENDIZAGEM E MEMÓRIA...........................................................................
2.5.1 Labirinto em T elevado..................................................................................
43
43
2.5.1.1 Fundamento.................................................................................................... 43
2.5.1.2 Descrição do aparato...................................................................................... 46
2.5.1.3 Procedimento.................................................................................................. 47
2.6 PERFUSÃO E ANÁLISE HISTOLÓGICA........................................................... 47
2.7 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA........................................................................ 49
2.7.1 Estudos Imunoistoquímicos.......................................................................... 49
2.8 ANÁLISE QUALITATIVA.................................................................................... 50
2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................... 51
3. RESULTADOS.....................................................................................................
3.1 EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DE CITRATO DE ALUMÍNIO SOBRE AS
ATIVIDADES LOCOMOTORAS E EXPLORATÓRIAS NO TESTE DO CAMPO
ABERTO......................................................................................................................
3.2 EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DE CITRATO DE ALUMÍNIO NO TESTE DE
MEMÓRIA NO LABIRINTO EM T ELEVADO.............................................................
3.2.1 Análise das diferenças entre os grupos em cada tentativa de esquiva....
3.2.1.1 Linha de Base.................................................................................................
3.2.1.2 Esquiva 1.........................................................................................................
3.2.1.3 Esquiva 2.........................................................................................................
3.2.1.4 Esquiva 3 (Teste de Memória)........................................................................
3.2.2 Análise comparativa entre todas as tentativas de esquiva de cada grupo
3.2.2.1 Grupo 1 (controle)...........................................................................................
3.2.2.2 Grupo 2...........................................................................................................
3.2.2.3 Grupo 3...........................................................................................................
3.2.2.4 Grupo 4...........................................................................................................
3.2.3 Análise das latências de fuga dos grupos em cada tentativa do LTE.......
3.3 ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS NO HIPOCAMPO APÓS INTOXICAÇÃO
POR CITRATO DE ALUMÍNIO EM RATOS................................................................
3.3.1 Preservação Neuronal....................................................................................
3.3.2 Ativação Astrocitária......................................................................................
4 DISCUSSÃO..........................................................................................................
4.1 CONSIDERAÇÕES TÉCNICAS............................................................................
4.2 A INTOXICAÇÃO EXPERIMENTAL COM CITRATO DE ALUMÍNIO INDUZ
ALTERAÇÕES NEUROCOMPORTAMENTAIS.........................................................
4.3 A INTOXICAÇÃO EXPERIMENTAL COM CITRATO DE ALUMÍNIO INDUZ
ALTERAÇÕES NA MORFOLOGIA HIPOCAMPAL....................................................
5 CONCLUSÃO........................................................................................................
REFERÊNCIAS...........................................................................................................
52
52
54
54
54
55
56
56
57
57
58
59
59
60
61
61
64
66
66
67
70
75
76
ix
RESUMO
Evidências experimentais sugerem que o alumínio é um agente neurotóxico com
ações deletérias sobre os processos cognitivos. No entanto, poucos estudos
investigaram de forma sistemática os efeitos comportamentais e neuropatológicos
da intoxicação experimental com alumínio. Neste estudo, investigamos os efeitos
neurocomportamentais da contaminação experimental com citrato de alumínio sobre
os processos mnemônicos de ratos Wistar adultos. Utilizou-se 29 ratos Wistar
machos de 230-250 g, divididos em 1 grupo controle (G1) e 3 grupos experimentais
(G2, G3 e G4) com os tempos de sobrevida de 8, 17 e 31 dias, respectivamente. A
dose usada de citrato de alumínio foi de 320 mg/kg. O neurotóxico foi administrado
por via intragástrica, durante 4 dias. Os animais foram submetidos a os testes
comportamentais do campo aberto e do Labirinto em T elevado (LTE). Os animais
foram perfundidos com solução salina a 0.9% e paraformaldeído. Realizou-se
imunoistoquímica para a avaliação da perda neuronal (anti-neuN) e ativação de
astrócitos (anti-GFAP) em secções coronais contendo as regiões CA1 e CA3 do
hipocampo. Verificou-se um aumento da atividade locomotora no teste do campo
aberto para o grupo G2 em comparação ao grupo controle e aos demais grupos
(P<0.05). No LTE, a latência de esquiva, nas quatro tentativas, apresentou uma
diferença estatística altamente significativa para todos os grupos (P<0.01). O tempo
de permanência dos animais no braço fechado desde a linha de base até a esquiva
2 aumentou significativamente e já na esquiva 3 (teste de memória) realizada 72
horas após a esquiva 2 diminuiu bruscamente em todos os grupos, com exceção do
grupo controle, caracterizando um déficit no aprendizado. Não houve diferenças
significativas nas fugas 1 e 2. Os dados da imunoistoquímica revelaram intensa
perda neuronal e diminuição progressiva na ativação astrocítica nas regiões CA1 e
CA3 do hipocampo no cérebro dos animais intoxicados. Estes resultados sugerem
que a intoxicação experimental com citrato de alumínio induz déficits de aprendizado
e memória, bem como alterações patológicas na morfologia hipocampal, o que
reforça a hipótese de que o acúmulo patológico deste metal pesado possui uma
ação deletéria sobre os processos mnemônicos hipocampais.
Palavras-chave: Rato, Citrato de Alumínio, Hipocampo, Memória, Aprendizado
x
ABSTRACT
Experimental evidences suggest that aluminium is a neurotoxic agent with
deleterious actions on cognitive processes. Nevertheless, few studies have
systematically investigated both neurobehavioral and neuropathological effects of
experimental intoxication with aluminium. In this study, we have investigated the
neurobehavioral effects of experimental contamination with aluminium citrate on the
mnemonic processes of adult Wistar rats. 29 adult male Wistar rats weighing 230-
250 g, were divided into 1 control group (G1) and 3 aluminium citrate-treated groups
(G2, G3 and G4) with survival times of 8, 17 and 31 days, respectively. It has been
used a 320 mg/kg dose of aluminium citrate. The neurotoxicant was intragastrically
administered during 4 days. Animals were submitted to behavioral tests of open field
and elevated T-maze. Animals were perfused with 0.9% saline solution and 4%
paraformaldehyde. Imunohistochemistry has been performed to evaluate neuronal
loss (anti-neuN) and astrocyte activation (anti-GFAP) in coronal sections containing
CA1 and CA3 hippocampal regions. There was an increase in locomotor activity in
open field test for G2 in comparison to control group and other groups. The elevated
T-maze avoidance latency in the four trials showed a high statistically significant
difference for all groups. The permanency time of the animals in the closed arm from
the base line to the avoidance 2 significantly increased and in the avoidance 3
(memory test) performed at 72 h after the avoidance 2 abruptly decreased for all
groups, except for the control group, indicating a learning deficit. There were no
significant differences for 1 and 2 escape. The immunohistochemical data revealed
an intense neuronal loss and a progressive decrease in the astrocytic activation in
both CA1 and CA3 hippocampal regions in the brains of intoxicated animals. These
results suggest that the experimental intoxication with aluminium citrate induces
deficits on learning and memory as well as pathological alterations on the
hippocampal morphology. This reinforces the hypothesis that the pathological
accumulation of this heavy metal possesses deleterial actions on the mnemonic
hippocampal processes.
Key Words: Rat, Aluminium Citrate, Hippocampus, Memory. Learning
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. A estrutura do complexo Al-citrato..................................................... 21
Figura 2. Diagrama da organização sináptica do hipocampo.........................
28
Figura 3. Campo aberto utilizado para verificação das reações
comportamentais depois da intoxicação por citrato de Al................................
42
Figura 4. Labirinto em T elevado....................................................................
46
Figura 5. Procedimento de perfusão..............................................................
48
Figura 6. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4
(intoxicados com citrato de Al) no campo aberto (distância
percorrida)........................................................................................................
52
Figura 7. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4
(intoxicados com citrato de Al) no campo aberto ((levantamento, auto
limpeza e congelamento).................................................................................
53
Figura 8. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4
(intoxicados com citrato de Al) na linha de base teste do LTE).......................
55
Figura 9. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4
(intoxicados com citrato de Al) na esquiva 1 no teste do LTE.........................
55
Figura 10. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4
(intoxicados com citrato de Al) na esquiva 2 no teste do LTE.........................
56
Figura 11. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4
(intoxicados com citrato de Al) na esquiva 3 no teste do LTE.........................
57
Figura 12. Gráfico comparativo das tentativas de esquiva no braço fechado
do LTE do Grupo 1...........................................................................................
58
Figura 13. Gráfico comparativo das tentativas de esquiva no braço fechado
do LTE do Grupo 2...........................................................................................
58
Figura 14. Gráfico comparativo das tentativas de esquiva no braço fechado
do LTE do Grupo 3..........................................................................................
59
Figura 15. Gráfico comparativo das tentativas de esquiva no braço fechado
xii
do LTE do Grupo 4........................................................................................... 60
Figura 16. Efeitos da intoxicação com citrato de alumínio sobre
preservação de pericários neuronais nas regiões de CA1 e CA3 do
hipocampo .......................................................................................................
62
Figura 17. Efeitos da intoxicação com citrato de alumínio sobre
preservação de pericários neuronais nas regiões de CA1 e CA3 do
hipocampo........................................................................................................
Figura 18. Efeitos da intoxicação com citrato de alumínio sobre ativação de
astrócitos nas regiões de CA1 e CA3 do hipocampo.......................................
63
65
xiii
LISTA DE TABELA
Tabela 1. Distribuição dos grupos de acordo com tratamento, dose
s
número de doses e tempo de sobrevida.......................................................
.
39
Tabela 2. Parâmetros mensurados no Teste do Campo Aberto...................
43
Tabela 3. Médias dos grupos intoxicados por citrato de Al no Teste do
LTE para latência de fuga.............................................................................
60
xiv
LISTA DE ABREVIATURA
AChE Acetilcolinesterase
Al
+3
Íon livre de Alumínio
Al(HO)
3
Hidróxido de Alumínio
Al
2
(SO
4
)
3
Sulfato de Alumínio
CS Citrato de Sódio
CA Cornos de Amon do Hipocampo
CEPAE Comitê de Ética em Pesquisa com Animais
ChAT Colina Acetil Transferase
DA Doença de Alzheimer
DD Doença Dialítica
EROs Espécies reativas de oxigênio
GFAP Proteína ácida fibrilar glial
LCE Labirinto em cruz elevado
LTE Labirinto em T Elevado
PBS Tampão
SNC Sistema Nervoso Central
UFPA Universidade Federal do Pará
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O ALUMÍNIO
O alumínio é um elemento químico de número atômico 13 (13 prótons e
13 elétrons) com massa atômica 27 u, sendo o metal mais abundante da crosta
terrestre. Sua leveza, condutividade elétrica, resistência à corrosão e baixo ponto de
fusão lhe conferem uma multiplicidade de aplicações: embalagens, transporte,
construção civil, bens de uso, combustível sólido para foguetes, produção de
explosivos, transmissão elétrica, recipientes criogênicos até -200 ºC e mesmo para a
fabricação de caldeiras (ATSDR, 2006). Todavia, mesmo com baixo custo para sua
reciclagem, o que aumenta sua vida útil e a estabilidade do seu valor, a elevada
quantidade de energia necessária para sua obtenção reduz sobremaneira o campo
de aplicação do alumínio, além das implicações ecológicas negativas no rejeito dos
subprodutos do processo de reciclagem, ou mesmo de produção do alumínio
primário (AZEVEDO e CHASIN, 2003).
Durante muitos anos considerou-se que o alumínio fosse um elemento
que não tivesse efeitos nocivos aos seres vivos, entretanto, há uma série de relatos
científicos demonstrando que o alumínio possui fortes efeitos toxicológicos
observados nas mais diferentes formas de vida, como algas marinhas,
microorganismos, plantas e animais e, obviamente, no homem (KISS, 1995;
TAPPARO, 1995; ZATTA et al., 1998; RONDON-BARRAGÁN et al., 2007).
Estudos apontam que o alumínio é um agente neurotóxico e que as
condições neuropatológicas estão associadas com elevadas concentrações de
alumínio no cérebro (KLATZO et al., 1965; DEVOTO e YOKEL, 1994; KISS, 1995;
16
TAPPARO, 1995; ZATTA et al., 1998). Devido a estes estudos, houve um avanço no
conhecimento dos efeitos do alumínio no sistema nervoso central (SNC), mas, no
entanto ainda permanece obscura a atividade funcional do metal tanto nesse
sistema quanto nos demais. Isso implica em uma avaliação médica mais detalhada
em pessoas que foram expostas à esse metal, pois, a maioria dos médicos, clínicos
gerais, desconhece o quadro de sintomas clínicos ou condição subclínica de
intoxicação, pelo fato dessas informações ainda estarem sendo geradas por
pesquisadores em laboratórios, a partir de estudos experimentais in vivo e in vitro ou
de campo (LIBERAL, 2003).
1.2 BIODISPONIBILIDADE DO ALUMÍNIO
Formando cerca de 8,13% da crosta terrestre, o alumínio é o metal mais
abundante em nosso planeta e o terceiro elemento nele mais profuso (AZEVEDO e
CHASIN, 2003; ZATTA et al.,2003). Sua biodisponibilidade decorre principalmente
de chuvas ácidas, as quais o liberam do solo na água fresca, tornando-o acessível
aos seres vivos (KISS, 1995).
O alumínio é um elemento naturalmente presente ou introduzido em
nosso ambiente. Todavia, a atividade antropogênica é bem diversificada tanto na
forma quanto na sua aplicabilidade, o que contribui para aumento do processo de
liberação do alumínio. Desde sais de alumínio usados em sistemas de tratamento de
água como o sulfato de alumínio e em medicamentos antiácidos à base de hidróxido
de alumínio até recipientes para o cozimento ou conservação de alimentos líquidos
ou sólidos. Nestas condições, reações com diversos tipos de sais provocam
oxidação e resultam na liberação do alumínio de seus revestimentos (MARTINS,
1986 TAPPARO et al.,1995, ZATTA et al., 1998).
17
Segundo DeVoto e Yokel (1994), o aumento desse processo de liberação
do alumínio, nos últimos anos tem implicado, inevitavelmente, na exposição de seres
humanos a esse metal. Segundo eles, a média da ingestão oral diária da população
geral seria cerca de 30 a 50 mg.
A biodisponibilidade e os processos de liberação do alumínio têm sido
alvos de vários estudos como os de Alfrey (1986); DeVoto e Yokel (1994); WHO
(1994) e; Sabino et al. (2004) para tentar compreender a toxicologia deste metal,
bem como as principais fontes de exposição e os níveis de concentrações de
alumínio no ambiente.
Os estudos de Alfrey (1986) e DeVoto e Yokel (1994), apontam que o
alumínio pode ser encontrado na água potável em uma concentração de 2 a 4 mg/l.
WHO (1994), revela que em águas macias, presentes em solos ácidos, as
concentrações de alumínio podem atingir 200 a 300 μg/L, podendo aumentar para
600 μg/L em áreas reflorestadas. Nas águas de superfície, DeVoto e Yokel (1994)
afirmam que o alumínio é encontrado em uma concentração de 0,016 a 1,17 mg/l.
Ainda de acordo com os estudos de DeVoto e Yokel (1994) os níveis de
concentração de alumínio no ar urbano em uma área de 5000 ng/m³ é de
aproximadamente 0,14 a 0,2 mg.
Sabino et al. (2004) realizando um estudo sobre a biodisponibilidade de
diversos metais, dentre eles, o alumínio, nos sedimentos, no solo e em vegetais
(alface) na bacia hidrográfica da Pampulha, situada em Belo Horizonte, Minas
Gerais, encontraram uma concentração de alumínio nos sedimentos de 113000
ppm, no solo de 4700 ppm e na alface de 50
μg/g.
18
Esse considerável número de trabalhos acerca das diversificadas fontes
de exposição do alumínio, só nos reforça a idéia de que os seres humanos estão
constantemente correndo o risco de vir a sofrer intoxicação por esse metal pesado.
1.3 TOXICOLOGIA DO ALUMÍNIO
Durante anos pensou-se que o alumínio fosse um elemento que não
oferecesse efeitos danosos aos organismos vivos. No entanto, este cenário vem se
modificando desde a década de 60 com os primeiros trabalhos publicados por Klatzo
et al.(1965) mostrando uma degeneração neurofibrilar no SNC de coelho, após
intoxicação com fosfato de alumínio.
Nos últimos anos, essa evidência se fortaleceu por dois motivos
independentes, mas convergentes: a maior biodisponibilidade ambiental do íon livre
do alumínio, o Al
+3
, aos seres vivos, decorrente de chuvas ácidas (MARTIM, 1994;
KISS, 1995) e os estudos recentes que demonstram o acumulo de Al
+3
em fluidos,
tecidos e sistemas biológicos como agente tóxico sobre plantas, animais e no
homem (KISS, 1995; TAPPARO, 1995; ZATTA et al., 1998).
Rondon-Barragán et al. (2007) relatam que em plantas, o primeiro lugar
de acumulação e toxicidade do alumínio é no meristema da raiz, sugerindo que o
metal interaja com as células que apresentam mitose ativada, porém não com as
células maduras da região basal.
Nos microorganismos o alumínio parece afetar a regulação de íons e de
cálcio; nas algas ele afeta a concentração de clorofila e peixes morrem asfixiados
também por quebra da regulação iônica (AZEVEDO & CHASIN, 2003; RONDON-
BARRAGÁN et al., 2007).
19
Aves e outros animais terrestres submetidos a uma dieta rica em alumínio
sofrem de perda de apetite, redução no ganho de peso ou perda de peso, sendo que
em ruminantes observa-se o quadro conhecido como tetania fatal, caracterizado por
fasciculações musculares, galope alterado, convulsões, hipersensibilidade,
incontinência urinária seguido de morte (AZEVEDO E CHASIN, 2003).
Em ratos submetidos à intoxicação por alumínio foi observado um efeito
bifásico (aumento ou diminuição) na atividade da acetilcolinesterase (AChE) em
regiões do cérebro estudadas (KUMAR, 1998). A resposta bifásica foi caracterizada
por um aumento na resposta a dose baixa e uma diminuição em resposta a uma
dose mais alta (KUMAR, 1999). Outro estudo mostrou a acumulação de alumínio no
tecido cerebral de ratos após intoxicação crônica (PONSAR et al,1997).
Nos seres humanos o alumínio pode se acumular nos ossos, fígado, rins,
coração, sangue, e principalmente no encéfalo pela sua capacidade de atravessar a
barreira hematoencefálica onde se acumula nas células nervosas, chegando a
alcançar concentrações micromolares nessas células (AREMU e MESHITSUKA,
2006; KAIZER, 2008). A acumulação do alumínio principalmente no encéfalo pode
ocasionar diversas manifestações neurológicas, dentre elas podemos citar a perda
de memória, tremores, espasmos, enfraquecimento da coordenação motora,
movimentos lentos, perda de entusiasmo e convulsão generalizada com sintomas de
epilepsia (ZATTA et. al, 1991).
Segundo Veer Bala Gupta et al. (2005) e Kaizer (2008), recentes estudos
epidemiológicos, neuropatológicos e bioquímicos têm verificado que é possível uma
ligação entre a neurotoxicidade do alumínio e a patologia Mal de Alzheimer. Porém,
essa relação ainda é muito discutida na comunidade científica mundial. Segundo
20
Ferreira et al. (2008), o Mal de Alzheimer é provavelmente o resultado de um
processo de envelhecimento multifatorial que está associado à componentes
genéticos e ambientais. Entre os fatores ambientais está a exposição ao alumínio.
1.3.1 TOXICOCINÉTICA DO ALUMÍNIO
O trânsito do alumínio no organismo ainda não está completamente
elucidado. Em mamíferos, sabe-se que o alumínio é pouco absorvido no trato
gastrintestinal após sua ingestão, sendo que a maior parte dos compostos é
transformada em sais insolúveis (principalmente fosfato de alumínio) no tubo
digestivo (BAST, 1993).
A absorção do alumínio depende da rota de ingestão e esta, por sua vez,
depende da forma química do metal (BAST, 1993; RONDON-BARRAGÁN et al.,
2007) e da habilidade gastrintestinal para dissolver o alumínio e também da acidez
das secreções gástricas (LIBERAL, 2003; RONDON-BARRAGÁN et al., 2007).
Dependendo da forma química da substância, o alumínio pode formar
complexos insolúveis ou solúveis no trato gastrointestinal, o que pode favorecer (i) a
precipitação e eliminação do alumínio pelo trato gastrointestinal ou (ii) o acúmulo em
tecidos após a absorção no trato intestinal, respectivamente. (MARTIN, 1986;
MARTIN, 1994; TAPPARO et al., 1995, ZATTA et al., 1998).
Bast (1993) verificou que 10% do alumínio presente na dose 200 mg/ kg
de Al
2
(SO
4
)
3
(dose elevada) foi absorvido pelo trato gastrintestinal de ratos. Cunat et
al. (2000) verificaram que o alumínio é melhor absorvido quando presente em sais
de citrato que em outros sais (tartarato de alumínio, gluconato de alumínio, lactato
de alumínio, cloreto de alumínio, sulfato de alumínio e Nitrato de alumínio).
Alguns autores afirmam que o citrato torna o alumínio solúvel e uma
considerável fração ocorre como um complexo neutro, capaz de atravessar
facilmente as membranas, atuando como um veículo que facilita a absorção do
metal no organismo (MARTIN, 1986, 1994; TAPPARO et al., 1995; ZATTA et
al.,1998; CUNAT et al., 2000; MESHITSUKA e AREMO, 2007).
O citrato atua como veículo, onde a passagem do alumínio depende de
sua ligação a um citrato livre (EXLEY, 1999). O complexo Al-citrato é formado pela
ligação do alumínio com o grupo hidroxil e dois terminais carboxilados do citrato
(GREGOR & POWELL, 1986). (Figura 1)
Figura 1. A estrutura do complexo Al-citrato. Adaptado de Yokel et al. (1999).
Uma das hipóteses levantadas é que o citrato aumenta a biodisponibilidade
no intestino por aumentar a permeabilidade dos canais paracelulares, possivelmente
através da desregulação na homeostasia do cálcio. Este mecanismo pode ser único
para o complexo alumínio-citrato, estando em conformidade com a maior
biodisponibilidade deste complexo em comparação com outros complexos ligantes
(CUNAT et al., 2000; MOORE et al., 2000). Segundo Liberal (2003), o fato da
absorção intestinal de ambos depender do mesmo mecanismo, reforça a idéia de
21
22
que o alumínio pode ser captado pelo mesmo transportador de citrato. Pajor (1999)
relatou que a absorção de citrato está acoplada a um transportador de sódio, o Na
+1
/ dicarboxilato cotransportador, o qual se associa ao cloreto, liberando o citrato para
ligações com alumínio.
Em condições aquosas ácidas, como no estômago (pH≈2-3), o baixo pH
permite a dissolução total de compostos alumínicos que seriam insolúveis em outras
regiões corpóreas. Essa dissolução gera o Al
+3
(alumínio livre) que fica disponível
para novas ligações e possível absorção no trato intestinal (DEVOTO e YOKEL,
1994).
O alumínio solubilizado presente no estômago pode formar novos
complexos com a união do composto de alumínio que foi inicialmente ingerido ou
formar novos complexos provenientes da dieta. Os ácidos mono-, di- e tricarboxílicos
(particularmente o ácido cítrico) desempenham um papel importante na formação
desses complexos (TAPPARO, 1995; ZATTA et al., 1998; MESHITSUKA e AREMO,
2007).
Venugopal e Luckey (1978) e Devoto e Yokel (1994) sugeriram que, após
absorvido, o alumínio é distribuído principalmente no esqueleto, fígado, testículos,
rins e cérebro e em menores quantidades em outros tecidos moles.
Ratos alimentados com dietas contendo hidróxido de alumínio
apresentaram níveis aumentados de alumínio no tecido ósseo, muscular e renal
(GREGER e DONNAUBAUER, 1986 apud de BAST, 1993).
Ao ser administrado por via oral em coelhos, o alumínio pode atravessar a
barreira placentária e se acumular no feto, podendo ser também transferido para o
recém nascido através do leite (CAIPIRA e MCNAMARA, 1985; CRANMER et al.,
1986 apud de BAST, 1993).
23
O alumínio, por si só, não sofre metabolismo na medida em que é
absorvido e excretado inalterado. No entanto, este metal é facilmente vinculado a
outras moléculas pequenas no organismo e seu destino é determinado pela sua
afinidade com cada um dos ligantes e de seu metabolismo (ATSDR, 2006). A
associação do alumínio com moléculas pequenas (peptídeos, ácidos nucléicos,
aminoácidos e citrato) facilita a absorção tecidual, particularmente pelo cérebro,
onde pode ser absorvido por transportadores acoplados (DELONCLE et al.,1990).
Segundo Berton (1998), a rota de distribuição do alumínio pode ser
fisiológica por meio transcelular (membranas, citoplasma e basolateral) ou
extracelular (difusão passiva).
Nos sistemas biológicos, o alumínio compete com cátions, especialmente
o Mg
2+
e se liga ao citrato na corrente sanguínea. A maior parte do Al
+3
no sangue
se liga à transferrina, cerca de 89%, podendo acessar o SNC através do sistema
comum ao transporte de ferro via endocitose mediada por complexo receptor-
transferrina (XU et al., 1992; YOKEL et al.,1999).
Berton (1998) e ATSDR (2006) relataram que boa parte do alumínio é
excretado/eliminado pelas fezes, urina e suor. Segundo Berton (1998), a eliminação
do alumínio depende muito do complexo ao qual o metal está associado e da dieta
consumida. Com a administração de 5 mg/dia de alumínio, 74% do metal é
excretado nas fezes e só 1,3 mg permanece. Já com a ingestão de 125 mg/dia, 96%
é excretado ficando apenas 5 mg. Conforme comentado anteriormente, vale
ressaltar que a presença de citrato na dieta pode aumentar a quantidade de alumino
absorvida.
24
1.3.2 TOXICODINÂMICA DO ALUMÍNIO
O alumínio é conhecidamente um elemento neurotóxico. A evidência
dessa neurotoxicidade é a sua presença no SNC, uma vez que o mesmo ultrapassa
facilmente a barreira hematoencefálica alterando o fluxo de moléculas e íons dentro
e fora do cérebro (MESHITSUKA e AREMO, 2007). Dessa forma, há o
reconhecimento do alumínio como um agente neurotóxico, e vários estudos atribuem
seu envolvimento na etiologia da Doença de Alzheimer (DA) e Demência Dialítica
(DD) (TAPPARO et al 1995; YOKEL et al.,1999; VEER BALA GUPTA, et al., 2005;
AREMU e MESHITSUKA, 2006)
Há também relatos de que este metal pode ocasionar outras
desordens/doenças, tais como: (a) estresse ou morte celular de neurônios e células
gliais. A morte dessas células ocorre devido o alumínio diminuir a habilidade
neuroprotetora dos astrócitos para a manutenção e vida dos neurônios
(MESHITSUKA e AREMO, 2007). Já o estresse oxidativo é caracterizado por um
significante aumento na concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) nas
células e tecidos pelo alumínio (KAIZER, 2008); (b) peroxidação lipídica ocorre
devido o aumento do metabolismo oxidativo nas células, pois a interação do
alumínio com as membranas celulares, constituem seu principal alvo, induzindo
alterações estruturais e funcionais das membranas (KAIZER, 2008); (c) bloqueio dos
sistemas de transmissão intracelular, resultando na geração de radicais livres de
oxigênio (KOENIG e JOPE, 1987; WOOD et al., 1994); (d) interferência no sítio de
ligação de cálcio dentro da célula. Um dos sítios primários de toxicidade do alumínio
pode estar relacionado com sua inserção nos domínios de ligação de metais nas
enzimas e lipídeos, causando uma alteração no metabolismo e sinalização celular
25
(MARTIN, 1992); (e) danos no transporte axonal (TRONCOSO et al., 1985); (f) perda
de memória (YATES, et al., 1980; ARENDT, et al., 1985; RONDON-BARRAGÁN et
al 2007); (g) esclerose lateral amiotrófica e (h) parkinsonismo (AZEVEDO e
CHASIN, 2003; BARRETO e ARAUJO, 2008).
Estas desordens/doenças estão associadas com o acúmulo de Al
+3
em
neurônios cerebrais, os quais sofrem degeneração neurofibrilar em forma de
emaranhados neurofibriliares, bem como a formação de placas senis (GARRUTO et
al, 1995; VEER BALA GUPTA, et al., 2005).
Tais evidências permitiram, nas últimas décadas, um aumento
considerável na utilização de modelos animais experimentais na tentativa de se
compreender melhor a forma de ação desse metal não apenas nos sistemas
fisiológicos, mas principalmente suas possíveis implicações em processos
cognitivos, bem como em fatores tróficos (STRUYS-PONSAR et al, 1997).
Essa gama de evidências acerca dos efeitos tóxicos do alumínio, inclusive
com a utilização de modelos animais, levou os investigadores da área a tentar
formular hipóteses acerca de possíveis modos de ação desse íon metálico no SNC.
A hipótese mais consistente que se tem até o momento é conhecida como
a hipótese do astrócito. Em experimentos com cultura de neurônios e astrócitos,
diversos autores (GUO-ROSS et al., 1999; SUAREZ FERNANDES et al., 2001;
AREMU e MESHITSUKA, 2006; MESHITSUKA e AREMO, 2007) têm mostrado,
através de tratamentos com alumínio in vitro, que o tratamento com este metal
diminui a habilidade dos astrócitos em proteger os neurônios e que esse efeito
poderia estar ocorrendo por três mecanismos: os astrócitos, após sofrerem os
efeitos da contaminação desse metal secretariam um fator que torna os neurônios
mais suscetíveis à toxicidade induzida por glutamato; a secreção de um fator
26
neurotóxico na presença do glutamato; a redução da secreção de fatores tróficos
que protegem os neurônios da excitotoxidade do glutamato, como as neurotrofinas
que são moléculas neuroprotetoras que estimulam a sobrevivência neuronal. Esta
última opção tem se mostrado a mais plausível (AREMU e MESHITSUKA, 2006;
MESHITSUKA e AREMO, 2007), estando sustentada por trabalhos como os de
Ahlemeyer et al. (2003) que demonstrou que a ativação de astrócitos altera sua
capacidade para proteger os neurônios depois de um dano de excitotoxidade devido
a diminuição na liberação de fatores solúveis termolábeis.
Um estudo realizado por Theiss e Meller (2002) evidenciou que o alumínio
altera a comunicação celular quando acumulado no astrócito, causando
fragmentações típicas de apoptose, levando a morte dessas células gliais e a
conseguinte degeneração de neurônios no hipocampo (RONDON-BARRAGÁN et
al., 2007).
1.4 PROCESSOS NEUROBIOLÓGICOS DE MEMÓRIA
1.4.1 Considerações gerais
A memória é a capacidade que o homem e os animais possuem de
armazenar informações que possam ser recuperadas e utilizadas posteriormente
(LENT, 2001). Xavier (1993) define memória como a capacidade de alterar o
comportamento em função de experiências anteriores e Lent (2001) a difere da
aprendizagem, argumentando que esta seria apenas o processo de aquisição das
informações.
A memória envolve um complexo mecanismo que abrange o arquivo e a
recuperação de experiências anteriores e, portanto, está intimamente associada à
27
aprendizagem. Esta seria a aquisição de novos conhecimentos, enquanto a memória
seria a retenção dos conhecimentos aprendidos (CARDOSO, 1997; LENT, 2001).
Pode-se afirmar que a memória é a base do conhecimento, estando
envolvida com a orientação no tempo e no espaço e com as habilidades intelectuais
e mecânicas. Aprendizagem e memória são suporte para todo o nosso saber,
habilidades e planejamento, fazendo considerarmos o passado e nos situarmos no
presente, prevendo o futuro (CARDOSO, 1997).
Uma das estruturas fundamentais para o aprendizado e memória é o
hipocampo, localizado medialmente ao ventrículo lateral e consistindo em duas finas
áreas de neurônios, dobradas uma sobre a outra (GAZZANIGA et al., 2006). Uma
área é denominada de corno de Amon e é dividida em 4 regiões denominadas CA1,
CA2, CA3 e CA4. O corno de Amon forma o hipocampo propriamente dito. A CA2 é
pequena, e indistinta em algumas espécies, por isso ele é freqüentemente incluído
em CA1 nas análises. A outra área é denominada de giro denteado (LENT, 2004).
Estudos sugerem que essa estrutura está envolvida com os aspectos emocionais do
aprendizado e memória (BEAR, 1996; LOMBARDO et al., 2001; REZAYAT et al.,
2009).
O hipocampo é constituído por três camadas, a camada polimórfica
(stratum oriens), camada piramidal (stratum pyramidale) e camada molecular
(stratum radiatum e stratum lacunosum-moleculare). Já o giro denteado é formado
por camada polimórfica (hilus), camada granular (stratum granulosum) e a camada
molecular (stratum moleculare) que é continua com o hipocampo (GAZZANIGA et
al., 2006).
As conexões no hipocampo são realizadas pelas fibras perfurantes que
são aferentes externos ao hipocampo e fazem sinapse com as células granulares do
giro denteado. Os axônios das células granulares, por sua vez, estabelecem
sinapses com os dendritos das células piramidais e se estendem até a região de
CA3. A partir daí, as células piramidais podem percorrer dois caminhos: projetar
seus axônios para fora do hipocampo ou enviar os colaterais de Schaffer à região
CA1, onde fazem sinapses com os dendritos de outras células piramidais, cujos
axônios projetam para fora do hipocampo (LENT, 2004; SQUIRE & KANDEL, 2003)
(Figura 2).
Figura 2. Diagrama da organização sináptica do hipocampo. As fibras Colaterais de Schaffer conectam a
região CA3 a CA1. A região de CA3 comunica-se com o giro denteado através das fibras musgosas. As
fibras perfurantes são provenientes do córtex entorrinal e conduzem informações sensoriais ao giro
denteado. Na camada de neurônios piramidais (CA1) encontramos o estrato oriens. O giro denteado
divide-se em camadas: molecular, granular e polimórfica (ou hilo). Figura adaptada encontrada em
www.sciencephtolibrary.com.
Colaterais de Schaffer
Fibras musgosas
Fibras perfurantes
28
29
O hipocampo armazena memórias de média duração, sendo fundamental
para a consolidação da memória. Após a consolidação da memória na região do
hipocampo, estas informações são transferidas para outras regiões do córtex
cerebral (neocórtex) (GAZZANIGA et al., 2006).
As regiões envolvidas com a consolidação da memória são: hipocampo
(CA1 e CA3 principalmente), córtex entorrinal, córtex perirrinal e giro para-
hipocampal. Sendo que as lesões no córtex perirrinal, levam à déficits de memória
(EICHENBAUM et al.,2007).
1.4.2 Tipos de Memória
São vários os tipos e subtipos de memória. De fato, de acordo o
referencial adotado, classificações diferentes surgem para esta faculdade. Quando
se leva em conta o tempo de retenção de uma dada informação, pode-se considerar
a memória como sendo ultra-rápida, de curta duração ou de longa duração. Por
outro lado, se levarmos em conta a funcionalidade da memória, possuímos memória
espacial, memória emocional, memória episódica, memória de procedimento, etc
(LENT, 2001; SQUIRE & KANDEL, 2003; FUENTES et al.,2008).
Um dos tipos de memória mais investigada é a memória espacial. Este
tipo de memória é essencial para a sobrevivência dos animais, uma vez que é
responsável pelo armazenamento dos parâmetros de relações ambientais (MORRIS,
1984).
A memória espacial posiciona o animal de forma adequada à melhor
realizar suas atividades no meio ambiente, sejam elas básicas como encontrar
alimento e abrigo, sejam elas atividades mentais superiores, como as coordenadas
30
geográficas utilizadas pelo homem. Através da memória espacial os animais
constroem um mapa de seu mundo externo e o internalizam com sua disposição,
sua temporalidade e, acima de tudo, no caso do homem, com sua significação.
Circuitos cerebrais e sistemas de neurotransmissão específicos garantem esse
processo (MORRIS, 1984; SANTOS, 1997).
Outro tipo de memória, quanto à sua natureza, amplamente investigado, é
a chamada memória emocional. Ao contrário da memória espacial, esse tipo de
memória funciona como um sistema de alerta, caracterizado pelo seu componente
subjetivo, que sinaliza perigo à integridade física do animal ou expressa o significado
de algo. Esse tipo de memória requer circuitos neuronais e neurotransmissores
diferenciados da memória espacial, ainda que ambas estejam relacionadas na
construção integral da atividade dos animais (VIANA et al., 1994; ZANGROSSI e
GRAEFF, 1997).
1.5 ALUMINOSES E SUAS POSSÍVEIS IMPLICAÇÕES SOBRE OS
PROCESSOS DE MEMÓRIA
Estudos mostram que o alumínio não estaria envolvido apenas em
quadros sintomáticos de doenças orgânicas e neurodegenerativas, mas também em
uma série de processos cognitivos, como memória e emoção (KING, 1984; CHONG
e SUH, 1995; DLUGASZEK et al, 2000; VER BALA GUPTA, 2005; NEHRU, BHALLA
e GARG, 2006; RONDON-BARRAGÁN et al., 2007).
Nas últimas quatro décadas estudos têm evidenciado que importantes
tipos de memória estariam sendo afetados pelos compostos do alumínio, como por
exemplo, a memória espacial e a memória emocional. Dentre alguns estudos,
31
podemos citar Mcdermott et al. (1977); Basun et al. (1991) e Bondy e Truong (1999)
e Bush (2000) que, através da técnica de análises teciduais post-mortem,
verificaram um grande acúmulo de alumínio em emaranhados fibrilares e placas
senis em pacientes com sintomas semelhantes a doença de Alzheimer , cujo selo
histopatológico do diagnóstico é exatamente a presença de emaranhados
neurofibrilares e placas senis. Por outro lado, um dos principais sintomas da doença
de Alzheimer é a deterioração da memória espacial, com perda das referências
ambientais.
As evidências da degeneração de determinados grupos de neurônios e da
deterioração da memória espacial em paciente com DA levaram a um diversificado
campo de investigação acerca das estruturas anatômicas e dos neurotransmissores
envolvidos em tais processos (VEER BALA GUPTA, 2005).
Através de estudos bioquímicos e neuroquímicos tem sido mostrando
alterações nos circuitos neurais em estruturas límbicas do encéfalo, principalmente
no hipocampo, utilizando majoritariamente o sistema acetilcolinérgico de
neurotransmissão, parecem ser cruciais para o quadro histológico da DA (LENT,
2001; SQUIRE & KANDEL, 2003). Interessantemente, esses mesmos métodos têm
demonstrado que o alumínio inibe a glicólise e diminui a atividade da enzima colina
acetil transferase (ChAT), bem como o transporte de colina em cérebro de ratos
(YATES et al, 1980; KING,1984; KUMAR,1998).
Esses dados corroboram uma hipótese acerca do papel do alumínio nos
déficits de memória, característicos da DA, uma vez que a ChAT e o transporte de
colina são parâmetros para a síntese de acetilcolina, o principal neurotransmissor
envolvido nos processos de armazenamento de informação e que também encontra-
se diminuída na DA (YATES et al, 1980; ARENDT et al,1985).
32
As implicações do alumínio em desordens neurológicas e cognitivas
sugerem que esse metal pode ser um fator etiológico de danos aos processos de
aprendizagem e de memória. A importância de se compreender as bases
moleculares e celulares dos efeitos neurotóxicos do alumínio tem estimulado
enormes esforços no desenvolvimento de modelos moleculares, celulares e animais
(TAPPARO et al., 1995).
1.6 UTILIZAÇÃO DE MODELOS ANIMAIS PARA ESTUDOS EXPERIMENTAIS
ACERCA DOS EFEITOS DO ALUMÍNIO
O uso de modelos animais na investigação do alumínio teve inicio na
década de 1960 com Klatzo et al (1965), os quais desenvolveram um procedimento
experimental de degeneração neurofibrilar, que consistia na administração
intracerebral de fosfato de alumínio em coelhos, resultando no desenvolvimento de
convulsões e modificações neuronais (degeneração neurofibrilar) no SNC.
Na opinião de Tapparo et al (1995), o maior avanço no desenvolvimento
de modelos animais, para medir a toxicidade de alumínio, só foi possível dez anos
mais tarde, através de dois trabalhos, realizados de forma independente. O primeiro
foi em 1976, Alfrey et al que publicaram as primeiras provas convincentes de que a
sobrecarga de alumínio em pacientes que são submetidos à diálise estaria
fortemente relacionada com a demência dialítica. O segundo foi publicado no
mesmo ano por McLachlan et al, os quais relataram que níveis significativamente
elevados de alumínio encontravam-se presentes em áreas específicas do cérebro de
pacientes afetados pela Doença de Alzheimer.
33
Dentre diversos estudos utilizando modelos animais, podemos citar
Hermenegildo et al (1999) que mostram danos à rota do GMP cíclico do glutamato -
óxido nítrico (Glu-NO GMPc), em ratos expostos a sulfato de alumínio na água
ingerida durante 3-5 semanas; Kumar (1998), que após administrar oralmente a
dose de 320 mg/kg de cloreto de alumínio por 4, 14 e 60 dias, observou efeito
bifásico de alumínio sobre a atividade da acetilcolinesterase (AChE) em neurônios
do bulbo olfatório e do hipotálamo de ratos; Stryus-Ponsar et al, (1997) relataram,
após intoxicação por via intraperitoneal de gluconato de alumínio em ratos, durante 3
meses, acumulação do alumínio no tecido cerebral, sendo maior no córtex temporal,
no núcleo olfatório anterior e no hipocampo, média no córtex frontal e parietal, e
baixa no cerebelo e na medula. Ainda neste experimento, foram realizados testes
comportamentais no labirinto radial para conhecer as relações entre acúmulo de
alumínio e comportamento, os quais foram inconclusivos e, na opinião dos autores,
precisariam ser refeitos e ampliados.
Sethi et al. (2008), avaliaram os efeitos a longo prazo da administração
oral de cloreto de alumínio através de ensaios eletrofisiológicos, bioquímicos e
comportamentais para investigar possíveis fisiopatologias associadas com a alta
toxicidade do alumínio. Os resultados desta pesquisa revelaram através dos ensaios
eletrofisiológicos que os animais apresentaram hiper-excitabilidade; os dados
histopatológicos demonstraram que a toxicidade do alumínio diminuiu
significativamente o número de células das regiões de cornos de Amon do
hipocampo (CA). As regiões afetadas nesse estudo foram CA1 e CA3, onde
observou-se desorganização celular dos neurônios piramidais. Por outro lado, os
dados comportamentais do campo aberto mostraram que os ratos tiveram a
34
atividade ambulatorial elevada e do labirinto aquático de Morris os animais
apresentaram um déficit de aprendizagem e memória.
O uso de modelos animais apresenta como principal vantagem o
fornecimento de informações sobre o organismo como um todo, fato que não é
conseguido com outros métodos, mesmo com o progresso de métodos alternativos
nos últimos anos (CHORILLI et al., 2007).
35
1.7 HIPÓTESE EXPERIMENTAL
A investigação da etiologia e da prevalência de doenças associadas à
contaminação por metais pesados, em nossa região, tem nítida relevância teórica e
social. No caso do alumínio o seu papel toxicológico ainda permanece pouco
esclarecido, embora existam diversos trabalhos na literatura como os de Kiss, 1995;
Tapparo et al (1995) e Sethi et al. (2008) apontando efeitos, de caráter degenerativo,
em diferentes formas de vida. Esses trabalhos demonstram uma série de
implicações desse metal à saúde, atingindo principalmente o SNC e causando
desordens neurológicas e cognitivas.
Existem estudos sugerindo uma relação entre acúmulo de alumínio em
áreas do SNC, dentre elas o hipocampo, e um quadro histopatológico e
comportamental semelhante a DA, no qual se observa a deterioração de processos
de memória e degeneração de células hipocampais. No entanto, nestes estudos os
procedimentos experimentais utilizados apresentam inconsistências nos métodos e
doses de administração do alumínio, nas diferenças de amostras biológicas e nos
períodos de exposição (STRYUS-PONSAR et al, 1997; KUMAR, 1998). Além disso,
o correlato neural das alterações comportamentais, como o padrão de degeneração
das camadas hipocampais, não foi investigado de forma sistemática.
A hipótese desta investigação é a de que a intoxicação por via oral com
citrato de alumínio pode interferir nos processos de memória no sentido de
prejudicar o aprendizado ou a retenção de uma tarefa no labirinto em T elevado. Do
ponto de vista morfológico, espera-se verificar um padrão degenerativo de células
hipocampais.
36
1.8 OBJETIVOS
1.8.1 Geral
Analisar os efeitos neurocomportamentais da contaminação experimental com
citrato de alumínio sobre os processos mnemônicos de ratos Wistar adultos, fazendo
uma relação com o padrão histopatológico do hipocampo.
1.8.2 Específicos
• Investigar os efeitos da administração oral de citrato de alumínio sobre
atividade exploratória e locomotora de ratos Wistar submetidos ao teste do
campo aberto.
• Verificar os efeitos da administração oral de citrato de alumínio sobre o
desempenho comportamental em ratos Wistar submetidos ao teste de
memória do labirinto em T elevado.
• Investigar qualitativamente os efeitos da contaminação experimental com
citrato de alumínio sobre o padrão de perda neuronal e astrocitose no
hipocampo de ratos Wistar adultos.
37
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Neste trabalho foram utilizados ratos albinos da espécie Rattus
novergicus, linhagem Wistar, machos, experimentalmente ingênuos com peso entre
230 e 250 g com 5 meses de vida fornecidos pelo Biotério do Laboratório de
Psicobiologia da Universidade Federal de Pará (UFPa).
Os animais foram alojados aos pares em gaiolas-viveiro de plástico, com
dimensões de 30 cm x 20 cm x 12 cm, divididos em grupos de acordo com
tratamento. Durante o período de alojamento, os animais foram alimentados com
ração balanceada e água ad libitum e permaneceram em uma temperatura de 25 ºC,
em ciclo claro/escuro de 12 h.
Todas as condições experimentais e os procedimentos éticos estão de
acordo com as normas locais do Comitê de Ética em Pesquisa com animais
experimentais do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará,
onde o presente trabalho foi aprovado (CEPAE/UFPA), tendo o PARECER
PSI002/2008.
2.2 PREPARO DA SOLUÇÃO DE CITRATO DE ALUMÍNIO
A solução foi preparada no Laboratório de Análises Químicas do Instituto
de Geociências da Universidade Federal do Pará, pelo técnico especializado
Natalino Valente, seguindo o protocolo adaptado de Martin (1994) descrito a seguir:
Primeiramente foi pesado 14,23 g de ácido cítrico e 17,89 g de cloreto de
Alumínio hexahidratado. Logo após, ambos os reagentes foram colocados em um
38
Becker e adicionado 100 ml de água deionizada. Em seguida, adicionou-se
aproximadamente 200 ml de hidróxido de amônia na solução para o pH chegar até
7. Depois a solução foi agitada a uma temperatura de 60 °C por alguns minutos e
completada com água deionizada para um balão volumétrico de 500 ml.
2.3 PROCEDIMENTOS DE INTOXICAÇÃO E FORMAÇÃO DOS GRUPOS
EXPERIMENTAIS
A intoxicação dos animais experimentais foi realizada por citrato de
alumínio (Cal) administrada na dose de 320 mg/kg injetada em um volume de até 2
ml por via oral (gavagem) de acordo com o peso do animal, sempre no horário entre
9:00 e 11:00 h da manhã.
Já o grupo controle recebeu a administração de citrato de sódio (CNa) por
via intragástrica na mesma dose e volume do grupo experimental, conforme está
representado na tabela 01.
A distribuição dos grupos foi feita por tempo de sobrevida/ grupo
experimental, sendo três experimentais e um controle, conforme descrito a seguir:
• Grupo 1 (Animais controle): Os animais deste grupo (N=7) foram tratados
com citrato de sódio durante quatro (4) dias consecutivos e após 24h foram
realizados os testes comportamentais (campo aberto e Labirinto em T
elevado) durante três (3) dias, e em seguida os animais foram perfundidos (8°
dia do inicio do tratamento).
39
• Grupo 2 (Animais intoxicados com citrato de alumínio e perfundidos ao
8° dia): Os animais deste grupo (N=7) foram tratados com CAl durante quatro
(4) dias consecutivos e após 24h foram realizados os testes comportamentais
(campo aberto e labirinto em T elevado) durante três (3) dias, e em seguida
os animais foram perfundidos (8° dia do inicio da contaminação).
• Grupo 3 (Animais intoxicados com citrato de alumínio e perfundidos ao
17° dia): Os animais pertencentes a este grupo (N= 7) foram intoxicados com
CAl durante quatro (4) dias consecutivos. Dez (10) dias depois foram
realizados os testes comportamentais (campo aberto e labirinto em T elevado)
durante três (3) dias, e em seguida os animais foram perfundidos (17° dia do
inicio da contaminação).
• Grupo 4 (Animais intoxicados com citrato de alumínio e perfundidos ao
31° dia): Este grupo (N=8) foi intoxicado com CAl durante quatro (4) dias
consecutivos. Vinte e quatro (24) dias depois foram realizados os testes
comportamentais (campo aberto e labirinto em T elevado) durante três (3)
dias, e em seguida, os animais foram perfundidos (31° dia do inicio da
contaminação).
Tabela 1. Distribuição dos grupos de acordo com tratamento, doses,
número de doses e tempo de sobrevida.
Grupo Tratamento Dose (mg/kg) N° de doses Tempo de sobrevida
01 CNa 320 4 8 dias
02 CAl 320 4 8 dias
03 CAl 320 4 17 dias
04 CAl 320 4 31 dias
40
2.4 TESTE PARA AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES BÁSICAS DE ATIVIDADES
LOCOMOTORAS E EXPLORATÓRIAS APÓS O PROTOCOLO DE INTOXICAÇÃO
2.4.1 Campo Aberto
2.4.1.1 Fundamento:
No presente estudo foi utilizado uma arena que, em sua essência lembra
aquele que ficou conhecido como o modelo do campo aberto (AGUIAR, 1995). O
campo aberto foi desenvolvido por Calvin Hall (1934) o qual utilizou a quantidade de
defecção e urina do animal como índice de emocionalidade. A partir daí o número de
variáveis dependentes utilizadas nesse modelo aumentaram consideravelmente.
A metodologia do campo aberto consiste basicamente em mensurar os
comportamentos elucidados por um animal colocado em um espaço aberto, que
represente novidade para ele e do qual não consegue fugir, por existir paredes ao
redor desse espaço. Esse modelo permite amplamente avaliar tanto medidas de
exploração (locomoção, levantamento, farejamento) como medidas aversivas
(defecação, micção, congelamento), relacionados a atividade motora a construtos
teóricos sobre exploração e medo (NAHAS, 1997, 2001).
O campo aberto pode variar amplamente no tamanho, na forma
(quadrado, retangular ou circular) e nos parâmetros das respostas a serem
avaliados. Dessa forma, esse teste pode ser utilizado tanto para medir o
comportamento do animal mediante uma simples situação de novidade, como pode
servir para avaliar efeitos de drogas, de lesões, estimulação elétrica do SNC,
habituação, bem como a aprendizagem em respostas ao meio ambiente
experimental (AGUIAR, 1995).
41
Por estar historicamente relacionado a pesquisas com emocionalidade, o
campo aberto vem sendo utilizado para avaliar o potencial ansiolítico de drogas, pois
respostas emotivas em ratos ocorrem em maior freqüência e/ou duração em
ambientes amplos, nos quais os roedores, por instinto, se locomovem perto das
paredes, onde se sentem mais protegidos. Agentes ansiolíticos aumentam a
passagem dos animais pelo centro desta arena e diminuem a defecação e/ou
micção e ainda aumentam a freqüência e a duração de respostas de congelamento
(NAHAS, 2001).
O objetivo da utilização desse modelo neste trabalho foi (i) verificar se a
intoxicação não estaria afetando as atividades locomotoras e exploratórias dos
animais experimentais, cujo prejuízo poderia mascarar ou impedir a avaliação de
possíveis efeitos tóxicos do citrato do alumínio nos processos cognitivos que
estamos tentando investigar e (ii) favorecer a exploração dos animais no teste do
Labirinto em T elevado (LTE).
2.4.1.2 Equipamento:
Para o teste do campo aberto utilizou-se aparelho de campo aberto;
webcam, computador, software Any Maze Stoelting
®
e cronômetro.
O aparelho do campo aberto utilizado nesse estudo era de madeira
coberta com fórmica impermeável, ocupando uma área de 100 cm
2
, tendo assoalho
negro dividido em 25 quadrados e cercado por paredes de madeira de 30 cm de
altura, conforme a figura 2. A iluminação do ambiente foi feita com uma lâmpada
fluorescente branca de 80 watts à altura de 2,60 m do centro da arena.
Figura 3. Campo aberto utilizado para verificação das reações comportamentais depois da
intoxicação por citrato de Al.
2.4.1.3 Procedimento:
O animal foi colocado no centro do campo aberto e exposto,
individualmente, ao mesmo por um período de 5 minutos, durante os quais os
comportamentos foram capturados por uma webcam, que se encontrava a 1 m de
distância do modelo, para análise posterior, utilizando o software Any Maze Stoelting
®
que é especializado em medir parâmetros comportamentais importantes da atividade
exploratória, e assim contribuir para investigar com maior resolução se as condições
de alojamento (ambiente versus gaiola padrão) afetam o comportamento no campo
aberto dos animais.
Na análise foram avaliados os seguintes parâmetros: a taxa de ambulação,
do levantar, da auto-limpeza e do congelamento (NAHAS, 1997). A tabela 3
apresenta os parâmetros mensurados neste teste.
42
43
Tabela 2. Parâmetros mensurados no Teste do Campo Aberto
Parâmetros analisados Unidades
Distância percorrida Cm
Levantamento (rearing) Freqüência
Auto-limpeza (grooming) Freqüência
Congelamento (freezing) Segundo
A taxa de ambulação foi mensurada através da distância percorrida pelo
animal no aparato com as 4 patas; o levantamento (rearing) foi analisado como o
apoio do tronco, em posição próxima à vertical, apenas sobre as patas traseiras; a
auto-limpeza (grooming) foi considerada como movimentos dirigidos à cabeça ou ao
corpo, efetuados com as patas dianteiras; o congelamento (freezing) foi avaliado
quando o animal permaneceu imobilizado por mais de 10 segundos consecutivos
(NAHAS, 2001).
Antes e depois da exposição de cada animal foi realizada a limpeza do
assoalho do campo aberto com álcool etílico a 30% e toalhas de papel, deixando-o
secar bem e receber a circulação normal de ar.
2.5 PROCEDIMENTOS DE ANÁLISE COMPORTAMENTAL PARA AVALIAÇÃO
DE APRENDIZAGEM E MEMÓRIA
2.5.1 Labirinto em T elevado
2.5.1.1 Fundamento
O Labirinto em T elevado (LTE) é uma modificação do labirinto em cruz
elevado (LCE), o qual foi desenvolvido por Handley e Mithani em 1984, com o
objetivo de detectar os efeitos de drogas ansiolíticas e que se consolidou como um
44
modelo comportamental largamente utilizado para o estudo da ansiedade (VIANA et
al,1994; AGUIAR, 1995).
Handley e Mithani utilizando o LCE confirmaram os achados de
Montgmery publicados em 1955, o qual foi o primeiro a utilizar um modelo de
labirinto elevado, demonstrando que a exposição a um braço aberto desse aparato
era capaz de provocar uma situação de conflito em ratos entre a motivação para
explorar um ambiente novo e o medo gerado pelo espaço aberto e a altura. Ele
verificou que essa relação conflituosa não estava presente quando ao animal era
permitido a exploração de um braço fechado desse labirinto (AGUIAR, 1995).
É sabido que os modelos animais de ansiedade necessariamente
envolvem interferências de processos psicobiológicos, tais como as habilidades
motoras, motivação, percepção, aprendizado e memória. No entanto, a maioria
desses modelos, como é o caso do LCE, um modelo etológico que surgiu para
eliminar situações aversivas, como estímulos dolorosos, não costuma levar em conta
os processos de aprendizado e memória que sabidamente estão envolvidos em
situações de ansiedade. Além disso, uma grande quantidade de evidências
experimentais indica que estruturas cerebrais envolvidas na ansiedade e na
modulação da memória, em particular a memória emocional, estão associadas
(GRAEFF et al., 1993; VIANA et al., 1994).
Na tentativa de criar um modelo onde se possa fazer essa correlação
Graeff et al.(1993) e Viana et al.(1994) padronizaram o LTE com objetivo de analisar
em animais os diferentes tipos de ansiedade, e ao mesmo tempo avaliar a memória.
A partir daí, este modelo comportamental passou e ser utilizado para investigar os
efeitos de drogas na memória e nos substratos neurais envolvidos nos
comportamentos emocionais e processos de aprendizado (GRAEFF et al., 1993).
45
O LTE é um modelo etológico que permite a avaliação de fenômenos
biológicos naturais, tais como medo, pânico, fobias e ansiedade representando uma
homologia aos fenômenos humanos observados na clínica (FERREIRA e
FERREIRA, 2003).
O LTE foi desenvolvido para medir respostas relacionadas tanto ao medo
aprendido como ao medo inato (medo incondicionado) no mesmo indivíduo, e
simultaneamente a avaliação de memória para estes comportamentos (VIANA et al.,
1994). Este modelo é construído com pelo menos dois ambientes e com diferentes
níveis de aversão: frequentemente provoca medo e favorece o comportamento
exploratório, levando a um adequado conflito de esquiva (HANDLEY e MCBLANE,
1993; MONTGOMERY, 1955). A ausência de paredes e a impossibilidade de girar
com as patas traseiras parecem ser a base da aversão de roedores a espaços
abertos, sugerindo que esta característica deva ser a base do comportamento de
esquiva em relação aos braços abertos do LTE (GRAEFF, 1999).
Zangrossi e Graeff (1997) demonstraram que o fator motivacional crítico
no modelo do LTE é a natureza aversiva dos braços abertos. Enquanto a esquiva
inibitória do braço aberto supostamente representa o medo aprendido, a resposta de
fuga representaria o medo inato.
As análises realizadas neste modelo comportamental são baseadas na
quantificação dos comportamentos de esquiva inibitória e fuga, considerados por
alguns autores como uma medida do grau de ansiedade e medo, respectivamente
(GRAEFF et al., 1993; VIANA et al., 1994).
A metodologia deste modelo consiste basicamente em colocar o animal
repetidamente dentro do braço fechado para explorar o labirinto permitindo ao
mesmo aprender o comportamento de esquiva inibitória dos braços abertos. Por
outro lado, o posicionamento do animal no final de um dos braços abertos leva a
uma resposta de fuga do mesmo (VIANA et al., 1994).
Esses parâmetros contribuem para as pesquisas experimentais acerca de
processos relacionados ao aprendizado e memória, bem como contribuir para a
avaliação de efeitos drogas ou agentes neurotóxicos, como o alumínio, metal
utilizado neste estudo.
2.5.1.2 Descrição do aparato
O LTE é constituído por três braços de madeira, medindo cada um 50 cm
de comprimento por 12 cm de largura. Um dos braços é circundado lateralmente por
paredes opacas de 40 cm e é disposto perpendicularmente aos outros dois braços,
que permanecem abertos. Todo o conjunto está elevado 50 cm do solo. Para evitar
a queda dos animais, os braços abertos são circundados por uma tira de madeira de
1 cm de altura, ilustrado na figura 4 (GRAEFF, 1993; ZANGROSSI JR e GRAEFF,
1997).
Figura 4. Labirinto em T elevado, construído a partir do modelo descrito por
Zangrossi Jr e Graeff (1996).
46
47
2.5.1.3 Procedimento
O procedimento adotado neste estudo foi baseado no trabalho de Viana
et al (1994), o qual foi constituído de uma linha de base, duas tentativas de esquiva
inibitória e uma de fuga. A linha de base iniciou-se com o animal colocado pelo
experimentador no fim do braço fechado com a cabeça voltada para o centro do
labirinto para se medir a latência (tempo) de saída do animal, com as quatro patas
desse ambiente em um período de 300 segundos, que foi o tempo padronizado para
o teste. Em seguida foi realizada a primeira tentativa de esquiva inibitória, cujo
procedimento era o mesmo da linha de base; 30 segundos depois foi realizada a
segunda tentativa de esquiva inibitória. Logo após o teste de esquiva inibitória,
realizou-se o teste de fuga, onde o animal foi colocado no fim do braço aberto direito
do labirinto para registrar a latência (tempo) que o animal levaria para sair com as
quatro patas do braço aberto.
Os testes para a verificação da retenção da memória para as respostas
de esquiva e fuga no LTE foram realizados 72 horas após os procedimentos
descritos anteriormente, quando se fez mais uma tentativa de esquiva inibitória e
uma de fuga.
Cabe salientar que o inicio dos testes no LTE começaram logo após os
animais terem sido submetidos ao teste do campo aberto.
2.6 PERFUSÃO E ANÁLISE HISTOLÓGICA
Nos diferentes tempos de sobrevida descritos anteriormente, os animais
foram anestesiados com Cloridrato de Cetamina (72 mg/kg) e Cloridrato de Xilazina
(9 mg/kg) (i.p). Após a ausência dos reflexos corneanos e de retirada da pata,
iniciou-se rapidamente a toracotomia para a visualização do coração. Em seguida,
foi realizado o clampeamento da aorta descendente e uma cânula foi introduzida no
ventrículo esquerdo e direcionada até a porção inicial da aorta. Foi também
realizada uma pequena incisão no ventrículo direito para a eliminação do sangue do
animal, conforme a figura 5. O protocolo utilizado para esse procedimento foi
baseado no trabalho de Gomes-Leal et al (2004).
Figura 5. Procedimento de perfusão. Após a anestesia, cada animal foi perfundido
transcardiacamente com salina heparinizada, seguido de fixação, para posterior
craniotomia. A seta indica o posicionamento que a agulha foi inserida no coração. Fonte:
http://www.neuroscienceassociates.com/
images/Graphics/ perfusion.gif
A perfusão dos animais foi realizada com solução salina a 0,9%
heparinizada seguida de paraformaldeído a 4% para a fixação. Após a pós-fixação,
os encéfalos foram submetidos ao processo de crioproteção utilizando o seguinte
protocolo: i) solução crioprotetora a 25% por um dia; solução crioprotetora a 50% por
dois dias e; solução crioprotetora a 100% por sete dias. Depois da crioproteção, o
tecido foi congelado em gel de imersão para criostato (Tissue Tek) a – 55 °C e
secções coronais do encéfalo com espessura de 30 µm foram obtidas. Os cortes
48
49
foram colocados em lâminas previamente gelatinizadas que foram mantidas a
temperatura ambiente por um período mínimo de 48 horas e guardadas logo em
seguida em freezer a -20 °C para posterior estudo de imunoistoquímica.
2.7 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA
2.7.1 Estudos Imunoistoquímicos
Para identificar corpos neuronais e células gliais nas diferentes regiões do
hipocampo (CA1 e CA3) após a intoxicação por Citrato de Alumínio, foram
realizados estudos imunoistoquimicos. Utilizou-se os seguintes anticorpos: anti-
NeuN (1:100, Chemicon) para a marcação de neurônios e; proteína ácida fibrilar glial
(GFAP, 1:1000, DAKO) para a identificação de astrócitos (MULLEN et al., 1992;
ROBINSON et al.,1986).
O protocolo de imunoistoquímica adotado neste estudo foi baseado no
trabalho de Gomes-Leal et al., (2002, 2004) e será resumido a seguir:
(a) As lâminas foram retiradas do freezer à -20 °C e colocadas em estufa à 60 °C por
10 minutos;
(b) Lavagem em PBS por 3 minutos no agitador;
(c) Pré-tratamento com tampão borato à 60 °C por 25 minutos;
(d) As lâminas foram retiradas do tampão borato para resfriar em temperatura
ambiente por 20 minutos;
(e) As secções foram circundados com caneta hidrofóbica;
(f) Lavagem em PBS por 3 minutos no agitador; lavagem no metanol/H
2
0 (30%) por
20 minutos;
(g) Lavagem em PBS/TWEEN em 3 séries de 3 minutos no agitador;
50
(h) As lâminas foram levadas para a câmara úmida para serem incubadas com soro
normal de cavalo (para os anticorpos primários NeuN) ou soro normal de cabra
(para o anticorpo primário GFAP) a 10% em PBS (1ml de soro para 9 ml de PBS) e
deixados por 1 hora;
(i) As secções receberam o anticorpo primário anti-NeuN (1:100)ou GFAP (1:1000)
diluídos em PBS e deixados em overnight;
(j) As lâminas foram retiradas da câmara úmida e lavadas em PBS/TWEEN em 3
séries de 3 minutos no agitador;
(l) As secções foram incubadas por 2 horas com os anticorpos secundários: horse
anti-mouse (1:100) para NeuN e goat anti-rabbit (1:200) para GFAP;
(m) Lavagem em PBS/TWEEN (3 vezes de 3 minutos no agitador);
(n) As secções foram incubadas no complexo avidina-biotina-peroxidase (1gota de A
+ 1 gota de B em 5 ml de PBS por 2 horas;
(o) Lavagem em PBS/TWEEN (4 vezes de 3 minutos);
(p) As secções foram reagidas através do método DAB-rápido até a formação de
um cromógeno marrom na estrutura estudada;
(q) Lavagem em PB 0,1M (2 vezes de 5 minutos) para a interrupção da reação e
lavagem para a remoção do excesso de DAB;
(r) Montagem entre lâmina e lamínula com entellan.
2.8 ANÁLISE QUALITATIVA
Para avaliar a perda neuronal e astrocitose nas regiões CA1 e CA3 do
hipocampo dos animais intoxicados e controle, todas as secções marcadas pelos
diferentes métodos de imunoistoquímicos foram inspecionadas em microscópio
51
óptico (Olympus BX41). Imagens de secções contendo os campos mais ilustrativos
dos animais em todos os tempos de sobrevida e animais controle foram obtidas com
o uso de uma câmera digital acoplada ao microscópio utilizado (Olympus Evolt E-
330).
2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise dos dados comportamentais foi utilizado análise de
variância (ANOVA) de um critério com comparações post hoc realizadas através do
teste de Bonferroni quando necessário, testes de Friedman para K≥3 medidas
repetidas e o Kruskall-Wallis para verificar as diferenças amostrais entre os grupos.
O nível de significância adotado neste estudo foi p<0,05.
3 RESULTADOS
3.1 EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DE CITRATO ALUMÍNIO SOBRE AS
ATIVIDADES LOCOMOTORAS E EXPLORATÓRIAS NO TESTE DO CAMPO
ABERTO
Os animais tratados com citrato de alumínio não apresentaram perda de
peso corpóreo, quando comparados ao grupo controle, em quase a totalidade dos
períodos avaliados. Os mesmos mantiveram o peso durante e após o tratamento
com citrato de alumínio. Além disso, a administração de citrato de alumínio não
causou morte de nenhum animal.
A administração oral de citrato de alumínio resultou em aumento da
atividade locomotora, caracterizada pelo aumento da distância percorrida, para o
grupo 2 (intoxicado) (ANOVA P< 0.05) em comparação ao grupo 1 (controle) e aos
demais grupos intoxicados, conforme a figura 6.
.
Figura 6. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4 (intoxicados com citrato
de Al) no campo aberto. A freqüência da resposta de distância percorrida no campo aberto
está expressa como média ± EPM. N= 07 animais para os grupos 1 (controle), 2 e 3
(intoxicados) e N= 08 animais para o grupo 4 (intoxicado). * P< 0,05 representa a diferença
significativa em relação ao grupo 1 (controle) e
+
P< 0,05 representa diferença significativa em
rela
ç
ão ao
g
ru
p
o 2
(
ANOVA / Bonferroni
)
.
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
0
10
20
Intoxicados com citrato de Al
*
+
+
Distância (cm)
52
Com relação aos episódios de levantamento, comportamento de auto-
limpeza e congelamento, a administração de citrato de alumínio não resultou em
diferença significativa entre os grupos intoxicados (2, 3 e 4) com citrato de alumínio
em comparação ao grupo controle (1), conforme mostram o figura 7 (A-C).
53
Figura 7. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4 (intoxicados com
citrato de Al) no campo aberto. A freqüência das respostas de levantamento (A), auto
limpeza (B) e congelamento (C) no campo aberto está expressa como média ± EPM
(ANOVA). N= 07 animais para os grupos 1 (controle), 2 e 3 (intoxicados) e N= 08 animais
para o grupo 4 (intoxicado).
A
B
C
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
0
10
20
Intoxicados com citrato de Al
Nº de Levantamento
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
0
100
200
300
Intoxicados com citrato de Al
Congelamento (s)
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
0
5
10
Intoxicação com citrato de Al
Nº de Autolimpeza
54
3.2 EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DE CITRATO ALUMÍNIO NO TESTE DE
MEMÓRIA NO LABIRINTO EM T ELEVADO
No Teste do LTE dois parâmetros foram avaliados através das tentativas
de esquiva inibitória no braço fechado e fuga no braço aberto: a latência de esquiva
inibitória e a latência de fuga.
Para a latência de esquiva, uma analise global das médias totais (M
base
=
29,96; M
E1
= 103,52; M
E2
= 156,75 e M
E3
= 75,06) nas quatro tentativas (Linha de
base, esquiva 1, esquiva 2 e esquiva 3) foi feita por meio do teste de Friedman para
K≥3 medidas repetidas, e a diferença foi altamente significativa: χ
2
(3, N = 29) =
17,43, p<0,001. Pode-se observar que a latência de esquiva, ou seja, o tempo de
permanência do rato no braço fechado desde a linha de base até a esquiva 2
aumentou significativamente e já na esquiva 3 (teste de memória) realizada 72 horas
após a esquiva 2 diminuiu bruscamente em todos os grupos, com exceção do grupo
controle (p<0,005), caracterizando um déficits no aprendizado.
3.2.1 Análise das diferenças entre os grupos em cada tentativa de esquiva
3.3.1.1 Linha de Base
Na primeira exposição ao LTE para avaliação dos níveis basais do tempo
de esquiva, os grupos 3 e 4 (intoxicados) apresentaram diferenças significativas
(p<0,05 – ANOVA / Bonferroni) em relação ao grupo 1 (controle). A média da
latência de esquiva do grupo 4 foi de 81,12 segundos, enquanto que dos grupos 2 e
3 foi 16,00 e 5,71 segundos, respectivamente. Contudo, o grupo 3 apresentou pior
desempenho em relação grupo controle, pois apresentou redução no tempo de
permanência no braço fechado (figura 8).
Figura 8. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4 (intoxicados com
citrato de Al) na linha de base no teste do LTE. A latência de linha de base no braço
fechado está expressa como média ± EPM (ANOVA / Bonferroni). N= 07 animais para
os grupos 1 (controle), 2 e 3 (intoxicados) e N= 08 animais para o grupo 4 (intoxicado). *
P< 0,05 representa a diferença significativa em relação ao grupo 1 (controle).
0
100
200
300
*
*
Grupo 4
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Linha de Base
Latência de esquiva (s)
3.2.1.2 Esquiva 1
Após 30 segundos do teste de linha de base, os animais foram
novamente submetidos ao braço fechado do LTE para avaliação do tempo da
esquiva 1, conforme figura 9. Observou-se nesta etapa do teste que todos os grupos
elevaram a latência no braço fechado, no entanto não apresentaram diferenças
significativas no tempo de esquiva.
0
100
200
300
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Esquiva 1
Latência de esquiva (s)
Figura 9.
55
Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4 (intoxicados com
na esquiva 1 no teste do LTE. A latência de esquiva 1 no braço fechado
ssa como média ± EPM (ANOVA). N= 07 animais para os grupos 1
(controle), 2 e 3 (intoxicados) e N= 08 animais para o grupo 4 (intoxicado).
citrato de Al)
está expre
3.2.1.3 Esquiva 2
Na terceira exposição (esquiva 2), após 30 segundos da obtenção do
tempo de esquiva 1, a ANOVA revelou que todos os grupos aumentaram o tempo de
permanência no braço fechado. Usando o teste post hoc de Bonferroni para
averiguar tal diferença, observou-se diferenças significativas entre o grupo controle
em relação aos grupos intoxicados (p<0,05). Os grupos tratados com citrato de
alumínio não permaneceram por muito tempo no braço fechado do LTE. A média
total do grupo 1 (controle) foi de 300,00 segundos, enquanto que as médias dos
grupos 2, 3 e 4 (intoxicados) foram bem baixas 98,57, 168,00 e 146,87 segundos,
respectivamente (Figura 10).
0
100
200
300
*
*
*
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Esquiva 2
Latência de esquiva (s)
Figura 10. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4 (intoxicados com
citrato de Al) no teste do LTE. A latência de esquiva 2 no braço fechado está expressa
como média ± EPM (ANOVA / Bonferroni). N= 07 animais para os grupos 1 (controle), 2 e 3
(intoxicados) e N= 08 animais para o grupo 4 (intoxicado). * P< 0,05 representa a diferença
significativa em relação ao grupo 1 (controle).
3.2.1.4 Esquiva 3 (Teste de Memória)
Na quarta exposição (esquiva 3), considerada como teste de memória,
realizada 72 horas após a obtenção de esquiva 2, ANOVA mostrou diferenças
significativas entre os grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle. Observa-se
56
também que em relação à esquiva 2 todos os grupos, com exceção do grupo
controle, apresentaram uma queda brusca no tempo de permanência no braço
fechado do labirinto, sugerindo um déficits no aprendizado (Figura 11).
0
100
200
300
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
*
*
Esquiva 3
Latência de esquiva (s)
Figura 11. Efeitos comportamentais dos grupos 1 (Controle), 2, 3 e 4 (intoxicados com
citrato de Al) na esquiva 3 no teste do LTE. A latência de esquiva 3 no braço fechado está
expressa como média ± EPM (ANOVA de um critério). N= 07 animais para os grupos 1
(controle), 2 e 3 (intoxicados) e N= 08 animais para o grupo 4 (intoxicado). * P< 0,05
representa a diferença significativa em relação ao grupo 1 (controle).
3.2.2 Análise comparativa entre todas as tentativas de esquiva de cada grupo
3.2.2.1 Grupo 1 (controle)
Com já esperado o grupo controle apresentou um aumento significativo
nas tentativas de esquivas 1, 2 e 3 em relação a linha de base (M
base
= 16,00; M
E1
=
90,00; M
E2
= 215,00 e M
E3
= 125,42 p<0,05), sugerindo a retenção do aprendizado
da tarefa (Figura 12).
57
0
100
200
300
*
*
*
Linha de Base
Esquiva 1
Esquiva 2
Esquiva 3
Grupo 1
58
3.2.2.2 Grupo 2
No grupo 2 (intoxicado) houve uma diferença estatisticamente significativa
na esquiva 3 em relação a esquiva 1(p< 0,05 – ANOVA), podemos observar através
das médias de cada tentativa, que este grupo teve o tempo de permanência maior
no braço fechado apenas na esquiva 1(M
E1
= 132,85) (Figura 13), enquanto que nas
esquivas 2 e 3 houve uma brusca diminuição (M
E2
= 98,57 e M
E3
= 19,28),
caracterizando um déficit de memória.
Latênc de qui (s
Figura 12. Gráfico comparativo das tentativas de esquiva no braço fechado do LTE do
Grupo 1. N= 07 animais. A latência de esquiva no braço fechado está expressa como
média ± EPM (ANOVA / Bonferroni). *P< 0.05 (LB versus Esquiva 1, 2 e 3).
)va esia
Figura 13. Gráfico comparativo das tentativas de esquiva no braço fechado do LTE do
Grupo 2. N= 07 animais. A latência de esquiva no braço fechado está expressa como
média ± EPM (ANOVA). *P< 0.05 em relação à esquiva 1.
0
100
200
300
Linha de Base
Esquiva 1
Esquiva 2
Esquiva 3
*
Grupo 2
Latência de esquiva (s)
3.2.2.3 Grupo 3
A análise deste grupo intoxicado demonstrou que houve um aumento na
latência no braço fechado nas esquiva 1 e 2, entretanto na esquiva 3 houve uma
diminuição em relação as tentativas anteriores realizadas 72 horas antes da esquiva
3 (p< 0,05 – ANOVA / Bonferroni). Esse resultado aponta um prejuízo no
aprendizado que pode estar associado à contaminação com alumínio (Figura 14).
Figura 14. Gráfico comparativo das tentativas de esquiva no braço fechado do LTE do
Grupo 3. N= 07 animais para os grupos 3 (intoxicado). A latência de esquiva no braço
fechado está expressa como média ± EPM (ANOVA / Bonferroni). *p< 0.05 (LB versus
esquiva 1 e 2) e
+
P< 0,05 (Esquiva 3 versus LB e Esquivas 2 e 3).
0
100
200
300
*
*
+
Linha de Base
Esquiva 1
Esquiva 2
Esquiva 3
Grupo 3
L
(s)n d esq va
ui
ecia
atê
3.2.2.4 Grupo 4
59
Este grupo não apresentou diferenças significativas entre as tentativas de
esquiva, pois o tempo de permanecia no braço fechado do LTE foram bem
semelhante (p> 0,05 – ANOVA). Entretanto o que observa neste grupo é que houve
um aumento da latência nas primeiras tentativas de esquiva, com exceção da
esquiva 3, pois o grupo não conseguiu elevar o seu tempo de permanência no braço
fechado em relação a terceira tentativa de esquiva realizada 72 horas depois da
esquiva 2 (Figura 15).
0
100
200
300
Linha de Base
Esquiva 1
Esquiva 2
Esquiva 3
Grupo 4
Latência de esquiva (s)
Figura 15. Gráfico comparativo das tentativas de esquiva no braço fechado do LTE do
Grupo 4. N= 08 animais. A latência de esquiva no braço fechado está expressa como
média ± EPM (ANOVA).
3.2.3 Análise das latências de fuga dos grupos em cada tentativa do LTE
Para a latência de fuga a partir do braço aberto do LTE, utilizamos o teste
de Kruskall-Wallis para verificar as diferenças amostrais entre os grupos, o qual não
revelou nenhuma diferença significativa entre os grupos, conforme mostra a tabela
3.
A latência de fuga dos grupos intoxicados em relação o grupo controle
foram bem semelhantes, caracterizando que a resposta de fuga representada pelo
medo inato não foi comprometida pela intoxicação.
Tabela 3. Médias dos grupos intoxicados por citrato de Al no Teste do
LTE para latência de fuga.
Fuga 1 Fuga 2
GRUPO N M DP M DP
1 7 26,57 23,04 50,42 110,27
2 7 56,42 107,76 11,14 10,44
3 7 16,00 7,39 12,71 8,15
4 8 47,12 102,44 54,75 101,67
TOTAL
29 36,89 74,15 33,03 75,24
* N= número de animais, M= média e DP = desvio padrão
60
61
3.3 ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS NO HIPOCAMPO APÓS
ADMINISTRAÇÃO COM CITRATO DE ALUMÍNIO EM RATOS
3.3.1 Preservação Neuronal
Para avaliarmos os efeitos da administração de citrato de alumínio no
SNC, mais especificamente nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo, sobre a
preservação neuronal, realizamos imunoistoquímica para NeuN, um marcador
específico de neurônios, em secções de todos os grupos experimentais (Figura 16).
A administração de citrato de alumínio induziu conspícua perda neuronal
nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo nos grupos intoxicados (G2, G3 e G4) em
relação ao grupo controle (G1), o que originou clara desorganização celular nestas
camadas hipocampais (Figura 16 e 17).
Figura 16. Efeitos da intoxicação com citrato de alumínio sobre preservação de pericários
neuronais nas regiões de CA1 e CA3 do hipocampo reveladas pela imunoistoquímica anti-
NeuN. Animais controle (G1) e animais intoxicados (G2, G3 e G4). Notar a desorganização
das regiões CA3 e CA1 nos grupos de animais intoxicados pelo alumínio (B-D). No grupo
controle, estas regiões hipocampais apresentam um padrão morfológico normal (A). Escala
de 300 µm.
62
Figura 17. Efeitos da intoxicação com citrato de alumínio sobre preservação de pericários
neuronais nas regiões de CA1 e CA3 do hipocampo reveladas pela imunoistoquímica anti-
NeuN. Animais controle (G1) e animais intoxicados (G2, G3 e G4). No quadro acima, pode-
se observar uma redução no número de células das regiões CA1 e CA3 e uma
desorganização na citoarquitetonia nos grupos de animais intoxicados pelo alumínio (C-G).
No grupo controle, estas regiões hipocampais apresentam um padrão morfológico normal
(A e B). Escala de 300 µm.
63
64
3.3.2 Ativação Astrocitária
Para investigarmos os efeitos da administração de citrato de alumínio
sobre os padrões de ativação de astrócitos, utilizamos a imunoistoquímica para
GFAP, um marcador clássico de astrócitos (GOMES-LEAL et al., 2004). A ativação
de astrócitos foi observada nas margens dos ventrículos laterais e hipocampo dos
animais controle e intoxicados com citrato de alumínio. No grupo controle, os
astrócitos apresentaram-se bem reativos no hipocampo, enquanto que nos grupos
intoxicados houve uma diminuição progressiva da reatividade astrocítica (Figura 18).
Esta diminuição de reatividade foi máxima no grupo com tempo de sobrevida mais
tardio (grupo 4).
Figura 18. Efeitos da intoxicação com citrato de alumínio sobre a ativação de astrócitos nas
regiões de CA1 e CA3 do hipocampo reveladas pela imunoistoquímica anti-GFAP. Animais
controle (A-B) e animais intoxicados (C-H). Notar a diminuição progressiva no padrão de
ativação e número de astrócitos nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo nos grupos de
animais intoxicados com Citrato de alumínio (C-G). O efeito é mais marcante nos tempos
de sobrevida tardios (grupos G3 e G4). No grupo controle (G1), estas regiões hipocampais
apresentam um padrão morfológico normal (A-B). Escala de 300 µm.
D
65
66
4 DISCUSSÃO
4.1 CONSIDERAÇÕES TÉCNICAS
O papel toxicológico do alumínio ainda não foi totalmente esclarecido,
embora existam diversos trabalhos na literatura que utilizaram diferentes métodos de
intoxicação, dose e compostos de alumínio para estudar os efeitos deste metal nas
mais diferentes formas de vida (KISS, 1995; ZATTA et al., 1998; RODON-
BARRAGÁN et al., 2007). No entanto, não existe consenso sobre os parâmetros
mais adequados que devem ser utilizados nos estudos com intoxicação
experimental pelo alumínio (MARTIN, 1994; TAPPARO et al.,1995; STRYUS-
PONSAR et al.,1997).
Um dos problemas observados nos modelos experimentais de intoxicação
pelo alumínio é a absorção inadequada do composto utilizado. Alguns estudos
sugerem que a absorção deste metal é maior quando administrado em forma de
complexo, em especial o citrato de alumínio, pois torna o alumínio solúvel e
facilmente consegue atravessar as membranas, atuando como um veículo que
facilita a absorção do metal no organismo (MARTIN, 1994). A escolha do composto
citrato de alumínio como veículo de intoxicação se baseou nos estudos que relatam
que é na forma de tal complexo que o alumínio ultrapassa a barreira gastrointestinal
para o sangue (MARTIN, 1994). Deste modo, acredita-se que o protocolo utilizado
neste estudo propiciou melhor penetração do alumínio através da barreira
hematoencefálica, com resultados conspícuos no SNC.
67
4.2 A INTOXICAÇÃO EXPERIMENTAL COM CITRATO DE ALUMÍNIO INDUZ
ALTERAÇÕES NEUROCOMPORTAMENTAIS
Neste estudo, primeiramente avaliamos os possíveis efeitos do citrato de
alumínio nas atividades locomotoras e exploratórias em ratos Wistar através do teste
do campo aberto. O teste do campo aberto foi utilizado neste estudo com o objetivo
de verificar se a intoxicação com alumínio não afetaria as atividades locomotoras e
exploratórias dos animais, cujo prejuízo poderia mascarar ou impedir a avaliação de
possíveis efeitos tóxicos do citrato do alumínio nos processos cognitivos que
estávamos investigando.
Os resultados do campo aberto sugerem que o citrato de alumínio não
prejudicou os episódios de levantamento, autolimpeza e tempo de congelamento, o
que é corroborado por estudos prévios com nitrato de alumínio que sugerem que o
mesmo não interfere nas atividades locomotoras de ratos submetidos ao teste do
campo aberto (DOMINGOS et al., 1996).
No entanto, houve diferença significativa no grupo intoxicado com o
menor tempo de sobrevida (grupo 2) para o parâmetro distância percorrida. Este
grupo de animais apresentou um aumento na distância percorrida no campo aberto.
Resultados similares foram relatados em estudos recentes utilizando outros
compostos de alumínio (RIBES et al., 2008; SETHI et al., 2008).
Ribes et al.(2008) revelaram que a administração de lactato de alumínio
causou diferenças significativas na distância percorrida em camundongos
transgênicos. Os camundongos intoxicados com lactato de alumínio apresentaram
um aumento na distância percorrida no campo aberto em relação ao grupo controle.
Em um outro estudo, Sethi et al. (2008) demonstraram que o alumínio causou um
68
efeito de hiper excitabilidade, mensurado por ensaios eletrofisiológicos e apoiados
pelo teste do campo aberto em ratos contaminados com cloreto de alumínio por via
oral. Segundo esses autores, os resultados obtidos podem estar relacionados a
parâmetros de estresse ou ansiedade causados pela intoxicação.
Quando os animais foram submetidos ao modelo do labirinto em T
elevado, observou-se que nas primeiras três tentativas de esquiva os animais dos
grupos intoxicados com tempo de sobrevida menor e intermediário (grupos 2 e 3)
não apresentaram a latência no braço fechado do labirinto igual ou próxima do grupo
controle. Isto pode significar que a administração de citrato de alumínio dificultou o
aprendizado das respostas de esquiva. Resultado similares foram verificados por
estudos prévios, os quais revelaram que a administração periférica (via
intraperitoneal e via oral) de cloreto e sulfato de alumínio causou déficits de
aprendizagem e memória (STRYUS-PONSAR et al., 1997; KUMAR, 1998; SETHI et
al., 2008). Estes resultados sugerem que a intoxicação com citrato de alumínio pode
interferir nos mecanismos de aprendizado (aquisição) e memória.
Quando avaliado o tempo de permanência do animal no braço fechado,
nas três primeiras tentativas de esquiva, observou-se que na primeira tentativa,
considerada a linha de base, o grupo intoxicado com tempo de sobrevida maior
(grupo 4) teve um desempenho diferente em relação aos demais grupos, no sentido
de ter permanecido por mais tempo no braço fechado do labirinto. É importante
esclarecer que estudos com drogas ansiolíticas, utilizando este mesmo modelo,
demonstram que a primeira latência no braço fechado do Labirinto em T elevado é
sempre menor que as subsequentes tentativas, devido à primeira exposição ser
novidade para o animal, o que o leva a uma maior exploração nos braços abertos,
quando comparado com o braço fechado (VIANA et al., 1994; GRAEFF et al., 1998).
69
Portanto, a maior permanência dos animais intoxicados no braço fechado do
labirinto pode ser uma consequência patológica da intoxicação experimental por
citrato de alumínio
Ao ser realizada a segunda tentativa (esquiva1), foi observado que o
comportamento de aversão aos braços abertos foi alterado em todos os grupos, pois
todos conseguiram elevar o seu tempo de permanência no braço fechado do
labirinto. Esse fato está de acordo com a observação feita por Graeff et al.(1998),
de que as tentativas posteriores à primeira sempre se observa esse aumento de
tempo de permanência no braço fechado do labirinto.
Quando avaliada a terceira exposição ao braço fechado do LTE (esquiva
2), observa-se que todos os grupos intoxicados diminuíram o tempo de permanência
no braço fechado, em relação ao grupo controle. Esse dado sugere um efeito tóxico
do citrato de alumínio na chamada memória de curta duração.
Com relação à quarta tentativa (esquiva 3), realizada 72 horas após a
esquiva 2, avaliou-se a chamada memória de longa duração. Observou-se que os
animais dos grupos intoxicados apresentaram déficits de memória, caracterizado
pelos valores reduzidos do tempo de permanência no braço fechado em relação ao
grupo controle. Izquierdo et al
.(1997) e Squire e Kandel (2003) afirmam que a
consolidação da memória de longa duração ocorre em apenas algumas horas,
através de modificações bioquímicas do processo de consolidação, podendo ser
recuperada em dias ou até mesmo meses após o estímulo aversivo. Uma vez que
os grupos intoxicados apresentaram dificuldade no aprendizado de esquiva, é
possível que a intoxicação com alumínio tenha causado prejuízo no processo de
70
consolidação do aprendizado das respostas de esquiva, ou seja, um déficit na
memória de longa duração.
Os resultados encontrados neste trabalho são corroborados por outros
estudos que utilizaram modelos de intoxicação experimental por metais pesados,
incluindo alumínio (ROLOFF et al., 2002; KANECO et al., 2006) e metilmercúrio,
além de outros neurotóxicos, como o etanol (CAROBREZ e BERTOGLIO, 2005;
MAIA et al., 2009). Nos estudos com metilmercúrio e etanol, os animais intoxicados
apresentaram prejuízo no aprendizado, caracterizado pela diminuição no tempo de
permanência no braço fechado em relação ao grupo controle (CAROBREZ e
BERTOGLIO, 2005; MAIA et al., 2009). Além disso, os animais intoxicados
apresentaram comprometimento nos processos da chamada memória de curta
duração, os quais ocorrem nas primeiras tentativas de esquiva (com um intervalo de
30 segundos entre elas), bem como na memória de longa duração, observada nas
tentativas realizadas 24 horas depois. Em animais intoxicados com alumínio em
diferentes composições, houve déficits de memória quando submetidos ao teste de
memória espacial do Labirinto Aquático de Morris (ROLOFF et al., 2002; KANECO et
al., 2006).
4.3 A INTOXICAÇÃO EXPERIMENTAL COM CITRATO DE ALUMÍNIO INDUZ
ALTERAÇÕES NA MORFOLOGIA HIPOCAMPAL
Considerando que protocolos experimentais utilizando diferentes
compostos do alumínio, têm sido motivo de controvérsias na literatura, seja com
relação à doses ou rotas de administração, na tentativa de dar maior consistência
aos estudos comportamentais, decidiu-se avançar para uma avaliação a nível
71
histopatológico de uma estrutura anatômica considerada fundamental no processo
de consolidação do aprendizado, o hipocampo. Para tal, utilizamos a técnica de
imunoistoquímica para a marcação de neurônios e astrócitos nas áreas CA1 e CA3
dessa estrutura.
Os resultados dessa técnica revelaram que os animais intoxicados com
citrato de alumínio apresentaram intensa perda neuronal e desorganização das
camadas CA1 e CA3 do hipocampo. As alterações morfológicas observadas nessas
áreas podem estar influenciando o déficit de memória observado neste estudo, uma
vez que as áreas CA1 e CA3 do hipocampo são reconhecidamente responsáveis
pelos processos de consolidação da memória. Nossos resultados sugerem que as
alterações morfológicas observadas podem ter prejudicado a capacidade de
aprendizagem dos ratos intoxicados com citrato de alumínio. Este dado está de
acordo com estudos prévios que mostram alterações morfológicas e perda neuronal
em ratos tanto em modelos comportamentais quanto em trabalhos
in vitro
(LÉVESQUE et al., 2000; MESHITSUKA e AREMO, 2007; SETHI et al., 2008).
El-Rahman (2003) também relatou em seus estudos com sulfato de
alumínio, administrado durante 35 dias que esse metal causa desorganização dos
neurônios piramidais, perda neuronal e degeneração neurofibrilar no hipocampo,
que, interessantemente, são semelhantes aos emaranhados neurofibrilares
observado na doença de Alzheimer. Além disso, Sethi et al. (2008) relataram em
seus estudos que a administração do alumínio afetou as áreas CA 1 e CA3 do
hipocampo causando, também, enorme perda neuronal e desorganização do
neurônio piramidais.
Outros trabalhos relatam que além do hipocampo, outras áreas do SNC
podem ser afetadas pelo acúmulo de alumínio, entre as quais neocórtex, bulbo
72
olfatório, hipotálamo, cerebelo e estriado (XU et al,.1992; STRYUS-PONSAR et al.,
1997; KUMAR, 1998).
Além de perda neuronal, os resultados mostraram uma diminuição
progressiva da ativação astrocítica nos grupos de animais intoxicados com citrato de
alumínio. Esta diminuição de reatividade foi máxima no tempo de sobrevida mais
tardio (grupo 4). A alteração na ativação astrocítica é um fenômeno comumente
observado em doenças neurodenerativas agudas e crônicas, incluindo lesão
cerebral, lesão na medula espinhal (GOMES-LEAL et al., 2004) e a doença de
Alzheimer (MCGEER & MCGEER, 1998; MEDA et al., 2001).
É interessante ressaltar o fato de que, segundo a literatura a ativação de
astrócitos pode ocorrer tanto em lesões severas como em lesões leves no SNC.
Acredita-se que em lesões leves a ativação de astrócitos pode contribuir para
fenômenos neuroplásticos induzindo neuroproteção, mas em lesões severas a
ativação de astrócitos pode contribuir para a liberação excessiva de glutamato
induzindo lesão secundária por excitotoxicidade (PANICKAR & NORENBERG,
2005).
Estudos
in vitro, usando cultura de neurônios e astrócitos, sugerem que a
intoxicação por citrato e cloreto de alumínio induz perda neuronal (SASS et al., 1993;
LÉVESQUE et al., 2000; AREMU e MESHITSUKA, 2006; MESHITSUKA e AREMO,
2007). Nestes estudos, os autores sugerem que a morte neuronal ocorre pelo fato
de que os astrócitos, ao serem contaminados com o metal, perdem ou diminuem sua
habilidade em proteger os neurônios da excitotoxidade do glutamato.
Em outro estudo, Suarez-Fernández et al.(1999) encontraram acúmulo de
alumínio em neurônios e astrócitos após exposições de 8 a 12 dias e de 15 a 18
dias. Nas exposições de 8 a 12 dias, esse metal causou fortes mudanças na
73
morfologia dos astrócitos, bem como encolhimento dos corpos celulares. Já nas
exposições de 15 a 18 dias, foi observada uma redução de 50% na viabilidade dos
astrócitos.
No presente estudo, a diminuição da reatividade astrocítica pode indicar
comprometimento patológico desta população de células gliais. É possível que este
fenômeno possa contribuir para a perda neuronal observada no hipocampo, o que
está de acordo com a hipótese anteriormente mencionada, qual seja, os astrócitos
possuem uma função neuroprotetora que é perdida durante a intoxicação por citrato
de alumínio.
Esse conjunto de resultados reforça a hipótese mais consistente acerca
desses efeitos, conhecida como a
hipótese do astrócito (GUO-ROSS et al., 1999;
SUAREZ FERNANDES et al., 2001; AREMU e MESHITSUKA, 2006; MESHITSUKA
e AREMO, 2007).
É importante mencionar, que observou-se uma intensa ativação de
astrócitos tanto nas margens dos ventrículos laterais e terceiro ventrículo como no
hipocampo de animais nao intoxicados. Sabe-se que existem populações de células
tronco neurais na parede das regiões ventriculares, o que contribui para a
neurogênese no cérebro adulto (KRIEGSTEIN
e ALVAREZ-BUYLLA, 2009).
Acredita-se que esta neurogênese endógena pode contribuir para mecanismos de
aprendizado e memória no hipocampo (
BALU e LUCKI, 2009 ). A intoxicação por
alumínio induziu uma diminuição geral no padrão de reatividade astrocitária,
inclusive nas áreas neurogênicas mencionadas. É possível que a intoxicação
experimental com citrato de alumínio prejudique a neurogênese no cérebro adulto,
incluindo a existente nas regiões hipocampais. Este fato pode contribuir para os
déficits de aprendizado e memória observados nos animais intoxicados, no entanto,
74
esta hipótese deve ser investigada em estudos futuros, nos quais marcadores
específicos de neurogênese hipocampal sejam utilizados nos animais intoxicados e
controle.
75
5 CONCLUSÃO
No presente estudo, ratos adultos intoxicados experimentalmente com
citrato de alumínio apresentaram déficits de aprendizado e memória, nos grupos 2 e
3, ou seja, aqueles animais que foram intoxicados com 320 mg/kg com o citrato de
alumínio e testados 1 dia e 10 dias, respectivamente, depois da intoxicação nos
modelos comportamentais. Já com relação a avaliação histopatológica em células
hipocampais foram verificadas perdas neuronais e astrocitose nas regiões CA1 e
CA3 do hipocampo. Estes resultados sugerem um efeito patológico do acúmulo de
alumínio sobre os processos mnemônicos.
A relevância desses resultados preliminares levam à necessidade de
estudos complementares que possam aprofundar a análise sobre o papel do
alumínio em processos cognitivos, como a memória, tanto ao nível da investigação
de seus aspectos funcionais como das possíveis implicações morfológicas em
estruturas específicas do SNC. Considerando os inúmeros trabalhos relatados na
literatura que apontam para a participação do hipocampo nos mecanismos do
aprendizado e da memória, bem como do papel neurotóxico do alumínio, tanto
nesses processos cognitivos quanto nos padrões celulares dessa estrutura é
necessário se avançar nos estudos com a utilização de outros modelos animais,
como o labirinto radial, o qual analisa parâmetros relacionados a memmória
espacias, a qual parece envolver diretamente o hipocampo em seus diferentes
núcleos.
Para avançarmos nos aspectos morfológicos, os quais dão relevante
suporte à análise comportamental, é fundamental levarmos adiante a hipótese de
que o alumínio poderia prejudicar a neurogênese, processo esse que parece cumprir
76
papel relevante nos mecanismos da memória levados a cabo pelo hipocampo. Uma
vez que este trabalho demonstrou uma intensa ativação de astrócitos, tanto nas
margens dos ventrículos laterais quanto no terceiro ventrículo, os quais possuem
reservas de células tronco neurais envolvidas no processo de neurogênese, a
utilização de marcadores específicos para neurogênese hipocampal deve ser uma
dos primeiros passos a ser seguido no futuro.
Outro relevante aspecto do debate acerca do papel do alumínio nos
processos mnemônicos, particularmente aqueles de responsabilidade do
hipocampo, que não foi contemplado neste trabalho é o neuroquímico. Todavia
existem diversos trabalhos que mostram o prejuizo causado pelo alumínio em
sistemas de neurotransmissores, particularmente a ach, interessantemente nas
regiões hipocampais. O que tem sido observado é que esse quadro é comumente
encontrado em pacientes intoxicados por alumínio e que desenvolvem sintomas
semelhantes ao mal de Alzheimer, o que levou à chamada hipótese colinérgica
dessa patologia.
Assim, torna-se necessário a utilização de métodos neuroquímicos que
possam medir os neurotransmissores liberados nas regiões hipocampais de animais
intoxicados e submetidos aos modelos de memória. Um método adequado à essa
investigação é a microdiálise com a leitura por eletroforese, técnica essa largamente
utilizada para dosagem de neurotransmissores clássicos. Um outro método que
certamente contribuirá para uma melhor caracterização do appel do alumínio em
nossos estudos seria o cromatográfico, o qual garantiria a localização, bem mais
precisa, do alumínio nas diversas regiões do SNC.
77
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