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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
KATRINE BEZERRA CAVALCANTI
RESPOSTA IMUNE À SALIVA DE FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA:
PSYCHODIDAE) EM INDIVÍDUOS RESIDENTES EM ÁREAS URBANA E
PERIURBANA NO NORDESTE DO BRASIL
NATAL
2009
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KATRINE BEZERRA CAVALCANTI
RESPOSTA IMUNE À SALIVA DE FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA: PSYCHODIDAE)
EM INDIVÍDUOS RESIDENTES EM ÁREAS URBANA E PERIURBANA NO
NORDESTE DO BRASIL
Dissertação apresentada ao Departamento de
Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Bioquímica.
Orientadora: Profª. Drª Maria de Fátima Freire de
Melo Ximenes
NATAL
2009
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Ao meu avô materno, João Batista
Bezerra (in memorian), que apesar de sua
pouca instrução sempre me incentivou
nos estudos e na vida. Muito do que tornei
hoje devo a ele.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, a Deus por tantas vezes ter sido a força que me
impulsionou a seguir adiante, por me ter feito acreditar que meu esforço teria
recompensa e por, me ajudar a levantar após cada queda. Agradeço também, pelos
meus fracassos, pois serviram de aprendizado inigualável, pelas minhas vitórias que
me encorajaram no meu trabalho e por todas as entrelinhas que vieram a me
preencher durante todo esse tempo. Agradeço principalmente pela minha vida!
Agradeço aos meus pais, Luiz Inaldo Cavalcanti e Maria de Fátima Bezerra
Cavalcanti, por, apesar de tudo, me apoiarem, incentivarem, ajudarem com seus
esforços nas tão cansativas capturas de insetos, e por tudo o que me ensinaram,
mesmo sem palavras. Devo a vocês a minha mais sincera gratidão.
Ao meu irmão, Luiz Inaldo Cavalcanti Júnior, apesar de todas as
desavenças, é um pedaço enorme de mi, com quem eu aprendo todos os dias que o
tempo e a paciência são imensos aliados com os quais podemos contar.
À minha querida orientadora, Maria de Fátima Ximenes, que por muitas
vezes se tornou bem mais que isso. Uma pessoa que há dois anos atrás acolheu
uma desconhecida para uma missão tão difícil: orientação de mestrado em
bioquímica, mais que mesmo assim aceitou com muita fé e carinho. Nem tenho
palavras para descrever o quão grata sou por aquele “sim”, pela paciência, pelo
carinho e pela credibilidade.
Ao meu namorado, Vitor Guimarães Pipolo, por nunca ter me deixado
desistir, pela imensa ajuda e compreensão, por ter acreditado em mim quando nem
eu mesma mais acreditava.
À minha segunda orientadora, Selma Maria Jerônimo, um exemplo de
dedicação, esforço e trabalho. Muito obrigada por confiar em mim e no meu trabalho,
por custear parte dos meus experimentos e por ajudar a esclarecer aquelas dúvidas
mais persistentes.
À minha turma de mestrado, Jailma, Cleysyvan, Leandro, Sheyla e Lígia,
pois mesmo não sendo uma turma muito grande, foi sem dúvida uma turma
maravilhosa, aclamada por todos os professores do departamento e com os quais,
sem dúvidas, pude amadurecer de forma inimaginável. Obrigada por entenderem
todas as minhas lágrimas.
À todos que fazem o Laboratório de Entomologia Médica, Gláucia, Vanessa,
Rodrigo, Hilário, Thiago e Eliúde, por darem movimento e descontração aos meus
dias.
À todos do Laboratório de Entomologia 01, Bianca, Lucas, Guido, Isabel,
Leandro pela companhia indispensável nos momentos de trabalho.
À Edson Santana pelo disponibilidade e presteza para realização das
coletas.
À Kathiane amiga de graduação, de trabalhos intermináveis, de momentos
desesperadores e outros alegres.
À todos que fazem o Laboratório de Imunogenética, Núbia, Virgínia, Glória,
Daniella, Williane, Marcus, Leonardo, Sérgio, Isabela, João Neto, Thiaguinho,
Cristina, James, Michelli, Manuela, Jethe, Carlos Maia, pela prestatividade.
Aos meus amigos do Departamento de Fisiologia, Luis Wagner (Lula), Nívia,
Fívia, Fábio Caixeta, André Pontes, Dina Lilian pela alegria e positividade durante
esse tempo.
Às minhas amigas do colegial, Ranaíze, Juliana, Karla Celi, Lorena Costa,
Ananda, Mariana, Paula, Larissa e Tatiana (clube das luluzinhas) pela alegria e
companhia sempre constantes.
Aos meus queridos primos Alice, Ediely, Edilaine, Wanessa, Luciana,
Júnior, Rodrigo, Leandro, Edson Júnior, Josinaldo, Rosário, e à toda família
Cavalcanti por serem parte de mim e da minha vida.
À família Bezerra, minha avó Maria Natália da Neves Bezerra, minhas tias e
tios, todos os meus amáveis primos por nunca me deixarem sucumbir aos apertos
da vida.
Aos meus vizinhos, Laerte Bruno e sua mãe Débora Maria por sempre
apresentarem um sorriso aberto e gestos de carinho.
À todos os funcionários do Centro Clínico da Ribeira José Carlos Passos
pelas amostras de sangue doadas.
À Secretaria de Saúde de São Gonçalo do Amarante, na pessoa de Geane
Benedito da Silva pela ajuda no fornecimento de flebotomíneos para a pesquisa.
Às minhas amigas do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais,
Vivivane, Mariana, Joana, Eutália, Micheli, Nayana, Kely pelos momentos de
descontração e por todos os ensinamentos que ficarão guardados por toda a minha
vida.
Não vai demorar que passemos adiante
uma grande e bela ciência, que faz arte
em defesa da vida.
(Carlos Chagas)
RESUMO
A Leishmaniose visceral (LV) tem vasta distribuição geográficas nas áreas
tropicais e subtropicais do planeta, cujo parasito é um protozoário do gênero
Leishmania. Esse patógeno é transmitido aos hospedeiros através da picada do
flebotomíneo, juntamente com sua saliva, o que leva resposta imunológica a ambos.
No estado do Rio Grande do Norte, 85% da fauna flebotomínica capturada
corresponde a Lutzomyia longipalpis, porém o segundo mais abundante, Lutzomyia
evandroi, vem merecendo destaque devido ao seu comportamento eclético e ampla
distribuição. A exposição de pessoas residentes em área endêmica para a LV ao
inseto vetor aumenta grandemente as chances de infecção. O presente trabalho
teve como objetivo avaliar aspectos do perfil epidemiológico de LV de área
endêmica e não endêmica na Região Metropolitana de Natal, assim como verificar a
abundância e flutuação sazonal de espécies de flebotomíneos em dois municípios
endêmicos para a LV. Foram realizadas coletas nos municípios de Nísia Floresta,
Parnamirim, São Gonçalo do Amarante e Macaíba, dos quais foram separados
grupos de fêmeas para posterior dissecação das glândulas salivares e identificação
das espécies. As amostras de sangue utilizadas foram provenientes de indivíduos de
dois bairros de Natal onde nunca fora relatado casos de LV e de bairros de
Parnamirim que apresentam casos recorrentes de LV. No município de Nísia
Floresta, a espécie mais abundante foi L. evandroi com 38,39%, seguida de L.
longipalpis com 36,22%, L. walkeri 19,67%, L. lenti 3,81%, L. wellcomei 1,39% e L.
whitmani 0,52%. Já em Parnamirim, as proporções foram L. walkeri com 73,15%, L.
evandroi com 10,55%, L. wellcomei 7,63%, L. longipalpis 6,37%, L. whitmani 1,46%,
L. sordellii 0,52%, L. intermedia 0,21 e L. shanonni 0,1%. Em ambos municípios foi
observado maior abundância de espécies distribuídos nos meses inicias do ano,
como Fevereiro e Março. O estudo mostrou que não há diferença na exposição ao
vetor da LV entre indivíduos de área endêmica e não endêmica para essa
enfermidade. Porém há diferença na exposição de indivíduos entre L. longipalpis e
L. evandroi, confirmando a grandiosa competência vetorial do primeiro. Também foi
possível caracterizar como fenótipo mais predominante na população de área
endêmica aqueles que apresentavam respostas sorológicas negativas para
antígenos de Leishmania e resultado negativo no teste cutâneo de Montenegro
(DTH), indicando que boa parte da população está sendo picada por insetos não
infectados.
Palavras-chave: Flebotomíneos. Lutzomyia. Saliva. Calazar. Resposta Imune.
Leishmania.
ABSTRACT
Visceral leishmaniasis (VL) has a wide geographical distribution in tropical and
subtropical areas of the planet, which is a protozoan parasite of the genus
Leishmania. This pathogen is transmitted to the host through the sandflies bite, with
its saliva, the immune response that leads to both. In the state of Rio Grande do
Norte, 85% of the sand flies captured is Lutzomyia longipalpis, but the second most
abundant, Lutzomyia evandroi, it deserves emphasis because its wide distribution
and eclectic behavior. The exposure of people living in endemic areas for the insect
vector VL greatly increases the chances of infection. This study aimed to evaluate
aspects of the epidemiological profile of VL in endemic areas of human and non-
endemic in the metropolitan area of Natal, as well as verify the abundance and
seasonal fluctuations of sandflies species in two counties endemic for VL. Were
collected in the municipalities of Nísia Floresta, Parnamirim, São Gonçalo do
Amarante and Macaíba, of which groups of females were separated for further
dissection of the salivary glands and identification of species. The blood samples
used were from individuals of two Natal’s districts where it has never been reported
cases of VL and neighborhoods of Parnamirim applicants who present cases of VL.
In the municipality of Nísia Floresta, the most abundant species was L. evandroi with
38.39%, followed by L. longipalpis with 36.22%, L. walkeri 19.67% L. lenti 3.81%, L.
wellcomei 1.39% and L. whitmani 0.52%. Already in Parnamirim the proportions were
L. walkeri with 73.15%, L. evandroi with 10.55%, L. wellcomei 7.63%, L. longipalpis
6.37%, L. whitmani 1.46%, L. sordellii 0.52%, L. intermedia 0.21 and L. shanonni
0.1%. In both municipalities was observed higher abundance of species distributed in
the initial months of the year, as February and March. The study showed that no
difference in exposure to the vector of VL among individuals from endemic and non
endemic area for this disease. But there are differences in exposure between
individuals of L. longipalpis and L. evandroi, confirming the great powers of the first
vector. It was also characterized as predominant phenotype in the population of
endemic areas who had negative serologic responses to antigens of Leishmania and
result in negative Montenegro skin test (DTH), indicating that much of the population
hasn’t been bitten by infected insects.
Keywords: Sandflies. Lutzomyia. Saliva. Calazar. Immune response. Leishmania.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
Formas promastigotas de Leishmania..............................................
15
Figura 2
Formas amastigotas de Leishmania infectando macrófago.............
16
Figura 3
Ciclo biológico de Leishmania..........................................................
17
Figura 4 Distribuição de LV no mundo............................................................
18
Figura 5 Distribuição de casos autóctones de Leishmaniose Viscera
l............
20
Figura 6
Padrão de respostas de células T auxiliares....................................
23
Figura 7 Fêmea de flebotomíneo....................................................................
26
Figura 8 Macho e fêmea de flebotomíneo......................................................
26
Figura 9 Efeitos da saliva de flebotomíneos no hospedeiro vertebrado.........
29
Quadro 1 Atividades vasodilatadoras e imunomodulatórias salivares de
flebotomíneos
32
Figura 10 Região Metropolitana de Natal/RN................................................... 34
Figura 11 Local de coleta de flebotomíneos em ambiente peridomicilar.......... 35
Figura 12 Dissecação de glândulas salivares e obtenção de homogenado
salivar de flebotomíneos em laboratório...........................................
36
Figura 13 Antígenos e soros utilizados nos testes ELISA anti-homogenado
salivar de flebotomíneos...................................................................
38
Figura 14 Antígenos e soros utilizados nos testes ELISA anti-
Leishmania........................................................................................
39
Figura 15 Teste cutâneo de hipersensibilidade tardia (DTH), usando como
antígeno L. chagasi...........................................................................
40
Gráfico 1 Abundância de flebotomíneos de acordo com os meses e a
precipitação pluviométrica..............................................................
42
Gráfico 2
Flutuação sazonal de L. longipalpis e L. evandroi em Nísia
Floresta..............................................................................................
43
Gráfico 3 Resultados dos testes ELISA realizados com soros humanos de
área endêmica com antígeno salivar de L. longipalpis.....................
44
Gráfico 4 Resultados dos testes ELISA realizados com soros humanos de
área não endêmica com antígeno salivar de L. longipalpis..............
44
Gráfico 5 Comparação dos resultados dos testes ELISA com soros
humanos de área endêmica e não endêmica com antígeno salivar
de L. longipalpis................................................................................
44
Gráfico 6 Resultados dos testes ELISA realizados com soros humanos de
área endêmica com antígeno salivar de L.
evandroi.............................................................................................
45
Gráfico 7 Resultados dos testes ELISA realizados com soros humanos de
área não endêmica com antígeno salivar de L.
evandroi...........................................................
45
Gráfico 8 Comparação dos resultados dos testes ELISA com soros
humanos de área endêmica e não endêmica entre saliva de L.
longipalpis e L. evandroi....................................................................
46
Gráfico 9
Resultado de testes ELISA anti-saliva de L. longipalpis em
indivíduos DTH positivos (DTH+) e que apresentam sorologia à
Leishmania positiva (S+)...................................................................
47
Gráfico 10
Resultados de testes ELISA anti-saliva de L. longipalpis em
indivíduos DTH negativos (DTH-) e que apresentam sorologia à
Leishmania positiva (S+)...................................................................
48
Gráfico 11
Resultados de testes ELISA anti-saliva de L. longipalpis em
indivíduos DTH positivos (DTH+) e que apresentam sorologia à
Leishmania negativa (S-)..................................................................
48
Gráfico 12
Resultados de testes ELISA anti-saliva de L. longipalpis em
indivíduos DTH negativos (DTH-) e que apresentam sorologia à
Leishmania negativa (S-)..................................................................
48
LISTA DE TABELA
Tabela 1 Ocorrência de flebotomíneos por espécie coletados no município de
Nísia Floresta...............................................................................................
41
Tabela 2 Ocorrência de flebotomíneos por espécie coletados no município de
Parnamirim
....................................................................................………....
43
LISTA DE ABREVIATURAS/ SIGLAS
ABTS Azino-di-(ácido sulfônico 3-etilbenzotiazolino)
AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome
CDC CDC Control Center Disease
DTH DTH Delayed Type Hipersensitivity
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
IgG Imunoglobulina G
IL-1 Interleucina – 1 2
IL-2 Interleucina – 2
IL-4 Interleucina – 4
IL-5 Interleucina – 5
IL-6 Interleucina – 6
IL-10 Interleucina – 10
IL-12 Interleucina - 12
IL-17 Interleucina - 17
IL-22 Interleucina - 22
INF-γ Interferon – gama
LPG Lipophosphoglycan
LV Leishmaniose visceral
MAX Maxidilan
NO Nitric oxide
PBS Tampão salina fosfatada
PGE
2
Prostaglandina E
2
PMSF Phenylmethanesulphonylfluoride
RNAm RNA mensageiro
TGF-β Transforming growth factor - beta
Th1
Subpopulação de células T helper 1
Th17
Subpopulação de células T helper 17
Th2
Subpopulação de células T helper 2
TNF-α Tumor necrosis factor - alpha
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO………………………………………………………………….. 15
1.1
ASPECTOS GERAIS................................................................................... 15
1.2
EPIDEMIOLOGIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA............. 18
1.3
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS.................................................................... 21
1.4
RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS DO HOSPEDEIRO À LEISHMANIA........ 22
1.5
FLEBOTOMÍNEOS LUTZOMYIA LONGIPALPIS E LUTZOMYIA
EVANDROI..................................................................................................
25
1.6
RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS DO HOSPEDEIRO AO VETOR............... 27
2 OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS..................................................... 33
2.1
OBJETIVO GERAL...................................................................................... 33
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................... 33
3 METODOLOGIA.......................................................................................... 34
3.1
ÁREA DE ESTUDO..................................................................................... 34
3.2
FLEBOTOMÍNEOS...................................................................................... 35
3.3
DISSECAÇÃO DE GLÂNDULAS SALIVARES........................................... 36
3.4
COMITÊ DE ÉTICA..................................................................................... 36
3.5
SOROS HUMANOS.................................................................................... 37
3.6
TESTE SOROLÓGICO ANTI-HOMOGENADO SALIVAR DE
FLEBOTOMÍNEOS......................................................................................
37
3.7
TESTE SOROLÓGICO ANTI LEISHMANIA................................................ 39
3.8
TESTE CUTÂNEO DE HIPERSENSIBILIDADE TARDIA (DTH)................ 40
3.9
ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................. 40
4 RESULTADOS............................................................................................ 41
4.1
ABUNDÂNCIA E FLUTUAÇÃO SAZONAL DAS ESPÉCIES DE
FLEBOTOMÍNEOS EM NÍSIA FLORESTA.................................................
41
4.2
TESTES SOROLÓGICOS ANTISSALIVA DE FLEBOTOMÍNEOS............. 42
4.3
TESTES SOROLÓGICOS PARA DETECÇÃO DE ANTÍGENOS DE
LEISHMANIA
.....................................................................................................................................
46
4.4
TESTE CUTÂNEO DE HIPERSENSIBILIDADE TARDIA (DTH)................ 46
5 DISCUSSÃO............................................................................................... 49
6 CONCLUSÕES........................................................................................... 53
REFERÊNCIAS........................................................................................... 54
15
Katrine Bezerra Cavalcanti
1 INTRODUÇÃO
1.1 ASPECTOS GERAIS
As Leishmanioses representam uma das mais prevalentes doenças humanas
transmitidas por insetos (ROHOUSAVA et al., 2005), as quais ocorrem em 88 países
em quatro continentes. São doenças caracterizadas por sinais clínicos e espectros
sintomatológicos que vão desde lesões cutâneas a enfermidades viscerais (VOLF et
al., 2008). Tratam-se de zoonoses que resultam do parasitismo de hospedeiros
vertebrados por protozoários do gênero Leishmania, cujo vetor é a fêmea de um
díptero, mais conhecido como flebotomíneo (SHAW; LAINSON, 1987). O gênero
Leishmania compreende um crescente número de espécies, em torno de 30, das
quais aproximadamente 20 são patogênicas para humanos (ASHFORD, 2000).
A espécie Leishmania chagasi, foco da atenção no presente estudo, é um
protozoário, pertencente à ordem Kinetoplastida, à família Trypanossomatidae
(LEISHMAN, 1994). O protozoário apresenta duas formas básicas: uma flagelada ou
promastigota (figura 1), extracelular, que pode ser encontrada livre no tubo digestivo
do inseto vetor ou aderida às microvilosidades da cutícula intestinal e em cultura
(KILLICK-KENDRICK, 1990a; WALTERS et al, 1989); e outra aflagelada ou
amastigota (figura 2), como é visto nos tecidos dos hospedeiros vertebrados
(homem e outros animais superiores) intracelular obrigatória.
Figura 1: Formas prosmatigotas de Leishmania (1000x)
16
Katrine Bezerra Cavalcanti
Figura 2: Formas amastigotas de Leishmaniainfectando macrófago (1000x)
A principal forma de transmissão parasitária para o homem e outros
hospedeiros mamíferos é através da picada de flebotomíneos fêmeas (SCOTT;
FARRELL, 1998). O ciclo do parasita da leishmaniose inicia-se com o repasto
sanguíneo do flebotomíneo que, ao picar um animal infectado, ingere, juntamente
com o sangue, as formas amastigotas do protozoário (figura 3). Estas atingem o
intestino anterior do inseto, desenvolvendo uma série de modificações morfológicas,
bioquímicas e funcionais (KILLICK-KENDRICK 1990a; WALTERS et al, 1989)
necessárias para sua sobrevivência dentro do hospedeiro e para o desenvolvimento
da infecção (SACKS, 1989). Uma vez no interior do trato digestivo do vetor, o
parasito assume sua forma promastigota, diferenciando-se em promastigota
procíclica, estágio que evita sua expulsão do intestino médio do flebotomíneo.
Posteriormente, a leishmania assume sua forma promastigota metacíclica infectante,
fase na qual migra para as peças bucais do invertebrado. Após alguns dias, o inseto,
ao exercer novamente a hematofagia, inocula as formas promastigotas na pele do
hospedeiro. Essas formas, ao penetrarem nas células do sistema fagocítico
mononuclear local, transformam-se em amastigotas, e por divisão longitudinal
binária, multiplicam-se intensamente (MELBY et al., 1998). O hospedeiro infectado
desenvolve as formas amastigotas dentro de seus macrófagos, o que pode levar aos
sintomas da doença ou servir de reservatório para um próximo flebotomíneo reiniciar
o ciclo parasitário.
17
Katrine Bezerra Cavalcanti
Figura 3: Ciclo biológico de Leishmania. (A) Desenvolvimento no homem: 1 Parasitas de
Leishmania transportados por espécies de flebotomíneos (estágio promastigota) adentram
nos macrófagos através da picada do inseto; 2 – 6 Desenvolvimento intracelular nos
macrófagos e posteriormente em células endoteliais; 7 Macrófagos infectados presentes no
sangue periférico contendo formas amastigotas. (B) Desenvolvimento no flebotomíneo vetor:
8 Formas amastigotas dentro de células do hospedeiro ingeridas pelo flebotomíneo; 9
Crescimento e multiplicação de formas promastigotas no intestino do inseto; 10 Estágio
flagelado (forma promastigota metacíclica) na probóscide do inseto. (C) Desenvolvimento
como no homem (A) em animais reservatórios (como cães, pequenos roedores etc).
Fonte: Adaptado de Mencke et al. (2003).
18
Katrine Bezerra Cavalcanti
A Leishmania chagasi, um membro do complexo Leishmania donovani, é
frequentemente atribuída como o agente etiológico da Leishmaniose visceral nas
Américas (CUNHA; CHAGAS, 1937). As outras duas espécies desse complexo (L.
infantum e L. donovani) estão presentes apenas no Velho Mundo. Estudos
anteriores usando métodos genéticos e enzimáticos indicaram que amostras
identificadas como L. infantum e L. chagasi são muito proximamente relacionadas
(RIOUX et al., 1990; CUPOLILLO et al., 1994; MOMEN, 1987; GRIMALDI; TESH,
1993) de forma que amostras de L. chagasi não poderiam ser diferenciadas de L.
infantum, indicando uma recente separação geográfica.
1.2 EPIDEMIOLOGIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL
Apesar de ser considerada uma das doenças mais negligenciadas do mundo
(YAMEY; TORREELE, 2002), a Leishmaniose Visceral (LV) tem vasta distribuição
geográfica na maioria das áreas tropicais e subtropicais do globo terrestre,
estendendo-se pelas Américas do Sul e Central, Europa, África, Ásia e Oriente
Médio (figura 4). Trata-se de uma séria e crônica enfermidade, cuja letalidade pode
alcançar 100% caso o tratamento adequado não seja instituído (CAMARGO;
LANGONI, 2006). Estima-se sua incidência anual em cerca de 500.000 novos casos
humanos com taxa de mortalidade de 80.000 casos por ano (WHO 2000).
Figura 4
(Fonte: WHO/CTD)
Figura 4: Distribuição de LV no mundo, 2001
19
Katrine Bezerra Cavalcanti
A LV foi primariamente caracterizada como uma doença de caráter
eminentemente rural, mas, recentemente, vem se expandindo para áreas urbanas
de grande e médio porte e se tornou um crescente problema de saúde pública no
país, como uma endemia em franca expansão geográfica (BRASIL, 2005). De
acordo com a Organização Mundial de Saúde, em 2002, o surgimento de novos
casos deveu-se principalmente a alterações ambientais e a fatores de risco
individuais, como AIDS, co-infecções, entre outros (BRASIL, 2002). Drásticas
mudanças no meio ambiente causadas pela ação antrópica vem provocando
alterações na distribuição de algumas espécies de flebotomíneos, assim como na
epidemiologia das leishmanioses. Contínuos desmatamentos, expansão de
fronteiras agrícolas, extrativismo, colônias rurais, represas e usinas hidrelétricas são
alguns fatores que podem contribuir positivamente para novos surtos. Da mesma
forma, os graduais e constantes fluxos migratórios para áreas urbanas têm
constituído uma vertente socioeconômica, contribuindo para o agravamento do
quadro atual (RANGEL; VILELA, 2008).
Popularmente conhecida como calazar, a LV é causada por espécimes
pertencentes ao complexo Leishmania donovani (LAINSON; SHAWN, 1987), sendo
o principal agente etiológico nas Américas identificado como Leishmania chagasi.
Sua ocorrência depende, basicamente, da presença de hospedeiros susceptíveis,
assim como de reservatórios igualmente susceptíveis (MAURÍCIO et al., 2000). Os
principais hospedeiros silvestres de L. chagasi são raposas e marsupiais, enquanto
que no ambiente doméstico os cães são considerados os mais importantes
hospedeiros reservatórios e fonte de infecção, tornando-os um alvo para estratégias
de controle (GONTIJO; MELO, 2004).
No Brasil, a doença emergiu como um importante problema de saúde em
áreas metropolitanas já no início dos anos 80 (COSTA et al., 1990; JERONIMO et
al., 1994), sendo cerca de 5 a 10 mil indivíduos atingidos em todo o país
anualmente, dos quais cerca de 10% não sobrevivem, quando não instituído o
tratamento adequado (SABROZA, 2006). De acordo com a Secretaria de Vigilância
Sanitária, mais de 70% dos casos ainda se concentram no Nordeste (figura 5), o que
vem merecendo destaque em âmbito nacional (GONTIJO; MELO, 2004).
20
Katrine Bezerra Cavalcanti
Figura 5: Distribuição de casos autóctones de Leishmaniose Visceral, segundo município,
Brasil 2002
Fonte: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_leish_visceral2006.pdf
O primeiro caso de leishmaniose visceral no Estado do Rio Grande do Norte
foi relatado em 1934, baseado na autópsia de pacientes mortos com diagnóstico de
febre amarela (PENNA, 1934). Dos 162 municípios do Estado, foram relatados
casos de leishmaniose visceral em 106, entre 1986 e 1997 (XIMENES et al., 2007).
O primeiro surto urbano de LV no estado ocorreu entre os anos de 1990-1992
(JERONIMO et al., 1994). Mais recentemente, os casos de LV têm ocorrido nos
subúrbios de Natal, a capital do estado, na qual o aumento da população nas
periferias está associado com os altos índices de casos da doença (XIMENES, et al.,
2000). Embora seja tipicamente rural, a doença pode ser adquirida em vilas ou em
subúrbios de grandes cidades, onde as condições ambientais são apropriadas para
o desenvolvimento do vetor. A doença apresenta uma maior prevalência em
crianças com idade inferior a 10 anos, atingindo uma taxa de mortalidade entre 5 a
10% (JERONIMO et al., 2004; XIMENES et al., 2007).
As alterações parasitárias e imunológicas geram uma série de repercussões
devido ao aumento no número e no volume de macrófagos infectados, dentre as
quais: rompimento das células parasitadas, hepatoesplenomegalia, hepatomegalia,
anemia e disfunção de plaquetas (LOCKSLEY; SCOTT, 1991; MILON et al., 1995).
A LV pode ser fatal, quando não tratada, e epidêmica com alta taxa de letalidade
(BRASIL, 2002).
21
Katrine Bezerra Cavalcanti
1.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
A LV possui como agente etiológico a Leishmania chagasi, que juntamente
com outras duas espécies, a Leishmania donovani e Leishmania infantum,
constituem o complexo Leishmania donovani. As manifestações clínicas da
leishmaniose visceral refletem o equilíbrio entre a multiplicação dos parasitos nas
células do sistema fagocítico mononuclear, a resposta imune do indivíduo e as
alterações degenerativas resultantes desse processo. Desse modo, observa-se que
muitos dos indivíduos infectados apresentam forma inaparente ou oligossintomática
da doença, e que o número de casos graves ou com o cortejo de sintomatologia
manifesta é relativamente pequeno em relação ao de infectados (PEARSON;
SOUSA ,1996).
O calazar é às vezes precedido por uma lesão ulcerativa seca no local da
picada do inseto vetor. Dentre os sinais sistêmicos clássicos pode-se destacar febre,
mal-estar, perda de peso, pirexia intermitente, anemia, esplenomegalia,
hepatomegalia, e progressiva caquexia, os quais se desenvolvem entre semanas a
anos seguintes à infecção. Sinais menos constantes incluem linfadenopatia e
diarréia persistente (ASFORD, 2000). Pacientes na Índia frequentemente
desenvolvem hiperpigmentação (o que deu origem ao nome kala-azar, que significa
“febre negra”). Ocasionalmente, pode aparecer icterícia. Em estágios mais
avançados da doença, os pacientes podem desenvolver epistasia, sangramento
gengival ou petéquia, bem como edema e ascite secundária à hipoalbuminemia. A
severa caquexia observada parece ser ocasionada pela secreção de TNF ou outra
citocina, como a IL-1 (MANTOVANI et al. 1998). Sarampo, diarréia, pneumonia
bacteriana, tuberculose e outras infecções secundárias são comuns nos estágios
mais crônicos, o que frequentemente contribui para as altas taxas de mortalidade da
doença (PEARSON; SOUSA, 1996). Essa enfermidade pode se desenvolver até a
morte do indivíduo, visto o fato da mesma culminar em estado clínico
imunossupressor do paciente.
22
Katrine Bezerra Cavalcanti
1.4 RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS DO HOSPEDEIRO À LEISHMANIA
Em condições normais, várias células fagocíticas englobam os patógenos,
mas, como as leishmanias se multiplicam rapidamente e a membrana das formas
amastigotas resiste à ação destruidora dos macrófagos, os parasitos rompem a
célula antes que a mesma o destrua (ILGOUTZ; MCCONVILLE, 2001).
A ocorrência da doença em uma determinada área depende basicamente da
presença do vetor e do hospedeiro/reservatório susceptível (GONTIJO; MELO
2004), o que está diretamente ligado à virulência da cepa, do número de formas
infectantes inoculadas e da resistência do hospedeiro (TITUS et al., 2006). Logo,
evidências sugerem que vários fatores podem afetar o processo de infecção por
Leishmania, como: a presença de determinadas citocinas no meio durante os
eventos iniciais da diferenciação celular bem como os mecanismos sinalizadores
diferenciais usados pelas subclasses de células T auxiliares. Essa variação no
padrão de resposta imunológica tem sido constatada nas diferentes formas clínicas,
resultando na existência de formas polares da doença (BOGDAN et al., 1990).
As formas amastigotas da Leishmania são parasitas intracelulares
obrigatórios, vivendo dentro de vacúolos lisossomais das células fagocíticas de
hospedeiros vertebrados, como monócitos e macrófagos. Elas se multiplicam dentro
de macrófagos, mas são mortas pelos mesmos estimulados por INF-γ ou pelo
contato direto com células T auxiliares
(PEARSON; SOUSA, 1996).
As células envolvidas na resposta imune celular têm um papel central na
evolução do hospedeiro frente à infecção por Leishmania (SOLBACH; LASKAY,
2000). Estudos experimentais em murinos com o protozoário intracelular Le. major
tem fornecido um valioso modelo de respostas de células T auxiliares visto que
raças resistentes de camundongos desenvolvem uma resposta Th1, secretoras de
INF-γ e IL-12, enquanto que outras raças desenvolvem lesões sem cura associadas
com uma resposta Th2, que secretam IL-4, IL-5 mas não INF-γ (HEINZEL et al.,
1989; MOSMANN et al., 1986; REINER; LOCKSLEY, 1995; SCOTT; FARRELL,
1998). Os camundongos da maioria das raças resistentes, como C3H/He, CBA,
C57BL/6, 129Sv/Ev, desenvolvem uma lesão cutânea local com espontânea
23
Katrine Bezerra Cavalcanti
IL-4
IL-5
IL
-
13
Th 1
Th 2
Th 0
TNF-α
IL-2
INF-γ
IL- 4
TGF
-
β
+ IL
-
6
INF
-
γ
resolução e, posteriormente, em uma segunda inoculação do parasita não
desenvolvem lesões (GUMY et al., 2004). Por outro lado, camundongos de raças
susceptíveis, como os BALB/c desenvolvem lesões severas e incontroladas sem o
desenvolvimento de uma resposta imune a uma reinfecção, tornando-se
representantes do fenótipo susceptível (MITCHELL et al., 1981).
Sabe-se que as reações imunes crônicas são frequentemente dominadas por
uma das duas subpopulações de células T auxiliares, Th1 ou Th2. Cada uma dessas
subpopulações produz citocinas diferentes, que não determinam somente as suas
funções efetoras, mas também participam do desenvolvimento e expansão das
respectivas subpopulações (MOSMANN; SAD, 1996) (figura 6). Dessa forma, cada
subpopulação amplifica a si mesma e ainda regula a subpopulação oposta, o que
explica o fato das respostas imunes se desenvolverem cada vez mais polarizadas
numa dada direção. Assim, o desenvolvimento de uma subpopulação de células Th1
culmina na ativação de macrófagos e na conseqüente resistência do hospedeiro à
doença, enquanto que o desenvolvimento de uma subpopulação Th2 culmina na
terceira subpopulação de células T que estaria envolvida na resposta imune do
hospedeiro à infecção por Leishmania, as células Th17, que parece desempenhar
papéis complementares a Th1 na resposta humana contra a LV, sendo ambos
requisitados para a completa proteção do hospedeiro (PITTA et al., 2009).
Figura 6: Padrão de resposta de células T auxiliares (Setas azuis indicam progressão do
processo de resistência ou de susceptibilidade; setas vermelhas indicam regulação)
Fonte: Adaptado de Stockinger and Veldhoen (2007).
IL-17
IL-22
IL-21
IL-23
Th 17
24
Katrine Bezerra Cavalcanti
Dessa forma, foi observado que a resolução da leishmaniose e proteção
contra uma nova reinfecção em indivíduos susceptíveis é governada pela expansão
de células T auxiliar CD4
+
específicas para a Leishmania, do tipo Th1 que produz
INF-γ. Quando presentes essas células ativam macrófagos para matar as formas
amastigotas intracelulares. Por outro lado, durante a progressão de infecções
sistêmicas, existe uma expansão de células T CD4
+
do tipo Th2 que secreta IL-4,
mas não INF-γ ou IL-2, na resposta aos antígenos da Leishmania. A IL-4 reprime o
desenvolvimento de uma resposta Th1 e, consequentemente, ativação de
macrófagos pelo INF-γ. Em pacientes com calazar, concentrações de IL-10 maiores
que IL-4 são responsáveis pela supressão de respostas potencialmente protetoras
Th1. Por sua vez, IL-17 também aumenta a produção de IL-6, que possui efeitos
proinflamátorios e regulatórios da resposta imune (KORN et al., 2009) e a IL-22
aumenta a produção de moléculas proinflamatórias (BONIFACE et al., 2005).
Sinergicamente, IL-17 e IL-22 aumentaram a produção de peptídeos
antimicrobianos, como as β-defensinas, por células epiteliais (LIANG et al., 2006).
Ambos os aumentos da barreira protetora epitelial e o recrutamento de células
inflamatórias, incluindo neutrófilos, para a epiderme e fígado, poderiam contribuir
para a proteção contra a Leishmania (BONIFACE et al., 2005; ZENEWICS et al.,
2007). Os fatores que determinam quais células CD4
+
,
Th1 ou Th2, dominarão o
curso da infecção durante os episódios da leishmaniose ainda não estão muito bem
esclarecidos (PEARSON ; SOUSA 1996; XU et al., 2003).
Dessa maneira, indivíduos residentes em áreas endêmicas para a LV podem
apresentar variações na resposta imunológica elicitada contra o patógeno e, evoluir
com características clínicas distintas. Indivíduos que resolvem espontaneamente a
infecção, evoluem com uma resposta imune celular tipo tardia, apresentando teste
de Montenegro positivo (DTH positivo), característica do perfil Th1. Enquanto
indivíduos que desenvolvem LV apresentam imunossupressão celular específica
para a Leishmania (CARVALHO, TEIXEIRA et al. 1981).
A leishmania tem a capacidade de estabelecer um estado de parasitismo
intracelular nos macrófagos ao desenvolver estratégias de evasão ou subversão de
funções efetoras ou regulatórias dessas células. Uma das principais estratégias
refere-se a uma considerável modificação no LPG (lipofosfoglicano presente na
membrana do protozoário) durante os processos de metaciclogênese, na qual ocorre
25
Katrine Bezerra Cavalcanti
um amplo espessamento da superfície dessa molécula, promovendo um
impedimento estérico ao acesso de molécula do sistema complemento a membrana
celular do parasito (SACKS, 1989). Assim, a morte destes parasitas, tanto no início
da infecção como na fase tardia, depende da ativação de macrófagos. Fagócitos
ativados por citocinas, como IL-1, INF-γ e TNF-α, expressam a enzima óxido nítrico
sintase, que catalisa a oxidação do aminoácido L-arginina, com formação de óxido
nítrico (NO), sendo este rapidamente convertido em NO
2-
e NO
3-
(MURRAY;
NATHAN, 1999). O óxido nítrico é um gás que tem um importante papel no
mecanismo microbicida do macrófago, podendo se complexar com o ânion
superóxido dos intermediários reativos de oxigênio, tornando-se altamente tóxico.
De modo contrário, o TGF-β suprime a produção de NO por diminuir a estabilidade e
a tradução de RNAm do iNOS, permitindo a sobrevivência do patógeno.
1.5 FLEBOTOMÍNEOS LUTZOMYIA LONGIPALPIS E LUTZOMYIA EVANDROI
Os flebotomíneos são pequenos dípteros “corcundas” e muito pilosos, com as
asas em forma de ponta de lança, mantidas eretas sobre o corpo, quando em pouso
(figura 7). São insetos holometábolos diminutos, pertencentes à Ordem Diptera, à
Família Psychodidae e Subfamília Phlebotominae, cujas fêmeas possuem hábitos
hematofágicos (GONTIJO; MELO 2004), popularmente conhecidos como
flebotomíneo, birigui, tatuquira, asa dura, orelha de veado, mosquito palha e
cangalhinha. Comumente encontrados em áreas florestais ou próximo destas, em
locais úmidos e escuros com temperaturas moderadas, no entanto podem invadir
domicílios e anexos em grande quantidade. A despeito do seu pequeno tamanho, os
flebotomíneos incomodam o homem com suas picadas e transmitem parasitos,
principalmente protozoários do gênero Leishmania, como também a outros animais.
Além das leishmanioses, em alguns países, esses dípteros também podem
transmitir outras zoonoses, como as bartoneloses (BIRTLES, 2001), fleboviroses
(TESH, 1988) e alguns flavivírus, orbiviroses e vesiculoviroses (ASHFORD, 2001;
COMER; TESH, 1991) causando problemas de saúde para humanos e animais
domésticos. Existem aproximadamente 470 espécies de flebotomíneos descritos
26
Katrine Bezerra Cavalcanti
nas Américas, dos quais, cerca de 10% podem atuar na transmissão das
leishmanioses (GALATI, 2003).
Figura 7: Fêmea de flebotomíneo
Os flebotomíneos possuem aparelho bucal do tipo picador sugador,
apresentando como principal fonte de energia carboidratos obtidos de seiva de
planta, néctar (ALEXANDER; USMA, 1994), secreções de afídeos e frutas maduras.
As fêmeas são hematófagas obrigatórias, pois necessitam de sangue para o
desenvolvimento dos ovos, tendo hábito alimentar noturno que se inicia cerca de 1
hora após o crepúsculo (XIMENES et al., 2006). O ciclo biológico do inseto vetor
compreende uma fase larvária terrestre, em locais úmidos, sombreados e ricos em
matéria orgânica. Do ovo à fase adulta decorrem cerca de 30 a 70 dias. Os machos
diferem morfologicamente das fêmeas por possuírem a terminália formada por três
pares de apêndices (figura 8) enquanto a fêmea apresenta o abdôme recurvado
para baixo (figura 8).
27
Katrine Bezerra Cavalcanti
Figura 8: Macho (à esquerda) e fêmea (à direita) de flebotomíneo
O gênero Lutzomyia compreende espécies de flebotomíneos do Novo Mundo
(KILLICK-KENDRICK, 1990). Além da transmissão de protozoários, os
flebotomíneos também são responsáveis pela transmissão de vírus e bactérias
(ARIAS et al., 1985).
Lutzomyia longipalpis Lutz & Neiva 1912 é a principal espécie transmissora da
Leishmania chagasi no Brasil (dos Santos, Arias et al. 1998) e certamente preenche
todos os critérios estabelecidos para competência vetorial (KILLICK-KENDRICK,
1990), destacando aqueles considerados essenciais, como a antropofilia,
distribuição espacial coincidente com casos humanos da doença e infecção natural
pelo parasito (DEANE, 1956; KILLICK-KENDRICK, 1990; LAINSON; RANGEL,
2005). No Brasil, essa espécie já apresenta extensiva distribuição geográfica, sendo
apenas os estados do Amazonas, Amapá, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do
Sul os únicos que ainda não tiveram casos relatados da doença. Estudos anteriores
como Ximenes (XIMENES et al. 1999) e Lainson (LAINSON; RANGEL 2005)
associam o comportamento eclético e oportunista de L. longipalpis à urbanização da
leishmaniose visceral, especialmente sua flexibilidade de hábitos alimentares e fácil
adaptação às condições domésticas, permitindo sua captura dentro de moradias
humanas e abrigos animais (RANGEL; VILELA, 2008). Outro flebotomíneo que
merece destaque é o Lutzomyia evandroi Costa Lima & Antunes 1936 o qual se
apresenta largamente distribuído no estado do Rio Grande do Norte, presente em
áreas endêmicas de leishmaniose visceral e tegumentar, tanto em locais peri quanto
intradomiciliares (XIMENES et al., 2001). Além de apresentar a mesma distribuição
geográfica que L. longipalpis, é a segunda espécie mais abundante no estado,
representando cerca de 11% da fauna total de flebotomíneos capturados (XIMENES
et al., 2000). Estudos realizados em Jacobina, Bahia, indicaram que L. evandroi
poderia estar envolvido na transmissão de L. chagasi em cães (SHERLOCK, 1996).
1.6 RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS DO HOSPEDEIRO AO VETOR
28
Katrine Bezerra Cavalcanti
Durante a picada, a fêmea introduz suas peças bucais na pele do hospedeiro
vertebrado, causando traumas e laceração de pequenos vasos e pequenas
hemorragias locais. A picada do inseto exerce na pele uma ação mecânica e
enzimática por meio da saliva do flebotomíneo. Com a picada do inseto e a presença
do parasita, mecanismos naturais de defesa do hospedeiro são ativados no local da
inoculação, como reações do sistema complemento, ativação de trombinas,
plaquetas, anticorpos naturais e fagócitos (CHAMPAGNE, 2005).
Sabe-se hoje que moléculas imunossupressoras/imunomodulatórias salivares
de artrópodes hematófagos podem aumentar a transmissão de patógenos (TITUS et
al., 2006). Também se tem conhecimento que os fatores vasodilatadores presentes
na saliva de artrópodes podem aumentar o sucesso na obtenção sanguínea (TITUS
et al. 2006). Da mesma forma, está bastante claro que proteínas imunossupressivas
estão presentes na saliva da maioria, se não todos, os artrópodes que realizam
repasto sanguíneo, o que pode ser uma razão pela qual esses vetores transmitem
tantas doenças (BOWMAN et al., 1997; SCHOELER, WIKEL, 2001). Alguns estudos
provaram que a saliva do flebotomíneo exerce importante papel como
anticoagulante, além de possuir o mais potente vasodilatador conhecido, o maxidilan
(LERNER; MORO, 1997), que inibe a ação de macrófagos (LERNER et al. 1991;
RIBEIRO; TITUS, 1988;), aumenta o fluxo sanguíneo e assim acelera e otimiza o
repasto sanguíneo (figura 9). Além do maxidilan, foi provado a existência de um
grande número de substâncias nos extratos salivares de flebotomíneos, que incluem
a habilidade de inibir a hemostasia, vaconstricção e desenvolvimento da inflamação
e da resposta imune (BOWMAN et al., 1997; SCHOELER; WIKEL, 2001) (tabela 1).
Logo, o maxidilan, interleucinas, prostaglandinas e outros, potencializam a
visceralização do parasita e o desenvolvimento da doença (GILLEPIE et al., 2000;
RIBEIRO et al., 1987). Este quadro de interações entre componentes da saliva,
proteínas da superfície do parasito e padrões distintos de resposta mediada por
linfócitos determinam o curso da relação parasito-hospedeiro, ou seja,
suscetibilidade ou resistência do hospedeiro (PERKINS; SACKS, 1985). No entanto,
hipóteses a respeito da presença de fatores vasodilatadores e imunomodulatórios na
saliva de artrópodes são, relativamente, recentes (SCHOELER; WIKEL, 2001).
29
Katrine Bezerra Cavalcanti
Figura 9: Efeitos da saliva de flebotomíneos no hospedeiro vertebrado
Fonte: Andrade (2007)
Alguns pesquisadores conseguiram induzir a doença em camundongos
experimentais injetando com seringa milhões de L. major. Em contraste, o
flebotomíneo injeta apenas, no máximo, 100 parasitos durante a alimentação
(SCHLEIN; WARBURG, 1986). A partir de então, surgiram muitas dúvidas a respeito
da grande eficiência do inseto quando comparado à seringa e a respeito do tão
pequeno número de parasitos conseguirem sobreviver na presença dos mecanismos
de defesa do hospedeiro e ainda causar doença. Quando a L. major é injetada pelo
flebotomíneo junto com sua saliva, é possível que componentes da saliva, de
alguma forma, protejam o parasito assim aumentando sua infectividade ao
hospedeiro. Para testar essa hipótese, experimentos foram realizados com
camundongos, os quais foram infectados com L. major na presença ou na ausência
de lisados de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (o flebotomíneo do Novo
Mundo), para determinar se a saliva intensifica a infectividade de L. major (TITUS,
1998). Foi encontrado que além da intensificação do tamanho da lesão, o
homogenado de glândula salivar também aumentou a carga parasitária dentro das
lesões. Desde o trabalho inicial com L. major, tem sido mostrado que a saliva de
flebotomíneos potencialmente exacerba a infecção de todas as Leishmanias
30
Katrine Bezerra Cavalcanti
testadas (SAMUELSON et al., 1991; THEODOS, et al., 1991; WARBURG et al.,
1994). Vários estudos anteriores provaram a existência de um grande número de
substâncias nos extratos salivares de flebotomíneos, que incluem a habilidade de
inibir a hemostasia, vaconstricção e desenvolvimento da inflamação e da resposta
imune (BOWMAN, et al., 1997; SCHOELER; WIKEL, 2001) (tabela 1). O resultado
mais instigante foi obtido em um experimento com L. braziliensis, no qual o parasito
sozinho induz apenas uma pequena infecção transiente no camundongo, enquanto
que o co-injetado com a saliva de L. longipalpis, as lesões não foram resolvidas
resultando numa enorme carga parasitária comparada com o grupo controle (LIMA
et al., 1997).
O maxidilan, ou MAX, o peptídeo salivar, parece ser o principal vasodilatador
na saliva dos flebotomíneos (LERNER et al., 1991; LERNER; SCHOEMAKER,
1992), o que aumenta o fluxo sanguíneo e assim acelera e otimiza o repasto
sanguíneo. Em adição, o MAX parece também intensificar a infecção com L. major
(LERNER et al., 1991), uma vantagem para o parasita e, presumivelmente para o
flebotomíneo, já que o MAX deve inibir o desenvolvimento de uma resposta imune
para a saliva do vetor. Observa-se que uma importante célula-alvo para MAX é o
macrófago, o principal hospedeiro celular da Leishmania, tendo diversos efeitos nos
macrófagos que explicam sua habilidade para exacerbar a infecção com L. major em
camundongos e prolongar a sobrevivência do parasito no hospedeiro. O MAX inibe a
produção de óxido nítrico, H
2
O
2
e TNF-α pelos macrófagos, e todos esses fatores
estão associados com a morte de Leishmania pelas células (TITUS et al., 1994). Em
contraste, MAX aumenta a produção de IL-10, prostaglandina E (PGE
2
) e IL-6, que
devem intensificar a sobrevivência de L. major. A IL-10 regula negativamente a
produção de INF-γ e pode inibir a produção de óxido nítrico pelos macrófagos
(CUNHA et al., 1992; MOORE et al., 1993). A redução na produção de INF-γ e óxido
nítrico parece ser vantajoso para Leishmania, já que o INF-γ ativa macrófagos para
matar esses protozoários através da habilidade de eliciar a produção de óxido nítrico
pelas células (TITUS et al., 1994). A PGE
2
inibe a inflamação, favorecendo o
aumento na produção de IL-4 (MILANO et al., 1996; PHIPPS et al., 1991), e tem sido
mostrado conduzir à progressão da infecção em camundongos infectados com L.
major (FREITAS et al., 1999). Por outro lado, tem sido mostrado que a IL-6 pode
favorecer o aumento da produção celular de IL-4 (RINCON et al., 1997), o que
31
Katrine Bezerra Cavalcanti
parece ser vantajoso L. major, já que a IL-4 pode intensificar a infecção e pode
bloquear a destruição da Leishmania pelos macrófagos (TITUS et al., 1994). A IL-6 é
hoje descrita como uma citocina que induz TH17, porém regula negativamente
células Th1, o que pode exarcebar a infecção por Leishmania (HATZIGEORGIOU et
al., 1993). Como um todo, esses numerosos efeitos de MAX nos macrófagos podem
ser suficientes para explicar o efeito exacerbativo que a saliva dos flebotomíneos
tem sobre a infecção com L. major.
Recentemente, a produção de anticorpos contra a saliva de flebotomíneos foi
observada em humanos (BARRAL et al., 2000; GOMES et al., 2002). Populações
residentes de área endêmica de leishmaniose no Brasil e na Turquia apresentaram
altos níveis de IgG anti-saliva , específicas para as espécies locais flebotomíneos.
Os anticorpos são capazes de reconhecer a maioria das proteínas salivares,
entretanto a freqüência e a intensidade da reação varia de pessoa para pessoa
(Gomes et al., 2002; ROHOUSOVA et al., 2005).
Logo, estudos direcionados ao conhecimento do padrão de resposta
imunológica de indivíduos residentes de área endêmica, sejam eles sadios ou não,
podem ser vistos como uma importante ferramenta pelo poder público local, a fim de
traçar um perfil dessa enfermidade e de suas susceptibilidades.
Atividades vasodilatadores e imunomodulatórias
salivares
Referências
32
Katrine Bezerra Cavalcanti
Quadro 1:
Atividades vasodilatadoras e imunomodulatórias salivares de flebotomíneos
Inibidores da ativação de células T (THEODO; TITUS
1993; TITUS 1998)
Inibidores da ativação de macrófagos (THEODOS; TITUS
1993)
Inibidores da produção de óxido nítrico/H
2
O
2
pelos
macrófagos e morte intracelular de L. major
(HALL; TITUS 1995;
GILLESPIE, Mbow et
al. 2000;
NORSWORTHY,
Sun et al. 2004)
Inibidores de INF-γ, IL-12, iNOS (MBOW, Bleyenberg
et al. 1998)
Estimuladores de IL-4, IL-5, IL-10 (BELKAID, kamhawi
et al. 1998; Mbow;
BLEYENBERG et al.
1998;
NORSWORTHY,
Sun et al. 2004)
Anticomplemento (CAVALCANTE,
Pereira et al. 2003)
Anticoagulante (ADLER, Theodor
1928; VALENZUELA,
Belkaid et al. 2004)
Vasodilatadores (maxidilan no L. longipalpis e adenosina e
5’-AMP em P. papatasi)
(LERNER, Ribeiro et
al. 1991; RIBEIRO,
Katz et al. 1999)
33
Katrine Bezerra Cavalcanti
2 OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Analisar parâmetros da resposta imunológica de humanos residentes em
diferentes áreas da Região Metropolitana de Natal/RN em relação aos componentes
da saliva de flebotomíneos e de antígenos do patógeno.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar a abundância e a flutuação sazonal das diferentes espécies de
flebotomíneos capturados em Nísia Floresta, município da Região Metropolitana
de Natal.
• Comparar a exposição aos flebotomíneos L. longipalpis e L. evandroi
em residentes de áreas endêmicas com o perfil de residentes em área sem
ocorrência de casos de leishmaniose visceral (bairros de Petrópolis e Lagoa
Seca).
• Analisar as diferenças na resposta imune frente à saliva de espécies
diferentes de flebotomíneos (Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia evandroi)
capturados na região metropolitana de Natal.
• Avaliar a imunidade celular e humoral em indivíduos residentes de área
endêmica para a leishmaniose visceral.
34
Katrine Bezerra Cavalcanti
3 METODOLOGIA
3.1 ÁREA DE ESTUDO
A região metropolitana do Natal consiste em nove municípios, sendo eles
Natal, Parnamirim, São Gonçalo do Amarante, Ceará - Mirim, Macaíba, Extremoz,
Nísia Floresta, São José do Mipibu e Monte Alegre (fig. 10). Para o presente estudo
foram utilizados soros de indivíduos humanos de dois destes municípios, Natal
(bairros de Petrópolis e Lagoa Seca) como área não endêmica para o calazar e
Parnamirim como área endêmica. Para tal, foram arrolados 117 indivíduos humanos
de área endêmica e 102 de área não endêmica para o calazar, totalizando 219
amostras. A escolha das amostras de área endêmica foi feita de forma que fossem
utilizados apenas soros de humanos que possuíssem cães em sua propriedade.
Figura 10: Região Metropolitana de Natal/RN
35
Katrine Bezerra Cavalcanti
3.2 FLEBOTOMÍNEOS
Os flebotomíneos foram coletados nos municípios de Nísia Floresta, próximo
à Lagoa do Bonfim; de Parnamirim; de São Gonçalo do Amarante e de Macaíba,
totalizando 2.841 espécimes. As capturas no município de Nísia Floresta foram
realizadas uma vez ao mês, de Fevereiro de 2008 a Janeiro de 2009, com
armadilhas luminosas do tipo CDC (Control Disease Center), instaladas em
ambiente peridomiciliar, das 17:00hs às 06:00hs da manhã seguinte (figura 11 ). Os
locais onde as armadilhas foram postas foram escolhidos por meio de estudos
prévios, visto que são conhecidos pela abundância de flebotomíneos das espécies
L. longipalpis e L. evandroi. Após a captura, esses insetos foram levados para o
Laboratório de Entomologia, localizado no Centro de Biociências da UFRN, onde
foram triados e mantidos durante dois dias em insetário próprio para o manuseio
destes e a uma temperatura aproximada de 27ºC, com alimentação à base de
solução açucarada a 10%. Os insetos foram conservados em álcool 70%, para
identificação em laboratório das amostras coletadas foi usado critérios de morfologia
interna, segundo a chave de identificação de (YOUNG; DUNCAN, 1994).
Figura 11: Local de coleta de flebotomíneos em ambiente peridomicilar
36
Katrine Bezerra Cavalcanti
3.3 DISSECAÇÃO DE GLÂNDULAS SALIVARES
Fêmeas não alimentadas foram dissecadas com o auxílio de um microscópio
estereoscópico, estiletes e pinças entomológicas, e as glândulas salivares foram
retiradas. A dissecação foi realizada de forma que cada 10 pares de glândulas
salivares fossem armazenadas em 20µL de tampão Tris-NaCl (20 mM Tris, 150 mM
NaCl), em pH 7,6, e misturadas com inibidor de protease PMSF a fim de evitar
degradação proteíca. Imediatamente após a dissecação, as glândulas foram
congeladas a -80º C (RIBEIRO et al., 2000) e mantidas no Laboratório de
Imunogenética da UFRN. Posteriormente, suas células foram rompidas por
repetitivos ciclos de gelo-degelo, usando câmara de refrigeração (CHARLAB et al.,
1995) e centrifugadas para obtenção de um homogenado salivar livre de frações
celulares (figura 12). Após a dissecação das glândulas salivares o abdome das
fêmeas foi analisado para diferenciação das espermatecas e confirmação das
espécies L. longipalpis e L. evandroi.
Figura 12: Dissecação de glândulas salivares e obtenção de homogenado salivar de
flebotomíneos em laboratório
3.4 COMITÊ DE ÉTICA
37
Katrine Bezerra Cavalcanti
O presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética da UFRN sendo
avaliado o protocolo para o uso de soros humanos estocados em laboratório e
daqueles cedidos pelo Centro Clínico da Ribeira José Carlos Passos. O número do
parecer de aprovação é 292/2008 e o protocolo é 098/2008-CEP-UFRN.
3.5 SOROS HUMANOS
Os soros provenientes dos indivíduos residentes de área endêmica para o
calazar utilizados no estudo em questão, tratam-se de amostras previamente
coletadas em estudos anteriores e que, atualmente, encontram-se estocados em
câmara de refrigeração adequada, de acordo com as normas da ANVISA. Já com
relação aos soros humanos de área não endêmica, estes foram concedidos pelo
Centro Clínico da Ribeira José Carlos Passos, sendo provenientes de dois bairros
da cidade nos quais não há notificação de casos da doença. Foram obtidos 3mL de
soros sanguíneos de cada um dos indivíduos participantes da pesquisa. Os sujeitos
humanos recrutados para o estudo foram escolhidos aleatoriamente
independemente de sexo, raça, naturalidade, peso ou idade. As amostras foram
utilizadas em testes ELISA para análise da presença de anticorpos contra a saliva
do inseto vetor ou contra os antígenos de Leishmania.
3.6 TESTE SOROLÓGICO ANTI-HOMOGENADO SALIVAR DE FLEBOTOMÍNEOS
Com os soros humanos foram realizados testes sorológicos pelo método
imunoenzimático ELISA a fim de se determinar a presença de anticorpos anti-saliva
de flebotomíneos L. longipalpis (BARRAL et al., 2000) e L. evandroi. Como antígeno
para tal teste foi usado o homogenado de glândula salivar de ambas as espécies
desses insetos separadamente, numa concentração de 26,95 µg/mL. Os indivíduos
sujeitos da pesquisa que foram usados para os testes com o antígeno de L.
longipalpis foram os mesmos usados nos testes da outra espécie (figura 13). As
38
Katrine Bezerra Cavalcanti
placas de microaglutinação com 96 poços para ELISA, de baixa afinidade, foram
sensibilizadas com 20 ng de antígeno salivar por poço e ressuspensas em 100 µL de
tampão Bicarbonato-Carbonato de sódio (Na
2
CO
3
15 mM, NaHCO
3
30,8 mM,
Timerosal 0,01%), pH 9,6, incubadas em durante a noite à 4ºC. Em seguida, o
excesso de antígeno foi removido e foram realizadas 3 lavagens com tampão PBS
1x Tween 0,05%. Para o bloqueio foi utilizado o tampão PBS 0,1% Tween 0,05%
BSA, durante 1 hora a 37°C. Os soros utilizados foram adicionados em 100 µL em
cada poço numa diluição de 1/100 em PBS 1x Tween 0,05%, sendo incubado
overnight a 4°C. Após a remoção do soro, as placas foram lavadas conforme
supracitado e adicionado 100 µL do conjugado humano anti-IgG peroxidase na
diluição de 1:2000 (Promega, WI, EUA) por poço, diluído em tampão PBS durante
45 minutos a uma temperatura de 37°C. O anticorpo secundário foi removido e as
placas foram novamente lavadas, sendo adicionados 100 µL de solução reveladora
com peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), na presença do cromógeno ABTS [2,2 azino-di-
(ácido sulfônico 3-etilbenzotiazolino)] (Sigma Chemical Co. St. Louis, MI, EUA) por 1
hora, a temperatura ambiente. Finalmente, a reação foi interrompida pela adição de
100 µL SDS a 5%. (C
12
H
25
NaO
4
S Sulfato dodecil de sódio) do BDH Laboratory
supplies. Para a leitura foi necessário um espectrofotômetro (Titerteck instruments,
Inc., Huntsville, AL, EUA) com absorbância a 405 nm. O cut-off foi calculado a partir
da média dos controles negativos mais duas vezes o desvio-padrão.
Figura 13: Antígenos e soros utilizados nos testes ELISA anti-homogenado salivar de
flebotomíneos
39
Katrine Bezerra Cavalcanti
3.7 TESTE SOROLÓGICO ANTI LEISHMANIA
A determinação de anticorpos anti Leishmania no soro foi realizada pelo teste
ELISA, utilizando extrato bruto de Leishmania chagasi como antígeno (EVANS et al.,
1992). Os soros usados nesses experimentos foram dos humanos referentes aos
indivíduos de área endêmica para Leishmaniose Visceral (figura 14). As placas para
ELISA utilizadas, de média afinidade (Constar Corporation, Cambridge, MA, EUA),
foram sensibilizadas com 1µg de extrato bruto de L. chagasi por poço com 100 µL de
tampão Bicarbonato-Carbonato de sódio, pH 9,6, incubadas por 24 horas, a 4ºC.
Após a remoção do excesso de antígeno, as placas foram bloqueadas com tampão
PBS pH 7,4/Tween-20 a 1%, e mantidas por 1 hora à temperatura ambiente. Logo
em seguida, as placas foram lavadas 4 vezes com PBS /Tween-20 a 0,1%seguidas
da adição de 100 µL de soro, por poço na diluição de 1/500, incubadas por 1 hora, à
temperatura ambiente. Posterior à remoção do soro, as placas foram lavadas
novamente e adicionados 100 µL do anticorpo secundário anti-IgG peroxidase
humana na diluição de 1:400 diluído em tampão PBS, e incubadas por 1 hora.
Removido o anticorpo secundário, as placas foram novamente lavadas, sendo
adicionados 100 µL da mesma solução reveladora anteriormente citada, na
presença de ABTS por 1 hora à temperatura ambiente. A reação também foi
interrompida com SDS 5% a leitura foi feita em espectrofotômetro a 405 nm. O cut-
off foi calculado a partir da média dos controles negativos mais três vezes o desvio-
padrão.
40
Katrine Bezerra Cavalcanti
Figura 14: Antígenos e soros utilizados nos testes ELISA anti-Leishmania
3.8 TESTE CUTÂNEO DE HIPERSENSIBILIDADE TARDIA (DTH)
Foi realizado o teste cutâneo de hipersensibilidade tardia (DTH), em
indivíduos residentes de área endêmica para a LV, utilizando-se antígenos de L.
chagasi, através da inoculação intradérmica de 0,1 mL da proteína na face interna
do antebraço. A leitura foi feita 48 horas após a inoculação, analisando-se a reação
local e a área de enduração. O teste é considerado positivo (DTH+) quando o nódulo
é igual ou maior que 5 mm, indicando que houve infecção e/ou LV pregressa, com
posterior desenvolvimento de imunidade (figura 15).
Figura 15: Teste cutâneo de hipersensibilidade tardia (DTH), usando como antígeno
L. chagasi
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para as análises estatísticas de comparação entre os resultados de ELISA
das áreas endêmica e não endêmica, bem como entre aqueles das duas espécies
de flebotomíneo, foram utilizados os testes de comparação de proporções. Já para a
41
Katrine Bezerra Cavalcanti
análise de cruzamentos entre os resultados de ELISA anti-saliva, anti-Leishmania e
DTH foi usado o teste Qui-quadrado.
42
Katrine Bezerra Cavalcanti
4 RESULTADOS
4.1 ABUNDÂNCIA E FLUTUAÇÃO SAZONAL DAS ESPÉCIES DE
FLEBOTOMÍNEOS EM NÍSIA FLORESTA
No município de Nísia Floresta foram coletados 2.308 espécimes de
flebotomíneos, sendo 2.011 machos e 297 fêmeas. Dentre estes, foram encontradas
seis diferentes espécies do gênero Lutzomyia: Lutzomyia evandroi Costa Lima &
Antunes, 1936 foi a espécie mais abundante representando 38,39% do total de
flebotomíneos coletados, Lutzomyia longipalpis Lutz & Neiva, 1912, a segunda mais
prevalente com 36,22%, seguido por Lutzomyia walkeri Newstead, com 19,67%,
Lutzomyia lenti Mangabeira, 1938, com 3,81%, Lutzomyia wellcomei com 1,39%,
sendo pela primeira vez relatada nesta região, e por fim, Lutzomyia whitmani
Antunes & Coutinho, 1939 com 0,52% (tabela 1). A relação entre machos e fêmeas
foi em torno de 6 para 1. Um fato observado foi que com o advento da época
chuvosa a abundância de flebotomíneos reduziu consideravelmente (gráfico 1),
apresentando maior abundância nos meses de Fevereiro e Março.
Espécie Proporção
Lutzomyia evandroi
38,39%
Lutzomyia longipalpis
36,22%
Lutzomyia walkeri
19,67%
Lutzomyia lenti
3,81%
Lutzomyia wellcomei
1,39%
Lutzomyia whitmani
0,52%
Tabela 1: Ocorrência de flebotomíneos por espécie coletados no município de
Nísia Floresta
43
Katrine Bezerra Cavalcanti
Gráfico 1: Abundância de flebotomíneos de acordo com os meses e a precipitação
pluviométrica
A distribuição de L. longipalpis e L. evandroi ao longo do ano se mostrou,
nessa área, semelhante, sendo a última ainda mais abundante que a primeira
(gráfico 2).
Gráfico 2: Flutuação sazonal de L. longipalpis e L. evandroi em Nísia Floresta
Semelhante ao que foi encontrado em Nísia Floresta, as espécies de
flebotomíneos em Parnamirim tendem a se distribuir anualmente de forma a
apresentar maior abundância no mês de Fevereiro tende uma substancial redução
com a chegada do mês de Março em diante.
As capturas realizadas em Parnamirim não permitiram analisar flutuação, no
entanto foram encontradas as seguintes espécies: L. walkeri como sendo a mais
44
Katrine Bezerra Cavalcanti
abundante representando 73,15% das espécies coletadas, seguida por L. evandroi
com 10,55%; L. wellcomei com 7,63%; L. longipalpis Lutz &Neiva, 1912, com 6,37%;
L. whitmani Antunes & Coutinho, 1939 com 1,46%; L. sordellii, pela primeira vez
encontrado no estado com 0,52%; L. intermedia com 0,21% e, por final, L. shanonni
representando 0,1% das espécies encontradas (tabela 2).
Tabela 2: Ocorrência de flebotomíneos por espécie coletados no município de
Parnamirim
4.2 TESTES SOROLÓGICOS ANTI-SALIVA DE FLEBOTOMÍNEOS
Dentre os 117 soros humanos de área endêmica testados por ELISA com o
antígeno salivar de L. longipalpis 38 reagiram positivamente, o que equivale a
32,48% desse total (gráfico 3). O valor da absorbância do cut-off calculado foi de
0,74 nm. Resultado bastante semelhante foi também encontrado no teste de 92
amostras de humanos de área não endêmica, dos quais 30 reagiram positivamente,
equivalente a 32,6% (gráfico 4). Quando comparados esses resultados, observou-se
que os soros humanos que reagiram com saliva de L. longipalpis tanto de área
Espécie Proporção
Lutzomyia walkeri
73, 15%
Lutzomyia evandroi
10,55%
Lutzomyia wellcomei
7,63%
Lutzomyia longipalpis
6,37%
Lutzomyia whitmani
1,46%
Lutzomyia sordellii
0,52%
Lutzomyia intermedia
0,21%
Lutzomyia shanoni
0,1%
45
Katrine Bezerra Cavalcanti
endêmica para LV como de área não-endêmica não houve diferença significativa
(p>0,05) (gráfico 5).
Gráfico 3: Resultados dos testes ELISA realizados com soros humanos de área endêmica
com antígeno salivar de L. longipalpis
Gráfico 4: Resultados dos testes ELISA realizados com soros humanos de área não
endêmica com antígeno salivar de L. longipalpis
46
Katrine Bezerra Cavalcanti
Gráfico 5: Comparação entre os resultados de testes ELISA com soros humanos de área
endêmica e não endêmica com antígeno salivar de L. longipalpis
.
Resultado semelhante foi encontrado nos testes ELISA realizados com o
antígeno salivar de L. evandroi. Os mesmos 117 humanos de área endêmica usados
para os testes com L. longipalpis foram usados naqueles para L. evandroi, dos quais
6 reagiram positivamente (5,13%) (gráfico 6). Com os humanos de área não
endêmica, foram testadas 102 amostras, das quais 6 também mostraram-se
positivas (5,88%) (gráfico 7). O valor do cut-off calculado foi um pouco inferior ao de
L. longipalpis, sendo o equivalente a 0,735 nm. Não foi observada diferença
significativa entre os indivíduos de área endêmica e de área não endêmica testados
com antígeno salivar de L. evandroi (p>0,05). Porém, quando comparados os
resultados dos testes de uma mesma área (área endêmica, por exemplo) com as
diferentes espécies de flebotomíneo, observa-se diferença estatisticamente
significativa (gráfico 8).
Gráfico 6: Resultados dos testes ELISA realizados com soros humanos de área endêmica
com antígeno salivar de L. evandroi
47
Katrine Bezerra Cavalcanti
Gráfico 7: Resultados dos testes ELISA realizados com soros humanos de área não
endêmica com antígeno salivar de L. evandroi
Gráfico 8: Comparação dos resultados dos testes ELISA com soros humanos de área
endêmica e não endêmica entre saliva de L. longipalpis e L. evandroi
4.3 TESTES SOROLÓGICOS PARA DETECÇÃO DE ANTÍGENOS DE
LEISHMANIA
Os testes ELISA contra antígenos de Leishmania foram feitos apenas nos
indivíduos de área endêmica para a LV, visto o fato de nunca ter sido relatado casos
da doença na região da qual vieram os soros de indivíduos de área não endêmica.
Dessa forma, das 117 amostras, 29 reagiram positivamente, gerando o equivalente
de 24,8% do total.
4.4 TESTE CUTÂNEO DE HIPERSENSIBILIDADE TARDIA (DTH)
Pelo mesmo motivo que o ELISA anti-Leishmania, o DTH foi realizado apenas
em indivíduos de área endêmica para LV. Dentre os 117 indivíduos, seis deles não
foi possível fazer a leitura do teste pela impossibilidade de se encontrar esses
48
Katrine Bezerra Cavalcanti
pacientes no devido dia. Assim, dos 111 restantes, 38 reagiram positivamente, o
equivalente a 34,23%.
Assumindo que a sorologia positiva anti-Leishmania indica infecção ao
patógeno e DTH positivo é um marcador de proteção contra casos subclínicos de
leishmaniose, então foi observado se havia algum tipo de associação entre as
respostas de sorologia e DTH dos indivíduos de área endêmica, e constatou-se que
realmente havia um tipo de associação inversa entre esses parâmetros. Ou seja, os
sujeitos que apresentaram sorologia positiva tinham 4 vezes mais chances de
apresentarem resposta DTH negativa que aqueles com sorologia negativa. Outra
observação realizada foi quando se dividiu os pacientes em quatro grupos distintos:
Grupo 1 com indivíduos que apresentavam sorologia à Leishmania positiva e DTH
também positivo; Grupo 2 com sorologia positiva e DTH negativo; Grupo 3 com
sorologia negativa e DTH positivo; e por fim, Grupo 4 com sorologia negativa e DTH
igualmente negativo. Dessa forma, pôde-se observar se existe diferença na
distribuição desses quatro fenótipos em uma população de área endêmica e se
algum desses fenótipos apresenta maior resposta antissaliva de L. longipalpis
(gráficos 9, 10, 11 e 12). Através do teste de comparação de proporções observou-
se que entre o Grupo 4 (DTH negativo e sorologia negativa) e o Grupo 3 (DTH
positivo e sorologia negativa) não há diferença significativa. Porém, quando
comparado o Grupo 4 com o Grupo 2 (DTH negativo e sorologia positiva) ou com o
Grupo 1 (DTH positivo e sorologia positiva), em ambos os casos foi observado
diferença significativa (p< 0,01).
Grupo 1 DTH+/S+
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
D.O. 405 nm
Negativo
Positivo
49
Katrine Bezerra Cavalcanti
Gráfico 9: Resultado de testes ELISA anti-saliva de L. longipalpis em indivíduos DTH
positivos (DTH+) e que apresentam sorologia à Leishmania positiva (S+)
Grupo 2 DTH-/S+
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
D.O. 405 nm
Negativo
Positivo
Gráfico 10: Resultados de testes ELISA anti-saliva de L. longipalpis em indivíduos DTH
negativos (DTH-) e que apresentam sorologia à Leishmania positiva (S+)
Grupo 3 DTH+/S-
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
D.O. 405 nm
Negativo
Positivo
Gráfico 11: Resultados de testes ELISA anti-saliva de L. longipalpis em indivíduos DTH
positivos (DTH+) e que apresentam sorologia à Leishmania negativa (S-)
Grupo 4 DTH-/S-
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
D.O. 405 nm
Positivo
Negativo
50
Katrine Bezerra Cavalcanti
Gráfico 12 – Resultados de testes ELISA anti-saliva de L. longipalpis em indivíduos DTH
negativos (DTH-) e que apresentam sorologia à Leishmania negativa (S-).
5 DISCUSSÃO
A trajetória da distribuição da Leishmaniose visceral nas Américas tem
mudado nos últimos 13 anos, visto que a avaliação epidemiológica mostra
alterações no perfil de transmissão, originalmente caracterizada como padrão rural,
para um atual perfil associado a grandes cidades, como Natal (RN), São Luís (MA),
Teresina (PI), Palmas (TO), Belo Horizonte (MG), entre outras (Saúde 2003). No
Brasil, L. longipalpis mostra acentuada expansão geográfica, sendo apenas 6 dos 27
estados que não apresentam, ainda, descrição de ocorrências do flebotomíneo
vetor. Esse inseto gradualmente colonizou o ambiente rural e, no final dos anos 80
foi encontrado invadindo o ambiente urbano, especialmente em grandes cidades de
periferia, onde foi capturado em ambientes tanto intra quanto peridomiciliar
(LAINSON; RANGEL, 2005). Dessa forma, pode-se inferir que o comportamento de
L. longipalpis desempenha um papel determinante no contexto da urbanização da
LV, especialmente devido à sua flexibilidade de hábitos alimentares e fácil
adaptação às condições domésticas.
As espécies do gênero Lutzomyia são distribuídas nas Américas, com
exceção do Chile. A distribuição geográfica desses insetos é amplamente
influenciada por fatores bióticos e abióticos, como barreiras físicas, precipitação,
vegetação, solo e abundância de hospedeiros vertebrados dos quais possam se
alimentar (YOUN; ARIAS, 1991). Nas áreas estudadas, os flebotomíneos foram
capturados em ambientes peridomiciliares com criação de porcos, cavalos, galinhas,
tatus-peba e cães, clima subúmido, presença de frutíferas (coqueiros, mangueiras,
cajueiros e bananeiras). E na área de Mata Atlântica secundária, L. longipalpis foi
capturado em menor proporção quando se compara às áreas peridomiciliares de
Nísia Floresta. Diferentemente de estudos anteriores feitos pelo nosso grupo de
pesquisa, L. longipalpis mostrou-se como a segunda mais abundante espécie em
Nísia Floresta, e não a primeira como avaliado anteriormente (XIMENES et al., 1999)
e como a quarta mais abundante na Mata da Emparn (município de Parnamirim).
Outro resultado divergente foi o fato de L. evandroi ter se mostrado como a primeira
espécie mais abundante no município de Nísia Floresta (não mais a segunda) e a
51
Katrine Bezerra Cavalcanti
segunda na Mata da Emparn (Parnamirim), o que pode indicar uma flexibilidade
maior dessa espécie a diferentes ecótopos. Esse fato torna-se preocupante pelo fato
de estar se observando uma expressiva expansão de uma espécie ainda pouco
conhecida e estudada e que pode vir a estar envolvida na transmissão de
Leishmania (SHERLOCK, 1996).
Em contraste a L. longipalpis, as espécies L. wellcomei, L. whitmani (ambas
encontradas nas duas áreas estudadas) e L. intermedia (encontrada em Parnamirim)
são associadas a transmissão de L. braziliensis, o agente etiológico da leishmaniose
tegumentar. O presente estudo demonstrou não apenas a presença dessas
espécies em diferentes habitats como também que estas ainda apresentam-se em
menores proporções quando comparados a outras espécies de flebotomíneos.
A distribuição de flebotomíneos em ambas as áreas (Nísia Floresta e
Parnamirim), bem como a distribuição de L. longipalpis coincide com aquela
encontrada em Belo Horizonte, estado de Minas Gerais (RESENDE et al., 2006),
mostrando-se mais abundante nos primeiros meses do ano, quando há
predominância de temperatura quente com leve precipitação. No entanto, Ximenes
(2006) em estudo realizado ao longo de três anos mostram que a densidade de
flebotomíneos se eleva em dois momentos do ano, o primeiro pico entre Maio e
Junho, e o segundo pico em Novembro, de modo geral, o aumento da populações
está relacionado às chuvas, umidade relativa do ar e à diminuição da velocidade do
vento.
Estudos entomológicos sobre a ocorrência e densidade vetorial buscam
fornecer informações quantitativas e qualitativas de flebotomíneos potencialmente
transmissores de leishmanioses. Dessa forma, pode-se definir áreas transmissão
prevalentes e o melhor período a ser administrada estratégias de controle ao vetor,
seja por método de controle químico ou físico.
No momento do repasto sanguíneo, quando a fêmea de flebotomíneo pica o
hospedeiro, ela injeta seu conteúdo salivar na pele, o qual é constituído de um
poderoso fluido farmacologicamente ativo que interfere diretamente na hemostasia e
nas respostas inflamatórias e imunes do vertebrado (ANDRADE et al., 2007). Essa
influência sobre a resposta imune do hospedeiro também é observada em
experimentos de exposição à saliva de outros insetos hematófagos (CHAMPAGNE,
2005), levando à produção de anticorpos específicos para proteínas salivares, o que
52
Katrine Bezerra Cavalcanti
permite seu uso como marcador epidemiológico de exposição aos vetores (BARRAL
et al., 2000). Em áreas endêmicas para LV a exposição de hospedeiros aos
flebotomíneos é um importante fator epidemiológico que pode ser usado para
estimar o risco de transmissão do parasita e medir o efeito de campanhas de
controle do vetor, visto que permitem determinar parâmetros individuais de proteção
do indivíduo. No presente estudo, foi encontrado quantidade razoável de pessoas
residentes em áreas da Região Metropolitana de Natal onde nunca foi relatado o
surgimento de casos de LV mas que apresentaram anticorpos anti-saliva de L.
longipalpis, em proporções semelhantes àqueles encontrados em indivíduos
residentes em áreas onde há relato anual de casos da doença. Esse dado mostra
que pessoas de ambas as áreas estão sendo picadas por esse inseto, o que pode
estar relacionado ao fato do fluxo populacional entre as áreas ser demasiadamente
grande, havendo inúmeras pessoas que trabalham numa área e moram em outra.
Embora L. longipalpis seja encontrado com mais facilidade na região norte de Natal,
a espécie pode ser encontrada nas três outras zonas da cidade (Ximenes, dados
não publicados). Outra explicação seria a possibilidade de reação cruzada entre
antígenos da saliva de flebotomíneos com os da saliva de outros dípteros, como por
exemplo os culicídeos, que apresentam em sua saliva diversas moléculas
imunomodulatórias pertencentes às mesmas famílias de muitas daquelas
encontradas nos flebotomíneos. A família 5’ nucleotidase consistindo de apirase e 5’
nucleotidase foi encontrada em mosquitos e no Phlebotomus papatasi, bem como a
família D7 de proteínas salivares foi encontrada em Aedes aegypti, Anopheles
gambiae, Anopheles darlingi, Culex quinquefasciatus, Phlebotomus papatasi e
Lutzomyia longipalpis (VALENZULA et al., 2002). Por outro lado, em virtude da
ampla distribuição de culicídeos nas áreas urbanas, como por exemplo Aedes
aegypti e muriçocas, seria de se esperar que praticamente todas as pessoas
tivessem apresentado resultados positivos. Em relação a L. evandroi, não há
estudos a respeito das proteínas salivares antigênicas encontradas nessa espécie,
portanto não se pode afirmar se aqueles indivíduos que apresentaram anticorpo
antissaliva de L. evandroi poderiam apresentar reação cruzada com outro inseto
hematófago. Os resultados do presente trabalho ganham autoridade ao reforçar a
importância dos componentes salivares do vetor como uma valiosa ferramenta para
o desenvolvimento de uma vacina para a leishmaniose (VALENZUELA et al., 2008).
53
Katrine Bezerra Cavalcanti
Foi ainda observado através do teste Qui-quadrado que os indivíduos que
apresentaram sorologia anti Leishmania positiva em sua maioria apresentavam
resposta DTH negativo, levando a uma associação inversa entre esses dois
parâmetros, o que corrobora com dados encontrados por Miles et al, 2005, que
encontrou a mesma correlação negativa em indivíduos com diagnóstico positiva para
LV através de aspirados de medula óssea (MILES et al., 2005).
Utilizando resultados clínicos de sorologia anti Leishmania, teste cutâneo de
Montenegro (DTH) e sorologia antissaliva do flebotomíneo L. longipalpis, pudemos
definir as quatro categorias fenotípicas de indivíduos residentes de área endêmica
para LV na Região Metropolitana de Natal. O fenótipo mais abundante encontrado
foi o do Grupo 4, no qual dos indivíduos que apresentaram sorologia positiva
antissaliva cerca de 40% mostraram sorologia anti Leishmania negativa e DTH
negativo, ou seja, os indivíduos foram picados e expostos à saliva de flebotomíneos
mas não desenvolveram a doença, provavelmente por duas razões: a primeira seria
de que as pessoas podem ter sido infectadas mas eliminaram o parasito por
mecanismos de defesa imune inata e a segunda é de que mesmo se tratando de
uma área endêmica para LV, com casos recorrentes anuais, muitas das pessoas
residentes na área podem estar sendo picadas por insetos não infectados. Por outro
lado, os indivíduos do Grupo 1, que apresentavam sorologia anti patógeno positiva e
DTH positivo, apenas 7,9% também se mostraram positivos à saliva do vetor, o que
pode ser provavelmente explicado pelo fato da memória imunológica aos antígenos
salivares do inseto vetor seja mais efêmera que aquela apresentada aos antígenos
do próprio parasita.
54
Katrine Bezerra Cavalcanti
6 CONCLUSÕES
1) Lutzomyia evandroi foi a espécie mais abundante em coletas peridomiciliares no
município de Nísia Floresta, seguida por Lutzomyia longipalpis. Na área de mata
de Parnamirim, L. evandroi foi a segunda mais abundante e L. longipalpis a
quarta. Esses dados indicam que mesmo não sendo apontada como espécie
vetora, L. evandroi vem se expandindo em direção à áreas periurbanas da
Região Metropolitana de Natal.
2) De acordo com os dados de flutuação sazonal de flebotomíneos em Nísia
Floresta pode-se concluir que a época de maior abundância desses insetos é no
início do ano, entre os meses de Fevereiro a Abril, provavelmente devido aos
ventos mais amenos e menor precipitação pluviométrica.
3) Foram encontradas respostas à saliva de L. evandroi em indivíduos humanos de
área endêmica e não endêmica para a LV, porém em menores proporções que L.
longipalpis, o que indica a maior competência vetorial e antropofilia deste em
relação ao primeiro.
4) Não foi encontrada diferença na exposição ao vetor da LV entre indivíduos de
área endêmica e não endêmica para o calazar. Porém outros estudos são
necessários para se averiguar a possibilidade de reações cruzadas com
respostas imunológicas a outros insetos.
5) Em área endêmica para o calazar, foi encontrada uma parcela significativa de
indivíduos que apresentaram exposição ao vetor, porém sem indícios de
infecção, o que leva a crer que outros fatores, como nutricionais ou genéticos,
podem estar envolvidos na susceptibilidade de desenvolvimento à doença.
55
Katrine Bezerra Cavalcanti
REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K.; LITCHMAN, A. H. Imunologia celular e molecular. 5. ed. Rio de
Janeiro: Elsevier, 2005.
ADLER, S.; THEODOR, O. The exit of Leishmania tropica through the proboscis of
Phlebotomus papatasi. Nature, Fort Collins, v. 121, p. 282, 1928.
ALEXANDER, B.; USMA, M.C. Potential sources of sugar for the phlebotomine
sandfly Lutzomyia youngi (Diptera: Psychodidae) in a Colombian coffee plantation.
Ann Trop Med Parasitol, Colombia, v. 88, n.5, p. 543-549, 1994.
ANDRADE, B. B. et al. Role of sand fly saliva in human and experimental
leishmaniasis: current insights. Scand J Immunol, Bahia, v. 66, n.2-3, p. 122-7,
2007.
ARIAS, J. R. et al. Flagellate infections of Brazilian sand flies (Diptera: Psychodidae):
isolation in vitro and biochemical identification of Endotrypanum and Leishmania. Am
J Trop Med Hyg, São paulo, v. 34, n. 6, p. 108 - 198, 1985.
ASFORD, R. W. Phlebotomus fevers. The Encyclopedia of Arthopod-Transmitted
Infections. Wallingford: CABI Publising, 2001. p. 397-401.
BARRAL, A. et al. Human immune response to sand fly salivary gland antigens: a
useful epidemiological marker? Am J Trop Med Hyg, Fort Collins, v. 62, n. 6, p. 5-
740, 2000.
BELKAID, Y. et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis:
powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of
Leishmania major infection in the mouse ear dermis. J Exp Med, Nova York, v. 188,
n. 10, p. 1941-53, 1998
BIRTLES, R. J. Carrión's disease. The Enciclop Arthrop-Transmitted Inctions.
[S.l.: s.n.], 2001. p. 6-104,
BOGDAN, C. et al. Immunization of susceptible hosts with a soluble antigen fraction
from Leishmania major leads to aggravation of murine leishmaniasis mediated by
CD4+ T cells. Eur J Immunol, Erlangen, v. 20, n. 12, p. 40-2355, 1990.
56
Katrine Bezerra Cavalcanti
BONIFACE, K. et al. IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces
proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. J Immunol,
França, v. 174, p. 702-3695, 2005.
BOWMAN, A. S. et al. Tick saliva: recent advances and implications for vector
competence. Med Vet Entomol, Estados unidos, v. 11, n. 3, p. 85-277, 1977.
BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Epidemiologia. Guia de
Vigilância Epidemiológica. [S.l.], 2002.
CAMARGO, L.; LANGONI, H. Impact of Leishmaniasis on Public Health. J Venom
Anim Toxins incl Trop Dis, Botucatu, v. 12, n. 4, p. 48-527, 2006.
CAVALCANTE, R. R. et al. Anti-complement activity in the saliva of phlebotomine
sand flies and other haematophagous insects. Parasitology, Belo Horizonte, v.127,
p. 87-93, 2003.
CHAMPAGNE, D. E. Antihemostatic molecules from saliva of blood-feeding
arthropods. Pathophysiol Haemost Thromb, Georgia, v. 34, n. 4-5, p. 7-221, 2005.
CHARLAB, R. et al. Leishmania amazonensis: sensitivity of different promastigote
morphotypes to salivary gland homogenates of the sand fly Lutzomyia longipalpis.
Exp Parasitol, Arizona, v. 80, n. 2, p. 75-165, 1995.
COMER, J. A.; TESH, R. B. Phlebotomine sand flies as vectors of vesiculovirus: a
review. Parasitologia, Novo Mexico, v. 33, p. 50-143, 1991.
COSTA, C. H. N. et al. Epidemia de leishmaniose visceral no Estado do Piauí, Brasil,
1980-1986. Revista de Saúde Pública, São Paulo, v. 24, n. 5, 1990.
CUNHA, A. M.; CHAGAS, E. New species of protozoa of the genus Leishmania
pathogenic to man Leishmania chagasi n. sp previous note. O Hospital, Londres, v.
11, p. 3 - 9, 1937.
CUNHA, F. Q. et al. Interleukin-10 (IL-10) inhibits the induction of nitric oxide
synthase by interferon-gamma in murine macrophages. Biochem Bioph Res Com,
Reino Unido, v. 182, p. 9-115, 1992.
57
Katrine Bezerra Cavalcanti
CUPOLILLO, E.; GRIMALDI, G.; MOMEN, H. A general classification of New World
Leishmania using numerical zymotaxonomy. Am J Trop Med Hyg, Rio de Janeiro, v.
50, n. 3, p. 296 - 311, 1994.
DEANE, L. Leishmaniose visceral no Brasil: Estudos sobre reservatórios e
transmissores realizados no Estado do Ceará. [S.l] : [s.n], 1956.
EVANS, T. G. et al. Epidemiology of visceral leishmaniasis in northeast Brazil. J
Infect Dis, Ceará, v. 166, n. 5, p. 32-1124, 1992.
FREITAS, L. A. R. de. et al. Indomethacin treatment slows disease progression and
enhances Th1 response in susceptible BALB/c mice infected with Leishmania major.
Paras Immun, Bahia, v. 21, p. 7-273, 1999.
FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE. Manual de controle da leishmaniose
tegumentar americana. [S.l.]: NED/ASCOM/FUNASA, 2000.
GILLEPIE, R. D. et al. The immunomodulatory factors of bloodfeeding arthropod
saliva. Parasite Immunol, Colorado, v. 22, n. 7, p. 31-319, 2000.
GOMES, R. B. et al. Seroconversion against Lutzomyia longipalpis saliva concurrent
with the development of anti-Leishmania chagasi delayed-type hypersensitivity. J
Infect Dis, Bahia, v. 186, n. 10, p. 14-1530, 2002.
GONTIJO, C. M. F.; MELO, M. N. Leishmaniose visceral no Brasil: quadro atual,
desafios e perspectivas Revista Brasileira de Epidemiologia, São Paulo, v. 7, n. 3
p. 12, 2004.
GRIMALDI, G.; TESH, R. Leishmaniases of New World: current concepts and
implications for the future research. Clin Microbiol Rev, Rio de Janeiro, v. 6, p. 50-
230, [199-?].
GUMY, A. et al. The murine model of infection with Leishmania major and its
importance for the deciphering of mechanisms underlying differences in Th cell
differentiation in mice from different genetic backgrounds. Int J Parasitol, Suiça, v.
34, n. 4, p. 433-444, 2004.
HALL, L. R.; TITUS, R. G. Sand fly vector saliva selectively modulates macrophage
functions that inhibit killing of Leishmania major and nitric oxide production. J
Immunol, Estados Unidos, v. 155, n. 7, p. 6-3501, 1995.
58
Katrine Bezerra Cavalcanti
HATZIGEORGIOU, D. E. et al. IL-6 down-modulates the cytokine-enhanced
antileishmanial activityin human macrophages. The J Immun, New York, v. 151, n. 7,
p. 92-3692, 1993.
HEINZEL, F. P. et al. Reciprocal expression of interferon gamma or interleukin 4
during the resolution or progression of murine leishmaniasis. Evidence for expansion
of distinct helper T cell subsets. J Exp Med, California, v. 169, n.1, p. 59-72, 1989.
ILGOUTZ, S. C.; MCCONVILLE, M. J. Function and assembly of the Leishmania
surface coat. Int J Parasitol, Austrália, v. 31, n. 9, p. 899-908, 2001.
JERONIMO, S. M. et al. An emerging peri-urban pattern of infection with Leishmania
chagasi, the protozoan causing visceral leishmaniasis in northeast Brazil. Scand J
Infect Dis, Natal, v. 36, n. 6-7, p. 9-443, 2004.
JERONIMO, S. M. et al. An urban outbreak of visceral leishmaniasis in Natal, Brazil.
Trans R Soc Trop Med Hyg, Natal, v. 88, n. 4, p.8-386 1994.
KAMHAWI, S. The biological and immunomodulatory properties of sand fly saliva and
its role in the establishment of Leishmania infections. Microbes Infect, Estados
Unidos, v. 2, n. 14, p. 73-1765, 2000.
KILLICK-KENDRICK, R. The life-cycle of Leishmania in the sandfly with special
reference to the form infective to the vertebrate host. Ann Parasitol Hum Comp,
Inglaterra, v. 65, p. 37-42, 1990a. Suplemento.
______. Phlebotomine vectors of the leishmaniases: a review. Med Vet Entomol,
Inglaterra, v. 4, n. 1, p. 1-24, 1990b.
KORN, T. et al. IL-17 and IL-22 Th17 cells. Annu Rev Immunol, Munique, v. 27, p.
485 -517, 2009.
LAINSON, R.; RANGEL, E. F. Lutzomyia longipalpis and the eco-epidemiology of
American visceral leishmaniasis, with particular reference to Brazil: a review. Mem
Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 100, n. 8, p. 27-811, 2005.
LAINSON, R.; SHAWN, J. J. Evolution, classification and geographical distribution.
The Leishmaniasis in Biology and Medicine, London, v. 1, p. 120, 1987.
59
Katrine Bezerra Cavalcanti
LEISHMAN, W. B. On the possibility of the occurrence oh tripanosomiasis in India.
1903. Natl Med J India, Índia, v. 7, n. 4, p. 196 - 200, 1994.
LERNER, E. A. et al. Isolation of maxadilan, a potent vasodilatory peptide from the
salivary glands of the sand fly Lutzomyia longipalpis. J Biol Chem, Boston, v. 266, n.
17, p. 6-11234, 1991.
LIANG, S. C. et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and
cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. J Exp Med, Estados
Unidos, v. 203, p. 9-2271, 2006.
LIMA, H. C. et al. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected
animals. Paras Tod, Estados Unidos, v. 13, p. 2-80, 1997.
LOCKSLEY, R. M.; SCOTT, P. Helper T-cell subsets in mouse leishmaniasis:
induction, expansion and effector function. Immunol Today, Estados Unidos, v. 12,
n. 3, p. 58-61, 1991.
MAURÍCIO, I. L. et al. The strange case of Leishmania chagasi. Parasitology
Today, Estados Unidos, v. 16, n. 5, p. 2, 2000.
MBOW, M. L. et al. Phlebotomus papatasi sand fly salivary gland lysate down-
regulates a Th1, but up-regulates a Th2, response in mice infected with Leishmania
major. J Immunol, Fort Collins, v. 161, n. 10, p. 7-5571, 1998.
MELBY, P. C. et al. Regional differences in the cellular immune response to
experimental cutaneous or visceral infection with Leishmania donovani. Infec
Immun, Estados Unidos, v. 66, n. 1, p. 18 - 27, 1998.
MENCKE, N. et al. Repelent efficacy of a combination containing Imidacloprid and
Permethrin against sandflies (phlebotomus papatasi) on dogs. Parasitol Res,
Alemanha, v. 90, p. 11-108, 2003.
MILANO, S. et al. Ex vivo evidence for PGE
2
and LTB
involvement in cutaneous
leishmaniasis: relation with infection status and cytokine production. Parasit,
Campinas, v. 112, n. 1, p. 13-9, 1996.
MILES, S. A. et al. A role for IgG immune complexes during infection with the
intracellular pathogen Leishmania. J Exp Med, Natal, v. 201, n. 5, p. 54-747, 2005.
60
Katrine Bezerra Cavalcanti
MILON, G. et al. Immunobiology of experimental cutaneous leishmaniasis. Parasitol
Today, Paris, v. 11, n. 7, p. 7-244, 1995.
MITCHELL, G. F. et al. Resistance and abrogation of resistance to cutaneous
leishmaniasis in reconstituted BALB/c nude mice. Aust J Exp Biol Med Sci,
Austrália, v. 59, n. 5, p. 54-539, 1981.
MOMEN, H. et al. Leishmania infantum, the aethiological agent of American visceral
leishmaniasis (AVL)? Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 82, p. 8-447,
1987.
MOORE, K. W. et al. Interleukin-10. Ann Rev Immun, Califórnia, v. 7, p. 90-165,
1993.
MORO, O.; LERNER, E. A. Maxadilan, the vasodilator from sand flies, is a specific
pituitary adenylate cyclase activating peptide type I receptor agonist. J Biol Chem,
Estados Unidos, v. 272, n. 2, p. 70-966, 1997.
MOSMANN, T. R. et al. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition
according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol,
Estados Unidos, v. 136, n. 7, p. 57-2348, 1986.
MOSMANN, T. R.; SAD, S. The expanding universe of T-cells subsets: Th1, Th2 and
more. Immunol Tod, Estados Unidos, v. 17, n. 3, p. 46-138, 1996.
NORSWORTHY, N. B. et al. Sand fly saliva enhances Leishmania amazonensis
infection by modulating interleukin-10 production. Infect Immun, Califórnia, v. 72, n.
3, p. 7-1240, 2004.
PEARSON, R. D.; SOUSA, A. Q. Clinical spectrum of Leishmaniasis. Clin Infect Dis,
Estados Unidos, v. 22, n. 1, p. 1-13, 1996.
PENNA, H. A. Leishmaniose visceral no Brasil. J Bras Med, São Paulo, v. 48, p. 50-
949, 1934.
PHIPPS, R. P. et al. A new view of prostaglandin E regulation of the immune
response. Immun Tod, Estados Unidos, v. 12, p. 52-349, 1991.
61
Katrine Bezerra Cavalcanti
PITTA, M. G. R. et al. IL-17 and IL-22 are associated with protection against human
kala azar caused by Leishmania donovani. The J Clin Invest, França, v. 119, n. 8, p.
87-2379, 2009.
RANGEL, E. F.; VILELA, M. L. Lutzomyia longipalpis (Diptera, Psychodidae,
Phlebotominae) and urbanization of visceral leishmaniasis in Brazil. Cad Saude
Publica, Rio de Janeiro, v. 24, n. 12, p. 52-2948, 2008.
REINER, S. L.; LOCKSLEY, R. M. The regulation of immunity to Leishmania major.
Annu Rev Immunol, São Francisco, v. 13, p. 77-151, 1995.
RESENDE, M. C. et al. Seasonal variation of Lutzomyia longipalpis in Belo
Horizonte, State of Minas Gerais. Rev Soc Bras Med Trop, Uberaba, v. 39, n. 1, p.
5-51, 2006.
RIBEIRO, J. M. Role of saliva in blood-feeding by arthropods. Annu Rev Entomol,
Estados Unidos, v. 32, p. 78-463, 1987.
RIBEIRO, J. M. et al. Simulium vittatum (Diptera: Simuliidae) and Lutzomyia
longipalpis (Diptera: Psychodidae) salivary gland hyaluronidase activity. J Med
Entomol, Washington, v. 37, n. 5, p. 7-743, 2000.
______. et al. Salivary glands of the sand fly Phlebotomus papatasi contain
pharmacologically active amounts of adenosine and 5'-AMP. J Exp Biol, Washigton,
v. 202, n. 11, p. 9-1551, 1999.
RINCON, M. et al. Interleukin (IL) 6 directs the differentiation of IL-4 production CD4
+
T cells. J Exp Med, Estados Unidos, v. 185, p. 9-416, 1997.
RIOUX, J.A. et al. Taxonomy of Leishmania. Use of isoenzymes. Suggestion for a
new classification. Ann Parasitol Hum Comp, Montpellier , v. 65, n. 3, p. 15-111,
1990.
ROHOUSOVA, I. et al. Detection of species-specific antibody response of humans
and mice bitten by sand flies. Parasitology, Turquia, v. 130, n. 5, p. 9-493, 2005.
SABROZA, P. Epidemiologia das leishmanioses. Rio de Janeiro, 2006. Disponível
em: < http://www.fiocruz.br/ccs/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=355 &sid=6>.
Acesso em: 5 jan. 2010.
62
Katrine Bezerra Cavalcanti
SACKS, D. L. Metacyclogenesis in Leishmania promastigotes. Exp Parasitol,
Estados Unidos, v. 69, n. 1, p. 3-100, 1989.
SACKS, D. L.; PERKINS, P. V. Development of infective stage Leishmania
promastigotes within phlebotomine sand flies. Am J Trop Med Hyg, Estados Unidos,
v. 34, n. 3, p. 9-456, 1985.
SAMUELSON, J. et al. A mouse model of Leishmania brasiliensis infection produced
by co-infection with sand-fly saliva. J Exp Med, Boston, v. 173, p. 54-49, 1991.
SANTOS, S. O. dos. et al. Incrimination of Lutzomyia cruzi as a vector of American
visceral leishmaniasis. Med Vet Entomol, Mato Grosso do Sul, v. 12, n. 3, p. 7-315,
1998.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Manual de vigilância e controle da leishmaniose
visceral. [S.l.]: [s.n], 2003.
SCHOELER, G. B.; WIKEL, S. K. Modulation of host immunity by haematophagous
arthropods. Ann Trop Med Parasitol, Estados Unidos, v. 95, n. 8, p. 71-755, 2001.
SCOTT, P.; FARREL, J. P. Experimental cutaneous leishmaniasis: induction and
regulation of T cells following infection of mice with Leishmania major. Chem
Immunol, [S.l.], v. 70, p. 60-80, 1998.
SHAW, J. J.; LAINSON, R. Ecology and epidemiology. In: KILLICK-KENDRICK, P.
R. The Leishmaniasis in Biology and Medicine. [S.l.]: Acad Press, 1978. p. 1-120.
SHERLOCK, I. A. Ecological interactions of visceral leishmaniasis in the state of
Bahia, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 91, n. 6, p. 83-671, 1996.
SOLBACH, W.; LASKAY, T. The host response to Leishmania infection. Adv
Immunol, Alemanha, v.74, p. 275-317, 2000.
STOCKINGER, B.; VELDHOEN, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Cur
Opinion Immunol, Londres, v.19, p. 6-218, 2007.
TESH, R. B. The genus Phlebovirus and its vectors. Ann Rev Entomol, Estados
Unidos, v. 33, p. 81-169, 1988.
63
Katrine Bezerra Cavalcanti
THEODOS, C. M. et al. Analysis of the enhancing of sand fly saliva on infection with
Leishmania in mice. Infec Immun, Boston, v. 59, p. 8-1592, 1991.
THEODOS, C. M.; TITUS, R. G. Salivary gland material from the sand fly Lutzomyia
longipalpis has an inhibitory effect on macrophage function in vitro. Parasite
Immunol, [S.l.], v.15, n. 8, p. 7-481, 1993.
TITUS, R. G. Salivary gland lysate from the sand fly Lutzomyia longipalpis
suppresses the immune response of mice to sheep red blood cells in vivo and
concanavalin A in vitro. Exp Parasitol, Boston, v. 89, n. 1, p. 6-133, 1998.
TITUS, R. G. et al. The immunomodulatory factors of arthropod saliva and the
potential for these factors to serve as vaccine targets to prevent pathogen
transmission. Parasite Immunol, Boston, v. 28, n. 4, p. 41-131, 2006.
TITUS, R. G.; RIBEIRO, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia
longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science, Boston, v. 239, n. 4845, p. 18-
1306, 1988.
TITUS, R. G. et al. Interactions between Leishmania major and macrophages.
Immun Ser, Boston, v. 60, p. 59-437, 1994.
VALENZUELA, J. G. et al. Toward a defined anti-leishmania vaccine targeting vector
antigens: characterization of a protective salivary protein. The J Exp Med, Estados
Unidos, v. 194, n. 3, p. 42-331, 2008.
VALENZUELA, J. G. The salivary apyrase of the blood-sucking sand fly Phlebotomus
papatasi belongs to the novel cimex family of apyrase. The J Exp Med, Estados
Unidos, v. 204, n. 2, p. 37-229, 2004.
VALENZUELA, J. G. et al. The D7 family of salivary proteins in blood sucking diptera.
Insect Mol Biol, Estados Unidos, v. 11, n. 2, p. 55-149, 2002.
VOLF, P. et al. Molecular crosstalks in Leishmania-sandfly-host relationships.
Parasite, República Tcheca, v. 15, n. 3, p. 43-237, 2008.
WALTERS, L. L. et al. Ultrastructural development of Leishmania chagasi in its
vector, Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae). Am J Trop Med Hyg, New
Haven, v. 41, n. 3, p. 295-317, 1989.
64
Katrine Bezerra Cavalcanti
WARBURG, A. et al. Saliva of Lutzomyia longipalpis sibling species differs in its
composition and capacity to enhance leishmaniasis. Philos Trans Royal Soc Lond,
Reino Unido, v. 354, p. 30-223, 1994.
WARBURG, A.; SCHLEIN, Y. The effect of post-bloodmeal nutrition of Phlebotomus
papatasi on the transmission of Leishmania major. Am J Trop Med Hyg, New
Haven, v. 36, n. 5, p. 30-926, 1986.
XIMENES, Maria de Fátima Freire Melo. et al. Effect of abiotic factors on seasonal
population dynamics of Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) in northeastern
Brazil. J Med Entomol, Lanham, v. 43, n. 5, p. 5-990, 2006.
______. Phlebotomine (Diptera: Psychodidae) and leishmaniasis in Rio Grande do
Norte State Brazil: anthropic environment responses. Neotrop Entomol,
Piracicaba,
v. 36, n. 1, p. 37-128, 2007.
______. et al. Characteristics of the biological cycle of Lutzomyia evandroi Costa
Lima & Antunes, 1936 (Diptera: Psychodidae) under experimental conditions. Mem
Inst Osw Cruz , Rio de Janeiro, v. 96, n. 6, p. 6-883, 2001.
______. et al. Distribution of phlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae) in the
state of Rio Grande do Norte, Brazil. J Med Entomol, Lanham, v. 37, n. 1, p. 9-162,
2000.
______. et al. Density of sand flies (Diptera: psychodidae) in domestic and wild
animal shelters in an area of visceral Leishmaniasis in the state of Rio Grande do
Norte, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 94, n. 4, p. 32-427, 1999.
XU, D. et al. CD4+ CD25+ Regulatory T cells supress differentiation and functions of
Th1 and Th2 cells, Leishmania major infection, and colitis in mice. The j Immunol,
Bethesda, v. 170, p. 9-394, 2003.
YAMEY, G.; TORREELE, E. The world's most neglected diseases. Bmj, Londres, v.
325, n. 7357, p. 7-176, 2002.
YOUNG, D.; ARIAS, J. Phlebotomine sandflies in the Americas. P. A. H.
Organization,[S.l. : s.n.], 1991.
65
Katrine Bezerra Cavalcanti
YOUNG, D. G; DUNCAN, M. A. Guide to the Identification and Geographic
Distribution of sand Flies in Mexico, The Wets Indies, Central and South
America Diptera: Psycodidae, [S.l.], 1994.
ZENEWICZ, L. A. et al. Interleukin-22 but not interleukin-17 provides to hepatocytes
during acute liver inflammation. Immun, New Have, v. 27, p. 59-647, 2007.
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