( PDF ) Desenvolvimento e validação de um método espectrofotométrico para a quantificação de ácido kójico por complexação com alumínio e caracterização do complexo

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

MÁRIO SÉRGIO PIANTAVINI

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO

ESPECTROFOTOMÉTRICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDO KÓJICO POR

COMPLEXAÇÃO COM ALUMÍNIO E CARACTERIZAÇÃO DO COMPLEXO

CURITIBA

2010

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MÁRIO SÉRGIO PIANTAVINI

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO

ESPECTROFOTOMÉTRICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDO KÓJICO POR

COMPLEXAÇÃO COM ALUMÍNIO E CARACTERIZAÇÃO DO COMPLEXO

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor de

Ciências da Saúde, Universidade Federal do

Paraná, como requisito parcial à obtenção do

título de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Prof. Dr. Roberto Pontarolo

Co-orientadora: Prof. Dra. Ângela Cristina Leal

Badaró Trindade

CURITIBA

2010

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Termo de aprovação

Dedico este trabalho

À Deus e Aos meus pais Sérgio e Maria Aparecida

Às minhas avós (

in memoriam

) e todos os familiares

pela educação, formação e amor que sempre me

deram em todas as fases da vida

E amigos que de muitas formas me incentivaram e

ajudaram para que fosse possível a concretização

deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

Diversas espécies de aves migram ou se deslocam regularmente de uma região

para outra, de acordo com a mudança das estações. Na antiguidade os gregos

conheciam esse procedimento das aves em busca de clima favorável para sua

sobrevivência, tanto que as tinham como símbolo da amizade e da fidelidade porque

elas voltavam anualmente para ocupar o mesmo ninho. Inspirado por elas o filósofo

grego Aristóteles (384-322 a,C.) cunhou a frase “uma andorinha só não faz

primavera”, ou “não faz verão”. Dentre as possíveis interpretações pode-se entender

que as ações praticadas por um único indivíduo podem não ser suficientes para

solucionar todos os problemas ou o problema de todos. Entretanto na coletividade

encontramos pontos como a pluralidade de pensamentos, a complementaridade, a

reciprocidade e outros valores que nos tornam muito mais fortes e resistentes. Na

própria natureza encontramos exemplos disso como na revoada dos gansos ou na

resistência ao frio dos pingüins. A todos que participaram ativamente dessa jornada

deixo meus agradecimentos, mas alguns em especial que de fato fizeram valer o ideal

da amizade e coletividade.

Em primeiro lugar a Deus por tudo que nos proporciona diariamente. Aos meus

pais e minha família o meu muito obrigado pelas lições que ainda me dão, pelo carinho

e amor que necessito para continuar em frente. À minha namorada Elaine, que é meu

porto seguro para enfrentar todas as tormentas, por ser minha essência, pela

compreensão e amor que é um privilégio que usufruo com imensa alegria.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas e ao Departamento

de Farmácia da UFPR que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho, em especial

ao Centro de Estudos em Biofarmácia e seus colaboradores em nome da Dra.

Francinete R.C. pela parceria. Ao departamento de Química da UFPR pela

disponibilidade de uso do infravermelho e ao mesmo tempo à colaboração da

doutoranda Gilcélia A. Cordeiro pelo auxílio imprescindível. Ao departamento de

Bioquímica pelo uso do RMN. À farmacêutica Dagmar da farmácia de manipulação

DAGFARMA pela colaboração, amizade e oportunidade.

Ao professor Dr. Roberto Pontarolo falta-me léxico para expressar em singelas

linhas o “desafio” que foi chegar até aqui desde o primeiro dia há anos em busca de um

mero estágio em laboratório até o dia de colher os louros e ser reconhecido como

Mestre. Simples demais seriam as palavras neste momento, mas fica aqui o sentimento

de um privilegiado por ter sido realmente orientado por quem, de fato, é uma pessoa

que por conhecimento adquirido e experiência de vida pode ser considerado um espelho

ou um norte a ser seguido, um legítimo professor. Muito obrigado por tudo.

Ao professor Dr. Alan G. Gonçalves pela valiosa contribuição, dedicando seu

tempo a longas discussões e diversos trabalhos práticos para me ajudar a ficar “na

crista da onda”. À professora Dra. Ângela C. L. B. Trindade pelo companheirismo e

por importantes auxílios em momentos decisivos nesse “trem” de trabalho. Ao professor

Dr. Cassyano J. Correr pela sempre disposta ajuda nos “quatro cantos’ do laboratório.

À professora Márcia Olandoski que foi estatisticamente significante com os resultados

deste trabalho. À professora Dra. Ana L. R. Mercê pela disposição, paciência e

complexos ensinamentos por todo esse tempo de parceria. Ao professor Dr. Paulo

Roberto Janissek pela disposição e colaboração de grande importância e relevância. A

todos os amigos mais antigos, os do mestrado e em especial aos do laboratório (Rafael

V., Jocy D. C., Andreia e Consuelo pela amizade, Luana L. pela parceria em infinitos

projetos, Astrid W. pelas palavras e sinceras atitudes de ajuda em todos os momentos

dentro e fora do laboratório– Vielen Dank/ Grazie Mille).

A todos digo que não consigo expressar tudo o que desejo, pois há sentimentos

que a linguagem não expressa e emoções que as palavras não sabem traduzir.

"BOM MESMO É IR À LUTA COM DETERMINAÇÃO,

ABRAÇAR A VIDA E VIVER COM PAIXÃO,

PERDER COM CLASSE E VIVER COM OUSADIA,

POIS O TRIUNFO PERTENCE A QUEM SE ATREVE,

E A VIDA É MUITO BELA PARA SER INSIGNIFICANTE."

(Charles Chaplin)

RESUMO

O ácido kójico (AK, 5-hidroxi-2-hidroximetil-4-pirona) é um ácido orgânico,

comumente produzido por cepas de Aspergillus sp. Isolado pela primeira vez por

Saito (1907), nome e a estrutura foram definidos por Jabuta em 1924. Tem diversas

aplicações, dentre as quais as mais importantes são: na indústria alimentícia como

antioxidante; na saúde pública em tratamento de doenças como a β-talassemia e o

diabetes; na indústria cosmética como clareador, pois inibe a síntese da melanina.

No presente trabalho foi desenvolvido e validado um método espectrofotométrico na

região do UV. Tomou-se por base a capacidade do analito de formar complexo com

cátions metálicos, neste caso escolhido o Al

, por não apresentar propriedade

paramagnética, já que esta poderia interferir na análise do complexo por RMN.

O solvente que se mostrou mais apropriado foi o metanol, pois permitiu um

deslocamento batocrômico maior além de solubilizar facilmente o analito e seu

complexo, também produziu solução límpida do produto formulado creme cosmético,

facilitando assim a análise.

O complexo formado AK-Al

foi analisado por espectroscopia eletrônica, IV,

titulação potenciométrica e RMN

C. Pelos espectros de UV verificou-se um

deslocamento batocrômico quando se adiciona alumínio em meio ácido à solução de

AK. Pela titulação potenciométrica constatou-se que, apesar de se ter duas

aparentes inflexões, o cálculo da segunda derivada confirmou que o AK sofre

apenas uma ionização com um valor de pKa= 7,68+-0,02. Pela adição de Al

há

formação de complexos, dependentes do pH e da proporção molar AK:Al

A comparação de espectros no IV do AK, não complexado e complexado, em

diferentes valores de pH, permitiu correlacionar as modificações na absorção dos

picos referentes aos grupamentos enólico (3200 e 1350 cm

-1

) e carbonílico (1768 e

1700 cm

-1

). Os dados dos deslocamentos químicos dos carbonos permitiram concluir

que, na variação para pH alcalino, a blindagem do C-2 e desblindagem de C-4 e C-5

ocorrem pelo rearranjo da molécula.

Comparando os deslocamentos entre os carbonos do AK não complexado e

complexado em meio ácido (pH 4) verificou-se que apenas C-3 se blinda, enquanto

que C-2, C-4 e C-5 se desblindam. A partir desses resultados foi possível sugerir

que a estruturas do AK dependem do pH e da proporção molar AK/Al

no meio, e

confirmam a saída do hidrogênio da hidroxila enólica e da complexação do alumínio

entre a carbonila e o grupo enol do AK.

O método espectrofotométrico desenvolvido com base na complexação do AK:Al

3+,

mostrou um desempenho muito bom na validação. Foi linear no intervalo de entre 5-

50 μg/mL de AK (r= 0,9998), seletivo, sensível (LD= 0,15 μg/mL e LQ= 0,46 μg/mL),

preciso (DPR de 0,402%, 1,284 e 1,192 para 10, 15 e 20 μg/mL na repetitividade;

DPR de 2,171, 0,976 e 0,440 10, 15 e 20 μg/mL na precisão intermediária ), exato (±

100%) e robusto (para pequenas varias no pH, temperatura e tempo de leitura). O

método espectrofotométrico na região do UV com adição de alumínio foi adequado

para a quantificação de ácido kójico em matéria-prima e em creme cosmético com

ou sem adição de hidroquinona. É uma opção viável para laboratórios analíticos,

sendo um método simples, rápido e econômico.

Palavras- chave: ácido kójico, alumínio, espectrofotometria, validação de método

analítico, complexometria

ABSTRACT

Kojic acid (KA, 5-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4H-pyran-4-one), is an organic acid,

commonly produced by species of Aspergillus sp. It had been first isolated by Saito

(1907) and its name and structure were defined in 1924 by Jabuta. KA has several

applications, among them, the most important are: in the food industry as antioxidant;

public health in the treatment of diseases such as β-thalassemia and diabetes; in

cosmetic industry as bleaching agent, since it inhibits the melanin synthesis.

The present work developed and validated a spectrophotometric method in the UV

region by AK-Al complexation.

The method was based on the ability of the analyte to form complexes with metal

ions and for this work Al

was chosen, because it does not show paramagnetic

property, whereas this could interfere with the RMN analysis of complex. The solvent

methanol was more appropriate to the analysis, since it allowed a greater

bathochromic displacement and generate a clear solution of cosmetic cream,

improving the extraction of analyte.

The AK-Al

complex was analyzed by UV, IR, potentiometric titration and NMR

By UV spectra a bathochromic shift was verified by adding aluminium in KA acidic

solution. Was found by potentiometric titration that despite having two apparent

shifts, the second derivative calculated confirmed that the KA has only one ionization,

pKa= 7,68+-0,02. Adding aluminium there is complex formation, pH and molar

dependent. The comparison of complexed (AK/Al

) and non-complexed KA IR

spectra , at different pH, allowed to correlate the changes in peaks absorption related

to enolic (3200 e 1350 cm

-1

) and carbonyl (1768 e 1700 cm

-1

) groups. The carbon

chemical shifts in non-complexed KA allowed to conclude that, varying the pH to an

alkaline range, the C-2 shield and C-4 and C-5 deshielded occur by molecule

rearrangement. By comparison of the chemical shifts of carbons in complexed and

non-complexed KA (pH 4), only C-3 proved to be shielded, whereas C-2, C-4 and C-

5 proved to be deshielded. From these results it was possible to suggest that the KA

structures depend on the pH and molar ratio and to confirm the hydrogen output of

the enolic hydroxyl and aluminum complexation between the carbonyl and enolic KA

group. The complexes suggested by the potentiometric titration and infrared

spectroscopy are consistent with the chemical shifts observed in the obtained NMR

spectra. The results obtained by these techniques provided evidence of possible

structures of KA in different pH and of the complex AK-Al. The data confirm the

hydrogen output from enolic hydroxyl.

The spectrophotometric method developed based on the complexation AK:Al

showed a good performance in the validation. This method yields linearity in the

range of 5 and 50 μg/mL of KA (r= 0.9998), selectivity, sensibility (DL= 0,15 μg/mL

and QL= 0,46 μg/mL) precision (RSD 0,402%, 1,284 and 1,192% for 10, 15 and 20

μg/mL on repeatability; RSD 2,171, 0,976 and 0,440 for 10, 15 and 20 μg/mL for

intermediate precision), accuracy (recovery near 100%) and robustness (varying pH,

temperature and time). The spectrophometric UV method with the addition of

aluminium is suitable for the quantification of kojic acid raw material and cosmetic

cream with or without hydroquinone. Additionally the method takes advantage of

simple and accessible reagents and equipment, while having a low operating cost.

Key-words: kojic acid, aluminum, spectrophotometry, validation of analytic method,

complexometry

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 01 – Camadas e componentes da pele ..................................................... 20

FIGURA 02 – Estrutura do tegumento ..................................................................... 21

FIGURA 03 – Arquitetura da pele clara e escura ..................................................... 24

FIGURA 04 – Forma simplificada da formação da melanina.................................... 25

FIGURA 05 – Melanogênese com diferentes passos regulatórios ........................... 26

FIGURA 06 – Hiperpigmentação da pele pela estimulação da radiação solar ......... 29

FIGURA 07 – Ilustração esquemática das possíveis abordagens para interferir

. com a via melanogênica .................................................................... 30

FIGURA 08 – Estrutura da hidroquinona .................................................................. 31

FIGURA 09 – Estrutura química do ácido kójico ...................................................... 32

FIGURA 10 – Possível biossíntese do ácido kójico a partir da glucose ................... 32

FIGURA 11 – Possíveis reações na biossíntese do ácido kójico ............................. 33

FIGURA 12 – biossíntese do ácido kójico a partir da gluconolactona ...................... 33

FIGURA 13 – Modelo do complexo ácido kójico-cobre ............................................ 35

FIGURA 14 – Regiões do espectro eletromagnético ................................................ 38

FIGURA 15 – Estruturas esquemáticas da ligação do alumínio com citrato ............ 41

FIGURA 16 – Ciclo de vida de um método de análise ............................................. 47

FIGURA 17 – Fórmula da exatidão .......................................................................... 50

FIGURA 18 – Fórmula do desvio padrão relativo ..................................................... 52

FIGURA 19 – Possível estrutura quelante do AK com um íon metálico ................... 72

FIGURA 20 – Espectros de UV das soluções aquosa e metanólica de AK

.......................(15 μg/mL) ......................................................................................... 74

FIGURA 21 – Espectro de UV da solução aquosa de AK (15 μg/mL) acidificada

.......................(pH 2,8) e alcalinizada (pH 10,5) de AK (15 μg/mL) .......................... 74

FIGURA 22 – Espectro de UV da solução metanólica de AK (15 μg/mL) acidificada

.......................(pH 1,2) e alcalinizada (pH 9,5) de AK (15 μg/mL) ............................ 74

FIGURA 23 – Espectros de UV de soluções metanólicas contendo AK

.......................0,1-50 μg/mL e solução ácida de cloreto de alumínio ....................... 76

FIGURA 24 – Representação gráfica dos coeficientes de correlação versus

.......................comprimento de onda do conjunto de soluções metanólicas deAK

.......................0,1-50 μg/mL em solução ácida de cloreto de alumínio 0,2% ........... 76

FIGURA 25 – Região de maior (A) e menor (B) probabilidade de estar envolvida

.......................na ligação AK com íons metálicos ..................................................... 77

FIGURA 26 – Espectro de UV da solução aquosa e metanólica de AK (15 μg/mL)

.......................com solução ácida de AlCl

0,2% ..................................................... 78

FIGURA 27 – Estruturas químicas do metilparabeno (A) e propilparabeno (B) ...... 79

FIGURA 28 – Espectro de UV de soluções metanólicas com AK (15 μg/mL), creme

.......................lanette contendo AK 2% em associação ou não com HQ 4% e

.......................somente creme lanette, todos com adição de AlCl

0,2% ................. 80

FIGURA 29 – Espectro de UV da solução metanólica do AK (15 μg/mL) com cloreto

.......................de alumínio.em comparação com espectros de absorção da

.......................hidroquinona e nipazol em metanol .................................................. 81

FIGURA 30 – Gráfico da absorbância das soluções na variação molar de AK

.......................(15 μg/mL) com cloreto de alumínio (0,2%) em 305 nm .................... 82

FIGURA 31 – Espectros de UV de soluções metanólicas com AK e AlCl

......................diferentes relações molares................................................................ 83

FIGURA 32 – Resultado da avaliação da linearidade do método espectrofotométrico

.......................de AK com AlCl

de 5-50 μg/mL em 305 nm no meio metanólico ..... 84

FIGURA 33 – Resultado da avaliação da linearidade do método espectrofotométrico

.......................de AK com AlCl

de 10-20 μg/mL em 305 nm no meio metanólico ... 84

FIGURA 34 – Resultado da avaliação da linearidade do método espectrofotométrico

.......................pela recuperação de AK em creme Lanette com AlCl

de 5-30 μg/mL

.......................em 305 nm no meio metanólico ......................................................... 85

FIGURA 35 – Resultado da avaliação da linearidade do método espectrofotométrico

.......................pela recuperação de AK em presença de hidroquinona em creme

.......................Lanette com AlCl

de 5-30 μg/mL em 320 nm no meio metanólico ... 85

FIGURA 36 – Representação da hipotética dissociação do ácido kójico ................. 98

FIGURA 37 – Estruturas da coordenação do AK com magnésio ............................. 98

FIGURA 38 – Curva de titulação do ácido kójico não complexado ........................ 100

FIGURA 39 – Espectros de UV do ácido kójico não complexado em solução

.......................aquosa (15 μg/mL) na variação de pH de 2,0 a 12,0 e identificação

.......................dos pontos isosbésticos ................................................................. 101

FIGURA 40 – Espectros de UV do ácido kójico não complexado em solução

.......................aquosa (15 μg/mL) na variação de pH de 2,0 a 12,0 e identificação

.......................dos pH no λ= 270 nm depois do primeiro ponto isosbéstico .......... 101

FIGURA 41 – Espectros de UV do ácido kójico não complexado em solução

.......................aquosa (15 μg/mL) na variação de pH de 2,0 a 12,0 e identificação

.......................dos pH no λ= 315 nm depois do segundo ponto isosbéstico .......... 102

FIGURA 42 – Gráfico da segunda derivada da titulação potenciométrica do AK

.......................não complexado ............................................................................ 103

FIGURA 43 – Estrutura do ácido kójico com os carbonos assinalados .................. 103

FIGURA 44 – Diagrama de especiação do AK não complexado em meio aquoso 104

FIGURA 45 – Curva de titulação na proporção AK 1:1 Alumínio em meio aquoso 105

FIGURA 46 – Espectros de UV do ácido kójico 1:1 alumínio em solução aquosa

.......................(15 μg/mL) na variação de pH de 2,0 a 12,0 e identificação dos

.......................pontos isosbésticos ........................................................................ 106

FIGURA 47 – Diagrama de especiação da proporção AK 1:1 Alumínio ................ 107

FIGURA 48 – Curvas de titulação do AK não complexado (0,1 mmol) e nas e nas

.......................proporções AK 1:0,5 Al e AK 1:1 Al em solução aquosa ................. 111

FIGURA 49 – Reações graduais de hidrólise do complexo Fe(III) 1:1 AK ............. 112

FIGURA 50 – Reações graduais de hidrólise do complexo Fe(III) 2:1 AK ............. 112

FIGURA 51 – Espectros de absorção do AK matéria-prima em comparação com

.......................o AK padrão na região do infravermelho ......................................... 115

FIGURA 52 – Espectros de absorção do ácido kójico padrão e a partir de soluções

.......................pH 9 e 14 na região do infravermelho ............................................ 116

FIGURA 53 – Espectros de absorção do complexo ácido kójico / alumínio a partir de

.......................soluções nos pH 1, 11 e 14 na região do infravermelho .................. 117

FIGURA 54 – Espectros de absorção do ácido kójico puro em comparação com o

........................complexo AK/Alumínio a partir de soluções nos pH 1, 11 e 14 na

........................região do infravermelho ................................................................. 119

FIGURA 55 – Espectros de absorção do ácido kójico pH 14 em comparação com o

........................complexo AK/Alumínio pH 14 na região do infravermelho ............ 119

FIGURA 56 – Possíveis estruturas de ressonância do ácido kójico ...................... 121

FIGURA 57 – Possível estrutura de ressonância do ácido kójico complexado ...... 121

FIGURA 58 – Espectros de RMN e os dados obtidos em pH 4, 7 e 11 do AK não

.......................complexado ..................................................................................... 122

FIGURA 59 – Estruturas hipotéticas da ressonância do AK na forma ácida (A) e

.......................básica (B) ........................................................................................ 123

FIGURA 60 – Estruturas hipotéticas de uma das representações do ácido kójico

.......................complexado em pH 4 ....................................................................... 125

FIGURA 61 – Estrutura química do AK com os assinalamentos por RMN

C em

.......................Me

SO-d

........................................................................................ 125

LISTA DE QUADROS

QUADRO 01 – Regiões do UV e IV do espectro eletromagnético ........................... 39

QUADRO 02 – Classificação dos métodos analíticos de acordo com a finalidade .. 47

QUADRO 03 – Ensaios necessários para a validação de métodos analíticos de.

.........................acordo com a finalidade .................................................................. 48

LISTA DE TABELAS

TABELA 01 – Relações molares entre o ácido kójico e o alumínio .......................... 70

TABELA 02 – Valores de concentração de AK e erro relativo na avaliação da

.......................repetitividade ..................................................................................... 87

TABELA 03 – Valores de concentração de AK e erro relativo na avaliação da

........................precisão.intermediária ...................................................................... 88

TABELA 04 – Valores de concentração de AK no ensaio de recuperação em

........................creme lanette e erro relativo ............................................................. 89

TABELA 05 – Valores de concentração de AK em presença de hidroquinona no

........................ensaio de recuperação em creme lanette e erro relativo .................. 90

TABELA 06 – Valores de concentração de AK no ensaio de recuperação em

........................creme não iônico e erro relativo ....................................................... 91

TABELA 07 – Valores de concentração de AK em presença de hidroquinona no

........................ensaio de recuperação em creme não iônico e erro relativo ............ 91

TABELA 08 – Resultado do ensaio de robustez pela avaliação do tempo ............... 93

TABELA 09 – Resultado do ensaio de robustez pela avaliação da temperatura .... 94

TABELA 10 – Resultado do ensaio de robustez pela avaliação do pH .................... 95

TABELA 11 – Comparação entre as soluções de AK puro e complexado com

........................alumínio para os valores de absorbância em comprimentos de

........................onda e diferentes valores de pH ..................................................... 108

TABELA 12 – Constantes do do ácido kójico em meio aquoso em várias

........................proporções molares com alumínio .................................................. 109

TABELA 13 – Picos mais significativos no espectro de infravermelho da variação

........................de pH do ácido kójico puro e do complexo AK/Alumínio ................ 120

TABELA 14 – Picos significantes no espectro de infravermelho de alguns quelatos

........................de ácido kójico ................................................................................ 120

TABELA 15 – Valores dos deslocamentos químicos dos carbonos do ácido kójico

........................não complexado em diversos pH ................................................... 123

TABELA 16 – Comparação dos deslocamentos químicos dos carbonos do AK pela

........................variação de pH ............................................................................... 123

TABELA 17 – Valores dos deslocamentos químicos dos carbonos do ácido kójico

........................complexado com alumínio em pH 2 e 4 ......................................... 124

TABELA 18 – Comparação dos deslocamentos químicos dos carboos do AK puro

........................e complexado com alumínio em pH 4 ............................................ 124

TABELA 19 – Comparação dos dados de assinalamentos dos carbonos do AK por

.......................RMN

C da literatura e dos obtidos no presente trabalho .............. 126

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

- Ácido Kójico

ANVISA

- Agência Nacional de Vigilância Sanitária

- Coeficiente de variação

COSY

- Espectroscopia de correlação

DEPT

- Reforço por transferência de polarização sem distorção

- Desvio padrão

DPR

- Desvio padrão relativo

DPR%

- Desvio padrão relativo percentual

FDA

- Food and drug administration

HMBC

- Experimento de correlação para ligações heteronucleares múltiplas

HPLC

- Cromatografia Líquida de Alta Pressão ou Eficiência

- Hidroquinona

ICH

- International Conference on Harmonisation

IUPAC

- International Union of Pure and Applied Chemistry

INMETRO

- Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial

- Metal-ligante

RMN

- Ressonância magnética nuclear

- Coeficiente de correlação

- Coeficiente de determinação

ROS

- Espécies reativas de oxigênio

USP

- United States Pharmacopeia

UV/Vis

- Ultravioleta-visível

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ 10

LISTA DE QUADROS .............................................................................................. 12

LISTA DE TABELAS ............................................................................................... 12

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................. 13

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................... 17

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................. 20

2.1 PELE ...................................................................................................... 20

2.1.1 Epiderme ................................................................................................ 21

2.1.2 Derme ..................................................................................................... 22

2.1.3 Melanócito .............................................................................................. 23

2.1.4 Melanina ................................................................................................. 24

2.1.5 Eumelanina e feomelanina .................................................................... 25

2.1.6 Tirosina .................................................................................................. 27

2.1.7 Tirosinases ............................................................................................ 27

2.2 PIGMENTAÇÃO DA PELE .................................................................... 28

2.3 HIPERPIGMENTAÇÃO DA PELE ......................................................... 28

2.4 TRATAMENTO ...................................................................................... 29

2.4.1 Ácido Kójico ........................................................................................... 32

2.5 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA QUANTIFICAÇÃO DE AK .................. 36

2.5.1 Espectroscopia eletrônica ...................................................................... 38

2.5.1.1 Complexometria ..................................................................................... 40

2.5.2 Espectroscopia no infravermelho ........................................................... 42

2.5.3 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear ................................ 43

2.5.4 Titulação potenciométrica ....................................................................... 44

2.6 VALIDAÇÃO ........................................................................................... 45

2.6.1 Seletividade / especificidade ................................................................. 48

2.6.2 Linearidade e intervalo .......................................................................... 49

2.6.3 Exatidão ................................................................................................ 50

2.6.4 Precisão ................................................................................................ 51

2.6.4.1 Repetitividade ........................................................................................ 52

2.6.4.2 Precisão intermediária ........................................................................... 52

2.6.4.3 Reprodutibilidade ................................................................................... 52

2.6.5 Robustez ............................................................................................... 53

2.6.6 Sensibilidade ......................................................................................... 53

3. OBJETIVOS ........................................................................................... 55

3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................. 55

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................. 55

4. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 57

4.1 DESENHO EXPERIMENTAL ................................................................. 57

4.2 MATERIAL ............................................................................................. 57

4.2.1 Materiais e reagentes ............................................................................. 57

4.2.2 Equipamentos......................................................................................... 58

4.3 MÉTODOS ............................................................................................. 58

4.3.1 Desenvolvimento do método .................................................................. 58

4.3.1.1 Escolha do solvente e influência do pH .................................................. 59

4.3.1.2 Avaliação da seletividade ....................................................................... 59

4.3.1.3 Influência da proporção AK e AlCl3 na intensidade de absorção ........... 60

4.4 VALIDAÇÃO ........................................................................................... 61

4.4.1 Linearidade e intervalo ........................................................................... 61

4.4.2 Sensibilidade .......................................................................................... 62

4.4.3 Precisão ................................................................................................. 62

4.4.3.1 Repetitividade ......................................................................................... 62

4.4.3.2 Precisão intermediária ............................................................................ 62

4.4.4 Exatidão ................................................................................................. 63

4.4.5 Robustez ................................................................................................ 63

4.4.5.1 Influência do tempo de leitura na intensidade de absorção .................... 64

4.4.5.2 Influência da temperatura na intensidade de absorção .......................... 64

4.4.5.3 Influência do pH na intensidade de absorção ......................................... 64

4.4.5.4 Influência da concentração do metal na intensidade de absorção ......... 65

4.5 ESTUDO DO COMPLEXO ..................................................................... 65

4.5.1 Espectroscopia no infravermelho (IV) ..................................................... 65

4.5.2 Ressonância magnética nuclear............................................................. 65

4.5.3 Titulação Potenciométrica ...................................................................... 66

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................ 67

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................. 72

5.1 CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS ............................................................. 72

5.2 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ..................................................... 73

5.2.1 Escolha do solvente e influência do pH .................................................. 73

5.2.2 Seleção do comprimento de onda .......................................................... 75

5.2.3 Avaliação da seletividade ....................................................................... 76

5.2.4 A proporção molar AK e alumínio ........................................................... 82

5.3 VALIDAÇÃO ........................................................................................... 83

5.3.1 Linearidade e intervalo ........................................................................... 84

5.3.2 Sensibilidade .......................................................................................... 86

5.3.3 Precisão ................................................................................................. 87

5.3.3.1 Repetitividade ......................................................................................... 87

5.3.3.2 Precisão intermediária ............................................................................ 88

5.3.4 Exatidão ................................................................................................. 89

5.3.5 Robustez ................................................................................................ 92

5.3.5.1 Influência do tempo de leitura na intensidade de absorção .................... 92

5.3.5.2 Influência da temperatura na intensidade de absorção .......................... 94

5.3.5.3 Influência do pH na intensidade de absorção ......................................... 95

5.3.5.4 Influência da concentração do metal na intensidade de absorção ......... 96

5.4 ESTUDO DO COMPLEXO ..................................................................... 97

5.4.1 Titulação potenciométrica e espectroscopia no ultravioleta ................... 97

5.4.2 Espectroscopia no infravermelho ......................................................... 112

5.4.3 Ressonância magnética nuclear........................................................... 122

6. CONCLUSÃO ...................................................................................... 128

REFERÊNCIAS .................................................................................... 131

Introdução

1. INTRODUÇÃO

No mundo contemporâneo a preocupação com a aparência física se

intensificou, muito em busca de uma aceitação e valorização pelos diversos

contextos sociais. Parte disso potencializado pela ―necessidade‖ de adequação aos

padrões e modelos de comportamento valorizados pela sociedade. Qualquer detalhe

estético que esteja fora do padronizado pode ser sinônimo de rejeição.

Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), a proporção

de idosos, no Brasil, vem se elevando e com o passar da idade começam a ocorrer ,

em maior proporção, problemas como a disfunção das camadas da pele, somados a

outros fatores como os genéticos, ambientais, climáticos . As manchas que ocorrem

na pele, dentre elas principalmente as que ocorrem na face, podem gerar problemas

relacionados ao bem-estar dos indivíduos, quando estes se apresentam perante a

sociedade. Segundo RUIZ-MALDONADO;OROZCO-COVARRUBIAS (1997) mesmo

uma alteração mínima da pigmentação da pele pode resultar num interesse estético

maior, com implicações psicológicas. Corroborando com essa idéia, ISHIKAWA

(2007) afirma que uma hiperpigmentação indesejada pode também produzir um

significante stress psicológico. Além do lado pessoal, há dados de estudos

econômicos dentro do nosso país em que se constata que num universo de 57343

consultas pesquisadas, os transtornos da pigmentação somaram 4822 casos, o que

corresponde a 8,4% das principais causas de consultas registradas (PENNA;

RAMOS; CAFÉ, 2006) e isto representa um custo significativo ao sistema de saúde

nacional.

As hiperpigmentações são, em geral, distúrbios caracterizados pelo aumento

de melanina e outros pigmentantes na pele (SATO et al., 2007). O tratamento se faz

basicamente com o uso de agentes clareadores químicos, como por exemplo, o

ácido kójico (AK). Ele é comumente usado na indústria de cosméticos devido às

suas propriedades de absorção de radicais livres e inibição da produção de

melanina (ZBOROWSKI; GRYBOS; PRONIEWICZ, 2003), A atividade clareadora

pode ser devido a uma lenta e reversível inibição competitiva da tirosinase

(NOHYNEK et al., 2004), principal grupo de enzimas responsável pela conversão da

tirosina em melanina.

Segundo BRENNER (2008), a modificação da pigmentação da pele desperta

grande interesse farmacêutico e como acredita CURTO et al (1999) há uma

demanda no mercado global que tem se desenvolvido recentemente para agentes

clareadores da pele como produtos cosméticos da ―vaidade‖.

Sob esse contexto há uma preocupação da indústria farmacêutica em atender

esse grupo de pessoas que são acometidas por distúrbios de pele como as

hiperpigmentações do tipo melânica. Com o crescimento dessa demanda, há a

necessidade de se verificar a qualidade das matérias-primas e dos produtos. E com

isso são constantes os desafios da tecnologia analítica que precisa disponibilizar

métodos confiáveis, de baixo custo, simples e acessíveis aos diferentes segmentos

do mercado.

Para o ácido kójico, não foi encontrado nenhum método de quantificação e

análise descrito na literatura oficial (farmacopéias). Entretanto, na literatura científica

encontram-se descritos alguns métodos de quantificação propostos por

cromatografia líquida de alta eficiência (LIN; WU; HUANG, 2007), eletroforese capilar

(LIN; YANG; WU, 2007) e espectroscopia eletrônica (GOMARA et al., 2004), sendo

os dois primeiros aplicados a produtos em associações e o último aplicado somente

para a matéria-prima. Os métodos por HPLC e Eletroforese não são métodos

simples e não são de fácil aquisição para as farmácias de manipulação - que são

grandes produtoras destes produtos despigmentantes - o que se constitui numa

dificuldade para que estes estabelecimentos realizem o controle de qualidade destes

produtos. A falta de qualidade destes produtos pode trazer problemas como

ineficiência do tratamento; podendo também ocorrer agravamento do seu problema

de saúde ou a geração de um novo, ou prolongar o tempo de tratamento caso a

concentração seja diferente da declarada ou recomendada. O controle de qualidade

da matéria-prima ou dos produtos tornou-se uma ferramenta imprescindível na

indústria química, alimentícia e farmacêutica. O processo de validação é o

mecanismo utilizado para garantir maior confiabilidade nos resultados.

No presente trabalho foi desenvolvido e validado um método por

espectroscopia no UV para quantificação do analito na matéria-prima e creme

cosmético.

A presente pesquisa visa contribuir com o avanço da tecnologia analítica,

disponibilizando um método para quantificar AK na rotina do controle de qualidade,

método esse que minimize os custos e o tempo da análise.

Revisão Bibliográfica

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. PELE

As camadas da pele são representadas pela epiderme, derme e hipoderme.

Esta consiste em tecido gorduroso que conecta a derme aos componentes

esqueléticos subjacentes (COSTIN; HEARING, 2007) como representada na figura

1. Na estrutura A pode-se observar as três diferentes camadas e seus componentes.

Na estrutura B estão representadas quatro camadas da epiderme: estrato basal,

espinhoso, granuloso e córneo. Pode-se também observar as formas dos

melanócitos bem como dos queratinócitos.

FIGURA 1 – CAMADAS E COMPONENTES DA PELE

FONTE: ADAPTADA DE COSTIN; HEARING, 2007

Na figura 2 pode-se observar a divisão estrutural da epiderme e derme com

seus corpos funcionais.

FIGURA 2 – ESTRUTURA DO TEGUMENTO

FONTE: BEAR; CONNORS; PARADISO, 2002

2.1.1 Epiderme

A epiderme é a camada mais externa, de epitélio estratificado desprovido de

sangue ou nervos. É um epitélio escamoso estratificado queratinizado

(MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007; POWELL, 2007). Compreende camadas de

células estreitamente empacotadas produzidas pela divisão celular da camada

celular basal (POWELL, 2007). É composta de várias populações celulares distintas:

queratinócitos e melanócitos são os constituintes principais, dos quais o primeiro

compreende cerca de 95% (COSTIN; HEARING, 2007; MAKRANTONAKI;

ZOUBOULIS, 2007) da epiderme. Melanócitos correspondem de 1 a 2% da

epiderme (MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007).

Os queratinócitos sintetizam queratina, a principal proteína estrutural da

epiderme (POWELL, 2007) e, também, citocinas, que são mediadores químicos

secretados por células ativadas que afetam outras células. A produção de citocinas

é estimulada pela injúria, incluindo aquela causada por radiação UV (POWELL,

2007).

A sua função principal é proteger o corpo de estímulos prejudiciais do meio

ambiente e diminuir a perda de fluidos (MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007).

Pode-se dividir a epiderme em quatro ou cinco camadas ou estratos: estrato

germinativo, espinhoso, granuloso, lúcido (no qual o queratinócito gradualmente

migra para a superfície num processo chamado ―descamação‖) e estrato córneo

(MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007) como representa a figura 1-B.

Estrato basal é também conhecido como estrato germinativo, é uma camada

simples de células unidas a uma membrana não celular que separa a epiderme da

derme. Consiste na sua maior parte de queratinócitos e no mínimo dois tipos

diferentes de células derivadas das cristas neurais - células Merkel e os melanócitos

(COSTIN; HEARING, 2007)

O próximo nível na epiderme é a camada espinhosa, assim chamada por

causa das células que estão unidas coesivamente por desmossomos que se

assemelham a espinhos em microscopia (POWELL, 2007). Ele contém

queratinócitos poliédricos irregulares com capacidade limitada para a divisão celular

(COSTIN; HEARING, 2007).

Estrato granuloso contém queratinócitos achatados, poliédricos e sem divisão

produzindo grânulos de proteínas chamadas de queratohialinas. (COSTIN;

HEARING, 2007). Como o queratinócito se move para cima, começa a fazer parte da

camada granular, duas ou três camadas de células planas contendo muitos

grânulos. Estes são lisossomos que contém enzimas hidrolíticas que destroem o

núcleo e outras organelas, resultando na morte celular (POWELL, 2007).

Estrato córneo é a camada mais superior da epiderme e consiste em células

achatadas, mortas, sem núcleo e com grossas membranas celulares que se aderem

umas às outras. Gradualmente essas células são substituídas por células

subjacentes. A camada córnea é uma efetiva barreira para a maioria dos

microrganismos, químicos e fluídos, embora seja permeável a algumas substâncias

(COSTIN; HEARING, 2007; POWELL, 2007).

2.1. 2 Derme

A derme é uma camada de tecido conectivo (COSTIN; HEARING, 2007;

MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007) à epiderme. Situa-se abaixo da mesma e

suporta-a estruturalmente e na sua nutrição. O componente principal é o fibroblasto

e o colágeno que ele produz. Essa camada assume a importante função de

termorregulação e suportar a rede vascular para suprir a epiderme com nutrientes

(MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2007).

2.1.3 Melanócito

Melanócitos são inicialmente derivados da crista neural (DEL MARMOL et al.,

1993; STULBERG; CLARK; TOVEY, 2003; SLOMINSKI et al., 2004) e durante o

desenvolvimento embrionário (HEARING; TSUKAMOTO, 1991; TSATMALI;

ANCANS; THODY, 2002), melanoblastos migram para a ectoderme (POWELL,

2007), epiderme (TAYLOR, 2002) ou lugares apropriados (YAMAGUCHI;

BRENNER; HEARING, 2007). Uma vez que eles alcançaram o destino final se

diferenciam em melanócitos, os quais no sexto mês de vida fetal, aproximadamente,

estão prontos e estabelecidos nas junções dermal-epidermal (COSTIN; HEARING,

2007). São capazes de produzir melanina e distribuí-la através de seus dendritos

para os queratinócitos ao redor, por isso funcionam como componentes chave na

pigmentação (TSATMALI; ANCANS; THODY, 2002). Melanócitos epidermais

proliferam-se lentamente e são bem resistentes a apoptose (YAMAGUCHI;

BRENNER; HEARING, 2007).

Queratinócitos e melanócitos formam uma unidade funcional conhecida como

melanina epidérmica. Interagem intimamente para produzir e distribuir melanina na

pele humana durante o processo de pigmentação, de tal modo que enquanto os

queratinócitos produzem fatores parácrinos que afetam a proliferação dos

melanócitos, dendritos e síntese de melanina, os melanócitos controlam a síntese de

melanina e a transferem para um queratinócito adjacente (AHN et al., 2003).

YAMAGUCHI (2007) afirmou que os melanócitos epidermais e queratinócitos

basais podem ocorrer numa proporção de cerca de 1:10 e a distribuição de melanina

que eles produzem pode ser visualizada na figura 3. Através desta também pode-se

notar também o grau de penetração da radiação UV em indivíduos de pele clara e

escura, sendo que nos primeiros é maior pelo menor número de pigmentos

responsáveis pela absorção dessa radiação. Nos negros a radiação UV atinge no

máximo o estrato espinhoso, enquanto que nos brancos atravessa a membrana

basal da epiderme e atinge a derme.

FIGURA 3 - ARQUITETURA DA PELE CLARA E ESCURA

SC: Estrato córneo; G: Estrato granuloso; S: Estrato espinhoso; B: Estrato basal; BM: Membrana

basal; D: Derme; K: queratinócitos; M: Melanócitos; F: fibroblasto (ovalado)

FONTE: ADAPTADA DE YAMAGUCHI; BRENNER; HEARING (2007)

2.1.4 Melanina

A melanina é um biopolímero (HEARING; TSUKAMOTO, 1991; COSTIN;

HEARING, 2007; HERRLING; JUNG; FUCHS, 2008) nitrogenado (JONES et al.,

2002) fenólico (CHOI et al., 2006; PLONKA; GRABACKA, 2006), granular

extremamente insolúvel (SCHMIDT; KRIEN; RÉGNIER, 1996), produzido por células

dentríticas especializadas, melanócitos - que estão localizadas primariamente na

pele, bulbo capilar e olhos (HEARING; TSUKAMOTO, 1991) - através de uma via

enzimática (STURM; TEASDALE; BOX, 2001) como está sucintamente representada

na figura 4. Essa via envolve uma série de eventos celulares complexos (ARCANS

et al., 2001). Dentro dos melanócitos a melanina está ligada a uma proteína matriz

para formar melanossomos (WILKINSON; MOORE 1990). Uma vez produzida, os

melanossomos são transferidos até os queratinócitos adjacentes (TSATMALI;

ANCANS; THODY, 2002; HOOGDUIJN et al., 2004). São poliânions com um relativo

alto teor de carga negativa por apresentar grupo carboxil e o-semiquinonas (FELIX

et al., 1978) e são moléculas de alto peso molecular, formada pela polimerização

oxidativa de compostos fenólicos (FOGARTY; TOBIN, 1996), se concentra nos

melanossomos (JONES, 2002) e é amplamente distribuída na natureza (CHOI et al.,

2006). Ela é encontrada em bactérias, fungos, plantas e animais (MOMTAZ; LALL;

BASSON, 2008). A produção parece ser controlada por fatores relacionados à

presença ou falta de luz. Fatores relacionados à luminosidade incluem epinefrina,

noraepinefrina e melatonina. Os outros fatores com a falta de luminosidade incluem

estimulação do hormônio melanocítico, andrógeno e estrógeno (ABDEL-WANIS;

NAWAHARA, 2003). O estímulo melanogênico é através do hormônio estimulante

de melanócito (MSH) (HEARING; TSUKAMOTO, 1991).

FIGURA 4 - FORMA SIMPLIFICADA DA FORMAÇÃO DA MELANINA

FONTE: ADAPTADO DE FRIEDMAN (1996)

Ela atua como um filtro fotoprotetor ótico e químico, o qual reduz a penetração

de todos os comprimentos de luz até tecidos subepidermais (JABLONSKI;

CHAPLIN, 2000). Uma das principais funções biológicas é a fotoproteção via

absorção óptica e espalhamento da radiação UV (SCHMIDT; KRIEN; RÉGNIER,

1996), sendo um mecanismo de defesa primário (KANG et al., 2009).

A existência de melanina na pele é altamente correlacionada com a

prevenção de radicais livres / ROS (espécies reativas de oxigênio) gerados pela

radiação UV. Especialmente na pele, a melanina assegura a proteção natural

eliminando esses radicais livres gerados (HERRLING; JUNG; FUCHS, 2008). Além

desse possível papel ela pode atuar como um sequestrante de agentes citotóxicos

como os íons metálicos, uma vez que estes têm propriedades catiônicas e se

ligariam por interação iônica (LARSSON, 2006). A melanina é um dos fatores mais

importantes na determinação da coloração da pele (SAKUMA et al., 1999). O

acúmulo de certos agentes químicos no tecido com pigmentação, devido a afinidade

à melanina, é possivelmente o mecanismo de retenção mais pronunciado do corpo

(LARSSON, 2006).

2.1.5 Eumelanina e feomelanina

Em humanos, melanina é classificada em dois tipos gerais: eumelanina é um

biopolímero nitrogenado polimorfo preto ou marrom e altamente associado a

proteínas através de ligações covalentes (SLOMINSKI et al., 2004); A feomelanina

vermelha ou amarela, colorida pela polimerização incorporada de precursores de

conjugados de cisteína (NAITO et al., 2007) e fortemente ligada a proteínas, o que

indica que ela ocorre como uma cromoproteína com alta variabilidade no número de

em nitrogênio e enxofre (SLOMINSKI et al., 2004).

Já BRENNER (2008) considera que há três tipos de melanina: feomelanina

(vermelha/amarela) e dois tipos de eumelanina. A pele humana contém uma mistura

dos três tipos, mas as proporções variam enormemente e determinam a cor da pele.

Ainda de acordo com BRENNER (2008), dentro dos melanosomos, no mínimo

três enzimas são indispensáveis para a síntese dos diferentes tipos de melanina:

- Tirosinase (TYR), Eumelanina 5,6-dihidroxiindole (DHI) e Proteína Tirosinase-

RELATED 1 (TYRP1).

Segundo PROTA (2001) além do modo da polimerização do DHI e o seu

derivado 2-carboxil, DHICA, e os fatores controlando o modelo de rearranjo do

dopacromo, os principais destaques deste esquema incluem o papel da peroxidase

na polimerização do DHI e os efeitos regulatórios de íons metálicos e, diferentes

estágios da melanogênese, nomeadas como ativação da tirosinase, rearranjo de

dopacromo e polimerização do DHI. O esquema pode ser visualizado pela figura 5.

FIGURA 5 - MELANOGÊNESE COM OS DIFERENTES PASSOS REGULATÓRIOS

FONTE: PROTA (2001)

2.1.6 Tirosina

Tirosina não permeia livremente através dos lipídios biliares e o mecanismo

para o transporte do substrato inicial para a melanogênese para o seu

compartimento catalítico é desconhecido (STURM; TEASDALE; BOX, 2001).

Estudos indicam que há dois sítios catalíticos diferentes para tirosina e dopa

(HEARING; EKEL, 1976) e um aumento na concentração intracelular de ambos

resulta no aumento da melanogênese.

2.1.7 Tirosinases

Tirosinases ou polifenoloxidases são proteínas amplamente distribuídas na

escala filogenética e é responsável pela melanização nos animais e escurecimento

das plantas (CABANES; CHAZARRA; GARCIACARMONA, 1994) e frutas (HYUN et

al., 2008). São enzimas do tipo monooxigenase (STURM; TEASDALE; BOX, 2001)

que pertencem a uma família de proteínas que tem o centro catalítico formado por

cobre (MATOBA et al., 2006) e catalisam a orto-hidroxilação dos monofenóis e a

subseqüente oxidação dos produtos difenólicos em correspondentes quinonas

(TEPPER; BUBACCO; CANTERS, 2002). Ela contribui direcionando a formação de

pigmentos nos corpos dos mamíferos tanto quanto nas plantas, microrganismos e

fungos (MOMTAZ; LALL; BASSON, 2008). É uma enzima limitante para a

melanogênese (HEARING; TSUKAMOTO, 1991; TSATMALI; ANCANS; THODY,

2002) na conversão de tirosina em dopaquinona (AHN et al., 2003). Ela é crítica na

formação dos dois subtipos de melanina (TAYLOR, 2002) e é a lesão chave em

muitos tipos de albinismo (HEARING; TSUKAMOTO, 1991).

Inibidores das tirosinases são agentes químicos capazes de reduzir reações

enzimáticas, como a melanização da pele humana e escurecimento dos alimentos.

O controle da sua atividade é importante na prevenção da síntese de melanina no

escurecimento de alimentos (QIU et al., 2009). Compostos naturais como vitamina C

e AK são inibidores representativos da supressão melanogênica (UM et al., 2003).

Ela também pode ser inibida por aldeídos aromáticos e ácidos aromáticos (QIU et

al., 2009). Por isso, é grande o interesse por moléculas que tenham a propriedade

da inibição da tirosinase para campos como a cosmética e agricultura.

Íons metálicos têm três modelos principais de participação nos processos

biocatalíticos: orientação adequada do substrato alvo no estado de transição;

mediação nas reações de redução/oxidação; estabilização eletrostática ou

blindamento de cargas negativas (STENSON; CIOFFI, 2007).

2.2 PIGMENTAÇÃO DA PELE

Os pigmentos visíveis são sintetizados pelos melanócitos. Durante o

desenvolvimento embrionário as células melanocíticas precursoras (melanoblasto)

migram das cristas neurais para a pele, olhos e então são diretamente responsáveis

pelas características de cor (STURM; TEASDALE; BOX, 2001). A pigmentação da

pele é considerada o sinal universal de juventude e beleza (RESZKO; BERSON;

LUPO, 2009). É resultado da síntese e distribuição de melanina (NAITO et al., 2007),

começando pela oxidação da tirosina em dopaquinona catalisada pela tirosinase

(CHOI et al., 2006).

O tamanho e o número das organelas são importantes na determinação da

pigmentação. Melanossomos na pele de negros são maiores que seus homólogos

na pele de brancos e estão armazenados como simples unidades em vez de grupos.

Isto tem o efeito de retardar a degradação nos queratinócitos e contribui para um

maior nível de pigmentação da pele (TSATMALI; ANCANS; THODY, 2002).

Melanócitos escuros exibem uma taxa de síntese de aproximadamente três vezes

mais melanina que os melanócitos de caucasianos (SCHMIDT; KRIEN; RÉGNIER,

1996).

2.3 HIPERPIGMENTAÇÃO DA PELE

RUIZ-MALDONADO (1997) afirmou que embora hiperpigmentação seja um

termo frequentemente usado como um sinônimo para hipermelanose, esta se refere

a um aumento relacionado à melanina e aquela a um aumento da pigmentação sem

qualquer controle. O acúmulo excessivo de pigmentação epidermal pode causar

várias desordens de hiperpigmentação (KANG et al., 2009).

Vários são os fatores que podem desencadear processos de

hiperpigmentação da pele, como por exemplo: Pinealectomia (ABDEL-WANIS;

NAWAHARA, 2003); durante terapia antimalárica (é reportada entre 10-25% dos

pacientes) (SELVAAG, 1996); Sob o estímulo de hormônios, irritação, ou

idiopaticamente em algumas desordens, hiperplasia dos melanócitos (STULBERG;

CLARK; TOVEY, 2003); em resposta à exposição ao sol (STULBERG; CLARK;

TOVEY, 2003; COSTIN; HEARING, 2007; BRENNER; HEARING, 2008), como pode

ser observado na figura 6; inflamações da pele tais como eczema, dermatite de

contato alérgico e irritante (HALDER; RICHARDS, 2004); psoríase, queimadura,

radioterapia, etc (RUIZ-MALDONADO; OROZCO-COVARRUBIAS, 1997); uma

ampla variedade de fármacos como antibióticos e quimioterápicos (BRENNER;

HEARING, 2008).

Pigmentações epidermais devido à queimaduras solares, sardas, manchas

senis são consideradas como causadas por um desequilíbrio entre a síntese e

excreção de melanina, resultando em um aumento anormal (SAKUMA et al., 1999).

FIGURA 6 – HIPERPIGMENTAÇÃO DA PELE PELA ESTIMULAÇÃO DA RADIAÇÃO SOLAR

FONTE: ASTISTRY (2009)

2.4 TRATAMENTO

O despigmentante ideal deveria ter um efeito clareador potente, rápido e

seletivo sobre os melanócitos hiperativados, não ocasionar a curto ou a longo prazo

efeitos colaterais e remover permanentemente o pigmento indesejado, agindo em

um ou mais passos no processo de pigmentação (BRIGANTI; CAMERA; PICARDO,

2003). Podem-se ter diversos mecanismos para despigmentação da pele como, por

exemplo: destruir seletivamente os melanócitos; inibir a formação de melanossomas

e alterar sua estrutura; inibir a biossíntese da tirosina; inibir a formação da melanina;

interferir com a transferência de melanossomas; ter um efeito químico sobre a

melanina ou aumentar a degradação de melanossomas em queratinócitos

(WILKINSON; MOORE 1990; PANDYA; GUEVARA, 2000). A figura 7 apresenta de

forma resumida as principais abordagens para se interferir na via melanogênica

antes, durante e depois da síntese da melanina. A despigmentação pode ser obtida

regulando (I) a transcrição e atividade da tirosinase, proteína relacionada a

tirosinase-1 (TRP-1), proteína relacionada a tirosinase-2 (TRP-2), e/ou peroxidase;

(II) condução e distribuição dos melanossomos nos queratinócitos e (III) degradação

da melanina e melanossomo e o retrocesso de queratinócitos pigmentados.

FIGURA 7 – ILUSTRAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS POSSÍVEIS ABORDAGENS PARA INTERFERIR

COM A VIA MELANOGÊNICA.

Tyr: TIROSINASE; M: MELANOSSOMOS; ROS: ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO

FONTE: ADAPTADO DE BRIGANTI; CAMERA; PICARDO (2003)

Como resultado do papel chave desenvolvido pela tirosinase na biossíntese

da melanina, a maior parte dos agentes clareadores atuam especificadamente para

reduzir a função dessa enzima por vários mecanismos: (I) interferência com a

transcrição e/ou glicosilação, (II) inibição por diferentes modalidades, (III) redução

dos produtos e (IV) controle pós-transcrição (BRIGANTI; CAMERA; PICARDO,

2003).

O tratamento de desordens da hiperpigmentação pode ser um longo processo

e o impacto psicossocial destas desordens deve ser levada em consideração

(HALDER; RICHARDS, 2004). A duração do tratamento pode variar de individuo

para indivíduo, sendo em geral alguns meses, evitando-se passar de dois anos

(KATSAMBAS; STRATIGOS, 2001). Esse longo período é freqüentemente

insatisfatório (COTOLLESSA et al., 2001). O sucesso do tratamento depende

também da complacência do paciente ao aderir a todas as proposições e ao evitar

possíveis problemas gerados pela exposição ao sol.

KATSAMBAS (2001) definiu uma série de parâmetros que são de grande

relevância para a eficácia do tratamento, como por exemplo: antes do início do

tratamento os pacientes devem ser informados de que ele tem a finalidade de

melhorar a pigmentação em vez de resolver completamente a causa. Isto pelo fato

de que os resultados podem não ser permanentes; a localização da disfunção

também é um fator importante, uma vez que a histologia do mesmo pode levar a

diferentes caminhos.

Atualmente, há três categorias de agentes de clareamento: compostos

fenólicos, não fenólicos e fórmulas combinadas.

Dentro da classe dos compostos fenólicos o mais importante agente é a

hidroquinona (HQ) – figura 8. É considerada o padrão ouro no tratamento das

hiperpigmentações nos últimos 50 anos (HALDER; RICHARDS, 2004). Ela inibe a

conversão de dopa em melanina inibindo a enzima tirosinase. Esta etapa se dá

durante a síntese da melanina (BRIGANTI; CAMERA; PICARDO, 2003). A eficácia

depende de vários fatores como a concentração, estabilidade química e o veículo

usado. Em formulações de concentrações 4-5% são consideradas bem efetivas.

FIGURA 8 – ESTRUTURA DA HIDROQUINONA

FONTE: THE INDEX MERCK (1983)

O maior exemplo dos compostos não fenólicos é o ácido azelaico, que ocorre

naturalmente como um composto saturado, dicarboxílico com nove carbonos

(HALDER; RICHARDS, 2004). Pode oxidar ácidos graxos insaturados em ácidos

dicarboxílicos, os quais competitivamente inibem a tirosinase (BRIGANTI; CAMERA;

PICARDO, 2003; HALDER; RICHARDS, 2004).

Agentes de clareamento podem ser combinados com superficiais ou médio-

profundos peels químicos, ácido glicólico ou peels de ácido tricloroacético 30%.

Hidroquinona ou combinações da mesma, tretinoína e um corticosteróide tópico

pode ser usado antes e/ou depois do peel para aumentar a resposta terapêutica e

diminuir o risco de hiperpigmentação pós-inflamatória (KATSAMBAS; STRATIGOS,

2001). Ácido azelaico ou ácido kójico, agentes químicos de peeling, e lasers também

tem sido muito utilizados (PANDYA; GUEVARA, 2000).

2.4.1 Acido kójico

O ácido kójico (5-hidroxi-2-hidroximetil-4-pirona) – figura 9 - é um ácido

orgânico (TAKAMIZAWA et al., 1996) do metabolismo secundário dos fungos. É

comumente produzido por cepas de Aspergillus (GOULD, 1938), Acetobacter e

Penicillium (TAMURA et al., 2006) em um processo aeróbio de uma ampla gama de

fontes de carbono, pela conversão de glucose por meio de reações enzimáticas em

várias etapas (MOHAMAD; ARIFF, 2007). Foi isolado pela primeira vez de uma cepa

de Aspergillus em 1907 por Saito (GOMES et al., 2001) e a estrutura do AK, que

está representada na figura 9, foi definida por Yabuta em 1924 (ICHIMOTO;

TATSUMI, 1964). O nome do ácido tem origem na palavra ―koji‖ que significa

―cultura‘, pois ele foi extraído pela primeira vez de culturas de arroz.

FIGURA 9 – ESTRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO KÓJICO

FONTE: THE MERCK INDEX (1983)

Compostos heterocíclicos de seis membros contendo oxigênio constituem

uma importante classe de produtos naturais biologicamente ativos e sintéticos,

desempenhando um papel fundamental na química bioinorgânica (FARARD et al.,

2009). De acordo com BENTLEY (2006), a principal via biosintética é a conversão

de glucose em AK, sem a quebra do anel piranosídico ou da cadeia carbônica

(ARNSTEIN; BENTLEY, 1956), como pode ser visualizado na figura 10.

FIGURA 10 - POSSÍVEL BIOSSÍNTESE DO AÁCIDO KÓJICO A PARTIR DA GLUCOSE

FONTE: BENTLEY (2006)

A reação inicial seria por uma oxidação como uma desidratação entre as

estruturas II e III com a remoção de dois átomos de hidrogênio do carbono 3 da

glucopiranose sob influência de uma oxidase e transformando-se em 3-cetoglucose

(III). De acordo com ARNSTEIN e BENTLEY (1953) esse tipo de oxidação ocorre

frequentemente no metabolismo de fungos e bactérias. Segue-se pela perda de

duas moléculas de água até AK (IV), como está representado na figura 11.

FIGURA 11 - POSSÍVEIS REAÇÕES NA BIOSÍNTESE DO AK

FONTE: ARNSTEIN; BENTLEY (1953a)

Uma outra possibilidade de biossíntese é a partir da molécula de

gluconolactona (V) ser a precursora, demonstrada na figura 12. Se a oxidação até

ácido 3-cetogluconico lactona ocorrer duas rotas são possíveis: (a:) redução a 3-

cetoglucose (III) seguida da perda de duas moléculas de água; (b) perda de uma

molécula de água gera (VII) seguido da redução do grupo carbonila (VIII) e perda

de uma segunda molécula de água até AK (IV).

FIGURA 12 - BIOSÍNTESE DO AK A PARTIR DA GLUCONOLACTONA

FONTE: ARNSTEIN; BENTLEY (1953a)

Uma terceira pode envolver a incorporação de átomos de carbono

predominantemente os átomos de carbono 4, 5 e 6 do AK quando pequenas

moléculas são adicionadas durante a fermentação da glucose (ARNSTEIN;

BENTLEY, 1953b).

Vários tipos de fontes de carbono como a sucrose e a frutose hidrolisadas

podem ser utilizadas por A. flavus para a biotransformação até AK (MOHAMAD;

ARIFF, 2007). Várias fontes podem ser usadas na biossíntese do AK por espécies

de Aspergillus. Entre elas a D-xylose e D-ribose são as que deram os melhores

rendimentos, L-arabinose é menos efetiva e D-arabinose, D-lyxose e L-xylose são

fontes de carbono muito pobres para a produção de AK. A.flavus não sintetizou AK

de L-lyxose ou L-ribose (ARNSTEIN; BENTLEY, 1956).

O AK tem formula molecular C

e peso molecular de 142,11 g/mol

(BURDOCK; SONI; CARABIN, 2001). Esse ácido apresenta-se como um pó

cristalino branco amarelado (THE MERCK INDEX, 1983). Ele cristaliza como

agulhas prismáticas com acetona, etanol, éter ou metanol e acetato de etila. A faixa

de fusão é 153–154ºC e tem pKa próximo de 7,90 (THE MERCK INDEX, 1983) 7,88

(MCBRYDE; ATKINSON, 1961). Através de dados experimentais percebeu-se que à

medida que a temperatura aumenta os valores de pKa diminuem (7.75, 7.68, 7.62 e

7.55) (SALLAM; HAGGAG; MASOUD, 1990).

O AK é altamente solúvel em água, metanol, acetona e moderadamente

solúvel em éter, acetato de etila, clorofórmio e piridina (BURDOCK; SONI;

CARABIN, 2001) (THE MERCK INDEX, 1983). Para mamíferos, a dose letal é de

aproximadamente 1g/kg (BRTKO et al., 2004). É conhecido por formar fortes

quelatos com íons metálicos (BATTAINI et al., 2000) como o cobre (NAITO et al.,

2007), ferro (MCBRYDE; ATKINSON, 1961) e compostos organometálicos

(SYNYTSYA et al., 2007). É usado analiticamente para detecção e quantificação de

níveis muito baixos de ferro pela sua alta afinidade pelo metal (STENSON; CIOFFI,

2007).

Possui atividade bacteriostática leve (BRTKO et al., 2004). Baseado nisto, ele

tem sido usado como aditivo alimentício na prevenção do escurecimento enzimático

(TAMURA et al., 2006) como citado anteriormente. A prevenção do escurecimento

enzimático pode ocorrer de forma direta pela mudança no cobre do sítio catalítico da

enzima e indireta através de reações com intermediários, prevenindo uma adicional

mudança da quinona em pigmentos escuros (FRIEDMAN, 1996). Ele é permitido

como aditivo no Japão e é adicionado a alimentos como um antioxidante. Usado na

produção de inúmeros alimentos incluindo miso (pasta de soja) shoyu (molho de

soja) e sake. Também é utilizado na produção de fermentados como o amazake,

shouchu (licor destilado) e mirin (tempero alcoólico) (BURDOCK; SONI; CARABIN,

2001). Intoxicação pelo consumo de alimentos contendo AK não tem sido reportadas

(BRTKO et al., 2004). Devido as suas propriedades bioquímicas, gêneros

alimentícios que o contém são considerados como produtos mais seguros (EMAMI

et al., 2007). É relatado uma série de outros usos tais como precursor de

potenciadores de sabor, antioxidante (TAKAMIZAWA et al., 1996), efeitos

antinflamatórios (BRTKO et al., 2004). Ele também é utilizado na saúde pública no

tratamento de doenças. Como as relacionadas à sobrecarga de ferro como a β-

talassemia (STENSON, 2007) em que o AK quela os íons ferro que, neste tipo de

doença, estão em excesso no organismo. Também no tratamento do diabetes no

qual o AK quela o vanádio e a estrutura resultante mimetiza a ação da insulina

DABROS, 2007).

AK é comumente usado na indústria de cosméticos devido às suas

propriedades de absorção de radicais livres (MITANI et al., 2001) e inibição da

produção de melanina (ZBOROWSKI; GRYBOS; PRONIEWICZ, 2003). A atividade

clareadora pode ser devido a uma lenta e reversível inibição competitiva da

tirosinase (NOHYNEK et al., 2004), durante a síntese da melanina (BRIGANTI;

CAMERA; PICARDO, 2003), principalmente devido à atividade quelante do cobre

(LIM, 2001), cofator essencial para a atividade da enzima. Devido ao seu conhecido

mecanismo de inibição da tirosina é um componente essencial para a

downregulation da hiperpigmentação da pele (AHN et al., 2003). Os limites máximos

de concentração de AK em cremes é 2% e hidroquinona acima de 5% podem causar

efeitos colaterais severos como dermatite, eritema e hiperpigmentação (LIN; YANG;

WU, 2007; YANG; ZHANG, 2007). O modelo de como poderia ser o complexo

formado entre o AK e o cobre, que não permitiria a ativação das tirosinases, está

representado na figura 13.

FIGURA 13 - MODELO DO COMPLEXO AK-COBRE

FONTE: TEPPER; BUBACCO; CANTERS (2002)

O mecanismo inibitório do AK sobre polifenol oxidase segue através das

seguintes ações: interferindo com a captação de O

requerido para a reação

enzimática; pela redução de compostos quinona para difenóis para prevenir a

formação da melanina via polimerização e pela combinação das duas ações acima

(CHEN; WEI; MARSHALL, 2001).

De acordo com KANG et al (2009) em células B16F10 de melanomas de

camundongos o AK inibiu em 15,8% a produção de melanina a 200 μg/ml e 31,1% a

400 μg/ml e aproximadamente 80% de sobrevivência das mesmas células. LIM

(2001) em um estudo com mulheres chinesas que apresentavam melasma na face

mostrou que houve uma melhora em 60,0% daquelas que usaram gel com AK (2%),

hidroquinona (2%) e ácido glicólico (10%) enquanto que entre aquelas que usaram

apenas hidroquinona (2%) e ácido glicólico (10%) a melhora ocorreu em 47,5%.

Melanócitos tratados com AK se tornam não dendríticos com uma diminuição

da quantidade de melanina (BRTKO et al., 2004). Comparativamente com a

hidroquinona, que é prescrição de rotina, o AK tem a vantagem de ser

farmaceuticamente mais estável (BURDOCK; SONI; CARABIN, 2001). Tem-se

encontrado também que o AK confere um impacto significante na fisiologia de

queratinócitos normais como uma supressão da síntese e secreção de citocinas

(AHN et al., 2003).

As radiações solares UVB (280-320 nm) e particularmente UVA (320-400 nm)

têm a capacidade de gerar espécies químicas reativas como os radicais livres nas

células. Esses têm se mostrado estar envolvidos em diversos efeitos biológicos na

pele como o eritema, envelhecimento da pele etc (JUNG et al., 2008). De acordo

com os resultados obtidos por GOMES et al (2001) o AK tem uma atividade

antioxidante eficiente contra três espécies reativas de oxigênio (·OH, ·O

Deste modo ele poderia ser utilizado em produtos cosméticos, bloqueando a ação e

os efeitos colaterais de muitas espécies reativas de oxigênio produzidas.

2.5 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDO KÓJICO

A concentração de uma amostra não é uma grandeza física observável e num

processo analítico ela sempre é obtida de forma indireta, a partir de medidas de

outras grandezas como absorção ou emissão de luz e condutividade (PIMENTEL;

NETO, 1996). Deste modo é necessário que se disponha de métodos e aparelhos

adequados para a identificação e quantificação do analito em harmonia com a sua

real concentração. Uma das ferramentas mais importantes no controle de qualidade

físico-químico é a utilização de equipamentos que envolvem a mensuração de um

ou mais analitos de forma simultânea. A seleção e desenvolvimento de métodos de

análises tem tradicionalmente sido assunto de importância para analistas que

trabalham em laboratórios analíticos (WOOD, 1999). Cada aparelho tem seu

princípio teórico básico e relacionando isto as técnicas são desenvolvidas,

aperfeiçoadas e validadas.

As técnicas e os métodos de determinação e/ou quantificação de AK são

bastante variadas, como por exemplo: cromatografia gasosa baseada em derivados

silyl para separação e quantificação de AK (OWENS; WELTY; LUCAS, 1970);

cromatografia em camada delgada (SCOTT; LAWRENCE; WALBEEK, 1970);

determinação espectrofotométrica com sulfato de ferro (III) (KAWATE; KOIKE;

FUKUO, 1972); cromatografia líquida de alta eficiência (QURESHI; PRENTICE;

BURGER, 1979); determinação de AK em meio fermentativo pelo método ―stopped

flow‖ e espectrofotometria (TANIGAKI; OBATA; TOKUYAMA, 1980); cromatografia

líquida de alta eficiência em fase reversa (FRISVAD, 1987); cromatografia gasosa

usando capilar de sílica fundida (GOTO; MATSUI; KITSUWA, 1990); coluna

cromatográfica Bio Gel P-2 (KARITA et al., 1991); método enzimático para a

determinação de AK que apesar de ser muito sensitivo e específico pode ser mais

oneroso que os demais métodos por causa da pureza das enzimas (STREFFER et

al., 1998); determinação do analito por HPLC-UV acoplado com fluorescência pela

formação de um característico amarelo esverdeado brilhante (ZERINGUEJR et al.,

1999); Em 2004, GOMARA et al. desenvolveram e validaram um método de análise

direta através de espectroscopia UV; CORRER et al. (2005) desenvolveram uma

técnica para determinação de AK em produtos farmacêuticos utilizando-se de uma

ferramenta analítica – calibração multivariada – e espectroscopia no UV; No ano

seguinte duas novas técnicas foram publicadas com a mesma finalidade das outras

anteriores. Em uma delas, YANG; ZHANG (2007) investigaram o comportamento

voltimétrico do AK por PVP/ABPE e desenvolveram um método para quantificação.

LIN; WU; HUANG,(2007) combinaram um HPLC com microdiálise online para

determinação simultânea de ascorbil, AK e niacinamida em cosméticos clareadores.

Já em 2007, (BUBACCO et al., 2007) usaram absorção por raio-x; LIN; YANG; WU

(2007) otimizaram um sistema para análise de AK, arbutin e hidroquinona

simultaneamente através da eletroforese capilar eletrocinética micelar; SYNYTSYA

et al (2007) complexaram AK com ferro III para quantificação em UV-Vis e

conjugados com chitosana por RMN de H

; método por LC/TOF-MS com

confirmação dos dados também por UV e tempo de retenção no cromatógrafo

líquido (SENYUVA; GILBERT; OZTURKOGLU, 2008).

Cada aparelho e técnica usada como HPLC, eletroforese capilar, UV-VIS e

seus métodos tem recursos especiais e deficiências, os quais devem ser

considerados (BRUCE; MINKKINEN; RIEKKOLA, 1998).

2.5.1 Espectroscopia eletrônica

A radiação numa faixa de comprimento de onda de 2-800 nm é passada

através de uma solução do composto. Os elétrons das ligações são excitados e

ocupam um estado quântico superior, absorvendo um pouco de energia que passa

pela solução (WATSON, 1999). A absorção depende da estrutura eletrônica da

molécula (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1994) e do comprimento de onda

da radiação (SOLOMONS, 1996). As transições dos elétrons podem ocorrer a partir

de um entre vários estados de vibração e de rotação de um nível de energia

eletrônica para um entre diversos estados de vibração ou de rotação do nível mais

elevado (SOLOMONS, 1996). A transição de um elétron entre diferentes níveis

energéticos é chamado de ―transição eletrônica‖ e o processo de absorção é

chamado ―absorção eletrônica‖ (SKOOG et al., 2000). O termo cromóforo é usado

para descrever qualquer estrutura característica o qual leva a absorção na região do

UV-Vis e inclui grupos nos quais as transições π→ π*, n→ π* e n→ ζ* são possíveis

(FURNISS et al., 1989). A conjugação n→ π leva a um deslocamento da absorção

para comprimento de ondas maiores é chamado ―efeito batocrômico‖ e inversamente

para menores como ―efeito hipsocrômico‖. Quando há um aumento na intensidade o

efeito é denominado ―hipercrômico‖ e quando ela diminui é ―hipocrômico‖ (HESSE;

MEIER; ZEEH, 2008; FURNISS et al., 1989). As regiões do espectro

eletromagnético podem ser visualizados na figura 14 e, em especial, do ultravioleta e

infravermelho no quadro 1.

FIGURA 14 – REGIÕES DO ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO

FONTE: HOLLAS (2004)

REGIÃO ESPECTRAL

COMPRIMENTO DE ONDA

FREQÜÊNCIA EM NÚMERO DE ONDA

(cm

-1

)

Ultravioleta

2 – 400 nm

5000000 - 50000

Ultravioleta visível

400 – 800 nm

50000 – 25000

Infravermelho

0,75 – 2,5 μm

13333 - 400

Infravermelho distante

2,5 μm – 1 mm

400 – 10

QUADRO 1 – REGIÕES DO ULTRAVIOLETA E INFRAVERMELHO DO ESPECTRO

ELETROMAGNÉTICO

FONTE: SKOOG et al., 2000

Um dos grupos de maior interesse é o dos hidrocarbonetos insaturados, uma

vez que eles apresentam hibridação sp

. Há uma ligação π dos elétrons p do

carbono perpendiculares ao plano das ligações ζ. Neste caso, os elétrons π ligantes

têm uma força de ligação menor e podem passar para níveis de energia superiores,

orbitais π antiligantes, sem se dar uma completa ruptura da molécula. Assim,

verifica-se a absorção da radiação na região do ultravioleta, atribuído a transições

dos elétrons π de orbitais ligantes para antiligantes transições (π- π*). No estado π*

a ligação π não existe e a molécula só tem ligações simples para se manter como

um todo. Estas transições correspondem a absorções na região de 200-700 nm

(GONÇALVES, 1990).

Como ponto forte a espectroscopia no UV é fácil de usar, é relativamente

barata e oferece uma boa precisão para mensurações quantitativas (WATSON,

1999). É uma das ferramentas mais poderosas e amplamente usada em análises

quantitativas (SKOOG et al., 2000). Como limitação, é moderadamente seletiva,

dependendo do cromóforo, e não muito aplicável para misturas de analitos

(WATSON, 1999). Entretanto, o mesmo ponto pode ser visto no âmbito de que

grupos característicos podem ser reconhecidos em moléculas bastante complexas

(SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1994).

Em 2004, GOMARA et al publicaram um artigo que teve por objetivo

desenvolver e validar um método de quantificação por espectroscopia eletrônica

direta e sem a complexação com alumínio do AK. Usando um meio aquoso, e

comprimento de onda máximo de 269 nm, ela determinou para o método: intervalo,

linearidade, robustez, exatidão e precisão. O método que foi desenvolvido é limitado

apenas para a matéria-prima, sendo inviável para produto. Isso se dá uma vez que

na região do comprimento de onda de quantificação do AK (269 nm) outras

moléculas que estão presentes nos cremes como conservantes (nipagin nipazol)

contém cromóforos que absorvem na mesma região. Em 2007 (OLIVEIRA et al.,

2007) desenvolveram um método para quantificar AK em estudos de permeação in

vitro com solução salina de cloreto de sódio 0,9% (m/v) no comprimento de onda

268 nm. Ácido kójico também pode ser determinado por colorimetria na reação com

cloreto férrico em água (MORTON et al., 1945) e de acordo com MOSS e MELLON

(1941) em pH 5-6 na proporção de 1 ferro para 3 AK. Coloração vermelha escura é

observada quando as soluções de ferro (III) e AK são misturadas na faixa de pH 2-3

(MURAKAMI, 1962b).

2.5.1.1 Complexometria

Compostos de coordenação incluem compostos com um átomo metálico ou

íon e um ou mais ligantes (átomos, íons ou moléculas) que formalmente doam

elétrons para o metal. Esses compostos também são conhecidos como Complexos

(MIESSLER; TARR, 2003).

O estudo moderno dos compostos de coordenação se iniciou com Alfred

Werner e Sophus Mads Jorgensen, sendo que pode-se concluir que Werner estava

―certo‖ e Jorgensen estava ―errado‖ na interpretação das evidências experimentais

que eles tinham (HUHEEY; KEITER; KEITER, 1993). Werner foi capaz de explicar a

natureza das ligações nos complexos e concluiu que nesses compostos o metal

apresenta dois tipos de valência: primárias, que seria o número de cargas no íon

complexo; e secundárias, que seria igual ao número de átomos ligantes

coordenados ao metal (LEE, 1996).

Há três teorias que explicam as ligações entre metal e os ligantes nos

complexos, todas formuladas na década de 30: teoria da ligação de valência, teoria

do campo cristalino e teoria dos orbitais moleculares (LEE, 1996).

Baseado na estrutura do gás nobre é possível prever a estequiometria da

maioria dos complexos de ligantes π-ácido. O número de elétrons de valência do

átomo metálico adicionado ao número de pares de elétrons ζ, contribuídos pelos

ligantes, deve ser igual ao número de elétrons do átomo de gás nobre que sucede

ao metal (COTTON; WILKINSON, 1978).

A determinação de constantes de estabilidade por titulações potenciométricas

com alumínio é um método poderoso para definir a identidade e distribuição dos

complexos metal-ligante pela investigação da especiação em sistemas aquosos

(JORDAN et al., 1996).

Os elementos do grupo III formam complexos com muito maior facilidade do

que os elementos do bloco s, pois apresentam menor tamanho e carga maior. Os

compostos de alumínio apresentam como aspecto incomum as estruturas

dimerizadas e parecem incluir ligações tricentradas envolvendo orbitais híbridos sp

no Al e C nas pontes Al-C-Al (LEE, 1980). Os elementos trivalentes formam

complexos com a coordenação 4, 5 ou 6 catiônicos como o [Al(H

]

, neutros ou

aniônicos (COTTON; WILKINSON, 1978). A quelação com íons metálicos

desempenha um papel central na homeostase da atividade enzimática, no qual mais

de um terço de todas as enzimas conhecidas requerem a presença de íons

metálicos da atividade catalítica (STENSON; CIOFFI, 2007). Conhecimento da

especiação do Al

em soluções aquosas é importante para uma ampla gama de

áreas de pesquisa como a de cosméticos (FOURNIER; SHAFRAN; PERRY, 2008).

Em soluções aquosas, por exemplo, com citrato o alumínio é capaz de fazer seis

ligações, entre moléculas de água e do próprio citrato ou apenas entre oxigênios do

mesmo como pode ser visualizado na figura 15.

FIGURA 15 - ESTRUTURAS ESQUEMÁTICAS DA LIGAÇÃO DO ALUMÍNIO COM CITRATO

FONTE: ADAPTADO DE KUAN et al. (2005)

A molécula do cloreto de alumínio, em solução, devido à grande energia de

hidratação liberada supera a elevada energia de ionização e os íons metálicos

existem num estado hidratado. Estes apresentam seis moléculas de água

firmemente ligadas formando uma estrutura octaédrica. Em solução ácida o

potencial de redução de Al

até Al

é -1.66 e, em solução básica, é -2.31 (LEE,

1980). A estrutura do íon aluminato varia de acordo com o pH, de 8 a 12 os íons

polimerizam através de pontes de OH e cada átomo de alumínio possui

coordenação oito (COTTON; WILKINSON, 1978; LEE, 1980).

O interesse nos complexos metálicos com o ligante AK tem sido estimulado

por fatores como: espera-se que os complexos possuam uma atividade antibiótica

de amplo espectro e pela alta estabilidade dos complexos (BHATIA; KAUSHIK;

SODHI, 1988).

2.5.2. Espectroscopia no infravermelho

A radiação infravermelha não tem energia suficiente para provocar excitações

dos elétrons, mas faz com que os átomos, ou grupo de átomos, dos compostos

orgânicos vibrem com maior rapidez e com maior amplitude em torno das ligações

covalentes que os unem. Estas vibrações são quantizadas e, quando ocorrem, os

compostos absorvem energia IV em certas regiões do espectro (SOLOMONS,

1996). Apesar da energia não ser suficiente a radiação pode induzir transições em

estados vibracionais e rotacionais associados com o estado eletrônico fundamental

das moléculas (SKOOG et al., 2000). A intensidade das bandas de absorção

depende da magnitude da carga na oscilação do momento dipolo da ligação durante

a transição e também é diretamente proporcional ao número de ligações para aquela

absorção particular. (FURNISS et al., 1989).

O IV está inserido no espectro eletromagnético entre as regiões do visível e

das microondas e pode ser dividida em infravermelho próximo (14290 cm

-1

– 4000

-1

), médio (4000 cm

-1

– 700 cm

-1

) e infravermelho distante (700 cm

-1

– 200 cm

-1

)

(SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1979). A região mais importante para a

química orgânica é compreendida entre 4000 e 660 cm

-1

(FURNISS et al., 1989).

Na região do infravermelho, a absorção da radiação pode dar informações

sobre a identidade dos compostos na presença ou ausência de grupos funcionais e

estrutura das moléculas. Com exceção de moléculas diatômicas homonucleares,

todas as outras absorvem radiação infravermelha. Por isso, é um dos métodos

espectroscópicos de mais ampla aplicação (SKOOG et al., 2000). É adequado para

usos em linha, próxima de uma aplicação universal, pois qualquer molécula contém

ligações C-H, N-H, S-H ou O-H (PASQUINI, 2003). Há dois tipos principais de

vibrações moleculares: estiramento axial e deformação angular. Os estiramentos

axiais podem ser simétricos ou assimétricos. Deformações angulares podem ser

simétricas no plano (tesoura), assimétrica no plano (balança), simétrica fora do plano

(torção) e assimétrica fora do plano (abano) (FURNISS et al., 1989).

O principal uso do infravermelho para moléculas como complexos metálicos é

fornecer um método rápido para determinação da formação do complexo. Em alguns

casos, informações estruturais específicas podem ser obtidas (JORDAN et al.,

1996). A técnica tem sido amplamente utilizada como um meio direto e rápido para

identificar produtos pela indústria farmacêutica (PASQUINI, 2003).

Uma interpretação completa de um espectro é, muitas vezes, difícil e

complexa, pois a maioria dos compostos orgânicos tem um número muito grande de

movimentos de flexão e alongamento. Entretanto não há a necessidade da

elucidação completa do espectro, mas da identificação mínima de grupos funcionais.

Se por um lado essa complexidade é um ponto negativo, ela também tem um ponto

positivo quando dois espectros são quase que perfeitamente superponíveis a

chance de elas terem sido geradas por amostras de uma mesma substância é muito

grande.

O método experimental mais utilizado para analisar carbonila e complexos

metálicos é espectroscopia no infravermelho. A utilidade da freqüência de

estiramento da carbonila se dá pela sensitividade desta absorção em relação à

população de elétrons dos orbitais CO antiligantes (HUHEEY; KEITER; KEITER,

1993).

Infravermelho pode ser útil em dois aspectos: o número de bandas de IV

depende da simetria molecular e a determinando se é capaz de decidir ou reduzir o

número de possibilidades entre as alternativas geométricas; a posição das bandas

de IV podem indicar a função do ligante e pode descrever o meio em que está o

elétron do metal (MIESSLER; TARR, 2003). Tem sido amplamente usada em

análises qualitativas e quantitativas, sendo importante para a avaliação de matérias-

primas e produtos (STUART, 2004). É uma técnica analítica que pode ser

quantitativa, rápida, não destrutiva e praticamente não exige a utilização de

reagentes e solventes.

2.5.3. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Sob condições apropriadas em um campo magnético, uma amostra pode

absorver radiação eletromagnética na região de rádio-frequência em freqüências

definidas pelas características do analito (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE,

2005). Os núcleos de certos elementos e isótopos comportam-se como se fossem

imãs girando em torno de um eixo. Quando se coloca um composto contendo

átomos de

H ou de

C num campo magnético muito forte e simultaneamente se

irradia o composto com energia eletromagnética, os núcleos podem absorver

energia que é quantizada (SOLOMONS, 1996). A nuvem eletrônica que circunda o

núcleo também tem carga, movimento e, portanto, momento magnético. O campo

magnético gerado pelos elétrons altera o campo magnético no microambiente ao

redor do núcleo (LAMBERT; MAZZOLA, 2003). A absorção é função de

determinados núcleos da molécula. Por convenção, freqüência e, portanto, a força

do campo magnético aumenta da esquerda para direita. Movimentos da esquerda

para direita são denominados para campo alto (mais blindadas) e da direita para

esquerda de movimentos para campo baixo (desblindadas) (FURNISS et al., 1989).

Um registro gráfico das freqüências dos picos de absorção contra suas intensidades

constitui-se em um espectro de RMN (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1979).

A técnica é somente aplicável aos núcleos que possuem número de quantum

spin (I) maior que zero (FURNISS et al., 1989). Ressonância magnética nuclear é

um método poderoso para se estudar complexos com Al

em solução. Além disso,

espectros com

H e

C podem ser obtidos de um modo relativamente simples

(JORDAN et al., 1996). Uma evolução importante na detecção de sinais fracos é a

RMN com Transformada de Fourier (FT) (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL,

1979). RMN é uma ferramenta valiosa na caracterização de complexos

organometálicos (MIESSLER; TARR, 2003).

2.5.4 Titulação potenciométrica

Potenciometria é uma técnica comum para determinar as constantes de

estabilidade por causa da simplicidade dos aparatos experimentais e a facilidade

com o qual o sistema pode ser automatizado (JORDAN et al., 1996).

Embora os resultados da titulação potenciométrica não possam fornecer uma

compreensão da estrutura do complexo, verificando as constantes de ligação as

quais mostram a força de interação entre um ligante e um íon metálico, um pode

inferir qual o sítio básico é mais provável para interagir com o ácido de Lewis; a

especiação de acordo com a carga nos valores de pH podem ser calculados

(MERCÊ et al., 2002). O mecanismo dominante para a reação de primeira hidrólise

do Al

é uma troca rápida e direta de H

entre adjacentes H

O / H

e H

O / OH

; pó

segundo e terceiro passos da hidrólise são também rápidos, porque o mecanismo de

troca do H

deveria acontecer nessas reações também. Deste modo, sob a maioria

das condições as espécies Al

, Al(OH)

e Al(OH)

se interconvertem rapidamente

e estão equilíbrio dinâmico entre eles(FAUST et al., 1995). O pH de uma solução de

um ácido poliprótico submetida a uma titulação pode ser estimado em qualquer

ponto considerando as espécies primárias em solução e o equilíbrio de transferência

de próton que determina o pH (ATKINS; JONES, 2001). Um melhor entendimento da

bioquímica do alumínio requer um aumento do conhecimento do equilíbrio do

complexo do íon Al

com ligantes. Para isto é absolutamente necessário construir

modelos de especiação (VENTURINI-SORIANO; BERTHON, 1998).

2.6 VALIDAÇÃO

Atualmente não há uma gama muito ampla de técnicas simples de

quantificação de AK em preparações farmacêuticas. Sendo assim faz-se necessário

o estudo e a conseqüente validação de mais métodos que quantifiquem esse analito.

Em indústrias, tais como a farmacêutica, química e alimentícia, os métodos

analíticos são os ―olhos‖ e os ―ouvidos‖ para todos os materiais produzidos e usados

(BOULANGER et al., 2007). A escolha de uma metodologia analítica adequada é de

fundamental importância para o procedimento do controle de qualidade de uma

substância ativa ou forma farmacêutica (VALENTINI; SOMMER; MATIOLI, 2007).

O desenvolvimento de um método analítico, a adaptação ou implementação

de método conhecido, envolve processo de avaliação que estime sua eficiência na

rotina do laboratório (BRITO et al., 2003). Esse processo denomina-se validação.

A validação confere ao processo maior confiabilidade e aceitação dos

resultados. É feita para assegurar que a metodologia analítica seja exata, específica,

reprodutível e robusta sobre um intervalo especificado em que o analito será

analisado (SHABIR, 2003). É uma parte inevitável no desenvolvimento de métodos

farmacopeicos ou procedimentos analíticos de controle de qualidade (GRDINIC;

VUKOVIC, 2004). A ANVISA (2003) preconiza que o objetivo de uma validação é

demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a

determinação qualitativa, semi ou quantitativa. Através do fornecimento de evidência

objetiva, comprova que os requisitos para uma aplicação ou uso específicos

pretendidos foram atendidos (INMETRO, 2003). O processo visa dar aos

laboratórios e aos órgãos regulatórios uma garantia que cada mensuração que será

feita posteriormente será ―próxima o suficiente‖ ao ―valor verdadeiro‖ ou no mínimo

que a diferença estará abaixo do limite aceitável (HUBERT et al., 2004). Validar um

resultado é fazer com que todos os procedimentos até chegar ao resultado final

sejam aceitos como corretos.

A validação de um método analítico não significa que este possa ser aplicado

sem restrições para diferentes medicamentos com o mesmo princípio ativo, uma vez

que os resultados são influenciados por inúmeros fatores como a estrutura química,

diferenças entre as fórmulas de um laboratório para outro (VALENTINI; SOMMER;

MATIOLI, 2007).

Usar testes estatísticos adequados para cada parâmetro faz com que as

tomadas de decisão sejam menos subjetivas e, conseqüentemente, deixa o método

mais fácil de ser explicado e de ser implementado. O INMETRO (2003) sugere uma

série de elementos e pontos chave que podem ser relevantes durante o processo de

desenvolvimento analítico. O planejamento e execução da validação pode ser feito

com a seguinte seqüência: Definir a aplicação, objetivo e escopo do método; Definir

os parâmetros de desempenho e critérios de aceitação; Desenvolver um

procedimento operacional para validação; Definir os experimentos de validação;

Verificar se as características de desempenho do equipamento estão compatíveis

com o exigido pelo método em estudo; Qualificar os materiais, por exemplo, padrões

e reagentes; Executar os experimentos preliminares de validação; Ajustar os

parâmetros do método e/ou critérios de aceitação, se necessário; Executar

experimentos completos de validação; Preparar um procedimento operacional para

execução do método, na rotina; Definir critérios de revalidação (por exemplo,

mudanças de pessoal, condições ambientais, equipamentos, periodicidade), e definir

tipo e freqüência de verificações de controle da qualidade analítica para a rotina.

Os processos de validação são dinâmicos e nesse contexto têm-se as etapas

do ciclo (que aparecem dentro dos retângulos) e as ferramentas principais ou

técnicas (que estão nas elipses) da figura 16 (FEINBERG, 2007).

FIGURA 16 - CICLO DE VIDA DE UM MÉTODO DE ANÁLISE

FONTE: ADAPTADO DE FEINBERG (2007)

Os métodos analíticos podem ser classificados de acordo com a finalidade

como está descrito no Quadro 2:

CATEGORIA

FINALIDADE DO TESTE

Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos

farmacêuticos ou matérias–primas

Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e produtos

de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas

III

Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo)

Testes de identificação

QUADRO 2 – CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS ANALÍTICOS DE ACORDO COM A FINALIDADE

FONTE: ANVISA (2003)

Os parâmetros a serem analisados em um método a ser validado são:

especificidade e seletividade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade (limite de

detecção), limite de quantificação, exatidão e robustez. Cada categoria descrita no

quadro 2 exige um determinado conjunto de testes, conforme relacionados no

Quadro 3:

PARÂMETRO

CATEGORIA I

CATEGORIA II

QUANTITATIVO

ENSAIO LIMITE

CATEGORIA

III

CATEGORIA

Especificidade

Sim

Linearidade

Sim

Não

Intervalo

Sim

Não

Repetibilidade

Precisão

Intermediária

Sim

Não

Sim

Não

Limite de detecção

Não

Sim

Não

Limite de

quantificação

Não

Sim

Não

Exatidão

Sim

Não

Robustez

Sim

Não

* Pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico.

** Se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária a Precisão Intermediária.

QUADRO 3 – ENSAIOS NECESSÁRIOS PARA A VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS DE ACORDO

COM A SUA FINALIDADE

FONTE: ANVISA (2003)

Como a proposta do método desse trabalho é quantificar princípio ativo em

produtos farmacêuticos e matéria-prima, os parâmetros analisados foram: intervalo,

linearidade, precisão, seletividade, exatidão e robustez.

2.6.1 Seletividade / especificidade

A especificidade e a seletividade estão relacionadas ao evento da detecção

(INMETRO, 2003). A seletividade é a capacidade que um método possui de medir

exatamente um composto em presença de outros componentes tais como

impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz (ANVISA, 2003).

Para métodos cromatográficos, serão específicos aquele que mensurarem

com exatidão o analito na presença de todos os outros componentes potenciais da

amostra (SHABIR, 2003). Mensurações espectrométricas como UV-VIS tendem a

serem seletivas, pois não distinguem muito bem compostos que tenham cromóforos

semelhantes (PERSSON; VESSMAN, 1998).

Seletividade tem sua origem em ―seligo‖, que em latim significa escolher ou

selecionar. Seletivo é algo que ―tende a escolha com cuidado‖ e seletividade o

―estado ou qualidade de ser escolhido‖ (PERSSON; VESSMAN, 2001). A

seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de

interesse (PHARMACOPEIA, 1999). Em procedimentos analíticos os métodos para

detectar qualitativamente são seletivos e os que mensurarem quantitativamente

serão específicos (VESSMAN, 1996),porém poucos métodos são realmente

específicos (PERSSON; VESSMAN, 1998). Entretanto os termos tem sido usados

indistintamente ou com diferentes interpretações (INMETRO, 2003) e para o termo

especificidade o mesmo significado de seletividade tem sido freqüentemente

utilizado (RIBANI et al., 2004), embora no senso restrito não seja correto (PETERS;

DRUMMER; MUSSHOFF, 2006) por terem significados diferentes (ROZET et al.,

2007). Esse problema poderia ser evitado caso se utilizasse apenas o termo

seletividade -como sugere a IUPAC- uma vez que são diminutos os métodos que

respondem à apenas uma substância.

2.6.2 Linearidade e intervalo

A linearidade de um procedimento analítico é a habilidade para obter

resultados dos testes os quais são diretamente proporcionais à concentração (valor)

do analito na amostra dentro de um intervalo especificado (ICH, 2005; INMETRO,

2003; ANVISA, 2003). Essa relação matemática, muitas vezes, pode ser expressa

como uma equação de reta chamada de curva analítica (RIBANI et al., 2004). Ela se

aplica aos resultados (concentração) e não às respostas (sinal) (HUBERT;

NGUYEN-HUU; BOULANGER; CHAPUZET; COHEN et al., 2007). Deve ser

avaliado entre a faixa do procedimento analítico. Pode ser demonstrado diretamente

na substância (pela diluição de uma solução padrão estoque) e/ou pesagens

separadas de misturas sintéticas dos componentes do produto, usando o

procedimento proposto (ICH, 2005)

Deve ser avaliada pela inspeção visual do contexto de sinais como uma

função da concentração do analito. Se há uma relação linear, ela deverá ser

investigada por métodos estatísticos apropriados, por exemplo, pelo cálculo de uma

regressão linear (ICH, 2005). Para estabelecer a linearidade, um mínimo de 5

concentrações é recomendada (ICH, 2005). A equação da reta que relaciona as

duas variáveis é: y = ax + b

y = resposta medida (absorbância); x = concentração;

a = inclinação da curva de calibração = sensibilidade;

b = interseção com o eixo y, quando x=0.

O coeficiente de correlação linear (r) é freqüentemente usado para indicar o

quanto pode ser considerada adequada a reta como modelo matemático. Um valor

maior que 0,90 é, usualmente, requerido. Quanto mais se aproximar de 1,0 o

coeficiente menor será a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a

incerteza dos coeficientes de regressão estimados (RIBANI et al., 2004). O método

pode ser considerado como livre de tendências (unbiased) se o corredor de

confiança da reta de regressão linear contiver a origem (INMETRO, 2003). O critério

mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve ser = 0,99 (ANVISA, 2003).

Intervalo é a faixa entre a maior e a menor concentração (valor) do analito na

amostra para o qual tem sido demonstrado que o procedimento analítico tem um

nível adequado de precisão, exatidão e linearidade (ICH, 2005; SHABIR, 2003). É

normalmente derivado dos estudos de linearidade. É estabelecido pela confirmação

de que o procedimento analítico proporciona um grau de aceitabilidade da

linearidade, exatidão e precisão dentro dos extremos da faixa especificada.

Geralmente vai de 80 a 120% da concentração teste (ICH, 2005; ANVISA, 2003).

2.6.3 Exatidão

Expressa a proximidade da concordância entre o valor no qual cada um é

aceito como um valor convencional verdadeiro ou um valor referencia aceito e o

valor encontrado (SHABIR, 2003; HUBERT; NGUYEN-HUU; BOULANGER;

CHAPUZET; CHIAP et al., 2007). É chamada, às vezes, de veracidade (ICH, 2005).

Pode ser feita pela comparação dos resultados do procedimento analítico com

aqueles de um segundo procedimento bem caracterizado (ICH, 2005; ANVISA,

2003). A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da

linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a

partir de, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear do

procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três)

réplicas cada. A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média

determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente:

FIGURA 17 – Fórmula da exatidão

Quando aplicada a uma série de resultados de ensaio, implica numa

combinação de componentes de erros aleatórios e sistemáticos (tendência)

(INMETRO, 2003).

Na avaliação da exatidão utilizando um material de referência pode-se usar

testes estatísticos como o erro relativo, teste de hipóteses, entre outros. Caso não

seja alcançado resultados satisfatórios deve ser feita uma investigação para

averiguar as possíveis causas, reavaliar o ensaio e efetuar ações corretivas.

2.6.4 Precisão

A precisão de um procedimento analítico expressa a proximidade de

concordância (grau de dispersão) entre a série de leituras obtidas de múltiplas

amostras da mesma amostra homogênea sob condições prescritas (ICH,

2005)(INMETRO, 2003). É a parte mais importante de qualquer validação de método

analítico (WALFISH, 2006).

Deve ser investigada usando amostras autenticas e homogêneas. Entretanto,

se não é possível obter uma amostra homogênea, ela deve ser investigada usando

amostras preparadas artificialmente ou uma amostra solução (ICH, 2005).

A precisão pode ser considerada em três níveis: repetitividade, precisão

intermediária e reprodutibilidade (ICH, 2005). Repetitividade e reprodutibilidade são

geralmente dependentes da concentração do analito e devem ser determinadas para

um número diferente de concentrações. Neste caso o desvio padrão relativo pode

ser útil, uma vez que foi normalizado com base na concentração e deste modo ele é

praticamente constante ao longo da faixa de interesse (INMETRO, 2003).

2.6.4.1 Repetitividade

É o grau de concordância entre os resultados de medições sucessivas de um

mesmo mensurando, efetuadas sob as mesmas condições de medição, chamadas

de condições de repetitividade: mesmo procedimento de medição; mesmo

observador; mesmo instrumento usado sob mesmas condições; mesmo local, e

repetições em curto espaço de tempo (INMETRO, 2003).

Deve ser realizada com um mínimo de 9 determinações cobrindo a faixa

especificada (80,100 e 120%) para o procedimento ou 6 determinações da

concentração teste (100%) (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003). O termo repetitividade

é adotado pelo Vocabulário Internacional de Metrologia (INMETRO, 2000). Por outro

lado, a ANVISA (2003) utiliza o mesmo conceito para o termo repetibilidade.

2.6.4.2 Precisão intermediária

A precisão intermediária refere-se à precisão avaliada sobre a mesma

amostra, amostras idênticas ou padrões, utilizando o mesmo método, no mesmo

laboratório ou em laboratórios diferentes, mas definindo exatamente quais as

condições a variar (uma ou mais), tais como: diferentes analistas; diferentes

equipamentos; diferentes tempos.

O objetivo da validação da precisão intermediária é verificar que no mesmo

laboratório o método fornecerá os mesmos resultados.

Esta medida de precisão é reconhecida como a mais representativa da

variabilidade dos resultados em um laboratório e mais aconselhável de usar. Para

determinar a precisão intermediária de um método, efetuam-se ―n‖ medições em

replicata, ou em ensaio único, sobre a amostra, nas condições pré-definidas, pois

existem vários métodos de estudar este tipo de precisão. (INMETRO, 2003).

2.6.4.3 Reprodutibilidade

Concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes.

Refere-se aos resultados de colaboração entre laboratórios e deve ser considerada

em situações como a padronização de procedimentos analíticos a serem incluídos,

por exemplo, em farmacopéias (ANVISA, 2003; ICH, 2005). A ICH e a ANVISA

sugere um mínimo de nove determinações de um mínimo de três níveis de

concentrações, de acordo com o intervalo especificado, ou um mínimo de seis

determinações para uma única concentração teste. A precisão pode ser expressa

como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV%), segundo a

fórmula:

DPR = (DP x 100)

CMD

FIGURA 18 – FÓRMULA DO DESVIO PADRÃO RELATIVO

Em que, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada. O

valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada,

a concentração do analito na amostra, o tipo da matriz e a finalidade do método, não

se admitindo valores superiores a 5% (ANVISA, 2003).

2.6.5 Robustez

É uma medida da capacidade dos resultados continuarem inalterados, por

pouco, frente a variações deliberadas nos parâmetros do método e proporciona uma

indicação da confiabilidade durante usos normais (ICH, 2005). Ela é descrita como a

estabilidade do método (BRUCE; MINKKINEN; RIEKKOLA, 1998).

Mede a sensibilidade que este apresenta face a pequenas variações. Um

método diz-se robusto se revelar praticamente insensível a pequenas variações que

possam ocorrer quando esse está sendo executado (INMETRO, 2003).

2.6.6 Sensibilidade

A sensibilidade é definida como a capacidade de um método em distinguir,

com determinado nível de segurança, duas concentrações próximas (ICH, 2005).

A sensibilidade foi verificada através dos limites de detecção e quantificação.

O limite de detecção (LD) de um procedimento analítico é a menor quantidade do

analito numa amostra a qual pode ser detectada, mas não necessariamente

quantificada como um valor exato (FDA, 1995), sob as condições experimentais

estabelecidas (ANVISA, 2003). Ele é calculado pelo desvio padrão do intercepto

com o eixo Y (a partir de três curvas analíticas) multiplicado por três e dividido pela

inclinação da curva analítica.

O limite de quantificação (LQ) de um procedimento analítico individual é a

menor quantidade do analito na amostra que pode ser determinado com adequada

precisão e exatidão (FDA, 1995). Ele é calculado pelo desvio padrão do intercepto

com o eixo Y (a partir de três curvas analíticas) multiplicado por dez e dividido pela

inclinação da curva analítica.

Objetivos

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver e validar um método para a quantificação de ácido kójico

matéria-prima e produto por espectrofotometria no ultravioleta.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Desenvolver um método para a quantificação do ácido kójico em matéria-

prima e em cremes, por espectrofotometria no ultravioleta, tendo por base as

propriedades quelantes do analito com íons metálicos (Alumínio);

- Validar o método desenvolvido segundo normas nacionais e internacionais;

- Testar o método desenvolvido em preparações magistrais contendo o ácido

kójico em associação com a hidroquinona;

- Quantificar ácido kójico e a hidroquinona na mesma análise;

- Elucidar o tipo de complexo formado entre o ácido kójico e o alumínio

Material e Métodos

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 DESENHO EXPERIMENTAL

A pesquisa foi dividida basicamente em duas etapas. A primeira etapa

compreendeu o desenvolvimento e validação de um método espectrofotométrico

(UV) para a quantificação de ácido kójico em matéria-prima e em creme cosmético.

No desenvolvimento foram testados diferentes solventes para definir o mais

adequado, o comprimento de onda, a absortividade molar, bem como a necessidade

de otimização do método. A validação foi realizada baseada na Resolução - RE nº

899, de 29 de maio de 2003, farmacopéia americana (USP, 2005) e da Conferência

Internacional de Harmonização (ICH, 2005) nos parâmetros: linearidade,

sensibilidade, repetitividade, precisão intermediária, exatidão e robustez. Na

segunda etapa procurou-se elucidar o tipo de complexo formado entre AK e AlCl

Para essas análises foram utilizadas algumas ferramentas como a espectrometria no

UV-Vis, titulação potenciométrica, infravermelho e ressonância magnética nuclear.

4.2 MATERIAL

4.2.1 Materiais e reagentes

- ácido kójico padrão Sigma Aldrich Chem. Co. (98,0%)

- ácido kójico matéria-prima Via Farma (100.5%)

- álcool metílico P.A. (FMAIA)

- água ultrapura e deuterada

- brometo de potássio (KBr) P.A.

- cloreto de alumínio solução 0,2% (LABSYNTH) e padrão 1000mg/l (MERCK)

- cloreto de sódio (NaCl) P.A.

- cloreto de potássio P.A.

- creme Lanette (DAGFARMA)

- chemynol (0,3 %), imidazoli (0,6 %), propilenoglicol (0,5 %), lanette N

(16,0 %), vaselina líquida (5,0%), BHT cristal (0,05 %), nipazol (0,1 %), glicerina

branca bidestilada (5,0 %), EDTA (0,1%), nipagin (0,2%), silicone volátil (2,0 %) e

água purificada qsp.

- creme Lanette AK 2% (DAGFARMA), AK 2% e HQ 4 %(DAGFARMA)

- creme não iônico (DAGFARMA)

- chemynol (0,3 %), silicone dc 9040 (1,0 %), imidazoli (0,6 %),

propilenoglicol (0,5 %), chembase NF (18,0 %), BHT cristal (0,1 %), nipazol (0,05 %),

glicerina branca bidestilada (5,0 %), EDTA (0,2%), nipagin (0,15%), silicone volátil

(1,0 %) e água purificada qsp.

- creme não iônico AK 2% (DAGFARMA), AK 2% e HQ 4 % (DAGFARMA)

- cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm

- papel filtro quantitativo (FRAMEX

; J.PROLAB)

4.2.2 Equipamentos

- aparelho de ponto de fusão (BUCHI SMP-20)

- balança analítica (METTLER TOLEDO EXCELENCE PLUS)

- espectrofotômetro UV-Vis (AGILENT 8453E) – Equipamento 1

- espectrofotômetro UV-Vis (SHIMADZU 1601PC) – Equipamento 2

- aparelho de ressonância magnética nuclear (BRUKER Avance DRX 400)

- espectrômetro infravermelho (BOMEM MB 100)

- espectrômetro de absorção atômica AA-220 FS Varian

- potenciômetro digital (HANNA HI 4521)

- titulador automático Titrando 805E (METROHM)

4.3 MÉTODOS

4.3.1 Desenvolvimento do método

O ácido kójico é um fármaco que apresenta um cromóforo característico e

possui intensa absorção na região do ultravioleta. Deste modo torna-se viável o

desenvolvimento de um método por espectrofotometria nessa região para a

quantificação do mesmo. Inicialmente foram testados os solventes água e metanol e

diferentes valores de pH, verificada a necessidade de filtração principalmente para o

produto e o processo mais adequado, verificação de outras substâncias presentes

na formulação e que também podem absorver na mesma região do espectro, como

melhorar a seletividade, seleção do melhor comprimento de onda e validação do

método.

4.3.1.1 Escolha do solvente e influência do pH

Para este ensaio foram preparadas soluções-mãe de ácido kójico, a primeira

em água (1500 μg/mL) e a segunda em metanol (1500 μg/mL). A partir da solução-

mãe aquosa de ácido kójico foram preparadas três soluções. A primeira contendo

AK 15 μg/mL; a segunda AK 15 μg/mL em meio acidificado (HCL 0,1M); a terceira

AK 15 μg/mL em meio alcalinizado (NaOH 0,1M). Procedeu-se da mesma forma

para a solução metanólica. Dessas soluções foram obtidos os espectros de

absorção na região de 200-400 nm foram obtidos em espectrofotômetro UV-Vis

Agilent 8453E, com cubeta de quartzo, espessura de 1,0 cm, à temperatura de 20ºC.

4.3.1.2 Avaliação da seletividade

O método foi desenvolvido com o propósito de ser utilizado para quantificar

ácido kójico em cremes cosméticos. Estes cremes geralmente contêm conservantes,

sendo também comuns a associação do AK com a hidroquinona. Desta forma, a

possível interferência destes componentes foi avaliada.

Para avaliar a interferência destes componentes foram preparadas soluções

aquosa e metanólica dos componentes da formulação (nipagin

, nipazol

hidroquinona e da base que era creme não iônico ou Lanette obtidas

comercialmente). Para o nipagin e nipazol a concentração final foi de 10 μg/ml. Para

a hidroquinona a concentração final foi de 20 μg/ml e para a base 1 mg/mL. Para os

conservantes também foram preparadas soluções ácidas e básicas.

Para melhorar a seletividade de métodos espectrofotométricos, em geral,

deve-se deslocar a banda de absorção do analito de interesse para comprimentos

de onda de maiores valores, onde poucas moléculas absorvem. Tomando por base

as características quelantes do analito, uma possibilidade foi a de utilização de um

cátion metálico trivalente (Al

), tendo em vista que os complexos em geral

promovem um deslocamento batocrômico. Para a formação do complexo uma

solução ácida (HCl 0,1M) de cloreto de alumínio 0,2% (p/V) foi adicionada, em

excesso na proporção molar, à solução de AK (20 μg/ml) tanto em meio aquoso

quanto metanólico.

Para a seleção do comprimento foram preparadas soluções de ácido kójico na

concentração de 15 μg/ml, em solução aquosa, metanólica e com solução ácida de

cloreto de alumínio, e os espectros das soluções foram obtidos na região de 200 –

400 nm A seleção do melhor comprimento de onda foram feitas levando-se em

consideração a intensidade da absorção e a região do espectro mais seletiva dentre

as bandas de absorção.

Outro recurso utilizado foi avaliação do coeficiente de correlação. Para esta

análise foram preparadas várias soluções de AK em solução ácida de cloreto de

alumínio em concentrações variando de 0,1 a 50 μg/ml. Em seguida foram obtidos

os espectros das soluções na região de 200 – 400 nm. A partir do conjunto de

espectros foram obtidas as curvas analíticas para os vários comprimentos de onda

do espectro (200 – 400 nm) e calculados os coeficientes de determinação. Os

valores de coeficiente de determinação foram representados graficamente versus

comprimento de onda, para avaliar a região de melhor proporcionalidade.

4.3.1.3 Influência da proporção AK e AlCl

na intensidade de absorção

Para esta análise foram preparadas soluções de ácido kójico (15 μg/ml) e

solução ácida (HCl 0,1M) de cloreto de alumínio 0,2% p/v. Em seguida foram

misturadas de tal forma que a concentração de AK foi mantida fixa em 15 μg/ml, e a

concentração da solução ácida de cloreto de alumínio variou, de tal forma a se obter

28 soluções em que o AK e o AlCl

encontravam –se em proporções molares (mol

de AK / mol de AlCl

) de 1:0 até 1: 136 (tabela 1).

4.4 VALIDAÇÃO

O método espectrométrico envolvendo a complexação do AK com cloreto de

alumínio em meio metanólico uma vez desenvolvido foi validado tomando por base

os parâmetros preconizados pela farmacopéia americana (USP, 2005), RDC 899

(ANVISA, 2003) e da Conferência Internacional de Harmonização (ICH, 2005).

4.4.1 Linearidade e intervalo

Para a determinação da linearidade foi preparada uma solução-mãe com

concentração de 2000 μg/ml e a partir desta foram feitas diluições em balões

volumétricos de 10 mL para se obter soluções de concentrações que variaram de 1-

100 μg/mL (1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 μg/mL). Em

cada sistema foi adicionado 1,5 mL de solução ácida (HCl 0,1M) de cloreto de

alumínio 0,2% (p/V) e o volume completado para 10 ml com metanol. As

absorbâncias foram determinadas em λ= 305 nm. O ensaio foi realizado em

triplicata. Os gráficos foram traçados correlacionando-se as concentrações às

respectivas absorbâncias. Foram determinados a equação da reta e o coeficiente de

determinação. A partir do gráfico da linearidade foi também definido o intervalo, e a

concentração de trabalho.

O intervalo foi definido a partir do ensaio da linearidade, e considerando a

concentração de trabalho, ± 20,0% da concentração teórica teste recomendada para

determinação quantitativa de matéria-prima e produto acabado. Para a construção

da curva padrão foram realizadas três pesagens para preparar três soluções padrão

de 2000 μg/mL. A partir destas soluções foram preparadas soluções de diferentes

concentrações de AK (5, 10, 15, 20 e 25 μg/mL) e adição de 1,5 mL de solução

ácida (HCl 0,1 M) de cloreto de alumínio 0,2% (p/V), sendo o volume completado

para 10 mL com metanol. As leituras de absorbância foram realizadas λ= 305 nm,

em triplicata, com um total de nove mensurações, calculado o DPR%, determinada a

equação de reta e o coeficiente de correlação. Procedeu-se o ensaio de linearidade

utilizando a mesma metodologia com a recuperação de AK na presença ou ausência

de hidroquinona em creme Lanette, na faixa de 5-30 μg/mL.

Para a avaliação da linearidade procedeu-se o teste de Kolmogorov-Smirnov

para verificar a normalidade, a comparação de variâncias através do cálculo da

razão entre as médias quadráticas da regressão e médias quadráticas dos resíduos

com comparação com o valor da distribuição F tabelado para um grau de confiança

de 95% com 1 e 8 graus de liberdade.

4.4.2 Sensibilidade

A sensibilidade foi avaliada através dos limites de detecção e quantificação. O

limite de detecção foi calculado pelo desvio padrão do intercepto com o eixo Y (a

partir de três curvas analíticas) multiplicado por três e dividido pela inclinação da

curva analítica. O limite de quantificação foi calculado pelo desvio padrão do

intercepto com o eixo Y (a partir de três curvas analíticas) multiplicado por dez e

dividido pela inclinação da curva analítica.

4.4.3 Precisão

A precisão foi obtida através da avaliação da proximidade dos resultados

obtidos a partir de uma série de mensurações de uma mesma amostra. Ela é

avaliada estatisticamente pelo cálculo do desvio padrão relativo ou coeficiente de

variação e erro relativo. Ela foi mensurada através da análise dos parâmetros

repetitividade (intra-dia) e precisão intermediária (inter-dias).

4.4.3.1 Repetitividade

A repetitividade foi avaliada em três níveis de concentração (n= 18). Foram

preparadas três soluções-mãe de concentrações iguais a 2000 μg/mL e partir destas

foram feitas diluições para se obter soluções de ácido kójico de diferentes

concentrações (10, 15 e 20 μg/mL). Em cada sistema foi adicionado 1,5 mL de

solução ácida (HCl 0,1 M) de cloreto de alumínio 0,2% (p/V), e o volume completado

para 10 mL com metanol. As leituras das absorbâncias foram feitas a 305 nm e

calculado o DPR. Para cada concentração também foi calculado o erro relativo e o

valor de ―p‖ pelo teste t para amostras independentes. As soluções foram

preparadas no mesmo dia, pelo mesmo analista e com o mesmo equipamento.

4.4.3.2 Precisão intermediária

Para a análise da precisão intermediária foram preparadas soluções-mãe de

2000 μg/mL de ácido kójico e diluídas nas concentrações 10, 15, e 20 μg/mL, com

três leituras para cada ponto. A cada sistema foi adicionado 1,5 mL de solução ácida

(HCl 0,1 M) de cloreto de alumínio 0,2% (p/V) e o volume completado para 10 mL

com metanol. As leituras das absorbâncias foram feitas no comprimento de onda

305 nm. As análises foram feitas em dias consecutivos por analistas diferentes e

usando equipamentos diferentes. Para cada concentração também foi calculado o

DPR, erro relativo e o valor de ―p‖ pelo teste t para amostras independentes.

4.4.4 Exatidão

A exatidão foi determinada através do ensaio de recuperação. À 375 mg de

base (creme lanette ou não iônico) foram incorporadas quantidades conhecidas de

ácido kójico e, em seguida, diluiu-se adequadamente com metanol e filtrado.

Alíquotas adequadas do filtrado foram transferidas para balões volumétricos de 10

ml, aos quais foi adicionado 1,5 mL de solução ácida de cloreto de alumínio 0,2%

(p/V) e completado com metanol para o volume de 10 mL, de tal forma a obter

soluções contendo concentrações de 10, 15 e 20 μg/mL em ácido kójico . Procedeu-

se da mesma forma com as amostras em que foram incorporados em associação de

ácido kójico (2%) e hidroquinona (4%), obtendo-se soluções contendo 10, 15 e 20

μg/mL em ácido kójico e 20, 30 e 40 μg/mL em hidroquinona.

A concentração dos analitos foi determinada através da leitura por

espectrofotometria no UV nos comprimentos de onda de 305, 315 e 320 nm e as

porcentagens de recuperação foram calculadas pelo método, considerando os

diferentes comprimentos de onda. Para cada concentração também foi calculado o

DPR, erro relativo e o valor de ―p‖ pelo teste t para amostras independentes.

4.4.5 Robustez

O ensaio de robustez tem por objetivo avaliar a capacidade do método de não

ser afetado por pequenas e deliberadas variações, fornecendo um indicativo de

confiança para o uso do método. Na avaliação da robustez foram testados os

seguintes parâmetros: influência da concentração do íon metálico, do tempo de

leitura e da temperatura na intensidade de absorbância.

4.4.5.1 Influência do tempo de leitura na intensidade de absorção

Foram preparadas soluções-mãe de ácido kójico 1000 μg/mL, em triplicata, e

diluídas em balão volumétrico até 15 μg/mL. Cada balão continha 1,5 mL de solução

ácida (HCl 0,1 M) de cloreto de alumínio 0,2% (p/V) e 150 μL da solução-mãe (1000

μg/mL) e completadas com metanol para 10 mL.

As leituras das absorbâncias foram feitas em 305 nm em temperatura

controlada de 20ºC, nos tempos zero, 24 e 72 horas. Para cada grupo de resultados

foram calculados o DPR, o erro relativo e valor de ―p‖ pelo teste t para amostras

pareadas.

4.4.5.2 Influência da temperatura na intensidade de absorção

Foram preparadas soluções-mãe de ácido kójico 1000 μg/mL, em triplicata, e

diluídas em balão volumétrico até 15 μg/mL. Cada balão continha 1,5 mL de solução

ácida (HCl 0,1 M) de cloreto de alumínio 0,2% (p/V) e 150 μL da solução-mãe (1000

μg/mL)e completadas com metanol para 10 mL.

As leituras das absorbâncias foram feitas em 305 nm nas temperaturas 5ºC,

20ºC e 30ºC, após permanecerem por quatro horas nessas condições. Para cada

grupo de resultados foram calculados o DPR, o erro relativo e valor de ―p‖ pelo teste

t para amostras pareadas.

4.4.5.3 Influência do pH na intensidade de absorção

Foi preparada solução-mãe de ácido kójico 1500 μg/mL e diluída para 150

μg/mL. Em balão de 10,0 mL foram preparadas nove soluções, sendo que em cada

balão continha 1,0 mL da solução diluída, 1,5 mL de solução ácida (HCl 0,1 M) de

cloreto de alumínio 0,2% (p/V) e pH ajustados com KOH para pH 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8,

11 e 14 e completadas com metanol para 10 mL. As leituras das absorbâncias foram

feitas em 305 nm em temperatura controlada de 20ºC. Para cada grupo de

resultados foram calculados o DPR, o erro relativo e valor de ―p‖ pelo teste t para

amostras pareadas.

4.4.5.4 Influência da concentração do metal na intensidade de absorção

Foram preparadas soluções de ácido kójico (15 μg/mL), variando a

concentração de cloreto de alumínio a fim de que houvesse diferentes relações

molares entre os reagentes. As proporções avaliadas de AK : Al

foram de 1 : 0 até

1 : 136.

4.5 ESTUDO DO COMPLEXO

4.5.1 Espectroscopia no Infravermelho (IV)

Os espectros de absorção no IV foram obtidos no espectrofotômetro FTIR –

MB 100 BOMEM e detector DTGS no Departamento de Química da UFPR. Foram

obtidos espectros do padrão, e de liofilizados de soluções aquosas de ácido kójico

em pH 9 e 14 e de soluções aquosas de ácido kójico com cloreto de alumínio em pH

1, 11 e 14.

Soluções de ácido kójico (15 μg/mL) com valores de pH 9 e 14, e soluções

de ácido kójico com alumínio com valores de pH de 1, 11 e 14 foram liofilizadas. O

ajuste de pH para a faixa básica foi feito com KOH. Para pH 1, não houve ajuste. O

padrão do analito foi verificado em amostra sólida, sem a utilização da liofilização.

Todas as amostras foram preparadas em pastilha de KBr.

Os espectros foram adquiridos com resolução igual a quatro, o número de

scans igual a 64, no modo transmitância e tendo como branco o ar. Os espectros

foram processados considerando a faixa espectral do infravermelho médio (4000 a

400 cm

-1

4.5.2 Ressonância magnética nuclear (RMN)

Os espectros de ressonância magnética nuclear foram obtidos em

espectrofotômetro BRUKER Avance DRX 400 operando na freqüência base de

400,13 MHz e 100,63 MHz para os núcleos de

H e

C, respectivamente,

experimento este realizado no Departamento de Bioquímica da UFPR. Foram

obtidos espectros do padrão em solução aquosa (15 mg/mL) em pH 4, 7, 9, 11 e 14,

de soluções de ácido kójico complexado com alumínio na proporção AK 1:1 Al

pH 2 e 4.

Os espectros de RMN –

C DEPT foram obtidos em um θz de 135º, no qual

CH e CH

ocorrem em fase positiva em relação à linha de base e CH

em fase

negativa. As amostras foram solubilizadas em solventes deuterados (D

O e CD

OD)

e colocadas em tubos de 5 mm de diâmetro para análise a 25ºC. Algumas amostras

tiveram seus assinalamentos determinados com auxílio dos experimentos

bidimensionais COSY e HMBC, sendo estes realizados de acordo com parâmetros

indicados no Manual Bruker.

Os deslocamentos químicos expressos em ppm foram determinados

utilizando-se:

- padrões internos: Me

Si (0.00 ppm para

H e

C) ou acetona (2,23 ppm e

30, 20 ppm,

H e

C respectivamente)

- sinal central dos solventes deuterados: CD

OD (3,31 ppm e 49,15 ppm,

H e

C respectivamente).

4.5.3 Titulação potenciométrica

As titulações potenciométricas foram conduzidas com o método desenvolvido

no laboratório de equilíbrio químico (LEQ-UFPR) de acordo com MARTELL e

MOTEKAITIS (1988) (MERCE et al., 1998)

Todos os ensaios foram realizados em triplicata em atmosfera inerte de N

(White-Martins, Brasil), gás previamente purificado em dois frascos de limpeza

contendo soluções de KOH 1 e 0,1 M (Merck, Brasil), em recipiente fechado e

mantido a 25,0±0,1ºC (Banho termostatizado MQBTC 99-20, Microquímica, Brasil)

contendo quantidades exatas de ácido kójico (0,1 mmol, ≥98.0%, Sigma Aldrich),

372,7 mg de KCl p.a. para ajuste da força iônica ( 0,100 mol/L) e dissolvidos em

50,00 mL de água purificada ou com adição de 10,00, 5,00 ou 3,00 mL de solução

de cloreto de alumínio 0.01 mol/L em ácido nítrico 0.13 mol/L (padrão Merck). A

pureza do AK foi determinada nos próprios ensaios de titulação potenciométrica e a

solução de AlCl

foi padronizado por EAA – espectroscopia de absorção atômica,

aparelho modelo AA-220 FS Varian com sips (diluição automática); Lâmpada de Al -

cátodo oco com corrente de 10mA; comprimento de onda da leitura: 237,3 nm com

abertura de fenda (slit width) de 0,5 nm. Como condições experimentais teve-se

leitura em triplicata com desvio padrão máximo de 1%, chama óxido nitroso (9,11

mL/min.) com acetileno (7,04 mL/min.) em modo de absorbância. A concentração

de acido inorgânico forte [(H+)] foi determinada por titulação do tipo Gran‘s Plot de

acordo com MARTELL e MOTEKAITIS (1988). A bureta utilizada foi a de pistão,

automática, precisão 0.01 mL - (Metrohm 809 Titrando – software TIAMO versão

1.2.1, Suíça), para a adição da solução titulante (KOH padrão, Merck, Brasil, 0.1 M).

Os valores de pH foram mensurados diretamente com eletrodos de vidro e Ag/AgCl

de referência, calibrados diariamente com 3 soluções tampão (4,01 , 7,00 e 9,00). A

faixa d pH medido foi de 1,8 a 11,5.

A formação do complexo foi descrito de acordo com a teoria ácido-base

(PEARSON, 1963) no qual o ácido (alumínio) é um aceptor de par de elétrons

doados pela base que é o AK quando a hidroxila de C-5 está desprotonada.

O software Hyperquad foi utilizado para calcular as constantes de protonação

e as constantes de formação global para as espécies complexadas encontradas em

porcentagem superior a 10% de todas as espécies metálicas presentes no equilíbrio.

O modelo matemático leva em consideração dados de pH das titulações

potenciométricas, as constantes de hidrólise para Al

(BAES e MESMER, 1976) e a

quantidade, em milimols, de ácido kójico, de Al

e de H

em todos os sistemas.

Os cálculos foram realizados até a melhor curva simulada coincidir com a

experimental. O programa HYSS (ALDERIGH, 1999) calculou o diagrama de

distribuição das espécies usando como entrada, os dados calculados previamente

pelo HYPERQUAD com o menor desvio padrão possível obtido.

4. 6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para a análise estatística foram utilizados os parâmetros desvio padrão

relativo, erro relativo, test t de Student, teste exato de Fisher, teste de Levene,

Tuckey, LSD, ANOVA one way e coeficiente de Pearson..

O teste t de Student permite verificar se dois conjuntos de dados são

estatisticamente equivalentes, utilizando, para tanto, as médias e os desvios padrão

dos resultados obtidos para cada método. O nível de significância foi definido como

α= 0,05 e determinado o valor de ―p‖. Foram então formuladas a hipótese nula (H

) e

alternativa (H

- hipótese nula (H

): Estabelece a ausência de diferença entre os parâmetros,

ou seja, não há diferença entre os grupos. As médias dos valores da amostra padrão

são iguais aos valores experimentais das variações propostas pearaensaio de

robustez.

- hipótese alternativa (H

): as médias dos valores da amostra padrão são

diferentes dos valores experimentais das variações propostas pelo ensaio de

robustez

Se pelo teste de hipóteses se verificar que a diferença observada é grande

demais para ser explicada somente por uma variável aleatória – acaso – afirma-se

que a diferença é estatisticamente significativa. O ―p‖ é a probabilidade exata de se

cometer o erro tipo I – rejeita Ho quando Ho é verdadeira; expressa a probabilidade

de que a diferença tão grande quanto a observada na amostra ocorre somente por

acaso; em duas populações ―p‖ é a probabilidade de errar ao se afirmar que a

diferença existe.

p < 0,05: rejeita a hipótese nula (valores são estatisticamente diferentes)

p > 0,05: não rejeita a hipótese nula (valores são estatisticamente iguais)

Caso o valor de ―p‖ seja maior que 0,05 a hipótese nula não é rejeitada e isso

não implica em dizer que ela é aceita, uma vez que o número limitado de

observações pode não ser uma evidência suficiente para que ela seja rejeitada.

O teste exato de Fisher é um teste de significância estatística utilizados na

análise de tabelas de contingência no qual os tamanhos de amostra são pequenas.

Se há associações não randômicas entre duas variáveis.

O teste de Levene é um teste não paramétrico usado para testar a

homogeneidade das variâncias

O teste de Tuckey é usado para comparação múltipla, quando se deseja

comparar todos os pares de médias adotando um único nível de confiança.

O teste LSD (Least Square difference) é um indicador de diferenças

significativas. Qualquer diferença entre médias superior a LSD indica que a

diferença é significativa.

ANOVA (Análise de Variância com um fator) testa se os grupos são bem

modelados por distribuições normais de igual variância, comparamos as médias

entre os grupos.

O coeficiente de correlação de Pearson é uma medida do grau de relação

linear entre duas variáveis quantitativas. Este coeficiente varia entre os valores -1 e

1. O valor 0 (zero) significa que não há relação linear, o valor 1 indica uma relação

linear perfeita e o valor -1 também indica uma relação linear perfeita mas inversa, ou

seja quando uma das variáveis aumenta a outra diminui. Quanto mais próximo

estiver de 1 ou -1, mais forte é a associação linear entre as duas variáveis.

Resultados e discussão

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS

O AK é um ácido orgânico fraco, pois possui pKa próximo a 7,9. Na molécula

são identificadas as funções álcool, cetona enol e éter. O ácido kójico possui duas

hidroxilas – uma alcoólica e outra enólica - e uma carbonila que são estruturas

capazes de formar ligações do tipo pontes de hidrogênio, conferindo assim a ele a

possibilidade de ser solúvel em solventes como água e metanol.

A hidroxila enólica e a carbonila, grupos eletronegativos, encontram-se em

carbonos vicinais, conferindo a esta região a possibilidade de ser a região quelante

dos íons metálicos. Na figura 19 são destacadas algumas das várias possibilidades

diferentes de complexação através dessa região.

Íon metálico

FIGURA 19 - POSSÍVEIS ESTRUTURA SQUELANTES DO AK COM ÍON METÁLICO

FONTE: O AUTOR (2009)

Verifica-se que há insaturações alternadas e pares de elétrons não ligantes,

caracterizando assim um cromóforo que absorve na região do ultravioleta (200-400

nm) do espectro eletromagnético, justificando assim o desenvolvimento de um

método por espectrometria nessa região. Métodos que se utilizam desta propriedade

são chamados espectrofotométricos e preconizam a necessidade de características

fundamentais intrínsecas ou adquiridas pela molécula, como a presença de um ou

mais cromóforos. Partindo-se deste princípio foi possível o desenvolvimento e

validação de um método para quantificação desse analito.

5.2 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO

O desenvolvimento do método é uma etapa de grande importância na qual se

define o conjunto de parâmetros que devem ser otimizados para o funcionamento do

método. A seqüência básica do desenvolvimento de métodos analíticos de

quantificação utilizando a espectrofotometria no ultravioleta passa pela análise de

diversos parâmetros, tais como: escolha do solvente, seleção do melhor

comprimento de onda, definição da concentração de trabalho mais adequada para o

analito, avaliação de possíveis interferentes (seletividade), influência do pH, preparo

da amostra, entre outros.

5.2.1 Escolha do solvente e influência do pH

A primeira etapa de desenvolvimento foi verificar o melhor solvente e a

influência exercida pelo potencial hidrogeniônico sobre o sistema. O solvente de

escolha deve ser capaz de solubilizar o soluto: não deve absorver na mesma região

que o analito e, se possível, deve ser de baixo custo e não poluente. A alta

solubilidade do AK em metanol e água e o fato destes não apresentarem absorção

na região do UV, fez destes possíveis solventes de escolha. Quando se comparam

os espectros de varredura obtidos para solução aquosa e solução metanólica de AK

(15 μg/ml) observa-se que são muito semelhantes (figura 20), evidenciando duas

bandas de absorção de forte intensidade, com máximos em λ= 215 nm e 269 nm.

Observa-se que o AK apresenta uma absortividade molar em 269 nm a 20ºC maior

em solução aquosa (ε= 8235) que em solução metanólica (ε= 6899) sendo mais

intensa no espectro aquoso Isto significa que no meio aquoso a sensibilidade é

maior.

FIGURA 20 - ESPECTROS DE UV DAS SOLUÇÕES AQUOSA E METANÓLICA DE AK (15 μg/ml).

FONTE: O AUTOR (2008)

Foi também avaliada a influência do pH no perfil espectral em soluções de

mesma concentração de AK (15 μg/ml), tanto em meio aquoso ácido e alcalino

(figura 21), quanto em meio metanólico ácido e alcalino (figura 22).

FIGURA 21 - ESPECTRO DE UV DA SOLUÇÃO AQUOSA DE AK (15 μg/ml), ACIDIFICADA (pH 2,8)

E ALCALINIZADA (pH 10,6) DE AK (15 μg/ml)

FONTE: O AUTOR (2008)

FIGURA 22 - ESPECTRO DE UV DA SOLUÇÃO METANÓLICA DE AK (15 μg/ml), ACIDIFICADA

(pH 1,2) E ALCALINIZADA (pH 9,5) DE AK (15 μg/ml)

FONTE: O AUTOR (2008)

Pode-se verificar que as soluções aquosas e metanólicas de AK, com ou sem

adição de ácido clorídrico, geram espectros que se sobrepõem com absorção

máxima em 269 nm. Quando o meio se torna básico, pela adição de hidróxido de

sódio, a ionização muda o arranjo eletrônico e, conseqüentemente, o cromóforo.

Como resultado, há um deslocamento do tipo batocrômico, ou seja, para

comprimentos de onda maiores (de λ= 269 nm para λ= 315 nm) e hipocrômico

(diminuição da intensidade da absorção).

Pelos espectros obtidos nos diferentes meios e pHs, os dois solventes

demonstram ser adequados para o desenvolvimento do método por UV.

5.2.2 Seleção do comprimento de onda

A seleção do comprimento de onda foi feita através do espectro de varredura

e a análise dos picos de absorção máxima do analito. As absorções máximas

ocorreram em 215 nm e 269 nm como pode ser observado na figura 23. O λ

máx

trabalho deve ser preferencialmente maior que 220 nm e não apresentar problemas

de linearidade.

A ampla maioria dos compostos que absorvem na região do ultravioleta o

fazem próximo a 200 nm. Cromóforos mais específicos podem ser obtidos por

alterações no pH, reações de derivatização, complexação, entre outros. Neste caso

observou-se que o analito poderia complexar com cátions metálicos o que,

teoricamente, poderia levar a um deslocamento batocrômico e, assim, dar mais

seletividade ao método. Uma vez verificada e confirmada essa possibilidade foram

feitas soluções com AK e cloreto de alumínio e avaliada a linearidade. A partir de 17

amostras com concentrações variando de 0,1 a 50 μg/mL foram obtidas as curvas

analíticas para os vários comprimentos de onda do espectro de 200– 400 nm (figura

23) e calculados os coeficientes de correlação para as retas obtidas nos diferentes

comprimentos de onda na região de 200– 400 nm. Os valores de ―r‖ foram

representados graficamente versus comprimento de onda, para avaliar a região de

melhor proporcionalidade (figura 23). No intervalo entre 273 nm e 329 nm os valores

de ―r‖ obtidos estão acima de 0,999 (figura 24). Logo, é possível utilizar a região no

intervalo de 305 nm e 320 nm.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

200 250 300 350 400

Comprimento de onda (nm)

Absorbância

FIGURA 23 - ESPECTROS DE UV DE SOLUÇÕES METANÓLICAS CONTENDO AK 0,1-50 μg/ml E

SOLUÇÃO ÁCIDA DE CLORETO DE ALUMÍNIO 0,2%

FONTE: O AUTOR (2008)

FIGURA 24 – REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DOS COEFICIENTES DE CORRELAÇÃO VERSUS

COMPRIMENTOS DE ONDA DO CONJUNTO DE SOLUÇOES METANÓLICAS DE AK 0,1-50 μg/ml

EM SOLUÇÃO ÁCIDA DE CLORETO DE ALUMÍNIO 0,2%

FONTE: O AUTOR (2008)

5.2.3 Avaliação da seletividade

Em técnicas que envolvem a espectroscopia no UV o parâmetro mais

comumente otimizado é o comprimento de onda. Isto se dá pelo fato de que uma

infinidade de moléculas absorvemem comprimentos de onda próximos aos 200 nm

e, por isso, deve-se tentar ao máximo criar mecanismos para que o analito de

interesse absorva em comprimentos de onda maiores, fora dessa região. Para

melhorar a seletividade, em geral, deve-se deslocar a absorção para comprimentos

de onda onde um número menor de moléculas absorve, ou seja, mais para o visível.

Um dos recursos para um deslocamento batocrômico é a formação de complexos

que absorvem de modo diferente do analito individualmente. Em 1976 Kotani et al.

estudaram a atividade do AK como bacteriostático e, concomitantemente, o

potencial quelante do mesmo com íons cobre e cádmio. Tendo em vista esta

propriedade quelante do analito, utilizou-se cloreto de alumínio para obter um

complexo que promovesse um deslocamento do tipo batocrômico e, assim,

aumentar a seletividade do método.

Com dois grupos muito eletronegativos em carbonos vicinais e uma das

hidroxilas ao lado de um oxigênio de carbonila, confere-se a esta região da molécula

de AK a possibilidade de quelar íons metálicos, como está circundado na figura 25-

Na porção inferior da molécula tem-se um carbono ligado à hidroxila alcoólica,

que é do tipo sp

e, por isso, tem rotação livre, fazendo com que a hidroxila possa

estar espacialmente muito próxima do oxigênio da ligação éter (figura 25-B). Essa

região, também muito eletronegativa, se assemelha muito com a porção superior da

molécula, fazendo com que também seja teoricamente possível a complexação

através dessa porção.

Em estudos preliminares de ressonância magnética nuclear verificou-se que a

região em que há modificação no deslocamento químico dos carbonos e em que

deve ocorrer preferencialmente a ligação é a que se visualiza na região circundada

na figura 25-A.

(A) (B)

FIGURA 25 – REGIÃO DE MAIOR (A) E MENOR (B) PROBABILIDADE DE ESTAR ENVOLVIDA NA

LIGAÇÃO DO AK COM ÍONS METÁLICOS

FONTE: O AUTOR (2009)

As coordenações do AK com o alumínio podem ser mais estáveis em meio

metanólico que em meio aquoso, no qual as moléculas de água poderiam estar

competindo com o AK na formação do aquo-complexo.

Quando se comparam os espectros das soluções de AK (15 μg/mL) em

solução ácida de AlCl

0,2%, tanto em meio aquoso (pH 1,0) quanto em meio

metanólico (pH 1,7), figura 26, observa-se que o complexo em meio metanólico

apresenta um máximo de absorção em comprimento de onda maior (λ= 305 nm) que

em meio aquoso (λ= 298 nm).

FIGURA 26 - ESPECTRO DE UV DA SOLUÇÃO AQUOSA E METANÓLICA DE AK (15 μg/ml) COM

SOLUÇÃO ÁCIDA DE AlCl

0,2%

FONTE: O AUTOR (2008)

Essas bandas de absorção intensa em 298 nm (água) e 305 nm (metanol)

não existem no espectro de solução aquosa ou metanólica do AK sem cloreto de

alumínio sendo, portanto, um indicativo da formação do complexo AK-Al. No meio

aquoso a banda de absorção que antes estava em 269 nm se desloca para 298 nm

e no metanólico o deslocamento é ainda maior, de 269 nm para 305 nm, ocorrendo

assim, para ambos, um deslocamento do tipo batocrômico (para comprimentos de

onda maiores), ou seja, o meio metanólico parece ser um pouco mais seletivo que

em meio aquoso.

Muitos complexos inorgânicos e orgânicos exibem deslocamento por

transferência de carga. Este consiste de um grupo doador de elétrons ligado a um

que os aceitam. Quando este produto absorve radiação, um elétron do doador é

transferido a um orbital que está associado ao aceitador. O estado excitado é,

portanto, um produto de um tipo de processo interno oxidação/redução. Este

comportamento difere de outros cromóforos orgânicos no qual o elétron excitado

está em um orbital molecular que é dividido por dois ou mais átomos (SKOOG et al.,

2000).

Para a quantificação do AK em creme cosmético foi importante avaliar se

algum componente da formulação base absorveria no UV de forma a interferir na

quantificação do analito. Para esta avaliação, foram adquiridas duas formulações de

AK em creme não iônico e o creme lanette. Na composição das mesmas foram

identificados os conservantes metilparabeno (nipagin

) e propilparabeno (nipazol

) –

figura 27.

(A ) (B)

FIGURA 27 – ESTRUTURAS QUÍMICAS DO METILPARABENO (A), PROPILPARABENO (B)

FONTE: THE INDEX MERCK (1983)

Tanto o Nipagin

, quanto o Nipazol

absorvem na região do UV. Quando em

solução aquosa acidificada os espectros são praticamente iguais, com máximo de

absorção em 256 nm e 257 nm, respectivamente. Em meio metanólico o nipagin

não se solubilizou, sendo possível separá-lo da amostra por meio físico. O Nipazol

em metanol, tem um máximo de absorbância em 257 nm

Outro interferente é a hidroquinona, um ativo comumente prescrito em

associação com o AK em tratamentos de clareamento de pele. Os espectros das

soluções de hidroquinona (20 μg/ml) em água e em metanol acidificados são

praticamente iguais entre si, diferindo nos comprimentos de onda máximos, no meio

aquoso λ= 290 nm e no meio metanólico λ= 294 nm.

Considerando que os conservantes (nipagin e nipazol) não se complexam

com o cátion alumínio e, por isso não tem a banda de absorção deslocada, pode-se

dizer que o sistema formado pelo AK em meio metanólico com cloreto de alumínio é

mais seletivo. Deve-se considerar também que em pH alcalino, apesar do AK

apresentar um máximo de absorção em 315 nm, há a possibilidade de degradação

do mesmo neste pH e o nipazol também tem um deslocamento batocrômico que

interfere na quantificação nesse meio alcalino.

Com o objetivo de se verificar a seletividade foram também obtidos os

espectros de cremes comerciais, creme lanette contendo 2% de AK em associação

ou não com HQ 4%, o próprio creme base e solução do padrão de AK, todos na

mesma concentração (15 μg/ml) do analito (figura 28). Observa-se que a absorção

do creme base mais intensa ocorreu na região entre 250-260 nm o que era esperado

devido ao nipazol, Observa-se também que o creme base não apresenta

interferência alguma em 305 nm região de absorção máxima da solução do padrão

de AK com cloreto de alumínio. Quando comparamos o espectro obtido da solução

do creme lanette contendo 2% AK com o do padrão observamos que eles diferem

em intensidade em torno de 260 nm provavelmente pela presença do conservante

na amostra, mas próximo a 300 nm os espectros do padrão e da amostra são

perfeitamente sobreponíveis. Na amostra que continha AK e HQ nota-se um

aumento significativo tanto na região de 260 nm como 300 nm pelo fato de que se

somam as absorções dos conservantes, do próprio AK e da hidroquinona. Em creme

não iônico, sob as mesmas condições, os resultados foram exatamente iguais.

FIGURA 28 – ESPECTROS DE UV DE SOLUÇÕES METANÓLICAS DE AK (15 μg/mL) CREME

LANETE CONTENDO AK 2% EM ASSOCIAÇÃO OU NÃO COM HQ 4% E SOMENTE O CREME

LANETTE. TODOS COM ADIÇÃO DE SOLUÇÃO ÁCIDA DE AlCl

0,2%

FONTE: O AUTOR (2008)

Isso significa que para produto que contém apenas AK e conservantes o

comprimento de onda em 305 nm é adequado para quantificação do analito.

Entretanto, se for um produto de AK com hidroquinona é necessário escolher outro

comprimento de onda. Nota-se que um comprimento de onda que poderia ser

adequado seria de λ = 320 nm, já que não há mais absorção da hidroquinona (figura

29), nessas condições.

FIGURA 29 – ESPECTROS DE UV DA SOLUÇÃO METANÓLICA DO AK (15 μg/mL) COM

CLORETO DE ALUMÍNIO EM COMPARAÇÃO COM ESPECTROS DE ABSORÇÃO DA

HIDROQUINONA E NIPAZOL EM METANOL

FONTE: O AUTOR (2008)

Uma das formas de se demonstrar que esse comprimento de onda (320 nm) é

adequado para quantificação é construir curvas analíticas e calcular o coeficiente de

correlação de cada ponto na região de análise. Foram preparadas 17 amostras de

solução metanólica com cloreto de alumínio com concentrações de AK variando na

faixa de 0,1 a 50 μg/ml. Como a região de comprimento de onda λ= 320 nm tem um

coeficiente de correlação superior a 0,999 pode ser considerado como adequado

para quantificação de AK quando em associação com hidroquinona.

Fez-se também a avaliação da seletividade através da estatística, utilizando o

teste t para comparação de médias pareadas com o analito com e sem a matriz.

Os valores de ―p‖ para os conjuntos de dados referentes à comparação de

dados de AK na concentração de 15 μg/mL em 305, 315 e 320 nm com e sem as

matrizes Lanette e Creme Não Iônico, são maiores que 0,05. Isto significa que não

se deve rejeitar a hipótese nula e os valores são estatisticamente iguais. Quando se

tem a adição de hidroquinona às matrizes os valores de ―p‖ para 269 e 305 nm são

menores que 0,05, e apenas para 320 nm eles são maiores, indicando que nesse

comprimento de onda os valores são estatisticamente iguais.

5.2.4 A proporção molar AK e Alumínio

Um aspecto importante é garantir que a limitação de resposta não seja por

falta de reagente, ou seja, que todo o analíto seja complexado e quantificado, e que

o alumínio esteja em excesso em relação a um valor teórico. Do outro lado não se

pode colocar um excesso de forma aleatória, pois a quantidade de alumínio na

solução final pode influenciar na leitura seja pela densidade ou índice de refração

elevado. Foram feitas análises variando a relação molar com a concentração de AK

fixa e aumentando a concentração de cloreto de alumínio desde AK : Al

proporção 1:0 até 1:136

Os valores obtidos de absorbância pelas relações molares AK : Al

comprimento de onda de 305 nm estão na figura 30.

À medida que essa relação aumenta no sentido de ter mais alumínio os

valores aumentam até estabilizar em uma proporção próxima de 1:1. A partir desse

ponto até a relação 1 : 136 não há mais diferença estatística entre os valores de

absorbância obtidos.

FIGURA 30 – GRÁFICO DA ABSORBÂNCIA DAS SOLUÇÕES NA VARIAÇÃO MOLAR DE AK

(15μg/mL) COMPLEXADO COM AlCl

(0,2%) EM 305 nm

FONTE: O AUTOR (2008)

A relação completa de todas as variações molares pode ser visualizada

através da figura 31, desde AK : Al

na proporção 1: 0, em que a absorção é maior

em 269 nm, até 1 : 136 em que a absorção máxima se dá em 305 nm.

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

200 250 300 350 400

Comprimento de onda (nm)

Absorbância

FIGURA 31 - ESPECTRO DE ABSORÇÃO UV DE SOLUÇÕES METANÓLICAS COM AK E AlCl

DIFERENTES RELAÇÕES MOLARES

FONTE: O AUTOR (2008)

Depois de finalizada a etapa de desenvolvimento o método ficou definido com

os seguintes parâmetros: solvente metanol; AK : Al

na proporção molar 1 : 20, λ=

305 nm para matéria-prima e produto, quando não associado, e λ= 320 nm para

produto, quando associado à hidroquinona; sistema de filtração: papel quantitativo.

5.3 VALIDAÇÃO

O método desenvolvido foi validado de acordo com as normas nacionais e

internacionais para determinação de princípio ativo em produtos farmacêuticos ou

matéria-prima. Os parâmetros analisados foram linearidade e intervalo; seletividade;

precisão; exatidão e robustez.

5.3.1 Linearidade e intervalo

A linearidade do método foi avalia através da proporcionalidade entre duas

grandezas, concentração e absorbância. O método com cloreto de alumínio em

metanol para matéria-prima é linear para quantificação de AK em 305 nm no

intervalo entre 5 a 50 μg/mL, com um coeficiente de correlação de 0,9998 (figura 32)

e na faixa de 10-20 μg/mL (figura 33), como no creme Lanette sem hidroquinona

(figura 34) ou com hidroquinona em 320 nm (figura 35). Valores satisfatórios por

atender o exigido pelo INMETRO, que é de 0,9, e pela ANVISA que é de 0,99.

y = 0,0369x - 0,0037

= 0,9997

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0

Concentração (μg/ml)

Absorbância

FIGURA 32 – RESULTADO DA AVALIAÇÃO DA LINEARIDADE DO MÉTODO

ESPECTROFOTOMÉTRICO DE AK COM AlCl

DE 5-50 μg/mL EM 305 nm NO MEIO METANÓLICO

FONTE: O AUTOR (2008)

A faixa de trabalho foi de 10 a 20 μg/ml (figura 33) e a concentração de

trabalho definida como 15 μg/ml. A variação desta concentração foi de

aproximadamente 65 a 135%. Valores estes que contemplam a faixa mínima de 80 a

120%, recomendada pela ANVISA.

y = 0,0374x - 0,0137

= 0,9999

0,0

0,5

1,0

0,0 10,0 20,0 30,0

Concentração (μg/ml)

Absorbância

FIGURA 33 – RESULTADO DA AVALIAÇÃO DA LINEARIDADE DO MÉTODO

ESPECTROFOTOMÉTRICO DE AK COM AlCl

DE 10-20 μg/mL EM 305 nm NO MEIO

METANÓLICO

FONTE: O AUTOR (2008)

y = 0,0378x + 0,0078

= 0,9998

0,0

0,4

0,8

1,2

0 5 10 15 20 25 30

Concentração (μg/ml)

Absorbância

FIGURA 34 – RESULTADO DA AVALIAÇÃO DA LINEARIDADE DO MÉTODO

ESPECTROFOTOMÉTRICO DE PELA RECUPERAÇÃO DE AK EM CREME LANETTE COM AlCl

DE 5-30 μg/mL EM 305 nm NO MEIO METANÓLICO

FONTE: O AUTOR (2008)

y = 0,0379x - 0,0109

= 0,9997

0,0

0,4

0,8

1,2

0 5 10 15 20 25 30

Concentração (μg/ml)

Absorbância

FIGURA 35 – RESULTADO DA AVALIAÇÃO DA LINEARIDADE DO MÉTODO

ESPECTROFOTOMÉTRICO DE PELA RECUPERAÇÃO DE AK EM PRESENÇA DE

HIDROQUINONA EM CREME LANETTE COM AlCl

DE 5-30 μg/mL EM 320 nm NO MEIO

METANÓLICO

FONTE: O AUTOR (2008)

Para se testar se a característica estudada da amostra é oriunda de uma

população com distribuição normal. Foi aplicado o teste não paramétrico de

Kolmogorov-Smirnov ao conjunto de dados da linearidade na faixa de concentração

de 5-50 μg/mL de AK na matéria-prima em 305 nm e também para produto acabado

de AK sem hidroquinona em 305 nm de 5-30 μg/mL e com hidroquinona em 320 nm

de 5-30 μg/mL. O teste é baseado na maior diferença absoluta entre a freqüência

acumulada observada e a estimada pela distribuição normal.

Como o número de amostras é menor que 100 os valores calculados devem

ser comparados com os valores tabelados. Para a matéria-prima o valor calculado é

igual a 0,321, menor que o valor tabelado igual a 0,410 (para n=10 e significância de

0,05). Para o produto acabado os valores calculados foram iguais a 0,311 (AK 2 %)

e 0,309 (AK 2 % + HQ 4 %), que são menores que o valor tabelado igual a 0,565

(para n= 5 e significância de 0,05). Como os valores calculados são menores que

cada respectivo valor crítico tabelado a hipótese nula não é rejeitada e conclui-se

que os valores nessa população seguem a distribuição normal. O valor de ―p‖

também foi calculado e foi igual a 1,000. Isto significa que não há evidência

suficiente para rejeitar a hipótese nula, que corrobora com o resultado encontrado no

teste de Kolmogorov-Smirnov. Os valores mínimos do resíduo padrão foi de -1,187 e

o máximo de 1,343 para AK matéria-prima e mínimo de -1,079 (AK 2 %), – 0,937

(AK 2 % + HQ 4 %) e o máximo de 1,102 (AK 2 %), 0,875 (AK 2 % + HQ 4 %) para

produto acabado, o que indica que os valores estão próximos do ponto zero e dentro

da curva normal A razão das médias quadráticas da regressão pelas médias

quadráticas dos resíduos foi de 17839 para AK matéria-prima e 16406 (AK 2 %) e

6683 (AK 2 % + HQ 4 %) para produto acabado, ou seja, muito maiores que os

valores de F tabelado dos dados para matéria-prima (F

tab

1,8= 5,3177) e dos dados

para produto acabado (F

tab

1,3= 10,13), por isso rejeita-se a hipótese nula e aceita-

se o modelo linear como adequado.

5.3.2 Sensibilidade

A sensibilidade foi verificada pelo limite de detecção e quantificação. O limite

de detecção calculado foi de 0,15 μg/mL e o limite de quantificação foi de 0,46

μg/mL..

5.3.3 Precisão

É a avaliação da dispersão de resultados entre ensaios independentes e foi

avaliada em dois níveis: repetitividade (intra-dia) e precisão intermediária (inter-dias).

5.3.3.1 Repetitividade

É o grau de concordância entre os resultados de mensurações de um mesmo

analito por um único analista em um mesmo equipamento num curto espaço de

tempo. A repetitividade foi avaliada através do DPR (desvio padrão relativo) obtido

para cada conjunto de dados das concentrações de 10, 15 e 20 μg/mL. Este ensaio

visa representar se há concordância entre os resultados das leituras de modo

sucessivo do método a ser validado.

Os resultados para a repetitividade encontram-se na tabela 02, sendo que

cada valor para cada concentração representa a média de três leituras consecutivas.

Em todas as concentrações testadas o valor de DPR é menor que o estabelecido

pela norma vigente que preconiza 5%. Isso satisfaz o critério para a repetitividade e

indica que o método apresenta boa precisão intra-dia.

TABELA 02 – VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE AK E ERRO RELATIVO NA AVALIAÇÃO DA

REPETITIVIDADE

Concentração (μg/mL)

A 1

A 2

A 3

A 4

A 5

A 6

9,902

9,939

9,964

9,872

9,866

9,876

14,799

14,720

15,069

14,951

14,791

14,835

20,089

20,084

20,097

19,749

19,911

19,737

Média

DPR

Erro relativo (%)

9,903

0,040

0,406

0,325

14,861

0,127

0,855

0,684

19,945

0,171

0,857

0,686

FONTE: O AUTOR (2008)

Pelo teste t para amostras independentes para cada uma das concentrações

de 10, 15 e 20 μg/ml o valor de ―p‖ foi de 0,076, 0,357 e 0,777 respectivamente,

assumindo-se variâncias iguais e como os valores são maiores que 0,05 não se

deve rejeitar a hipótese nula e os valores são estatisticamente iguais.

5.3.3.2 Precisão intermediária

É a precisão avaliada sobre a mesma amostra por analistas, equipamentos e

em dias diferentes. Para a avaliação da precisão intermediária foram realizadas

análises em dias consecutivos e verificados através do DPR (desvio padrão relativo)

obtido para cada conjunto de dados das concentrações 10, 15 e 20 μg/ml.

Os resultados para a repetitividade encontram-se na tabela 03, sendo que

cada valor para cada concentração representa a média de três leituras consecutivas.

Em todas as concentrações testadas o valor de DPR é menor que o estabelecido

pela norma vigente que preconiza 5%. Isso satisfaz o critério para a precisão

intermediária e indica que o método apresenta boa precisão intermediária.

TABELA 03 – VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE AK E ERRO RELATIVO NA AVALIAÇÃO DA

PRECISÃO INTERMEDIÁRIA

Concentração (μg/ml)

Dia / Equipamento / Amostra

1 1 A 1

1 1 A 2

1 1 A 3

2 2 B 1

2 2 B 2

2 2 B 3

9,872

9,866

9,876

9,585

9,475

9,434

14,799

14,720

15,069

14,743

14,735

14,663

19,749

19,911

19,737

20,028

19,936

19,845

Média

DPR

Erro relativo (%)

9,685

0,210

2,171

5,319

14,788

0,144

0,976

0,781

19,868

0,113

0,568

0,455

FONTE: O AUTOR (2008)

Foi calculado o ―p‖ pelo teste t para amostras independentes para cada uma

das concentrações de 10, 15 e 20 μg/ml, entres os dias 1 e 2. O valor de ―p‖ para a

concentração de 10 μg/ml foi de 0,010 assumindo-se variâncias iguais. Como o valor

foi menor que 0,05, significa que deve-se rejeitar a hipótese nula em que os dois

conjuntos de dados seriam iguais. Para as concentrações de 15 e 20 μg/ml os

valores de ―p‖ foram 0,242 e 0,149 respectivamente quando se assumem variâncias

iguais. Valores estes maiores que 0,05 e, neste caso, não se deve rejeitar a hipótese

nula e os valores entre o dia 1 e 2 são estatisticamente iguais.

5.3.4 Exatidão

Expressa o grau de concordância entre um valor dado como referência aceito

como verdadeiro e o valor encontrado na prática. Para a verificação da exatidão do

método para quantificação do AK por espectrofotometria no UV utilizou-se o ensaio

de recuperação. Quantidades conhecidas de AK foram incorporadas às bases creme

Lanette ou creme não iônico, com adição ou não de hidroquinona. Neste caso uma

concentração de 2% para AK e 4% para HQ para simular as concentrações em que

são vendidas no comércio. As soluções foram diluídas até concentrações de 10, 15

e 20 μg/mL e com a adição de 1,5 mL de cloreto de alumínio 0,2% ([H

]= 0,1 M)

quando completados para 10 mL com metanol foram lidas em 305, 315 e 320 nm em

espectrofotômetro UV. As análises foram realizadas em triplicata e cada amostra

avaliada em três comprimentos de onda. Os resultados da recuperação de AK em

creme Lanette podem ser visualizados na tabela 04, e com presença de

hidroquinona em Lanette, na tabela 05.

Tabela 04 – VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE AK NO ENSAIO DE RECUPERAÇÃO EM CREME

LANETTE E ERRO RELATIVO

Conc.

teórica

(μg/ml)

(nm)

Concentração (μg/ml)

Média

DPR

Recuperação

(%)

Erro

relativo

(%)

305

10,15

10,13

10,09

10,12

0,030

0,294

101,24

0,341

315

10,22

10,20

10,16

10,20

0,033

0,327

101,90

0,339

320

10,31

10,29

10,24

10,28

0,036

0,354

102,80

0,397

305

14,93

14,92

14,94

14,93

0,011

0,072

99,53

0,076

315

14,98

15,00

14,97

14,99

0,015

0,103

99,90

0,115

320

15,05

15,03

15,06

15,04

0,019

0,124

100,30

0,115

305

19,94

19,92

19,86

19,91

0,039

0,197

99,53

0,237

315

20,04

20,03

19,96

20,01

0,042

0,211

100,06

0,247

320

20,15

20,13

20,06

20,12

0,049

0,245

100,58

0,266

FONTE: O AUTOR (2008)

Os valores de ―p‖ para os conjuntos de dados referentes à concentração de

15 μg/mL em 305, 315 e 320 nm, na recuperação de AK em creme Lanette foram

0,560, 0,319 e 0,158 respectivamente, assumindo que as variâncias são iguais.

Todos os valores são maiores que 0,05 e isto significa que não se deve rejeitar a

hipótese nula e os valores são estatisticamente iguais aos ―verdadeiros‖.

Tabela 05 – VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE AK EM PRESENÇA DE HIDROQUINONA NO

ENSAIO DE RECUPERAÇÃO EM CREME LANETTE E ERRO RELATIVO

Conc.

teórica

(μg/ml)

(nm)

Concentração (μg/ml)

Média

DPR

Recuperação

(%)

Erro

relativo

(%)

305

18,97

19,00

18,98

0,019

0,099

189,81

0,121

315

11,04

11,03

11,08

11,05

0,028

0,249

110,51

0,282

320

10,33

10,40

10,35

0,045

0,434

102,02

0,491

305

27,49

27,48

27,49

0,002

0,005

183,24

0,006

315

16,02

0,004

0,023

106,80

0,026

320

15,01

15,02

0,005

0,031

100,10

0,035

305

36,58

36,56

36,57

0,012

0,033

182,84

0,037

315

21,54

21,55

21,54

0,010

0,047

107,81

0,046

320

20,32

20,34

20,42

20,36

0,056

0,277

101,80

0,313

FONTE: O AUTOR (2008)

Os valores de ―p‖ para os conjuntos de dados referentes à concentração de

15 μg/mL em 305, 315 e 320 nm na recuperação de AK em presença de HQ em

creme Lanette foram 0.000, 0.000 e 0.219 respectivamente quando se assumem

variâncias iguais. Para os dois primeiros comprimentos de onda os valores de ―p‖

são inferiores a 0,05 e isto significa que deve-se rejeitar a hipótese nula de que os

conjuntos são iguais aos ―verdadeiros‖. Para 320 nm o valor é maior que 0,05, sendo

considerado estatisticamente igual ao ―verdadeiro‖.

De acordo com os resultados da recuperação de AK em creme Lanette pode-

se destacar, pela tabela 04, que quando ele é o único ativo não há interferência do

creme lanette na quantificação do mesmo nas concentrações finais de 10, 15 e 20

μg/ml e nos comprimentos de onda de 305, 315 e 320 nm. A hidroquinona está

presente em muitas formulações em associação com o AK na concentração de 4 e

2%, respectivamente. Nessa proporção, pelo ensaio de recuperação em lanette

(tabela 05), pode-se verificar que nas concentrações finais de 10, 15 e 20 μg/ml e

nos comprimentos de onda de 305, 315 há interferência superior a 5%, pois a

hidroquinona ainda absorve um pouco até essa faixa. Já em 320 nm a interferência

é insignificante, de modo que nesse comprimento de onda a quantificação do AK é

possível, mesmo na presença de hidroquinona.

Os resultados da recuperação de AK em presença ou não de hidroquinona

em creme não iônico encontram-se nas tabelas 06 e 07, respectivamente.

TABELA 06 – VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE AK NO ENSAIO DE RECUPERAÇÃO EM

CREME NÃO IÔNICO E ERRO RELATIVO

Conc.

teórica

(μg/ml)

(nm)

Concentração (μg/ml)

Média

DPR

Recuperação

(%)

Erro

relativo

(%)

305

10,13

9,84

9,85

9,94

0,165

1,657

101,53

1,874

315

10,15

10,19

10,20

10,18

0,025

0,250

101,81

0,282

320

10,17

10,22

10,24

10,21

0,034

0,328

102,10

0,371

305

14,44

14,38

14,36

0,033

0,228

95,75

0,258

315

14,49

14,41

14,43

14,45

0,038

0,262

96,30

0,297

320

14,58

14,49

14,53

0,048

0,331

96,90

0,374

305

19,16

19,11

19,14

19,13

0,025

0,131

95,67

0,148

315

19,28

19,21

19,25

0,031

0,161

96,23

0,182

320

19,39

19,31

19,34

19,35

0,040

0,206

96,74

0,233

FONTE: O AUTOR (2009)

Os valores de ―p‖ para os conjuntos de dados referentes à concentração de

15 μg/mL em 305, 315 e 320 nm na recuperação de AK em creme não iônico foram

0,013, 0,018 e 0,039 respectivamente. Todos os valores são menores que 0,05 e

isto significa que se deve rejeitar a hipótese nula e os valores não são

estatisticamente iguais aos ―verdadeiros‖.

TABELA 07 – VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE AK EM PRESENÇA DE HIDROQUINONA NO

ENSAIO DE RECUPERAÇÃO EM CREME NÃO IÔNICO E ERRO RELATIVO

Conc.

teórica

(μg/ml)

(nm)

Concentração (μg/ml)

Média

DPR

Recuperação

(%)

Erro

relativo

(%)

305

19,06

18,49

18,68

0,329

1,762

190,83

1,994

315

11,00

11,01

11,00

0,008

0,068

110,05

0,077

320

10,22

10,24

10,23

0,013

0,128

102,34

0,113

305

26,53

26,51

26,52

0,010

0,039

176,78

0,044

315

15,33

15,34

15,35

15,34

0,010

0,063

102,29

0,071

320

14,51

14,56

14,48

14,51

0,009

0,065

96,76

0,073

305

35,52

35,54

35,53

0,010

0,029

177,67

0,032

315

20,65

20,67

20,64

20,65

0,015

0,074

103,26

0,083

320

19,26

19,32

19,27

19,28

0,031

0,158

96,42

0,180

FONTE: O AUTOR (2009)

Os valores de ―p‖ para os conjuntos de dados referentes à concentração de

15 μg/mL em 305, 315 e 320 nm na recuperação de AK em presença de HQ em

creme Lanette foram 0.000, 0.011 e 0.33 respectivamente. . Para os dois primeiros

comprimentos de onda os valores de ―p‖ são inferiores a 0,05 e isto significa que

deve-se rejeitar a hipótese nula de que os conjuntos são iguais aos ―verdadeiros‖.

Para 320 nm o valor é maior que 0,05, sendo considerado estatisticamente igual ao

―verdadeiro‖.

De acordo com os resultados da recuperação de AK pode-se destacar pela

tabela 06, que quando ele é o único ativo o nível de interferência do creme não

iônico na quantificação do mesmo nas concentrações finais de 10, 15 e 20 μg/ml e

nos comprimentos de onda de 305, 315 e 320 nm está dentro do limite de 5%.

Quando a hidroquinona está presente, pelo ensaio de recuperação em creme não

iônico (tabela 07) pode-se verificar que nos comprimentos de onda de 305 e 315 há

interferência superior a 5%, pois a hidroquinona ainda absorve um pouco até essa

faixa. Já em 320 nm a interferência é menor que 5 %, de modo que nesse

comprimento de onda a quantificação do AK é possível mesmo na presença de

hidroquinona.

5.3.5 Robustez

A robustez é um ensaio que tem por objetivo verificar a capacidade do

método em suportar pequenas variações em parâmetros do método de modo que os

resultados continuem inalterados. Ele mede a confiabilidade do método em

condições normais, permitindo verificar as tolerâncias dos parâmetros críticos do

método. Neste caso foram avaliados o fator tempo, pH, temperatura e variação da

concentração do metal.

Para determinação do erro do método também foram estimados componentes

de variância associados às fontes de variação de cada particular método,

considerando-se na especificação do erro relativo intervalos com 95% de confiança

para média.

5.3.5.1 Influência do tempo de leitura na intensidade de absorção

O primeiro parâmetro analisado foi a influência do tempo sobre a estabilidade

da solução e a intensidade de absorção. Uma solução de concentração conhecida

foi preparada e lida no tempo zero, 24 h e 72 h após o preparo, sendo que as duas

últimas foram mantidas em temperatura controlada de 20ºC até leitura. Como pode

ser observado, através da análise da tabela 08, não houve diferença significativa nos

valores de absorbância do tempo zero até setenta e duas horas. A estabilidade do

sistema faz com que a solução possa ser lida em espectrofotômetro até três dias

após o seu preparo. Deste modo o fator tempo não é um parâmetro crítico inerente

ao método.

TABELA 08 – RESULTADO DO ENSAIO DE ROBUSTEZ PELA AVALIAÇÃO DO TEMPO

Tempo (h)

Concentração (μg/mL)

Absorbância média

Conc. média real

(μg/mL)

Erro relativo

(%)

0,547

14,72

0,121

0,551

14,84

0,214

0,536

14,43

0,262

Média

0,545

14,66

0,008

0,212

DPR

1,438

1,448

FONTE: O AUTOR (2008)

Foi aplicado o test t para amostras pareadas na comparação entre os valores

―verdadeiros‖ e os tempos zero, 24 e 72 h no ensaio de robustez para a avaliação da

influência do tempo sobre a estabilidade do sistema e a intensidade de absorção

referentes à concentração de 15 μg/mL. Os valores de ―p‖ para os conjuntos de

dados foram 0,185, 0,222 e 0,221, respectivamente. Todos os valores são maiores

que 0,05 e isto significa que não se deve rejeitar a hipótese nula e os valores são

estatisticamente iguais aos ―verdadeiros‖.

Também foi aplicado o teste ANOVA one way. O teste de homogeneidade de

variâncias foi verificado pelo teste de Levene, sendo:

: s

= s

; H

: As variâncias são homogêneas

Como pelo teste de Levene F=1,545 < F

(0.05;2;6)

= 5,14, ou p-value =0.288 >

α=0.05, conclui-se que as variâncias são homogêneas, isto é, dentro de cada um

dos tratamentos a variabilidade é apenas devida a causas aleatórias. Por ANOVA

F= 3,325 < F

(0.05;2;6)

= 5,14, ou p-value = 0.107 > α=0.05, conclui-se que não existem

diferenças significativas entre os tempos zero, 24 e 72 h com um nível de

significância de 5%. No teste de comparações múltiplas são identificados apenas um

tratamento que se difere significativamente, que é entre o tempo zero e 72 h, mas

apenas o teste LSD que acusa essas diferenças. Isto é, o teste LSD acusa como

diferentes tratamentos cujas médias estão menos afastadas do que o teste Tuckey,

que dá, por assim dizer, maior margem de dúvida antes de imputar essas diferenças

aos efeitos dos tratamentos.

5.3.5.2 Influência da temperatura na intensidade de absorção

O segundo parâmetro avaliado foi a influência da temperatura sobre a

estabilidade do sistema. Uma solução de concentração conhecida foi preparada e

dividida em três porções, sendo que a primeira foi reservada em geladeira a 5ºC, a

segunda mantida em temperatura controlada a 20ºC e a terceira em estufa a 30ºC,

todas mantidas nesses ambientes por quatro horas. Para essa faixa de temperatura

não houve alteração significativa na leitura de absorbância, como pode ser

visualizado na tabela 09. Pequenas variações para mais ou para menos não afetam

o sistema e isso faz com que o fator temperatura não seja crítico ao método.

TABELA 09 – RESULTADO DO ENSAIO DE ROBUSTEZ PELA AVALIAÇÃO DA TEMPERATURA

Temperatura

(ºC)

Concentração (μg/mL)

Absorbância média

Conc. média real

(μg/mL)

Erro relativo

(%)

0,5200

13,99

0,243

0,5214

14,03

0,262

0,5191

13,97

0,120

Média

0,5202

13,99

0,001159

0,03141

DPR

0,2227

0,2244

FONTE: O AUTOR (2008)

Foi aplicado o test t para amostras pareadas na comparação entre os valores

―verdadeiros‖ e as temperaturas 5ºC, 20ºC e 30ºC no ensaio de robustez para a

avaliação da influência da temperatura sobre a estabilidade do sistema e a

intensidade de absorção referentes à concentração de 15 μg/mL. Os valores de ―p‖

para os conjuntos de dados foram 0.357, 0.221 e 0.369, respectivamente. Todos os

valores são maiores que 0,05 e isto significa que não se deve rejeitar a hipótese nula

e os valores são estatisticamente iguais aos ―verdadeiros‖.

Também foi aplicado o teste ANOVA one way. O teste de homogeneidade de

variâncias foi verificado pelo teste de Levene, sendo:

: s

= s

: As variâncias são homogêneas

Como pelo teste de Levene F=1,980 < F

(0.05;2;6)

= 5,14, ou p-value= 0,219 >

z‘α= 0.05, conclui-se que as variâncias são homogêneas, isto é, dentro de cada um

dos tratamentos a variabilidade é apenas devida a causas aleatórias. Por ANOVA

F= 1,030 < F

(0.05;2;6)

= 5,14, ou p-value = 0,415 > α=0.05, conclui-se que não existem

diferenças significativas entre as temperaturas 5, 20 e 30ºC com um nível de

significância de 5%.

No teste de comparações múltiplas não são identificados nenhum tratamento

que se difere significativamente.

5.3.5.3 Influência do pH na intensidade de absorção

O terceiro parâmetro avaliado foi a influência do pH sobre a estabilidade do

sistema. Foram preparadas nove soluções de concentração conhecida e o pH de

cada uma foi ajustada com hidróxido de potássio. O pH da solução obtida

diretamente do método é igual a 1 e através da avaliação dos dados obtidos pela

variação do pH pode-se verificar que o intervalo de 1 a 3 é o que deve ser utilizado

para a quantificação do AK. O pH 4, apesar do valor ser muito próximo aos outros,

não se recomenda que seja utilizado uma vez que a solução resultante é levemente

turva. Entre pH 5 e 8 houve a formação de um precipitado floculado que se dissolvia

facilmente. Pela análise do material límpido sobrenadante é possível gerar a

hipótese de que nessa faixa de pH em que o alumínio precipita pode ter carreado

quase todo o AK ainda na forma de complexo, pois se o analito estivesse livre na

solução a absorbância deveria ser maior que a verificada. Em pH 11 a solução volta

a ficar límpida, entretanto o rearranjo eletrônico no meio básico é diferente do ácido,

gerando picos de absorbância em λ(nm) diferente de 305 nm como na faixa ácida.

Em pH 14 a solução voltou a ficar turva.

TABELA 10 – RESULTADO DO ENSAIO DA ROBUSTEZ PELA AVALIAÇÃO DO pH

Concentração

teórica (μg/ml)

Absorbância

média

Concentração real

(μg/ml)

DPR

0,541

14,648

0,0157

0,1071

0,185

0,532

14,399

0,0094

0,0654

0,051

0,531

14,392

0,0097

0,0676

0,052

0,540

14,636

0,0224

0,1530

0,167

0,110

2,980

0,0450

1,5096

0,000

0,015

0,412

0,0952

23,1094

0,000

0,076

2,047

0,1128

5,5121

0,000

0,339

9,198

0,0379

0,4125

0,000

0,650

17,611

0,0294

0,1667

0,002

FONTE: O AUTOR (2008)

Foi aplicado o test t para amostras pareadas na comparação entre os valores

―verdadeiros‖ e os valores de pH no ensaio de robustez para a avaliação da

influência do pH sobre a estabilidade do sistema e a intensidade de absorção

referentes à concentração de 15 μg/mL. Os valores de ―p‖ para os conjuntos de

dados de pH 1 a 4 foram maiores que 0,05 e isto significa que não se deve rejeitar a

hipótese nula e os valores são estatisticamente iguais aos ―verdadeiros‖. Do pH 5 ao

14 os valores são inferiores a 0,05, ou seja, são estatisticamente diferentes.

Também foi aplicado o teste ANOVA one way. O teste de homogeneidade de

variâncias foi verificado pelo teste de Levene, sendo:

: s

= s

: As variâncias são homogêneas

Como pelo teste de Levene F= 3,524 > F

(0.05;8;18)

= 2,510, ou p-value = 0,013 <

α= 0.05, conclui-se que as variâncias não são homogêneas, isto é, dentro de cada

um dos tratamentos a variabilidade não se dá apenas devido a causas aleatórias.

Por ANOVA F= 44157 > F

(0.05;8;18)

= 2,510, ou p-value = 0,000 < α= 0.05, conclui-se

que existem diferenças significativas entre os valores de pH com um nível de

significância de 5%.

No teste de comparações múltiplas são identificados em todos os tratamentos

que se diferem significativamente, exceto entre o pH 1 e 4 e entre pH 2 e 3.

O pH é um fator crítico que deve ser verificado para que não se tenha

soluções de pH superiores a 3.

5.3.5.4 Influência da concentração do metal na intensidade de absorção

Este ensaio foi verificado numa das primeiras etapas do processo analítico

(figura 30 – página 77) e por ele nota-se que na proporção próxima de 1:1 em diante

até a relação em que se tem excesso de alumínio com AK 1 : 136 Al

não há mais

diferença estatística entre os valores de absorbância obtidos. Deve-se garantir que

sempre se tenha alumínio em excesso de até 136 vezes mais para se ter uma

intensidade de leitura máxima e constante, pois esse é um fator crítico ao processo.

5.4 ESTUDO DO COMPLEXO

Para confirmar como ocorrem as coordenações (AK-Al

) e quais grupos da

molécula do AK estariam envolvidos na complexação do mesmo com o alumínio

foram feitos ensaios por espectroscopia no infravermelho e de ressonância

magnética nuclear de

C com base nas espécies encontradas nas titulações

potenciométricas e nos diagramas de especiação, de acordo com a variação do pH.

5.4.1 Titulação potenciométrica e espectroscopia no ultravioleta

É importante caracterizar o tipo do complexo e a porcentagem em que cada

tipo aparece à medida que se varia o pH. Uma das técnicas utilizadas para

caracterizar as espécies formadas no sistema é através da titulação potenciométrica.

Os complexos metálicos do AK têm uma estabilidade relativa alta (BHATIA;

KAUSHIK; SODHI, 1988).

A determinação das constantes de estabilidade por titulação potenciométrica

é uma maneira poderosa para se definir a identidade e distribuição de complexos

ligante-metal e conseqüentemente para se proceder a investigação da especiação

em sistemas aquosos (JORDAN et al., 1996). É uma técnica comum, pela

simplicidade do instrumento e da automação.

O objetivo da utilização da técnica de titulação potenciométrica, neste

trabalho, foi inicialmente determinar a constante de protonação do AK e as

constantes de complexação do sistema aquoso AK na presença de íons alumínio, de

acordo com a variação de pH. Dados da literatura, de estudos anteriores sobre AK

não complexado e complexado à alumínio foram relatados em 2001 (MARTELL , A.

E.; SMITH, R. M. 2001)e mostraram valores para log K = 7.66 +- 0,05 (25

C e I =

0,1mol/L) e log K para os complexos metal-ligante ML= 7.66 (25

C e I = 0,1 mol/L), e

log β para ML

e ML

= 13,72 e 19,26 ( 25

C e I = 0,5 mol/L).

Os dados encontrados por (SALLAM; HAGGAG; MASOUD, 1990) em meio

aquoso também indicam que apenas um próton é liberado entre α= 0 - 1 (α= mols de

base adicionada por mol de ligante). O valor obtido da constante de protonação

(7,68) para o equilíbrio protolítico envolvendo as espécies neutras e aniônicas estão

de acordo com os reportados na literatura de 7,75, 7,83, 7,61 e 7,80 (SALLAM;

HAGGAG; MASOUD, 1990). Outro pKa encontrado na literatura por HEDLUNT;

OHMAN (1988) foi de 7,61.

A titulação potenciométrica do ácido kójico foi também realizada por

MURAKAMI (1962) e forneceu somente uma inflexão nítida (porém o artigo não

mostra a curva da titulação potenciométrica), a qual corresponde à dissociação que

pode ser visualizada na figura 36.

FIGURA 36 – REPRESENTAÇÃO DA DISSOCIAÇÃO DO ÁCIDO KÓJICO

FONTE - MURAKAMI (1962)

O valor de log K relatado (MURAKAMI, 1962) foi de 7,68. O mesmo autor

sugere a formação de um complexo tetracoordenado com o íon magnésio (II),

conforme figura 37. O íon magnésio (II) tem um comportamento parecido com o íon

manganês (II), com similar magnitude na formação das constantes em sistema

aquoso.

FIGURA 37 - ESTRUTURAS DA COORDENAÇÃO DO AK COM MAGNÉSIO

FONTE: MURAKAMI (1962)

Inicialmente, de posse das constantes de protonação do ligante procedeu-se

aos cálculos das constantes de complexação do ligante mais o íon metálico em

estudo. Os cálculos com os dados potenciométricos da titulação do AK na ausência

do alumínio forneceu uma desprotonação, com pKa= 7,68+-0,02 (25,0ºC, I= 0,100

mol/L KCl), valor em conformidade com os outros relatados na literatura. A

desprotonação ocorre pela perda do hidrogênio ligado ao oxigênio do carbono 5, que

pode ser visualizado na figura 43. Na figura 38 visualiza-se a curva de titulação

experimental (linha grossa formada pela união de pequenos quadrados) e simulada

(linha fina) para o AK puro, curva esta que é feita a partir do teste estatístico do qui

quadrado e contando com 95% de confiança.

Com os dados das titulações potenciométricas para AK (0,1 mmol) + Al

(10

mL) (proporção ligante-metal 1:1), AK (0,1 mmol) + Al

(5 mL) (proporção ligante-

metal 1:0,5) e AK (0,1 mmol) + Al

(3 mL) (proporção ligante-metal 1:0,3), calculou-

se – utilizando o programa HYPERQUAD (GANS; SABATINI; VACCA 1993) – em

cada um desses três experimentos feitos em triplicata, para se obter as constantes

de complexação de cada um dos sistemas nas proporções estudadas. Os cálculos,

utilizando-se este programa com o método matemático de mínimos quadrados, são

feitos utilizando-se os valores obtidos inicialmente por suposições químicas e

matemáticas e recalculados.

A cada nova etapa de cálculo, as curvas de simulação matemática e

experimental são checadas e quando a maior sobreposição for atingida e o erro não

diminuir mais, dá-se por terminado os cálculos. Tendo-se procedido assim com a

matriz matemática composta de concentração das espécies conhecidas, expressas

em milimol, constantes de hidrólise do alumínio (BAES E MESMER, 1976), log Ka do

AK e possíveis espécies complexas do sistema AK:Al

, obteve-se as constantes de

complexação que estão dispostas na tabela 12. A figura 48 mostra os perfis das

titulações potenciométricas do AK + Al

nas proporções 1:1, 1: 0,5 e 1:0,3, ligante-

metal.

Através da curva da titulação potenciométrica do ácido kójico não complexado

(figura 38) pode-se observar que até pH 11 existe uma inflexão nítida e uma

segunda discutível. Dá-se o nome de ponto de inflexão ao ponto que separa uma

parte convexa de uma curva contínua de uma parte côncava, ou seja, a inflexão é

uma indefinição transitória das tendências da função em um determinado ponto no

qual ela passa da condição de tendência ao crescimento para a tendência ao

decaimento, ou vice-versa.

100

FIGURA 38 - CURVA DE TITULAÇÃO DO ÁCIDO KÓJICO NÃO COMPLEXADO (SOLUÇÃO

AQUOSA 0,1mmol)

FONTE: O AUTOR (2009)

As soluções tiveram seus valores de pH aumentados e os espectros foram

obtidos nestas soluções de razão e pHs variados. Durante a conversão química de

uma espécie em outras, absorventes no UV e/ou visível, os espectros se cruzarão

no mesmo comprimento de onda, cruzamento conhecido como ponto isosbéstico

(HARRIS, 2001). Dois pontos isosbésticos (ponto onde as curvas se juntam e

comprimento de onda da forma ácida e básica tem o mesmo coeficiente de extinção

e índices de absorbância iguais) aparecem no espectro ácido kójico não complexado

(figura 39). Um deles corresponde à desprotonação e o segundo corresponde

possivelmente a uma interconversão de espécie hidrolisada, não determinada neste

estudo.

Através do espectro no UV do AK (figura 40) tem-se que na região próxima ao

comprimento de onda 270 nm pode-se observar que do pH 2,0 até 6,0 tem-se

espectros praticamente idênticos, já em 6,5 há um decréscimo discreto que continua

em 7,0 e em 7,5 é significativo (desprotonação de AKH para AK

). A queda persiste

até estabilidade a partir de 9,5 até 12, já com total inversão da banda no espectro de

270 nm para 315 nm (figura 41).

101

FIGURA 39 – ESPECTROS DE UV DO ÁCIDO KÓJICO NÃO COMPLEXADO EM SOLUÇÃO

AQUOSA (15µg/mL) NA VARIAÇÃO DE pH DE 2,0 A 12,0 E IDENTIFICAÇÃO DOS DOIS PONTOS

ISOSBÉSTICOS

FONTE: O AUTOR (2009)

FIGURA 40 – ESPECTROS DE UV DO ÁCIDO KÓJICO NÃO COMPLEXADO EM SOLUÇÃO

AQUOSA (15µg/mL) NA VARIAÇÃO DE pH DE 2,0 A 12,0 E IDENTIFICAÇÃO DOS pH NO λ= 270

nm, DEPOIS DO PRIMEIRO PONTO ISOSBÉSTICO

FONTE: O AUTOR (2009)

102

FIGURA 41 - ESPECTRO DE UV DO ÁCIDO KÓJICO NÃO COMPLEXADO EM SOLUÇÃO

AQUOSA (15µg/mL) NA VARIAÇÃO DE pH DE 2,0 A 12,0 E IDENTIFICAÇÃO DOS pH NO λ= 315

nm, DEPOIS DO SEGUNDO PONTO ISOSBÉSTICO.

FONTE: O AUTOR (2009)

A existência de dois pontos isosbésticos aumentaram ainda mais a dúvida

sobre a possível segunda inflexão do AK, que corresponderia à segunda ionização

do mesmo ainda não relatada na literatura. Para confirmar essa possibilidade foram

calculadas as derivadas dos dados da variação do pH em função da adição de base.

Os possíveis pontos de inflexão são aqueles que separam uma parte convexa de

uma curva contínua de uma parte côncava e quando existe derivada segunda nos

pontos de inflexão, ela é nula. Através desse cálculo verificou-se que existe apenas

um único ponto em que a segunda derivada é nula na variação máxima dos dois

eixos (figura 42).

103

FIGURA 42 – GRÁFICO DA SEGUNDA DERIVADA DA TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DO AK

NÃO COMPLEXADO

FONTE: O AUTOR (2009)

Deste modo, concluiu-se que na titulação potenciométrica do AK há apenas

uma inflexão e dados posteriores descritos a seguir, envolvendo outras técnicas

analíticas, demonstraram que somente há a perda do hidrogênio ligado ao oxigênio

do carbono 5 (figura 43).

FIGURA 43 - ESTRUTURA DO ÁCIDO KÓJICO COM OS CARBONOS ASSINALADOS

FONTE: O AUTOR (2009)

Com base no modelo de apenas uma ionização e de posse dos valores da

titulação e das constantes calculadas, o programa HYSS (ALDERIGHI et al., 1999)

calculou e desenhou o diagrama de distribuição das espécies para o sistema do AK

não complexado como pode ser visualizado na figura 44.

104

FIGURA 44 - DIAGRAMA DE ESPECIAÇÃO DO AK NÃO COMPLEXADO EM MEIO AQUOSO

FONTE: O AUTOR (2010)

Foram realizados, na seqüência, ensaios para várias proporções de metal-

ligante seguindo o mesmo raciocínio dos cálculos. A curva da titulação

potenciométrica da proporção AK 1:1 Al

está representada na figura 45.

As titulações, na presença de alumínio, apresentam uma região de

tamponamento grande, pois a solução de cloreto de alumínio utilizada, acidificada,

necessita de um grande volume de base para neutralizar esse ácido inorgânico. Um

número maior de inflexões observado sugere a presença de um número grande de

espécies complexadas presentes. Estas espécies sugeridas pela titulação

potenciométrica (tabela 12), podem ser visualizadas através do maior número de

pontos isosbésticos (figura 46) no espectro no UV e também observadas nos

diagrama de distribuição das espécies, figura 47.

105

FIGURA 45 - CURVA DE TITULAÇÃO NA PROPORÇÃO AK 1:1 ALUMÍNIO EM MEIO AQUOSO

FONTE: O AUTOR (2009)

As espécies complexadas e hidroliticas de Al

estão representadas como:

metal = Al

; ligante ácido kójico = L; n prótons = H

e n OH

= H

-n

. Os sistemas

aquosos de alumínio apresentam normalmente varias espécies complexadas que

podem ou não ser solúveis em água, dependendo sempre do ligante e do valor de

pH que se está considerando.

De acordo com a literatura até 2001 (MARTELL , A. E.; SMITH, R. M. 2001)

que é uma compilação de dados da literatura, há 3 constantes de complexação, do

tipo metal ligante, detectadas nos estudos efetuados até então, ML, ML

e ML

. No

entanto, estudos anteriores mostram que o AK na presença de Al

forma espécies

complexas tanto n protonadas como n hidroxiladas (HEDLUNT; OHMAN, 1988).

Portanto sistemas aquosos que contem AK + Al

em diferentes proporções M e L e

em pH variáveis, são sistemas interessantes e ricos para estudos continuados.

À medida que os sistemas analíticos se aproximam em sensibilidade e limite

de detecção, mais espécies são possíveis de serem detectadas, tornando o desafio

de encontrar essas espécies e de calcular suas constantes de complexação, maior.

A lista de valores de Ka de complexação, conforme tabela 12, maior que os

valores relatados até 2010 na literatura, pode não ser ainda exaustiva, nem a final,

pois o sistema AK+Al

em água é rico em espécies complexadas e que a

solubilidade dessas espécies é em função do pH.

106

FIGURA 46 - ESPECTROS DE UV DO ÁCIDO KÓJICO 1:1 ALUMÍNIO EM SOLUÇÃO AQUOSA

(15µg/mL) NA VARIAÇÃO DE pH DE 2,0 A 12,0 E IDENTIFICAÇÃO DOS PONTOS ISOSBÉSTICOS

FONTE: O AUTOR (2009)

Os espectros obtidos no UV-Vis, contendo vários pontos isosbésticos

confirmam a variedade de espécies complexadas nos sistemas estudados e

calculados anteriormente.

De posse dos valores das constantes calculadas, o programa HYSS

(ALDERIGHI et al., 1999) calculou e desenhou o diagrama de distribuição das

espécies para cada um dos sistemas estudados. Cada um dos sistemas contendo

diferentes proporções de AK e Al

foi estudado pela técnica de espectroscopia no

UV para se tentar mapear a presença das espécies propostas pela técnica da

titulação potenciométrica (figura 47).

107

FIGURA 47 - DIAGRAMA DE ESPECIAÇÃO DA PROPORÇÃO AK 1:1 Al

FONTE: O AUTOR (2010)

Espécies hidrolíticas complexadas, AK desprotonado não complexado,

espécies poliméricas do ligante não hidrolíticas e hidrolíticas estão presentes em

toda a faixa de pH estudado, tanto para a proporção 1:1 como 1:0,5.

Os valores de pH em que há maior concentração de espécies complexadas

solúveis é entre pH 6 e 10. Somente espécies solúveis e presentes em concentração

acima de 10% em relação a todas as espécies metálicas presentes no equilíbrio

foram consideradas para o cálculo dos diagramas de distribuição das espécies. Foi

possível verificar através da figura 45 que o alumínio forma uma enormidade de

espécies complexadas com o ligante estudado e a concentração e solubilidade delas

são função da concentração dos reagentes e do pH considerado. As curvas de

titulação do AK puro e na presença de alumínio, em duas proporções estudadas

podem ser visualizados na figura 48. A proporção estudada Ligante 1:0,3 Metal não

apresentou diferença nas espécies complexadas em relação às outras duas

estudadas, e por isso não será discutida neste trabalho.

No estudo realizado por STENSON et al (2007) foi concluído que o ácido

kójico forma prontamente complexos com 11 íons metálicos testados com três

cargas positivas. Os complexos mais comuns encontrados foram ML

e M

. No

caso do complexo com alumínio foram obtidos com maior abundância relativa a íons

108

correspondentes ao (ML

)

, (ML

)

, (M

)

e (M

)

em que L representa o

ácido kójico desprotonado (ou AK

) e M o íon metálico 3+. A energia de colisão

necessária para dissociação do (ML

)

com alumínio foi a maior entre os 11

elementos testados (Al, As, Cr, Ga, Fe, In, Yb, Y, Gd, Nd e La) e não por acaso ele é

o elemento de menor número atômico e menor camada de valência, indicando que a

ligação com o alumínio é a mais forte, pois necessita de uma energia de colisão

maior.

As diferenças entre os espectros obtidos por UV da solução de ácido kójico

puro e da solução AK 1:1 Al podem ser visualizadas nos comprimentos de onda

máximos e intensidades do pH 2 até 11,5, conforme a tabela 11.

TABELA 11. COMPARAÇÃO ENTRE AS SOLUÇÕES DE AK PURO E COMPLEXADO COM

ALUMÍNIO PARA OS VALORES DE ABSORBÂNCIA EM COMPRIMENTOS DE ONDA E

DIFERENTES VALORES DE pH

AK não complexado

AK 1:1 Al

máx

(nm)

Abs.

máx

(nm)

Abs.

2,0

216

269

1,347

0,876

2,0

217

268

2,341

1,140

2,5

216

269

1,357

0,886

2,5

218

265

1,584

0,542

3,0

216

269

1,325

0,869

3,0

218

259

1,786

0,449

3,5

216

269

1,322

0,868

3,5

218

256

296

1,870

0,425

0,386

4,0

216

269

1,333

0,874

4,0

218

255

294

1,898

0,411

0,394

4,5

216

269

1,355

0,887

4,5

219

255

295

1,920

0,407

0,408

5,0

216

269

1,337

0,867

5,0

219

255

297

1,893

0,426

0,402

5,5

216

269

1,329

0,861

6,0

216

269

1,340

0,871

6,0

220

258

1,691

0,428

6,5

217

269

1,325

0,839

7,0

217

269

1,357

0,801

7,0

220

259

1,695

0,450

7,5

220

269

1,419

0,616

7,7

220

260

1,668

0,449

8,0

226

315

1,970

0,546

8,5

226

315

2,005

0,560

8,5

220

260

1,666

0,442

9,0

226

315

1,993

0,553

109

9,5

226

315

2,042

0,592

9,5

226

313

1,614

0,390

10,0

226

315

2,056

0,601

10,0

227

314

1,688

0,432

10,5

226

315

2,034

0,593

10,5

227

315

1,766

0,469

11,0

226

315

2,092

0,613

11,0

227

315

1,832

0,503

11,5

226

315

2,082

0,607

11,5

228

315

1,861

0,517

Pontos

isosbésticos

λ= 240 e 290nm

Pontos

isosbésticos

λ= 243, 287, 293 e 303nm

FONTE: O AUTOR (2009)

TABELA 12 - CONSTANTES ÁCIDO KÓJICO EM MEIO AQUOSO EM VÁRIAS PROPORÇÕES

MOLARES NA PESENÇA DE ALUMÍNIO ( 25,0

C E I = 0.100 mol/L)

Espécies

AK não complexado

Al : AK

Log β

Al H

-1

-5.4091

Al H

-2

-9.9816

Al H

-3

-15.6916

Al H

-4

-23.4551

-2

-7.7

-2

-3

-9.5742

-3

-4

-13.6944

-3

-11

-54.694

-6

-15

-49.398

-8

-22

-76.425

AK H

7,842

AK Al

14,7147

AK Al H

19,8244

AK Al

19,3613

25,8912

Al H

33,9850

Al H

39,5787

32,5274

Al H

45,1462

Al H

52,6295

44,2361

Al H

77,1048

52,7751

Al H

61,2327

67,9809

-1

-13.78

FONTE: O AUTOR (2010)

De acordo com os resultados obtidos (tabela 11) pode-se observar que em

relação ao AK puro: de pH 2,0 a 6,0 o λ

máx

das duas bandas são os mesmos (216

110

nm) e as intensidades também (1,33); de pH 6,0 para 6,5 há deslocamento

batocrômico da primeira banda de 216 nm para 217 nm, em pH 7,2, para 220 nm, e,

em pH 8,0, também com deslocamento batocrômico pequeno para 226 nm e

hipercrômico na intensidade de 1,419 em pH 7,5 (220 nm) para 1,970 (226 nm); na

segunda banda (269 nm) o deslocamento batocrômico é bem mais significativo de

269 nm (pH 7,5) para 315 (pH 8,0).

Pode-se observar que em relação ao sistema AK 1:1 Al (tabela 11), em pH

2,0 o AK está majoritariamente na forma protonada e as bandas em 217 nm e 268

nm são muito características, já em pH 2,5 há uma diminuição significativa da

intensidade de absorção com deformação das bandas, fato esse que associado ao

diagrama de especiação calculado pode-se sugerir que o alumínio já teria força

suficiente para deslocar e ocupar o lugar do hidrogênio na ligação com o AK

formando a primeira espécie complexada (AKAlH – MLH, onde M = Al

, L = AK); em

pH 3,0 as bandas continuam deformadas e já de pH 3,5 a 5,0 voltam a ficar bem

definidas, e desta vez são três bandas e não duas como abaixo de 3,5 e acima de

5,0; de pH 6,0 até 8,5 as bandas não estão bem definidas, sendo intermediárias ao

formato das resultantes de pHs mais ácidos e mais básicos. A primeira banda

característica (217 nm) em todos os pHs estão próximos a 220 nm e depois se

desloca para 227 nm; a partir do pH 9,5 a segunda banda (269 nm) começa a se

caracterizar melhor até ficar bem evidente em pH 11,5; de pH 2,0 a 5,0 a segunda

banda se inicia em 268 nm e vai sofrendo um deslocamento hipsocrômico até 255

nm (poderia ser em função da maior solvatação do par de elétrons n não-ligados, o

que abaixa a energia do orbital n. Em solvente polares hidroxilados, como água ou

álcoois, a formação de ligações de hidrogênio entre prótons do solvente e o par de

elétrons não-ligados é extensiva. Aqui a energia dos orbitais n é reduzida por uma

grandeza aproximadamente igual à energia de ligação de hidrogênio. Quando uma

transição n → π* ocorre, no entanto, o elétron n remanescente não consegue manter

a ligação de hidrogênio, assim, a energia do estado excitado n, π* não é efetuada

por esse tipo de interação com o solvente. Um deslocamento hipsocrômico

corresponde, de modo geral, à energia de ligação de hidrogênio, aumentando até

260 nm em pH 8,5 com um salto até 313 nm em pH 9,5 e tendência de estabilização

de pH 10,5 a 11,5 com 315 nm; a partir de pH 9,5 não se tem mais dados que

confirmem a manutenção da complexação, induzindo à conclusão que a partir deste

ponto ela seja mínima e decrescente (LEVER, 1964)

111

Os mesmos resultados mostram as correlações entre AK puro e o sistema AK

1:1 Al: no AK puro a primeira banda se estabiliza com absorção máxima em 226 nm

no pH 8,0, enquanto que no outro sistema ela só chega ao mesmo λ em 9,5 e

mesmo assim continua aumentando com o aumento do pH; com o analito puro a

segunda banda se estabiliza com absorção máxima em 315 nm no pH 8,0, enquanto

que com alumínio a partir de pH 10,5; apenas em alguns pHs são verificados

comprimentos de onda máximo coincidentes, como em pH 7,5 (220 nm), 9,5 (226

nm) e de 10,5 a 11,5 (315nm); no pH 2,0 as duas bandas de absorção máxima são

muito próximas (216 e 217, 269 e 268 nm) e de 2,5 até 7,5 são bem diferentes.

FIGURA 48 - CURVAS DE TITULAÇÃO DO AK NÃO COMPLEXADO (0,1 mmol) E PROPORÇÕES

AK 1: 0,5 Al e AK 1:1 Al EM SOLUÇÃO AQUOSA

FONTE: O AUTOR (2009)

Murakami, em 1962, estudou como seriam os complexos formados com AK e

ferro. Segundo ele, através de reações graduais de hidrólise, o complexo se formaria

em equilíbrio em que poderiam ocorrer proporções de AK e ferro 1:1 ou 2:1 como

pode ser visto na figura 49 e 50.

112

FIGURA 49 - REAÇÕES GRADUAIS DE HIDRÓLISE DO COMPLEXO Fe(III) 1 : 1 AK

FONTE: MURAKAMI, 1962b

FIGURA 50 - REAÇÕES GRADUAIS DE HIDRÓLISE DO COMPLEXO Fe(III) 2 : 1 AK

FONTE: MURAKAMI, 1962b

O íon hidróxido substitui facilmente os grupos aquo enquanto grupos

doadores de forte afinidade com o íon metálico em um ligante polidentado pode não

ser substituído tão facilmente, mesmo em faixas elevadas de pH. A propriedade

ácida do íon metálico central diminui conforme o número de coordenação com

grupos doadores de carga negativa aumenta (MURAKAMI, 1962b).

Baseado nas estruturas complexas de AK e íons metálicos na literatura, pode-

se sugerir que o íon metálico alumínio se complexa através a hidroxila desprotonada

do C-5 e da carbonila C-4.

5.4.1 Espectroscopia no infravermelho

Uma das aplicações mais comuns da espectroscopia no infravermelho é a

identificação de compostos orgânicos (STUART, 2004).

A espectroscopia no infravermelho é o método mais utilizado para a análise

de complexos metal carbonila de acordo com HUHEEY et al (1993), pois pode-se

113

verificar nos resultados qualitativos dos espectros que a ligação π metal-carbono de

carbonila aumenta a frequência e a ligação C-O diminui.

Os espectros, neste trabalho foram obtidos para o padrão, AK puro, e para as

amostras contendo complexos de AK com alumínio. Em um primeiro momento, o

objetivo foi verificar a pureza e identidade da amostra de AK através da comparação

com um padrão. O espectro da amostra (figura 51) é igual ao do padrão,

confirmando assim a identidade do analito.

A localização das bandas é muito importante, pois substâncias idênticas

devem apresentar bandas nas mesmas regiões. Assim, no caso desta técnica, são

fatores relevantes a correspondência e a similaridade das bandas.

Mesmo para moléculas relativamente simples, o espectro no infravermelho é

geralmente complexo. Pela análise do espectro da amostra de AK, as atribuições

prováveis de bandas relacionadas com o tipo de ligações são:

- estiramentos em 3273 e 3175 cm

-1

de hidroxilas de álcool primário e

fenólica. As bandas características observadas no espectro de álcoois e fenóis

resultam do estiramento O-H e C-O (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2005). Em

geral a banda fenólica aparece entre 50-100 cm

-1

da alcoólica (STUART, 2004). O

deslocamento para freqüências menores e alargamento da banda pode ser devido a

ligações de hidrogênio intermoleculares (FURNISS et al., 1989).

- estiramento da ligação =C-H em 3101 cm

-1

atribuída aos carbonos 3 e 6;

- estiramento da ligação de hidrogênio intramolecular e acoplamento por

estiramento C-O e deformação O-H em 3075 cm

-1

correspondente à porção superior

e/ ou inferior da molécula;

- estiramento de –CH

- em 2843 cm

-1

remete ao carbono 7;

- estiramento de CH

assimétrico de C sp

em 2926 cm

-1

também de C-7;

- pico de CO

em 2343 e 2362 cm

-1

, contaminação, provavelmente

incorporado no preparo da pastilha e/ou variações do ar atmosférico no

compartimento da amostra, não fazendo parte da estrutura da amostra;

- estiramento de C=O é observado em 1768 cm

-1

. A intensidade desse pico

está muito abaixo da esperada. As ligações de hidrogênio internas podem aumentar

as interações de ressonância e perturbar significativamente o estiramento C=O

(MAYO; MILLER; HANNAH, 2003). Quando um grupo ligado ao carbono da

carbonila pode efetivamente fazer uma conjugação, seja pelo par de elétrons livres

ou elétrons π, a direção e magnitude do deslocamento da freqüência são

114

relacionadas ao balanço da deslocalização de tais elétrons e efeitos indutivos

(FURNISS et al., 1989). A banda em 1660 cm

-1

além da carbonila também pode

estar relacionada com os grupos C=C-H e C=C-O. Insaturações adjacentes ao C=O

reduzem a absorção da carbonila (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2005)

(MAYO; MILLER; HANNAH, 2003); Ligações no carbono α podem resultar em

diminuição no ângulo de ligação C-CO-C e consequente aumento da freqüência

para valores entre 1750-1775 cm

-1

(FURNISS et al., 1989).

- estiramento C=O que pode ser de cetona aromática ou –C=C-O- em 1699

-1

;

- quando a ligação C=C está conjugada com o grupo carbonila mais dupla

ligação aparece, mas não tão característica. O número de bandas observadas pode

ser relacionado ao número de conjugações com as duplas ligações (FURNISS et al.,

1989) e neste caso aparecem duas bandas em 1602 e 1630 cm

-1

;

- deformação tesoura de –CH

- 1473 cm

-1

do carbono 7;

- flexão no plano de O-H, estiramento C-O, deformação C-H e flexão no plano

de C-O-H de fenol em 1350 cm

-1

;

- resultante de estiramento C-C-C e flexão de C-C(=O)-C em 1284 cm

-1

;

- estiramento de ligação C-O de fenol em 1226 cm

-1

;

- vibração simétrica C-O-C que pode estar acoplado a estiramento de C-O e

deformação no plano de O-H de álcool primário em 1075 cm

-1

;

- banda em 850 cm

-1

de deformação fora do plano C-H, estiramento

assimétrico CH de C=C encoberto em 3049 cm

-1

, estiramento simétrico C-H de C=C

em 3007 cm

-1

e em 1699 cm

-1

de alceno trissubstituído;

- flexão ou torção fora do plano de C-O-H em 767 cm

-1

;

- deformação angular fora do plano de O-H em ligação hidrogênio próxima a

650 cm

-1

- deformação angular simétrica de ligações C-C do anel próximas a 600 cm

-1

115

FIGURA 51 – ESPECTROS DE ABSORÇÃO DO AK MATÉRIA-PRIMA EM COMPARAÇÃO COM O

AK PADRÃO NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO

FONTE: O AUTOR (2008)

Para elucidação estrutural dos complexos deste trabalho ensaios no

infravermelho foram realizados para o padrão e soluções da amostra com e sem

alumínio, em diferentes valores de pH.

Para a obtenção de material sólido para a produção das pastilhas, as

soluções foram liofilizadas e armazenadas em congelador a -80ºC. Os espectros do

AK padrão, em comparação com o pH 9 e 14 podem ser visualizados na figura 52;

os espectros do complexo AK/Al

, em pH 1, 11 e 14, estão apresentados na figura

53; a comparação entre o padrão de AK e os diferentes pH do complexo na figura 54

e a comparação entre o pH 14 da solução de AK puro e do complexo, na figura 55.

Os valores dos principais picos obtidos estão descritos na tabela 11.

Quando se compara o AK não complexado com a solução liofilizada pH 9 e

14 (figura 52) pode-se notar que a banda característica de OH próxima de 3200 cm

-1

diminui sensivelmente em pH 9 e em 14 ela volta a aumentar em intensidade e

também no intervalo de freqüências onde ela ocorre (alargamento). É possível que

no preparo da solução de pH 14 hidroxilas provenientes da base, e em excesso no

equilíbrio dado o alto valor de pH, tenham se incorporado à matriz no processo de

liofilização e também, que os compostos sejam mais higroscópicos. A banda

próxima de 3075 cm

-1

que poderia indicar ligação de hidrogênio intramolecular está

encoberta ou não existe. O estiramento da ligação =C-H em 3101 cm

-1

pode ser

observado em todos os espectros. Próximo a 1770 cm

-1

a banda de C=O em pH 9 e

14 não se caracterizam, enquanto a banda que pode ser de ligação –C=C- ou –C=C-

116

O- em 1700 cm

-1

parece estar sobreposta em pH 9 e mais intensa em 14, podendo

ser referente à estrutura de ressonância que desloca parte da carga dos oxigênios

para o anel. Em 1530 cm

-1

não é observado o pico no espectro do AK padrão, mas

essa banda aparece com grande intensidade nos espectros obtidos dos outros dois

pHs. As bandas referentes à flexão no plano de O-H, estiramento C-O, deformação

C-H e flexão no plano de C-O-H de enol em 1350 cm

-1

não aparecem em pH 9. O

estiramento C-C-C e flexão de C-C(=O)-C em 1284 cm

-1

permanece em pH 9 e se

desloca para 1300 cm

-1

em pH 14.

FIGURA 52 – ESPECTROS DE ABSORÇÃO DO AK PADRÃO E A PARTIR DE SOLUÇÕES pH 9 E

14 NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO

FONTE: O AUTOR (2009)

Na comparação entre os complexos AK:Al

nos pH 1, 11 e 14 (figura 53)

nota-se que de 2000 a 4000 cm

-1

há características semelhantes entre os espectros,

com alargamento de banda próximo de 3200 cm

-1

provavelmente pelo mesmo fato

ocorrido com as soluções do analito puro e por serem, essas amostras, muito

higroscópicas.

117

FIGURA 53 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO COMPLEXO AK / ALUMÍNIO A PARTIR DE

SOLUÇÕES NOS pH 1, 11 E 14 NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO

FONTE: O AUTOR (2009)

A comparação entre o AK não complexado com os complexos pode ser vista

na figura 54. De 2000 a 4000 cm

-1

não há grandes diferenças, apenas o alargamento

da banda próxima de 3200 cm

-1

em pH 11 e 14. Em 3075 a ligação de hidrogênio

intramolecular está presente em todos os espectros, exceção do pH 14, indicando

que possivelmente a hidroxila alcoólica pode estar próxima do oxigênio do anel,

justamente pela livre rotação do carbono sp

vizinho de livre rotação. Somente o

padrão apresenta banda de C=O próximo de 1750 cm

-1

, mas a de –C=C e –C=C-O-

próximo de 1700 cm

-1

está presente nos outros três valores. A ligação entre

alumínio e oxigênio se dá também próximo a 1750 cm

-1

e a banda ou está encoberta

ou não está presente. Os espectros entre 1600-1700 cm

-1

são muito semelhantes,

região que caracteriza principalmente as ligações do tipo –C=C- e –C=C-CO-. Entre

1600-1650 cm

-1

o número de bandas pode ser igual ao número de conjugações

presentes na molécula e apenas no pH 14 parece existir apenas uma banda,

enquanto que nos outros pH e no padrão há 2 bandas. Bandas em 1610 cm

-1

podem

caracterizar ligação entre carbono e oxigênio com ressonância da carga entre os

oxigênios e essa banda está presente no padrão, no complexo pH 1 e 11, mas

parece não estar presente no pH 14. Entre 1500-1600 em geral se dá a ligação entre

118

o grupo fenil e um metal e nesse caso o padrão e o complexo pH 1 têm picos

intensos de absorção em 1583 cm

-1

e pH 11 e 14 parecem ter, mas sobrepostos

enquanto que o pH 14 ainda tem em 1530 cm

-1

e o pH 11 parece estar sobreposto e

o padrão e pH 1 não têm. O espectro de infravermelho obtido por BHATIA et al

(1988) tem uma banda intensa em 1655 cm

-1

, o qual é assinalado à ligação C=0. Na

complexação, esta freqüência é reduzida cerca de 50 cm

-1

, indicando que o grupo

carbonila é quelado . A ligação C=C é deslocada de 1580 para 1560 cm

-1

complexo devido a formação de ligações de coordenação com o íon metálico

(BHATIA; KAUSHIK; SODHI, 1988).

Aparentemente nenhum deles apresenta banda de C=O próximo de 1750

, mas a de –C=C e –C=C-O- próximo de 1700 cm

-1

está presente nos três

valores. De acordo com o diagrama de especiação obtido com os dados da titulação

potenciométrica, os sólidos que potencialmente poderiam trazer mais informações

sobre o comportamento dos complexos no estado sólido, seriam entre pHs 6 e 10.

Porém, dificuldades operacionais não permitiram a realização dos ensaios até o

presente momento. Para maiores conclusões deste sistema por espectroscopia no

infravermelho, espectros desses complexos devem ser obtidos no futuro. Não foi

possível visualizar diferenças muito significativas e mais conclusivas no restante do

espectro pela intensidade e sobreposição de bandas nos pH 11 e 14 a não ser na

região de comprimentos de onda entre 1300 a 1420 cm

-1

. Nesta região, o espectro

do AK puro demonstra absorção referente às vibrações v(C-OH) e δ (OH) (se atribui

aos estiramentos simétricos do tipo tesoura e ―wagging‗), que desaparecem nos

complexos a pH 11 e AK hidrolisado pH 9. Esta modificação comprova que o

grupamento cabonil e o grupamento alfa-hidroxo estão ligados ao íon metálico

alumínio (MASOUD, 1989;FRANCO; MERCÊ, 2006)

119

FIGURA 54 – ESPECTROS DE ABSORÇÃO DO AK PADRÃO EM COMPARAÇÃO COM O

COMPLEXO AK / ALUMÍNIO A PARTIR DE SOLUÇÕES NOS pH 1, 11 E 14 NA REGIÃO DO

INFRAVERMELHO

FONTE: O AUTOR (2009)

Os espectros em pH 14 do analito não complexado e do complexo (figura 55)

são exatamente iguais em toda a faixa entre 400-4000 cm

-1

. A este valor de pH, o

comportamento dos complexos é imprevisível com esse íon metálico.

Os picos mais significativos e suas respectivas atribuições mais prováveis

podem ser visualizados na tabela 13.

FIGURA 55 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO ÁCIDO KOJIKO pH 14 EM COMPARAÇÃO COM O

COMPLEXO AK / ALUMÍNIO pH 14 NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO

FONTE: O AUTOR (2009)

120

TABELA 13 – PICOS MAIS SIGNIFICATIVOS E ATRIBUIÇÕES MAIS PROVÁVEIS NO ESPECTRO

DE INFRAVERMELHO DA VARIAÇÃO DE PH DO AK PURO E DO COMPLEXO AK/ALUMÍNIO

Ácido kójico

Ácido kójico 1 : 1 Alumínio

Atribuição

Padrão

14*

11*

14*

3273, F

3420, m

1290, F

3400, F,L

3180, F,L

3075

3295, F,L

3076

3400, F,L

O-H (CH

OH)

3175. F

3400, F,L

O-H fenol

OH (H-ligado)

1660, F

1685, f

1630, F

1710, F

1670, F

1630, F

1701, m

1658, F

1629, F

1699, m

1635, F

1703, F

1668, F

1635, F

C=0 str.

1630, F

1615, F

1583, F

865, F

1579, F

1585, F

1581, F

865, F

1585, F

1552, F

879, F

1585, F

1531, F

885, F

860, F

C=C

F: forte ; m: médio; f: fraco; L: largo

*em solução aquosa e, posteriormente, liofilizado

FONTE: O AUTOR (2009)

O espectro do AK não complexado em pH 9 parece não ter pico que

caracterize o estiramento da ligação C=C, o que poderia sugerir que neste pH o

caráter de dupla está enfraquecido. Em 1290 cm

-1

tem a banda de O-H de álcool

primário, mas a de fenol entre 1310-1410 cm

-1

não está bem caracterizado, da

mesma forma entre 3250-3500 cm

-1

. Em 1579 cm

-1

o pico pode corresponder à

ligação –C=C-CO-.

Em 1965, MURAKAMI e MERA, publicaram alguns estudos por infravermelho

do AK puro e quelado com os metais cobre (II), zinco (II), níquel (II) e cobalto (II).

Pelos picos de absorção desses quelatos observa-se que eles são praticamente

idênticos, com uma leve diferença para o cobre em relação aos outros três como

pode ser observado na tabela 14.

Tabela 14 – PICOS SIGNIFICANTES NO ESPECTRO NO INFRAVERMELHO DE ALGUNS

QUELATOS DE AK

Kojic acid

Cu (II) –kojate

Zn (II)-kojate

Ni (II)-kojate

Co (II)-kojate

Atribuição

3290 m

3175 m, b

3090 m

3085 m

3090 m

O-H (CH

OH)

3215 m,b

O-H fenol

2680 w

2760 w

2610 w, b

2440 w

2755 w

2590 w, b

2440 w

2760 w

2590 w, b

2450 w

OH (H-ligado)

1710 w

1668 s

1635 s

1634 s

1635 s

C=0

1640 s

1621 s

1591 s

865 s

1580 s

1535 s

895 m

876 w

867 m

1572 s

1540 s

905 m

1570 s

1540 s

905 m

1570 s

1550 s

905 m

C=C

s: forte ; m: medio; w: fraco; b:largo

FONTE: MURAKAMI; MERA, 1965

121

O comportamento espectral quase idêntico entre os quelatos de zinco, níquel

e cobalto sugerem que eles possuem ligações de coordenação de características

praticamente idênticas (MURAKAMI; MERA, 1965).

De acordo com os dados, o mesmo autor propõe estruturas de ressonância

para o AK puro (figura 56) e de coordenação com metais (figura 57). Os

deslocamentos de C=O e C=C para freqüências mais baixas parecem indicar que a

contribuição das estruturas de ressonância de II a IV, no qual o átomo de hidrogênio

é substituído por um íon metálico, se tornam maiores com a formação das ligações

de coordenação com o metal (MURAKAMI; MERA, 1965). Essas estruturas

propostas na literatura são coerentes com os dados espectrais obtidos neste

trabalho, tanto por titulação potenciométrica como por espectroscopia no

infravermelho.

FIGURA 56 – POSSÍVEIS ESTRUTURAS DE RESSONÂNCIA DO AK

FONTE: MURAKAMI; MERA, 1965

FIGURA 57 – POSSÍVEL ESTRUTURA DE RESSONÂNCIA DO AK COMPLEXADO

FONTE: MURAKAMI; MERA, 1965

122

5.4. 2 Ressonância magnética nuclear

Sob condições apropriadas uma amostra pode absorver radiação

eletromagnética na região de radiofreqüência em uma freqüência governada pelas

características estruturais da amostra. A absorção é função de determinados

núcleos da molécula (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRILL, 1979).

Para confirmar as coordenações e quais grupos químicos da molécula do AK

estariam envolvidos na complexação com o alumínio foram feitos ensaios de

ressonância magnética nuclear de

O primeiro experimento foi realizado com solução concentrada de AK puro

(7,5 mg/ mL) em meio aquoso, com pH iguais a 4, 7, 9 e 11 como pode ser

visualizado pela figura 58, exceto pH 9.

FIGURA 58 – ESPECTROS DE RMN E DADOS OBTIDOS EM pH 4, 7 E 11 DO ÁCIDO KÓJICO

NÃO COMPLEXADO

FONTE: O AUTOR (2009)

Os carbonos numerados como 3, 6 e 7 não sofreram deslocamento químico

significativo, somente os carbonos 2, 4 e 5 como estão representados nas tabelas

15 e 16.

123

TABELA 15 – VALORES DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DOS CARBONOS DO ÁCIDO

KÓJICO NÃO COMPLEXADO EM DIVERSOS pH

δ (ppm) (RMN

C) AK puro

168,2

110,3

176,4

144,4

141,8

59,6

167,8

110,4

177,5

146,1

142,0

60,0

165,3

110,0

181,2

152,0

142,2

60,2

164,9

109,8

182,0

153,6

142,2

60,2

166,0

109,2

181,6

153,0

141,9

60,2

Δ δ

-2,2

-0,5

+5,2

+8,6

+0,1

+0,6

FONTE: O AUTOR (2009)

TABELA 16 – COMPARAÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DOS CARBONOS DO AK PELA

VARIAÇÃO DE pH

δ (ppm) (RMN

C) AK puro

168,2

110,3

176,4

144,4

141,8

59,6

Δ δ 7

-0,4

-0,1

+1,1

+1,7

+0,2

+0,4

Δ δ 9

-2,9

-0,3

+4,8

+7,6

+0,4

+0,6

Δ δ 11

-3,3

-0,5

+5,6

+9,2

+0,4

+0,6

Δ δ 14

-2,2

-0,5

+5,2

+8,6

+0,1

+0,6

Δ δ

-2,2

-0,5

+5,2

+8,6

+0,1

+0,6

FONTE: O AUTOR (2009)

O carbono 2 sofreu um deslocamento químico para campo mais alto com um

Δ δ de -2,2, ou seja, com a variação de pH ele se protegeu mais. Isso se deve ao

fato de que provavelmente ele recebeu elétrons doados pelo grupo alquil ligado

diretamente a ele. Os carbonos 4 e 5 sofreram um deslocamento químico mais

intenso, principalmente o 5 que estava ligado diretamente á hidroxila enólica. Nota-

se que os deslocamentos nesses carbonos são crescentes e proporcionais, exceto

quando se considera o pH 14, com uma variação mais significativa na transição de

pH 7 para 9 que é a faixa em que se encontra o pKa do analito. O carbono 3

provavelmente sofreu dois β-shift, um de cada lado e por isso ficou praticamente

sem nenhum deslocamento evidente. A partir dos dados de RMN foi possível criar

uma hipótese de como estaria a molécula em pH ácido (figura 59 - A) e alcalino

(figura 57- B).

(A) (B)

FIGURA 59 – ESTRUTURAS HIPOTÉTICAS DA RESSONÂNCIA DO AK NA FORMA ÁCIDA (A) E

BÁSICA (B)

FONTE: O AUTOR (2010)

124

Da mesma forma foram realizados ensaios com a proporção AK 1:1 Al

, mas

apenas na faixa ácida (pH 2 e 4), uma vez que o alumínio precipita em pH básico,

como está representada através da tabela 17.

TABELA 17 - VALORES DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DOS CARBONOS DO ÁCIDO

KÓJICO COMPLEXADO COM ALUMÍNIO EM pH 2 e4

δ (ppm) (RMN

C) AK 1:1 Al

168,0

171.2

110,2

105.8

176,1

177.9

143,9

149.3

141,6

142.0

59,5

60.0

171.3

105.9

178.1

149.4

141.8

60.0

Δ δ

-0.1

-0.2

-0.1

+0.2

FONTE: O AUTOR (2009)

Observa-se que em pH 2 o analito não está totalmente na forma complexada

por apresentar dois grupos de valores significativos de deslocamentos para cada

carbono, sendo que um deles é praticamente coincidente ao valor obtido do AK

puro. Considerando apenas a variação do deslocamento químico dos complexos

não houve diferença significativa.

Quando se compara em um mesmo pH os deslocamentos químicos obtidos

do AK puro com a proporção AK 1:1 Al

percebe-se que há uma variação no

deslocamento mais evidentes nos carbonos 2, 3, 4 e 5 como está representada na

tabela 18.

TABELA 18 - COMPARAÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DOS CARBONOS DO AK

PURO E COMPLEXADO COM ALUMÍNIO EM pH 4

δ (ppm) (RMN

C) pH 4.0

AK puro

168.2

110.3

176.4

144.4

141.8

59.6

AK + Al

171.3

105.9

178.1

149.4

141.8

60.0

Δ δ

+3.1

-4.4

+1.7

+5.0

+0.4

FONTE: O AUTOR (2009)

O carbono 3 sofre um deslocamento para campo mais alto, protegendo-se

mais e isso pode ser devido ao fato de que houve um aumento do trânsito eletrônico.

Os carbonos 2, 4 e 5 sofreram deslocamento para campo mais baixo, e

desblindando mais. Para o carbono 2 pode ser que como ele tinha uma dupla

ligação e agora há uma divisão de carga a proteção eletrônica é menor. O carbono 4

sofreu o menor deslocamento dos três, mas deve ser porque deslocamento químico

de cetona já é alto e por isso não sofreria uma alta variação. O carbono 5 teve o

maior deslocamento, para campo mais baixo, desblindando-se, pois está ligado

125

diretamente ao oxigênio que fez a ligação com o metal e este por sua vez atrai mais

os elétrons para si, também fazendo com que houvesse menor carga eletrônica para

protegê-lo. Na figura 60 representa-se uma hipótese de uma das possíveis espécies

complexadas de AK com alumínio em pH 4 na proporção AK 1:1 Al

FIGURA 60 – ESTRUTURAS HIPOTÉTICAS DE UMA DAS REPRESENTAÇÕES DO AK

COMPLEXADO EM pH 4

FONTE: O AUTOR (2009)

Na especiação por ionização por eletrospray com íon trap e transformada de

Fourrier evidencia-se que o AK forma complexo com todos os metais 3

(exceto As

em que o sinal é provavelmente muito baixo). O complexo envolve um metal (M

dois íons de AK desprotonados (AK

) e uma molécula de AK (HKA) (STENSON;

CIOFFI, 2007).

Em um estudo realizado por KINGSBURY et al (1975) de ressonância

magnética nuclear para o AK e alguns derivados foram obtidos valores de

deslocamentos químicos muito próximos aos encontrados no presente trabalho

como pode ser visualizado na figura 61 e na tabela 19.

FIGURA 61 – ESTRUTURA QUÍMICA DO AK com OS ASSINALAMENTOS POR RMN

C EM

SO-d

FONTE: KINGSBURY et al (1975)

126

TABELA 19 – COMPARAÇÃO DOS DADOS DE ASSINALAMENTOS DOS CARBONOS DO AK POR

RMN

C - DADOS DA LITERATURA COM OS OBTIDOS NO PRESENTE TRABALHO

δ (ppm) (RMN

C) AK puro

KINGSBURY et al

(1975) (AK 17,0 mg/mL)

167,8

109,6

173,5

145,4

139,0

59,3

Presente Trabalho

(AK 7,5 mg/ mL)

168,2

110,3

176,4

144,4

141,8

59,6

FONTE: O AUTOR (2009)

Os valores são muito parecidos, entretanto os solventes utilizados foram

diferentes e talvez esse seja o motivo pelo qual os deslocamentos não são

exatamente iguais. O solvente utilizado neste trabalho foi água e água deuterada

10%, enquanto que o utilizado por KINGSBURY et al (1975) foi Me

SO-d

De acordo com JAIN; KAUSHIK (1997) pelos experimentos de ressonância

magnética nuclear de hidrogênio do AK pode-se verificar que na complexação o pico

correspondente à hidroxila fenólica desaparece e que o deslocamento para campo

mais baixo de dois hidrogênios são atribuídos ao envolvimento da carbonila do

carbono 4 e do grupo fenólico do carbono 5.

Todos os dados experimentais do presente trabalho confirmam que o AK

coordena o íon metálico alumínio, e que provavelmente essa complexação se dá

preferencialmente através o átomo de oxigênio do grupo –OH fenólico e a carbonila

do C-4, formando uma estrutura de um quelato com anel de 5 membros em valores

de pH entre 6 e 10, preferencialmente.

127

Conclusão

128

6. CONCLUSÃO

De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho foram obtidas as

seguintes conclusões:

- O método por UV desenvolvido, com base nas propriedades de

complexação do AK com cátions metálicos mostrou-se adequado para a

quantificação do AK na matéria-prima e nos cremes, mesmo quando em associação

com hidroquinona e na presença de conservantes.

- A reação de complexação AK-Al apresenta uma certa seletividade em

relação à ligação, e também permitiu tornar o método espectrofotométrico mais

seletivo, deslocando a banda de absorção máxima do AK puro de 269 nm para

305 nm quando complexado.

- A vantagem da utilização do metanol como solvente é o fato de permitir um

deslocamento da banda de absorção do complexo para comprimento de onda maior

(305 nm) do que aquele quando se utilizou água (298 nm). E também no caso do

produto contendo conservantes este facilita a eliminação do nipagin, pois o mesmo

fica insolúvel nesse meio, podendo ser facilmente separado por filtração.

- O pH é uma propriedade que deve ser levado em consideração nas

condições de execução do método, e não deve ser maior que 3, pois em valores

superiores ocorre turvação.

- O método desenvolvido atendeu os limites estabelecidos para os parâmetros

de validação linearidade (r> 0,999 na faixa de 5-50 μg/mL), exatidão (recuperação

próxima de 100%), precisão (DPR de 0,402%, 1,284 e 1,192 para 10, 15 e 20 μg/mL

na repetitividade; DPR de 2,171, 0,976 e 0,439 10, 15 e 20 μg/mL na precisão

intermediária) e robustez (pH, tempo de leitura e temperatura) conforme normas

nacionais e internacionais;

- Por este método, uma vez desenvolvido e validado, obteve-se respostas

satisfatórias nas análises de quantificação do AK em produtos feitos à base de

creme não iônico e creme lanette, mostrando-se apto para ser usado na rotina

laboratorial para este tipo de análise.

- As principais vantagens do método, em relação aos métodos já descritos na

literatura, é ser de baixo custo, requerer reagentes e equipamentos acessíveis e

simples, é de fácil execução e rápido.

129

- A comparação de espectros no IV do AK puro e do complexo AK-íon

metálico, em diferentes valores de pH, foi um recurso que permitiu correlacionar as

modificações na absorção do grupamento enólico e carbonílico complexados.

- Pela análise dos espectros de RMN

C, através dos deslocamentos

químicos de, principalmente C-5, pode-se inferir que a complexação sugerida pelos

dados da titulação potenciométrica e da espectroscopia no infravermelho, estão de

acordo com os deslocamentos químicos observados nos espectros de RMN obtidos.

- Pelos dados de especiação por titulação potenciométrica verificou-se que o

ácido kójico complexa o íon alumínio de diferentes maneiras: dependendo da

proporção molar em que eles se encontram e da faixa de pH, os complexos obtidos

são bem diversos. Dois modelos se ajustaram perfeitamente, ou seja, a curva

experimental coincidiu igualmente com a curva da simulação matemática: o primeiro

com o ácido kójico perdendo um próton da hidroxila do C-5. No segundo modelo

matemático, o AK ainda poderia perder um segundo próton, do OH alcoólico do C-7.

Esse modelo matemático mostrou-se incoerente com os fatos e hipóteses químicas,

tendo sido descartado após análise dos resultados das técnicas analíticas

empregadas e de resultados publicados na literatura.

130

Referências Bibliográficas

131

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