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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
RELAXAMENTO DO MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE RATO PELO EUGENOL
FELIPE CRESCÊNCIO LIMA
Fortaleza-2009
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1
Felipe Crescêncio Lima
RELAXAMENTO DO MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE RATO PELO EUGENOL
Orientador: Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso
FORTALEZA – 2009
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado Acadêmico em Ciências
Fisiológicas da Universidade Estadual do
Ceará como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Fisiológicas.
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Felipe Crescêncio Lima
RELAXAMENTO DO MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE
RATO PELO EUGENOL
Dissertação apresentada ao curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas
da Universidade Estadual do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de
mestre em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em ___/___/___ Conceito Obtido:
Orientador: Profº Dr. José Henrique Leal Cardoso
Banca examinadora:
Profº Dr. José Henrique Leal Cardoso
___________________________________________________________
Universidade Estadual do Ceará
Profª Drª Aline Alice Cavalcante Albuquerque
___________________________________________________________
Universidade Estadual do Ceará
Profº Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães
___________________________________________________________
Universidade Federal do Ceará
3
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida, pela minha família, pelos meus amigos, pelos momentos
alegres e principalmente pelos momentos de dificuldades os quais me deixam cada
vez mais forte.
Ao meu orientador. Profº Dr. José Henrique Leal Cardoso pelo acolhimento como
aluno e como pessoa no seu laboratório. Graças ao o que o senhor me ensinou e à
experiência acumulada no LEF muitas portas se abriram.
Aos meus pais, Francisco Roberto Bezerra Lima e Maria Luciene Crescêncio
Lima, meus mais ardentes torcedores. Graças a vocês tornei-me um homem de
bem e nenhum título acadêmico significará mais para mim do que esse que vocês
me proporcionaram.
À Helena, minha segunda mãe, que cuidou de mim e dos meus irmãos como se
fôssemos seus filhos. Nunca poderei pagar tanto amor, dedicação e sacrifício.
Aos meus irmãos, Roberto, Israel e Lílya, com cuja convivência mostrou-me que
superar as diferenças é também uma forma de se aproximar de Deus.
À minha namorada, amiga e companheira Daniele Trindade, um dos melhores
presentes que Deus colocou na minha vida. Obrigado do fundo do meu coração pela
compreensão, paciência e por acreditar no nosso amor.
Ao meu amigão José Ossian Filho, pela sua dedicação e fidelidade á nossa
amizade, e pela imensa ajuda com a correção dessa dissertação.
Ao amigo, que eu escolhi como irmão (“meu brother”), Matheus Fontenelle, pelas
inúmeras vezes que você me apoiou e incentivou. “Vocês não se conheceram por
acaso”. Essa frase marcou para sempre a minha vida.
A uma especialíssima amiga, Dieniffer Peixoto Neves, por sua importantíssima
contribuição científica. Seu exemplo de determinação me encorajou nos momentos
mais difíceis desse trabalho.
À amiga Maria Diana Moreira Gomes (Didica), pelos conselhos, pelo apoio pela
ajuda nos experimentos e principalmente por se preocupar verdadeiramente comigo.
Sua amizade é muito importante para mim e vou fazer de tudo para continuar
merecendo-a.
À amiga Raquel Felipe, por compartilhar experiências de vida e por proporcionar
momentos de muita alegria na minha vida.
À professora Andrelina Noronha Coelho de Souza, pelos sábios ensinamentos e
pela pronta disponibilidade a colaborar com este trabalho.
4
Ao Professor Saad Lahlou, cuja contribuição foi valiosíssima para abrilhantar esse
trabalho.
À Mirizana Alves de Almeida, pelos preciosos ensinamentos os quais me
prepararam para esse momento.
Ao Pedro Militão de Albuquerque Neto, por manter o LEF em perfeitas condições
para a realização dos experimentos. Obrigado também meu amigo, pelas alegrias e
pelas lágrimas, você me ensinou muito, me ensinou coisas que não se aprendem
em livros.
Ao Francisco José Ferreira dos Santos (Franck), meu amigo e parceiro, pela
constante disponibilidade para ajudar. Essa vitória também é sua.
Aos colegas de trabalho e amigos do LEF que de alguma forma contribuíram para a
realização desse trabalho.
Aos amigos Tiago Olinda, Jô Malveira, Michel Kamimura, Rachel Pinho, Kátia
(Molécula), Alcyvânia, Jeferson Falcão, Samara e demais amigos que conquistei
nesse período. Todos de alguma forma me ajudaram com seu apoio e incentivo.
Ás instituições, CAPES, CNPq e FUNCAP cujo apoio financeiro possibilitou a
realização deste trabalho.
5
Dedico este trabalho aos meus pais
Francisco Roberto Bezerra Lima e
Maria Luciene Crescêncio Lima
6
SUMÁRIO
Página
Lista de figuras
08
Lista de tabelas
10
Lista de abreviaturas
11
Resumo
13
Abstract
15
INTRODUÇÃO
16
CONSIDERAÇÕES GERAIS
16
MÚSCULO LISO
17
Estrutura e função
17
Mecanismo de contração e de relaxamento
18
MÚSCULO LISO DAS VIAS AÉREAS
22
PRODUTOS NATURAIS
23
EUGENOL
24
Características fisico-químicas
25
Atividades biológicas e farmacológicas
26
RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
30
OBJETIVOS
31
Objetivo Geral
31
Objetivos específicos
31
MATERIAL E MÉTODOS
32
Animais
32
Sais e fármacos
32
Soluções
32
Preparação tecidual
33
7
Medida da resposta mecânica do músculo liso traqueal
34
Protocolos experimentais
36
Análise estatística
42
RESULTADOS
43
Efeito do eugenol sobre o tônus intrínseco da traquéia isolada
de rato
43
Efeito relaxante do eugenol sobre as contrações induzidas e
sustentadas por potássio em traquéia de rato.
46
Efeito relaxante do eugenol sobre as contrações induzidas e
sustentadas por carbacol em traquéia isolada de rato.
50
Efeito inibitório do eugenol em contrações induzidas por
estimulação de campo elétrico.
53
Curva concentração-efeito de acetilcolina em presença de
eugenol.
57
Efeito inibitório do eugenol em contrações induzidas por 60
mM de ACh em traquéia isolada de rato mantida em solução
isenta de Ca
2+
.
60
Efeito inibitório do eugenol sobre a contração induzida por
influxo de Ca
2+
em traquéia isolada de rato.
62
Efeito inibitório do eugenol sobre a contração induzida por
influxo de bário (Ba
2+
) em traquéia isolada de rato.
65
Efeito relaxante do eugenol sobre a contração induzida e
sustentada por éster de forbol na traquéia isolada de rato em
ausência ou presença de tapsgargina.
68
DISCUSSÃO
70
CONCLUSÃO
76
REFERÊNCIAS
77
8
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
1
Regulação da contração do músculo liso.
20
2
Relaxamento do músculo liso.
22
3
Estrutura molecular do eugenol.
24
4
Eugenia caryophyllus (Spr.) Merril et Harr.
25
5
Representação esquemática do sistema utilizado para registro
de contrações.
35
6
Representação esquemática dos eletrodos de estimulação de
campo elétrico.
35
7
Esquema ilustrativo da série 1.
37
8
Esquema ilustrativo da série 2.
37
9
Esquema ilustrativo da série 3.
38
10
Esquema ilustrativo da série 4.
39
11
Esquema ilustrativo da série 5.
40
12
Esquema ilustrativo da série 6.
41
13
Esquema ilustrativo da série 7.
41
14
Esquema ilustrativo da série 8.
42
15
Efeito do eugenol sobre o tônus intrínseco da traquéia isolada
de rato.
45
16
Efeito relaxante do eugenol sobre as contrações induzidas e
sustentadas por potássio em traquéia de rato.
47
17
Efeito relaxante do eugenol sobre as contrações induzidas e
sustentadas por carbacol em traquéia isolada de rato.
51
18
Efeito inibitório do eugenol em contrações induzidas por
estimulação de campo elétrico.
55
9
19
Curva concentração-efeito de acetilcolina em presença de
eugenol.
58
20
Efeito inibitório do eugenol em contrações induzidas por 60 mM
de ACh em traquéia isolada de rato mantida em solução isenta
de Ca
2+
.
61
21
Efeito inibitório do eugenol sobre a contração induzida por
influxo de Ca
2+
em traquéia isolada de rato.
63
22
Efeito do eugenol sobre a contrações induzidas por BaCl
2
extracelular.
66
23
Efeito relaxante do eugenol sobre a contração induzida e
sustentada por éster de forbol na traquéia isolada de rato em
ausência ou presença de tapsgargina.
69
10
LISTA DE TABELAS
Tabela
Página
1
Valores de EC
50
do relaxamento do eugenol em
traquéia de rato.
49
11
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP
Adenosina trifosfato
ATR
Atropina
[ Ca
2+
]
i
Concentração intracelular de cálcio
0Ca
2+
Solução de Tyrode isenta de cálcio
ACh
Acetilcolina
AMPc
Adenina monofosfato cíclico
ANOVA
Análise de variância
Ca
2+
Cálcio
CAPZ
Capsazepina
CARB
Carbacol
CE
50
Concentração que produz 50% do efeito máximo
CEUA
Comissão de ética para uso de animais
COBEA
Colégio brasileiro de experimentação animal
COX
Ciclooxigenase
DAG
Diacilglicerol
DBF
12,13-dibutirato de forbol
DPOC
Doença pulmonar obstrutiva crônica
ECE
Estimulação de campo elétrico
E
m
Potencial transmembrana
E.P.M.
Erro padrão da média
EGTA
Ácido etileno-bis (β-amino-etil-éter)-N,N,N’,N’-tetracético
GMPc
Guanosina monofosfato cíclico
GTP
Guanosina trifosfato
12
IND
Indometacina
IP
3
Trifosfato de Inositol
ISCB
Instituto superior de ciências biomédicas
KCl
Potássio
ĸDa
Quilo Dalton
MAOA
Monoamina oxidase A
MLCK
Cinase de cadeia leve de miosina
MLCP
Fosfatase de cadeia leve de miosina
MLVA
Músculo liso das vias aéreas
NANC
Não adrenérgico-não colinérgico
OMS
Organização Mundial da Saúde
PIP
2
Bifosfato de fosfatidilinositol
PKC
Proteína cinase C
PLC
Fosfolipase C
RESPIR 4-95
Análogo químico da capsazepina
RhoGEF
Fator de troca do nucleotídeo guanina-Rho
RhoK
Rho Cinase
ROC
Canal operado por receptor
SUS
Sistema único de saúde
TRPV1
Receptores transientes vanilóides do tipo 1
VOC
Canal operado por voltagem
rMLC
Cadeia leve regulatória da miosina
TM
Tyrode Modificado
13
RESUMO
Eugenol é um fenol monoterpenóide, encontrado como principal componente do óleo
do cravo da índia. O presente estudo visa avaliar o relaxamento do músculo liso
traqueal de rato pelo eugenol e os mecanismos pelos quais esse efeito ocorre.
Foram utilizadas preparações de traquéia isolada de ratos machos Wistar, mantidas
em Tyrode modificado, para registro isométrico das contrações musculares.
Concentrações crescentes e cumulativas (1 - 2000 µM) de eugenol não alteraram o
tônus basal, entretanto relaxaram de modo dependente de concentração as
contrações induzidas por KCl (80 mM) (CE
50
: 597,03 ± 60,6 µM) e por 1 µM de
carbacol (CE
50
: 571,31 ± 148,80 µM). A presença de 10 µM de capsazepina ou de 2
µM de indometacina não alterou significativamente os valores de CE
50
da contração
induzida por carbacol, entretanto em contrações induzidas pelo acoplamento
eletromecânico, a capsazepina reduziu os valores de EC
50
do relaxamento induzido
unicamente por eugenol de 597,03 ± 60,6 para 153,03 ± 28,52 µM. O eugenol
também foi capaz de inibir as contrações induzidas por Estímulo de Campo Elétrico
(ECE) (CE
50
: 842,3 ± 52,7 µM) e nem a presença de indometacina, nem a de
montelucaste (10 µM) alteraram significativamente essas EC
50
. Essa inibição
ocorreu também de modo significativo na curva concentração-resposta de
acetilcolina na presença de 1 mM de eugenol. Em meio isento de Ca
2+
contendo 0,2
mM de EGTA, 2 mM de eugenol inibiu toda a contração induzida por ACh. Em
presença ou ausência de 1 µM tapsigargina, o eugenol (300 – 2000 µM) relaxou
significantemente as contrações induzidas por dibutirato de forbol (DBF). A potência
farmacológica do eugenol para o relaxamento de contrações foi semelhante em
todos os mecanismos com exceção do bloqueio do mecanismo dependente de canal
de Ca
++
operado por voltagem (contrações induzidas por Ba
++
em meio isento de
Ca
++
e com 60 mM de [K
+
]), que foi mais potente do que mecanismos dependentes
de canais de Ca
++
operados por receptores. Em conclusão, o relaxamento induzido
pelo eugenol é provavelmente causado por bloqueio do canal de Ca++ operado por
voltagem. Com menor potência farmacológica o eugenol atua provavelmente
também ou através de vários outros mecanismos ou através de um único
mecanismo situado distalmente ao acoplamento excitação-contração nos
acoplamentos fármaco- e eletro-mecênico. Entretanto evidências diretas serão
necessárias para demonstrar esse efeito.
14
Palavras-chave: Acoplamento excitação-contração; eugenol; estimulação de campo
elétrico; miorrelaxante; músculo liso; traquéia isolada.
15
ABSTRACT
Eugenol, a phenol monoterpenoid, is the main component of clove oil. This study
aims to evaluate the relaxation of tracheal smooth muscle of rat by eugenol and the
mechanisms underlying these effects. We used preparations of trachea of male
Wistar rats maintained in aerated modified Tyrode to record isometric muscle
contractions. Increasing and cumulative concentrations (1 to 2000 µM) of eugenol did
not affect the basal tone, however relaxed in a concentration-dependent contractions
induced by KCl (80 mM) (EC50: 597.03 ± 60.6 mM) and by 1 µM of carbachol (EC50:
571.31 ± 148.80 µM). The presence of 10 µM of capsazepine or 2 µM of
indomethacin did not significantly alter the EC50 of the contraction induced by
pharmachomecnical coupling, however in the contractions induced by
electromechanical coupling, the capsazepine reduced the EC50 to 153.03 ± 28.52
µM. Eugenol was also able to inhibit contractions induced by electrical field
stimulation (EFS) (EC50: 842.3 ± 52.7 µM) and nor the presence of indomethacin,
neither of montelukast (10 µM) significantly altered these EC50. This inhibition was
also significant in concentration-response curve of acetylcholine in the presence of 1
mM of eugenol. In Ca
2+
-free medium containing 0,2 mM EGTA, 2 mM eugenol
inhibited completely the contraction induced by ACh. In the presence or absence of 1
µM thapsigargin, eugenol (300 to 2000 µM) significantly relaxed the contractions
induced by phorbol dibutyrate (DBF). The potency of eugenol for relaxation of
contractions was similar in all mechanisms except the of the mechanism activated by
voltage-dependent Ca
2+
channel, which was more potent than dependent
mechanisms of receptor-operated channels. In conclusion, the relaxation induced by
eugenol may be mediated by several mechanisms with the same potency, except for
that dependent of voltage-operated Ca
2+
channel, or through a direct interaction with
a later stage of contraction and common to all mechanisms.
Keywords: Excitation-contraction coupling; Eugenol; Electrical field stimulation;
Myorelaxing; Smooth muscle; Trachea.
16
INTRODUÇÃO
Considerações gerais:
Infecções no trato respiratório inferior, doença pulmonar obstrutiva crônica
(DPOC), tuberculose e câncer de pulmão estão entre as dez doenças que causam
mais morte no mundo (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002). A organização
Mundial de Saúde estima que para 2030, DPOC poderá ser a terceira responsável
por mortes causadas por doenças (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008)
Muitos são os determinantes que contribuem para as doenças respiratórias
crônicas, e entre estes se destaca a exposição direta ou indireta à fumaça do
tabaco, como principal fator de risco para desenvolvimento das mesmas. Outro
importante fator é a exposição à poluição do ar, seja por fontes domésticas (fogão a
lenha, por exemplo) ou ambientais (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002).
A Organização Mundial de Saúde lançou em 2006 no Brasil, um programa
para prevenir e controlar as doenças respiratórias na infância. Dados mostrados pela
entidade apontaram que 20% dos adolescentes tinham sintomas de asma e 20%
dos brasileiros eram afetados por doença respiratória crônica. Segundo o organismo
internacional, enfermidades como a asma e a DPOC entre outras, tenderiam a
crescer 30% em dez anos, caso medidas emergenciais não fossem adotadas.
(Agência Brasil, 2006).
As doenças respiratórias foram responsáveis por 11% do total de óbitos bem
definidos no Brasil no ano de 2003, perdendo apenas para doenças
cardiovasculares (32%) e neoplasias (15%). Segundo o Ministério da Saúde, essas
doenças crônicas não transmissíveis respondem pelos maiores gastos com atenção
médica no Sistema Único de Saúde (SUS), onde as doenças respiratórias
respondem pelo segundo lugar (Ministério da Saúde, 2009).
17
Enquanto muitos países adotam medidas preventivas para reverter esse
quadro, novos fármacos para o tratamento dessas doenças são sempre bem vindos,
funcionando assim como valiosos coadjuvantes.
Músculo liso:
Estrutura e função
Camadas de células musculares lisas estão presentes nas paredes de
vários órgãos e tubos no corpo, incluindo vasos sanguíneos, estômago, intestinos,
bexiga, vias aéreas, útero, corpos cavernosos, entre outros (BERNE et al., 2004).
Quando contraídas, as células musculares encurtam-se produzindo força ou
encurtamento, que por sua vez permite a motilidade (propulsão do quimo), alteração
das dimensões de alguns órgãos (diminuição do volume da bexiga) e a manutenção
da tensão (vasos sanguíneos) (BÁRANY, 1996). Deste modo, as células musculares
lisas são vitais para o bom funcionamento do organismo (SOMLYO; SOMLYO,
1994).
As células do músculo liso são fusiformes e mais curtas que as
esqueléticas. As estriações, tão bem caracterizadas no músculo esquelético e
cardíaco, não estão presentes. O túbulo T também não está presente, mas o
sarcolema, que representa 2 a 6% do volume celular, possui fileiras longitudinais de
pequenas bolsas denominadas cavéolas (BERNE et al., 2004).
O retículo sarcoplasmático existe, mas não apresenta a mesma
organização da encontrada no músculo esquelético. Em contraste com a
musculatura esquelética, o aparato contrátil não é organizado em miofibrilas e não
existem as linhas Z. O equivalente funcional seria os chamados “corpos densos”,
aos quais se fixam os filamentos finos. Portanto, não há sarcômero bem definido
(BERNE et al., 2004).
Sua inervação é feita geralmente pelo sistema nervoso autonômico. Nas
artérias, o músculo liso é inervado primariamente por fibras simpáticas, já em outros
tecidos pode possuir tanto inervação simpática quanto parassimpática (BERNE et
al., 2004).
18
Mecanismo de contração e de relaxamento
Tanto a contração quanto o relaxamento no músculo liso estão
relacionados, respectivamente, com o aumento e a diminuição da concentração
citoplasmática de cálcio. E, para que isso ocorra, é preciso que haja o acoplamento
excitação-contração, ou através de mecanismos que envolvem o potencial
transmembrana (acoplamento eletromecânico), ou por meios que independam do
potencial elétrico entre os lados da membrana, como por exemplo, pela ativação de
receptores por seus agonistas (acoplamento farmacomecânico) (SOMLYO;
SOMLYO, 1994 e 2000), ou por esses dois mecanismos juntos (SOMLYO;
SOMLYO, 1990).
O processo de contração da célula muscular lisa é regulado principalmente
por receptores e por ativação mecânica das proteínas contráteis miosina e actina.
Também pode ocorrer através de disparos de potenciais de ação ou ativação dos
canais iônicos da membrana plasmática dependentes de estiramento. Para a
contração ocorrer, a cinase de cadeia leve de miosina (MLCK) precisa fosforilar a
cadeia leve regulatória de miosina (MLCr), possibilitando deste modo a interação
molecular entre miosina e actina. A energia liberada do ATP pela atividade ATPase
da miosina resulta no ciclo das pontes-cruzadas da miosina com actina, gerando
assim a contração (WEBB, 2003).
O mecanismo de excitação-contração no músculo liso difere da encontrada
no músculo esquelético uma vez que, na segunda, a elevação da concentração
intracelular do Ca
2+
afeta a actina enquanto que na primeira, afeta a miosina. Além
disso, a fixação do Ca
2+
é feita com a calmodulina (ausente no músculo esquelético)
e não com a troponina C (presente no músculo esquelético e não no liso). O
complexo cálcio-calmodulina, por sua vez, é quem ativa a MLCK. O ciclo de ponte
de miosina no músculo liso é similar ao do músculo estriado, onde após a fixação ao
filamento de actina, a ponte cruzada sofre uma ação de alavanca, tracionando o
filamento fino em direção ao centro do filamento grosso gerando força (WEBB,
2003).
O estado de fosforilação da cadeia leve de miosina é regulado pela sua
fosfatase (MLCP), a qual é responsável por remover o fosfato altamente energético
19
da cadeia leve de miosina para promover o relaxamento do músculo liso. A fosfatase
em questão possui três subunidades: uma subunidade catalítica de 37 KDa, uma
subunidade variável de 20 KDa e uma subunidade que se liga à miosina de 110 a
130 KDa. Esta última, quando se encontra fosforilada (pela Rho Cinase), inibe a
atividade enzimática da MLCP fazendo com que a cadeia leve de miosina
permaneça fosforilada, favorecendo, assim, a contração (WEBB, 2003).
O relaxamento do músculo liso ocorre tanto pela remoção do estímulo
contrátil quanto pela ação direta de uma substância que inibe o mecanismo contrátil
(ex: fator atrial natriurético). Estes processos envolvem a redução dos níveis
intracelulares de Ca
2+
e o aumento na atividade da fosfatase de cadeia leve de
miosina (MLCP) (SOMLYO et al., 1999).
O potencial transmembrana (Em) das células do músculo liso varia entre -
40 a -70 mV. Alterações desse potencial a valores menos negativos
(despolarização) ou alterações na [K
+
] extracelular podem abrir canais de Ca
2+
dependentes de voltagem, causando influxo de cálcio e o conseqüente aumento da
sua concentração intracelular (SOMLYO; SOMLYO, 1994).
Outro mecanismo de contração do músculo liso, independente de potencial
transmembrana, envolve vários agonistas (neurotransmissores, hormônios e etc.),
que se ligam a receptores acoplados à proteína G heterotrimérica (Figura 1). Em
seguida a esta ligação, a célula responde com um aumento da atividade da
fosfolipase C (PLC) que produz dois segundos mensageiros potentes, oriundos do
lipídio de membrana fosfatidil-inositol 4,5-bisfosfato (PIP
2
). São eles: o diacilglicerol
(DAG) e o inositol 1,4,5-trifosfato (IP
3
) (WEBB, 2003).
20
Figura 1. Regulação da contração do músculo liso. Ca
2+
: cálcio; DAG: diacilglicerol; IP
3
:
trifosfato de inositol; MLCK: cinase da cadeia leve de miosina; PKC: proteína cinase; PLC:
fosfolipase C; PIP
2
: bifosfato de fosfatidilinositol; RhoGEF: fator de troca do nucleotídeo
guanina-Rho. Fonte: Webb, 2003.
O IP
3
liga-se a receptores específicos no retículo sarcoplasmático (RS),
liberando Ca
2+
do mesmo. Já o DAG, juntamente com o Ca
2+
, ativa a proteína
quinase C (PKC), que por sua vez fosforila proteínas. A elevação da [Ca
2+
]
i
é
passageira, e a resposta contrátil é mantida por um mecanismo sensível ao Ca
2+
promovido pela inibição da atividade da miosina-fosfatase, através de quinase de
Rho. A proteína Rho é uma proteína G monomérica que tem como enzima alvo a
quinase de Rho, uma quinase serina/treonina cuja ativação favorece a contração,
enquanto que sua inibição induz o relaxamento em segmentos isolados de músculo
liso contraídos por diferentes agonistas (WEBB, 2003).
Vários mecanismos de remoção do Ca
2+
citosólico envolvem diretamente a
membrana do citoplasma e a do RS. Como exemplo podemos citar a proteína Ca
2+
-
21
Mg
2+
-ATPase que, quando fosforilada, liga-se a dois íons Ca
2+
que serão
transportados para a face luminal do retículo (Figura 2). Além disso, na membrana
plasmática também contém Ca
2+
-Mg
2+
-ATPase, que provê um mecanismo adicional
para reduzir a concentração Ca
2+
na célula. Esta enzima difere da proteína do RS
por ter um domínio auto-inibitório que pode estar ligado a calmodulina, causando
excitação da bomba de Ca
2+
na membrana plasmática (WEBB, 2003).
O aumento da extrusão ou do seqüestro de Ca
2+
presumivelmente se dá
pela fosforilação das bombas de Ca
2+
dependentes de guanosina monofosfato
cíclico (GMP
c
). Outros mecanismos que contribuem para a diminuição da [Ca
2+
]
intracelular são: o aumento da atividade do trocador Na
+
/ Ca
2+
; a fosforilação das
pontes cruzadas e o aumento das concentrações celulares de adenosina
monofosfato cíclico (AMP
c
), levando ao aumento da probabilidade de abertura de
canais de potássio ativados por cálcio (K
Ca
) e canais de potássio ativados por ATP
(K
ATP
); o aumento de GMP
c
, levando a abertura de canais de K
+
, ambos produzindo
conseqüentemente hiperpolarização, que reduz a entrada de Ca
2+
pelos canais tipo
L (RAPAPORT et al., 1985; WORD et al, 1991; KARAKI et al.,1988; MAC DANIEL
et al, 1992; THORNBURY et al., 1991; ROBERTSON et al, 1993)
22
Figura 2: Relaxamento do músculo liso. Ca
2+
: cálcio; MLC: cadeia leve de miosina; Na
+
:
Sódio. Fonte: Webb, 2003.
Músculo liso das vias aéreas:
O músculo liso das vias aéreas (MLVA), presente na traquéia e na árvore
brônquica acima dos bronquíolos terminais, é um importante tecido envolvido na
regulação do tônus broncomotor, controlando o diâmetro das vias aéreas e a
resistência à passagem de ar. O tônus muscular é controlado por uma variedade de
sinais externos, que são traduzidos em trabalho útil através de proteínas contráteis
(GERTHOFFER, 1991). Evidências sugerem que o MLVA sofre modulação
fenotípica no desenvolvimento do pulmão, e em estado de doenças como a asma,
bronquite crônica e enfisema (ARMANI; PANETTIERI, 2003).
Uma característica marcante da traquéia é o número variável de peças
cartilaginosas do tipo hialino, em forma de C, cujas extremidades livres estão
voltadas para a região dorsal, próxima ao esôfago, apresentando feixes musculares
23
lisos, que também podem ser encontrados entre os anéis cartilaginosos. A traquéia
se divide nos dois brônquios fontes, que se divide repetidamente, de forma
dicotômica, até a 23
a
ordem de geração, os sacos alveolares. A parede da árvore
traqueobrônquica é caracterizada pela presença de cartilagem e glândulas que
desaparecem ao nível da 10
a
geração brônquica (BERNE et al., 2004).
O controle neural do músculo liso das vias aéreas é de grande interesse,
especialmente porque estes componentes neurais estão relacionados com doenças
respiratórias como a asma (BARNES, 2001). A asma, por sua vez, envolve uma fase
inicialmente broncoconstritora e uma fase tardia inflamatória, que se caracteriza por
uma hipersensibilidade das vias aéreas a vários estímulos físicos, químicos e
farmacológicos (BARNES, 1989). Como o MLVA é inervado por vários tipos de
nervos eferentes e sensoriais, ele se torna um campo vasto para pesquisa (FEDAN,
2001).
Segundo Fedan (2001), o estudo dos efeitos de neurotransmissores em
músculo liso de preparações isoladas de vias aéreas é acessível e pode ser
acompanhada virtualmente em qualquer preparação de via aérea. Estimulação com
corrente elétrica, do tipo estimulação de campo elétrico (ECE), da preparação
isolada da via aérea, poderá causar ativação de nervos intrínsecos e a liberação de
neurotransmissores e respostas do músculo liso para esses transmissores.
Produtos naturais:
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente
65 - 80% da população mundial em países em desenvolvimento, devido à pobreza e
a dificuldade de acesso à medicina moderna, dependem essencialmente das plantas
para seus cuidados com a saúde. Entretanto poucas plantas têm sido estudadas
cientificamente para assegurar sua qualidade, segurança e eficácia.
Desde tempos remotos, produtos naturais originários de plantas tem sido uma
importante fonte de agentes terapêuticos. Aproximadamente 25-30% de todas as
drogas avaliadas como terapêuticas são derivadas de produtos naturais (plantas,
micróbios e animais). Evidências recentes de companhias farmacêuticas mostraram
24
que, para algumas doenças complexas, produtos naturais ainda representam uma
fonte extremamente valorosa para a produção de novas entidades químicas.
(BOLDI, 2004; CLARDY; WALSH, 2004; KOEHN; CARTER, 2005).
Eugenol:
O eugenol (EUG), objeto de estudo desse trabalho, é um fenol
monoterpenóide (Figura 3) derivado do fenilpropano (BRUNETON, 1995;
TISSERAND; BALACS, 1995), obtido do fracionamento de óleos essenciais, os
quais são extraídos de diversas partes de muitas plantas (CRAVEIRO et al., 1981;
TISSERAND; BALACS, 1995; BRUNETON, 1995). O Nordeste do Brasil, por
exemplo, possui algumas plantas aromáticas que têm o EUG como um dos
principais constituintes de seus óleos essenciais (DALLMEIER; CARLINI, 1981; LIN
et al., 1999; HUANG et al., 1999; WU et al., 1994).
Dentre as plantas que possuem o EUG como constituinte destacam-se:
Eugenia caryophyllus (Spr.) Merril et Harr, o “cravo-da-índia”; Discipelium
cariophyllatum Ness., o “craveiro do Maranhão ou cravinho”; I Presl. quimiotipo
Eugenoliferum , a “canela-ceilão”; Pimenta dioica (L.) Merril; Croton zehntneri Pax et
Hoffm, a “canela-de-cunhã”, variedade Eugenoliferum; Ocimum gratissimum L.,
variedade Eugenoliferum, a “alfavaca-cravo” (CRAVEIRO et al., 1981).
Figura 03: Estrutura molecular do eugenol.
OH
OCH
3
eugenol
25
O teor de EUG no óleo essencial pode variar entre as espécies chegando,
por exemplo, a 88,5% do peso do óleo no caso do cravo-da-índia (Figura 04)
(CHAIEB et al, 2007a). Além disso, o EUG pode ter sua produção influenciada pela
luz solar, como foi constatado em folhas de Ocimum gratissimum, onde sua
produção passou de 98% às 12:00 para 11% às 17:00 (VASCONSELOS SILVA et
al, 1999).
A B
Figura 04: Eugenia caryophyllus (Spr.) Merril et Harr. A: Planta e B: cravos secos.
Características físico-químicas
Quimicamente o EUG é designado como 2-metóxi-4-(2 propenil) fenol
(MORRISON; BOYD, 1961) ou 4-alil-2-metóxi-fenol (SILVA, 1998) ou 2-metoxi-4-alil-
fenol. Seu peso molecular é de aproximadamente 164 g/mol (OLIVEIRA-FILHO et
al., 1975).
Em temperatura ambiente o EUG apresenta-se no estado líquido, incolor
ou levemente amarelado e com aspecto oleoso. Seu odor forte e aromático lembra o
cheiro de cravo-da-índia. Possui sabor ardente e picante, podendo causar irritação à
mucosa quando em contato. Dissolve-se completamente em clorofórmio, éter,
gorduras e álcool etílico (STICHT; SMITH, 1971). E graças a essa lipossolubilidade,
o EUG é capaz de penetrar as membranas biológicas e atingir alvos intracelulares
26
como as mitocôndrias (USTA et al., 2002), ou penetrar com rapidez a bainha de
mielina de uma fibra ou de um feixe nervoso (GURNEY, 1965).
O eugenol possui dose letal (DL
50
) alta (1.930 a 3.000 mg/kg em
camundongos e ratos) (STICHT; SMITH, 1971; OPDYKE, 1975) e um alto índice
terapêutico (IT), para muitos efeitos (DALLMEIER; CARLINI, 1983). O EUG pode ser
convertido metabolicamente em derivados farmacologicamente ativos (WEINBERG
et al., 1972). Segundo Hume (1988), seus efeitos farmacológicos dependerão da
concentração e do tempo de exposição e/ou de contato entre o EUG e as células.
Atividades biológicas e farmacológicas
Vários estudos apontam que o óleo essencial de cravo (Eugenia
caryophyllata) possui propriedades antioxidantes (CHAIEB et al, 2007b;
NAGABABU; LAKSHMAIAH, 1994), antimicrobiana (KALEMBA; KUNICKA, 2003),
antifúngica, anticonvulsivante (ZHENG et al., 1992), antiviral (KUROKAWA et al,
1995; HUSSEIN et al, 2000) e anticarcinogênica (ROMPELBERG et al 1993).
Por ser o constituinte majoritário do óleo essencial de cravo e por compartilhar
de algumas propriedades desse óleo, acredita-se que o EUG seja o responsável,
pelo menos em parte, por essas ações.
Sua propriedade antioxidante foi comprovada e reforçada recentemente por
um trabalho que relatou a capacidade do EUG, extraído de O. gratissimum, de
proteger macrófagos peritoneais contra efeitos tóxicos induzidos por nicotina,
através da redução de radicais livres (MAHAPATRA et al, 2009). Outros efeitos
como agente antimicrobiológico (BLASZYK; HOLLEY, 1998; VAZQUEZ et al, 2001)
bacteriostático e bactericida (WALSH et al, 2003), antivirótico (BENECIA;
COURRÉGES, 2000) e antifúngico (PINTO et al, 2009) são bastante relatados na
literuatura.
Dentre as espécies de bactéria cujo crescimento in vitro foi inibido pelo EUG
podemos citar: Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes, Pseudomonas
aeruginosa (HIMEJIMA; KUBO, 1992; KUBO, 1994), Clostridium sporogenes,
Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris,
27
Salmonella pullorum, Streptococcus faecalis e Comamonas terrigena (DEANS;
SVOBOBA, 1988).
Muitos dos efeitos do EUG mencionados na literatura podem ser
explicados pela sua alta relação estrutura-atividade (DALLMEIER; CARLINI, 1981;
CHAINY et al., 2000). Um trabalho, por exemplo, sugere que a atividade antifúngica
contra Candida albicans poderia ser tanto pela presença do anel aromático como
pela presença do grupo hidroxila fenol livre (TAMPIERE et al, 2005). Já outro
trabalho relacionou o grupo carboxila livre com o efeito inibitório da “monoamina
oxidase A” (MAOA) pelo eugenol, que por sua vez poderia explicar também a
atividade antidepressiva encontrada pelos autores (TAO et al, 2005).
A estrutura química do EUG é similar à da capsaicina, um agonista de
receptores vanilóides 1 (TRPV1). A Capsaicina causa dor por abrir canais TRPV1
em neurônios aferentes nociceptivos. Entretanto, a exposição à capsaicina produz
uma dessensibilização duradoura dos canais, os quais são a base para a analgesia
induzida por capsaicina (OHKUBO; SHIBATA, 1997).
O EUG exibe ação irritante, além do seu efeito analgésico (SNEDDON;
GLEW, 1973), assemelhando-se deste modo ao efeito da capsaicina (HOLZER,
1991; SZALLASI; BLUMBERG, 1999). Substâncias pungentes como piperina,
zingerina e capsaicina conservam uma estrutura química comum, uma parte
semelhante ao radical vanilil, o qual se acredita ser necessária para uma atividade
semelhante a da capsaicina (SZALLASI; BLUMBERG, 1999).
Como o EUG é um congênero natural da capsaicina, possuindo também
uma parte vanilil semelhante á capsaicina (SZALLASI; BLUMBERG, 1999), seu
efeito também poderia ser efetivado através dos receptores vanilóides 1 como a
capsaicina o faz em neurônios sensoriais (CATERINA et al., 1997).
Os trabalhos de Ohkubo e Kitamura (1997), e Ohkubo e Shibata (1997)
sugeriram que o EUG poderia produzir seu efeito via TRPV1. Isso foi confirmado por
Yang et al. (2003), que demonstraram que o EUG não somente ativava correntes
internas, como também aumentava a concentração interna de Ca
2+
em células
embrionárias humanas, cujos receptores TRPV1 foram expressos. No mesmo
trabalho, os autores demonstraram que esse efeito era prontamente inibido na
28
presença de capsazepina, um antagonista de TRPV1. Este trabalho demonstrou,
ainda, que o influxo de cátions através dos TRPV1 resultou na despolarização do
potencial de membrana, evocando, assim, o potencial de ação, e sugerindo que
esse poderia ser o principal mecanismo molecular pelo qual o eugenol produz ação
irritante.
Recentemente alguns trabalhos investigaram a participação do eugenol
em inibir correntes de cálcio (LEE et al, 2005), de sódio (PARK et al, 2006) e de
potássio (LI et al, 2007), ambos dependentes de voltagem, via participação de
TRPV1. Entretanto, a ativação desses receptores não foi pré-requisito para o efeito
inibitório do EUG em ambos os trabalhos.
O EUG é também descrito na literatura como um poderoso agente inibidor
competitivo da prostaglandina-sintetase, na faixa de 10
-5
a 10
-4
mol/L (DEWHIRST;
GOODSON, 1974; DEWHIRST; GOODSON, 1980). Thompson et al. (1989)
demonstraram que o EUG inibe, especialmente, a ciclooxigenase, (COX) e sugeriu
que esta inibição se deve à competição com o ácido araquidônico (AA) pelo sítio de
ação da prostaglandina-sintetase. Posteriormente, estudos mostraram que o EUG
era eficaz em inibir significativamente e de modo dependente de concentração, a
produção de Prostaglandina E
2
(PGE
2
) induzida por lipopolissacarídeo (KIM et al.,
2003; LEE et al, 2007). Esses autores demonstraram que o EUG suprimia a
expressão de COX-2 a um nível transcricional, contribuindo, portanto, para a
diminuição da produção de COX-2 e de PGE
2
.
O bloqueio da condução do potencial de ação em nervos periféricos e na
junção neuromuscular pelo EUG já era conhecido (BRODIN; ROED, 1984), quando
Leal-Cardoso et al. (2002) relataram, em músculo esquelético, que a capacidade do
EUG de bloquear o acoplamento excitação-contração era similar à potência de
bloqueio da excitabilidade nervosa e transmissão neuromuscular. No entanto, o
mesmo trabalho demonstrou que o EUG, em determinada faixa de concentração,
poderia induzir contrações, provavelmente por liberação de Ca
2+
do retículo
sarcoplasmático e/ou por um mecanismo relacionado com a presença de cátions
bivalentes no meio extracelular.
29
Trabalhos recentes relataram que o EUG atua tanto em sítios pré-
sinápticos quanto pós-sinápticos de neurônios, e que bloqueia correntes de Ca
2+
,
diminuindo o potencial de membrana de neurônios (SZABADICS; ERDÉLYI, 2005).
Além disso, alguns trabalhos apontam que o EUG (10
-4
a 10
-3
M) promoveu
vasodilatação reversível de artéria pré-contraída, tanto pela norepinefrina, quanto
por alta [K
+
]
e
e pela estimulação elétrica (STICHT; SMITH, 1971; HUME, 1983;
NISHIJIMA; KUNOKAWA, 1999).
O EUG mostrou-se eficaz em relaxar o tônus basal de íleo, e em inibir as
contrações induzidas por ligante-receptor, ou por outros mecanismos, além de
contrações induzidas por acetilcolina em soluções isentas de Ca
2+
(0.2 mM EGTA),
ou em presença de nifedipina (10 µM). Isso sugere que o EUG promove um efeito
antiespasmódico miogênico, ou seja, induz relaxamento diretamente nas células
musculares lisas (LEAL-CARDOSO et al., 2002).
Lima et al. (2000) sugeriram que o metil-eugenol, um análogo do eugenol,
relaxava íleo isolado e inibia contrações induzidas por estimulações de canais
operados por receptores e canais operados por voltagem. Damiani et al. (2003)
sugeriram que o EUG atuava como antagonista de Ca
2+
, inibindo contrações
induzidas por ativação de canais de cálcio operados por voltagem e também por
receptor.
30
Relevância e justificativa
De acordo com o que foi visto anteriormente neste trabalho, o eugenol é
uma molécula biologicamente ativa, responsável por vários efeitos dos quais, alguns
continuam sem explicação, como é o caso do relaxamento do músculo liso traqueal.
Portanto, acreditamos que esse estudo possa nos levar a um melhor entendimento
do seu mecanismo de ação ou à descoberta de novos mecanismos fisiológicos.
31
OBJETIVOS
Objetivo geral
Verificar o efeito do eugenol em músculo liso traqueal isolado de
rato.
Objetivos específicos
Avaliar o efeito do eugenol no tônus intrínsico de músculo liso
traqueal de rato;
Avaliar o efeito do eugenol em contrações induzidas tanto via
acoplamento eletromecânico quanto farmacomecânico;
Elucidar a participação de possíveis efeitos neurogênicos (devido à
presença de neurônios intramurais na traquéia) nos efeitos do
eugenol no músculo liso;
Elucidar o mecanismo de ação do eugenol sobre a contratilidade do
músculo liso traqueal de rato.
32
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Animais
Os animais utilizados foram ratos (Rattus novergicus) Wistar, machos,
adultos, pesando entre 200 – 250 g, mantidos com livre acesso à ração e água, ad
libitum provenientes do Biotério da Universidade Federal do Ceará e do próprio
Instituto de Ciências Biomédicas-ISCB da Universidade Estadual do Ceará.
Os animais foram tratados respeitando-se as recomendações de manuseio
bioético do Guia Internacional de Princípios para Pesquisa Biomédica Envolvendo
Animais, Suíça, e do livro “Princípios éticos na experimentação animal” do Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), Brasil. O manuseio foi então
aprovado pela Comissão de Ética para Uso de Animais CEUA-UECE (protocolo nº
06379067-0).
Sais e fármacos:
Os sais utilizados no preparo das soluções fisiológicas foram de grau de
pureza analítica obtidos da companhia Sigma Chemical Corporation (St. Louis,
Missiouri, USA). As concentrações foram expressas em milimol/litro (mM).
O cloridrato de acetilcolina (ACh), o carbacol (CCh, a atropina (ATR), a
capsazepina (CAPZ), a indometacina (IND), tween, ácido etileno-bis (-amino-etil-
éter)-N,N,N’,N’-tetracético (EGTA), o éster de forbol (DBF), a tapsigargina, a
lidocaína, o montelucaste, e o eugenol (EUG) foram adquiridos da Sigma-Aldrich.
Soluções
A solução nutritiva de Tyrode (Tyrode modificado: concentração de K = 5,0
mM) utilizada teve a seguinte composição em mM: NaCl 136; KCl 5,0; MgCl
2
0,98;
33
NaH
2
PO
4
0,36; NaHCO
3
11,9; CaCl
2
2,0 e Glicose 5. A solução nutritiva foi mantida
constantemente aerada, à temperatura de 37ºC e teve o pH ajustado para 7,4.
A solução isenta de cálcio ou “zero cálcio” (0Ca
2+
) foi produzida de maneira
semelhante, entretanto o CaCl
2
foi omitido e o EGTA (0,2 mM) foi adicionado. Nos
protocolos (reposição do cálcio) onde a presença do EGTA inviabilizaria o
experimento, a solução de 0Ca
2+
foi feita omitindo tanto o EGTA quanto o CaCl
2
. Na
solução isotônica de KCl (60 mM), o NaCl foi substituído pela quantidade excedente
de KCl.
Soluções estoque de EUG foram diluídas diretamente em Tyrode, seguido
de agitação em aparelho, vortex mixers. Dessas soluções, retiraram-se volumes
específicos que ao serem adicionados diretamente à câmara, atingiram as
concentrações desejadas.
As soluções estoques de ACh, CCh, ATR, IND, CAPZ, DBF, tapsigargina,
lidocaína e montelucaste foram preparadas de acordo com a literatura, seguindo-se
as recomendações específicas de diluição para cada solução. Deste modo, das
soluções hipertônicas, retiravam-se volumes adequados para atingir a concentração
desejada na câmara do banho de órgão isolado. Vale salientar que quando a
substância era diluída diretamente em álcool, a concentração final na câmara não
passava de 0,1%. Além desses cuidados, estabeleceu-se como procedimento
padrão o armazenamento em freezer dessas soluções e o descarte após o uso para
evitar possíveis erros.
Métodos
Preparação tecidual.
Após a pesagem, os animais foram sacrificados por concussão cerebral e
tiveram a face ventral do pescoço aberta por uma incisão longitudinal na pele. A
exposição da traquéia foi feita através do afastamento das glândulas e dos
músculos, facilitando assim a remoção da mesma. A traquéia foi então transferida
para uma placa de petri contendo solução fisiológica, enquanto todos os tecidos
anexos eram removidos. A mesma foi seccionada transversalmente a cada 4 ou 5
34
“anéis” de cartilagem. Os segmentos circulares foram então montados em banho
para órgão isolado com volume de 5 ml, mantidos a 37ºC em solução de Tyrode (pH
7,40) oxigenada por borbulhamento de ar.
Medida da resposta mecânica do músculo liso traqueal
Um Transdutor de força do tipo “Strain Gage” (Grass Instrument, modelo
FTO.3, Quincy, Mass, EUA), transformava as respostas musculares mecânicas
(geração de força ou relaxamento) em sinal elétrico. Este transdutor de força era
conectado a um amplificador diferencial (DATAQ, modelo PM-1000,USA) na entrada
de um conversor analógico digital (A/D) cujos dados eram convertidos em traçados e
armazenados em arquivos através do software WINDAQ versão 1.65 (DATAQ
Instrumentos, Inc. USA) para análise posterior. (Fig. 05)
Os segmentos circulares de traquéia foram conectados ao transdutor de
força através de fixadores triangulares de aço inoxidável ligados a um fio de algodão
e a uma base fixa (Fig. 05). Deste modo, as alterações na linha de base para cima
foram consideradas como contrações enquanto que as alterações para baixo, como
relaxamento.
A tensão de estabilização aplicada foi ajustada em 1g e mantida por um
período de 1 a 2 horas, tempo necessário para obtermos o tônus basal de repouso,
uma vez que a preparação estava adaptada às novas condições.
No protocolo onde a estimulação por campo elétrico foi utilizada, as
contrações foram induzidas por estimuladores elétricos do tipo estimulador de
corrente (estimulador de fabricação local, capaz de gerar trens de pulsos com a
duração do pulso de 0,1 a 100 ms com corrente de até 150 mA e complacência de
voltagem de 150 V) ligados a eletrodos para estimulação de campo, que ficaram
bem próximos à preparação tecidual (Fig. 06). O número de estímulos do trem variou
de 1 a 50 aplicados a uma frequência de 0,1 a 30 Hz. Os trens foram aplicados a
uma frequência regular entre 1 a 5 por minuto. A duração de cada pulso do trem foi
0,5 ms (estimulação de nervo) ou 10 ms (estimulação de músculo).
35
Figura 05. Representação esquemática do sistema utilizado para registro de contrações.
Fonte: Alves-de-Almeida, 2004.
Figura 06. Representação esquemática dos eletrodos de estimulação de campo elétrico.
Fonte: Adaptado de Barnes, 2001.
36
Protocolos experimentais
Para garantir resultados fidedignos, os experimentos foram realizados
respeitando-se sempre a existência de grupos controles e experimentais montados
ao mesmo tempo e submetidos às mesmas condições. Avaliou-se também a
viabilidade do tecido, a reprodutividade e a integridade da resposta biológica do
ensaio através de duas contrações iniciais subseqüentes e induzidas por 60 mM de
K
+
(K
60
). Portanto, somente experimentos com contrações reproduzíveis foram
utilizados.
Curvas concentração-efeito foram obtidas pela exposição das preparações
a concentrações crescentes e não cumulativas das substâncias contraturantes (K
+
,
ACh e CCh) adicionadas no banho e mantidas por período suficiente para
observação clara da resposta (platô ou estado estacionário). A resposta máxima e a
concentração que provoca uma contração submaximal (representa 70 a 80% da
resposta máxima) foram determinadas através da análise da curva concentração-
efeito de cada uma das substâncias utilizadas.
Na série de estímulos por campo elétrico (ECE), a configuração (Amplitude,
60 mA; Duração, 0,5 ms; Frequência, 10 Hz) capaz de induzir contrações
submaximais foi estabelecida variando a amplitude da corrente e fixando a
frequência e a duração em 10 Hz e 0,5 ms respectivamente. Deste modo obteve-se
uma curva amplitude-efeito semelhante à curva mencionada no parágrafo acima. A
fixação da duração do pulso foi determinada assim para evitar a estimulação direta
do músculo.
Série 1: Efeito do eugenol sobre o tônus intrínseco da traquéia isolada de
rato
Com a finalidade de avaliar o efeito do EUG sobre o tônus muscular
espontâneo, foram administradas concentrações crescentes e cumulativas de EUG
(1, 3, 10, 30, 100, 300, 600 e 1000 µM) na solução (TM) que “banha” o músculo liso
traqueal (Fig. 07). A diferença entre o valor anterior e o posterior às respectivas
concentrações de EUG foram registrados como valores brutos em grama (g).
37
Figura 07. Esquema ilustrativo da série 1.
Série 2: Efeito relaxante do eugenol sobre as contrações induzidas e
sustentadas por potássio ou por carbacol em traquéia de rato.
A figura 08 ilustra outro modelo de protocolo que possibilitou pesquisar a
ação do EUG em concentrações crescentes e cumulativas (1, 3, 10, 30, 100, 300,
600, 1000 e 2000 µM) sobre a contração induzida e mantida por 80 mM de K
+
(K
80
),
ou por carbacol (1µM) em Tyrode, na ausência ou na presença de IND ou de CAPZ.
Nessa série, os dados foram calculados como porcentagem do tônus
aumentado induzido por K80 ou por CCh.
Figura 08. Esquema ilustrativo da série 2.
38
Série 3: Efeito inibitório do eugenol em contrações induzidas por
estimulação de campo elétrico.
Nessa série de experimentos o tecido, mantido em Tyrode, foi exposto a
concentrações crescentes e cumulativas (1, 3, 10, 30, 100, 300, 600, 1000 e 2000
µM) de eugenol por dez minutos, em seguida foi estimulado com corrente cuja
amplitude era de 60 mA; a duração do pulso de 0,5ms e a Frequência de 10 Hz (fig.
09). Nessa série de experimentos foi verificado também o efeito do eugenol na
presença de 2 µM de indometacina ou de 10 µM de montelucaste. Os dados foram
então coletados como porcentagem da média das duas estimulações iniciais
anteriores ao eugenol.
Figura 09. Esquema ilustrativo da série 3.
Série 4: Efeito inibitório do eugenol em contrações induzidas por
acetilcolina.
Em outra série de experimentos, contrações foram induzidas por ACh (0,01
– 100 µM) adicionada diretamente na solução de Tyrode. As concentrações
crescentes e não cumulativas eram administradas dez minutos depois da adição do
eugenol (Fig. 10). Deste modo observou-se a curva concentração-efeito na
ausência ou na presença de EUG (500 ou 1000 µM). Os dados foram então,
expressos como porcentagem do valor máximo obtido pela contração evocada por
ACh.
39
Figura 10. Esquema ilustrativo da série 4.
Série 5: Efeito inibitório do eugenol em contrações induzidas por
acetilcolina em meio isento de cálcio.
Esse protocolo permitiu avaliar o efeito inibitório do EUG no componente
contrátil via receptores de ACh que não depende de Ca
2+
extracelular, mas sim
daquele liberado do retículo sarcoplasmático pela via do IP
3
.
Para isso, foi preciso induzir três contrações subseqüentes por 60 M de
ACh em meio 0Ca
2+
(com EGTA) e confirmar que havia a depleção dos estoques
intracelulares. Tal confirmação era dada pela diminuição seqüencial das contrações
que praticamente eram abolidas na terceira tentativa.
O próximo passo consistiu em evocar novamente essas três contrações por
ACh 60 na presença do eugenol e comparar a primeira contração dessa série com a
primeira da série anterior ao eugenol. Como pode ser visto na figura 11, entre as
duas séries de contrações por ACh 60, os estoques intracelulares foram
recarregados pela solução de TM (contendo cálcio) que foi logo confirmado pela
contração evocada por K60 em seguida.
40
Figura 11. Esquema ilustrativo da série 5.
Série 6: Efeito do eugenol sobre a reposição do cálcio.
Esse protocolo exigiu a depleção do cálcio intracelular que por sua vez foi
conseguida com contrações subseqüentes de ACh 60 (do mesmo modo que a série
5 ). Após a confirmação da depleção, a solução isenta de Ca
2+
com EGTA foi
substituída por outra isenta de Ca
2+
, mas sem EGTA.
Seguiu-se então o protocolo adicionando as seguintes soluções nessa
sequência: ACh 60 mM durante 5 minutos, nifedipina (10 µM) durante 10 minutos e
por último o CaCl
2
(0,1 – 10 mM ) de forma cumulativa. O grupo experimental foi
feito posteriormente, do mesmo modo no mesmo tecido, porém adicionando o
eugenol antes da reposição de CaCl
2
(Fig. 12).
Os dados foram expressos em porcentagem, comparando-se a curva na
ausência e na presença do eugenol.
41
Figura 12. Esquema ilustrativo da série 6.
Série 7: Efeito do eugenol sobre as contrações induzidas por BaCl
2
extracelular.
Como pode ser observado na figura 13, após as duas contrações iniciais
evocadas por K60, o tecido ficou imerso em solução isotônica de KCl (K60) isenta de
Ca
2+
(com EGTA). Seguiu-se então com a adição cumulativa de BaCl
2
(0,1 - 0,3 – 1
– 3 – 10 e 30 mM) de modo que cada concentração atingia seu próprio platô de
contração. O grupo experimental foi feito posteriormente no mesmo tecido,
adicionando-se eugenol antes do BaCl
2
.
Mais uma vez os dados foram expressos em porcentagem, comparando-se as
contrações na ausência e na presença de eugenol.
Figura 13. Esquema ilustrativo da série 7.
42
Série 8: Efeito do eugenol sobre a contração induzida por éster de forbol.
A seguinte série de experimentos objetivou analisar a atuação do eugenol
quando a sensibilidade ao cálcio está aumentada por dibutirato de forbol (DBF).
Como pode ser acompanhado pela figura 14, inicialmente uma pequena
contração é induzida por 20 mM de KCl (K20), em seguida 1 µM de DBF é
adicionado à solução. Sobre o platô da contração de DBF, eugenol foi aplicado
nas concentrações de 300, 1000 e 2000 µM isoladamente.
Seguindo a mesma linha de raciocínio, em experimentos paralelos, 10
minutos antes da contração induzida por K20, 1µM de tapsigargina foi adicionado
à solução, inibindo assim a bomba Ca
2+
-ATPase do retículo sarcoplasmático.
Figura 14. Esquema ilustrativo da série 8.
Análise Estatística
Os resultados dos dados são apresentados como média E.P.M. (n), onde
n representa o número de experimentos e E.P.M. é o erro padrão da média. Os
gráficos foram produzidos através do software Sigma Plot 10.0. Foi utilizado o
software Sigma Stat 2.03 para a análise estatística onde foram considerados
estatisticamente significantes os resultados que apresentaram probabilidade de
ocorrência da hipótese de nulidade menor que 5% (p< 0,05). Para comparação de
dois grupos foi realizado o teste t pareado ou não pareado; para mais de dois grupos
experimentais, ANOVA seguido de técnica de contraste (testes paramétricos ou não
paramétricos), conforme apropriado, respeitando-se as hipóteses de normalidade da
distribuição e de homosedasticidade. As CE
50
foram calculadas por interpolação
43
semilogarítmica e fit sigmóide através do software Sigma Plot 10.0, sendo
consideradas neste trabalho como a concentração da substância que é capaz de
produzir 50% do efeito máximo.
44
RESULTADOS
Efeito do eugenol sobre o tônus intrínseco da traquéia isolada de rato
Neste protocolo, o eugenol (1-1000 µM) foi administrado em concentrações
crescentes e cumulativas sobre o tônus intrínseco da traquéia isolada de rato (Fig.
15a). Conforme pode ser observado na figura 15b, a exposição ao eugenol não
alterou o tônus basal (one way ANOVA) quando comparado com os valores iniciais
do tônus. Após um período de sucessivas lavagens, o tecido mostrou recuperação
de 90,8 ± 2,9 % da contração inicial, mostrando assim a viabilidade do tecido ao final
do experimento.
45
a
b
Eugenol [µM]
0,1 1 10 100 1000 10000
Tensão (g)
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
Eugenol (n=5)
Figura 15. Efeito do eugenol sobre o tônus intrínseco da traquéia isolada de rato. a)
Traçados de experimentos representativo mostrando que o eugenol não alterou o tônus
intrínseco da traquéia isolada de rato. b) Gráfico do efeito do eugenol no tônus intrínseco da
traquéia. ■, eugenol. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa o
número de experimentos.
46
Efeito relaxante do EUG sobre a contração sustentada por 80 mM de potássio
em traquéia isolada de rato.
Adições cumulativas de EUG (1- 2000 µM) (Fig. 16b) relaxaram o tônus,
induzido e mantido por K
+
(K
80
), das preparações de traquéia. Esse relaxamento foi
progressivo conforme o aumento da concentração de eugenol, sendo portanto,
significante a partir da concentração de 600 µM (one-way ANOVA).
A CE
50
foi de 597,3 ± 60,6 µM (n = 6), enquanto que o efeito máximo
observado no grupo em questão foi de 13,8 ± 1,9 % abaixo do tônus basal (Fig.16c).
Esse efeito relaxante não foi influenciado pelo tempo de exposição ao agente
contraturante, uma vez que o EUG foi omitido em outro grupo e o valor do tônus
aumentado manteve-se o mesmo, segundo análises estatísticas, durante todo o
experimento (Fig. 16a)
Seguindo a mesma linha de raciocínio do protocolo acima, utilizamos 2 µM
de indometacina (bloqueador da ciclooxigenase) ou 10 µM de capsazepina
(antagonistas dos receptores vanilóides) antes da exposição ao eugenol. As adições
cumulativas de EUG, novamente induziram de maneira dependente de
concentração, em ambos os grupos, um relaxamento progressivo do tônus da
traquéia (one-way ANOVA)
A presença de indometacina ou capsazepina, portanto, não impediu o
eugenol de abolir a contração mantida por KCl uma vez que, ao relaxamento
máximo observado, o tônus muscular foi reduzido para -0,60 ± 7,43 e -33,95 ± 9,26
% (- significa valor contrátil inferior ao tônus basal) do valor estacionário da
contração, respectivamente.
Conforme é mostrado na figura 16c, os efeitos foram significantes a partir
de 300 µM e de 30 µM enquanto que as CE
50
foram de 316,06 ± 88,41 µM (n = 6) e
153,03 ± 28,52 µM (n = 6), respectivamente para o eugenol em presença de
indometacina e para o eugenol em presença de capsazepina.
Segundo o teste estatístico (teste-t) realizado, há diferença significante
entre a EC
50
do eugenol e a do eugenol em presença de capsazepina. Ver tabela 1.
47
a
b
C
0,1 1 10 100 1000 10000
% Contração KCl (80mM)
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Eugenol em presença de Indometacina (n = 6)
Eugenol em presença de Capsazepina (n = 6)
Eugenol somente (n = 6)
Eugenol [µM]
*
$
#
Figura 16. Efeito relaxante do EUG sobre a contração sustentada por 80 mM de
potássio em traquéia isolada de rato. a) Traçado de experimento representativo
mostrando que o tempo de exposição não influencia na contração mantida por 80 mM de
KCl. b) Traçados de experimentos originais mostrando o efeito relaxante do eugenol sobre a
contração mantida por 80 mM de KCl. c) Gráfico do efeito relaxante do eugenol sobre a
contração induzida por 80 mm de KCl no músculo liso traqueal isolado de rato. ∆ eugenol
48
em presença de indometacina; ○ eugenol em presença de capsazepina; ■ eugenol. As
linhas contínuas representam o ajuste da função logística sigmoidal para valores do eugenol
em ausência ou presença de indometacina ou de capsazepina. Os valores estão expressos
como média ± E.P.M. n representa o número de experimentos. #, Primeiro efeito significante
(em relação ao controle) para eugenol em presença de capsazepina. $, Primeiro efeito
significante (em relação ao controle) para eugenol em presença de indometacina.*, Primeiro
efeito significante (em relação ao controle) para eugenol somente (p< 0,05, one-way ANOVA
seguido de Holm-Sidak).
49
Tabela 1
Valores de EC
50
do relaxamento do eugenol em traquéia de rato.
eugenol
eugenol em presença
de Capsazepina
eugenol em presença
de Indometacina
Relaxamento do KCl
597,03 ± 60,6
153,03 ± 28,52*
316,06 ± 88,41
Relaxamento do
Carbacol
571,31 ± 148,80
503,59 ± 216,20
#
564,43 ± 60,31
Inibição do ECE
842,3 ± 52,7
_____
816,1 ± 70,15
Nota: ECE (Estímulo de Campo Elétrico); * P<0,05, teste t de student,
em relação ao grupo eugenol
(Relaxamento do KCl); # P< 0,05, teste t de student,
relaxamento do KCl vs. relaxamento do carbacol;
Os valores estão expressos em µM (média ± E.P.M.).
50
Efeito relaxante do eugenol sobre a contração sustentada por carbacol em
traquéia isolada de rato.
Em contrações induzidas e mantidas por 1µM de carbacol (Fig. 17 b, c), o
eugenol (1- 2000 µM) produziu novamente um relaxamento progressivo do tônus,
dependente de concentração, onde o primeiro efeito significante foi a partir de 300
µM. O relaxamento atingiu valor máximo de -16,52 ± 9,39 % e a CE
50
em questão foi
de 571,31 ± 148,80 µM.
Conforme pode ser observado na figura 17a, esse efeito relaxante não foi
influenciado pelo tempo de exposição a 1µM de carbacol, uma vez que o EUG foi
omitido em outro grupo e o valor do tônus aumentado manteve-se o mesmo,
segundo análises estatísticas, durante todo o experimento.
A presença de indometacina (2 µM ) ou de capsazepina (10 µM ), não impediu
que o eugenol relaxasse significativamente o tônus aumentado pelo carbacol (Fig.
17c). Esse relaxamento também se mostrou progressivo e dependente de
concentração. As primeiras concentrações em que o eugenol promoveu diminuição
significativa foi 600 µM, em presença de 2 µM de indometacina, e de 100 µM, em
presença de capsazepina.
No efeito máximo induzido pelo eugenol, o tônus foi reduzido para -12,49 ±
4,91 % e -18,24 ± 10,8 % do valor do platô da contração (Fig. 17), e as CE
50
foram
564,43 ± 60,31 µM e 503,59 ± 216,20 µM, em presença de indometacina e de
capsazepina, respectivamente. Como pode ser acompanhado na tabela 1, o teste
estatístico realizado entre os valores de EC
50
não mostrou diferença significante
entre os três grupos.
Ao compararmos as Ec
50
da via eletromecânica (80 mM de KCl) com as da
via farmacomecânica (1µM de carbacol), apenas o grupo em presença de
capsazepina diferiu significativamente. Veja a tabela 1.
51
a
b
c
[µM]
0,1 1 10 100 1000 10000
% Contração de Carbacol ( 1µM )
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Eugenol somente (n = 5)
Em presença de capsazepina (n = 5)
Em presença de Indometacina (n = 5)
#
*
$
Figura 17. Efeito relaxante do eugenol sobre a contração sustentada por carbacol em
traquéia isolada de rato. a) Traçado de experimentos representativo mostrando que o
52
tempo de exposição não influencia na contração mantida por 1µM de carbacol. b) Traçado
de experimentos representativo mostrando o efeito relaxante do eugenol sobre a contração
mantida por 1µM de carbacol. c) Gráfico do efeito relaxante do eugenol sobre a contração
induzida por 1µM de carbacol no músculo liso traqueal isolado de rato. ∆ eugenol em
presença de indometacina (2 µM); Ο eugenol em presença de capsazepina (10 µM); □
eugenol somente. As linhas contínuas representam o ajuste da função logística sigmoidal
para valores do eugenol em ausência ou presença de indometacina ou capsazepina. Os
valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa o número de experimentos. *,
Primeiro efeito significante para eugenol somente. #, Primeiro efeito significante (em relação
ao controle) para eugenol em presença de capsazepina. $, Primeiro efeito significante (em
relação ao controle) para eugenol em presença de indometacina. (p< 0,05, one-way ANOVA
seguido de Holm-Sidak).
53
Efeito inibitório do eugenol em contrações induzidas por Estimulação de
Campo Elétrico.
Nesta série de experimentos, inicialmente, utilizou-se 1 mM de lidocaína
(bloqueador de canais de Na
+
) ou 1 µM de atropina (bloqueador colinérgico
muscarínico) para confirmar que a contração gerada era estimulada apenas por via
nervosa e não pela estimulação direta do músculo. Como pode ser observado nas
figuras 18a e 18b, tanto a lidocaína quanto a atropina foram capazes de bloquear
completamente a contração pelo Estímulo de Campo Elétrico (ECE).
Para assegurar que o próprio ECE não influenciava o tecido durante o
decorrer do experimento, grupos paralelos foram estimulados sem adição de
nenhuma substância além da solução de Tyrode modificado (solução nutridora
também usada como veículo do EUG) e conforme pode ser observado na figura 18e
e no 2º traçado da Figura 18c, a amplitude da contração não foi alterada
significativamente (one-way ANOVA).
De outro modo, na presença de eugenol, as contrações induzidas por ECE (
60mA; 0,5ms; 10Hz) foram inibidas de forma dependente de concentração (1 -
2000µM). A inibição foi completa somente na concentração de 2000 µM, entretanto,
a partir de 600µM, o eugenol já se mostrou significante quando comparado com o
controle (one-way ANOVA seguido de Holm-Sidak) (Fig. 18d). A EC
50
em questão foi
de 842,3 ± 52,7 µM.
A presença de 2 µM de indometacina ou de 10 µM de montelucaste
(antagonista de receptores de leucotrieno ) não anulou o relaxamento dependente
de concentração induzido pelo eugenol (fig. 18d). A contração foi completamente
inibida na concentração de 2000 µM em presença de indometacina. Já em presença
de montelucaste, a amplitude atingiu valores de 4,0 ± 2,48 %. Em ambos os grupos
o relaxamento foi significante a partir de 600µM.
As EC
50
obtidas nessa série foram de 842,3 ± 52,7 µM para o eugenol, 816,1
± 70,15 µM para o eugenol em presença de indometacina e 693,1 ± 170,85 µM para
o eugenol em presença de montelucaste. Os testes estatísticos mostram que não há
diferença significante entre os três grupos.
54
a
b
força (g)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Controle
Atropina
Lidocaína
*
*
ECE ( A = 60 mA; D = 0,5 ms; F = 10 Hrz )
c
d
55
Eugenol [µM]
0,1 1 10 100 1000 10000
% Contração de ECE
-20
0
20
40
60
80
100
120
EUG em presença de montelucaste (n = 5)
EUG somente (n = 7)
EUG em presença de indometacina (n = 5)
*
e
[µL]
0,1 1 10 100 1000 10000
% da Contração de ECE
0
20
40
60
80
100
120
Veículo (TM) (n = 8)
Figura 18. Efeito inibitório do eugenol em contrações induzidas por Estimulação de
Campo Elétrico. a) Traçados de experimento representativo mostrando o bloqueio da
Estimulação por Campo Elétrico (ECE) pela lidocaína (1mM ) e pela atropina ( 1µM ). b)
Gráfico do bloqueio da ECE pela lidocaína (1mM ) e pela atropina ( 1µM ). c) Traçados de
experimento representativo mostrando o bloqueio da ECE pelo eugenol. d) Gráfico do
bloqueio da ECE pelo eugenol em presença ou ausência de indometacina ou montelucaste.
e) Gráfico do grupo controle (veículo) mostrando que a amplitude das contrações não se
56
altera significativamente. ∆ eugenol em presença de indometacina (2 µM); ○ eugenol em
presença de montelucaste (10 µM) ; □ eugenol; • veículo (Tyrode). Os valores estão
expressos como média ± E.P.M. n representa o número de experimentos. *, Primeiro efeito
significante (em relação ao controle) para eugenol em presença ou ausência de
montelucaste ou de indometacina. (p< 0,05, one-way ANOVA seguido de Holm-Sidak).
57
Curva concentração-efeito de acetilcolina em presença de eugenol.
Em presença de EUG (1000 M) as amplitudes das contrações induzidas por
concentrações crescentes e não cumulativas de ACh (0,01 – 100 M) foram
significativamente inibidas quando comparadas com as respostas em ausência do
eugenol (Fig. 19a).
No grupo onde o eugenol foi omitido, a contração máxima atingiu em média,
valores de aproximadamente 0,823 ± 0,09 g enquanto que em presença de 1000 M
esses valores foram reduzidos significativamente para 29,64 ± 9,38 % (Fig. 19b). Já
em presença de 500 M de eugenol, embora o valor máximo não tenha diferenciado
do controle, a curva foi diferente da curva controle segundo o teste estatístico (Two
way ANOVA seguido de Holm Sidak).
58
a
b
0,001 0,01 0,1 1 10 100
% contração max. de ACh
-20
0
20
40
60
80
100
120
ACh em presença de Eug 1000 µM (n = 6)
ACh em presença de Eug 500 µM (n = 6)
ACh somente (n = 6)
[ µM ]
*
#
$
$
Figura 19. Curva concentração-efeito de acetilcolina em presença de eugenol. a)
Traçados de experimento representativo mostrando a inibição das contrações induzidas por
acetilcolina (ACh) pelo eugenol ( 1000 µM). b) Gráfico mostrando a inibição das contrações
(por ACh) pelo eugenol (500 e 1000 M). ∆ Acetilcolina em presença de 1000µM de
eugenol; ͦ Acetilcolina em presença de 500 µM de eugenol; □ Acetilcolina somente. Os
valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa o número de experimentos. *,
Primeiro efeito significante (em relação ao tônus basal) para ACh somente ou em presença
59
de 500 µM de eugenol. #, Primeiro efeito significante (em relação ao tônus basal) para ACh
em presença de 1000 µM de eugenol. (p< 0,05, one-way ANOVA seguido de Holm-Sidak).
$, eugenol vs. controle (p< 0,05, two way ANOVA seguido de Holm Sidak).
60
Efeito inibitório do eugenol sobre contração induzida por 60 µM de ACh em
traquéia isolada de rato mantida em solução isenta de Ca
2+
.
Neste protocolo, as contrações induzidas por 60 µM de ACh, foram
inicialmente realizadas em solução de Tyrode. Em seguida a solução foi substituída
por solução isenta de Ca
2+
(com
0,2 mM de EGTA). Finalmente as contrações foram induzidas na ausência e
na presença de eugenol (Fig. 20a).
No grupo controle (eugenol ausente), a amplitude das contrações
subseqüentes induzidas por 60 mM de ACh em meio isento de Ca
2+
foi
progressivamente reduzida, sugerindo que estaria ocorrendo depleção dos estoques
intracelulares e inexistência do influxo de Ca
2+
extracelular (Fig. 20a).
Em presença de eugenol (100 - 2000 µM), a primeira dessas contrações em
solução isenta de Ca
2+
foi estatisticamente reduzida em relação à primeira contração
controle (meio isento de Ca
2+
e de eugenol) (Fig. 20b). Essa redução ocorreu de
modo dependente de concentração e atingiu efeito máximo na concentração de
2000 µM.
O fato do eugenol ter inibido a contração induzida via liberação de Ca
2+
dos
estoques intracelulares nos sugere que seu mecanismo pode estar envolvido com a
participação dos receptores de IP
3
.
61
a
b
Eugenol [ µM ]
% Contração ACh 60mM
0
20
40
60
80
100
ACh + 0Ca
++
(n = 5)
Eugenol (n= 5)
0Ca
+2
*
*
*
*
*
100
300
600
1000
2000
Figura 20. Efeito inibitório do eugenol sobre contração induzida por 60 mM de ACh em
traquéia isolada de rato mantida em solução isenta de Ca
2+
. a) Traçados de experimento
representativo mostrando a depleção dos estoques intracelulares de cálcio. b) Gráfico
mostrando a inibição das contrações (por ACh) em meio isento de cálcio pelo eugenol (100 -
2000 M). Os valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa o número de
experimentos. *, eugenol vs. controle (contração induzida por ACh em meio isento de
cálcio). (p< 0,05, teste t de student não pareado).
62
Efeito inibitório do eugenol sobre contração induzida por influxo de Ca
2+
em
traquéia isolada de rato.
Neste protocolo, as preparações foram expostas inicialmente à solução
isenta de cálcio (com 0,2 mM de EGTA) para que os estoques intracelulares de Ca
2+
fossem depletados por contrações subseqüentes induzidas por 60 mM de ACh
conforme mostra a figura 21a.
Em seguida a solução nutridora foi substituída por outra também isenta de
cálcio, porém sem EGTA. A essa nova solução foi adicionada 60 mM de ACh e 10
µM de nifedipina (5 min) antes das contrações induzidas por CaCl
2
(0,1 – 10 mM).
Essas concentrações crescentes e cumulativas induziram contrações que partiram
sempre do platô da contração anterior (Fig. 21a).
Em ausência de eugenol, a contração máxima teve amplitude de 0,853
± 0,130 g, sendo significante a partir da concentração de 0,3 mM de CaCl
2
. Já em
presença de 600 e 1000 µM de eugenol, a contração máxima foi (estatisticamente
não significante) reduzida para 80,3 ± 7,61 e 39,03 ± 10,12 % (estatisticamente
significante) do controle, respectivamente (Fig. 21b). O teste estatístico realizado (p
< 0,05, two way Anova seguido de Holm-Sidak) mostrou que somente a curva em
presença de 1000 µM de eugenol é diferente da curva controle.
Com os dados obtidos nesse experimento podemos sugerir que o eugenol
não atua exclusivamente pelos canais de cálcio operados por voltagem (VOC) do
tipo L, caso contrário o relaxamento seria totalmente inibido pela nifedipina.
Entretanto, os canais operados por receptores podem sim ter participação nesse
efeito, pois houve relaxamento significante por essa via.
63
a
b
CaCl
2
[mM]
0,01 0,1 1 10
% Contração máxima de CaCl
2
0
20
40
60
80
100
120
Controle ( n = 6 )
Eugenol 1000 µM ( n = 5)
Eugenol 600 µM (n = 5)
$
Figura 21. Efeito inibitório do eugenol sobre a contração induzida por influxo de Ca
2+
em traquéia isolada de rato. a) Traçados de experimento representativo mostrando as
contrações induzidas pelo influxo de Cálcio em meio contendo nifedipina (10 µM) em
ausência de eugenol (painel superior) ou em presença de 1000 µM de eugenol (painel
inferior). b) Gráfico mostrando o eugenol (600 e 1000 M) inibindo as contrações induzidas
64
pelo influxo de Cálcio em meio contendo 10 µM de nifedipina. ■ Controle; ○ eugenol 600 µM;
• eugenol 1000 µM. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa o
número de experimentos. * primeiro efeito significante (em relação ao tônus basal) para a
curva controle e para a curva em presença de 600 µM de eugenol. # primeiro efeito
significante (em relação ao tônus basal) para curva em presença de 1000 µM de eugenol. $,
eugenol vs. controle (p< 0,05, two way ANOVA seguido de Holm Sidak).
65
Efeito inibitório do eugenol sobre contração induzida por influxo de bário
(Ba
2+
) em traquéia isolada de rato.
Neste protocolo as preparações foram expostas a solução com KCl isotônico
(60 mM) isenta de Ca
2+
e contendo EGTA (2 mM). Concentrações crescentes e
cumulativas de BaCl
2
(0,1 – 30 mM) foram adicionadas a essa solução induzindo
contrações que partiam sempre do platô da contração anterior. Ver figura 22a.
A amplitude máxima da contração atingida sem eugenol foi de 0,631 ± 0,06 g
e a primeira contração significante foi a partir da concentração de 1mM de BaCl
2
(p <
0,05, one way ANOVA). Em presença de eugenol (600 e 1000 µM) o primeiro efeito
significante foi a partir de 3 mM de BaCl
2
para ambos os grupos (p < 0,05, one way
ANOVA seguida de Dunn).
A amplitude máxima em presença de 600 e 1000 µM foi reduzida
respectivamente para 71,90 ± 9,5 % e 30,7 ± 1,8 % do controle (Fig. 22b). Esse
relaxamento portanto, caracterizou-se de maneira dependente de concentração. O
teste estatístico realizado (p < 0,05, two way Anova seguido de Holm-Sidak) mostrou
que as curvas em presença de eugenol (600 µM e 1000 µM) são diferentes da curva
controle.
Nesse experimento, apenas os canais operados por voltagem (VOC) foram
ativados, uma vez que o agente contraturante era o K60 (60 mM de KCl), e como o
relaxamento não foi anulado supomos que esse efeito não se deve exclusivamente
aos canais operados por receptor (VOC).
66
a
b
BaCl
2
[mM]
0,01 0,1 1 10 100
% Contração BaCl
2
-20
0
20
40
60
80
100
120
Eugenol 600 µM ( n = 6)
Controle ( n = 6)
Eugenol 1000 µM (n = 6)
*
#
$
$
Figura 22. Efeito inibitório do eugenol sobre contração induzida por influxo de Ba
2+
em
traquéia isolada de rato. a) Traçados de experimento representativo mostrando as
contrações induzidas pelo influxo de bário em meio isento de cálcio e contendo KCl
isotônico (60 mM) em ausência de eugenol (painel superior) ou em presença de eugenol
67
(painel inferior). b) Gráfico mostrando o eugenol (600 e 1000 M) inibindo as contrações
induzidas pelo influxo de bário em meio isento de cálcio e contendo KCl isotônico (60 mM).□
Controle; ∆ eugenol 600 µM; ○ eugenol 1000 µM. Os valores estão expressos como média ±
E.P.M. n representa o número de experimentos. * e # primeiro efeito significante (em relação
ao tônus basal) respectivamente para a curva controle e para a curva em presença de
eugenol 600 e 1000 µM. $, eugenol vs. controle (p< 0,05, two way ANOVA seguido de Holm
Sidak).
68
Efeito relaxante do eugenol sobre a contração induzida e sustentada por éster
de forbol na traquéia isolada de rato em ausência ou presença de tapsigargina.
Neste protocolo, após a verificação de viabilização do tecido, uma contração
inicial foi induzida por 20 mM de KCl em Tyrode modificado. Em seguida, foi
induzida uma contração por 1 µM de éster de forbol (DBF) que teve início no platô
da contração por potássio. Ver figura 23a.
Em ausência do eugenol, a amplitude máxima atingiu uma média de 1,7 ± 0,2
g de tensão. Já em presença de eugenol 300, 1000 e 2000 µM, a contração foi
reduzida para 69,6 ± 7,1; 49,5 ± 7,1 e 8,4 ± 9,9 % do controle, respectivamente.
Todos os grupos foram estatisticamente diferentes do controle (p < 0,05, teste t de
Student ).
A figura 23b mostra que a presença de tapsigargina (1 µM), adicionada antes
do potássio (20 mM), não foi capaz de anular o efeito relaxante do eugenol. As
amplitudes dessas contrações foram de 79,3 ± 5,1; 26,7 ± 2,5 e 11,5 ± 9,5 % do
controle, respectivamente para eugenol 300, 1000 e 2000 µM. Todos os grupos
diferiram significativamente do controle (p < 0,05, teste t de Student) e apenas a
concentração de 1000 µM de eugenol foi diferente estatisticamente quando
comparado em ausência e presença de tapsigargina.
O gráfico em questão mostra claramente que o relaxamento induzido pelo
eugenol não foi mais potente do que nos demais experimentos, sugerindo assim que
a dessensibilização ao Ca
2+
não é o principal mecanismo de ação do eugenol e que
uma etapa comum, posterior a esta, pode estar envolvida nesse relaxamento.
69
a
b
[µM]
300 300 1000 1000 2000 2000
% Contração de (k20 + DBF)
0
20
40
60
80
100
EUG em presença de tapsgargina (n = 6)
EUG sem tapsgargina (n = 6)
*
*
*
_________
_________
_________
#
Figura 23. Efeito relaxante do eugenol sobre a contração induzida e sustentada por
éster de forbol na traquéia isolada de rato em ausência ou presença de tapsigargina.
a) Traçados de experimento representativo mostrando as contrações induzidas pelo éster de
forbol (DBF) em presença de 20 mM de KCl (K20) e de eugenol. b) Gráfico mostrando o
eugenol (300, 1000 e 2000 M) inibindo as contrações induzidas pelo éster de forbol (1 µM)
em presença e em ausência de 1 µM de tapsigargina. Os valores estão expressos como
média ± E.P.M. n representa o número de experimentos. * (p < 0,05, teste t de Student)
eugenol em presença e ausência de tapsigargina vs. controle. # (p < 0,05, teste t de
Student) para eugenol com tapsigargina vs. eugenol sem tapsigargina.
70
DISCUSSÃO
Relatos na literatura demonstram que o eugenol promove atividade
antiespasmódica em músculo liso ileal (LEAL-CARDOSO et al, 2002) e vascular
(HUME, 1983; NISHIJIMA; KUNOKAWA, 1999), porém ainda são poucos os
trabalhos sobre o relaxamento do músculo liso pelo eugenol e nula a quantidade
daqueles realizados em traquéia de rato.
Este estudo demonstrou, como principal achado, que o eugenol possui
efeito relaxante sobre a traquéia isolada de rato pré-contraída tanto pelo
acoplamento eletromecânico quanto pelo farmacomecânico. A semelhança da
potência farmacológica desses dados sugere que o eugenol pode atuar em uma
etapa comum a essas vias.
Ao final de cada experimento, todas as preparações foram verificadas
quanto à viabilidade do tecido, garantindo portanto, que o efeito relaxante não era
influenciado pelo fator tempo e nem pela toxicidade do eugenol, uma vez que a dose
letal é de 1.930 a 3.000 mg/kg em camundongos e ratos (STICHT; SMITH, 1971;
OPDYKE, 1975).
Efeito do eugenol sobre o tônus basal da traquéia isolada de rato
Lima et al. (2000), relataram que o metil-eugenol relaxou de maneira
reversível o tônus basal de íleo de cobaio. Posteriormente, Leal-Cardoso et al.
(2002) relataram o mesmo efeito em rato. Especificamente em músculo liso traqueal
de cobaio, esse relaxamento induzido pelo eugenol mostrou-se significativo em
trabalhos anteriores realizados por Alves-de-Almeida (2004) no mesmo laboratório
onde esse foi executado. Por esse motivo, o relaxamento do tônus intrínseco do
músculo liso traqueal isolado de rato era esperado.
Entretanto, como mostra a figura 15, não houve relaxamento significativo
evocado por EUG. O período de recuperação do tecido ao final do experimento
garantiu que a inalteração do mesmo não era por inviabilidade do tecido. Tal fato
71
chama a atenção para as características no trato respiratório do cobaio, dentre as
quais podemos citar o tônus basal mediado por PGE
2
através da COX2 (CANNING;
CHOU, 2008), a grande responsividade a nível de tônus basal o que pode levar a
uma contração excessiva (CANNING; CHOU, 2008) e uma broncoconstricção no
estado pós-morte (ZOSKY; SLY, 2007; RESSMEYER et al, 2006), o que explicaria
então, o relaxamento do tônus basal por eugenol relatado por Alves-de-Almeida
(2004).
Esse dado torna-se interessante uma vez que é vantajoso que um agente
terapêutico não altere o tônus intrínseco, e sim que atue revertendo um
broncoespasmo, por exemplo. E como foi mostrado neste trabalho, o eugenol
apresenta exatamente esse perfil, uma vez que ele não altera o tônus basal, mas é
capaz de reverter ou inibir contrações musculares induzidas tanto pela via
farmacomecânica quanto pela via eletromecânica.
Efeito do eugenol sobre o acoplamento eletromecânico
Na concentração de 80 mM de K
+
, a despolarização promovida leva os
valores de potencial transmembrana para aproximadamente -10 mV, o que ativa os
canais de cálcio dependentes de voltagem, permitindo o influxo de Ca
2+
com
conseqüente aumento da [Ca
2+
]
i
, mas inativa os canais de Na
+
responsáveis pelo
potencial de ação, bloqueando assim, a atividade nervosa (QUAST, 1993).
Portanto, sem a participação neural, o EUG isoladamente foi capaz de
reverter completamente a contração induzida por alta concentração externa de KCl
(Fig. 16).
Efeito do eugenol sobre o acoplamento farmacomecânico
Durante o acoplamento farmacomecânico, a ativação de receptores pode
ter como conseqüência a liberação do Ca
2+
do retículo sarcoplasmático, influxo de
Ca
2+
para o citoplasma pela abertura de canais de Ca
2+
dependentes e
independentes de voltagem e o aumento da sensibilidade das proteínas contráteis
ao Ca
2+
(SOMLYO et al., 1999).
72
Neste estudo, o eugenol também foi capaz de interferir no acoplamento
farmacomecânico, inibindo a contração induzida por acetilcolina (0,01 – 100 µM) ou
por Estímulo de Campo Elétrico, bem como relaxando as preparações contraídas e
sustentadas por 1 µM de carbacol.
Ao analisarmos o relaxamento induzido pelo eugenol isoladamente, as
EC
50
do acoplamento eletromecânico não diferiram estatisticamente do
farmacomecânico (tabela1), sugerido um mecanismo de ação comum às duas vias.
Estimulação de campo elétrico
O músculo liso das vias aéreas é inervado por vários tipos de nervos
sensoriais e eferentes que podem ser colinérgicos, adrenérgicos ou não-
adrenérgicos não-colinérgicos (NANC) (BARNES et al, 1991). Logo, a passagem do
campo elétrico através da preparação de vias aéreas isolada causa a ativação dos
nervos intrínsecos, a liberação de neurotransmissores e consequente resposta do
músculo liso a esses neurotransmissores (FEDAN, 2001).
Como a inervação inibitória NANC tem sido caracterizada nas vias aéreas
de diferentes espécies e como a ativação elétrica dessa via pode causar
relaxamento pela liberação de óxido nítrico (NO) e peptídeo intestinal vasoativo
(VIP) (BARNES et al, 1991), verificamos se a ECE causaria relaxamento próprio no
tecido. Acompanhando as figuras 18a e 18c, observamos que na ausência do
eugenol, as contrações mantiveram sua amplitude durante todo o experimento,
semelhante a do controle.
Nossos experimentos mostraram que a contração induzida por ECE foi
bloqueada completamente pela lidocaína e pela atropina, sugerindo que a célula
muscular não era estimulada diretamente, mas somente a via nervosa através de
receptores colinérgicos. Somando-se a isso o fato de que a potência do eugenol em
inibir essas contrações não foi diferente estatisticamente da potência em relaxar a
contração induzida por carbacol (tabela 1), podemos inferir então que o efeito
relaxante ocorre pelo mesmo mecanismo tanto ao inibir quanto ao reverter a
contração.
73
Participação dos receptores vanilóides VR1, dos prostanóides e dos
leucotrienos.
Duas hipóteses iniciais foram testadas para tentar explicar por onde o
eugenol atuaria: a primeira baseava-se em características comuns entre a
capsaicina e o eugenol que poderiam ser explicadas pela semelhança entre suas
moléculas (SZALLASI; BLUMBERG, 1999), sugerindo que o eugenol assim como a
capsaicina poderia atuar através de receptores TRPV1(CATERINA et al., 1997). De
fato, Yang et al (2003), demonstraram que o eugenol ativava correntes internas de
cálcio tanto em células renais embrionárias humanas que expressavam TRPV1
como em neurônio ganglionar trigeminal e que essas correntes foram
completamente bloqueadas por capsazepina.
A segunda hipótese fundamentava-se no fato de que o eugenol inibiria a
síntese de metabólitos do ácido araquidônico, favorecendo assim, o relaxamento
muscular. De fato, Kim et al. (2003) e Lee et al. (2007), demonstraram em
macrófagos de camundongos e de humanos, respectivamente, que o eugenol tanto
suprimia a expressão do gene da COX-2 quanto inibia diretamente sua atividade
enzimática.
Portanto, seguindo essas duas linhas de raciocínio, esperar-se-ia que o
bloqueio dos receptores vanilóides pela capsazepina ou que a inibição dos produtos
da COX pela indometacina ou que o bloqueio dos receptores de leucotrienos pelo
montelucaste interferisse com o relaxamento induzido pelo eugenol.
Entretanto, para a nossa surpresa, a presença de capsazepina amplificou o
relaxamento do eugenol em preparações contraídas por K80, de modo que sua EC
50
foi estatisticamente menor do que a do eugenol isoladamente. Já nas preparações
contraídas por carbacol ou por ECE, nem a indometacina nem a capsazepina e nem
o montelucaste sequer diferiram suas EC
50
em relação ao relaxamento induzido por
eugenol unicamente, sugerindo portanto, que tal efeito não se deve à ativação de
receptores TRPV1 ou à participação de prostanóides e de leucotrienos.
Para tentar explicar porque a presença de capsazepina amplificou o
relaxamento traqueal apenas nas preparações contraídas por K80 e não nas
contraídas por carbacol é preciso relatar dois estudos publicados recentemente.
74
Skogvall et al (2007) demonstraram que 10 µM de capsazepina relaxaram
broncoconstricção em tecido humano causada por diferentes agonistas (LTB4,
histamina e PGD2) com a mesma eficácia. Entretanto, para relaxar contrações
induzidas por 100 µM de ACh, uma concentração 10 vezes maior de capsazepina foi
necessária. O relaxamento não se deu por ativação de receptores β-adrenérgicos,
nem por inibição de canais de Ca
2+
tipo L, nem por participação de NO ou
prostagladinas e nem via TRPV1. Com relação à via TRPV1, curiosamente, outros
cinco antagonistas de TRPV1 não apresentaram tal efeito, enquanto que análogos
químicos da capsazepina sim.
Posteriormente Skogvall et al (2008) demonstraram que um análogo
químico da capsazepina, RESPIR 4-95, foi dez vezes mais potente que a própria
capsazepina em relaxar broncoconstricção causada por LTB4. Esse relaxamento
também ocorreu frente a vários agonistas (LTB4, histamina, PGD2) incluindo ACh
(100 µM) e KCl (60 mM). Esses trabalhos juntos sugerem que a capsazepina pode
fazer parte de uma nova classe de broncorrelaxantes.
Portanto nossos achados, à luz dos dados que esses dois trabalhos
mostram, sugerem que a capsazepina pode estar amplificando o efeito relaxante do
eugenol e que essa amplificação não ocorreu frente ao carbacol talvez pelo fato da
concentração de capsazepina estar abaixo da necessária. Adicionalmente, eles
sugerem que o efeito anti-espasmódico da capsazepina e/ou eugenol á mais potente
sobre a contração induzida eletromecanicamente. O que teria permitido uma
interação sinérgica entre eugenol e capsazepina.
Participação dos VOC e dos ROC
Como o Ca
2+
é um intermediário comum à contração induzida tanto por
acoplamento eletromecânico quanto por acoplamento farmacomecânico, Damiani et
al (2003) sugeriram que em aorta de rato, o eugenol interferiria em ambos os
mecanismos através da redução da entrada de cálcio por bloquear os canais de
cálcio dependentes de voltagem do tipo L. Em nossos experimentos, o eugenol
(1000 µM), em meio 0Ca
2+
(sem EGTA) e na presença de nifedipina, reduziu a
contração induzida por influxo de cálcio para aproximadamente 39% do controle,
75
sugerindo portanto, que se o eugenol bloqueia os canais de Ca
2+
dependentes de
voltagem do tipo L, seu relaxamento não se dá exclusivamente por essa via.
Na série descrita acima, a ACh ativava os canais operados por receptores
(ROC) que por sua vez permitia aumento da [Ca
2+
]
intracelular, e esses receptores
portanto, poderiam ser alvos do eugenol. Para testarmos essa hipótese, em outra
série, excluímos a participação dos ROC ao induzirmos a contração por alta [K
+
]
extracelular e por adicionarmos BaCl
2
à solução nutridora (0Ca
2+
com EGTA). Deste
modo, com a participação dos canais operados por voltagem (VOC) e a “exclusão”
dos ROC, pudemos avaliar por qual dos dois mecanismos (ROC ou VOC) o
relaxamento pelo eugenol seria mais potente.
As figuras 21 e 22 mostram que 1 mM de eugenol inibiu a amplitude
máxima para valores semelhantes em ambas as contrações induzidas por VOC ou
por ROC. Diferentemente, na concentração de 600 µM, o eugenol mostrou-se mais
potente em inibir contrações via VOC do que via ROC, uma vez que a curva foi
estatisticamente diferente naquela e não nesta em relação ao controle.
Mecanismo intracelular
Com base na figura 20b o relaxamento induzido pelo eugenol nos sugere
que há participação dos canais de Ca
2+
do retículo sarcoplasmático ativados por IP
3
,
uma vez que excluímos a participação do cálcio extracelular preservando deste
modo, apenas os estoques intracelulares. Entretanto os valores de relaxamento na
concentração de 1 mM não diferiram estatisticamente dos valores encontrados no
relaxamento via ROC (Fig. 21b) ou via VOC (Fig. 22b) nem nas preparações
submetidas a dibutirato de forbol na presença ou ausência de tapsigargina (Fig.
23b). Neste último, o eugenol mostrou-se menos potente em relaxar as contrações
por aumento da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca
2+
, sugerindo que o sítio
de ação do eugenol pode estar na etapa final da contração, provavelmente ao nível
de interação entre actina e miosina.
76
CONCLUSÃO
Eugenol não altera o tônus intrínseco da traquéia isolada de rato.
Eugenol possui efeito antiespasmódico e miorrelaxante em traquéia
isolada de rato.
Eugenol é capaz de interferir tanto no acoplamento eletromecânico
quanto no farmacomecânico.
O relaxamento induzido pelo eugenol, em contrações dependentes de
acoplamento eletromecânico pode ser amplificado pela capsazepina.
A potência similar do eugenol para o relaxamento de contrações
dependentes dos outros diferentes mecanismos de ação sugere que
ele, possivelmente atua através de vários mecanismos ou de uma
interação direta com uma etapa da cascata bioquímica da contração
ulterior e comum a todos os mecanismos aqui pesquisados, exceto o
dependente do canal de Ca
++
operado por voltagem.
O eugenol foi mais potente em bloquear o mecanismo dependente do
canal de Ca
++
operado por voltagem do que nos outros mecanismos
(ROC, liberaçãode IP
3
, sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca
++
,
contração propriamente dita).
77
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