ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA
DAVILENE GIGO BENATO
ANÁLISE DA REGENERAÇÃO DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS EM
LESÕES MODERADAS E GRAVES SOB AÇÃO DO LASER DE BAIXA
INTENSIDADE.
SÃO CARLOS - SP
2010
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA
DAVILENE GIGO BENATO
Orientador: Prof. Dr. Nivaldo Antonio Parizotto
ANÁLISE DA REGENERAÇÃO DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS EM
LESÕES MODERADAS E GRAVES SOB AÇÃO DO LASER DE BAIXA
INTENSIDADE.
Apoio Finaceiro: FAPESP-Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São
Paulo. Proc. N° 06/52931-4
SÃO CARLOS – SP
2010
Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Fisioterapia da Universidade Federal de
São Carlos, como parte dos requisitos para
a obtenção do título de Doutora em
Fisioterapia.
ads:
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária/UFSCar
G461ar
Gigo-Benato, Davilene.
Análise da regeneração do nervo isquiático de ratos em
lesões moderadas e graves sob ação do laser de baixa
intensidade / Davilene Gigo Benato. -- São Carlos : UFSCar,
2010.
61 f.
Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,
2010.
1. Fisioterapia. 2. Laserterapia. 3. Axôniotmese. 4.
Neurotomia. 5. Função neuromuscular. 6. Metaloproteinase
(MMP-2). I. Título.
CDD: 615.82 (20
a
)
MEMBROS
DA
BANCA
-RA
PARA
DEFESA
DE
TESE DE
DavaaC
Gig0
Bemato,
APRESENTADA
A0
PROGRAMA
DE
POS
GRADUACAO
EM
KSIO-IA
DA
UNIWERSIBADE
FEDERAL
DE
SAO
CARLOS,
EM
17
DE
MAR@
DE
2010.
BANCA
EXAMINADORA:
(UFSCar)
A
do..
ana
Macher
Teodori
(UNIMEP)
#(--.
Stela
r
la
M
ttiello
Gon~alves Rosa
Dedicatória
Á Deus por colocar tudo em
minha vida no seu devido tempo e
lugar.
Aos meus familiares e amigos por
toda sua colaboração e carinho
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos aqui citados pela ajuda na realização dessa dissertação (ordem
alfabética):
Ademar amigo marceneiro que construiu nosso “corredor” para a realização do
teste funcional.
Aluna: Érika Harumi Tanaka, pela dedicação, força de vontade, disciplina, por
me ajudar sempre nos experimentos mesmo na hora do almoço, feriados e festas.
Ressalto aqui minha grande gratidão pela super ajuda. Não foi uma simples
ajudante, mas sim, uma colaboradora.
Professoras Ana Beatriz de Oliveira e Anielle Cristhine de Medeiros Takahashi
pela ajuda na utilização do software Matlab e por terem montado a rotina para nós, e
lógico pelo grande companheirismo.
Carla Tim, sem essa maravilhosa pessoa não sei o que seria da minha tese.
Obrigada do fundo do coração por todos os esforços que fez. Feriados importantes
foram perdidos para me ajudar. Obrigada parceira.
Colegas de laboratório: Carla, Charles Taciro, Elaine, Jaqueline, Lívia, Poliani,
Natália, Renan, Vivian Cury. Obrigada por sempre me darem uma forcinha nas
horas de dificuldade.
Colegas de laboratório Plasticidade Muscular (vizinhos): Carolina, Cristina,
Christiani, Esperanza, Gabriel, João, Marcela, Sabrina , Paula, Teresa e Thiago.
Obrigada por toda a ajuda e paciência que sempre tiveram comigo, vocês são
realmente muito amigos.
FAPESP por me subsidiar por esses anos e me apoiar na pesquisa com a reserva
técnica.
Profa. Heloísa Selistre, por me ceder seu laboratório de fisiologia (UFSCar) e
sua estrutura para alguns procedimentos.
Profa. Juanita Anders por me receber tão bem em seu laboratório no Department
of Anatomy, Physiology and Genetics Uniformed Services University of the Health
Sciences. Agradeço todas as discussões e ensinamentos que contribuíram muito para
o enriquecimento desse trabalho.
Secretárias da pós-graduação Kelly e Cris, por sempre me darem uma mãozinha
nas questões burocráticas da Universidade.
Ms. Lívia Ribeiro de Assis pelas análises da zimografia e ajuda no processo de
coleta de material para análise dos grupos da axoniotmese.
Fisiot. Marcela, obrigada pela sua disponibilidade para sempre me ajudar, pelo
processamento e análises dos músculos e ajuda em geral dentro do laboratório.
Profa. Marisa, por ceder seu laboratório de Fisiologia-UFSCar e seus
equipamentos, assim como seu pessoal para me auxiliar.
Profa. Marise do laboratório de Fisiologia-UFSCar, por ter cortado e corado
todos os nervos em historesina.
Prof. Milton Benato (Mirtão), pelas ajudas das traduções e versões de inglês.
Prof. Doutor Nivaldo Antonio Parizotto por me acolher em seu laboratório com
tanta alegria e me acompanhar nessa tragetória .
Profa Tania de Fátima Salvini por me ceder o espaço do seu laboratório, pelas
orientações e análises dos músculos. Principalmente pelo apoio de “mãe”.
A técnica de laboratório Teresa que sempre me ajudou a preparar soluções e
dava dicas interessantes.
Doutor Thiago Luiz de Russo por ter me ajudado em todas as etapas de todo
esse trabalho. A palavra “obrigada” é pouco por tudo que ele fez nessa tese. Sem
ele, com certeza essa tese não teria sido finalizada. Obrigada também por ter sido
tão companheiro e dedicado.
Xingia técnica da Profa. Juanita Anders no Department of Anatomy, Physiology
and Genetics Uniformed Services University of the Health Sciences. Agradeço todos
os ensinamentos, e discussões.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIAÇÕES
RESUMO
ix
ABSTRACT
x
1. INTRODUÇÃO
01
1.1. Ação da Leserterapia no tecido nervoso
03
1.2. Ação do laser na regeneração do nervo
05
2. OBJETIVO
11
3. MATERIAIS E MÉTODOS
12
3.1. Animais
12
3.2. Procedimentos Cirúrgicos
12
3.2.1. Protocolo de lesão por esmagamento
12
3.2.2. Protocolo de lesão término-terminal
13
3.3. A Laserterapia (Aplicação do Laser)
14
3.3.1. Protocolo de Aplicação do Laser Pós- Axoniotmese
14
3.3.2. Protocolo de Aplicação do Laser Pós-Neurorrafia Termino-terminal
15
3.4. Grupos Experimentais
15
3.5. Avaliação Funcional
16
3.6. Avaliação Morfológica e Imunofluorescência
17
3.7. Avaliação Morfométrica das Fibras Nervosas Regeneradas
18
3.8. Avaliação do Músculo
18
3.9. Análise zimográfica
19
3.9.1. Dosagem de proteínas
19
3.9.2. Zimografia
19
3.10. Avaliação Estatística dos Dados
20
4. RESULTADOS
21
4.1 Grupos com esmagamento do nervo
21
4.1.1. Teste Funcional
21
4.1.2. Histologia dos músculos Tibiais Anteriores (TA)
24
4.1.3. Área de Secessão transversa (AST) das fibras musculares
25
4.1.4. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no músculo TA
25
4.1.5. Análise histológica do Nervo Ciático
26
4.1.6. Análise Morfométrica do Nervo Ciático
30
4.1.6.1. Número de Fibras por campo
30
4.1.6.2. Área de secção transversa (AST) da mielina, axônio e fibras nervosas.
30
4.1.7. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no nervo ciático
31
4.2. Grupos neurorrafia Termino-Terminal
33
4.2.1. Teste Funcional
33
4.2.2. Histologia dos músculos TA (Tibial Anterior)
34
4.2.3. Área de secção transversa (AST) das fibras musculares
36
4.2.4. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no músculo TA
36
4.2.5 Histologia do nervo ciático
37
4.2.5.1. Análise histológica do Nervo Ciático
37
4.2.6. Área de secção transversa do nervo ciático
41
4.2.6.1. Número de fibras nervosas
41
4.2.6.2. Área de secção transversa (AST) de mielina, axônio e fibra nervosa.
41
5. DISCUSSÃO
43
6. CONCLUSÃO
50
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
51
ANEXO 1. Atividades Realizadas No Período
58
ANEXO 2. Artigo Submetido À Publicação-2010
61
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Procedimento de lesão de esmagamento. 12
Figura 2.
Cirurgia Neurorrafia termino-terminal. 13
Figura 3.
Parâmetros de aplicação do laser. 14
Figura 4.
Análise funcional da marcha do rato. 16
Figura 5.
Resultado do teste funcional CR660nm. 22
Figura 6.
Resultado do teste funcional CR780nm. 22
Figura 7.
Cortes histológicos transversais do ventre dos músculos TA. 24
Figura 8.
Área de Secção Transversa (AST) dos músculos TA. 25
Figura 9.
Atividade total da MMP2 nos grupos CR. 26
Figura 10.
Cortes histológicos dos nervos axoniotmisados. 28
Figura 11.
Cortes histológicos dos nervos axoniotmisados com anti-S100. 29
Figura 12.
Número de fibras nervosas por campo microscópico dos nervos ciáticos nos
diferentes grupos experimentais.
30
Figura 13.
Área de secção transversa de mielina, axônio e fibra nervosa em nervo ciático
dos diferentes grupos experimentais.
31
Figura 14.
Atividade total da MMP-9 observada nos diferentes grupos experimentais. 32
Figura 15.
Atividade total da MMP-2 observada nos diferentes grupos experimentais. 33
Figura 16.
Índice funcional do nervo ciático nos diferentes grupos experimentais. 34
Figura 17.
Cortes histológicos transversais do ventre dos músculos TA. 35
Figura 18.
Área de Secção Transversa (AST) dos músculos TA dos diferentes grupos
experimentais.
36
Figura 19.
Atividade total da MMP-2 observada nos diferentes grupos experimentais. 37
Figura 20.
Cortes histológicos dos nervos ciáticos, impregnados com tetróxido de ósmio. 39
Figura 21.
Cortes histológicos transversais dos nervos axoniotmisados marcados com
anti-S100
40
Figura 22.
Número de fibras nervosas por campo microscópico dos nervos ciáticos nos
diferentes grupos experimentais.
41
Figura 23.
Área de secção transversa da bainha de mielina, axônio e fibra nervosa em
nervo ciático dos diferentes grupos experimentais.
42
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AChRs
Receptores de acetilcolina .
AST:
Área de Secção Transversa.
BCA:
Ácido bicinconínico.
CR:
Crush = esmagamento.
GaAlAs: Arseneto de Gálio e Alumínio.
IFC:
Índice Funcional do Ciático.
J:
Joule.
J/cm
2
:
Joule Por Centímetro Quadrado.
JNM:
Junção Neuro Muscular.
MEC:
Matriz Extracelular.
M.:
Músculo.
MMPs:
Metaloproteinases de Matriz.
mW:
Mili Watts.
Nm:
Nanômetros.
N:
Normal.
PO:
pós-operatório.
TA:
Tibial Anterior.
TGF- β1:
Fator de Crescimento Transformador Beta 1.
TIMP:
Inibidores Teciduais das Metaloproteinases.
TNF α:
Fator de Necrose Tumoral Alfa..
TT:
Neurorrafia Termino-Terminal.
vi
RESUMO
O objetivo do estudo foi analisar a ação dos lasers de baixa intensidade (GaAlAs) com
diferentes comprimentos de ondas (660 e 780 nm), em diferentes densidades de energia (10
J/cm², 60 J/cm² e 120 J/cm2) na regeneração do nervo ciático do rato após lesões moderadas
(axoniotmese) e graves (neurotmese). Para tal, 128 ratos Wistar (275 g) foram divididos em
16 grupos: Para axoniotmese: Normal (N); axoniotmese (CR); axoniotmese irradiado com
laser 660 nm com 10 J/cm2 (CR660 10J); CR660 60J; CR660 120J; CR780 10J; CR780 60J;
CR780 120J. Para neurotmese: N; neurotmese (TT); TT660 10J; TT660 60J; TT660 120J;
TT780 10J; TT780 60J; TT780 120J. A estimulação a laser foi realizada com potência fixa de
40 mW e área do feixe de 4,0 mm2. O laser foi aplicado durante 10 dias consecutivos, a partir
do primeiro dia do pós-operatório nos nervos com axoniotmese e neurotmese. Entretanto, para
os grupos neurotmese foi acrescido de mais um mês de aplicação em dias alternados. Os
músculos tibiais anteriores (TA) e os nervos ciáticos foram avaliados após 28 (axoniotmese) e
84 dias (neurotmese) após a cirurgia. Para investigar a área de secção transversa (AST) das
fibras musculares, axônios, mielina e fibra nervosa; número de fibras nervosas foi feita
morfometria. A atividade das metaloproteinases de matriz (MMPs) 2 e 9 foi realizada para
observar o remodelamento da matriz. O índice funcional do nervo ciático foi para avaliar a
função. A imunoflorescência com anticorpo S-100 foi utilizada para a observar a bainha de
mielina e células de Schwann. Os dados foram submetidos a testes de homogeneidade e
normalidade. Os testes Anova one-way seguido por Tukey e Kruskal-Wallis seguido por
Newman-Keuls foram usados em amostras paramétricas e não paramétricas, respectivamente.
Um nível de significância de 5% foi adotado. Os resultados deste estudo mostram que os
grupos axoniotmese irradiados com lasers 660 nm 10 e 60 J/cm2, 780 nm 10 e 120 J/cm2
apresentaram AST da fibra nervosa e da mielina semelhante aos valores normais. O laser 660
nm, independente da densidade de energia utilizada, acelerou a recuperação da atrofia
muscular e aumentou a atividade da MMP-2 nos nervos ciáticos dos grupos axoniotmese. Ele
também reduziu a atividade da MMP-9 nos nervos e da MMP-2 nos músculos. Todos os
animais submetidos à axoniotmese recuperaram a função normal após 28 dias de lesão. Em
relação aos grupos neurotmese, foram observados valores superiores de AST da bainha de
mielina e de fibra nervosa no grupo TT660 120J comparado ao TT. Valores de AST das fibras
musculares foram superiores ao TT nos grupos TT660 60 e 120J e TT780 10J. Estes
parâmetros de laser também foram eficientes em promover a diminuição da atividade de
MMP-2 nos músculos TA. Todos os grupos submetidos à neurotmese não recuperaram
totalmente a função após 84 dias de lesão. Com base no objetivo proposto podemos concluir
vi
que a laserterapia, em determinados protocolos de aplicação, mostrou-se efetiva na
recuperação do nervo, evitou a atrofia do muscular e atuou no remodelamento da matriz
extracelular do músculo e do nervo periférico via regulação das MMPs.
Palavras Chave: Axoniotmese, Neurotmese, regeneração do nervo ciático, Laser terapia de
baixa intensidade.
vi
ABSTRACT
Peripheral nerves are frequently target of traumatic injuries and their functional
recovery is generally incomplete. The aim of the present study was to evaluate the
effects of 660 or 780 nm low-level laser therapy (LLLT) GaAlAs using different energy
densities (10, 60 and 120 J/cm2) on nerve sciatic recovery after severe (neurotmesis) or
moderate (axonotmesis) injuries in rat. One hundred and twenty eight Wistar male rats
(275g) were divided into 16 groups, and they were performed as follow: For
axonotmesis: Normal (N); axonotmesis (CR); axonotmesis and 660 nm LLLT with 10
J/cm2 irradiation (CR660 10J); CR660 60J; CR660 120J; CR780 10J; CR780 60J;
CR780 120J. For neurotmesis: N; neurotmesis (TT); TT660 10J; TT660 60J; TT660
120J; TT780 10J; TT780 60J; TT780 120J. The LLLT irradiation was performed using
a fix potence of 40 mW and a spot area of 4 mm2. Nerves submitted to axonotmesis or
neurotmesis were irradiated with LLLT daily during 10 consecutive days starting on the
first post-operatory. However, neurotmesis groups received additionally one month of
LLLT applied every other day. Tibialis anterior (TA) muscles and sciatic nerve were
evaluated 28 (axonotmesis) and 84 (neurotmesis) after surgery. The follow analyses
were performed: muscle fiber, axon, myelin and nerve fiber cross-sectional area (CSA);
matrix metalloproteinases (MMP) 2 and 9 activities; sciatic functional index; S-100
immunofluorescence. Data were submitted to homogeneity and normality tests. Anova
one-way followed by Tukey tests and Kruskal-Wallis followed by Newman-Keuls tests
were performed when data was parametric or non-parametric, respectively. Significance
level was set at 5%. The results of the present study showed that groups irradiated with
660 nm LLLT with 10 or 60 J/cm2, and 780 nm 10 or 120 J/cm2 showed normal values
of nerve fiber and myelin CSA. The 660 nm LLLT, regardless the energy density used,
accelerated muscle fiber recovery and increased the MMP-2 activity in nerve.
Furthermore, it also decreased the MMP-9 and MMP-2 activities in nerves and muscles
respectively. All axotomized animals recovery normal levels of function on the 28 day
after surgery. Regarding neurotmesis groups, TT660 120J presented higher values of
myelin and nerve fiber CSA compared to TT. Superior values of muscle fiber CSA were
observed in TT660 60 e 120J e TT780 10J compared to TT. These LLLT parameters
were also efficient to decrease MMP-2 activity in TA muscles. All groups submitted to
neurotmesis did not recover normal function after 84 days of injury. Based on the
proposed objective, it is possible to conclude that LLLT, considering specific protocols
vi
of application, recovered nerves effectively, avoided muscle fiber atrophy and acted on
the muscle and nerve extracellular matrix remodeling via MMPs regulation.
1
1. INTRODUÇÃO
As lesões nervosas periféricas são ocorrências clínicas comuns que afetam principalmente os
nervos que percorrem os membros periféricos (EVANS et al., 2005) causando muita
incapacidade (GIGO BENATO et al., 2005). Segundo um estudo realizado nos EUA, 50 mil
sujeitos sofrem lesões traumáticas nos nervos a cada ano
(MILESI et al.,2000 ; EVANS et
al.,2001). Num estudo brasileiro, de 456 casos analisados, 45% das lesões nervosas periféricas
eram do tipo axoniotmese, 41% neurotmese e 14 % neuropraxia. (KOUYOUMDJIAN et al.,
2006).
A gravidade do dano nervoso pode variar muito em relação às dimensões do evento
traumático (LUNDBORG, 2000). O tempo de recuperação varia de acordo com a extensão da
lesão, tanto na axoniotmese quanto na neurotmese (LUNDBORG, 2000). Em lesões graves em
que há a ruptura total no nervo, como na neurotmese, é necessária a intervenção cirúrgica
(SEDDON et al., 1943 ; SUNDERLAND 1978; LUNDBORG, 2000). Na lesão do tipo
axoniotmese, mesmo com a preservação dos tubos endoneurais, se a compressão for muito
extensa, as fibras axonais demoram um tempo considerável para crescer (SEDDON et al., 1943 ;
SUNDERLAND 1978), e quanto mais tardio o restabelecimento das conexões neuromusculares,
mais atrofia muscular se desenvolve. Com isso, prolonga-se o tempo para restabelecer a função
neuromuscular (RCHKIND, GEUNA & SAINBERG, 2009,b). Contudo, além do tipo da lesão
(axoniotmese ou neurotmese), é importante considerar também sua extensão e o tipo de
intervenção cirúrgica. Essas três características interferem no prognóstico de recuperação pós-
lesão nervosa periférica (GIGO-BENATO et al., 2005).
Além das alterações ocorridas no nervo, outro tecido que é bastante afetado após uma lesão
nervosa periférica é o músculo esquelético. A inervação é um fator crítico para a integridade
funcional e estrutural do músculo (ISHIDO, KAMI & MITSUHIKO, 2004; KOSTROMINOVA,
2005). A lesão do nervo causa uma profunda perda de massa e capacidade de geração de força do
músculo (BILLINGTON & CARLSON, 1996; DOW, 2004). As lesões nervosas periféricas
podem causar muitas modificações na estrutura, metabolismo e expressão gênica do músculo
esquelético. Uma mudança importante que ocorre quando músculos tornam-se desnervados é o
aumento de receptores de acetilcolina (AChR) no sarcolema. Os receptores de acetilcolina são
normalmente expressos na junção neuromuscular em músculos inervados. Entretanto, a
2
desnervação causa aumento e proliferação de AChRs extrajuncionais. Alguns autores vêem isso
como um tipo de “sinal” que causa brotamentos de novos axônios dos nervos e também como
uma forma de preparação para a formação de uma nova junção neuromuscular (LIEBER, 2002).
O músculo quando é desnervado, ocorre um remodelamento da matriz extracelular (Demestre
et al, 2005) e as metaloproteinases de matriz (MMPs) tem um papel importante nas modificações
dessa matriz extracelular (SCHOSER & BLOTTNER, 1999; AHTIKOSKI et al., 2004;
DEMESTRE et al., 2005). As MMPs são uma família de enzimas proteolíticas zinco-dependentes
que podem ser sintetizadas e secretadas por células presentes no músculo esquelético, como as
células de Schwann, axônios, células satélites e fibroblastos (CARMELI 2004). As funções das
MMPs no músculo desnervado ainda não são bem esclarecidas e apenas alguns estudos
investigaram seu papel nas doenças neuromusculares (KHERIF et al., 1998; SCHOSER &
BLOTTNER, 1999; KOSKINEN et al., 2000; SCHOSER, BLOTTNER & STUERENBURG,
2002; AHTIKOSKI et al, 2004; DEMESTRE et al., 2005). Em músculos normais de
camundongo, a MMP-2 e a 9 foram localizadas na junção neuromuscular (JNM), em células de
Schwann e no perineuro de nervos intramusculares (KHERIF et al., 1998). Entretanto, depois da
lesão por esmagamento, as MMPs permanecem presentes na JNM (KHERIF et al., 19988,
DEMESTRE et al., 2005) mas também podem ser encontradas ao redor de fibras musculares,
capilares, na matriz extracelular ou em células mononucleadas (DEMESTRE et al., 2005).
Dentre as metaloproteinases de matriz a MMP-2 (gelatinase A) e a MMP-9 (gelatinase B) são
enzimas chaves no processo de remodelamento da matriz extracelular no músculo esquelético
durante mudanças de demanda de atividade e respostas frente a lesões (CARMELI et al., 2004).
Ambas são conhecidas por degradar a forma não fibrilar de colágeno tipo IV, desnaturar
colágenos intersticiais, assim como a matriz extracelular (AHTIKOSKI et al., 2004).
O remodelamento da matriz extracelular no nervo também é importante para compreender o
processo de reestruturação do nervo pós-lesão. Apesar das MMPs serem muito estudadas, ainda
não está claro e definido quais são os papéis que cada uma desempenha no sistema nervoso (C.I.
PLATT et al., 2003). Estudos sugerem que a MMP-2 e MMP-9 estão envolvidas na facilitação do
crescimento axonal ao longo da matriz do nervo após axoniotmese ( C.I. PLATT et al., 2003;
HEINE et al. ,2004,).
Autores questionam que a MMP-2 possa degradar colágeno, principalmente o tipo IV, que é
rico no segmento distal do nervo pós-esmagamento. Eles acreditam que essa degradação do
3
colágeno possa criar canais pelos quais os brotos axonais possam crescer. O aumento da atividade
da MMP2 está intimamente relacionado ao aumento do fator de necrose tumoral (TNF α) que é
secretado pela célula de Schwann, após uma lesão do nervo (SHUBAYEV & MYERS, 2000;
SIEBERT et al.,2001). Já a alta atividade da MMP-9 é mais encontrada no segundo e terceiro dia
pós-lesão, quando ocorre infiltração de macrófagos no nervo lesado. Estes macrófagos
(juntamente com as células de Schwann) são responsáveis pela eliminação de mielina e outros
detritos na região nervosa distal à lesão. O aumento no início da MMP-9 pode ajudar a quebrar a
barreira sangue- nervo e, assim, facilitar a infiltração de macrófagos do sangue para o tecido
nervoso. (LA FLEUR ET AL., 1996, C.I. PLATT ET AL., 2003). A barreira sangue nervo
impede seletivamente a passagem de substâncias para o espaço extracelular que envolve as fibras
nervosas no endoneuro, limitando a penetração de macromoléculas e controlando a passagem de
íons para o espaço endoneural, protegendo as fibras nervosas de vários agentes nocivos
(CAVANAGH, 1990). Outra possível hipótese é que os macrófagos residentes possam ser
ativados após esmagamento do nervo, contribuindo para estimular a atividade MMP-9 (C.I. Platt
et al., 2003).
A regeneração nervosa periférica já é um fato fundamentado e, por esta razão, pesquisas são
realizadas no intuito de detalhar os fatores, mecanismos, terapêuticos e técnicas designadas à
restauração nervosa (CRISCI & FERREIRA, 2002). Todavia, a recuperação funcional é muito
relativa entre um paciente e outro sendo raramente completa (AZZE & MATTAR, 2000) e nem
sempre satisfatória (SUNDERLAND, 1978; LUNDBORG, 2000). Portanto, se dá muita
importância ao tratamento de recuperação no pós-operatório, com a finalidade de garantir a todos
os pacientes a suficiente restauração da função neuromuscular.
Partindo dessa necessidade de restabelecer a função neuromuscular, o processo de
reabilitação conta com várias terapias físicas, tais como, laser de baixa intensidade, ultrassom,
estimulação elétrica, entre outros, na tentativa de influenciar positivamente a melhora da função
(GIGO-BENATO et al., 2005).
1.1. Ação da Laserterapia no tecido nervoso
A laserterapia na regeneração do nervo recebeu uma crescente atenção por volta de 20 anos
atrás (ROCHKIND & OUAKNINE,1992; ANDERS et al., 2004). Porém, a ação do laser no
4
sistema nervoso ainda não está bem definida, mas durante a última década grandes avanços
ocorreram para a compreensão dos efeitos celulares e moleculares da aplicação do laser nos
tecidos biológicos (TURNER & HODE, 2003).
Com base nos resultados obtidos até hoje, principalmente estudos in vitro, várias teorias
foram desenvolvidas para explicar as alterações que a laserterapia exerce, como por exemplo,
mudanças nas estruturas biológicas, tais como o aumento de síntese de ATP ou (GAGLIARDI,
ATLANTE & PASSARELLA, 1997; AMAT et al., 2005) a proliferação celular (KREISLER et
al., 2003)
Estudos in vitro mostraram que a laserterapia induz o crescimento massivo de neuritos em
neurônios em cultura. (WU et al., 19870; 2009 ;WOLLMAN, ROCHKIND & SIMANTOV,
1996). A laserterapia parece acelerar o crescimento precoce das células nervosas. As células
irradiadas com o laser já crescem 24 horas após seu cultivo. Na primeira semana essas células
irradiadas podem conter alto número de neurônios, com um citoplasma grande, fibras neuronais
ramificadas, interligadas e formando redes. Esse padrão de crescimento das células cultivadas e
irradiadas mostra-se acelerado ao se comparar com o normal. O desenvolvimento padrão é que
esses neurônios crescem e se tornam grandes somente após várias semanas em cultura.
(ROCHKIND et al., 2009 a).
Outro possível mecanismo de ação do laser no tecido nervoso é a ação neuroprotetora, que
facilita o processo de regeneração das fibras nervosas. A aplicação da laserterapia após lesão do
nervo inibe a atividade do óxido nítrico (um agente neurotóxico) e aumenta a expressão do fator
de crescimento transformador β1 (TGF-β1) (LEUNG et al., 2003). Uma fascinante hipótese é que
a laserterapia possa guiar os cones de crescimento neuronal in vitro, talvez devido à sua interação
com a proteína citoplasmática, e particularmente, a um aumento da proliferação em direção a
margem do axônio (EHRLICHER et al., 2002). Além disso, há demonstração experimental que a
irradiação a laser seja capaz de estimular a proliferação das células de Schwann de ratas in vivo
apontando para outro mecanismo de efeito direto no crescimento do axônio. Essa evidência
comprova que a laserterapia exerce um efeito de regeneração nervosa periférica (VAN
BREUGEL & BAR, 1993). Considerando a presença de um número adequado de células de
Schwann como sendo um fator importante no sucesso da regeneração nervosa, a laserterapia
desempenha uma ação gliotrófica que representa uma forte indicação a favor de seu uso no pós-
traumático ou pós-cirúrgico na reparação nervosa periférica (GEUNA et al., 2003).
5
Além do laser terapêutico exercer ação direta nos componentes neurais, ele auxilia na função
dos músculos desnervados que podem ser restaurados parcialmente num grau muito considerável,
se o tratamento for iniciado logo após a lesão do nervo (ROCHKIND et al., 2009 a, b,c,d).
1.2. Ação do laser na regeneração do nervo
Por mais que existam vários estudos in vitro que investiguem a real efetividade da
laserterapia na regeneração do nervo ainda existem muitas controvérsias (GIGO-BENATO,
GEUNA &. ROCHKIND, 2005; ANDERS, GEUNA & ROCHKIND, 2004) sobre a escolha do
melhor protocolo de tratamento (tipo de comprimento de onda e densidade de energia) para cada
tipo de lesão nervosa periférica. A laserterapia tem demonstrado ser efetiva na aceleração da
recuperação da função neuromuscular. Numa recente revisão crítica da literatura (GIGO-
BENATO, GEUNA &. ROCHKIND, 2005; ANDERS, GEUNA & ROCHKIND,2004), mostrou-
se que mais de 80 % dos estudos experimentais, conduzidos até hoje sobre o uso da laserterapia
na promoção da regeneração nervosa periférica, levam a uma positiva recuperação nervosa após
axoniotmese e após cirurgia reparadora. As características de cada artigo estão apresentadas em
uma tabela atualizada com os estudos relacionados ao tema (Tabela 1).
Os estudos publicados na década de 80 se basearam no uso do modelo de axoniotmese
(ROCHKIND et al., 1988; ROCHKIND & OUAKNINE, 1992). Esses estudos concluíram que a
laserterapia foi efetiva na recuperação nervosa. Os efeitos desta laserterapia foram medidos em
um curto espaço de tempo, ou seja, dentro de dias e minutos assim como em longo prazo por
vários dias e meses (ROCHKIND et al., 1986; ROCHKIND et al., 1987 a,b; ROCHKIND &
OUAKNINE, 19920). No modelo experimental em curto prazo, foi aplicado o laser diretamente
no nervo ainda exposto (ROCHKIND, BARR-NEA & VOLGER, 1990; ROCHKIND &
OUAKNINE, 1992). Os comprimentos de onda 540 nm, 632 nm e 780 nm foram os que
produziram os melhores efeitos. Já no modelo a longo prazo, o nervo ciático foi estimulado
diretamente. Os autores encontraram, segundo a atividade eletrofisiológica, uma redução da
atividade após a lesão de esmagamento nos nervos não irradiados, mas o uso da laserterapia
(comprimento de onda de 632.8 nm, densidade de energia de 10 J/cm²) melhorou o potencial de
ação após a lesão por esmagamento no período a longo prazo (ROCHKIND et al., 1987a;b;
ROCHKIND & OUAKNINE, 1992). A aplicação da laserterapia após lesão por esmagamento
aumentou o crescimento axonal, acelerando a recuperação do nervo ciático (ROCHKIND et al.,
1987a ; ROCHKIND et al., 1987b; ROCHKIND & OUAKNINE, 1992).
6
Existem trabalhos que mostram que se o laser for aplicado tanto no segmento da medula
espinhal correspondente ao nervo, quando no nervo lesado, o tempo e a qualidade da recuperação
nervosa são melhores do que aqueles grupos que só receberam irradiação no nervo (ROCHKIND
et al., 2001; SHAMIR et al., 2001; LEUNG et al., 2002; LUCAS et al., 2002, WU et al., 2009).
Estudos demonstram a aplicação de laser na medula e no nervo é eficiente para a indução de
proliferação de astrócitos e oligodendrócitos, com isso, levando a uma diminuição das mudanças
degenerativas no nervo. Isto sugere um aumento do metabolismo nos neurônios, quando
submetidos à influência do tratamento a laser e melhora a habilidade de produção de mielina
(ROCHKIND, BARR-NEA & VOLGER, 1990). A laserterapia aplicada na medula também tem
sido estudada e mostrou uma grande perspectiva nas lesões medulares. Um estudo verificou que a
aplicação transcutânea de laser 810 nm durante 14 dias consecutivos (1,589 J/cm
2
ao dia) sobre a
medula espinhal levou a um maior número de axônios e melhora da função neuromuscular em
animais com lesão medular, em comparação ao grupo que não recebeu o tratamento (WU et al.,
2009).
Estudos experimentais usaram a laserterapia após lesão de esmagamento, demonstraram que a
laserterapia promove a regeneração nervosa (KHULLAR et al., 1995; SHIN et al., 2003), nervo
fibular (HAMILTON, KEVEN & RAY, 1992), e facial (ANDERS et al., 1993). Khullar (1995) e
seus autores, aplicaram transcutaneamente o laser 820nm (48 J/cm²), por 28 dias, iniciado a partir
do primeiro dia do pós-operatório, mostraram que, ocorreu uma aceleração na recuperação ,nos
animais tratados em comparação aos não tratados. Um resultado similar foi obtido num estudo o
qual utilizou o laser de comprimento de onda de 630 nm (emissão de irradiação contínua) com
aplicação transcutânea a partir do primeiro dia do pós-operatório, num período de somente cinco
dias, em lesão por axoniotmese no nervo ciático (SHIN et al., 2003). Esses resultados sugerem
que a laserterapia é mais efetiva quando aplicada logo após o período pós-traumático. Um estudo
conduzido por Hamilton, Keven e Ray (1992) os quais irradiaram (laser 632.8 nm, 3,52 J/cm²,
aplicação transcutânea) o nervo fibular esmagado de coelho já a partir do primeiro dia pós-lesão,
durante 15 dias, demonstrou uma melhora significativa na recuperação do potencial de ação em
comparação com o grupo não tratado.
Anders e colaboradores (1993) realizaram um o estudo mais completo comparando diferentes
comprimentos de onda de laser (361 nm, 470 nm, 514 nm, 632.8 nm, 1061 nm) sobre a
regeneração do nervo facial. Os resultados desse estudo confirmaram todos os estudos anteriores
7
que demonstraram que a fototerapia aplicada transcutaneamente, diariamente, a partir do primeiro
dia do pós-operatório, leva a um significante aumento da velocidade de regeneração dos axônios
nos nervos faciais em comparação aos animais não tratados. (ANDERS et al., 1993; ANDERS,
GEUNA & ROCHKIND, 2004). Neste estudo, todos os comprimentos de onda foram efetivos na
estimulação da regeneração após lesão nervosa, mas o melhor resultado foi obtido pelo laser de
comprimento de onda de 632,8 nm.
Um estudo (BAGIS et al., 2003) não encontrou nenhum efeito da laserterapia na recuperação
nervosa periférica. Os nervos ciáticos dos ratos receberam esmagamento bilateral, um dos lados
foi estimulado com laser de comprimento de onda de 904 nm, com diferentes densidades de
energia (0,31 J/cm² e 19 J/cm²), e o outro nervo serviu como controle da lesão. A eletrofisiologia
e a morfologia destes nervos não mostraram diferenças significantes entre lesão e lesão mais
irradiação. Entretanto, é difícil dizer que o resultado desse estudo seja fortemente confiável, pois
é difícil considerar resultados negativos usando o lado contra lateral “não tratado” como controle.
Principalmente se considerarmos que a laserterapia pode exercer efeitos sistêmicos, além da ação
da regeneração nervosa, (ROCHKIND et al., 1989), contudo o uso do lado contralateral é
inapropriado nesse contexto.
Seis estudos experimentais contribuíram com novas e importantes informações no que diz
respeito aos resultados obtidos sobre modelo de lesão de neurotmese e tratamento com o laser.
No primeiro estudo a laserterapia no pós-operatório demonstrou ser efetiva na promoção da
regeneração nervosa periférica, no caso de transecção completa e reparação término-terminal
(SHAMIR et al., 2001). Esse estudo aplicou transcutaneamente o laser, com comprimento de
onda de 780 nm, por 30 minutos, durante 21 dias consecutivos na região da cirurgia do nervo
ciático, assim como na medula espinhal. A resposta somatossensorial positiva foi encontrada em
69% dos ratos irradiados em comparação com os 18 % dos ratos não irradiados. A avaliação com
imunoistoquímica do grupo tratado com laser mostrou maior intensidade de crescimento axonal e
melhor qualidade de regeneração, com um aumento do número de fibras nervosas de médio e
grande diâmetro. Esta descoberta sugere que a laserterapia aumenta o processo regenerativo após
a lesão completa e sutura término-lateral no nervo.
O segundo estudo utilizou a técnica término-terminal em coelhos da Nova Zelândia. Uma boa
regeneração foi observada nos grupos tratados com laser, representada pelo maior calibre dos
axônios dos nervos e uma espessa camada de bainha de mielina em comparação ao grupo não
8
tratado. Esse estudo utilizou comprimento de onda 901 nm com laser diodo (10 diodos, potência
média de 2 mW de repetição de pulso) GaAlAs, irradiação foi feita a partir do primeiro dia do
pós-operatório, por dez dias consecutivos (MOHAMMED, AL-MUSTAWFI & KAKA, 2007).
Alguns pesquisadores acreditam que o laser possa auxiliar no processo cicatricial já no momento
da cirurgia, ajudando unir os dois cotos e melhorando o prognóstico da função (MOHAMMED,
AL-MUSTAWFI & KAKA, 2007; JOHNSON et al., 2007; O'NEILL et al., 2009 ).
O terceiro investigou os efeitos da laserterapia no pós-operatório do nervo alveolar inferior
reparados com tubulização (tubo Gore-tex) em coelhos. O resultado demonstrou que a
laserterapia promoveu a regeneração nervosa, ao longo do enxerto sintético, o qual serviu como
uma ponte para a junção dos dois cotos. No local onde o nervo alveolar inferior foi reparado, foi
aplicado o laser de 820-830 nm transcutaneamente com 29 J/cm², em um ponto, por quatro dias
consecutivos, iniciado a partir do primeiro dia do pós-operatório, seguido de seis sessões
adicionais, uma vez por semana por seis semanas. A investigação morfológica sobre a
regeneração nervosa demonstrou que ocorreu uma melhora no diâmetro das fibras nervosas em
comparação com o não tratado (MILORO et al., 2002).
No quarto estudo, ainda relacionado com tubulização [(tubo=ácido poliglicólico), (PGA
Neurotube)], foi retirado um segmento do nervo ciático do rato (0,5 cm) e foi colocado o enxerto.
O laser 780 nm (200 mW) foi aplicado 14 dias consecutivo, tanto na lesão distal, no tubo e
proximal do nervo ciático, quanto na região correspondente ao nervo na medula espinhal (L3-
L6). A eletrofisiologia após três meses de lesão mostrou que 70% dos animais irradiados tiveram
resposta positiva. O teste funcional confirmou os resultados dos grupos irradiados com o laser
que melhoraram sua função comparada com os não irradiados. Os animais tratados com laser
mostram maior crescimento axonal em comparação com os não irradiados (ROCHKIND et al,
2009a;b;c;d).
O quinto estudo (GEUNA et al., 2003; GIGO-BENATO et al., 2004) foi sobre o efeito
positivo da laserterapia na regeneração do nervo mediano de rato reparado com a neurorrafia
término-lateral no nervo ulnar intacto como doador. Após os ratos serem operados eles receberam
a laserterapia por três semanas, três dias alternados, iniciadas a partir do primeiro dia do pós-
operatório e foram comparados com o grupo operado com aplicação simulada (sham). Os lasers
(808 nm e 905 nm) foram utilizados transcutaneamente, pontual no local da cirurgia, com
densidade de energia 29 J/cm² e 40 J/cm² respectivamente. O resultado do estudo duplo cego
9
randomizado mostrou que a laserterapia induziu a uma significante e rápida mielinização,
regeneração das fibras nervosas e recuperação da massa muscular, resultando num significativo
rápido aumento da função em comparação com o grupo controle.
No sexto estudo, Chen (2005) relatou a ocorrência de um efeito inibidor sobe a emissão do
laser pulsado no comprimento de onda de 904 nm (densidade de energia aplicada: 2,33 a 15,5
J/cm²) no nervo ciático do rato. Esse efeito inibidor pode ser devido à utilização de um tubo de
silicone de 10 milímetro de comprimento entre os cotos distais e proximais para a união dos
cotos. O resultado negativo é de difícil interpretação, visto que foi obtido de um modelo
experimental diferente dos outros em vários aspectos como o: 1) Uso de um tubo guia de silicone
(o qual poderia interferir com a luz nesse comprimento de onda); 2) Uso de irradiação pulsada em
alta freqüência (5-20 KHz); 3) Iniciaram a laserterapia após a primeira semana da cirurgia; 4)
Estimulação prolongada (por 2 meses); 5) e tamanho de enxerto muito grande. Portanto, neste
resultado o protocolo de estimulação a laser não só foi ineficaz quanto impediu a recuperação
nervosa, com isso, revelou impróprio o seu uso.
Como foi possível notar pela revisão da literatura, existem resultados conflitantes sobre o uso
da laserterapia. Tais resultados podem ser resultantes de inúmeras variáveis técnicas (em
particular o comprimento de onda, doses e tipos de irradiação) os quais se não forem
adequadamente ajustados poderão reduzir o eventual sucesso do procedimento terapêutico
(GIGO-BENATO,GEUNA & ROCHKIND, 2005).
Seguindo essa necessidade de estabelecer protocolos clínicos de aplicação da laserterapia
ainda não testados. Este estudo teve a intenção continuar aprofundar a análise dessa irradiação
sobre o nervo, focalizando especial atenção na escolha do tipo de comprimento de onda do laser,
nos parâmetros de irradiação e também dois tipos de modelos experimentais de lesões nervosas
(neurotmese e axoniotmese), os quais são aspectos relevantes nas perspectivas de aplicação em
pacientes. Podendo assim, acelerar o prognóstico de recuperação desse indivíduo.
10
Autor (País) Ano
Tipo de nervo
lesão/reparação
Modelo
Experimental
Tipo de laser
Comprimento
de Onda
Tempo de
Emissão
Protocolo de tratamento
Formas de
mensuração
Resultados
Efeitos
Rochkind et al.
(Israel)
1987b esmagamento n. ciático do rato HeNe(contínuo) 632.8 nm 14 min
1° dia pós-op.,por 20 dias
consec.(tot. = 20)
Eletrofisiológica
morfológica
positivo
Rochkind et al.
Israel
1987b esmagamento n. ciático do rato HeNe(contínuo) 632.8 nm 7 min
1° dia pós-op.,por 20 dias
consec.(tot. = 20)
Eletrofisiológica
morfológica
positivo
Hamilton et al.
(USA)
1992 esmagamento
n. fibularl do
coelho
HeNe 632.8 nm 9 min
1° dia pós-op.,por 15 dias
consec.(tot. = 15)
eletrofisiológica positivo
Anders et al. (USA) 1993 esmagamento n. facial do rato HeNe (contínuo) 632.8 90 min
1° dia pós-op.,por 7-9 dias
consec.(tot.= 7-9)
morfológica positivo
Khullar et al.
(Noruega)
1995 esmagamento n. ciático do rato GaAlAs 820 nm 85 S
1° dia pós-op.,por 28 dias
consec.(tot. = 28)
funcional
eletrofisiológica
morfológica
positivo
Shin et al. (Coréia) 2003 esmagamento n. ciático do rato
Semicondutor
(contínuo)
650 nm 5min
1° dia pós-op.,por 5 dias
consec.(tot. = 5)
Funcional
morfológica
positivo
Bagis et al.
(Turquia)
2003 esmagamento n. ciático do rato GaAs (pulsado) 904 nm 15 min
1° dia pós-op.,por 7 dias
consec.(tot. = 7)
Eletrofisiológica
morfológica
nenhum
Shamir et al.
(Israel)
2001
Neurorafia termino-
terminal
n. ciático do rato AsGaAl(contínuo) 780 nm 30 min
1° dia pós-op.,por 20 dias
consec.(tot. = 21)
Eletrofisiológica
morfológica
positivo
Miloro et al. (USA) 2002
Tubulização com
Gore-Tex
(8mm)(bilateral)
n. alveolar
inferior do
coelho
GaAlAs (contínuo)
820-830 nm 90 s
1° dia pós-op., por 4 dias
consec, mais 1 dia por semana
por 6 semanas (tot. = 10)
morfológica positivo
Gigo-Benato et al.
(Brasil-Itália)
2003
Neurorrafia termino-
lateral no nervo
Ulnar
n. mediano do
rato
InGa(Al)As
(contínuo) InGaAs
(pulsado)
808nm 905 nm 39s
1° dia pós-op., 3 dias por
semana por 3 semanas (tot. =
9)
Funcional
morfológica
positivo
Che net al. 2005
Tubulização tubo-
silicone (10 mm)
n. ciático do rato
As GaAl (pulsado)
GaAs (pulsado)
905 nm 904 nm 72 s 2min
Início 2°sem pós-op por 7
sem dias alternados
Eletrofisiológica
morfológica
negativo
Rochkind et al.
(Israel)
2007
Tubulização PGA
Neurotube (5 mm)
n.ciático do rato (contínuo) 780 nm
5 min Por
ponto (6
pontos) Total
30 min
14 dias consec .(tot. = 14)
funcional
eletrofisiológica
morfológica
positivo
Mohammed et al.
(Iraque)
2007
Neurorrafia termino-
terminal
n. fibular
coelhos da Nova
Zelandia
GaAlAs diodo 901 nm 10 min
1° dia pós-op.,por 10 dias
consec.(tot. = 11)
Morfologia
Morfometria
Positivo
Wu et al. (Estados
Unidos)
2009
Hemisecção dorsal
Contusão dorsal
Medula T9/10
ratos
diodo 810 nm 2,997 s
15 min após lesão por 14 dias
consec.(tot. = 15)
Morfologia Marcação
retrógrada Funcional
Teste de campo aberto
Positivo
Tabela 1. Principais caracterís
ticas dos principais estudos.
11
2. OBJETIVO
Analisar a regeneração do nevo isquiático de ratos, em lesões moderadas (axoniotmese) e
graves (neurotmese) , sob ação do laser de baixa intensidade, com comprimentos de ondas de 660
nm e 780 nm, com potencia fixa de 40mW, em diferentes densidades de energia de 10 J/cm², 60
J/cm² e 120 J/cm
2
.
12
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Neste estudo foram utilizados ratos, albinos, Wistar (Rattus norvegicus), adultos (275 g), num
total de 128 animais divididos em 16 grupos. Os animais foram mantidos ao longo de todo o
experimento em gaiolas individuais, com comida e água ad libitum, e ambiente com temperatura
e luminosidade controlada. O experimento foi conduzido segundo as normas internacionais de
ética na experimentação animal e foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal UFSCar (Parecer n°
001/06).
3.2. Procedimentos Cirúrgicos
Os animais foram previamente pesados e submetidos à anestesia geral (quetamina 95 mg/kg e
xilazina 12 mg/kg). Foi realizada a tricotomia e assepsia na face posterior do membro inferior
direito dos animais. Foram posicionados em decúbito ventral. Em seguida, foi feito o afastamento
dos músculos glúteo médio e mínimo para produzir uma abertura longitudinal na face posterior
da coxa, com aproximadamente dois centímetros de comprimento, para visualização do nervo
ciático.
3.2.1. Protocolo de lesão por esmagamento
Para criar uma lesão reproduzível e padronizada, foi utilizada uma pinça que exerceu uma
força de 54 N por um período de 30 s, ao longo de 3 mm do comprimento do nervo ciático, 10
mm acima da sua bifurcação (BEER, STEURER & MEYER, 2001; VAREJÃO, 2004). A pinça
era introduzida dentro da cavidade e era feita a pressão sem tracionar o nervo.
A
B
Figura 1. Procedimento de lesão de esmagamento. A) Pinça de Pressão padronizada 54N, esmagando o
nervo ciático. Foto meramente ilustrativa, para exposição do nervo para a foto. B) Nervo ciático
aproximadamente 30 segundos após esmagamento.
13
3.2.2. Protocolo de lesão término-terminal
O nervo ciático sofreu um corte transversal ao seu eixo e após a neurotmese o coto proximal
do nervo foi suturado ao coto distal com um fio de sutura monofilamento 8.0. A sutura foi
realizada na região do epineuro dos nervos. Esse procedimento microcirúrgico foi realizado
através da visualização por lupa cirúrgica com ampliação de quatro vezes.
Durante ambos os procedimentos cirúrgicos, o campo da cirurgia foi mantido úmido com
solução fisiológica a 0,9 %. Após a lesão do nervo o músculo glúteo foi suturado com fio
monofilamento de nylon 6.0 e a pele com fio de sutura 4.0. Após a cirurgia os animais foram
colocados isoladamente em gaiolas e alimentados com comida e água ad libitum. Por quatro dias
foi adicionado à água Paracetamol 750mg (13,5 mg/100 ml) para a redução da dor. Uma dose
única de antibiótico terramicina (1mg/0,1mL) foi administrada para evitar complicações
secundárias referentes a possíveis infecções.
Figura 2. Cirurgia Neurorrafia termino-terminal. Foto ilustrativa da cirurgia, a sutura é somente na
região epineural.
14
3.3. A Laserterapia (Aplicação do Laser)
A estimulação a laser foi realizada com o laser de baixa intensidade (GaAlAs e AsGaIn),
devidamente calibrado e aplicado com emissão contínua transcutânea pontual, tanto o
comprimento de 660 nm quanto o de 780 nm com potência fixa de 40 mW. A área do feixe era de
0,04 cm
2
. O tempo de aplicação por ponto variou de acordo com a densidade de energia aplicada,
ilustrada na figura 3.
Comprimento de
Onda
Potência Fixa
para todos
Densidade de
energia
Energia total
emitida por
ponto
Tempo de
emissão em
minutos
660 nm 40 mW 10 J/cm
2
4 J 1/2
660 nm 40 mW 60 J/cm
2
24 J 1
660 nm 40 mW 120 J/cm
2
48 J 2
780 nm 40 mW 10 J/cm
2
4 J 1/2
780 nm 40 mW 60 J/cm
2
24 J 1
780 nm 40 mW 120 J/cm
2
48 J 2
Para evitar variabilidade no manuseio, todos os animais operados foram estimulados
manualmente tanto na aplicação simulada quanto na do laser. Os animais não foram anestesiados
nos procedimentos terapêuticos. Um pano escuro era colocado no dorso do animal cobrindo sua
face até o quadril, a mão do aplicador ficava posicionada sobre o pano, para imobilização do
animal. Deste modo, era aplicado o laser na região da lesão.
3.3.1. Protocolo de Aplicação do Laser Pós-Axoniotmese
Aplicação foi realizada diariamente por 10 dias consecutivos, a partir do primeiro dia do pós-
operatório, em dois pontos ao longo do nervo ciático (dois centímetros de distância entre eles), um
na região mais proximal, e o outro ponto na região mais distal da lesão. Os ratos foram
tricotomizados antes de todas as aplicações do laser. Os ratos não tiveram tratamento por 19 dias.
Figura 3. Parâmetros de aplicação do laser. Energia por ponto = dose (J/cm
2
) x área do spot (cm
2
).
15
3.3.2. Protocolo de Aplicação do Laser Pós-Neurorrafia Término-terminal
Aplicação foi realizada diariamente por 10 dias consecutivos, a partir do primeiro dia do
pós-operatório, em dois pontos ao longo do nervo ciático (dois centímetros de distância entre
eles), um na região mais proximal, e o outro ponto na região mais distal da lesão.
Após o décimo primeiro dia foi iniciada a aplicação do laser em dias alternados por um
mês. Depois do tratamento eles ficaram 43 dias sem aplicação do laser.
3.4. Grupos Experimentais
Os grupos experimentais foram chamados somente como “J” somente para abreviar o nome
dos grupos apresentados e discutidos nesse trabalho. Portanto o “J” nos grupos representa J/cm
2
.
Os grupos animais foram divididos em 16 e tiveram 8 animais por grupo (n:8):
Grupos experimentais:
1.Com lesão de esmagamento (Crush – CR) do nervo
1. a) N Normal
1. b) Crush (CR) axoniotmese
1. c) CR 660 + 10 J/cm²
1. d) CR 660 + 60 J/cm²
1. e) CR 660 + 120 J/cm²
1. f) CR 780 + 10 J/cm²
1. g) CR 780 + 60 J/cm²
1. h) CR 780 + 120 J/cm²
2. Com neurorrafia término-terminal
2. a) N Normal
2. b) Término-Terminal (TT)
2. c) TT 660 + 10 J/cm²
2. d) TT 660 + 60 J/cm²
16
A B C
D
2. e) TT 660 + 120 J/cm²
2. f) TT 780 + 10 J/cm²
2. g) TT 780 + 60 J/cm²
2. h) TT 780 + 120 J/cm²
3.5. Avaliação Funcional
A avaliação da recuperação nervosa calculada pelo índice funcional do ciático (SFI) que foi
descrito por Bain, Mackinnon & Hunter (1989). Os animais foram treinados, três vezes seguidas, a
caminhar em um corredor que mede 42 cm de comprimento e 8,2 cm de largura. Após o treino,
um papel branco colocado no assoalho do corredor possibilitou o rato caminhar sobre ele e
registrar suas pegadas das patas posteriores, previamente coradas com tinta de carimbo. As
mensurações foram feitas pelo mesmo avaliador por meio de uma régua. Três medidas foram
obtidas a partir das impressões destas patas (1) PL= distância do 3º dedo ao calcâneo; (2) TS =
distância do 1º ao 5º dedo; (3) ITS = distância do 2º ao 4º dedo. Após todas as medidas feitas tanto
na pata experimental (E) quanto na normal (N) o índice funcional do ciático foi calculado de
acordo com a equação proposta por Bain, Mackinnon & Hunter (1989) :
Figura 4. Análise funcional da marcha do rato. A) Marca de uma pata de rato, e como são feitas as medidas.
B) Representação em uma pata natural de um animal. C) A execução do teste. D) Fórmula numérica para
aquisição do índice funcional do ciático. Varejão et al., 2004
17
3.6. Avaliação Morfológica e Imunofluorescência
Após 30 dias (para os grupos axoniotmese) e 84 dias (para o grupo neurorrafia término-
terminal) da intervenção cirúrgica, os nervos ciáticos reparados foram isolados e removidos dos
animais sob anestesia total, assim como os músculos tibiais anteriores (TA), inervados pelo nervo
ciático, analisados para avaliar a recuperação do trofismo muscular. Para o estudo com
axoniotmese, quatro nervos foram imediatamente congelados imediatamente em nitrogênio
líquido e armazenados em freezer -86ºC; outros quatro foram usados para a análise morfológica.
Após a dissecação dos tecidos os animais foram eutanasiados com overdose de anestésico.
Já para o estudo com neurotmese, oito nervos foram usados para a análise morfológica e
morfométrica.
Para a análise morfológica tem-se então: cada nervo (parte distal) foi dividido
transversalmente em dois segmentos. Um foi fixado em glutaraldeído e incluído em resina, para
análise morfométrica, o outro foi fixado em praformaldeído e incluído em parafina, para análise
de imunofluorescência. Para a inclusão em historesina e em parafina, foram utilizados os
procedimentos de rotina. Basicamente para a inclusão em parafina, os nervos foram fixados em
formol 10% em uma hora e armazenados em álcool 70%, foram desidratados e posteriormente
inclusos em parafina. Cortes transversais de 7 µm de espessura, paralelos ao eixo transversal do
nervo, foram feitos em um micrótomo da marca ANCAP. Para a inclusão em historesina os nervos
foram fixados em glutaraldeído 25% durante sete horas e armazenados em tampão sacarose e
azida sódica. Antes de serem inclusos em historesina os nervos foram impregnados com Tetróxido
de ósmio á 2%. Posteriormente, os nervos foram cortados transversalmente com 3 µm de
espessura. Para a observação dos grupos esmagados os cortes foram corados com azul de
toluidina.
Para análise de imunofluorescência, os cortes foram incubados por uma noite em solução
contendo anticorpo anti-S100 (policlonal produzido em coelho, com lócus de reconhecimento da
unidade monomérica para S-100 cálcio-englobando a proteína 21 KD bovina, diluição 1:800,
Sigma, St Louis, MO, USA) capaz de identificar mielina e células de Schwann. Após lavagem em
PBS, os cortes foram encubados por uma hora contendo o anticorpo secundário TRITC-conjugado
IgG anti-coelho (diluição de 1:200, Dako). Os cortes foram montados para análise em microscópio
18
de fluorescência. As imagens foram obtidas no microcópio Axiolab (Carl Zeiss, Jena, Alemanha) e
as fotos foram feitas no aumento da objetiva de 100x com a câmera HRc Carl Zeiss AxioCam.
3.7. Avaliação Morfométrica das Fibras Nervosas Regeneradas
Para análise morfométrica das fibras nervosas regeneradas, foi utilizado o método do
Systematic Random Sampling e do 2D-Dissector que foi descrito por Geuna ,Gigo-Benato &
Rodrigues (2004). As lâminas foram analisadas no microscópio Olympus CBA-K. As imagens
foram feitas, a 100x com a câmera Digital color SCC-131A Samsung e capturadas com o
programa Honestech Tvr 2.5.
Para a histomormometria foram feitas 12 imagens por nervo, seguindo um rigoroso esquema
de escolha do campo, depois essas imagens foram analisadas no programa: Image J Launcher
versão 1.41 (Wayne Rasband National Institutes of Health, USA / http://rsb.info.nih.gov/ij
). As
medidas realizadas foram: número de fibras nervosas por campo, área de secção transversa do
axônio, da bainha de mielina e da fibra nervosa. Os dados numéricos foram analisados por meio
do programa MATLAB.
3.8. Avaliação do Músculo
Os músculos TA direitos foram divididos em duas porções a partir do ventre muscular, um
fragmentado proximal foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido para a zimografia. O
fragmento distal foi congelado em isopentano pré resfriado em nitrogênio líquido e armazenado
em freezer -86ºC. Foram realizados cortes histológicos seriados (10 μm), na porção média do
músculo, em micrótomo criostato a -25ºC. Estes cortes foram corados com azul de toluidina (TB)
para análise da área de secção transversa das fibras musculares. Os músculos foram corados com
Trinômio de Masson para análise morfológica geral sobre a estrutura muscular entre os diferentes
grupos.
A morfometria da área de secção transversa das fibras musculares foi medida em microscopia
de luz, usando o software Axion Vision (Carl Zeis). A área de secção transversa de duzentas fibras
musculares, escolhidas aleatoriamente de cada músculo TA, foi mensurada a partir da imagem
obtida da região central do ventre muscular.
19
3.9. Análise zimográfica
A zimografia é uma técnica que utiliza gelatina como substrato em gel de SDS-PAGE,
permitindo verificar a atividade gelatinolítica de proteases teciduais. Neste caso, pretendemos
observar a atividade de MMPs, que são fortemente ativas durante processos de adaptação
muscular, sendo responsáveis, em grande parte, pelo processo de remodelamento do tecido
conjuntivo do músculo e do nervo. Fragmentos musculares e nervos congelados (25 mg) foram
lavados 3 a 4 vezes com salina gelada e incubados com o tampão de extração (ácido cacodílico 10
mM pH 5,0, NaCl 0,15 mM, ZnCl
2
1 μM, CaCl
2
20 mM, NaN
3
1,5 mM e Triton X-100 0,01%
[v/v]) a 4
o
C, com agitação contínua, durante 24 horas. As amostras foram então centrifugadas a
13000 rpm e o sobrenadante coletado.
3.9.1. Dosagem de proteínas
A concentração de proteínas dos nervos e dos músculos foi determinada utilizando-se o kit
BCA
TM
Protein Assays (Pierce), segundo instruções do fabricante. Esse método é baseado no
ácido bicinconínico (BCA) para detecção colorimétrica e quantificação de proteínas totais. Foi
construída uma curva padrão baseada nas concentrações de 25 µg/ml a 2000 µg/ml de BCA. As
absorbâncias da curva padrão e das amostras de interesse foram lidas a 562 nm e a concentração
protéica foi estimada a partir delas.
3.9.2. Zimografia
O extrato tecidual foi então testado quanto à presença de atividade gelatinolítica, conforme
descrito por Cleutjens et al (1995). Duplicatas de amostras foram eletroforisadas em gel de SDS-
PAGE com gelatina (100 mg/ml). Após a eletroforese, o gel foi lavado 2 vezes durante 30 minutos
em solução 2,5 % de Triton X-100 para remoção do SDS. Em seguida, separaram-se as duplicatas,
cortando-se o gel. Uma metade do gel foi incubada em tampão de substrato (Tris-HCl 50 mM pH
8,0, CaCl
2
5 mM e NaN
3
0,02%). A outra metade foi incubada no mesmo tampão contendo EDTA
(15 mM), para verificar se a protease é um metaloprotease, uma vez que o EDTA inibe sua
atividade. Ambas as metades foram incubadas a 37º C, durante 24 horas. Após este tempo, o gel
foi corado com Coomassie Blue por 30 minutos, descorado com ácido acético:metanol:água
(1:4:5) para visualização das bandas de atividade. Para documentação, o gel foi fotografado e as
bandas de atividade foram analisadas quanto sua densitometria no software Gene Tool da
Syngene.
20
3.10. Avaliação Estatística dos Dados
Os dados foram submetidos aos testes de Levene e Shapiro-Wilk para avaliar a
homogeneidade e normalidade das amostras, respectivamente. Para dados paramétricos, os testes
Anova one-way seguido por Tukey foram utilizados para identificar e localizar as diferenças,
respectivamente. Para dados não paramétricos, Kruskal-Wallis seguido por Newman-Keuls foram
utilizados. Um nível de significância de 5% foi adotado.
21
4. RESULTADOS
4.1. Grupos com esmagamento do nervo
4.1.1. Teste Funcional
As figuras 5 e 6 mostram os resultados da avaliação funcional da recuperação pós-traumática
do nervo ciático dos grupos que foram operados com a técnica de esmagamento, calculada por
meio do índice funcional do ciático. No momento pré-cirúrgico, todos os grupos estavam normais
e seus valores foram semelhantes e próximos à zero. No primeiro dia após a cirurgia, como era
esperado, ocorreu uma queda significativa do índice de todos os grupos experimentais. Os índices
se mantiveram baixos até o 12° dia, após esse período os grupos aproximaram-se dos níveis
considerados normais. Portanto a análise estatística ANOVA mostrou a diferença mais evidente
no momento pré-cirurgia, que foi quando os nervos ainda estavam normais, em comparação com o
pós-cirúrgico e a pré-eutanásia. Todas as avaliações entre os grupos, em todos os momentos
estudados, não detectaram mudanças entre os sete grupos (p>0,05).
22
Figura 5. Resultado do teste funcional CR660nm. Análise funcional da marcha, dos grupos dos nervos
esmagados e tratados com o laser 660 nm. CR crush. Medidas realizadas antes da lesão do nervo, e em dias
alternados. * Diferença estatística significante (p <0,05). Os números de 2° ao 28° são os dias que foram
realizados o teste funcional pós-lesão. Valores normais entre 0 á -20. J = J/cm
2
.
Figura 6. Resultado do teste funcional CR780nm Análise funcional da marcha, dos grupos dos nervos esmagados
e tratados com o laser 780 nm. CR controle lesado. Medidas realizadas antes da lesão do nervo, e em dias
alternados. * Diferença estatística significante (p <0,05). Os números de 2° ao 28° são os dias que foram
realizados o teste funcional pós-lesão. Valores normais entre 0 á -20. J = J/cm
2
23
4.1.2. Histologia dos músculos Tibiais Anteriores (TA)
A análise histológica por Tricrômio de Masson dos músculos TA mostrou uma atrofia das
fibras musculares dos grupos CR e CR780 10, 60 e 120J comparados ao grupo N e CR660 10,
60 e 120J (Fig. 7). Esta atrofia pode ser observada pela redução da área de secção transversa
das fibras musculares. A forma poligonal das fibras musculares foi preservada em todos os
grupos experimentais (Fig. 7). Os grupos submetidos à lesão nervosa periférica apresentaram
um aumento da produção de colágeno total principalmente no perimísio que recobre os feixes
de fibras musculares (Fig. 7).
Fibras musculares alvo foram encontradas próximas às terminações nervosas em todos os
grupos com lesão nervosa periférica. Estas fibras alvo são um indicativo que o processo de
reinervação está ocorrendo. As fibras musculares alvo apresentam sinais morfológicos de
reorganização da sua citoarquitetura, pois possuem uma região central arredondada com
filamentos desorganizados (Fig. 7).
24
Figura 7 Cortes histológicos transversais do ventre dos músculos TA dos diferentes grupos experimentais corados com Tricrômio de Masson.
Observe que os grupos CR e CR780 10, 60 e 120J apresentaram atrofia das fibras musculares em relação ao N. Cabeças de setas indicam aumento de
colágeno total no perimísio dos grupos submetidos à lesão nervosa periférica. Setas indicam a presença de fibras alvo, sendo um indicativo de
reinervação destas fibras. Asterisco (*) mostra uma terminação nervosa intramuscular. J = J/cm
2..
Escala da barra=20µm para todos os grupos, na
última a figura abaixo à direita 50µm.
25
4.1.3. Área de Secessão transversa (AST) das fibras musculares
A AST das fibras do músculo TA diminuiu significativamente nos grupos CR e CR780
comparados ao grupo N (P<0,05; Fig. 8). No grupo CR houve uma redução média de 55,11%
comparado a N (P<0,05; Fig. 8). Os grupos irradiados com laser 780 nm apresentaram uma
diminuição média de 44,47% na AST das fibras musculares (CR780 10J: -37,01%; CR780
60J: -51,77%; CR780 120J: -44,63%) comparados ao N (P<0,05; Fig. 8). Os valores de AST
das fibras musculares nos grupos irradiados com laser 660 nm não diferiram entre si e foram
semelhantes aos valores normais (P>0,05; Fig. 8).
4.1.4. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no músculo TA
A MMP-9 não foi detectada nos músculos TA em nenhum dos grupos experimentais.
A atividade da MMP-2 no grupo CR não diferiu dos valores normais (p>0,05; Fig. 9). O
laser com comprimento de onda de 660 nm nas diferentes doses (10, 60 e 120J) diminuiu
significativamente a atividade da MMP-2 quando comparado ao grupo N (p<0,05; Fig. 9).
Além disso, tanto CR660 10J quanto CR660 60J também apresentaram valores
significativamente menores na atividade de MMP-2 se comparados ao CR (p<0,05; Fig. 9).
Figura 8.. Área de Secção Transversa (AST) dos músculos TA dos diferentes grupos experimentais.
*p<0,05 comparado ao N. Note que a irradiação à laser 660nm acelerou a recuperação da AST das
fibras musculares independente da intensidade de energia aplicada. J = J/cm
2
26
Os grupos CR780 60J e CR780 120J apresentaram uma diminuição de atividade da MMP-
2 em comparação ao N e ao CR (p<0,05; Fig. 9). A atividade da MMP-2 em CR780 10J não
diferiu dos grupos N e CR (p<0,05; Fig. 9).
4.1.5. Análise histológica do Nervo Ciático
A figura 10 mostra a histologia dos nervos ciáticos corados com azul de Toluidina, de
todos os grupos lesados e também do grupo normal, que ilustram claramente similaridade de
organização estrutural em todos os grupos. Uma leve diminuição da AST da fibra pode ser
observada em todos os cortes dor nervos que foram esmagados em comparação ao grupo
normal. Esta leve atrofia pode ser observada mais evidente nos dois últimos grupos CR780
60J e 120J. Os nervos dos grupos que foram tratados com o laser 660 nm nas três densidades
de energia (10, 60 e 120 J/cm
2
) e o grupo CR780 10 J mostraram-se mais estruturados com as
fibras nervosas maiores comparados ao CR.
A figura 11 mostra um nervo marcado com anti-S100. Esta técnica nos possibilitou
observar a bainha de mielina e células de Schwann ao redor do axônio. No grupo N foi
Figura 9. Atividade total da MMP2 nos grupos CR. A Atividade total da MMP-2 observada nos
diferentes grupos experimentais. *P<0,05: comparado ao N; †P<0,05: comparado ao CR. Observe a
expressiva diminuição da atividade da MMP-2 nos grupos CR irradiados com laser 660 nm, em doses
baixas (10J); ou moderadas (60J). Observe os irradiados com laser 780 nm; em doses moderadas (60J)
ou elevadas (120J), comparado aos grupos N e CR. Bandas representativas da atividade gelatinolítica da
MMP-2 são apresentadas na parte superior do gráfico. J = J/cm
2
27
possível observar a organização das fibras nervosas, a bainha de mielinha bem evidenciada na
cor vermelha. Já nos grupos experimentais foi observada uma expressão similar de S-100
entre os grupos com axoniotomia, indicando um processo de regeneração e reestruturação da
fibra nervosa. Não houve diferenças aparentes entre os grupos com lesão nervosa periférica.
28
Figura 10. Cortes histológicos dos nervos axoniotmisados, corados com azul de toluidina. Seta
representa a fibra nervosa mielinisadas. Escala da barra 100µm. J = J/cm
2
29
Figura 11. Cortes histológicos transversais dos nervos axoniotmisados marcados com anti-S100. Observe a
bainha de mielina em vermelho. Cabeça de seta representa a estrutura normal da bainha de mielina; Seta mostra
o padrão de expressão de S-100 nos grupos axoniotomizados. Escala da barra 100µm. J = J/cm
2
30
4.1.6. Análise Morfométrica do Nervo Ciático
4.1.6.1 Número de Fibras por campo
O valor médio de fibras nervosas por campo foi de 135 ± 27, sendo que não houve
diferença entre o número de fibras nervosas entre os diferentes grupos experimentais (P>0,05;
Fig. 12).
4.1.6.2. Área de secção transversa (AST) da mielina, axônio e fibras nervosas.
A figura 13 mostra os valores de AST das mielinas, dos axônios e das fibras nervosas nos
nervos ciáticos nos diferentes grupos experimentais. Para a mielina, foi observada uma
redução na AST nos grupos CR, CR660 120J e CR780 60J comparados a N (P<0,05, Fig. 13).
Os grupos CR660 10 e 60J e CR780 10 e 120J apresentaram valores de AST de mielina
semelhante ao grupo N (P>0,05; Fig.13). Para o axônio, observou-se uma diminuição na AST
de todos os grupos com lesão nervosa periférica, comparados a N (P<0,05; Fig. 13). Não
houve diferença entre os grupos experimentais lesados (P>0,05; Fig.13). O comportamento da
AST da fibra nervosa acompanhou as alterações da mielina, isto é, os grupos CR660 10 e 60J
e CR780 10 e 120J apresentaram valores similares ao grupo N (P>0,05; Fig.13), enquanto que
Figura 12. Número de fibras nervosas por campo microscópico dos nervos ciáticos nos diferentes grupos
experimentais. Não houve diferença entre todos os grupos.
31
CR, CR660 120J e CR780 10 e 120J tiveram seus valores de AST reduzidos quando
comparados ao grupo N (P<0,05; Fig.13).
4.1.7. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no nervo ciático
A lesão nervosa não modificou a atividade da MMP-9 no grupo CR comparado ao N
(p>0,05). A irradiação com laser 660 nm, independente da dose utilizada, diminuiu a
atividade da MMP-9 nos nervos ciáticos lesados comparados ao CR (CR660 10J: -62%,
p=0,0002; CR660 60J: -68%, p=0,0001; e CR660 120J: -39%, p=0,03; Fig. 14). O grupo
CR780 10J apresentou uma redução significa da atividade da MMP-9 comparada ao N e ao
CR (p=0,02 e p=0,0001, respectivamente; Fig.14). Os grupos CR780 60 e 120J apresentaram
atividade de MMP-9 semelhante aos grupos N e CR (p>0,05. Fig.14).
Figura 13. Área de secção transversa das bainhas de mielina, dos axônios e das fibras nervosas em nervo
ciático dos diferentes grupos experimentais. *P<0,05 comparado ao N. Observe que os grupos CR660 10 e
60J e CR780 10 e 120J apresentaram valores de AST de mielina e fibra nervosa similares ao N. Todos os
grupos diminuiriam a AST do axônio comparados ao N. J= J/cm
2
.
32
A atividade da MMP-2 não foi alterada nos grupos CR e CR780 10, 60 e 120J comparada
ao grupo N (p>0,05; figura 15). No entanto, todos os grupos irradiados com laser 660 nm
tiveram a atividade da MMP-2 significativamente aumentada, se comparado ao grupo N
(CR660 10J: +81%, p=0,04; CR660 60J: +126%, p=0,003; e CR660 120J: +100%, p=0,02) e
CR (p<0,05; figura 15).
Figura 14. Atividade total da MMP-9 observada nos diferentes grupos experimentais.*p<0,05: comparado ao
grupo N; †p<0,05: comparado ao CR. Observe que todos os grupos irradiados com laser 660 nm e apenas o
grupo CR780 10J, apresentaram uma diminuição da atividade de MMP-9 comparada ao CR. Bandas
representativas da atividade gelatinolítica da MMP-9 são apresentadas na parte superior do gráfico.J= J/cm
2
.
33
4.2. Grupos neurorrafia Término-Terminal
4.2.1. Teste Funcional
Todos os grupos experimentais apresentaram valores similares ao N (P>0,05; Fig. 16) no
momento prévio à cirurgia (pré-TT). No entanto, já no primeiro dia todos os grupos TT,
irradiados ou não com laser, apresentaram valores médios em torno de -117. Estes valores não
diferiram entre si, mas foram inferiores aos seus valores pré-TT (P<0,05; Fig.16). No quarto
dia, houve uma diferença entre os grupos TT660 10J e TT780 60J, eles aumentaram em
comparação ao TT (P<0,05). Todos os grupos foram melhores que TT no décimo sexto dia
(P<0,05). No vigésimo quinto dia, os grupos TT660 60 e 120J e os grupos TT780 60 e 120J
apresentaram valores significativamente maiores que o grupo TT (P<0,05). Os grupos TT660
120J e todos os grupos TT780 foram melhores que o grupo TT no trigésimo sétimo e no
quadragésimo nono dias (P<0,05). Além disso, no dia 49 TT660 10J também teve um
desempenho melhor que TT (P<0,05). No dia 61, os grupos TT660 10J e TT780 60 e 120J
foram melhores que o TT. No final do experimento, todos os grupos experimentais lesados
Figura 15. Atividade total da MMP-2 observada nos diferentes grupos experimentais. *p<0,05: comparado os
grupos N e CR. Observe o aumento significativo da atividade da MMP-2 nos grupos irradiados com laser
660nm comparado ao N e CR. Bandas representativas da atividade gelatinolítica da MMP-2 são apresentadas
na parte superior do gráfico.J= J/cm
2
.
34
estavam menores que na pré-lesão (P<0,05; Fig.16), não houve diferenças significativas entre
eles ao final do experimento (P>0,05; Fig.16).
4.2.2. Histologia dos músculos TA
Cortes transversais dos músculos TA mostraram atrofia das fibras musculares nos grupos
TT, TT660 10J, TT780 60J e TT780 120J quando comparados ao N (Fig.17). Estas fibras
apresentaram uma forma arredondada diferente da forma poligonal da fibra muscular normal
(Fig.16). Todos os grupos lesados apresentaram fibras musculares anguladas, algumas fibras
com núcleos centralizados e degeneradas (Fig.17). Os grupos TT660 60J, TT660 120 e TT780
10J apresentaram fibras musculares com a arquitetura bem preservada e diâmetro
aparentemente similar ao grupo N (Fig.17).
Figura 16.. Índice funcional do nervo ciático nos diferentes grupos experimentais. *P<0,05 comparado ao
Pré-TT e ao N. Observe que já no primeiro dia, todos os grupos submetidos à cirurgia diminuíram seus
índices indicando uma piora da função. Esta diminuição manteve-se até o final do experimento. Todos os
grupos TT não alcançaram seus valores Pré-lesão (normais). Valores normais entre 0 á -20. J= J/cm
35
Figura 17. Cortes histológicos transversais do ventre dos músculos TA dos diferentes grupos experimentais corados com Azul de Toluidina. Observe
que os grupos TT, TT660 10J, TT780 60J e TT780 120J apresentaram atrofia das fibras musculares em relação ao N. As fibras musculares destes grupos
apresentaram uma forma arredondada característica de fibras desnervadas. Os grupos TT660 60 e 120J e TT780 10J possuíam fibras musculares com
arquitetura mais preservada. Em todos os grupos com TT irradiados ou não com laser foram observadas fibras anguladas (setas), fibras musculares com
núcleos centralizados (cabeça de seta) e fibras em degeneração. J= J/cm
2
.
36
4.2.3. Área de secção transversa (AST) das fibras musculares
A AST das fibras musculares diminuiu significativamente nos grupos TT (-41%, p =
0,0001), TT660 10J (-20%, p = 0,09), TT780 60 (-24%, p = 0,04) e 120J (-31%, p = 0,002)
comparados ao grupo N (Fig. 18). Os grupos TT660 60 e 120J e TT780 10J apresentaram
valores da AST das fibras musculares semelhantes ao N (P>0,05; Fig.18) e superiores ao TT
(TT660 60J: p = 0,005; TT660 120J: p = 0,01; e TT780 10J: p = 0,02, respectivamente;
Fig.18).
4.2.4. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no músculo TA
A MMP-9 não foi observada nos músculos TA nos grupos experimentais examinados.
A atividade da MMP-2 no grupo TT não diferiu dos valores normais (p>0,05; Fig. 19). O
laser com comprimento de onda de 660 nm nas diferentes doses (10, 60 e 120J) diminuiu
significativamente a atividade da MMP-2 quando comparado ao grupo N e TT (p<0,05; Fig.
18). Não houve diferença entre os grupos TT660 (P>0,05; Fig.19).
A atividade da MMP-2 foi significativamente menor no grupo TT780 10J quando
comparada ao TT (P<0,05; Fig.19), já o grupo TT780 60J apresentou atividade semelhante ao
Figura 18. Área de Secção Transversa (AST) dos músculos TA dos diferentes grupos experimentais.
*p<0,05: comparados ao N; †P<0,05: comparado ao TT. Note que os grupos TT660 60 e 120J e TT780 10J
apresentaram valores normais da AST das fibras musculares.J= J/cm
2
37
N e ao TT (P>0,05; Fig.19). Além disso, o grupo TT780 120J teve a atividade total de MMP-
2 aumentada se comparada ao N e TT (P<0,05; Fig..19).
4.2.5. Histologia do nervo ciático
4.2.5.1. Análise histológica do Nervo Ciático
A figura 20 mostra a histologia dos nervos ciáticos impregnados com tetróxido de ósmio
em todos os grupos lesados e também do grupo normal que ilustram claramente a diferença de
organização estrutural de todos os grupos lesados em comparação ao normal. A figura do
grupo N mostra suas fibras bem arredondadas e com a bainha de mielinha bem evidente. Já
nos grupos experimentais as fibras não são todas arredondadas, com a presença de fibras
achatadas e com a espessura tanto da fibra quanto da bainha de mielina menores do que as
normais. Foi encontrado um grande número de células de Schwann englobando as fibras
lesionadas.
Figura 19. Atividade total da MMP-2 observada nos diferentes grupos experimentais. *p<0,05: comparado
ao N; †p<0,05: comparado ao TT. Observe a expressiva diminuição da atividade da MMP-2 nos grupos
TT660 10, 60, 120J e TT780 10J comparados ao N e TT. O grupo irradiado com laser 780 nm 120J
apresentou um aumento na atividade total da MMP-2. J= J/cm
2
.
38
A figura 21 mostra um nervo marcado com anti-S100. Esta técnica nos possibilitou
observar a bainha de mielina e células de Schwann ao redor do axônio. No grupo N foi
possível observar a organização das fibras nervosas, a bainha de mielina bem evidenciada na
cor vermelha. Já nos grupos experimentais foi observada uma diminuição da bainha de
mielina, assim como a expressão de S100, comparados ao grupo normal. Todos os grupos
experimentais neurotmizados não diferenciaram entre si.
39
Figura 20. Cortes histológicos dos nervos ciáticos, impregnados com tetróxido de ósmio. Escala da barra
100µm. J = J/cm
2
. Setas=Células de Schwann.
40
Figura 21. Cortes histológicos transversais dos nervos axoniotmisados marcados com anti-S100.
Observe a bainha de mielina em vermelho. Cabeça de seta representa a estrutura normal da bainha de
mielina; Seta mostra o padrão de expressão de S-100 nos grupos axoniotomizados. Escala da barra
100µm. J = J/cm
2
.
41
4.2.6. Área de secção transversa do nervo ciático
4.2.6.1. Número de fibras nervosas
O valor médio de fibras nervosas por campo foi de 132 ± 20, sendo que não houve diferença
entre o número de fibras nervosas entre os diferentes grupos experimentais (P>0,05; Fig. 22).
4.2.6.2. Área de secção transversa (AST) de mielina, axônio e fibra nervosa.
A figura 23 mostra os valores das AST das bainhas de mielinas, axônios e fibras nervosas
nos nervos ciáticos nos diferentes grupos experimentais. Para mielina, axônio e fibra nervosa
observou-se uma redução na AST em todos os grupos TT, irradiados ou não com laser,
comparados a N (P<0,05, Fig. 23). Apenas o grupo TT660 120J apresentou valores de AST
da bainha de mielina e fibra nervosa superiores ao TT (P<0,05; Fig.23). Os demais grupos
irradiados com laser 660 e 780 nm mostraram valores de AST para mielina e fibra nervosa
semelhantes aos valores encontrados em TT (P>0,05; Fig.23). Todos os grupos TT
apresentaram valores da AST dos axônios semelhantes entre si (P>0,05; Fig.23).
Figura 22. Número de fibras nervosas por campo microscópico dos nervos ciáticos nos diferentes grupos
experimentais. Não houve diferença entre todos os grupos. J= J/cm
2
.
42
Figura 23. Área de secção transversa da bainha de mielina, axônio e fibra nervosa em nervo ciático dos
diferentes grupos experimentais. *P<0,05 comparado ao N; †P<0,05 comparado ao TT. Observe que todos os
grupos lesados apresentaram valores da AST da bainha de mielina, axônio e fibra nervosa inferiores aos
valores normais. Apenas o grupo TT660 120J mostraram valores superiores da AST da bainha de mielina e
fibra nervosa comparado ao TT. J= J/cm
2
.
43
5. DISCUSSÃO
O presente estudo trouxe novas informações sobre os efeitos de doses diferentes da
laseterapia na regeneração nervosa periférica e no músculo desnervado, em dois tipos de lesão
do nervo ciático do rato. Todos os resultados trouxeram informações importantes para ajudar
a esclarecer, determinar o melhor protocolo de aplicação do laser para acelerar a recuperação
neuromuscular e consequentemente melhorar a sua função.
A análise geral e em conjunto dos resultados será discutida, pois tanto os resultados dos
músculos, quanto os dos nervos,
tiveram uma tendência em demonstrar uma melhor resposta neuromuscular em
determinadas doses do laser. Vários estudos realizados demonstram que o laser acelera o
processo de regeneração do nervo (GIGO-BENATO, GEUNA & ROCHKIND, 2005;
ANDERS et al., 2004). Porém, não foi encontrado nenhum estudo na última década que tenha
analisado a reposta do músculo TA, pós-aplicação do laser, na lesão nervosa periférica
(ROCHKIND et al., 2009 b;c). Outro ponto inovador desse estudo, que foi o pioneiro em
estudar a atividade das MMPs no nervo esmagado e tratado com o laser. Além de estudar a
atividade das MMPs no músculo TA pós-aplicação do laser na lesão nervosa periférica.
Os resultados conflitantes sobre o uso da laserterapia podem ser resultantes de inúmeras
variáveis técnicas (em particular o comprimento de onda, doses e tipos de irradiação) os quais
se não forem adequadamente ajustados poderão reduzir o eventual sucesso do procedimento
terapêutico (GIGO-BENATO, GEUNA & ROCHKIND, 2005). Seguindo essa necessidade de
estabelecer protocolos clínicos de aplicação da laserterapia ainda não testados, esse estudo
teve a intenção de continuar aprofundar a análise dessa irradiação sobre o nervo. Os principais
aspectos que foram confrontados foram os tipos de comprimento de onda do laser, três
parâmetros de irradiação e também dois tipos de modelos experimentais de lesões nervosas
(neurotmese e axoniotmese), os quais são aspectos relevantes nas perspectivas de aplicação
em pacientes.
A escolha dos parâmetros do protocolo de irradiação do laser de baixa intensidade do
presente estudo teve como base vários estudos científicos. Existe um aumento no uso dos
aparelhos laser infravermelho, mas isso é justificado, pela sua maior penetração através da
pele (TURNER & HODE , 1993). Efeitos positivos em estudos experimentais foram obtidos
com comprimento de onda visível (ROCHKIND et al., 1987; HAMILTON et al., 1992;
ANDERS et al., 1993) e próximo ao infravermelho (ROCHKIND et al., 2007 a;b;
ROCHKIND et al., 2009 a). Parece que ambos os tipos de laser podem ser utilizados para
promover a regeneração nervosa (GIGO-BENATO,GEUNA & ROCHKIND, 2005). Outro
44
parâmetro é a densidade de energia, em que as análises dos resultados publicados mostraram
que a laserterapia em diferentes níveis de densidade de energia, com menos de 10 J/cm² até
150 J/cm², são eficientes na regeneração nervosa (GIGO-BENATO,GEUNA & ROCHKIND,
2005). O mesmo pode ser aplicado nos tempos de tratamento os quais oscilam de menos de 1
minuto até 90 minutos. Portanto, essas observações sugerem que a luz exerce um efeito
positivo na regeneração nervosa, com uma grande variação de intervalos tanto de densidade
de energia, quanto tempo de emissão. Todos os estudos publicados, os quais utilizaram
emissão contínua levaram a resultados positivos. Portanto, esse tipo de emissão a laser de
acordo com os protocolos observados, foi utilizado neste estudo baseados em achados na
literatura (GIGO-BENATO,GEUNA & ROCHKIND, 2005).
O presente estudo trouxe uma curva dose dependente, o qual foi essencial para
conseguirmos encontrar uma dose mais adequada tanto ao tipo de lesão, quanto ao tipo de
comprimento de onda utilizado. Nos grupos esmagados,parece que ambos os comprimentos
de onda foram melhores para a área de secção transversa do nervo ciático. Porém, somente em
algumas densidades de energia a atrofia da fibra nervosa periférica foi evitada, que foram no
laser 660 nm nas densidades de energia 10 e 60 J/cm
2
e no laser 780 nm na densidade de
energia de 10 e 120 J/cm
2
. Nas mesmas doses foi observada que a espessura da bainha de
mielina estava igual ao normal, este achado é um indicativo que o nervo pós-esmagamento e
tratado com o laser nas doses acima mencionadas, melhorou sua atividade de condução.
Porém na análise qualitativa de imunofluorescência a bainha de mielina e células de Schwann
estavam marcadas, destacadas, porém não estavam diferentes do controle CR. A bainha de
mielina é responsável pela condução do potencial de ação ao longo do axônio, e a falta ou
redução dela no nervo causa uma diminuição ou perda da função axonal (OH, 2001). Já
atrofia dos nos músculos TA foi evitada nos grupos experimentas que foram estimulados com
o laser 660 nm, que se apresentaram sem atrofia muscular, comparados ao grupo lesado, isso
sugere que suas funções estão normais, e que o laser 660 nm nas densidades de energia de 10,
60 e 120J/cm
2
são eficazes em evitar a atrofia muscular do TA pós-lesão de axoniotmese.
Os resultados relativos à atividade das MMPs no modelo de esmagamento nervoso,
também são interpretados de acordo com o contexto global dos achados do músculo e do
nervo. Deste modo, os autores do presente estudo acreditam que o laser 660 nm,
principalmente os grupos 60 e 120 J/cm
2
, acelerou o processo de regeneração nervosa e
reinervação das fibras musculares. Tal hipótese pode ser sustentada pelo fato que os grupos
irradiados com laser 660 nm recuperaram a AST das fibras musculares comparados ao grupo
normal e lesão. Esta recuperação foi acompanhada por um aumento da atividade da MMP-2 e
45
uma diminuição da MMP-9 no nervo. Já no músculo foi acompanhada por uma diminuição da
atividade da MMP-2.
Durante a degeneração walleriana, eventos iniciais como a desintegração do citoesqueleto
axonal e a quebra da bainha de mielina são coordenados, dentre outros fatores, pela atividade
das MMPs, especialmente a MMP-9 e -2. La Fleur e colaboradores (1996) mostraram que
altos níveis de MMP-9 no 1º e 4º dia pós-lesão por esmagamento do nervo estão relacionados
com o ingresso de neutrófilos e macrófagos, respectivamente. Os autores relatam ainda que
estas células inflamatórias, e as células de Schwann, são capazes de secretar MMP-9. A
secreção desta MMP é importante para gerar o remodelamento da matriz extracelular (MEC)
que acompanha a destruição de débris de axônios e mielina, e assim permitindo o crescimento
axonal. Além disso, a ação das MMPs é capaz de liberar as células de Schwann das suas
conexões com a membrana basal, permitindo sua proliferação e estimulação das terminações
axonais (LA FLEUR et al., 1996).
Apesar do aumento da atividade da MMP-9 ser desejada em uma fase inicial da
degeneração nervosa, a manutenção de seus níveis elevados pode ser prejudicial para a
integridade tecidual. Beuche e colaboradores (2000) observaram um aumento de níveis
séricos da MMP-9 em pacientes com esclerose lateral amiotrófica, possivelmente causado por
nervos em degeneração e músculos desnervados. Ratos MMP-9-knockout que foram
submetidos a uma lesão medular apresentaram uma recuperação acelerada da função motora
comparados a animais não transgênicos (NOBLE et al, 2002). Juntos estes resultados indicam
que a regulação negativa da MMP-9, pode ser um aspecto positivo durante fases finais do
reparo neural.
Ainda neste contexto, a produção de componentes da MEC como laminina, fibronectina e
colágeno tipo IV pelas células de Schwann, é importante para auxiliar o crescimento axonal
durante o processo regenerativo, pois formam uma espécie de rede para a passagem do cone
de crescimento. Contudo, outros componentes da MEC como as proteoglicanas sulfato de
condroitina (CSPG), são capazes de inibir este processo (GANTUS et al, 2006).
Estudos prévios mostraram que, durante o processo de degeneração walleriana, o aumento
da atividade da MMP-2 no nervo é capaz de reorganizar a lâmina basal via degradação de seu
principal componente, o colágeno tipo IV, permitindo o avanço do cone de crescimento
axonal (LA FLEUR et al, 1996). Além disso, já está bem descrito na literatura que a MMP-2
degrada proteoglicanas que inibem o processo de crescimento axonal como o sulfato de
condroitina (GANTUS et al, 2006). Deste modo, o aumento da atividade da MMP-2 poderia
ser um indicativo positivo do processo de degeneração/regeneração dos axônios.
46
Portanto, nossos resultados corroboram com tais achados, pois uma vez que grupos que
apresentaram AST das fibras musculares iguais aos normais, e que apresentaram maior AST
da bainha de mielina possuíam uma menor atividade de MMP-9 e maior de atividade de
MMP-2 no nervo. Também é necessário destacar que estas MMPs são sistematicamente
reguladas pelos inibidores teciduais de metaloproteinase (TIMP), controlando o processo e
protegendo a estrutura da lâmina basal (LA FLEUR et al, 1996). Estudo futuros para
investigar o papel do laser sobre as MMPs no tecido nervoso e muscular, devem também
considerar os TIMPs.
Em relação ao músculo esquelético desnervado, o papel das MMPs nestas situações ainda
não está definido. Alguns estudos mostraram que o aumento da atividade da MMP-2 em
músculos após 28 dias de desnervação pode estar relacionado com a atrofia muscular e a
proliferação de tecido conjuntivo ao redor das fibras musculares (RUSSO et al., 2008), mas
também com a abertura de canais para a reinervação das fibras desnervadas. Contudo, outros
estudos mostram que o aumento da atividade da MMP-2 pode estar relacionado com ciclos de
degeneração/regeneração das fibras musculares. Deste modo, a diminuição da atividade da
MMP-2 nos músculos dos grupos irradiados com laser 660 nm, pode ter sido benéfica para o
tecido muscular, pois poderia haver menos lesão.
Estudos futuros deveriam avaliar os tecidos musculares e nervosos em diferentes períodos
de tempo, para investigar o comportamento destas MMPs e assim confirmar estas hipóteses
aqui geradas.
Todos os animais experimentais que foram esmagados recuperam sua função normal ao
final do experimento. Tal resposta já era esperada pelo tipo de lesão de esmagamento no
nervo ciático do rato. Varejão e colaboradores (2004) usaram nosso mesmo protocolo de lesão
de esmagamento no nervo ciático do rato, constataram que 4 semanas pós-lesão ocorreu
recuperação de cerca de 80% da função, e que na 8° semana a recuperação motora dos
animais era total. Portanto, no presente estudo a lesão no nervo ciático do rato (VAREJÃO et
al., 2004) foi realizada mediante uma pinça com pressão padronizada (BEER, 2001). Esse é o
modelo mais estudado na literatura (ROCHKIND et al 1987a;1987b; HAMILTON, KEVEN
& RAY, 1992; ANDERS et al. 1993; KHULLAR et al.,1995; BAGIS et al.,2003; SHIN et al.,
2003) por ser uma cirurgia rápida e por conseguir estudar os efeitos iniciais da recuperação
nervosa. Mesmo sendo uma lesão com prognóstico de recuperação rápido em modelo animal,
em humanos o tempo de recuperação de uma lesão traumática do nervo pode se estender
vários meses ou até anos, dependendo do grau de severidade e de extensão da lesão
(ROCHKIND et al., 2007 a;b). Pensando na aplicabilidade clínica é necessário estudar
47
terapias que acelere a recuperação do nervo lesado evitando vários problemas, como por
exemplo, o tempo de imobilização que causa atrofia muscular.
O laser foi eficaz em acelerar a regeneração do nervo pós-lesão severa em estudos que
utilizaram comprimentos de onda similares e iguais aos aplicados no presente estudo (tab. 1)
(ROCHKIND et al., 2007; MOHAMMED, AL-MUSTAWFI & KAKA., 2007; WU et al.,
2009). Os resultados do nosso estudo, com lesão severa, ou seja, os neurotmesados, referente
aos resultados da AST da bainha de mielina, foram todos iguais ao lesão TT. Com exceção no
grupo TT660 120J que a bainha de mielina teve uma espessura igual ao normal. Os resultados
da imunoflorescência não mostraram diferenças entre os grupos lesados. Em adição, é
importante destacar que a AST da fibra dos músculos TA no grupo TT660 120J estava igual
ao normal. Tais resultados reforçam a hipótese que o laser 660 nm na densidade de energia de
120 J/cm
2
foi mais efetivo, em comparação as demais doses, dentro dos grupos dos
submetidos à neurotmese.
Em relação ao músculo TA, é importante salientar que a AST das fibras musculares nos
grupos TT660 60J e TT780 10J apresentou níveis normais. Não é possível excluir a hipótese
que talvez o laser 780 nm com densidade de energia de 10 J/cm
2
possa exercer efeitos
benéficos sobre a recuperação neuromuscular, pois níveis normais de AST das fibras
musculares foram observados neste grupo. Achados interessantes em modelos animais e em
humanos mostraram que o laser 780 nm é capaz de acelerar a regeneração nervosa periférica
em lesões severas (ROCHKIND et al, 2007 a;b; ROCHKIND et al., 2009 a). Estudo em
cultura de células neuronais de ratos estimuladas com o laser 780 nm, mostrou que esse
comprimento de onda estimulou a migração de células neuronais, desenvolveu neurônios de
maior calibre, com uma densa e ramificada rede de interligação de fibras nervosas
(ROCHKIND et al.,2009 a). Parece que esse comprimento de onda também é eficaz em
acelerar o prognóstico de recuperação em pacientes que sofreram lesões no nervo
(ROCHKIND et al.,2007 a).
A resposta funcional dos grupos experimentais ao longo dos 84 dias de pós-neurorrafia
término-terminal foi muito variável. Entretanto, ao observarmos o grupo TT660 120J a partir
do vigésimo dia, ele se manteve com sua função melhor em comparação ao controle TT, até o
sexagésimo primeiro dia pós-lesão. Ao comparar esse achado funcional aos resultados da
AST do nervo e do músculo TA, nesse grupo TT660 120J, é possível sugerir que o laser possa
ter estimulado a regeneração do nervo, evitado a atrofia muscular e consequentemente
melhorado a função neuromuscular.
48
Relativo a atividade das MMPs no músculo do experimento término-terminal, o laser 660
nm 60 e 120 J/cm
2
e 780 nm 10 J/cm
2
pode ter exercido um efeito benéfico sobre o tecido
muscular, pois diminuiu a atividade da MMP-2 e acelerou a recuperação da AST das fibras
musculares. Uma limitação do nosso estudo foi a ausência da análise da atividade total das
MMPs do nervo. Devido ao número de amostras, o tempo de realização do experimento e a
quantidade do tecido nervoso optamos por usar os nervos ciáticos para as análises histológicas
e morfométricas a fim de evitar grandes variabilidades na amostra. Deste modo, consideramos
que estudos futuros usem mais animais por grupo para evitar tais problemas. Apesar disso,
acreditamos que mesmo na ausência das análises da atividade das MMPs no nervo,
investigações futuras poderão focalizar e identificar as MMPs e os componentes da matriz
extracelular, como laminina e colágeno IV.
A neurotmese, como já foi anteriormente descrito na introdução, tem um prognóstico de
recuperação mais lento. De Sá e colaboradores (2004) viram que em oito semanas a função do
nervo na reparação término-terminal era de 80% e para que seja absoluta o autor sugere ainda
algumas semanas. Contudo, estudos futuros deveriam estudar tempos pós-lesão e pós-
tratamento superiores a 84 dias, ou talvez fazer uma curva de tempo, principalmente para as
doses do presente estudo que apresentaram respostas positivas.
O teste funcional utilizado em nosso estudo é muito difundido e utilizado, porque é de
fácil execução, não invasivo e de baixo custo. Entretanto, a eficácia dos seus resultados é
muito conflitante entre os cientistas. Alguns estudiosos aceitam o teste como uma boa
ferramenta para avaliar o nervo ciático lesado, outros questionam sua acurácia, e sempre
indicam testes mais precisos, como por exemplo, a vídeo análise (BEVAR, 2002;
SARIKCIOGLU L, DEMIREL & UTUK et al.,2009, COSTA et al., 2009). Por mais que este
teste funcional seja questionado, ele é uma análise adicional e que se observada em conjunto
com outras análises, dá um respaldo á mais aos resultados dos tecidos analisados, dando uma
visão global de como está à interação neuromuscular, assim como todo o segmento
acometido.
Com um adequado protocolo de aplicação da irradiação a laser, com lesões nervosas
periféricas padronizadas, este estudo trouxe dados importantes para o uso clínico, tanto no
comprimento de onda, densidade de energia, quanto no melhor protocolo de aplicação para
cada tipo de lesão no nervo (axoniotmese ou neurotmese).
Paralelamente aos resultados do presente estudo, chama a atenção para a necessidade de
mais pesquisas sobre os efeitos da laserterapia na regeneração nervosa periférica, objetivando
49
uma definição mais clara sobre a parametrização, protocolos de irradiação do laser que sejam
efetivos na promoção da recuperação nervosa pós-traumática.
50
6. CONCLUSÃO
Este estudo teve como objetivo principal observar o efeito da laserterapia em seis
protocolos de aplicação, em dois tipos de lesão do nervo ciático do rato. Ao observar os
resultados em conjunto dos grupos que foram submetidos à axoniotmese é possível concluir
que os protocolos de aplicação do laser 660nm 10, 60 e 120 J/cm
2
mostrou ser efetivo na
recuperação do nervo esmagado, evitou a atrofia do músculo tibial anterior, e ajudou no
remodelamento da matriz extracelular do músculo tibial e do nervo ciático.
Com base no objetivo proposto, podemos concluir que o grupo que foi submetido à
neurotmese com o protocolo de aplicação do laser 660nm 120 J/cm
2
mostrou ser efetivo na
recuperação do nervo, evitou a atrofia do músculo tibial anterior, ajudou no remodelamento
da matriz extracelular no músculo e sua função foi melhor em relação ao não tratado em
quase todo o experimento. Na lesão grave, os protocolos de aplicação do laser 660nm 60, 120
J/cm
2
e
780nm 10 J/cm
2
exerceu um efeito benéfico no músculo tibial anterior, pois acelerou a
área de secção transversa das fibras e ajudou no remodelamento da matriz extracelular.
51
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AHTIKOSKI, A M TUOMINEN H, KORPELAINEN JT, TAKALA TE, OIKARINEN A.
Collagen Synthesis and degradation in polyneuropathy and myopathies. Muscle Nerve. 30
(5):602-82, Nov 2004.
AMAT A, RIGAU J, WAYNANT RW, ILEV IK, TOMAS J, ANDERS JJ. Modification of
the intrinsic fluorescence and the biochemical behavior of ATP after irradiation with visible
and near-infrared laser light. J Photochem Photobiol B.81(1):26-32, 3 Out 2005.
ANDERS JJ, GEUNA S, ROCHKIND S. Phototherapy Promotes Regeneration and
Functional Recovery of Injured Peripheral Nerve. Neurol Res. 26:233-239, 2004.
ANDERS JJ, BORKE RC, WOOLERY SK, VAN DE MERWE WP. Low Power Laser
Irradiation Alters The Rate of Regeneration of The Rat Facial Nerve. Lasers Surg Med.
13:72– 82,1993.
AZZE R J, MATTAR Jr. R. Lesões dos Nervos Periféricos. In: Pardini Jr. AG, editor.
Traumatismos da mão. 3
a
ed., Rio de Janeiro, Meds, 2000.
BAGIS S, COMELEKOGLU U, COSKUN B, MILCAN A, BUYUKAKILLI B, SAHIN G,
OZISIK S, ERDOGAN C. No Effect of GA-AS (904 nm) Laser Irradiation on the Intact Skin
of the Injured Rat Sciatic Nerve. Lasers Med Sci.18:83– 88, 2003.
BAIN JR, MACKINNON SE, HUNTER DA. Functional Evaluation of Complete Sciatic,
Peroneal, and Posterior Tibial Nerve Lesions in the Rat. Plast Reconstr Surg. 83:129-138,
1989.
BEER GM, STEURER J, MEYER VE. Standardizing Nerve Crushes with a Non-Serrated
Clamp. J Reconstr Microsurg .17:531-534, 2001.
BERVAR M. An alternative video footprint analysis to assess functional loss following injury
to the rat sciatic nerve. Acta Chir Plast. 44(3):86-9, 2002.
BEUCHE W, YUSHCHENKO M, MÄDER M, MALISZEWASKA M, FELGENHAUER K,
WEBER F. Matrix metalloproteinase-9 is elevated in serum of patients with amyotrophic
lateral sclerosis. Neuroreport.11:3419-3422, 2000.
BILLINGTON L.; CARLSON B. M. The recovery of Long-Term Denervated rat muscles
after Machine Treatment and Grafting. J neurol Sci. 144:147-155, 1996.
CAVANAGH, J. B, WELLER, R. O. Peripheral Nervous system. Nervous System,
Muscle and Eyes. London: Churchil Livingstone, 3. ed., v.4, cap. 11, p. 533-543,1990.
CARMELI E, Moas M, Reznick AZ, Coleman R. Matrix metalloproteinases and skeletal
muscle: a brief review. Muscle Nerve. 29:191–197, 2004.
CHEN YS, HSU SF, CHIU CW, LIN JG, CHEN CT, YAO CH. Effect of Low-Power Pulsed
Laser on Peripheral Nerve Regeneration in Rats. Microsurgery. 25:83– 89, 2005.
52
C.I. PLATT, C .A. KREKOSKI, R.V. WARD, D.R. EDWARDS, J. GAVRILOVIC.
Extracellular Matrix and Matrix Metalloproteinases in Sciatic Nerve. Journal of
Neuroscience Research. 74:417–429, 2003.
COSTA LM, SIMÕES MJ, MAURÍCIO AC, VAREJÃO AS. Chapter 7: Methods and
protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part IV-kinematic gait
analysis to quantify peripheral nerve regeneration in the rat. Int Rev Neurobiol.;87:127-39,
2009.
CLEUTJENS JP, VERLUYTEN MJ, SMITHS JF, DAEMEN MJ. Collagen remodeling after
myocardial infarction in the rat heart. Am J Pathol.. 147(2):325-38, Ago 1995.
CRISCI A R., FERREIRA L F. Low-Intensity Pulsed Ultrasound Accelerates the
Regeneration of the Sciatic Nerve after Neurotomy in Rats. Ultrasound in Med. & Biol. 28
(10):1335-1341, 2002.
DE SÁ JMR, MAZZER N, B CH, BARREIRA AA. The End-To-Side Peripheral Nerve
Repair Functional and Morphometric Study Using the Peroneal Nerve of Rats. Journal of
Neuroscience Methods. 1–9, 2004
DOW DE, CEDERNA PS, HASSETT CA, KOSTROMINOVA TY, FAULKNER JA,
DENNIS RG. Number of Contractions to Maintain Mass and for of a Denervated Rat Muscle.
Muscle Nerve. 30:77-86, 2004.
DEMESTRE M, ORTH M, WELLS GM, GEARING A J, HUGHES RA, GREGSON NA.
Characterization of matrix metalloproteinases in denervated muscle. Neuropathol Appl
Neurobiol. 31:545-555, 2005.
EHRLICHER A, BETZ T, STUHRMANN B, KOCH D, MILNER V, RAIZEN MG, KAS J.
Guiding neuronal growth with light. Proc Natl Acad Sci USA. 99:16024–16028, 2002.
EVANS, G. R. Challenges to Nerve Regeneration. Semin Surg Oncol. 19:312-318, 2000.
EVANS, G. R. Peripheral nerve injury: a review and approach to tissue engineered constructs.
The Anatomical Record. 263:396-404, 2001.
GAGLIARDI S, ATLANTE A, PASSARELLA S. A Novel Property Of Adenine
Nucleotides: Sensitivity To Helium-Neon Laser In Mitochondrial Reactions. Biochem Mol
Biol Int.41:449–460, 1997.
GANTUS M A V, NASCIUTTI L E, CRUZ C M, PERSECHINI P M, MARTINEZ A M B.
Modulation of extracellular matrix components by metalloproteinases and their tissue
inhibitors during degeneration and regeneration of rat sural nerve. Brain Res.1122:36-46,
2006.
GEUNA S., GIGO-BENATO D., DE CASTRO R A. On sampling and sampling errors in
histomorphometry of peripheral nerve fibers. Microsurgery. 24:72-76, 2004.
GEUNA S, RAIMONDO S, NICOLINO S, BOUX E, FORNARO M, TOS P, BATTISTON
B, PERROTEAU I. Schwann-cell proliferation in muscle-vein combined conduits for
53
bridging rat sciatic nerve defects. J Reconstr Microsurg. (2):119-23; discussion 124, 19Fev
2003.
GIGO-BENATO D, GEUNA S, DE CASTRO R A, TOS P, FORNARO M, BOUX E,
BATTISTON B, GIACOBINI-ROBECCHI M G. Low-power laser biostimulation enhances
nerve repair after end-to-side neurorrhaphy: a double-blind randomized study in the rat
median nerve model. Lasers Med Sci. 19(1):57-65, 30 Jul, 2004.
GIGO-BENATO D, GEUNA S, ROCHKIND S. Phototherapy for enhancing Peripheral
Nerve Rapier: A Review of the Literature. Muscle Nerve. 31:694-701, 2005.
HAMILTON G F, KEVEN R T, RAY R H. The Effects Of Helium-Neon Laser Upon
Regeneration Of The crushed Peroneal Nerve. J Orthop Sports Phys Therapy.15:209 –214,
1992.
HEINE W, CONANT K, GRIFFIN JW, HÖKE A. Transplanted neural stem cells promote
axonal regeneration through chronically denervated peripheral nerves. Exp Neurol.
189(2):231-40, Out 2004.
SIEBERT H, DIPPEL N, MA M ¨, WEBER F, WOLFGANG B¨ C K. Matrix
Metalloproteinase Expression and Inhibition After Sciatic Nerve Axotomy. Journal of
Neuropathology and Experimental Neurology. 60 ( 1): 85-86, Jan 2001.
ISHIDO M.; KAMI K.; MITSUHIKO M. In vivo Expression Patterns of MyoD, P21 and Rb
Proteins in Myonuclei and Satellite Cells of Denervated Rat Skeletal Muscle. Am J Physiol
Cell Physiol. 287:C484-C493, 2004.
JOHNSON TS, O'NEILL AC, MOTARJEM PM, AMANN C, NGUYEN T, RANDOLPH
MA, WINOGRAD JM, KOCHEVAR IE, REDMOND RW. Photochemical tissue bonding: a
promising technique for peripheral nerve repair. J Surg Res. 143(2):224-9, Dez 2007.
KHERIF S, Dehaupas M, Lafuma C, Fardeau M, Alameddine HS. Matrix metalloproteinases
MMP-2 and MMP-9 in denervated muscle and injured nerve. Neuropathol Appl Neurobiol.
24:309 –319,1998.
KHULLAR SM, BRODIN P, MESSELT EB, HAANAES HR. The Effects of Low Level
Laser Treatment on Recovery of Nerve Conduction and Motor Function After Compression
Injury in the Rat Sciatic Nerve. Eur J Oral Sci.103:299 –305, 1995.
KOSKINEN SO, KJAER M, MOHR T, SΦRENSEN FB, SUURONEN T, TAKALA TE.
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle: effect of functional
electrical stimulation. Muscle Nerve .23:580 –589, 2000.
KOSTROMINOVA, T.Y. et al. Comparison of Gene Expression of Two-Month Denervated,
Two-Month Stimulated-Denervated and Control Rat Skeletal Muscles. Physiol Genomics.
22:227-243, 2005.
KOUYOUMDJIAN, J. A. Peripheral Nerve Injuries: A Retrospective Survey of 456 Cases.
Muscle Nerve. 34: 785–788, 2006.
54
KREISLER M, CHRISTOFFERS A B, WILLERSHAUSEN B, D’HOEDT B. Effect Of
Low-Level GaAlAs Laser Irradiation On The Proliferation Rate Of Human Periodontal
Ligament Fibroblasts: An In Vitro Study. J Clin Periodontol. 30:353–358, 2003.
LA FLEUR M, Underwood JL, Rappolee DA, Werb Z. Basementmembrane and repair of
injury to peripheral nerve: defining a potential role for macrophages, matrix
metalloproteinases, and tissue inhibitor of metalloproteinases-1. J Exp Med. 184:2311–2326,
1996.
LEUNG MC, LO SC, SIU FK, SO KF. Treatment Of Experimentally Induced Transient
Cerebral Ischemia With Low Energy Laser Inhibits Nitric Oxide Synthase Activity And Up-
Regulates The Expression Of Transforming Growth Factor-Beta1. Lasers Surg Med.
31:283–288, 2002.
LIEBER R. Skeletal Muscle Structural, Function, & Plasticity. Lippincott Williams &
Wilkins. 2
nd
edition, Philadelphia, 2002.
LUCAS C, CRIENS-POUBLON L J, COCKRELL C T, DE HAAN R J. Wound Healing in
Cell Studies and Animal Model Experiments by Low Level Laser Therapy; Were Clinical
Studies Justified? A Systematic Review. Lasers Med Sci. 17:110 –134, 2002.
LUNDBORG G. A 25-Year Perspective of Peripheral Nerve Surgery: Evolving
Neuroscientific Concepts and Clinical Signifi-Cance. J Hand Surg. 25:391– 414, 2000.
MILORO M, HALKIAS LE, MALLERY S, TRAVERS S, RASHID RG. Low Level Laser
Effect On Neural Regeneration In Gore-Tex Tubes. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol Endod. 93: 27–34, 2002.
MILLESI H. Techniques for Nerve Grafting. Hand Clinics 16: 73-91, 2000.
MOHAMMED I F, AL-MUSTAWFI N, KAKA L N. Promotion of regenerative processes in
injured peripheral nerve induced by low-level laser therapy. Photomed Laser Surg.
25(2):107-11,2007.
NOBLE L J, DONOVAN F, IGARASHI T, GOUSSEV S, WERB Z. Matrix
metalloproteinases limit functional recovery after spinal cord injury by modulation of early
vascular events. J Neurosci. 22;7526-35, 2002.
O'NEILL A C, RANDOLPH M A, BUJOLD K E, KOCHEVAR I E, REDMOND R W,
WINOGRAD J M. Photochemical sealing improves outcome following peripheral
neurorrhaphy. J Surg Res. 151(1):33-9. Mar 5, 2009.
OH S J. Color atlas of nerve biopsy pathology. Library of Congress. Washington DC. 2001
p.10-30
ROCHKIND S, BARR-NEA L, RAZON N, BARTAL A, SCHWARTZ M. Stimulatory
Effect Of He-Ne Low Dose Laser On Injured Sciatic Nerves of Rats. Neurosurgery. 20:843–
847, 1987a.
ROCHKIND S, BARR-NEA L, VOLGER I. Spinal Cord Response to Laser Treatment of
Injured Peripheral Nerve. Spine. 15:6–10, 1990.
55
ROCHKIND S, EL-ANI D, NEVO Z, SHAHAR A. Increase of Neuronal Sprouting and
Migration Using 780nm Laser Phototherapy as Procedure for Cell Therapy. Lasers in
Surgery and Medicine .41:277–281, 2009. a
ROCHKIND S, DRORY V, ALON M, NISSAN M, OUAKNINE G E. Laser phototherapy
(780 nm), a new modality in treatment of long-term incomplete peripheral nerve injury: a
randomized double-blind placebo-controlled study. Photomed Laser Surg.25(5):436-42,
Out. 2007.a
ROCHKIND S, GEUNA S, SHAINBERG A. Chapter 25 phototherapy in peripheral nerve
injury effects on muscle preservation and nerve regeneration. Int Rev Neurobiol. 87:445-64,
2009.b
ROCHKIND S, LEIDER-TREJO L, NISSAN M, SHAMIR MH, KHARENKO O, ALON M.
Efficacy of 780-nm laser phototherapy on peripheral nerve regeneration after neurotube
reconstruction procedure (double-blind randomized study). Photomed Laser Surg.
25(3):137-43, Jun 2007.b
ROCHKIND S, NISSAN M, RAZON N, SCHWARTZ M, BARTAL A. Electrophysiological
Effect of HeNe Laser On Normal And Injured Sciatic Nerve in The Rat. Acta Neurochir.
83:125–30, 1986.
ROCHKIND S, NISSAN M, BARR-NEA L, RAZON N, SCHWARTZ M, BARTAL A.
Response of Peripheral Nerve To He-Ne Laser: Experimental Studies. Lasers Surg
Med.7:441– 443, 1987b.
ROCHKIND S, NISSAN M, LUBART R, AVRAM J, BARTAL A. The In-Vivo Nerve
Response to Direct Low-Energy-Laser Irradiation. Acta Neurochir .94:74 –77, 1988.
ROCHKIND S, NISSAN M, ALON M, SHAMIR M, SALAME K. Effects of Laser
Irradiation on the Spinal Cord for The Regeneration of Crushed Peripheral Nerve in Rats.
Lasers Surg Med. 28: 216–219, 2001.
ROCHKIND S, OUAKNINE G E. New Trend in Neuroscience: Low-Power Laser Effect on
Peripheral and Central Nervous System (Basic Science, Preclinical and Clinical Studies).
Neurol Res. 14:2-11, 1992.
ROCHKIND S, ROUSSO M, NISSAN M, VILLARREAL M, BARR-NEA L, REES D G.
Systemic Effects Of Low-Power Laser Irradiation on The Peripheral and Central Nervous
System, Cutaneous Wounds, and Burns. LasersSurgMed. 9:174–182, 1989.
ROCHKIND S. Stimulation Effect of Laser Energy on the Regeneration of Traumatically
Injured Peripheral Nerves. Morphogen Regen.83:25–27, 1978.
ROCHKIND S. Phototherapy in peripheral nerve injury for muscle preservation and nerve
regeneration. Photomed Laser Surg. 27(2):219-20, Apr 2009c
RUSSO T L, PEVIANI S M, DURIGAN J L, SALVINI T F. Electrical stimulation increases
matrix metalloproteinase-2 gene expression but does not change its activity in denervated rat
muscle. Muscle Nerve. 37(5):593-600, May 2008.
56
SARIKCIOGLU L, DEMIREL B M, UTUK A. Walking track analysis: an assessment
method for functional recovery after sciatic nerve injury in the rat. Folia Morphol (Warsz).
68(1):1-7, Fev 2009.
SCHOSER BG, BLOTTNER D. Matrix metalloproteinases MMP-2, MMP-7 and MMP-9 in
denervated human muscle. Neuroreport. 10:2795-2797, 1999.
SCHOSER B G, BLOTTNER D, STUERENBURG H J. Matrix metalloproteinases in
inflammatory myopathies: enhanced immunoreactivity near atrophic myofibers. Acta Neurol
Scand.105:309–313, 2002.
SEDDON H. Three Types of Nerve Injury. Brain. 66: 227-288, 1943.
SHIN D H, LEE E, HYUN J K, LEE S J, CHANG Y P, KIM J W, CHOI Y S, KWON B S.
Growth-Associated Protein-43 Is Elevated in the Injured Rat Sciatic Nerve After Low Power
Laser Irradiation. Neurosci Lett. 344:71–74, 2003.
SNYDER S K, BYRNES K R, BORKE R C, SANCHEZ A, ANDERS J J. Quantification of
Calcitonin Gene-Related Peptide mRNA and Neuronal Cell Death in Facial Motor Nuclei
Following Axotomy and 633 nm Low Power Laser Treatment. Lasers Surg Med. 31: 216 –
222, 2002.
SHAMIR M H, ROCHKIND S, SANDBANK J, ALON M. Double-Blind Randomized Study
Evaluating Regeneration of the Rat Transected Sciatic Nerve After Suturing and
Postoperative Low Power Laser Treatment. J Reconstr Microsurg.17:133– 137, 2001.
SHUBAYEV V I, MYERS R R. Upregulation and interaction of TNFalpha and gelatinases A
and B in painful peripheral nerve injury. Brain Res. 855:83– 89, 2000.
SUNDERLAND S. Nerves and nerve injuries. Churchill Livingstone, New York, 1978.
TURNER J, Hode L. Laser Therapy: Clinical Practice and Scientific Background. Prima
Books Grängesberg, Sweden: p380–434, 2003.
VAN BREUGEL H H, Bar P R. He-Ne Laser Irradiation Affects Proliferation of Cultured Rat
Schwann Cells in a Dose-Dependent Manner. J Neurocytol .22:185–190, 1993.
VAREJÃO A S, CABRITA A M, MEEK M F, BULAS-CRUZ J, MELO-PINTO P,
RAIMONDO S, GEUNA S, GIACOBINI-ROBECCHI MG. Functional and Morphological
Assessment of a Standardized Rat Sciatic Nerve Crush Injury with a non-Serrated Clamp. J
Neurotrauma. 21:1652-1670, 2004.
WOLLMAN Y, ROCHKIND S, SIMANTOV R. Low Power Laser Irradiation Enhances
Migration and Neurite Sprouting of Cultured Rat Embryonic Brain Cells. Neurol
Res.18:467– 470, 1996.
WELLS J, KAO C, KONRAD P, MILNER T, KIM J, MAHADEVAN-JANSEN A, JANSEN
ED. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophys J.
Oct 1;93(7):2567-80. May 25, 2007
57
WU X, DMITRIEV AE, CARDOSO MJ, VIERS-COSTELLO AG, BORKE RC,
STREETER J, ANDERS JJ. 810 nm Wavelength light: an effective therapy for transected or
contused rat spinal cord. Lasers. Surg Med. 41(1):36-41, Jan, 2009.
WU WH, PONNUDURAI R, KATZ J, POTT CB, CHILCOAT R, UNCINI A, et al. Failure
to confirm Report Of Light-Evoked Response of Peripheral Nerve to Low Power Helium-
Neon Laser Light Stimulus. Brain Res. 401:407– 408,1987.
58
ANEXO 1
ATIVIDADES REALIZADAS NO PERÍODO
59
ATIVIDADES REALIZADAS NO PERÍODO
No período de vigência do doutorado tive apoio financeiro da CAPES (2 meses) e
FAPESP (34 meses).
Durante o período do doutorado, além do trabalho apresentado, estive envolvida em
alguns projetos de pesquisa e outras atividades no exterior, as quais foram importantes para a
minha formação acadêmica.
Participação de projetos de pesquisa:
No doutorado, algumas análises e submissões pendentes do mestrado, foram realizadas. Ainda
no mestrado foi dado início a três artigos científicos. Dois eram meus trabalhos de mestrado, o
outro foi colaboração com um trabalho de doutorado de Tiago L. de Russo. Um dos artigos
foi seu tema de Doutorado já foi publicado:
Russo, TL; Peviani, SM; Freria, CM; Gigo-Benato, D; Geuna, S; Salvini, TF. Electrical
Stimulation Based On Chronaxie Reduces Atrogin-1 And Myod Gene Expressions In
Denervated Muscle Of Rat. Muscle Nerve. 35: 87–97, 2007.
Um dos meus dois trabalhos de Mestrado foi aceito para publicação. No doutorado, analises
complementares foram realizadas no músculo, em parceria com o Laboratório de Plasticidade
Muscular, com colaboração do Dr. Thiago L. de Russo, e Dra.Tania de Fátima Salvini.
Trabalho em publicação:
Davilene Gigo-Benato, Thiago Luiz Russo, Stefano Geuna, Natalia Rezende Santa Rosa
Domingues, Tania Fátima Salvini, Nivaldo Antonio Parizotto.Electrical stimulation impairs
early functional recovery and accentuates skeletal muscle atrophy after sciatic nerve crush
injury in rat. Muscle Neve. Para impressão.
No doutorado ainda me dediquei juntamente com os colaboradores, para a publicação do
artigo que está submetido, intitulado:
The 830nm lasertherapy effects on early rat sciatic nerve recovery after crush injury. Gigo-
Benato, D; Geuna, S; Russo, TL; Cillo, G; Gonçalves, H; Raimondo, S; Salvini, TF;
Giacobini-Robecchi, MG; Parizotto, NA. Submitted to: Photomedicine and Laser Surgery.
60
As análises dos nervos, desses três trabalhos, eu fiz em parceria com o Laboratório de
Anatomia, no Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche, della Universitá di Torino, na
Itália, ainda quando eu estava no mestrado.
No doutorado, participei também de um artigo já aceito a publicação, o qual realizei as
análises dos nervos , em parceria com o Laboratório de Plasticidade Muscular, com
colaboração do Dr. Thiago L. de Russo, e Dra.Tania de Fátima Salvini.
Trabalho em publicação:
Thiago Russo; Sabrina M Peviani, João L Durigan, Davilene Gigo-Benato, Gabriel B
Delfino; Tania F Salvini. Stretching and electrical stimulation reduce the accumulation of
MyoD, myostatin and atrogin-1 in denervated rat skeletal muscle. Journal of Muscle
Research and Cell Motililty. In press
Experiência Internacional no Período:
Curso de Verão na França:
No período de vigência da bolsa de doutorado da Fapesp, tive a oportunidade de participar de
um curso de Verão de Miologia na França, no período de 17-26 de Junho de 2009. No
Instituto de Miologia -Hostital Pittie-Salpetriere-París-França. Os temas abordados foram
sempre na área de miopatologia e principalmente alterações neuromusculares em distúrbios
genéticos. Os palestrantes eram especialistas nesse assunto de toda a europa. Além de
palestras participávamos de dinâmicas em grupo e atividades práticas.
Visita científica:
Visita científica no laboratório da Profa. Juanita J. Anders, no, Department of Anatomy,
Physiology, and Genetics. Uniformed Services University of the Health Sciences, Maryland
EUA. 14-19 Dezembro de 2009.
A Profa. Juanita J. Anders, é umas das pessoas mais conceituadas na área de laser na
regeneração nervosa tanto periférica, quanto central. Ela é editora de várias revistas
consagradas na área de laser.
Quando estive em seu laboratório, pude aprender e participar de uma parte experimental, de
cultura de células de schwann irradiadas com laser de baixa intensidade. Além de discutirmos
os resultados da minha tese. A professora contribuiu muito para o enriquecimento científico
do presente estudo. Colaborações futuras já estão sendo planejadas.
61
ANEXO 2
ATIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO_ 2010
Main Menu
Author Dashboard
Submission Confirmation
You are logged in as Thiago Russo
Thank you for submitting your manuscript to Lasers in Surgery & Medicine.
Manuscript ID: LSM-10-0054
Title:
Effects of 660 and 780 nm low-level laser therapy on neuromuscular recovery after
crush injury in rat sciatic nerve.
Authors:
Gigo-Benato, Davilene
Russo, Thiago
Tanaka, Erika
Assis, Livia
Salvini, Tania
Parizotto, Nivaldo
Date Submitted: 21-Feb-2010
ScholarOne Manuscripts
TM
v4.2.1 (patent #7,257,767 and #7,263,655). © ScholarOne, Inc., 2009. All Rights Reserved.
ScholarOne Manuscripts is a trademark of ScholarOne, Inc. ScholarOne is a registered trademark of ScholarOne, Inc.
Terms and Conditions of Use - ScholarOne Privacy Policy - Get Help Now
Page
1
of
1
ScholarOne Manuscripts
21/02/2010
http://mc.manuscriptcentral.com/lsm
For Peer Review
Effects of 660 and 780 nm low-level laser therapy on
neuromuscular recovery after crush injury in rat sciatic
nerve.
Journal:
Lasers in Surgery & Medicine
Manuscript ID:
LSM-10-0054
Wiley - Manuscript type:
Basic Research
Date Submitted by the
Author:
21-Feb-2010
Complete List of Authors:
Gigo-Benato, Davilene; Federal University of São Carlos,
Departament of Physiotherapy
Russo, Thiago; Federal University of São Carlos, Physical Therapy
Tanaka, Erika; Federal University of São Carlos, Departament of
Physiotherapy
Assis, Livia; Federal University of Sao Carlos, Physiotherapy
Department
Salvini, Tania; Federal University of São Carlos, Departament of
Physiotherapy
Parizotto, Nivaldo; Federal University of São Carlos, Departament of
Physiotherapy
Key Words:
peripheral nerve repair, lasertherapy, denervated muscle,
rehabilitation, functional analysis
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
For Peer Review
1
Effects of 660 and 780 nm low-level laser therapy on neuromuscular recovery after
crush injury in rat sciatic nerve.
Davilene Gigo-Benato
1
, PhD, Thiago Luiz Russo
2
, PhD, Erika Harumi Tanaka
1
, Lívia
Ribeiro Assis
1
, MD, Tania Fátima Salvini
2
, PhD, Nivaldo Antonio Parizotto
1
, PhD.
1
Unity of Thermophototherapy, Department of Physiotherapy, Federal University of
São Carlos (UFSCar), São Carlos, SP, zip code: 13565-905, Brazil (DGB, EHT, LRA
and NAP).
2
Unity of Skeletal Muscle Plasticity, Department of Physiotherapy, Federal University
of São Carlos (UFSCar), São Carlos, SP, zip code: 13565-905, Brazil (TLR and TFS).
Acknowledgements: This work was supported by grants of the FAPESP (Fundação de
Âmparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, process numbers: 2006/52931-4 and
08/03499-8).
Corresponding author: Davilene Gigo Benato; Department of Physiotherapy, Federal
University of São Carlos (UFSCar), Rodovia Washington Luís km 235, C.P. 676 –
CEP: 13565-905 São Carlos, SP, Brazil; Telephone: 00 55 16 33518345 FAX: 00 55 16
33612081; E-mail:
Page 1 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
2
Key Words:
Peripheral nerve repair, lasertherapy, denervated muscle, rehabilitation, functional
analysis.
Page 2 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
3
Abstract
BACKGROUND AND OBJECTIVE: Posttraumatic nerve repair is still a challenge for
rehabilitation. Although surgical techniques have made enormous progresses over the
years, the functional recovery after nerve injury is often incomplete and sometimes
frankly unsatisfactory. It is thus particularly important to find out clinical protocols to
enhance nerve regeneration. The present study investigated the effects of 660 and 780
nm LLLT using different energy densities (10, 60 and 120 J/cm
2
) on neuromuscular and
functional recovery as well as on matrix metalloproteinases (MMPs) activity after crush
injury in rat sciatic nerve. MATERIALS AND METHODS: Rats received LLLT
irradiation transcutaneously at the lesion site for 10 consecutive days post-injury and
then sacrificed 28 days after injury. Both sciatic nerves and tibialis anterior (TA)
muscles were analyzed. Nerve analyses consisted of histology (light microscopy) and
myelin, axon and nerve fiber cross-sectional area (CSA) measurements. The S-100
labeling was used to identify myelin sheath and Schwann cells. Muscle fiber CSA and
zymography were carried out to assess the degree of muscle atrophy and MMPs
activities respectively. Statistical significance was set at 5% (P ≤ 0.05). RESULTS: 660
nm LLLT either using 10 or 60 J/cm
2
recovered muscle fiber, myelin and nerve fiber
CSA compared to normal values. Furthermore, it increased MMP-2 activity in nerve
and decreased MMP-2 and -9 activities in muscles and nerves respectively. Functional
recovery in irradiated groups did not differ from crushed non irradiated group.
CONCLUSIONS: Data suggest that 660 nm LLLT with low (10 J/cm
2
) or moderate (60
J/cm
2
) energy densities is able to accelerate neuromuscular recovery after crush nerve
injury in rat.
Page 3 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
4
INTRODUCTION
Peripheral nerve injury is a common clinical event which is generally related to
incapacity [ 1, 1]. According to a U.S. study, 50,000 subjects suffer traumatic injuries of
peripheral nerves every year [ 3, 4] representing a significant public health problem. In
Brazil, a recent study classified 456 cases of nerve injuries and showed that
axonotmesis represents the most common nerve injury (45%) followed by neurotmesis
(41%) and neuropraxia (14%) respectively [ 5].
The mechanisms involving nerve regeneration are well described.
When nerve fiber
continuity is interrupted, the distal stump undergoes Wallerian degeneration [ 6]. The
proximal axon stump can then regenerate along the nerve tract distal to the lesion and
reach the peripheral target (muscle fibers and sensory receptors) [ 6].
Another tissue strongly affected by peripheral nerve injuries is skeletal muscle.
Innervation is critical for muscle functionality and structural integrity [ 7, 8]. Thus,
denervation leads to a profound loss of muscle mass and inability to generate force [ 9,
10].
The coordination of regeneration process depends of numerous modifications of
extracellular matrix (ECM) [ 11] occurring concomitantly in both injured nerve and
denervated muscles [ 12- 14]. These changes require the action of proteolytic zinc-
containing enzymes called matrix metalloproteinases (MMPs), which play a critical role
in the ECM reorganization. MMPs are secreted by Schwann cells, intramuscular axons,
muscle satellite cells and fibroblasts into skeletal muscle at the neuromuscular junction
(NMJ) and around muscle fibers [ 12, 15- 17].
Nevertheless, only a few studies have investigated the MMPs in neuromuscular diseases
[ 12, 13, 15, 18- 20]. Studies of nerve crush injury suggest that MMP-2 and MMP-9 are
involved in facilitating axonal growth along the peripheral nerve via basal lamina
Page 4 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
5
remodeling [ 13, 14]. Thus, MMP activity can be considered as a good marker to
investigate peripheral nerve recovery.
Low-level laser therapy (LLLT) seems to be a very efficient technique in peripheral
nerve recovery and its effectiveness has been found over the years. A critical review of
the literature [ 1] showed that more than 80% of the experimental studies carried out so
far on the use of LLLT for promoting peripheral nerve repair, led to a positive outcome
on posttraumatic/postoperative nerve recovery, thus pointing to this physiotherapy tool
as a very promising clinical approach for patients who suffered a nerve lesion.
On the other hand there are conflicting results on the use of LLLT. These results may be
due to technical variables lists (in particular wavelength, doses and types of radiation)
which if not properly adjusted may reduce the success of any therapeutic procedure [ 1,
21]. Following the need to establish clinical protocols for the application of LLLT, this
study intends to continue to deepen the analysis of this therapy on the peripheral nerve,
focusing particular attention on the choice and combination of the LLLT wavelength
(660nm and 780nm) and the parameters of irradiation (10, 60 and 120 J/cm
2
) on the
MMP activity response and neuromuscular recovery after sciatic nerve crush in rats.
The results of this study bring important aspects in the prospects for application in
patients in the future.
Page 5 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
6
MATERIALS AND METHODS
Crush Injury
Wistar adult (275 g) (Rattus norvegicus) male rats were used in this study. Good
laboratory animal practice was observed according to the international standards for
animal experimentation and following approval by our local Institution’s Animal Care
and Ethics Committee. The animals were anaesthetised with an intraperitoneal injection
of a premixed solution containing ketamine (95 mg/kg) and xylazine (12 mg/kg). The
skin was shaved and cleaned with 10% povidone iodine. A 2-cm-long incision was
made on the skin through a gluteal approach and the left sciatic nerve was exposed. A
non-serrated clamp, exerting a force of 54 N [ 22, 23], was used for a period of 30
seconds to create a 3-mm-long crush injury, 10 mm above the bifurcation, in order to
get a good reproducibility of the axonotmetic lesion [ 23]. The starting diameter of the
sciatic nerve was about 1 mm, during the crush the nerve flattens to a new diameter of 2
mm, giving a final pressure of p
=
9 MPa. The nerves were kept moist with 37ºC sterile
saline solution throughout the surgical intervention. After surgery, animals were housed
in single cages and fed rat chow and water ad libitum. For the first four days,
acetaminophen (13,5 mg/100 ml) was added to water for pain reduction.
LLLT Protocol and Experimental Design
Biostimulation was carried on using a gallium–aluminium–arsenide laser device (TWIN
LASER, MM Optics, São Carlos, SP, Brazil) with following parameters: continuous
radiation, wavelength: 660 or 780 nm, power: 40 mW, spot area: 4 mm², energy density
at the point of entry: 10, 60 or 120 J/cm
2
. The time of stimulation was pre determinate
by the device following the parameters above described. All parameters are described in
detail on Table 1.
Page 6 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
7
The radiation was applied transcutaneoulsy at skin contact, after shaving the skin, on the
site of surgery (recognizable for the presence of the surgical scar) at two points
following the sciatic nerve trajectory, one above and one bellow the scar site
considering two inches away from them. Applications were made daily for 10
consecutive days beginning on the 1
st
day after surgery. The animals were gently
handling. Laser biostimulation did not produce any painful sensation and distress to the
animals.
The animals were randomly divided into eight groups (n: 8): (1) normal (N), in which
the animals received no intervention and remained free in the cage for 28 days; (2)
Crush (CR), in which the animals were submitted the crush injury and received the
simulation treatment (placebo); (3) crushed nerve irradiated with LLLT 660nm 10J/cm
2
(CR660 10J); (4) crushed nerve irradiated with LLLT 660nm 60J/cm
2
(CR660 60J); (5)
crushed nerve irradiated with LLLT 660nm 120J/cm
2
(CR660 120J); (6) crushed nerve
irradiated with LLLT 780nm 10J/cm
2
(CR780 10J); (7) crushed nerve irradiated with
LLLT 780nm 60J/cm
2
(CR780 60J); (8) crushed nerve irradiated with LLLT 780nm
120J/cm
2
(CR780 10J). The experimental groups and the LLLT parameters are
described on Table 1.
The assessment of nerve functional recovery
The assessment of nerve function recovery was carried out by calculating the sciatic
functional index (SFI) as described by Bain and cols [ 24]. Animals were tested in a
confined walkway measuring 42-cm-long and 8.2-cm-wide, with a dark shelter at the
end. A white paper was placed on the floor of the rat walking corridor. The hind paws
of the rats were pressed down onto a finger paint-soaked sponge, and they were then
allowed to walk down the corridor leaving its hind footprints on the paper. Three
Page 7 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
8
measurements were taken from the footprints: (1) the print length (PL), i.e. the distance
from the heel to the third toe; (2) the toe spread (TS), i.e. distance from the first to the
fifth toe; and (3) the intermediary toe spread (ITS), i.e. distance from the second to the
fourth toe. All three measurements were taken from the experimental (E) and normal
(N) sides. The SFI was calculated according to the following equation:
8.83.135.1093.38 −
−
+
−
+
−
−=
NITS
NITSEITS
NTS
NTSETS
NPL
NPLEPL
SFI
Muscle and nerve evaluation
Twenty-eighth days after surgery, all animals were euthanized with anesthetic overdose.
The right sciatic nerves and the right muscles tibialis anterior (TA) were carefully
dissected to avoid mechanical injuries.
The muscles were then divided in half at the middle of the belly. The distal fragment
was used for the histological and morphometric measurements. The proximal fragment
was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C (Forma Scientific,
Marietta, OH) for the zimography analysis.
Afterwards, the distal fragment was frozen in isopentane, previously frozen in liquid
nitrogen. Muscle samples were placed in plastic tubes and stored in freezer at -80°C.
Histological serial cross-sections (10 µm), cut transversely to the muscle main axis,
were obtained with a HM 505E cryostat (Microm, Walldorf, Germany) at a level
corresponding to the middle belly of the muscle. Sections were stained with Masson’s
Trichrome kit for morphological evaluation according to manufacture instruction
(Sigma-Aldrich, catalogue no. HT15, St. Louis, MO). For muscle fiber morphometry,
the cross-sectional area of two hundred randomly selected fibers was measured in the
middle belly of each TA muscle, using a light microscope (Axioplan 2, Carl Zeiss, Jena,
Page 8 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
9
Germany) equipped with a digital camera (AxioCam HRc, Carl Zeiss, Germany) and
the AxioVision 4.7 software (Carl Zeiss, Jena, Germany). A blind procedure was used
for measurements.
Four sciatic nerves were immediately frozen in liquid nitrogen at stored at -80
o
C for
zymography. The other four nerves were divided in half at the distal of the lesion. One
part were fixed in 10 % formalin for 3 h and then washed in phosphate buffer saline
(PBS) until embedding. The specimens were dehydrated and embedded in paraffin and
cut at 7 µm perpendicular to the main nerve axis. For immune-histochemistry, sections
were incubated overnight in a solution of anti-S100 (polyclonal, rabbit, which
recognizes the bovine 21 kD monomeric units of S-100 calcium-binding protein,
dilution 1:800, Sigma, St. Louis, MO). After washing in PBS, immunolabelling was
carried out by incubating sections for 1h in a solution containing secondary antibodie:
TRITC-conjugated anti-rabbit IgG (dilution 1:200, Dako, Milano, Italy). The sections
were finally mounted with a Dako fluorescent mounting medium and analyzed by a
fluorescence microscope (Axiolab, Carl Zeiss, Jena, Germany) equipped with
appropriate filter. A magnification of 100x was used.
For specificity assessment we have also carried out a "morphology-based specificity
test", consisting of the same immunolabelling protocol to stain sections from normal
peripheral nerve where the protein is known to be present with a clear localization easily
detectable from a morphological viewpoint. This test supported the specificity of the
reagent by demonstrating that it specifically labels only the tissue elements where the
immunogen is known to be present.
The other part of the divided nerve were fixed by dripping (for 5 minutes) and then
immersion in a solution containing 2.5% purified glutaraldehyde and 0.5% saccarose in
0.1M Sorensen phosphate buffer (pH 7.4, 4°C), for 6-8 hours. Specimens were washed
Page 9 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
10
in a solution containing 1.5% saccarose in 0.1M Sorensen phosphate buffer (pH 7.4) for
6-12 hours, post-fixed in 1.5% osmium tetroxide, dehydrated and then embedded in
historesin according to manufacture instructions (Leica HistoResin, Leica, Wehrheim,
Germany). Series of 2 µm thick semi-thin transverse sections were cut using an
ultramicrotome and stained by Toluidine blue for 30 seconds. The nerve section were
observed under a light microscope (Axiolab, Carl Zeiss, Jena, Germany) equipped with
a Carl Zeiss AxioCam HRc camera.
For morphometric analysis of the regenerated nerve fibers, we used the method of
Systematic Random Sampling and 2D-dissector which was described previously [ 25].
The measurements were performed using the software ImageJ 1.42q (Wayne Rasband,
National Institutes of Health, US, available to download at
http://rsb.info.nih.gov/ij).
The variables analyzed were: number of nerve fibers per field; axon, myelin and nerve
fiber CSA. Numerical data were analyzed using MATLAB (version 7.0.1).
Zymography
Muscle and nerve extraction and zymographic analysis was performed according to
current methodology [ 26, 27]. The molecular mass of gelatinolytic activities was
determined by comparison to reference protein molecular mass marker PageRuler
Prestained Protein Ladder (Fermentas Life Sciences, Burlington, Ont., Canada).
Activity bands were identified according to their molecular weights (active-MMP-9: 85
kDa; pro-MMP-2: 72 kDa; intermediary-MMP-2: 64 kDa; and active-MMP-2: 57 kDa).
Densitometric quantitative analysis of the total protein in the zymography was
performed using GeneTools v3.06 software (Syngene, Cambridge,UK).
Statistic
Page 10 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
11
Shapiro-Wilk’s W and Levene’s test were applied to evaluate the normality and
homogeneity of the results, respectively. For parametric data: one-way ANOVA was
used to identify possible differences between groups. When differences were observed,
the Tukey test was performed. For non-parametric data: Kruskal-Wallis test followed by
Newman-Keuls test were performed. For all tests, the significance level was set at 5%
(p ≤ 0.05).
Page 11 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
12
Results
Walking track analysis
Figure 1 shows the functional assessment of posttraumatic sciatic nerve recovery by
calculating the SFI. Normal walking is represented on the moment pre-crush (Pre-CR;
Fig 1) when SFI values are close to zero. As expected, on the day-2 all groups had their
SFI declined compared do Pre-CR (P<0.05; Fig 1). The indexes maintained low until
the 10
th
day when they started to increase and reached normal values on the 20-day
(P>0.05). They remained practically unchanged until the final experimental period (Fig
1). No difference among the groups was observed in any investigated period (P>0.05;
Fig 1).
Muscle Histology and Morphometric Analysis
Figure 2 represents sections from TA muscles stained with Masson’s Trichrome.
Muscle fiber atrophy was observed in CR, CR780 10, 60 and 120J groups in
comparison to N and CR660 10, 60 and 120J (Fig 2). All groups preserved the
polygonal muscle fiber shape (Fig 2). Target muscle fibers with signs of morphological
reorganization were found close to nerve endings in all groups submitted to peripheral
nerve injury. These target fibers are an indicative of reinnervation process (Fig 2).
Furthermore, groups submitted to peripheral nerve injury had an increase total collagen
mainly in the perimysium, surrounding muscle fibers bundles (Fig 2).
Muscle fiber CSA decreased significantly in CR and CR780 (10, 60 and 120J)
compared to N group (P <0.05, Fig 3) confirming histology findings. The CR group
decreased its CSA around 55.11% compared to N (P <0.05, Fig 3). The groups
irradiated with 780 nm laser decreased around 44.47% in muscle fiber CSA (CR780
10J: -37.01%; CR780 60J: -51.77%; CR780 120J: -44.63%) compared to N (P <0.05,
Page 12 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
13
Fig 3). The CR660 groups presented muscle fiber CSA similar to normal values (P>
0.05, Fig 3).
Total activity of MMPs in TA muscles
The MMP-9 was not detected in muscles of any experimental groups (data not shown).
The MMP-2 activity in the CR group did not differ from normal values (P>0.05, Fig 4).
The 660 nm LLLT at different doses (10, 60 and 120J) decreased significantly the
MMP-2 activity compared to N group (P <0.05, Fig 4). Furthermore, MMP-2 activity in
both CR660 10J and CR660 60J was lower than CR levels (P<0.05, Fig 4). The CR780
60J and CR780 120J groups showed a decrease of MMP-2 activity compared to N and
CR (P<0.05, Fig 4). The MMP-2 activity in CR780 10J group was similar to N and CR
(P>0.05, Fig 4).
Nerve histology, S-100 immunofluorescence and morphometry
Figure 5 shows the sciatic nerve histology stained with toluidine blue for all injured and
normal groups. They all clearly illustrate similarities in structural organization. A slight
atrophy can be observed in all crush groups compared to normal. However, this atrophy
can be observed most clearly in CR and in the last two groups CR780 60J and 120J (Fig
5). The nerves from CR660 10, 60 and 120J, and CR780 10 J group were better
structured with bigger nerve fibers compared to the other crush groups (CR, CR780 60
and 120J; Fig 5).
The S100 immunofluorescence can be observed in the Figure 6. Schwann cells and
myelin sheath are represented in red. Myelin sheath is well delimited in N group (Fig
6A). All crushed nerves presented a similar pattern of S100 expression (Fig 6B-D).
Page 13 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
14
Myelin sheath was well delimited in many nerve fibers, but it was smaller than N group.
No notable difference was observed among crush groups submitted or not to LLLT.
Morphometric nerve analysis showed that the mean number of nerve fiber per field was
135 ± 27, and there was no difference among the experimental groups (P> 0.05, Fig 7).
Figure 8 shows the mean ± SD values of myelin, axon and nerve fiber CSA in the
sciatic nerves of the experimental groups. For myelin, a reduction of CSA was observed
in CR, CR660 120J and CR780 60J compared to N (P <0.05, Fig 8). The CR660 10, and
60J, and CR780 10 and 120J had myelin CSA values similar to N group (P> 0.05; Fig
8). Axon CSA decreased in all crushed groups compared to N (P <0.05, Fig 8) with no
difference among them (P> 0.05; Fig 8). Nerve fiber CSA followed the changes
observed in myelin, e.g., the CR660 10 and 60J, and CR780 20 and 120J groups
presented values similar to N group (P>0.05; Fig 8), whilst CR, CR660 120J, and
CR780 60J were smaller than N group (P<0.05; Fig 8).
Total MMP activity in sciatic nerve
After 28 days, MMP-9 activity from CR was similar to N group (p> 0.05; Fig 9). LLLT
660 nm, regardless the dose used, decreased MMP-9 activity in injured sciatic nerves
compared to CR (CR660 10J: -62%, p = 0.0002; CR660 60J: -68%, p = 0, 0001; and L
660 120J: -39%, p = 0.03; Fig. 9). The CR780 10J group showed a significant reduction
of MMP-9 activity compared to N and CR groups (p = 0.02 and p = 0.0001,
respectively; Fig.9). Both CR780 60 and 120J groups presented the same levels of
MMP-9 activity compared to N and CR groups (p> 0.05; Fig.9).
The MMP-2 activity remained unchanged in CR, CR780 10, 60 and 120J groups
compared to N (p> 0.05, Figure 10). However, all groups irradiated with 660 nm laser
had the MMP-2 activity significantly increased compared to N (L 660nm 10J: +81%, p
Page 14 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
15
= 0.04; L 660nm 60J: +126%, p = 0.003, and L 660nm 120J: +100%, p = 0.02) and CR
group (p <0.05, Figure 10).
Page 15 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
16
DISCUSSION
This study brings new information about the effects of different doses of LLLT in
peripheral nerve regeneration and denervated muscle recovery after crush injury. All
results brought important contribution to clarify and establish the best parameters for
LLLT clinical use, focusing the acceleration of neuromuscular recovery and functional
improvement.
The authors consider that the results cannot be interpreted out of a global context.
Therefore, in the present study, the effects of LLLT were carried out considering both
muscle and nerve responses. Since some parameters showed to be better to
neuromuscular recovery than others.
Several studies had already showed that LLLT accelerates the peripheral nerve
regeneration process [ 1, 28- 40]. However, no study in the last decade has examined the
effects of LLLT irradiation on TA muscle trophism after peripheral nerve injuries [ 39,
40]. Another innovator point of this study was to study the MMP activity in both nerve
and muscle submitted to LLLT.
The conflicting results about the LLLT use in rehabilitation could be due to numerous
technical variables, particularly wavelength, energy densities and type of irradiation. If
they are not well adjusted, they can impair therapeutic process [ 1]. Following the
necessity of to establish clinical protocols of LLLT application, the present study
proposed to go deeper on the investigation of the effects of peripheral nerve irradiation.
The mainly aspects confronted in this study were the wavelength types (660 nm vs 780
nm) and the energy densities (10, 60 and 120 J/cm
2
) which are relevant aspects to
patient application perspectives.
The LLLT parameters chosen in this study were based on several scientific studies.
Literature shows that there is an increase of infrared laser devices use, and it is justified
Page 16 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
17
by its greater penetration through the skin [ 41]. Nervertheless, positive effects obtained
from experimental studies used either visible [ 30, 42, 43] or near-infrared lasers [ 21]. It
seems that both types of LLLT wavelengths are useful to promote nerve regeneration.
Another important parameter to be considered when investigating LLLT effects is
energy density. Analysis of published results showed that LLLT at different levels of
energy density (ranging from less than 10 J/cm² to 150 J/cm²) are effective in promoting
nerve regeneration [ 1]. The same can be reported from time of irradiation which vary
from less than 1 minute to 90 minutes. Therefore, these observations suggest that LLLT
has positive effects on nerve regeneration. On the other hand there is a lot of doubts
involving the best parameter combination to consider when to treat nerve injuries. All
published studies which presented good results in nerve regeneration used continuous
LLLT, thus this type of laser emission was used in the current study [ 1, 28, 39].
Regarding to muscle fiber CSA results, 660 nm LLLT with10, 60 or 120 J/cm
2
seems to
be effective to accelerate the recovery of muscle fiber trophism in the present study. On
the other hand, groups irradiated with 780 nm LLLT presented muscle fiber CSA
similar to CR values. In addition, nerve morphometry showed that both myelin and
nerve fiber CSA reached normal levels in CR660 10 and 60 J/cm
2
and also in CR780 10
and 120 J/cm
2
. Myelin sheath is responsible for action potential conduction along the
axon, and its reduction causes decrease or loss of axonal function [ 44]. Nerve histology
corroborated to this findings because these groups presented bigger nerve fibers and less
content of connective tissue rounding fibers. Furthermore, S-100, a marker of Schwann
cells and myelin sheath, showed that its expression was quite similar among crushed
groups, and myelin was not structured as in control groups. To elucidate these different
aspects involving muscle and nerve recovery, future studies should investigate electrical
neurophysiologic parameters of neuromuscular system such as H-reflex and M-wave,
Page 17 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
18
and also factors related to muscle reinnervation, for example neural cell adhesion
molecule (N-CAM), agrin, and acetylcholine receptors expressions.
Relating to MMP activity results, the biological meaning of its behavior due to LLLT
are interpreted in accordance to nerve and muscle global results. Therefore, the authors
believe that the 660 nm LLLT, especially the groups 10 and 60J/cm
2
, accelerated nerve
regeneration and muscle fiber reinnervation. This hypothesis can be supported by the
fact that groups irradiated with 660 nm laser recovered muscle fiber CSA compared to
the N group. This recovery was accompanied by an increased of MMP-2 activity in
nerve and a decrease of MMP-9 and MMP-2 activities in nerve and muscle,
respectively.
During initial phases of Wallerian degeneration, axonal cytoskeleton disintegration and
myelin sheath breakdown are highly coordinated by MMPs, specially MMP-9 and -2.
La Fleur and cols [ 45] showed that high levels of MMP-9 on the day-1 and -4 after
nerve crush injury are related to neutrophils and macrophage influx respectively.
Furthermore, the authors report that inflammatory cell and Schwann cells are able to
secret MMP-9. Its secretion is important to degrade axon and myelin debris promoting
ECM remodeling necessary to axonal growth. In addition, MMPs can release Schwann
cells of their connections with basal membrane allowing their proliferation and
stimulating axon terminals penetration through ECM [ 45].
Despite the increment of MMP-9 activity is desired during early stage of nerve
degeneration, the maintenance of high MMP-9 levels can be detrimental to tissue
integrity. Beuche and cols [ 46] observed an increase of serum MMP-9 levels in patients
with amyotrophic lateral sclerosis possibly caused by peripheral nerve degeneration and
muscle denervation. Mice MMP-9-knockout underwent a spinal cord injury showed an
accelerated recovery of motor function compared to wild animals [ 47]. Together these
Page 18 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
19
results indicate that the negative regulation of MMP-9 might be important during the
final stages of neural repair. Thus, our results suggest that LLLT might have an anti-
inflammatory effect controlling inflammatory cell influx via MMP-9 down regulation.
In this context, the production and degradation of ECM components seems to stimulate
or impair axonal growth. Gantus and cols [ 11] reported that laminin, fibronectin and
collagen IV are important to support axonal growth during regenerative process,
forming a network of ECM to the growth cone. However, other ECM components such
as chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG) are able to inhibit this process [ 11].
Previous studies have shown that during the Wallerian process, the increment of MMP-
2 activity in nerve is able to reorganize the basal lamina by degradating collagen type
IV and allowing the axonal growth cone to move forward [ 45]. Moreover, it is well
described in the literature that MMP-2 degrades CSPG [ 11] suggesting that the increase
of MMP-2 activity could be a positive indicator of axon regeneration process.
Therefore, our results corroborate to these findings. In the present study groups which
presented the normal values of muscle fiber and myelin CSA had the lowest values of
MMP-9 and the highest values of MMP-2 in sciatic nerves. It is also necessary to
emphasize that these MMPs are systematically regulated by tissue inhibitors of
metalloproteinase (TIMP) which control the process and protect the basal lamina
structure [ 45]. Future studies should investigate the role of LLLT not only on MMPs
activity in nerve and muscle tissues but also consider the TIMPs expression.
For the denervated skeletal muscle, the role of MMPs in this affection is not well
defined yet. Some studies have shown that the increase of MMP-2 activity in muscles
after 28 days of denervation may be related not only to muscle atrophy and proliferation
of connective tissue around muscle fibers [ 26], but also to ECM remodeling which
allows axonal growing and muscle fiber reinnervation. However, other studies show
Page 19 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
20
that increase of MMP-2 activity may be related to cycles of degeneration / regeneration
of muscle fibers. Thus, the decrease of MMP-2 activity in muscles from groups
irradiated with 660nm LLLT may have been beneficial to muscle tissue, probably
causing less damage in muscle fibers. Future studies should evaluate the behavior of
these MMPs in muscular and peripheral nervous systems in different periods of time to
confirm the hypotheses here generated.
Regarding to functional analysis, all experimental groups submitted to crush nerve
injury recovered normal function in the ending of experimental period. Such response
was expected due to the type of nerve injury performed. Varejão and cols [ 23] used the
same protocol of crush injury in rat sciatic nerve and found that 4 weeks post-injury,
animals recovery about 80% of the function, and on the 8
th
week, the motor recovery
was complete. Following this premise, the authors opted for using a well described,
controlled and reproducible model of crush injury of rat nerve sciatic [ 22, 23, 30, 31,
43, 48, 49, 50] which allows to verify different phases of nerve recovery. Morphological
findings of the present study such as targed muscle fibers were observed in all crushed
groups suggesting that muscle fibers were reinnervated confirming the time set of nerve
recovery after the crush.
Even considered as an injury with rapid prognosis of recovery in animal model, in
humans the time of recovery after nerve traumatic injury may extend during several
months or even years, depending on the severity and extension of the lesion [ 38].
Additionally, the recovery in many times used to be incomplete generating dysfunctions
and impairing daily life activities. Regarding clinical applicability this type of study
brings important contribution to design new safe and effective strategies of peripheral
nerve injury rehabilitation.
Page 20 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
21
The functional test used in our study is largely widespread and used, because it is an
easy, noninvasive and cheap procedure. However, the effectiveness of their results
differs among scientists. Some accept the test as a good tool to evaluate sciatic nerve
injury. Others groups question its accuracy, and suggest that video analysis could be
more precise [ 51- 53]. Even questioned, functional test is an additional analysis that
whether observed combined with other analyses can suggest how the neuromuscular is
interacting.
Interesting, the present study demonstrated that both nerve and muscle have a biological
response according to wavelength and dose used, e.g., data support a dose-dependent
curve. The 660 nm LLLT with 10 or 60 J/cm
2
seems to be more effective to accelerate
nerve recovery because CR660 10 and 60J groups presented normal values of muscle
fiber CSA, decreased the MMP-2 and -9 activities in TA muscles and sciatic nerves,
respectively, increased the MMP-2 activity in nerve, and presented normal values of
myelin and nerve fiber CSA, indicating a possible acceleration of nerve regeneration
and muscle fiber reinnervation.
Based on objective proposed we can conclude that 660 nm LLLT specially low (10
J/cm
2
) and moderate (60J/cm
2
) energy densities accelerates neuromuscular recovery and
ECM remodeling in nerve and muscle via MMP-2 and -9 regulation, but it failed to
improve function after crush nerve injury in rats.
Page 21 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
22
LEGENDS
Figure 1. Functional analysis of crushed groups assessed by sciatic functional index
calculation. Pre-CR: immediately before nerve crush injury. At pre-lesion state the
function was absolutely normal in all groups. Function decreased at the 2-day and
remained unchanged until 10 days of injury. After that, an exponential increase of
functionality was observed in all groups, and they reached normal values on the 20
th
day. * Difference statistically significant (p <0.05) compared to Pre-CR. J = J/cm
2
.
Figure 2. Histological appearance of tibialis anterior muscle after Masson’s Trichrome
staining. Note that CR, CR780 10, 60 and 120J groups presented muscle fiber atrophy
compared to N. Head arrows indicate increase of total collagen in the perimisium in all
crushed groups. Arrows show target muscle fibers indicating cytoarchitecture
reorganization. Target fibers are an indicative of reinnervation process. Asterisk (*)
indicate an intramuscular nerve termination. J = J/cm
2
. Bar = 100 µm.
Figure 3. Mean cross-sectional area of tibialis anterior muscle fibers. *P<0.05
compared to N. Note that CR and CR780 10, 60 and 120J did not recovery normal
values of muscle fiber CSA. Groups irradiated with 660 nm LLLT presented normal
muscle fiber CSA. J = J/cm
2
.
Figure 4. Total MMP-2 activity observed in different experimental groups.
Representative bands of MMP-2 gelatinolytic activity are represented on the top of the
figure. J = J/cm
2
. * P <0.05: compared to N; † P <0.05: compared to CR. Note the
significant decrease of MMP-2 activity in CR660 10 and 60J, and also in CR780 60 and
120J compared to N and CR groups.
Page 22 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
23
Figure 5. Histological nerve sections stained with toluidine blue. Note structural
similarities among the experimental groups. Scale bar: 40 µm². J = J/cm².
Figure 6. Immunofluorescence analysis of S-100 performed in sciatic nerves. Myelin
sheath and Schwann cells are marked in red. Head arrows represent normal S-100
expression in N group. White arrows show S-100 expression in small regenerated
fibers. No difference was observed among crushed groups. Bar: 100 µm². J = J/cm².
Figure 7. Number of nerve fibers per microscopic field in different experimental
groups. There was no difference among the groups.
Figure 8. Myelin, axon and nerve fiber cross-sectional are (CSA) from sciatic nerve.* P
<0.05 compared to N. Note that CR660 10 and 60J and CR780 10 and 120J had myelin
and nerve fiber CSA values similar to N. All crushed groups decreased the axon CSA
compared to N with no difference among them. J = J/cm2.
Figure 9. Total MMP-9 activity observed in sciatic nerve from different experimental
groups. Representative bands of MMP-2 gelatinolytic activity are presented on the top
of the figure. J = J/cm2. * P<0.05: compared to group N; †P<0.05: compared to CR.
Note that all groups CR660 (10, 60 and 120J) and only CR780 10J decreased MMP-9
activity compared to CR.
Figure 10. Total MMP-2 activity observed in sciatic nerve from different experimental
groups. Representative bands of MMP-2 gelatinolytic activity are presented on the top
of the figure. J = J/cm2. * P<0.05: compared to group N and CR; Note that all groups
Page 23 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
24
submitted to 660 nm LLLT regardless the dose (10, 60 and 120J) had MMP-2 activity
increased.
Page 24 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
25
REFERENCE
1. Gigo-Benato D, Geuna S, de Castro Rodrigues A, Tos P, Fornaro M, Boux E,
Battiston B, Giacobini-Robecchi MG. Low-power laser biostimulation enhances
nerve repair after end-to-side neurorrhaphy: a double-blind randomized study in
the rat median nerve model. Lasers Med Sci 2004; 19:57-65.
2. Gigo-Benato D. Geuna S, Rochkind S. Phototherapy for enhancing Peripheral
Nerve repair: a review of the literature. Muscle Nerve 2005; 31:694-701.
3. Millesi H. Techniques for nerve grafting. Hand Clinics 2000; 16:73-91.
4. Evans GR. Peripheral nerve injury: a review and approach to tissue engineered
constructs. Anat Rec 2001; 263:396-404.
5. Kouyoumdjian JA. Peripheral nerve injuries: a retrospective survey of 456 cases.
Muscle Nerve 2006; 34:785-788.
6. Lundborg G. Nerve injury and repair, 2nd Edition, Edinburgh: Churchill
Livingstone. 2005.
7. Ishido M, Kami K, Mitsuhiko M. In vivo expression patterns of MyoD, p21 and
Rb proteins in myonuclei and satellite cells of denervated rat skeletal muscle.
Am J Physiol Cell Physiol 2004; 287:C484-C493.
8. Kostrominova TY, Dow DE, Dennis RG, Miller RA, Faulkner JA. Comparison
of gene expression of two-month denervated, two-month stimulated-denervated
and control rat skeletal muscles. Physiol Genomics 2005; 22:227-243.
9. Billington L, Carlson BM. The recovery of long-term denerveted rat muscles
after marcaine treatment and grafting. J Neurol Sci 1996; 144:147-155.
10. Dow DE, Cederna PS, Hassett CA, Kostrominova TY, Faulkner JA, Dennis RG.
Number of contractions to maintain mass and for of a denervated rat muscle.
Muscle Nerve. 2004; 30:77-86.
11. Gantus MAV, Nasciutti LE, Cruz CM, Persechini PM, Martinez AMB.
Modulation of extracellular matrix components by metalloproteinases and their
tissue inhibitors during degeneration and regeneration of rat sural nerve. Brain
Res 2006; 1122:36-46.
12. Demestre M, Orth M, Wells GM, Gearing A J, Hughes RA, Gregson NA.
Characterization of matrix metalloproteinases in denervated muscle.
Neuropathol Appl Neurobiol 2005; 31:545-555.
13. Platt CI, Krekoski CA, Ward RV, Edwards DR, Gavrilovic J. Extracellular
matrix and matrix metalloproteinases in sciatic nerve. J Neurosci Res 2003;
74:417-429.
Page 25 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
26
14. Siebert H, Dippel N, Mäder M, Weber F, Brück W. Matrix metalloproteinase
expression and inhibition after sciatic nerve axotomy. J Neuropathol Exp Neurol
2001; 60:85-93.
15. Ahtikoski AM, Tuominen H, Korpelainen JT, Takala TE, Oikarinen A. Collagen
synthesis and degradation in polyneuropathy and myopathies. Muscle Nerve
2004; 30:602-608.
16. Schoser BG, Blottner D. Matrix metalloproteinases MMP-2, MMP-7 and MMP-
9 in denervated human muscle. Neuroreport 1999; 10:2795-2797.
17. Carmeli E, Moas M, Reznick AZ, Coleman R. Matrix metalloproteinases and
skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 2004; 29:191-197
18. Kherif S, Dehaupas M, Lafuma C, Fardeau M, Alameddine HS. Matrix
metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in denervated muscle and injured nerve.
Neuropathol Appl Neurobiol 1998; 24:309-319
19. Koskinen SO, Kjaer M, Mohr T, Sϕrensen FB, Suuronen T, Takala TE. Type
IV collagen and its degradation in paralysed human muscle: effect of functional
electrical stimulation. Muscle Nerve 2000; 23:580-589.
20. Schoser BG, Blottner D, Stuerenburg HJ. Matrix metalloproteinases in
inflammatory myopathies: enhanced immunoreactivity near atrophic myofibers.
Acta Neurol Scand 2002; 105:309-313.
21. Rochkind S, El-Ani D, Nevo Z, and Shahar A. Increase of neuronal sprouting
and migration using 780nm laser phototherapy as procedure for cell therapy.
Lasers Surg Med 2009; 41:277-281.
22. Beer GM, Steurer J, Meyer VE. Standardizing nerve crushes with a non-serrated
clamp. J Reconstr Microsurg 2001; 17:531-534.
23. Varejão AS, Cabrita AM, Meek MF, Bulas-Cruz J, Melo-Pinto P, Raimondo S,
Geuna S, Giacobini-Robecchi MG. Functional and morphological assessment of
a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J
Neurotrauma 2004; 21:1652-1670.
24. Bain JR, Mackinnon SE, Hunter DA. Functional evaluation of complete sciatic,
peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast Reconstr Surg 1989;
83:129-138.
25. Geuna S, Gigo-Benato D, De Catro Rodrigues A. On sampling and sampling
errors in histomorphometry of peripheral nerve fibers. Microsurgery 2004;
24:72-76.
26. Russo TL, Peviani SM, Durigan JL, Salvini TF. Electrical stimulation increases
matrix metalloproteinase-2 gene expression but does not change its activity in
denervated rat muscle. Muscle Nerve 2008; 37:593-600.
Page 26 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
27
27. Peviani SM, Russo TL, Durigan JL, Vieira BS, Pinheiro CM, Galassi MS,
Salvini TF. Stretching and electrical stimulation regulate the metalloproteinase-2
in rat denervated muscle. Neurol Res 2009 (in press).
28. Anders JJ, Geuna S, Rochkind S. Phototherapy promotes regeneration and
functional recovery of injured peripheral nerve. Neurol Res 2004; 26:233-239.
29. Rochkind S, Nissan M, Razon N, Schwartz M, Bartal A. Electrophysiological
effect of HeNe laser on normal and injured sciatic nerve in the rat. Acta
Neurochir 1986; 83:125-30.
30. Rochkind S, Barr-Nea L, Razon N, Bartal A, Schwartz M. Stimulatory effect of
He-Ne low dose laser on injured sciatic nerves of rats. Neurosurgery 1987;
20:843- 847.
31. Rochkind S, Nissan M, Barr-Nea L, Razon N, Schwartz M, Bartal A. Response
of peripheral nerve to HeNe laser: experimental studies. Lasers Surg Med 1987;
7:441-443.
32. Rochkind S, Nissan M, Lubart R, Avram J, Bartal A. The in-vivo nerve response
to direct low-energy-laser irradiation. Acta Neurochir 1988; 94:74-77.
33. Rochkind S, Rousso M, Nissan M, Villarreal M, Barr-Nea L, Rees DG.
Systemic effects of low-power laser irradiation on the peripheral and central
nervous system, cutaneous wounds, and burns. Lasers Surg Med 1989; 9:174-
182.
34. Rochkind S, Barr-Nea L, Volger I. Spinal cord response to laser treatment of
injured peripheral nerve. Spine 1990; 15:6-10.
35. Rochkind S, Ouaknine GE. New trend in neuroscience: low-power laser effect
on peripheral and central nervous system (basic science, preclinical and clinical
studies). Neurol Res 1992; 14:2-11.
36. Rochkind S, Nissan M, Alon M, Shamir M, Salame K. Effects of laser
irradiation on the spinal cord for the regeneration of crushed peripheral nerve in
rats. Lasers Surg Med 2001; 28:216-219.
37. Rochkind S, Drory V, Alon M, Nissan M, Ouaknine GE. Laser phototherapy
(780 nm), a new modality in treatment of long-term incomplete peripheral nerve
injury: a randomized double-blind placebo-controlled study. Photomed Laser
Surg. 2007; 25:436-42.
38. RochkindO S, Leider-Trejo L, Nissan M, Shamir MH, Kharenko O, Alon M.
Efficacy of 780-nm laser phototherapy on peripheral nerve regeneration after
neurotube reconstruction procedure (double-blind randomized study). Photomed
Laser Surg 2007; 25:137-43.
Page 27 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
28
39. Rochkind S, Geuna S, Shainberg A. Chapter 25: Phototherapy in peripheral
nerve injury effects on muscle preservation and nerve regeneration. Int Rev
Neurobiol 2009; 87:445-64.
40. Rochkind S. Phototherapy in peripheral nerve injury for muscle preservation and
nerve regeneration. Photomed Laser Surg 2009; 27:219-20.
41. Turner J, Hode L. Laser Therapy: Clinical practice and scientific background.
Sweden: Prima Books Grängesberg. 2003:380-434.
42. Hamilton GF, Keven Robinson T, Ray RH. The effects of helium-neon laser
upon regeneration of the crushed peroneal nerve. J Orthop Sports Phys Therapy
1992; 15:209-214.
43. Anders JJ, Borke RC, Woolery SK, Van De Merwe WP. Low power laser
irradiation alters the rate of regeneration of the rat facial nerve. Lasers Surg Med
1993; 13:72-82.
44. OH, Shin J. Color atlas of nerve biopsy pathology. EUA: CRC Press LLC. 2005.
45. La Fleur M, Underwood JL, Rappolee DA, Werb Z. Basement membrane and
repair of injury to peripheral nerve: defining a potential role for macrophages,
matrix metalloproteinases, and tissue inhibitor of metalloproteinases-1. J Exp
Med 1996; 184:2311-2326.
46. Beuche W, Yushchenko M, Mäder M, Maliszewaska M, Felgenhauer K, Weber
F. Matrix metalloproteinase-9 is elevated in serum of patients with amyotrophic
lateral sclerosis. Neuroreport 2000; 11:3419-3422.
47. Noble LJ, Donovan F, Igarashi T, Goussev S, Werb Z. Matrix
metalloproteinases limit functional recovery after spinal cord injury by
modulation of early vascular events. J Neurosci 2002; 22:7526-35.
48. Khullar SM, Brodin P, Messelt EB, Haanaes HR. The effects of low level laser
treatment on recovery of nerve conduction and motor function after compression
injury in the rat sciatic nerve. Eur J Oral Sci 1995; 103:299-305.
49. Bagis S, Comelekoglu U, Coskun B, Milcan A, Buyukakilli B, Sahin G, Ozisik
S, Erdogan C. No effect of GA-AS 9904 nm) laser irradiation on the intact skin
of the injured rat sciatic nerve. Lasers Med Sci 2003; 18:83-88.
50. Shin DH, Lee E, Hyun JK, Lee SJ, Chang YP, Kim JW, Choi YS, Kwon BS.
Growth-associated protein-43 is elevated in the injured rat sciatic nerve after low
power laser irradiation. Neurosci Lett 2003; 344:71-74.
51. Bervar M. An alternative video footprint analysis to assess functional loss
following injury to the rat sciatic nerve. Acta Chir Plast 2002; 44:86-89.
52. Sarikciouglu L, Demirel BM, Utuk A.Walking track analysis: an assessment
method for functional recovery after sciatic nerve injury in the rat. Folia
Morphol (Warsz) 2009; 68:1-7.
53. Costa LM, Simões MJ, Maurício AC, Varejão AS. Chapter 7: Methods and
protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part IV-
Page 28 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
29
kinematic gait analysis to quantify peripheral nerve regeneration in the rat.Int
Rev Neurobiol 2009; 87:127-39.
Page 29 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
30
Table 1: Experimental groups and LLLT parameters investigated. 1
Experimental
Groups
(n = 8)
Wavelength
(nm)
Power
(mW)
Energy Density
(J/cm
2
)
Total energy
emitted per point*
(J)
Time ON
(min)
N - - - - -
CR - - - - 1
CR660 10J 660 40 10 4 0.3
CR660 60J 660 40 60 24 1
CR660 120J 660 40 120 48 2
CR780 10J 780 40 10 4 0.3
CR780 60J 780 40 60 24 1
CR780 120J 780 40 120 48 2
N: normal group; CR: crush group. Note that “J” in the experimental groups column means “J/cm
2
”. *Total energy emitted per point = energy 2
density (J/cm
2
) x spot area 3
Page 30 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 1. Functional analysis of crushed groups assessed by sciatic functional index calculation. Pre-
CR: immediately before nerve crush injury. At pre-
lesion state the function was absolutely normal in
all groups. Function decreased at the 2-day and remained unchanged until 10 days of injury. After
that, an exponential increase of functionality was observed in all groups, and they reached normal
values on the 20th day. * Difference statistically significant (p <0.05) compared to Pre-CR. J =
J/cm
.
217x140mm (150 x 150 DPI)
Page 31 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 2. Histological appearance of tibialis anterior muscle after Masson’s Tri
chrome staining. Note
that CR, CR780 10, 60 and 120J groups presented muscle fiber atrophy compared to N. Head
arrows indicate increase of total collagen in the perimisium in all crushed groups. Arrows show
target muscle fibers indicating cytoarchitecture reorganization. Target fibers are an indicative of
reinnervation process. Asterisk (*) indicate an intramuscular nerve termination. J = J/cm2. Bar =
100 µm.
242x183mm (150 x 150 DPI)
Page 32 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 3. Mean cross-sectional area of tibialis anterior muscle fibers. *P<0.05 compared to N. Note
that CR and CR780 10, 60 and 120J did not recovery normal values of muscle fiber CSA. Groups
irradiated with 660 nm LLLT presented normal muscle fiber CSA. J = J/cm2.
250x111mm (150 x 150 DPI)
Page 33 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 4. Total MMP-2 activity observed in different experimental groups. Representative bands of
MMP-2 gelatinolytic activity are represented on the top of the figure. J = J/cm2. * P <0.05:
compared to N; † P <0.05: compared to CR. Note the significant decrease of MMP-2 activity in
CR660 10 and 60J, and also in CR780 60 and 120J compared to N and CR groups.
255x142mm (150 x 150 DPI)
Page 34 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 5. Histological nerve sections stained with toluidine blue. Note structural similarities among
the experimental groups. Scale bar: 40 µm². J = J/cm².
171x255mm (150 x 150 DPI)
Page 35 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 6. Immunofluorescence analysis of S-100 performed in sciatic nerves. Myelin sheath and
Schwann cells are marked in red. Head arrows represent normal S-100 expression in N group.
White arrows show S-100 expression in small regenerated fibers. No difference was observed
among crushed groups. Bar: 100 µm². J = J/cm².
177x153mm (150 x 150 DPI)
Page 36 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 7. Number of nerve fibers per microscopic field in different experimental groups. There was
no difference among the groups.
237x155mm (150 x 150 DPI)
Page 37 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 8. Myelin, axon and nerve fiber cross-sectional are (CSA) from sciatic nerve.* P <0.05
compared to N. Note that CR660 10 and 60J and CR780 10 and 120J had myelin and nerve fiber
CSA values similar to N. All crushed groups decreased the axon CSA compared to N with no
difference among them. J = J/cm2.
249x141mm (150 x 150 DPI)
Page 38 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 9. Total MMP-9 activity observed in sciatic nerve from different experimental groups.
Representative bands of MMP-2 gelatinolytic activity are presented on the top of the figure. J =
J/cm2. * P<0.05: compared to group N; †P<0.05: compared to CR. Note that all groups C
R660 (10,
60 and 120J) and only CR780 10J decreased MMP-9 activity compared to CR.
248x156mm (150 x 150 DPI)
Page 39 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
For Peer Review
Figure 10. Total MMP-2 activity observed in sciatic nerve from different experimental groups.
Representative bands of MMP-2 gelatinolytic activity are presented on the top of the figure. J =
J/cm2. * P<0.05: compared to group N and CR; Note that all groups submitted to 660 nm LLLT
regardless the dose (10, 60 and 120J) had MMP-2 activity increased.
248x149mm (150 x 150 DPI)
Page 40 of 40
John Wiley & Sons, Inc.
Lasers in Surgery and Medicine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
