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UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA ACADÊMICA
COORDENAÇÃO GERAL DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS AMBIENTAIS
ALÍCIA MARIA ANDRADE TORRES JARA
BIOFILMES E ENZIMAS SINTETIZADOS NO
PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DO TEREFTALATO
DE POLIETILENO (PET) POR Bacillus subtilis e
Phanerochaete chrysosporium
Recife
2007
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ALÍCIA MARIA ANDRADE TORRES JARA
BIOFILMES E ENZIMAS SINTETIZADOS NO
PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DO TEREFTALATO
DE POLIETILENO POR Bacillus subtilis e
Phanerochaete chrysosporium
Orientadora: Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki
Recife
2007
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação do Mestrado em
Desenvolvimento de Processos Ambientais
da Universidade Católica de Pernambuco,
como pré-requisito para obtenção do título
de Mestre em Desenvolvimento de
Processos Ambientais.
Á
rea de Concentração: Desenvolvimento de
Processos Ambientais.
Linha de Pesquisa: Tecnologia e Meio
Ambiente.
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BIOFILMES E ENZIMAS SINTETIZADOS NO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DO
TEREFTALATO DE POLIETILENO (PET) POR Bacillus subtilis e Phanerochaete
chrysosporium
Alícia Maria Andrade Torres Jara
Examinadores:
_________________________________________________________________________
Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki
Universidade Católica de Pernambuco- UNICAP
Orientadora
_________________________________________________________________
Profa. Dra. Norma Buarque de Gusmão
Universidade Federal de Pernambuco – UFPE
_________________________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Alberto Alves da Silva
Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP
A Deus pela vossa força,
a minha querida MÃE
Deuzonea Rodrigues de Andrade,
por seu exemplo e incentivo, e
a minha orientadora Profa. Galba Takaki,
pelos grandiosos ensinamentos.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, por iluminar meus caminhos e pela força do Espírito Santo;
À minha família, pelo incentivo e compreensão e em especial, minha prima Lúcia
Araújo, ao meu primo Breno, ao meu sobrinho César Victor e minha irmã Lílian, pelo
apoio em todos os momentos;
Ao Reitor da Universidade Católica de Pernambuco, Prof. Dr. Pe Pedro Rubens
Ferreira Oliveira, S.J., por estar preocupado com a formação de recursos humanos,
oferecendo ensino de qualidade;
Ao meu grande amigo Max Fonseca pela amizade, pelo incentivo e apoio;
Ao Prof. Dr. Nelson Durán e todos seus alunos do Laboratório de Química do Instituto
de Química da UNICAMP, pela amizade, apoio e ensinamentos;
Aos Professores Dr. Elias Tambourgi e Flávio Vasconcelos pelo apoio dado na
UNICAMP;
Aos funcionários da Universidade Católica de Pernambuco em especial Cristiano,
Alexandre e Jorge pelo carinho e incentivo;
À Profa. Dra. Aline do Nascimento pelo auxílio com as eletromicrografias de varredura;
Aos professores do Mestrado em Desenvolvimento de Processos Ambientais Profa.
Dra. Alexandra Amorim Salgueiro, Profa. Dra. Arminda Saconi Messias, Prof. Dr.
Carlos Alberto Alves da Silva, Profa. Dra. Kaoru Okada e Profa. Dra. Leonie Asfora
Sarubbo, Prof. Dr. Valdemir Alexandre dos Santos e Profa. Dra. Eliane Cardoso
Vasconcelos pelos ensinamentos;
À Dra. Norma Suely Evangelista que mesmo tão distante contribuiu bastante para
realização desta dissertação;
Aos meus queridos colegas do Mestrado em Desenvolvimento de processos
Ambientais, em especial Ricardo, Antonio, Aline, Daniel e Humberto pelo
companheirismo e amizade, construídos durante o curso;
Aos meus colegas do NPCIAMB, Glauber, Renato, Rafael, Marcelo, Adriana, Hélvia,
Patrícia, Raquel, Juliana, Marcos, Petrusk, Luiza, Thayse, Charles, e em especial,
Marta Cristina, pela grande amizade, companheirismo e apoio nos momentos difíceis;
Aos funcionários Sônia Maria de Souza, secretária do Núcleo e técnicos Severino
Humberto de Almeida e Salatiel Joaquim, pela presteza, eficiência e apoio em todos
os momentos;
À CAPES pela concessão da bolsa para realização do intercâmbio com a UNICAMP;
A todos que direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
vii
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
i
SUMÁRIO
ii
LISTA DE FIGURAS
iii
LISTA DE TABELAS
iv
LISTA DE SÍMBOLOS
v
LISTA DE ABREVIATURAS
vi
RESUMO
xiii
ABSTRACT
xiv
CAPÍTULO 1
1.1 Introdução
1.2 Objetivos
16
18
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
1.3 Revisão da Literatura
18
18
19
1.3.1 Histórico dos Polímeros 19
1.3.2 Consumo Mundial de Plásticos 19
1.3.3 Resíduos Sólidos e Impacto Ambiental 20
1.3.4 Classificação dos Plásticos 23
1.3.4.1 Termoplásticos 23
1.3.4.2 Termorrígidos (Termofixos) 24
1.3.4.3 Elastômeros (Borrachas) 24
1.3.5 Propriedades dos Plásticos 24
1.3.5.1 Aditivação de Polímeros 26
1.3.6 Produção de Polímeros 27
1.3.7 Tereftalato de Polietileno (PET) 29
1.3.7.1 Aditivação do PET 30
1.3.7.2 Obtenção da Garrafa PET 31
1.3.8 Utilização de Bactérias e Fungos na Degradação de Plásticos 33
1.3.8.1 Crescimento Microbiano e Alterações dos Polímeros Sintéticos 34
viii
1.3.8.2 Enzimas Envolvidas no Processo de Degradação 36
1.4 Referências Bibliográficas
37
CAPÍTULO 2
Formação de Biofilmes e Produção de Enzimas por Bacillus subtilis em
Superfícies de Tereftalato de Polietileno Simulando Degradação
43
2.1. Resumo 46
2.2 Abstract 46
2.3 Introdução
2.4 Material e Métodos
2.5 Resultados e Discussão
2.6 Conclusões
2.7 Referências Bibliográficas
46
47
51
55
56
CAPITULO 3
Tratamentos com UV e Temperatura em Tereftalato de Polietileno
Mediando Mudanças Poliméricas, Colonização e Detecção de Enzimas
por Phanerochaete chrysosporium
67
3.1 Resumo 68
3.2 Abstract 68
3.3 Introdução 68
3.4 Material e Métodos 70
3.5 Resultados e Discussão 72
3.6 Conclusões 76
3.7 Referências Bibliográficas 76
CONCLUSÕES GERAIS
86
ANEXOS
88
ix
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1 Composição Média das Resinas nos Resíduos Plásticos
Rígidos Separados em Programas de Coleta Seletiva
(CEMPRE, 1998) 21
Figura 2 Estrutura Química do Eteno (GOMES, 2006) 27
Figura 3 Estrutura Química da Borracha – Butadieno (GOMES, 2006) 28
Figura 4 Estrutura do Tereftalato de Polietileno – PET (GOMES, 2006) 30
Figura 5 Pré- formas (LIMA, 2001) 32
Figura 6 Garrafa PET de 2L (LIMA, 2001) 32
CAPITULO 2
Figura 1 Microscopia Eletrônica de Varredura-MEV apresentando os
biofilmes formados por Bacillus subtilis nas partículas de PET,
após 60 dias de incubação em tereftalato de polietileno-PET,
nas seguintes condições: A: e C - Controles (sem tratamento);
B: Tratamento com temperatura de 35ºC e D: Tratamento com
6 horas de irradiação da luz ultravioleta-UV
63
Figura 2 Toxicidade dos líquidos metabólicos livre de células após o
contato contínuo do Bacillus subtilis com tereftalato de
polietileno-PET, com e sem tratamento com luz ultravioleta e
temperatura, após 60 dias de incubação, usando como
bioindicador a Artemia salina
64
CAPITULO 3
Figura 1 Toxicidade dos líquidos metabólicos livre de células após o
contato contínuo do Phanerochaete chrysosporium com
tereftalato de polietileno-PET, com e sem tratamento, após 60
dias de incubação, usando como bioindicador a Artemia salina
83
x
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela 1 Crescimento bacteriano de Bacillus subtilis, formação de
biofilme, proteínas totais produzidas e pH, com 30 e 60 dias de
incubação com tereftalato de polietilleno-PET com tratamento
físico ou não 58
Tabela 2 Peso inicial das partículas do tereftalato polietileno-PET, com e
sem tratamento com luz ultravioleta e tempratura com biofilme e
após a remoção do biofilme, com 30 dias de incubação com o
Bacillus subtilis
59
Tabela 3 Peso inicial das partículas do tereftalato polietileno-PET, com e
sem tratamento luz ultravioleta e temperatura, com biofilme e
após a remoção do biofilme, com 60 dias de incubação com o
Bacillus subtilis
60
Tabela 4 Atividade enzimática detectada no líquido metabólico de Bacillus
subtilis com 30 e 60 dias de incubação com tereftalato de
polietileno-PET tratado ou não
61
Tabela 5 Biofilme formado por Bacillus subtilis em partículas de tereftalato
de polietileno-PET, com e sem tratamento com ultravioleta e
temperatura, após 60 dias de incubação
62
Tabela 6 CL
50
do teste de toxicidade com Artemia salina, com 30 dias de
incubação do Bacillus subtilis com tereftalato de polietileno-PET
com e sem tratamento com luz ultravioleta e temperatura
65
CAPITULO 3
Tabela 1 Crescimento fúngico de Phanerochaete chrysosporium,
formação de biofilme, proteínas totais produzidas e Ph, com 30 e
60 dias de incubação com tereftalato de polietilleno-PET com
tratamento com luz UV e temperatura 79
xi
Tabela 2 Peso inicial das partículas do tereftalato polietileno-PET, com e
sem tratamento luz UV e temperatura, com biofilme e após a
remoção do biofilme, com 30 dias de incubação com o
Phanerochaete chrysosporium
80
Tabela 3 Peso inicial das partículas do tereftalato polietileno-PET, com e
sem tratamento luz UV e temperatura, com biofilme e após a
remoção do biofilme, com 60 dias de incubação com o
Phanerochaete chrysosporium
81
Tabela 4 Atividade enzimática detectada no líquido metabólico de
Phanerochaete chrysosporium com 30 e 60 dias de incubação
com tereftalato de polietileno-PET tratado ou não com luz UV e
temperatura
82
Tabela 5 CL
50
do teste de toxicidade com Artemia salina, com 30 dias de
incubação do Phanerochaete chrysosporium com tereftalato de
polietileno-PET com e sem tratamento com luz UV e temperatura 84
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
PET Tereftalato de polietileno
PEAD’S Polietileno de Alta Densidade
PEBD’S Polietileno de Baixa Densidade
PVC Policloreto de Vinila
PR Resina fenólica
PMMA Poli (metilmetacrilato)
PS Poliestireno
LDPE Polietileno de baixa densidade
PU Poliuretano
ER Resina Epoxídica
POM Polioximetileno
HDPE Polietileno de alta densidade
PP Polipropileno
PC Policarbonato
ASTM American Society for Testing Materials
xiii
RESUMO
O Tereftalato de Polietileno – PET é um termoplástico polar,com elevada
estabilidade dimensional e temperatura de fusão, alta impermeabilidade a
gases e resistência química a ácidos e solventes, empregado na fabricação de
garrafas no Brasil. A biodegradação tem sido descrita como uma possível
metodologia para reduzir o acúmulo de plásticos. Neste trabalho foi avaliado o
desempenho das linhagens de Bacillus subtilis e Phanerochaete chrysosporium
isoladamente na biodegradação do tereftalato de polietileno. Neste sentido,
foram preparadas partículas do polímero sendo submetidas aos tratamentos
com luz ultra violeta (6 e 36 horas) e temperaturas (35ºC e 50ºC) em seguida,
foram colocadas nos meios caldo nutriente (B.subtilis) e Sabouraud (P.
chrysosporium), incubados por 30 e 60 dias, incubados a 35ºC e 28ºC,
respectivamente. Com a degradação das partículas observou-se que o pH
passou de 5 para >8, com formação de biofilmes e indução da produção de
enzimas (amilase, protease, esterase e polifenoloxidases). A formação do
biofilme foi evidenciada por microscopia eletrônica de varredura. Os produtos
metabólicos formados no meio de cultura foram avaliados pelo teste de
toxicidade utilizando Artemia salina. A microscopia eletrônica demonstrou que
B. subtilis colonizou completamente a superfície das partículas do PET, tanto
nas condições controle (sem tratamento), como tratados. Os melhores
resultados foram observados com o tratamento à temperatura de 50ºC, onde
ocorreu alteração na superfície do polímero, perda da massa polimérica,
permitindo maior colonização de ambos os microrganismos. As enzimas
hidrolíticas foram produzidas pelos microrganismos em todos os tratamentos,
em especial, à temperatura de 50ºC. Contudo, observou-se que B. subtilis não
produziu polifenoloxidases. Os subprodutos da degradação do PET nas
condições estudadas apresentaram alta toxicidade para Artemia salina no caso
do P. chrysosporium e baixa toxicidade para B. subtilis. Os resultados obtidos
sugerem o tratamento o prévio com a temperatura de 50ºC como importante
para o processo de biorremediação.
Palavras-Chave: Tereftalato de polietileno, Bacillus subtlis, Phanerochaete
chrysosporium, biodegradação, toxicidade.
xiv
ABSTRACT
In recent years, the consumption of the poly ethylene terephtalate plastic - PET
is used in the manufacture of bottles, comes increasing in Brazil. PET is a polar
thermoplastic, with raised dimensional stability and temperature of fusion, high
impermeability the acid gases and chemical resistance to solvents. The
biodegradation has been described as a possible methodology to reduce the
accumulation of plastics. In this work it was carried through the evaluation by
Bacillus subtilis and Phanerochaete chrysosporium performance on the
biodegradation of the polyethylene terephtalate. In this direction, particles of
polymer were submitted to the treatments: exposition to ultra violet light (6 and
36 hours) and temperatures (35ºC and 50ºC), followed incubation with the
microorganisms during 30 and 60 days. The polymer degradation process was
accompanied by determination of pH, biofilm formation and the cells viability,
enzymes detection (amylase, protease, esterase, and polyphenoloxidase), as
well as the scanning electron microscopy of biofilm and toxicity tests. The
results obtained observed the biofilm formation by Bacillus subtilis on
polyethylene terephtalate surface particles. The treatment using the
temperature of 50ºC demonstrated a higher alteration in the surface of the
polymer, supported the colonization of the microorganisms followed of the
hydrolytic enzymes production. It was observed that Bacillus subtilis does not
produced polyphenoloxidase. The results indicated the temperature (50º.C),
induces the esterase production and it is related to degradation process. The P.
chrysosporium produced esterases and polyphenoloxidase, whose enzymes
had demonstrated to be involved with the polyethylene terephtalate degradation
process, and were formed products with higher toxicities to Artemia salina.
Keywords: Polyethylene terephtalate, Bacillus subtlis, Phanerochaete
chrysosporium, biodegradation, toxicity.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados..... 15
CAPÍTULO 1
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
16
1.1 Introdução
Nos últimos anos, o homem vem descobrindo a necessidade da preservação do
ambiente em que vive, tendo em vista o aumento significativo do uso de polímeros
sintéticos desde o começo do século XX (NDON et al., 1992). De acordo com
estimativas, existem cerca de 100 milhões de toneladas por ano de polímeros sintéticos
produzidos no mundo, no entanto, praticamente metade de toda esta produção é
descartada rapidamente, permanecendo em depósitos de lixo e aterros sanitários por
décadas. Desta forma, os plásticos sintéticos vêm se acumulando na natureza com uma
taxa crescente de 25 milhões de toneladas/ano (AHN et al., 2001; REDIFF, 2006).
O tereftalato de polietileno (PET) foi introduzido no mercado brasileiro em 1988, e
é um dos polímeros mais utilizados na atualidade, principalmente na fabricação de
embalagens para refrigerantes (DUARTE, 2003). O manejo total dos resíduos plásticos
requer combinações complementares de biodegradação, incineração e reciclagem
(ALBERTSSON e HUANG, 1995). A biodegradação dos polímeros é um processo no
qual bactérias, fungos filamentosos e leveduras expressam suas enzimas para utilizar
parte da estrutura química, como fonte de carbono, modificando assim, a forma original
do polímero (ROSA e CHUI, 2002; CHANDRA e RUSTIG, 1998).
Portanto, a busca de microrganismos capazes de degradar compostos
xenobióticos é de grande interesse para os processos de biorremediação, principalmente
na remoção de plásticos (CHANDRA e RUSTGI, 1998). Os microrganismos como
Streptomyces virisosporus e Phanerochaete chrysosporium são conhecidos pelo
potencial enzimático na degradação da lignina (ROSA; PENTEADO; CALIL, 2000), e por
conseguinte, os microrganismos que degradam lignina apresentam habilidade para
degradar plásticos (LEE, 1991). Contudo, a biodegradabilidade do polímero depende de
várias propriedades físico-químicas, incluindo o aumento da massa molar e número de
ramificações nas cadeias, os quais dificultam o processo de biodegradação (KUSTER,
1979; KUMAR et al., 1983).
Os efeitos do ataque bacteriano aos plásticos, sob condições simuladas de
ambientes aquáticos, em geral pode ocorrer por hidrólise, por oxidação de cadeias ou
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados..... 17
grupo funcionais (LEONAS; GORDEN, 1996). A biodeterioração de um polímero sintético
pode ser considerada como um fenômeno de adesão do biofilme,
isto é, os microrganismos promovem uma colonização na superfície polimérica, na forma
de biofilme, podendo ocorrer uma mistura complexa de microrganismos, água e
substâncias poliméricas extracelulares (FLEMMING, 1998).
A biodegradação portanto, tem sido descrita como um processo fundamental para
reduzir o acúmulo dos polímeros contaminantes ambientais. Pesquisas intensas com este
objetivo vem sendo realizadas com a finalidade de degradar os plásticos sintéticos
(ALBERTSSON e HUANG, 1995). O presente trabalho teve como objetivo utilizar formas
alternativas para avaliar a biodegradação do tereftalato de polietileno por Bacillus subtilis
e Phanerochaete chrysosporium, na pespectiva de obter resultados com a redução do
tempo do processo de biodegradação.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
18
1.2 Objetivos
Objetivo Geral
Investigar a habilidade dos microrganismos Bacillus subtilis e Phanerochaete
chrysosporium de produzir biofilmes e enzimas em superficie de tereftalato de polietileno
submetido ou não a tratamentos fisicos, nos períodos de 30 e 60 dias de incubação e
avaliar o processo de degradação, através da avaliação da toxicidade com Artemia
salina.
Objetivos Específico:
Avaliar a influência da luz ultravioleta e da temperatura na perda de massa do
polímero com incubação de 30 e 60 dias;
Investigar a formação de biofilmes por B. subtilis e P. chrysosporium na superfície
do tereftalato de polietileno; submetidos ou não a tratamentos físicos;
Avaliar a modificação do pH, atividade fenoloxidase, esterase, amilase e protease
produzidas por B. subtilis e P. chrysosporium nos líquidos metabólicos;
Investigar a toxicidade dos produtos formados durante o processo de
biodegradação de tereftlato de polietileno com e sem tratamento por B.subtilis e P.
chrysosporium utilizando Artemia salina ;
Investigar através de microscopia eletrônica de varredura, a formação do biofilme
e possível degradação por B. subtilis e P. chrysosporium na superfície do tereftlato de
polietileno com e sem tratamento.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
19
1.3 Revisão da Literatura
1.3.1 Polímero Sintético
Staudinger (1920) considerou que a borracha natural e outros produtos de
síntese, de estrutura química até então desconhecida, eram na verdade materiais
constituídos de moléculas de cadeias longas, e não agregados coloidais de pequenas
moléculas. Contudo, somente em 1928 foi definitivamente reconhecido pelos cientistas
que os polímeros eram substâncias de elevado peso molecular (MANO; MENDES, 1999).
A palavra polímero,vem do grego e foi criada por Berzelius, em 1832, para
designar compostos de peso moleculares múltiplos. Os polímeros representam a imensa
contribuição da Química para o desenvolvimento industrial do século. Polímeros são
macromoléculas caracterizadas por seu tamanho, estrutura química e interações intra – e
intermoleculares, possuindo unidades químicas ligadas por covalência, repetidas
regularmente ao longo da cadeia. O número de unidades da cadeia polimérica é
denominada grau de polimerização, sendo geralmente simbolizado por n ou DP. Os
primeiros materiais plásticos empregados na indústria foram obtidos de produtos naturais,
por modificação química, como o nitrato de celulose, proveniente da celulose do algodão,
a galalite originária da caseína do leite e a ebonite, da borracha natural (MANO;
MENDES, 1999).
A baquelita, uma resina fenólica (PR) foi um dos primeiros plásticos sintéticos
comercializados sob forma de artefatos, em 1910, e mais tarde, na década de 30, o
policloreto de venila (PVC), o polimetacrilato de metila (PMMA) e o poliestireno (PS). Na
década de 40 surgiram o polietileno de baixa densidade (LDPE), o poliuretano (PU) e a
resina epoxídica (ER). Na década de 50 foram introduzidos o polioximetileno (POM), o
polietileno de alta densidade (HDPE), o polipropileno (PP) e o policarbonato (PC) (MANO;
MENDES, 1999).
1.3.2 Consumo Mundial de Plásticos
A indústria de plásticos vem movendo-se ao redor do mundo buscando
oportunidades nos mercados emergentes de alto crescimento. O setor é dominado por
um grande número de companhias multinacionais que atuam em várias etapas da cadeia
produtiva. Embora seja uma indústria global, a base de produção de muitos materiais
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
20
plásticos, migrou para paises como Arábia Saudita, China e Coréia do Sul. Os produtores
dos mercados mais desenvolvidos – Estados Unidos, Europa Ocidental e Japão –
respoderam a esse movimento concentrando suas linhas em itens de maior valor
agregado e racionalizando a capacidade de produção, a fim de elevar a rentabilidade. As
três regiões respondem por 90% do consumo mundial de materiais plásticas (PLÁSTICO,
2007).
O mercado de plásticos em geral tende a crescer. Nos últimos anos, diversos
materiais tradicionais, como vidro, matais e fibras naturais, vêm sendo crescentemente
substituídos por produtos de origem plástica, com menores custos de obtenção e
produção, maior flexibilidade, diversidade e assepsia, e possibilidade de reciclagem. Ásia
e América do Sul são as áreas de maior potencial de expansão tanto no curto quanto no
longo prazo. O consumo mundial de matérias plásticas foi de aproximadamente 114
milhões de toneladas em 1999. Desse total, Europa Ocidental e Estados Unidos
representavam 27% cada. Em seguida aparecem China (13%), Japão (9%) e Coréia do
Sul (3%). O Brasil ocupou a sexta posição, com 3,2% do mercado consumidor mundial
(PLÁSTICOS, 2007).
1.3.3 Resíduos sólidos e Impacto Ambiental
Esta parte aborda questões relacionados aos resíduos sólidos, com enfoque para
os plásticos, bem como o seu aumento no lixo doméstico nos últimos anos. A
composição de resíduos sólidos urbanos em algumas cidades do Brasil, em programas
de coleta seletiva é mostrado na figura 1. Os tipos de plásticos mais encontrados no lixo
urbano são: Polietileno de alta densidade, polietileno de baixa densidade, tereftalato de
polietileno, policloreto de vinila, polipropileno e poliestireno (CEMPRE, 2006).
Estima-se que seriam necessários de 100 a 150 anos para que os polímeros
sejam degradados na natureza. ( ADELINA et al.,2005).
O PET, oriundo das embalagens de refrigerante, possui um dos maiores
percentuais entre os plásticos encontrados em programas de coleta seletiva, 21%,
ficando somente atrás dos polietilenos (PEAD e PEBD), 37%. Esta é uma indicação de
nível de consumo deste material, demandando atenção para a importância de novos
estudos com foco ambiental, que sejam dirigidos não só para o destino destes resíduos,
mas também para a sua geração no processo produtivo.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
21
Figura 1 : Composição média das resinas nos resíduos plásticos rígidos separados em
programas de coleta seletiva, fonte: CEMPRE (2006)
O plástico é um material proveniente de resinas geralmente sintéticas e derivadas
do petróleo. Sob o ponto de vista ambiental, o uso do plástico é considerado problemático
pela sua alta durabilidade e grande volume na composição total do lixo (OSE – COC,
2006). A demanda mundial de polímeros sintéticos é de cerca de 2,2 milhões de
toneladas por ano, com previsão de dobrar nos próximos anos. O consumo de plásticos
praticamente dobrou no Brasil onde no período de 1991 a 1998 foram produzidos 175 mil
toneladas de plástico PET em 1998.
Os polímeros sintéticos persistentes no meio ambiente, não devem ser
comumente incinerados em lixões municipais por gerarem os gases tóxicos e
potencialmente indutor de chuvas ácidas (HUANG E EDELMAN et al., 1995;
FRANCHETTI e MARCONATO, 2001). Além de garrafas PET e sacos de lixo
depositados no litoral, o
ecossistema marinho permanece carregado de microfibras e
fragmentos de plásticos, resultantes da degradação de objetos maiores ao longo de
décadas. Os sedimentos de várias praias na região de Plymouth, na Grã-Bretanha,
apresentam fragmentos de plásticos incluindo acrílico, náilon, poliéster, polietileno,
polipropileno, entre outros polímeros industriais. Pesquisadores coletaram animais entre
as ilhas britânicas e a Islândia e avaliaram que os resíduos plásticos não estavam apenas
em meio à água , mas também observaram dentro dos animais aquáticos (AMBIENTE
BRASIL/ ESTADÃO ON LINE, 2006).
Fomos acostumados a associar a palavra lixo à sujeira, imundice e restos.
Derivada do latim lix (cinza), o lixo tecnicamente é conhecido como “Resíduo Sólido
Urbano” (RSU) (ZANIN et al. 2004). Se até o começo da Revolução Industrial o lixo era
composto basicamente de restos e sobras de alimentos, a partir dessa era passou a ser
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
22
identificado, também, por todo e qualquer material descartado e rejeitado pela sociedade.
O desenvolvimento para o conforto e o bem-estar humano produzido a partir da
Revolução Industrial levou ao uso intenso de material descartado, ocasionando um
aumento da quantidade de resíduos gerados e não utilizados pelo homem, muitos deles
provocando a contaminação do meio ambiente e trazendo riscos à saúde humana,
basicamente nas áreas urbanas.
O crescimento das áreas urbanas não levou em consideração a necessidade de
adequação de locais específicos para depósito e tratamento dos resíduos sólidos. No
Brasil de hoje, por exemplo, estima-se que a produção anual de lixo esteja em torno de
44 milhões de toneladas (CEMPRE, 2006), sendo que a maior parte dos resíduos
recolhidos nos centros urbanos é simplesmente jogada sem qualquer cuidado em
depósitos existentes nas periferias das cidades (AMBIENTARE BRASIL, 2006).
Existem várias opções de tecnologias para a o resíduo sólido urbano (aterros
sanitários, reciclagem/ compostagem, incineração e biodegradação), destacam-se a
importância das unidades de reciclagem e compostagem, que são alternativas
importantes todas as vezes que se verificarem a existência de mercados para absorção
de materiais recicláveis produzidos (FORLIN et al., 2002).
A falta de novas áreas para implantação de aterros sanitários (ou “lixões”, ou
aterros controlados) é um fator que tem contribuído para a implementação de outras
técnicas como as citadas acima. Estudos apontam que as técnicas utilizadas pela
compostagem são capazes de reduzir à metade a massa dos resíduos processados e,
num prazo de 60 e 90 dias, levar à obtenção de um composto para utilização na
agricultura sem causar danos ao meio ambiente (FORLIN et al., 2002).
Estima-se que técnicas como a reciclagem pode fazer com que 44 milhões de
toneladas anuais estimadas de lixo economizem pelo menos 30% da energia gerada na
Hidrelétrica Binacional de Itaipu (MANCINE et al., 1998). Existem ainda, algumas rotas
para aproveitamento energético dos resíduos sólidos, a utilização do seu poder calorífico
por meio da queima direta ou da gaseificação ou aproveitamento calorífico do biogás; ou
a produção de um combustível sólido a partir dos restos alimentares, para ser queimada
em caldeiras ou mover turbinas a vapor, ou ainda, um combustor externo, sendo possível
o aproveitamento em ciclos combinados (FORLIN et al., 2002).
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
23
De outro lado, a biodegradação, tem sido descrita como um processo
fundamental para reduzir o acúmulo dos polímeros contaminantes ambientais. Pesquisas
intensas com este objetivo vem sendo realizadas com a finalidade de degradar os
plásticos sintéticos (ALBERTSSON e HUANG, 1995). Contudo, os polímeros têm sido
considerados os grandes vilões ambientais, pois podem demorar séculos para se
degradar, conseqüentemente, grandes partes dos aterros sanitários, são interferidos de
forma negativa nos processos de compostagem e de estabilização biológica. Além disso,
os resíduos poliméricos quando descartados em lugares inadequados, como lixões, rios,
encostas, etc., causam um impacto ainda maior ao meio ambiente (SIPNACÉ e PAOLI et
al., 2005).
1.3.4 Classificação dos Plásticos
Há diversas maneiras de se classificar os polímeros. De uma maneira geral os
polímeros podem ser divididos em termoplásticos, termorrígidos (termofixos e
elastômeros (borrachas) (CANEVAROLO, 2002).
1.3.4.1 Termoplásticos
Os chamados plásticos constituem a maior parte dos polímeros comerciais. A
principal característica desses polímeros é poder ser fundido diversas vezes.
Dependendo do tipo do plástico, também podem dissolver-se em vários solventes sendo
possível sua reciclagem, uma característica bastante desejável nos dias de hoje (MANO,
1985).
As propriedades mecânicas variam conforme o tipo de plástico e sob temperatura
ambiente, podem ser maleáveis, rígidos ou mesmo frágeis. Exemplo deste tipo de
material é: polietileno (PE), polipropileno (PP), poli (tereftalato de etileno) (PET),
policarbonato (PC), poliestireno (PS), poli (cloreto de vinila) (PVC), poli (metilmetacrilato)
(PMMA) (ANON, 1997).
1.3.4.2 Termorrígidos (Termofixos)
Os plásticos rígidos e frágeis são estáveis a variações de temperatura, contudo
uma vez preparados não se fundem novamente. O aquecimento deste tipo de polímero
promove decomposição do material antes de sua fusão, ou seja, não há a fusão do
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
24
polímero. Assim sua reciclagem é complicada. A estrutura molecular dos termorrígidos é
constituída de monômeros formando uma rede ou ligação cruzada. As cadeias estão
presas entre si por meio de numerosas ligações e se movimentam com alguma liberdade
como no caso dos termoplásticos (CANEVAROLO, 2002).
Entre os termorrígidos a baquelita é um exemplo, usado em tomadas e no
embutimento de amostras metalográficas, poliéster usado em caixas d’água, piscinas,
etc., na forma de plástico reforçado (fiberglass) (CANEVAROLO, 2002).
1.3.4.3 Elastômeros (Borrachas)
Classe intermediária entre os termoplásticos e os termorrígidos, os elastômeros
são infusíveis, mas apresentam alta elasticidade, não sendo rígidos como os termofixos.
Sua reciclagem é complicada pela incapacidade de fusão, de forma análoga aos
termorrígidos (CANEVAROLO, 2002).
Os elastômeros possuem uma estrutura molecular similar ao do termorrígido,
mas, neste caso, há menor número de ligações cruzadas, ou seja, é como se fosse uma
rede, mas com malhas bem mais largas que os termorrígidos. Exemplos deste tipo de
material são pneus, vedações e mangueiras de borracha (CANEVAROLO, 2002).
1.3.5 Propriedades dos Plásticos
As propriedades dos polímeros dependem de diversos fatores, como natureza
química, estrutura, massa molar, polidispersão, etc. O processo de polimerização conduz
à formação de cadeias poliméricas de diferentes tamanhos, e conseqüentemente de
massa molares diferentes. Os polímeros possuem propriedades físicas e químicas muito
distintas das que tem os corpos formados por moléculas simples. Assim, por exemplo,
são muito resistentes à ruptura e ao desgaste, muito elásticos e resistentes à ação dos
agentes atmosféricos. Estas propriedades, juntamente com a sua fácil obtenção a baixas
temperaturas, têm possibilitado a sua fabricação em grande escala.
Os polímeros de estrutura unidimensional têm elevada massa molar, e
geralmente, são rígidos à temperatura ambiente, embora se tornem moles e flexíveis ao
elevar a temperatura. Dependendo da natureza química dos monômeros e da técnica
empregada para a polimerização, os polímeros podem exibir diferentes tipos de
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
25
estruturas e, com isso, diferentes propriedades físicas o que, no final, irá determinar a
sua aplicabilidade (STRONG, 1999).
Conforme o tipo de polímero e aditivos usados na sua formulação pode-se obter
material com flexibilidade bastante variável. Alta resistência ao impacto e a transparência,
permite substituição do vidro em varias aplicações, como por exemplo, lentes de óculos
(em acrílico ou policarbonato), faróis de automóveis (policarbonato), janelas de trens
(policarbonato) etc. No caso do policarbonato a resistência à abrasão e a solventes não é
tão boa quanto a do vidro. As lentes de acrílico riscam facilmente e são facilmente
danificadas se entrarem em contato com solventes como, por exemplo, acetona.
A
conformação de peças utilizando materiais poliméricos requer, de uma maneira geral,
aquecimento entre temperatura ambiente (T
amb
) e 250ºC, o que pode ser considerada
relativamente baixa. Disso decorre baixo consumo de energia para a conformação deste
material, quando comparado com os metais, por exemplo, além de exigir equipamentos
mais simples e não tão caros quanto o processamento de metais ou cerâmica. No
entanto, alguns plásticos especiais requerem até 400ºC, para serem processados
(ANON, 1997).
Polímeros são altamente indicados para aplicações onde se requer isolamento
elétrico, pois este material não contém elétrons livres, responsáveis pela condução de
eletricidade nos metais. A adição de cargas especiais condutoras (limalha de ferro) pode
tornar polímeros fracamente condutores, evitando acúmulo de eletricidade estática, que é
perigoso em certas aplicações em polímeros condutores (ANON, 1997).
A condutividade térmica dos polímeros é cerca de mil vezes menor que a dos
metais. Logo, são altamente recomendados em aplicações que requeiram isolamento
térmico, particularmente na forma de espumas. A ausência de elétrons livres dificulta a
condução de calor nos polímeros (MICHAELI et al., 1995). As ligações químicas
presentes nos polímeros (de uma maneira geral covalentes/Van der Walls) conferem
maior resistência à corrosão por oxigênio ou produtos químicos do que no caso dos
metais (ligação metálica). Contudo, não quer dizer que os polímeros sejam
completamente invulneráveis à baixa resistência química, como no ataque químico da
terebentina ao policarbonato formando no CD.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
26
De maneira geral, os polímeros são atacados por solventes orgânicos que
apresentam estrutura similar a eles, ou seja; similares diluem similares (MANO,1985).
Quanto à porosidade e o espaço entre as macromoléculas do polímero é relativamente
grande. Isso confere baixa densidade ao polímero, o que é uma vantagem em certos
aspectos, no entanto, esse largo espaçamento entre moléculas faz com que a difusão de
gases seja alta. Em outras palavras, esses materiais apresentam alta permeabilidade a
gases, que varia conforme o tipo de plástico (MICHAELI, 1995).
A principal conseqüência deste fato é a limitação dos plásticos como material de
embalagem, que fica patente no prazo de validade mais curto de bebidas acondicionadas
em garrafas de PET. Alguns polímeros, como termorrígidos e borrachas, não podem ser
reciclados de forma direta: não há como refundi-los com o fornecimento de baixa
quantidade de energia. A reciclagem de polímeros termoplásticos, como é o caso do
PET, apesar de tecnicamente possível, muitas vezes não é economicamente viável
devido ao seu baixo preço e baixa densidade (FORLIN e FARIA et al., 2002).
1.3.5.1 Aditivação de polímeros
Uso de fibras (vidro, carbono, boro) ou algumas cargas minerais (talco, mica,
caolim, wolastonita) aumentaram a resistência mecânica. As cargas fibrosas podem
assumir forma de fibras curtas ou longas. Cargas inorgânicas minerais inertes (ex:
CaCO
3
) permitem reduzir custo da peça sem afetar propriedades. Exemplos: piso de vinil/
cadeiras de jardim (PP), que contém até 60% de cargas.
Negro de fumo em pneus (borracha) e filmes para agricultura (PE) aumentaram
resistência mecânica e a resistência ao ataque por ozônio e raios ultravioletas (UV)
(ANON, 1997). Aditivos conhecidos como plastificantes podem alterar completamente as
características de plásticos como o PVC e borrachas, tornando-os mais flexíveis e
tenazes (STRONG, 1999).
Já existe fabricação de espumas que é feita por meio de adição de agentes
expansores, que se transformam em gás no momento da polimerização, quando ele se
encontra no estado fundido (ANON, 1997).
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
27
1.3.6 Produção de polímeros
A matéria-prima que dá origem ao polímero chama-se monômeros. No caso do
polietileno (PE) é o etileno (ou eteno), conforme já citado anteriormente, que é obtido a
partir do petróleo ou gás natural, pois é a rota mais barata. É possível obter monômeros
da madeira, álcool, carvão e até C0
2
, pois todas essas matérias-primas são ricas em
carbono, o átomo principal que constitui os materiais poliméricos. Todas essas rotas,
contudo, aumentam o preço do monômero obtido, tornando-se não competitivo (ANON,
1997).
Polímeros são materiais compostos por macromoléculas. Essas macromoléculas
são cadeias compostas pela repetição de uma unidade básica, chamado mero. Daí o
nome: poli (muitos) + mero. Os meros estão dispostos um após o outro (MICHAELI,
1995).
Logo, pode-se fazer uma analogia: as moléculas de um polímero estão dispostas
de uma maneira muito semelhante a um novelo de lã. É difícil extrair um fio de um novelo
de lã. Também é difícil remover uma molécula de uma porção de plástico, pois as
cadeias “seguram-se” entre si. O polietileno (ou, abreviadamente, PE) – polímero
extremamente comum usado, por exemplo, em saquinhos de leite – é composto pela
repetição de milhares de unidades da molécula básica o etileno, conforme ilustra a figura
2.
n
Figura 2: Estrutura química do eteno (GOMES, 2006)
De uma maneira geral o número de unidade de repetição (n) é superior a 10.000
ou seja, uma molécula de polietileno é constituída da repetição de 10.000 ou mais
unidades de etileno. O parâmetro não é definido como sendo o grau de polimerização do
polímero, ou seja, o número de meros que constitui a macromolécula (MANO, 1985).
Alguns polímeros podem ser constituídos da repetição de dois ou mais unidades.
Neste caso, eles são chamados copolímeros. Por exemplo, a macromolécula da borracha
ou copolímero de butadieno-estireno (SBR) é formada pela repetição de dois meros:
estireno e butadieno (CANEVAROLO, 2002), conforme ilustra a figura 3.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
28
n
Figura 3: Estrutura química da borracha-butadieno (GOMES, 2006)
O polietileno é o plástico mais conhecido e utilizado no Brasil que está presente
nas sacolas de embalagem utilizadas no comércio. Contudo, alterando as condições em
que ocorre a polimerização, as indústrias conseguem variar bastante a aparência e as
propriedades físicas de um plástico, podendo gerar os PET (tereftalato de polietileno)
como mostra na figura 3, os PEAD’s e os PEBD’s, se diferenciam entre si pelo tamanho
das cadeias e arranjos moleculares (LIMA, 2001).
O polipropileno é um plástico sintético usado, geralmente, para fabricar os pára-
choques plásticos dos automóveis, que exigem uma alta resistência ao calor, ideal para
ser empregado em objetos que requerem esterilização pelo aquecimento, como
mamadeiras e cabos de instrumentos cirúrgicos (LIMA, 2001).
O policloreto de venila (PVC) é considerado o plástico mais fabricado e
consumido no mundo contemporâneo. Apresenta uma estrutura bastante rígida, porém,
com a propriedade de flexibilidade através do uso de plastificantes, os quais são
responsáveis pela redução da força atrativa entre as moléculas do polímero. O polímero
pode ser degradado por microrganismos, sendo adicionado biocida, que impedi a
proliferação de microrganismos e o ressecamento do material (LIMA, 2001).
O poliestireno é usado para manufatura de seringas e copos plásticos, contudo
quando fabricado de modo a conter bolhas de ar em seu interior, recebe o nome de
isopor (LIMA, 2001). Os plásticos raion, náilon e poliéster apresentam um impacto
econômico e até mesmo cultural, podendo ser usados para confecção das fibras têxteis
sintéticas. No entanto, estes polímeros sintéticos não são degradados facilmente, depois
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
29
de completado os seus ciclos de vida úteis, são colocados em aterros e lixões a céu
aberto, contribuindo para a poluição ambiental e todos os problemas decorrente dela
(LIMA, 2001).
1.3.7 Tereftalato de Polietileno (PET)
O tereftalato de polietileno é um termoplástico da família do poliéster que teve sua
origem nas primeiras décadas do século passado na Universidade de Harvard. O Dr.
Wallace H. Carothers foi um dos principais investigadores que dando continuidade ao
trabalho do professor Staudinger, desenvolveu os principios da policondensação de
polímeros de cadeia longa (KAPLAN, 1998). Em 1928, a equipe após várias experiências
chegou à obtenção do poliéster, procurando explorar o potencial de produção de fibras.
Em 1941, Whinfield e Dickson, investigaradores da “Calico Printers Association”,
produziram e patentearam uma fibra de poliéster, a qual foi dado o nome de Terileno.
Desde então as investigações sobre o poliéster se intensificaram pelo mundo dando
origem a uma das principais matérias-primas termoplásticas para fabricação de fibras,
filmes e embalagens (MANO, 1985).
As primeiras embalagens de refrigerantes PET foram fabricadas em 1977 nos
Estados Unidos da América e desde então o seu uso tem sido intensificado ano a ano.
Os passos da polimerização dos poliésteres são independentes e não necessitam de
radicais ou íons transmissores de cadeia, na verdade resultam de uma reação gradual,
com a intervenção de dois monômeros contendo cada um deles mais de um grupo
funcional idêntico. Ao reagir, possibilita a formação de longas cadeias macromoleculares,
de elevada massa molar. Em cada ligação estabelecida ocorre a liberação de uma
molécula de água ou metano, sendo o processo designado de condensação. Quando os
monômeros são ácidos carboxílicos e álcool, ambos com mais de um grupo funcional, a
molécula resultante da reação apresenta, além da ligação éster, um grupo terminal
carboxílico e um grupo terminal hidroxila, que permite a repetição das ligações, gerando
uma macromolécula com muitas ligações éster (GOMES, 2006).
Na produção do PET utiliza-se como matérias-primas o ácido tereftálico e o
etilenoglicol, que reúnem as características ideais para uma reação gradual de poli-
condensação produzindo o tereftalato de polietileno (figura 4). As macromoléculas de
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
30
PET são constituídas de repetições da molécula mais simples do tereftalato de etileno
(CANEVAROLO, 2002)
Figura 4: Estrutura do Tereftalato de Polietileno – PET (GOMES, 2006)
1.3.7.1 Aditivação do PET
O PET normalmente não necessita de adições de plastificantes ou outros aditivos
para seu processamento. Mesmo nos casos em que ocorre o uso de aditivos, a
formulação é feita pelo próprio produtor da resina e não pelo transformador, que já
compra o produto pronto. Contudo, há diversas versões com propriedades especiais que
podem conter outros agentes de reforço. Normalmente nas resinas de PET são usados
como agente de reforço, fibras de aramida, esferas de vidro, carbonato de cálcio (por ex.,
em fitas magnéticas de PET, pois melhora o coeficiente de fricção da fita), asbestos e
wollastonita (CANEVAROLO, 2002).
Os graus com agentes de reforço (fibras de vidro e carbono, mica) normalmente
são direcionados para peças moldadas por injeção de alto desempenho. Note-se que
estas cargas afetam negativamente a transparência do plástico. Componentes de PET
para uso externo devem conter aditivos anti-raios ultravioleta. Por exemplo, absorvedores
de ultravioleta do tipo benzotriazona, pois afetam muito pouco a cor do plástico, que
passa a ter grande estabilidade. A versão de alto grau de cristalinidade (CPET) contém
aditivos para promover a formação de cristalitos na resina (iniciadores, agentes
nucleantes) (CANEVAROLO, 2002).
O PET também pode ser usado na forma expandida, requerendo neste caso a
adição de agentes de expansão. Obviamente, corantes são utilizados para colorir as
resinas. No caso de filmes, podem ser usados aditivos para controlar a rugosidade
superficial e, conseqüentemente, o coeficiente de atrito da superfície do filme. Outros
aditivos podem ser usados para controlar o grau de transparência e de reflexão
superficial. As principais propriedades do PET são boas resistências mecânicas, térmicas
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
31
e químicas, além de boas propriedades de barreira a absorção de oxigênio é de 10 a 20
vezes menor que nos plásticos “commodities” fácil reciclabilidade (CANEVAROLO, 2002).
Em seu trabalho Spinacé (2000), conclui que apesar da fácil reciclabilidade,
ocorre perda das propriedades mecânicas após sucessivas reciclagens, fato que se
acentua após o terceiro ciclo.
1.3.7.2 Obtenção da garrafa PET
Moldagem por injeção: Nesta etapa o objetivo é obter mudanças físicas no PET. A
matéria-prima seca, situada no sítio de secagem sobre a injetora, entrará por tubulações
flexíveis pela entrada na injetora para sofrer o processo de plastificação. O processo de
plastificação é assim denominado, pois o PET em estado sólido e a temperatura de
aproximadamente de 150ºC (temperatura proveniente da secagem), passará para um
estado pastoso (atingindo a temperatura de 300ºC). Isto ocorre em uma parte da injetora
denominado extrusor (LIMA, 2001).
O PET entra pela garganta e é aquecido por resistência e numa rosca é cisalhado,
até atingir o estado pastoso. O PET pastoso e compactado é transferido para um outro
canhão, denominado canhão injetor, onde este também contém resistências para manter
a temperatura e/ ou homogeneizar a mesma. O canhão injetor transfere o PET para o
molde (LIMA, 2001).
No molde será dada a forma e realizada uma primeira resfriada nas pré-formas,
onde elas atingem uma temperatura aproximada de 90ºC. As pré-formas são retiradas do
molde por um equipamento robô, onde as pré-formas serão resfriadas para o
armazenamento (LIMA, 2001).
Após o resfriamento são descarregadas sobre uma esteira transportadora que as
direciona para uma caixa de papelão à frente da injetora, onde são armazenadas para
serem distribuídas para os clientes. A figura 5 ilustra uma pré-forma.
Estas pré-formas são semelhantes a um tubo de ensaio, com a aba suporte e
rosca já estabelecidas. Pode ser nas cores cristal, verde, etc. Dependendo da coloração
a ser solicitada pelo mercado (LIMA, 2001).Uma quantidade da produção já sai da
empresa na forma de pré-forma, e poderá ser transportada para fábrica que irá
desenvolver as próximas etapas. A parte final, moldagem por sopro, pode ser realizada
na mesma fábrica, em outra especializada ou na fábrica de refrigerantes localizadas em
alguns estados.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
32
Figura 5: Pré- formas da garrafa PET(LIMA, 2001)
Moldagem por sopro: Esta etapa é normalmente realizada nas empresas de refrigerantes.
O processo consiste no aquecimento da pré-forma e inserida no molde com formato da
garrafa, a pré-forma é submetida a um estiramento, sofrendo orientação axial e ao
mesmo tempo é insuflado ar comprimido, expandindo a pré-forma contra a parede do
molde, proporcionando orientação radial, ao mesmo tempo em que a garrafa recém-
formada é resfriada pela parede do molde. Em seguida a garrafa é retirada do molde. Um
exemplo da garrafa é ilustrado na figura 6.
Figura 6: Garrafa PET de 2L. Forma industrializada (LIMA, 2001)
1.3.8 Utilização de bactérias e fungos na degradação de plásticos
As bactérias e fungos são capazes de degradar a madeira, em ecossistemas
terrestres naturais, porém sem dúvida alguma, fungos superiores, especialmente os da
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
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classe Basidiomycetes, são os mais eficientes degradadores (BLANCHETE, 1991 e
ERIKSSON, 1990). As bactérias do gênero Bacillus, que possuem forma de bastonetes,
sendo em geral patogênicas para os seres humanos e demais mamíferos, como é o caso
do Bacillus anthracis, causador do antraz. O Bacillus cereus causa gastroenterites e
outras infecções. Todos os Bacillus produzem endósporos (esporos internos à bactéria).
Muitos produzem toxinas. Classificação científica do Bacillus : Reino Bactéria, Filo
Firmicutes, Classe Bacilli, Ordem Bacillales, Família Bacillaceae, Gênero Bacillus e
espécie subtilis (SONENSHEIN, 1993).
O gênero Bacillus foi descrito desde o século XIX, com base na sua habilidade
de motilidade e esporulação, evidenciando a morfologia e presença de flagelos que o
diferenciava do gênero Clostridium ( FORSYTH et al., 1998). Segundo Sneath (1986), os
Bacillus são descritos como aeróbios que degradam gelatina e formam colônia do tipo
rizóide, e sua distinção do outro gênero da família Bacillaceae – Clostridium – está na
utilização do oxig~eno e na forma de seus esporos.
As espécies de Bacillus são consideradas bem distribuídas no solo, na água e no
ar e seu estudo taxonômico evolui bastante nos últimos anos com o desenvolvimento das
técnicas moleculares (RNA 16S), mas sua identificação e classificação ainda são
dificultadas, pois consomem muito tempo e são consideradas laboriosas (DICKINSON et
al., 2004), o que faz necessário o emprego de métodos de combinação tradicionais,
quimiotaxonomicas, moleculares e genéticas para se obter um completo e definido perfil
da família Bacillaceae ( FORSYTH et al. 1998).
Os fungos basidiomicetos são geralmente classificados com base nas diferenças
dos respectivos padrões de degradação da madeira que apresentam, levando-se em
consideração características macroscópicas da degradação. Assim, podem ser divididas
em fungos de degradação clara (ou branca) (White-rot), degradação marrom (Brown-rot)
e degradação macia (soft-rot) (BLANCHETE, 1991 e HATAKA, 1994).
Os fungos basidiomicetos são incluídos taxonomicamente no filo Basidiomycota
do Reino Fungi. Morfologicamente são caracterizados como fungos que produzem
esporos de origem sexuada em estruturas especializadas chamadas basídios, onde
ocorre a cariogamia e a meiose. Apresentam micélio dicariótico durante a maior parte do
ciclo de vida e hifas septadas que podem formar ansas, que são alças de conexão que
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
34
auxiliam na manutenção da dicariótica típica do grupo. Embora, nem todo basidiomiceto
possua ansa, toda hifa com estrutura complexa, perfurado no centro e com a parede
espessada envolta do poro, que por sua vez pode ser recoberto com uma membrana
vinda do retículo endoplasmático (ALEXOPOULOS, 1996).
A degradação da lignina por fungos de decomposição branca é mais rápida do
que a causada por outros microrganismos, sendo estes os responsáveis pela maioria da
decomposição da lignina na natureza. O crescimento destes fungos diminui em
condições limitadas de nitrogênio e carbono, e a atividade de enzimas lignolíticas
aparece como forma de metabolismo secundário (KIRK e FARRELL, 1987; TUOMELA, et
al., 2000). Para o fungo Phanerochaete chrysosporium, assim como outros de
decomposição branca, o processo de degradação é maior quando há ausência de
nitrogênio, enxofre e carboidratos no substrato (ALEXOPOULOS, 1996).
Na degradação da lignina, algumas enzimas fenol-oxidases extracelulares são
produzidas, incluindo a lacase, a lignina peroxidase e manganês peroxidase. O processo
completo de deterioração da lignina pode ocorrer parcialmente por reações não
enzimáticas (ALEXOPOULOS, 1996; BLANCHETTE, 1991; ERIKSSON et al., 1990). A
lignina contém uma variedade de ligações que estão comumente presentes em poluentes
aromáticos. O sistema degradativo dos fungos de decomposição branca é inespecífico e
oxidativo (BUMPUS ; AUST, 1987 ; HAMMEL, 1989).
1.3.8.1 Crescimento microbiano e alterações dos polímeros sintéticos
Entre os polímeros sintéticos, o poliuretano (PU) foi considerado biodegradável
nas primeiras pesquisas realizadas em 1966 (EL-SAYED et al., 1996). Os poliéster-
uretanos são mais suscetíveis à degradação fúngica em comparação aos poliésteres-
uretanos (HOWARD et al., 1998; AKUTSU et al., 1998; NAKAJIMA-KAMBE et al., 1997,
SANTERRE et al., 1993). Foi verificada em 1981, que, adicionando-se suplementos de
nitrogênio, a biodegradação do poliéster PU por fungos filamentosos e pela levedura
Cryptococcus laurentii, aumentava (EL-SAYED et al., 1996).
Em 1985, foi demonstrada a função das enzimas extracelulares na biodegradação
do poliuretano (EL-SAYED et al., 1996). Geralmente os polímeros sintéticos e naturais
podem ser atacados bioquimicamente por microrganismos através da produção de
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
35
enzimas hidrolíticas que catalisam a hidrólise das ligações éster, éter ou amida, como é o
caso das esterases (SCHNABEL, 1981).
Desde então, um número crescente de fungos com capacidade de degradar
poliéster PU tem sido isolados, e foi sugerido que o ataque enzimático do PU envolve a
ação de enzimas hidrolíticas como ureases, proteases e esterases (HOWARD et al.,
1998; AKUTSU et al., 1998; NAKAJIMA-KAMBE et al., 1997 e SANTERRE et al., 1993),
como ocorrido em 1994, onde foram isolados quatro espécies de fungos, Curvularia
sengalensis, Fusarium solani, Aureobasidium pullulans e Cladosporium sp, sendo
caracterizada suas capacidades em degradar ésteres de PU. Observou-se que C.
sengalises secretou uma enzima extracelular com as mesmas propriedades das
esterases (HOWARD et al., 1998).
O fungo Phanerochaete chrysosporium apresentou crescimento intenso, de difícil
remoção, em filmes de polietileno, sendo sua degradação evidente quando comparados
aos controles. As condições de cultivo foram aquelas adequadas a degradação de
lignina. Foram verificadas também, que microrganismos ligninoliticos foram capazes de
degradar componentes oxidados de tereftalato de polietileno, observando-se reduções de
massa molecular deste polímero (LEE et al., 1991).
Filmes de policloreto de vinila (PVC) apresentaram-se opacos e menos flexíveis
quando incubados com os fungos basidiomicetos P. Chrysosporium, Peniophora cinerea
e Trogia buccinalis, e análise em espectro de UV revelaram mudanças significativas,
indicando a presença de ácidos carboxílicos e de polienos proveniente das quebras
oxidativas da cadeia macromolecular, através de processos enzimáticos (FRANCHETTI
et al., 1998).
Os efeitos esperados quanto ao crescimento microbiano em polímeros sintéticos
são: ataque da superfície do polímero, descoloração e perda de transparência. A
remoção dos plastificantes, modificadores e lubrificantes resulta no aumento da firmeza
(menor flexibilidade), mudanças no peso, dimensões e outras propriedades físicas, assim
como, em deterioração das propriedades elétricas, tais como, resistência, constante e
força dielétrica e fator de potência (ASTM -G-21).
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
36
Freqüentemente, as mudanças nas propriedades elétricas ocorrem devidas,
principalmente, ao crescimento microbiano na superfície e está associada à umidade e a
mudanças no pH provocadas pela excreção de metabólitos. A não uniformidade de
plastificantes, lubrificantes ou de outros aditivos de processamento na superfície
polimérica também influencia no ataque microbiano, podendo ocorrer crescimento
preferencial causado pela dispersão desigual destes compostos. Mudanças físicas são
observadas em produtos, tais como, filmes ou revestimentos, nos quais a relação
superfície/volume é alta e onde os materiais nutrientes, como os plastificantes e
lubrificantes, continuam a se difundir para a superfície quando utilizados pelos
microrganismos (ASTM G21-90, 1990).
1.3.8.3 Enzimas envolvidas no processo de degradação
As Fenoloxidases representam o maior grupo de enzimas envolvidas na atividade
metabólica secundária, mas comumente associado a produção dos melanina e outros
pigmentos. As reações catalisadas por estas enzimas estão também relacionadas com
mudanças nas propriedades da parede celular (aumento da impermeabilidade e
resistência hidrostática), interações intercelulares (agregação hifal) e a remoção/
detoxificação de certos metabolitos secundários (MAYER, 1987; MAYER e HAREL,
1979).
O termo fenoloxidase, fenolase de polifenol oxidase, são usados para descrever
enzimas que catalizam a oxidação molecular de compostos aromáticos. A presença das
enzimas tais como a catalase, a peroxidase e a superoxido dismutase que reagem com o
oxigênio ativado, é também importante em determinar a estabilidade dos compostos
aromáticos (MAYER ; HAREL, 1979).
As fenoloxidases são oxidoredutases que catalisam o óxido dos compostos
fenólicos. São divididas em dois subgrupos (lacases e tirosinases) e ambos reagem com
o oxigênio (DÚRAN et al., 2000). A atividade de feneloxidase extracelulares, indicando a
presença de enzimas lignoloticas foi descoberta na década de 30 em um fungo de
degradação branca (ERIKSSON, 1990); logo depois foi demostrado que as reações eram
catalisadas por oxidoredutases do tipo de lacases e peroxidases (KIRK 1971; ANDER e
ERIKSSON, 1976). A biodegradaçao da lignina é um processo oxidativo, no entanto, o
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
37
metabolismo dos fragmentos de lignina envolve uma combinação de reações de óxido-
redução (SCHOEMAKER, 1990).
Devido à natureza e tamanho da molécula de lignina, as enzimas responsáveis
pelo ataque inicial precisam ser extracelulares e não-específicas. As enzimas
extracelulares melhores estudadas, produzidas por estes fungos, são: lignina peroxidase
(LiP), manganês peroxidase (MnP), e lacase. O papel de LiP e MnP na degradação da
lignina tem sido verificado, enquanto que outras enzimas são ainda incertas. Diferentes
fungos de decomposição branca produzem diferentes combinações de enzimas: existem
os produtores de LiP e MnP, outros que produzem MnP e lacase, fungos que produzem
LiP e lacase, e ainda os que não produzem LiP nem MnP, mas sim lacase e álcool aril
oxidase (AAO), ou ainda outras enzimas (TUOMELA et al., 2000).
1.4 Referências Bibliográficas
AHN, B.D; KIM, S.H.; YANG, J.S. Synthesis and characterization of the biodegradable
copolymers from succinic acid and adipic acid with 1,4-butanediol. Journal of Applied
Polymer Science and Technology. v.82, p.2808-2826, 2001.
AKUTSU, Y., NAKAJIMA-KAMBE, T., NOMURA, N.; NAKAHARA, T. Purification and
properties of a polyester polyurethane – degrading enzyme from Comamonas
acidovorans TB-35. Applied Environmetal Microbiology. v.64. n.1, p. 62 – 67, 1998.
ALBERTSSON, A.C.; HUANG, S. J. Degradable Polymers, Recycling, and Plastics
Waste Management. New York: Marcel Dekker. Inc. 1995. 317 p.
ALEXOPOULOS, C. J; MIMS, C. W.; BLACKWELL, M. Introductory Mycology. 4
th
ed.
New York: John Wiley & Sons.1996. 869p.
AMBIENTARE BRASIL Disponível em: http:// www.ambientarebrasil.org.br
. Acessado
em: junho 2006.
ANDER, P.; ERIKSSON, K.E. The importance of phenol oxidase activity in lignin
degrdation by the White-rot fungus Sporotrichum pulverulentum. Archives of
Microbiology, v. 109, p. 1-8, 1976.
ANON. Curso básico intensivo de plásticos. Niterói, Jornal de Plásticos, 1997.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
38
American Society for Testing Materials. 1985. ASTM standards on materials and
environmental microbiology, p. 178 – 180. American Sciety for Testing Materials,
Philadelphia, Pa.
BLANCHETE, R. A. Delignification by Wood-Decay Fungi. Annual Review
Phytopathology. v.29, p.381 – 398, 1991.
BLANCHETTE, R. A. Degradation of Lignocellulose Complex in wood. Canadian Journal
Botany. Canadá. v. 73, p. 999-1010, 1991.
BUMPUS, J. A. e AUST, S. D. Biodegradation of environmental pollutants by white-rot
fungus Phanerochaete chrysosporium. Bioassays. v. 6, p.166 – 170, 1987.
CANEVAROLO, S. V. Ciência dos polímeros. editora Art Líber. 1º ed. 2002. 184 p.
CHANDRA, R. e RUSTIGI. Biodegradable Polymers. Program of Polymer Science. v.3,
p.1273-1335,1998.
CSEMP. Disponível em: http:// www.packplast.org/prog/actualites.htm/2005/
. Acesso em:
22 de outubro 2006.
CEMPRE – Compromisso Empresarial para reciclagem. Reciclagem & Negócios –
plástico granulado. 1998. Disponível em: http://www.cempre.org.br
. Acesso em 25
outubro de 2006.
DICKINSON, D.N.; DUC, M.T.L.; HASKINS, W.E,; GORNUSHKIN, I.; WINEFORDNER,
J.D.; POWELL, D.H.; VENKATESWARAN, K. Species differentiation of suite of Bacillus
Spores by mass spectrometry based protein profiling. Appied and Environmental
Microbiology, v. 70; p. 475-482, 2004.-
DUARTE, L. T.; LINS, V. F.C.; MARIANO, C.; BRANCO, J. R. T.; COLLARES M. P.;
GALERY, R. Recobrimentos de poli ( tereftalato de etileno) depositados em aço por
aspersão térmica a partir de pós obtidos em diferentes condições de moagem.
Polímeros: Ciência e Tecnologia, v. 13, p.198 – 204, 2003.
DURÁN, N. e ESPOSITO, E. Potencial applications of oxidative enzymes and
phenoloxidase – like compounds in wastewater and soil treatment: a review. Applied
Catálisis B: Environmental, v. 28, p. 83-99, 2000.
EL-SAYED, A. H. M. M., MAHMOUD, W. M., DAVIS, E. M. e COUGHLIN, R. W.
Biodegradation of polyurethane coatings by hydrocarbon-degrading bacteria. Journal
International Biodeterioration and Biodegradation. v.37, p.69-79, 1996.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
39
ERIKSSON,K. E. L. Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Wood Science
Technology. v.24,p.79-101, 1990.
ERIKSSON, K. E. L; BLANCHETTE, R. A. e ANDER, P. Microbial and Enzymatic
Degradation of wood and wood components. Springer Verlag, Germany-Berlin.407 p,
1990.
FLEMMING, H. C. Relevance of Bioflms for the biodeterioration of surfaces of polymerc
materials. Polymer Degradation Stabil, v. 59, p.309-316,1998.
FORLIN, F. J. e FARIA, J. A. F. Considerações sobre a reciclagem de embalagens
plásticas. Polímeros, v. 12, n. 1, p. 1 – 10, 2002.
FRANCHETTI, S. M. M. e MARCONATO, J. C. Decomposição térmica do PVC e
detecção do HCl utilizando um indicador ácido-base natural: uma proposta de ensino
multidisciplinar. Química Nova Escola, v.14, p. 40-42, 2001.
FRANCHETTI, S. M. M., NICOLETI, J. e RODRIGUES, M. L. B. O. Biotransformação de
filmes de PVC por fungos basidiomicetos. II Reunião Nacional de Microbiologia
Aplicada ao Meio Ambiente, UFSC- Florianópolis, 12 – 15 out., 1998.
GENEAU, M. C. Procede d’ elaboration d’ agromateriau composite naturel par
extrusion bivis et injection moulage de tourteau de tournesol. 2006. 381f. Tese de
doutorado – Instituto Nacional Politécnica de Toulouse, França.
GOMES, H. A. S. Obtenção, caracterização mecânica de PET, Amido plasticado e o
calculo das incertezas das medições. 2006. 89 f. Dissertação de Mestrado (Engenharia
e Ciência dos Materiais) – Universidade de São Francisco, Itatiba, São Paulo.
HATAKA, A; Lignin-Modifying Enzimes from Selected White-Rot Fungi: Production and
Role in Lignin Degradation. FEMS Microbiol Reviews. v.13, p.125-135 ,1994.
HAMMEL, K. E. Organopollutant degradation by lignilolytic fungi. Enzyme Microbiol
Technology. v.11,p.776-777,1989.
HOWARD, G. T. e BLAKE, R.C. Growth of the Pseudomonas fluorescens on a polyester-
polyrethane and the purification and characterization of a polyrethanase-protease
enzyme. Journal International Biodeterioration and Biodegradation. v.42, p. 231 –
220, 1998.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
40
HUANG, S. J. e EDELMAN, P. G. Anoverview of biodegradable polymers and
biodegradation of polymer In: Scorr, G & Gilead, (Ed). Degradable polymers: principles &
opplications. London Chapman and Hall, p.18-23, 1995.
JARA, A. M. A. T. Produção de Polifenoloxidases por Bactérias. 2005. 47f. Monografia
(Tecnologia Ambiental) – Universidade Católica de Pernambuco, Recife.
KAPLAN, A. Modern Plastics Encyclopedia, Mc Grow Hill Book Company Highstown,
1998. 99p.
KIRK,T.K. Effects of microorganisms on lignin. Annual Review of Phytopatology, v.9,
p.185-210, 1971.
KIRK, T. K. e FARRELL, R. L. Enzymatic “combustion”: the microbial degradation of
lignin, Annu. Reviews Microbiology.v. 41, p. 465 – 505, 1987.
KUMAR, G. S; KALPAGAM, V. e NANDI, V.S. Biodegradable polymers: prospects,
problems and progress. J. Mat. Sci. Macromol. Chemistry Physical. v. 22, n.2, p.225-
260, 1983.
KUSTER, E. Biological degradation of synthtic polymers. J. Appl. Polym. v.35,p. 395-
404, 1979.
LEE, B., POMETTO III, A. L., FRATZKE, A. e BAILEY JR., T. B. Biodegradation of
Degradable Plastic Polyethylene. Phanerochaete and Streptomyces spects.Applied and
Environmental Microbiology. v.57, p. 678-685,1991.
LEONAS, K. K. e GORDEN, R. W. Bactéria Associated with Desintegrating Plastics Films
Under Simulated Aquatic Environments. Bull Environ. Contam. Toxicol.v. 56,p.948-955,
1996.
LIMA, A. M. F. Estudo da cadeia produtiva do polietileno tereftalato (PET) na região
metropolitana de Salvador como subsidio para analise do ciclo de vida. 2001. 94 f.
Monografia (Gerenciamento e Tecnologia Ambientais na Indústria) – Universidade
Federal da Bahia, Salvador.
MANCINE S. D.; BEZERRA, M. N. e ZANIN, M. Polimeros Ciência Tecnologia. v. 3,
n.2, p.68 – 75, 1998.
MANO, E. B. Introdução a Polímeros. Ed. Edgard Blucher, São Paulo, 1985.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
41
MANO, E. B. e MENDES, L. C. Introdução a Polímeros. 2º. ed. Edgard Blucher, São
Paulo, 1999. 191p.
MAYER, A. M. Polyphnol oxidases in plants – recent progress. Phytochemistris. v.26, p.
11-20, 1987.
MAYER, A. M. e HAREL, E Polyphenol oxidases in plants. Phytochemistry. v. 18, p.
193-215, 1979.
MICHAELI, W.Tecnologia dos plásticos. Editora Edgard Blucher Ltda. São Paulo,
Introdução e Lição. v. 1. 1995. p. 1 a 13.
NAKAJIMA-KAMBE, T., ONUMA, F., AKUTSU, Y. e NAKAHARA, T. Determination of the
polyester polyurethane breakdown products and distribution of the polyurethane
degrading enzyme of Comamonas acidovorans strain TB-35. J. Ferm. Bioeng. v.83, n.5,
p. 456-460,1997.
NASCIMENTO, A. M., SILVEIRA, A. P. C., COSTA, K., RIEHL, L. A. S.R., SANTOS,
Z.A.M. Reciclagem de lixo e química verde. 2005. 71f. Curso de formação continuada
ciências da natureza, matemática e suas tecnologias – Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro.
NDON, U. J; LEVINE, A. D. e BRADLEY, B. S. Evaluation of biodegradability of starch –
based plastcs. Wat. Sci. Tech. v.26,n.9-11,p.2089-2092,1992.
OSE – COC. Disponivel em: http://www.ose.g12.br/vantagem.htm
. Acesso em: 15 de
novembro de 2006.
PLÁSTICOS. Disponível em: http://www.desenvolvimento.gov.br
. Acesso em: 09 de julho
de 2007.
RESBRASIL NOTÍCIAS. Disponível em: http://www.resbrasil.com.br/notícia11.htm.
Acesso em: 27 de setembro de 2005.
REDIFF ON THE NET. Disponível em: http://members.rediff.com/jogsn/BP4.html
. Acesso
em: 25/09/2006.
ROSA S. D; PENTEADO D. F. e CALIL, M. R. Propriedades Térmicas e
Biodegradabilidade de PCL e PHB em um Pool de Fungos. Revista de Ciência e
Tecnologia. v. 15, p. 75 - 80, 2000.
Jara, A. M. A. T Biofilmes e enzimas sintetizados....
42
ROSA S. D. e CHUI Q.S.H. Avaliação da Biodegradação de poli-β-(hidroxibutirato-co-
valerato) e poli-e-(caprolactona) em solo compostado. Polímeros : Ciência e
Tecnologia. v. 12,p. 311-317,2002.
SANTERRE, J. P., LABOW, R.S. e ADAMS, G.A. Enzyme-biomaterial interactions: Effect
of biosystems on degradation of polyrethanes. J. Biom. Mat. Res. v.27.p.97-109, 1993.
SCHANABEL, W. Polymer Degradation – Principles and Practical Applications. 1º
ed. New York: Macmillan Publishing Co, New York, 1981. 177p.
SCHOEMAKER, H. E.On the chemistry of lignin biodegradation. Recl. Trav. Chim. Pays-
Bas Neth.v.109,p.255-272,1990.
SONENSHEIN, A. L. Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry,
physiology, and molecular genetics. Amereican Society Microbiolpgy, 1993.1120 p.
SPINACÉ, M. A. S. Poli (tereftalato de etileno) processamento por extrusão e obtenção
da garrafa PET. Química Nova.p. 34 – 48, 2000
SPINACÉ, M. A. S. e DE PAOLI, M. A. A tecnologia da reciclagem de polímeros, poli
(tereftalato de etileno). Química Nova. v. 28, p. 65-72, 2005.
STRONG, B.A. Plastics Materials and Processing,2º ed, Upper Saddle River, New
Jersey, Columbus, Ohio. Editora Prentice Hall, 1999.
TUOMELA, M; VIKMAN, M; HATAKKA, A. e ITAVARRA, M. Biodegradation of lignin in
compost environment: a review. Bioresource Technology. v. 72,p.169-183, 2000.
ZANIN, M. e MANCINI, S. D. Residuos Plásticos e Reciclagem aspectos gerais e
tecnologia, São Carlos EDUFSCAR – Editora da Universidade de São Carlos. 2004. 143
p.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
43
CAPÍTULO 2
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
44
Primeiro Artigo
Formação de Biofilmes, Produção de Enzimas
por Bacilllus subtilis em Superfícies de
Tereftalato de Polietileno no processo de
Degradação
Manuscrito a ser submetido para publicação em
International Biodeterioration & Biodegradation
_______________________________________________
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
45
Formação de Biofilmes e Produção de Enzimas por Bacillus
subtilis em Superfícies de Tereftalato de Polietileno
Simulando Degradação
_______________________________________________
Alicia Maria Andrade Torres Jara
Mestrado em Desenvolvimento de Processos Ambientais
Universidade Católica de Pernambuco
Rua do Príncipe, 526 - Boa Vista - 50050900 - Recife - PE - Brasil.
Norma Suely Evangelista
Instituto de Ciências do Mar -LABOMAR
Universidade Federal do Ceará
Av. Abolição, 3207, Meireles, 60.165-081, Fortaleza, CE, Brasil.
Nelson Duran
Laboratório de Química Biológica
Universidade Estadual de Campinas
Cidade Universitária “Zeferino Vaz”, Caixa Postal 6154, Distrito de Barão
Geraldo, Campinas, SP, Brasil.
Aline Elesbão do Nascimento
*Galba Maria de Campos Takaki
Centro de Ciências e Tecnologia
Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais
Universidade Católica de Pernambuco
Rua Nunes Machado, 42 - Bloco J - Boa Vista - Recife - PE - Brasil.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
46
Formação de Biofilmes, Produção de Enzimas por
Bacillus subtilis em Superfícies de Tereftalato de
Polietileno no processo de Degradação
Alícia Maria Andrade Torres Jara
a,b
, Norma Suely Evagelista
c
,
Nelson Durán
d
,
Aline Elesbão do Nascimento
b
, Galba Maria de Campos-Takaki
b
*
1
Mestrado em Desenvolvimento de Processos Ambientais,
2
Núcleo de Pesquisas em Ciências
Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco. Recife – PE, Brasil. CEP: 50.050-590 ;
3
Instituto de Ciências do Mar-LABOMAR, Universidade Federal do Ceará, Av. Abolição, 3207,
Meireles, 60.165-081, Fortaleza, CE, Brasil.
4
Laboratório de Química Biológica, Universidade
Estadual de Campinas, Cidade Universitária “Zeferino Vaz”, Caixa Postal 6154, Distrito de
Barão Geraldo, Campinas, SP, Brasil;
Abstract
The modification of polyethylene terephthalate (PET) fibres from used beverage
bottles was investigated by treatment with UV (6 and 36h), temperature (35ºC and
50ºC), and without physic treatment on the production of extracellular enzymes, and
biofilm formation by Bacillus subtilis under controlled conditions. The results showed
partial degradation of the copolymer submitted to physic treatments and colonization by
B. subtilis. The best results of degradation were associated with protease, amylase and
esterase on surface of PET particles submitted to 50
0
C of temperature, during 60 days.
However, the esterase activity simulating biodegradation of PET by B. subtilis, and
suggest residual lost of weight, and the products showed low toxicity when compared
with the PET particles without treatments.
Keywords: polyethylene terephtalate; enzymes; Bacillus subtilis
1. Introdução
Os plásticos em geral apresentaram uma grande difusão comercial nas últimas
décadas, considerando a sua resistência e emprego industrial na síntese de novos
polímeros com propriedades físico-químicas especiais. Paralelamente associado a
essas qualidades, ocorrem problemas graves para o meio ambiente, devido a grande
quantidade de descarte de polímeros no meio ambiente, permanecendo por um longo
tempo em depósito de lixo e aterros sanitários. Esta situação tem permitido que os
produtos manufaturados com plásticos, permaneçam visíveis em muitos ambientes
terrestres e aquáticos, devido a sua difícil eliminação (Eggins et al., 1971, 1975).
O tereftalato de polietileno (PET) é um polímero sintético que tem sido muito
utilizado na área de embalagens alimentares, especialmente, bebidas gaseificadas,
apesar da maior parte da demanda mundial deste plástico, contudo, esta relacionada à
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
47
aplicação de fibras (Edge et al., 1996) . No Brasil, são produzidos anualmente cerca
de 270 mil toneladas de tereftalato de polieileno (PET).
A biodegradação dos polímeros é um processo pelo qual bactérias, fungos
filamentosos e leveduras excretam suas enzimas para utilizar parte da estrutura
química, como fonte de carbono, modificando assim, a forma original do polímero
(Chandra; Rustgi, 1998 e Rosa et al., 2002). Portanto, a busca de microrganismos
capazes de degradar compostos xenobióticos é de grande interesse para os
processos de biorremediação, principalmente na remoção de plásticos (Chandra;
Rustgi, 1998).
Os plásticos, apresentam uma relação inversa entre peso molecular e
biodegradabilidade. Oligômeros de hidrocarbonetos lineares com peso molecular
abaixo de 620 suportam crescimento microbiano, contudo, pesos moleculares mais
altos são dificilmente utilizados pelos microrganismos (Haines e Alexander, 1974;
Potts, 1978).
Neste sentido, tem sido amplamente aceitável a resistência à degradabilidade do
tereftalato de polietileno, considerando seu peso molecular, além da natureza
hidrofóbica que interfere com a colonização e viabilidade dos microganismos (Hadad
et al. , 2005).
Portanto, explorar processos de transformações físico no plástico se faz necessária
para proporcionar a perda de algumas de suas propriedades físicas, tornando-se
assim, mais acessivel à colonização microbiana e consequentemente, possibilitar o
processo de biodegradação (Chanda e Roy, 1986; Cornelli et al.,1984).
Neste trabalho foi avaliada a formação de biofilme por Bacillus subtilis em
superfície de tereftalato de polietileno - PET, submetido ou não ao tratamento com
irradiação de luz ultravioleta (6 e 36 horas) e temperatura (35ºC e 50ºC por 72 horas),
respectivamente, associados à produção de enzimas (polifenoloxidases, amilase,
protease e esterase), liberação de proteinas totais, pH e toxicidade.
2. Materiais e Métodos
2.1 Microrganismo
Foi utilizada a linhagem Bacillus subtilis UCP 999, isolada de solo contaminado
por petróleo no porto do Recife-PE, procedente do Banco de Culturas da Universidade
Católica de Pernambuco – UNICAP, mantida no meio ágar nutriente-AN, à
temperatura de 5
0
C.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
48
2.2 Tereftalato de Polietileno e Tratamentos com Irradiação UV e temperatura
O polímero sintético utilizado nos ensaios foi o tereftalato de polietileno
industrial (garrafa de coca-cola) foram cortados em partículas,correspondente ao
tamanho de 20 x 20 mm, com espessura de 0,35 mm. Em seguida as partículas de
tereftalato de polietileno foram submetidas a 2 processos físicos: 1.1) irradiação UV
por 2h (durante 3 dias) correspondendo ao total de 6h; 1.2) irradiação UV 12h (durante
3 dias) correspondendo ao total de 36h. O tratamento com irradiação UV foi realizado
na capela de fluxo laminar, onde a lâmpada de UV estava na altura de 40 cm com o
comprimento de onda entre 2.400 e 2.800 nm.
2) A influência da temperatura foi avaliada submetendo-se as partículas à 35ºC e
50ºC, respectivamente, durante 72h e como controle, partículas de PET sem
tratamento físico.
2.3 Desinfecção das partículas de PETs
As partículas do PET foram previamente cortadas, pesadas e em seguida
colocadas em placas de Petri, contendo álcool iodado, deixados em câmara de fluxo
laminar, por 60 minutos, agitando-se ocasionalmente. A seguir, com o auxilio de uma
pinça estéril, estes foram removidos e transferidos para outras placas de Petri com
solução de etanol 70%, onde permaneceram por um período de 60 minutos, agitando-
se ocasionalmente, segundo estabelecido pela ASTM-D-5247, (Lee et al., 1998, 1991).
Após estes procedimentos, os plásticos foram transferidos, assepticamente, para
placas de Petri com água destilada por 60 minutos, agitando-se ocasionalmente. Por
fim, as partículas de PET permaneceram à temperatura ambiente, em dessecador, até
peso constante.
2.4 Condições culturais para avaliar a colonização de Bacillus subtilis
O Bacillus subtilis foi crescido em placas de Petri contendo o meio Ágar
nutriente, constituído por extrato de carne 5,0g, cloreto de sódio 5,0g, peptona 10,0g,
ágar 15,0g, e 1000mL de água destilada, incubado à temperatura de 35ºC durante 24
horas, pH 6,72. O crescimento do B. subtilis foi medido por turbidez a uma densidade
óptica (D.O
600
) de 0.5. Foram utilizados frascos de Erlenmeyers com 250 mL de
capacidade, contendo 100 mL do caldo nutriente, adicionado de 0.02-0.50% de Tween
80 e 1 mL da suspensão bacteriana, adicionados das partículas do PET, de acordo
com os tratamentos utilizados, previamente pesadas e esterilizadas. Em seguida, os
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
49
frascos foram mantidos sob agitação de 150 rpm, à temperatura de 35ºC, por um
período de 30 e 60 dias. Após o período de incubação, dos cultivos foram avaliados a
viabilidade celular, em seguida, filtrados com filtro Sterifil D-GV, Millipore 0,22µm. Do
líquido metabólico livre de células foi utilizado para as seguintes determinações: da
atividade enzimática, do pH, de proteínas totais e da toxicidade. As películas do PET
foram removidas dos frascos, colocadas em estufa à 35ºC até secar totalmente, sendo
então transferidas para dessecador e mantidas até peso constante. Controles foram
realizados com ausência de tratamento físico. Todos os experimentos foram
realizados em duplicata.
Determinação do pH
- O pH do líquido metabólico livre de células foi medido
utilizando-se um pHmetro Orion, modelo 310.
Viabilidade celular
– a viabilidade celular foi realizada através da técnica “pour plate”,
usando como meio inoculante o agar nutriente, 24h de incubação à temperatura de
35ºC, seguido de contagem do número de colônias.
Determinação das proteínas totais
- A concentração de proteínas totais do líquido
metabólico livre de células foi determinada segundo o kit LABTEST Diagnóstica. O
princípio dessa técnica consiste na reação das proteínas da amostra com o biureto
(hidróxido de sódio, 1,86 mol/L; tartarato de sódio e potássio 430 mM/L; sulfato de
cobre, 120 mM/L e iodeto de potássio 300 mM/L), desenvolvendo uma coloração roxa,
proporcional à concentração de proteínas das amostras, determinadas a 545 nm,
tendo como padrão albumina.
2.5 Avaliação da toxicidade dos metabólitos produzidos pela biodegradação do
tereftalato de polietileno
Os testes de toxicidade foram realizados com os líquidos metabólicos dos
ensaios com 30 e 60 dias de incubação do PET (tratado ou não), usando o crustáceo
Artemia salina como bioindicador. O bioensaio foi baseado apenas na porcentagem de
morte dos organismos em relação ao seu número total (10 larvas), na presença de
diferentes concentrações do líquido metabólico (v/v de 25%, 50% e 75%), diluídas em
5 ml de uma solução aquosa de sal marinho sintético (33,3g L), incubados por 24h. O
volume máximo da amostra teste (líquido metabólico) foi de 1,5ml (Mc Laughlin et al.
1985).
Em seguida, foi realizada a contagem dos organismos sobreviventes,
determinando-se assim a dose limite (CL
50
) dos líquidos metabólicos. Os testes foram
realizados em duplicata.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
50
2.6 Remoção do biofilme bacteriano da superfície do Tereftalato de Polietileno
Para facilitar a avaliação do biofilme nas partículas do PET, dois tratamentos
foram realizados de acordo com (Hadad et al., 2005) modificado, pela remoção inicial
do biofilme pelo tratamento com água destilada estéril. Deste modo, as partículas de
PET contendo colonização do B. subtilis foram inicialmente pesadas, transferidas para
Erlenmeyers de 125 mL de capacidade, contendo 15 mL de água estéril, mantidos sob
agitação de 150 rpm, à temperatura de 28ºC, por um período de 12 horas. Em
seguida, as partículas foram lavadas com uma solução de dodecil sulfato de sódio –
(SDS) a 2% (v/ v) durante 4 horas, seguido de cinco lavagens com água destilada até
remoção total da solução. As partículas de tereftalato de polietileno foram colocadas
em papel de filtro, secas “overnight” à 35ºC, sendo colocadas em dessecador até peso
constante. A porcentagem de perda de massa do PET foi estimada em relação ao
peso inicial da partícula, após a remoção do biofilme.
2.7 Detecção de Atividade enzimática
Atividade esterase:
A detecção da atividade esterase foi realizada pelo método
descrito por (Kitancharoen e Hatai 1998), tendo Tween 80 como susbtrato. Discos de
papel xarope de 6 mm foram embebidos com 100 µl, depositados no centro da placa
de Petri contendo o meio para atividade esterase, incubadas à temperatura de 35ºC,
sendo observadas a cada 24 horas, após o aparecimento do halo púrpura ao redor do
disco, medido e expresso em mm.
Atividade Amilase:
A detecção da atividade amilase foi realizada de acordo
com a metodologia de (Hankin e Anagnostakis 1979), tendo amido solúvel como
substrato. Discos de 6 mm de papel xarope, contendo 100 µl do líquido metabólico
(controle e tratados), depositados no centro da placa de Petri contendo o meio para
atividade amilase, incubadas à temperatura de 37ºC, sendo observadas a cada 24
horas, após a coloração com lugol o aparecimento do halo transparente ao redor do
disco, medido e expresso em mm.
Atividade Protease
: A detecção da atividade de protease nos líquidos
metabólicos foi realizada de acordo a metodologia de (Hankin e Anagnostakis 1979),
tendo gelatina a 2% como substrato. Discos de 6 mm de papel xarope contendo 100 µl
do líquido metabólico (controle e tratados) foram colocados no centro da placa
contendo o meio para atividade protease, incubados à temperatura de 37ºC, sendo
observados a cada 24 horas, até o aparecimento do halo transparente ao redor do
disco, medido e expresso em mm.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
51
Atividade de Polifenoloxidases:
A determinação da atividade feneloxidase dos
líquidos metabólitos foi realizada pelo método descrito por (Conceição et al. 2005),
tendo ácido gálico como substrato. Discos de papel xarope de 6 mm contendo 100 µl
do líquido metabólico (controle e tratados) foram colocados no centro da placa
contendo o meio para atividade fenoloxidase, incubadas à temperatura de 37ºC, sendo
observadas a cada 24 horas, até o aparecimento do halo marrom ao redor do disco,
medido e expresso em mm.
2.8 Microscopia Eletrônica de Varredura
O biofilme formado por B. subtilis coletadas com 30 e 60 dias de cultivo nas
partículas do PET foram lavados em PBS, pH 7.2, por duas vezes, durante 10
minutos. Em seguida fixados com glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1M, pH 7.4,
durante 1 hora, a temperatura ambiente. Finda a etapa de fixação, todas as amostras
foram novamente lavadas com tampão fosfato, duas vezes, durante 10 minutos,
seguido de pós-fixação com tetróxido de ósmio a 1%, em tampão fosfato, durante 1
hora à temperatura ambiente, na ausência de luz. Em seguida, as amostras foram
mais uma vez lavadas com tampão fosfato 0,1M, sendo posteriormente, submetidas
ao processo de desidratação. Para a desidratação das amostras foi utilizado álcool
etílico, em proporções de 50%, 70%, 90% (5 minutos para cada troca) até a proporção
de 100% (três vezes, 10 minutos cada troca). Após essa etapa, as amostras foram
submetidas ao ponto crítico para eliminação total da fase líquida e montagem em
suportes de alumínio, com posterior metalização. As amostras foram visualizadas,
analisadas e fotografadas ao Microscópio Eletrônico de Varredura JEOL JSM T2000
(De Souza, 1998).
3. Resultados e discussão
A tabela 1 apresenta os valores da viabilidade celular de B. subtilis após 30 dias e 60
dias de incubação com as partículas do polímero, com e sem tratamentos físicos.
Observou-se que ocorreu um aumento do número de células que foi de 9,1x107 para
as partículas do PET com irradiação UV por seis horas, em relação ao número inicial
de células do controle. O efeito das temperaturas 35ºC no PET acarretou uma redução
na população bacteriana, com 60 dias de incubação, observando-se um número de
células de 4,3x10
7
no período de 60 dias de incubação, quando comparados ao PET
controle (sem tratamento).
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
52
Observou-se ainda, que após 30 e 60 dias de incubação conforme mostra na tabela 1,
o pH inicial de 6,72 aumentando para pH (>8,0) em todos os tratamentos, inclusive no
controle. Contudo, as partículas submetidos à irradiação com UV apresentou no
período de 36h de tratamento um pH de 8,41, após 30 dias de incubação e 8,60 após
60 dias, sugerindo a presença de metabólitos oriundos do processo de uma possível
degradação, causando alteração do pH. Observou-se ainda, que com 30 dias o
plástico tratado com temperatura de 35ºC apresentou uma maior alteração do pH,
passando para 8,51 com 30 dias de incubação, no qual com 60 dias o pH baixou para
8.05. Segundo a ASTM- G-21, ( Lee et al., 1991 e Raghavan, 1995), as mudanças nas
propriedades elétricas dos plásticos ocorrem devido, principalmente, ao crescimento
microbiano na superfície do plástico, estando associado à umidade e às mudanças do
pH, provavelmente, causadas pela degradação química do PET ou pela formação de
metabólitos secundários.
Com relação às proteínas totais produzidas no líquido metabólico com 30 e 60 dias de
incubação, ocorreu um grande aumento no período mais prolongado de crescimento
(60 dias), exceto para a irradiação com a luz ultravioleta por seis horas e a tempertura
de 50ºC. Nesta temperatura observou-se uma drástica redução no conteúdo de
proteínas totais, possivelmente, devido ao processo de desnaturação e ou
degradação, mediados pela alta temperatura (50ºC) (Gilan et al 2004) analisou
conteúdo de proteínas no processo de colonização, formação e biodegradação de
polietileno por Rhodococcus ruber .
Nas tabelas 2 e 3 observam-se o peso inicial das partículas, peso com biofilme e peso
após a remoção do biofilme, indicando a porcentagem de perda de massa nas
partículas do PET tratado ou não com processos físicos, após a colonização de
Bacillus subtilis.
Destacaram-se no período de 30 dias (tabela 2), a partícula tratada com irradiação UV
com 6 horas e com temperatura de 50ºC respectivamente, apresentaram diminuição
de 0, 06% e 0,07% da massa inicial da partícula do PET. A porcentagem da
diminuição da massa da película sem tratamento foi igual a da irradiação ultravioleta
(0,06%).
Observa-se na tabela 3 que, as porcentagens de perda de massa polimérica no
período de 60 dias foram mais altas em comparação ao período de 30 dias, sendo a
maior perda de 0,08% apresentada para a partícula tratada com temperatura de 50ºC
e com 0,07% para as tratadas com irradiação UV por 36 horas.
A literatura se refere a uma perda de massa na porcentagem de elongação do
polímero (polyclean), como também na média do peso molecular, quando comparado
ao controle (sem tratamento) (Lee et al., 1991).
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
53
3.1 Enzimas produzidas por Bacillus subtilis durante o processo de degradação do
PET
Foram produzidas protease, amilase e esterase, com exceção da enzima
polifenoloxidases (tabela 4). A atividade amilase produzida pelo B. subtilis de uma
forma geral apresentou halos de 10 a 48 mm, contudo, o controle apresentou a maior
detecção com 60 dias de incubação. Observou-se com 60 dias de incubação halos
superiores a 10mm. Observou-se ainda, que a amilase produzida pelo B. subtilis nas
superfíces do PET tratadas com UV e temperatura foi mais expressiva com 60 dias de
incubação ( tabela 4).
Resultados semelhantes também foram observados com a protease, sendo que o
controle, apresentou halos de 45 mm, com sessenta dias de incubação. Ressalta-se
que o tratamento com a temperatura de 50ºC formou o maior halo com 60 dias de
incubação, de 52mm.
Os resultados obtidos demonstraram ainda, que apenas quando o microrganismo
colonizava o polímero previamente tratado com a temperatura de 50ºC expressou
atividade esterase (tabela 4). A literatura se reporta às enzimas hidrolíticas
sintetizadas pelos microrganismos como amilase, protease e principalmente, esterase
(Fische-Colbrie et al., 2004), estar envolvidas com o processo de degradação do PET,
cujas informações apoiam os resultados obtidos, sugerindo uma possível degradação
do PET nas condições estudadas.
Mayende et al 2006 descrevem a produção de enzimas polifenoloxidases por Bacillus
thermophilic spp. Diferentes dos resultados encontrados no presente trabalho.
3.2 Formação do biofilme por Bacillus subtilis na superfíce de tereftalato de polietileno
com e sem tratamento físico
Os conteúdos estimados de biofilme formado na superfície polimérica do tereftalato de
polietileno, com e sem tratamento por Bacillus subtilis estão apresentados na tabela 5.
Transformações físico-químicas no material plástico se faz necessária para que ele
perca algumas de suas propriedades físicas e torne-se mais acessivel à colonização
microbiana e consequentemente, possibilitar o processo de biodegradação (Chanda et
al., 1986 e Corneli et al., 1984). Segundo ( Xu et al..,1995), a biodegradação pode ser
facilitada por aplicação de processos prévios de luz (UV) e/ou calor na matriz
polimérica. Ambos os tratamentos com irradiação UV por 6 e com temperatura de
35ºC possibilitaram uma superfície mais adequada para a colonização e formação do
biofilme por Bacillus subtilis quando comparado às partículas controle (sem
tratamento).
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
54
Após a quantificação do conteúdo de biofilme foi confirmada através da microscopia
eletrônica de varredura a formação de biofilme pelo Bacillus subtilis, utilizando-se
amostras com 60 dias de incubação, controle e tratado com luz ultravioleta, como
também com a temperatura (figura 1. A,B,C e D). Observou-se uma distribuição
homogênea e esparsa, com pontos de ligação dos microrganismos à superfície do
polímero (figura A e C). Contudo, com o tratamento com temperatura de 35ºC foram
observados bacilos alongados, com alta densidade eletrônica, células estruturadas de
forma agrupada, sendo essas informações corroboradas por (Gilan et al.2004),
trabalhando com o processo de colonização de Rhodococcus ruber.
Contudo, com a irradiação ultravioleta por 6 horas verificou-se uma diminuição
da população bacteriana aderida à superfície do polímero. As células apresentaram
uma forma mais arredondada, com distribuição heterogênea. Observou-se ainda, uma
diminuição da eletrondensidade celular. Os resultados observados sugeriram que a
temperatura e o tratamento com a luz ultravioleta induzem variações na distribuição,
da forma, homogeneidade e eletrondensidade da população bacteriana aderida à
superfície do polímero, quando comparadas ao controle.
3.3 Toxicidade dos metabólitos formados pelas partículas PET
Após o período de incubação do B. subtilis por 30 e 60 dias com as partículas
de PET com tratamento de irradiação ultravioleta por seis e trinta e seis horas e
temperaturas de 35ºC e 50ºC por 72 horas, testes de toxicidade foram realizados com
o líquido metabólico oriundo dos respectivos ensaios, utilizando o bioindicador Artemia
salina. Os resultados obtidos nos testes de toxicidade são mostrados na figura 5. A
porcentagem de mortalidade para A. salina, após exposição com as amostras de 60
dias de incubação quando comparadas ao controle (contendo apenas água do mar). O
ensaio com irradiação UV 36h demonstrou maior toxicidade, com mortalidade entre 10
a 55%. No ensaio com a temperatura de 35ºC observou-se uma mortalidade mais alta
na concentração de 75% do liquido metabólico, comparando ao ensaio com a
temperatura de 50ºC (figura 2). Assim, amostras controle foram testadas,
apresentando uma mortalidade de apenas 10% nas concentrações de 50% e 75%,
respectivamente.
O valor da CL
50
das amostras (concentração que causa 50% de mortalidade) foi
calculado pelo método de Trimmed Spearman-Karber ( Youn – Joo, 2006). A CL
50
das
amostras com 30 dias de incubação foram calculadas segundo este método, onde a
amostra controle apresentou uma CL
50
de 65,52 % (v. v
-1
), com uma faixa de variação
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
55
de 52,69 e 81,47%, para um intervalo de confiança de 95%. Com o tratamento da luz
ultra violeta por seis horas observou-se uma CL
50
de 62,24% (v.v
-1
),com uma faixa de
variação de 44,73 e 83, 83%, para um intervalo de confiança de 95%, sendo um valor
mais baixo em relação ao controle (tabela 6). Contudo, com 36h, não foi possível ser
calculada segundo este método, uma vez que apresentou baixo percentual de
mortalidade.
Para o tratamento com a temperatura de 35ºC o valor da CL
50
foi de 54,33% (v. v
-1
),
com uma faixa de variação de 43,83 e 67,35%, para um intervalo de confiança de
95%. No entanto, com a temperatura de 50ºC a CL
50
foi de 45,74% (v.v
-1
) e faixa de
variação de 37,85 a 55,27%, para um intervalo de confiança de 95% (tabela 6).
Estudos realizados por (Siqueira et al., 1998) demosntraram que a validade e a
confiabilidade do bioensaio de toxicidade com Artemia salina estão relacionadas com
as frações que continham uma substância reconhecidamente ativa. Portanto, a CL
50
dos experimentos com 60 dias de incubação não foram calculados segundo este
método, uma vez que apresentaram baixo percentual de mortalidade. Observou-se
que o teste controle (contendo apenas água do mar e Artemia), não indicou que as
larvas foram afetadas, validando a condição dos experimentos.
Cavalcante et al.2000 sugeriu que ensaios de letalidade proporcionam uma avaliação
da toxicidade geral e, portanto, devem ser considerados essenciais para testes
preliminares, considerando o estudo de compostos com potencial de atividade
biológica.
Reginatto, 1998 usando a alga Scenedesmus subspicatu, observou que os testes de
toxicidade com alga, mesmo padronizados, não são utilizados com cautela e que uma
padronização internacional mais detalhada são necessárias, levando-se em
consideração as características das amostras a serem avaliadas. Assim, nos estudos
aqui descritos observou-se que uma possível degradação do PET pelo B. subtilis
formou metabólitos com 60 dias de incubação, contudo, os mesmos apresentaram
baixa toxicidade.
Os estudos realizados com o microrganismo Bacillus subtilis evidenciam a formação
de um biofilme na superfíce polimérica do tereftalato de polietileno sugerindo a
ocorrência de degradação. Contudo, dos tratamentos físicos utilizados a temperatura
de 50ºC demonstra uma possível alteração na superfície, conduzindo portanto, a uma
fácil e rápida colonização do microrganismo, possibilitando à expressão de enzimas
hidrolíticas, responsáveis pelo fenômeno de degradação, e consequentemente, a
perda de massa polímerica. Os estudos realizados evidenciam ainda que os
tratamentos físicos (UV e temperatura) demonstram auxiliar na redução da toxicidade
dos produtos de degradação. No entanto partículas de PET tratadas com irradiação
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
56
UV e temperatura torna-se mais acessível a adesão do microrganismo em relação a
partícula sem tratamento.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao suporte financeiro do CNPq, CAPES e FINEP.
Referências
Albertsson, A.C. e Karlsson, S.;Prog Polymer Sci. 1990. The influence of biotic and
abiotic environments on the degradation of polyethye15, 177, 192.
ASTM G21-90 – Standard test meterod fortensile properties of plasctics. Annual Book
of ASTM, Philadelphia, Pa, 1990.
ASTM D-5247-92 – Standard test meterod fortensile properties of plasctics. Annual
Book of ASTM, Philadelphia, Pa, 1992.
Cavalcante, M.F., Oliveira, M.C.C., Velandia, J.R., Echevarria, A.S., 2000. Síntese de
1,3,5-triazinas substituídas e avaliação da toxicidade frente Artemia salina Leach.
Química Nova 23, 20 -22.
Conceição, D. M., Angelis, D.A, Bidoia, E. D., Angelis, D. F., 2005. Fungos
filamentosos isolados do Rio Atibaia, SP e refinaria de petróleo biodegradadores
de compostos fenólicos. Arq. Inst. Biol 72, 99 –106.
Cornell, J., Kaplan, A. M., Rogers M.R., 1984. Biodegradability of photooxidized
polyalkylenes. J. Appl. Polym. Sci 29, 2581-2597.
Chanda, M., Roy S.K. Plastic technology handbook. Marcel Dekker, Inc.,New York.
1986.
Chandra, R., Rustigi., 1998. Biodegradable Polymers. Program of Polymer Science,
(S.I), 3, 1273-1335.
De Souza, W. Técnicas básicas da Microscopia Eletrônica Aplicada às Ciências
Biológicas. Ed. Sociedade Brasileira de Microscopia, Rio de Janeiro.156p.1998.
Edge, M., Wiles, R., Allen, N.S., McDonald, W. A., Mortlock, S. V.,1996.
Characterization of the species responsible for yellowing in melt degradaded
aromatic polyesters – I: Yellowing of poly(ethylene terephthalate). Polym. Degr and
Stabil 53, 141-151.
Eggins, H.O.W., Allsopp, D.,1975..Biodeterioration and biodegradation by fungi.
In:Smith. J. E & Berry, D.R. The filamentous fungi. Arnold. London 1, 301-319.
Eggins, H.O.W., Mills., J., Holta., Scott, G., 1971. Biodeterioration and biodegradation
of synthetic polymer. In: Sykes,G. & Skinner, F. A. Microbial aspects of pollution.
London Academic Press, 267 – 279.
Fischer-Colbrie, G., Heumann, S., Liebminger, S., Almansa, E., Cavaco-Paulo, A.,
Georg, M. G., 2004. New Enzymes with Potential for PET Surface Modification.
Biocatalysis and Biotransformation 22, 341 – 346.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
57
Gilan, I., Hadar, Y., Sivan A., 2004. Colonization, biofilm formation and biodegradation
of polyethylene by a strain of Rhodocossus ruber. Aplied Microbial and cell
Physiology 65, 97-104.
Hadad, D., Geresh S., Sivan A., 2005. Biodegradation of polyethylene by thermophilic
bacterium Brevibacillus borstelensis.Journal of Applied Microbiology 98, 1093 –
1100.
Haines, J. R., Alexander, M., 1974. Microbial degradation of high molecular-weight
alkanes. Applied Microbiology 28, 1084.
Hankin, L. E, Anagnostakis, S.L., 1979. The use of solid media for detection of ezymes
production by fungi, Mycologia 67, 597 – 607.
Kitancitaroen, N. E, Hatai, K., 1998. Some biological characteristics of fung isolated
from salmonial eggs. Mycoscience 39, 249 – 255.
Lee, B., Pometto III, A. L., Fratzke, A., Bailey, J.R.T.B., 1991. Biodegradation of
Degradable Plastic Polyethylene. Phanerochaete and Streptomyces spects.
Applied and Environmental Microbiology 57, 678-685.
Mangiarotti, A. M., Caretta, G., Nelli, E., PiontellIi, E., 1994. Biodeterioro de materiales
plásticos por microhongos. Boletim Micológico 9, 39 – 47.
Mc Laughlin , J. L., Saizarbitoria, T.C., Anderson, J. E., 1985. Tres biosensayos
simples para quimicos de produtos naturales. Revista de la Sociedad Venezolana
de Química 18, 13-18.
Mayende, L., Wilhelnu,B. S., Pletschk,B.I., 2006. Biologia do solo e Biochemistry 38,
2963-2966.
Potts,J.E., 1978. Biodegradation. In Aspects of Degradation and Stabilization of
Polymers ed. Jelinek, H.H.G. New York: Elsevier 617 – 658.
Raghavan, D., 1995. Characterization of Biodegradable Plastics. Polym. Plastics
Technol and Eng. 34, 41-42.
Reginatto, V. Avaliação do ensaio de toxicidade com a alga Scenedesmus subspicatus
para o estudo de efluentes industriais. 1998. 263p. Tese (doutorado)- Universidade
Estadual de Campinas, Sao Paulo.
Rosa D. S., Chui Q.S.H., 2002. Avaliação da Biodegradação de poli-β-(hidroxibutirato-
co-valerato) e poli-e-(caprolactona) em solo compostado. Polímeros : Ciência e
Tecnologia 12, 311-317.
Siqueira, J. M., Bomm, M. D., Pereira N. F. G., 1998. Estudo Fitoquímico de unonopsis
lindmanii – annonaceae, biomonitorado pelo ensaio de toxicidade sobre a Artemia
salina leach. Química Nova, 21, 557-559.
Youn – Joo.,2006. A. Assessment of comparative toxicities of lead and copper using
plant assay. Chemosphere 8, 1359 – 1365.
Xu, X., Guo, S.A., 1995. A Study on morphological structure of low molecular weight
PVC prepared by vibromilling degradation. Polym. Plastics Techonol and Eng., 34,
621-632.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
58
Tabela 1: Crescimento bacteriano de Bacillus subtilis, formação de biofilme, proteínas
totais produzidas e pH, com 30 e 60 dias de incubação com tereftalato de polietilleno-
PET com tratamento físico ou não
PET
Crescimento
bacteriano
(UFC mL)
30d 60d
Biofilme (g)
30d 60d
Proteínas totais
(mg mL)
30d 60d
pH
30d 60d
Controle
UV 6h
UV 36h
T 35 ºC
T 50 ºC
3,8x10
7
9,2x10
7,4x10
7
5,7x10
7
5,3x10
7
8,4x10
7
9,1x10
7
9,1x10
7
4,3x10
7
7,6x10
7
0,0006
0,0012
0,0003
0,0005
0,0005
0,0003
0,0007
0,0003
0,0008
0,0004
32
42
14
12
16
46
28
52
28
8
8,40
8,11
8,41
8,51
8,02
8,57
8,09
8,60
8,05
8,35
*pH inicial 6,72 * Pré-inóculo= 5,9x10
2
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
59
Tabela 2: Peso inicial das partículas do tereftalato polietileno-PET, com e sem
tratamento com luz ultravioleta e temperatura, com biofilme e após a remoção do
biofilme, com 30 dias de incubação com o Bacillus subtilis
PET
Peso inicial da
partícula(g)
Partícula com
biofilme (g)
Partícula após
a remoção do
biofilme (g)
Perda de
massa das
partículas
(%)
Controle 0,1835 0,1841 0,1834 0,06
UV 6h
0,1706 0,1715 0,1705
0,06
UV 36h 0,1633 0,1636 0,1633 0
T 35ºC 0,1524 0,1527 0,1524 0
T50ºC
0,1550 0,1555 0,1549
0,07
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
60
Tabela 3: Peso inicial das partículas do tereftalato polietileno-PET, com e sem
tratamento luz ultravioleta e temperatura, com biofilme e após a remoção do biofilme,
com 60 dias de incubação com o Bacillus subtilis
PET Peso inicial da
partícula(g)
Partícula com
biofilme (g)
Partícula após
a remoção do
biofilme (g)
Perda de
massa das
partículas
(%)
Controle 0,1830 0,1836 0,1830 0
UV 6h 0,1706 0,1712 0,1706 0
UV 36h
0,1546 0,1551 0,1545
0,07
T35ºC 0,1524 0,1531 0,1524 0
T50ºC
0,1327 0,1331 0,1326
0,08
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
61
Tabela 4: Atividade enzimática detectada no líquido metabólico de Bacillus subtilis
com 30 e 60 dias de incubação com tereftalato de polietileno-PET tratado ou não
Tratamentos
Protease
(
mm)
30d 60d
Amilase
(mm)
30d 60d
Esterase
(mm)
30d 60d
Polifenoloxidase
(mm)
30d 60d
Controle
UV 6h
UV 36h
T 35 ºC
T 50 ºC
23
20
20
23
39
45
45
43
45
52
48
20
17
44
10
45
40
40
42
44
-
-
-
-
-
-
-
-
-
40
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
(-) negativo.
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
62
Tabela 5. Biofilme formado por Bacillus subtilis em partículas de tereftalato de
polietileno-PET, com e sem tratamento com luz ultravioleta e temperatura, após 60
dias de incubação
Tereftalato de polietileno-PET
Tratamentos
Peso inicial (g) Peso final (g) Biofilme (g) %
Controle
UV 6h
UV 36h
T 35
ºC
T 50 ºC
0,1835g
0,1672g
0,1633g
0,1682g
0,1550g
0,1838g
0,1679g
0,1636g
0,1690g
0,1554g
0,0003g
0,0007g
0,0003g
0,0008g
0,0004g
0,16
0,42
0,16
0,48
0,24
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
63
A B
C D
Figura 1. Microscopia Eletrônica de Varredura-MEV apresentando os biofilmes
formados por Bacillus subtilis nas partículas de PET, após 60 dias de incubação em
tereftalato de polietileno-PET, nas seguintes condições: A: e C - Controles (sem
tratamento); B: Tratamento com temperatura de 35ºC e D: Tratamento com 6 horas de
irradiação da luz ultravioleta-UV
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
64
00
30
10
00
10
20
10
15 15
5
10
25
55
30
20
15
0
10
20
30
40
50
60
Pl á st i c o
controle
UV 6h UV 36h T 35º C T 50º C Mei o NA
Tratamentos
Mortalidade (
%
25%
50%
75%
Figura 2. Toxicidade dos líquidos metabólicos livre de células após o contato contínuo
do Bacillus subtilis com tereftalato de polietileno-PET, com e sem tratamento com luz
ultravioleta e temperatura, após 60 dias de incubação, usando como bioindicador a
Artemia salina
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados.....
65
Tabela 6: CL
50
do teste de toxicidade com Artemia salina, com 30 dias de incubação
do Bacillus subtilis com tereftalato de polietileno-PET com e sem tratamento com luz
ultravioleta e temperatura
PET CL
50
(%) Faixa de variação (%) Intervalo de
confiança (%)
Controle 62,52 52,69 e 81,47 95
UV 6h 62,24
44,73 e 83,83 95
UV 36h - - -
T35ºC
54,33
43,43 e 67,35 95
T50ºC
45,74
37,85 e 55,27 95
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
66
CAPÍTULO 3
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
67
Segundo Artigo
Tratamentos com UV e temperatura em tereftalato
de polietileno mediando mudanças poliméricas,
colonização e detecção de enzimas por
Phanerochaete chrysosporium
Manuscrito a ser submetido para publicação em:
Brazilian Journal Microbiology
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
68
TRATAMENTOS COM UV E TEMPERATURA EM
TEREFTALATO DE POLIETILENO COMO INDUTOR DO
PROCESSO DE COLONIZAÇÃO E PRODUÇÃO DE
ENZIMAS POR PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM
Alicia Maria Andrade Torres Jara, Marta Cristina de Freitas da Silva, Norma Suely
Evangelista, Lívia Cordi e Galba Maria Campos- Takaki*
Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais , Universidade Católica de Pernambuco.
Rua Nunes Machado, 42- Boa Vista. 50050-590 Recife, Pernmabuco, Brazil.
_________________________________________________
ABSTRACT
To select polyethylene terephtalete-degrading conditions of UV and temperature,
mediated colonization of Phanerochaete chrysosporium and the study of enzymes
detection and evaluation the toxicity of the products of degradation.A ligninolytic
Phanerochaete chrysosporium strain was used UCP (from culture collection of Nucleus
of Research in Environmental Sicences, Catholic University of Pernambuco, Recife, PE,
Brazil) utilized high-density polyethylene terephtalate treated with u.v.(2 and 12 hours),
and temperature (35 and 50
o
.C) as the carbon source. Incubation of P. chrysosporium
(30 and 60 days) added its gravimetric weights of 0,78% of biofilm. Biodegradation by
u.v. and temperature oxidized the polymer when increasing the irradiation time or the
temperature exposition. Colonization of P. chrysosporium and enzymes (protease,
amylase, and esterase) were formed during stress conditions (u.v. 12 hours and
temperature (50
o
.C), and showed high toxicity to Artemia salina. This study demonstrates
that polyethylene terephtalate – considered to be inert- can be biodegraded by P.
chrysosporium strain. The maximum of biodegradation was obtained with 50
o
.C of
temperature, and probably was affecting the polymer chemical structure
Key words: biodegradation, Phanerochaete chrysosporium, UV photo-oxidation,
temperature.
INTRODUÇÃO
Hoje, o consumo da sociedade demanda a manufatura de milhões de produtos de
plásticos, sendo não degradáveis são amplamente empregados nas indústria de um
modo geral e na agricultura. Aproximadamente cem milhões toneladas de plásticos são
Correspondece to: Galba Maria de Campos-Takaki, Nucleus of Environmental Sciences,
Catholic University of Pernambuco. Rua Nunes Machado, 42- Boa Vista. 50050-590
Recife, Pernmabuco, Brazil. Phone/FAX/E.mail: 55 81 21194014/ 21194043/
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
69
produzidos em todo o mundo por ano, correspondendo a 40 toneladas de plásticos por
pessoa, por ano. Entre 30 e 42% dos plásticos produzidos são usados para empacotar
(22).
Os plásticos para empacotamento e os destinados para garrafas de polietileno
tereftalato (PET) produzem uma quantidade significante de resíduos municipais. A
grande quantidade de resíduo da garrafa PET faz parte de uma significante demanda
dos produtos recicláveis, e cada vez mais a reciclagem dessas garrafas ganham maior
atenção, devido à preservação ecológica e no sentido de obter produtos com maior valor
agregado ( 27, 8 ).
Assim, o PET vem sendo considerado o polímero mais importante com uso
também para produção de fibras sintéticas, onde a produção mundial de fibras foi de
33,6 milhões de toneladas, atingindo apenas 55% do mercado ( 7 ).
O PET é um polímero não degradável, resistente a hidrólise, inócuo para
humanos, contudo é visto como material acumulativo em grandes volumes, com alta
resistência na atmosfera aos agentes biológicos. Neste sentido, uma possível solução
para evitar este problema seria a criação de polímeros biodegradáveis (20) e ou o
desenvolvimento de processos capazes de mineralizar os plásticos, de modo a reduzir o
seu tempo de permanência nos aterros sanitários, minimizando assim o acúmulo no
ambiente.
Entre os agentes biológicos empregados para a degradação dos plásticos
ressaltam-se os microrganismos lignocelulolíticos, considerando a produção enzimática
que tem um alto potencial biotecnológico, e consequentemente, uma grande variedade
de aplicações, incluindo produtos químicos, proteínas, ração animal ( 2, 4, 15 , 19 ).
O Phanerochaete chrysosporium pertence a classe dos Basidiomycetes, do grupo
dos fungos da podridão branca e tem sido um dos microrganismos mais bem estudados,
considerando a sua produção de enzimas da família lignolíticas ( 6, 23, 9, 12, 24).
O presente trabalho foi realizado usando a irradiação UV (6 e 36 horas) e
temperatura (35º.C e 50º.C) nas partículas de PET, no sentido de alterar algumas
propriedades físicas e químicas estrutura do tereftalato de polietileno (PET), facilitando a
colonização do Phanerochaete chrysosporium na perspectiva de promover o processo
de biodegradação, seguido de detecção das enzimas (polifenoloxidases, esterases,
proteases e amilases), envolvidas com a degradação do polímero, além de avaliar,
modificação do pH, proteínas totais e a toxicidade dos produtos formados, com o objetivo
de contribuir para um maior conhecimento sobre a biodegradação do PET.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
70
MATERIAIS E MÉTODOS
Linhagem fúngica e condições culturais
Neste trabalho foi utilizada a linhagem de Phanerochaete chrysosporium UCP
963, mantido no meio Sabouraud dextrose agar, à temperatura de 5ºC, gentilmente
cedido pelo Banco de Culturas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais da
Universidade Cátolica de Pernambuco – UNICAP, Recife, Pernambuco, Brasil. O P.
chrysosporium, foi crescido em placas de Petri contendo meio de cultura sólido Batata
Dextrose Ágar (BDA), da marca Merck, incubada à 28ºC durante 12 dias. Após o
crescimento, os esporos foram coletados em salina tamponada, contados até 10
7
esporos/mL em hemacitômetro, câmara de Neubauer labor optik, 0,0025mm
2
.
Polímero: tereftalato de polietileno
O polímero sintético utilizado foi o da garrafa PET. Foram cortados em partículas
de 20 x 20 mm, com espessura de 0,35 mm. Em seguida as partículas foram submetidas
aos seguintes processos físicos químicos: irradiação à luz UV por 6h (duas horas por
dia) e 36h (12 horas por dia), sendo a irradiação UV realizada na capela de fluxo laminar
onde a lâmpada de UV encontrava-se na altura de 40 cm. O tratamento com a
temperatura de 35ºC e de 50ºC, foram de 72h (3 dias consecutivos) em estufa. E
partículas de PET sem tratamento físico. As partículas de tereftalato de polietileno foram
previamente cortadas, pesadas e colocadas em placas de Petri, contendo álcool iodado
e deixadas em câmara de fluxo laminar, por 60 minutos, agitando-se ocasionalmente.
Em seguida, as partículas foram removidas para uma solução de etanol 70%,
permanecendo por 60 minutos, sob agitação no shaker (1). Os plásticos foram lavados
sob condições estéreis, secos, mantidos em dessecador até peso constante. Controles
(sem tratamento) foram preparados seguindo as mesmas condições.
Colonização do Phanerochaete chrysosporium em tereftalato de polietileno e
estimação da biomassa
Frascos de Erlenmeyers de 250 mL em duplicata, contendo 100 mL do meio
Sabourand, caldo e 0,02 – 0,50% de Tween 80, pH 5,0 foram inoculados com as
partículas de PET previamente cortadas, pesadas e desinfetadas como também com 5
mL de suspensão de 10
7
esporos/mL, correspondente a uma densidade óptica (D.O
600
)
de 0,5. Em seguida, os frascos foram mantidos sob agitação de 100 rpm, à temperatura
de 28ºC por um período de 30 e 60 dias. Após o crescimento, as amostras foram filtradas
em filtro Millipore de 0,22µm, separados partículas plásticas e líquido metabólico livre de
células, onde, a biomassa (determinada por gavimetria) foi colocada em frasco
previamente
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
71
tarados, submetidos ao processo de liofilização mantida em dessecador a vácuo, à
temperatura ambiente.
Remoção do biofilme: as partículas de PET foram removidas do Erlenmeyer e
lavadas com uma solução de dodecil sulfato de sódio a 2% (v / v) durante 4 horas. Em
seguida, lavadas por 5 vezes com água destilada até remoção total da solução. As
partículas de tereftalato de polietileno foram colocadas em papel de filtro e secas
overnight a 60ºC, sendo retiradas e colocadas em dessecador até peso constante. O
peso residual de tereftalato foi estimado em relação ao peso da partícula contendo o
biofilme. Do líquido metabólico foi determinado pH, foram realizados testes para
detecção de enzimas, conteúdo protéico e avaliação da toxicidade. O pH do líquido
metabólico livre de células foi medido utilizando-se um pHmetro Orion, modelo 310.
Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
Determinação das proteínas
-A concentração de proteínas nos biopolímeros
obtidos foi determinada segundo o método de Proteínas Totais, utilizando-se o kit
LABTEST Diagnóstica. O princípio dessa técnica consiste na reação das proteínas da
amostra com o biureto (hidróxido de sódio, 1,86 mol/L; tartarato de sódio e potássio 430
mM/L; sulfato de cobre, 120 mM/L e iodeto de potássio 300 mM/L), desenvolvendo uma
coloração roxa, proporcional à concentração de proteínas da amostra. As absorbâncias
da amostra e padrão são determinadas a 545 nm e a concentração de proteínas totais,
tendo uma solução de albumina como padrão.
Detecção de Atividade enzimática
Atividade esterase
: A detecção da atividade esterase foi realizada pelo método
descrito por (14), tendo Tween 80 como susbtrato. Discos de papel xarope de 6 mm
foram embebidos com 100 µm, depositados no centro da placa de Petri contendo o meio
para atividade esterase, incubadas à temperatura de 35º.C, sendo observadas a cada 24
horas até o aparecimento do halo púrpura ao redor do disco, medido e expresso em mm.
Atividade Amilase
: A detecção da atividade amilase foi realizada de acordo com a
metodologia de (11), tendo amido solúvel como substrato. Discos de 6 mm de papel
xarope, contendo 100 µm do líquido metabólico (controle e tratados), depositados no
centro da placa de Petri contendo o meio para atividade amilase, incubadas à
temperatura de 37º.C, sendo observadas a cada 24 horas, após a
coloração com lugol observou-se o aparecimento do halo transparente ao redor do disco,
medido e expresso em mm.
Atividade Protease
: A detecção da atividade de protease nos líquidos metabólicos
foi realizada de acordo a metodologia de (11), tendo gelatina a 2% como substrato.
Discos de 6 mm de papel xarope contendo 100 µm do líquido
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
72
metabólico (controle e tratados) foram colocados no centro da placa de Petri contendo o
meio para atividade protease, incubados à temperatura de 37º.C, sendo observados a
cada 24 horas, até o aparecimento do halo transparente ao redor do disco, medido e
expresso em mm.
Atividade de Polifenoloxidases
: A determinação da atividade feneloxidase dos
líquidos metabólitos foi realizada pelo método descrito por (3), tendo ácido gálico como
substrato. Discos de papel xarope de 6 mm contendo 100 µm do líquido metabólico
(controle e tratados) foram colocados no centro da placa de Petri contendo o meio para
atividade fenoloxidase, incubadas à temperatura de 37º.C, sendo observadas a cada 24
horas, até o aparecimento do halo marrom ao redor do disco, medido e expresso em
mm.
Efeito da toxicidade pelos metabólitos formados pela biodegradação do polietileno
tereftalato
Os testes de toxicidade foram realizados utilizando a metodologia de (18), nos
ensaios com 30 e 60 dias de incubação. Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram
transferidas para frascos contendo a amostra teste produtos oriundos da degradação do
tereftalato de polietileno, com diferentes concentrações (25, 50 e 75%), diluídas em 5 ml
de uma solução aquosa de sal marinho sintético (33,3g L). Teste controle foi realizado
contendo somente água salina. Os testes foram realizados em duplicata. A contagem
dos microcustaceos mortos e vivos foi realizada após 24 h de exposição. Para obtenção
das CL
50
e respectivos intervalos de confiança, utilizou-se o método de análise Trimmed
Spearman-Karber (26).
RESULTADOS e DISCUSSÃO
A tabela 1 apresenta os valores da biomassa do P. chrysosporium após 30 dias e 60
dias de incubação com as partículas do polímero, com e sem tratamentos físico.
Observou-se que ocorreu um aumento da biomassa que foi de 7317g/mL para as
partículas do PET com irradiação 36 horas com UV, em relação ao número inicial de
células do controle, após 60 dias de incubação.
O efeito das temperaturas 35ºC e 50 ºC no PET acarretaram uma redução na biomassa
fúngica, após 60 dias de incubação. Observou-se ainda, que apenas o PET tratado com
irradiação UV 2 à horas apresentou um número de células inferior 4945 g/mL no período
de 60 dias de incubação, quando comparados ao PET controle (sem tratamento).
Observou-se que após 30 e 60 dias de incubação o pH inicial foi aumentado para pH
>8,0 em todos os tratamentos, inclusive no controle, com exceção da partícula tratada
com irradiação ultravioleta por duas horas, sendo esses resultados superiores aos
apresentados por (17). Contudo, as partículas submetidos à irradiação com UV
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
73
apresentaram no período de 36h de tratamento um maior valor de pH de 8.99, após 30
dias de incubação, sendo diminuído para 8,06 após 60 dias, sugerindo uma provável
produção de metabólitos oriundos do processo de degradação (tabela 1). Com 30 dias o
plástico submetido temperatura de 35ºC apresentou uma alteração do pH, passando de
5,0 para 8.75, quando comparado ao controle.
Segundo a “American Standard for Testing and Methods” (1), as mudanças nas
propriedades elétricas dos plásticos ocorrem devido, principalmente, ao crescimento
microbiano na superfície do plástico, estando associado à umidade e as mudanças do
pH, provavelmente, causadas pela degradação química do PET ou pela formação de
metabólitos secundários.
Com relação as proteínas totais produzidas no liquido metabólico com 30 e 60 dias de
incubação ocorreu uma grande diminuição da quantidade de proteínas totais no período
de 60 dias, exceto para o tratamento com irradiação UV 6h. O conteúdo de proteínas
totais mostrou redução (520 mg/ mL), com o polímero tratado com irradiação UV por 36h,
sugerindo uma possível degradação mediante o processo de irradiação.
Nas tabelas 2 e 3 observam-se o peso inicial das partículas, peso com biofilme e peso
após a remoção do biofilme, indicando a porcentagem de perda de massa nas partículas
do PET tratado ou não com processos físicos, após a colonização do Phanerochaete
chrysosporium.
Pode-se verificar na tabela 2 que tanto a partícula com irradiação UV 36h e com
temperatura de 50ºC, apresentaram valores de perda de massa polimérica de 0,1%,
sendo estes resultados inferiores aos apresentados por (21) onde utilizou o mesmo
microrganismo com perda de 0,48% após 30 dias de incubação.
Todas as partículas de PET apresentaram decréscimo em sua massa polimérica após 60
dias de incubação exceto a partícula com tratamento de temperatura com 35ºC. Pode-se
verificar na tabela 3 que a partícula tratada com temperatura de 50ºC, apresentou o
maior valor (0.1%) de perda de massa do PET.
Produção de enzimas por P. chrysosporium versus degradação do PET
Nos experimentos realizados com P. chrysosporium observou-se a produção de
enzimas hidrolíticas (protease, amilase e esterase) e enzimas polifenoloxidase, todas
envolvidas com o processo de degradação de plásticos (tabela 4).
A atividade proteasica produzida pelo P.chrysosporium de uma forma geral
apresentou halos entre 25 a 50 mm, após 60 dias de incubação, contudo, o polímero
tratado com temperatura de 35ºC apresentou menor halo neste mesmo período de
tempo. Com 60 dias de incubação que o maior halo foi de 50mm, referente ao tratamento
com a temperatura à 50ºC. A enzima protease produzida pelo P. chrysosporium na
superfíce do
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
74
PET tratadas com temperatura foi mais expressiva, comparando ao controle. Porém com
30 dias de incubação o tratamento com UV por 16h não apresentou formação de halo
(tabela 4).
Resultados semelhantes também foram observados com a amilase cujos halos
variaram de 20 a 50mm de uma forma geral, com 30 e 60 dias de incubação. O
tratamento com a temperatura de 50º.C foi indutor para a produção de amilase, sendo o
maior halo com 50mm, contudo, para o controle, observou-se halo apenas de 35mm,
após 60 dias de incubação.
A enzima esterase foi detectada apenas no período de 30 dias de incubação. Os halos
variaram de 19 mm a 48 mm. Ressalta-se que resultados semelhantes também foram
observados em relação ao tratamento com a temperatura de 50ºC onde apresentou o
maior halo com 48mm. Os resultados obtidos demonstraram que quando o
microrganismo colonizava o polímero com tratamento expressou atividade esterase
(tabela 4). A esterase tem sido descrita pela literatura como uma enzimas hidrolítica
envolvida com o processo de degradação do PET (7). Essas informações da literatura
estão de acordo com os resulatdos obtidos para P. chrysosporium e sugerem uma
possível degradação do PET nas condições estudadas. Segundo (21) em seu trabalho
ocorreu alterações estruturais do PET causadas pelo crescimento dos microrganismos
estudados dentre os quais o Phanerochaete chrysosporium e produção de enzimas
lignolíticas.
Considerando que P. chrysosporium trata-se de um fungo lignolítico as polifenoloxidases
apresentaram halos que variaram de 30 a 40 mm, em 30 e 60 dias de incubação.
Observou-se que o maior halo (40 mm) foi com o tratamento à temperatura de 35ºC.
Com o tratamento com irradiação UV por 36 horas foi detectada a produção de
polifenoloxidase em ambos os períodos de tempo (tabela 4).
Segundo (25), a enzima polifenoloxidase, apresenta uma ampla especificidade para
compostos aromáticos que contem grupos hidroxila e amino. Visto que a lignina contém
vários grupos fenólicos e hidroxila. Assim, a literatura tem sugerido que as
polifenoloxidases possuem uma importante função na degradação da lignina, e por
conseguinte, apresentam habilidade para degradar compostos com anéis aromáticos,
inclusive plásticos (16).
Degradação do PET Toxicidade dos metabólitos formados por P. chrysosoporium
Ensaios de toxicidade usando Artemia salina nas amostras da simulação da
biodegradação do PET com e sem tratamento de 6 e 36 horas com exposição a
irradiação ultravioleta e temperatura de 35 ºC e 50ºC, após 30 dias de incubação, foram
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
75
realizados afim de determinar a toxicidade dos metabólicos secundários. Observou-se
uma porcentagem de mortalidade, quando comparados aos controle contendo apenas
água salina sintética. O ensaio com UV 6h demonstrou maior toxicidade, com percentual
de mortalidade entre 10 a 45%. Com temperatura de 35ºC observou-se uma mortalidade
de 10% tanto na concentração de 25% como na de 50% (figura 1). A CL
50
das amostras
(concentração que causa 50% de mortalidade) com seus respectivos coeficientes de
confiança mínimo e máximo foram calculados pelo método Trimmed Spearman-Karber
(26). A maior CL
50
foi apresentado para o ensaio UV 36h (75% v.v
-1
), seguido do controle
(58, 77 v.v
-1
) e T 50ºC (51,42% v.v
-1
).
A CL
50
das amostras com 60 dias de incubação foi calculada segundo este método, onde
a amostra controle apresentou uma CL
50
de 54,68 % (v. v
-1
), com uma faixa de variação
de 46,16 e 64,77%, para um intervalo de confiança de 95% (tabela 5).
Com o tratamento da luz ultravioleta por 2 horas observou-se uma CL
50
foi de 54,20%
(v.v
-1
), com uma faixa de variação de 47,79 e 61,41%, para um intervalo de confiança de
95%, sendo um valor aproximado ao controle. Contudo, com 36h, não foi possível ser
calculada segundo este método, uma vez que apresentou baixo percentual de
mortalidade (tabela 5).Para o tratamento com a temperatura de 35ºC o valor da CL
50
foi
de 49,15% (v. v
-1
), com uma faixa de variação de 40,72 e 59,33%, para um intervalo de
confiança de 95%.
No entanto, com a temperatura de 50ºC observando-se um valor da CL
50
de 42,10%
(v.v
1
) e faixa de variação de 32,63 a 54,32%, para um intervalo de confiança de 95%
(tabela 3). Observou-se ainda, que o controle (contendo apenas água do mar e Artemia),
não indicou que as larvas foram afetadas, validando assim a condição dos experimentos.
Em estudos recentes, (13) apontaram para a importância da manutenção do pH em
ensaios de toxicidade e sugeriram o uso de tampão HEPES para realização do
ensaio de toxicidade com daphinias. O uso do mesmo tampão foi sugerido para a cultura
da alga verde Ankistrodesmus convolutus utilizada nos ensaios de daphinias. (5)
estudando a biotoxicidade de um resíduo industrial têxtil usando P. aeruginosa,
observaram que a toxicidade das amostras analisadas foram reduzidas para aquelas
amostra controle (sem tratamento), sugerindo que durante a incubação, produtos
intermediários ou mais tóxicos não foram formados.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem o apoio financeiro da FINEP, CNPq e CAPES (bolsa PROCAD).
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
76
RESUMO
Selecionar e degradar o polietileno tereftalato nas condições de UV e temperatura,
mediante a colonização do Phanerochaete chrysosporium e o estudo da detecção e
avaliação da toxicidade dos produtos por enzimas . O Phanerochaete chrysosporium
UCP (da coleção de cultura do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais,
Universidade Católica de Pernambuco, Recife, PE, Brasil) utilizando o tereftalato de
polietileno de alta densidade tratado com UV (2 e 12 horas), e temperatura (35ºC e 50ºC)
como a fonte de carbono. Incubação do Phanerochaete chrysosporium (30 e 60 dias)
adicionados a seus pesos por gavimetria de 0,78% de biofilme. A biodegradação por UV
e temperatura oxidou o polímero quando aumentou o tempo de irradiação ou a
exposição da temperatura. A Colonização do P. chrysosporium e enzimas (protease,
amilase, e esterase) foram formadas em condições de tensão (UV 12 horas e
temperatura (50ºC), e demonstrou alta toxicidade a Artemia salina. Este estudo
demonstra que o tereftalato de polietileno considerou estar inerte pode ser biodegradável
através do P. chrysosporium. O máximo da biodegradação foi obtido com a temperatura
de 50ºC, e provavelmente estava afetando o polímero da estrutura química.
Palavras-chaves: biodegradação, Phanerochaete chrysosporium, irradiação UV,
temperatura.
REFERÊNCIAS
1. American Society for Testing Materials. (1985). ASTM standards on materials and
environmental microbiology. American Society for Testing Materials. Philadelphia, Pa, pp
178 –180.
2. Bhat, M.K.; Bhat, S. (1997). Cellulose degrading enzymes and their potential Industrial
applications. Biotechnol Adv .,15, 583 – 620.
3. Conceição, D.M.; Angelis, D.A.; Bidoia, E.D.; Angelia, D.F. (2005). Fungos
filamentosos isolados do Rio Atibaia, SP e refinaria de petróleo biodegradadores de
compostos fenólicos. Arq Inst Biol .,72, 99 –106.
4. Coughlan, M.P. (1985). The production of fungal and bacterial cellulases with comment
on their production and application. Biotechnol Genet Eng Ver .,13, 39 – 109.
5. El- naggar, M.A.; El-aasar, S.A.; Barakat, K.L. (2004). Bioremediation of crystal violet
using air buble bioreactor packed with Pseudomonas aeruginosa. Water Res., 38,4313-
4322.
6. Fenn, P.; Kirk, T.K. (1981). Relationship of nitrogen to the onset and suppression of
ligninolytic activity and secondary metabolism in Phanerochaete chrysosporium. Arch
Microbiol .,130, 59 – 65.
7. Fischer-Colbrie, G.; Heumann, S.; Liebminger, S.; Almnsa, E.; Cavaco-Paulo, A.;
Geotg, M.G. (2004). New Enzymes with Potential for PET Surface Modification.
Biocatalysis and Biotransformation .22, 341 – 346.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
77
8. Franchetti, S.M.M.; Marconato, J.C. (2006). Polímeros Biodegradáveis – Uma solução
parcial para diminuir a quantidade dos resíduos plásticos. Química nova., 29, 811 – 816.
9. Giardina, P.; Palmieri, G.; Scaloni, A.; Fontanella, B.; Faraco, V.; Cennamo, G.;
Sannia, G. (1999). Protein and gene structure of a blue laccase from Pleurotus ostreatus.
Biochem J ., 34, 655 – 663.
10. Hadad, D.; Geresh, S.; Sivan, A. (2005). Biodegradation of polyethylene by
thermophilic bacterium Brevibacillus borstelensis. Journal of Applied Microbiology., 98;
1093 – 1100.
11. Hankin, L.; Anagnostakis, S.L. (1979). The use of solid media for detection of ezymes
production by fungi. Mycologia .,67, 597 – 607.
12. Horward, R.L.; Masoko, P.; Abotsi, E. (2003). Enzyme activity of a Phanerochaete
chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from
Escherichia coli. African Journal of Biotechnology ., 2, 296 – 300.
13. Keating, K.; Caffrey, P.B.; Dagbusan, B.C. (1996). Buffers in daphnid culture and
bioassay. Environ Toxicol Chem .,15, 348-352.
14. Kitancitaroen, N.; Hatai, K. (1998). Some biological characteristics of fung isolated
from salmonial eggs. Mycoscience .,39, 249 – 255.
15. Kotchoni, O.S.; Shonukan, O.O.; Gachomo, W.E. (2003). Bacillus pumilus BpCRI 6, a
promising candidate for cellulase production under conditions of catabolite repression. Afr
J Biotechnol .,2, 140- 146.
16. Lee, B.; Pometto III, A.L.; Fratzke, A.; Bailey, J.R.T.B. (1991). Biodegradation of
Degradable Plastic Polyethylene. Phanerochaete and Streptomyces spects. Applied and
Environmental Microbiology .,57, 678-685.
17. Mangiarotti, A.M.; Caretta, G.; Nelli, E. Piontelli, E. (1994). Biodeterioro de materiales
plásticos por microhongos. Boletim Micológico .,9, 39 – 47.
18. Mc Laughlin, J.L.; Saizarbitoria, T.C.; Anderson, J.E. (1985).Tres biosensayos
simples para quimicos de produtos naturales. Revista de la Sociedad Venezolana de
Química .,18, 13-18.
19. Ojumu, T.V.; Solomon, B.O.; Betiku, E.; Layokun, S.K.; Amigun, B. (2003). Cellulase
production by Aspergillus flavus Linn isolate NSPR 101 fermented in sawdust, bagasse
and corncob. Afr J Biotechnol .,2, 150 – 152.
20. Okada, M.; Okada, Y.; Tao, A.; Aoi, K. (1996). Polymerization of oxazolines. Prog
Polym Sci., 21,151-208.
21. Reyes, L.F. (2003). Estudo da degradação de polietileno tereftalato (PET) por fungos
basidiomicetos ligniolíticos. Tese de Doutorado. Campinas, São Paulo, 104 p.
22..Stevens, E.S. (2002). Green Plastics: An Introduction to the New Science of
Biodegradable Plastics. NJ: Princeton University Press.
23. Tien, M.; Kirk, T.K. (1983). Lignin – degrading enzyme from enzyme from
hymenomycete Phanerochaete chrysosporium. Science., 221, 661 – 663.
24. Ubhayasekera, W.; Munoz, I.G.; Vasella, A.; Stahlberg, J.; Mowbray, S.L. (2005).
Structures of Phanerochaete chrysosporium Cel7D in complex with product and
inhibitors. FEBS Journal .,272, 1952 – 1964.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
78
25. Youn, H.D.; Hah, Y.C.; Kang, S.A. (1995). Role of laccase in lignin degradation by
white- rot fungi. FEMS Microb Lett .,132, 183-188.
26. Youn – Joo, A. (2006) .Assessment of comparative toxicities of lead and copper using
plant assay. Chemosphere .,8, 1359 – 1365.
27. Zope, V.S.; Mishra, S.; Patil, V.S.; Agrawal, K.K.; Mahajan, J.P.; Firke, S.A. (2003).
Studies of Degradation of Waste Poly (ethylene terephthalate) using Autoclave
Technique. IE(l) Journal-CH., 84, 44 - 46.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
79
Tabela 1: Crescimento fúngico de Phanerochaete chrysosporium, formação de biofilme,
proteínas totais produzidas e pH, com 30 e 60 dias de incubação com tereftalato de
polietilleno-PET com tratamento com luz UV e temperatura
PET Biomassa (g /L)
30d 60d
Biofilme (g)
30d 60d
Proteínas totais
(mg/mL)
30d 60d
pH
30d 60d
Controle
UV 6h
UV 36h
T 35 ºC
T 50 ºC
7494
8140
6460
7188
6278
5304
4945
7317
5934
6202
0,0002
0,0001
0,0002
0,0002
0,0000
0,0001
0,0002
0,0001
0,0003
0,0002
600
240
760
560
160
560
440
240
320
80
8,58
8,50
8,99
8,75
8,66
8,36
7,56
8,06
8,04
8,30
*pH inicial 5,0 * Pré-inóculo= 10
7
esporos/mL
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
80
Tabela 2: Peso inicial das partículas do tereftalato polietileno-PET, com e sem
tratamento luz UV e temperatura, com biofilme e após a remoção do biofilme, com 30
dias de incubação com o Phanerochaete chrysosporium
PET
Peso inicial da
partícula(g)
Partícula com
biofilme (g)
Partícula após
a remoção do
biofilme (g)
Perda de
massa das
partículas
(%)
Controle 0,1746 0,1748 0,1745 0,06
UV 6h 0,1760 0,1761 0,1760 0
UV 36h
0,1662 0,1663 0,1660
0,1
T 35ºC 0,1726 0,1727 0,1726 0
T50ºC
0,1442 0,1443 0,1440
0,1
*Controle: partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
81
Tabela 3: Peso inicial das partículas do tereftalato polietileno-PET, com e sem
tratamento luz UV e temperatura, com biofilme e após a remoção do biofilme, com 60
dias de incubação com o Phanerochaete chrysosporium
PET
Peso inicial da
partícula(g)
Partícula com
biofilme (g)
Partícula após
a remoção do
biofilme (g)
Perda de
massa das
partículas
(%)
Controle 0,1843 0,1844 0,1842 0,06
UV 6h 0,1760 0,1763 0,1759 0,06
UV 36h 0,1676 0,1677 0,1675 0,06
T 35ºC 0,1738 0,1740 0,1738 0
T50ºC
0,1443 0,1444 0,1441 0,1
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
82
Tabela 4: Atividade enzimática detectada no líquido metabólico de Phanerochaete
chrysosporium com 30 e 60 dias de incubação com tereftalato de polietileno-PET tratado
ou não com luz UV e temperatura
PET Protease (
mm)
30d 60d
Amilase (mm)
30d 60d
Esterase (mm)
30d 60d
Polifenoloxidas (mm)
30d 60d
Controle
UV 6h
UV 36h
T 35 ºC
T 50 ºC
48
44
-
-
38
47
40
43
25
50
40
20
33
38
48
35
38
35
30
50
-
19
40
-
48
-
-
-
-
-
-
34
35
40
-
20
-
30
-
-
(-) negativo
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
83
Figura 1. Toxicidade dos líquidos metabólicos livre de células após o contato contínuo do
Phanerochaete chrysosporium com tereftalato de polietileno-PET, com e sem tratamento,
após 60 dias de incubação, usando como bioindicador a Artemia salina
10
5
15
10
8
45
20
15
10
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
UV 6h T35 C Meio SAB
Tratamentos
Mortalidade (%)
25%
50%
75%
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84
Tabela 5:
CL
50
do teste de toxicidade com Artemia salina, com 30 dias de incubação do
Phanerochaete chrysosporium com tereftalato de polietileno-PET com e sem tratamento
com luz UV e temperatura
PET CL
50
(%) Faixa de variação
(%)
Intervalo de confiança
(%)
Controle 54,68 46,16 e 64,77 95
UV6 h 54,20 47,79 e 61,41 95
UV36 h - - 95
T 35ºC 49,15 40,72 e 59,33 95
T 50ºC 42,10 32,63 e 54,32 95
*Controle : partículas do PET sem tratamento físico
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
85
CAPÍTULO 4
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
86
CONCLUSÕES GERAIS
Os estudos realizados com a avaliação dos microrganismos Bacillus subtilis e P.
chrysosporium na degradação do tereftalato de polietileno evidenciam:
Ocorrência de uma fácil e rápida colonização dos microrganismos possibilitando o
fenômeno da biodegradação.
Confirmação de biofilme formados pelos microrganismos na superfície polimérica do PET,
com tratamentos físicos (UV e temperatura), como também, nas condições controle (sem
tratamento), através de microscopia eletrônica de varredura, sendo mais evidente nas
partículas tratadas.
Dentre os tratamentos utilizados a temperatura de 50º.C, demonstra maior perda de
massa polimérica do polietileno tereftalato (PET) tanto com B. subtilis como para o P.
chrysosporium.
Com relação às enzimas produzidas protease e esterase por B. subtilis, obteve melhores
resultados, a partícula tratada com temperatura de 50ºC em relação ao controle, cujas
enzimas apresentam uma co-participação na degradação do polímero.
Observa-se a alta atividade enzimática de protease, amilase, esterase e polifenoloxidases
por P. chrysosporium, onde a partícula de PET tratada com temperatura de 50ºC
mostraram melhores resultados em relação ao controle, no entanto essas enzimas estão
envolvidas na degradação de substancias químicas com núcleos aromáticos.
Os tratamentos físicos (UV e temperatura) auxiliam na redução da toxicidade
Os produtos formados pela degradação do PET por Bacillus subtilis apresentaram baixa
toxicidade para Artemia salina.
Jara, A. M. A. T. Biofilmes e enzimas sintetizados....
87
Ressalta-se que os produtos formados pela degradação do PET por P. chrysosporium
demonstram alta toxicidade para Artemia salina.
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