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DEFENSINAS DE SEMENTES DE FEIJÃO: PURIFICAÇÃO,
CLONAGEM MOLECULAR, EXPRESSÃO HETERÓLOGA E
ATIVIDADE BIOLÓGICA
IZABELA SILVA DOS SANTOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
AGOSTO 2009
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DEFENSINAS DE SEMENTES DE FEIJÃO: PURIFICAÇÃO,
CLONAGEM MOLECULAR, EXPRESSÃO HETERÓLOGA E
ATIVIDADE BIOLÓGICA
IZABELA SILVA DOS SANTOS
Tese apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia, da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título
de Doutor em Biociências e
Biotecnologia.
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
AGOSTO 2009
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DEFENSINAS DE SEMENTES DE FEIJÃO: PURIFICAÇÃO,
CLONAGEM MOLECULAR, EXPRESSÃO HETERÓLOGA E
ATIVIDADE BIOLÓGICA
IZABELA SILVA DOS SANTOS
Tese apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia, da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título
de Doutor em Biociências e
Biotecnologia.
Aprovada em 04 de agosto de 2009.
Comissão Examinadora:
______________________________________________________________
Prof
a
. Ilka Maria Vasconcelos (Dr
a
. em Ciências Biológicas) – UFC
______________________________________________________________
Prof
a
. Kátia Valevski Sales Fernandes (PhD. em Bioquímica e Biologia
Molecular de Plantas) – UENF
______________________________________________________________
Prof
o
. José Roberto da Silva (Dr. em Biociências e Biotecnologia) – UFRJ
___________________________________________________________
Prof
a
. Valdirene Moreira Gomes (Dr
a
. em Ciências) – UENF
(Orientadora)
____________________
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos_____________________________________________________________
I
Agradeço...
A Deus, pois sem ele nada seria.
À profª. Valdirene Moreira Gomes por toda a dedicação, pela confiança, pelo
imenso carinho, pela amizade... Por tudo! Não tenho palavras para descrever o
quanto lhe sou grata, nem o quanto você é importante para mim.
Ao Dr. André de Oliveira Carvalho pela enorme colaboração.
Ao Prof
o
. Gonçalo A. de Souza-Filho e a todos os seus alunos, pela
colaboração e atenção, pelo aprendizado, pela amizade.
À Dr
a
. Beatriz Ferreira dos Santos pela colaboração.
À profª. Olga Lima Tavares Machado e aos seus alunos, pela colaboração e
amizade.
À Dr
a
. Viviane Veiga do Nascimento por toda a dedicação e pela amizade.
À profª. Maura da Cunha e aos seus alunos, pela colaboração e amizade.
A Érica de O. Melo por, gentilmente, ter me ajudado com a purificação da
defensina de sementes de Phaseolus.
Ao técnico, Luiz Carlos D. de Souza por estar sempre pronto a ajudar, pelo
carinho e pela amizade.
À técnica, Valéria Marques, pela dedicação e amizade.
Às técnicas, Beatriz F. Ribeiro e Giovana A. Torres pela dedicação.
À profª. Kátia V. S. Fernandes agradeço por ter aceitado revisar este trabalho.
À amiga e aluna Júlia Ribeiro Soares por tamanha dedicação.
À aluna Andressa Martorelli por me auxiliar nestes últimos meses.
Aos colegas de grupo e aos demais membros do LFBM que sempre
estiveram prontos a ajudar.
Aos meus amigos e familiares por compreenderem minha “ausência”, pelo
incentivo e pelo amor incondicional.
__________________
ÍNDICE
Índice_____________________________________________________________________
II
AGRADECIMENTOS................................................................................................
I
ÍNDICE......................................................................................................................
II
LISTA DE FIGURAS/ESQUEMAS/TABELAS.........................................................
VII
ABREVIATURAS......................................................................................................
X
RESUMO.................................................................................................................. XII
ABSTRACT.............................................................................................................. XIV
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................
1
1.1- Os peptídeos antimicrobianos de plantas........................................................
1
1.2- As defensinas de plantas................................................................................ 3
1.2.1- As defensinas e a defesa de plantas...................................................... 3
1.2.2- Aspectos estruturais.................................................................................
5
1.2.3- Atividades descritas in vitro para as defensinas de plantas.....................
7
1.2.3.1- Defensinas de plantas e a inibição de α-amilases.............................
8
1.2.3.2- Atividade antimicrobiana das defensinas de plantas.........................
10
1.3- O feijão-de-corda............................................
................................................
14
1.3- O feijão comum..........................................................................................
.....
16
2. OBJETIVOS..........................................................................................................
20
2.1.Objetivos gerais................................................................................................ 20
2.2.Objetivos específicos........................................................................................
20
3. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................
21
Parte I: Purificação, expressão heteróloga e atividade inibitória de α-amilase
por uma defensina de sementes de feijão-de-corda...........................................
21
3.1- Materiais biológicos..........................................................................................
21
3.1.1- Sementes..................................................................................................
21
3.1.2- Microrganismos.........................................................................................
21
3.2- Purificação da defensina de sementes de feijão-de-corda..............................
21
3.2.1- Extração protéica.....................................................................................
21
3.2.2- Cromatografias........................................................................................
22
Índice_____________________________________________________________________
III
3.2.2.1- Cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose.......
22
3.2.2.2- Cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sephadex G-
50..............................................................................................................................
23
3.2.2.3- Cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18...........................
23
3.2.3- Quantificação de proteínas......................................................................
24
3.2.4- Eletroforese em gel de tricina na presença de dodecil sulfato de sódio
(SDS)........................................................................................................................
24
3.2.4.1- Preparo das amostras e condições de corrida..................................
24
3.2.4.2- Coloração e descoloração do gel ....................................................
24
3.3- Clonagem molecular e expressão heteróloga da defensina de sementes de
feijão-de-corda..........................................................................................................
25
3.3.1- Obtenção do cDNA de feijão-de-corda....................................................
25
3.3.2- Estratégia de clonagem no vetor de super-expressão pET-32 Ek/LIC....
25
3.3.3- Desenho do iniciador para clonagem no vetor de superexpressão pET-
32 Ek/LIC..................................................................................................................
28
3.3.4- Reação em cadeia da polimerase (PCR) - Teste da temperatura de
anelamento e concentração dos iniciadores.............................................................
28
3.3.5- Purificação dos fragmentos com o kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-
Up System”...............................................................................................................
30
3.3.6- Clonagem do fragmento amplificado no vetor.........................................
30
3.3.7- Produção de células competentes de E. coli, linhagem JM109.............
31
3.3.8- Transformação de células competentes de E. coli (linhagem JM109)
com a construção pET-DEF......................................................................................
32
3.3.9- Análise dos clones positivos - extração e digestão dos vetores...............
32
3.3.10- Transformação de células competentes de E. coli (linhagem BL21
(DE
3
) pLysS) com a construção pET-DEF................................................................
33
3.3.11- Indução da expressão heteróloga da defensina de feijão-de-corda em
bactérias E. coli (linhagem BL21 (DE
3
) pLysS).........................................................
34
3.3.12- Eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida 15 % sob condições
desnaturantes (SDS-PAGE).....................................................................................
35
3.3.12.1- Preparo das amostras e condições de corrida...............................
35
3.3.12.2- Coloração e descoloração do gel...................................................
35
3.3.13- Verificação de expressão heteróloga por Western blotting.....................
36
3.3.14- Transformação de células competentes de E. coli (linhagem Rosetta
gami 2 (DE
3
) pLysS) com a construção pET-DEF....................................................
37
Índice_____________________________________________________________________
IV
3.3.15- Indução da expressão heteróloga da defensina de feijão-de-corda em
bactérias E. coli (linhagem Rosetta gami 2 (DE
3
) pLysS).........................................
37
3.3.16- Lise celular e recuperação da fração solúvel..........................................
38
3.4- Isolamento e caracterização da defensina recombinante................................
38
3.4.1- Cromatografia de afinidade em coluna de Ni Sepharose......................... 38
3.4.2- Clivagem com enteroquinase....................................................................
39
3.4.3- Cromatografia de afinidade em coluna de Ni sepharose..........................
39
3.4.4- Cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18...................................
39
3.4.5- Precipitação com nitrato de prata..............................................................
40
3.4.5.1- Soluções.........................................................................................
40
3.4.5.2- Precipitação e revelação protéica..................................................
40
3.4.6- Seqüenciamento N-terminal da defensina recombinante..........................
41
3.4.6.1- Preparo da amostra e condições de corrida...................................
41
3.4.6.2- Eletrotransferência para membrana de polivinilidenodifluoreto
(PVDF)......................................................................................................................
41
3.4.6.3- Seqüenciamento N-terminal............................................................
42
3.4.7- Estudos de modelagem por homologia................................................
42
3.5- Inibição da atividade de α-amilases pela defensina de sementes de feijão-
de-corda e seu respectivo homólogo recombinante.................................................
43
Parte II: Purificação, clonagem molecular e atividade antimicrobiana de uma
defensina de sementes de feijão comum.............................................................
44
3.1- Materiais biológicos..........................................................................................
44
3.1.2- Sementes.............................................................................................
44
3.1.3- Microrganismos....................................................................................
44
3.2- Purificação da defensina de sementes de feijão comum.................................
44
3.2.1- Extração protéica.................................................................................
44
3.2.2- Cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE–Sepharose.........
45
3.2.3- Cromatografia de fase reversa em HPLC............................................
45
3.3- Clonagem molecular, seqüenciamento e caracterização do cDNA de uma
defensina de sementes de feijão comum..................................................................
46
3.3.1- Obtenção de RNAm de sementes de feijão comum............................
46
3.3.1.1- Preparo de solução de fenol:clorofórmio:alcool isoamílico.............
46
3.3.1.2- Preparo de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC)..............
46
Índice_____________________________________________________________________
V
3.3.1.3- Extração de RNA total de sementes de feijão comum....................
47
3.3.1.4- Análise eletroforética de RNAs totais..............................................
47
3.3.1.5- Estimativa da concentração de RNA total.......................................
48
3.3.1.6- Isolamento de RNA poli-adenilado a partir de RNA total................
48
3.3.2- Obtenção do cDNA..............................................................................
48
3.3.2.1- Reação de transcrição reversa.......................................................
48
3.3.3- Reação em cadeia da polimerase (PCR).............................................
48
3.3.4- Clonagem do cDNA amplificado no vetor pTZ57R/T...........................
50
3.3.5- Produção de células competentes de E. coli, linhagem DH5α............
51
3.3.6- Transformação de células competentes de E. coli DH5α com o vetor
pTZ57R/T ligado ao cDNA amplificado com o iniciador DEFdeg.............................
52
3.3.7- Análise dos clones positivos - extração e digestão dos vetores..........
53
3.3.8- Seqüenciamento do cDNA amplificado com o iniciador DEFdeg........
54
3.3.9- Análise da sequência de nucleotídeos do cDNA amplificado com o
iniciador DEFdeg.......................................................................................................
55
3.3.10- Análise filogenética............................................................................
55
3.4- Análise da atividade antifúngica da defensina de feijão comum......................
55
3.4.1- Ensaio de inibição do crescimento de leveduras em meio líquido.......
55
3.4.1.1- Preparo dos inóculos.......................................................................
55
3.4.1.2- Ensaio de inibição...........................................................................
56
3.4.2- Análise morfológica de células de leveduras tratadas com a
defensina de sementes de feijão comum por microscopia eletrônica de varredura.
56
3.4.3- Análise ultraestrutural de células de leveduras tratadas com a
defensina de sementes de feijão comum..................................................................
57
3.4.4- Permeabilização da membrana plasmática da levedura
Saccharomyces cerevisiae pela defensina de sementes de feijão comum..............
58
3.5- Inibição da atividade de α-amilases pela defensina de sementes de feijão
comum......................................................................................................................
58
4.RESULTADOS .....................................................................................................
60
Parte I: Purificação, expressão heteróloga e atividade inibitória de α-amilase
por uma defensina de sementes de feijão-de-corda...........................................
60
4.1- Purificação da defensina de sementes de feijão-de-corda .............................
60
4.2- Clonagem molecular e expressão heteróloga da defensina de sementes de
Índice_____________________________________________________________________
VI
feijão-de-corda..........................................................................................................
63
4.3- Isolamento e caracterização da defensina recombinante................................
71
4.3.1- Isolamento da defensina recombinante.............................................
71
4.3.2- Caracterização da defensina recombinante.......................................
74
4.4- Inibição da atividade de α-amilases pela defensina de sementes de feijão-
de-corda e seu respectivo homólogo recombinante.................................................
79
Parte II: Purificação, clonagem molecular e atividade antimicrobiana de uma
defensina de sementes de feijão comum.............................................................
82
4.1- Purificação da defensina de sementes de feijão comum.................................
82
4.2- Clonagem molecular, seqüenciamento e caracterização do cDNA de uma
defensina de sementes de feijão comum em ...........................................................
84
4.2.1- Clonagem molecular de uma defensina de sementes de feijão
comum em E. coli......................................................................................................
84
4.2.2- Sequenciamento e caracterização do cDNA de uma defensina de
sementes de feijão comum ......................................................................................
89
4.3- Análise da atividade antifúngica da defensina de sementes de feijão comum
95
4.4- Inibição da atividade de α-amilases pela defensina de sementes de feijão
comum......................................................................................................................
101
5.DISCUSSÃO..........................................................................................................
102
Parte I: Purificação, expressão heteróloga e atividade inibitória de α-amilase
por uma defensina de sementes de feijão-de-corda...........................................
102
Parte II: Purificação, clonagem molecular e atividade antimicrobiana de uma
defensina de sementes de feijão comum.............................................................
107
6.CONCLUSÕES.....................................................................................................
110
7.REFERÊNCIAS.....................................................................................................
115
8. Anexos
8.1- Artigos publicados
__________________
LISTA DE FIGURAS/
ESQUEMAS/TABELAS
Lista de figuras/esquemas/tabelas ______________________________________________
VII
FIGURAS
Figura 1. Comparação entre estruturas encontradas elucidadas de diferentes
defensinas de plantas...............................................................................................
06
Figura 2. Feijão-de-corda (Vigna unguiculata L. Walp).............................................
14
Figura 3. Feijão comum (Phaseolus vulgaris L.).......................................................
16
Figura 4. Mapa de restrição do vetor pET-32 Ek/LIC................................................
27
Figura 5. Comparação das seqüências N-terminais das defensinas de feijão-de-
corda e feijão comum................................................................................................
49
Figura 6. Mapa de restrição do vetor pTZ57R/T.......................................................
51
Figura 7. Etapas de purificação da defensina de sementes de feijão-de-corda.......
61
Figura 8. Visualização eletroforética em gel de tricina na presença de SDS das
frações obtidas durante a purificação da defensina de sementes de feijão-de-
corda.........................................................................................................................
62
Figura 09. Visualização eletroforética das amostras obtidas da reação de PCR
utilizando diferentes concentrações dos iniciadores DEFs e DEFas e
temperaturas.............................................................................................................
65
Figura 10. Visualização eletroforética de amostras obtidas como produto da
digestão do vetor pET-DEF extraído de células bacterianas da linhagem JM109
com as enzimas de restrição EcoR I e Bgl II em gel de agarose 1%.......................
66
Figura 11. Visualização eletroforética de amostras obtidas da reação de PCR
feita diretamente de colônias bacterianas da linhagem BL21 (DE
3
) pLysS
transformadas com o plasmídeo pET-DEF utilizando os iniciadores DEFs e
DEFas.......................................................................................................................
67
Figura 12. Visualização, por SDS-PAGE, de extratos protéicos obtidos de
colônias positivas das células BL21 (DE
3
) pLysS clonadas com o vetor pET-DEF..
68
Figura 13. Western blotting das amostras dos extratos protéicos obtidos de
colônias BL21 (DE
3
) pLysS transformada com vetor pET-DEF e tratado com
anticorpo contra a cauda de histidina.......................................................................
69
Figura 14. Visualização, por SDS-PAGE, de extratos protéicos obtidos de uma
colônia positiva das células Rosetta gami 2 (DE
3
) pLysS clonadas com o vetor
pET-DEF...................................................................................................................
70
Figura 15. Cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 da fração sN1
oriunda da cromatografia de afinidade em Ni Sepharose.........................................
72
Lista de figuras/esquemas/tabelas ______________________________________________
VIII
Figura 16. Visualização, por SDS-PAGE, das diferentes frações obtidas durante a
purificação da defensina recombinante....................................................................
73
Figura 17. Alinhamento da seqüência N-terminal da defensina recombinante com
seqüências de outras defensinas obtidas a partir de pesquisa em banco de dados
(NCBI/BLAST)...........................................................................................................
75
Figura 18. A. Estrutura tridimensional da defensina recombinante modelada com
o programa Modeller, baseada na estrutura da defensina 2 de Vigna radiata
(VrD2) (código pdb 2gl1A)........................................................................................
76
Figura 19. Sobreposição das estruturas tridimensionais da defensina
recombinante e da defensina 2 de Vigna radiata (VrD2) (código pdb2gl1A)............
77
Figura 20. Mapa de Ramachandran da estrutura da defensina recombinante.........
78
Figura 21. Efeito da defensina de sementes de feijão-de-corda e da defensina
recombinante sobre a atividade α-amilásica de extratos intestinais dos insetos
Callosobruchus macullatus e Zabrotes subfasciatus................................................
80
Figura 22. Efeito da defensina de sementes de feijão-de-corda e da defensina
recombinante sobre a atividade α-amilásica da saliva humana................................
81
Figura 23. Purificação da defensina de sementes de feijão comum.........................
83
Figura 24. Visualização eletroforética em gel de agarose (0,8 %) do RNA total
extraído de sementes de feijão comum ...................................................................
86
Figura 25. Visualização eletroforética em gel de agarose (1%) do produto da
reação de PCR utilizando o iniciador DEFdeg..........................................................
87
Figura 26. Visualização eletroforética de produtos da digestão do vetor pTZ57R/T
(ligado ao cDNA amplificado utilizando o iniciador DEFdeg) extraído de células
bacterianas da linhagem DH5α com as enzimas de restrição EcoR I e BamH I em
gel de agarose 1 %...................................................................................................
88
Figura 27. Seqüência de nucleotídeos do cDNA amplificado por RT-PCR usando
o iniciador desenhado a partir da seqüência de defensina de feijão comum e
clonado no pTZ57R/T...............................................................................................
90
Figura 28. Comparação da seqüência deduzida de aminoácidos do peptídeo com
seqüências de defensinas de diferentes espécies de plantas obtidas a partir de
pesquisa em banco de dados (NCBI/BLAST)...........................................................
91
Figura 29. Árvore filogenética sem raiz das defensinas de plantas..........................
93
Figura 30. Efeito da defensina de feijão comum no crescimento de leveduras........
97
Figura 31. Microscopia eletrônica de varredura de células de leveduras crescidas
Lista de figuras/esquemas/tabelas ______________________________________________
IX
na presença da defensina de feijão comum.............................................................
98
Figura 32. Microscopia de fluorescência de células da Saccharomyces cerevisiae
incubadas com o corante SYTOX Green após tratamento com a defensina de
sementes de feijão comum (100 µg.mL
-1
).................................................................
99
Figura 33. Microscopia eletrônica de transmissão das células de levedura
Cândida albicans e C. guilliermondii........................................................................
100
ESQUEMAS
Esquema 1. Estratégia de clonagem no vetor pET-32 Ek/LIC..................................
26
TABELAS
Tabela 1. Peptídeos e pequenas proteínas de plantas com atividade
antimicrobiana...........................................................................................................
2
Tabela 2. Atividade antifúngica de defensinas contra fungos, leveduras,
oomicetos e bactérias...............................................................................................
11
Tabela 3. Principais doenças do feijoeiro comum. ...................................................
17
Tabela 4. Principais pragas do feijoeiro comum.......................................................
18
Tabela 5. Mapa estatístico da análise estrutural da defensina de sementes de
feijão-de-corda..........................................................................................................
78
____________________
ABREVIATURAS
Abreviaturas _______________________________________________________________
X
ABREVIATURAS
ATP Adenosina 5´-trifosfato
BSA
Albumina sérica bovina
DAB Diaminobenzidina
DAD “Diodo array detector”
DEAE Dietilaminoetil
DEFdeg Iniciador degenerado desenhado a partir da porção N-terminal da
defensina de sementes de feijão-de-corda
DEFs Iniciador específico desenhado a partir da porção N-terminal da
defensina de sementes de feijão-de-corda
DEFas Iniciador específico desenhado a partir da porção C-terminal da
defensina de sementes de feijão-de-corda
DEPC Dietilpirocarbonato
DMSO Dimetilsulfóxido
DNS Ácido 3,5-dinitrosalicílico
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético
HCl Ácido clorídrico
HPLC Cromatografia líquida de alto desempenho
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactosídeo
KCL Cloreto de postássio
kDa Quilodaltons
LB Luria-Bertani
LiCl Cloreto de lítio
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
ORF “Open reading frame”
pb Pares de base
PEG Polietilenoglicol
PITC fenilisotiocianato
PCR “Polymerase chain reaction”
PMSF Fluoreto de fenilmetilasulfonila
Abreviaturas _______________________________________________________________
XI
PVDF Polivinilidenodifluoreto
RMN Ressonância Nuclear Magnética
SDS Dodecil sulfato de sódio
TEMED N, N”, N”’, N””-tetrametiletilenodiamino
TFA Ácido trifluoroacético
Tris Tris(hidroximetil) amino etano
u Unidades de atividade
____________________
RESUMO
Resumo___________________________________________________________________
XII
Defensinas de plantas são peptídeos básicos, ricos em cisteína, que estão
amplamente distribuídos nos organismos vivos. Em plantas, são componentes
importantes da imunidade inata e têm sido descritas em diferentes órgãos, incluindo
as sementes. A primeira parte deste trabalho mostra a purificação e a expressão
heteróloga de uma defensina de sementes de feijão-de-corda e a descrição de sua
atividade inibitória contra α-amilases. A defensina de sementes de feijão-de-corda foi
purificada de acordo com a metodologia descrita por Carvalho et alli (2001), com
modificações. Após purificação, esta defensina foi submetida a ensaio de inibição da
atividade de α-amilases e se mostrou capaz de inibir as α-amilases dos insetos
Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus. O fragmento que codifica a
defensina de sementes de feijão-de-corda foi clonado no vetor pET EK/LIC, o qual
foi usado para transformação bacteriana. O peptídeo recombinante foi purificado
através de cromatografia de afinidade em coluna de Ni Sepharose e cromatografia
de fase reversa em coluna C2/C18 por HPLC. O sequenciamento N-terminal do
peptídeo recombinante mostrou que este possui a mesma sequência da defensina
isolada a partir das sementes. Ensaio de inibição da atividade α-amilásica mostrou
que a defensina recombinante também inibe a α-amilase de C. maculatus. As
defensinas isoladas não inibem a α-amilase salivar de humanos. A estrutura
tridimensional da defensina recombinante foi modelada e a estrutura resultante é
similar às estruturas de outras defensinas de plantas já caracterizadas.
Na segunda parte deste trabalho, é apresentada a clonagem molecular e a
atividade antifúngica de uma defensina de sementes de feijão comum. A seqüência
N-terminal da defensina madura isolada de sementes de feijão comum foi usada
para produzir um iniciador degenerado. Este iniciador permitiu a amplificação do
cDNA da defensina por RT-PCR a partir do mRNA de sementes de P. vulgaris.
Análise da sequência do cDNA clonado, nomeado PVD1, demonstrou que 314 bp
codificam um polipeptídeo de 47 resíduos de aminoácidos. A seqüência deduzida do
peptídeo apresenta grande similaridade com defensinas de Cicer arietinum (95%),
Vigna unguiculata (93%) e Pachyrhizus erosus (87%). A defensina de sementes de
feijão comum foi purificada através de cromatografias de troca iônica e de fase
reversa e posteriormente submetida à análise da sua atividade antifúngica. Esta
defensina inibiu o crescimento das leveduras Candida albicans, C. parapsilosis, C.
guilliermondii, Kluyveromyces marxiannus e Saccharomyces cerevisiae, além de
causar alterações na morfologia das células de C. albicans, C. tropicalis e S.
Resumo___________________________________________________________________
XIII
cerevisiae. Ensaio de captação de SYTOX Green revelou que esta defensina ainda
é capaz de alterar a permeabilidade da membrana plasmática de S. cerevisiae.
Análises da ultra-estrutura de células de C. albicans e C. guilliermondii tratadas com
a defensina de sementes de feijão comum revelaram desorganização do conteúdo
citoplasmático, bem como da membrana plasmática. A defensina de sementes de
feijão comum não inibem a atividade de α-amilases.
____________________
ABSTRACT
Abstract___________________________________________________________________
XIV
Plant defensins are basic cysteine-rich peptides widely distributed in living
organisms. In plants, they are important components of the innate immunity and have
been described in several organs including seeds. The first part of this work shows
the purification and heterologous expression of a defensin from cowpea seeds and
describes its α-amylase inhibitory activity. The cowpea seed defensin was purified
according methodology described by Carvalho et alli (2001), with modifications. After
purification, this defensin was tested for its α-amylase inhibition potential and was
seen to be able to inhibit α-amylases from the weevils Callosobruchus maculatus and
Zabrotes subfasciatus. The fragment encoding the cowpea defensin was cloned into
the pET EK/LIC vector, which was used for bacterial cells transformation. The
recombinant peptide was purified through affinity chromatography on a Ni Sepharose
column and reverse-phase chromatography on a C2/C18 column by HPLC. N-
terminal amino acid sequencing revealed that the recombinant peptide had the same
sequence of the defensin isolated from cowpea seeds. α-Amylase inhibition assays
showed that the recombinant defensin also inhibits α-amylase from the weevil C.
maculatus. Both purified defensins were unable to inhibit human salivary α-amylase
activity. The three-dimensional structure of the recombinant defensin was modeled
and the resulting structure was shown to be similar to other plant defensin structures
already characterized.
In the second part of this work, the molecular cloning and antifungal activity of
a defensin from common bean seeds is reported. The N-terminal sequence of the
mature defensin isolated from common bean seeds was used to produce a
degenerated primer. This primer allowed the amplification of the defensin cDNA by
RT-PCR from mRNA of common bean seeds. The sequence analysis of the cloned
cDNA revealed 314 bp encoding a polypeptide of 47 amino acids. The deduced
peptide amino acid sequence was highly similar to those from defensins of Cicer
arietinum (95%), Vigna unguiculata (93%) and Pachyrhizus erosus (87%). The
common bean seed defensin was purified through anion exchange and phase
reverse chromatographies and tested for its antifungal activity abilities. This defensin
inhibited the growth of the yeasts Candida albicans, C. parapsilosis, C. guilliermondii,
Kluyveromyces marxiannus and Saccharomyces cerevisiae; furthermore, it caused
morphologic alterations in the cells of C. albicans, C. tropicalis and S. cerevisiae. A
SYTOX Green uptake assay revealed that the common bean seed defensin is able to
modify the plasma membrane permeability of S. cerevisiae cells. Ultrastructural
Abstract___________________________________________________________________
XV
analysis of C. albicans and C. guilliermondii cells treated with the common bean seed
defensin revealed disorganization of both cytoplasmic content and plasmma
membrane. The common bean seed defensin was unable to inhibit α-amylases.
____________________
INTRODUÇÃO
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 1
1. INTRODUÇÃO
1.1- Os peptídeos antimicrobianos de plantas
Apesar da aparente passividade associada ao seu caráter sedentário, as
plantas são capazes de perceber e responder às alterações ambientais ou ao
ataque de organismos agressores. Para isso, desenvolveram sofisticados
mecanismos de defesa os quais são efetivos tanto para estresses bióticos quanto
para estresses abióticos (Agrios, 1997; Shewry e Lucas, 1997; Moraes, 1998).
De um modo geral, as defesas de plantas são agrupadas em duas grandes
categorias: as defesas constitutivas, quando estas fazem parte do programa de
desenvolvimento normal da planta; e as defesas induzidas, quando estão
diretamente envolvidas na resposta a algum fator de estresse. Essas duas
categorias podem ainda ser subdivididas em: defesas estruturais (barreiras físicas
que impedem o acesso do organismo agressor à planta) e defesas bioquímicas
(compostos tóxicos ao desenvolvimento/crescimento do organismo agressor)
(Gomes e Xavier-Filho, 1994; Agrios, 1997; Shewry e Lucas, 1997).
Diferentes classes de proteínas têm sido identificadas como importantes
componentes da defesa de plantas. A grande maioria atua diretamente sobre o
metabolismo do patógeno ou herbívoro agressor impedindo seu desenvolvimento,
exibindo assim atividades antimicrobianas e/ou anti-inseticidas (Carlini e Grossi-de-
Sá, 2002; Broekaert et al., 1997; Castro e Fontes, 2005). Dentre as proteínas
descritas como participantes ativas da defesa de plantas, podemos citar: as lectinas
(Melo et al., 2005; De Hoff et al., 2009), as proteínas RIPs (Kim et al., 2004), as
vicilinas (Gomes et al., 1997), as albuminas 2S (Agizzio et al., 2006), as β-1,3-
glucanases (Gonzáles et al., 2009), os inibidores de proteases e amilases (Habib e
Fazili, 2007) as quitinases (López e Gómez-Gómez, 2009), as peroxidases
(Gonzáles et al., 2009), as toxinas vegetais (Vasconcelos et al., 1994; Carlini e
Grossi-de-Sá, 2002) e os peptídeos antimicrobianos (Castro e fontes, 2005).
Os peptídeos antimicrobianos são moléculas pequenas, com massa
molecular entre 3 e 10 kDa, que possuem carga líquida positiva em pH fisiológico.
São ricos em cisteínas (4, 6 ou 8), as quais são pareadas através de pontes
dissulfeto (2, 3 ou 4) conferindo uma alta estabilidade à molécula (Broekaert et al.,
1997). São denominados antimicrobianos por apresentarem atividade inibitória sobre
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 2
o crescimento de diferentes patógenos, incluindo bactérias, Gram negativas e
positivas, e fungos (Hancock e Diamond, 2000; Castro e Fontes, 2005). Têm sido
descritos tanto como componentes da defesa constitutiva, quanto como
componentes da defesa induzida (Castro e Fontes, 2005; Sels et al., 2008).
Nos últimos anos, uma grande variedade de peptídeos que possuem
atividade antimicrobiana, tem sido isolada de plantas. Estudos têm demonstrado que
estes peptídeos, além de serem ativos contra uma grande variedade de patógenos,
são também ativos contra insetos (Svensson et al., 2004; Liu et al., 2006; Ribeiro et
al., 2007; Solis et al., 2007).
Baseando-se na similaridade das estruturas primárias, os peptídeos
antimicrobianos podem ser classificados em 10 diferentes famílias, a saber:
proteínas transportadoras de lipídeos (LTPs), snakinas, tioninas, peptídeos do tipo
heveína, peptídeos do tipo knotinas, seferdinas, peptídeos MBP-1, peptídeos
macrocíclicos, peptídeos Ib-AMPs, e defensinas. Na tabela 1 estão relacionadas as
diferentes classes de peptídeos antimicrobianos e as atividades antimicrobianas
descritas para cada uma delas (García-Olmedo et al., 2001, Ribeiro et al., 2007).
Tabela 1. Peptídeos e pequenas proteínas de plantas com atividade antimicrobiana
FAMÍLIA
Nº DE RESÍDUOS
DE
AMINOÁCIDOS
Nº DE
PONTES
DISSULFETO
ATIVIDADE
LTPs 90 – 95 3 – 4 Antibacteriana; antifúngica
Snakinas 61 – 70 6 Antibacteriana; antifúngica
Defensinas 45 – 54 4
Antibacteriana; antifúngica; inibe α-amilase
Tioninas 45 – 47 3 – 4 Antibacteriana; antifúngica
Tipo heveína 43 4 Antibacteriana (Gram +); antifúngica
Tipo knotina 36 – 37 3 Antibacteriana (Gram +); antifúngica
Seferdinas 28 – 38 0 Antibacteriana; antifúngica
MBP-1 33 2 Antibacteriana; antifúngica
Macrocíclicos 29 – 31 3 Antibacteriana (Gram +)
Ib-AMPs 30 2 Antibacteriana (Gram +); antifúngica
Fonte: Adaptado de
Ribeiro et al., 2007
.
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 3
1.2- As defensinas de plantas
As primeiras defensinas de plantas foram isoladas no início da década de 90,
a partir de sementes de trigo (Collilla et al., 1990). Inicialmente, por possuírem o
mesmo número de resíduos de cisteína das tioninas e massa molecular em torno de
5 kDa, as defensinas foram descritas como tioninas. Nesta ocasião, foi criada uma
nova classe de tioninas, as γ-tioninas, para reunir estas moléculas, pois as mesmas
não possuíam o mesmo padrão de formação de pontes dissulfeto das classes já
existentes, α- e β-tioninas. Alguns anos depois, devido às suas propriedades
antimicrobianas e sua semelhança estrutural às defensinas de insetos e mamíferos,
elas foram renomeadas como defensinas de plantas (Terras et al., 1995).
As defensinas de plantas são pequenas moléculas protéicas de 45 a 54
resíduos de aminoácidos, básicas e ricas em cisteína (8 resíduos) (Thomma et al.,
2002; Carvalho e Gomes, 2009). São importantes componentes da imunidade inata
de plantas e estão amplamente distribuídas entre as espécies vegetais, estando
localizadas em diversos tecidos e órgãos. Dentre outras espécies, já foram descritas
defensinas em rabanete (Terras et al., 1992), trigo (Gaudet et al., 2003), cevada
(Méndez et al., 1996), ervilha (Lobo et al., 2007), feijão (Carvalho et al., 2001) e
girassol (Zélicourt et al., 2007).
1.2.1- As defensinas e a defesa de plantas
Diferentes estudos têm demonstrado o envolvimento das defensinas com a
defesa de plantas. Em 1992, Terras et alli relataram a presença de duas defensinas
antifúngicas em sementes de rabanete, as defensinas RS-AFP
1
e RS-AFP
2
.
Posteriormente, em 1995, estes autores mostraram que defensinas eram
acumuladas em folhas de rabanete em resposta ao ataque fúngico (Terras et al.,
1995). Nesta mesma ocasião, estes autores mostraram que defensinas eram
exsudadas das sementes de rabanete durante a germinação, em concentrações
capazes de inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos, sugerindo a participação
destas moléculas na proteção da semente. Terras et alli (1995) mostraram ainda,
através de estudos de imunomarcação, que as defensinas estavam localizadas na
parede celular, nos espaços extracelulares do cotilédone e em camadas periféricas
das sementes, localização bastante adequada a um componente do sistema de
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 4
defesa que estaria presente nas regiões onde ocorrem os primeiros contatos do
fungo com a semente.
Confirmando definitivamente a participação das defensinas na defesa de
plantas Terras et alli (1995) introduziram o gene que codifica a defensina Rs-AFP
2
em plantas de tabaco. Por comparação do número e da área das lesões causadas
pelo fungo Alternaria longipes, verificou-se que nas plantas transformadas, as áreas
de lesão foram de sete a oito vezes menores que nas plantas controles. Este estudo,
além de confirmar a participação das defensinas na defesa de plantas, forneceu
indícios do possível potencial biotecnológico destas moléculas.
A resistência de plantas conferida pela introdução de genes que codificam
para defensinas foi mostrada por diferentes autores. Kanzaki et alli (2002)
mostraram que plantas de arroz transgênicas que expressam constitutivamente o
gene de uma defensina de Wasabia japonica apresentaram resistência aumentada
contra o fungo Megnaporthe grisea. De forma semelhante, Turrini et alli (2004)
mostraram que plantas de Solanum melongena expressando a defensina Dm-AMP
1
de Dahlia merckii apresentaram resistência contra o fungo Botrytis cinerea e
exsudavam essa defensina pelas raízes, o que demonstrou reduzir o crescimento do
fungo fitopatogênico Verticillium albo-atrum. É importante ressaltar, que estes
autores mostraram ainda que a introdução desse gene para defensina não interferiu
com o estabelecimento da simbiose entre tais plantas transgênicas e o fungo
micorrízico arbuscular Glomus mosseae. Mais recentemente, Zhu et alli (2007)
mostraram que plantas de mamão expressando a defensina de Dahlia merckii
DmAMP1 apresentava resistência ao patógeno Phytophthora palmivora.
É valido lembrar que, apesar da expressão de defensinas ser amplamente
relacionada com estresses bióticos, alguns autores têm demonstrado que as
defensinas também podem estar atuando na defesa de plantas contra estresses
abióticos. Galdet et alli (2003) demonstraram que baixas temperaturas eram
capazes de induzir a expressão de uma defensina em sementes de trigo. Mais
recentemente, Mirouze et alli (2006) apontaram que uma defensina de Arabidopsis
halleri era capaz de conferir tolerância ao metal pesado zinco.
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 5
1.2.2- Aspectos estruturais
Estudos da estrutura tridimensional de defensinas encontradas em diferentes
espécies de plantas revelaram que estas moléculas são bastante semelhantes entre
si (Almeida et al., 2002). De um modo geral, a estrutura das defensinas de plantas é
composta por três folhas β e uma α-hélice, sendo estes elementos da estrutura
secundária conectados através de três alças. A estrutura das defensinas de plantas
é estabilizada por quatro pontes dissulfeto (Fant et al., 1998; Almeida et al., 2002;
Carvalho e Gomes, 2009) (Fig. 1A). Duas dessas pontes são formadas entre as
Cys21 da α-hélice e Cys45 da última folha β e entre a Cys25 da α-hélice e Cys47 da
última folha β formando um arranjo estrutural denominado de domínio αβ
estabilizado por Cys (Fant et al., 1998; Cornet et al., 1995; Almeida et al., 2002).
Embora exista uma grande similaridade entre as estruturas das defensinas de
plantas, recentemente foram descritas algumas defensinas que possuem estruturas
diferenciadas. A defensina 1 de Vigna radiata,VrD1, apresenta em sua estrutura uma
hélice extra denominada hélice 3
10
(Fig. 1B). Além desta, as defensinas isoladas de
flores de Petunia hybrida, PhD1 e PhD2, apresentam em sua estrutura 5 pontes
dissulfeto (Janssen et al., 2003; Lay et al., 2003a; Lay et al., 2003b) (Fig. 1C).
Mesmo com estas diferenças estruturais, estas defensinas continuam apresentando
o domínio αβ estabilizado por Cys. A figura 1 mostra os três tipos de estrutura
descritos para as defensinas de plantas.
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 6
Figura 1. Comparação entre estruturas elucidadas de diferentes defensinas de
plantas. A. Estrutura da defensina PsD1 de Pisum sativum (Almeida et al., 2002); B.
Estrutura da defensina VrD1 de Vigna radiata (Liu et al., 2006); C. Estrutura da
defensina PhD1 de Petunia hybrida (Jans et al., 2003). (N) Região N-terminal; (C)
região C-terminal; (α1) α-hélice; (β1) folha β 1; (β2) folha β 2; (β3) folha β 3; (3
10
) α-
hélice 3
10
.
A
β1
β2
β3
α1
C B
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 7
1.2.3- Atividades descritas in vitro para as defensinas de plantas
Diferentes atividades têm sido descritas in vitro para as defensinas de plantas,
muitas delas reforçam o papel destes peptídeos na defesa de plantas. Já foram
descritas defensinas inibidoras da síntese protéica (Méndez et al., 1996; Chen et al.,
2004; Wong et al., 2006); bloqueadoras de canais iônicos (Kushmerick et al., 1998;
Spelbrink et al., 2004); inibidoras de tripsina (Wijaya et al., 2000) e de α-amilases
(Bloch and Richardson, 1991; Pellegrini et al., 2005; Liu et al., 2006) e
antimicrobianas (Thevissen et al., 1999; Carvalho et al., 2001; Franco et al., 2006;
Finkina et al., 2008).
Méndez et alli (1990) foram os primeiros a relatar a capacidade das
defensinas de plantas de inibirem a síntese protéica. Estes autores mostraram que
uma γ-tionina de sementes de cevada era capaz de inibir a síntese protéica em um
sistema livre de células eucarióticas. Mais recentemente, Chen et alli (2002 e 2004)
e Wong et alli (2006) relataram a presença de outras defensinas com capacidade de
inibir a síntese protéica em sementes de Vigna radiata e Phaseolus vulgaris,
respectivamente. O mecanismo de ação destas defensinas ainda não está descrito,
porém os dados apresentados nos estudos acima citados mostram que as
defensinas inibem a tradução em diferentes momentos, tanto na iniciação quanto na
elongação da cadeia polipeptídica.
Alguns autores têm demonstrado ainda que as defensinas de plantas podem
interferir com a atividade de canais iônicos. Este efeito foi relatado para as
defensinas γ1-zeationina e γ2-zeationina de milho (Kushmerick et al., 1998) e para a
defensina MsDEF
1
de Medicago sativa (Spelbrink et al., 2004). Devido à sua
similaridade estrutural à proteína KP4, um bloqueador de canal de cálcio
dependente de voltagem, Spelbrink et alli (2004) sugeriram que as defensinas de
plantas podem funcionar como bloqueadores de canais iônicos. Novos estudos são
necessários para se determinar a relação desta atividade com outras funções das
defensinas de plantas como a sua atividade antifúngica, por exemplo, uma vez que o
íon Ca
2+
é uma molécula sinalizadora envolvida em diferentes processos na
fisiologia dos fungos. Dentre outros processos, o Ca
2+
é importante para a formação
do broto e para a elongação da hifa.
Em 2000, Wijaya et alli relataram uma outra atividade para esta classe de
moléculas. Estes autores isolaram 2 peptídeos de sementes de Cassia fistula
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 8
homólogos às defensinas de plantas, denominados 5459 e 5144. 5459 é um inibidor
de tripsina, enquanto 5144 não possui esta mesma característica. As estruturas
primárias destes dois peptídeos são muito semelhantes, diferindo em poucos
resíduos, mas parece ser a troca da Thr
25
(5144) por uma Lys
25
(5459)
o fator
determinante desta atividade. O mecanismo de inibição de tripsina pelas defensinas
de plantas ainda não está determinado, mas Melo et al. (2002) relataram que a Lys
11
da tionina Cp-tionina de V. unguiculata se ligava à tripsina causando inibição.
As atividades mais bem caracterizadas para as defensinas de plantas são: a
atividade antimicrobiana, relatada principalmente contra fungos (Osborn et al., 1995;
Thevissen et al., 1999; Carvalho et al., 2001; Wang e Ng,2006; Sollis et al., 2007) e
atividade inibitória de α-amilases (Block and Richardison, 1991; Pellegrini et al.,
2005; Liu et al., 2006).
1.2.3.1- Defensinas de plantas e a inibição de α-amilases
As α-amilases (α-1,4 glucano-4-glucanohidrolases) são enzimas
monoméricas que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas α-1,4 do amido.
Estão amplamente distribuídas em microrganismos, plantas e secreções de animais.
Estas enzimas exercem um importante papel no metabolismo de carboidratos, pois
são responsáveis pela clivagem do amido. Este é um passo essencial no processo
de assimilação de carboidratos que constituem um dos principais componentes da
dieta animal. Assim como para outros animais, para os insetos, especialmente
aqueles que vivem em sementes e grãos ricos em amido, as α-amilases são
essenciais para o crescimento e desenvolvimento (Payan, 2004).
A inibição de α-amilases foi uma das estratégias desenvolvidas pelas plantas
para se defenderem de seus agressores amidolíticos, principalmente os insetos.
Seis diferentes classes de inibidores de α-amilases foram descritas em plantas: os
peptídeos do tipo knotinas, as CM-proteínas, os inibidores do tipo Kunitz, as
taumatinas, as lectinas e as defensinas (Svensson et al., 2003).
A atividade inibitória de α-amilases das defensinas de plantas vem se
tornando alvo de muitos estudos. Foi inicialmente descrita por Bloch e Richardson,
em 1991, que relataram a presença de uma defensina de 5 kDa inibidora da
atividade de α-amilase em sementes de Sorghum bicolor. Posteriormente, alguns
outros autores relataram a existência de outras defensinas de plantas inibidoras de
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 9
α-amilases (Chen et al., 2002; Chen et al., 2005; Pellegrini et al., 2008). A presença
de defensinas com atividade inibitória de α-amilase foi ainda relatada em sementes
de Vigna radiata (Chen et al., 2002) e V. angularis (Chen et al., 2005).
Chen et alli (2002) mostraram que sementes artificiais contendo 0,2 % da
proteína rVrD1 (homólogo recombinante da defensina VrD1, de V. radiata, expressa
em Escherichia coli) tinham efeito letal sobre o desenvolvimento de Callosobruchus
chinensis. Posteriormente, Chen et alli (2004) obtiveram resultados semelhantes
expressando um homólogo recombinante da defensina VrD1 em Pichia pastoris. Em
2005, Chen et alli mostraram a clonagem e caracterização de VaD1, uma defensina
isolada de sementes de V. angularis. VaD1 que quando incorporada a sementes
artificiais na concentração de 0,8 %, também inibe o desenvolvimento de C.
chinensis.
O mecanismo de ação das defensinas inibidoras de α-amilases ainda não
está totalmente descrito. Liu et alli (2006) mostraram que a alça de conexão entre as
folhas β, β
2
e β
3,
das defensinas de plantas era o componente estrutural responsável
pela inibição de α-amilases. Neste estudo, os autores sugeriram que tanto o
comprimento desta alça quanto a sua composição de aminoácidos (distribuição de
carga eletrostática) influenciava nesta inibição. Lin et alli (2007), utilizando diferentes
quimeras protéicas construídas a partir da defensina 2 de V. radiata (VrD2),
confirmaram a importância desta alça para a inibição de proteases e/ou α-amilases.
Em 2008, Pellegrini et alli mostraram que a defensina de feijão-de-corda VuD1 utiliza
resíduos tanto de sua porção N-terminal quanto da porção C-terminal para bloquear
o sítio ativo da α-amilase do inseto Z. subfasciatus. Este grupo mostrou ainda que a
inibição da enzima seria mediada, em grande parte, através de ligações iônicas e
pontes salinas e de hidrogênio feitas entre a defensina de sementes de feijão-de-
corda e o sítio catalítico da enzima.
Em seu trabalho de 2007, Lin et alli sugeriram que as diferenças estruturais
tridimensionais entre VrD1 e VrD2 poderiam ser o fator responsável por VrD1 ter
efeito inibitório sobre a atividade de α-amilases e VrD2 não apresentar este mesmo
efeito. Porém, Pellegrini et alli (2008) mostraram que apesar de a defensina VuD1
possuir estrutura primária bastante semelhante à VrD2, ela é funcionalmente
semelhante à defensina VrD1.
Alguns inibidores protéicos de α-amilases apresentam uma rigorosa
especificidade para a enzima alvo, atuando apenas sobre uma enzima ou sobre um
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 10
grupo específico de enzimas. Já foram descritos vários exemplos de inibidores
agindo em enzimas de insetos, mas não em enzimas de mamíferos e vice-versa
(Reis et al., 1997). Outros inibidores têm afinidade por diferentes enzimas, desde
que elas apresentem alguma homologia entre si. Este é o caso de inibidores que
atuam tanto sobre as α-amilases de insetos quanto de mamíferos as quais possuem
cerca de 35 % de homologia entre si (Svensson et al., 2004; Kluh et al., 2005).
Assim como muitos outros inibidores descritos, as defensinas de plantas
podem funcionar como inibidores específicos (Lin et al., 2007). Bloch e Richardson
em 1991, quando demonstraram a capacidade das defensinas de plantas de
inibirem α-amilases, mostraram que as defensinas encontradas em sementes de
Sorghum bicolor eram capazes de inibir as α-amilases de gafanhotos e baratas, mas
causavam apenas uma leve inibição sobre as α-amilases do fungo Aspergillus
oryzae e salivar humana. Além disto, estes peptídeos não possuíam nenhuma
atividade sobre as α-amilases de cevada, pancreática de porco e de espécies do
gênero Bacillus spp.
1.2.3.2- Atividade antimicrobiana das defensinas de plantas
A atividade antimicrobiana das defensinas tem sido demonstrada por
diferentes autores sendo a atividade mais bem caracterizada para defensinas de
origem vegetal, principalmente a que diz respeito à inibição do crescimento de
fungos. Diversas espécies de fungos têm o crescimento inibido pelas defensinas de
plantas e dentre eles estão vários patógenos de plantas (Tabela 1) (Terras et al.,
1992; Terras et al., 1993; Osborn et al., 1995). A concentração inibitória varia muito
e é dependente do fungo e da proteína testados; por exemplo, Fusarium culmorum é
inibido por Ah-AMP
1
com 12 µg.mL
-1
(IC
50
), enquanto é inibido por Rs-AFP
2
com 1,5
µg.mL
-1
(IC
50
) (Tabela 2).
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 11
Tabela 2. Atividade antifúngica de defensinas contra fungos, leveduras, oomicetos e
bactérias.
Os valores são mostrados em concentrações expressas em µg.mL
-1
necessárias para se
obter 50 % da inibição do crescimento do fungo (IC
50
). (-), atividade não determinada; sa,
atividade inibitória acima de 500 µg.mL
-1
; >*1, atividade acima de 100 µg.mL
-1
; >*2, atividade
acima de 200 µg.mL
-1
; Ah, Aesculus hippocastanum; At, Arabidopsis thaliana; Bn, Brassica
napus; Br, Brassica rapa; Ct, Clitorea ternatea; Dm, Dahlia merckii; Hs, Heuchera
sanguinea; Rs, Raphanus sativus;
+
, dados obtidos de Terras et al. (1992); #, de Terras et al.
(1993); *, de Osborn et al. (1995). Fonte: Adaptado de Carvalho, 2005.
Terras et alli (1992) foram os primeiros a mostrar a atividade antifúngica
destas moléculas. Nesta ocasião, eles relataram que defensinas de sementes de
rabanete eram capazes de inibir o crescimento de patógenos fúngicos através de
hiper-ramificação e redução do crescimento da hifa. Posteriormente, Thevissen et
alli (1999) mostraram a inibição do crescimento do fungo Neurospora crassa pela
defensina Rs-AFP
2
de rabanete. Em 2001, Carvalho et alli relataram a presença de
uma defensina em sementes de feijão-de-corda que, atuando em sinergismo com
uma LTP, inibia o crescimento de fitopatógenos fúngicos de importância econômica.
DEFENSINAS
µg.mL
-1
(IC
50
)
Fungos Ah
1
Ct
1
Dm
1
Dm
2
Hs
1
Rs
1
Rs
2
Br
1
Br
2
At
1
Bn
1
Bn
2
Botrytis cinerea
25
*
20
*
12
*
10
*
6
*
8
#
10
*
1,5
#
>*1
#
3,9
#
2
#
2
#
Cladosporium sphaerospermum
0,5
*
6
*
3
*
3
*
1
*
- 3
*
- - - - -
Fusarium culmorum 12
*
10
*
5
*
3
*
1
*
5
#
1,5
*
1,2
#
38
#
3
#
2,8
#
2,1
#
Leptosphaeria maculans
0,5
*
6
*
1,5
*
1
*
25
*
- 12
*
- - - - -
Penicillium digitatum
6
*
20
*
2
*
2
*
1
*
- 1,5
*
- - - - -
Trichoderma viride
>*1 >*1
*
>*1
*
>*1
*
15
*
- 30
*
- - - - -
Septoria tritici 0,5
*
2
*
1
*
1
*
0,5
*
- 1,5
*
- - - - -
Verticilium albo-atrum
6
*
2
*
4
*
2
*
12
*
- 12
*
- - - - -
Alternaria brassicola
- - - - - 15
#
2
#
3
#
75
#
10
#
0,6
#
1,2
#
Fusarium oxysporum lycorpesici
- - - - - 30
#
2
#
1,8
#
42
#
3
#
1,3
#
1,5
#
Pericularia oryzae
- - - - - 0,3
#
0,4
#
0,25
#
3
#
0,25
#
0,35
#
0,25
#
Verticilium dahlae
- - - - - 5
#
1,5
#
0,8
#
15
#
1,5
#
1,2
#
1
#
Phythophtora infestans
- - - - - 3
+
25
+
- - - - -
Saccharomyces cerevisiae - - - - - sa
#
sa
#
sa
#
sa
#
sa
#
sa
#
sa
#
Bactérias Gram +
Bacilus megaterium - - - - - sa
#
- sa
#
52
#
sa
#
Sarcina lutea
- - - - - sa
#
- sa
#
sa
#
sa
#
Bacillus subtilis
100
*
15
*
150
*
- >*2
#
- >*2
#
- - - -
Staphylococcus aureus
sa
#
sa
#
sa
#
- >*2
#
- >*2
#
-
- - -
Microcous luteus sa
#
sa
#
sa
#
- >*2
#
- >*2
#
-
- - -
Streptococcus faaecalis
sa
#
sa
#
sa
#
- >*2
#
- >*2
#
-
- -
Bactérias Gram -
Agrobacterium tumefaciens
- - - - - sa
#
-
sa
#
sa
#
sa
#
Alcalignes eutrophus
- - - - - sa
#
-
sa
#
sa
#
sa
#
Azospirillum brasilenses
- - - - - sa
#
-
sa
#
sa
#
sa
#
Escherichia coli sa
#
sa
#
sa
#
- >*2
#
sa
#
-
sa
#
sa
#
sa
#
Erwinia carotovora
- - - -
-
sa
#
-
sa
#
sa
#
sa
#
Pseudomonas solanacearum
- - - -
- -
sa
#
sa
#
sa
#
Proteus vulgaris
sa
#
sa
#
sa
#
-
sa
#
-
sa
#
- - -
MICRORGANISMOS
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 12
Mais recentemente, em 2007, Solis et alli mostraram o efeito inibitório da defensina
de maca (Lepidium meyenii) sobre o desenvolvimento do fungo fitopatogênico
Phytophthora infestans.
Diferentes estudos têm sido feitos no sentido de se desvendar o mecanismo
de ação das defensinas de plantas, porém este ainda não foi totalmente elucidado.
Thevissen et alli (1996) relataram que a presença das defensinas Rs-AFP
2
(defensina de Raphanum sativus) e Dm-AMP
1
(defensina de Dahlia merckii) no meio
de crescimento do fungo Neurospora crassa resultava em um influxo de Ca
+2
, efluxo
de K
+
e uma concomitante alcalinização do meio de incubação. Posteriormente, este
mesmo grupo mostrou que a presença de Rs-AFP
2
e Dm-AMP
1
no meio de cultura
causava a permeabilização da membrana do fungo Neurospora crassa (Thevissen et
al., 1999). Em 2000, Thevissen et alli mostraram que a presença de esfingolipídeos
na membrana plasmática de S. cerevisiae era necessária para a atividade
antifúngica de Dm-AMP
1
.
Algum tempo depois, este grupo comprovou que a
defensina Dm-AMP
1
realmente interagia com esfingolipídeos da membrana de S.
cerevisiae e sugeriram que o receptor para Dm-AMP
1
na membrana de S. cerevisiae
fosse o esfingolipídeo manosildiinositolfosfoforil-ceramida (Thevissen et al., 2003a).
Thevissen et alli (2003a) mostraram ainda que a melhor condição para a interação
entre as defensinas de plantas e seu possível receptor era quando havia no meio
concentrações equimolares de esfingolipídeos e ergosteróis. Esta é uma condição
que ocorre nos rafts de lipídeos. Assim, sugere-se que as defensinas de plantas
têm, além de um receptor, um sítio específico de interação com a membrana.
Estudos semelhantes também foram realizados utilizando a defensina Rs-
AFP
2
. Em 2003, Thevissen et alli mostraram que Rs-AFP
2
interage com
glicosilceramidas presentes na membrana fúngica (Thevissen et al., 2003b) e que
esta defensina não é capaz de se ligar às glicosilceramidas presentes nas células de
humanos e de soja. Segundo estes autores isto acontece devido ao fato de os
lipídeos encontrados nestas células serem estruturalmente diferentes. Os dados
acima relatados nos dão indícios de que as defensinas de plantas podem atuar
sobre microorganismos também de uma maneira específica. Além da estrutura dos
lipídios que constituem a membrana, a composição lipídica da mesma parece
determinar a susceptibilidade e/ou resistência às defensinas de plantas. Ferket et alli
(2003) demonstraram que mutantes do fungo Neurospora crassa com maiores
quantidades de esteril-glicosil (ergosterol-β-D-glicopiranosideo) em sua membrana
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 13
eram resistente às defensinas Rs-AFP
2
,
Dm-AMP
1
e HsAFP
1
(defensina de
Heuchera sanguinea). Adicionalmente, Thevissen et alli (2007) mostraram que as
defensinas HsAFP
1
e RsAFP
2
eram capazes de inibir o crescimento de Candida
albicans e C. krusei, mas não de C. glabrata e atribuem que estes dados se devem
ao fato de que C. glabrata não sintetiza glicosilceramidas (possível receptor para
RsAFP
2
).
Recentemente, Aerts et alli (2007) demonstraram que RsAFP
2
induz a
produção endógena de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células de C.
albicans e que tanto esta produção de ROS quanto a atividade antifúngica
desaparece na presença do antioxidante ácido ascórbico, o que sugere uma ligação
causal entre a atividade antifúngica de RsAFP
2
e a produção de ROS por ela
mediada. Estes autores sugerem ainda que, a permeabilização da membrana é
conseqüência de uma sinalização intracelular gerada pela ligação de RsAFP
2
com
as glicosilceramidas da membrana e não simplesmente a ação direta deste peptídeo
na membrana através de sua interação com este esfingolipídeo.
Até agora, não está claro se as defensinas de plantas acima citadas são
internalizadas pelas células fúngicas através de sua interação com os
esfingolipídeos de membrana, ou se elas se mantêm do lado de fora da célula e
modulam processos que levam a morte celular (como por exemplo, produção de
ROS e apoptose) via interação com os esfingolipídeos de membrana. No entanto,
Lobo et alli (2007) relataram a internalização da defensina Psd1 (defensina de Pisum
sativum) por células do fungo Neurospora crassa e a sua interação com uma ciclina
F relacionada com o ciclo celular do fungo, descrevendo assim um possível alvo
intracelular para as defensinas de plantas.
Poucos são os estudos relatando a atividade antibacteriana das defensinas
de plantas. A atividade inibitória contra bactérias é bem menos pronunciada e é
observada, principalmente, contra bactérias Gram-positivas (Carvalho e Gomes,
2009), embora alguns autores têm demonstrado a atividade destes peptídeos sobre
bactérias Gram negativas (Terras et al., 1993; Franco et al., 2006).
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 14
1.3- O feijão-de-corda
O feijão-de-corda ou caupi, Vigna unguiculata (L.) Walp., é uma espécie da
família Fabaceae (anteriormente, Leguminosae) que teve sua origem no continente
africano, mas que atualmente é amplamente cultivada nas regiões tropicais e
subtropicais (Singh e Singh, 1985). É uma espécie considerada bastante tolerante a
secas e adaptada a solos arenosos, condições em que outras leguminosas não se
desenvolvem bem (Ehlers e Hall, 1997; Singh et al., 2002) (Fig. 2).
Figura 2. Feijão-de-corda (Vigna unguiculata L. Walp). (A) ilustração de uma planta
de feijão-de-corda (Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Vigna_unguiculata); (B) flor de
feijão-de-corda (Fonte: http://www.loc.gov/rr/scitech/mysteries/blackeyedpeas.html);
(C) fruto (vagens) de feijão-de-corda (fonte:
http://www.paginarural.com.br/noticias_detalhes.php?id=91959); (D) diversas
variedades de sementes de feijão-de-corda (Foto de Dr. André de Oliveira Carvalho).
Apesar da importância social e do potencial econômico que representa, uma
grande parcela da produção anual de feijão-de-corda é perdida devido ao ataque de
pestes e patógenos (Gomes e Xavier Filho, 1994; Ehlers e Hall, 1997; Brito et al.,
A
B
D
C
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 15
2006). Estes causam perdas tanto na quantidade como na qualidade do produto.
Dentre os agentes patogênicos que infectam o feijão-de-corda, certamente os
fungos agrupam o maior número de patógenos nocivos à cultura, embora algumas
espécies de bactérias e nematóides e grupos de vírus proporcionem algumas vezes
danos significativos (Allen, 1982; Rios e Zimerman, 1987).
A principal praga que incide sobre os grãos de feijão-de-corda é o caruncho
Callosobruchus maculatus. A infestação por este inseto começa no campo, mas a
maioria dos danos é feita durante o armazenamento. Sementes danificadas por este
inseto perdem peso, valor nutritivo e sua capacidade germinativa, tornando-se
inadequadas para o consumo humano e comercialização (Barreto e Quinderé, 2000;
Almeida et al., 2004; Boeke et al., 2004).
Diferentes proteínas e peptídeos de defesa têm sido isolados de sementes de
feijão-de-corda. Estes parecem atuar tanto contra patógenos quanto contra insetos.
Inicialmente, Macedo et alli (1993) mostraram a relação de globulinas 7S do tipo
vicilinas de sementes de feijão-de-corda com a resistência dessas sementes à sua
principal praga, o C. maculatus. Posteriormente, Gomes et alli, relataram que essas
proteínas de reserva também tinham a capacidade de inibir o crescimento de
fitopatógenos fúngicos (Gomes et al., 1997; Gomes et al., 1998a; Gomes et al.,
1998b). Em 2001, Carvalho et alli mostraram que peptídeos antimicrobianos (LTP e
defensina) de sementes de feijão-de-corda possuíam efeito inibitório sobre o
desenvolvimento dos fungos filamentosos Fusarium oxysporum e F. solani.
Posteriormente, Nobrega et alli (2005) mostraram que em exsudados obtidos
durante a germinação de sementes de feijão-de-corda estavam presentes uma LTP,
uma quitinase e uma β-1,3-glucanase e que tais exsudados eram capazes de inibir o
crescimento do fungo filamentoso Fusarium oxysporum, sugerindo uma ativação
destas proteínas na proteção da semente durante a germinação. Mais
recentemente, Aguiar et alli (2006) mostraram o que uma cistatina presente em
sementes de feijão-de-corda inibe proteinases intestinais dos insetos
Acanthoscelides obtectus e Z. subfasciatus, além de causar a redução de tamanho e
mortalidade das larvas destes insetos quando incorporada à dieta dos mesmos.
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 16
1.4- O feijão comum
O gênero Phaseolus (família Fabaceae) originou-se das Américas e possui
cerca de 55 espécies, das quais cinco são cultivadas; P. vulgaris L., P. lunatus L., P.
coccineus L., P. acutifolius A. Gray var. latifolius Freeman e P. polyanthus
Greenman. O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é a mais importante, por ser a
espécie cultivada mais antiga e mais utilizada nos cinco continentes (Vieira et al.,
2006) (Fig. 3).
Figura 3. Feijão comum (Phaseolus vulgaris L.). (A) ilustração de uma planta de
feijão comum (Fonte: http://www.maviga.com/espanol/who_we_are.asp); (B) flor do
feijoeiro comum (Fonte;
http://www.maltawildplants.com/FABC/Phaseolus_vulgaris.php); (C) fruto (vagens)
do feijoeiro comum (Fonte: http://www.fourlangwebprogram.com/fourlang/
nl/pl_es_F.htm); (D) diversas variedades de sementes do feijoeiro comum
(http://www.plantsciences.ucdavis.edu/gepts/pb143/pb143_hot_news.htm).
Cultivado por pequenos e grandes produtores, em diversificados sistemas de
produção e em todas as regiões brasileiras, o feijão comum é de grande importância
econômica e social (Aidar et al., 2003). É um dos principais componentes da dieta
A
B
D
C
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 17
alimentar brasileira, constituindo uma das mais importantes fontes de proteína
(Vieira, 2006). Além do seu conteúdo protéico, o elevado teor de ferro e fibra
alimentar, com seus reconhecidos efeitos hipocolesterolêmico e hipoglicêmico,
aliado às vitaminas (especialmente do complexo B) e aos carboidratos, tornam o seu
consumo altamente vantajoso como alimento funcional (Aidar et al., 2003).
O feijoeiro comum é suscetível a numerosas doenças e pragas. As doenças
que ocorrem no feijoeiro constituem uma das principais causas da sua baixa
produtividade no Brasil e têm se tornado um desafio para os agricultores. Os fungos
são os principais patógenos desta cultura. As doenças fúngicas do feijoeiro são
divididas em dois grupos com base na sua origem: as doenças da parte aérea, cujos
agentes causais não sobrevivem no solo; e as doenças de solo, cujos agentes
causais encontram-se adaptados para sobreviverem neste ambiente (Sartorato et
al., 2006). As principais doenças destes dois grupos e seus agentes causadores
estão relacionadas na tabela 3.
Tabela 3. Principais doenças do feijoeiro comum
Doença Local de ocorrência Agente causador
Mancha-angular Parte aérea Phaeoisariopsis griseola
Mancha-de-alternária Parte aérea Alternaria spp.
Ferrugem Parte aérea Uromyces appendiculatus
Carvão Parte aérea Microbotryum phaseoli
Sarna Parte aérea Colletotrichum dematium truncata
Oídio Parte aérea Erysiphe polygoni
Antracnose Solo Colletotrichum lindemunthianum
Mela Solo Thanatephorus cucumeris
Mofo-branco Solo Sclerotinia sclerotiorum
Murcha-de-Fusarium Solo Fusarium oysporum f. sp.
phaseoli
Podridão-cinzenta-do-caule Solo Macrophomina phaseolina
Podridão-radicular de
Rhizoctonia
Solo Rhizoctonia solani
Fonte: Adaptado de Vieira et al., 2006.
O feijoeiro pode sofrer o ataque de insetos e outras pragas que afetam sua
produção antes e após a colheita. Devido à diversidade de espécies encontradas
atacando a cultura, todos os tecidos têm-se mostrado suscetíveis ao ataque destes
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 18
agressores como mostram os dados da tabela 4. A ocorrência de carunchos
atacando o feijão armazenado é generalizada em todo país e leva a uma redução
significativa da sua produção. Zabrotes subfasciatus é uma das espécies de
caruncho que ataca o feijoeiro. Esta é uma espécie tropical e predomina nas zonas
de cultivo com o clima mais quente. Os danos causados por este caruncho alteram o
peso do produto e o poder germinativo das sementes, além de causar a depreciação
do seu valor comercial devido à presença dos insetos mortos, ovos, excrementos e
orifícios deixados nos grãos (Vieira et al., 2006).
Tabela 4. Principais pragas do feijoeiro comum
Nome comum Local de ocorrência Agente causador
Broca-do-caule Plântula Elasmopalpus lignosellus (Zeller)
Lagarta-rosca Plântula Agrotis ipsilon (Hufnagel)
Lesma Plântula Vaginulus sp.
Vaquinhas Folhas Diabrotica speciosa (Gemar)
Cerotoma arcuata (Olivier)
Lagarta-enroladeira Folhas Omiodes indicata
Mosca-minadora Folhas Liriomyza sp.
Cigarrinha-verde Folhas Empoasca kraemeri (Ross e More)
Mosca-branca Folhas Bemisia tabaci (Genn.)
Ácaro-branco Folhas Polyphagotarsonemus latus (Banks)
Lagartas-das-vagens Vagens Maruca testulalis (Geyer)
Percevejos Vagens Neomegalotomus sp.
Piezodorus guildinii (West)
Nezara viridula (L.)
Carunchos Grãos armazenados Zabrotes subfasciatus (Boheman)
Acanthoscelides obtectus (Say)
Fonte: Adaptado de Vieira et al., 2006.
Assim como descrito para o feijão-de-corda, diferentes proteínas com
atividade antimicrobiana e/ou inseticida têm sido descritas em P. vulgaris L. A
presença de proteínas com atividade inibitória sobre α-amilases foi relatada, em
1996, por Ishimoto e Chrispeels que isolaram a partir de sementes de P. vulgaris os
inibidores de α-amilases αAI-1 e αAI-2. Carlini e Grossi-de-Sá também relataram a
presença de proteínas com atividade inseticida em feijão comum (Carlini e Grossi-
de-sá, 2002). Wong et alli (2005) isolaram, também de sementes de P. vulgaris, um
Introdução_________________________________________________________________
Santos, I.S. 19
peptídeo com cerca de 7 kDa com um grande espectro de atividade antimicrobiana,
capaz de inibir o crescimento dos fungos Fusarium oxysporum, Mycosphaerella
arachidicola, Physalospora piricola e Botrytis cinerea e das bactérias Mycobacterium
phlei, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis e Proteus vulgaris. Mais recentemente,
estes autores isolaram destas sementes uma defensina com diferentes atividades,
dentre elas: atividade antifúngica, antibacteriana e inibidora da síntese protéica
(Wong et al., 2006).
____________________
OBJETIVOS
Objetivos __________________________________________________________________
Santos, I.S. 20
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
Este trabalho teve como objetivo geral a purificação e expressão heteróloga
de uma defensina de sementes de Vigna unguiculata L. Walp (feijão-de-corda) e a
avaliação de sua atividade inibitória contra α-amilases, além da clonagem molecular
e a análise da atividade antifúngica da defensina de sementes de Phaseolus vulgaris
L. (feijão comum).
2.2. Objetivos específicos
1. Purificar a defensina de sementes de feijão-de-corda descrita por Carvalho et
alli em 2001.
2. Superexpressar, de forma heteróloga, a defensina de sementes de feijão-de-
corda em bactérias Escherichia coli.
3. Avaliar a atividade inibitória de α-amilases pela defensina de sementes de
feijão-de-corda e de seu homólogo recombinante.
4. Fazer a clonagem molecular do cDNA da defensina de sementes de feijão
comum e o seu seqüenciamento.
5. Estudar o efeito da defensina de sementes de feijão comum sobre o
desenvolvimento de leveduras.
6. Estudar o efeito da defensina de sementes de feijão comum sobre a
permeabilização de membranas de fungos, utilizando células de Saccharomyces
cerevisiae como modelo.
7. Analisar os efeitos da defensina de sementes de feijão comum sobre a
morfologia e ultra-estrutura de células de levedura.
8. Avaliar a atividade inibitória de α-amilases pela defensina de sementes de
feijão comum.
____________________
MATERIAIS E
MÉTODOS
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 21
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Parte I: Purificação, expressão heteróloga e atividade inibitória de α-amilase
por uma defensina de sementes de feijão-de-corda
3.1- Materiais biológicos
3.1.1- Sementes
Sementes de Vigna unguiculata (L.) Walp (feijão-de-corda), cultivar EPACE
10, foram fornecidas pelo Departamento de Fitotecnia do Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.
3.1.2- Microrganismos
Células de Escherichia coli, linhagem JM 109 [genótipo: endA1, recA1,
gyrA96, thi, hsdR17, (r
k
-
, m
k
+
), relA1, supE44, λ
-
, ∆(lac-proAB), [F´, traD36, proAB,
lacI
q
Z∆M15]] e linhagem BL21 (DE
3
) pLysS [genótipo: F
–
, ompT, hsdS
B
(r
B
–
, m
B
–
),
dcm, gal, (DE3), pLysS, Cm
r
] foram adquiridas da Promega Corporation, USA.
Células de Escherichia coli, linhagem Rosetta gami 2 (DE3) pLysS [genótipo: ∆(ara-
leu)7697 ∆lacX74 ∆phoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL (DE3) F′[lac
+
lacI
q
pro] gor522::Tn10 trxB pLysSRARE2 (Cam
R
, Str
R
, Tet
R
) ] foram adquiridas da
Novagen, Inc. Estas bactérias foram mantidas em stab de glicerol (750 µL da cultura
celular + 250 µL de glicerol 50 %).
3.2- Purificação da defensina de sementes de feijão-de-corda
A purificação da defensina de sementes de feijão-de-corda foi feita seguindo a
metodologia descrita por Carvalho et alli (2001), com algumas modificações.
3.2.1- Extração protéica
Sementes de feijão-de-corda sem tegumento foram trituradas em triturador de
alimentos até a obtenção de uma farinha de fina granulação. As proteínas da farinha
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 22
foram então extraídas em tampão fosfato pH 5,4 (Na
2
HPO
4
0,01 M, NaH
2
PO
4
0,015
M, KCl 0,1 M, EDTA 1,5 %) na proporção de 1:5 (farinha:tampão, m:v), por 2 h, sob
agitação constante, a 4 °C. A suspensão foi submetida à centrifugação (15.400 x g
por 20 min a 4 °C) e fracionado com sulfato de amônio na faixa entre 30 e 70 % de
saturação. Após fracionamento, o material foi centrifugado (15.400 x g por 20 min a
4 °C) e o precipitado resultante ressuspenso em 10 mL de água destilada e
aquecido por 15 min a 80
o
C e em seguida, novamente, centrifugado (10.000 x g por
10 min a 4 °C). O precipitado assim obtido, denominado fração F/30-70, foi então
ressuspenso em água destilada e dialisado por três dias a 4 °C contra água
destilada, com 3 trocas diárias. Após diálise, esta fração foi liofilizada.
3.2.2- Cromatografias
3.2.2.1- Cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose
Uma coluna de troca iônica (3 x 7 cm) foi preparada com resina DEAE-
Sepharose empacotada sob a ação da gravidade. Posteriormente, a resina foi
lavada abundante e sucessivamente com: água destilada; NaOH 0,1 M; água
destilada; HCl 0,1 M; água destilada, e por fim, equilibrada com o tampão Tris-HCl
0,05 M pH 8,0 (2x o volume da coluna). Todo o processo foi feito a um fluxo
constante de 90 mL.h
-1
. A amostra a ser aplicada na coluna foi preparada da
seguinte maneira: 15 mg da fração F/30-70 foram dissolvidos em 10 mL de tampão
Tris-HCl 0,05 M pH 8,0 e a solução foi centrifugada a 16.000 x g por 3 min a
temperatura ambiente. O sobrenadante resultante desta centrifugação foi então
aplicado na coluna. A amostra foi eluída inicialmente com o tampão de equilíbrio e
posteriormente com NaCl 1 M. Foram coletadas frações de 3 mL a um fluxo
constante de 60 mL.h
-1
. As absorvâncias das frações foram lidas em um
espectrofotômetro a 280 nm. Após a cromatografia, o pico não retido foi concentrado
por liofilização.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 23
3.2.2.2- Cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sephadex G-50
A coluna de Sephadex G-50 (2,3 x 60,5 cm) foi montada e equilibrada com
tampão Tris-HCl 0,02 M, pH 8,0, a um fluxo constante de 20 mL.h
-1
. Proteínas de
massas moleculares conhecidas (albumina sérica bovina, ovalbumina e lisozima)
foram utilizadas para a calibração da coluna. A fração não retida oriunda da
cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose foi dissolvida em 1 mL
de tampão de equilíbrio e centrifugada a 16.000 x g por 2 min. O precipitado
resultante da centrifugação foi descartado e o sobrenadante aplicado na coluna de
exclusão molecular. Foram coletadas frações de 1 mL, a um fluxo constante de 20
mL.h
-1
. As absorvâncias das frações foram lidas em um espectrofotômetro a 280 nm.
Todos os picos foram dialisados e liofilizados.
3.2.2.3- Cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18
Uma coluna de fase reversa C2/C18 equilibrada com 0,1 % de TFA foi
empregada no processo de isolamento da defensina de sementes de feijão-de-
corda. A fração P2 oriunda da cromatografia em Sephadex G-50 foi solubilizada em
TFA 0,1 % e 500 µL desta solução foram injetados na coluna de fase reversa. A
cromatografia foi desenvolvida utilizando-se um fluxo de 0,7 mL.min
-1
, a temperatura
de 32
o
C, em sistema de HPLC. Para a eluição das proteínas da coluna foi utilizado
um gradiente de acetonitrila. O gradiente de eluição foi feito da seguinte maneira: 0-
10 min, 100 % do solvente A (TFA 0,1 % e acetonitrila 2 %); 10-80 min, 0-100 % do
solvente B (TFA 0,1 % e acetonitrila 80 %); 80-85 min, 100 % de B; 85-90 min, 100-0
% de B; e 90-95 min, 100 % de A. A eluição da coluna foi acompanhada por um
detector do tipo DAD, sendo os picos detectados a 220 nm. Após ser coletado, o
pico de interesse foi seco em “speedvac” (Savant, modelo SC110A).
O processo de purificação foi acompanhado por eletroforese em gel de
poliacrilamida.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 24
3.2.3- Quantificação de proteínas
As determinações quantitativas de proteínas foram feitas pelo método de
Bradford (1976) e também pelo método do ácido biciconiníco (feito segundo
metodologia descrita pelo fabricante, Sigma Co., USA), sendo a ovalbumina
utilizada como padrão.
3.2.4- Eletroforese em gel de tricina na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS)
As amostras provenientes das diferentes cromatografias foram visualizadas
em gel de tricina segundo método descrito por Schägger e Von Jagow (1987).
Foram usadas placas de vidro de 8 x 10 cm e 7 x 10 cm e espaçadores de 0,75 mm.
3.2.4.1- Preparo das amostras e condições de corrida
Alíquotas das diferentes frações protéicas obtidas durante o processo de
purificação da defensina de feijão-de-corda foram ressuspensas em tampão de
amostra (Tris-HCl 0,125 M pH 8,0; SDS 0,2 %, sacarose 10 % e azul de bromofenol
0,25 %), aquecidas por 5 min a 100 °C e centrifugadas a 16.000 x g por 2 min a
temperatura ambiente. Após este procedimento, 20 µL das amostras foram
aplicadas no gel de concentração. O marcador de massa molecular utilizado foi o
MW-SDS-17S (Sigma, Co.) composto das seguintes proteínas: mioglobina (16.950
Da), mioglobina I + II (14.400 Da), mioglobina I + III (10.600 Da), mioglobina I (8.160
Da) e mioglobina II (6.200 Da). A corrida foi feita a uma voltagem constante de 20 V
por um período de aproximadamente 16 h.
3.2.4.2- Coloração e descoloração do gel
Após o término da corrida, o gel foi cuidadosamente retirado das placas de
vidro e colocado em uma solução corante de Coomassie Blue R (0,05 %) por
aproximadamente 30 min. Passado esse período, o gel foi transferido para uma
solução descorante (ácido acético 10 % e metanol 30 % em água destilada) e nesta
mantido até a visualização das bandas protéicas.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 25
3.3- Clonagem molecular e expressão heteróloga da defensina de sementes de
feijão-de-corda
Todos os procedimentos de biologia molecular utilizados neste trabalho foram
baseados em Sambrook e Russel (2001).
3.3.1- Obtenção do cDNA de feijão-de-corda
O cDNA que codifica para a defensina de sementes de feijão-de-corda foi
gentilmente cedido pelo Dr. André de Oliveira Carvalho.
3.3.2- Estratégia de clonagem no vetor de super-expressão pET-32 Ek/LIC
O vetor pET-32 Ek/LIC (Novagen, Inc.) é parte de um sistema de expressão e
purificação de proteínas baseado em uma técnica de clonagem independente de
ligação (sistema LIC), ou seja, permite a clonagem direcional de produtos de PCR
sem a necessidade de digestão com enzimas de restrição. O sistema LIC explora a
atividade exonucleásica 3'→5' da T4 DNA polimerase para criar uma região de
aproximadamente 13 a 14 pares de base em uma fita única no vetor. Produtos de
PCR com uma região complementar são criados com uma extensão apropriada 5'
nos iniciadores. Assim, após tratamento com a T4 DNA polimerase, na presença de
ATP, são geradas regiões específicas, também em fita simples, compatíveis com as
do vetor (Esquema 1).
Este vetor foi desenhado especialmente para expressão de proteínas
recombinantes fusionadas, dentre outras moléculas, à tioredoxina e à cauda de
histidinas. A tioredoxina ajuda na solubilidade da proteína expressa e na formação
de pontes dissulfeto e a cauda de histidina é útil para a purificação e identificação da
proteína. Após a purificação, estas podem ser completamente removidas pela
clivagem proteolítica com enteroquinase, cujo sítio de clivagem é provido pelo
desenho do vetor (Figura 4).
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 26
Esquema 1. Estratégia de clonagem no vetor pET-32 Ek/LIC (retirado do manual do
vetor, User Protocol TB163 Rev. G 1005, Novagen, Inc.). (1) amplificação do
fragmento alvo com os iniciadores desenhados especificamente para a clonagem no
vetor pET-32 Ek/LIC; (2) tratamento do fragmento com a T4 DNA polimerase; (3)
ligação do fragmento amplificado ao vetor pET-32 Ek/LIC.
Inserto EK/LIC
Plasmídeo recombinante
Anelamento, Transformação (3)
GENE ALVO
T4 DNA pol + dATP (2)
PCR (1)
Stop
ORF ALVO
ORF ALVO
Plasmídeo Ek/LIC
ORF ALVO
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 27
Figura 4. Mapa de restrição do vetor pET-32 Ek/LIC (retirado do manual do vetor,
User Protocol TB163 Rev. G 1005, Novagen, Inc.).
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 28
3.3.3- Desenho do iniciador para clonagem no vetor de superexpressão pET-32
Ek/LIC
A partir da seqüência de nucleotídeos do fragmento de interesse (obtida por
Carvalho et al., 2006) foram desenhados iniciadores para a clonagem no vetor pET-
32 Ek/LIC. Estes foram construídos seguindo instruções do fabricante do kit do vetor
(Novagen, Inc.) e denominados DEFs (sense) e DEFas (antisense).
Assim, os iniciadores foram construídos da seguinte forma:
• Iniciador “sense”: 5' GAC GAC GAC AAG ATG AAG ACG TGC GAG AAC
CTG- 3' (DEFs)
• Iniciador “antisense”: 5' GAG GAG AAG CCC GGT TTA ACA GTT TCT GGT-
3' (DEFas)
A sequência do iniciador que anela com o fragmento está demonstrada em
negrito. A sequência sublinhada corresponde à região do iniciador que se anela ao
vetor. A sequência destacada em cinza corresponde ao códon da metionina, inserida
no iniciador seguindo instruções do fabricante (a sequência que codifica para a
defensina de sementes de feijão-de-corda não possui este códon naturalmente).
3.3.4- Reação em cadeia da polimerase (PCR) - Teste da temperatura de
anelamento e concentração dos iniciadores
Neste experimento, além dos iniciadores DEFs e DEFas, foi utilizada uma Taq
DNA polimerase de alta fidelidade (FideliTaq DNA Polymerase, Amersham
Biosciences).
A reação de PCR foi feita inicialmente em cinco temperaturas diferentes, que
variaram em torno da temperatura de anelamento dos iniciadores fornecida pelo
fabricante, e utilizando três concentrações diferentes dos iniciadores (DEFs e
DEFas). A reação foi feita no termociclador Mastercycler Gradient 22331 (Eppendorf)
que permite a formação de um gradiente de temperatura. As misturas foram
montadas do seguinte modo:
• Mistura 1 (Mix 1): 45,7 µL de água, 10 µL do tampão da FideliTaq 10x [Tris-
HCl 100 mM, pH 9,0, e KCl 500 mM], 8 µL MgCl
2
15 mM, 16 µL de dNTPs
1,25 mM, 10 µL de iniciador sense 10 pmol, 5 µL do iniciador anti-sense 10
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 29
pmol, 1,5 µL da reação com a transcriptase reversa e 0,8 µL da FideliTaq
DNA polimerase (1 u);
• Mistura 2 (Mix 2): 45,7 µL de água, 10 µL do tampão da FideliTaq 10x, 8 µL
MgCl
2
15 mM, 16 µL de dNTP 1,25 mM, 5 µL de iniciador sense 10 pmol, 10
µL de iniciador anti-sense 10 pmol, 1,5 µL da reação com a transcriptase
reversa e 0,8 µL da FideliTaq DNA polimerase (1 u);
• Mistura 3 (Mix 3): 40,7 µL de água, 10 µL do tampão da FideliTaq 10x, 8 µL
MgCl2 15 mM, 16 µL de dNTP 1,25 mM, 10 µL de iniciador sense 10 pmol, 10
µL de iniciador anti-sense 10 pmol, 1,5 µL da reação com a transcriptase
reversa e 0,8 µL da FideliTaq DNA polimerase (1 u).
Cada mistura foi então alíquotada (20 µL) em tubos de PCR e estes
numerados do seguinte modo: Mix 1 de 1 a 5, Mix 2 de 6 a 10 e Mix 3 de 11 a 15.
Os tubos numerados foram posicionados na placa do termociclador, onde cada
coluna corresponde a uma temperatura diferente, do seguinte modo:
A reação de polimerização amplificada foi programada para 40 ciclos das
seguintes etapas sequenciais: 1) 95 °C por 3 min; 2) 45,3 °C por 45 s; 3) 72 °C por 1
min e 30 s; 4) 95 °C por 45 s; 5) gradiente de temperatura por 45 s; 6) 72 °C por 1
min e 30 s; 7) volta para 4 por 35 vezes; 8) 72 °C por 5 min. Ao final dos ciclos as
amostras foram resfriadas a 8 °C ainda no termociclador.
Após amplificadas por PCR, as amostras foram visualizadas por eletroforese
em gel de agarose 1 % para confirmar se houve amplificação e qual a melhor
condição para que a mesma ocorresse. Como marcador de massa molecular foi
(DEFs:DEFas)
1 2 3 4 5 Mix 1 (2:1)
6 7 8 9 10 Mix 2 (1:2)
11 12 13 14 15 Mix 3 (1:1)
60,9
62,2
65,5
67,8
71,9
Gradiente em °C
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 30
utilizado o marcador 1 Kb ladder (Biotools) composto dos seguintes marcadores (em
pb): 100, 200, 300, 400, 1000, 1650, 5000 e 12000.
3.3.5- Purificação dos fragmentos com o kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System”
Uma vez tendo sido confirmada a amplificação dos fragmentos por PCR, as
amostras foram purificadas utilizando o Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System” (Promega), seguindo a metodologia descrita pelo fabricante.
Inicialmente, as amostras foram submetidas à separação eletroforética em gel
de agarose 1 % contendo brometo de etídeo e as bandas de DNA foram
visualizadas sob luz ultravioleta. As bandas referentes ao fragmento de interesse
foram identificadas, recortadas do gel, transferidas para tubos de microcentrífuga e
solubilizadas na “membrane binding solution” (acetato de potássio 0,5 M, pH 5,0 e
isotiocianato de guanidina 4,5 M) (proporção 1:1, m:v; a 60
o
C até completa
dissolução do gel). Posteriormente, a mistura foi transferida para uma minicoluna
pré-fabricada e deixada em contato com a mesma por 1 min a temperatura
ambiente. A coluna foi então centrifugada (10.000 x g por 1 min a temperatura
ambiente) e o volume que passou por ela foi descartado. Setecentos microlitros da
solução “membrane wash solution” foram adicionados (acetato de potássio 10 mM,
pH 5,0, etanol 80 % e EDTA 16,7 µM, pH 8,0) à coluna e esta foi novamente
centrifugada (10.000 x g por 1 min à temperatura ambiente). Mais uma vez, o
volume que passou pela coluna foi descartado e foram adicionados mais 500 µL da
solução “membrane wash solution”. Desta vez a coluna foi centrifugada a 10.000 x g
por 5 min e ao final da centrifugação a coluna foi transferida para um novo tubo (tubo
coletor). À coluna foram adicionados 50 µL de água ultra pura (fornecida com o Kit)
deixadas em contato com a coluna por 1 min a temperatura ambiente. Após esse
período, a coluna foi centrifugada (10.000 x g por 1 min) e o material coletado foi
armazenado a -20 °C.
3.3.6- Clonagem do fragmento amplificado no vetor
A clonagem dos fragmentos purificados no vetor pET-32 Ek/LIC foi feita
segundo o protocolo fornecido pelo fabricante.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 31
Para que se ligassem corretamente ao vetor, antes de se fazer a ligação, os
fragmentos foram tratados com a T4 DNA polimerase. Em um tubo de
microcentrífuga foram reunidos 1 µL do produto da reação de PCR (300 ng do
fragmento purificado), 2 µL de tampão 10x (Tris-acetato 33 mM pH 7,0 acetato de
sódio 66 mM, acetato de magnésio 10 mM, DTT 1 mM), 2 µL de dATP 25 mM, 1 µL
de DTT 100 mM, 2,5 µL da T4 DNA polimerase (2,5 u/µL), e 13,8 µL de água
ultrapura. A solução foi incubada a 22
o
C por 30 min e, posteriormente, a 75
o
C por
20 min, para inativação enzimática.
Para o anelamento dos fragmentos ao vetor, 2 µL da solução preparada
conforme citado acima, foram misturados a 1 µL (50 ng) do vetor e a mistura foi
incubada a 22
o
C por 5 min. A construção de DNA resultante foi nomeada pET-DEF
e utilizada para a transformação das células bacterianas.
3.3.7- Produção de células competentes de E. coli, linhagem JM109
Uma colônia bacteriana de uma cultura fresca de E. coli, linhagem JM109, foi
inoculada em um tubo contendo 5 mL de meio LB e este incubado a 37 °C por 16 h
a 250 rpm (pré-inóculo). Desse pré-inoculo foram retiradas alíquotas de 0,2, 0,4 e
0,8 mL que foram transferidas para 50 mL de meio LB e incubadas a 37 °C por 3 h a
250 rpm. Após esse período, foram feitas leituras no espectrofotômetro a 600 nm. A
cultura que apresentou densidade óptica em torno de 0,55 foi usada para o preparo
das células competentes, sendo transferida para banho de gelo por 10 min e
centrifugada a 2.500 x g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e o
sedimento de células foi ressuspenso em 10 mL de solução salina (PIPES 10 mM,
pH 6,7, MgCl
2
55 mM, CaCl
2
15 mM e KCl 250 mM) e centrifugado (2.500 x g por 10
min a 4 °C). O sobrenadante foi mais uma vez descartado e o sedimento de células
foi suspenso em 10 mL da solução salina e acrescido de 375 µL de dimetilsulfóxido
(DMSO) 100 %. As células foram homogeneizadas gentilmente e incubadas por 10
min em banho de gelo. Após essa incubação, mais 375 µL de DMSO 100 % foram
adicionados; a suspensão de células foi novamente homogeneizada e alíquotas de
200 µL foram transferidas para tubos de microcentrífuga estéreis e imediatamente
congelados em nitrogênio líquido, antes de serem armazenadas a -70 °C.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 32
3.3.8- Transformação de células competentes de E. coli (linhagem JM109) com a
construção pET-DEF
A transformação bacteriana foi feita de acordo com a metodologia descrita por
Inoue et alli (1990). Tubos contendo 200 µL de células competentes, armazenados a
-70 °C, foram descongelados em banho de gelo e às células foi adicionado 1 µL da
construção pET-DEF. Feito isto, os tubos foram incubados por 10 min em banho de
gelo e, após esse período, transferidos do gelo para 42 °C por 90 s e em seguida
novamente para banho de gelo por mais 10 min. Após o choque térmico, foram
adicionados 250 µL de meio LB às células e, então, essas foram incubadas a 37 °C.
Após 1 h, 50 µL, 100 µL e 150 µL das células foram plaqueados em diferentes
placas de Petri contendo meio LB acrescido de ampicilina (100 µg.mL
-1
) (GE
Healthcare) e as placas foram incubadas a 37 °C por 16 h.
3.3.9- Análise dos clones positivos - extração e digestão dos vetores
Para a confirmação de que os clones positivos possuíam o vetor pET-32
Ek/LIC contendo o fragmento amplificado com os iniciadores DEFs e DEFas, o vetor
foi extraído das células bacterianas, JM 109, e submetido à digestão com uma
enzima de restrição que liberaria o fragmento ligado.
Os vetores foram extraídos das células bacterianas utilizando a seguinte
metodologia: colônias positivas individualizadas foram transferidas para 10 mL de
meio LB líquido contendo ampicilina (100 µg.mL
-1
) e incubadas a 37 °C por 16 h, a
250 rpm. Após esse período de crescimento, 750 µL de cada cultura foram
transferidos, separadamente, para tubos de microcentrífuga e centrifugados a
16.000 x g por 1 min. Os sobrenadantes foram descartados e aos sedimentos foram
adicionados mais 750 µL das referentes culturas no mesmo tubo e a centrifugação
foi repetida. Os sobrenadantes foram novamente descartados e aos sedimentos
foram adicionados 300 µL de TENS (Tris-HCl 0,01 M, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaOH
0,1 M e SDS 25 mM) e as amostras foram agitadas por 10 s para provocar a lise
celular. Após a lise das células bacterianas, 150 µL de acetato de sódio 3 M pH 5,2
foram adicionados e novamente as amostras foram agitadas por 10 s, antes de
serem centrifugadas a 16.000 x g por 3 min. Os precipitados foram descartados e os
sobrenadantes foram transferidos para um novo tubo e a eles foi adicionado 1 mL de
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 33
etanol 100 % gelado. As amostras foram homogeneizadas gentilmente e incubadas
por 1 min à temperatura ambiente e centrifugadas nas mesmas condições. Os
sobrenadantes foram descartados e os precipitados, lavados com 1 mL de etanol 70
%. As amostras foram centrifugadas nas mesmas condições, os sobrenadantes
foram descartados e os precipitados, secos em banho-seco a 37 °C por 10 min.
Após a secagem, os precipitados foram ressuspensos em 40 µL de tampão TE
contendo RNase A (Tris-HCl 0,01 M, pH 8,0, EDTA 1 mM e RNase A 20 µg.mL
-1
) e
incubados nesse tampão por 1 h a 37 °C.
Ao final desse procedimento, os vetores extraídos foram submetidos à
digestão com as enzimas de restrição EcoR I e Bgl II.
O vetor pET-32 Ek/LIC possui sítios de restrição para as enzimas EcoR I e
Bgl II flanqueando a região em que o fragmento é inserido (Fig. 4), portanto a
digestão com estas enzimas, abre o vetor e ao mesmo tempo libera o fragmento
inserido. A reação de digestão foi feita da seguinte forma: 10 µL do vetor pET-32
Ek/LIC (contendo os fragmentos de interesse), 20 µL de tampão das enzimas 10x
[Tris-HCl 50 mM pH 8,0, MgCl
2
5 mM, KCl 100 mM, Triton X-100 0,02 %, β-
mercaptoetanol 1 mM e BSA 0,1 mg.mL
-1
], 0,3 µL de Bgl II (10 u.µL
-1
), 0,25 µL de
EcoR I (20 u.µL
-1
) e 12,45 µL de água ultrapura.
As amostras foram homogeneizadas e então incubadas a 37 °C por 2 h. Ao
final da incubação, os vetores digeridos foram analisados por eletroforese em gel de
agarose 1 % para confirmar se houve a transformação bacteriana.
3.3.10- Transformação de células competentes de E. coli (linhagem BL21 (DE
3
)
pLysS) com a construção pET-DEF
Uma vez confirmada a clonagem do fragmento amplificado com os inicidores
DEFs e DEFas no vetor pET-32 EK/LIC, a construção pET-DEF, extraída conforme
metodologia descrita no item 3.3.9, foi utilizada para a transformação de células
bacterianas apropriadas para a expressão de proteínas (linhagem BL21(DE3)
pLysS). A metodologia utilizada para a transformação foi a mesma citada no item
3.3.8. A confirmação da transformação bacteriana foi feita por amplificação do DNA
das colônias (reação da PCR montada seguindo metodologia descrita no item 3.3.4),
seguida por visualização eletroforética em gel de agarose 1 %.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 34
3.3.11- Indução da expressão heteróloga da defensina de feijão-de-corda em
bactérias E. coli (linhagem BL21 (DE
3
) pLysS)
Uma vez confirmada a transformação das células bacterianas de expressão, a
indução da expressão da defensina foi feita seguindo a metodologia indicada pelo
fabricante do kit do vetor (Novagen, Inc.).
Colônias positivas (3) foram transferidas para 10 mL de meio LB líquido
contendo ampicilina (50 µg.mL
-1
) e cloranfenicol (50 µg.mL
-1
) e incubadas a 37 °C
por 16 h, sob agitação a 250 rpm. Após esse período, 1 mL de cada cultura foi
transferido, separadamente, para 50 mL de meio novo (LB líquido contendo
ampicilina 50 µg.mL
-1
e cloranfenicol 34 µg.mL
-1
) e as células novamente incubadas
a 37 °C por 3 h (até densidade celular entre 0,5 e 1, determinada em
espectrofotômetro a 600 nm). Então, adicionaram-se às culturas concentrações de
isopropil-beta-D-tiogalactopiranisídeo (IPTG) (0,4 e 1 mM). Durante 4 h, em
intervalos de 30 min, foram retiradas alíquotas de 2 mL de cada cultura. Uma
alíquota foi retirada imediatamente antes da adição do IPTG (tempo 0 h) e esta foi
considerada o controle da indução. As alíquotas foram centrifugadas a 14.000 x g
por 2 min e os sedimentos armazenados a -20
o
C.
Após a retirada de todas as alíquotas, os sedimentos foram descongelados e
a cada um deles adicionados 380 µL de tampão de lise (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0,
SDS 0,5 %, β-mercaptoetanol 5 %). Posteriormente, a mistura foi homogeneizada e
aquecida a 100
o
C em banho-maria e analisada por eletroforese em gel de
poliacrilamida.
Uma vez confirmada a expressão da defensina e padronizada a melhor
condição para esta expressão, havia ainda a necessidade de se verificar se a
mesma estava sendo expressa na sua forma solúvel ou se estava sendo
depositadas em corpos de inclusão. Para tal verificação foi utilizado o protocolo
descrito pelo fabricante do kit do vetor (Novagen, Inc.).
Como descrito anteriormente, as células foram crescidas na presença de
IPTG (0,4 mM e 1 mM) e desta cultura foram retiradas alíquotas (em intervalos de 30
min durante 4 h), que foram centrifugadas a 14.000 x g por 2 min e os precipitados
armazenados a -20
o
C. Após a retirada de todas as alíquotas, os precipitados foram
transferidos para nitrogênio líquido e na seqüência descongelados em banho-maria
a 40
o
C (choque térmico). Após descongelamento, foram adicionados a eles 100 µL
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 35
de tampão de lise (NaH
2
HPO
4
50 mM, NaCl 50 mm, glicerol 5 %), então, agitados
vigorosamente até a completa lise celular. Feito isto, as amostras foram
centrifugadas a 16000 x g por 4 min à temperatura ambiente; os sobrenadantes
foram reservados em freezer -20
o
C e os precipitados lavados 2 vezes com 200 µL
de tampão fosfato (NaH
2
HPO
4
50 mM, NaCl 50 mm). Após as lavagens, os
precipitados foram ressuspensos em 100 µL de SDS 1 %. O conteúdo protéico dos
sobrenadantes e dos precipitados foram então avaliados através de eletroforese em
gel de poliacrilamida.
3.3.12- Eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida 15 % sob condições
desnaturantes (SDS-PAGE)
A eletroforese em gel de poliacrilamida, usando o sistema de gel descontínuo,
foi feita segundo método descrito por Laemmli (1970). Foram usadas placas de vidro
de 8 x 10 cm e 7 x 10 cm e espaçadores e pentes de 0,75 mm.
3.3.12.1- Preparo das amostras e condições de corrida
Dez microgramas dos diferentes lisados celulares obtidos foram resuspensos
em tampão de amostra (Tris-HCl 0,125 M pH 8,0; SDS 0,2 %, sacarose 10 % e azul
de bromofenol 0,25 %) e, posteriormente, aquecidos a 100
o
C por 5 min e
centrifugados a 16.000 x g por 3 min. Após esses procedimentos, os lisados foram
aplicados no gel de concentração e submetidos à eletroforese sob condições
desnaturantes. A corrida foi feita a 100 V por um período de, aproximadamente, 2 h.
O tampão de corrida utilizado continha Tris-HCl 0,05 M, glicina 0,192 M e SDS 0,1%.
3.3.12.2- Coloração e descoloração do gel
Os procedimentos de coloração e descoloração do gel foram feitos seguindo
metodologia descrita no item 3.2.4.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 36
3.3.13- Verificação da expressão heteróloga por Western blotting
Para confirmar se a proteíma expressa tratava-se realmente da defensina de
interesse, a técnica de Western blotting (Towbin et al., 1979) utilizando-se como
anticorpo primário o anticorpo anti-histidina e como anticorpo secundário a proteína
A conjugada à peroxidase, ambos adquiridos comercialmente (Sigma Co.), foi
empregada.
Ao término da corrida, o gel foi retirado da placa e imerso em tampão de
transferência (glicina 182 mM, Tris 25 mM e metanol 20 %) por 20 min. De forma
semelhante, membrana de nitrocelulose (cortada nas mesmas dimensões do gel)
também foi imersa em tampão de transferência por 20 min. Passado este tempo, as
proteínas do gel foram eletrotransferidas para a membrana de nitrocelulose
utilizando uma célula comercial de transferência (semi-seca). Para a
eletrotransferência foi utilizada a seguinte metodologia: sobre a célula de
transferência foi montado um “sanduíche” composto respectivamente de quatro
folhas de papel de filtro (previamente embebidas em tampão de transferência), a
membrana, o gel e mais uma camada de quatro folhas, embebidas em tampão de
transferência, do papel de filtro. Uma vez montado o “sanduíche”, a célula de
transferência foi fechada, e sobre ela aplicada uma corrente constante de 1 mA/cm
2
de membrana por 2 h no sentido gel-membrana. Após a transferência, o “sanduíche”
foi cuidadosamente desfeito, a membrana submetida à coloração reversível com
Ponceau S (0,1 %), para determinação do sucesso da transferência (Método
descrito por Towbin et alli (1979), com modificações) e submetida aos seguintes
tratamentos: imersão em tampão bloqueador [PBS pH 7,4 (NaH
2
PO
4
10 mM + NaCl
0,15 M) + leite em pó desnatado 2 % + Tween-20 0,05 %] à temperatura ambiente
por um período de 1 h, com o objetivo de bloquear os sítios não específicos na
membrana; incubação em tampão bloqueador contendo o anticorpo primário
(1:1000), por um período de 16 h a 4 °C; lavagem com PBS pH 7,4 à temperatura
ambiente (5 lavagens de 10 min cada); incubação em tampão bloqueador, sendo
que desta vez, contendo o anticorpo secundário por um período de 2 h à
temperatura ambiente; e lavagem com PBS pH 7,4 à temperatura ambiente (5
lavagens de 10 min cada). A revelação da reação imunológica foi realizada
utilizando uma solução contendo diaminobenzidina (DAB). Após as lavagens, a
membrana foi imersa na solução reveladora (Tris-HCl 40 mM pH 7,5, DAB
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 37
1 mg.mL
-1
,
imidazol 100 mM, peróxido de hidrogênio 0,03 %) e mantida ao abrigo da
luz por 5 min ou até a visualização das bandas.
3.3.14- Transformação de células competentes de E. coli (linhagem Rosetta gami 2
(DE
3
) pLysS) com a construção pET-DEF
Como a super-expressão da defensina na linhagem de E. coli linhagem BL21
(DE
3
) pLysS não mostrou resultado satisfatório, a linhagem BL21 (DE
3
) pLysS foi
trocada pela linhagem Rosetta gami 2 (DE3) pLysS que é uma linhagem de
expressão especial, pois permite a formação de pontes dissulfeto no citoplasma
quando a célula bacteriana está expressando uma proteína heteróloga. Além disto,
esta linhagem contém os sete tRNAs raros que permitem uma tradução universal,
sem a interferência de uso preferencial de códons.
Células de E. coli da linhagem Rosetta gami 2 (DE3) pLysS foram
transformadas com a construção de DNA pET-DEF conforme metodologia descrita
no item 3.3.8.
3.3.15- Indução da expressão heteróloga da defensina de feijão-de-corda em
bactérias E. coli (linhagem Rosetta gami 2 (DE
3
) pLysS)
A indução da expressão da defensina foi feita seguindo a metodologia
indicada pelo fabricante do kit do vetor (Novagen, Inc.).
Uma colônia bacteriana de uma cultura fresca de E. coli, linhagem Rosetta
gami 2 (DE
3
) pLysS transformada com a construção pET-DEF, foi inoculada em 20
mL de meio LB contendo 34 µg.mL
-1
de cloranfenicol e 50 µg.mL
-1
de ampicilina e
incubada a 37 °C por 16 h a 250 rpm (pré-inóculo). Desse pré-inóculo foi retirada
uma alíquota de 9 mL e transferida para 400 mL de meio LB fresco (inóculo). O
inóculo foi, então, incubado a 37 °C por 3 h a 250 rpm (densidade celular entre 0,5 e
1, medida em espectrofotômetro a 600 nm). Após esse período, adicionou-se à
cultura 0,4 mM de IPTG e esta foi novamente incubada a 37 °C por 3 h e a 250 rpm.
Uma alíquota foi retirada imediatamente antes da adição do IPTG (tempo 0 h) e esta
foi considerada o controle da indução. Posteriormente, as células foram recuperadas
por centrifugação (15.400 x g por 10 min a 4 °C), ressuspensas em 25 mL de
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 38
tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,4 contendo 500 mM de cloreto de sódio e 40
mM de imidazol e armazenadas a -20 °C.
3.3.16- Lise celular e recuperação da fração solúvel
As células, até então armazenadas a -20 °C, foram descongeladas e a elas
acrescentado 1 mM de fluoreto de fenilmetilasulfonila (PMSF). Posteriormente, as
células foram rompidas por sonicação (10 pulsos de 30 s, na potência de 8 watts).
Após sonicação, a solução celular foi centrifugada a 15.400 x g por 5 min a 4 °C. O
sobrenadante foi então aquecido por 30 min a 90 °C e centrifugado a 15.400 x g por
5 min a 4 °C. O sobrenadante resultante desta centrifugação foi recuperado e
armazenado a -20 °C. As amostras foram posteriormente visualisadas em
eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida 15 % como descrito no item
3.3.12.
3.4- Isolamento e caracterização da defensina recombinante
3.4.1- Cromatografia de afinidade em coluna de Ni Sepharose
Para a purificação da defensina recombinante expressa em bactéria E. coli,
linhagem Rosetta gami 2 (DE
3
) pLysS, foi inicialmente empregada uma
cromatografia de afinidade em coluna de Ni Sepharose (GE Health Care).
A coluna de afinidade foi preparada com 5 mL da resina empacotada sob a
ação da gravidade e equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7,4
contendo NaCl 500 mM e imidazol 40 mM. Cinco mililitros do sobrenadante obtido
conforme descrito no item 3.3.16 foram centrifugados a 16.000 x g por 3 min e
aplicados na coluna. A amostra foi eluída com tampão fosfato de sódio 20 mM pH
7,4 contendo NaCl 500 mM e imidazol 500 mM. Foram coletadas frações de 7 mL.
Os picos foram recuperados, dialisados contra água destilada (membrana com poros
de 1.000 Da), com 3 trocas diárias, por 3 dias a 4 °C e liofilizados.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 39
3.4.2- Clivagem com enteroquinase
Como citado anteriormente, as proteínas clonadas no vetor de
superexpressão pET-32 Ek/LIC são expressas fusionadas à outras moléculas que
são removidas pela clivagem com a enteroquinase. Assim, esta enzima foi utilizada
para separar a defensina recombinante das moléculas à ela fusionadas.
Neste trabalho foi utilizada uma enteroquinase bovina recombinante expressa
em E. coli obtida da Sigma Co. A reação de clivagem foi montada seguindo a
metodologia indicada pelo fabricante. A 8 mg de pó do pico retido da cromatografia
de afinidade em coluna de Ni Sepharose (8 mg de proteína total, aproximadamente,
6 mg da proteína de interesse) foram adicionados 4 mL de tampão Tris-HCl 50 mM
pH 8,0 contendo NaCl 50 mM, cloreto de cálcio 1 mM e Tween 20 0,1 % e 0,12
unidades da enzima. Após homogeneização, a solução foi incubada a 25 °C por 16
h.
3.4.3- Cromatografia de afinidade em coluna de Ni sepharose
Após, clivagem com a enteroquinase, a amostra protéica contendo a
defensina recombinante foi novamente submetida à cromatografia de afinidade em
coluna de Ni Sepharose (seguindo metodologia descrita no item 3.4.1). O pico de
interesse foi recuperado e concentrado por liofilização.
3.4.4- Cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18
Uma coluna de fase reversa C2/C18 equilibrada com 0,1 % de TFA também
foi empregada no processo de isolamento da defensina recombinante. A fração não
retida oriunda da cromatografia de afinidade em Ni Sepharose foi solubilizada em
TFA 0,1 % e 500 µL desta amostra foram injetados na coluna de fase reversa. A
cromatografia foi desenvolvida utilizando-se o mesmo protocolo descrito no item
3.2.2.3. Após ser coletado, o pico de interesse foi reunido e seco em “speedvac”.
Todo processo de purificação da defensina recombinante foi monitorado
através de eletroforese em gel de tricina na presença de SDS, segundo método de
Schägger e von Jagow (1987) (item 3.2.4). Porém, na maioria das etapas, o gel foi
revelado através da precipitação com nitrato de prata.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 40
3.4.5- Precipitação com nitrato de prata
A precipitação por nitrato de prata foi feita segundo método descrito por
Morrissey (1998), com modificações.
3.4.5.1- Soluções
A solução 1 foi preparada utilizando 10 % de ácido acético, 40 % de etanol
absoluto, 50 % de água ultrapura.
A solução 2 foi preparada utilizando 5 % de glutaraldeído em água ultrapura.
A solução 3 foi preparada utilizando 20 % etanol absoluto em água ultrapura.
A solução 4 foi preparada com 0,2 g de nitrato de prata dissolvidos em 1 mL
de água ultrapura.
A solução 5, chamada solução “Staining”, foi preparada da seguinte forma: a
36,5 mL de água ultrapura foram adicionados 10 mL de etanol absoluto, 500 µL da
solução 4, 500 µL de hidróxido de amônio 30 % e 2,5 mL de hidróxido de sódio 4 %.
Os reagentes foram colocados nessa ordem e sob agitação. Essa solução foi
preparada imediatamente antes do uso.
A solução 6, chamada solução de coloração, foi preparada da seguinte forma:
a 40 mL de água ultrapura foram adicionados 10 mL de etanol absoluto, 50 µL de
formaldeído 37 % e 12,5 µL de ácido cítrico 2,3 M. Esta solução foi preparada
imediatamente antes do uso.
A solução 7, chamada solução de fixação, foi preparada da seguinte forma: a
45 mL de água ultra pura foram adicionados 5 mL de ácido acético e 500 µL de
glicerol. Esta solução foi preparada juntamente com a solução 6.
3.4.5.2- Precipitação e revelação protéica
Ao término da corrida, o gel foi cuidadosamente retirado das placas de vidro
e: incubado na solução 1 por 40 min; lavado em água ultrapura por 5 min; incubado
na solução 2 por 20 min; lavado novamente em água ultrapura (2 lavagens de 10
min cada); incubado na solução 3 por 20 min; incubado na solução 5 (ao abrigo da
luz) por 20 min; incubado na solução 3 por 20 min (2 lavagens de 10 min cada);
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 41
colocado na solução 6 até obter coloração desejada; deixado na solução 7 por 10
min; e armazenado em água destilada.
3.4.6- Sequenciamento N-terminal da defensina recombinante
3.4.6.1- Preparo da amostra e condições de corrida
O preparo das amostras, bem como as condições de corrida, tiveram como
base a metodologia descrita por Hunkapiller et alli (1983), com modificações. A
defensina recombinante purificada a partir de cromatografia de fase reversa em
coluna C2/C18 foi ressuspensa em tampão de amostra (Tris-HCl 0,125 M, pH 8,0;
SDS 0,2 %; sacarose 10 % e azul de bromofenol 0,25 %) contendo 5 % de β-
mercaptoetanol e 5 % vinil piridina, incubada, por 30 min a 37 °C e por 15 min a 60
°C; centrifugada a 16.000 x g por 3 min; e submetida à eletroforese descontínua em
gel de tricina na presença de SDS (item 3.2.4), montado 24 h antes do uso. Antes
que a amostra fosse aplicada no gel foi feita uma pré-corrida, de 45 min a 8 mA, na
qual os tampões anodo e catodo continham 5 µM de glutationa reduzida. Após a pré-
corrida trocou-se o tampão catodo por um novo, desta vez contendo 5 µM de
glutationa reduzida e 0,1 mM de tioglicolato de sódio; e aplicou-se a amostra.
3.4.6.2- Eletrotransferência para membrana de polivinilidenodifluoreto (PVDF)
Ao término da corrida, o gel foi retirado das placas e imerso em tampão de
transferência (glicina 182 mM, Tris 25 mM e metanol 20 %) por 20 min. De forma
semelhante, a membrana de PVDF (cortada nas mesmas dimensões do gel) foi
imersa por 3 segundos em metanol 100 %, imersa em água para retirar o excesso
de metanol e, então, imersa no tampão de transferência por 20 min. Passado este
tempo, as proteínas do gel foram eletrotransferidas para a membrana de PVDF
utilizando uma célula comercial de transferência (semi-seca). Para a
eletrotransferência, foi utilizada a seguinte metodologia: sobre a célula de
transferência foi montado um “sanduíche” composto respectivamente de quatro
folhas de papel de filtro (previamente embebidas em tampão de transferência), a
membrana, o gel e mais uma camada de quatro folhas, embebidas em tampão de
transferência, do papel de filtro. Uma vez montado o “sanduíche”, a célula de
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 42
transferência foi fechada, e sobre ela aplicada uma corrente constante de 1 mA/cm
2
de membrana por 2 h no sentido gel-membrana. Após a transferência, o “sanduíche”
foi cuidadosamente desfeito, a membrana submetida à coloração reversível com
Ponceau S (0,1 %), para determinação do sucesso da transferência (Método
descrito por Towbin et alli (1979), com modificações), e a banda de interesse
recortada da membrana. Em seguida, esta foi lavada em água destilada (para que
fosse retirado o excesso de corante), seca à temperatura ambiente e submetida ao
seqüenciamento.
3.4.6.3- Seqüenciamento N-terminal
Para a determinação da sequência de aminoácidos foi empregada a
metodologia introduzida e desenvolvida por Edman (1950), utilizando-se para tal um
seqüenciador automático de proteínas. Este é um processo cíclico de três etapas,
onde resíduos de aminoácidos são clivados um a um, a cada ciclo, a partir do N-
terminal da proteína e identificados como derivados feniltioidantoína. A primeira
etapa do ciclo é o acoplamento do fenilisotiocianato (PITC) com resíduos N-terminal;
a segunda, a clivagem do resíduo N-terminal via ciclização em meio ácido; a
terceira, a conversão do derivativo tiazolinona (ATZ) formado para um derivativo
mais estável, a tioidantoína (PTH), o qual pode ser identificado por cromatografia
(Allen, 1989).
3.4.7- Estudos de modelagem por homologia
Com a finalidade de encontrar o molde para a defensina recombinante foi
utilizada a ferramenta BlastP, que busca dentre seqüências de proteínas
depositadas em um banco de dados, aquelas que apresentem alguma identidade
com a seqüência da proteína alvo (defensina recombinante) (Altschul et al., 1997). A
partir desta seleção, pode-se escolher o melhor molde para a modelagem da
proteína alvo.
Na busca do molde para a defensina recombinante chegou-se à defensina 2
de Vigna radiata (VrD
2
, código pdb 2gl1A), que teve sua estrutura previamente
determinada por RMN (Lin et al., 2007). As estruturas primárias de VrD
2
e da
defensina recombinante foram então alinhadas utilizando o programa Clustal-W
(Thompson et al., 1994 - http://www.ebi.ac.uk/clustalw) e este alinhamento revelou
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 43
que a defensina VrD
2
é bastante semelhante à proteína alvo, diferindo da mesma em
apenas 3 resíduos de aminoácidos (93 % de identidade).
Assim, a estrutura da defensina recombinante foi modelada utilizando como
molde a estrutura de VrD
2
. Para a modelagem, foi utilizado o programa Modeller
(Sali e Blundell, 1993) que, com base na sobreposição de regiões conservadas
estruturalmente, identificadas por alinhamento entre a defensina recombinante e
VrD2, gera um conjunto de restrições espaciais e constrói o modelo.
A qualidade estereoquímica do modelo foi validada utilizando o programa
PROCHECK (Laskowski et al., 1993), disponível via PARMODEL web server (Uchôa
et al., 2004), que analisa diversos parâmetros incluindo ligações peptídicas,
planaridade dos anéis das cadeias laterais e torção dos ângulos φ e ψ da cadeia
principal.
3.5- Inibição da atividade de α-amilases pela defensina de sementes de feijão-
de-corda e seu respectivo homólogo recombinante
Para os ensaios de inibição da atividade de α-amilases foram utilizados
extratos intestinais dos insetos Zabrotes subfasciatus e Callosobruchus maculatus e
a saliva humana, os quais foram gentilmente cedidas pela Dr
a
. Olga Lima Tavares
Machado do Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos do Centro
de Biociências de Biotecnologia desta Universidade.
Diferentes concentrações da solução contendo defensina de sementes de
feijão-de-corda (10-50 µg.mL
-1
) e 30 µg.mL
-1
de seu respectivo homólogo
recombinante, suspensas em água ultrapura, foram incubadas com 5 U das
diferentes α-amilases em banho-maria a 30 °C por 30 min. Após este período, foram
adicionados à solução 25 µL de solução de amido 1 %, e a suspensão foi
novamente incubada a 30 °C (por 30 min para as α-amilases de insetos e por 15 min
para as α-amilases da saliva humana). Após o resfriamento do meio reacional, 400
µL de ácido 3,5-dinitro salicílico (DNS) foram adicionados à solução e esta foi fervida
por 5 min. Então, 400 µL de água foram adicionados à solução, e a hidrólise do
substrato pela enzima foi determinada por leitura em espectrofotômetro (absorvância
a 540 nm) (Bernfeld, 1955). Uma unidade de atividade da α-amilase foi definida
como a quantidade de enzima que aumenta em 0,1 unidades a absorvância em 540
nm. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 44
Parte II: Purificação, clonagem molecular e atividade antimicrobiana de uma
defensina de sementes de feijão comum
3.1- Materiais biológicos
3.1.2- Sementes
As sementes de Phaseolus vulgaris L. (feijão comum), cultivar Pérola, foram
fornecidas pelo Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal do Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, Rio de Janeiro, Brasil.
3.1.3- Microrganismos
As leveduras Candida parapsilosis (CE002), Candida guilliermondii (CE013),
Candida tropicalis (CE017), Candida albicans (CE022), Kluyveromyces marxiannus
(CE025) and Saccharomyces cerevisiae (1038) foram ) foram gentilmente cedidas
pela Dr
a
.
Vânia Maria Maciel Melo do Departamento de Biologia, Universidade
Federal do Ceará, Ceará, Brasil. As leveduras foram mantidas em meio de cultura
ágar Sabouraud.
Células de Escherichia coli, linhagens DH5-α [genótipo: F- φ80lacZ∆M15
∆(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(r
k
-
, m
k
+
) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1
λ
-
] foram adquiridas da Invitrogen Corporation. Estas bactérias foram mantidas em
stab de glicerol (750 µL da cultura celular + 250 µL de glicerol 50 %).
3.2- Purificação da defensina de sementes de feijão comum
3.2.1- Extração protéica
As sementes de feijão comum foram trituradas com o auxílio de um triturador
de alimentos até a formação de uma farinha bem fina. A farinha obtida foi extraída
em tampão fosfato pH 5,4 (Na
2
HPO
4
10 mM, NaH
2
PO
4
15 mM, KCl 100 mM, EDTA
1,5 %) na proporção de 1:5 (farinha:tampão de extração) sob agitação constante por
2 h a 4 ºC. Essa metodologia foi desenvolvida segundo Terras et alli (1993), seguida
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 45
de algumas modificações. A suspensão foi submetida à centrifugação a 15.000 x g
por 20 min a 4 ºC e o sobrenadante resultante submetido à precipitação com sulfato
de amônio a 70 % de saturação. O precipitado resultante da saturação com sulfato
de amônio foi ressuspenso em 10 mL de água destilada e aquecido a 80 ºC por 15
min e, em seguida, centrifugado a 10.000 x g por 8 min a 4 ºC. O precipitado
resultante desta última centrifugação foi descartado e o sobrenadante dialisado
exaustivamente contra água destilada e, em seguida, liofilizado. Esta fração foi
denominada fração F/0-70 e foi submetida às diferentes etapas de purificação da
defensina.
3.2.2- Cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE–Sepharose
Uma coluna de troca iônica (3 x 7 cm) foi preparada com resina DEAE-
Sepharose empacotada sob a ação da gravidade. Posteriormente, a resina foi
lavada sucessiva e abundantemente com: água destilada; NaOH 0,1 M; água
destilada; HCl 0,1 M; água destilada e, por fim, equilibrada com o tampão Tris-HCl
0,05 M pH 8,0 (2x o volume da coluna). Todo o processo foi feito a um fluxo
constante de 90 mL/h. A amostra a ser aplicada na coluna foi preparada da seguinte
forma: 50 mg de F/0-70 foram pesados e dissolvidos em 5 mL de tampão de
equilíbrio e depois centrifugados a 16.000 x g por 3 min à temperatura ambiente e o
sobrenadante aplicado na coluna. A amostra foi eluída primeiramente no tampão de
equilíbrio e, em seguida, no tampão de equilíbrio Tris-HCl acrescido de NaCl na
concentração de 1 M. Foram coletadas frações de 3 mL a um fluxo de 60 mL.h
-1
. As
absorvâncias das frações foram lidas em um espectrofotômetro a 280 nm. Os picos
foram separados, dialisados exaustivamente contra água destilada e liofilizados.
3.2.3- Cromatografia de fase reversa em HPLC
Uma coluna de fase reversa C2/C18 equilibrada com 0,1 % de TFA foi
sequencialmente empregada no processo de isolamento desta defensina. A fração
não retida obtida da cromatografia de troca iônica foi solubilizada em TFA 0,1 % e
injetada na coluna de fase reversa. A cromatografia foi desenvolvida utilizando-se
um fluxo de 0,5 mL.min
-1
a 32
o
C em sistema de HPLC. O gradiente de eluição foi
feito da seguinte maneira: 0-10 min, 100 % do solvente A (0,1% TFA e 2%
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 46
acetonitrila); 10-40 min, 0-100 % do solvente B (80% acetonitrila contendo 0,1%
TFA; 40-45 min 100 % do solvente B; 45-50 min, 100-0 % de B; e 50-60 min, 100 %
de A. A eluição da coluna foi acompanhada por um detector do tipo DAD, sendo os
picos detectados a 220 nm.
O processo de purificação da defensina de sementes de feijão comum foi
monitorado através de eletroforese em gel de tricina na presença de SDS, segundo
método de Schägger e von Jagow (1987).
3.3- Clonagem molecular, sequenciamento e caracterização do cDNA de uma
defensina de sementes de feijão comum
Todos os procedimentos de biologia molecular utilizados neste trabalho foram
baseados em Sambrook e Russel (2001).
3.3.1- Obtenção de RNAm de sementes de feijão comum
3.3.1.1- Preparo de solução de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico
O fenol equilibrado (pH 8,0) (GE Healthcare) foi misturado ao clorofórmio
(Merck) e ao álcool isoamílico (Merck) na proporção de 25:24:1, respectivamente, e
a solução foi armazenada em um frasco âmbar livre de RNase.
3.3.1.2- Preparo de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC)
A um litro de água ultra pura foram adicionados 1 mL de DEPC (0,1 % v/v) e
então esta solução ficou sobre forte agitação por, aproximadamente, 16 h. Ao final
deste tempo, a solução foi autoclavada a 121 °C por 15 min (água DEPC) e
armazenada a temperatura ambiente até ser utilizada.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 47
3.3.1.3- Extração de RNA total de sementes de feijão comum
Inicialmente, sementes quiescentes de feijão comum foram trituradas em
nitrogênio líquido até a obtenção de uma farinha bem fina. Após maceração, foi
pesado 0,1 g (peso fresco) da farinha e reservado em tubo de microcentrífuga ao
qual foram adicionados 600 µL de tampão de extração gelado (Tris-HCl 0,2 M, pH
7,5, LiCl 0,1 M, EDTA 5 mM, SDS 1 %) e 600 µL da solução fenol:clorofórmio
(fenol:clorofórmio:álcool isoamílico, 25:24:1) gelada. Os tubos foram agitados por,
aproximadamente, 5 min em um agitador de tubos e centrifugados a 8.000 x g por 5
min a 8°C. Após centrifugação, a parte aquosa foi transferida para um novo tubo e à
ela foram adicionados 600 µL de LiCl 6 M; então, a mistura foi mantida a 4°C por 1
h. Passado esse período, esta foi centrifugada a 13.600 x g por 10 min a 8 °C, o
sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em 100 µL de água DEPC.
À nova suspensão foram adicionados 10 µL de acetato de sódio 3 M, pH 5,2 e 220
µL etanol absoluto (2 volumes de 110 µL) e, então, deixadas a -20 °C. Após 1 h,
esta foi centrifugada a 13.600 x g por 15 min a 4 °C, o sobrenadante descartado e o
precipitado desidratado em banho seco a 37 °C por 10 min. Após secagem foram
adicionados ao precipitado 40 µL de água-DEPC e armazenado -20 °C até o uso.
3.3.1.4- Análise eletroforética de RNAs totais
Para preparo do gel de agarose 0,8 %, foram pesados 0,8 g de agarose
(Sigma) e foram adicionados a ela 100 mL de tampão TAE (Tris 40 mM, ácido
acético 20 mM, EDTA 1 mM e água-DEPC). A agarose foi fundida a 100 °C, com
atenção para que a solução não entrasse em fervura, resfriada a 50 °C e então
acrescida brometo de etídeo (0,5 µg.mL
-1
). O gel foi homogeneizado e vertido sobre
uma forma previamente preparada e enxaguada com água-DEPC. Esperou-se 1 h
após a solidificação para a utilização do gel.
As amostras foram preparadas misturando-se 1 µL da extração de RNA total,
6,5 µL de água-DEPC e 2,5 µL de tampão de amostra 4x (glicerol 50 %, TAE 4x e
azul de bromofenol 0,025 %). As amostras foram homogeneizadas e aplicadas no
gel. A corrida foi feita a uma voltagem de 4 V.cm
-1
de gel.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 48
3.3.1.5- Estimativa da concentração de RNA total
Para a quantificação do RNA total, uma alíquota de 1 µL deste foi aplicado em
um gel de agarose 0,8 % juntamente com concentrações conhecidas de um
marcador (RNA de concentração conhecida). Por comparação com a intensidade do
sinal da amostra e das bandas do marcador, estimou-se a concentração aproximada
da amostra.
3.3.1.6- Isolamento de RNA poli-adenilado a partir de RNA total
A purificação de RNA poli-adenilado (poli-A), a partir do RNA total, foi obtida
usando-se o Kit PolyATract
mRNA Isolation Systems IV (Promega), seguindo as
instruções fornecidas pelo fabricante.
3.3.2- Obtenção do cDNA
3.3.2.1- Reação de transcrição reversa
Para a transcrição reversa foi montada uma reação de 10 µL misturando-se: 4
µg de RNA poli-adenilado, tampão “first strand buffer” 1x (Tris-HCl 50 mM, KCl 75 M,
MgCl2 3 mM pH 8,3) (Invitrogen), 80 pmol do iniciador oligo dT18, DTT 5 mM,
dNTPs 0,5 mM, 20 unidades de RNaseOUT e 100 unidades de SuperScript III
(Invitrogen). A reação foi incubada por 80 min a 50
o
C. Posteriormente, o cDNA foi
utilizado para as reações em cadeia da polimerase.
3.3.3- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para a amplificação da defensina de sementes de feijão comum foi usado o
mesmo iniciador usado para a amplificação da defensina de sementes de feijão-de-
corda (DEFdeg), pois a seqüência amino-terminal dos peptídeos é idêntica (Fig. 5).
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 49
(A) Seqüência amino terminal da defensina de V. unguiculata
K T C E N L A D T Y R G P C F T T G S C
(B) Seqüência amino terminal da defensina de P. vulgaris
K T C E N L A E T Y K G P C F T T G S C
Figura 5. Comparação das seqüências N-terminais das defensinas de feijão-de-
corda e feijão comum. A. Seqüência amino-terminal da defensina de V. unguiculata
obtida pelo sequenciamento do peptídeo por degradação de Edman (Carvalho et al.
2001); a sequência de aminóacidos K T C E N L A, mostrado em cinza, foi usada
para se desenhar o iniciador degenerado. B. Seqüência amino-terminal da defensina
de P. vulgaris obtida por sequenciamento (degradação de Edman) do peptídeo
purificado (Games, 2006). A sequência mostrada em negrito é igual à sequência da
defensina de V. unguiculata.
Inicialmente, a amplificação da defensina de feijão comum foi feita seguindo a
metodologia descrita para a amplificação do cDNA da defensina de sementes feijão-
de-corda descrita por Carvalho et al. (2006).
A reação foi montada da seguinte forma: 11,4 µL de água, 2 µL do tampão da
Taq 10x [Tris-HCl 100 mM, pH 9,0, e KCl 500 mM], 1,6 µL MgCl
2
15 mM, 3,2 µL de
dNTPs 1,25 mM, 2 µL de oligo dT
18
(10 pmol), 1 µL do iniciador (DEFdeg) (10 pmo),
0,5 µL da reação com a transcriptase reversa (cDNA) e 0,16 µL da Taq DNA
polimerase (1 u).
A polimerização procedeu-se por 40 ciclos programadas com as seguintes
etapas: 1) 95 °C por 45 s; 2) 95 °C por 45 s; 3) 44,4 °C por 45 s; 3) 72 °C por 2 min;
e 72 °C por 30 min. Ao final, as amostras foram resfriadas a 8 °C ainda no
termociclador.
Com o objetivo de melhorar a amplificação do fragmento foram montadas
diferentes reações como a citada acima variando as concentrações de cloreto de
magnésio (0, 0,5, 0,8, e 1 mM), de cDNA (0,025 µL, 0,03 µL e 0,05 µL) e
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 50
temperaturas de anelamento (41,1; 42,2; 43,1; 44,2; 45,3; 46,4; 47,4;48,3; e 49,4
°C).
Após amplificação por PCR, as amostras foram analisadas por eletroforese
em gel de agarose 1 % para confirmar se houve amplificação e qual a melhor
condição para que a mesma ocorresse. Como marcador de massa molecular foi
utilizado o marcador 1 Kb ladder (Biotools).
3.3.4- Clonagem do cDNA amplificado no vetor pTZ57R/T
O vetor pTZ57R/T (Fermentas) (Fig. 6) é fornecido como parte de um Kit e a
clonagem dos cDNAs nesse vetor foi feita segundo o protocolo fornecido pelo
fabricante.
A reação de ligação continha: 7 µL do fragmento purificado (350 ng), 3 µL de
tampão de ligação 10 x [Tris-HCl 400 mM, MgCl
2
100 mM, DTT 100 mM, ATP 5 mM
pH 7,8], 3 µL de PEG 4000, 3 µL do vetor pTZ57R/T (165 ng), 1,2 µL de T4 DNA
ligase 5 u. µL
-1
e 12,8 µL água ultra-pura.
A reação foi gentilmente homogeneizada e incubada por 16 h a 16 °C. A
próxima etapa foi a transformação de células competentes com o vetor ligado aos
cDNAs amplificados com o iniciador DEFdeg. O objetivo da clonagem dos cDNAs
nesse vetor foi sua subsequente purificação, o seqüenciamento dos mesmos e
também sua manutenção.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 51
Figura 6. Mapa de restrição do vetor pTZ57R/T (retirado do manual do vetor,
Fermentas).
3.3.5- Produção de células competentes de E. coli, linhagem DH5α
Uma colônia bacteriana de uma cultura fresca de E. coli, linhagem DH5α, foi
inoculada em um tubo contendo 5 mL de meio LB acrescido de ampicilina (100
µg.mL
-1
). Esse tubo foi incubado a 37 °C por 16 h a 250 rpm (pré-inóculo). Desse
pré-inóculo, foram retiradas alíquotas de 0,2, 0,4 e 0,8 mL e transferidas para 50 mL
de meio LB acrescido de ampicilina (100 µg.mL
-1
) e incubados a 37 °C por 3 h e a
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 52
250 rpm. Após esse período, foram feitas leituras no espectrofotômetro a 600 nm. A
cultura que apresentou densidade ótica em torno de 0,55 foi usada para o preparo
das células competentes, sendo transferida para banho de gelo por 10 min e
centrifugada a 2.500 x g por 10 min, a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e o
sedimento de células foi ressuspenso em 10 mL de solução salina (PIPES 10 mM,
pH 6,7, MgCl
2
55 mM, CaCl
2
15 mM e KCl 250 mM) e essa ressuspensão
centrifugada nas mesmas condições. O sobrenadante foi mais uma vez descartado
e o sedimento de células foi suspenso em 10 mL da solução salina e acrescido de
375 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) 100 %. As células foram homogeneizadas
gentilmente e incubadas por 10 min em banho de gelo. Após essa incubação, mais
375 µL de DMSO 100 % foram adicionados, a suspensão de células foi novamente
homogeneizada e alíquotas de 200 µL foram transferidas para tubos de
microcentrífuga autoclavados e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido,
antes de serem armazenadas a -70 °C.
3.3.6- Transformação de células competentes de E. coli DH5α com o vetor
pTZ57R/T ligado ao cDNA amplificado com o iniciador DEFdeg
A transformação foi feita de acordo com as instruções fornecidas pelo
fabricante do kit vetor (Fermentas). Inicialmente, tubos contendo 200 µL de células
competentes, armazenados a -70 °C, foram descongelados em banho de gelo e às
células foram adicionados 5 µL do vetor pTZ57R/T ligado ao cDNA amplificado com
o iniciador DEFdeg. Feito isto, os tubos foram incubados por 10 min em banho de
gelo. Após esse período, os tubos contendo as células e o vetor foram transferidos
do gelo para 42 °C por 90 s e, em seguida, novamente para banho de gelo por mais
10 min. Após o choque térmico, foram adicionados 250 µL de meio LB às células e,
então, essas foram incubadas a 37 °C por 1 h. Após esse período de incubação, 50,
100 e 150 µL das células foram plaqueados em placas de Petri contendo meio LB
acrescido de ampicilina (100 µg.mL
-1
) (GE Healthcare). Ao final do plaqueamento as
placas foram incubadas a 37 °C por 16 h.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 53
3.3.7- Análise dos clones positivos - extração e digestão dos vetores
Após a transformação, diferentes colônias foram recolhidas e submetidas à
análise dos clones positivos através de extração e digestão dos vetores com
enzimas de restrição.
Para a extração utilizou-se a seguinte metodologia: colônias que cresceram
na placa com ampicilina (100 µg.mL
-1
) foram transferidas para 10 mL de meio LB
líquido contendo ampicilina (100 µg.mL
-1
) e incubadas a 37 °C por 16 h, a 250 rpm.
Após esse período de crescimento, 750 µL de cada cultura foram transferidos,
separadamente, para um tubo de microcentrífuga e centrifugados a 9.000 x g por 1
min. Os sobrenadantes foram descartados e aos sedimentos de bactérias foram
adicionados mais 750 µL das respectivas culturas no mesmo tubo e a centrifugação
foi repetida. Os sobrenadantes foram novamente descartados e aos sedimentos de
bactérias foram adicionados 300 µL de TENS (Tris-HCl 0,01 M, pH 8,0, EDTA 1 mM,
NaOH 0,1 M e SDS 25 mM), sendo as amostras foram agitadas por 10 s para a lise
das células. Após a lise das bactérias, 150 µL de acetato de sódio 3 M pH 5,2 foram
adicionados e novamente as amostras foram agitadas por mais 10 s, antes de serem
centrifugadas a 13.200 x g por 3 min. Os precipitados foram descartados e os
sobrenadantes transferidos para um novo tubo e a eles foi adicionado 1 mL de
etanol 100 % gelado. As amostras foram homogeneizadas gentilmente e incubadas
por 1 min à temperatura ambiente e centrifugadas nas mesmas condições. Os
sobrenadantes foram descartados e os precipitados lavados com 1 mL de etanol 70
%. As amostras foram centrifugadas nas mesmas condições, os sobrenadantes
foram descartados e os precipitados, secos em banho-seco a 37 °C por 10 min.
Após a secagem, os precipitados foram ressuspensos em 40 µL de TE contendo
RNase A (Tris-HCl 0,01 M, pH 8,0, EDTA 1 mM e RNase A 20 µg.mL
-1
) e incubados
nesse tampão por 1 h a 37 °C.
Ao final desse procedimento, alíquotas dos precipitados ressuspensos foram
submetidas à digestão com as enzimas de restrição EcoR I e BamH I e o restante
das amostras foi armazenado a -20 °C.
O vetor pTZ57R/T possui sítios de restrição para as enzimas EcoR I e BamH I
flanqueando a região em que o fragmento é inserido (Fig. 6). Portanto, a digestão
com estas enzimas abre o vetor e ao mesmo tempo libera o fragmento inserido. A
reação de digestão foi feita da seguinte forma: 10 µL da solução contendo o vetor
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 54
pTZ57R/T ligado ao cDNA amplificado (obtido conforme descrito no item 3.3.4), 5 µL
de tampão BamH I 10x [Tris-HCl 50 mM pH 8,0, MgCl
2
5 mM, KCl 100 mM, Triton X-
100 0,02 %, β-mercaptoetanol 1 mM e BSA 0,1 mg.mL-1] (1x), 0,05 µL de BamH I 20
u.µL
-1
(1 u), 0,05 µL de EcoR I 20 u.µL
-1
(1u) e 35 µL de água ultra pura.
As amostras foram homogeneizadas e então incubadas a 37 °C por 2 h. Ao
final desse período, foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 1%.
3.3.8- Sequenciamento do cDNA amplificado com o iniciador DEFdeg
Para o sequenciamento foram escolhidos 3 clones positivos. Para cada um
deles foram montadas duas reações, uma consistindo de 200 ng do vetor contendo
o cDNA clonado e 3,2 pmol do iniciador “reverse” (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´)
para o sítio M13 “reverse” do vetor e outra contendo 300 ng do mesmo vetor e 3,2
pmol do iniciador “forward” (-20) (5´-GTAAAACGACGGCCAGT-3´) para o sítio M13
“forward” do vetor (Fig. 6), para que as fitas pudessem ser seqüenciadas
separadamente.
A reação de amplificação para o seqüenciamento foi preparada com o kit Big
Dye
Terminator v3.1 (Amersham Biosciences) segundo informações fornecidas
pelo fabricante. A reação de amplificação consistiu de 25 ciclos, baseados na
seguinte programação: 1) 95 °C por 1 min; 2) 96 °C por 15 s; 3) 50 °C por 30 s; 4) 60
°C por 4 min.
Posteriormente, as amostras foram purificadas, pela adição de 40 µL
isopropanol 65% (30 min, temperatura ambiente). Os tubos contendo as amostras
foram então centrifugados por 25 min a 12.000 rpm (Sanyo MSEmicro Centaur). Os
sobrenadantes foram descartados e os precipitados lavados com etanol 60 % e
centrifugados por 5 min a 12.000 rpm. Os sobrenadantes foram descartados e os
tubos novamente centrifugados emborcados por 30 s a 500 rpm. As centrifugações
foram feitas à temperatura ambiente. Os precipitados foram secos em termociclador
(10 min a 65 °C) e, posteriormente, ressuspensos em 10 µL de formamida, agitados
vigorosamente em vortex, transferidos para as placas de seqüenciamento,
incubados a 95
o
C por 2 min e transferidos imediatamente para gelo até o
sequenciamento. O seqüenciamento foi feito em um seqüenciador automático ABI
3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 55
3.3.9- Análise da sequência de nucleotídeos do cDNA amplificado com o iniciador
DEFdeg
A dedução da sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo cDNA
clonado, assim como o seu alinhamento com proteínas depositadas em bancos de
dados foram feitos utilizando os programas “Expasy-Translate tool”
(http://ca.expasy.org/tools/dna.html) e “BLAST” (http:/www.ncbi.nlm.nih.org/BLAST)
(Altschul et al., 1990), respectivamente. A dedução do ponto isoelétrico (pI) e da
massa molecular desta proteína foi feita utilizando o programa “Expasy-Compute
pI/Mw tool” (http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html) (Bjellqvist et al., 1993; Bjellqvist
et al., 1994; Gasteiger et al., 2005)
3.3.10- Análise filogenética
Para análise filogenética, a sequência obtida no item 3.3.9 e mais 34
defensinas de diferentes espécies de plantas (proteínas maduras, sem o peptídeo
sinal), obtidas a partir do banco de dados SWISSPROT (http://ca.expasy.org/sprot),
foram alinhadas utilizando o programa CLUSTAL W2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Com os dados obtidos a partir
deste alinhamento, foi montada, utilizando o programa PHYLIP Drawtree
(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/phylogeny/phylip-fr.html), uma árvore de relação
filogenética entre estas defensinas.
3.4- Análise da atividade antifúngica da defensina de sementes feijão comum
3.4.1- Ensaio de inibição do crescimento de leveduras em meio líquido
3.4.1.1- Preparo dos inóculos
Inóculos das células das leveduras Candida albicans, C. parapsilosis, C.
tropicalis, C. guilliermondii, Kluyveromyces marxiannus e Saccharomyces cerevisiae
foram retirados dos tubos contendo ágar Sabouraud inclinado e transferidos para
placas de Petri contendo ágar Sabouraud. As células foram mantidas por um
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 56
período de três dias à temperatura ambiente. Após crescimento, uma alíquota foi
dissolvida em caldo sabouraud e as células quantificadas em câmara de Neubauer.
3.4.1.2- Ensaio de inibição
Após quantificação, as células das leveduras C. albicans, C. parapsilosis, C.
tropicalis, C. guilliermondii, K. marxiannus e S. cerevisiae (1 x 10
4
células.mL
-1
)
foram incubadas em 200 µL de caldo Sabouraud contendo a defensina de feijão
comum em diferentes concentrações (25, 50 e 100 µg.mL
-1
). O ensaio foi realizado
em placas de cultura de células (96 poços), a temperatura ambiente por um período
de 36 h. A determinação da densidade óptica (reflexo do crescimento celular) foi
feita de 6 em 6 h em um “leitor de ELISA,” a 660 nm. Todo o procedimento do ensaio
foi feito sob condições estéreis em capela de fluxo laminar, segundo metodologia
adaptada de Broekaert et alli (1990).
3.4.2- Análise morfológica de células de leveduras tratadas com a defensina de
sementes de feijão comum por microscopia eletrônica de varredura
Após o ensaio de inibição (3.4.1.2), as células das leveduras C. albicans, C.
parapsilosis, C. tropicalis e S. cerevisiae crescidas na presença da defensina de
sementes de feijão comum (100 µg.mL
-
1) foram exustivamente lavadas em meio de
cultura e submetidas aos seguintes tratamentos: Fixação (300 µL da solução
contendo células da levedura foram fixados em 2,5 % de glutaraldeído (GA), 4 % de
paraformaldeído (PA) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,3, por um período de 30 min à
temperatura ambiente); Lavagem (o material foi lavado 3 vezes, por um período de
10 min cada, com tampão fosfato 0,1 M, pH 7,3); Adesão às lamínulas (após a
lavagem, as leveduras foram aderidas a lamínulas pré-cobertas com poli-L-lisina, por
10 min); Pós-fixação (as células de leveduras foram pós-fixadas em 1 % de tetróxido
de ósmio (OsO
4
) em tampão fosfato 0,1 M, por 30 min, no escuro à temperatura
ambiente); Lavagem (o material foi lavado 3 vezes, por um período de 10 min cada,
com tampão fosfato 0,1 M, pH 7,3); Desidratação (em uma série crescente de
acetona (30, 50, 70, 90 e 100 %), por 15 min em cada etapa); Secagem (pelo
método do ponto crítico, no aparelho Balzers CPD 030, usando gás carbônico
líquido); Montagem dos suportes (as lamínulas, com a face contendo o material para
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 57
cima foram montadas em suportes metálicos, com auxílio de fita adesiva de carbono
e cola de prata); e, finalmente, vaporização de ouro (os suportes montados
receberam vaporização de ouro, em um aparelho de “sputtering” por 80 s. Nestas
condições, as amostras apresentam uma camada de ouro de aproximadamente 20
nm de espessura). A observação e a confecção de micrografias das amostras foram
feitas no microscópio eletrônico de varredura Zeiss 962.
3.4.3- Análise ultraestrutural de células de leveduras tratadas com a defensina de
sementes de feijão comum
A análise da ultraestrutura celular foi feita através da microscopia eletrônica
de transmissão. Após o ensaio de inibição (3.4.1.2), as células das leveduras C.
albicans e C. guilliermondii crescidas na presença da defensina de sementes de
feijão comum foram abundantemente lavadas em meio de cultura e submetidas aos
seguintes tratamentos: Lavagem (o material foi lavado 3 vezes, por um período de
10 min cada, com tampão fosfato 0,1 M, pH 7,3); Fixação (300 µL da solução
contendo células da levedura foram fixados em 2,5 % de glutaraldeído (GA), 4 % de
paraformaldeído (PA) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,3, por um período de 30 min à
temperatura ambiente); Lavagem (o material foi lavado 2 vezes (30 min cada
lavagem) com tampão fosfato 0,1 M pH 7,0; Pós-fixação com 1 % de tetróxido de
ósmio (OsO
4
) em tampão fosfato 0,1 M, por 30 min, no escuro, à temperatura
ambiente; Desidratação em uma série crescente de acetona (50, 70, 90,100,
novamente 100 % e, por fim, acetona 100 % super seca s.s., tendo cada etapa a
duração de 1 h); e Infiltração em resina Epon (3 partes de acetona 100 % s.s., para
1 de Epon; 2 partes de acetona 100 % s.s., para 1 de Epon; 1 parte de acetona 100
% s.s., para 1 de Epon; 1 parte de acetona 100 % s.s., para 2 de Epon;1 parte de
acetona 100 % s.s, para 3 de Epon; apenas Epon; emblocamento e polimerização
48 h a 60
o
C, cada etapa com duração de 8 h). A observação e a confecção de
micrografias das amostras foram realizadas no microscópio eletrônico de
transmissão TEM 900.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 58
3.4.4- Permeabilização da membrana plasmática da levedura Saccharomyces
cerevisiae pela defensina de sementes de feijão comum
A permeabilização da membrana de células da levedura S. cerevisiae tratadas
com a defensina de sementes de feijão comum foi avaliada através da utilização do
corante fluorescente SYTOX Green (Molecular probes®, Invitrogen), segundo
metodologia descrita por Thevissen et alli (1999), com algumas modificações.
Inóculos de células de S. cerevisiae foram colocadas para crescer em placas
de Petri contendo ágar Sabouraud, onde cresceram por três dias a 30
o
C. Após este
período, as células foram homogeneizadas em 4 mL de meio Sabouraud líquido e 5
µL dessa suspensão celular foram adicionados a 200 mL de meio de cultura (caldo
Sabouraud) e mantidas sob agitação constante de 250 rpm a 30
o
C por
aproximadamente 16 h. Posteriormente, as células foram recuperadas por
centrifugação (3.000 x g por 5 min a 4
o
C), lavadas com água ultra pura para a
retirada do excesso de meio e incubadas (10
7
células/mL) por 1 h em 1 mL de Tris-
HCl 10 mM, pH 6,0 contendo glicose 0,1 M e 100 µg.mL
-1
da defensina de sementes
de feijão comum. Imediatamente após a incubação, uma alíquota contendo 2 x 10
6
células/mL de levedura foi incubada sob constante agitação por 1 h com o corante
fluorescente SYTOX Green a uma concentração final de 0,2 µM, de acordo com
instruções fornecidas pelo fabricante. Após este período, estas células foram
observadas em microscópio óptico de campo claro (Axioplan ZEISS). As imagens
foram obtidas através do microscópio Axioplan acoplado à câmera “Cannon Power
Shot A640." Como controle positivo foram utilizadas células mortas por calor (as
células foram aquecidas a 100
o
C por 5 min).
3.5- Inibição da atividade de α-amilases pela defensina de sementes de feijão
comum
Para os ensaios de inibição da atividade de α-amilases foram utilizadas α-
amilases dos insetos Zabrotes subfasciatus e Callosobruchus maculatus e a α-
amilase salivar humana. Todas as enzimas testadas foram gentilmente cedidas pela
Dr
a
. Olga Lima Tavares Machado do Laboratório de Química e Função de Proteínas
e Peptídeos do Centro de Biociências de Biotecnologia desta Universidade.
Materiais e Métodos _________________________________________________________
Santos, I.S. 59
Diferentes concentrações da solução contendo defensina de sementes de
feijão comum (10-50 µg. mL
-1
), suspensas em água ultrapura, foram incubadas com
5 U das diferentes α-amilases em banho-maria a 30 °C por 30 min. Após este
período, foram adicionados à solução 25 µL de solução de amido 1 %, e a
suspensão foi novamente incubada a 30 °C (por 30 min para as α-amilases de
insetos e por 15 min para as α-amilases da saliva humana). Após o resfriamento do
meio reacional, 400 µL de ácido 3,5-dinitro salicílico (DNS) foram adicionados à
solução e esta foi fervida por 5 min. Então, 400 µL de água foram adicionados à
solução, e a hidrólise do substrato pela enzima foi determinada por leitura em
espectrofotômetro (absorvância a 540 nm) (Bernfeld, 1955). Uma unidade de
atividade da α-amilase foi definida como a quantidade de enzima que aumenta em
0,1 unidades a absorvância em 540 nm. Todos os ensaios foram realizados em
triplicata.
____________________
RESULTADOS
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
60
4. RESULTADOS
Parte I: Purificação, expressão heteróloga e atividade inibitória de α-amilase
por uma defensina de sementes de feijão-de-corda
4.1- Purificação da defensina de sementes de feijão-de-corda
A purificação da defensina de sementes de feijão-de-corda foi obtida através
de uma cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose. Nesta coluna,
a fração F/30-70, oriunda do fracionamento com sulfato de amônio (30-70 % de
saturação), foi separada em dois picos denominados F1 e F2. O pico F1
corresponde à fração não retida na coluna, eluída com o tampão de equilíbrio da
coluna, e o pico F2 à fração retida na coluna, eluída com 1 M de NaCl (Fig. 7A).
Posteriormente, a fração F1 foi submetida à cromatografia de exclusão
molecular em coluna de Sephadex G-50, onde foi fracionada em dois novos picos
denominados P1 e P2. A defensina de interesse está presente na fração P2 (Fig.
7B).
Em um passo subseqüente de purificação, a fração P2 foi submetida à
cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 em HPLC e dividida em duas
novas frações denominadas H1 e H2 (Fig. 7C). A fração H1, eluída com
aproximadamente 35 % de acetronitrila, corresponde à defensina purificada de
sementes de feijão-de-corda.
A Figura 8 mostra o perfil eletroforético das frações P2, H1 e H2 obtidas
durante o isolamento da defensina de sementes de feijão-de-corda. Como pode ser
observado na figura, a cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 se mostrou
bastante eficiente na purificação da defensina, sendo a fração H1 composta apenas
por uma banda protéica bastante homogênea de aproximadamente 6 kDa, massa
molecular da defensina de sementes de feijão-de-corda, mesmo resultado obtido por
Carvalho et alli (2001).
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
61
Figura 7. Etapas de purificação da defensina de sementes de feijão-de-corda. A.
Cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose da fração F/30-70 de
sementes de feijão-de-corda. B. Cromatografia de exclusão molecular em coluna de
Sephadex G-50 da fração F1 oriunda da cromatografia de troca iônica em DEAE-
Sepharose. C. Cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 da fração P2
oriunda da cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-50.
P1
P2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 10 20 30 40 50 60
Frações
ABS (280 nm)
F1
F2
-200
300
800
1300
1800
2300
1 1201 2401 3601 4801
Tempo (segundos)
ABS (220 nm)
H2
H1
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 20 40 60 80 100 120
Frações
ABS (280 nm)
A
B
C
NaCl
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
62
Figura 8. Visualização eletroforética em gel de tricina na presença de SDS das
frações obtidas durante a purificação da defensina de sementes de feijão-de-corda.
(1) P2, fração oriunda da cromatografia de exclusão molecular em coluna de
Sephadex G-50; (2) H1, fração oriunda da cromatografia de fase reversa em coluna
C2/C18 em HPLC; (3) H2, fração oriunda da cromatografia de fase reversa em
coluna C2/C18 em HPLC; (M) marcador de massa molecular (kDa).
M 1 2 3
8,1
16,9
14,4
10,6
6,2
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
63
4.2- Clonagem molecular e expressão heteróloga da defensina de sementes de
feijão-de-corda
A expressão funcional da defensina de sementes de feijão-de-corda foi
iniciada com a amplificação de um fragmento que codificava para este peptídeo
utilizando os iniciadores DEFs e DEFas. Para se avaliar quais as condições ideais
para esta amplificação, foram montadas reações da PCR utilizando diferentes
concentrações destes iniciadores e temperaturas.
A análise eletroforética dos géis de agarose carregados com as amostras
oriundas destas PCRs revelou, independente da condição testada, a amplificação de
um fragmento de aproximadamente 250 pb. Como pode ser observado na figura 9, o
Mix 3 (1:1, DEFs:DEFas) apresentou o melhor resultado, independente da
temperatura de anelamento testada.
Uma vez padronizadas as condições da amplificação, uma nova reação de
PCR foi montada com um volume de reação maior e os fragmentos delas oriundos
foram ligados ao vetor pET-32 Ek/LIC. A construção pET-DEF foi então utilizada
para a transformação de células da bactéria E. coli (linhagem JM109). A extração e
digestão dos vetores revelaram a clonagem do fragmento de interesse. Após a
digestão, um fragmento de 250 pb correspondente ao fragmento amplificado com os
iniciadores DEFs e DEFas foi liberado (Fig. 10).
Porém, células da linhagem JM109 não são células próprias para a expressão
de proteínas. Assim, a fim de superexpressar a defensina de sementes de feijão-de-
corda, os vetores (pET-DEF) extraídos de células da linhagem JM109 foram
utilizados para a transformação das células bacterianas da linhagem BL21 (DE
3
)
pLysS. Esta transformação também foi bem sucedida. A figura 11 mostra reações de
PCR feitas a partir de colônias positivas resultantes desta transformação.
Tendo se confirmado a transformação das células bacterianas de expressão
com o vetor pET-DEF, restava então padronizar as condições ideais para expressão
da proteína recombinante. Assim, as células transformadas com o vetor pET-DEF
foram submetidas à indução da expressão da defensina heteróloga através da
adição de IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranisídeo) no meio de cultivo.
Diferentes tempos de crescimento e concentrações de IPTG foram testados. Após
estes testes, ficou estabelecido que a concentração de IPTG a ser utilizada para a
expressão da defensina recombinante era 0,4 mM e que o tempo de crescimento
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
64
após inoculação deveria ser em torno de 3 h (Fig. 12). Nesta figura pode ser ainda
observada a presença de concentrações consideráveis da proteína recombinante no
precipitado (corpos de inclusão) (Fig. 12 C e D), o que indica o mau enovelamento
da proteína.
Através de técnica de Western blotting, ficou confirmado que a banda protéica
com massa molecular próxima a 26 kDa, correspondente à fusão da tioredoxina e
cauda de histidina (20,4 kDa) à defensina madura (isto é, sem o peptídeo sinal de
5,17 kDa), está presente nos diferentes lisados celulares obtidos (Fig. 13).
Como a super-expressão da defensina na linhagem de E. coli linhagem BL21
(DE
3
) pLysS não fora de todo bem sucedida, pois grande parte da proteína
produzida estava sendo depositada em corpos de inclusão (Fig. 12 C e D), os
vetores pET-DEF extraídos foram utilizados para a transformação de células
bacterianas da linhagem Rosetta gami 2 (DE3) pLysS, células de expressão que
permitem a formação de pontes dissulfeto e que contêm um plasmídeo com os
códons de 7 tRNAs raros em procariotos. Esta transformação foi bem sucedida.
De posse das células bacterianas da linhagem Rosetta gami 2 (DE3) pLysS
transformadas e com o conhecimento das condições ideais para a expressão da
defensina recombinante, a indução da expressão passou a ser feita utilizando estas
células. Induzidas com IPTG, células da linhagem Rosetta gami 2 (DE3) pLysS
transformadas com o vetor pET-DEF expressaram a proteína fusionada de
aproximadamente 26 kDa (Fig. 14).
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
65
Figura 09. Visualização eletroforética das amostras obtidas da reação de PCR
utilizando diferentes concentrações dos iniciadores DEFs e DEFas e temperaturas.
Mix 1, mistura de reação contendo iniciadores DEFs e DEFas na proporção de 2:1;
Mix 2, mistura de reação contendo iniciadores DEFs e DEFas na proporção de 1:2;
Mix 3, mistura de reação contendo iniciadores DEFs e DEFas na proporção de 1:1;
M, padrão de peso molecular (em pb); Figura negativa do gel corado com brometo
de etídeo.
1.500
250
3.000
5.000
10
.000
500
71,9
60,9
65,5
62,2
67,6
Mix
3
71,9
60,9
65,5
62,2
67,6
Mix
2
71,9
60,9
65,5
62,2
67,6
Mix
1
M
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
66
Figura 10. Visualização eletroforética de amostras obtidas como produto da digestão
do vetor pET-DEF extraído de células bacterianas da linhagem JM109 com as
enzimas de restrição EcoR I e Bgl II em gel de agarose 1%. (1 a 3) vetores extraídos
das colônias 1 a 3 que após a digestão com as enzimas EcoR I e Bgl II liberaram um
fragmento de 250 pb indicado pela seta. (4) fragmento que codifica a defensina
purificado e usado para a clonagem no vetor pET Ek/LIC. (5) vetor pET-DEF
extraído da colônia 1 sem digerir; (M) padrão de massa molecular em pb. Figura
negativa do gel corado com brometo de etídeo.
1.500
250
3.000
5.000
10
.000
500
M 1 2 3 4 5
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
67
Figura 11. Visualização eletroforética de amostras obtidas da reação de PCR feita
diretamente de colônias bacterianas da linhagem BL21 (DE
3
) pLysS transformadas
com o plasmídeo pET-DEF utilizando os iniciadores DEFs e DEFas. (1 a 3) vetores
extraídos das colônias 1 a 3; (M) padrão de massa molecular em pb. Figura negativa
do gel corado com brometo de etídeo.
1.500
250
3.000
5.000
10
.000
500
M 1 2 3
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
68
Figura 12. Visualização, por SDS-PAGE, de extratos protéicos obtidos de colônias
positivas das células BL21 (DE
3
) pLysS clonadas com o vetor pET-DEF. (A) fração
solúvel, indução feita com 0,4 mM de IPTG; (B) fração solúvel, indução feita com 1
mM de IPTG; (C) precipitado, indução feita com 0,4 mM de IPTG; (D) precipitado,
indução feita com 1 mM de IPTG; (1) extrato protéico da célula BL21 (DE
3
) pLysS;
(2) extrato protéico da célula BL21 (DE
3
) pLysS transformada com vetor pET-DEF
controle sem indução com IPTG; (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) extrato protéico da célula BL21
(DE
3
) pLysS transformada com vetor pET-DEF após 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3
h, 3,5 h e 4 h após indução com IPTG, respectivamente. Géis corados com
Coomassie Blue R; (M) marcador de massa molecular em kDa.
B
C
D
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
36
20
14
29
45
66
36
20
14
29
45
66
36
20
14
29
45
66
36
20
14
29
45
66
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
69
Figura 13. Western blotting dos extratos protéicos obtidos de colônias BL21 (DE
3
)
pLysS transformada com vetor pET-DEF, usando-se anticorpos contra a cauda de
histidina. (1) extrato protéico da célula BL21 (DE
3
) pLysS; (2) extrato protéico da
célula BL21 (DE
3
) pLysS transformada com vetor pET-DEF controle sem indução
com IPTG; (3, 4, 5) extrato protéico da célula BL21 (DE
3
) pLysS transformada com
vetor pET-DEF 30 min, 1,5 h e 3 h após indução com 0,4 mM de IPTG,
respectivamente.
1 2
3
4
5
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
70
Figura 14. Visualização, por SDS-PAGE, de extratos protéicos obtidos de uma
colônia positiva das células Rosetta gami 2 (DE
3
) pLysS clonadas com o vetor pET-
DEF. (1) extrato protéico das células Rosetta gami 2 (DE
3
) pLysS clonadas com o
vetor pET-DEF não induzidas com IPTG; (2) extrato protéico das células Rosetta
gami 2 (DE
3
) pLysS clonadas com o vetor pET-DEF 3 h após indução com 0,4 mM
de IPTG. Gel corado com Coomassie blue R; (M) marcador de massa molecular em
kDa.
36
M 1
2
20
14
29
45
66
24
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
71
4.3- Isolamento e caracterização da defensina recombinante
4.3.1- Isolamento da defensina recombinante
A purificação da defensina recombinante foi feita através de cromatografias
de afinidade e de fase reversa. A fração solúvel do extrato bacteriano foi inicialmente
fracionada por cromatografia de afinidade em coluna de Ni Sepharose, a qual
apresentou dois picos denominados N1 (não retido) e N2 (retido). A fração retida
desta cromatografia foi então submetida à clivagem com enteroquinase bovina
recombinante para remover a tioredoxina e a cauda de histidina fusionadas à
defensina recombinante fusionadas. Em um passo seguinte de purificação, esta
fração resultante da clivagem foi novamente submetida à cromatografia de afinidade
em coluna de Ni Sepharose. Esta segunda cromatografia de afinidade também
apresentou dois picos. A fração não retida obtida nesta cromatografia (sN1) foi então
posteriormente fracionada em cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 (Fig.
15).
A figura 16 mostra o perfil eletroforético das diferentes frações obtidas durante
o processo de purificação da defensina recombinante. Na linha 2 desta figura está a
fração solúvel do extrato bacteriano e na linha 3 o pico N2 obtido na primeira
cromatografia de afinidade a níquel. A banda de aproximadamente 30 kDa presente
nestas frações corresponde à proteína fusionada expressa por células da linhagem
Rosetta gami 2 (DE3) pLysS transformadas com o vetor pET-DEF. A fração obtida
após a clivagem com a enteroquinase é mostrada na figura 16A linha 4. É notável o
aparecimento de uma banda protéica de aproximadamente 6 kDa após esta
clivagem. Esta é a massa molecular da defensina de sementes de feijão-de-corda.
Ainda nesta mesma figura, na linha 5 pode ser visualizado o perfil eletroforético da
fração sN1 oriunda da segunda cromatografia de afinidade a níquel. A defensina
recombinante está presente nesta fração. Na figura 16B linha 1 está apresentada a
defensina recombinante purificada através de cromatografia de fase reversa em
HPLC coluna C2/C18. Na linha 2 desta figura está a defensina de sementes de
feijão-de-corda também purificada através de cromatografia de fase reversa em
HPLC coluna C2/C18.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
72
Figura 15. Cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 da fração sN1 oriunda
da cromatografia de afinidade em Ni Sepharose. A cromatografia foi desenvolvida
utilizando-se um fluxo de 0,7 mL.min
-1
a temperatura de 32
o
C em sistema de
HPLC. Para a eluição das proteínas da coluna foi utilizado um gradiente de
acetonitrila de 0 a 80 %. A eluição da coluna foi acompanhada por um detector do
tipo DAD, sendo as absorbâncias lidas a 220 nm. A linha em cinza claro representa
o gradiente de acetonitrila. O pico indicado pela seta corresponde à defensina
recombinante.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
73
Figura 16. Visualização, por SDS-PAGE, das diferentes frações obtidas durante a
purificação da defensina recombinante. A. (1) extrato protéico das células Rosetta
gami 2 (DE
3
) pLysS clonadas com o vetor pET-DEF não induzidas com IPTG; (2)
fração solúvel do extrato bacteriano (células da linhagem Rosetta gami 2 (DE
3
)
pLysS transformadas com o vetor pET-DEF 3 h após indução com 0,4 mM de IPTG);
(3) pico N2 obtido da cromatografia de afinidade a níquel; (4) pico N2 após clivagem
com enteroquinase bovina recombinante; (5) pico sN1 obtido da segunda
cromatografia de afinidade a níquel. B. (1) Defensina recombinante purificada
através de cromatografia de fase reversa em HPLC (coluna C2/C18); (2) Defensisa
de sementes de feijão-de-corda purificada através de cromatografia de fase reversa
em HPLC (coluna C2/C18); (M) marcador de massa molecular em kDa. A seta indica
a proteína superexpressa.
B
1 2
M 1 2 3 4 5
A
8,1
16,9
14
,4
10,6
6,2
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
74
4.3.2- Caracterização da defensina recombinante
Uma vez purificada, a defensina recombinante foi submetida ao
sequenciamento N-terminal por degradação de Edman. A comparação da sequência
obtida com sequências de outras proteínas depositadas em bancos de dados
mostrou que a proteína superexpressa é homóloga às defensinas de outras
espécies de plantas (Fig. 17). Além disto, as seqüências da defensina recombinante
e da defensina de sementes de feijão-de-corda são idênticas.
A estrutura tridimensional da defensina recombinante foi modelada utilizando
como molde a estrutura da defensina 2 de Vigna radiata (VrD
2
) previamente
determinada por RMN (código pdb 2gl1A). Na figura 18 está apresentado o modelo
estrutural da defensina recombinante (Fig 18A) e o potencial eletrostático do modelo
criado por homologia (Fig 18B). A figura mostra que a estrutura deste peptídeo é
composta por 3 folhas β (em verde) e 1 α-hélice (em vermelho). Além disso, na
figura pode ser observada a presença de quatro pontes dissulfeto (em amarelo). A
figura 19 apresenta a sobreposição das estruturas da defensina recombinante e da
defensina VrD
2
. A sobreposição mostra que não há diferenças significativas entre as
duas estruturas.
Para avaliar a qualidade estereoquímica do modelo criado para a defensina
recombinante foi calculado, utilizando o programa Procheck, o mapa de
Ramachandran para esta estrutura. Este revelou a boa qualidade estereoquímica do
modelo (Fig. 20), visto que 92,7 % dos resíduos de aminoácidos se encontram em
regiões favoráveis, 7,3 % dos resíduos de aminoácidos se encontram em regiões
permitidas e nenhum dos resíduos se encontra em regiões menos favoráveis. Em
adição, o índice RMSD encontrado para este modelo foi 0,4271 Å.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
75
a
1
M
K
T
C
E
N
L
A
D
T
Y R
G
P
14
b
1
- K
T
C
E
N
L
A
D
T
Y R
G
P
13
c
1
- K
T
C
E
N
L
V
D
T
Y R
G
P
14
d
1
- K
T
C
E
H
L
A
D
T
Y R
G
U
14
e
1
- E
L
C
E
K
A
S
K
T
W
S
G
N
14
f 1
- N
L
C
E
R
A
S
L T
W
T
G
N
14
g
1
- N
T
C
E
N
L
A
G
S
Y K
G
V
14
h
2
- K
L
C
E
R
P
S
G
T
W
S
G
V
14
Figura 17. Alinhamento da sequência N-terminal da defensina recombinante com
sequências de outras defensinas obtidas a partir de pesquisa em banco de dados
(NCBI/BLAST). Resíduos idênticos são mostrados em negrito. Os números que
estão flanqueando a sequência indicam a posição dos aminoácidos. (a) defensina
recombinante; (b) defensina de sementes de feijão-de-corda (Carvalho et al., 2001);
(c) pSAS10, defensina predita de V. unguiculata; (d) Ps1, Psd1 - defensina 1 de
Pisum sativum (gi20139322); (e) Dm, Dm-AMP
1
- proteína antimicrobiana 1 de
Dahlia merckii (gi1049480); (f) Ct, Ct-AMP
1
- proteína antimicrobiana 1 de Clitoria
ternatea (gi1049479); (g) pI230 defensina de rabanete (Terras et al., 1995); (g)
defensina Rs-AFP
1
de Raphanus sativus.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
76
Figura 18. A. Estrutura tridimensional da defensina recombinante modelada com o
programa “Modeller" baseada na estrutura da defensina 2 de Vigna radiata (VrD2)
(código pdb 2gl1A). As folhas β estão representadas em verde e a α-hélice em
vermelho. As pontes dissulfeto estão representadas em amarelo. B. Mapa do
potencial eletrostático do modelo criado sendo representadas, em azul, as cargas
positivas e em vermelho, as cargas negativas.
A
B
N-
terminal
N-
terminal
N-terminal
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
77
Figura 19. Sobreposição das estruturas tridimensionais da defensina recombinante
(em vermelho) e da defensina 2 de Vigna radiata (VrD2) (código pdb2gl1A) (em
cinza). Círculos amarelos mostram as principais diferenças encontradas entre as
estruturas.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
78
Figura 20. Mapa de Ramachandran da estrutura da defensina recombinante. Em
vermelho, estão representadas as regiões favoráveis; em amarelo, as regiões
permitidas; em bege, as regiões menos favoráveis.
Tabela 4 - Mapa estatístico da análise estrutural da defensina recombinante
Defensina
recombinante
Resíduos em regiões favoráveis [Vermelho - A,B,L] 92,7 %
Resíduos em regiões permitidas [Amarelo - a, b, l, p] 7,3 %
Resíduos em regiões menos favoráveis [Bege - ~a, ~b, ~l, ~p] 0,0 %
Psi (graus)
Phi (graus)
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
79
4.4- Inibição da atividade de α-amilases pela defensina de sementes de feijão-
de-corda e seu respectivo homólogo recombinante
A figura 21 mostra o efeito inibitório da defensina de sementes de V.
unguiculata e de seu homólogo recombinante sobre a atividade das α-amilases
presentes nos extratos intestinais dos insetos Callosobruchus maculatus e Zabrotes
subfasciatus. Como pode ser observado na figura 21A a defensina de sementes de
feijão-de-corda inibe totalmente a atividade α-amilásica do extrato intestinal do inseto
C. maculatus na concentração de 30 µg.mL
-1
. Concentrações menores desta
proteína inibem parcialmente esta atividade (Fig. 21A). Em presença de 10 µg.mL
-1
da defensina de sementes de feijão-de-corda há uma inibição de 69 % desta
atividade enzimática, enquanto que apenas 4 % desta atividade é mantida quando a
enzima é incubada com a concentração de 20 µg.mL
-1
deste peptídeo. No entanto, a
atividade α-amilásica do extrato intestinal do inseto Z. subfasciatus só é inibida
totalmente quando incubada com 50 µg.mL
-1
da defensina de feijão-de-corda (Fig
21B). Esta atividade é estimulada nas concentrações de 10 e 20 µg.mL
-1
desta
defensina. As concentrações de 30 e 40 µg.mL
-1
deste peptídeo inibem 64 e 36 %
da atividade α-amilásica do extrato deste inseto, respectivamente (Fig 21B).
A defensina recombinante apresenta atividade inibitória um pouco menor
quando comparada à defensina isolada de sementes. Esta proteína na concentração
de 30 µg.mL
-1
inibe 92 % da atividade α-amilásica do extrato intestinal do inseto C.
maculatus (Fig. 21C). A atividade inibitória de α-amilases da defensina recombinante
sobre as α-amilases intestinais do inseto Z. subfasciatus não foi testada devido a
falta de quantidades suficientes da mesma para a realização dos ensaios.
A defensina de sementes de V. unguiculata e seu homólogo recombinante
não inibem a atividade α-amilásica da saliva humana. Ao contrário disto, o que se
observa é que, na presença destas defensinas, esta atividade parece ser um pouco
estimulada (Fig. 22).
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
80
Figura 21. Efeito da defensina de sementes de feijão-de-corda (A e B) e da
defensina recombinante (C) sobre a atividade α-amilásica de extratos intestinais dos
insetos Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus.
A
Callosobruchus maculatus
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50
Concentração de defensina
Atividade de alfa-amilase (%)
B
Zabrotes subfasciatus
0
50
100
150
200
250
300
350
0 10 20 30 40 50
Concentração de defensina
Atividade de alfa-amilase (%)
C
Callosobruchus maculatus
0
20
40
60
80
100
120
0 30
Concentração de defensina
Atividade de alfa-amilase (%)
Defensina nativa (µg.mL
-
1
)
Defensina nativa (µg.mL
-
1
)
Defensina
recombinante
(µg.mL
-
1
)
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
81
Figura 22. Efeito da defensina de sementes de feijão-de-corda (A) e da defensina
recombinante (B) sobre a atividade α-amilásica da saliva humana.
A
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 30 50 100
Concentração de defensina
Atividade de alfa-amilase (%)
B
0
20
40
60
80
100
120
0 30
Concentração de defensina
Atividade de alfa-amilase (%)
Defensina nativa (µg.mL
-
1
)
Defensina
recombinante
(µg.mL
-
1
)
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
82
Parte II: Purificação, clonagem molecular e atividade antimicrobiana de uma
defensina de sementes de feijão comum
4.1- Purificação da defensina de sementes de feijão comum
A purificação da defensina de sementes de feijão comum foi obtida, conforme
descrita por Games et al. (2008), através de uma única etapa cromatográfica.
Submetida à cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose, a fração
F-0/70 obtida após fracionamento com sulfato de amônio (0-70 % de saturação) foi
fracionada em dois picos: um pico não retido, eluído com o tampão de equilíbrio da
coluna (D1), e um pico retido eluído com de NaCl 1 M (D2) (Figura 23 A). A fração
D1 é composta apenas pela defensina de sementes de feijão comum. Esta
purificação foi confirmada através de cromatografia de fase reversa em coluna
C2/C18 em HPLC (Fig. 23B)
A figura 23C mostra o perfil eletroforético das frações obtidas durante o
processo de purificação da defensina de sementes de feijão comum. Na fração F-
0/70, assim como na fração D2 são observadas a presença de diferentes bandas
protéicas. No entanto, a fração D1, bem como o pico H1 são compostos por um
única banda protéica de massa molecular de aproximadamente 6 kDa.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
83
Figura 23. Purificação da defensina de sementes de feijão comum. (A)
Cromatograma da fração F/0-70 de sementes de feijão comum em coluna de troca
iônica em resina de DEAE-Sepharose. (B) Cromatograma de fase reversa da fração
D1 em coluna C2/C18 em HPLC. (C) Visualização eletroforética em gel de tricina na
presença de SDS das frações obtidas durante a purificação da defensina de
sementes de feijão comum: (F) fração F-0/70 oriunda do fracionamento com sulfato
de amônio (0-70 % de saturação); (D1) fração não retida oriunda da cromatografia
de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose; (D2) fração retida oriunda da
cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose; (H1) defensina
purificada em cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18. (M) marcador de
massa molecular (kDa).
NaCl
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 10 20 30 40 50 60 70
Frações
ABS (280 nm)
D1
D2
A
Tempo
A
H1
B
kDa
M
F
D1
D2
PvD1
16.9
14.4
10.6
8.1
6.2
M F D1 D2 H1
B
C
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
84
4.2- Clonagem molecular, seqüenciamento e caracterização do cDNA de uma
defensina de sementes de feijão comum
4.2.1- Clonagem molecular de uma defensina de sementes de feijão comum em E.
coli
Uma vez extraído o RNA total das sementes de feijão comum, este foi
submetido à eletroforese em gel de agarose 0,8 % com o objetivo de verificar sua a
qualidade e integridade. Na Figura 24, pode ser observado o perfil eletroforético do
RNA extraído. Verifica-se que foi obtido um RNA (bandas de menor massa
visualizadas no gel) de boa qualidade (livre de contaminação) e integridade. A
banda de mais alta massa molecular presente no gel corresponde ao DNA
genômico que, freqüentemente, é extraído junto com o RNA.
A partir do RNA total extraído, foi isolado o RNA poli-adenilado que foi
utilizado para a reação de transcrição reversa e obtenção do cDNA. Este cDNA
serviu então como molde para a amplificação do fragmento de DNA que codificava
para a defensina de sementes de feijão comum. Reações de PCR utilizando
diferentes temperaturas e concentrações de cloreto de magnésio e cDNA foram
montadas na tentativa de serem obtidas as condições ideais para essa amplificação.
Após testar diferentes condições de amplificação, chegou-se enfim à melhor
condição para a amplificação do fragmento alvo: 1 mM de cloreto de magnésio, 0,03
µL de cDNA e a temperatura de anelamento de 44,4 °C. A figura 25 mostra o perfil
eletroforético da amostra obtida a partir da reação de PCR utilizando o iniciador
DEFdeg sob estas condições. Como pode ser observado na figura, houve a
amplificação de um único fragmento de tamanho em torno de 300 pb.
Após padronização da condição de amplificação, a reação de PCR foi
repetida em maior escala e o fragmento dela oriundo foi ligado ao vetor pTZ57R/T.
A construção de DNA resultante desta ligação foi então utilizada para a
transformação de células da bactéria E. coli (linhagem DH5α). A transformação das
células bacterianas foi confirmada através de extração e digestão dos vetores. Após
a digestão com as enzimas de restrição EcoR I e BamH I, um fragmento de
tamanho entre 300 e 400 pb correspondente ao fragmento amplificado com o
iniciador DEFdeg foi liberado (Fig. 26), revelando a clonagem do fragmento de
interesse. Torna-se válido ressaltar que os fragmentos amplificados possuem uma
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
85
pequena variação de tamanho que é decorrente do tamanho da cauda poli-A
apresentada pelos mesmos.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
86
Figura 24. Visualização eletroforética em gel de agarose (0,8 %) do RNA total
extraído de sementes de feijão comum. Extração com cloreto de lítio (LiCl) a partir
de sementes secas. Extração feita em 5 réplicas. Figura negativa do gel corado com
brometo de etídeo.
25
S rRNA
18S rRNA
5S rRNA
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
87
Figura 25. Visualização eletroforética em gel de agarose (1%) do produto da reação
de PCR utilizando o iniciador DEFdeg. (M), padrão de peso molecular (em pb); Gel
corado com brometo de etídeo. Figura negativa do gel corado com brometo de
etídeo.
12000
5000
1650
1000
400
300
200
100
M
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
88
Figura 26. Visualização eletroforética de produtos da digestão do vetor pTZ57R/T
(ligado ao cDNA amplificado utilizando o iniciador DEFdeg) extraído de células
bacterianas da linhagem DH5α com as enzimas de restrição EcoR I e BamH I, em
gel de agarose 1 %. (1) vetor extraído da colônia 1 não digerido com as enzimas
EcoR I e BamH I; (2 a 4) vetores extraídos das colônias 1 a 3 que após a digestão
com as enzimas EcoR I e BamH I liberaram um fragmento de 300 pb (indicado pela
seta). (M) padrão de massa molecular em pb. Figura negativa do gel corado com
brometo de etídeo.
1000
400
300
200
100
M 1 2 3 4
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
89
4.2.2- Sequenciamento e caracterização do cDNA de uma defensina de sementes
de feijão comum
O sequenciamento do fragmento (clonado no vetor pTZ57R/T) revelou que
este é composto por 314 bp (Fig. 27) os quais codificam um peptídeo de 47
aminoácidos que possui teoricamente pI em torno de 8,2 e massa molecular em
torno de 5.448,11 Da.
O alinhamento da sequência do peptídeo predito a partir da seqüência de
nucleotídeos com sequências protéicas depositadas em bancos de dados mostrou
que realmente se trata de um peptídeo homólogo às defensinas de plantas. O
peptídeo apresenta 87% de similaridade com a defensina de Pachyrhizus erosus,
93% de similaridade com a defensina de V. unguiculata, 95% de similaridade com a
defensina de Cicer arietinum (95%), dentre outras (Fig. 28). Na figura 28, é possível
ainda observar que na seqüência da defensina predita estão presentes os 8
resíduos de cisteína altamente conservados nas defensinas de plantas e, além
delas, os resíduos conservados Tyr11 e Gly13.
Para investigar a relação filogenética entre a defensina de feijão comum e
outras defensinas de plantas, uma árvore filogenética foi construída com base na
sequência predita de aminoácidos do peptídeo e seqüências de defensinas de
diferentes espécies de plantas obtidas a partir de pesquisa em banco de dados
(Swissprot) (Fig. 29). Como pode ser observado na figura, a árvore filogenética está
organizada, de maneira geral, por famílias. A defensina recombinante de feijão
comum encontra-se agrupada próxima às defensinas de espécies da família
Fabaceae como V. unguiculata, Pachyrhizus erosus, Cicer arietinum e Pisum
sativum, indicando a relação entre as defensinas desta família (a defensina
recombinante de feijão comum encontra-se sublinhada na figura). Por sua vez,
defensinas de Arabidopsis thaliana e Wasabia japonica, membros da família
Brassicaceae, também encontram-se agrupadas. Ainda, as defensinas pertencentes
à famíla Poacea como Sorghum bicolor e Hordeum vulgare, formam um ramo da
árvore, assim como as defensinas das espécies da família Solanaceae, Capsicum
annuum e Solanum chacoense. Além destas, a defensina de Ginkgo biloba está
arranjada com a defensina de Picea abies, duas espécies de Gimnospermas.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
90
AAGACGTGCGAGAACCTGGCTGATACATACAAGGGTCCATGCTTCACCACTGGCAGCTGC
K T C E N L A D T Y K G P C F T T G S C
GATGATCACTGCAAGAACAAAGAACACTTGAGGAGTGGCAGGTGCAGGGATGATTTCCGC
D D H C K N K E H L R S G R C R D D F R
TGTTGGTGCACCAAAAACTGTTAAGTGGATTCAGGACTTTTTATAAATAAAACAACTATT
C W C T K N C -
ATATATATGGAATAAGACTAGCACTGCATCCACGAACTATATGTATAGTCTGTGGCTGTG
CAGAACAGCTGAGTTATGTATTTACTTTATGAATAAAGTTCTTCTGTTGTAATAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAA
Figura 27. Seqüência de nucleotídeos do cDNA amplificado por RT-PCR usando o
iniciador desenhado a partir da seqüência de defensina de feijão comum e clonado
no pTZ57R/T. O cDNA apresenta 314 bp e a seqüência deduzida de aminoácidos
codifica um peptídeo de 47 resíduos de aminoácidos como é mostrado abaixo da
seqüência de nucleotídeo. O códon de parada (TAA) é mostrado em negrito. A
seqüência utilizada para o desenho do iniciador está representada em cinza.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
91
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
92
Figure 28. Comparação da seqüência deduzida de aminoácidos da defensina de
feijão comum com seqüências de defensinas de diferentes espécies de plantas
obtidas em banco de dados (NCBI/BLAST). Os números flanqueando a seqüência
indicam a posição dos aminoácidos baseando-se na seqüência da defensina Rs-
AFP
1
,
de Raphanus sativus. Resíduos idênticos são mostrados na parte inferior da
figura e resíduos positivos (que possuem características físico-químicas em comum)
são mostrados em preto. Na figura é mostrada a porcentagem dos resíduos idênticos
(I) e positivos (P). As linhas presentes na parte inferior da figura indicam elementos
de estrutura secundária da defensina de R. sativus, linhas simples indicam folhas β e
linhas duplas α-hélices, de acordo com Fant et alli (1998). Espaços (-) foram
inseridos para um melhor alinhamento. O nome da espécie da planta e o número de
acesso ao banco de dados para cada proteína (ou artigo base) são mostrados a
seguir: PVD1 – peptídeo predito do clone pTZ57R/T-DEF; VUDEF - peptídeo predito
do clone pCR2.1-DEF de Vigna unguiculata (Carvalho et al., 2006); Psas10
(gi112671) - clone PSAS10 de V. unguiculata; SPE10 (gi50659050) – defensina de
Pachyrhizus erosus; Psd1 (gi20139322) - defensina 1 de Pisum sativum; Psd2
(gi20139323) – defensina 2 de P. sativum; defensina de Capsicum annuum
(gi40794499); defensina de Prunus persica (gi28624546); PDF2.3 (gi15226878) -
defensina de Arabidopsis thaliana; defensina de Helianthus annuus (gi8099184);
defensina de Solanum tuberosum (gi129350); defensina de Picea glauca
(gi40362748); defensina de Ginkgo biloba (gi5149374331); defensina de Triticum
aestivum (gi22324363); SIα2 (gi134486) – inibidor de α-amilase 2 de Sorghum
bicolor; SIα3 (gi1173437) – inibidor de α-amilase 3 de S. bicolor; hordotionina de
Hordeum vulgare Gamma (gi135793); defensina de Beta vulgaris (gi1839272); Ah-
AMP
1
(gi1049478) – proteína antifúngica 1 de Aesculus hippocastanum; Ct-AMP
1
(gi1049479) - proteína antimicrobiana 1 de Clitoria ternatea; Dm-AMP
1
(gi1049480) -
proteína antimicrobiana 1 de Dahlia merckii; Rs-AFP
1
(gi2914400) - proteína
antifúngica 1 de R. sativus; defensina de Wasabia japonica (gi11691894); Hs-AFP
1
(gi1049482) - proteína antifúngica 1 de Heuchera sanguinea.
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
93
Figura 29. Árvore filogenética sem raiz das defensinas de plantas. O nome da
espécie e o número de acesso ao banco de dados para cada proteína (ou artigo
base) são mostrados a seguir: PVDEF1, peptídeo deduzido de feijão comum; Vu,
peptídeo predito do clone pCR2.1-DEF de Vigna unguiculata (Carvalho et al., 2006);
Pe, SPE10 – defensina de Pachyrhizus erosus (gi50659050); Ca, defensina de Cicer
arietinum (Q6XW14); Ps1, Psd1 - defensina 1 de Pisum sativum (gi20139322); Ps2,
Psd2 – defensina 2 de P. sativum (gi20139323); Ah, Ah-AMP
1
– proteína antifúngica
1 de Aesculus hippocastanum (gi1049478); Ct, Ct-AMP
1
- proteína antimicrobiana 1
de Clitoria ternatea (gi1049479); Dm, Dm-AMP
1
- proteína antimicrobiana 1 de Dahlia
merckii (gi1049480); At1, AFP1- proteína antifúngica rica em cisteína 1 de
Arabidopsis thaliana (P30224); At2, AFP3- provável proteína antifúngica rica em
cisteína 2 de A. thaliana (O80994); Wj, defensina de Wasabia japonica (gi11691894);
Hs, Hs-AFP1- Proteína antifúngica 1 de Heuchera sanguinea (gi1049482); BV,
PVDEF1
Vu
Ca
Pe
Ps1
Ps2
Ah
Ct
Dm
At1
At2
Wj
Hs
Bv
Sb1
Sb2
Hv
Pa
Gb
Tm
Tk
St
Os
At3
Ha
Pp
Na
Ta
Gm
Sc
Can
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
94
defensina de Beta vulgaris (gi1839272); Sb1, SIα2- inibidor de α-amilase 2 de
Sorghum bicolor (gi134486); Sb2, SIα3- inibidor de α-amilase 3 de S. bicolor
(gi1173437); Hv, Gama hordotionina de Hordeum vulgare (gi135793); Pa, defensina
de Picea abies (gi:1360108); Gb, defensina de Gingko biloba (gi5149374331); Ta,
defensina de Triticum aestivum (gi22324363); Tm, Tm-AMP, defensina de T.
monococcum (P84964); Tk, Tk-AMP- defensina de T. kiharae (P84965); Gm, SRP-
SOYBN, precursor de uma proteína rica em enxofre de 8,4 kDa (Protein SE60) de
Glycine max (Q07502); St, defensina de Solanum tuberosum (gi129350); Os,
defensina de Oryza sativa (Q7F8K7); Can, defensina de Capsicum annuum
(gi40794499); Sc, Gama hordotionina/defensina de S. chacoense (gi170773916);
At3, PDF2.3, defensina de A. thaliana (gi15226878); Ha, SD2- defensina de
Helianthus annuus (gi8099184); Pp, defensina de Prunus persica (gi28624546); Na,
defensina de Nicotiana attenuata (gi42374733).
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
95
4.3. Análise da atividade antifúngica da defensina de sementes de feijão
comum
O efeito inibitório da defensina de sementes de feijão comum sobre o
desenvolvimento de leveduras foi testado através da avaliação do seu crescimento
em meio contendo diferentes concentrações desta defensina. Como pode ser
observado na figura 30, o desenvolvimento das leveduras Candida albicans, C.
parapsilosis, C. guilliermondii e Kluyveromyces marxiannus foi inibido na presença
do peptídeo em todas as concentrações testadas. No caso de C. albicans, o valor de
IC
50
corresponde a concentrações menores que 50 µg.mL
-1
(Fig. 30A). Através do
ensaio de inibição do crescimento celular em meio líquido, não foi possível observar
a inibição do desenvolvimento da levedura patogênica C. tropicalis. Uma acentuada
redução do crescimento da levedura S. cerevisiae foi observada apenas na
presença da defensina de sementes de feijão comum na concentração de 100
µg.mL
-1
(Fig. 30F).
Através de microscopia eletrônica de varredura, foi possível verificar as
alterações morfológicas causadas pela presença da defensina de sementes de feijão
comum no meio de crescimento das leveduras C. albicans, C. parapsilosis, C.
tropicalis e S. cerevisiae. (Fig. 31A-I). De um modo geral, as amostras observadas
apresentam uma notável redução do número de células na cultura (todas as
espécies analisadas) e/ou diferenças no que diz respeito ao formato e à topografia
celular (S. cerevisiae). Nas culturas de C. albicans (Fig. 31A e B) e C. tropicalis (Fig.
31E e F) tratadas com esta defensina é possível visualizar uma aglomeração celular
sugerindo que a presença desta proteína no meio de cultura perturba o processo de
formação e liberação dos brotos. A topografia celular encontrada para S. cerevisiae
também é característica deste efeito (Fig. 31G, H e I).
A habilidade da defensina de sementes de feijão comum de permeabilizar a
membrana plasmática de células de levedura também foi avaliada através de ensaio
de captação do corante fluorescente SYTOX Green. Este corante possui alta
afinidade por ácidos nucléicos e penetra em células apenas quando sua membrana
está comprometida. Células de S. cerevisiae incubadas por 30 min com 100 µg.mL
-1
da defensina de sementes de feijão comum e, posteriormente, incubadas por 1 h
com esse corante apresentaram uma forte fluorescência quando observadas no
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
96
microscópio de fluorescência (Fig. 32 F). O mesmo aconteceu com as células mortas
por calor utilizadas como controle positivo (Fig. 32 D).
A análise da ultra-estrutura de células das leveduras C. albicans e C.
guilliermondii tratadas com a defensina de sementes de feijão comum através de
microscopia eletrônica de transmissão revelou que esta defensina causou uma
grande alteração na organização do conteúdo intracelular, além de causar uma
desorganização da membrana celular (Fig. 33).
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
97
Figura 30. Efeito da defensina de feijão comum no crescimento de leveduras. ()
Controle; () 25 µg.mL
-1
; () 50 µg.mL
-1
; () 100 µg.mL
-1
da defensina de
sementes de feijão comum. Barras de erro foram omitidas para melhor visualização
da figura.
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Time, h
Absorbance, 660 nm
Absorbância, 660 nm
Tempo, h
A
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Time, h
Absorbance, 660 nm
B
Absorbância, 660 nm
Tempo, h
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Time, h
Absorbance, 660 nm
Tempo, h
D
Absorbância, 660 nm
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Time, h
Absorbance, 660 nm
Absorbância, 660 nm
C
Tempo, h
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 6 12 18 24 30 36
Time, h
Absorbance, 660 nm
F
Absorbância, 660 nm
Tempo, h
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 6 12 18 24 30 36
Time, h
Absorbance, 660 nm
Absorbância, 660 nm
Tempo, h
E
C
.
albicans
K. maxiannus
C. guilliermondii
C. parapsilosis
C
.
tropicallis
S.
cerevisiae
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
98
Figura 31. Microscopia eletrônica de varredura de células de leveduras crescidas na
presença da defensina de feijão comum. (A, C, E and G) controles, ausência da
defensina; (B, D, F, H, I) presença da defensina (100 µg.mL
-1
). Candida albicans (A
e B), C. parapsilosis (C e D), C. tropicalis (E e F), e Saccharomyces cerevisiae (G, H
e I). A, B, C, D, E, F, H Barra =25 µm; G, I Barra = 5 µm.
A
B
C
D
E F
G
H
I
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
99
Figura 32. Microscopia de fluorescência de células da Saccharomyces cerevisiae
incubadas com o corante SYTOX Green após tratamento com a defensina de
sementes de feijão comum (100 µg.mL
-1
). (A, B) controle, células não tratadas com a
defensina; (C, D) controle positivo, células mortas por calor; (E, F) células tratadas
com a defensina. (A, C, E) células visualizadas por microscopia ótica de campo
claro; (B, D, F) células visualizadas por microscopia de fluorescência. Aumento de
400x.
F
A
C
E
B
D
F
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
100
Figura 33. Microscopia eletrônica de transmissão das células de levedura Candida
albicans (A, B, D, E) e C. guilliermondii (C, F). A, D – controle; B, C, E, F - células
tratadas com a defensina (100 µg.mL
-1
). A, Barra = 0,4 µm; B,C,E,F Barra = 0,25 µm;
D, Barra = 0,65 µm. () Alteração na organização do conteúdo intracelular. ()
Desorganização da membrana plasmática das células.
A
B
C
D
E
F
Resultados________________________________________________________________
Santos, I. S.
101
4.4- Inibição da atividade de α-amilases pela defensina de sementes de feijão
comum
A atividade inibitória de α-amilases pela defensina de feijão comum também
foi avaliada. Os ensaios revelaram que esta defensina não inibe a atividade de α-
amilases dos insetos Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus. Este
peptídeo também não inibe a atividade α-amilásica da saliva humana.
____________________
DISCUSSÃO
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 102
5. Discussão
Parte I: Purificação, expressão heteróloga e atividade inibitória de α-amilase por
uma defensina de sementes de feijão-de-corda
As sementes, por serem órgãos ricos em nutrientes, se tornam um atrativo para
um vasto número de organismos heterotróficos. Sendo assim, ao longo de sua
evolução, as plantas depositaram nas sementes diferentes compostos que as permitem
se defender do ataque de predadores. Dentre estes compostos, estão diferentes
proteínas e peptídeos de defesa (Gomes e Xavier-Filho, 1994; Agizzio et al., 2003; Diz
et al., 2006; Ribeiro et al., 2007; Vasconcelos et al., 2008). Em 2001, Carvalho et al.
relataram a presença de uma defensina com atividade antimicrobiana em sementes de
feijão-de-corda. Posteriormente, em 2006, este mesmo grupo fez a clonagem molecular
e a caracterização do cDNA que codifica para esta defensina, além de analisar sua
expressão em plantas de feijão-de-corda sob diferentes estresses. Neste trabalho, é
apresentada a purificação e a expressão heteróloga deste peptídeo e é revelada sua
atividade inibitória contra α-amilases.
A purificação da defensina natural foi feita basicamente por métodos
cromatográficos, segundo metodologia descrita por Carvalho et alli (2001). Inicialmente,
cromatografias de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose e exclusão molecular em
coluna de Sephadex G-50 foram utilizadas, sendo a defensina finalmente purificada
após cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 (Fig. 07), como pode ser
observado na figura 8. Este resultado está de acordo com os resultados obtidos por
Carvalho et alli (2001) bem como de outros autores encontrados na literatura, nos quais
defensinas de plantas, especialmente de sementes, foram purificadas seguindo os
procedimentos cromatográficos acima descritos (Terras et al., 1993; Terras et al., 1995;
Osborn et al., 1995; Finkina et al., 2008).
A superexpressão de uma proteína de origem eucariótica em um sistema
procariótico é uma tarefa que requer cuidados e estratégias específicas. Vários
problemas podem ser encontrados ao realizar tal procedimento. Dentre estes, a
proteína pode ser incorretamente enovelada (pode não haver a formação de suas
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 103
pontes dissulfeto) ou nem chegar a ser produzida por causa do fenômeno de uso
preferencial de códon (LaVallie et al., 2003; Elmorjani et al., 2004).
Algumas vezes acontece também de a proteína ser expressa, mas não
superexpressa. Chen et al., em 2002, relataram que a superexpressão de uma
defensina de Vigna radiata em Escherichia coli não foi satisfatória devido à baixa
quantidade de proteína recombinante produzida, tendo a mesma sido alcançada
posteriormente com êxito em um sistema de expressão eucarioto, a levedura Pichia
pastoris (Chen et al., 2004).
De forma semelhante, o homólogo recombinante da defensina de sementes de
feijão-de-corda foi, inicialmente, expresso em células da bactéria E. coli da cepa BL21
(DE3) pLysS, porém a superexpresão não foi obtida de forma satisfatória, pois apesar
de o peptídeo estar sendo expresso, pouca quantidade do mesmo era recuperado após
o processo de purificação. No trabalho aqui apresentado, no entanto, com a simples
substituição da cepa bacteriana BL21 (DE3) pLysS pela cepa Rosetta-gami 2 (DE
3
)
pLysS, obteve-se a superexpressão do homólogo recombinante da defensina de
sementes de feijão-de-corda com sucesso.
Após indução com 0,4 mM de IPTG, a bactéria transformada com o vetor pET-
DEF expressou uma proteína fusionada de aproximadamente 26 kDa que é composta
pela tioredoxina ligada à cauda de histidina (20,4 kDa) e pela defensina recombinante
madura de 5,170 kDa (Fig. 14). Resultados semelhantes foram obtidos por Kristensen
et alli (1999) e por Lin et alli (2007), os quais mostraram, respectivamente, a
superexpressão das defensinas AX2, de folhas de beterraba, e VrD2, de sementes de
Vigna radiata. A fusão da tioredoxina à proteínas que estão sendo superexpressas
auxilia na formação das pontes dissulfeto presentes nas estruturas das mesmas,
garantindo a solubilidade destas moléculas (LaVallie et al., 2003; Elmorjani et al., 2004).
Além disso, Elmorjani et alli (2004) mostraram que o acoplamento desta proteína à
molécula alvo aumenta significativamente o rendimento específico da produção de
proteína recombinante quando comparada a outras metodologias.
O acoplamento da proteína recombinante à cauda de histidina é uma estratégia
muito utilizada quando se deseja obter uma proteína recombinante purificada. Esta
estrutura permite a purificação da proteína superexpressa através da utilização de
cromatografias de afinidade a íons metálicos imobilizados (IMACs) que vêm
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 104
rotineiramente sendo empregadas para a purificação de proteínas fusionadas à cauda
de histidina (Elmorjani et al., 2004; Lin et al., 2007; Huang et al., 2008; Vijayan et al.,
2008). Alguns autores relatam que o uso exclusivo de uma destas IMACs é suficiente
para a purificação da proteína recombinante, como por exemplo, podemos citar os
resultados apresentados por Lin et alli, em 2007, que apresentaram a purificação do
homólogo recombinante de uma defensina de sementes de V. radiata (fusionada à
cauda de histidina) através de um único passo cromatográfico, uma cromatografia de
afinidade ao íon cobalto. Outros autores, porém, têm relatado que nem sempre o uso
exclusivo de uma IMAC é suficiente para purificar a proteína recombinante, sendo
necessárias outras etapas cromatográficas para se obtê-la (Elmorjani et al., 2004;
Vijayan et al., 2008). No trabalho aqui apresentado, o uso de apenas cromatografia de
afinidade ao íon níquel não foi suficiente para a purificação do peptídeo recombinante,
sendo uma cromatografia de fase reversa também utilizada para a purificação do
mesmo. Inicialmente, a proteína fusionada superexpressa em células bacterianas da
linhagem Rosetta-gami 2 (DE
3
) pLysS foi submetida à etapas alternadas de
cromatografia de afinidade em resina Ni Sepharose e clivagem com enteroquinase
(para remoção da tioredoxina ligada à cauda de histidina). Posteriormente, a defensina
recombinante foi finalmente purificada através de cromatografia de fase reversa em
coluna C2/C18 (Fig. 15). A figura 16B (linha 1) mostra o perfil eletroforético da proteína
recombinante purificada. Como pode ser observada nesta figura, a defensina
recombinante apresenta a mesma massa molecular da defensina isolada a partir das
sementes de feijão-de-corda.
A fim de se comprovar que o peptídeo expresso estava no quadro correto de
leitura e que não aconteceram clivagens internas pela enteroquinase, este foi
submetido ao seqüenciamento N-terminal por degradação de Edman. A seqüência
assim obtida mostrou que, além do peptídeo estar no quadro correto de leitura e não ter
sofrido clivagens internas pela enteroquinase, realmente era homólogo à defensina
nativa de feijão-de-corda. O alinhamento da sequência N-terminal do peptídeo
recombinante com a seqüência da defensina natural (Carvalho et al., 2001) e com
seqüências de outras defensinas isoladas de plantas depositadas em banco de dados
(Singh e Singh, 1985; Tchang et al., 1988; Duvick et al., 1992; Terras et al., 1995; Silva-
Conceição e Brokaert, 1999) mostrou um alto grau de similaridade entre elas (Fig. 17).
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 105
A defensina de sementes de feijão-de-corda e seu homólogo recombinante possuem a
mesma seqüência de aminoácidos. Torna-se válido ressaltar que a defensina
recombinante possuí como primeiro aminoácido uma metionina que não está presente
na seqüência da proteína natural madura, mas que é conseqüência da expressão de
proteínas no vetor pET-32 EK-LIC. Todas as proteínas clonadas neste vetor são
expressas com esta metionina inicial. Isto acontece porque os iniciadores que são
desenhados para a amplificação do cDNA a ser clonado neste vetor possuem uma
parte de sua seqüência pré-determinada (prescrita no manual do kit do vetor). Esta
seqüência ocorre na região ‘upstream’ à seqüência que codifica para a proteína a ser
clonada, e no final dela está inserida a seqüência de nucleotídeos (códon) que codifica
para a metionina. Neste trabalho, não foi feita a retirada deste aminoácido a fim de se
evitar que o processo de retirada do mesmo alterasse a conformação estrutural e assim
atividade biológica do peptídeo recombinante.
As semelhanças entre as defensinas de plantas vão além de suas estruturas
primárias. De um modo geral, estas moléculas apresentam estruturas secundárias
bastante similares. Esta estrutura é basicamente composta por três folhas β
antiparalelas e uma α-hélice, além de quatro pontes dissulfeto (Fant et al., 1998;
Almeida et al., 2002). Recentemente, Lin et alli (2007) determinaram por RMN a
estrutura da defensina 2 de V.radiata (VrD2), a qual apresentou 93 % de identidade
com a defensina de sementes de feijão-de-corda. A modelagem da estrutura da
defensina recombinante foi feita usando a defensina VrD2 como molde devido à alta
similaridade de estrutura primária apresentada entre estas moléculas. Esta modelagem
mostrou que a defensina recombinante de sementes de feijão-de-corda é constituída de
três folhas β antiparalelas e uma α-hélice e que esta estrutura é estabilizada por quatros
pontes dissulfeto (Fig. 18A). A sobreposição das estruturas de VrD2 e da defensina
recombinante mostra o quão similares são estas duas moléculas, corroborando com a
escolha de VrD2 como molde (Fig. 19). A qualidade estereoquímica do modelo criado
foi avaliada através do mapa de Ramachandran. Este revelou a boa qualidade do
modelo (Fig. 20), visto que 92,7 % dos resíduos de aminoácidos se encontram em
regiões mais favoráveis, 7,3 % dos resíduos de aminoácidos se encontram em regiões
permitidas e nenhum dos resíduos se encontra em regiões menos favoráveis.
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 106
Muitas atividades têm sido descritas in vitro para as defensinas de plantas,
dentre elas a atividade inibitória de α-amilases (Bloch e Richardson, 1991; Zhang et al.,
1997; Liu et al., 2006). Defensinas com atividade inibitória sobre α-amilases já foram
descritas em diferentes espécies, incluindo V. radiata (Chen et al., 2004), Sorghum
bicolor (Bloch e Richardson, 1991) e Hordeum vulgare (Méndez, 1990). No presente
trabalho, é mostrado que a defensina natural de sementes de feijão-de-corda, cultivar
EPACE 10, também é capaz de inibir a atividade de α-amilases in vitro. Esta defensina
inibe totalmente a atividade α-amilásica de extratos intestinais dos insetos
Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus nas concentrações de 30 µg.mL
-1
e
50 µg.mL
-1
, respectivamente (Fig. 21A e B, respectivamente). Curiosamente, nas
concentrações de 10 e 20 µg.mL
-1
, esta defensina estimula a atividade α-amilásica do
extrato intestinal do inseto Z. subfasciatus (Fig. 21B). Isto possivelmente está ocorrendo
devido à ativação, por este peptídeo, de algum sítio alostérico presente na estrutura das
α-amilases presentes neste extrato, porém estudos posteriores se fazem necessários
para melhor entendimento deste fenômeno.
Recentemente, a expressão funcional de uma defensina de sementes de Vigna
unguiculata foi relatada por Pellegrini et alli (2008). Nesta ocasião, eles mostraram a
atividade inibitória de α-amilases da defensina recombinante sobre as α-amilases de
Acanthoscelides obtectus e Z. subfasciatus, bruquídeos que causam perdas
significativas em lavouras de feijão comum. Eles também relataram que esta defensina
não possuía efeito inibitório sobre a α-amilase de C. maculatus nem sobre a amilase do
fungo patogênico Aspergillus fumigatus e que apresentava uma baixa atividade contra
α-amilases de mamíferos (pancreática de porco e salivar humana). Neste trabalho, no
entanto, foi mostrado que o homólogo recombinante da defensina de sementes de
feijão-de-corda, assim como a proteína natural, possui atividade inibitória sobre a
atividade da α-amilases de C. maculatus. Na concentração de 30 µg.mL
-1
a defensina
recombinante inibiu 92 % da atividade da enzima deste inseto (Fig. 21C). Outro dado
importante é que tanto a defensina natural quanto seu homólogo recombinante não tem
efeito sobre a atividade α-amilásica da saliva humana (Fig. 22).
Como pode ser observado, nas figuras 21A e C, a defensina recombinante
possui atividade um pouco reduzida quando comparada à defensina natural. Kristensen
et alli, em 1999, também relataram que o homólogo recombinante da defensina AX2 de
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 107
folhas de beterraba possuía atividade biológica ligeiramente menor quando comparada
à proteína natural e sugeriram que esta redução na atividade biológica poderia ser
devido à presença de um aminoácido adicional (uma arginina) na região N-terminal da
proteína recombinante (conseqüência da expressão no vetor “T-vector pT7Blue”). O
homólogo recombinante da defensina de sementes de feijão-de-corda também possuí
uma aminoácido adicional em sua região N-terminal, o que pode estar motivando esta
redução em sua atividade biológica. Corroborando com este dados, em 2008, Pellegrini
et alli mostraram que a defensina de feijão-de-corda, VuD1, utiliza resíduos tanto de
sua porção N-terminal quando da porção C-terminal para bloquear o sítio ativo da α-
amilase do inseto Z. subfasciatus. Assim sendo, a partir dos dados acima mencionados,
podemos sugerir que a redução da atividade da defensina recombinante pode estar
associada ao fato desta defensina apresentar um aminoácido (metionina) a mais na
região N-terminal, que segundo dados de Pellegrini et alli (2008) é uma possível região
de ligação entre as defensinas e as α-amilases.
Parte II: Purificação, clonagem molecular e atividade antimicrobiana de uma
defensina de sementes de feijão comum
Nos últimos anos, diferentes proteínas com atividade antimicrobiana e/ou
inseticida têm sido isoladas em espécies do gênero Phaseolus, principalmente a partir
de sementes (Carlini e Grossi-de-Sá, 2002; Wang et al., 2004; Dayler et al., 2005; Wang
et al., 2008; Lin et al., 2009). No ano de 2006, a aluna Patrícia Dias Games apresentou,
em seu trabalho de conclusão de curso, o isolamento e a caracterização de uma
defensina de sementes de feijão comum, cultivar Pérola. Nesta parte do trabalho, é
apresentada a clonagem molecular deste peptídeo e o sequenciamento do cDNA
clonado, além do efeito da defensina isolada da semente sobre o crescimento de
leveduras.
De um modo geral, as defensinas de plantas são proteínas básicas que
apresentam massa molecular em torno de 5 kDa, sendo constituídas de 45 a 55
resíduos de aminoácidos (Carvalho e Gomes, 2009). Dentre estes, alguns resíduos são
altamente conservados os quais incluem uma Ser
8
, um resíduo aromático na posição
11, uma Gly
13
, um Glu
29
e uma Gly
34
(numeração baseada na defensina Rs-AFP
2
), além
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 108
de 8 cisteínas altamente conservadas. Esses resíduos de cisteína estão ligados entre si
formando quatro pontes dissulfeto as quais são importantes para a estabilização do
enovelamento global do peptídeo. Duas dessas pontes, formadas entre as Cys
21
e
Cys
25
da região em α-hélice com as Cys
45
e Cys
47
da última folha β, compreendem o
arranjo estrutural denominado de motivo αβ estabilizado por Cys, que está presente em
todas as estruturas de defensinas de plantas descritas até o momento (Fant et al.,
1998; Almeida et al., 2002; Carvalho e Gomes, 2009). A clonagem molecular da
defensina de sementes de feijão comum foi feita segundo metodologia descrita por
Sambrook e Russel (2001). O sequenciamento do fragmento (clonado no vetor
pTZ57R/T) revelou que este é composto por 314 bp os quais codificam um peptídeo de
47 aminoácidos (Fig. 27). A seqüência deste fragmento de DNA não possui o códon de
iniciação AUG, que é coerente com o fato de o mesmo ter sido amplificado utilizando
um iniciador específico para a proteína madura, ou seja, sem o peptídeo sinal. Na
seqüência do fragmento de DNA que codifica para a defensina de sementes feijão
comum é notável a presença de 8 cisteínas, altamente conservadas na defensinas de
plantas, e de dois outros resíduos conservados Tyr
11
e Gly
13
(Fig. 28). Através de
ferramentas computacionais (“Expasy – Comute PI/MW tool”) foi calculado o pI (8,2) e a
massa molecular (5.444,11 Da) da defensina predita de feijão comum que juntamente
com os dados acima mencionados mostram que a defensina de feijão comum é
semelhante a outras defensinas de plantas (Terras et al., 1992; Thomma et al., 2002).
O alinhamento da proteína predita a partir da seqüência do cDNA que codifica
para a defensina de sementes de feijão comum com seqüências de outras proteínas
vegetais depositadas em bancos de dados revelou que esta apresenta alta similaridade
com defensinas de Cicer arietinum (95 %), Vigna unguiculata (93 %) e Pachyrhizus
erosus (87 %) (Fig 28). Para investigar as relações evolutivas entre a defensina de
feijão comum e outras defensinas de plantas, foi construída uma árvore filogenética
sem raíz. Como pode ser observado na figura 28, a defensina de P. vulgaris é agrupada
com quatro outras defensinas de espécies da família Fabaceae, Vigna unguiculata,
Pachyrhizus erosus, Cicer arietinum e P. sativum, mostrando uma estreita relação das
defensinas desta família (Fig. 29, sublinhada). Pode ser ainda observado que a árvore
filogenética é agrupada, em geral, de uma maneira família-específica. Por exemplo,
defensinas de Arabidopsis thaliana e Wasabia japonica, membros da família
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 109
Brassicaceae, estão agrupadas em um mesmo “cluster”. A árvore também demonstra
que as defensinas de espécies da famíla Poacea, Sorghum bicolor e Hordeum vulgare,
estão agrupadas, como fazem as espécies de família Solanaceae, Capsicum annuum e
Solanum chacoense. Além disto, a defensina de Ginkgo biloba foi posicionada bem
próxima à outra defensina de uma espécie da subclasse Gimnoperma, Picea abies.
Estes dados se assemelham bastante aos dados previamente encontrados por Shen et
alli (2005), que demonstraram que a defensina G. biloba (GbD) compartilha a mesma
origem evolutiva das defensinas de outras espécies da subclasse Gimnoperma.
A fim de se analisar a atividade antifúngica da defensina de sementes de feijão
comum, esta foi inicialmente purificada segundo a metodologia descrita por Games, em
2006. Como descrito pela referida autora, a defensina de sementes de feijão comum foi
purificada através de uma única etapa cromatográfica, uma cromatografia de troca
iônica em coluna de DEAE-Sepharose (Fig. 23A). Análises por eletroforese sob
condições desnaturantes da fração não-retida oriunda desta cromatografia mostram
que esta fração é composta por uma única proteína de massa molecular em torno de 6
kDa (Fig. 23C). Esta purificação foi consolidada por cromatografia de fase reversa em
HPLC (Fig. 23 B). Uma vez purificada, a defensina foi utilizada para os ensaios de
inibição do crescimento de leveduras.
Diversos estudos têm mostrado o efeito inibitório das defensinas de plantas
sobre o crescimento de fungos, principalmente filamentosos (Terras et al., 1992; Terras
et al., 1993; Osborn et al., 1995). Thevissen et alli (em 2007) avaliaram o potencial das
defensinas de plantas como agentes terapêuticos testando o efeito destas moléculas
em leveduras do gênero Candida. Nesta ocasião, este grupo relatou que as defensinas
de plantas Hs-AFP1 e Rs-AFP2 eram capazes de inibir o crescimento de C. albicans e
C. krusei, mas não de C. glabrata. Segundo estes autores, isto ocorre devido a uma
diferença na composição lipídica das membranas destes organismos, uma vez que, ao
que tudo indica, os receptores para estas defensinas de plantas são esfingolipídeos
presentes na membrana dos fungos (Thevissen et al., 2003a; Thevissen et al., 2003b;
Thevissen et al., 2004). Assim, a constituição da membrana destes organismos vai
determinar o efeito que a defensina vai ter sobre o crescimento dos mesmos.
Neste estudo, o efeito da defensina de sementes de feijão comum sobre o
crescimento de leveduras foi testado contra as células de C. albicans, C. parapsilosis,
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 110
C. guilliermondii, C. tropicalis Kluyveromyces marxiannus e Saccharomyces cerevisiae.
Na presença deste peptídeo, o crescimento de todas as leveduras, com as exceções de
C. tropicalis e S. cerevisiae, foi inibido em todas as concentrações utilizadas. O valor de
IC
50
encontrado para C. albicans foi menor que 50 µg.mL
-1
(Fig. 30A), no entanto, a
redução no crescimento da levedura S. cerevisiae foi observada apenas na
concentração de 100 µg.mL
-1
(Fig. 30F). Através deste ensaio, não foi possível se
verificar que a defensina de sementes de feijão comum apresentasse efeito significativo
sobre o crescimento de C. tropicalis. Alguns autores já tinham demonstrado que a
concentração inibitória de defensinas é muito variante e depende do fungo testado
(Terras et al., 1992a; Terras et al., 1993; Osborn et al., 1995; Carvalho e Gomes, 2009).
As alterações morfológicas causadas pela presença da defensina de sementes
de feijão comum no meio de crescimento das leveduras C. albicans, C. parapsilosis,
Kluyveromyces marxiannus, C. guilliermondii, C. tropicalis e Saccharomyces cerevisiae
foram observadas através de microscopia eletrônica de varredura. De um modo geral,
as células das espécies testadas apresentam uma notável redução em seu número na
cultura e/ou diferenças no que diz respeito ao formato e à topografia celular. Nas
culturas de C. albicans (Fig. 31A e B), C. tropicalis (Fig. 31 E e F) e S. cerevisiae (Fig.
31G, H e I) tratadas com a defensina de sementes de feijão comum nota-se aspectos
típicos de células com dificuldades no processo de liberação dos brotos. Curiosamente,
a cultura celular de C. tropicalis crescida na presença desta defensina apresentou ainda
significativa redução no número de células na cultura, dado que foi, possivelmente,
mascarado no ensaio de inibição do crescimento em meio líquido devido à aglomeração
celular causada pela presença da desta defensina no meio de cultura, o que pode ter
interferido com a determinação da densidade óptica (reflexo do crescimento celular)
feita por espectrofotometria. Resultados semelhantes foram mostrados por Agízzio et
alli (2006) após tratamento de células da levedura S. cerevisiae com um peptídeo
homólogo às albuminas 2S extraído de sementes de maracjá. Ribeiro et alli (2007)
também relataram efeitos similares aos aqui encontrados quando células da levedura S.
cerevisiae foram tratadas com peptídeos antimicrobianos de sementes de pimenta.
A habilidade da defensina de sementes de feijão comum de permeabilizar a
membrana plasmática de células de levedura foi avaliada neste trabalho através de
ensaio de captação do corante fluorescente SYTOX Green. Estes ensaios revelaram
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 111
que células de S. cerevisiae incubadas com a defensina de sementes de feijão comum
estavam permeabilizadas após por 30 min de contato com a proteína (Fig. 32C). Estes
resultados se assemelham aos resultados obtidos por Thevissen et alli que
demonstraram que as defensinas de plantas são capazes de permeabilizar a
membrana tanto de fungos filamentosos (Thevissen et al., 1999) quanto de leveduras
(Thevissen et al., 2007). Os resultados obtidos através de ensaio de inibição do
crescimento, somados aos obtidos no ensaio de permeabilização de membranas
através de captação do corante SYTOX Green sugerem que a defensina presente em
sementes de feijão comum atua comprometendo o funcionamento da membrana
plasmática destas células, alterando sua permeabilidade a íons e moléculas orgânicas
como o SYTOX Green.
Estes dados foram confirmados através da análise ultraestrutural de células de
leveduras tratadas com a defensina de sementes de feijão comum através de
microscopia eletrônica de transmissão. Estas análises mostraram que células tratadas
com a defensina apresentavam uma desorganização do conteúdo citoplasmático (Fig.
33, estrelas), bem como a descontinuidade de sua membrana plasmática (Fig. 33,
setas).
Os resultados aqui apresentados podem ser comparados aos descritos para
outras proteínas ou peptídeos de defesa como as osmotinas (Narasimhan et al., 2001),
abuminas 2S (Agízzio et al., 2006) e LTPs (Diz et al., 2006). No entanto, novos
trabalhos, utilizando técnicas de microscopia, que apresentem imagens de células
tratadas com peptídeos antimicrobianos, especialmente defensinas, se fazem
necessários para melhor caracterizar os fenômenos ultraestruturais e morfológicos
celulares ocorridos em conseqüência da atuação destas proteínas, visto que poucos
são trabalhos os que utilizam essas técnicas para avaliar a ação dessas proteínas
antimicrobianas.
Embora características estruturais possam permitir às plantas vários graus de
defesa contra insetos e patógenos, torna-se claro que a resistência de plantas depende
não apenas das barreiras estruturais, mas também de substâncias químicas produzidas
nas células antes e após a agressão. A identificação e a caracterização de substâncias,
em especial as de natureza protéica, que estão associadas com os mecanismos de
defesa de plantas são fundamentais para a produção de cultivares resistentes. As
Discussão____________________________________________________________________
Santos, I.S. 112
defensinas de plantas são moléculas versáteis que exibem uma variedade de
atividades biológicas e com grande potencial biotecnológico. Os dados aqui
apresentados reunidos ilustram o potencial biotecnológico desta classe de peptídeos
antimicrobianos e provêm evidências que a manipulação genética desta classe de
moléculas pode prover um método eficiente de proteção contra as perdas nas lavouras.
_____________________
CONCLUSÕES
Conclusões________________________________________________________________
Santos, I.S.
113
6. Conclusões
• A defensina recombinante, produzida e purificada neste trabalho, mostrou ser
idêntica à defensina natural isolada de sementes de feijão-de-corda e alto
grau de similaridade com outras defensinas de plantas, quando analisadas
através de sequenciamento amino-terminal.
• A modelagem da estrutura da defensina recombinante mostrou que a
defensina de sementes de feijão-de-corda é constituída de três folhas β
antiparalelas e uma α-hélice e que esta estrutura é estabilizada por quatros
pontes dissulfeto.
• A defensina natural de sementes de feijão-de-corda, bem como seu homólogo
recombinante, possuem atividade inibitória sobre α-amilases do inseto
Callosobruchus maculatus. Adicionalmente, a defensina natural da semente
também foi testada e provou ser inibidora das α-amilases de Zabrotes
subfasciatus.
• A defensina de sementes de feijão-de-corda e seu homólogo recombinante
não apresentam atividade contra α-amilase salivar humana.
• A clonagem molecular do cDNA da defensina de sementes de feijão comum
no vetor pTZ57R/T, e a subseqüente transformação de células da bactéria E.
coli linhagem linhagem DH5α, produziu um fragmento de 314 pb, codificador
de um peptídeo de 47 aminoácidos.
• O seqüenciamento do cDNA e a dedução da sequência de aminoácidos do
peptídeo mostrou que este corresponde à defensina isolada a partir de
sementes de feijão comum. O alinhamento da sequência da defensina predita
com seqüências protéicas depositadas em bancos de dados mostrou um alto
grau de homologia com diversas defensinas de plantas.
• A defensina predita possui estreita relação filogenética com defensinas de
outras espécies da família Fabaceae.
Conclusões________________________________________________________________
Santos, I.S.
114
• A defensina de sementes de feijão comum tem efeito inibitório sobre o
desenvolvimento das leveduras Candida albicans, C. parapsilosis,
Kluyveromyces marxiannus, C. guilliermondii, C. tropicalis e Saccharomyces
cerevisiae.
• A defensina de sementes de feijão comum é capaz de causar alterações
morfológicas nas células das diferentes leveduras testadas, além de interferir
com o processo de formação de brotos nas leveduras S. cerevisiae e C.
albicans.
• A defensina de sementes de feijão comum é também capaz de permeabilizar
a membrana das células das leveduras, causar alterações no conteúdo
citoplasmático das mesmas, além de promover desorganização na membrana
plasmática.
• A defensina de sementes de feijão comum não inibe as α-amilases dos insetos
C. maculatus e Z. subfasciatus nem a α-amilase salivar humana.
____________________
REFERÊNCIAS
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 115
Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Meert, E. M. K., Li, Q-T., Cammue, B. P. A. e Thevissen, K.
(2007). The antifungal activity of Rs-AFP
2
, a plant defensin from Raphanus sativus,
involves the induction of reactive oxygen species in Candida albicans. J. Mol. Microbiol.
Biotechnol., 13:243-47.
Agizzio, A. P., Carvalho, A. O., Ribeiro, S. F. F., Machado, O. L. T., Alves, E. W., Okorokov,
L. A., Samarão, S. S., Bloch Jr., C., Prates, M. V. e Gomes, V. M. (2003). A 2S albumin-
homologous protein from passion fruit seeds inhibits the fungal growth and acidification of
the medium by Fusarium oxysporum. Arch. Biochem. Biophys., 416:188-195.
Agizzio, A.P., Da Cunha, M., Carvalho, A.O., Oliveira, M.A., Ribeiro, S.F.F., Gomes, V.M.
(2006). The antifungal proprieties of a 2S albumin-homologous protein from passion fruit
seeds involve plasma membrane permeabilization and ultrastructural alterations in yeast
cells. Plant Sci., 171:215–222.
Agrios, G. N. (1997). How plant defend themselves against pathogens. In: Plant pathology.
4
a
edição. London, Academic Press, Inc., 97-115.
Aguiar, J. M., Franco, O. L., Rigden, D. J., Bloch, C. Jr., Monteiro, A. C., Flores, V. M.,
Jacinto, T., Xavier-Filho, J., Oliveira, A. E., Grossi-de-Sá, M. F. e Fernandes, K. V. S.
(2006). Molecular modeling and inhibitory activity of cowpea cystatin against bean bruchid
pests. Proteins, 15:63(3):662-70.
Aidar, H. (2003). Características da cultura. Cultivo do feijoeiro comum. Embrapa arroz e
feijão, Sistema de produção 2, em
http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Feijao/CultivodoFeijoeiro/inde
x.htm, consulta feita em 29 de junho de 2009.
Allen, D. J. (1982). The pathology of tropical food legumes. In: Disease resistance in crop
improvment. Chinchester, John Wiley, 431-445.
Allen, G. (1989). Determination of peptides sequences. In: Bufdon, R. H. e Knipperg, P. H.
(editors), Laboratory Tecniques in Biochemistry and Molecular Biology, Sequencing of
proteins and peptides. 2
a
edição. Oxford, Elsevier, p.221-222.
Almeida, M. S., Cabral, K. M. S., Kurtenbach, E., Almeida, F. C. L. e Valente, A. P. (2002).
Solution structure of Pisum sativum defensin 1 by high resolution NMR: plant defensins,
identical backbone with different mechanisms of action. J. Mol. Biol., 315:749-57.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 116
Almeida, S. A., Almeida, F. A. C., Santos, N. R., Araújo, M. E. R. e Rodrigues, J. P. (2004).
Atividade inseticida de extratos vegetais sobre Callosobruchus maculatus (Fabr., 1775)
(COLEOPTERA: BRUCHIDAE). R. Bras. Agrociência, 10(1):67-70.
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. e Lipman, D. J. (1990). Basic local
alignment search tool. J. Mol. Biol., 215:403-410.
Altschul, S. F., Madden , T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. e Lipman, D.
J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search
programs. Nucleic Acids Res., 25(17):3389-402.
Barreto, P. D. e Quinderé, M. A. W. (2000). Resistência de genótipos de caupi ao caruncho.
Pesq. Agropec. Bras., 35(4):779-785.
Bernfeld, P. (1955). Amylase α and β. Methods Enzymol., 1: 149-154.
Bjellqvist, B., Hughes, G. J., Pasquali, C. h., Paquet, N., Ravier, F., Sanchez, J-Ch., Frutiger,
S. e Hochstrasser, D. F. (1993). The focusing positions of polypeptides in immobilized pH
gradients can be predicted from their amino acid sequences. Electrophoresis, 14:1023-
1031.
Bjellqvist, B., Basse, B. e Olsen, E. J. E. (1994). Reference points for comparisons of two-
dimensional maps of proteins from different human cell types defined in a pH scale where
isoelectric points correlate with polypeptide compositions. Electrophoresis, 15:529-539.
Bloch, C. J. e Richardson, M. (1991). A new family of small (5 kDa) protein inhibitors of
insect α-amylases from seeds of sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench) have sequence
homologies with wheat γ-purothionins. FEBS, 279(1):101-4.
Boeke, S. J., Baumgart, I. R., Van Loon, J. J. A., Van Huis, A., Dicke, M. e Kossou, D. K.
(2004). Toxicity and repellence of African plants traditionally used for the protection of
stored cowpea against Callosobruchus maculatus. J. Stored Prod. Res., 40:423–438.
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of dye binding. Biochem., 72: 248- 254.
Brito, J. P., Oliveira, J. E. M. e Bortoli, S. A. (2006). Toxicidade de óleos essenciais de
Eucalyptus spp. sobre Callosobruchus maculatus (Fabr., 1775) (Coleoptera: Bruchidae).
Revista de Biologia e Ciências da Terra, 6(1):96-103.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 117
Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A. e Vanderleyden, J., (1990). An
automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microb. Lett., 69:55-60.
Broekaert, W. F., Cammue, B. P. A., De Bolle, M. F. C., Thevissen, K., De Samblanx, G. e
Osborn, R. W. (1997). Antimicrobial peptides from plants. Crit. Rev. Plant Sci., 16(3):297-
323.
Carlini, C. R. e Grossi-de-Sá, M. F. (2002). Plant toxic protein with insecticidal properties. A
review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon, 40: 1515-1539.
Carvalho, A. O., Machado, O. L. T., Da Cunha, M., Santos, I. S. e Gomes, V. M. (2001).
Antimicrobial peptides and immunolocalization of a LTP in Vigna unguiculata seeds. Plant.
Physiol. Biochem., 39:137-46.
Carvalho, A. O. (2005). Localização intracelular, clonagem molecular e expressão de
peptídeos antimicrobianos em plantas de feijão-de-corda (Vigna unguiculata (L.) Walp).
Tese (doutorado em biociências e biotecnologia)-Campos dos Goytacazes, RJ, - Centro
de Biociências e Biotecnologia - Universidade Estadual do Norte Fluminense-UENF.
Texto completo.
Carvalho, A. O., Filho, G. A. S., Ferreira, B. S., Branco, A. T., Okorokova-Façanha, A. L. e
Gomes, V. M. (2006). Cloning and characterization of a cDNA encoding a cowpea seed
defensin and analysis of its expression. Protein Pept. Lett., 13:1029-36.
Carvalho, A. O. e Gomes, V. M. (2009). Plant defensins—Prospects for the biological
functions and biotechnological properties. Peptides, 30:1007–1020.
Castro, M. S. e Fontes, W, (2005). Plant defense and antimicrobial peptides. Protein Pept.
Lett., 12:11-16.
Chen, K-C., Lin, C-Y., Kuan, C-C., Sung, H-Y. e Chen, C-S. A novel defensin encoded by a
mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid. J. Agric. Food Chem.,
50:7258-63.
Chen, J-Jr., Chen, G-H., Hsu, H-C., Li, S-S. e Chen, C-S. (2004). Cloning and functional
expression of a mungbean defensin VrD1 in Pichia pastoris. J. Agric. Food Chem.,
52:2256-61.
Chen, G-H., Hsu, M-P., Tan, C-H., Sung, H-Y., Kuo, C. G., Fan, M-J., Chen, H-E., Chen, S. e
Chen, C-S. (2005). Cloning and characterization of a plant defensin VaD1 from azuki
bean. J. Agric. Food Chem., 53: 982-8.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 118
Colilla, F. J., Rocher, A. e Mendez, E. (1990). γ-purothionins: animo acid sequence of two
polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm. FEBS, 270(1,2): 191-4.
Cornet, B., Bonmatin, J-M., Hetru, C., Hoffmann, J. A., Ptak, M. e Vovelle, F. (1995).
Refined three-dimensional solution structure of insect defensin A. Structure, 3:435-48.
Dayler, C. S. A., Mendes, P. A. M., Prates, M. V., Bloch, C. Jr., Franco, O. L. e Grossi-de-Sá,
M. F. (2005). Identification of a novel bean a-amylase inhibitor with chitinolytic activity.
FEBS Lett., 579:5616–5620.
De Hoff, P. L., Brill, L. M. e Hirsch, A. M. (2009). Plant lectins: the ties that bind in root
symbiosis and plant defense. Mol. Genet. Genomics, 282(1):1-15.
Diz, M. S. S., Carvalho, A. O., Rodrigues, R., Neves-Ferreira, A. G. G., Da Cunha, M., Alves,
E. W., Okorokova-Façanha, A., Oliveira, M. A., Perales, J., Machado, O. L. T., Gomes, V.
M. (2006). Antimicrobial peptides from chilli pepper seeds causes yeast plasma
membrane permeabilization and inhibits the acidification of the medium by yeast cells.
Arch. Biochem. Biophys., 1760:1323-1332.
Duvick J. P., Rood, T., Rao, A. G. e Marshak, D. R. (1992). Purification and characterization
of a novel antimicrobial peptide from maize (Zea mays L.) kernels. J. Biol. Chem.,
267:18814–18820.
Edman, P. (1950). Method for determination of amino acid sequences in peptides. Acta
Chem. Scand., 28: 283-293.
Ehlers, J. D. e Hall, A. E. (1997). Cowpea ( Vigna unguiculata L. Walp.). Field Crop. Res.,
53:187-204.
Elmorjani, K., Lurquin, V., Lelion, A., Rogniaux, H. e Marion, D. (2004). A bacterial
expression system revisited for the recombinant production of cystine-rich plant lipid
transfer proteins. Biochem. Bioph. Res. Co., 316:1202–1209.
Fant, F., Vranken, W., Broekaert, W. e Borremans, F. (1998). Determination of the three-
dimensional solution structure of Raphanus sativus antifungal protein 1 by
1
H NMR. J.
Mol. Biol., 279:257-70.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 119
Ferket, K. K. A., Levery, S. B., Park, C., Cammue, B. P. A. e Thevissen, K. (2003). Isolation
and characterization of Neurospora crassa mutants resistant to antifungal plant defensins.
Fungal Gen. Biol., 40:176–185.
Finkina, E. I., Shramova, E. I., Tagaev, A. A. e Ovchinnikova, T. V. (2008). A novel defensin
from the lentil Lens culinaris seeds. Biochem. Biophys. Res. Commun., 371:860-865.
Franco, O. L., Murad, A. M., Leite, J. R., Mendes, P. A. M., Prates, M. V. e Bloch, C. Jr.
(2006). Identification of a cowpea γ-thionin with bactericidal activity. FEBS J., 273:3489-
97.
Games, P. D., (2006). Peptídeos antimicrobianos presentes em sementes de feijão comum
(P. vulgaris L.). Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas) - Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF – Campos dos Goytacazes - RJ
García-Olmedo, F., Rodríguez-Palenzuela, P., Molin, A., Alamillo, J. M., López-Solanilla, E.,
Berrocal-Lobo, M. e Poza-Carrión, C. (2001). Antibiotic activities of peptides, hydrogen
peroxide and peroxynitrite in plant defence. FEBS Lett., 498(2-3):219-22.
Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D. e Bairoch,
A. (2005). Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. In: John MW
(editor), The Proteomics Protocols Handbook. Totowa, Humana Press, texto completo.
Gaudet, D. A., Laroche, A., Frick, M., Huel, P. e Puchalski, B. (2003). Cold induced
expression of plant defensin and lipid transfer protein transcripts in winter wheat. Physiol.
Plantarum, 117:195-205.
Gomes, V. M. e Xavier-Filho, J. (1994). Biochemical defenses of plants. Arq. Biol. Tecnol.,
37(2): 371- 383.
Gomes, V. M., Blanco-Labra, A., Sales, M. P., Fernandes, K. V. S., Cordeiro, R. A. e Xavier-
Filho, J. (1997). Vicilin storage proteins from cowpea (legume) seeds inhibit fungal
development. J. Agric. Food Chem., 45:4110-4115.
Gomes, V. M., Okorokov, L. A., Rose, T. L., Fernandes, K. V. S. e Xavier-Filho, J. (1998a).
Legume vicilins 7S storage globulins inhibit yeast growth and glucose stimulated
acidification of the medium by yeast cells. Biochem. Biophys. Acta, 1379:207-216.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 120
Gomes, V. M. , Da Cunha, M., Miguens, F. C., Fernandes, K. V. S., Rose, T. L. e Xavier-
Filho, J. (1998b). Ultrastructure and immunolabelling of Vigna unguiculata vicilins (7S
storage proteins) associated to fungi cells. Plant Sci., 138:81-89.
González-Teuber, M., Eilmus, S., Muck, A., Svatos, A. e Heil, M. (2009). Pathogenesis-
related proteins protect extrafloral nectar from microbial infestation. Plant J., 58(3):464-73.
Habib, H. e Fazili, K. M. (2007). Plant protease inhibitors: a defense strategy in plants.
Biotechnology and Molecular Biology Review, 2 (3): 068-085.
Hancock, R. E. W. e Diamond, G. (2000). The role of cationic antimicrobial peptides in innate
host defences. Trends Microbiol., 8(9):402-410
Huang, L., Ching, C. B., Jiang, R. e Leong, S. S. J. (2008). Production of bioactive human
beta-defensin 5 and 6 in Escherichia coli by soluble fusion expression. Protein Expres.
Purif., 61:168–174.
Hunkapiller, W. M., Lujan, E., Ostrander, F. e Hood, L. E. (1983). Isolation of microgram
quantities of protein from polyacrilamide gels for amino acid sequence analysis. In:
Methods in Enzymology. London, Academic press, Inc., 227-236.
Inoue, H., Nojima, H. e Okayama, H. (1990). High eficiency transformation of Escherichia coli
with plasmids. Gene, 96:23-28.
Ishimoto, M. e Chrispeels, M.J. (1996). Protective mechanism of the Mexican bean weevil
against high levels of alpha-amylase inhibitor in the common bean. Plant Physiol.,
111:393–401.
Janssen, B. J. C., Schirra, H. J., Lay, F. T., Anderson, M. A. e Craik, D. J. (2003). Structure
of Petunia hybrida defensin1, a novel plant defensin with five disulfide bonds.
Biochemistry, 42:8214-22.
Kanzaki, H., Nirasawa, S., Saitoh, H., Ito, M., Nishihara, M., Terauchi, R., Nakamura, I.
(2002). Overexpression of the wasabi defensin gene confers enhanced resistance to blast
fungus (Magnaporthe grisea) in transgenic rice. Theor. Appl. Genet., 105:809-14.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 121
Kim, S. T., Kim, S. G., Hwang, D. H., Kang, S. Y., Lee, B. H., Lee, J. J. e Kang, K. Y.
(2004). Proteomic analysis of pathogen-responsive proteins from rice leaves induced by
rice blast fungus, Magnaporthe grisea. Proteomics, 4 (11): 3569-3578.
Kluh, I., Horn, M., Hyblova, J., Hubert, J., Doleckova-Maresova, L., Voburka, Z., Kudlıkova,
I., Kocourek, F. e Mares, M. (2005). Inhibitory specificity and insecticidal selectivity of α-
amylase inhibitor from Phaseolus vulgaris. Phytochemistry, 66:31–39.
Kristensen, A. K., Brunstedt, J., Nielsen, J. E., Mikkelsen, J. D., Roepstorff, P. e Nielsen, K.
K. (1999). Processing, disulfide pattern, and biological activity of a sugar beet defensin,
AX2, expressed in Pichia pastoris. Protein Expr. Purif., 16(3):377-87.
Kushmerick, C., Castro, M. S., Cruz, J. S., Bloch, C. Jr. e Beiraìo, P. S. L. (1998). Functional
and structural features of γ-zeathionins, a new class of sodium channel blockers. FEBS
Lett., 440:302-6.
Laemmili, U. K., (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.
Laskowski, R. A., MacArthur, M. W, Moss, D. S e Thornton, J. M. (1993). PROCHECK: A
program to check the stereochemical quality of protein structures, J. Appl. Crystallogr.,
26:283-291.
LaVallie, E. R., DiBlasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., Lu, Z. e McCoy, J. M. (2003).
Thioredoxin and related proteins as multifunctional fusion tags for soluble expression in E.
coli, Methods Mol. Biol., 205:119–140.
Lay, F. T., Schirra, H. J., Scanlon, M. J., Anderson, M. A. e Craik, D. J. (2003a). The three-
dimensional solution structure of NaD
1
, a new floral defensin from Nicotiana alata and its
application to a homology model of the crop defense protein alfAFP. J. Mol. Biol.,
325:175-88.
Lay, F.T., Brugliera, F. e Anderson, M. A. (2003b). Isolation and properties of floral defensins
from ornamental tobacco and petunia. Plant Physiol., 131:1283-93.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 122
Lin, K-F., Lee, T-R., Tsai, P-H., Hsu, M-P., Chen, C-S. e Lyu, P-C. (2007). Structure-based
protein engineering for α-amylase inhibitory activity of plant defensin. Proteins., 68:530-
40.
Lin, P., Wong, J. H. e Ng, T. (2009). A defensin with highly potent antipathogenic activities
from the seeds of purple pole bean. Biosci. Rep., artigo in press.
Liu, Y-J., Cheng, C-S., Lai, S-M., Hsu, M-P., Chen, C-S. e Lyu, P-C. (2006). Solution
structure of the plant defensin VrD
1
from mung bean and its possible role in insecticidal
activity against bruchids. Proteins, 63:777-86.
Lobo, D. S., Pereira, I. B., Fragel-Madeira, L., Medeiros, L. N., Cabral, L. M., Faria, J., Bellio,
M., Campos, R. C., Linden, R. e Kurtenbach, E. (2007). Antifungal Pisum sativum
defensin 1 interacts with Neurospora crassa cyclin F related to the cell cycle.
Biochemistry, 46:987-996.
López, R. C., Gómez-Gómez, L. (2009). Isolation of a new fungi and wound-induced
chitinase class in corms of Crocus sativus. Plant Physiol. Biochem., 47(5):426-34.
Macedo, M. L. R., Andrade, L. B. S., Moraes, R. A. e Xavier-Filho, J. (1993). Vicilin variants
and the resistance of cowpea (Vigna unguiculata) seeds to the cowpea weevil
(Callosobruchus maculatus). Comp. Biochem. Physiol., 105:89-94.
Melo, F. R., Rigden, D. J., Franco, O. L., Mello, L. V., Ary, M. B., Grossi-de-Sá, M. F. e
Bloch, Jr. C. (2002). Inhibition of trypsin by cowpea thionin: Characterization, molecular
modeling, and docking. Proteins, 48(2):311-319.
Melo, V. M. M., Vasconcelos, I. M., Gomes, V. M., Da Cunha, M. e Oliveira, J. T. A. (2005).
Luetzelburgia auriculata agglutinin inhibits the growth of phytopathogenic fungi and
impairs glucose-stimulated acidification of the incubation medium by S. cerevisiae cells.
Plant Sci., 169: 629-639.
Méndez, E., Moreno, A., Colilla, F., Pelaez, F., Limas, G. G., Mendez, R., Soriano, F.,
Salinas, M. e de Haro, C. (1990). Primary structure and inhibition of protein synthesis in
eukaryotic cell-free system of a novel thionin, γ-hordothionin, from barley endosperm. Eur.
J. Biochem., 194:533-539.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 123
Méndez, E., Rocher, A., Calero, M., Girbes, T., Citores, L. e Soriano, F. (1996). Primary
structure of ω-hordothionin, a member of a novel family of thionins from barley
endosperm, and its inhibition of protein synthesis in eukaryotic and prokaryotic cell-free
systems. Eur. J. Biochem., 239:67-73.
Mirouze, M., Sels, J., Richard, O., Czernic, P., Loubet, S., Jacquier, A., François, I. E. J. A.,
Cammue, B. P. A., Lebrun, M., Berthomieu, P. e Marques, L. (2006). A putative novel role
for plant defensins: a defensin from the zinc hyper-accumulating plant, Arabidopsis halleri,
confers zinc tolerance. Plant J., 47:329-42.
Moraes, M. G. de (1998). Mecanismos da resistência sistêmica adquirida em plantas. RAPP,
6: 261-289.
Morrissey, J. H., (1998). Silver stain for proteins in polyacrilamide gels: a modified procedure
with enhaced uniform sensitivity. Anal. Biochem.117: 307-10
Narasimhan, M. L., Damsz, B., Coca, M. A., Ibeas, J. I., Yun, D-J., Pardo, J. M., Hasegawa,
P. M. e Bressan, R. A. (2001). A Plant Defense Response Effector Induces Microbial
Apoptosis. Mol. Cell, 8:921–930.
Nobrega, F. M., Santos, I. S., Da Cunha, M., Carvalho, A. O. e Gomes, V. M. (2005).
Antimicrobial protein frm cowpea root exudates: inhibitory activity against Fusarium
oxysporum and purification of a chitinase-like protein. Plant and soil, 272: 223–232.
Osborn, R. W., De Samblanx, G. W., Thevissen, K., Goderis, I., Torrekens, S., Van Leuven,
F. V., Attenborough, S., Rees, S. B. e Broekaert, W. F. (1995). Isolation and
characterization of plant defensins from seeds of Asteraceae, Hippocastanaceae and
Saxifragaceae. FEBS Lett., 368: 257-262.
Payan, F. (2004). Structural basis for the inhibition of mammalian and insect a-amylases by
plant protein inhibitors. Biochim. et Biophys. Acta, 1696:171– 180.
Pelegrini, P. B. e Franco, O. L. (2005). Plant γ-thionins: novel insights on the mechanisms of
actions of a multi-functional class of defense proteins. Int. J. Biochem. Cell Biol., 37:2239-
53.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 124
Pelegrini, P. B., Lay, F. T., Murad, A. M., Anderson, M. A. e Franco, O. L. (2008). Novel
insights on the mechanism of action of α-amylase inhibitors from the plant defensin family.
Proteins, 73:719-29.
Reis, C. M., Calvet, M. M., Sales, M. P., Fernandes, K. V. S., Gomes, V. M. e Xavier Filho, J.
(1997). Inhibitors of microbial-, plant-, insect-, and mammalian-alpha amylases found in
seeds of several legumes. Arquivos de biologia e tecnologia, Curitiba, Parana, v. 40, p.
413-418, 1997.
Ribeiro, S. F. F., Carvalho, A. O., Da Cunha, M., Rodrigues, R., Melo, V. M. M.,
Vasconcelos, I. M., Melo, E. J. T., Cruz, L. P. e Gomes, V. M. (2007). Isolation and
characterization of novel peptides from chilli pepper seeds: antimicrobial activities against
pathogenic yeasts. Toxicon, 50:600-611.
Rios, G. P. e Zimerman, F. J. P. (1987). Epidemyologic aspects and control of the
Cercospora leaf-spot on cowpeas. Agropecu. Bras., 22 (3): 275-279.
Sali, A. e Blundell, T. L. (1993). Comparative protein modelling by satisfaction of spatial
restraints. J. Mol. Biol., 234:779-815.
Sambrook, J. e Russel, D. W. (2001). Molecular cloning. A laboratory manual. 3
a
edição.
New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, texto completo.
Sartorato, A., de Faria J. C. e Rava, C. A., (2006). Doenças e métodos de controle.
Características da cultura. Cultivo do feijoeiro comum. Embrapa arroz e feijão, Sistema de
produção 2, em
http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Feijao/CultivodoFeijoeiro/inde
x.htm, consulta feita em 29 de junho de 2009.
Schägger, H. e Von Jagow, G. (1987). Tricine-sodium dodecysulfate polyacrylamide gel
electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal.
Biochem., 166: 368-379.
Sels, J., Mathys, J., De Coninck, B. M. A., Cammue, B. P. A. e De Bolle, M. F. C. (2008).
Plant pathogenesis-related (PR) proteins: A focus on PR peptides. Plant Physiol.
Biochem., 46(11): 941-950.
Shen, G., Pang, Y., Wu, W., Miao, Z., Qian, H., Zhao, L., Xiaofen, S. e Kexuan, T. (2005).
Molecular cloning, characterization and expression of a novel jasmonate-dependent
defensin gene from Ginkgo biloba. J. Plant Physiol., 162:1160-8.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 125
Shewry, P. R. e Lucas, J. A., (1997). Plant proteins that confer resistance to pest and
pathogens. Adv. Bot. Res., 26: 135-192.
Silva-Conceição, A. e Broekaert, W.F. (1999). Plant defensins, Pathogenesis-Related
Proteins in Plants. London, Academic Press Inc., pp. 247–260.
Singh, B. B. e Singh, S. R. (1985). Adjadi, Bruchid resistance in cowpea, Crop Sci., 25:736–
739.
Singh, B. B., Ehlers, J. D., Sharma, B. e Freire-Filho, F. R. (2002). In: Recent progress in
cowpea breeding. Fatokun, C. A., Tarawali, S. A., Singh, B.B., Kormawa, P. M. e Tamò,
M. (editors). Challenges and opportunities for enhancing sustainable cowpea production.
Proceedings of the World Cowpea Conference III held at the International Institute of
Tropical Agriculture (IITA), Ibadan, Nigeria, pp: 22-40.
Solis, J., Medrano, G. e Ghislain, M. (2007). Inhibitory effect of a defensin gene from the
Andean crop maca (Lepidium meyenii) against Phytophthora infestans. J. Plant Physiol.,
164:1071-82.
Spelbrink, R. G., Dilmac, N., Allen, A., Smith, T. J., Shah, D. M. e Hockerman, G. H. (2004).
Differential antifungal and calcium channel-blocking activity among structurally related
plant defensins. Plant physiol., 135:2055-67.
Svensson, B., Fukuda, K., Nielsen, P. K. e Bonsager, B. C. (2004). Proteinaceous a-amylase
inhibitors. Biochim. Biophys. Acta, 1696:145– 156.
Tchang, F., This, P., Stiefel, V., Arondel, V., Morch, M. D., Pages, M., Puigdomenech, P.,
Grellet, F., Delseny, M., Bouillon, P., Huet, J. C., Guerbette, F., Beauvaiscante, F.,
Duranton, H., Pernollet, J. C. e Kader, J. C. (1988). Phospholipid transfer protein - full-
length cDNA and amino-acid sequence in maize - amino-acid sequence homologies
between plant phospholipid transfer proteins, J. Biol. Chem., 263:16849–16855.
Terras, F. R. G., Schoofs, H. M. E., De Bolle, M. F. C., Van Leuven, F., Ress, S. B.,
Vanderleyden, J., Cammue, B. P. A. e Broekaert, W. F. (1992). Analysis of two novel
classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds. J. Biol.
Chem., 267:15301-15309.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 126
Terras, F. R. G., Torrekens, S., Van Leuven, F., Osborn, R. W., Vandeleyden, J., Cammue,
B. P. A. e Broekaert, W. F., (1993). A new family of basic cysteine-rich plant antifungal
proteins from Brassicaceae species. FEBS Lett., 316(3): 233-240.
Terras, F. R. G., Ergermont, K., Kovaleva, V., Raikhel, N. V., Osborn, R. W., Kester, A.,
Rees, S. B., Torrekens, S., Van Leuden, F., Vanderleyden, J., Cammue, B. P. A. e
Broekaert, W. F., (1995). Small cystein-rich antifungal proteins from radish: their role in
host defense. Plant Cell, 7: 573-588.
Thevissen, K., Ghazi, A., De Samblanx, G. W., Brownlee, C.,Osborn, R. W., e Broekaert,
W.F. (1996) Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins, J. Biol.
Chem., 271: 15018-15025.
Thevissen, K., Terras, F. R. G. e Broekaert, W. F. (1999). Permeabilization of fungal
membranes by plant defensins inhibits fungal growth. Appl. Environ. Microbiol.,
65(12):5451-5458.
Thevissen, K., Ferket, K. K. A., Francois, I. E. J. A. e Cammue, B. P. A. (2003a) Interactions
of antifungal plant defensins with fungal membrane components, Peptides 24:1705-1712.
Thevissen, K., François, I. E. J. A., Takemoto, J. Y., Ferket, K. K. A., Meert, E. M. K. e
Cammue, B. P. A. (2003b) DmAPM1, an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia
merckii), interacts with sphingolidids from Saccharomyces cerevisiae, FEMS
Microbiol.Lett., 226:169-173.
Thevissen, K., Warnecke, D. C., François, I. E. J. A., Leipelt, M., Heinz, E., Ott C, Zähringer,
U., Thomma, B. P. H. J., Ferket, K. K. A. e Cammue, B. P. A., (2004). Defensins from
insects and plants interact with fungal glucosylceramides. J. Biol. Chem., 279(6):3900-
3905.
Thevissen, K., Kristensen, H-H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A. e François, I. E. J.
A. (2007). Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov.
Today, 12(21-22): 966-971.
Thomma B. P., Cammue B. P. e Thevissen K. (2002). Plant defensins. Planta, 216: 193-202.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 127
Thompson, J. D., Higgins, D. G. e Gibson, T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,
position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl Acids Res., 22:4673-80.
Towbin, H., Staehelin, T. e Gordon, J. (1979). Eletrophoretic transfer of protein from
poliacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl.
Sci., 76(6): 4350-4354.
Turrini, A., Sbrana, C., Pitto, L., Castiglione, M. R., Giorgetti, L., Briganti, R., Bracci, T.,
Evangelista, M., Nuti, M. P. e Giovannetti, M. (2004). The antifungal Dm-AMP
1
protein
from Dahlia merckii expressed in Solanum melongena is released in root exudates and
differentially affects pathogenic fungi and mycorrhizal symbiosis. New Phytol., 163:393-
403.
Uchôa, H. B., Jorge, G. E., Freitas Da Silveira, N. J., Câmera, J. C. Jr, Canduri, F. e De
Azevedo, W. F. Jr. (2004). Parmodel: a web server for automated comparative modeling
of proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 325 (4):1481-1486.
Vasconcelos, I. M., Tretim, A., Guimarães, J. A. e Carlini, C. R. (1994). Purification and
physicochemical characterization of soyatoxin, a novel toxic protein isolated from soybean
(Glycine max). Arch. Biochem. Biophys., 312:357-366.
Vasconcelos, I. M., Morais, J. K. S., Siebra, E. A., Carlini, C. R., Sousa, D. O. B., Beltramini,
L. M., Melo, V. M. M. e OLIVEIRA, J. T. A. (2008). SBTX, a new toxic protein distinct from
soyatoxin and other toxic soybean [Glycine max] proteins and its inhibitory effect on
Cercospora sojina growth. Toxicon, 51:952-963.
Vieira, C., Júnior, T. J. P. e Borém, A. (2006). Feijão. 2
a
edição. Viçosa, Ed. UFV, texto
completo.
Vijayan, S., Guruprasad, L. e Kirti, P. B. (2008). Prokaryotic expression of a constitutively
expressed Tephrosia villosa defensin and its potent antifungal activity. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 80:1023-32.
Referências________________________________________________________________
Santos, I.S. 128
Wang, S. Y., Wu, J. H., Ng, T. B., Ye, X. Y. e Rao, P. F. (2004). A non-specific lipid transfer
protein with antifungal and antibacterial activities from the mung bean. Peptides, 8:1235-
42.
Wang, H. X. e Ng, T. B. (2006). An antifungal peptide from baby lima bean. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 73:576-81.
Wang, S., Rao, P. e Ye, X. (2008). Isolation and biochemical characterization of a novel
leguminous defense peptide with antifungal and antiproliferative potency. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 82(1):79-86.
Wijaya, R., Neumann, G. M., Condron, R., Hughes, A. B. e Poly, G. M. (2000). Defense
proteins from seed of Cassia fistula include a lipid transfer protein homologue and a
protease inhibitory plant defensin. Plant Sci., 159:243-55.
Wong, J. H. e Ng, T. B. (2005). Vulgarinin, a broad-spectrum antifungal peptide from haricot
beans (Phaseolus vulgaris). Int. J. Biochem. Cell Biol., 37:1626-32.
Wong, J. H., Zhang, X. Q., Wang, H. X. e Ng, T. B. (2006). A mitogenic defensin from white
cloud beans (Phaseolus vulgaris). Peptides, 27:2075-81.
Zélicourt, A., Letousey, P., Thoiron, S., Campion, C., Simoneau, P., Elmorjani, K., Marion,
D., Simier, P. e Delavault P. (2007). Ha-DEF1, a sun flower defensin, induces cell death
in Orobanche parasitic plants. Planta., 226:591-600.
Zhang, N. Y., Jones, B. L. e Tao, P. (1997). Purification and characterization of a new class
of insect α-amylase inhibitors from barley. Cereal Chem., 74:119-122.
Zhu, Y. J., Agbayani, R. e Moore, P. H. (2007). Ectopic expression of Dahlia merckii defensin
Dm-AMP
1
improves papaya resistance to Phytophthora palmivora by reducing pathogen
vigor. Planta., 226:87-97.
____________________
ANEXOS
Anexos____________________________________________________________________
Santos, I.S. 129
8.1- Artigos publicados
Anexos____________________________________________________________________
Santos, I.S. 130
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