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MARIA ISABEL BALBI-PEÑA
RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E RESISTENTES
A Oidium neolycopersici E Alternaria solani, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS
RELACIONADAS À DEFESA
MARINGÁ
PARANÁ - BRASIL
FEVEREIRO 2010
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MARIA ISABEL BALBI-PEÑA
RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E RESISTENTES
A Oidium neolycopersici E Alternaria solani, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS
RELACIONADAS À DEFESA
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Maringá como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, área de
concentração em Proteção de
Plantas, para obtenção do título de
Doutor.
MARINGÁ
PARANÁ - BRASIL
FEVEREIRO 2010
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MARIA ISABEL BALBI-PEÑA
RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E RESISTENTES
A Oidium neolycopersici E Alternaria solani, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS
RELACIONADAS À DEFESA
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Maringá como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, área de
concentração em Proteção de
Plantas, para obtenção do título de
Doutor.
APROVADA em: 1º de fevereiro de 2010
Prof. PhD Sérgio Florentino Pascholati Prof. Dr. José Renato Stangarlin
Prof. PhD Dauri José Tessman Profª. Drª. Vivian Carré Missio
Profª. Drª. Kátia Regina Freitas Schwan-Estrada
(Orientadora)
ii
AGRADECIMENTOS
À minha família.
À minha amiga e orientadora Profª. Drª. Kátia R. F. Schwan-Estrada, pelo seu
carinho e compreensão em todo momento, sobretudo naqueles de cansaço e
de desesperança.
Ao Prof. Dr. José Renato Stangarlin, pelo seu apoio e conselho desde o meu
primeiro dia de estudante no Brasil.
Aos meus amigos e colegas da UNIOESTE e da UEM: Renata, Juliana,
Adriana, Gilmar, Odair, Cláudia e Marinelva.
A todos os colegas e professores do Laboratório de Biotecnologia do Bloco T-
33, UEM.
Aos demais professores e funcionários da UEM que colaboraram no
desenvolvimento deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CNPq), pela concessão da
bolsa de estudos.
iii
BIOGRAFIA
MARIA ISABEL BALBI PEÑA, uruguaia, nasceu em 5 de julho de 1971,
na cidade de Montevideo. É engenheira agrônoma, formada pela Universidad
de la República Oriental del Uruguay. Após a graduação exerceu atividade
profissional na área de ciência e tecnologia de sementes em empresa de
produção de sementes no Uruguai. Em 2003, já no Brasil, ingressou no
Mestrado no curso de Pós-Graduação em Agronomia da Unioeste –
Universidade Estadual do Oeste de Paraná, desenvolvendo pesquisa na área
de Fitopatologia. Em 2006 iniciou o curso de Doutorado na UEM --
Universidade Estadual de Maringá, na área de concentração de Proteção de
Plantas.
iv
ÍNDICE
LISTA DE QUADROS .................................................................................... VIII
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................... X
RESUMO ........................................................................................................ XIII
ABSTRACT .....................................................................................................XV
CAPÍTULO 1 REVISÃO DE LITERATURA..................................................... 1
1. Oídio do tomate...............................................................................................1
1.1 Taxonomia.................................................................................................1
1.2 Morfologia e desenvolvimento no hospedeiro ...........................................3
1.3 Sintomas....................................................................................................4
1.4 Controle.....................................................................................................4
1.5 Cultivares resistentes ................................................................................5
2. Pinta preta do tomateiro..................................................................................6
2.1 Taxonomia.................................................................................................6
2.2 Ciclo da doença.........................................................................................8
2.3 Sintomas....................................................................................................9
2.4 Controle...................................................................................................10
2.5 Cultivares resistentes ..............................................................................11
3. Mecanismos de defesa das plantas..............................................................15
3.1 Mecanismos de defesa pré-formados .....................................................15
3.2 Mecanismos de defesa pós-formados.....................................................18
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 39
CAPÍTULO 2
DESENVOLVIMENTO DE Oidium neolycopersici EM
GENÓTIPOS DO GÊNERO Solanum SEÇÃO Lycopersicon....................... 54
RESUMO ......................................................................................................... 54
ABSTRACT ..................................................................................................... 55
1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 56
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 58
2.1 Patógeno e material vegetal........................................................................58
2.2 Inoculação e incubação de discos foliares..................................................59
2.3 Observação microscópica do processo de infecção de Oidium
neolycopersici ..............................................................................................59
2.4 Severidade da doença ................................................................................60
2.5 Estatística e delineamento experimental.....................................................60
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................... 61
v
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 67
CAPÍTULO 3
RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E
RESISTENTES A Oidium neolycopersici, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS
RELACIONADAS À DEFESA ......................................................................... 69
RESUMO ......................................................................................................... 69
ABSTRACT ..................................................................................................... 70
1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 71
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 74
2.1 Patógeno e material vegetal........................................................................74
2.2 Inoculação e coleta de amostras.................................................................75
2.3 Análises histoquímicas................................................................................75
2.3.1 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)...........................75
2.3.2 Localização in situ de superóxido (O
2
.-
)................................................76
2.4 Resposta de hipersensibilidade ..................................................................76
2.5 Análises bioquímicas ..................................................................................77
2.5.1 Obtenção dos extratos enzimáticos......................................................77
2.5.2 Proteínas totais.....................................................................................77
2.5.3 Atividade de peroxidase de guaiacol (EC 1.11.1.7)..............................77
2.5.4 Atividade de catalase (EC 1.11.1.6) .....................................................78
2.5.5 Atividade de polifenoloxidase (EC 1.10.3.2).........................................78
2.5.6 Atividade de quitinase (EC 3.2.1.14) ....................................................79
2.5.7 Atividade de β-1,3- glucanase (EC 3.2.1.6)..........................................79
2.6 Estatística e delineamento experimental.....................................................80
3. RESULTADOS ............................................................................................ 81
3.1 Desenvolvimento de O. neolycopersici nos genótipos avaliados................81
3.2 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) .................................84
3.3 Localização in situ de superóxido (O
2
.-
) ......................................................86
3.4 Resposta de hipersensibilidade ..................................................................91
3.5 Análises bioquímicas ..................................................................................94
3.5.1 Atividade de peroxidase de guaiacol ....................................................94
3.5.2 Atividade de catalase............................................................................95
3.5.3 Atividade de polifenoloxidase ...............................................................96
3.5.4 Atividade de quitinase...........................................................................97
3.5.5 Atividade de β-1,3- glucanase ..............................................................98
4. DISCUSSÃO.............................................................................................. 100
4.1 Reação de hipersensibilidade ...................................................................100
4.2 Espécies reativas de oxigênio...................................................................102
4.3 Atividade de enzimas relacionadas à patogênese ....................................104
5. CONCLUSÕES.......................................................................................... 111
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 112
vi
CAPÍTULO 4
RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E
RESISTENTES A Alternaria solani, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE ESPÉCIES
REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS RELACIONADAS À
DEFESA ........................................................................................................ 118
RESUMO ....................................................................................................... 118
ABSTRACT ................................................................................................... 120
1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 121
2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 124
2.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum
seção Lycopersicon ...................................................................................124
2.1.1 Patógeno e material vegetal...............................................................124
2.1.2 Inoculação e avaliação de severidade................................................125
2.1.3 Estatística e delineamento experimental ............................................126
2. 2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e
resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas
de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa.......................126
2.2.1 Patógeno e material vegetal...............................................................126
2.2.2 Inoculação e coleta de amostras ........................................................127
2.2.3 Análises histoquímicas .......................................................................127
2.2.4 Resposta de hipersensibilidade..........................................................128
2.2.5 Determinação de papilas....................................................................129
2.2.6 Análises bioquímicas..........................................................................129
2.2.7 Estatística e delineamento experimental ............................................132
3. RESULTADOS .......................................................................................... 133
3.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum
seção Lycopersicon ...................................................................................133
3.2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e
resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas
de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa.......................134
3.2.1 Desenvolvimento de A. solani sobre os hospedeiros .........................134
3.2.2 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
).........................136
3.2.3 Localização in situ de superóxido (O
2
.-
)..............................................137
3.2.4 Resposta de hipersensibilidade..........................................................139
3.2.5 Papilas................................................................................................141
3.2.6 Análises bioquímicas..........................................................................141
4. DISCUSSÃO.............................................................................................. 148
4.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum
seção Lycopersicon ...................................................................................148
4.2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e
resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas
de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa.......................149
5. CONCLUSÕES.......................................................................................... 160
CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................... 161
vii
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 163
viii
LISTA DE QUADROS
CAPÍTULO 1
Quadro 1. Fontes genéticas de resistência à pinta preta, podridão de colo e
lesão da haste (Adaptado de Chaerani & Voorrips, 2006)............................... 12
CAPÍTULO 2
Quadro 1. Identificação, origem e nível de resistência/suscetibilidade dos
genótipos de Solanum seção Lycopersicon empregados na avaliação do
processo de infecção por Oidium neolycopersici ............................................. 58
Quadro 2. Características do desenvolvimento dos conídios de O.
neolycopersici em discos foliares de genótipos de tomateiro avaliados 19 h pós-
inoculação (hpi)................................................................................................ 63
Quadro 3. Esporulação de O. neolycopersici e severidade de oídio em discos
foliares de genótipos de tomateiro avaliados aos 8 e 9 dias pós-inoculação,
respectivamente............................................................................................... 65
CAPÍTULO 3
Quadro 1. Porcentagem de conídios de O. neolycopersici apresentando
diferente número de hifas em tomateiros CNPH 1287 e cv Kada em diferentes
horários pós-inoculação (hpi)........................................................................... 81
Quadro 2. Porcentagem de conídios (e suas hifas) de O. neolycopersici
apresentando desenvolvimento de conidióforo 96 e 120 h pós-inoculação (hpi),
número de conidióforos por conídio (conídios inoculados com conidióforo) e por
conídio total avaliado ....................................................................................... 83
Quadro 3. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de O
2
.-
e número
de células coradas por sítio de infecção após inoculação de plantas de
tomateiro cv. Kada e CNPH 1287 com O. neolycopersici.
..
. ............................... 87
Quadro 4. Porcentagem de sítios de infecção com respostas de
hipersensibilidade (HR) após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e
CNPH 1287 com O. neolycopersici. ................................................................ 92
CAPÍTULO 4
Quadro 1. Lista e origem dos genótipos de tomateiro................................... 125
ix
Quadro 2. Tamanho das lesões de pinta preta obtidas por inoculação por
método de gota em seis genótipos de tomateiro............................................ 133
Quadro 3. Porcentagem de conídios de A. solani apresentando apressórios e
lesões em genótipos de tomateiro em diferentes horários pós-inoculação (hpi)
....................................................................................................................... 136
x
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1. Interconversão de espécies reativas de oxigênio (EROs) derivadas
do oxigênio molecular (O2) (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002). ... 19
Figura 2. Interconexões do H
2
O
2
, óxido nítrico (NO) e ácido salicílico (AS) para
a ativação e coordenação das múltiplas reações de defesa das plantas
(adaptado de Hammond-Kosack & Jones, 2000)............................................. 22
Figura 3. Representação da sinalização do NO durante a reação de
hipersensibilidade (HR) (traduzido a partir de Delledone, 2005)...................... 23
CAPÍTULO 2
Figura 1. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro 19 h pós-inoculação. ................................................................... 62
CAPÍTULO 3
Figura 1. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro em diferentes horários pós-inoculação (hpi). .............................. 82
Figura 2. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro mostrando acúmulo de H
2
O
2
em células epidérmicas após
inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287............................ 85
Figura 3. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de H
2
O
2
em células
epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada ( ) e CNPH
1287 () com O. neolycopersici..................................................................... 86
Figura 4. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de O
2
.-
em células
epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada ( ) e CNPH
1287 () com O. neolycopersici..................................................................... 88
Figura 5. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro mostrando acúmulo de O
2
.-
em células atacadas após inoculação
de plantas de cv. Kada e CNPH 1287.............................................................. 89
Figura 6. Porcentagem de sítios de infecção com resposta de
hipersensibilidade (HR) em CNPH 1287 () e cv. Kada ( ) em diferentes
horários pós-inoculação (hpi)........................................................................... 91
xi
Figura 7. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro às 120 h após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e
CNPH 1287...................................................................................................... 93
Figura 8. Dinâmica da atividade de peroxidase de guaiacol em plantas
inoculadas com O. neolycopersici () e plantas sadias ( ) de S.
habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). ........................ 94
Figura 9. Dinâmica da atividade de catalase em plantas inoculadas com O.
neolycopersici () e plantas sadias ( ) de S. habrochaites CNPH 1287 (■)
e S. lycopersicum cv. Kada (●). ....................................................................... 95
Figura 10. Dinâmica da atividade de polifenoloxidase em plantas inoculadas
com O. neolycopersici () e plantas sadias ( ) de S. habrochaites CNPH
1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). B...................................................... 96
Figura 11. Dinâmica da atividade de quitinase em plantas inoculadas com O.
neolycopersici () e plantas sadias ( ) de S. habrochaites CNPH 1287 (■)
e S. lycopersicum cv. Kada (●).. ...................................................................... 97
Figura 12. Dinâmica da atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas
com O. neolycopersici () e plantas sadias ( ) de S. habrochaites CNPH
1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●).......................................................... 98
CAPÍTULO 4
Figura 1. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de
tomateiro cv ‘Kada’ em diferentes horários pós-inoculação (hpi)................... 135
Figura 2. Porcentagem de conídios apresentando apressórios em plantas de
tomateiro cv. Kada ( ● ) e CNPH 1287 (●) após inoculação com A.
solani.............................................................................................................. 137
Figura 3. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de
tomateiro mostrando acúmulo de H
2
O
2
em células epidérmicas após inoculação
de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287............................................ 138
Figura 4. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de
tomateiro mostrando acúmulo de O
2
.-
em células atacadas após inoculação de
plantas de cv. Kada e CNPH 1287................................................................. 139
Figura 5. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de
tomateiro após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287. 140
Figura 6. Microfotografias de tecidos clareados de tomateiro cv. Kada
mostrando papila em paredes de células epidérmicas, sob apressório (seta)
após 96 h pós-inoculação com conídios de A. solani..................................... 141
Figura 7. Dinâmica da atividade de peroxidase de guaiacol em plantas
inoculadas com A. solani () e plantas sadias ( ) de S. habrochaites
CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●)............................................. 142
xii
Figura 8. Dinâmica da atividade de catalase em plantas inoculadas com A.
solani () e plantas sadias ( ) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S.
lycopersicum cv. Kada (●).............................................................................. 143
Figura 9. Dinâmica da atividade de polifenoloxidase em plantas inoculadas
com A. solani () e plantas sadias ( ) de S. habrochaites CNPH 1287 (■)
e S. lycopersicum cv. Kada (●). ..................................................................... 144
Figura 10. Dinâmica da atividade de quitinase em plantas inoculadas com A.
solani () e plantas sadias ( ) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S.
lycopersicum cv. Kada (●).............................................................................. 145
Figura 11. Dinâmica da atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas
com A. solani () e plantas sadias ( ) de S. habrochaites CNPH 1287 (■)
e S. lycopersicum cv. Kada (●).. .................................................................... 146
xiii
RESUMO
BALBI-PEÑA, Maria Isabel. Universidade Estadual de Maringá, fevereiro de
2010. Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e resistentes a Oidium
neolycopersici e Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas de
oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa. Orientadora: Profª. Drª.
Kátia Regina Freitas Schwan-Estrada.
Para investigar as respostas de defesa de dois genótipos do gênero
Solanum Seção Lycopersicon com resposta diferencial frente a Oidium
neolycopersici e Alternaria solani, avaliou-se a histopatologia, a produção e o
acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a atividade de enzimas
relacionadas à defesa [peroxidase de guaiacol (GPOX), catalase (CAT),
polifenoloxidase (PFO), β-1,3-glucanase (GLU) e quitinase (QUI)] após
inoculação com esses patógenos. Para selecionar um genótipo resistente e
outro suscetível avaliou-se o desenvolvimento do fungo nos hospedeiros no
caso de oídio e a severidade usando o método de inoculação por gota no caso
da pinta preta. O genótipo CNPH 1287 (Solanum habrochaites sin.
Lycopersicon hirsutum) e a cv. Santa Cruz Kada (S. lycopersicum sin.
Lycopersicon esculentum) foram selecionados como resistente e suscetível,
respectivamente, frente aos dois patógenos. Foram instalados dois
experimentos, onde plantas de CNPH 1287 e cv Kada foram inoculadas com os
patógenos separadamente e, posteriormente, coletadas em diferentes tempos
após inoculação. O mecanismo de resistência do genótipo CNPH 1287 frente a
O. neolycopersici esteve associado com resposta de hipersensibilidade (HR) e
explosão oxidativa. Essa associação não foi detectada na resistência frente a
A. solani. O aumento pós-inoculação da atividade de GPOX e PFO (enzimas
envolvidas nos processos fisiológicos relacionados à defesa), da CAT (enzima
envolvida na detoxificação das EROs) e os maiores níveis constitutivos e
aumentos da atividade pós-inoculação das enzimas hidrolíticas QUI e GLU
ocorridos em CNPH 1287 quando inoculado com O. neolycopersici são
coerentes com o acúmulo concomitante de EROs e o desenvolvimento de HR
nos tecidos. Mudanças similares na atividade dessas enzimas foram
xiv
verificadas em CNPH 1287 na interação com A. solani. A exceção foi a
ausência de resposta da CAT, coerente com o escasso acúmulo de EROs nos
tecidos foliares observada durante a interação com A. solani. No caso do
patógeno biotrófico O. neolycopersici, foi observada resistência do tipo gene-a-
gene com manifestação de HR e explosão oxidativa. Já na interação com o
patógeno necrotrófico A. solani, a magnitude da HR e acúmulo de EROs
observada não indicam que cumpram um papel de importância na resistência
frente a esse patógeno.
Palavras-chave adicionais: Oídio de tomate. Pinta preta. Espécies reativas de
oxigênio. Enzimas relacionadas à defesa. Patógeno biotrófico. Patógeno
necrotrófico.
xv
ABSTRACT
BALBI-PEÑA, Maria Isabel. Universidade Estadual de Maringá, February 2010.
Defense responses, in situ localization of reactive oxygen species and activity
of defense-related enzymes in tomato genotypes resistant and susceptible to
Oidium neolycopersici and Alternaria solani. Adviser: Prof. Dr. Kátia Regina
Freitas Schwan-Estrada.
To investigate plant defense responses on two Solanum section
Lycopersicon genotypes differing in their resistance against Oidium
neolycopersici and Alternaria solani, histopathology, generation and
accumulation of reactive oxygen species (ROS) and expression of defense-
related enzymes [guaiacol peroxidase (GPOX), catalase (CAT), polyphenol
oxidase (PPO), β-1,3-glucanase (GLU) and chitinase (CHI)] were studied after
inoculation with those pathogens. To select one resistant and one susceptible
genotype, we studied the fungus development on hosts in the case of tomato
powdery mildew and we evaluated disease severity using a droplet inoculation
method in the case of tomato early blight. CNPH 1287 (Solanum habrochaites
syn. Lycopersicon hirsutum) and cv. ‘Santa Cruz Kada’ (Solanum lycopersicum
syn. L. esculentum) were selected like as resistant and susceptible genotypes,
respectively, against both pathogens. Two experiments were performed, where
CNPH 1287 and Kada plants were inoculated with both pathogens and tissue
samples collected for analysis at different time intervals. Oxidative explosion
and hypersensitive response (HR) seem to be associated to resistance in
CNPH 1287 (S. habrochaites) genotype against O. neolycopersici but not
against A. solani. Higher constitutive levels and increased post-inoculation
activity of β-1,3-glucanase and chitinase, increased activity of GPOX and PPO
(enzymes involved with defense mechanisms) and CAT (enzyme involved with
ROS scavenging) that were observed in resistant genotype CNPH 1287 after
inoculation with O. neolycopersici were associated with simultaneously ROS
accumulation and HR in the tissues. When inoculated with A. solani, CNPH
12987 showed similar changes in enzyme activity except for catalase, where no
xvi
significant changes were observed. This agrees with the lower level of ROS
accumulation during the A. solani pathogenesis. Gene-for-gene resistance with
expression of HR and oxidative explosion were observed against the biotrophic
pathogen O. neolycopersici. In the case of the necrotrophic pathogen A. solani,
HR and ROS accumulation did not appear to play important roles in the
resistance against this pathogen.
Additional keywords: Tomato powdery mildew. Tomato early blight. Reactive
oxygen species. Defense-related enzymes. Biotrophic pathogen. Necrotrophic
pathogen.
1
CAPÍTULO 1
REVISÃO DE LITERATURA
O tomateiro [Solanum lycopersicum L. (PERALTA; KNAPP, SPOONER,
2005) sin. Lycopersicon esculentum Mill.] é a segunda solanácea mais cultivada
no mundo, sendo apenas superada pela cultura da batata. No ano 2007, o
Brasil foi o maior produtor dessa hortaliça na América Latina e o oitavo produtor
a nível mundial (FAO, 2009). A produção anual de tomate no Brasil no ano 2007
foi de 3,356 milhões de toneladas em uma área cultivada de 56.275 ha, com
uma produtividade média de 59,64 t ha
-1
(IBGE, 2009).
1. Oídio do tomate
O oídio do tomate, causado por Oidium neolycopersici L. Kiss (KISS et
al., 2001), tem causado sérios problemas na cultura de tomate durante os
últimos 15 anos. Infecções severas foram registradas na Europa ocidental
durante a década de 1980, mas o patógeno se disseminou relativamente rápido
para outros centros de produção de tomate na Europa e, na década de 1990,
foi reportado pela primeira vez na América do Norte (MIESLEROVÁ; LEBEDA;
KENNEDY, 2004).
No Brasil, é uma doença relativamente comum nos anos de inverno
seco, mas é raro causar danos à cultura em condições de campo. Entretanto,
com o incremento do cultivo protegido e da área irrigada por gotejamento, o
oídio assume maior importância (KUROZAWA & PAVAN, 2005; BOITEUX et
al., 2005). O número de plantas hospedeiras é elevado, incluindo 60 espécies
em 13 famílias de plantas, principalmente membros de Solanaceae e de
Cucurbitaceae (JONES; WHIPS; GURR, 2001).
1.1 Taxonomia
Os oídios constituem um dos mais importantes e bem estudados
grupos de patógenos de plantas. O termo “oídio” tem sido usado tanto para
designar a doença como também o grupo de fungos ascomicetos, pertencentes
2
à ordem Erysiphales, família Erysiphaceae (STADNIK, 2001). A ordem
Erysiphales tem 28 gêneros e 100 espécies de fungos. Todos os membros
dessa ordem são patógenos biotróficos de folhas e de frutos de plantas
superiores, causando a doença chamada oídio ou míldio pulverulento. A maioria
dos anamorfos da ordem Erysiphales pertence ao gênero Oidium (KENDRICK,
2001).
No final da década de 1970 foi reportado, no Japão e na Austrália, o
aparecimento de um novo oídio causando dano severo em tomate.
Posteriormente, epidemias de uma doença similar foram reportadas em vários
locais da Europa e da América do Norte. Em todos esses relatos, o agente
causal foi descrito como um Oidium anamórfico claramente distinto de
Oidiopsis, o estado anamórfico de Leveillula taurica, o qual afeta tomate em
regiões mais cálidas e apresenta conidióforos ramificados que emergem dos
estômatos (KISS; TAKAMATSU; CUNNINGTON, 2005). A fase sexual do fungo
é desconhecida. Os dados reportados da conidiogênese desse patógeno eram
contraditórios, já que alguns autores descreveram a produção de conídios em
cadeia (ARREDONDO et al., 1996;
BÉLANGER & JARVIS, 1994;
KARASEVICZ & ZITTER, 1996;
KISS, 1996; PERNEZNY & SONODA, 1998) e
outros a formação de conídios solitários (MAROIS et al., 2001; SMITH;
DOUGLAS; LAMONDIA, 1997; VAKALOUNAKIS & PAPADAKIS, 1992;
WHIPPS; BUDGE; FENLON, 1998). Já que a natureza da conidiogênese tem
um padrão estável em espécies de oídio, essa contradição sugeriu que as
epidemias de oídio poderiam ser causadas por mais de uma espécie em
diferentes partes do mundo ou inclusive na mesma região geográfica (KISS;
TAKAMATSU; CUNNINGTON, 2005).
Para identificar o agente causal das epidemias de oídio em tomate,
Kiss e colaboradores (2001) estudaram mais de 50 espécimens de oídio de
tomate obtidos de todos os continentes onde o tomate é cultivado usando
morfologia clássica, microscopia eletrônica de varredura e análise filogenética.
Eles concluíram que todas as ocorrências recentes de oídio em tomate fora da
Austrália foram causadas por uma espécie que formava conídios solitários, ou,
em condições de alta umidade relativa, em pseudocadeias de 2-6 conídios.
Baseados nisso, descreveram uma espécie nova, chamada de Oidium
3
neolycopersici para esse patógeno. Os isolados australianos, os quais sempre
formaram conídios em cadeia, retiveram o nome de Oidium lycopersici.
1.2 Morfologia e desenvolvimento no hospedeiro
Os esporos de O. neolycopersici possuem forma ovoide-elipsoide ou
doliforme, com tamanho aproximado de 22-46 x 10-20 um. O tubo germinativo
emerge do corpo do conídio, cresce e se alonga na ponta, formando um
apressório lobado. Subsequentemente, o peg de penetração emerge do centro
do apressório e penetra a célula do hospedeiro. A partir do corpo do conídio e
do apressório primário emergem hifas secundárias que colonizam rapidamente
o tecido. Os apressórios secundários se desenvolvem solitários ou em pares a
partir das hifas que se ramificam sobre a superfície da planta (JONES;
WHIPPS; GURR, 2001). As hifas são hialinas, septadas, ramificadas de 2-8 µm
de largura (WEHT, 2001).
Jones et al. (2000) encontraram depósitos de material de matriz
extracelular (ECM) embaixo de tubos germinativos, das hifas, ao redor das
bordas do apressório e ao redor do poro de penetração no sítio de penetração
de O. neolycopersici. A ECM não foi observada sob os esporos que não tinham
germinado. Em testes de adesão realizados com conídios de O. neolycopersici
no estágio de apressório e com conídios não germinados, foi comprovado que o
tecido dos conídios que apresentavam apressório fica aderido ao hospedeiro,
determinando o sucesso da adesão (JONES; WHIPPS; GURR, 2001).
Um pequeno pico na atividade de cutinase no momento da penetração
e a aparência lisa das bordas do orifício de penetração sugerem que as
enzimas têm um papel na penetração da cutícula e parede celular epidérmica
pelo fungo O. neolycopersici (JONES et al., 2000). Jones, Whipps e Gurr (2001)
reportam uma pressão de turgor máxima de aproximadamente 3 MPa no
apressório maduro às 11 h pós-inoculação, o que coincide com momento da
penetração da célula hospedeira.
Os haustórios são estruturas do fungo essenciais para a fixação e o
suprimento nutricional dos oídios, formando uma associação física íntima com o
plasmalema da célula do hospedeiro, sem, no entanto, perfurá-la. O fluido entre
a membrana extra-haustorial e a parede do haustório é denominada matriz
4
extra-haustorial, através da qual ocorre a transferência de nutrientes do
hospedeiro para o parasita (STADNIK & MAZZAFERA, 2001).
O ciclo de vida assexual se completa com a formação de conidióforos
eretos, perpendiculares à superfície do hospedeiro, com uma célula basal
cilíndrica e carregando um único conídio no ápice (JONES; WHIPPS; GURR,
2001).
1.3 Sintomas
O sintoma mais comum são massas de aspecto pulverulento de cor
branca a cinza, que se formam na face adaxial dos folíolos, nos pecíolos e no
caule dos tomateiros, constituídas de micélio e de órgãos de frutificação
assexuada do fungo (KUROZAWA & PAVAN, 2005). As pequenas colônias
iniciais (3-10 mm) se estendem rapidamente e, em cinco dias, podem cobrir
toda a superfície foliar (FLETCHER; SMEWIN; COOK, 1988). Nos estágios
mais avançados, as áreas afetadas passam a apresentar amarelecimento e,
finalmente, necrose. Esses sintomas são mais evidentes nas folhas mais velhas
da planta. Infecções severas levam à senescência prematura e a uma marcada
redução da qualidade e do tamanho do fruto (WHIPPS; BUDGE; FENLON,
1998).
1.4 Controle
Com o surgimento do novo oídio de tomate causado por O.
neolycopersici, a doença propagou-se rapidamente no mundo inteiro. Todos os
cultivares comerciais de tomate testados foram suscetíveis a esse fungo
(LINDHOUT; PET; VAN DER BEEK, 1994). Inicialmente, conseguiu-se bom
controle com o uso de fungicidas tais como benomil, carbendazim, tiabendazol,
triforine, bupirimate e várias preparações com enxofre, entre outros
(KUROZAWA & PAVAN, 2005; JONES; WHIPPS; GURR, 2001).
5
1.5 Cultivares resistentes
O uso de cultivares resistentes constitui a alternativa mais eficiente e
segura para o controle da doença, fundamentalmente por reduzir os custos de
produção e evitar danos à saúde humana e ao ambiente. A obtenção de fontes
de resistência entre as cultivares de tomate não tem tido muito sucesso, o que
tem levado à procura nas espécies selvagens do gênero Solanum seção
Lycopersicon. “Screening” intensivo tem revelado várias fontes potenciais de
resistência em acessos de Solanum habrochaites (sin. Lycopersicon hirsutum),
S. chilense (sin. L. chilense), L. parviflorum (sin S. neorickii), S. peruvianum
(sin. L. peruvianum), S. pimpinellifolium (sin. L. pimpinellifolium), S.
lycopersicum var. cerasiforme (sin. L. esculentum var. cerasiforme) e S.
pennellii (sin. L. pennellii) (LINDHOUT; PET; VAN DER BEEK, 1994;
CICCARESE et al., 1998; HUANG et al., 1998; HUANG et al., 2000;
MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; MATSUDA et al., 2005; LI et al.,
2006). Essas espécies selvagens estão agrupadas no complexo “peruvianum”
e no complexo “esculentum”. O complexo “esculentum” está formado por: S.
lycopersicum, S. habrochaites, S. cheesmaniae (sin. L. cheesmaniae), S.
neorickii, S. pimpinellifolium e S. pennellii, e essas espécies são o foco principal
do “screening” de resistência frente a O. neolycopersici, devido à facilidade de
cruzamento com o tomateiro cultivado (S. lycopersicum) (MIESLEROVÁ;
LEBEDA; CHETELAT; 2000).
Tem sido foco de atenção particular a resistência apresentada por S.
habrochaites, atribuída ao gene com dominância incompleta Ol-1, que co-
segrega com outros dois genes de resistência (LINDHOUT; PET; VAN DER
BEEK, 1994). Cicaresse et al. (1998) encontraram resistência em L.
esculentum var. cerasiforme, a qual é devida ao gene recessivo Ol-2. Embora o
foco esteja centrado no complexo “esculentum”, o trabalho com introgressão de
genes de resistência do grupo “peruvianum” em S. lycopersicum continua
(MIESLEROVÁ; LEBEDA; CHETELAT; 2000). Lindhout, Pet e Van Der Beek
(1994) propuseram que os dois complexos podem apresentar mecanismos
diferentes de resistência genética a O. neolycopersici, devido a seus diferentes
locais geográficos de origem, o qual deve ter impedido a cossegregação dos
genes de resistência.
6
2. Pinta preta do tomateiro
A pinta preta caracteriza-se por ser uma das mais importantes e
frequentes doenças da cultura do tomateiro nas condições brasileiras de cultivo.
A doença apresenta alto potencial destrutivo, incidindo sobre folhas, hastes,
pecíolos e frutos do tomateiro, ocasionando elevados prejuízos econômicos
(KUROZAWA & PAVAN, 2005), podendo causar danos em qualquer estádio de
desenvolvimento da planta. As perdas são diretas, através da infecção dos
frutos, e indiretas, através da redução do vigor da planta, além de danos aos
frutos expostos aos raios do sol em decorrência da desfolha. A maior
severidade da doença ocorre durante a fase de frutificação (VALE et al., 2000).
2.1 Taxonomia
O fungo Alternaria solani é um dos membros mais conhecidos e de
maior importância econômica do gênero Alternaria. Esse gênero pertence ao
reino Fungi, filo Ascomycota (classe Dothideomycetes, ordem Pleosporales,
família Pleosporaceae), mas, devido à ausência da fase sexual, o gênero é
usualmente classificado em Deuteromycota (filo artificial ou não filogenético). A
comparação de sequências de DNA assim como de caracteres fenotípicos não
sexuais permite, no entanto, a integração dos fungos assexuais no Filo
Ascomycota (SCHOCH et al., 2006; TAYLOR; SPATAFORA; BERBEE, 2006).
O gênero Alternaria foi estabelecido em 1817 com A. alternata
(originalmente A. tenuis) como o isolado tipo. A característica-chave do gênero
Alternaria é a produção de conídios grandes, multicelulares, escuros
(melanizados) com septos transversais e longitudinais (phaeodictyospores).
Esses conídios são mais largos perto da base e gradualmente se afinam até um
bico alongado, dando a aparência de clava (THOMMA, 2003). Dentro do gênero
Alternaria, as espécies são definidas primariamente com base nas
características dos conídios, sendo descritas mais de 100 espécies em todo o
mundo (SIMMONS, 1992). Devido à grande diversidade de espécies de
Alternaria, tem sido propostas divisões em grupos subgenéricos, como a
sugerida por Nergaard (1945), baseada no número de esporos na cadeia e,
7
mais recentemente, a proposta por Simmons (1992), baseada em grupos de
espécies, cada um tipificado por uma espécie representativa.
O fungo A. solani foi considerado o agente causal de pinta preta no
tomateiro e na batateira, entretanto, devido à considerável variabilidade do
fungo, existe controvérsia acerca se é o mesmo agente causal em ambos os
hospedeiros (FOOLAD; MERK; ASHRAFI, 2008). Em detalhado estudo sobre
espécies de Alternária de tomateiro e batateira, Simmons (2000) reporta duas
espécies diferentes desde o ponto de vista cultural e morfológico: A.
tomatophila E.G. Simmons e A. solani, como agentes causais de pinta preta no
tomateiro e batateira, respectivamente. As diferenças mais importantes se
referiram ao comprimento, largura e padrões de ramificação dos bicos do
conídio, assim como diferencias culturais (ZITTER & DRENNAN, 2005). Além
das diferenças em características morfológicas, têm sido detectadas diferenças
fisiológicas entre essas espécies, através do perfil de metabólitos secundários
usando cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (ANDERSEN,
DONGO; PRIOR, 2008), embora a função e estrutura química desses
compostos seja ainda desconhecida. A. tomatophila tem sido detectada nos
Estados Unidos, Austrália, Nova Zelandia e Venezuela (SIMMONS, 2000), mas
não foi reportada ainda no Brasil.
A variabilidade genética de A.solani foi analisada em 112 isolados do
fungo oriundos de tomateiro e batateira usando AFLP (“amplified fragment
length polymorphism analysis”). A análise incluiu isolados de várias regiões de
Cuba, USA, Brasil, Turquia, Grécia, Rússia e China (PÉREZ-MARTINEZ;
SNOWDON; PONS-KÜHNEMANN, 2004). O dendograma obtido por
agrupamento UPGMA baseado em fingerprints AFLP indicou uma
especialização por hospedeiro indicada pela separação dos isolados de
tomateiro e batateira em dois subgrupos diferentes com similaridade genética
de 0,7. Como, no entanto, alguns isolados não foram consistentes com a
hipótese de especialização por hospedeiro, os autores classificaram todos os
isolados como A. solani, até a realização de estudos morfológicos e culturais
detalhados de acordo a Simmons (2000).
Lourenço e colaboradores (2009) coletaram isolados de A. solani de
tomateiro e batateira de várias regiões produtoras de Brasil. Utilizaram
sequências da região do espaçador interno transcrito do rDNA (ITS) e
8
sequências parciais dos genes que codificam a proteína alt a1 (Alt a 1) e a
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Gpd) para estimar a diversidade
molecular assim como para análises de coalescência. A existência de
subpopulações associadas com os hospedeiros foi detectada quando foram
analisados os genes Alt a 1 e Gpd, mas não quando se analisaram os
polimorfismos da região ITS, devido à pequena ou inexistente variação nessa
região nas espécies do grupo porri ao qual A. solani pertence. Os resultados
apontam forte evidência de que a subpopulação de A. solani que causa pinta
preta em batata é geneticamente diferente daquela que causa pinta preta em
tomate. Segundo os autores, a associação de haplótipos com as espécies
hospedeiras seria uma evidência de um processo de especialização em
andamento, embora considerem necessária uma análise mais aprofundada das
características morfológicas e de componentes de adaptabilidade (“fitness”)
desses haplótipos, para identificar as possíveis espécies de Alternaria
associadas com pinta preta de tomateiro e batateira no Brasil.
2.2 Ciclo da doença
A pinta preta ocorre em todas as regiões onde o tomateiro é cultivado,
sobretudo em condições de alta umidade e temperaturas entre 25ºC e 30ºC.
Entretanto, pode ocorrer em clima semiárido, onde é verificado orvalho com
frequência (KUROZAWA & PAVAN, 2005).
O fungo A. solani sobrevive como conídio ou micélio em restos
culturais, solo e semente. Os conídios podem servir como fonte primária de
inóculo para o cultivo posterior até começar o ciclo secundário da doença.
Os esporos são dispersos principalmente por vento e, ocasionalmente,
por respingos de chuva, irrigação ou insetos (ROTEM, 1994). Clamidósporos
podem também servir como estruturas de sobrevivência (PATTERSON, 1991),
embora sejam encontrados com baixa frequência (ROTEM, 1994).
Os conídios apresentam paredes celulares grossas conferindo
resistência a baixas temperaturas e outras condições ambientais adversas
(FOOLAD; MERK; ASHRAFI, 2008). As células do conídio são melanizadas, o
que também protege de estresses e de condições desfavoráveis ambientais,
como temperaturas extremas, radiação UV e compostos segregados por
9
microrganismos antagonistas (ROTEM 1994, REHNSTROM & FREE, 1996,
KAWAMURA; TSUJIMOTO; TSUGE, 1999). A germinação do conídio ocorre
na faixa de 6ºC a 34ºC, com fator ótimo entre 28ºC a 30ºC em 35 a 45 min em
água (KUROZAWA & PAVAN, 2005). Os tubos germinativos emergem dos
esporos e se estendem sobre a superfície foliar. A infecção ocorre por
penetração direta das células epidérmicas ou através dos estômatos ou
ferimentos, após a formação de apressório. As lesões tornam-se visíveis sob
condições favoráveis entre um a três dias após a inoculação (ROTEM, 1994,
KUROZAWA & PAVAN, 2005, CHAERANI & VOORRIPS, 2006). A colonização
do hospedeiro é facilitada por enzimas (celulases, pectin-metil-galacturonases)
que degradam a parede celular do hospedeiro e por várias toxinas que matam
as células do hospedeiro permitindo que o patógeno derive nutriente a partir
dessas células mortas (ROTEM, 1994). Foram identificadas 11 toxinas em
filtrados de culturas de A. solani, dentre as quais o ácido alternárico e a
solanapyrone A, B e C são capazes de induzir sintomas necróticos similares
aos sintomas da pinta preta (MONTEMURRO & VISCONTI, 1992).
O ciclo de vida de A. solani é relativamente curto, o que permite
infecções policíclicas. Além disso, o fungo sobrevive no solo, em semente e no
ar, o que torna difícil o manejo desse patógeno pela rotação de cultivos e
desinfecção de sementes (CHAERANI & VOORRIPS, 2006).
Além do tomateiro, A. solani afeta outras solanáceas, tais como
batateira, berinjela, pimentão e jiló (KUROZAWA & PAVAN, 2005).
2.3 Sintomas
Além dos sintomas foliares que são conhecidos como pinta preta, A.
solani causa sintomas de menor importância econômica no tomateiro que
incluem podridão de colo (plântulas), lesões na haste em plantas adultas e
podridão do fruto.
A podridão do colo é caracterizada por lesões de tipo cancro, localizadas
no caule ao nível do solo. Eventualmente, essas lesões circundam o caule
formando colares e danificando o sistema vascular, o que leva à perda de stand
de plantas. A podridão do colo tem importância tanto como doença, assim como
10
fonte de inóculo para a ocorrência de uma epidemia de pinta preta (FOOLAD;
MERK; ASHRAFI, 2008).
Os sintomas foliares podem ocorrer em toda a parte aérea da planta,
mas as lesões são mais abundantes nas folhas mais velhas e próximas ao solo.
Nas folhas totalmente desenvolvidas, as lesões se caracterizam pela presença
de manchas necróticas, pardo-escuras com ou sem zonas concêntricas bem
pronunciadas, bordas definidas, circulares ou elípticas no início e irregulares
mais tarde, com diâmetro de 3 a 20 mm. Em lesões mais velhas, pode
constatar-se halo clorótico que pode tomar extensas áreas dos folíolos
(KUROZAWA & PAVAN, 2005). O ataque severo provoca desfolha acentuada e
expõe os frutos à queima de sol.
Nas hastes de plantas adultas, o sintoma é caracterizado por lesões
grandes, com anéis concêntricos, semelhantes aos que ocorrem nas folhas.
Nos frutos, verifica-se uma podridão de aspecto zonado, deprimida, grande,
circular, próxima ao pedúnculo, coberta por um mofo preto na superfície devido
à presença de frutificações do patógeno (LOPES et al., 2000).
2.4 Controle
As principais medidas de controle para pinta preta consistem em um
conjunto de medidas preventivas, tais como: a) tratamento de sementes com
os fungicidas thiram, captan, thiram + iprodione e uso de mudas livres da
doença; b) rotação de culturas com gramíneas; c) escolha de local para
instalação de culturas evitando áreas de baixada e sujeitas a neblina e
próximas a culturas de tomateiro; d) adubação equilibrada; e) pulverizações
preventivas com fungicidas (MADDEN; PENNYPACKER; MAC NAB, 1978;
KUROZAWA & PAVAN, 2005)
Potencialmente, o uso de cultivares resistentes seria a forma de controle
mais econômica estendendo os intervalos entre as pulverizações de fungicidas
(MADDEN; PENNYPACKER; MAC NAB, 1978; KEINATH; DU BOSE;
RATHWELL, 1996), mas, na prática, o progresso no melhoramento por
resistência à pinta preta tem sido limitado pela falta de genes de resistência no
tomateiro cultivado e pela expressão quantitativa e herança poligênica da
resistência (CHAERANI & VOORRIPS, 2006).
11
2.5 Cultivares resistentes
O uso de cultivares resistentes constitui a alternativa mais eficiente e
segura para o controle das doenças, fundamentalmente por reduzir os custos
de produção e evitar danos à saúde humana e ao ambiente. Altos níveis de
resistência à pinta preta são raros no tomateiro cultivado [Solanum
lycopersicum (PERALTA; KNAPP, SPOONER, 2005), sin. Lycopersicon
esculentum Mill.]. No entanto, várias espécies de tomateiro selvagens (S.
habrochaites [sin. L. hirsutum, S. pimpinellifoium [sin. L. pimpinellifolium], S.
peruvianum [sin. L. peruvianum e S. chilense [sin. L. chilense]) têm sido
identificadas como fontes potenciais de resistência (NASH & GARDNER
1988b; POYSA & TU 1996; FOOLAD et al. 2000; THIRTHAMALAPPA &
LOHITHASWA 2000). Chaerani e Voorrips (2006) sumarizam as fontes de
resistência à pinta preta, podridão de colo e lesão da haste em trabalhos
publicados desde 1945 até 2000 (Quadro 1). Esses autores assinalam que o
sucesso na incorporação de resistência é limitado, pois a maioria das linhagens
usadas em melhoramento (NC EBR-1, NC EBR-2 [GARDNER 1988], NC EBR-
4 [GARDNER & SHOEMAKER 1999], HRC90.303 e HRC91.341 [POYSA & TU
1996]) são de amadurecimento tardio, apresentam crescimento indeterminado
e baixo rendimento. Todas essas linhagens são derivadas de acessos de S.
habrochaites (sin. L. hirsutum).
A maioria dos estudos genéticos sobre a herança da resistência à
pinta preta, usando várias espécies de Solanum como fontes de resistência,
concluem que a resistência é uma característica quantitativa e de controle
poligênico (CHAERANI & VOORRIPS, 2006). As estimações de herdabilidade
da resistência à pinta preta são baixas a moderadas (NASH & GARDNER,
1988a; FOOLAD & LIN, 2001; FOOLAD et al., 2000) indicando que o progresso
baseado somente em avaliações fenotípicas é provavelmente baixo.
Chaerani e Voorrips (2006) sugerem que a seleção assistida por
marcadores seria potencialmente útil em acelerar a transferência de genes de
resistência à pinta preta em novos cultivares de tomateiro.
12
Quadro 1. Fontes genéticas de resistência à pinta preta, podridão de colo e
lesão da haste (Adaptado de Chaerani & Voorrips, 2006)
Fonte original
Linhagem
resistente ou
variedade
Testes
usados
para
confirmar
resistência
Referências
Resistência à pinta preta
Solanum iycopersicum (sin. Lycopersicon
esculentum)
a
Fonte desconhecida C1943 C Barksdale 1971
68B134 71B2 C Barksdale 1969
sin. Lycopersicon esculentum f. sp.
cerasiforme
b
PI 406758
- C Martin e Hepperly 1987
C1943 NC NBR-2 C,CV Gardner 1988
Acessos desconhecidos HRC90.145,
HRC90.158,
HRC90.159
CV Poysa e Tu 1996
NC EBR-1 NC EBR-4 C Gardner e Shoemaker 1999
NC EBR-1 IHR1816 C Thirthamallappa e
Lohithaswa 2000
NC EBR-1 e -2 NC EBR-3 C Gardner e Shoemaker 1999
NC EBR-3 e -4 Mountain Supreme C Gardner e Shoemaker 1999
NC EBR-5 e -6 Plum Dandy C Gardner 2000
71B2 NC EBR-5 C Gardner 2000
71B2 NC EBR-6 C Gardner 2000
Solanum habrochaites (sin. Lycopersicon
hirsutum)
a
PI 127827 - L Locke 1949
PI 390514, PI 390662 - C Martin e Hepperly 1987
PI 126445 NC EBR-1 C Gardner 1988
PI 1390662 87B187 C Maiero et al. 1990ª
B 6013 H-7, H-22, H-25 C Kallo e Banerjee 1993
Acessos desconhecidos HRC90.303,
HRC91.279,
HRC91.341
CV Poysa e Tu 1996
LA2100, LA 2124, LA2204 - CV Poysa e Tu 1996
PI 126445 NC39E C Foolad et al. 2002
Solanum peruvianum (sin. Lycopersicon
peruvianum)
a
PE 33 - CV Poysa e Tu 1996
Solanum pimpinellifolium (sin. Lycopersicon
pimpinellifolium)
a
PI 365912, PI 390519 - C Martin e Hepperly 1987
A 1921 P-1 C Kallo e Banerjee 1993
L4394 (IHR1939) - C Thirthamallappa e
Lohithaswa 2000
Resistência à podridão de colo
Fonte desconhecida Devon Surprise C Reynard e Andrus 1945
Fonte desconhecida C1943 CV Maiero et al. 1990b
Solanum pimpinellifolium (sin. Lycopersicon
racemigerum)
b
87610005
- ? Stancheva et al. 1991
Solanum liycopersicum (sin. Lycopersicon
humbodltii)
b
87610003
- ? Stancheva et al. 1991
Solanum chilense (sin. Lycopersicon chilense)
b
87610011
- ? Stancheva et al. 1991
Resistência à lesão da haste
Solanum liycopersicum 83602029 ? Stancheva et al. 1991
Solanum cheesmaniae (sin. Lycopersicon
cheesmanii f. typicum)
b
15
? Stancheva et al. 1991
Solanum neorickii (sin. Lycopersicon minutum)
b
87610006
? Stancheva et al. 1991
C, Campo; CV casa de vegetação; L, laboratório
a
Peralta; Knapp, Spooner (2005)
b
Peralta, Knapp e Spooner (comunicação pessoal aos autores)
13
É possível identificar fontes de resistência em avaliações a campo,
mas a duração dos ensaios, a impossibilidade de controlar as condições
ambientais necessárias para a infecção e a presença de outros patógenos
foliares são as maiores desvantagens desse tipo de teste (LOCKE, 1948;
FOOLAD et al. 2000; PANDEY et al. 2003). No campo, a severidade da pinta
preta é avaliada em termos de porcentagem de desfolha e de porcentagem de
área foliar necrosada na planta. Devido ao fato de os sintomas nas folhas
superiores corresponderem a menos de 2% do dano total, a avaliação do dano
se concentra na parte média ou inferior da folhagem. Christ (1991) propôs a
porcentagem de área necrótica no terço médio como boa estimativa da
severidade de pinta preta. As epidemias de pinta preta progridem lentamente
no início, mas aceleram quando as plantas amadurecem, resultando em uma
curva de progresso da doença tipicamente sigmoide (NASH & GARDNER
1988b).
Ocasionalmente a curva é bimodal devido à emergência de novas
folhas sadias após o primeiro ciclo de infecção. Uma única avaliação pode
subestimar ou superestimar o nível de resistência de um hospedeiro em
particular, e por isso as avaliações de campo devem estar baseadas em várias
observações, as quais são usadas para construir a curva de progresso da
doença. A curva de progresso da doença integra os efeitos do hospedeiro, do
patógeno e das condições ambientais que ocorrem durante a epidemia
(PANDEY et al., 2003).
Ensaios em casa de vegetação ou em câmaras de crescimento
oferecem condições ambientais mais uniformes, favoráveis e repetíveis, além
de permitirem vários ciclos de avaliações por ano, determinando resultados
mais confiáveis. Além disso, os resultados obtidos em condições controladas
apresentam boa correspondência com os resultados de campo (FOOLAD et al.,
2000). Os métodos de “screening” usados atualmente em condições de casa
de vegetação estão baseados no método estabelecido por Barksdale (1969).
Geralmente, as plantas são inoculadas através de pulverização quando
apresentam 4 a 6 semanas de idade e mantidas em condições 100% de
umidade relativa (UR) nas primeiras 24 h, seguido de períodos noturnos de 12-
16 h a 100% de UR por 5-7 dias (CHAERANI et al., 2007). A severidade da
pinta preta é avaliada aos 7 dias pós-inoculação através da estimação da
14
porcentagem de área necrosada nas folhas que já estavam presentes no
momento da inoculação. No caso de baixa incidência de manchas necróticas, a
severidade da pinta preta pode ser expressa como o número de lesões
(BARKSDALE, 1969).
As lesões de pinta preta que resultam da uma inoculação por
pulverização estão espalhadas sobre as folhas, o que requer que o avaliador
estime a área combinada de todas as lesões em todos os folíolos e a resuma
em uma porcentagem da área foliar total. Essas leituras de doença, embora
rápidas, apresentam altos níveis de subjetividade, além de não serem
suficientemente sensitivas para discriminar plantas moderadamente resistentes
das suscetíveis (GARDNER, 1990). Testes usando folíolos destacados para
avaliar resistência à pinta preta não se correlacionaram bem com os testes
feitos em casa de vegetação ou a campo, o que poderia indicar que a planta
inteira é requerida para a expressão da resistência (FOOLAD et al., 2000;
CHAERANI et al., 2007).
A severidade da doença pode ser determinada de forma mais precisa e
objetiva através da medição das lesões quando o inóculo é aplicado como
gotas isoladas nos folíolos (NASH & GARDNER, 1988b; CHAERANI et al.,
2007). Esse método foi introduzido primeiramente por Locke (1948) para
encontrar fontes de resistência à pinta preta (LOCKE, 1949). Nash & Gardner
(1988a) aplicaram esse método em um ensaio de plantas inteiras medindo o
diâmetro da lesão. A resistência à pinta preta de três parentais e da F1
resultante foi testada em casa de vegetação e os resultados se
correlacionaram bem com testes a campo. Chaerani et al. (2007) realizaram
um “screening” de um grande número de acessos de uma coleção de
tomateiros com o objetivo de identificar fontes potenciais de resistência à pinta
preta usando o método de inoculação de gota e a inoculação por pulverização.
Seus resultados indicaram que o método de gota é simples de aplicar, oferece
uma leitura objetiva da severidade da pinta preta e uma melhor caracterização
dos acessos. Algumas das discrepâncias encontradas entre os resultados dos
métodos foram explicadas devido a dois fatores principais. Um é de que
algumas espécies de tomateiro selvagens desenvolveram necroses em
condições de casa de vegetação muitas vezes indistinguíveis das lesões de
pinta preta quando a inoculação era feita por pulverização, enquanto que
15
quando a inoculação era feita por gota, as lesões foram facilmente
reconhecidas. O segundo fator foi a queda de folhas que ocorreu devido a
lesões no pecíolo da folha, levando a leituras erradas de grandes lesões no
caso de inoculação por pulverização.
3. Mecanismos de defesa das plantas
A resistência de um hospedeiro a um patógeno pode ser definida como
a capacidade da planta em atrasar ou em evitar a entrada e a subsequente
atividade de um patógeno em seus tecidos (PASCHOLATI & LEITE, 1995). Os
mecanismos de resistência das plantas são divididos em duas categorias: pré-
formados (presentes nas plantas antes do contato com o patógeno) e pós-
formados (produzidos ou ativados em resposta à presença do patógeno). Cada
grupo de mecanismos compreende, por exemplo (RESENDE & MACHADO,
2000; PASCHOLATI & LEITE, 1995; LO & NICHOLSON, 2008):
a) Pré-formados (passivos, constitutivos): estruturais (cutícula, tricomas,
estômatos, fibras/vasos condutores) e bioquímicos (fenóis, alcaloides
glicosídeos, lactonas, glicosídeos fenólicos e cianogênicos, inibidores
protéicos, fototoxinas).
b) Pós-formados (ativos, induzíveis): geração de espécies reativas de
oxigênio (EROs), reforço de paredes celulares (papilas, halos, lignificação),
síntese de proteínas relacionadas à patogênese (PR proteínas), e acúmulo de
fitoalexinas.
3.1 Mecanismos de defesa pré-formados
Análises ultraestruturais das respostas celulares nos hospedeiros
resistentes durante as interações fungo-planta têm revelado múltiplos
mecanismos de defesa para evitar o desenvolvimento das doenças (PARK &
IKEDA, 2008).
As camadas celulares cuticulares e camadas de cera epicuticulares são
consideradas como o primeiro mecanismo de defesa contra os patógenos. A
presença de cera aumentaria a hidrofobicidade da superfície foliar, resultando
em uma folha mais seca que limitaria a germinação de conídios e a formação
16
de tubos germinativos, diminuindo por tanto a incidência de doença (FOOLAD;
MERK; ASHRAFI, 2008).
Os efeitos de folhas cerosas têm sido reportados em várias interações
de Alternaria sp e Brassicas. No patossistema A. brassicae-canola, a maior
quantidade de cera na camada epicuticular presente em alguns cultivares
determinou menor germinação de conídios e menor número de tubos
germinativos produzidos (CONN & TEWARI, 1989). No patossistema A.
brassicae/A. brassicicola – couveflor, as cultivares que foram resistentes frente
ao patógeno apresentaram maior deposição de cera epicuticular nas suas
folhas (SHARMA et al., 1991). Os mecanismos de resistência em canola e
mostarda frente à mancha de Alternaria (causada por A. brassicae, A.
brassicicola, A. raphani e A. alternata) foram identificados como presença de
cera epicuticular e componentes bioquímicos pré-existentes ou de rápido
acúmulo como fenóis, flavonoides e orto-dihidroxi fenóis (SAHARAN &
NARESH MEHTA SANGWAN, 2003).
Tratamentos de calor que resultaram na remoção parcial da camada
cerosa natural do fruto de tomate e condições de congelamento aumentaram a
suscetibilidade dos frutos à infecção de A. alternata (BARKAI-GOLAN &
KOPELIOVITCH, 1989). Os autores destacam que a habilidade do patógeno
em penetrar o pericarpo tem um papel primordial na resistência dos genótipos
de tomateiros à infecção.
Estudos realizados por El-Farnawany (2006) com as cultivares de
tomateiro Castle rock, Strain-B e Super strain indicaram que os diferentes
níveis de suscetibilidade à pinta preta podem estar relacionados a
características estruturais e à composição da superfície foliar. O autor sugere
que a menor densidade estomatal e o conteúdo de cera maior da cv. Castle
rock, em comparação com os outros cultivares explicaria, pelo menos em parte,
sua maior resistência à pinta preta.
Propágulos de fungos que tenham atingido com sucesso a superfície
da folha de uma planta (filoplano) competirão com outros organismos que estão
vivendo ali (filosfera) (LEITE & STANGARLIN, 2008). Vários estudos têm
demonstrado que certos microrganismos presentes na superfície foliar
interferem no crescimento das hifas de fungos fitopatogênicos. Bactérias
isoladas a partir de folhas, coroa e raízes de girassol inibiram o crescimento in
17
vitro de patógenos causadores da mancha de Alternária (A. helianthi), de
murcha (Sclerotium [Corticium] rolfsii) e podridões radiculares (Rhizoctonia
solani e Macrophomina phaseolina). As bactérias antagonistas isoladas do
filoplano foram principalmente actinomicetes e bactérias Gram positivas,
enquanto que as isoladas da coroa e raízes foram identificadas como
Pseudomonas fluorescens-putida, P. maltophilia, P. cepacia, Flavobacterium
odoratum e Bacillus sp (HEBBAR et al., 1991).
A estirpe SON-17 da actinobactéria Nocardioides thermolilacinus,
isolada originalmente da rizosfera de plantas de tomateiro, demonstrou
potencial como agente de biocontrole de pinta preta reduzindo
significativamente a severidade da doença quando pulverizada na parte aérea
de tomateiros em experimentos em casa de vegetação e ensaios de campo. O
único mecanismo inibitório de Nocardioides thermolilacinus testado no trabalho
foi a inibição in vitro da germinação dos conídios de A. solani. O porcentual de
germinação dos conídios em água foi de 65,66% e de 6,66% na presença de
propágulos do antagonista, porcentual estatisticamente igual ao do fungicida
clorotanil (3,0%) (CARRER FILHO; ROMEIRO; GARCIA, 2008).
A epiderme de alguns vegetais apresenta “pelos”, denominados
genericamente tricomas, que, estruturalmente, são extensões da epiderme. Os
tricomas podem ser unicelulares ou pluricelulares e alguns, chamados de
tricomas glandulares, podem produzir exsudatos de composição variada. Esses
exsudatos repelem ácaros e insetos e podem inibir a germinação de esporos
fúngicos e a multiplicação de bactérias (LEITE & STANGARLIN, 2008).
Em algumas espécies selvagens de tomateiro observou-se que os
tricomas glandulares (tipo I, IV e VI) das folhas sintetizam vários fitoquímicos
tóxicos para alguns insetos praga da cultura de tomate. Entre eles, metil-
ketonas, a partir dos exsudatos dos tricomas tipo VI de S. habrochaites, tóxico
a larvas de Manduca sexta; acilglucoses sintetizados em tricomas tipo IV de S.
pennelli, tóxicas a larvas de H. zea e S. exigua e para o áfideo da batata
Macrosiphum euphorbiae (FRELICHOWSKI & JUVIK, 2001). Os tricomas
glandulares tipo VI são particularmente abundantes nas folhas e hastes do
tomateiro cultivado Solanum lycopersicum e Solanum habrochaites. No
entanto, os tricomas de S. lycopersicum acumulam monoterpenos e os de S.
habrochaites, altos níveis de sesquiterpenos, na maioria em forma de
18
derivativos de ácido carboxílico com atividade inseticida (GIANFAGNA;
CARTER; SACALIS, 1992; BESSER et al., 2009).
Em S. pennellii, os tricomas glandulares tipo IV exsudam acilglucoses
que contêm frações hidrofílicas e hidrofóbicas que ajudam a reter a umidade e
contribuem à sobrevivência em condições de seca extrema, característica da
região dos Andes peruanos, onde é nativa essa espécie. Nomomura et al.
(2009) descobriram que, em tratamentos artificiais de umidade em névoa de 30
s de duração, o exsudato condensava a umidade formando gotas de água no
ápice dos tricomas, sendo depois absorvida pela planta através do tricoma.
Tratamentos mais longos (40 s) causaram o deslizamento das gotas
localizadas nos ápices dos tricomas até a superfície foliar. Devido à
característica anfipática dos exsudatos, as gotas formaram uma camada fina
na superfície foliar. Os autores verificaram que esses exsudatos formaram uma
barreira química, mostrando ter atividade antifúngica frente a Oidium
neolycopersici através da supressão da germinação conidial. Embora S.
pennellii seja suscetível ao oídio, o mecanismo de condensação de água dos
exsudatos dos tricomas tipo IV pode contribuir à supressão da infecção por O.
neolycopersici.
É necessária maior investigação das substâncias exsudadas pelos
tricomas de espécies selvagens de tomateiro, para determinar o potencial
dessas substâncias na toxicidade frente a patógenos. A introdução de
características como densidade de tricomas e taxa de produção de compostos,
desde espécies selvagens para o tomateiro cultivado, já é uma alternativa em
alguns programas de melhoramento de tomate (GOFFREDA et al., 1989;
NOMOMURA et al., 2009).
3.2 Mecanismos de defesa pós-formados
3.2.1 Espécies reativas de oxigênio
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são moléculas reduzidas,
transitórias e altamente reativas, produzidas no caminho metabólico de
transformação do oxigênio molecular (O
2
) a água (H
2
O) (BAKER & ORLANDI,
1995). As seguintes espécies reativas de oxigênio podem ser geradas
19
(HEISER & OßWALD, 2008): oxigênio singlete (singlet oxygen) (
1
O
2
), radical
superóxido (O
2
.-
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), radical hidroxil (OH
•
) (Figura
1).
Figura 1. Interconversão de espécies reativas de oxigênio (EROs) derivadas
do oxigênio molecular (O2). O estado fundamental do oxigênio molecular (O2)
pode ser ativado por um excesso de energia, invertendo o giro de um dos
elétrons não pareados para formar o oxigênio singlete (1O2). Alternativamente,
a redução de um elétron leva à formação do radical superóxido (O2.-). O2.-
existe em equilíbrio com seu ácido conjugado, o radical hidroperoxil (HO2●).
Reduções sucessivas formam peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxil
(OH•), e água (H2O). Ions metálicos que estão principalmente presentes nas
células na forma oxidada (Fe3+) são reduzidos na presença do O2.- e,
consequentemente, podem catalisar a conversão de H2O2 a OH• pela reação
de Fenton ou Haber–Weiss (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002).
Inicialmente, a cadeia de reações necessita de uma entrada de
energia, enquanto os passos posteriores são exotérmicos e podem ocorrer
espontaneamente, sejam catalisados ou não. A aceitação de um excesso de
energia pelo oxigênio molecular inverte o giro de um dos elétrons não pareados
para formar oxigênio singlete (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002). A
partir da adição de um simples elétron, o oxigênio molecular é convertido ao
radical superóxido (O
2
.-
), um processo mediado, provavelmente, por
peroxidases ou NAD(P)H oxidases associadas à membrana, ou mesmo por
lipoxigenases a partir de ácidos graxos e O
2
(MEHDY, 1994). O O
2
.-
é
moderadamente reativo, tem vida curta (vida-média 2-4 µs), e não atravessa
reação de
Fenton/
Haber-Weiss
20
membranas biológicas (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002). O O
2
.-
existe em
equilíbrio com seu ácido conjugado, radical hidroperoxil (HO
2
●
) . Os
radicais hidroperoxil que são formados pela protonação do O
2
.-
em soluções
aquosas podem atravessar membranas celulares e subtrair átomos de
hidrogênio dos ácido graxos poli-insaturados e dos hidroperóxidos lipídicos,
iniciando a auto-oxidação lipídica (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989).
O superóxido formado pode ser "dismutado" e regenerar O
2
e peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
), o que pode ocorrer espontaneamente em pH neutro ou
pela ação da enzima superóxido dismutase (SOD). Alternativamente, o O
2
.-
reduz quinonas e complexos de Fe
3+
e Cu
2+
, o que afeta enzimas que contêm
metais. O H
2
O
2
formado pode sofrer diferentes transformações: reduzido ao
radical hidroxil (OH
•
); convertido a H
2
O e O
2
pela ação da catalase; convertido
a H
2
O pela oxidação de moléculas substratos, como ascorbato, via peroxidases
(WOJTASZEK, 1997; HEISER, I.; OßWALD, W.F.; ELSTNER, 1998). O H
2
O
2
é
moderadamente reativo e tem uma vida relativamente longa (vida-média de 1
ms) podendo difundir alguma distância desde seu local de produção. O H
2
O
2
pode
inativar enzimas ao oxidar seus grupos tiol, por exemplo Cu/Zn SOD e
enzimas do ciclo de Calvin (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002).
A mais reativa de todas as EROs é o radical hidroxil que é formado a
partir do H
2
O
2
pela chamada reação de Haber-Weiss ou Fenton usando metais
como catalizadores (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989). O OH
•
pode reagir
potencialmente com todas as moléculas biológicas e como as células não têm
mecanismos enzimáticos para eliminá-lo, sua produção em excesso leva à
morte celular. Moller (2001) indica três mecanismos principais pelos quais o
OH
•
danifica as células: reagindo com proteínas e, portanto, reduzindo a
atividade enzimática, reagindo com lipídios aumentando a permeabilidade das
membranas e reagindo com DNA causando mutações.
Espécies reativas de oxigênio podem se acumular rapidamente no
início do processo infeccioso em ambas as interações patógeno-hospedeiro
compatíveis ou incompatíveis, em um processo conhecido como explosão
oxidativa (LAMB et al., 1989). A explosão oxidativa tem sido verificada em
reações de hipersensibilidade em resposta a infecção por fungos (VERA-
ESTRELLA; BLUMWALD; HIGGINS, 1993) e bactérias (BAKER et al., 1993).
21
Podemos diferenciar artificialmente três fases na produção de EROs
durante a interação planta-patógeno. Na fase I, ocorre o reconhecimento dos
elicitores provenientes do patógeno (carboidratos, proteínas ou porções de
glicoproteínas), o que dispara os eventos de transdução de sinais. Durante a
fase II são iniciados vários processos relacionados à defesa resultante do
reconhecimento ocorrido na fase I, onde se incluem aumento de antioxidantes,
ação de lipoxigenases, a HR, produção de fitoalexinas, lignificação e
resistência sistêmica adquirida (SAR). A fase III compreende o processo de
evolução da patogênese levando ao desenvolvimento de sintomas visíveis. Na
natureza, dependendo das interações, ocorrerá uma sobreposição dos eventos
fisiológicos (BAKER & ORLANDI, 1995).
Em células vegetais, têm sido encontradas duas fases de indução de
EROs por elicitores fúngicos e bacterianos. A fase I é uma resposta muito
rápida (poucos minutos), que possivelmente envolve uma interação elicitor-
receptor, e que nem sempre está correlacionada com a resistência à doença,
pois pode também ocorrer em interações compatíveis. Na fase II ocorre uma
explosão mais forte e prolongada, que está diretamente correlacionada com a
resistência da planta ao patógeno, provocando a morte localizada de células
(resposta de hipersensibilidade), sendo características de interações
incompatíveis (BAKER & ORLANDI, 1995; LAMB & DIXON, 1997).
A rápida geração e acúmulo de espécies reativas de oxigênio,
desencadeadas pela explosão oxidativa após a percepção dos sinais de
avirulência do patógeno atua em diferentes funções de defesa. Dentre as
várias funções das EROs na defesa vegetal, podemos citar o efeito tóxico
direto de H
2
O
2
ao patógeno, agindo como um agente antifúngico e
antibacteriano (MEDHY et al., 1996). O H
2
O
2
participa do cruzamento oxidativo
(“cross-linking”) de proteínas da parede celular formando, com a matriz de
polissacarídeos, um grande polímero de várias glicoproteínas ricas em
hidroxiprolina, reforçando estruturalmente a parede celular. O H
2
O
2
também
atua como importante substrato das peroxidases e, por conseguinte, favorece o
processo de lignificação, com formação de precursores de polímeros de lignina,
via atividade da peroxidase (ALVAREZ et al., 1998). Por último, esses autores
também reportam o papel do H
2
O
2
na sinalização para respostas de defesa da
planta frente ao ataque do patógeno, por causa da sua vida relativamente
22
longa e a capacidade de atravessar membranas biológicas, o que acontece
como consequência de não possuir elétron pareado (Figura 2).
Assim, após o reconhecimento de um patógeno avirulento, ocorre uma
explosão oxidativa que gera O
2
.-
e H
2
O
2
e essas EROs induzem genes de
defesa e morte celular localizada (HR). O H
2
O
2
aumenta a atividade da enzima
ácido benzóico 2-hidrolase, requerida para a biossíntese do ácido salicílico,
potente sinalizador para ocorrência da resistência sistêmica adquirida (SAR)
(RESENDE; SALGADO; CHAVEZ, 2003; MARTINEZ et al., 2000).
Figura 2. Interconexões do H
2
O
2
, óxido nítrico (NO) e ácido salicílico (AS) para
a ativação e coordenação das múltiplas reações de defesa das plantas
(adaptado de Hammond-Kosack & Jones, 2000). SOD (superóxido dismutase),
SAGase (AS glicosiltransferase) e BA-2H (ácido benzóico 2-hidrolase).
23
A explosão oxidativa é necessária, mas não suficiente para disparar a
morte celular. Delledonne (2005) indica que a reação de hipersensibilidade
(HR) está caracterizada pelo rápido acúmulo de EROs e óxido nítrico (NO).
Segundo esse autor, as EROs e o NO constituem um sistema de sinalização
que desencadeia morte celular localizada, indução de genes de defesa e são
mediadores da rede envolvida no estabelecimento da SAR (Figura 3). O NO
também teria um papel importante como sinal intracelular que funciona na
propagação célula a célula da HR.
Figura 3. Representação da sinalização do NO durante a reação de
hipersensibilidade (HR) (traduzido a partir de Delledone, 2005). AC, ácido
cinâmico; Ca2+, fluxo de cálcio; ADPRc, ADP ribose cíclica; Cat, catalase;
C4H, ácido cinâmico-4-hidroxilase; CHS, chalcone sintetase; GMPc, GMP
cíclico; GPX, glutationa peroxidase; GSNO, S-nitroso-L-glutationa; GST,
glutationa S-transferase; NOS, óxido nítrico sintetase; ONOO-, peroxinitrito;
FAL, fenilalanina amônia-liase; FA, fenilalanina; PR, proteínas relacionadas à
patogênese; AS, ácido salicílico; SOD, superóxido dismutase.
24
Vranová, Inzé e Van Breusegem (2002) sumarizam as fontes que
geram EROs em plantas. Sob condições de estresse ambiental que limitam a
fixação de CO
2
, a regeneração do NADP
+
pelo ciclo de Calvin é reduzida e,
consequentemente, a cadeia de transporte eletrônico sofre super-redução,
formando radicais superóxido e oxigênio singlete. As NAD(P)H oxidases
associadas à membrana que liberam O
2
.-
a partir de oxigênio molecular,
constituem uma fonte importante de radical superóxido. A NADPH oxidase, as
peroxidases de parede celular, oxalato oxidases e amino oxidases têm sido
propostas como fontes de H
2
O
2
no apoplasto.
As EROs ocorrem normalmente no metabolismo celular, porém,
quando acumuladas, tornam-se tóxicas à célula, principalmente quando se
convertem em espécies muito mais reativas como o radical hidroxil (OH
-
).
Devido aos danos causados pelo acúmulo de EROs, as plantas utilizam
sistemas enzimáticos e não enzimáticos para prevenir o dano nos
componentes celulares do hospedeiro.
A enzima ascorbato peroxidase junto com glutationa redutase e
dehidroascorbato redutase, pertencem a um mecanismo de detoxificação de
H
2
O
2
conhecido como via ascorbato-GSH (ou via Halliwell-Asada)
(TOMÁNKOVÁ et al., 2006). A catalase (CAT) catalisa a reação de degradação
do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, reduzindo, dessa forma, o
excesso de EROs durante o estresse oxidativo. A superóxido dismutase (SOD)
catalisa a dismutação do O
2
.-
a H
2
O
2
. Além de gerar H
2
O
2
, as peroxidases
também são capazes de reduzir seu nível através de polimerização de álcoois
hidroxicinamil durante a biossíntese da lignina e suberina, de processos como
a ligação cruzada das proteínas de parede celular e de pectinas através de
pontes diferúlicos (TOMÁNKOVÁ et al., 2006; MLÍČKOVÁ et al., 2004).
Sistemas antioxidativos não enzimáticos, tais como glutationa, ascorbato
(BAKER & ORLANDI, 1995), tocoferol e compostos fenólicos: fenilpropanoides,
carotenoides e flavonoides previnem o dano dos componentes celulares pelas
EROs (SEDLAROVÁ et al., 2007).
A detecção e a quantificação de EROs em sistemas biológicos é
particularmente difícil devido à rápida destruição e detoxificação (“scavenging”)
desses radicais por mecanismos antioxidantes celulares. Além disso, as EROs
são difíceis de serem detectadas diretamente por métodos
25
espectrofotométricos ou HPLC. Por isso, a maioria das técnicas de detecção
baseia-se na oxidação ou na redução de certos compostos pelas EROs
(RESENDE; SALGADO; CHAVEZ, 2003). Alguns métodos de detecção de
EROs em plantas podem ser: macroscópico/microscópico (com nitroblue
tetrazólio, amido/iodeto de potássio e cloreto de titânio); espectrofotométrico
(com nitroblue tetrazólio, citocromo C e epinefrina); fluorescente (com piranina
e escopoletina) e quimioluminescente (com luminol e luciginina) (BAKER &
ORLANDI, 1995).
3.2.2 Resposta de hipersensibilidade
O termo hipersensibilidade foi usado por primeira vez por Stakman
(1915), para descrever a morte rápida e localizada das células no sítio de
infecção, induzida pelo fungo da ferrugem em plantas de cereais resistentes ao
patógeno. Usualmente, a resposta de hipersensibilidade (HR) é definida como
a morte rápida de células da planta associada com a restrição do crescimento
do patógeno (GOODMAN & NOVACKY, 1994). A HR é geralmente
reconhecida pela presença de células mortas, de cor marrom, no sítio de
infecção e, dependendo do patógeno, o número de células envolvidas pode
variar de uma a várias. A HR pode estar restringida ou não à célula invadida ou
em contacto direto com patógeno (HEATH, 2000). A necrose do tecido afetado
é diretamente relacionada ao acúmulo, oxidação e polimerização de fenóis
(NICHOLSON; HIPSKIND; HANAU, 1989).
Após a primeira publicação sobre HR, várias mudanças morfológicas,
fisiológicas e moleculares foram identificadas como coincidentes com a rápida
morte celular determinada pela HR. A produção de fitoalexinas, de enzimas
hidrolíticas, de proteínas relacionadas à patogênese, de inibidores de protease
e a deposição de lignina e calose em paredes celulares da planta, têm sido
propostos como contribuintes individuais ou em conjunto à resistência a
doenças. No entanto, já que muitas dessas respostas, incluindo a morte celular
por HR, são induzidas simultaneamente durante o ataque do patógeno, fica
difícil determinar como cada uma contribui na resistência à doença (RICHAEL
& GILCHRIST, 1999).
26
Para patógenos biotróficos, que requerem uma célula viva para se
alimentar, a morte celular da planta no local de infecção (resposta de
hipersensibilidade) é um mecanismo efetivo de resistência à doença. Para
patógenos necrotróficos, com capacidade de utilizar células mortas como
substrato, a morte celular por si só não restringe, no entanto, o crescimento do
patógeno. Essa restrição é atribuída às várias repostas de defesa induzidas
que ocorrem tipicamente nas células que estão morrendo e nas células vivas
vizinhas. Para autores como Heath (2000) e Richael & Gilchrist (1999), a HR
inclui, portanto, tanto a morte celular quanto a expressão de genes de defesa.
É importante ressaltar que a resistência a doenças e todas as respostas de
defesa induzíveis comumente associadas com HR podem ocorrer em plantas
na ausência de morte celular. Além disso, os patógenos podem também causar
morte celular e disparar respostas de defesa enquanto crescem com sucesso
em tecidos suscetíveis (HEATH, 2000). Heath (2000) sugere que a razão pela
qual a morte celular esteja consistentemente associada com resistência a
doenças está relacionada ao fato de que essa morte celular localizada causada
por elicitores de patógenos libera sinais (elicitores endógenos) que causam
respostas defensivas nas células circundantes.
É amplamente aceito que as EROs provocariam ou executariam a HR.
Desde o descobrimento da explosão oxidativa, a geração de EROs é
observada em suspensões de células em resposta a bactérias incompatíveis
(BAKER & ORLANDI, 1995) ou a patógenos oomicetes (NATON;
HAHLBROCK; SCHMELZER et al., 1996), assim como frente a elicitores
inespecíficos (LAMB & DXON, 1997) e específicos (HIGGINS et al., 1998) e
perturbações mecânicas das células (GUS-MAYER et al., 1998). Alguns
estudos, no entanto, não sustentam o papel das EROs na indução da HR
(HEATH, 2000). Estudos citológicos da interação cevada-oídio sugerem que as
EROs, embora presentes, não são um requerimento para a elicitação de HR
(HÜCKELHOVEN & KOGEL, 1998). Em estudos equivalentes no patossistema
feijão caupi-ferrugem não foi detectada geração de EROs prévia ao início de
morte celular por HR (HEATH, 1998). O papel variável das EROs como
provocador da HR pode ser explicado também pelo fato de que os
detoxificadores (“scavengers”) de ROS podem inibir a morte celular induzida
por elicitores em algumas situações (LAMB & DIXON, 1997), mas não em
27
outras (YANO; SUZUKI; SHINSHI, 1999). Estudos que examinaram os efeitos
de detoxificadores de EROs na HR induzida por patógenos revelaram que eles
podem inibir a HR induzida por vírus (KATO & MISAWA, 1976) ou por bactérias
(KEPPLER & NOVACKY, 1987), mas não a HR causada por fungos em
hospedeiros resistentes (HEATH, 1998).
Em conjunto, esses dados sugerem que o papel das EROs na indução
de morte celular por HR pode diferir em diferentes combinações planta-
patógeno (HEATH , 2000).
3.2.3 Papilas
A parede celular da planta representa uma barreira física à entrada de
patógenos em potencial, sendo composta principalmente por celulose,
hemicelulose e pectina. Proteínas estruturais, como as glicoproteínas ricas em
hidroxiprolina, assim como materiais fenólicos, também são importantes
componentes da parede celular e podem ter importantes papéis na contenção
do patógeno e na restrição do aumento da lesão (LO & NICHOLSON, 2008).
A formação de papilas e de justaposições de parede é um tipo de
reforço que ocorre rapidamente na parede celular após a tentativa de invasão
fúngica. As papilas podem se formar após dois ou três minutos ou até horas
após o ataque, na parte interna da parede celular, no local de penetração da
hifa na célula vegetal (ALVES; LEITE; KITAJIMA, 2008). As papilas são
heterogêneas quanto à composição e, embora lignina e calose sejam
tipicamente os maiores componentes das papilas, celulose, proteína, suberina,
gomas, silicone, fenóis simples e quitina também podem estar presentes (LO &
NICHOLSON, 2008). Acredita-se que a função das papilas na defesa frente a
fungos fitopatógenos seja o bloqueio físico da penetração do fungo no interior
do hospedeiro. O papel das papilas na resistência de plantas é, no entanto,
variável nos diferentes sistemas patógeno-hospedeiro (AIST, 1976).
As papilas podem funcionar como mecanismos de resistência em
algumas interações patógeno-hospedeiro, isso podendo ser evidenciado com
uso de inibidores da formação de papilas. Quando coleóptilos de cevada
resistentes a Erysiphe graminis f. sp. hordei foram tratados com 2-deoxi-D-
glucose, a formação de papilas foi inibida, resultando em maior eficiência de
28
penetração dos conídios e maior formação de haustórios (BAYLES;
GHEMAWAT; AIST, 1990). A eficiência da papila como mecanismo de
resistência depende da frequência e da velocidade com que se forma
(VIDHYASAKARAN, 2008).
A formação de papilas e a deposição generalizada de calose não foram
consideradas importantes na ocorrência da resistência em plantas hospedeiras
e não hospedeiras frente a várias espécies de Alternaria, dado que essas
respostas celulares estiveram presentes em locais onde a penetração foi bem
sucedida (Mc ROBERTS & LENNARD, 1996). Araújo e Matsuoka (2004)
sugerem também que a formação de papilas não é uma reação específica à
resistência do tomateiro a A. solani após observarem a ocorrência de papilas e
halos sob apressórios tanto no material resistente (CNPH 417) quanto no
suscetível (cv. ‘Miller’).
3.2.4 Enzimas relacionadas à defesa de plantas
3.2.4.1 Peroxidase (POX) (EC 1.11.1.7)
A enzima peroxidase catalisa a oxirredução entre peróxido de
hidrogênio e vários redutores, estando presente em microrganismos e tecidos
de plantas e animais. POX é uma glicoproteína que contém um grupo heme e,
nas plantas, é codificada por uma família de multigenes. Além de ter um grande
número de isoformas, uma isoforma isolada pode atuar sobre vários substratos
in vitro e também mais de uma isoforma pode atuar sobre o mesmo substrato.
Tem sido demonstrado que várias peroxidases são expressas
constitutivamente em plantas. Algumas das peroxidases são, no entanto,
induzidas durante o estresse causado por patógenos (HIRAGA et al., 2001) e
essas peroxidases são consideradas como proteínas relacionadas a
patogêneses (proteínas - PR) pertencentes à família PR-9 (VIDHYASAKARAN,
2008).
São citadas várias funções das peroxidases na defesa celular. Uma
delas é a participação na lignificação, na suberização e em outros
metabolismos da parede celular. A oxidação desidrogenativa do guaiacol (o-
metoxi-fenol) resulta na formação de radicais fenoxi e a subsequente ligação
29
de radicais instáveis leva à polimerização não enzimática de monômeros. De
forma similar, ácido hidroxicinâmico, hidroxicinamil álcool e seus derivativos
são convertidos em radicais fenoxi. As espécies de hidroxicinamil álcool são
polimerizadas para formar lignina e os ácidos hidroxicinâmicos que contêm
grupos alifáticos são incorporados em suberina (HIRAGA et al., 2001). POXs
também oxidam domínios fenólicos de polissacarídeos ferulicolados
(polissacarídeo ligado a ácido ferúlico) (FRY, 1986) e resíduos de tirosina de
proteínas estruturais da parede celular, como glicoproteínas ricas em
hidroxiprolina. Essas macromoléculas sofrem ligação cruzada formando
moléculas maiores e mais complexas na parede celular. As macromoléculas
polimerizadas pelas POXs da parede celular são depositadas na superfície
extracelular, fortalecendo a parede celular, restringindo a invasão por
patógenos e restringindo a expansão celular, contribuindo ao enrijecimento do
corpo da planta (HIRAGA et al., 2001).
A expressão das POXs também está correlacionada com a ocorrência
de infecção por patógenos. Quando sofrem ataque de patógenos, as plantas
sintetizam um conjunto de proteínas relacionadas à defesa (proteínas PR)
(VAN LOON et al., 1994). Existem relatos de que as POX são induzidas em
infecções de plantas por fungos (THORDAL-CHRISTENSEN et al., 1992), por
bactérias (RASMUSSEN et al., 1995), por vírus (HIRAGA et al., 2000) e por
viroides (VERA; TORNERO; CONEJERO, 1993). O papel delas no processo de
defesa é: reforçar a parede celular através da formação de lignina, de suberina,
de polissacarídeos ferulicolados e de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina
(FRY, 1986); o aumento na produção de EROs que atuam como mediadores
na sinalização; agir como agentes antimicrobianos (WOJTASZEK, 1997;
KAWANO & MUTO, 2000); e induzir a produção de fitoalexinas (KRISTENSEN;
BLOCH; RASMUSSEN, 1999).
Sedlářová et al. (2007), em um estudo da localização e metabolismo de
EROs em plantas de alface resistentes e suscetíveis a Bremia lactucae,
descreveram aumentos da quantidade de H
2
O
2
junto com aumento de atividade
de enzimas que detoxificam peróxido de hidrogênio (POX e CAT) nos
genótipos resistentes após inoculação com esse oomiceto. Mlíčcková et al.
(2004) e Tománková et al. (2006) analisaram histoquímica e bioquimicamente a
interação de O. neolycopersici e três genótipos de tomate com níveis de
30
resistência diferentes: Solanum habrochaites var. glabratum (LA 2128)
(altamente resistente), S. chmielewskii (LA 2663) (moderadamente resistente) e
S. lycopersicum (cv. ‘Amateur’) (suscetível). Os autores relataram aumentos
importantes na produção de H
2
O
2
, acompanhada de aumentos na atividade da
POX, CAT e ascorbato peroxidase nos genótipos resistentes. Ambos os
trabalhos não registraram mudanças na formação de lignina em nenhum dos
genótipos estudados.
Anjana et al. (2008) registraram a atividade da peroxidase em genótipo
resistente e em um altamente suscetível de girassol frente a Alternaria
helianthi. A atividade da peroxidase foi significativamente maior no genótipo
resistente quando comparado com o suscetível. O papel da peroxidase como
mecanismo de resistência frente à doença foi testado com tratamento com
inibidores (azida de sódio e metabisulfito de sódio). O tratamento com esses
inibidores diminuiu a atividade da peroxidase constitutiva, assim como a
peroxidase induzida pelo patógeno. O pré-tratamento do genótipo resistente
com os inibidores seguido pela inoculação com o patógeno aumentou a
manifestação da doença. Os autores concluem que a peroxidase é uma enzima
importante no sistema de defesa contra o patógeno necrotrófico A. helianthi e
que pode ser usada como um marcador confiável para avaliar resistência em
girassol.
Fernández et al. (1996) estudaram a indução e os padrões
isoenzimáticos da peroxidase de guaiacol em folhas de plantas resistentes e
suscetíveis de tomateiro (S. lycopersicon) inoculadas com A. solani. Eles
verificaram um aumento significativo na atividade da peroxidase nas plantas
inoculadas, em comparação com as plantas sadias. A maior atividade foi
detectada aos sete dias pós-inoculação. Quando comparadas plantas
inoculadas de cultivares resistentes, moderadamente resistentes e suscetíveis,
comprovou-se que os cultivares resistentes apresentaram maior atividade da
enzima, mas não foram observadas diferenças entre seus padrões
isoenzimáticos.
O efeito de filtrados de A. solani sobre a atividade da peroxidase foi
testado em calos e folhas de três cultivares de tomateiro, os quais diferiram no
nível de resistência frente a esse patógeno. Os níveis mais altos de atividade
foram detectados em calos do cultivar resistente às 24 h após inoculação
31
(CAPOTE et al., 2006). Os dados sugerem o envolvimento da peroxidase nas
repostas de defesa do tomateiro frente a A. solani.
3.2.4.2 Catalase (CAT) (EC 1.11.1.6)
As plantas têm a capacidade de lidar com espécies reativas de
oxigênio através de um sistema eficiente de detoxificação. Devido ao fato de
que os radicais hidroxil são muito mais reativos para serem controlados
diretamente, a planta prefere eliminar as formas precursoras menos reativas,
O
2
.-
e H
2
O
2
(VAN BREUSEGEM et al., 2001). A superóxido dismutase tem um
papel importante no sistema antioxidante de defesa, regulando a concentração
celular de O
2
.-
e H
2
O
2
. Já o H
2
O
2
é eliminado por catalases e peroxidases. A
catalase remove a maior parte do H
2
O
2
, enquanto a ascorbato peroxidase pode
detoxificar o H
2
O
2
, que é inacessível para a catalase devido à sua alta
afinidade por H
2
O
2
e à sua presença em vários locais dentro da célula
(SCANDALIOS, 1994; CREISSEN; EDWARDS; MULLINEAUX, 1994).
A catalase é uma enzima tetramérica que contém grupo heme e que
converte o H
2
O
2
em água e oxigênio molecular segundo a seguinte reação:
2H
2
O
2
O
2
+ 2H
2
O
A função principal da catalase é prevenir os efeitos potencialmente
danosos causados por mudanças na homeostase do H
2
O
2
. As catalases são as
principais enzimas que detoxificam H
2
O
2
em plantas, podendo dismutar H
2
O
2
diretamente ou oxidar substratos tais como metanol, etanol, formaldeído e
ácido fórmico (VAN BREUSEGEM et al., 2001). As plantas apresentam
múltiplas isoformas de catalase, as quais estão presentes nos peroxisomas e
nos glioxosomas. Willekens et al. (1994) dividiram as catalases em três
classes: as catalases da classe 1 são mais comuns em tecidos fotossintéticos e
estão envolvidas na remoção de H
2
O
2
produzido na fotorrespiração, as da
classe 2 são produzidas em grande quantidade nos tecidos vasculares e
podem estar relacionadas com lignificação e as da classe 3 são muito
abundantes em sementes e plantas jovens e sua atividade está ligada à
remoção do excesso de H
2
O
2
produzido durante a degradação de ácidos
graxos no ciclo do glioxilato nos glioxisomas. Plantas transgênicas de fumo,
deficientes nos genes Cat1 e Cat2 (que codificam catalase), mostraram que a
32
catalase funcionaria “absorvendo” o H
2
O
2
celular produzido em condições de
estresse. A grande sensibilidade frente ao ozônio e ao estresse salino
observada nas plantas deficientes em catalase demonstrou que o H
2
O
2
que
provém da fotorrespiração é um mediador importante da toxicidade celular
durante condições adversas e que a atividade de catalase é crucial para a
defesa celular contra esse estresse (WILLIKENS et al., 1997).
O foco no estudo de H
2
O
2
como um sinal potencial nas respostas de
defesa das plantas começou com a identificação da catalase como uma
proteína que se ligava ao ácido salicílico (“SA-binding protein”). A catalase foi
então proposta como sendo o receptor que se inativaria após ligação com o
AS. Essa inativação da catalase levaria ao acúmulo de H
2
O
2
, o qual foi
demonstrado que atua como mensageiro secundário na indução de genes
relacionado à patogênese (PR genes) (CHEN; SILVA; KLESSIG, 1993).
Durante a HR – típica em interações planta-patógeno incompatíveis --
uma explosão oxidativa coincide com a indução da morte celular no sítio de
ataque do patógeno. Essa morte celular localizada limita o avanço de
patógenos biotróficos no hospedeiro. O complexo de NADPH oxidase e as
peroxidases de parede celular são considerados como fontes importantes das
EROs da explosão oxidativa (LAMB & DIXON, 1997). Uma diminuição da
atividade de enzimas antioxidantes também pode, no entanto, gerar EROs
durante a HR de várias interações planta-patógeno. Em células de fumo que
desenvolveram HR após a infiltração de um elicitor fúngico, o acúmulo de H
2
O
2
foi correlacionado com a diminuição dos transcriptos dos genes Cat1 e Cat2,
junto com uma redução da atividade total da catalase (DOREY et al., 1998). A
supressão da atividade de detoxificação de H
2
O
2
provavelmente contribui para
o acúmulo de níveis críticos de H
2
O
2
ou mudanças na homeostase do H
2
O
2
, os
quais são necessários para a ativação de um programa de morte celular (VAN
BREUSEGEM et al., 2001).
A atividade da catalase não sofreu alterações em calos de Brassica
napus e B. juncea em meio de cultura adicionado com filtrados de cultura
fúngica de Alternaria brassicae, em contraste com o aumento da atividade das
enzimas polifenoloxidase e peroxidase (DHINGRA & KIRAN NARESH MEHTA
SANGWAN, 2004). Chawla, Gupta e Saharan (2001) também relatam o
aumento da atividade da peroxidase e da polifenoloxidase e a ausência de
33
mudanças na atividade da catalase em cultivares resistentes e suscetíves de B.
juncea inoculados com A. brassica. Os autores sugerem que a catalase não
estaria competindo com a polifenoloxidase pelo substrato e isso permitiria a
oxidação dos fenóis a quinonas, moléculas mais tóxicas e, portanto, mais
importantes na resistência à doença.
Em plantas de cártamo (Carthamus tinctorius) regeneradas via
organogênese e via embriogênese somática a partir de culturas in vitro tratadas
com filtrados de culturas fúngicas (FCF) de Alternaria carthami, foi avaliada a
severidade da doença e a atividade das enzimas antioxidantes peroxidase e
catalase e SOD. O número e comprimento das lesões nas plantas FCF
tolerantes foi menor quando comparadas às plantas controle. A atividade da
peroxidase e SOD foi maior e a atividade da catalase levemente inferior nas
plantas CFC tolerantes regeneradas via organogênese e via embriogênese
somática quando comparadas às plantas controle. Os autores concluíram que
o aumento da atividade da peroxidase e da SOD como resposta à produção de
ROS compensou a baixa atividade da catalase (VIJAYA KUMAR et al., 2008).
3.2.4.3 Polifenoloxidase (PFO) (EC 1.10.3.2)
As polifenoloxidases são enzimas que catalisam a reação de oxidação
de o-difenóis transformando-os em o-diquinonas, constituindo, portanto, uma
atividade de difenolase, embora possam também catalisar a o-hidroxilação de
monofenóis, constituindo atividade de monofenolase (VAUGHN & DUKE,
1984). Na literatura também são denominadas de fenol oxidases, catecolases,
fenolases, catecol oxidases ou tirosinases. A grande maioria das PFO
permanecem inativadas intracelularmente, compartimentalizadas dentro dos
tilacóides nos cloroplastos e separadas dos compostos fenólicos,
compartimentalizados nos vacúolos. Uma pequena parte pode, no entanto,
estar extracelularmente na parede celular (VAUGHN; LAX; DUKE, 1988).
A massa molecular das enzimas é bastante variável e, como as
peroxidases, as polifenoloxidases apresentam grande número de isoformas, o
que conferiria maior importância biológica (MAYER & HAREL, 1979).
Os produtos de oxidação do ácido clorogênico pela PFO – as quinonas
-- podem atuar de várias formas na defesa de plantas frente a patógenos.
34
Primeiro, a reatividade de clorogenoquinona pode limitar o desenvolvimento de
patógenos em sítios de infecção, presumivelmente por acelerar a taxa de morte
celular em células próximas ao local atacado e/ou gerar um ambiente tóxico,
que inibe diretamente o crescimento do patógeno nas células vegetais
(PETER, 1989). A segunda forma seria a habilidade da clorogenoquinona de
realizar reações de adição 1,4 com outros nucleófilos, resultando na
possibilidade de adicionar grupos alquil às proteínas, reduzindo, dessa forma, a
biodisponibilidade de proteínas para os patógenos (DUFFEY & FELTON,
1991
1
; citado por LI & STEFFENS, 2002). A terceira é que a reação da
clorogenoquinona com outros fenóis ocasiona a formação de grande número
de polímeros de condensação, e a reação covalente e o “cross-linking” de
clorogenoquinona com proteínas determina a formação de barreiras fenólicas
polimerizadas na parede celular contra ataques de patógenos (LI &
STEFFENS, 2002). Quarto, a conversão do pool endógeno de fenóis a
quinonas (catalisado pela PFO) também dispara uma complexa série de
reações que podem afetar a resistência das plantas frente a patógenos. A
formação de H
2
O
2
pela oxidação enzimática rápida dos fenóis que ocorre na
infecção por patógenos, além de ativar outras respostas de defesa, pode
impulsionar a oxidação de uma ampla gama de substratos fenólicos através da
ação da peroxidase. Por outro lado, as quinonas podem sofrer desproporção
2
formando radicais semiquinonas, o que resulta na produção de H
2
O
2
(RICHARD-FORGET & GAUILLARD, 1997).
Li e Steffens (2002) testaram plantas transgênicas de tomate que
superexpressavam a atividade de PFO por meio de inoculação com
Pseudomonas syringae pv. tomato. Essas plantas transgênicas oxidaram o
pool de fenóis endógenos em uma taxa muito maior que as plantas-controle e,
quando inoculadas, mostraram menor severidade de sintomas e forte inibição
do crescimento bacteriano. Posteriormente, Thipyapong, Hunt e Steffens
(2004) introduziram um cDNA de PFO antisense em plantas de tomate para
determinar o impacto da PFO na resistência a Pseudomonas syringae pv.
1
DUFFEY, S.; FELTON, G. Enzymatic antinutritive defenses of the tomato plant against insects. In: P.
Hedin (Ed.). Naturally occurring pest bioregulators. American Chemical Society, Washington, DC, p.
166–197, 1991.
2
Desproporção: redução e oxidação simultânea de uma substância que reage consigo mesma e forma
duas moléculas diferentes. Ex. 2C
2
H
4
→C
2
H
6
+C
2
H
2
.
35
tomato. A expressão antisense da PFO aumentou fortemente a
susceptibilidade das plantas tanto na interação compatível quanto na
incompatível, indicando que altos níveis constitutivos de PFO ou a capacidade
de induzir PFO na infecção por patógenos é fundamental em limitar o
desenvolvimento do patógeno.
A atividade das polifenoloxidases pode ser ativada ou inibida em
algumas plantas por estresses como injúrias, “chilling”, toxicidade de nitrogênio
e ataque de patógenos (SÁNCHEZ et al., 2000).
Nojosa et al. (2003) estudaram os níveis de fenóis solúveis totais e a
atividade das enzimas oxidativas polifenoloxidases e peroxidases em tecidos
foliares sadios de clones de cacaueiro resistentes e suscetíveis a Crinipellis
perniciosa. Os níveis de fenóis solúveis totais foram mais elevados em clones
de cacaueiro com resistência a C. perniciosa, podendo contribuir na resposta
de defesa contra o patógeno. A atividade de polifenoloxidases foi menor nos
clones resistentes que nos clones suscetíveis. Os níveis de fenóis e a atividade
das enzimas oxidativas correlacionaram-se de forma inversa na maioria dos
clones estudados, o que pode indicar uma inibição das enzimas peroxidases e
polifenoloxidases pelos compostos fenólicos.
Solórzano et al. (1996) estudaram a indução de PAL e PFO em três
variedades de tomateiro com nível diferente de resistência frente a A. solani
após inoculação com esse patógeno. Foram detectados níveis mais altos de
atividade enzimática de ambas as enzimas nas folhas inoculadas quando
comparadas com as folhas sem inocular. Além disso, essas atividades foram
maiores na variedade resistente (NCEBR-1) que nas susceptíveis (HC 3880 e
Campbell 28). Os autores sugerem uma relação entre a atividade das enzimas
PAL e PFO nos mecanismos de resistência do tomateiro frente a A. solani.
3.2.4.4 Quitinase (QUI) (EC 3.2.1.14) e β-1,3- glucanase (GLU) (EC 3.2.1.6)
Novas proteínas codificadas pelo hospedeiro, referidas como proteínas
relacionadas à patogênese, têm sido detectadas nos tecidos vegetais, não
apenas após o ataque por microrganismos patogênicos ou parasitas, como
também, em resposta ao tratamento com compostos químicos ou outros tipos
de estresse (VAN LOON & VAN STRIEN, 1999). As proteínas PR representam
36
a maior parte da alteração quantitativa das proteínas solúveis que ocorre no
processo de defesa, podendo alcançar, individualmente, até 1% da
concentração das proteínas totais solúveis em folhas (VAN LOON, 1997).
Em 1994, Van Loon e colaboradores propuseram uma nomenclatura
unificada para designação e classificação das PR proteínas em famílias,
baseando-se na similaridade das sequências de aminoácidos, na relação
sorológica e/ou na atividade enzimática ou biológica. Atualmente, as PR
proteínas são classificadas em 17 famílias distintas.
A família PR-2 é constituída de endo β-1,3-glucanases, que
apresentam atividade enzimática in vitro hidrolisando β-1,3-glucanas e são
agrupadas em três classes distintas baseando-se nas sequências de
aminoácidos de suas estruturas primárias. As glucanases da classe I são
proteínas básicas e estão localizadas no vacúolo da célula vegetal,
especialmente na epiderme de folhas inferiores e nas raízes de plantas sadias,
enquanto as das classes II e III incluem, principalmente, as proteínas ácidas
extracelulares (SELITRENNIKOFF, 2001). As PR proteínas presentes nos
vacúolos geralmente exercem um efeito de defesa após a
descompartimentalização das células, enquanto que as PR proteínas
extracelulares atuam diretamente em contato com o patógeno no processo de
penetração do tecido (STICHER; MAUCH-MANI; MÉTRAUX, 1997). A
atividade antifúngica de β-1,3-glucanases provém de sua ação catalítica na
hidrólise do polímero de β-1,3-glucana, componente estrutural da parede
celular de muitos fungos.
A síntese e acúmulo de β-1,3 glucanases em tecidos vegetais têm sido
associados aos mecanismos de defesa de plantas contra doenças. A
expressão diferencial de β-1,3 glucanases em interações compatíveis e
incompatíveis frente a patógenos obrigatórios vem sendo estudada por vários
autores. Em plantas resistentes de melão, trigo e milheto, frente a
Sphaerotheca fusca, Puccinia recondita f. sp. tritici e Sclerospora graminicola,
respectivamente, detectou-se maior atividade de β-1,3 glucanase (RIVERA et
al. 2002; KEMP et al., 1999; KINI et al., 2000), associado com aumentos
precoces na atividade da enzima ou indução diferencial de isoformas.
As famílias PR-3, PR-4, PR-8 e PR-11 estão constituídas por
endoquitinases. A ação antimicrobiana das quitinases baseia-se na capacidade
37
de hidrolisar os polímeros de quitina, enfraquecendo a parede celular e
tornando as células osmoticamente sensíveis (SELITRENNIKOFF, 2001). A
família PR-3 é constituída por endoquitinases das classes I, II, IV, V, VI e VII,
enquanto que as da família PR-4 são das classes I e II. As PR-11 são
quitinases do tipo I, capazes de hidrolisar quitosanas além de quitina, enquanto
as PR-8 são quitinases da classe III que possuem atividade enzimática
adicional de lisozima, catalisando a hidrólise do peptídeoglicano, componente
estrutural das paredes bacterianas (VAN LOON et al., 1994).
A atividade da β-1,3-glucanase pode ser sinergisticamente melhorada
pela quitinase tanto in vitro (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) quanto in
vivo (VAN LOON, 1997). Além da ação antimicrobiana direta, degradando a
parede celular de fungos, essas enzimas agem indiretamente liberando
fragmentos de parede celular que atuam como elicitores de repostas de defesa
da planta hospedeira (YOSHIKAWA; YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993).
A coindução de quitinases e glucanases foi observada em várias
espécies de plantas como café (GUZZO & MARTINS, 1996), ervilha (MAUCH;
MAUCH-MANI; BOLLER, 1988), feijão (STANGARLIN & PASCHOLATI, 2000),
e tomate (JOOSTEN & DE WIT, 1989; LAWRENCE et al., 2000), entre outras.
Em tomateiro, Lawrence, Joosten e Tuzun (1996) verificaram níveis
mais altos de quitinases e β-1,3-glucanase tanto na expressão constitutiva
quanto na induzida pelo patógeno em linhagens resistentes a A. solani que em
genótipos suscetíveis. Após inoculação com A. solani, quatro isoenzimas de
quitinases (26, 27, 30 e 32 kDa) foram induzidas tanto nos genótipos
resistentes quanto nos suscetíveis. As linhagens resistentes (NCEBR-1 e
NCEBR-2) tinham, no entanto, significativamente maior atividade da quitinase
de 30 kDa. Além disso, pela análise de Western blot demonstrou-se que, após
a infecção com A. solani, a linhagem altamente resistente NC 24-E
rapidamente acumula transcritos de mRNA que codificam para múltiplos PR
genes, incluindo isoenzimas de quitinases e β-1,3-glucanases (LAWRENCE et
al., 2000).
Solórzano et al. (1999) estudaram os padrões isoenzimáticos de PFO e
quitinases em folhas de duas variedades de tomateiro, NC EBR-1 (resistente) e
HC 3880 (suscetível). Foram detectadas seis isoformas ácidas de PFO, tanto
na variedade resistente quanto na suscetível. A respeito da quitinase,
38
observaram duas isoformas ácidas presentes nas duas variedades. Entretanto,
na variedade NC EBR-1 uma isoforma foi induzida a partir das 24 hpi, enquanto
que na variedade suscetível HC 3880, a indução ocorreu às 72 hpi. A outra
isoforma foi detectada em ambas as variedades às 72 hpi.
A indução de uma isoenzima de quitinase de 44 kDa e uma de proteína
tipo-taumatina (da família PR-5) de 23 kDa, já foram observadas em cultura de
células e em folhas de tomateiro em reposta a elicitores obtidos a partir de A.
solani (RADHAJEYALAKSHMI et al., 2009).
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p. 28–30.
54
CAPÍTULO 2
DESENVOLVIMENTO DE Oidium neolycopersici EM GENÓTIPOS DO
GÊNERO Solanum seção Lycopersicon
1
RESUMO
O oídio, causado pelo fungo Oidium neolycopersici, é uma doença
comum do tomateiro, sobretudo em condições de cultivo protegido. Para
esclarecer a natureza da resistência a oídio avaliou-se o processo de infecção,
através da histopatologia em diferentes genótipos de tomateiro: CNPH 416,
CNPH 423, CNPH 1287 (Solanum habrochaites sin. Lycopersicon hirsutum),
cv. Santa Cruz Kada, cv. Santa Clara (S. lycopersicum sin. Lycopersicon
esculentum) e CNPH 0081 (S. lycopersicum var. cerasiforme). Para isso, três
discos foliares (da 3ª, 4ª e 5ª folha “verdadeira”) de cada planta com 5-7 folhas
verdadeiras foram cortados e colocados em placas de Petri contendo ágar-
água. Os discos foram inoculados a partir de micélio esporulante desenvolvido
em tomateiro suscetível e incubados a 19ºC-22ºC, 4000 lx e fotoperíodo de 12
h. Os discos foram clareados em etanol aquecido e examinados
microscopicamente 19 h, 8 e 9 dias após-inoculação para se avaliar
desenvolvimento de tubo germinativo, esporulação e severidade da doença,
respectivamente. A germinação dos conídios sobre o tecido foliar não
apresentou diferenças entre genótipos. A formação de hifa secundária,
apressórios e haustórios por conídio germinado foram menores nos genótipos
CNPH 1287 e 423, que também apresentaram menor esporulação e menor
severidade da doença. Os genótipos de S. lycopersicum e S. lycopersicum var.
cerasiforme apresentaram maior suscetibilidade ao oídio. Assim, observou-se
que a resistência a oídio de CNPH 1287 e 423 ficou evidenciada já desde as 19
h após a inoculação, principalmente pela menor porcentagem de hifa
secundária e número de apressórios e haustórios formados quando
comparados com os genótipos suscetíveis.
Palavras-chave: Oídio de tomateiro. Tomateiro. Resistência. Formação de
apressório. Formação de haustório. Histopatologia.
1
Artigo aceito para publicação na Summa Phytopathologica, no vol. 36, n. 1, 2010.
55
ABSTRACT
Development of Oidium neolycopersici on Solanum seção Lycopersicon
genotypes
Tomato powdery mildew, caused by Oidium neolycopersici, is a
common disease of tomato, especially in greenhouse conditions. To investigate
the nature of powdery mildew resistance, we studied the histopathology of the
infection process in six different tomato genotypes: CNPH 416, CNPH 423,
CNPH 1287 (Solanum habrochaites syn. Lycopersicon hirsutum), cv. Santa
Cruz Kada, cv. Santa Clara (S. lycopersicum syn. Lycopersicon esculentum)
and CNPH 0081 (S. lycopersicum var. cerasiforme). Leaf discs of the 3
rd
, 4
th
e
5
th
leaves from plants with 5-7 true leaves were placed on water agar in Petri
dishes, inoculated using recent sporulating mycelium of tomato powdery mildew
and incubated at 19-22ºC, 4000 lx and 12h photoperiod. After clearing with
boiling ethanol, the discs were microscopically examined at 19 h, 8 and 9 days
post inoculation to evaluate germ tube development, sporulation and disease
severity. Conidial germination on foliar tissue was similar in all genotypes.
Secondary hypha, appresoria and haustoria per germinated conidia were lowest
in CNPH 1287 and 423, which also exhibited the lowest sporulation and disease
severity. S. lycopersicum and S. lycopersicum var. cerasiforme genotypes
showed the highest mildew susceptibility. Powdery mildew resistance of CNPH
1287 and CNPH 423 was already evident at 19 hours after inoculation based
upon the lower percentage of secondary hypha, appresoria and haustoria
observed than in the susceptible ones.
Additional keywords: Tomato powdery mildew. Tomato. Resistance.
Appresorium formation. Haustorium formation. Histopathology.
56
1. INTRODUÇÃO
Oídio do tomateiro [Solanum lycopersicum L. (PERALTA; KNAPP,
SPOONER, 2005) sin. Lycopersicon esculentum Mill.], causado por Oidium
neolycopersici L. Kiss tem causado problemas sérios na cultura nos últimos
anos, principalmente sob condições de cultivo protegido (KISS et al., 2001;
JONES; WHIPPS; GURR, 2001; CAFÉ FILHO; COELHO; SOUZA, 2001;
MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; KUROZAWA & PAVAN, 2005). O
patógeno afeta a superfície adaxial das folhas, pecíolos, caule e cálices, com
presença de micélio e estruturas de frutificação assexuada do fungo conferindo
o característico aspecto pulvurulento de cor branca a cinza. Em estágios mais
avançados, os tecidos subadjacentes apresentam clorose e, finalmente,
necrose. As infecções severas conduzem às plantas a senescência prematura,
desfolha e redução do número e tamanho de frutos (WEHT, 2001;
MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; KUROZAWA & PAVAN, 2005).
O uso de cultivares resistentes constitui a alternativa mais eficiente e
segura para o controle da doença, pois reduz os custos de produção e evita
danos à saúde humana e ao ambiente. A obtenção de fontes de resistência
entre os cultivares de tomateiro não tem levado a muito sucesso, o que gera a
necessidade da procura entre espécies selvagens do gênero Solanum seção
Lycopersicon. “Screening” intensivo tem identificado diferentes fontes
potenciais de resistência em acessos de Solanum habrochaites (sin.
Lycopersicon hirsutum), S. chilense (sin. L. chilense), L. parviflorum (sin S.
neorickii), S. peruvianum (sin. L. peruvianum), S. pimpinellifolium (sin. L.
pimpinellifolium), S. lycopersicum var. cerasiforme (sin. L. esculentum var.
cerasiforme) e S. pennellii (sin. L. pennellii) (LINDHOUT; PET; VAN DER
BEEK, 1994; CICCARESE et al., 1998; HUANG et al., 1998; HUANG et al.,
2000; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; MATSUDA et al., 2005; LI et
al., 2006).
Embora mecanismos de defesa pré-formados (espessura da cutícula,
presença de tricomas, entre outros) possam prevenir a infecção, por vezes, as
57
plantas mostram respostas ativas ao ataque de patógenos, como transcrição
de genes e formação de produtos de defesa, com o objetivo de retardar o
desenvolvimento do patógeno ou levar à morte da célula vegetal
(PASCHOLATI & LEITE, 1995; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004). A
expressão de resistência pode ser determinada em vários níveis, desde
populações de plantas até o estudo de planta individual, através de histologia e
respostas moleculares. A histologia da interação patógeno-hospedeiro é um
recurso eficiente no estudo dos processos de infecção, ajuda a esclarecer os
eventos de pré-penetração, penetração e colonização do hospedeiro, e
possibilita o entendimento da fisiologia da interação e os mecanismos de
resistência do hospedeiro (ARAÚJO & MATSUOKA, 2004).
Existem estudos focados na resistência de tomateiro e de espécies
aparentadas a Oidium neolycopersici (HUANG et al., 1998; MLÍČKOVÁ et al.,
2004; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; MATSUDA et al., 2005;
TOMÁNKOVÁ et al. 2006), onde foram estudados aspectos como germinação
de conídios na superfície do hospedeiro, comprimento de tubos germinativos,
formação de apressórios e haustórios, formação de papilas, respostas de
hipersensibilidade, formação de conidióforos, esporulação, produção de
espécies reativas de oxigênio (EROs) e de atividade de enzimas relacionadas
ao metabolismo de EROs.
O presente trabalho teve como objetivo estudar as etapas iniciais do
processo de infecção de O. neolycopersici, a esporulação e a correspondente
severidade no hospedeiro suscetível vs. resistente, buscando detectar
diferentes estratégias de resistência.
58
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Patógeno e material vegetal
O isolado de O. neolycopersici empregado foi obtido a partir de
tomateiros doentes provenientes do campo experimental da Universidade
Estadual do Oeste de Paraná (Unioeste), Campus de Marechal Cândido
Rondon (Paraná) e mantido em plantas de genótipo com alta suscetibilidade
(Santa Cruz Kada), a 19ºC-22ºC, 4000 lx e 12 h de fotoperíodo. Foram
utilizados seis genótipos do gênero Solanum seção Lycopersicon com
diferentes níveis de resistência a O. neolycopersici (Quadro 1). Os acessos de
Solanum lycopersicum var. cerasiforme e S. habrochaites foram formacidos
pelo Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da Empresa Brasileira
de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil.
Quadro 1. Identificação, origem e nível de resistência/suscetibilidade dos
genótipos de Solanum seção Lycopersicon empregados na avaliação do
processo de infecção por Oidium neolycopersici
Genótipo (cultivar, acesso) Origem
Resistência/
suscetibilidade
Solanum lycopersicum cv. Santa Cruz Kada Comercial
Suscetível
S. lycopersicum cv. Santa Clara Comercial
Suscetível
S. habrochaites (CNPH
1
416 – PI 126445) CNPH Resistente
S. habrochaites (CNPH 423 – PI 134417) CNPH Resistente
S. habrochaites (CNPH 1287 – PI 126445) CNPH Resistente
S. lycopersicum var. cerasiforme (CNPH 0081 -
Silvestre de Felixlândia)
CNPH Suscetível
1
CNPH - Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças da Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil.
Os genótipos foram semeados em bandejas contendo substrato
comercial (Plantmax HA®) para produção de mudas. Aos 45 dias após
59
semeadura foram transplantados para vasos plásticos com capacidade para
1,5 L (uma planta por vaso) contendo uma mistura deste substrato, solo e areia
esterilizados (2:1:1 v/v) e mantidos sob condições de casa de vegetação.
2.2 Inoculação e incubação de discos foliares
Aos 63 dias após o transplantio, quando as plantas apresentavam de
cinco a sete folhas totalmente desenvolvidas, três discos com 11 mm de
diâmetro foram retirados do folíolo terminal da 3ª, 4ª e 5ª folhas. Os discos
foliares foram colocados em placas de Petri contendo ágar-água (15 g L
-1
) com
a face adaxial voltada para cima. A inoculação com O. neolycopersici foi
realizada através de pequenas batidas com folhas de tomate cobertas (80-
100%) por micélio esporulante (MIESLEROVÁ; LEBEDA; CHETELAT, 2000;
MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004). Na sequência após a inoculação,
as placas de Petri foram fechadas com filme plástico e incubadas em câmara
de crescimento a 19ºC-22ºC, intensidade de luz 4000 lx e fotoperíodo de 12 h,
sendo o período com luz iniciado no momento da colocação das placas na
câmara de crescimento. O número médio de conídios inoculados sobre os
discos foliares foi estimado a partir de contagens ao micrsocópio dos conídios
presentes no disco (39,7 esporos mm
-2
).
2.3 Observação microscópica do processo de infecção de Oidium
neolycopersici
Os discos foliares dos genótipos foram examinados decorridos 19 h, 8
e 9 dias de incubação. Para tanto, procedeu-se a descoloração dos mesmos
pela imersão em etanol (92º) aquecido a 78ºC e conservados até observação
em frascos contendo glicerol 50%. Os discos foram montados em lâminas de
vidro para microscopia com lactofenol-azul de algodão e observados sob
microscópio de luz Leitz Diaplan. Às 19 h pós-inoculação (hpi) determinou-se o
percentual de germinação dos conídios através da contagem daqueles que
apresentavam tubos germinativos de comprimento igual ou maior que a largura
do esporo (contagem de 100 conídios em cada disco foliar). O desenvolvimento
do fungo foi determinado através do número de tubos germinativos por conídio,
60
comprimento deles e presença de apressórios e haustórios, sendo essas
características de desenvolvimento registradas em 20 conídios germinados por
disco de modo a obter-se 300 conídios para cada genótipo.
Para determinar a esporulação, aos oito dias pós-inoculação (dpi) os
conídios foram removidos dos discos foliares mediante a aplicação cuidadosa
de pequenos pedaços (1x1 cm) de fita adesiva transparente sobre os discos e
posteriormente transferidos para lâmina de microscopia com lactofenol-azul de
algodão para observação e contagem de esporos ao microscópio de luz.
2.4 Severidade da doença
O percentual do grau máximo de infecção (ID) foi determinado aos
nove dpi através da observação macroscópica das estruturas fúngicas nos
discos. A severidade foi determinada empregando-se a escala de Kashimoto et
al. (2003a) de acordo com a porcentagem de superfície foliar coberta pelo
fungo: 0 = ausência de sinais do patógeno, 1 = sinais em menos de 25% da
área, 2 = sinais em 25%-50% da área, 3 = sinais em 51%-75% da área, 4 =
sinais em mais de 76% da área. A severidade em cada planta foi determinada
usando a seguinte fórmula:
100
cos
(%) ×
×
=
∑
escaladamáximanotadisdenúmero
notas
ID
2.5 Estatística e delineamento experimental
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado,
com seis tratamentos e cinco repetições. Cada parcela experimental foi
representada por uma placa de Petri contendo três discos foliares, e a média
dos três discos foi empregada na análise estatística. Foram realizados testes
para homogeneidade da variância (teste de Levene, p=0,05) e para
normalidade dos erros (teste de Shapiro-Wilk, p=0,05) e, quando as
pressuposições foram violadas, procedeu-se transformação dos dados. Foi
realizada análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de
Scott-Knott (p=0,05).
61
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A forma e a dimensão dos conídios de O. neolycopersici observados
coincidiram com os dados morfológicos relatados para a espécie (JONES;
WHIPPS; GURR, 2001; KASHIMOTO et al., 2003b). Os conídios germinaram
de modo uniforme na superfície foliar de todos os genótipos, com percentual
médio de 54,5% (dados não apresentados). Huang et al. (1998) e Mieslerová,
Lebeda, e Kennedy (2004) reportaram anteriormente que a resistência de
tomateiro a O. lycopersicum não é devida à inibição da germinação de esporos.
Os conídios desenvolveram tubos germinativos primários com
comprimento variável, mas sem diferenças significativas entre genótipos. Na
parte terminal do tubo germinativo foi observado um apressório lobado (Figura
1A). Com frequência, sob o apressório, observou-se a formação de um
haustório (Figura 1B) e desenvolvimento de hifa secundária a partir do conídio
ou do tubo germinativo primário (Figura 1C). Para os conídios que
apresentavam hifa secundária foi detectado um haustório embaixo do
apressório do tubo germinativo. Na coleta, realizada às 19 hpi, não foi
observada a formação de apressório na hifa secundária. Para os diferentes
genótipos não foram observadas diferenças para o comprimento da hifa
secundária (dados não apresentados). Mieslerová, Lebeda, e Kennedy (2004),
em avaliações feitas 6, 24 e 48 hpi, observaram diferenças entre o
comprimento dos tubos germinativos primários, secundários e terciários de
conídios desenvolvidos em genótipos resistentes e suscetíveis de tomateiro.
Às 19 hpi, a maioria dos conídios já apresentava formação de
apressórios no tubo germinativo primário, havendo só um genótipo (CNPH
1287) que se diferenciou dos outros por apresentar menor percentual de
apressórios (Quadro 2). A presença de haustório não lobado sob o apressório
foi observada nos diferentes genótipos, variando de 23 no CNPH 423 a 79,6%
no CNPH 0081. Houve diferenças significativas para essa variável entre
genótipos avaliados às 19 hpi, sendo as menores frequências de haustórios
formados nos genótipos CNPH 1287 e CNPH 423 e a maior no CNPH 0081.
62
Figura 1. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro 19 h pós-inoculação. A: Apressório lobado (ap) B: Haustório (seta)
desenvolvido sob o apressório. C: Conídio apresentando tubo germinativo
primário com apressório e hifa secundária sem apressório. D1: Conídio com
tubo germinativo primário com apressório e hifa secundária. D2: Mesmo
conídio em plano focal inferior mostrando haustório (seta) sob apressório do
tg1º. Abreviações: c = conídio; ap = apressório; tg1º = tubo germinativo
primário; h 2ª = hifa secundária. Barra 10 µm.
Kashimoto et al. (2003b), ao avaliarem o desenvolvimento de O.
neolycopersici em cultivar suscetível de tomateiro em vários tempos pós-
infeção, observaram a formação do haustório primário às 12 hpi e que as hifas
secundárias desenvolveram-se a partir do conídio e, posteriormente, do
apressório primário às 24 hpi. Matsuda et al. (2005) verificaram que em
acessos de S. habrochaites completamente resistentes a oídio não se
formaram haustórios funcionais e sugeriram que isso ocorreu devido à reação
de hipersensibilidade ocorrida nas células epidérmicas invadidas pelo
patógeno, o que resultou em falha no estabelecimento da infecção a partir do
tg 1º
h 2ª
ap ap
A
C
B
B
D
2
D
1
tg 1º h 2ª
c
c
c
c
c c
ap
ap
63
conídio. Nas plantas de tomateiro suscetíveis, os conídios germinados e que
formaram apressório penetraram as células com sucesso, formaram haustórios
sem resposta de hipersensibilidade e originaram hifas secundárias para
expandir suas colônias.
Quadro 2. Características do desenvolvimento dos conídios de O.
neolycopersici em discos foliares de genótipos de tomateiro avaliados 19 h pós-
inoculação (hpi)
Genótipos
tg 1º
(µm)
h 2ª
(%)
tg 1º+h 2ª
(µm)
Apressório
(%)
Haustório
(%)
CNPH 1287 18,3
a 0,6a 18,3a
74,5
a 28,2a
CNPH 423 17,8
a 3,0a 22,4a
87,0
b 23,0a
CNPH 416 20,2
a 9,5 b 33,3 b
96,5
b 67,3 b
Santa Clara 20.9
a 7,0 b 32,5 b
97,5
b 65,5 b
CNPH 0081 20,3
a 22,2 c 32,0 b
94,5
b 79,6 c
Sta. Cruz Kada 25,0
a 29,5 c 46,4 c
96,7
b 66,1 b
CV (%) 19,2 55,7 23,2 6,9 15,7
Médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao
nível de 5% de probabilidade.
Abreviações: tg 1º (µm): comprimento do tubo germinativo primário, h 2ª
formação de hifa secundária, tg 1º+h 2ª (µm): comprimento do tubo germinativo
primário mais hifa secundária.
Diferente dessa situação, Huang et al. (1998) não observaram
diferenças nos percentuais de formação de haustórios primários em genótipos
suscetíveis e resistentes de espécies de Solanum seção Lycopersicon, mas,
sim, em características como formação de haustório secundário, necrose
induzida por haustório 1º e 2º, número de hifas por conídio, número de
apressórios por hifa, número de apressórios por conídio e esporulação às 65
hpi. Esses autores relataram reação de hipersensibilidade nas avaliações
tardias (65 hpi), quando a necrose das células atacadas determinou a
supressão do haustório após sua formação. Vários autores consideram que a
resposta de hipersensibilidade nas células epidérmicas seja a responsável pela
resistência ao oídio em genótipos de tomateiro resistentes (HUANG et al. 1998;
64
MATSUDA et al. 2005). No presente trabalho não foi avaliada a resposta de
hipersensibilidade nas células invadidas, mas a formação de haustórios e
subsequente formação de hifa secundária nas primeiras 19 hpi foram
consideradas fortes indicativos de mecanismos de resistência nos genótipos de
S. habrochaites (CNPH 1287 e 423). Para o genótipo CNPH 416, o maior
número de haustórios formados às 19 hpi pode ter sido seguido por resposta
de hipersensibilidade nas células atacadas e responsável pela posterior
degenerescência dos haustórios.
O patógeno produziu conídios não concatenados, o que confirma sua
identificação como O. neolycopersici (KISS et al., 2001; KISS; TAKAMATSU;
CUNNINGTON, 2005). Foram observadas diferenças entre genótipos quanto à
quantidade de esporos formados nos discos foliares na avaliação do oitavo dia
pós-inoculação (Quadro 3). Essas diferenças permitem distinguir três grupos: o
primeiro grupo compreendido pelos genótipos da espécie S. habrochaites com
baixa esporulação; o segundo grupo compreendido pelo cv. Santa Clara e o S.
lycopersicum var. cerasiforme, que apresentaram esporulação 31 vezes maior
do que o primeiro grupo; e o terceiro grupo representado pela cv. Santa Cruz
Kada, a qual apresentou maior esporulação (cerca de 60 vezes maior do que o
primeiro grupo). Segundo Huang et al. (1998), o desenvolvimento de unidades
de infecção nem sempre é detido quando as células epidérmicas, nas quais o
haustório primário foi formado, se tornam necróticas. Quando o crescimento da
hifa primária é bloqueado por necrose, novas hifas são usualmente formadas
do outro lado do esporo. As hifas secundárias produzem novos apressórios e,
subsequentemente, novos haustórios, embora, eventualmente, todos os
haustórios possam estar associados com necrose de células epidérmicas e a
infecção inibida completamente.
A menor esporulação observada para os genótipos de S. habrochaites,
quando comparada a outras espécies, foi coerente com a observação
macroscópica dos sinais do patógeno nos discos foliares, onde, nos genótipos
de S. habrochaites, não houve sintomas visíveis da doença. Lindhout, Pet e
Van der Beek (1994), em “screening” de 127 acessos de oito espécies
selvagens de Lycopersicon, reportaram que, macroscopicamente, a resistência
a oídio foi caracterizada por uma frequência de infecção muito baixa,
crescimento micelial reduzido e ausência de esporulação.
65
Quadro 3. Esporulação de O. neolycopersici e severidade de oídio em discos
foliares de genótipos de tomateiro avaliados aos 8 e 9 dias pós-inoculação,
respectivamente.
Esporos/disco (10
2
)
1
Severidade da
doença
2
Genótipos
Médias
originais
Médias
transformadas
Médias
originais
CNPH 416 71,9 8,5a
0
a
CNPH 1287 97,3 9,9a
0
a
CNPH 423 137,3 11,7a
0
a
Santa Clara 2498,4 50,0 b
13,3
b
CNPH 0081 3867,8 62,2 b
38,3
c
Sta. Cruz Kada
6048,4 77,8 c
75,0
d
CV (%) 28,8 34,6
Médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao
nível de 5% de probabilidade.
1
Para análise estatística os dados foram transformados em y=
x
. As médias originais foram
obtidas pela operação inversa da transformação.
2
Severidade da doença foi determinada para cada disco segundo a fórmula: ID (%)= [(soma de
todas as notas)/(número de discos avaliados x nota máxima da escala)] x 100. Notas: 0
(ausência de sintomas), 1 (sintomas em menos de 25% da área), 2 (sintomas em 25-50% da
área), 3 (sintomas em 50-75% da área), 4 (sintomas em mais de 76% da área).
Considerando-se os eventos iniciais e os mais tardios (esporulação e
severidade da doença) da patogênese causada por O. neolycopersici em
diferentes acessos selvagens do gênero Solanum seção Lycopersicon,
observa-se que os genótipos CNPH 1287 e 423 apresentaram comportamento
diferente dos suscetíveis (CNPH 0081, cv. Santa Cruz Kada e cv. Santa Clara),
principalmente quanto ao baixo número de haustórios e hifas secundárias
formadas às 19 hpi, esporulação e severidade da doença aos 8 e 9 dpi,
respectivamente.
66
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos a
M.I. Balbi-Peña e pela bolsa de produtividade a K.R.F. Schwan-Estrada e J. R.
Stangarlin. Os autores agradecem também ao Dr. Leonardo Boiteux, do Centro
Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da EMBRAPA, que, gentilmente,
cedeu as sementes utilizadas no experimento.
67
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69
CAPÍTULO 3
RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E
RESISTENTES A Oidium neolycopersici, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS
RELACIONADAS À DEFESA
RESUMO
Para investigar as respostas de defesa de dois genótipos do gênero
Solanum seção Lycopersicon com resposta diferencial a Oidium neolycopersici
L. Kiss, avaliou-se a resposta de hipersensibilidade (HR), a produção e o
acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a atividade de enzimas
relacionadas à defesa. Quando plantas do genótipo resistente CNPH 1287
(Solanum habrochaites sin. Lycopersicon hirsutum) e do suscetível Santa Cruz
Kada (S. lycopersicum sin. Lycopersicon esculentum) apresentavam sete-nove
e cinco-sete folhas totalmente desenvolvidas, respectivamente, foi realizada a
inoculação da 2ª, 3ª e 4ª folha verdadeira. Essas folhas foram coletadas no
momento da inoculação e às 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h pós-inoculação
(hpi). A produção e acúmulo in situ de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radical
superóxido (O
2
.-
) foram avaliadas com o uso de diaminobenzidina e
nitrobluetetrazolio, respectivamente. A partir das 24-48 hpi, foi detectado
acúmulo elevado de H
2
O
2
e O
2
.-
e de células epidérmicas, apresentando HR,
principalmente em folhas inoculadas do genótipo resistente (S. habrochaites).
Aumentos na atividade de peroxidase de guaiacol (GPOX), catalase (CAT),
polifenoloxidase (PFO), β-1,3-glucanase (GLU) e quitinase (QUI) foram
registrados principalmente às 24 hpi no genótipo resistente. A associação entre
a produção de EROs e atividade de enzimas relacionadas a seu metabolismo
(GPOX, CAT), enzimas hidrolíticas (GLU, QUI) e do metabolismo dos fenóis
(PFO), assim como de HR, foi evidente durante as repostas de defesa em
CNPH 1287 inoculado com O. neolycopersici.
Palavras-chave adicionais: Oídio de tomate. Hipersensibilidade. Espécies
reativas de oxigênio. Peroxidase. Catalase. Polifenoloxidase. Quitinase, β-1,3-
glucanase.
70
ABSTRACT
Defense responses, in situ localization of reactive oxygen species and
activity of defense-related enzymes in tomato genotypes resistant and
susceptible to Oidium neolycopersici
To investigate plant tissue defense responses on two Solanum section
Lycopersicon genotypes differing in their resistance against Oidium
neolycopersici L. Kiss, the hypersensitive response (HR), generation and
accumulation of reactive oxygen species (ROS) and activity of defense-related
enzymes were studied. Seven-nine and five-seven true leaves plants of the
resistant CNPH 1287 (Solanum habrochaites syn. Lycopersicon hirsutum), and
the susceptible cv. ‘Santa Cruz Kada’ (S. lycopersicum syn. Lycopersicon
esculentum), respectively, were inoculated at 2
nd
, 3
rd
and 4
th
true leaves. At
differente time intervals (0, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, and 120 hours after
inoculation), these leaves were collected for analysis. In situ production and
accumulation of hydrogen peroxide (H
2
O
2
) and superoxide radical (O
2
.-
) were
detected with diaminobenzidine (DAB) and nitrobluetetrazolium (NBT),
respectively. High accumulation of H
2
O
2
and O
2
.-
and cells undergoing HR were
observed after 24-48 hpi, mainly in inoculated leaves of the resistant genotype
(S. habrochaites). Increased activity of guaiacol peroxidase (GPOX), catalase
(CAT), polyphenol oxidase (PPO), β-1,3-glucanase (GLU) and chitinase (CHI)
were detected mainly at 24 hpi in resistant genotype. High association between
ROS production, activity of enzymes involved in their metabolism (GPOX, CAT),
hydrolytic enzymes (GLU, CHI) and enzymes related to phenol metabolism
(PPO) as well as HR was evident during defense-related response in CNPH
1287 plants inoculated with O. neolycopersici.
Additional keywords: Tomato powdery mildew. Hypersensitive response.
Reactive oxygen species. Peroxidase. Catalase. Polyphenol oxidase. Chitinase,
β-1,3-glucanase.
71
1. INTRODUÇÃO
O oídio do tomate (causado por Oidium neolycopersici L. Kiss (KISS et
al., 2001) tem causado sérios problemas na cultura de tomate [Solanum
lycopersicum L. (PERALTA; KNAPP, SPOONER, 2005) sin. Lycopersicon
esculentum Mill.] durante os últimos 15 anos. No Brasil, com o incremento do
cultivo protegido e da área irrigada por gotejamento, o oídio tem assumido
maior importância (KUROZAWA & PAVAN, 2005; BOITEUX et al., 2005). O
uso de cultivares resistentes constitui a alternativa mais eficiente e segura para
o controle da doença, mas a obtenção de fontes de resistência entre as
cultivares de tomateiro não tem tido êxito, o que gera a necessidade da procura
entre espécies selvagens do gênero Solanum seção Lycopersicon. “Screening”
intensivo tem identificado diferentes fontes potenciais de resistência em
acessos de Solanum habrochaites (sin. Lycopersicon hirsutum), S. chilense
(sin. L. chilense), L. parviflorum (sin S. neorickii), S. peruvianum (sin. L.
peruvianum), S. pimpinellifolium (sin. L. pimpinellifolium), S. lycopersicum var.
cerasiforme (sin. L. esculentum var. cerasiforme) e S. pennellii (sin. L. pennellii)
(LINDHOUT; PET; VAN DER BEEK, 1994; CICCARESE et al., 1998; HUANG
et al., 1998; HUANG et al., 2000; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004;
MATSUDA et al., 2005; LI et al., 2006).
As plantas resistem ao ataque dos agentes fitopatogênicos através de
defesas químicas e físicas que podem ser tanto pré-formadas (cutícula e
parede celular) quanto induzidas após o ataque do patógeno (PASCHOLATI &
LEITE, 1995; HUTCHESON, 1998). As defesas induzidas incluem a produção
de espécies reativas de oxigênio (EROs), o fortalecimento da parede celular, a
síntese de fitoalexinas e o acúmulo de proteínas relacionadas à defesa. A
geração localizada de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radical superóxido (O
2
.-
)
detectável citologicamente é um dos eventos de resposta mais precoces dos
tecidos vegetais (BAKER & ORLANDI, 1995) e está provavelmente envolvida
com a indução da reação de hipersensibilidade (HR) (LEVINE et al., 1994). As
espécies reativas de oxigênio (EROs), termo que reúne espécies derivadas do
72
oxigênio radicais e não radicais, embora reativas, estão envolvidas em várias
respostas de defesa em células vegetais. O H
2
O
2
é requerido para a ligação
cruzada de componentes de parede celular como parte da resposta de defesa
estrutural da planta (LAMB & DIXON, 1997). O H
2
O
2
pode também contribuir
para criar um ambiente antimicrobiano no apoplasto (PENG & KUC, 1992).
Quando produzidas em excesso, as EROs podem induzir peroxidação de
lipídeos e também danificar DNA e proteínas (MOLLER, 2001).
Vários sistemas enzimáticos estão envolvidos no metabolismo das
EROs. A peroxidase pode gerar H
2
O
2
, mas também é capaz de reduzir seu
nível através de polimerização de álcoois hidroxicinamil durante a biossíntese
da lignina e da ligação cruzada das proteínas de parede celular (IIYAMA; LAM;
STONE, 1994). Outra enzima que desempenha papel importante no
metabolismo do H
2
O
2
é a catalase (CAT). A CAT tem duas atividades: a
“catalítica” quando catalisa a degradação de H
2
O
2
em água e oxigênio e
“peroxidativa” quando uma molécula de H
2
O
2
e uma de hidrogênio servem
como substratos (MLÍČKOVÁ et al., 2004). A CAT protege as células dos
efeitos tóxicos do H
2
O
2
(LEBEDA et al., 2001).
Dentro das enzimas relacionadas à defesa, encontram-se as proteínas
relacionadas à patogênese (ou proteínas-PR). Quitinases e β-1,3-glucanases
são enzimas hidrolíticas induzidas em várias interações planta-patógeno (VAN
LOON, 1997). Elas podem degradar componentes da parede celular de muitos
fungos (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) e também podem atuar
liberando fragmentos de parede celular que atuam como elicitores da resposta
de defesa ativas do hospedeiro (YOSHIKAWA; YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993).
As polifenoloxidases (PFO) são enzimas localizadas nos plastídios, que
utilizam o oxigênio molecular para a oxidação de mono e o-difenóis em o-
diquinonas (VAUGHN; LAX; DUKE, 1988). As quinonas têm ação
antimicrobiana (MOHAMMADI & KAZEMI, 2002). As PFO também participam
do processo de lignificação durante a invasão pelo patógeno (LI & STEFFENS,
2002). O papel da PFO na geração de EROs está na oxidação de compostos
fenólicos, reação que produz H
2
O
2
em extratos vegetais (RICHARD-FORGET
& GAUILLARD, 1997) e na formação de intermediários, como as semiquinonas
que reduzem o oxigênio molecular a radical superóxido (THIPYAPONG; HUNT;
STEFFENS, 2004).
73
Estudos histoquímicos e bioquímicos prévios (MLÍČKOVÁ et al., 2004;
TOMÁNKOVÁ et al., 2006)
indicaram diferenças na resposta de defesa de
vários genótipos do gênero Solanum seção Lycopersicon frente à infecção com
Oidium neolycopersici, principalmente pela produção de EROs e atividade de
enzimas relacionadas a seu metabolismo. O objetivo deste trabalho foi
entender as estratégias de defesa de um genótipo resistente de S.
habrochaites e um suscetível de S. lycopersicum a O. neolycopersici, através
da observação da resposta de hipersensibilidade, o estudo da localização in
situ e acúmulo no tempo de H
2
O
2
e O
2
.-
, e da atividade de enzimas
relacionadas ao metabolismo das EROs, enzimas hidrolíticas e enzimas
relacionadas ao metabolismo dos fenóis.
74
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Patógeno e material vegetal
O isolado de O. neolycopersici L. Kiss foi obtido de tomateiros doentes
provenientes do campo experimental da Universidade Estadual do Oeste do
Paraná (Unioeste), Campus de Marechal Cândido Rondon (Paraná) e mantido
em plantas de genótipo com alta suscetibilidade (Santa Cruz Kada), a 19ºC-
22ºC, 4000 lx e 12 h de fotoperíodo (lâmpada fluorescente).
Os conídios procedentes da esporulação desse isolado foram enviados
para o Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) para identificação da espécie
de oídio. Esta foi realizada via sequenciamento da região ITS (internal
transcribed sequence) e do gene 5.8 S rDNA confirmando as observações
morfológicas de que se tratava da espécie O. neolycopersici.
Os genótipos de tomateiro utilizados foram CNPH 1287 (Solanum
habrochaites) e Santa Cruz Kada (Solanum lycopersicum), resistente e
suscetível a oídio, respectivamente. O nível de resistência a O. neolycopersici
foi avaliado em ensaio prévio (ver Capítulo 2). A semente do cultivar Santa
Cruz Kada (S. lycopersicum) foi de origem comercial, enquanto que a do
genótipo CNPH 1287 (S. habrochaites) foi cedida pelo CNPH -EMBRAPA.
Os genótipos foram semeados em bandejas contendo substrato
comercial para produção de mudas (Plantmax HA®). Após 28 dias, as plântulas
foram transplantadas para vasos de 0,6 L (uma planta por vaso) contendo o
mesmo substrato com fertilizante de liberação gradual (N 14%, P
2
O
5
16%, K
2
O
18%, S 8%, Mo 0,2%) e mantidos em câmara de crescimento a 18-24 ºC, 4000
lx e 12 h de fotoperíodo (lâmpada fluorescente).
75
2.2 Inoculação e coleta de amostras
Aos 34 dias após o transplantio, quando as plantas de Kada e de
CNPH 1287 apresentavam cinco-sete e sete-nove folhas totalmente
desenvolvidas, respectivamente, foi realizada a inoculação da 2ª, 3ª e 4ª folha
verdadeira. A face superior de cada folha foi inoculada com O. neolycopersici,
através do contato da face superior de folhas de tomateiro cv. Kada cobertas
(80-100%) por micélio esporulante. Condições de alta umidade do ar foram
mantidas com câmara úmida.
Foram coletadas a 2ª, 3ª e 4ª folhas de plantas de tomateiro às 0, 4, 8,
12, 24, 48, 72, 96 e 120 h pós-inoculação (hpi) com O. neolycopersici. Folhas
de plantas de tomateiro não inoculadas também foram coletadas nesses
mesmos tempos. As folhas foram colocadas em caixa de isopor com gelo e
transportadas ao laboratório. As amostras destinadas para análise bioquímica
(3ª e 4ª folhas) foram pesadas, congeladas em N
2
líquido e armazenadas em
congelador para análise posterior.
2.3 Análises histoquímicas
2.3.1 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
A detecção histoquímica de H
2
O
2
foi feita de acordo com Romero-
Puertas et al. (2004), com algumas modificações. Foram cortados três discos
de 11 mm de diâmetro de tecido foliar da 2ª folha de cada planta e colocados
submersos em uma solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1% (p/v) em
tampão MES 10 mM (pH 6,5). O corante DAB foi infiltrado em vácuo até a
infiltração total do tecido foliar. Para verificar a especificidade dos precipitados
marrons característicos da reação de DAB com H
2
O
2,
alguns discos foram
infiltrados com ácido ascórbico 10 mM (detoxificador de H
2
O
2
). Os discos
infiltrados foram incubados à temperatura ambiente por 1 h na luz,
posteriormente descorados por imersão em etanol (92º GL) aquecido a 78ºC e
conservados em glicerol 50% até observação. Os discos foram analisados
usando-se microscópio de luz e lactofenol-azul de algodão para visualizar as
estruturas do patógeno. O desenvolvimento do fungo foi caracterizado através
76
do número de hifas, formação de conidióforos e número de conídios por esporo
germinado. A detecção de H
2
O
2
foi realizada determinando-se o número de
locais com presença de precipitado marrom sob o ponto de penetração da hifa
e as células epidérmicas de cor marrom. Essas observações foram realizadas
em três discos por planta.
2.3.2 Localização in situ de superóxido (O
2
.-
)
A detecção in situ de O
2
.-
foi realizada segundo a metodologia de
Romero-Puertas et al. (2004), com modificações. Foram cortados três discos
de 11 mm de diâmetro de tecido foliar da 2ª folha de cada planta e colocados
submersos em uma solução de nitrobluetetrazólio (NBT) a 0,1% (p/v) em
tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,8). Foi realizada a infiltração completa
do corante no tecido foliar. Para verificar a especificidade dos precipitados
azuis de formazan característicos da reação de NBT com O
2
.-
, alguns discos
foram infiltrados com superóxido dismutase (SOD) 50 µg mL
-1
. Os discos
infiltrados foram incubados, descorados, conservados e analisados
microscopicamente segundo descrito no item 2.3.1. A detecção de O
2
.-
através
da redução in situ do NBT foi realizada determinando-se o número de locais
com coloração azul nas células epidérmicas no sítio de penetração do fungo.
Essas observações foram realizadas em três discos por planta.
2.4 Resposta de hipersensibilidade
Após intervalos de 24, 48, 72 e 120 hpi, foi determinada a porcentagem
de sítios de infecção (locais de penetração do patógeno) mostrando morte
celular. Foram contados pelo menos 200 sítios de infecção nos três discos
foliares cortados da 2ª folha de cada planta em cada intervalo de tempo. Os
discos foram descorados e conservados segundo procedimento descrito no
item 2.3.1. A autofluorescência das células epidérmicas foi observada sob luz
azul incidente (excitação 460-490 nm) usando um microscópio Zeiss Axioskop.
A resposta de hipersensibilidade (necrose das células penetradas) foi
detectada como autofluorescência da parede celular ou de toda a célula
77
epidérmica (KOGA et al., 1988). Para visualização das estruturas dos fungos, o
material foliar foi tratado com lactofenol-azul de algodão.
2.5 Análises bioquímicas
2.5.1 Obtenção dos extratos enzimáticos
A 3ª folha de cada planta (aproximadamente 0,5 g) foi macerada com
N
2
líquido e homogeneizada mecanicamente em 4 mL de tampão fosfato de
potássio 50 mM (pH 7,0) contendo 0,1 mM EDTA e 1% (p/p) de PVP (poli-vinil-
pirrolidona), em almofariz. O homogenato foi centrifugado a 15.000 g durante
30 min a 4°C, sendo o sobrenadante obtido considerado como extrato
enzimático, para a determinação do conteúdo protéico e da atividade de
peroxidase, catalase e polifenoloxidase.
Para determinação de atividade de quitinase e β-1,3-glucanase foi
utilizado extrato enzimático obtido a partir da 4ª folha utilizando tampão acetato
de sódio 100 mM (pH 5,2). O procedimento de extração e centrifugação foi o
mesmo utilizado anteriormente.
2.5.2 Proteínas totais
O teste de Bradford (1976) foi empregado para a quantificação do
conteúdo total de proteínas nas amostras. A cada 50 µL do sobrenadante foi
adicionado, sob agitação, 2,5 mL do reagente de Bradford. Após 5 min foi
efetuada a leitura da absorbância a 595 nm em espectrofotômetro. A
concentração de proteínas, expressa em mg por mL de amostra (mg proteína
mL
-1
), foi determinada utilizando-se curva-padrão de concentrações de
albumina de soro bovino (ASB) de 0 a 0,5 mg mL
-1
.
2.5.3 Atividade de peroxidase de guaiacol (EC 1.11.1.7)
A atividade da peroxidase de guaiacol (GPOX) foi determinada a 30°C,
através de método espectrofotométrico direto, pela medida da conversão do
guaiacol em tetraguaiacol em 470 nm (LUSSO & PASCHOLATI, 1999). A
78
mistura da reação continha 0,10 mL do extrato enzimático (conforme item
2.5.1) e 2,9 mL de solução com 250 µL de guaiacol e 306 µL de peróxido de
hidrogênio em 100 mL de tampão fosfato 0,01M (pH 6,0). A cubeta de
referência continha 3 mL da solução de guaiacol e peróxido de hidrogênio em
tampão fosfato. A atividade da peroxidase foi determinada por um período de 2
min. O diferencial entre a leitura aos 90 s e a leitura aos 30 s foi utilizado para a
determinação da atividade. Os resultados foram expressos em absorbância
min
-1
mg
-1
de proteína, sendo a determinação de proteínas efetuada como
descrito no item 2.5.2.
2.5.4 Atividade de catalase (EC 1.11.1.6)
A atividade da catalase (CAT) foi quantificada pelo método de Góth
(1991), modificado por Tomanková et al. (2006), através do complexo estável
formado pelo molibdato de amônio com peróxido de hidrogênio (A
405
). O extrato
enzimático (0,1 mL) (conforme item 2.5.1) foi incubado em 0,5 mL de mistura
de reação contendo 60 mM de peróxido de hidrogênio em tampão fosfato de
potássio 60 mM pH 7,4 a 38ºC por 4 min. A adição de 0,5 mL de 32,4 mM de
molibdato de amônio após 4 min de incubação foi feita para deter o consumo
de peróxido de hidrogênio pela enzima presente no extrato. Foi preparado um
branco para cada amostra através da adição de molibdato de amônio à mistura
de reação, omitindo o período de incubação. O complexo amarelo de molibdato
e peróxido de hidrogênio foi medido a 405 nm. A diferença entre a absorbância
do branco e a amostra incubada indicou a quantidade de peróxido de
hidrogênio utilizado pela enzima. A concentração de H
2
O
2
, foi determinada
utilizando-se o coeficiente de extinção є = 0,0655 mM
-1
cm
-1
.
2.5.5 Atividade de polifenoloxidase (EC 1.10.3.2)
A atividade das polifenoloxidases (PFO) foi determinada usando-se a
metodologia de Duangmal e Apenten (1999). O ensaio consistiu em quantificar
a oxidação do catecol convertido em quinona, reação mediada pela enzima
polifenoloxidase. O substrato foi composto por catecol, na concentração de 20
mM, dissolvido em tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6,8). A reação se
79
desenvolveu misturando-se 900 µL do substrato e 100 µL do extrato enzimático
(Item 2.5.1). A temperatura de reação foi de 30°C e as leituras em
espectrofotômetro, a 420 nm, foram realizadas de forma direta por um período
de 2 min. O diferencial entre a leitura no primeiro minuto e a leitura inicial foi
utilizado para a determinação da atividade. Os resultados foram expressos em
absorbância min
-1
mg
-1
de proteína.
2.5.6 Atividade de quitinase (EC 3.2.1.14)
A atividade da quitinase (QUI) foi avaliada através da liberação de
fragmentos solúveis de “CM-chitin-RBV”, a partir de quitina carboximetilada
marcada com remazol brilhante violeta (“Carboxy Methyl-Chitin-Remazol
Brilliant Violet”, Loewe Biochemica GmbH) (WIRTH & WOLF, 1990;
STANGARLIN; PASCHOLATI; LABATE, 2000). Para isso, foi utilizado 600 µL
do tampão de extração (acetato de sódio 100 mM pH 5,2) misturado com 200
µL de extrato enzimático (item 2.5.1) e 200 µL de “CM-chitin-RBV” (2 mg L
-1
).
Após incubar por 20 min a 40ºC, a reação foi interrompida com 200 µL de HCl
1M, seguido de resfriamente em gelo e centrifugação a 10.000 g por 5 min. A
absorbância do sobrenadante foi determinada a 550 nm. Os resultados foram
expressos em unidades de absorbância min
-1
mg
-1
proteína, descontando-se os
valores de absorbância do branco (800 µL de tampão de extração + 200 µL de
“CM-chitin-RBV”).
2.5.7 Atividade de β-1,3- glucanase (EC 3.2.1.6)
Para determinar a atividade da β-1,3-glucanase (GLU), 150 µL do
extrato enzimático (item 2.5.1) foram adicionados a 150 µL de laminarina (1,5
mg mL
-1
) em tampão de extração (acetato de sódio 100 mM pH 5,2). Como
controle, utilizou-se a mesma reação onde a laminarina foi adicionada
imediatamente antes da determinação de açúcares (sem incubação). A reação
foi conduzida a 40ºC durante 60 min, em banho-maria. Após o período de
incubação, os açúcares redutores formados foram quantificados pelo método
de Lever (1972). Para isso, foi retirada uma alíquota de 50 uL dos tubos
incubados e adicionado 1,5 mL de solução de hidrazida do ácido p-
80
hidroxibenzóico (PAHBAH) 0,5% em NaOH 0,5 M. A mistura foi mantida em
banho-maria fervente, por 10 min e resfriada em banho de gelo. A leitura das
absorbâncias foi realizada a 410 nm, em espectrofotômetro descontando-se os
valores de absorbância do branco. A quantidade de açúcares foi determinada
utilizando-se curva-padrão de concentrações de glicose, variando de 0 a 85 µg
glicose mL
-1
.
2.6 Estatística e delineamento experimental
A parcela experimental constituiu-se de um vaso contendo uma planta.
O delineamento experimental utilizado foi esquema fatorial considerando-se
dois genótipos (CNPH 1287 e Kada) x presença e ausência do patógeno (O.
neolycopersici) x nove horários de coleta (0, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h
após a inoculação) com três repetições.
Foi realizada análise de variância e as médias foram comparadas pelo
teste de Scott-Knott (p=0,05).
81
3. RESULTADOS
3.1 Desenvolvimento de O. neolycopersici nos genótipos avaliados
O desenvolvimento do fungo foi avaliado em ambos os genótipos em
todos os horários de coleta após inoculação. Na primeira observação, às 4 hpi,
a maioria dos conídios havia germinado e apresentavam tubos germinativos
primários (Figura 1A). Alguns esporos começavam a desenvolver apressório
lobado (Figura 1B). Às 8 hpi, a maioria dos conídios tinha desenvolvido
apressório e alguns apresentavam haustórios sob esse apressório (Figura 1C).
Quando avaliados às 12 hpi, a maioria dos conídios apresentava tubo
germinativo e alguns poucos apresentavam hifa secundária. A partir das 24 hpi
foi avaliada a frequência de conídios apresentando número diferente de hifas
(Quadro 1, Figura 1D).
Quadro 1. Porcentagem de conídios de O. neolycopersici apresentando
diferente número de hifas em tomateiros CNPH 1287 e cv Kada em diferentes
horários pós-inoculação (hpi)
hpi Genótipos
Tg 1ª
(%)
h 2ª
(%)
h 3ª
(%)
h 4ª
(%)
h 5ª
(%)
h 6ª
(%)
CNPH 1287 40,9a
1
57,3a 1,8b
24
Kada 31,3a 62,2a 6,5a
CNPH 1287 13,1a 23,9a 60,9a 6,0
b
48
Kada 2,3b 25,0a 61,7a 11,0
a
CNPH 1287 6,8a 7,6a 44,6a 39,3
b 1,7
b
72
Kada 3,2b 2,5b 19,8b 62,2
a 12,3
a
CNPH 1287 0 1,9a 25,6a 51,8
a 20,1
a 0,6a
96
Kada 0 0,4a 15,0a 50,1
a 34,1
a 0,4a
Abreviações: tg 1º: tubo germinativo primário, h 2ª: hifa secundária, h 3ª: hifa
terciária, h 4ª: hifa quaternária, h 5ª: hifa quinária, h 6ª: hifa sexternária
1
Dentro de cada horário pós-inoculação, médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si
pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
82
Figura 1. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com
lactofenol-azul de algodão. A: 4 hpi; conídio com tubo germinativo primário. B:
4 hpi; conídio com apressório lobado (ap) C: 8 hpi; haustório (seta)
desenvolvido embaixo do apressório. D: 48 hpi; conídio apresentando quatro
hifas e vários apressórios. E: 96 hpi; conídio com hifas e conidióforo. F: 120
hpi; aspecto geral de conídio com hifas ramificadas e conidióforo. Abreviações:
c = conídio; ap = apressório; tg1º = tubo germinativo primário; h = hifas; cd =
conidióforo. Barra A-E 10 µm, F 20 µm.
c
tg 1º
ap
c
c c
h
h
h
h
c
cd
cd c
A B
C
D
F E
83
O Quadro 1 mostra o desenvolvimento sucessivo de hifas a partir dos
conídios inoculados que germinaram no hospedeiro, pela porcentagem de
conídios apresentando uma, duas, três, quatro, cinco e seis hifas nos diferentes
tempos após inoculação. A cultivar Kada apresenta um desenvolvimento de
hifas mais rápido quando comparada com CNPH 1287, demonstrado pela
maior porcentagem de conídios com maior número de hifas desenvolvidas na
maioria dos tempos avaliados (Quadro 1). Somente às 96 hpi não se
detectaram diferenças significativas entre genótipos.
A partir das 96 hpi, foi observado o desenvolvimento de conidióforos
nas hifas produzidas pelos conídios (Figura 1E e 1F). A porcentagem de
conídios (considerando também as hifas desenvolvidas a partir deles)
apresentando conidióforos foi maior na cultivar Kada às 96 e 120 hpi (Quadro
2). Enquanto às 96 hpi o conjunto do conídio e suas hifas apresentavam
somente um conidióforo, às 120 hpi a quantidade de conidióforos por conídio
foi de 5,3 e 2,8 em Kada e CNPH 1287, respectivamente. Com base na
porcentagem de conídios apresentando conidióforo e no número de
conidióforos por conídio, foi calculado também o número de conidióforos por
conídio total avaliado.
Quadro 2. Porcentagem de conídios (e suas hifas) de O. neolycopersici
apresentando desenvolvimento de conidióforo 96 e 120 h pós-inoculação (hpi),
número de conidióforos por conídio (conídios inoculados com conidióforo) e por
conídio total avaliado
1
Dentro de cada horário pós-inoculação, médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si
pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
hpi
Genótipos
Conídios que
originaram pelo
menos um
conidióforo (%)
Nº de
conidióforos por
conídio inoculado
Nº de
conidióforos por
conídio avaliado
CNPH 1287
6,96b
1
1
a 0,07
b
96
Kada 25,6a 1
a 0,26a
CNPH 1287
31,2b 2,77
b 0,86b
120
Kada 80,8a 5,32
a 4,30a
84
3.2 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
A avaliação de sítios de interação fungo-hospedeiro mostrando
acúmulo de H
2
O
2
foi realizada em ambos os genótipos em todos os horários de
coleta após a inoculação.
A adesão do apressório sobre a célula epidérmica e/ou a formação do
haustório às 8 e às 12 hpi induziu acúmulo localizado de H
2
O
2
nas células
epidérmicas, indicado pela coloração marrom-avermelhada da polimerização
da diaminobenzidina sob o sítio de adesão-penetração. Isso ocorreu tanto no
genótipo suscetível como no CNPH 1287 (Figura 2A). A partir das 12 hpi, foi
detectado um acúmulo de H
2
O
2
nas células epidérmicas que sofreram
penetração da hifa e apresentam haustório, sobretudo nas plantas do genótipo
resistente (Figura 2B, 2C, 2D).
Em todos os horários pós-inoculação, o cultivar resistente apresentou
maior número de células epidérmicas de cor marrom, indicando acúmulo de
H
2
O
2.
A partir das 72 hpi, observou-se mais de uma célula epidérmica por sítio
de infecção sofrendo acúmulo de H
2
O
2,
devido a múltiplos sítios de penetração
das várias hifas produzidas por cada conídio original (Figura 2E-H). O número
de células epidérmicas marrons por sítio de infecção primário às 120 hpi foi de
1,5 na cultivar Kada e de 4,04 para o CNPH 1287.
A quantificação da porcentagem de sítios de penetração apresentando
acúmulo de H
2
O
2
nas células epidérmicas foi realizada em ambos os genótipos
até as 96 hpi (Figura 3). Após esse tempo tornou-se difícil devido à intensa
colonização do tecido foliar pelo patógeno.
No último horário quantificado (96 hpi), o genótipo CNPH 1287 teve
93% dos sítios de infecção com pelo menos uma célula epidérmica com reação
de DAB, enquanto o cultivar Kada apresentava 47%.
Na interação com o genótipo suscetível, nas primeiras fases de
infecção, o acúmulo de H
2
O
2
foi fraco (Figura 2B, 2D e 2F). Em etapas mais
tardias (96 hpi), registrou-se um aumento de células epidérmicas marrons em
contacto com hifas que tinham formado haustórios (Figura 3).
85
Figura 2. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro mostrando acúmulo de H
2
O
2
em células epidérmicas após
inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287. Material corado
com lactofenol-azul de algodão. Discos foliares foram cortados e infiltrados em
solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1% para avaliação microscópica em
diferentes horários pós-inoculação (hpi). A: Kada, 12 hpi; acúmulo de H2O2
B A
C
D
E
F
G H
c
c
c
c
c
c
c
c
ap
localizado sob apressório. B: CNPH 1287 24 hpi; célula epidérmica mostra
intenso acúmulo de H2O2. C: Kada 24 hpi; coloração fraca de DAB. D: CNPH
1287 72 hpi; duas células epidérmicas mostrando forte acúmulo de H2O2 no
sítio de infecção E: Kada 48 hpi; célula epidérmica apresentando coloração
fraca. F: CNPH 1287 96 hpi; plano focal inferior: três células epidérmicas
mostrando forte acúmulo de H2O2 no sítio de infecção; G: Kada 96 hpi;
aspecto geral de conídio com hifas ramificadas sem células com acúmulo de
H2O2. H: idem F em plano focal superior: conídio com quatro hifas.
Abreviações: c = conídio; ap = apressório. Barra 10 µm.
86
Tempo (horas pós-inoculação)
0 12 24 48 72 96
Porcentagem de sítios com coloração marrom (DAB)
0
20
40
60
80
100
Figura 3. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de H
2
O
2
em células
epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada ( ) e CNPH
1287 () com O. neolycopersici. Nos tempos indicados discos foliares foram
cortados e infiltrados em solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1%, para
avaliação microscópica da frequência dos sítios de infecção com precipitado
marrom. Cada ponto representa pelo menos 50 sítios de infecção em cada um
dos três discos foliares avaliados. Barras indicam desvio-padrão. ** Indicam
diferença estatística a nível de 1% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
3.3 Localização in situ de superóxido (O
2
.-
)
A coloração com nitrobluetetrazólio (NBT) foi realizada para se detectar
a geração e o acúmulo de O
2
.-
in situ. A porcentagem de sítios de infecção com
acúmulo de O
2
.-
foi quantificada às 24, 48 ,72 e 96 hpi (Quadro 3, Figura 4). No
genótipo resistente, a porcentagem de sítios de penetração com acúmulo de
O
2
.-
aumentou significativamente após a inoculação com O. neolycopersici, com
coloração azul de NBT cada vez mais intensa. No cultivar Kada, a frequência
de sítios com coloração de NBT foi menor em todas as avaliações quando
comparada com CNPH 1287, sendo que, na última avaliação (96 hpi), foi
levemente inferior que às 72 hpi.
**
**
**
**
**
87
Quadro 3. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de O
2
.-
e número
de células coradas por sítio de infecção após inoculação de plantas de
tomateiro cv. Kada e CNPH 1287 com O. neolycopersici.
. .
. Nos horários pós-
inoculacão (hpi) indicados discos foliares foram cortados e infiltrados em
solução de nitrobluetetrazólio (NBT) a 0,1%, para avaliação microscópica da
frequência dos sítios de infecção com coloração azul
A localização histológica da coloração com NBT foi avaliada
microscopicamente nos diferentes horários pós-inoculação. A partir das 12 hpi
foram detectados os primeiros sítios de penetração com acúmulo de O
2
.-
. Isso
coincide com o desenvolvimento de haustório na maioria dos conídios
observados. A partir das 24 hpi foi possível observar células epidérmicas com
coloração de NBT (Figura 5A e 5B), sobretudo no genótipo resistente (Quadro
3). No cultivar Kada, quando observado acúmulo de O
2
.-
no sítio de penetração,
a coloração foi menos intensa. A partir das 48 hpi, em alguns sítios, foram
observadas duas células do hospedeiro com acúmulo de O
2
.-
em um só sitio de
infecção, sendo mais frequente a ocorrência no genótipo resistente. Nos
tempos posteriores, observou-se coloração azul nas células do mesófilo
adjacentes aos locais que apresentavam haustórios (Figura 5H) e também
morte celular (cor amarelada) nas células epidérmicas com presença de
haustório (Figura 5C, 5E e 5G).
Hpi
Genótipos
Sítios de infecção
com coloração
de NBT (%)
Nº de células
coradas por sítio de
infecção primário
Nº de células
coradas por
conídio avaliado
CNPH 1287
50,1
± 10,8
1
0,5
24
Kada 7,6± 2,5 1
0,76
CNPH 1287
70,0± 11,6 1,25
± 0,12 0,88
48
Kada 24,9± 4,0 1,07
± 0,06 0,27
CNPH 1287
81,2± 5,0 2,49
± 0,36 2,02
72
Kada 20,0± 4,0 1,32
± 0,2 0,26
CNPH 1287
95,0± 2,1
96
Kada 17,6± 1,7
N/A N/A
88
Tempo (horas pós-inoculação)
0 24 48 72 96
Porcentagem de sítios com coloração azul (NBT)
0
20
40
60
80
100
Figura 4. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de O
2
.-
em células
epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada (
) e CNPH
1287 (
) com O. neolycopersici. Nos tempos indicados, discos foliares foram
cortados e infiltrados em solução de nitrobluetetrazolium (NBT) a 0,1% para
avaliação microscópica da frequência dos sítios de infecção com precipitado
azul. Cada ponto representa pelo menos 100 sítios de infecção avaliados.
Barras indicam desvio-padrão. ** Indicam diferença estatística ao nível de 1%
de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
A frequência de células epidérmicas com coloração amarelada às 72
hpi foi mais alta no genótipo resistente (ver 3.4). O aspecto do sítio de infecção
primário em CNPH 1287 às 120 hpi é o de um quebra-cabeça, sendo as peças
amareladas células mortas e as azuis células vivas que apresentam acúmulo
de O
2
.-
(Figura 5G). As células coradas de azul muitas vezes circundam as
células mortas. No genótipo CNPH 1287, ao longo da extensão das hifas,
algumas células epidérmicas que apresentavam haustórios apresentam cor
amarelada e outras reação de NBT (Figura 5E). Os sítios de infecção que
apresentavam células de cor amarelada foram observados sob luz fluorescente
para confirmar morte celular (Figura 5I e 5J).
**
**
**
**
89
(continua na página seguinte)
Figura 5. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro mostrando acúmulo de O
2
.-
em células atacadas após inoculação
de plantas de cv. Kada e CNPH 1287. Discos foliares foram cortados e
infiltrados em solução de nitro blue tretrazolium (NBT) a 0,1% para avaliação
microscópica em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com
lactofenol-azul de algodão. A: CNPH 1287, 48 hpi; acúmulo de O2.- na célula
epidérmica. B: Kada 48 hpi; células sem acúmulo de O2.- C: CNPH 1287, 72
hpi; acúmulo de O2.- e morte celular em células epidérmicas (setas). D: Kada
72 hpi; célula epidérmica mostrando coloração fraca no sítio de penetração. E:
CNPH 1287 96 hpi; células epidérmicas que apresentam haustórios mostrando
morte celular e acúmulo de O2.- (seta) no sítio de penetração. F: Kada 96 hpi;
células epidérmicas que apresentam haustórios sem sinais de acúmulo de O2.-
e células do mesófilo coradas de azul. G: CNPH 1287 120 hpi em plano focal
superior; células epidérmicas mortas em alguns sítios de penetração e com
acúmulo de O2.- (seta) em outros. H: CNPH 1287 120 hpi em plano focal
inferior; células vizinhas do mesófilo com intensa coloração azul. I: CNPH 1287
120 hpi células amareladas rodeadas por células com coloração de NBT
(setas). J: idem I observado sob luz fluorescente. Abreviações: MC= morte
celular; c= conídio. Barra A-F:10 µm; G: 20 µm.
A B
D
C
MC
c
c
c
c
90
Figura 5, continuação
c
MC
H
F
E F
G
MC
MC
c
H
I
MC
MC
J
MC
MC
91
3.4 Resposta de hipersensibilidade
Às 24, 48, 72 e 96 hpi, foi determinada a porcentagem de sítios de
infecção com células fluorescentes, indicativo de morte celular por
hipersensibilidade (HR) (Figura 6, Quadro 4).
Figura 6. Porcentagem de sítios de infecção com resposta de
hipersensibilidade (HR) em CNPH 1287 () e cv. Kada (
) em diferentes
horários pós-inoculação (hpi). Cada ponto representa pelo menos 200 sítios de
infecção avaliados. Barras indicam desvio-padrão. ** Indicam diferença
estatística ao nível de 1% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
Nas duas primeiras avaliações realizadas (24 e 48 hpi), a reação de
hipersensibilidade foi observada principalmente como fluorescência da parede
celular sendo muitas vezes parcial. Nas últimas avaliações, nas células onde
ocorreu penetração do fungo, a HR foi observada como fluorescência completa
no microscópio de luz fluorescente ou como cor amarelada no microscópio
comum (Figura 7D). Quando detectada HR na cultivar Kada, a fluorescência
era menos intensa (Figura 7B). O aspecto das células epidérmicas nos sítios
de infecção às 120 hpi adquire o mesmo aspecto de quebra-cabeça
apresentado na coloração com NBT nesse horário (Figura 7)
Tempo (horas pós-inoculação)
0 24 48 72 96
Porcentagem de sítios com HR
0
20
40
60
80
100
**
**
**
**
92
Quadro 4. Porcentagem de sítios de infecção com respostas de
hipersensibilidade (HR) após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e
CNPH 1287 com O. neolycopersici. Nos horários pós-inoculação (hpi)
indicados, foram cortados discos foliares para avaliação da frequência dos
sítios de infecção com o uso de microscopia de fluorescência incidente
Em todas as avaliações, no genótipo resistente houve maior frequência
de sítios com células apresentando HR quando comparado com a cultivar
suscetível. Às 96 hpi, 86% dos sítios de infecção avaliados na interação
resistente apresentaram HR, enquanto na interação suscetível a porcentagem
de sítios de penetração com HR foi 30%. O número de células por sítio de
infecção exibindo HR às 96 hpi foi de 2,1 e 1,2 no genótipo resistente e
suscetível, respectivamente (Quadro 4). Quando avaliado o número de células
com HR por sítio de infecção primário, a interação resistente apresentou 5
vezes mais reações de HR que no cultivar Kada.
Hpi
Genótipos
Sítios de infecção
com HR (%)
Nº de células com
HR por sítio de
infecção primário
Nº de células
com HR por
conídio avaliado
CNPH 1287
56,8
± 4,6
1 0,57
24
Kada 10,0± 4,1 1 0,10
CNPH 1287
63,8± 7,3 1 0,64
48
Kada 32,7± 3,5 1 0,33
CNPH 1287
64,9± 6,5 1,5± 0,21 0,97
72
Kada 24,2± 5,5 1,1± 0,07 0,27
CNPH 1287
86,1± 1,7 2,1± 0,22 1,81
96
Kada 30,3± 4,3 1,2± 0,15 0,36
93
Figura 7. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares
de tomateiro às 120 h após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e
CNPH 1287. Discos foliares foram cortados para avaliação microscópica de
resposta de hipersensibilidade (HR). Material corado com lactofenol-azul de
algodão. A: Desenvolvimento de hifas a partir de conídio sem presença de
células amareladas em cv Kada. B: idem C sob luz fluorescente; não se
detectou fluorescência. C: Células epidérmicas de cor amarelado (setas) em
CNPH 1287. D: idem C sob luz fluorescente; células amareladas na luz comum
apresentam fluorescência. Abreviações: c = conídio. Barra 10 µm.
A B
B A
C D
c c
c c
94
3.5 Análises bioquímicas
3.5.1 Atividade de peroxidase de guaiacol
Nos tempos 0, 12, 24, 72, 96 e 120 após inoculação, a atividade da
peroxidase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em relação
a Kada (Figura 8).
Diferenças na atividade da enzima em plantas inoculadas comparadas
com plantas sadias somente foram detectadas no genótipo CNPH 1287.
Ocorreu maior atividade da enzima às 8, 12, 24 e 120 hpi nas plantas
inoculadas em relação às plantas sadias.
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
Abs min
-1
mg
-1
proteína
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Figura 8. Dinâmica da atividade de peroxidase de guaiacol em plantas
inoculadas com O. neolycopersici (
) e plantas sadias (
) de S.
habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a
média ± desvio-padrão.
Foram detectadas variações na atividade da peroxidase em função do
tempo somente em plantas inoculadas do genótipo CNPH 1287. A atividade de
peroxidase em plantas desse genótipo inoculadas foi maior na coleta realizada
às 24 hpi seguida pela coleta das 120 hpi, das 12 hpi e por último das 72, 8, 48,
95
0 e 96 hpi. A coleta com menor atividade da enzima no genótipo CNPH 1287
foi a das 4 hpi.
3.5.2 Atividade de catalase
Nos tempos 24, 48, 96 e 120 após inoculação, a atividade da catalase
foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em relação a Kada
(Figura 9). Nos tempos 8, 12, e 72 hpi, somente as plantas inoculadas de
CNPH 1287 mostraram maior atividade da enzima do que as plantas
inoculadas da cv. Kada.
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
umol min
-1
mg
-1
proteína
0
20
40
60
80
100
120
Figura 9. Dinâmica da atividade de catalase em plantas inoculadas com O.
neolycopersici (
) e plantas sadias (
) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e
S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.
As diferenças na atividade da enzima em plantas inoculadas
comparadas com plantas sadias foram detectadas principalmente no genótipo
CNPH 1287. Nos tempos 8, 12, 72 e 120 hpi a atividade da enzima foi maior
nas plantas inoculadas em relação às plantas sem inocular desse genótipo. No
cultivar Kada, somente foi detectada diferença significativa entre as plantas
inoculadas e sem inocular às 12 hpi.
96
Foram detectados variações na atividade da catalase em função do
tempo em plantas de CNPH 1287 inoculadas. Essa ativiade foi maior na coleta
realizada às 12 hpi seguida das coletas realizadas às 72 e 48 hpi e pela
atividade às 24, 120 e 8 hpi. Em plantas inoculadas da cv. Kada, somente se
detectou maior atividade às 12 hpi.
3.5.3 Atividade de polifenoloxidase
Nos tempos 8, 12, 24, 48, 96 e 120 após inoculação, a atividade da
polifenoloxidase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em
relação a cv. Kada (Figura 10).
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
Abs min
-1
mg
-1
proteína
0
5
10
15
20
25
30
Figura 10. Dinâmica da atividade de polifenoloxidase em plantas inoculadas
com O. neolycopersici (
) e plantas sadias (
) de S. habrochaites CNPH
1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-
padrão.
As diferenças na atividade da enzima em plantas inoculadas
comparadas com plantas sadias somente foram detectadas no genótipo CNPH
97
1287, sendo que nos tempos 8, 12 e 24 hpi a atividade da enzima foi maior nas
plantas inoculadas.
Foram detectados variações na atividade da polifenoloxidase em
função do tempo somente em plantas de CNPH 1287 inoculadas. Nessas
plantas, a atividade foi maior na coleta realizada às 24 hpi seguida pelas
coletas realizadas às 120, 8, 48 e 12 hpi.
3.5.4 Atividade de quitinase
Nos horários 4, 8, 24 e 96 após inoculação, a atividade da quitinase foi
significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em relação às plantas de
Kada (Figura 11).
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
Abs min
-1
mg
-1
proteína
0
1
2
3
4
5
6
Figura 11. Dinâmica da atividade de quitinase em plantas inoculadas com O.
neolycopersici (
) e plantas sadias (
) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e
S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.
Diferenças na atividade da enzima em plantas inoculadas comparadas
com plantas sadias foram detectadas no genótipo CNPH 1287 às 24 e 72 hpi e
98
na cv. Kada somente às 12 hpi, sendo maior em todos os casos nas plantas
inoculadas do que nas plantas sem inocular.
Foram detectados variações na atividade da quitinase em função do
tempo somente em plantas de CNPH 1287 inoculadas. Essa atividade foi maior
na coleta realizada às 24 hpi seguida pelas coletas realizadas às 72, 8, 120, 48
e 96 hpi.
3.5.5 Atividade de β-1,3- glucanase
Nos horários de 4, 8, 24 e 48 após inoculação, a atividade da β-1,3-
glucanase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 do que em
Kada (Figura 12).
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
mg glicose min
-1
mg
-1
proteína
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Figura 12. Dinâmica da atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas
com O. neolycopersici (
) e plantas sadias (
) de S. habrochaites CNPH
1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-
padrão.
Diferenças na atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas
comparadas com plantas sadias somente foram detectadas no genótipo CNPH
1287. Nos horários de 8 e 24 hpi, a atividade da enzima foi maior nas plantas
99
inoculadas, enquanto no horário de 120 hpi essa atividade foi maior nas plantas
sem inocular.
Foram detectados variações na atividade da enzima em função do
tempo somente em plantas de CNPH 1287 inoculadas. A atividade da β-1,3-
glucanase foi maior nas coletas realizadas 8 e 24 hpi do que nos outros
horários.
100
4. DISCUSSÃO
4.1 Reação de hipersensibilidade
O termo hipersensibilidade foi usado pela primeira vez por Stakman
(1915) para descrever a morte rápida e localizada das células da planta no sítio
de infecção induzida pelo fungo da ferrugem em cereais com resistência à
ferrugem. Usualmente, a resposta de hipersensibilidade (HR) é definida como a
morte rápida de células da planta associada com a restrição do crescimento do
patógeno (GOODMAN & NOVACKY, 1994). A HR é geralmente reconhecida
pela presença de células mortas, de cor marrom, no sítio de infecção e,
dependendo do patógeno, o número de células envolvidas pode variar de uma
a várias. A HR pode estar restringida ou não à célula invadida ou em contato
direto com patógeno (HEATH, 2000). A necrose do tecido afetado é
diretamente relacionada ao acúmulo, à oxidação e à polimerização de fenóis
(NICHOLSON; HIPSKIND; HANAU, 1989). As interações incompatíveis estão
frequentemente associadas com HR (HAMMOND-KOSACK & JONES, 1996).
A HR pode expressar-se tanto como morte de células individuais quanto
necrose macroscopicamente detectável e é relatada em interações
incompatíveis como um dos mecanismos de defesa resultante da ativação de
genes do hospedeiro como resposta ao reconhecimento de moléculas
sinalizadoras do patógeno (elicitores) (AGRIOS, 2005).
No presente trabalho, as avaliações indicaram que ambos os genótipos
apresentaram HR, embora em diferentes níveis. Considerando-se a frequência
de HR e o número de células envolvidas por interação, a HR apresentada na
interação incompatível no último horário avaliado (96 hpi) é cinco vezes maior
que na compatível.
A autofluorescência das células epidérmicas ocorrida nas primeiras
horas da patogênese pode servir como indicativo de interação incompatível,
embora em fases mais avançadas esteja associada tanto com interações
compatíveis como incompatíveis envolvendo um maior número de células
mortas no hospedeiro (RODRIGUES et al., 2005).
101
Várias evidências sugerem que os compostos autofluorescentes
presentes nas células epidérmicas são compostos fenólicos relacionados
provavelmente à biossíntese da lignina (CARVER et al., 1994; CARVER et al.,
1996; WANG et al., 2007).
O valor relativamente alto de autofluorescência na interação Kada-O.
neolycopersici registrado somente a partir das 48 hpi confirma o
estabelecimento de uma relação biotrófica entre o fungo e a célula epidérmica
suscetível antes do desenvolvimento da morte celular. Já em CNPH 1287, a
autofluorescência ocorrida nas primeiras 24 hpi é um forte indicativo de morte
celular por HR, assim determinando, portanto, a interrupção do acesso a
nutrientes celulares por parte do patógeno. Segundo Dangl, Dietrich e Richberg
(1996), alguns dos mecanismos que conduzem à morte por HR e à morte
celular por doença são comuns.
A maior quantidade de hifas e de conidióforos desenvolvidos na cv.
Kada, nos tempos avaliados, indica que o desenvolvimento do fungo foi mais
rápido do que em CNPH 1287. Neste último genótipo, a elevada frequência de
HR em células epidérmicas atacadas seria responsável pela degenerescência
dos haustórios após sua formação, levando a uma menor colonização do
tecido. Matsuda et al. (2005) verificaram que, em acessos de S. habrochaites
completamente resistentes a oídio, não foram formados haustórios funcionais
devido ao desenvolvimento de resposta de hipersensibilidade nas células
epidérmicas invadidas pelo patógeno. Isso resultou na falha do
estabelecimento da infecção pelo conídio. Esses autores verificaram que, em
plantas de tomate suscetível, os conídios que formaram apressório penetraram
com sucesso e formaram haustórios sem causar resposta de hipersensibilidade
na célula atacada, produzindo hifas secundárias para expandir suas colônias.
Nossas observações indicaram que a HR não foi restrita à célula onde
foi formado o haustório, estendendo-se às células adjacentes. Huang et al.
(1998) também observaram necrose em células adjacentes às invadidas pelo
haustório em dois acessos de S. habrochaites (G1.1257 e G1.1290) inoculados
com O. lycopersicum.
A presença de células epidérmicas amareladas, indicativas de morte
celular, foi verificada a partir das 72 hpi no microscópio de luz normal e a
avaliação de células com autofluorescência a partir das 24 hpi. Segundo
102
Mansfield et al. (1997)
1
(citado por MLÍČKOVÁ et al., 2004), a cor amarelada
da célula é típica das últimas etapas de HR, já que as células se tornam
descoloridas várias horas depois de ocorrido dano irreversível nas membranas
celulares. Nas primeiras etapas de HR, outra expressão de incompatibilidade é
a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) (HAMMOND-KOSACK &
JONES, 1996).
4.2 Espécies reativas de oxigênio
Importantes diferenças na produção de EROs foram observadas nos
genótipos estudados. A geração de H
2
O
2
foi detectada nas folhas de CNPH
1287 nos primeiros horários pós-inoculação (12-24 hpi), enquanto no cultivar
suscetível o acúmulo de H
2
O
2
foi pouco frequente e fraco quando presente. O
acúmulo localizado de H
2
O
2
na célula provoca um efeito tóxico direto sobre o
patógeno e dano localizado na membrana celular em sítios de adesão com o
patógeno (MLÍČKOVÁ et al., 2004; RESENDE; SALGADO; CHAVEZ, 2003).
Esse último efeito foi comprovado neste trabalho, onde se detectou acúmulo
intenso de H
2
O
2
sob o apressório, inclusive na interação compatível. Em
contraste com essa resposta presente em ambas as interações no processo de
pré-penetração, o acúmulo de H
2
O
2
pós-penetração foi detectado mais
frequentemente na interação incompatível. Essa situação foi reportada por
Wang et al. (2007) na interação trigo-Puccinia striiformis f. sp. tritici e por
Hückelhoven et al. (1999) na interação cevada-Blumeria graminis f. sp. hordei).
Na interação incompatível, foi registrado um aumento importante de
sítios com acúmulo de H
2
O
2
entre 48 e 72 hpi. A frequência de células com
acúmulo de H
2
O
2
e apresentando HR às 72 hpi é similar em ambas as
interações. Como outros autores reportam no patosistema cevada-Blumeria
graminis f. sp. hordei (THORDAL-CHRISTENSEN et al., 1997;
HÜCKELHOVEN et al.,1999), trigo-Puccinia striiformis f. sp. tritici (WANG et al.,
2007) e Lactuca spp.-Bremia lactucae (SEDLÁŘOVÁ et al., 2007) e inclusive
1
J. MANSFIELD, M. BENNETT, C. BESTWICK, A. WOODS-TÖR. Phenotypic expression of gene-for-
gene interaction involving fungal and bacterial pathogens: variation from recognition to response, In:
CRUTE, I.R.; HOLUB, E.B.; BURDON, J.J. (Eds.), The gene-for-gene relationship in plant–parasite
interactions. CAB International, Wallingford, 1997. p. 265–291.
103
no mesmo patossistema aqui analisado (MLÍČKOVÁ et al., 2004;
TOMÁNKOVÁ et al., 2006), o acúmulo de H
2
O
2
nas células epidérmicas esteve
associado com a morte celular por HR. O mecanismo proposto é que as EROs,
sendo altamente reativas, causam a hidroxiperoxidação dos fosfolipídios da
membrana celular produzindo hidroperóxidos lipídicos. Esses últimos,
altamente tóxicos, rompem as membranas celulares provocando o colapso e a
morte celular por HR (AGRIOS, 2005).
O aumento de células coradas com DAB registrado a partir das 72 hpi
no cultivar suscetível pode ser explicado como uma reposta não específica do
tecido do hospedeiro resultante da desorganização celular causada pela
colonização do fungo e a subsequente restrição de nutrientes disponíveis.
O teste baseado na redução do NBT pelo radical O
2
.-
formando
formazan (precipitado azul) tem se revelado útil na detecção da geração do
superóxido. Na interação compatível, poucos sítios de penetração mostrando
acúmulo de O
2
.-
foram encontrados às 24 hpi. Por outro lado, na interação
incompatível, a frequência foi cinco vezes mais alta. Esse acúmulo de O
2
.-
continuou aumentando nas duas avaliações posteriores. A partir das 72 hpi,
observou-se morte celular nas células epidérmicas que apresentavam
haustórios e células vivas gerando O
2
.-
ao redor, enquanto em outras células
atacadas detectou-se acúmulo de superóxido. A quantidade de células
atacadas pelo fungo e apresentando morte celular por HR foi aumentando nos
horários finais, o que foi confirmado com as avaliações de HR usando
fluorescência.
Hückelhoven et al. (2000), estudando a interação cevada-Blumeria
graminis f. sp. hordei, reportou que uma explosão oxidativa foi induzida sob o
sítio de penetração do fungo nas células epidérmicas dos genótipos de cevada
resistentes. As células do mesófilo que acumularam H
2
O
2
e sofreram morte
celular por HR estavam rodeadas por uma camada de células vivas gerando
superóxido. Wang et al. (2007), estudando a interação compatível e
incompatível de trigo-Puccinia striiformis, também reportam acúmulo de O
2
.-
em
células de mesófilo rodeando células com HR. Jabs, Dietrich e Dangl (1996) e
Hückelhoven e Kogel (1998) sugeriram a hipótese de que a geração do radical
superóxido em células adjacentes a células com HR seria um sinal para
restringir a morte celular. O radical O
2
.-
interfere negativamente com a morte
104
celular protegendo as células do óxido nítrico através da formação do
peroxinitrito (ONOO
-
), o qual, aparentemente, não é muito tóxico para as
plantas (MLÍČKOVÁ et al., 2004). O óxido nítrico junto com H
2
O
2
desencadeia
morte celular (DELLEDONNE, 2005), indicando que o balanço entre O
2
.-
e H
2
O
2
é crucial para a indução e a restrição da morte celular.
Neste trabalho, os resultados indicam que o acúmulo de O
2
.-
e de H
2
O
2
na interação incompatível foi temporalmente diferente nas primeiras fases da
patogênese. Às 24 hpi, 50% dos sítios avaliados apresentavam reação com
NBT, enquanto, no mesmo tempo, somente 18% apresentavam acúmulo de
H
2
O
2
. O acúmulo antecipado de O
2
.-
aconteceu mais claramente na interação
resistente trigo-Puccinia striiformis, onde a maior geração do radical superóxido
(12 hpi) foi anterior à máxima geração de H
2
O
2
(24 hpi) (WANG et al., 2007).
Parte desse radical superóxido poderia ter sido convertida a H
2
O
2
pela
superóxido dismutase (SOD) ou por dismutação espontânea, embora a
geração de H
2
O
2
não dependa de uma geração prévia de O
2
.-
, podendo formar-
se a partir de outras fontes geradoras.
EROs nos sítios de interação podem ter diferentes funções tanto na
elicitação quanto na prevenção da morte celular, dependendo de sua
concentração, localização subcelular e duração da sua explosão oxidativa.
Neste trabalho, foram encontradas diferenças nas respostas de acúmulo de
EROs (H
2
O
2
e O
2
.-
) e de morte celular nas interações compatíveis e
incompatíveis entre oídio e duas espécies do gênero Solanum seção
Lycopersicon. Estas respostas foram mais rápidas e extensivas na interação O.
neolycopersici – S.habrochaites.
4.3 Atividade de enzimas relacionadas à patogênese
Na maioria dos tempos pós-inoculação, foi registrada uma maior
atividade de peroxidase de guaiacol (GPOX) no genótipo resistente (Figura 8).
Na cultivar suscetível não foram detectadas alterações na atividade da enzima.
Em CNPH 1287, a atividade aumentou das 4 hpi até 24 hpi, onde alcançou o
máximo, e às 120 hpi, onde houve outro pico de atividade.
105
O aumento da atividade da GPOX em plantas durante ou após ataque
de patógenos tem sido reportado em muitos trabalhos. As mudanças na
atividade da peroxidase indicam três níveis de respostas: mudanças não
específicas associadas com a inoculação, mudanças associadas com repostas
de defesa a nível geral e respostas que têm relevância no desenvolvimento de
HR (MLÍČKOVÁ et al., 2004).
A peroxidase tem um papel multifuncional, atuando como “peroxidase”,
reduzindo o nível de EROs ao metabolizar o H
2
O
2
, mas também como
“oxidase” gerando H
2
O
2
(HAMMOND-KOSACK & JONES, 1996). A produção
pH-dependente de H
2
O
2
por peroxidases de parede celular tem sido proposta
como via alternativa durante estresse biótico (BOLWELL & WOJTASZEK,
1997).
As peroxidases participam de vários processos fisiológicos
relacionados à defesa como ligação cruzada de proteínas de parede celular, de
pectinas por pontes diferúlicos e a oxidação de álcoois fenólicos durante a
formação de lignina. As isoenzimas de peroxidase estão presentes em
numerosos compartimentos celulares (retículo endoplasmático, aparelho de
Golgi, mitocôndria, citosol, vacúolos) e na parede celular. Na parede celular, as
peroxidases podem estar presentes em forma solúvel, iônica ou
covalentemente ligadas. O fortalecimento da parede celular, uma das funções
mais importantes da peroxidase, tem sido atribuído principalmente a
peroxidases cuja atividade pode ser detectada pelo uso de siringaldazina como
substrato na mistura de reação dos testes enzimáticos (RANIERI et al., 2001).
No genótipo suscetível, baixo acúmulo de H
2
O
2
nos tecidos
correspondeu a poucas mudanças na atividade de GPOX. Isso é coerente com
o rápido desenvolvimento do fungo e a baixa frequência de necrose celular
nesse genótipo. No genótipo resistente, a ocorrência do pico de atividade de
GPOX registrado no experimento coincide com as primeiras demonstrações de
HR. Considerando o papel da peroxidase no metabolismo de compostos
fenólicos, a intensa HR poderia estar associada com a localização de material
autofluorescente.
Sedlářová et al. (2007) descreveram aumento da peroxidase de
guaiacol solúvel em plantas de alface resistentes a Bremia lactucae após
inoculação com esse oomiceto. Mlíčcková et al. (2004) e Tománková et al.
106
(2006) analisando a interação O.neolycopersici- S.habrochaites var. glabratum
(LA 2128), relatam aumentos importantes na atividade dessa enzima. Enquanto
os primeiros autores registraram aumentos nas primeiras (8-16 hpi) e nas
últimas fases da infecção (48-120 hpi), os últimos detectaram aumentos de
atividade às 24 hpi e 72-168 hpi. Ambos os trabalhos não registraram
mudanças na formação de lignina em nenhum dos genótipos estudados. Esses
antecedentes confirmam os aumentos de atividade de GPOX em
S.habrochaites encontrados neste trabalho.
As EROs ocorrem normalmente no metabolismo celular, porém quando
acumuladas tornam-se tóxicas à célula, principalmente quando se convertem
para espécies ainda mais reativas como o radical hidroxil (OH
-
). Devido à
natureza daninha das EROs, as plantas utilizam sistemas enzimáticos
(superóxido dismutase, peroxidase de guaiacol, ascorbato peroxidase e
catalase) assim como sistemas antioxidantes não enzimáticos (glutatione,
ascorbato, tocoferol e compostos fenólicos) para prevenir o dano nos
componentes celulares do hospedeiro (SEDLAROVÁ et al., 2007). A catalase
(CAT) catalisa a reação de dismutação do peróxido de hidrogênio em água e
oxigênio, reduzindo dessa forma o excesso de EROs durante o estresse
oxidativo.
Nesse experimento, a atividade de CAT (Figura 9) em plantas
infectadas do genótipo resistente exibiu dois aumentos significativos no período
analisado, o primeiro e mais importante às 12 hpi e o segundo às 72 hpi. No
caso do cultivar suscetível, só foram registradas diferenças na atividade de
CAT entre plantas inoculadas e sadias às 12 hpi. O primeiro aumento de
atividade em CNPH 1287 coincide em tempo com os primeiros sinais de
acúmulo de H
2
O
2
nos locais de infecção de células epidérmicas. O segundo
pico de atividade registrado às 72 hpi poderia interpretar-se como resposta
frente a níveis muito altos de H
2
O
2
que ocorrem nesse momento. O aumento
registrado às 120 hpi sugere que os mecanismos de detoxificação
(“scavenging”) do H
2
O
2
excessivo podem seguir atuando nas fases mais
avançadas da patogênese. Esse comportamento da catalase também foi
reportado no mesmo patossistema por Mlíčková et al. (2004) e Tománková et
al. (2006).
107
A atividade da polifenoloxidase (PFO) foi maior em CNPH 1287 durante
todo o período avaliado (Figura 10). Além disso, somente nesse genótipo foram
detectadas diferenças de atividade entre plantas inoculadas e sadias, o que
ocorreu às 8, 12 e principalmente às 24 hpi. A atividade de PFO em Kada não
sofreu alterações ao longo do tempo e não houve diferenças entre plantas
inoculadas e não inoculadas.
As PFO são enzimas localizadas nos plastídios, que utilizam o oxigênio
molecular para a oxidação de mono e o-difenóis em o-diquinonas (VAUGHN;
LAX; DUKE, 1988). A atividade da PFO está latente até que a enzima é
liberada dos tilacoides por ferimentos, senescência ou ataque de insetos e
patógenos, iniciando o processo de oxidação dos compostos fenólicos. As
quinonas têm ação antimicrobiana (MOHAMMADI & KAZEMI, 2002) e são
altamente reativas participando de complexas reações não enzimáticas
secundárias. Entre elas, a conversão de quinonas em semiquinonas, as quais
tanto podem ligar-se covalentemente a outras moléculas, quanto realizar a
redução do oxigênio molecular a radical superóxido (THIPYAPONG; HUNT;
STEFFENS, 2004) e a reação covalente e ligação cruzada de
clorogenoquinona com proteínas fornecendo barreiras adicionais de fenóis
polimerizados (LI & STEFFENS, 2002). O papel da PFO na geração de EROs
está na oxidação de compostos fenólicos, reação que produz H
2
O
2
em extratos
vegetais (RICHARD-FORGET & GAUILLARD, 1997). A habilidade da PFO em
gerar EROs sugere que PFO não só tem papel direto na resposta de defesa
como também atua potencializando o acúmulo das EROs. O envolvimento da
PFO na resistência de plantas a fitopatógenos foi comprovada em plantas
transgênicas de tomate com superexpressão de PFO, onde os níveis
aumentados de atividade da enzima determinaram uma forte inibição do
crescimento de Pseudomonas syringae pv. tomato (LI & STEFFENS, 2002).
A correlação positiva encontrada nos níveis aumentados de atividade
de PFO até as 24 hpi em plantas resistentes inoculadas com o acúmulo de
H
2
O
2
e de O
2
.-
registrada a partir desse horário confirma o envolvimento dessa
enzima nas repostas de defesa do tomateiro frente a O. neolycopersici.
A reação de hipersensibilidade ocorre como uma expressão de
incompatibilidade entre a planta hospedeira e um patógeno específico, como
resultado da interação entre os genes de resistência e a virulência no
108
hospedeiro e no patógeno, respectivamente. Além de genes específicos para
resistência, as plantas contêm genes que codificam para proteínas com
atividade antifúngica geral. Essas proteínas relacionadas à patogênese
(proteínas PR), muitas delas enzimas, fazem parte da resposta de defesa
natural da planta e usualmente acompanham a HR. O acúmulo de PR
proteínas em plantas após infecção por patógenos está bem documentado
(VAN LOON, 1997). Entre elas, hidrolases como as β-1,3 glucanases (GLU) e
quitinases (QUI) estão envolvidas na resistência de plantas contra patógenos
fúngicos (JOOSTEN & DE WIT, 1989; KIM & HWANG, 1994; KINI; VASANTHI;
SHETTY, 2000; RIVERA et al., 2002). Essas enzimas atuam diretamente
degradando a parede celular de fungos ou interrompendo sua deposição, o que
contribui para a morte do patógeno (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988),
e indiretamente para a liberação de fragmentos da parede celular que atuam
como elicitores de repostas de defesa da planta hospedeira (YOSHIKAWA;
YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993).
Nesse experimento foi detectada atividade de QUI em ambos os
genótipos (Figura 11), embora o nível tenha sido maior em CNPH 1287. A
atividade de QUI apresentou um aumento importante nas plantas inoculadas do
genótipo resistente às 24 hpi e um aumento menos acentuado às 72 hpi. Já na
cultivar suscetível, houve um pequeno aumento de atividade nas plantas
inoculadas somente às 12 hpi. A atividade de GLU (Figura 12) aumentou às 8
e às 24 hpi em plantas inoculadas de CNPH 1287 enquanto no cultivar Kada
não houve aumento significativo de atividade. A presença de QUI e GLU em
plantas não inoculadas pode ser atribuída à expressão constitutiva dessas
enzimas em ambos os genótipos.
A atividade diferencial de GLU em interações compatíveis e
incompatíveis frente a patógenos obrigatórios tem sido estudada por vários
autores. Rivera et al. (2002) detectaram um aumento mais rápido da atividade
de GLU (às 48 hpi) e dos mensageiros dessa enzima no cultivar resistente de
melão quando inoculado com Sphaerotheca fusca. Kemp et al. (1999),
estudando a atividade de GLU em plantas de trigo resistentes e suscetíveis à
ferrugem da folha, encontraram maior atividade dessa enzima nas plantas
resistentes. Kini, Vasanthi e Shetty (2000) reportam diferentes níveis de
atividade e indução diferencial de isoformas de GLU em plântulas de milheto
109
resistentes e suscetíveis a Sclerospora graminicola. Após inoculação com esse
patógeno, a atividade em plantas inoculadas do cultivar resistente aumentou
em relação às plantas-controle e alcançou um pico às 24 hpi, enquanto nas
plantas do cultivar suscetível, a atividade da GLU foi maior em plantas sadias
do que nas inoculadas.
A atividade antifúngica de QUI pode ser sinergisticamente melhorada
pelas GLU tanto in vitro (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) como in vivo
(VAN LOON, 1997). Em plantas de tomateiro, Joosten e De Wit (1989)
registraram um rápido acúmulo de GLU e QUI em fluídos apoplásticos de
interações tomateiro-Cladosporium fulvum incompatíveis. Eles sugerem que,
devido ao acúmulo apoplástico dessas enzimas hidrolíticas, elas podem
proteger as plantas contra patógenos fúngicos extracelulares. Nas
extremidades das hifas, β-1,3 glucanos e quitina estão expostos na superfície e
poderiam ser atacados diretamente por GLU e QUI. Lawrence et al. (2000)
observaram maiores níveis constitutivos e maior indução de GLU e QUI em
genótipos de tomate altamente resistentes à pinta preta após inoculação com
A. solani em comparação com genótipos suscetíveis.
Nossos resultados também indicam que os níveis de enzimas
hidrolíticas pré-inoculação e os aumentos de atividade registrados após-
inoculação foram maiores no genótipo resistente. Lawrence et al. (2000)
encontraram níveis constitutivos de QUI e GLU cinco vezes e duas vezes mais
altos, respectivamente, em genótipos de tomate resistentes a Alternaria solani.
Embora os níveis constitutivos de QUI em CNPH 1287 sejam somente uma vez
e meia mais altos do que em Kada, o rápido aumento dos níveis detectado às 8
e às 24 hpi pode constituir-se em um dos fatores responsáveis pela defesa
frente ao ataque fúngico. O nível detectado de GLU pré-inoculação no genótipo
resistente foi 3,3 vezes maior do que na cultivar Kada.
As diferentes formas de GLU e QUI e quitinases ocorrem no apoplasto
(extracelular) e no vacúolo (intracelular). As PRs induzíveis são principalmente
proteínas acídicas que são secretadas ao espaço intercelular da folha. As PRs
básicas ocorrem em níveis relativamente baixos no vacúolo e são induzidas na
infecção (VAN KAN et al., 1992). O oídio é um patógeno biotrófico que cresce
na superfície da planta obtendo os nutrientes por meio de haustórios que
invaginam o plasmalema das células epidérmicas. Como consequência disso,
110
para ter algum efeito no patógeno, GLU e QUI extracelulares deveriam atuar na
parede do haustório e na matriz extra-haustorial. Por outro lado, o acúmulo
dessas enzimas nos vacúolos das células penetradas levaria a uma rápida
liberação de GLU e QUI no sítio de penetração (RIVERA et al., 2002). Essa
liberação de enzimas hidrolíticas durante a morte celular por HR ocorrida
possivelmente em plantas inoculadas de CNPH 1287 às 24 hpi pode ter
contribuído para deter o avanço do fungo. O pico de atividade GLU registrado
em CNPH 1287 às 8 hpi pode corresponder a formas extracelulares da enzima
induzidas previamente às formas intracelulares que estariam atuando no pico
das 24 hpi.
Os resultados confirmam a participação de H
2
O
2
e de O
2
.-
e enzimas
relacionadas a seu metabolismo (POX, CAT), assim como enzimas hidrolíticas
(QUI, GLU) e do metabolismo dos fenóis (PFO) nas respostas de defesa
envolvidas nessa interação patógeno-hospedeiro. A variação da intensidade e
do desenvolvimento temporal da produção de EROs, a expressão de enzimas
relacionadas à defesa e o desenvolvimento de HR, sugerem grandes
diferenças nos mecanismos de defesa dos genótipos estudados. Os resultados
de produção de EROs, reação de hipersensibilidade e atividade de POX e
CAT, são coerentes com resultados de experimentos já publicados, enquanto
os resultados de localização in situ de H
2
O
2
e O
2
.-,
assim como de atividade de
GLU, QUI e PFO, são novos nesse patossistema.
111
5. CONCLUSÕES
- O mecanismo de resistência do genótipo CNPH 1287 (Solanum
habrochaites) frente a Oidium neolycopersici esteve associado com resposta
de hipersensibilidade (HR) e explosão oxidativa.
- O aumento pós-inoculação da atividade da peroxidase do guaiacol,
polifenoloxidase e da catalase e os maiores níveis constitutivos e aumentos
pós-inoculação da atividade das enzimas hidrolíticas quitinase e glucanase
ocorridos nesse genótipo, são coerentes com o acúmulo concomitante de
EROs e o desenvolvimento de HR nos tecidos.
112
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118
CAPÍTULO 4
RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E
RESISTENTES A Alternaria solani, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS
RELACIONADAS À DEFESA
RESUMO
Para investigar as respostas de defesa de dois genótipos de Solanum
seção Lycopersicon com resposta diferencial a Alternaria solani, avaliou-se a
resposta de hipersensibilidade (HR), a produção e o acúmulo de espécies
reativas de oxigênio (EROs) e a atividade de enzimas relacionadas à defesa.
Quando plantas dos genótipos CNPH 1287 (Solanum habrochaites) e Santa
Cruz Kada (Solanum lycopersicum) apresentavam sete-nove e cinco-sete
folhas totalmente desenvolvidas, respectivamente, foi realizada a inoculação da
2ª, 3ª e 4ª folha verdadeira. Essas folhas foram coletadas no momento da
inoculação e às 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h pós-inoculação (hpi). A
produção e acúmulo in situ de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radical
superóxido (O
2
.-
) foi avaliada com o uso de diaminobenzidina e
nitrobluetetrazolio, respectivamente. Os conídios germinaram igualmente na
superfície foliar de ambos os genótipos sem orientação definida no crescimento
dos tubos germinativos. A menor frequência de lesões por A. solani no
genótipo CNPH 1287 foi conseqüência do menor número de apressórios
formados nesse genótipo. O acúmulo de H
2
O
2
e de O
2
.-
foi observado em baixa
frequência tanto no genótipo suscetível como no resistente. A HR foi observada
nas células epidérmicas onde ocorreu penetração em ambos os genótipos.
Nossos resultados indicam que EROs e HR não parecem contribuir com a
resistência de S. habrochaites frente a A. solani. Aumentos na atividade de
peroxidase de guaiacol, polifenoloxidase, β-1,3-glucanase e quitinase foram
registrados no genótipo resistente. Não foram detectados aumentos
significativos da atividade da catalase em nenhum dos genótipos. O
desenvolvimento diferencial do patógeno nos tecidos dos hospedeiros,
fundamentado na frequência de formação de apressórios, e a expressão de
119
enzimas relacionadas à defesa sugerem grandes diferenças no comportamento
dos genótipos frente a A. solani.
Palavras-chave adicionais: Pinta preta de tomate. Hipersensibilidade.
Espécies reativas de oxigênio. Peroxidase. Catalase. Polifenoloxidase.
Quitinase. β-1,3-glucanase.
120
ABSTRACT
Defense responses, in situ localization of reactive oxygen species and
activity of defense-related enzymes in tomato genotypes resistant and
susceptible to Alternaria solani
To investigate plant tissue defense responses in two Solanum section
Lycopersicon genotypes differing in their resistance against Alternaria solani,
hypersensitive reponse (HR), generation and accumulation of reactive oxygen
species (ROS) and activity of defense-related enzymes were studied. Seven-
nine and five-seven true leaves plants of CNPH 1287 (Solanum habrochaites)
and cv. ‘Santa Cruz Kada’ (Solanum lycopersicum), respectively, were
inoculated at 2
nd
, 3
rd
and 4
th
true leaves. At different time intervals (0, 4, 8, 12,
24, 48, 72, 96, e 120 hours post inoculation) these leaves were collected for
analysis. In situ production and accumulation of hydrogen peroxide (H
2
O
2
) and
superoxide radical (O
2
.-
) was detected with diaminobenzidine (DAB) and
nitrobluetetrazolium (NBT), respectively. Conidia germination occurred equally
over the leaf surface in both genotypes and germination tubes grew without
apparent orientation. Lower lesion frequency in CNPH 1287 was consequence
of lower number of appressoria formed by A. solani in that genotype. H
2
O
2
and
O
2
.-
accumulation were observed in lower frequency in both genotypes. HR was
observed in penetrated epidermal host cells also in both genotypes. It seems
that ROS and HR have not contributed to the resistance of S. habrochaites to A.
solani in this study. The activity of guaiacol peroxidase, poliphenol oxidase, β-
1,3-glucanase and chitinase was significantly increased in the resistant
genotype. No significant changes were detected in catalase activity in any of the
genotypes. Differential pathogen development in leaf host tissues, mainly due to
appressoria formation frequency, and expression of defense-related enzymes
suggest important differences in the resistance of these genotypes against A.
solani.
Additional keywords: Tomato early blight. Hypersensitive response. Reactive
oxygen species. Peroxidase. Catalase. Polyphenol oxidase. Chitinase. β-1,3-
glucanase.
121
1. INTRODUÇÃO
A pinta preta caracteriza-se por ser uma das mais importantes e
frequentes doenças da cultura do tomateiro [Solanum lycopersicum L.
(PERALTA; KNAPP, SPOONER, 20050 sin. Lycopersicon esculentum Mill.] a
nível mundial. Apresenta alto potencial destrutivo causando perdas que podem
ser maiores a 79% em países como Canadá, Índia, Estados Unidos e Nigéria
(FOOLAD; MERK; ASHRAFI, 2008). O uso de cultivares resistentes seria a
forma de controle mais eficiente e segura, mas, na prática, o progresso no
melhoramento por resistência à pinta preta tem sido limitado pela falta de genes
de resistência no tomateiro cultivado e pela expressão quantitativa e herança
poligênica da resistência. Várias espécies de tomateiro selvagens (S.
habrochaites S. Knapp & D. Spooner [sin. L. hirsutum Dunal], S. pimpinellifolium
L. [sin. L. pimpinellifolium (L.) Mill.], S. peruvianum L. [sin. L. peruvianum (L.)
Mill.] e S. chilense (Dunal) Reiche [sin. L. chilense Dunal]) têm sido identificadas
como fontes potenciais de resistência (CHAERANI & VOORRIPS, 2006).
Algumas dessas espécies são utilizadas pelo melhoramento tradicional, mas a
resistência tem se correlacionado negativamente com características
agronômicas e rendimento. Assim, portanto, a obtenção de cultivares
resistentes à pinta preta com melhor comportamento agronômico é ainda
necessária.
Embora mecanismos de defesa passivos ou pré-formados (espessura
da cutícula, presença de tricomas, entre outros) possam prevenir a infecção,
muitas vezes as plantas mostram respostas ativas frente ao ataque de
patógenos, incluindo transcrição de genes e formação de produtos de defesa
com o objetivo de retardar o desenvolvimento do patógeno (PASCHOLATI &
LEITE, 1995; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004). O estudo da
histologia das interações patógeno-hospedeiro pode ajudar a identificar
eventos que ocorrem na patogênese e levar, portanto, a um melhor
entendimento dos mecanismos da resistência (DITA et al., 2007).
122
As defesas induzidas incluem a produção de espécies reativas de
oxigênio (EROs), o fortalecimento da parede celular, a síntese de fitoalexinas e
o acúmulo de proteínas relacionadas à defesa. A geração localizada de
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radical superóxido (O
2
.-
) detectável
citologicamente é um dos eventos de resposta mais precoces dos tecidos
vegetais (BAKER & ORLANDI, 1995) e está provavelmente envolvida com a
indução da reação de hipersensibilidade (HR) (LEVINE et al., 1994).
Vários sistemas enzimáticos estão envolvidos nas respostas de defesa
da planta frente ao ataque de fitopatógenos. O papel das peroxidases (POX) no
processo de defesa é reforçar a parede celular através da formação de lignina,
suberina, polissacarídeos ferulicolados e glicoproteínas ricas em hidroxiprolina
(FRY, 1986), aumento na produção de EROs que atuam como mediadores na
sinalização e como agentes antimicrobianos (WOJTASZEK, 1997; KAWANO &
MUTO, 2000) e induzindo a produção de fitoalexina (KRISTENSEN; BLOCH;
RASMUSSEN, 1999). A catalase (CAT) desempenha um papel importante no
metabolismo das EROs, protegendo as células dos efeitos tóxicos do H
2
O
2
(LEBEDA et al., 2001). Dentro das proteínas relacionadas à patogênese (ou
proteínas PR), quitinases e β-1,3-glucanases são enzimas hidrolíticas que são
induzidas em várias interações planta-patógeno (VAN LOON, 1997). Elas
podem degradar componentes da parede celular de muitos fungos (MAUCH;
MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) e também podem atuar liberando fragmentos
de parede celular, os quais atuam como elicitores da resposta de defesa ativas
do hospedeiro (YOSHIKAWA; YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993). As
polifenoloxidases (PFO) são enzimas que oxidam mono e o-difenóis em o-
diquinonas (VAUGHN; LAX; DUKE, 1988) com ação antimicrobiana
(MOHAMMADI & KAZEMI, 2002). Também participam do processo de
lignificação durante a invasão pelo patógeno (LI & STEFFENS, 2002) e na
geração de EROs (RICHARD-FORGET & GAUILLARD, 1997; THIPYAPONG;
HUNT; STEFFENS, 2004).
Estudos histoquímicos (ARAÚJO & MATSUOKA, 2004) e bioquímicos
prévios (FERNÁNDEZ et al., 2006; SOLÓRZANO et al., 1996; SOLÓRZANO et
al., 1999; LAWRENCE et al., 2000)
indicaram diferenças na resposta de várias
espécies do gênero Solanum seção Lycopersicon frente à infecção com A.
solani.
123
O objetivo deste trabalho foi esclarecer os mecanismos de defesa de
um genótipo resistente de S. habrochaites e um suscetível de S. lycopersicum
frente a A. solani, através do estudo do desenvolvimento do fungo nos tecidos,
a localização in situ de H
2
O
2
e O
2
.-
, formação de papilas, reação de
hipersensibilidade e atividade de enzimas relacionadas à defesa nos
hospedeiros. Foi realizada uma seleção previa dos hospedeiros através de
avaliação da severidade de pinta preta utilizando um método de inoculação por
gota.
A análise morfológica dos esporos e as características culturais do
isolado de Alternaria utilizado neste trabalho indicam que o patógeno apresenta
algumas das características de A. tomatophila, descritas por Simmons (2000)
em seu artigo “Alternaria themes and variations”. Considerando a controvérsia
entre o trabalho de Simmons e aqueles baseados em análises de AFLP, como
o de Pérez-Martinez, Snowdon e Pons-Kühnemann (2004), e para evitar
problemas de comunicação, o agente causal de pinta preta de tomateiro neste
trabalho foi designado como A. solani.
124
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum
seção Lycopersicon
Com o objetivo de selecionar um hospedeiro resistente e um suscetível
para o experimento 2 (item 2.2), a severidade de pinta preta foi avaliada em
seis genótipos de tomateiros usando um método de inoculação por gota.
2.1.1 Patógeno e material vegetal
O isolado de A. solani (Ellis e Martin) Sorauer utilizado foi 1707 EH
cedido pelo Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil. Para a
manutenção, o fungo foi cultivado em meio V8 e incubado a 25ºC e fotoperíodo
de 8 h luz e 16 h de escuro. Para a indução de esporulação, quando a cultura
do fungo crescido no meio V8 atingiu 4/5 da placa, foi realizada raspagem do
micélio aéreo e lavagem do meio por 4 h em água corrente. Em seguida,
deixou-se a placa invertida para secar. Após 24 h, a placa foi fechada com
filme plástico e incubada nas condições já citadas. Para coletar os esporos,
acrescentou-se 10 mL de água destilada (com 0,1% ágar) nas placas contendo
culturas de aproximadamente 10 dias de idade e procedeu-se à raspagem do
micélio e filtragem em gaze, sendo determinado o número de conídios mL
-1
com auxílio de câmara de Neubauer ao microscópio de luz.
Foram utilizados seis genótipos de Lycopersicon spp. com diferentes
níveis de resistência a A. solani (Quadro 1). Os acessos de Solanum
lycopersicum var. cerasiforme e S. habrochaites foram cedidos pelo Centro
Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil.
Os genótipos foram semeados em bandejas contendo substrato
comercial para produção de mudas de hortaliças. Após 20 dias foram
transplantados para vasos de 0,5 L (duas planta por vaso) contendo o mesmo
125
substrato com fertilizante de liberação gradual (N 14%, P
2
O
5
16%, K
2
O 18%, S
8%, Mo 0.2%) e mantidos em câmara de crescimento a 20ºC-22ºC, 4000 lx e
12 h de fotoperíodo (lâmpada fluorescente).
Quadro 1. Lista e origem dos genótipos de tomateiro
Genótipo (cultivar, acesso) Origem
Solanum lycopersicum cv. Santa Cruz Kada
Comercial
S. lycopersicum cv. Santa Clara
Comercial
S. habrochaites (CNPH
1
416 – PI 126445)
CNPH
S. habrochaites (CNPH 423 – PI 134417)
CNPH
S. habrochaites (CNPH 1287 – PI 126445)
CNPH
S. lycopersicum var. cerasiforme (CNPH 0081 -
Silvestre de Felixlândia)
CNPH
1
CNPH - Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças da Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil.
2.1.2 Inoculação e avaliação de severidade
Aos 35 dias após o transplantio, quando as plantas apresentavam de
quatro a seis folhas totalmente desenvolvidas (dependendo da espécie), foi
realizada a inoculação utilizando o método de gota (“droplet inoculation
method”) (CHAERANI et al., 2007). Para isso, uma gota de 10 uL da
suspensão de esporos na concentração de 4,25x10
4
conídios de A. solani mL
-1
foi colocada no espaço internerval dos três folíolos apicais das quatro folhas
expandidas superiores. Adicionou-se ágar à suspensão de esporos para
melhorar a aderência da gota nas folhas. As plantas foram mantidas a 100% de
UR nas primeiras 48 h e, posteriormente, a 60%-75% de UR em câmara de
crescimento a 20ºC-22ºC, intensidade de luz 4000 lx e fotoperíodo de 12 h
(lâmpada fluorescente). O período de luz começou logo após a inoculação. A
avaliação de sintomas foi realizada aos 7 dias pós-inoculação (DPI) através
das medições da largura e comprimento das lesões. Plantas não inoculadas
foram usadas como controle.
126
2.1.3 Estatística e delineamento experimental
O delineamento usado foi inteiramente casualizado, com seis genótipos
e quatro repetições. A unidade experimental constituiu-se de um vaso contendo
duas plantas, nas quais se avaliaram os três folíolos apicais das quatro folhas
expandidas superiores. Foram realizados testes para homogeneidade da
variância (teste de Levene, p=0,05) e para a normalidade dos erros (teste de
Shapiro-Wilk, p=0,05). A transformação raiz quadrada de (x + 1) foi aplicada
nos dados antes da análise estatística para estabilizar as variâncias. Foi
realizada análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de
Scott-Knott (p=0,05).
2. 2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e
resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas
de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa
2.2.1 Patógeno e material vegetal
O isolado utilizado neste experimento assim como a metodologia usada
na indução da esporulação e a preparação do inóculo foram os mesmos
descritos no experimento 1 (item 2.1.1).
Os genótipos de tomateiro utilizados foram CNPH 1287 (Solanum
habrochaites) e Santa Cruz Kada (S. lycopersicum), resistente e suscetível à
pinta preta, respectivamente (o nível de resistência frente a A. solani foi
avaliado no experimento 1, item 2.1). A semente do cultivar Santa Cruz Kada
foi de origem comercial, enquanto a do genótipo CNPH 1287 foi cedida pelo
CNPH - EMBRAPA.
Os genótipos foram semeados em bandejas contendo substrato
comercial para produção de mudas. Após 18 dias as plântulas foram
transplantadas para vasos de 0,6 L (uma planta por vaso) contendo o mesmo
substrato com fertilizante de liberação gradual (N 14%, P
2
O
5
16%, K
2
O 18%, S
8%, Mo 0,2%) e mantidos em câmara de crescimento a 20-25 ºC, 4000 lx e 12
h de fotoperíodo (lâmpada fluorescente).
127
2.2.2 Inoculação e coleta de amostras
Aos 38 dias após o transplantio, quando as plantas de Kada e de
CNPH 1287 apresentavam cinco-sete e sete-nove folhas totalmente
desenvolvidas, respectivamente, foi realizada a inoculação da 2ª, 3ª e 4ª folha
verdadeira. A face superior de cada folha foi inoculada com uma suspensão de
esporos de 1,25 x 10
3
conídios mL
-1
de A. solani, usando pulverizador manual.
Condições de alta umidade do ar foram mantidas com câmara úmida.
Foram coletadas a 2ª, 3ª e 4ª folhas de plantas de tomateiro às 0, 4, 8,
12, 24, 48, 72, 96 e 120 h pós-inoculação (hpi) com O. neolycopersici. Folhas
de plantas de tomateiro não inoculadas também foram coletadas nesses
mesmos tempos. As folhas foram colocadas em caixa de isopor com gelo e
transportadas ao laboratório. As amostras destinadas para análise bioquímica
(3ª e 4ª folhas) foram pesadas, congeladas em N
2
líquido e armazenadas em
congelador para análise posterior.
Foram coletadas a 2ª, 3ª e 4ª folhas de cada tratamento, colocadas em
caixa de isopor com gelo, transportadas ao laboratório e pesadas, congeladas
em N
2
líquido e armazenadas em freezer para análise posterior.
2.2.3 Análises histoquímicas
2.2.3.1 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
A detecção histoquímica de H
2
O
2
foi feita de acordo com Romero-
Puertas et al. (2004), com algumas modificações. Foram cortados três discos
de 11 mm de diâmetro de tecido foliar da 2ª folha de cada planta e colocados
submersos em uma solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1% (p/v) em
tampão MES 10 mM (pH 6,5). O corante DAB foi infiltrado em vácuo até a
infiltração total do tecido foliar. Para verificar a especificidade dos precipitados
marrons característicos da reação de DAB com H
2
O
2
,
alguns discos foram
infiltrados com ácido ascórbico 10 mM (detoxificador de H
2
O
2
). Os discos
infiltrados foram incubados à temperatura ambiente por 1 h na luz e,
posteriormente, descorados por imersão em etanol (92º GL) aquecido a 78ºC e
conservados em glicerol 50% até observação. Os discos foram analisados
128
usando-se microscópio de luz e lactofenol-azul de algodão para visualizar as
estruturas do patógeno. O desenvolvimento do fungo foi caracterizado através
do número da porcentagem de germinação de conídios, número de tubos
germinativos por conídio germinado, formação de apressórios e de lessóes. A
detecção de H
2
O
2
foi realizada determinando-se o número de locais com
presença de precipitado marrom sob o ponto de penetração da hifa e as células
epidérmicas de cor marrom. Essas observações foram realizadas em três
discos por planta.
2.2.3.2 Localização in situ de superóxido (O
2
.-
)
A detecção in situ de O
2
.-
foi realizada segundo a metodologia de
Romero-Puertas et al. (2004), com modificações. Foram cortados três discos
de 11 mm de diâmetro de tecido foliar da 2ª folha de cada planta e colocados
submersos em uma solução de nitrobluetetrazólio (NBT) a 0,1% (p/v) em
tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,8). Foi realizada a infiltração completa
do corante no tecido foliar. Para verificar a especificidade dos precipitados
azuis de formazan característicos da reação de NBT com O
2
.-
, alguns discos
foram infiltrados com superóxido dismutase (SOD) 50 µg mL
-1
. Os discos
infiltrados foram incubados, descorados, conservados e analisados
microscopicamente segundo descrito no item 2.2.3.1 A detecção de O
2
.-
através da redução in situ do NBT foi realizada determinando-se o número de
locais com coloração azul nas células epidérmicas no sítio de penetração do
fungo. Essas observações foram realizadas em três discos por planta.
2.2.4 Resposta de hipersensibilidade
Foram avaliados os sítios de infecção (locais de penetração do
patógeno) mostrando morte celular nos três discos foliares da 2ª folha de cada
planta em cada intervalo de tempo. Os discos foram descorados e conservados
segundo procedimento descrito no item 2.2.3.1. A autofluorescência das
células epidérmicas foi observada sob luz azul incidente (excitação 460-490
nm) usando um microscópio Zeiss Axioskop. A resposta de hipersensibilidade
(necrose das células penetradas) foi detectada como uma autofluorescência da
129
parede celular ou de toda a célula epidérmica (KOGA et al., 1988). Para a
visualização das estruturas dos fungos, o material foliar foi tratado com
lactefenol-azul de algodão.
2.2.5 Determinação de papilas
Em amostras onde foi constatado acúmulo de H
2
O
2
sob o apressório,
utilizou-se azul-de-O toluidina para verificar a presença de compostos fenólicos
e confirmar formação de papilas. Os compostos fenólicos foram visualizados
por uma cor azul-turquesa em folhas descoloradas e, posteriormente, coradas
por 5 min em uma solução de azul-de-O toluidina ao 0,01 % (p/v) em tampão
fosfato de potássio 0,1 M, ph 6 (O´BRIEN; FEDER; MC CULLY, 1964;
MELLERSH et al., 2002; BORDALLO et al., 2002).
2.2.6 Análises bioquímicas
2.2.6.1 Obtenção dos extratos enzimáticos
A 3ª folha de cada planta (aproximadamente 0,5 g) foi macerada com
N
2
líquido e homogeneizada mecanicamente em 4 ml de tampão fosfato de
potássio 50 mM (pH 7,0) contendo 0,1 mM EDTA e 1% (p/p) de PVP (poli-vinil-
pirrolidona), em almofariz. O homogenato foi centrifugado a 15.000 g durante
30 min a 4°C, sendo o sobrenadante obtido considerado como extrato
enzimático, para a determinação do conteúdo protéico e da atividade de
peroxidase, catalase e polifenoloxidase.
Para determinação de atividade de quitinase e β-1,3-glucanase foi
utilizado extrato enzimático obtido a partir da 4ª folha utilizando tampão acetato
de sódio 100 mM (pH 5,2). O procedimento de extração e centrifugação foi o
mesmo utilizado anteriormente.
2.2.6.2 Proteínas totais
O teste de Bradford (1976) foi empregado para a quantificação do
conteúdo total de proteínas nas amostras. A cada 50 µL do sobrenadante foi
130
adicionado, sob agitação, 2,5 mL do reagente de Bradford. Após 5 min foi
efetuada a leitura da absorbância a 595 nm em espectrofotômetro. A
concentração de proteínas, expressa em mg por mL de amostra (mg proteína
mL
-1
), foi determinada utilizando-se curva padrão de concentrações de
albumina de soro bovino (ASB) de 0 a 0,5 mg mL
-1
.
2.2.6.3 Atividade de peroxidase de guaiacol (EC 1.11.1.7)
A atividade da peroxidase de guaiacol (GPOX) foi determinada a 30°C,
através de método espectrofotométrico direto, pela medida da conversão do
guaiacol em tetraguaiacol em 470 nm (LUSSO & PASCHOLATI, 1999). A
mistura da reação continha 0,10 mL do extrato enzimático (conforme item
2.2.6.1) e 2,9 mL de solução com 250 µL de guaiacol e 306 µL de peróxido de
hidrogênio em 100 mL de tampão fosfato 0,01M (pH 6,0). A cubeta de
referência continha 3 mL da solução de guaiacol e peróxido de hidrogênio em
tampão fosfato. A atividade da peroxidase foi determinada por um período de 2
min. O diferencial entre a leitura aos 90 s e a leitura aos 30 s foi utilizado para a
determinação da atividade. Os resultados foram expressos em absorbância
min
-1
mg
-1
de proteína, sendo a determinação de proteínas efetuada como
descrito no item 2.2.6.2.
2.2.6.4 Atividade de catalase (EC 1.11.1.6)
A atividade da catalase (CAT) foi quantificada pelo método de Góth
(1991), modificado por Tomanková et al. (2006), através do complexo estável
formado pelo molibdato de amônio com peróxido de hidrogênio (A
405
). O extrato
enzimático (0,1 mL) (conforme item 2.2.6.1) foi incubado em 0,5 mL de mistura
de reação contendo 60 mM de peróxido de hidrogênio em tampão fosfato de
potássio 60 mM pH 7,4 a 38ºC por 4 min. A adição de 0,5 mL de 32,4 mM de
molibdato de amônio após 4 min de incubação foi feita para deter o consumo
de peróxido de hidrogênio pela enzima presente no extrato. Foi preparado um
branco para cada amostra através da adição de molibdato de amônio à mistura
de reação, omitindo o período de incubação. O complexo amarelo de molibdato
e peróxido de hidrogênio foi medido a 405 nm. A diferença entre a absorbância
131
do branco e a amostra incubada indicou a quantidade de peróxido de
hidrogênio utilizado pela enzima. A concentração de H
2
O
2
, foi determinada
utilizando-se o coeficiente de extinção є = 0,0655 mM
-1
cm
-1
.
2.2.6.5 Atividade de polifenoloxidase (EC 1.10.3.2)
A atividade das polifenoloxidases (PFO) foi determinada usando-se a
metodologia de Duangmal e Apenten (1999). O ensaio consistiu em quantificar
a oxidação do catecol convertido em quinona, reação mediada pela enzima
polifenoloxidase. O substrato foi composto por catecol, na concentração de 20
mM, dissolvido em tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6,8). A reação se
desenvolveu misturando-se 900 µL do substrato e 100 µL do extrato enzimático
(Item 2.2.6.1). A temperatura de reação foi de 30°C e as leituras em
espectrofotômetro, a 420 nm, foram realizadas de forma direta por um período
de 2 min. O diferencial entre a leitura no primeiro minuto e a leitura inicial foi
utilizado para a determinação da atividade. Os resultados foram expressos em
absorbância min
-1
mg
-1
de proteína.
2.2.6.6 Atividade de quitinase (EC 3.2.1.14)
A atividade da quitinase (QUI) foi avaliada através da liberação de
fragmentos solúveis de “CM-chitin-RBV”, a partir de quitina carboximetilada
marcada com remazol brilhante violeta (“Carboxy Methyl-Chitin-Remazol
Brilliant Violet”, Loewe Biochemica GmbH) (WIRTH & WOLF, 1990;
STANGARLIN; PASCHOLATI; LABATE, 2000). Para isso, foi utilizado 600 µL
do tampão de extração (acetato de sódio 100 mM pH 5,2) misturado com 200
µL de extrato enzimático (item 2.2.6.1) e 200 µL de “CM-chitin-RBV” (2 mg L
-1
).
Após incubar por 20 min a 40ºC, a reação foi interrompida com 200 µL de HCl
1M, seguido de resfriamente em gelo e centrifugação a 10.000 g por 5 min. A
absorbância do sobrenadante foi determinada a 550 nm. Os resultados foram
expressos em unidades de absorbância min
-1
mg
-1
proteína, descontando-se os
valores de absorbância do branco (800 µL de tampão de extração + 200 µL de
“CM-chitin-RBV”).
132
2.2.6.7 Atividade de β-1,3- glucanase (EC 3.2.1.6)
Para determinar a atividade da β-1,3-glucanase (GLU), 150 µL do
extrato enzimático (item 2.2.6.1) foram adicionados a 150 µL de laminarina (1,5
mg mL
-1
) em tampão de extração (acetato de sódio 100 mM pH 5,2). Como
controle, utilizou-se a mesma reação onde a laminarina foi adicionada
imediatamente antes da determinação de açúcares (sem incubação). A reação
foi conduzida a 40ºC durante 60 min, em banho-maria. Após o período de
incubação, os açúcares redutores formados foram quantificados pelo método
de Lever (1972). Para isso, foi retirada uma alíquota de 50 uL dos tubos
incubados e adicionado 1,5 mL de solução de hidrazida do ácido p-
hidroxibenzóico (PAHBAH) 0,5% em NaOH 0,5 M. A mistura foi mantida em
banho-maria fervente por 10 min e resfriada em banho de gelo. A leitura das
absorbâncias foi realizada a 410 nm, em espectrofotômetro descontando-se os
valores de absorbância do branco. A quantidade de açúcares foi determinada
utilizando-se curva-padrão de concentrações de glicose, variando de 0 a 100
µg glicose mL
-1
.
2.2.7 Estatística e delineamento experimental
A parcela experimental constituiu-se de um vaso contendo uma planta.
O delineamento experimental utilizado foi esquema fatorial considerando-se
dois genótipos (CNPH 1287 e Kada) x presença e ausência do patógeno (A.
solani) x nove horários de coleta (0, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h após a
inoculação) com três repetições.
Foi realizada análise de variância e as médias foram comparadas pelo
teste de Scott-Knott (p=0,05).
133
3. RESULTADOS
3.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum
seção Lycopersicon
As primeiras lesões resultantes da inoculação apareceram aos quatro
dias após a inoculação. No experimento foi usada a concentração de inóculo
de 425 conídios gota
-1
, superior àquela usada por Chaerani et al. (2007) (40 a
200 conídios gota
-1
), embora o tamanho das lesões obtidas tenha sido similar
às desse autor.
A média do tamanho das lesões nos genótipos de tomateiro aos 7 DPI
está apresentada no Quadro 2.
Quadro 2. Tamanho das lesões de pinta preta obtidas por inoculação por
método de gota em seis genótipos de tomateiro
Genótipos
Tamanho de lesão (mm
2
)
1
Solanum habrochaites (CNPH 416 – PI 126445)
0,47 a
S. habrochaites (CNPH 1287 – PI 126445)
5,86 a
S. lycopersicum var. cerasiforme (CNPH 0081 –
Silvestre de Felixlândia)
22,03 b
S. lycopersicum cv. Santa Clara
31,28 b
S. habrochaites (CNPH 423 – PI 134417)
38,73 b
S. lycopersicum cv. Santa Cruz Kada
41,13 b
C.V (%)
29,8
Médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao
nível de 5% de probabilidade. Médias originais. Para análise estatística, os dados foram
transformados em raiz (x+1).
1
Largura x comprimento medidos aos 7 DPI. Cada valor é uma média de 4 repetições de 24
folíolos (3 folíolos x 4 folhas x 2 plantas).
Houve diferenças entre genótipos, formando-se dois grupos no teste de
diferenças de médias. O grupo que apresentou menor tamanho de lesão
134
estava formado por CNPH 416 e CNPH 1287. O outro grupo esteve formado
por todos os outros materiais que formaram lesões maiores. O fato de que
CNPH 416 e CNPH 1287 integraram o mesmo grupo é coerente com a origem
comum de ambos os materiais, o acesso PI 126445. O genótipo CNPH 416
resultou de uma seleção feita no Centro Nacional de Produção de Hortaliças da
EMBRAPA a partir do acesso PI 126445 e o CNPH 1287 teve sua origem em
uma seleção do USDA (United States Department of Agriculture) a partir do
mesmo acesso.
3.2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e
resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas
de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa
3.2.1 Desenvolvimento de A. solani sobre os hospedeiros
O desenvolvimento do fungo foi avaliado em ambos os genótipos em
todos os horários de coleta após inoculação. Na primeira avaliação, às 4 hpi, a
maioria dos conídios havia germinado, sendo a porcentagem de germinação
média de 83,7% e 84,9% para Kada e CNPH 1287, respectivamente. O
máximo de germinação de conídios foi registrado às 12 hpi com 93,3% e 93,2%
nos materiais suscetíveis e resistentes, respectivamente. A emissão de tubos
germinativos ocorreu a partir de células situadas na base, na metade ou na
extremidade dos conídios (Figura 1A). O número de tubos germinativos por
conídio atingiu um máximo de 3,7 e 2,8 em Kada e CNPH 1287,
respectivamente, às 12 hpi. Os tubos germinativos alcançaram tamanhos
variados. A maioria deles cresceu e formou hifas na superfície do hospedeiro e
alguns formaram dilatações tipo apressórios (Figura 1B e 1C). Não foi
observada orientação definida no crescimento dos tubos germinativos em
nenhum dos genótipos de tomateiro. A maioria dos apressórios observados
localizou-se nas extremidades dos tubos germinativos e lateralmente nas hifas
e formaram-se principalmente nas junções das células epidérmicas (Figura 1C)
e raramente no complexo estomatal (Figura 1D). O número de apressórios
formados na cv. Kada foi significativamente maior do que no CNPH 1287 em
todos os horários pós-inoculação (Quadro 3, Figura 2 ).
135
Figura 1. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de
tomateiro cv
“Kada” em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com
lactofenol-azul de algodão.
A: 4 hpi; conídio com tubos germinativos. B: 48 hpi;
conídio com apressórios (setas) nas extremidades dos tubos germinativos C:
48 hpi; apressórios (setas) nas junções das células epidérmicas. D: 48 hpi;
apressório (seta) sobre as células do estômato. E: 48 hpi; dois apressórios
(seta) sobre a mesma célula epidérmica. F: 96 hpi; local de penetração (seta) e
lesão desenvolvida a partir deste. Abreviações: c = conídio; ap = apressório.
Barra 50 µm.
A B
C
D
A
c
c
c
c
E F
136
A partir das 72 hpi foi constatado o aparecimento de lesões em ambos
os genótipos (Figura 1F), embora o número de lesões avaliadas às 96 e às 120
hpi tenham sido significativamente menores no genótipo resistente (Quadro 3).
Quadro 3. Porcentagem de conídios de A. solani apresentando apressórios e
lesões em genótipos de tomateiro em diferentes horários pós-inoculação (hpi)
Apressórios (%) Lesões (%)
Hpi
Kada CNPH 1287
Kada
CNPH
1287
12 29,1 a
1
1,3 b 0,0
0,0
24 20,6 a 6,6 b
0,0 0,0
48 28,0 a 5,3 b
0,0 0,0
72 28,6 a 6,8 b
0,0 0,0
96 36,5 a 8,8 b 7,0 a
0,0
b
120 23,2 a 11,8 b 16,6 a
2,2
b
1
Em cada horário pós-inoculação, médias na linha seguidas de mesma letra não diferem entre
si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
3
.2.2 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
A avaliação de sítios de interação fungo-hospedeiro mostrando
acúmulo de H
2
O
2
foi realizada em ambos os genótipos em todos os horários de
coleta após inoculação.
Embora pouco frequente, a adesão do apressório sobre a célula
epidérmica induziu acúmulo de H
2
O
2
nas células epidérmicas, indicada pela
coloração marrom-avermelhada da polimerização da Diaminobenzidina nas
células penetradas pelo fungo. Isso ocorreu tanto no genótipo suscetível como
no resistente a partir das 12 hpi (Figura 3A-D). A partir das 96 hpi, foi detectado
um acúmulo de H
2
O
2
localizado sob o apressório, sobretudo nas plantas do
genótipo suscetível (Figura 3E e 3F).
137
Tempo (horas pós-inoculação)
0 12 24 48 72 96
Porcentagem de conídios apresentando apressórios (%)
0
10
20
30
40
50
Figura 2. Porcentagem de conídios apresentando apressórios em plantas de
tomateiro cv. Kada (
●
) e CNPH 1287 (
●
) após inoculação com A.
solani. Cada ponto representa pelo menos 75 conídios avaliados. Barras
indicam desvio-padrão. ** e * indicam diferença estatística a nível de 1% e 5%
de probabilidade, respectivamente.
3.2.3 Localização in situ de superóxido (O
2
.-
)
A coloração com nitrobluetetrazólio (NBT) foi realizada para detectar a
geração e o acúmulo de O
2
.-
in situ. A localização histológica da coloração com
NBT foi avaliada microscopicamente nos diferentes horários pós-inoculação. A
partir das 72 hpi foram detectadas, em ambos os genótipos, células
epidérmicas com leve acúmulo de O
2
.-
ao redor das lesões (Figura 4A e 4B).
Menos frequentemente, detectou-se acúmulo de O
2
.-
localizado no local de
adesão do apressório sem indícios de aparecimento de lesão (Figura 4C).
Quando observada a lesão, as células epidérmicas penetradas e as vizinhas
apresentavam cor amarelada no microscópio de luz normal. Os sítios de
infecção que apresentavam células de cor amarelada foram observados sob
luz fluorescente para confirmar morte celular.
**
*
**
**
**
138
Figura 3. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de
tomateiro mostrando acúmulo de H
2
O
2
em células epidérmicas após inoculação
de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287. Discos foliares foram cortados
e infiltrados em solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1% para avaliação
microscópica em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com
lactofenol-azul de algodão. A: Kada, 12 hpi; acúmulo de H2O2 localizada em
complexo estomatal sob apressório. B: idem A em plano focal inferior. C: CNPH
1287 72 hpi; célula epidérmica mostra acúmulo de H2O2. D: idem C em plano
focal superior. E e F: Kada 96 hpi; coloração de DAB sob apressório sobre
junção de células epidérmicas. Abreviações: c = conídio; ap = apressório. Barra
50 µm.
c
c
c
c
ap
ap
E F
D
C
B
E
A
139
Figura 4. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de
tomateiro mostrando acúmulo de O
2
.-
em células atacadas após inoculação de
plantas de cv. Kada e CNPH 1287. Discos foliares foram cortados e infiltrados
em solução de nitro blue tretrazolium (NBT) a 0,1% para avaliação
microscópica em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com
lactofenol-azul de algodão. A: Kada 72 hpi; células epidérmicas mortas no local
de penetração e célula vizinha mostrando leve acúmulo de O2.- (seta). B:
CNPH 1287 96 hpi; células epidérmicas mortas no local de penetração e célula
vizinha mostrando leve acúmulo de O2.- (seta). C: Kada 96 hpi; apressório
(seta) sobre célula epidérmica apresentando reação de NBT; C1 plano focal
superior mostrando conídio, C2 plano focal inferior mostrando apressório na
célula epidérmica e C3 plano focal médio mostrando acúmulo de O2.- na célula
epidérmica. Barra A-B 10 µm, C 50 µm.
3.2.4 Resposta de hipersensibilidade
Nas avaliações realizadas a partir das 72 hpi, observou-se cor
amarelada nas células onde ocorreu penetração e autofluorescência quando
observadas no microscópio de luz fluorescente (Figura 5A-D). Isso aconteceu
tanto no genótipo suscetível quanto no resistente. Em estágios mais avançados
da patogênese, detectou-se fluorescência nas células do mesófilo sob áreas
lesionadas (Figura 5E e 5F).
A
C2
B
C1 C3
140
Figura 5. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de
tomateiro após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287.
Discos foliares foram cortados para avaliação microscópica de resposta de
hipersensibilidade (HR) em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material
corado com lactofenol-azul de algodão. A: Kada 96 hpi; local de penetração
sob apressório (seta) e reação das células epidérmicas à penetração por A.
solani. B: Kada 96 hpi; idem A sob luz fluorescente: células epidérmicas
apresentando reação de HR. C: CNPH 1287 96 hpi; local de penetração sob
apressório (seta) e reação das células epidérmicas à penetração por A. solani.
D: CNPH 1287 96 hpi; idem C sob luz fluorescente: células epidérmicas
apresentando reação de HR. E: CNPH 1287 120 hpi; lesão restrita pelos vasos
condutores (vc) na região superior e tecido epidérmico normal na região
inferior. F: CNPH 1287 120 hpi; idem E sob luz fluorescente. F1:
A B
E
C
F1
vc
C
D
F2
tecido lesionado e F2: tecido normal sem autofluorescência. Abreviações: vc =
vasos condutores. Barra 10 µm.
141
3.2.5 Papilas
Para verificar a ocorrência de papilas, as amostras em que se detectou
acúmulo de H
2
O
2
localizado sob o apressório (item 3.2.2) foram coradas com
azul-de-O toluidina para confirmar a presença de compostos fenólicos. Nas
avaliações realizadas às 96 hpi, observaram-se modificações da parede celular
de tipo papilas nas células epidérmicas do hospedeiro sob apressórios (Figura
6A e 6B). Isso aconteceu com maior frequência no genótipo suscetível, em
aparente conformidade com o maior número de apressórios formados nesse
material.
Figura 6. Microfotografias de tecidos clareados de tomateiro cv. Kada
mostrando papila em paredes de células epidérmicas, sob apressório (seta)
após 96 h pós-inoculação com conídios de A. solani. A: acúmulo de H
2
O
2
apresentando coloração de DAB (seta) sob apressório sobre junção de células
epidérmicas B: mesma interação mostrando compostos fenólicos em papila
(seta) corados com azul-de-O toluidina após infiltração de DAB 0,1%. Barra 50
µm.
3.2.6 Análises bioquímicas
3.2.6.1 Atividade de peroxidase de guaiacol
Nos horários 0, 4, 8, 24, 48 e 120 após inoculação, a atividade da
peroxidase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em relação
a Kada (Figura 7).
A B
142
Diferenças na atividade da enzima em plantas inoculadas comparadas
com plantas sadias, somente foram detectadas no genótipo CNPH 1287. A
atividade da enzima às 24, 72 e 120 hpi foi maior nas plantas inoculadas que
em plantas sadias.
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
Abs min
-1
mg
-1
proteína
0
5
10
15
20
25
30
Figura 7. Dinâmica da atividade de peroxidase de guaiacol em plantas
inoculadas com A. solani (
) e plantas sadias (
) de S. habrochaites CNPH
1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio
padrão.
A atividade da peroxidase em plantas de CNPH 1287 inoculadas foi
maior nas coletas realizadas às 72, 24 e 120 hpi, enquanto que, em plantas
sem inocular, a atividade da enzima foi maior no horário de 48 hpi. Em plantas
inoculadas da cv. Kada, a atividade foi maior às 72, 120, 96, 12 e 48 hpi.
143
3.2.6.2 Atividade de catalase
Somente às 48 hpi, a atividade da catalase foi significativamente maior
nas plantas de CNPH 1287 em relação a Kada (Figura 8). Em plantas
inoculadas de CNPH 1287, somente às 4 e 96 hpi a atividade da enzima foi
maior quando comparada com a atividade da enzima em plantas sadias. Na cv.
Kada, às 8 e 96 hpi as plantas inoculadas mostraram uma atividade da
catalase superior a das plantas sadias, enquanto que às 24 hpi ocorreu o
inverso, plantas sem inocular mostraram maior atividade.
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
umol min
-1
mg
-1
proteína
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Figura 8. Dinâmica da atividade de catalase em plantas inoculadas com A.
solani (
) e plantas sadias (
) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S.
lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.
Foram detectados variações na atividade da catalase em função do
tempo em plantas de CNPH 1287 inoculadas e não inoculadas. Nas plantas
inoculadas,, a atividade foi maior nas coletas realizadas às 24, 96 e 48 hpi,
enquanto que em plantas sem inocular, a atividade da enzima foi maior nos
144
horários das 24, 48 e 0 hpi. Em plantas inoculadas da cv. Kada, a atividade foi
maior às 96 hpi, seguida pela atividade às 72 e 8 hpi, enquanto que, em
plantas sadias, a atividade foi maior às 24 hpi.
3.2.6.3 Atividade de polifenoloxidase
A atividade da polifenoloxidase foi significativamente maior nas plantas
de CNPH 1287 quando comparadas a cv. Kada em todos os horários até as 72
hpi (Figura 9).
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
Abs min
-1
mg
-1
proteína
0
2
4
6
8
10
12
14
Figura 9. Dinâmica da atividade de polifenoloxidase em plantas inoculadas
com A. solani (
) e plantas sadias (
) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e
S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.
As diferenças na atividade da enzima em plantas inoculadas
comparadas com plantas sadias foram detectadas no genótipo CNPH 1287 às
72 e 96 hpi quando a atividade da enzima foi maior nas plantas inoculadas. Na
cv Kada, somente às 120 hpi a atividade da enzima nas plantas inoculadas foi
maior do que nas plantas sadias.
145
Foram detectados variações na atividade da polifenoloxidase em
função do tempo somente em plantas de CNPH 1287. A atividade de
polifenoloxidase em plantas de CNPH 1287 sem inocular foi maior na coleta
realizada às 48, 24 e 0 hpi.
3.2.6.4 Atividade de quitinase
Nos horários das 0, 24 e 72 após inoculação, a atividade da quitinase
foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 do que em Kada
(Figura 10).
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
Abs min
-1
mg
-1
proteína
0
1
2
3
4
Figura 10. Dinâmica da atividade de quitinase em plantas inoculadas com A.
solani (
) e plantas sadias (
) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S.
lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.
Diferenças na atividade da enzima em plantas inoculadas comparadas
com plantas sadias somente foram detectadas no genótipo CNPH 1287 às 96
hpi e sendo maior nas plantas inoculadas do que nas plantas sem inocular.
Foram detectados variações na atividade da quitinase em função do
tempo somente em plantas de CNPH 1287. A atividade da enzima em plantas
146
inoculadas foi maior na coleta realizada às 96 hpi seguida pelas coletas
realizadas às 24 e 72 hpi e em plantas sadias às 24, 72 e 0 hpi.
3.2.6.5 Atividade de β-1,3- glucanase
Nos horários 0, 4, 8, 24, 72 e 96 após inoculação, a atividade da β-1,3-
glucanase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 do que em
Kada (Figura 11).
Tempo (horas pós-inoculação)
0 4 8 12 24 48 72 96 120
mg glicose min
-1
mg
-1
proteína
0
1
2
3
Figura 11. Dinâmica da atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas
com A. solani (
) e plantas sadias (
) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e
S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.
Diferenças na atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas
comparadas com plantas sadias somente foram detectadas no genótipo CNPH
1287 ás 96 hpi, momento em que a atividade da enzima foi maior nas plantas
inoculadas.
Foram detectadas variações na atividade da glucanase em função do
tempo somente em plantas do genótipo CNPH 1287. A atividade da enzima em
147
plantas inoculadas foi maior nas coletas realizadas 24, 96, 0 e 4 hpi do que nos
outros horários e em plantas sadias às 24 e 0 hpi.
148
4. DISCUSSÃO
4.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum
seção Lycopersicon
O método de inoculação utilizado permitiu diferenciar eficientemente o
nível de resistência à pinta preta de um grupo de genótipos de tomateiro.
Embora a considerável quantidade de tempo requerido para a medição das
lesões, este método é objetivo e útil quando é necessária uma discriminação
detalhada do nível de resistência e quando são requeridos dados quantitativos
precisos em programas de melhoramento.
Chaerani e colaboradores (2007) utilizaram esse método para avaliar
54 acessos de tomateiro (incluindo espécies selvagens) em condições de casa
de vegetação. O método de inoculação por gota utilizando várias
concentrações de esporos foi o que melhor discriminou o nível de resistência
dos acessos quando comparado com o método de inoculação por pulverização.
As lesões geradas aos 7 dpi pela inoculação por gota foram desde pequenas
pintas até grandes manchas com uma distribuição exponencial de tamanhos de
lesões. Além disso, foram observadas correlações positivas significativas entre
os 54 acessos através de três testes diferentes.
Os resultados deste trabalho indicam que o método de inoculação por
gota é de simples aplicação e permite uma avaliação objetiva da severidade da
pinta preta. Esse método já foi utilizado anteriormente para avaliar com
sucesso severidade de pinta preta (CHAERANI et al., 2007) e componentes da
resistência à pinta preta (O´LEARY & SHOEMAKER, 1983) em acessos de
tomateiro.
149
4.2 Experimento 2:
Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e
resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas
de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa
Os conídios de A. solani germinaram igualmente na superfície foliar de
ambos os genótipos. Essa informação é coerente com a obtida por Araújo e
Matsuoka (2004) quando estudaram a histopatologia da interação A. solani- S.
lycopersicon (anteriormente L. esculentum) e A. solani-S. habrochaites
(anteriormente L. hirsutum var. glabratum). Em geral, os esporos de Alternaria
spp. germinam sobre folhas de cultivares resistentes e de plantas não
hospedeiras tão bem como nas plantas hospedeiras (ROTEM, 1994). Conídios
de A. brassicae, A. brassicicola, A. raphani e A. solani germinaram quase na
mesma taxa sobre as folhas de plantas hospedeiras e não hospedeiras, que
incluíam colza (Brassica napus), papoula (Papaver rhoeas), tomate (S.
lycopersicon) e trigo (Triticum aestivum) (McROBERTS & LENNARD, 1996).
A ausência de orientação definida no crescimento dos tubos
germinativos encontrada em ambos os genótipos de tomateiro está de acordo
com o observado por Araújo e Matsuoka (2004) no mesmo patossistema e por
Dita et al. (2007) no patossistema A.solani - batata. Resultados análogos em
outras interações de Alternaria spp. foram observados em A. porri - cebola
(AVELING; SNYMAN; RIJKENBERG, 1994) e A. brassicae, A. brassicicola e A.
raphani - brássicas (McROBERTS & LENNARD, 1996), A. cassiae - Vigna
unguiculata (VAN DER BERG; AVELING; VENTER, 2003) e A. panax –
ginseng americano (QUAYYUM; DOBINSON; TRAQUAIR, 2005).
Apesar da aparente ausência de orientação do crescimento dos tubos
germinativos, a grande maioria dos apressórios formou-se nas junções de
células epidérmicas, o que ocorre comumente em A. solani (ARAÚJO &
MATSUOKA, 2004; DITA et al., 2007) e em outras espécies do gênero
Alternaria (AVELING; SNYMAN; RIJKENBERG, 1994; McROBERTS &
LENNARD, 1996; BOEDO et al., 2008). Como possível causa dessa tendência
geral de os patógenos formarem apressórios nas junções de células tem sido
proposto que os estímulos para a formação de apressórios nessas espécies
sejam características gerais da topografia foliar e das flutuações de nutrientes
no microambiente das junções celulares (ARAÚJO & MATSUOKA, 2004).
150
A porcentagem de conídios apresentando apressórios foi sempre
inferior na superfície foliar de plantas de CNPH 1287 em comparação com cv.
Kada em todas as amostragens a partir das 12 hpi (momento em que foram
inicialmente detectados). Na análise do processo de infecção de A. solani em
tomateiro suscetível cv. Miller (S. lycopersicon) e resistente CNPH 417 (S.
habrochaites [anteriormente L. hirsutum var. glabratum]), a formação de
apressório foi um passo necessário para o sucesso da infecção, existindo uma
relação clara entre baixos níveis de formação de apressório e baixo número de
lesões no genótipo resistente (ARAÚJO & MATSUOKA, 2004). A influência do
genótipo na formação de apressórios parece ser, no entanto, um fato incomum
entre Alternaria spp. Apesar da escassez de estudos sobre o comportamento
dessas espécies em interações com mais de um hospedeiro, McRoberts &
Lennard (1996) estudaram o crescimento de A. brassicae, A. brassicicola e A.
raphani em oito espécies de crucíferas hospedeiras e A. solani, A. alternata, A.
brassicae, A. brassicicola e A. raphani, em colza, tomate, papoula e trigo
(representando hospedeiras e não-hospedeiras) e constataram que, pelas
taxas globais de formação de apressórios, ocorreram diferenças
interespecíficas entre os patógenos, mas apenas pequena variação para
espécies individuais de Alternaria spp. sobre as diferentes plantas, hospedeiras
ou não. Na interação A. solani - batata não foi detectada relação entre a
formação de apressório e a resistência da cultivar ou idade da folha, o que
sugere que a resistência à pinta preta da batata não estava associada com a
inibição da formação de apressórios nos cultivares testados (DITA et al., 2007).
As lesões se desenvolveram a partir de penetrações que ocorreram
após a formação de apressórios. A penetração por Alternaria spp. comumente
ocorre a partir de apressórios, o que comprovaria o caráter essencial dessa
estrutura para a patogênese (AVELING; SNYMAN; RIJKENBERG, 1994;
McROBERTS & LENNARD, 1996; ARAÚJO & MATSUOKA, 2004; DITA et al.,
2007). Em consequência, pode-se inferir que a menor frequência de lesões por
A. solani no genótipo CNPH 1287 foi consequência direta do menor número de
apressórios formados nesse genótipo.
O acúmulo de H
2
O
2
foi detectado mais precocemente (a partir das 12
hpi) do que o acúmulo de O
2
.-
(a partir das 72 hpi), embora em baixa
frequência. Ambas as espécies reativas de oxigênio foram observadas tanto no
151
genótipo suscetível como no resistente. A reação de hipersensibilidade foi
observada nas células epidérmicas onde ocorreu penetração às 72 hpi em
ambos os genótipos. Como, no entanto, penetrações e lesões foram mais
frequentes no genótipo Kada, a frequência de aparecimento de HR em células
epidérmicas desse genótipo foi mais elevada.
Os mecanismos moleculares por trás da ativação de mecanismos de
defesa são muito complexos. Frequentemente, as respostas começam com um
reconhecimento gene a gene do patógeno. A produção de certos fatores de
virulência pelo patógeno leva ao seu reconhecimento pelas plantas que
carregam o gene de resistência (R gene) correspondente (FLOR, 1971). O
reconhecimento resulta na rápida ativação das respostas de defesa e à
consequente limitação do crescimento do patógeno. A resistência mediada pelo
R-gene está usualmente acompanhada de uma rápida produção de EROs. A
produção de EROs é requerida para a ocorrência de outro componente da
resposta, a HR, um tipo de morte celular programada que limita o acesso do
patógeno a nutrientes. A resistência mediada por R-gene está associada
também com a ativação da via de sinalização dependente do ácido salicílico
(AS) que leva à expressão de certas proteínas relacionadas à patogênese (PR)
que contribuem para a resistência. Outras respostas de defesas vegetais estão
controladas por mecanismos dependentes do etileno (ET) e/ou jasmonatos
(JA). As vias de sinalização dependentes do AS, JA e ET interagem
extensivamente (GLAZEBROOK, 2005).
Os patógenos de plantas estão divididos em duas categorias de
acordo com seus estilos de vida: biotróficos e necrotróficos. Os biotróficos se
alimentam de tecido vegetal vivo enquanto os necrotróficos matam as células
do hospedeiro para alimentar-se do tecido morto. No caso dos biotróficos, a
resposta de HR privará a esses patógenos de sua fonte de alimento. No caso
dos necrotróficos, no entanto, a morte celular programada no hospedeiro
simplificaria a vida desses patógenos. A resistência gene a gene é uma forma
importante de resistência contra patógenos biotróficos e está associada com a
ativação de sinalização dependente do AS e resistência sistêmica adquirida. A
resistência gene a gene não deveria, no entanto, ser observada em interações
com patógenos necrotróficos, já que a morte celular do hospedeiro não limita
seu crescimento. Nesses patógenos, as respostas de defesa dependem da
152
sinalização de JA e ET (GLAZEBROOK, 2005). No caso de plantas de
Arabidopsis com a mutação coi1 que apresentavam a sinalização dependente
do JA bloqueada, foram suscetíveis frente a A. brassicicola indicando que a
sinalização dependente do JA era necessária para a resistência (THOMMA et
al., 1998). A produção da fitolalexina camalexina também é requerida, já que
mutantes pad3 (deficientes no gene da biossíntese da camalexina) são
suscetíveis (ZHOU; TOOTLE; GLAZEBROOK, 1999).
O acúmulo de EROs assim como a observação de HR foram
verificados em outros patossistemas envolvendo espécies do gênero Alternaria.
A inoculação com Alternaria brassicicola levou ao desenvolvimento de
pequenas lesões necróticas nas folhas de Arabidopsis thaliana e a grandes
lesões em plantas mutantes pad3-1 (deficientes em camalexina, fitoalexina do
tipo dos indóis). A produção de H
2
O
2
e a HR foram similares em ambos os tipos
de plantas, levando à conclusão de que a diferença estava nas respostas de
defesa após a ocorrência de morte celular (NARUSAKA et al., 2003). As
mudanças nos padrões de expressão de aproximadamente 7000 genes foram
examinadas por meio de análise de microarranjos de cDNA após inoculação
com A. brassicicola. Baseados nos resultados, os autores sugerem que a
mutação do gene pad3-1 alterou não só o acúmulo de camalexina como
também a coordenação da expressão de vários genes relacionados à defesa
na resposta ao desafio com A. brassicicola.
A geração de EROs foi examinada na interação compatível e
incompatível de Alternaria alternata patótipo pêra japonesa e plantas
hospedeiras (SHINOGI et al., 2003). As EROs foram induzidas nas paredes
celulares de apressórios e de pegs de penetração tanto em cultivares
suscetíveis quanto em resistentes, sendo o volume produzido maior na
interação suscetível do que na resistente. A geração de EROs pelas células do
hospedeiro só foi detectada, no entanto, na interação compatível, o que estaria
associado à morte celular facilitando, portanto, a colonização do patógeno.
Sharma e colaboradores (2007) estudaram duas linhagens de Brassica
derivadas de um cruzamento interespecífico entre Brassica napus e B. carinata
a respeito da sua tolerância frente a Alternaria brassicae. Uma das linhagens
mostrou tolerância frente ao patógeno, enquanto a outra se mostrou suscetível.
Usando eletroforese bi-dimensional, os autores analisaram as mudanças
153
produzidas ao nível proteómico que aconteceram em resposta ao patógeno.
Na linhagem tolerante, o nível de 48 proteínas foi afetado significativamente em
vários momentos diferentes (41 aumentaram e 7 diminuíram), enquanto na
linhagem suscetível modificou-se somente o nível de 23 proteínas (4
aumentaram e 19 diminuiram). As proteínas identificadas na linhagem tolerante
incluíram enzimas envolvidas com a geração de EROs e sua detoxificação,
com a transdução de sinais, assim como respostas mediadas pelo fitohormônio
auxina.
Em folhas destacadas de fumo e infiltradas com a toxina AT (Alternaria
alternata patótipo fumo) foi verificado o desenvolvimento de lesões necróticas
além da ocorrência de morte celular, níveis aumentados de H
2
O
2
,
malondialdeído e prolina livre e da atividade das proteases totais. Um acúmulo
extensivo de EROs foi detectado com DAB e 2’,7’– diclorofluoresceina
diacetato nas lesões produzidas pela toxina AT. O envolvimento das proteases
tipo caspase e das EROs no processo de morte celular sugere que a morte
celular induzida pela toxina AT é uma forma de morte celular programada
(YAKIMOVA et al., 2009).
Govrin e Levine (2000) examinaram a indução de explosão oxidativa e
de HR em Arabidopsis após inoculação com B. cinerea. O crescimento de B.
cinerea (necrotrófilo) foi suprimido no mutante dnd1 deficiente em HR e
favorecido pela HR causada pela infecção simultânea com uma raça avirulenta
de Pseudomonas syringae. A HR teve efeito oposto – inibitório -- sobre uma
raça virulenta de P. syringae (biotrófico). Além disso, os níveis de H
2
O
2
durante
a HR se correlacionaram positivamente com o crescimento de B. cinerea, mas
de forma negativa com o de P. syringae. Baseados nesses resultados, os
autores concluíram que a HR não protegeu as plantas contra a infecção dos
patógenos necrotróficos B. cinerea e Sclerotium sclerotiorum, mas, sim,
favoreceu a colonização dos tecidos.
Contrariamente, Dita e colaboradores (2007) verificaram que o número
de sítios de infecção apresentando HR era maior em plantas de batateira de
genótipo resistente a A. solani do que no genótipo suscetível após inoculação
com esse patógeno. Também encontraram relação entre o número de sítios de
penetração apresentando HR e idade das folhas, sendo mais frequentes em
lesões das folhas mais novas (da parte superior da planta).
154
Os resultados do presente trabalho não indicam que a geração de
EROs e a HR cumpram um papel importante na resistência frente a A. solani,
no entanto a ocorrência mais frequente de HR no genótipo suscetível, como
consequência da maior quantidade de lesões nesse genótipo, poderia ser um
fator que favoreceu a colonização dos tecidos do hospedeiro. Dessa forma, a
interação A. solani - tomateiro seguiria o modelo geral proposto para patógenos
necrotróficos, onde não parece existir resistência gene a gene caracterizada
por uma rápida produção de EROs e a consequente ocorrência de HR, e sendo
que, possivelmente, ocorrem defesas dependentes da sinalização de JA/ET
(GLAZEBROOK, 2005). Por outro lado, a produção de fitoalexinas, que tem se
revelado importante para a ocorrência de resistência na interação Arabidopsis -
A. brassicicola, não foi avaliada no atual experimento, mas poderia estar
envolvida na resistência na interação S. habrochaites - A. solani.
A observação de modificações de parede celular de tipo papilas em
ambos os genótipos sugere que a formação dessas estruturas não é uma
reação específica à resistência. Resultados similares foram reportados por
Araújo e Matsuoka (2004) na análise histopatológica da interação suscetível A.
solani - S. lycopersicon (cv. Miller) e A. solani – S. habrochaites (CNPH 417).
No trabalho de Mc Roberts e Lennard (1996), as papilas estiveram presentes
em locais onde a penetração foi bem sucedida e, portanto, não foram
consideradas importantes na ocorrência da resistência em plantas hospedeiras
e não hospedeiras frente a várias espécies de Alternaria.
Na maioria dos tempos pós-inoculação, a atividade da peroxidase do
guaiacol foi maior no genótipo resistente (Figura 7). Somente nesse genótipo
houve diferenças significativas de atividade entre plantas inoculadas e plantas
sadias (às 24, 72 e 120 hpi), sendo essa atividade maior nas plantas
inoculadas.
As peroxidases participam de vários processos fisiológicos
relacionados à defesa, como ligação cruzada de proteínas de parede celular,
de pectinas por pontes diferúlicos e a oxidação de álcoois fenólicos durante a
formação de lignina. As isoenzimas de peroxidase estão presentes em
numerosos compartimentos celulares (retículo endoplasmático, aparelho de
Golgi, mitocôndria, citosol, vacúolos) e na parede celular. Na parede celular, as
peroxidases podem estar presentes em forma solúvel, iônica ou
155
covalentemente ligadas. O fortalecimento da parede celular, uma das funções
mais importantes da peroxidase, tem sido atribuído, principalmente, a
peroxidases cuja atividade pode ser detectada pelo uso de siringaldazina como
substrato na mistura de reação dos testes enzimáticos (RANIERI et al., 2001).
As peroxidases também têm um papel multifuncional no metabolismo das
EROs, já atuando como “peroxidase”, reduzindo o nível de EROs ao
metabolizar o H
2
O
2
, mas também como “oxidase” gerando H
2
O
2
(HAMMOND-
KOSACK & JONES, 1996).
Trabalhos anteriores estudaram a atividade de peroxidase em
genótipos de tomateiro com diferente nível de resistência frente a A. solani.
Fernández et al. (1996) verificaram um aumento significativo na atividade da
peroxidase nas plantas inoculadas, em comparação com as plantas sadias. A
maior atividade foi detectada aos sete dias pós-inoculação. Quando
comparadas plantas inoculadas de cultivares resistentes, moderadamente
resistentes e suscetíveis, comprovou-se que as cultivares resistentes
apresentaram maior atividade da enzima, mas não se observaram diferenças
entre seus padrões isoenzimáticos. Capote et al. (2006), em um experimento
desenvolvido com calos e folhas de três cultivares de tomateiro que diferiram
no nível de resistência frente a A. solani, estudaram o efeito dos filtrados desse
patógeno sobre a atividade da peroxidase. Maior atividade da enzima foi
detectada em calos da cultivar resistente às 24 h após inoculação.
Esses resultados são coerentes com os aumentos de atividade da
peroxidase do guaiacol que acorreram principalmente no genótipo resistente
(S. habrochaites), após inoculação com A. solani.
As EROs ocorrem normalmente no metabolismo celular, porém,
quando acumuladas, tornam-se tóxicas à célula, principalmente quando se
convertem para espécies ainda mais reativas, como o radical hidroxil (OH
-
).
Devido à natureza daninha das EROs, as plantas utilizam sistemas enzimáticos
(superóxido dismutase, peroxidase de guaiacol, ascorbato peroxidase e
catalase), assim como sistemas antioxidantes não enzimáticos (glutatione,
ascorbato, tocoferol e compostos fenólicos) para prevenir o dano nos
componentes celulares do hospedeiro (SEDLAROVÁ et al., 2007). A catalase
(CAT) catalisa a reação de dismutação do peróxido de hidrogênio em água e
156
oxigênio, reduzindo, dessa forma, o excesso de EROs durante o estresse
oxidativo.
Neste trabalho, a atividade de CAT (Figura 8) não mostrou
comportamento diferencial entre genótipos nem aumentos destacáveis ao
longo da avaliação. A ausência de mudanças significativas na atividade da
catalase sugere que os mecanismos de detoxificação (“scavenging”) de EROs
propostos para essa enzima não estariam acontecendo nessa interação devido
à ausência de EROs em volume significativo.
A atividade da catalase não sofreu alterações em calos de Brassica
napus e B. juncea em meio de cultura adicionado com filtrados de cultura
fúngica de A. brassicae (DHINGRA & KIRAN NARESH MEHTA SANGWAN,
2004) nem em cultivares resistentes e suscetíves de B. juncea inoculados com
A. brassicae (CHAWLA; GUPTA; SAHARAN, 2001). De forma similar, a
atividade da peroxidase e SOD foi maior e a atividade da catalase levemente
inferior nas plantas de cártamo (Carthamus tinctorius) tolerantes regeneradas
via organogênese e via embriogênese somática a partir de culturas in vitro
tratadas com filtrados de culturas fúngicas de A. carthami, quando comparadas
com as plantas controle (suscetíveis) (VIJAYA KUMAR et al., 2008).
A atividade da polifenoloxidase (PFO) foi significativamente maior em
CNPH 1287 em quase todos os horários avaliados (Figura 9), sendo
detectadas diferenças de atividade entre plantas inoculadas e sadias às 72 e
96 hpi. A atividade de PFO em Kada não sofreu alterações ao longo do tempo
e somente houve diferenças entre plantas inoculadas e sem inocular às 120
hpi.
As PFO são enzimas localizadas nos plastídios, que utilizam o oxigênio
molecular para a oxidação de mono e o-difenóis em o-diquinonas (VAUGHN;
LAX; DUKE, 1988). A atividade da PFO está latente até que a enzima é
liberada dos tilacóides por ferimentos, senescência ou ataque de insetos e
patógenos, iniciando o processo de oxidação dos compostos fenólicos. As
quinonas têm ação antimicrobiana (MOHAMMADI & KAZEMI, 2002) e são
altamente reativas participando de complexas reações não enzimáticas
secundárias. Entre elas, a conversão de quinonas em semiquinonas, as quais
tanto podem ligar-se covalentemente a outras moléculas, quanto realizar a
redução do oxigênio molecular a radical superóxido (THIPYAPONG; HUNT;
157
STEFFENS, 2004) e a reação covalente e ligação cruzada de
clorogenoquinona com proteínas fornecendo barreiras adicionais de fenóis
polimerizados (LI & STEFFENS, 2002). O envolvimento da PFO na resistência
de plantas a fitopatógenos foi comprovada em plantas transgênicas de tomate
com super-expressão de PFO, onde os níveis aumentados de atividade da
enzima determinaram uma forte inibição do crescimento de Pseudomonas
syringae pv. tomato (LI & STEFFENS, 2002).
O envolvimento de PFO nas respostas de defesa foi verificado também
em genótipos resistentes frente a A. solani após inoculação com esse patógeno
(SOLÓRZANO et al., 1996). Os autores detectaram níveis mais altos de
fenilalanina amônia-liase e PFO na variedade resistente (NCEBR-1) em
comparação com as suscetíveis (HC 3880 e Campbell 28).
Quando patógenos fúngicos invadem tecidos vegetais, algumas
proteínas novas aparecem e se acumulam nos tecidos infectados. Essas
proteínas são chamadas proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR)
porque aparecem durante a patogênese. As proteínas PR são definidas como
proteínas codificadas pelo genoma da planta hospedeira e induzidas
especificamente em interações com patógenos (VIDHYASEKARAN, 2002). O
acúmulo de PR proteínas em plantas após infecção por patógenos está bem
documentado (VAN LOON, 1997). Entre elas, hidrolases como as β-1,3
glucanases (GLU) e quitinases (QUI) estão envolvidas na resistência de
plantas contra patógenos fúngicos (JOOSTEN & DE WIT, 1989; KIM &
HWANG, 1994; KINI; VASANTHI; SHETTY, 2000; RIVERA et al., 2002). Essas
enzimas atuam diretamente degradando a parede celular de fungos ou
interrompendo sua deposição, o que contribui para a morte do patógeno
(MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) e, indiretamente, liberando
fragmentos de parede celular que atuam como elicitores de repostas de defesa
da planta hospedeira (YOSHIKAWA; YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993).
Neste trabalho foi detectada atividade de QUI em ambos os genótipos
(Figura 10), embora o nível fosse quase sempre maior em CNPH 1287. A
atividade de QUI apresentou um aumento importante nas plantas inoculadas do
genótipo resistente às 96 hpi. A atividade de GLU (Figura 11) também foi
superior no genótipo resistente do que no suscetível em quase todos os
tempos pós-inoculação. De forma similar ao acontecido com a atividade da
158
QUI, a atividade de GLU em plantas inoculadas comparadas com plantas
sadias foi significativamente maior somente no genótipo CNPH 1287 às 96 hpi.
No cultivar Kada não houve aumento significativo de atividade. A presença de
QUI e GLU em plantas não inoculadas pode ser atribuída à expressão
constitutiva dessas enzimas em ambos os genótipos.
A atividade antifúngica de QUI pode ser sinergisticamente melhorada
pelas GLU tanto in vitro (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) como in vivo
(VAN LOON, 1997). Em plantas de tomateiro, Joosten e De Wit (1989)
registraram um rápido acúmulo de GLU e QUI em fluídos apoplásticos de
interações tomateiro - Cladosporium fulvum incompatíveis. Eles sugerem que,
devido ao acúmulo apoplástica dessas enzimas hidrolíticas, elas podem
proteger as plantas contra patógenos fúngicos extracelulares. As extremidades
das hifas, β-1,3 glucanos e quitina estão expostas na superfície e poderiam ser
atacadas diretamente por GLU e QUI. Em tomateiro, Lawrence, Joosten e
Tuzun (1996) verificaram níveis mais altos de QUI e GLU tanto na expressão
constitutiva quanto na induzida pelo patógeno em linhagens resistentes a A.
solani do que em genótipos suscetíveis. Solórzano et al. (1999) estudaram os
padrões isoenzimáticos de QUI em folhas de duas variedades de tomateiro, NC
EBR-1 (resistente) e HC 3880 (suscetível) após inoculação com A. solani. Eles
observaram duas isoformas ácidas presentes nas duas variedades, mas uma
delas era induzida precocemente na variedade resistente (24 hpi), enquanto,
na cultivar suscetível, era somente induzida às 72 hpi.
Nossos resultados também indicam que os níveis de enzimas
hidrolíticas pré-inoculação e os aumentos de atividade registrados após-
inoculação foram maiores no genótipo resistente. Os níveis constitutivos de
QUI e GLU foram uma vez e meia e três vezes mais altos em CNPH 1287 do
que em Kada. Lawrence et al. (2000) encontraram níveis constitutivos de QUI e
GLU cinco vezes e duas vezes mais altos, respectivamente, em genótipos de
tomate resistentes a Alternaria solani.
Formas apoplásticas (extracelulares) e vacuolares (intracelulares) são
reportadas nas GLU assim como em outras proteínas PR. As PRs induzíveis
são principalmente proteínas acídicas que são secretadas ao espaço
intercelular da folha. As PRs básicas ocorrem em níveis relativamente baixos
no vacúolo e são induzidas na infecção (VAN KAN et al., 1992). A liberação
159
das GLU e QUI intracelulares durante a morte celular das células penetradas
contribuiria a deter ou matar o fungo invasor (RIVERA et al., 2002). A maior
quantidade de enzimas hidrolíticas constitutivas no genótipo resistente e o
aumento de atividade detectado em plantas inoculadas desse genótipo às 96
hpi determinariam menor desenvolvimento de A. solani nos tecidos.
Os resultados confirmam a participação de POX, enzimas hidrolíticas
(QUI, GLU) e do metabolismo dos fenóis (PFO) nas respostas de defesa
envolvidas nessa interação patógeno - hospedeiro. O desenvolvimento
diferencial do patógeno nos tecidos dos hospedeiros, fundamentalmente na
frequência de formação de apressórios, e a expressão de enzimas
relacionadas à defesa sugerem grandes diferenças no comportamento dos
genótipos frente ao patógeno. Os resultados de formação de apressórios, de
lesões, de papilas, de reação de hipersensibilidade e de atividade de enzimas
relacionadas à defesa são coerentes com resultados de experimentos já
publicados, enquanto os resultados de localização in situ de H
2
O
2
e O
2
.-
são
novos neste patossistema.
160
5. CONCLUSÕES
- A resistência do genótipo CNPH 1287 (Solanum habrochaites) frente
a Alternaria solani não esteve associada com a geração de espécies reativas
de oxigênio (EROs) nem com resposta de hipersensibilidade (HR).
- O aumento pós-inoculação da atividade de peroxidase de guaiacol e
polifenolxidase e os maiores níveis constitutivos e aumentos pós-inoculação da
atividade das enzimas hidrolíticas quitinase e glucanase indicam maior
envolvimento dessas enzimas em repostas de defesa nesse genótipo.
- A ausência de resposta na atividade da catalase (enzima envolvida na
detoxificação das EROs é coerente com o escasso acúmulo de EROs nos
tecidos foliares.
161
CONSIDERAÇÕES FINAIS
As plantas desenvolveram a habilidade de reconhecer e de responder
às moléculas elicitoras dos patógenos ativando rapidamente respostas de
defesa. Antes do advento da genética molecular, esse fenômeno foi observado
como uma interação entre patógenos carregando genes dominantes (genes de
avirulência) que determinavam o reconhecimento das plantas hospedeiras que
carregavam genes dominantes de resistência (R genes), o que levou à
nomenclatura chamada de gene a gene. Os patógenos que são reconhecidos
nessa forma e que, portanto, falham na tentativa de causar doença, são
chamados de patógenos avirulentos e o hospedeiro é chamado resistente e a
interação é chamada incompatível. Na ausência de um reconhecimento gene a
gene, devido à ausência do gene de avirulência no patógeno e/ou do gene de
resistência no hospedeiro, o patógeno é virulento, o hospedeiro é suscetível e a
interação é compatível. Parte das rápidas mudanças de expressão dos genes
que ocorrem nas respostas gene a gene também ocorrem nas interações
suscetíveis, mas com menor cinética e amplitude reduzida. Resistência e
suscetibilidade não seriam alternativas binárias, já que há um continuum de
interações possíveis, que vão da resistência completa à suscetibilidade
extrema.
Há duas respostas de defesa que são consideradas distintivas da
resistência gene a gene. Uma delas é a rápida produção de espécies reativas
de oxigênio (EROs), chamada de explosão oxidativa. Esse aumento das EROs
pode ter um efeito antimicrobiano direto, assim como servir como sinal para a
ativação de outras respostas de defesa. A outra é uma forma de morte celular
programada conhecida como resposta de hipersensibilidade (HR). A HR agiria
contra patógenos biotróficos restringindo o acesso do patógeno a água e a
nutrientes. A resistência mediada por R-gene está associada também com a
ativação da via de sinalização dependente do ácido salicílico (AS) que leva à
expressão de certas proteínas relacionadas à patogênese (PR) que contribuem
para a resistência. A resistência gene a gene é uma forma importante de
resistência contra patógenos biotróficos, mas não deveria ser observada em
162
interações com patógenos necrotróficos, já que a morte celular do hospedeiro
não limita seu crescimento. Nesses patógenos, as respostas de defesa
dependem da sinalização dependente do ácido jasmônico (AJ) e do etileno
(ET) (GLAZEBROOK, 2005).
De acordo com esse modelo, a resistência do tipo gene a gene é uma
forma de resistência frente a patógenos biotróficos e está associada com a
ativação da sinalização dependente do ácido salicílico. Resultados a partir de
estudos com mutantes de Arabidopsis thaliana com defeitos em várias
respostas de defesa contra Peronospora parasitica, Erysiphe spp. e
Pseudomonas syringae apoiam a ideia de que a sinalização dependente do AS
é importante para a resistência em patógenos biotróficos. Por outro lado, os
resultados com esses mesmos mutantes de Arabidopsis na interação com
Alternaria brassicicola indicaram a ausência de resistência gene a gene. A
resistência frente a esse patógeno necrotrófico dependeu da sinalização
dependente do AJ e a produção de camalexina (fitoalexina) e a resistência
mediada por genes de resistência, a sinalização pelo AS e pelo ET não
cumpriram papéis importantes (GLAZEBROOK, 2005).
O presente trabalho mostra resultados da interação resistente e
suscetível de plantas de tomateiro frente a um patógeno biotrófico e um
necrotrófico. No caso da interação com o patógeno biotrófico O. neolycopersici,
foi observada resistência do tipo gene a gene com manifestação de HR e
explosão oxidativa. Já na interação com o patógeno necrotrófico A. solani, a
magnitude da HR e acúmulo de EROs observados não indicam que cumpram
um papel de importância na resistência frente a esse patógeno. Esses
resultados são coerentes com o modelo proposto por Glazebrook (2005),
embora o papel das fitoalexinas na interação com o patógeno necrotrófico não
tenha sido investigada.
163
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