ads:
Amanda da Silva Costa
Estudo Epidemiológico da Criptococose em pacientes do
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho e a Busca de
Novos Quimioterápicos Contra Cryptococcus gattii
Rio de Janeiro
2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
Estudo Epidemiológico da Criptococose em
pacientes do Hospital Universitário Clementino Fraga
Filho e a Busca de Novos Quimioterápicos Contra
Cryptococcus gattii
Amanda da Silva Costa
UFRJ
V.I.
ads:
3
Amanda da Silva Costa
Estudo Epidemiológico da Criptococose em pacientes do
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho e a Busca de
Novos Quimioterápicos Contra Cryptococcus gattii
Orientadora: Dra. Sonia Rozental
Rio de Janeiro
2009
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título
de Mestre em Ciências Biológicas
(Biofísica)
4
Costa, Amanda da Silva
Estudo Epidemiológico da Criptococose em pacientes do Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho e a Busca de Novos
Quimioterápicos Contra Cryptococcus gattii / Amanda da Silva
Costa. Rio de Janeiro, 2009. 82 fls
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas, Biofísica) –
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, 2009.
Orientadora: Sonia Rozental
1. Criptococose. 2. Cryptococcus gattii. 3. Tratamento. I. Rozental,
Sonia (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto
de Biofísica Carlos Chagas Filho. III. Título.
5
Amanda da Silva Costa
Estudo Epidemiológico da Criptococose em pacientes do Hospital Universitário
Clementino Fraga Filho e a Busca de Novos Quimioterápicos Contra
Cryptococcus gattii
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito necessário à obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica).
Rio de Janeiro, de agosto de 2009.
___________________________________________
Dra. Sonia Rozental, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, orientadora.
___________________________________________
Dra. Lucia Mendonça Previato, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.
___________________________________________
Dr. Marcio Lourenço Rodrigues, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de
Góes.
___________________________________________
Dra. Daniela Sales Alviano, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes.
___________________________________________
Dra. Rossiane Claudia Vommaro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
revisora.
6
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer à minha orientadora, Dra. Sonia Rozental, pela
oportunidade, apoio e ensinamentos durante todos esses anos.
Agradeço a todos do Laboratório de Biologia Celular de Fungos que
contribuíram para o meu crescimento, não apenas como pessoa, mas
principalmente, como pesquisadora.
Agradeço aos professores, pesquisadores, alunos e funcionários do
Laboratório Hertha Meyer, principalmente aos amigos que carrego desde da
graduação e a Dra. Juliany Cola pelos ensinamentos sempre que possível.
Agradeço ao Dr. Marcio Nucci, pela colaboração e a oportunidade de
realizar o estudo no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.
Gostaria de agradecer, principalmente, a minha pequena família, pelo
apoio, por estar ao meu lado em todos os momentos e por me dar forças para
sempre seguir em frente na busca do meu caminho.
Um agradecimento especial faço aos meus amigos. Obrigada por terem
cruzado meu caminho. Sem vocês eu não chegaria até aqui.
Agradeço aos professores e funcionários desta instituição que me
ajudaram em todos os momentos que precisei.
Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram na minha formação
e deixaram suas marcas quando cruzaram meu caminho.
Obrigada de coração,
Amanda Costa
7
RESUMO
Cryptococcus gattii é um fungo na forma de levedura encapsulada de grande
importância médica, sendo um dos principais agentes etiológicos da
criptococose. A criptococose é uma micose sistêmica que pode se manifestar
como uma doença oportunista primariamente patogênica. O objetivo do nosso
trabalho foi realizar um levantamento epidemiológico da criptococose no
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio
de Janeiro (HUCFF/UFRJ) e avaliar a eficácia de candidatos a antifúngicos
contra C. gattii. O levantamento epidemiológico foi realizado através da análise
de casos positivos para Cryptococcus sp. do HUCFF/UFRJ, no período de
1995 a 2005. Através da técnica de microdiluição determinamos a
concentração capaz de inibir 50% do crescimento (CI
50
) de 11 cepas de C.
gattii com 24 drogas de uso clínico ou não (anfotericina B, 2 azóis, terbinafina,
22,26-azasterol, epiminolanosterol, WSP1267, miltefosina e seus 8 análogos, 7
benzoxazinas e amiodarona) e avaliamos o efeito sinérgico destes, quando
combinados. Avaliamos o acúmulo de lipídios neutros, alterações no núcleo e
alterações na ultra-estrutura das células tratadas com estas drogas através da
microscopia de fluorescência e eletrônica de transmissão. Com o levantamento
epidemiológico observamos que dos 98 pacientes, 74% eram HIV+ sendo sua
maioria na faixa etária de 21 a 40 anos. Vinte e cinco pacientes foram a óbito
devido à infecção fúngica. Com raras exceções, os quimioterápicos testados
resultaram em valores de CI
50
inferiores ou iguais a 16µg/mL. A combinação
destes gerou efeito sinérgico, porém, este não foi observado em todas as
classes testadas. A microscopia de fluorescência nos permitiu observar o
acúmulo de lipídios neutros em compartimentos, além de 1, 2 ou nenhum
núcleo em células que sofreram algum tipo de tratamento. Nas amostras
processadas para microscopia eletrônica de transmissão observamos o
acúmulo de grânulos eletrondensos, a presença de vacúolos eletron-lucentes
que podem corresponder ao acúmulo de lipídios, descolamento da membrana
plasmática da parede celular e alterações na parede como fissuras e
rompimentos. Com os resultados obtidos podemos concluir que a criptococose
ainda é uma doença de alta incidência no estado do Rio de Janeiro, mesmo
após a implantação da terapia anti-retroviral, e que precisa de uma atenção
especial das políticas de saúde. Os novos quimioterápicos testados
apresentaram potencial para serem possíveis candidatos a antifúngicos no
tratamento da criptococose causada por C. gattii.
8
ABSTRACT
Cryptococcus gattii is an encapsulated yeast causing a life-threatening disease,
the cryptococcosis. Cryptococcosis is a systemic infection that can be an
opportunist or primarily pathogenic illness. The aims of this work were to carry
out an epidemiological study of the cryptococcosis in the Clementino Fraga
Filho University Hospital of the Federal University of Rio de Janeiro
(HUCFF/UFRJ) and to evaluate the antifungal activity of some new synthetic
compounds against C. gattii. The epidemiological study was based on the
analysis of positive cases for Cryptococcus sp. of the HUCFF/UFRJ, in the
period from 1995 to 2005. Using the technique of microdilution, we determined
the concentration of 24 compounds (amphotericin B, 2 azoles, terbinafine, 22-
26-azasterol, epiminolanosterol, WSP1267, miltefosine and 8 related analogs, 7
bezoxacines and amiodarone) capable of inhibiting the growth of 50% (IC
50
) of
11 C. gattii strains and the best associations of some drugs by the
checkerboard technique. We also evaluated the neutral lipids accumulation,
alterations in the nucleus and the ultra structure of the yeasts treated with these
drugs using fluorescence and transmission electron microscopy. We observed
in the epidemiological study that among 98 patients, 74% were HIV+, and the
majority was in the range of 21 to 40 years old. Twenty-five patients have died
because of the fungal infection. With rare exceptions, the drugs tested produced
IC
50
values lower than 16µg/mL. The combination of some of these drugs
generated synergic effect, however, this was not observed for all tested classes.
Acumulation of neutral lipids and nuclear alterations in the treated yeasts were
observed. Transmission electron microscopy showed the accumulation of
electron-dense granules, electron lucent vacuoles similar to lipid bodies,
detachment of the plasmatic membrane from the cell wall and the appearing of
regions of fission and disruption in the cell wall. We can conclude that
cryptococcosis is still an illness of high incidence in the state of Rio de Janeiro,
even after the implantation of the anti-retroviral therapy, and that it requires
special attention of the health policies. The new compounds studied here are
potential candidates to antifungal agents to the treatment of cryptococcosis
caused by C. gattii.
9
SUMÁRIO
Introdução 10
Cryptococcus 10
Cryptococcus gattii 11
Criptococose e sua Epidemiologia 13
Antifúngicos 18
Justificativa 24
Objetivos 25
Material e Métodos 26
Levantamento Epidemiológico 26
Identificação das cepas de Cryptococcus spp. 26
Amostras 27
Medição da Cápsula 27
Drogas 29
Testes de Susceptibilidade – Microdiluição em Caldo 31
Testes de Susceptibilidade – Efeito Fungicida 31
Testes de Susceptibilidade – Checkerboard 32
Efeito das drogas no acúmulo de lipídios neutros e no núcleo 34
Efeito das drogas na ultra-estrutura 34
Resultados 36
Epidemiologia 36
Identificação das Espécies 41
Análise da Expressão da Cápsula 42
Teste de Susceptibilidade 43
Medição da Cápsula de Células Tratadas 52
Efeito das drogas no acúmulo de lipídios neutros e no núcleo 53
Efeito das drogas na ultra-estrutura 56
Discussão 60
Conclusão 72
Referências 74
10
INTRODUÇÃO
Cryptococcus
O Cryptococcus é um fungo na forma de levedura pertencente ao grupo
dos Basidiomicetes. Esta levedura além de apresentar membrana plasmática e
parede celular, apresenta uma cápsula formada por polissacarídeos (figura 1).
Figura 1: Esquema do fungo Cryptococcus neoformans (adaptado de
www.scq.ubc.ca).
Esta levedura, de aproximadamente 5 – 20µm de diâmetro, foi isolada
pela primeira vez de sucos de frutas por Sanfelice, em 1984, e em seguida de
lesões cutâneas e na tíbia de uma mulher de 31 anos por Busse e Buschke, no
mesmo ano. A princípio esta infecção foi confundida com a blastomicose, uma
doença pulmonar também causada por leveduras. Somente a partir de 1950,
com outros casos descritos de infecções no cérebro, pulmões, rins e em outros
órgãos descritos, acometendo principalmente hospedeiros
imunocomprometidos, ficou confirmado que se tratava de uma outra infecção
sistêmica, a criptococose (revisado em Mitchell & Perfect, 1995).
A partir destes relatos, o fungo começou a ganhar mais destaque e,
nesta mesma década, o nome Cryptococcus neoformans foi adotado. Duas
variedades foram reconhecidas: variedade gattii e variedade neoformans (Lin &
11
Heitmann, 2006). Em seguida, mais uma variedade foi descrita, a variedade
grubii. Esta divisão está relacionada à composição polissacarídica da cápsula
que cada variedade possui, conferindo diferente antigenicidade. Os sorotipos B
e C pertencem à variedade gattii, o sorotipo A a variedade grubii e o sorotipo D
a variedade neoformans (Franzot, Salkin & Casadevall, 1999).
A variedade neoformans tem distribuição cosmopolita e, geralmente,
está associada a solos contaminados com fezes de aves, madeiras em
decomposição e poeira doméstica. Já a variedade gattii pode ser encontrada
em regiões tropicais e subtropicais, associada a troncos de eucalipto, de cássia
rosa e de fícus. A variedade grubii já foi isolada de fezes de pássaros, sucos de
frutas em fermentação, solo, ar e água (Reolon, Perez & Mezzari, 2004).
Evidências bioquímicas, ecológicas, genéticas e antigênicas distinguem
estas variedades. Trabalhos recentes propuseram a separação definitiva da
variedade neoformans e gattii, de modo a elevar esta última ao nível
taxonômico de espécie (Kwon-Chung et al., 2002; Kwon-Chung & Varma
2006). Atualmente, o gênero Cryptococcus é representado por mais de 30
espécies (Chayakulkeeree & Perfect, 2006), porém, apenas duas destas
possuem relevância médica: Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii
(Duncan, Stephen & Campbell, 2006).
Cryptococcus gattii
O Cryptococcus gattii foi descrito pela primeira vez na década de 70
(Kwong-Chung, Bennett & Theodore, 1978), e desde então vinha sendo
considerada uma variedade do C. neoformans. Esta espécie já foi descrita
como Filobasidiella bacillispora, de acordo com a sua forma telomórfica (forma
perfeita, a forma que apresenta reprodução sexuada). Já tendo sido chamada
também, de Cryptococcus bacillisporus, Cryptococcus hondurianus. Somente a
partir de 2002, o nome da espécie C. gattii vem sendo adotado (Kwon-Chung et
al., 2002). Após a reunião de evidências baseadas em diferentes conceitos de
espécie (fenotípico, biológico e cladístico), Kwon-Chung e Varma, em 2006,
propuseram a separação definitiva da variedade gattii criando a espécie C.
gattii.
12
Alguns métodos de identificação de espécies foram desenvolvidos para
esta levedura, de modo a otimizar o tempo do diagnóstico. Baseando-se nas
diferenças bioquímicas, temos o meio L-canavanina – glicina – azul de
bromotimol (CGB). Cepas de C. gattii, devido a sua capacidade de crescer na
presença do antibiótico L-canavanina e assimilar glicina como única fonte de
carbono, alcaliniza o meio, e devido a presença do indicador azul de
bromotimol, o meio se torna azul. O contrário acontece com as cepas de C.
neoformans, que não são capazes de crescer em meio com apenas esta fonte
de carbono, desta forma o meio se mantem com a sua coloração (figura 2)
(Kwon-Chung, Polacheck & Bennett, 1982).
Figura 2: Meio de identificação e separação das espécies de Cryptococcus. Meio L-
Canavanina – Glicina – Azul de Bromotimol (Kwong & Varma, 2006).
A sorotipagem, também, é utilizada para diferenciação das espécies. Os
antígenos capsulares podem estar presentes no líquor, plasma e urina e são
identificados através da técnica de aglutinação com látex, de modo que cepas
identificadas como sendo do sorotipo B ou C pertencem à espécie C. gattii
(Reolon, Perez & Mezzari, 2004).
No Brasil, nas regiões sul, sudeste e centro-oeste são raros os
isolamentos de C. gattii do ambiente quando comparados os de C. neoformans.
Já na região nordeste, seu isolamento tem sido mais freqüente. (figura 3)
(Nishikawa et al., 2003).
C. neoformans
C. gat
tii
13
Figura 3: Mapa da distribuição de Cryptococcus spp. no Brasil de um estudo realizado
com 467 isolados ambientais e clínicos no período de 1987 a 1998. CN – C.
neoformans e CG – C. gattii. (adaptado de Nishikawa et al. 2003).
Uma peculiaridade do C. gattii é sua capacidade de acometer
principalmente hospedeiros sadios, ao contrário do C. neoformans, que
acomete geralmente pacientes imunocomprometidos (HIV positivos,
transplantados ou com leucemia). A criptococose causada por C. gattii,
geralmente, tem uma resposta mais tardia à terapia antifúngica e em alguns
casos pode haver a necessidade de uma intervenção cirúrgica (Sorrell, 2001).
Criptococose e sua Epidemiologia
A criptococose é uma micose sistêmica que pode se manifestar como
uma doença oportunista, acometendo imunosuprimidos, se tratando da
infecção causada por C. neoformans, ou como uma doença primariamente
patogênica em indivíduos, aparentemente, sadios, quando causada por C. gattii
(Subramanian & Mathai, 2005).
A criptococose causada pelo C. neoformans tem sido chamada de
tolurose porque este agente já teve como sinonímia o nome de
Tolura histolítica, e também como blastomicose européia (Mitchell & Perfect,
14
1995). Foi primeiramente reportada em 1894 em uma lesão de tíbia em uma
mulher. Em 1905, o primeiro caso de meningite criptocócica foi relatado por
Van Hansemann. Esta infecção já foi observada, também, em mamíferos
domésticos, sendo mais comum em gatos e cães (Juliano, Souza & Scheide,
2006).
A principal via de infecção é a respiratória (figura 4), podendo causar o
aparecimento de massas tumorais de aspecto mucóide, ou de lesões, sem
aumento de volume nos pulmões. Essas lesões têm sido vistas, também, nas
narinas, encéfalo e meninges. Porém, há, também, casos de disseminação
geral com lesões em linfonodos, fígado e outros órgãos (Subramanian &
Mathai, 2005).
Figura 4: Via de infecção do C. gattii e C. neoformans (adaptado de Hull & Heitman,
2002).
O desenvolvimento de lesões pulmonares é raro, porém, as infecções no
sistema nervoso central (SNC) são freqüentes e se manifestam por sinais
neurológicos. No SNC a doença pode se desenvolver sob a forma de
meningite, encefalite, meningoencefalite, abscesso e granulomas. A explicação
para este neurotropismo tem como base três hipóteses: (1) no SNC o fungo
encontra substratos favoráveis para seu crescimento, (2) o SNC é um refúgio
15
para o Cryptococcus do sistema imune do hospedeiro ou (3) as células deste
fungo são atraídas pelos receptores de células neuronais. (Lin & Heitman,
2006).
Algumas características já foram descritas para diferenciar as infecções
causadas por cepas de C. gattii e C. neoformans. Hidrocefalia e lesões
cerebrais focais são mais comuns em infecções causadas por C. gattii.
Observa-se, também, criptococomas (massas tumorais causadas por este
agente) nos pulmões e cérebro, uma resposta aos antifúngicos mais lenta,
mais casos de seqüelas neurológicas e uma necessidade maior de intervenção
cirúrgica (Speed & Dunt, 1995).
A resposta imune a este fungo é tardia, pois os polissacarídeos
capsulares produzem paralisia imune no hospedeiro, ou seja, um estado em
que as células de defesa deixam de reagir, causam depleção do complemento
e mascaramento dos anticorpos dificultando uma resposta celular. A resposta
humoral e celular contribuem de forma evidente para a defesa contra infecção
criptocócica, pois os macrófagos participam da remoção do agente e há
algumas evidências de que os linfócitos T, bem como as células natural killer,
sejam capazes de destruir ou inativar diretamente fungo (Buchanan & Murphy,
1998).
Com o aumento do número de pacientes portadores do vírus HIV na
década de 80, a criptococose deixou de ser uma doença rara, passando a
ocupar o 2º lugar das doenças fúngicas e o 3ª lugar de doença doenças
oportunistas que acometem este tipo de paciente (Del Valle & Piña-Oviedo,
2006). Além da AIDS, outros fatores contribuíram para o aumento da incidência
desta doença, como o aumento de transplantes de órgãos e com isso o
aumento de terapias imunossupressoras, assim como o aumento de casos de
câncer na população (Moreira et al., 2006).
No Brasil, o primeiro caso de criptococose relatado foi em 1941, pelo Dr.
Carlos Lacaz e o Dr. Floriano de Almeida (Reis-Filho et al., 1985), desde então
novos casos vem sendo reportados em pacientes com ou sem doenças pré-
existentes.
Em 1986, em um levantamento de casos de criptococose feito por Kritski
et al. observou-se que entre os pacientes HIV+ que desenvolviam
meningoencefalite causada por Cryptococcus sp., a maioria apresentava febre,
16
dor de cabeça, lertagia, confusão mental, distúrbio de personalidade e coma
(70 - 90% destes). Pappalardo, em 2002, relatou cefaléia em 97% dos casos,
náusea e/ou vômito em 51%, febre em 34%, visão distorcida em 20% e
confusão metal em 11% dos 35 pacientes analisados em seu estudo. A cefaléia
é a segunda maior causa de dor em pacientes HIV+, e em 40% dos casos
estão ligados à meningite criptocócica (Aires, 2002).
A maior incidência de criptococose está entre pessoas de 30 a 60 anos
(Mitchell & Perfect, 1995). No Brasil, Corrêa et al. (1999) e Darzé et al. (2000)
verificaram um aumento de casos de criptococose em crianças, porém, a
prevalência ainda é em adultos, maiores de 24 anos. A criptococose é uma
micose sem predisposição por sexo, porém, a maioria dos casos se concentra
entre homens HIV+ (Queiroz et al., 2008).
Moreira et al. (2006) revelaram que a criptococose é a doença
oportunista de maior morbidade e mortalidade entre pacientes soropositivos.
Estudos brasileiros mostraram que 45 a 65% de pacientes com criptococose,
sejam eles imunocomprometidos ou imunocompetentes, vão a óbito
(Pappalardo & Melhem, 2003). No mundo, 10 a 25% dos pacientes morrem
durante a terapia inicial e de 30 a 60% no período subsequente de 12 meses
(Mitchell & Perfect, 1995).
O diagnóstico laboratorial se baseia em: isolamento do organismo em
cultura, análise histopatológica e detecção dos antígenos dos polissacarídeos
capsulares (Subramanian & Mathai, 2005). A pesquisa direta do agente
etiológico pode ser realizada utilizando o líquor, escarro, lavado brônquico,
urina, macerado de tecidos, pus das lesões, sangue e pulsão da medula óssea.
A técnica da tinta da Índia (nanquim) é um método rápido, simples e barato de
identificação e, geralmente, é empregada com amostras líquidas (Potón,
Sanches & Lopes-Medrano, 2001). Ela consiste na mistura do material extraído
do pacientes à tinta nanquim e análise no microscópio óptico, de modo que se
houver uma visualização de células leveduriformes com cápsula há uma
grande chance de o paciente estar infectado por Cryptococcus spp. (figura 5).
17
Figura 5: Microscopia óptica da cepa de C. gattii HEC40143 utilizando a técnica da
tinta Índia. Nela podemos observar com clareza a cápsula de polissacarídeos (c) ao
redor da levedura (arquivo pessoal).
O diagnóstico através da detecção do antígeno capsular se dá pela
aglutinação com látex, é um teste, também, rápido de ser realizado e, além
disso, é bastante sensível. Ele se baseia na utilização de partículas de látex
ligadas a um anticorpo monoclonal contra o principal polissacarídeo da cápsula
do C. neoformans, a glucuronoxilomanana (GXM). Através da incubação
destas partículas com o fluído cerebroespinhal, havendo a presença da
levedura, ocorrerá a ligação do anticorpo ao polissacarídeo, levando assim a
uma aglutinação (figura 6) (Hamilton et al., 1991).
Figura 6: A - Kit de identificação pelo método de aglutinação com látex do
polissacarídeo capsular. B – Resultado do teste de aglutinação, positivo na foto
superior e negativo na inferior (adaptado de doctorfungus.org).
B
A
c
18
Muitos métodos baseados em técnicas moleculares foram desenvolvidos
para o diagnóstico, monitoramento e tipificação dos isolados. A reação em
cadeia da polimerase (PCR) e suas variantes (PCR multiplex, PCR em tempo
real e nested PCR) tem sido importantes ferramentas de detecção de DNA de
C. gattii, C. neoformans e de outras leveduras (Rappelli et al., 1998; Posteraro
et al., 2000; Leal, 2002; Luo & Mitchell, 2002; Playford et al., 2006).
Antifúngicos de uso terapêutico
Os antifúngicos comercializados hoje têm como principal alvo o
ergosterol, que é um esterol de membrana plasmática encontrado em fungos,
protozoários e plantas. Em mamíferos, este esterol é ausente, com isso, sua
via de síntese se torna essencial no combate a infecções fúngicas. Alguns
quimioterápicos, também, atingem a via de síntese da parede celular e poucos
agem na síntese de DNA e RNA (Odds, Brown & Gow, 2003).
• Poliênicos
Os antifúngicos poliênicos, como a anfotericina B, foram os primeiros
antifúngicos utilizados. Eles têm como alvo moléculas de ergosterol (figura 7),
agem ligando-se a estes na membrana plasmática do fungo. Esta ligação
resulta na despolarização da membrana e na formação de poros que
aumentam a permeabilidade a solutos, levando, eventualmente, à morte da
célula (Odds, Brown & Gow, 2003).
Apesar da toxicidade dos poliênicos, a anfotericina B ainda é o
antifúngico de primeira escolha para muitas infecções sistêmicas (Lumbreras,
Lizasoain & Aguado, 2003). Pacientes que se utilizam desta terapia, que além
de ser pela via parenteral e com isso há a necessidade de internação, têm
como efeito colateral: febre, calafrios, náusea, vômitos, dores de cabeça,
dentre outros. Estudos demonstraram que, em concentrações elevadas, a
anfotericina B pode se ligar ao colesterol das células de mamífero e prejudicar
as funções renais. Há trabalhos, também, que demonstram esta droga como
sendo hepatotóxica, mielotóxica e cardiotóxica (Chen & Sorrel, 2007).
19
Figura 7: Mecanismo de ação da anfotericina B (adaptado de doctorfungus.org)
• Azóis
Os azóis constituem o maior grupo de antifúngicos, seu mecanismo de
ação é a inibição de uma enzima da biossíntese do ergosterol, a C14-α
demetilase, interrompendo assim a síntese deste esterol (figura 8) (Odds,
Brown & Gow, 2003). A inibição desta enzima conduz a diminuição do
ergosterol na membrana das células e a acumulação de intermediários de
esteróis, prejudicando a permeabilidade da membrana e o crescimento do
fungo.
Figura 8: Mecanismo de ação dos antifúngicos azólicos (adaptado de
doctorfungus.org)
20
O fluconazol, desde sua aprovação para uso clínico em 1990, se mostra
com excelentes propriedades farmacocinéticas, e comparado com a
anfotericina B, possui menor toxicidade (Lumbreras, Lizasoain & Aguado,
2003). Porém, já foi observada resistência de algumas cepas de Cryptococcus
spp. e Candida spp. a este medicamento (Chen & Sorrel, 2007). O itraconazol,
apesar de sua atividade contra algumas leveduras e fungos filamentosos,
possui a desvantagem de ser menos biodisponível no organismo (Chen &
Sorrel, 2007).
• Fluocitosina
Os antifúngicos que inibem a síntese de DNA e RNA têm apenas um
representante a fluocitosina (ou 5-fluocitosina). Esta foi desenvolvida, na
década de 50, como um agente antitumoral. Embora ineficaz para este fim, foi
observada uma atividade antifúngica. Esta molécula é transportada para o
interior de células fúngicas por uma permease específica e, no citoplasma, é
convertida a 5-fluorouracil. Este composto, após ser fosforilado, é incorporado
no RNA e impedindo a síntese protéica. Além disso, este composto fosforilado
é convertido a deoxinucleosideo que, também, irá inibir a síntese de DNA do
fungo (figura 9).
A fluocitosina pode ser convertida a 5-fluorouracil por bactérias
residentes no espaço gastrintestinal. Desta maneira, podem ocorrer efeitos
adversos durante o tratamento como diarréia, náusea e vômito. No Brasil,
devido a este fato e a observação de cepas resistentes a este quimioterápico,
há mais de 15 anos, ela foi retirada do mercado pelo fabricante. O Ministério da
Saúde, em 2006, recomendou, através de um parecer, sua exclusão definitiva.
21
Figura 9: Mecanismo de ação da fluocitosina (adaptado de doctorfungus.org).
• Equinocandinas
A parede celular é fundamental para a viabilidade e a virulência do fungo,
além de servir como um escudo protetor e de preservar a morfologia da célula.
A parede é um local onde há troca de íons, proteínas, assim como metabólitos
do fungo (Levin, 2005). Devido a ausência de parede em células de mamífero,
ela se torna um importante alvo seletivo para a terapia antifúngica.
Os inibidores da parede, as equinocandinas, atuam inibindo a síntese de
β(1,3)-glucana (figura 10), que é um componente essencial na formação da
parede do fungo (Odds, Brown & Gow, 2003). A inibição da enzima desta via
resulta na diminuição deste polímero na célula, tendo por resultado uma parede
defeituosa e fraca, incapaz de suportar o estresse osmótico.
Figura 10: Mecanismo de ação dos quimioterápicos inibidores da síntese de parede
celular (adaptado de doctorfungus.org).
22
• Outros inibidores da síntese de ergosterol
Outro antifúngico utilizado na clínica médica é a terbinafina. Ela faz parte
do grupo das alilaminas e tem como alvo a enzima esqualeno epoxidase, da
biossíntese de ergosterol. Sua formulação pode ser para uso tópico ou oral e é
utilizada no tratamento de onicomicoses e micoses de pele. A sua conjugação
com a anfotericina B ou com azóis já foi descrita no tratamento de infecções
causadas por fungos filamentosos (scedosporiose) (Chen & Sorrel, 2007).
• Novos antifúngicos
A escolha do agente antifúngico para o tratamento de uma micose
depende do local da infecção e estado imune do paciente. Atualmente, devido
aos poucos antifúngicos disponíveis no mercado, houve um aumento de
estudos que visam a busca de novos quimioterápicos (Chen & Sorrel, 2007).
Novas formulações de anfotericina B foram elaboradas de modo a
manter a sua eficácia e diminuir a sua toxicidade. Hoje, além da anfotericina B
deoxicolato, podemos contar com as formulações lipídicas (Chen & Sorrel,
2007). Entretanto, apesar de serem menos tóxicas, elas são mais caras, e
devido ao longo período de tratamento essas formulações se tornam inviáveis.
A segunda geração dos triazóis, derivados do fluconazol e do
itraconazol, vem sendo vista como uma alternativa no tratamento de micoses
invasivas. O voriconazol, derivado do fluconazol, foi aprovado pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) em 2005, este medicamento possui
amplo espectro, onde apenas os Zigomicetos não são sensíveis. O
ravuconazol, também derivado do fluconazol, é uma droga de amplo espectro
e, recentemente, obteve-se sua formulação intravenosa, o que possibilita seu
teste em micoses invasivas. Tem seu potencial semelhante ao do voriconazol,
com o diferencial de apresentar uma longa meia-vida plasmática, o que
possibilitaria um maior espaçamento entre as doses (Pasqualloto & Denning,
2008)
. O posaconazol, derivado do itraconazol, chegou ao mercado em 2008, e
apresenta uma eficácia 10 vezes maior que sua molécula de origem, e é o
único azol a ter atividade contra Zigomicetos. Já o albaconazol, em um estudo
comparativo com cepas de C. neoformans, apresentou 100 vezes mais eficácia
do que o fluconazol, que é a sua molécula de origem (Miller et al., 2004).
23
As novas candinas, como a caspofungina, já comercializada, a
anidulafungina e micafungina, que vêm sendo desenvolvidas apresentam ação,
principalmente, contra Candida spp. e Aspergillus spp. (Bergold & Georgiadis,
2004
).
Alguns medicamentos, que tinham ações contra outros patógenos ou
eram utilizados no tratamento de outras doenças, vêm sendo testados de modo
a avaliar a sua capacidade antifúngica. Alem e Douglas (2004) descreveram a
ação de inibidores de prostaglandinas em biofilmes de Candida albicans.
Azasteróis, que haviam sido testados para Leishmania amazonensis
(Rodrigues et al., 2002), têm sido descritos como tendo ação antifúngica
(Burbiel & Bracher, 2003).
A amiodarona, medicamento utilizado no tratamento de arritmias
cardíacas, já foi descrita como tendo atividade contra espécies de fungo
patogênicas (Courchesne, 2002). Droga antiproliferativa de células tumorais, a
miltefosina, com atividade contra Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi, foi
descrita como tendo atividade antifúngica contra Candida spp., Cryptococcus
spp., Aspergillus spp., Fusarium solani e Scedosporium spp. (Widmer et al.,
2006).
Para auxiliar no tratamento da criptococose no Brasil, atualmente,
contamos com o Consenso em Criptococose (2008). Um documento redigido
por profissionais da área que reuniram dados para melhor descrever os
esquemas terapêuticos a serem realizados. De acordo com o estado imune do
paciente e o órgão atingido diferentes medidas são utilizadas. Geralmente, a
anfotericina B é o medicamento de primeira escolha, seguido de fluconazol. A
utilização destes pode ser conjugada dependendo da forma clínica da doença.
O itraconazol é indicado na manutenção ou quando a infecção for apenas
pulmonar, pois se tratando de uma meningoencefalite, o itraconazol não
consegue penetrar na barreira hemato-encefálica. A utilização da fluocitosina é
citada, porém, com moderação, devido a sua toxicidade.
24
JUSTIFICATIVA
No Estado do Rio de Janeiro pouco se sabe sobre a incidência de
criptococose e suas formas. Na literatura encontram-se, principalmente, três
estudos no Rio de Janeiro o de Gonçalves et al. (1988), que realizaram um
levantamento de 10 casos da literatura no período de 1984 a 1985,
Rozembaum e Gonçalves (1994), que fizeram um levantamento de 171 casos
ocorridos no estado fluminense, e o mais recente, realizado por Leimann e
Koifman (2007), que através da análise do banco de dados da Assessoria de
Meningite, setor do Centro de Vigilância Epidemiológica da Secretaria de
Saúde Estadual do Rio de Janeiro, fizeram o levantamento de casos de
meningite criptocócica no estado.
O estudo epidemiológico através da divulgação dos casos contribui não
apenas nas análises estatísticas, mas também, pode contribuir na tomada de
medidas que viabilizam um diagnóstico mais preciso, um tratamento eficaz e,
possivelmente, uma medida preventiva.
O tratamento da criptococose, atualmente, conta com poucas
alternativas. Devido a relatos de falha terapêutica relacionados à resistência
aos antifúngicos comerciais e a alta toxicidade destes se torna indispensável a
busca de novos quimioterápicos, que tenham como alvo moléculas ou
estruturas exclusivas do patógeno, ou até mesmo uma investigação de
compostos já utilizados na clínica médica para outros fins.
Este estudo visa contribuir para o levantamento epidemiológico da
criptococose no Estado do Rio de Janeiro e buscar novas alternativas para o
tratamento da criptococose causada por C. gattii, descrita como uma infecção
mais severa e de resposta mais tardia aos antifúngicos.
25
OBJETIVOS
A presente dissertação teve como objetivos gerais:
• Realizar o levantamento de dados de criptococose do estado do Rio de
Janeiro atendidos no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (HUCFF/UFRJ);
• Avaliar a atividade antifúngica de diferentes quimioterápicos em cepas de
Cryptococcus gattii.
E como objetivos específicos:
• Estudar o perfil dos casos de criptococose do HUCFF/UFRJ no período de
1995 a 2005;
• Avaliar a presença de cepas de Cryptococcus gattii do conjunto de amostras
de Cryptococcus spp. do Laboratório de Biologia Celular de Fungos do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (LBCF/IBCCF) e do HUCFF/UFRJ;
• Estudar o perfil de expressão da cápsula das cepas identificadas como
Cryptococcus gattii;
• Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) dos inibidores de
ergosterol e de novos compostos para cepas de Cryptococcus gattii;
• Determinar a concentração fungicida mínima (CFM) dos inibidores de
ergosterol e de novos compostos para cepas de Cryptococcus gattii;
• Determinar as associações de quimioterápicos que produzirem os melhores
índices de combinação inibitória fracional (FIC index);
• Avaliar o efeito de diferentes quimioterápicos na morfologia, fisiologia, e
ultraestrutura em cepas de Cryptococcus gattii com o uso de marcadores
fluorescentes para lipídeos neutros e DNA através da microscopia de
fluorescência e em amostras processadas para microscopia eletrônica de
transmissão.
26
MATERIAL E MÉTODOS
1- Levantamento Epidemiológico
O levantamento epidemiológico foi realizado com os casos atendidos no
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio
de Janeiro (HUCFF/UFRJ). Foram utilizadas dados contidos na planilha de
casos de pacientes com criptococose cedidas pelo Dr. Marcio Nucci, professor
adjunto do departamento de Clínica Médica e chefe do Laboratório de
Micologia do HUCFF/UFRJ. Os dados analisados foram: ano da ocorrência,
idade, sexo, doenças pré-existestes, sintomas, tratamento inicial e status após
6 meses. Dos 108 casos atendidos apenas 98 foram submetidos à análise
devido à confiabilidade dos dados apresentados.
Através do programa SPSS Statistical Services foram realizadas as
análises e geração dos gráficos.
2- Identificação das cepas de Cryptococcus spp.
As amostras do fungo Cryptococcus spp. provenientes do HUCFF/UFRJ
e da micoteca do Laboratório de Biologia Celular de Fungos, do Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho (LBCF/IBCCF), foram submetidas ao teste CGB
descrito por Kwon-Chung et al. (1982).
As amostras foram mantidas em meio Ágar Sabouraud e em seguida
incubadas em meio L-canavanina – glicina – azul de bromotimol (CGB). Este
meio apresenta a seguinte composição: 880 mL de água destilada, 100 mL de
solução A (10g de glicina; 1g de fosfato monobásico; 1g de Sulfato de
magnésio; 30mg de sulfato de L-canavanina) e 20 mL de solução B (azul de
bromotimol sódico 0,4%) e 20g de ágar bacteriológico. O inóculo foi semeado
em tubos contendo o meio, incubados a 30°C, por até 7 dias. Após este
período obtemos o resultado semelhante ao da figura 13.
27
Figura 13: Identificação de cepas de Cryptococcus spp. pelo método CGB. Tubo na
esquerda, meio azul, CGB+ indicando a presença de C. gattii. Tubo no meio, meio
CGB sem fungo inoculado. Tudo na direita, meio amarelo, CGB- indicando a presença
de C. neoformans (arquivo pessoal).
3- Amostras
Foram utilizadas 38 amostras de Cryptococcus spp. para a realização do
teste L-canavanina – glicina – azul de bromotimol (CGB). Sendo elas: 5 cepas
American Type Culture Collection (ATCC); 3 isolados cedidos pela Dra. Márcia
Lazéra, do Laboratório de Micologia Médica, Hospital Evandro Chagas,
FIOCRUZ, Rio de Janeiro (LMM/FIOCRUZ); 1 cepa cedida pela Dra. Olga
Fisherman, da Universidade Federal de São Paulo; 5 cepas provenientes de
isolados de Belém cedidos pelo Dr. Cláudio Salgado do Laboratório de
Dermato-Imunologia da Universidade Estadual do Pará (LDI/UEPA); e 24
isolados de pacientes do HUCFF/UFRJ, sendo 20 amostras de pacientes que
foram a óbito devido a infecção fúngica, cedidos pelo Dr. Marcio Nucci.
4- Medição da Cápsula
As cápsulas das diferentes cepas de C. gattii confirmadas pelo teste do
CGB foram analisadas e medidas. Primeiramente, as cepas foram cultivadas
em meio mínimo (Glicose, KH
2
PO
4
, Glicina, MgSO
4
e Tiamina), a 30ºC, por 5
dias. Posteriormente, alíquotas foram retiradas, lavadas e depositadas em
lâminas, juntamente, com uma gota de tinta Índia (nanquim), revestidas por
28
uma lamínula e observadas em microscópio óptico Zeiss Axioplan, acoplado ao
sistema de captura de imagem com a câmera C5810 Hamamatsu.
A medição da cápsula foi feita com o programa Semafore 5.0 (Jeol),
considerando-se o tamanho capsular a distância entre a parede celular e o
limite externo da cápsula. Para obter a média da cápsula de cada cepa foram
analisadas 30 células, e para cada célula foram realizadas 8 medições (figura
14).
Figura 14: Representação das medidas realizadas com o programa Semafore 5.0 para
a obtenção da média da cápsula de cada cepa (arquivo pessoal).
O programa GraphPad Prism foi utilizado para avaliar se a diferença
entre os tamanhos médios das cápsulas de cada cepa eram significativos, e o
teste t foi escolhido para tal análise.
Com o objetivo de avaliar a influência do tratamento dos inibidores de
ergosterol na cápsula do C. gattii, após os testes de susceptibilidade com a
anfotericina B, fluconazol, itraconazol, 22,26-azasterol, epiminolanosterol,
WSP1267 e terbinafina, as células de C. gattii ATCC 32269 foram incubadas
em meio RPMI 1640 na presença ou na ausência do CI
50
de cada inibidor, por
48 horas, a 35ºC. Após esse período, o mesmo protocolo acima foi adotado
para a montagem das lâminas, observação e medição da cápsula. Novamente,
o programa GraphPad Prism foi utilizado para avaliar a significância dos
valores obtidos.
29
5- Drogas
Os inibidores da síntese de ergosterol utilizados nos experimentos foram
anfotericina B (SIGMA), fluconazol (Istarbag Hiconazol, Halex Istar), itraconazol
(SIGMA), terbinafina (SIGMA), 22,26-azasterol e epiminolanosterol (cedidos
pelo pesquisador Dr. Julio Urbina - Caracas, Venezuela), e WSP 1267 (cedido
pelo pesquisador Dr. Ian Gilbert - Cardiff, Reino Unido).
O WSP 1267 é inibidor da esqualeno sintetase. A terbinafina inibe a
enzima esqualeno epoxidase. O fluconazol e o itraconazol têm como alvo a
enzima C14-α demetilase. O 22,26-azasterol e o epiminolanosterol são
inibidores da enzima ∆
24(25)
esterol metiltransferase. A anfotericina B se liga a
própria molécula de ergosterol, causando danos na membrana plasmática
(figura 11).
Figura 11: Etapas da biossíntese do ergosterol indicando onde os quimioterápicos
atuam (adaptado de Ghannoum & Rice, 1999).
Foram utilizados, também, a amiodarona (SIGMA), miltefosina (DI.
CAYMAN), 8 análogos da miltefosina (TC19, TC52, TC70, TC104, TC106,
TC117, TC135 e TCAN26), além de 7 benzoxazinas (TC101, TC127, TC129,
TC130, TC131, TC142 e TC143), sendo estes cedidos pela Dra. Theodora
Calogeropoulou, do Institute of Organic and Pharmaceutical Chemistry,
National Hellenic Research Foundation, Grécia.
A amiodarona, como um medicamento antiarrítmico, age nos canais de
cálcio, potássio e sódio em células de mamífero. A miltefosina, juntamente com
seus análogos, é uma alquilfosfocolina que atua interferindo no metabolismo de
fosfolipídios e as benzoxazinas são compostos ainda sem alvo definido (Figura
12).
30
Figura 12: Estrutura dos 24 compostos utilizados nos ensaios. Quadro 1- Inibidores da
síntese de ergosterol, anfotericina B e amiodarona. Quadro 2- Miltefosina e seus 8
análogos. Quadro 3- Benzoxazinas (arquivo pessoal).
31
Testes de Susceptibilidade - Microdiluição em Caldo
As amostras foram submetidas ao teste de susceptibilidade descrito pelo
documento M27-A3, do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI,
2008). 200µL dos quimioterápicos, previamente diluídos em meio RPMI 1640,
foram distribuídos no primeiro poço de cada fileira de placas de 96 poços de
fundo chato. Em seguida, nos poços restantes, foram adicionados 100µL de
meio RPMI 1640, livre da droga e, com uma pipeta multicanal, foi realizada
uma diluição seriada obtendo as seguintes faixas de concentração: 0,25–
128µg/mL de Fluconazol e Amiodarona; 0,06–32µg/mL de miltefosina, seus 8
análogos e benzoxazinas; 0,03–16µg/mL das demais drogas. As leveduras,
crescidas em ágar Sabouraud, repicadas para meio mínimo e cultivadas por 72
horas, foram ajustadas para a concentração de 5 x 10
3
UFC/mL, em RPMI
1640, e distribuídas em cada poço, com exceção do poço 1, que serviu de
controle de esterilidade do meio e branco para a leitura espectrofotométrica.
Após 48 horas de incubação a 35ºC, foi realizada a leitura visual, onde
analisamos a concentração inibitória mínima (CI), que é a menor concentração
de droga onde não houve crescimento. No tempo de 72 horas, além da
avaliação visual, realizamos a leitura espectrofotométrica, utilizando o leitor
automático de microplacas para ensaios ELISA, Stat Fax 2100 (Awareness
Technology Inc.), no comprimento de onda de 492nm. De acordo com a
absorbância obtida, calculamos a menor concentração capaz de inibir 50% e
90% do crescimento em relação ao controle (CI
50
e CI
90
, respectivamente).
Cada ensaio foi realizado no mínimo 3 vezes, e cada repetição em
duplicada, além de terem sido feitas três leituras espectrofotométrica de cada
teste.
6- Testes de Susceptibilidade - Efeito Fungicida
Após o período de 72 horas de incubação da microdiluição em caldo,
alíquotas de 4µL cada concentração, de cada inibidor, foram retiradas e
plaqueadas em ágar Sabouraud e mantidas a 35ºC, por 48 horas. Após o
período de incubação, foi analisada a menor concentração que não teve
32
crescimento fúngico visível, logo, concentração fungicida mínima (CFM) (figura
15). Cada ensaio foi realizado no mínimo 3 vezes.
Figura 15: Placa com ágar Sabouraud semeado com alíquotas de C. gattii incubadas
na presença de diferentes concentrações das drogas testadas. Círculos em vermelho
representando a CFM (arquivo pessoal).
7- Testes de Susceptibilidade – Checkerboard (Associação de drogas)
Outro teste de susceptibilidade foi realizado com o objetivo de avaliar o
sinergismo entre os inibidores. Para isso foi realizada uma microdiluição
seriada em uma microplaca da droga A na horizontal e da droga B na vertical,
desta forma em cada poço obtemos uma combinação diferente de
concentrações de cada inibidor. Na mesma placa é realizada a diluição seriada
de cada droga sozinha, de modo a obter, além da inibição fúngica devido a
conjugação dos inibidores, o CI
50
da droga sozinha, e de posse desses dados
realizar o cálculo do FICindex.
O FICindex é o índice da concentração inibitória fracionada, ou seja, ele
representa o índice de inibição da combinação de dois inibidores. Ele é feito a
partir do cálculo:
Concentração da droga A na combinação + Concentração da droga B na combinação
CI
50
da droga A sozinha CI
50
da droga B sozinha
O resultado obtido será interpretado respeitando a relação:
33
FICindex < 0,5 = Sinergismo
0,5 < FICindex < 4 = Indiferente
FICindex > 4 = Antagonismo
Esta relação significa que, se na conjugação dos inibidores, a
concentração obtida de cada um deles for 4 vezes menor do que o valor do
CI
50
de cada inibidor sozinho (FICindex < 0,5), estará havendo um sinergismo
entre as drogas. Caso isso não seja verdadeiro, a conjugação dos inibidores
poderá ser indiferente, quando a inibição do crescimento fúngico estiver
ocorrendo apenas por influência de uma das droga, ou ainda, antagonista, caso
na combinação a concentração da droga A e B aumentem em relação ao CI
50
obtido delas sozinhas e forneça um FICindex > 4.
O primeiro ensaio foi realizado com uma cepa de cada grupo (ATCC,
ambiental, Belém, HUCFF/UFRJ) e as combinações realizadas podem ser
vistas na tabela 2. Como comparação, foi realizada a combinação fluconazol e
anfotericina B já descrita na literatura para Cryptococcus spp (Cuenca-Estrella,
2004).
Tabela 1: Combinação do checkerboard dos inibidores de uso clínico com a terbinafina
e do fluconazol com a anfotericina B. Para cada combinação foram realizados no
mínimo 3 ensaios.
Cepa Droga A Droga B
C. gattii ATCC 32269
Fluconazol Anfotericina B
C. gattii HEC40143
C. gattii CGBel5
C. gattii HU20
C. gattii ATCC 32269
Terbinafina
Anfotericina B
ou
Fluconazol
ou
Itraconazol
C. gattii HEC40143
C. gattii CGBel5
C. gattii HU20
Foi realizado, também, o checkerboard utilizando uma cepa de cada
grupo testando o sinergismo da amiodarona com as principais drogas utilizadas
em clínica. Por último, foi realizado o checkerboard do fluconazol com o 22,26-
azasterol, WSP 1267 e epiminolanosterol, porém, este ensaio foi realizado
34
apenas com a cepa C. gattii ATCC 32269, devido a pequena disponibilidade
destas drogas.
Efeito das drogas no acúmulo de lipídios neutros e no núcleo
Após 48 horas de incubação na presença ou ausência do CI
50
da
anfotericina B, fluconazol, itraconazol, 22,26-azasterol, epiminolanosterol, WSP
1267 ou terbinafina, as células foram lavadas, 2 vezes com PBS pH 7,2, e
fixadas, por 30 minutos, com paraformaldeído 4%. Em seguida, para a
marcação com o Nile Red (Fluka), o fixador foi retirado e as células foram
lavadas com PBS pH 7,2, após, foram adicionados 100µL do marcador, na
concentração de 10µg/mL, por 30 minutos. O material em seguida foi lavado
com PBS pH 7,2, para diminuir o background. Após a lavagem, as células
foram aderidas em lamínulas com poli-L-lisina por 2 horas, lavadas 3 vezes
com PBS pH 7,2 e as lâminas foram montadas com N-propil galato e vedadas
com esmalte. Para a marcação com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (SIGMA),
após a lavagem e fixação com paraformaldeído 4%, as células foram lavadas
com PBS pH 7,2, aderidas em lamínulas revestidas com poli-L-lisina e
incubadas com 10µL de DAPI na concentração de 1µg/mL, por 10 minutos. Em
seguida, as lamínulas foram lavadas e as lâminas montadas com N-propil
galato e vedadas com esmalte. As lâminas por fim foram observadas ao
microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan.
8- Efeito das drogas na ultra-estrutura
Após 48 horas de incubação na presença ou ausência do CI
50
da
anfotericina B, fluconazol, itraconazol, 22,26-azasterol, epiminolanosterol, WSP
1267 ou terbinafina, as células foram lavadas 2 vezes com PBS pH 7,2, fixadas
com glutaraldeído tipo II 2,5%, paraformaldeído 4% em tampão cacodilato de
sódio 0,1M, por 1 hora, à temperatura ambiente. Em seguida, as amostras
foram lavadas 3 vezes com tampão cacodilato de sódio 0,1M e pós-fixado com
tetróxido de ósmio 1% e ferrocianeto de potássio 1,25%, durante 2 horas, à
temperatura ambiente no escuro. As células foram, novamente, lavadas no
35
mesmo tampão e, em seguida, desidratadas em concentrações crescentes de
acetona (30%, 50%, 70%, 90%, 100% e duas vezes em 100% seca), por 30
minutos, cada etapa. Após a desidratação, as amostras foram infiltradas
gradativamente com a mistura Spurr: acetona (1:3, 1:2, 1:1, 2:1 e 3:1) e em
seguida com Spurr puro, overnight, em temperatura ambiente. Os materiais
foram incluídos com Spurr e DMAE, por 48 horas, a 60ºC. Os blocos foram
cortados e os cortes ultrafinos coletados em grades de cobre, contrastados em
acetato de uranila 5%, por 45 minutos, e citrato de chumbo, por 5 minutos. A
observação foi feita no microscópio eletrônico Zeiss 900 acoplado a câmera
CCD (Mega view III, Soft Image System) e as imagens processadas no
programa iTEM (Soft Image System).
36
RESULTADOS
1- Epidemiologia
1.1 - Incidência de Criptococose
Foram 98 os casos de pacientes com criptococose atendidos no Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho/UFRJ, no período de 1995 a 2005. 50%
ocorreram no período de 1995 a 1997 e outros 50% entre 1998 e 2005 (figura
16).
Incidência de Criptococose
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Ano
Porcentagem de Casos
Figura 16: Gráfico da incidência de casos de Criptococose atendidos no HUCFF/UFRJ
no período de 1995 a 2005.
1.2 - Doenças Pré-Existentes
A criptococose por se tratar de uma doença que atinge, principalmente,
pacientes imunocomprometidos, foi observada uma grande incidência de casos
no HUCFF/UFRJ em pacientes HIV+ (75%). Apenas 3% eram pacientes
imunocompetentes. Neste período, também, foram relatados casos de
criptococose em pacientes com: crescimento tecidual maligno nos linfonodos,
linfoma de não-Hodgkin (7%); transplantados (6%); apresentando neoplasia
(3%); doença auto-imune, Lupus (2%); acumulação anormal de células
infecciosas (granulomas) em diferentes órgãos, Sarcoidose (2%); e diabetes
37
(2%). A figura 17 representa as doenças pré-existentes neste grupo de
pacientes.
Doença de Base
0
10
20
30
40
50
60
70
80
I
m
un
oc
om
p
ete
nt
e
AID
S
Linfoma não-Hodgkin
Transplantado
Tu
m
or
Lupus
Sa
rc
oid
o
se
D
ia
be
te
s
Porcentagem dos Casos
Figura 17: Gráfico da presença ou ausência de doenças de base de pacientes com
criptococose atendidos no HUCFF/UFRJ no período de 1995 a 2005.
1.3 - Incidência de criptococose em pacientes portadores e não
portadores do vírus HIV.
A análise da incidência da criptococose em pacientes HIV+ e HIV- no
período estudado mostrou que no período de 1995 a 1997, em média, foram
atendidos 14 casos/ano de pacientes HIV+. No período seguinte, de 1998 a
2005, foram atendidos em média 4 casos/ano de pacientes HIV+, e no ano de
2003 não houve relatos de criptococose no HUCFF/UFRJ em pacientes
soropositivos (figura 18).
38
Incidência de Pacientes HIV+ e HIV- por Ano
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Ano
Porcentagem de Casos
HIV - HIV +
Figura 18: Gráfico da incidência de casos de Criptococose atendidos no
HUCFF/UFRJ, no período de 1995 a 2005, entre pacientes portadores e não
portadores do vírus HIV.
1.4 - Faixa Etária
A avaliação dos indivíduos com criptococose do HUCFF/UFRJ
demonstrou que 54% destes estavam na faixa de 21 a 40 anos.
Faixa Etária
0
10
20
30
40
50
60
0 - 20 21 - 40 41- 60 > 60
Porcentagem dos Casos
Figura 19: Gráfico da faixa etária dos pacientes com criptococose atendidos no
HUCFF/UFRJ no período de 1995 a 2005.
39
1.5 - Incidência entre os sexos
Dos 98 pacientes com criptococose atendidos no HUCFF/UFRJ, 70
eram homens, caracterizando 71% dos casos, e 28 mulheres, 29% dos casos
como mostra a figura 20.
Incidência entre os sexos
Masculino
71%
Feminino
29%
Figura 20: Incidência entre os sexos dos casos de criptococose atendidos no
HUCFF/UFRJ no período de 1995 a 2005.
1.6 - Principais Manifestações Clínicas
Dentre as manifestações relatadas pelos pacientes, as onze mais
comuns estão destacadas na figura 21. A principal manifestação foi o
comprometimento cerebral, presente em 88% dos pacientes. Logo em seguida
a febre, onde 76% dos pacientes apresentavam este sintoma, e cefaléia, 70%
dos casos. O comprometimento pulmonar também foi representativo (55% dos
casos), assim como comprometimento dos olhos e da pele (34% e 22%,
respectivamente). As manifestações menos comuns foram: problemas na
marcha, cegueira, papiledema (inchaço no disco óptico devido a pressão
intracraniana) e comprometimento dos ossos e articulações.
40
Principais Manifestações
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Envolvimento Cerebral
Feb
r
e
C
efaleia
Envolvimento Pulmonar
N
á
us
e
a ou vô
mi
to
Co
mp
ro
me
timen
t
o do
s
O
l
h
os
Envolvimento da Pele
P
r
ob
l
e
ma
s na Mar
c
ha
C
eg
u
ei
r
a
Papi
l
e
d
ema
Envolv
im
ento dos Ossos e Art
i
culaç
õ
es
Porcentagem dos Casos
Figura 21: Gráfico das principais manifestações entre os pacientes com criptococose
do HUCFF/UFRJ no período de 1995 a 2005.
1.7 - Tratamento Aplicado
A análise do tratamento aplicado revela que o antifúngico de primeira
escolha após a primeira manifestação foi anfotericina B em 84% dos casos,
seguida de fluconazol em 13%.
Tratamento Inicial
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Anfotericina B Fluconazol Outro
Porcentagem dos Casos
Figura 22: Antifúngico de primeira escolha para o tratamento dos casos de
criptococose no HUCFF/UFRJ no período de 1995 a 2005.
41
1.8 - Progressão dos casos
Durante seis meses após a primeira manifestação, os casos foram
acompanhados de modo a avaliar a sua progressão em relação ao tratamento.
A figura 23 demonstra o quadro do paciente após seis meses do diagnóstico da
infecção fúngica. Em 55% dos casos, os pacientes se encontravam vivos sem
evidência de infecção, porém, em 26% foram a óbito pela criptococose.
Status após 6 meses da Manifestação
Óbito, devido a
outra causa
11%
Vivo, com
infecção ativa
8%
Óbito, devido a
infecção
26%
Vivo, sem
evidência de
infecção
55%
Figura 23: Status dos pacientes com criptococose atendidos no HUCFF/UFRJ no
período de 1995 a 2005 após seis meses de diagnóstico da criptococose.
2- Identificação das Espécies
Das 38 amostras analisadas 11 foram positivas para o teste do meio
CGB (CGB+), sendo classificadas como Cryptococcus gattii e 27 foram
negativas (CGB-), sendo, então, classificadas como Cryptococcus neoformans
(tabela 5). Em relação as 14 cepas do LBCF/IBCCF, 6 eram CGB + e 8 CGB -.
Das amostras provenientes do HUCFF/UFRJ, 20 eram C. neoformans e
apenas 4 C. gattii. As 20 amostras de C. neoformans foram isoladas de 17
pacientes que foram a óbito devido a criptococose e apenas uma amostra de
C. gattii foi isolada de um paciente imunocompetente. Porém, para as demais
amostras de C. gattii, não foi possível obter informações sobre estado clínico
dos pacientes.
42
Tabela 5: Resultado do CGB com cepas de Cryptococcus spp. do Laboratório de
Biologia Celular de Fungos, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ e
do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da UFRJ. CGB + representa C. gattii
e CGB – C. neoformans. Linhas em cinza representam cepas controle, cuja espécie já
foi identificada e bem estudadas por diferentes autores.
Cepa
CGB
Cryptococcus gattii ATCC 24065
+
Cryptococcus neoformans ATCC 28957
-
Cryptococcus gattii ATCC 32269
+
Cryptococcus gattii ATCC 56990
+
Cryptococcus gattii CN 23/10993
+
Cryptococcus neoformans T
1
444
-
Cryptococcus neoformans HEC 3393
-
Cryptococcus gattii HEC 40143
+
Cryptococcus neoformans CAP 67
-
Cryptococcus sp. BEL1
-
Cryptococcus sp. BEL2
-
Cryptococcus sp. BEL3
+
Cryptococcus sp. BEL4
-
Cryptococcus sp. BEL5
+
Cryptococcus sp. HU 1
-
Cryptococcus sp. HU 2
-
Cryptococcus sp. HU 3
-
Cryptococcus sp. HU 4a*
-
Cryptococcus sp. HU 4b*
-
Cryptococcus sp. HU 4c*
-
Cryptococcus sp. HU 6
-
Cryptococcus sp. HU 7
-
Cryptococcus sp. HU 8
-
Cryptococcus sp. HU 9
-
Cryptococcus sp. HU 10
-
Cryptococcus sp. HU 11
-
Cryptococcus sp. HU 12
-
Cryptococcus sp. HU 13
-
Cryptococcus sp. HU 14
-
Cryptococcus sp. HU 15
-
Cryptococcus sp. HU 16a*
-
Cryptococcus sp. HU 16b*
-
Cryptococcus sp. HU 17a*
-
Cryptococcus sp. HU 17b*
-
Cryptococcus sp. HU 18
+
Cryptococcus sp. HU 19
+
Cryptococcus sp. HU 20
+
Cryptococcus sp. HU 21
+
* Amostras a, b e c pertencem ao mesmo paciente, porém, isolados de locais diferentes.
3- Análise da Expressão da Cápsula
Após identificar as cepas de C. gattii, estas foram submetidas a ensaios
para medição de suas cápsulas. Os resultados podem ser observados na
tabela 6.
43
Tabela 6: Média e desvio padrão em micrometros (µm) do tamanho da cápsula de
cada cepa do fungo C. gattii.
Cepa
Média (µ
µµ
µm)
Desvio Padrão
Expressão*
Cryptococcus gattii ATCC 24065
1,98 ± 0,74
++
Cryptococcus gattii ATCC 32269
4,49 ± 1,36
+++
Cryptococcus gattii ATCC 56990
1,49 ± 0,30
+
Cryptococcus gattii CN 23/10993
1,79 ± 0,44
++
Cryptococcus gattii HEC 40143
2,48 ± 0,81
++
Cryptococcus gattii CG Bel3
1,57 ± 0,60
+
Cryptococcus gattii CG Bel5
3,02 ± 1,14
++
Cryptococcus gattii HU 18
4,03 ± 0,70
+++
Cryptococcus gattii HU 19
4,08 ± 0,67
+++
Cryptococcus gattii HU 20
3,98 ± 0,50
+++
Cryptococcus gattii HU 21
3,65 ± 0,70
+++
*Critério subjetivo comparativo de expressão de cápsula entre as cepas. (+) baixa expressão,
(++) média expressão e (+++) alta expressão.
Apesar da ausência de uma correlação entre o tamanho da cápsula e
origem das amostras, as cepas provenientes dos pacientes do HUCFF/UFRJ
tiveram maior nível de expressão quando comparadas com as cepas do
LBCF/IBCCF.
4- Testes de Susceptibilidade aos diferentes quimioterápicos
4.1 - Microdiluição em caldo e efeito fungicida dos inibidores da síntese
de ergosterol
Os resultados do teste de susceptibilidade dos seguintes inibidores:
Anfotericina B, Fluconazol, Itraconazol, 22,26-Azasterol, Epiminolanosterol,
WSP 1267 e Terbinafina, podem ser vistos na tabela 7. Nela pudemos observar
as concentrações em microgramas por mililitro (µg/mL) capazes de inibir 50% e
90% do crescimento em relação ao controle (CI
50
e CI
90
, respectivamente) de
cada cepa do fungo C. gattii frente a cada inibidor.
Os resultados do ensaio do efeito fungicida dos mesmos inibidores
podem ser vistos na tabela 8, onde observamos a concentração fungicida
mínima (CFM) de cada inibidor com cada cepa de C. gattii.
44
Tabela 7: Concentração inibitória mínima (CI) de cada droga para cada cepa de C. gattii.
Concentração (µ
µµ
µg/mL)
Anfotericina B
Fluconazol
Itraconazol
22,26
-
Azasterol
EIL
WSP 1267
Terbinafina
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
C. gattii
ATCC 24065
0,06 0,50 4,00 8,00 0,25 1,00 8,00 >16,00 2,00 4,00 1,00 2,00 0,25 1,00
C. gattii
ATCC 32269
0,12 1,00 4,00 8,00 0,25 1,00 4,00 16,00 2,00 4,00 1,00 4,00 0,25 1,00
C. gattii
ATCC 56990
0,12 0,50 2,00 8,00 1,00 2,00 4,00 16,00 4,00 16,00 0,25 1,00 0,25 1,00
C. gattii
CN23/10993
0,06 0,25 0,25 2,00 0,06 0,25 2,00 8,00 2,00 4,00 1,00 2,00 0,50 1,00
C. gattii
HEC 40143
0,06 0,25 2,00 4,00 0,12 1,00 2,00 8,00 <0,03 0,03 0,50 2,00 0,12 0,50
C. gattii
CG Bel 3
0,12 0,25 8,00 16,00 2,00 8,00 8,00 16,00 4,00 8,00 2,00 4,00 1,00 2,00
C. gattii
CG Bel 5
0,25 0,50 2,00 4,00 1,00 4,00 8,00 >16,00 2,00 4,00 1,00 2,00 0,50 2,00
C. gattii
HU 18
1,00 4,00 1,00 8,00 0,12 0,25 16,00 >16,00 4,00 8,00 1,00 2,00 0,50 1,00
C. gattii
HU 19
1,00 4,00 1,00 8,00 0,06 0,25 8,00 16,00 1,00 4,00 1,00 2,00 0,50 1,00
C. gattii
HU 20
1,00 2,00 1,00 8,00 0,12 0,50 16,00 >16,00 0,50 4,00 1,00 2,00 0,50 1,00
C. gattii
HU 21
1,00 8,00 2,00 4,00 0,25 1,00 >16,00 >16,00 >16,00 >16,00 1,00 2,00 0,50 2,00
*resultado da média de três ensaios
4
4
45
Tabela 8: Concentração fungicida mínima (CFM) de cada droga para cada cepa de C. gattii.
CFM (µ
µµ
µg/mL)
Anfotericina B
Fluconazol
Itraconazol
22,26
-
Azast
erol
EIL
WSP 1267
Terbinafina
C. gattii
ATCC 24065
0,50 8,00 2,00 16,00 16,00 4,00 4,00
C. gattii
ATCC 32269
0,50 8,00 1,00 16,00 >16,00 4,00 2,00
C. gattii
ATCC 56990
1,00 8,00 4,00 16,00 >16,00 4,00 1,00
C. gattii
CN 23/10993
0,25 4,00 2,00 16,00 4,00 8,00 2,00
C. gattii
HEC 40143
0,25 4,00 0,50 2,00 0,12 2,00 1,00
C. gattii
CG Bel 3
1,00 32,00 16,00 >16,00 >16,00 16,00 16,00
C. gattii
CG Bel 5
1,00 64,00 4,00 >16,00 8,00 8,00 2,00
C. gattii
HU 18
8,00 32,00 0,50 >16,00 16,00 4,00 2,00
C. gattii
HU 19
16,00 16,00 0,50 >16,00 8,00 2,00 2,00
C. gattii
HU 20
4,00 32,00 0,50 >16,00 16,00 8,00 >16,00
C. gattii
HU 21
8,00 16,00 1,00 >16,00 >16,00 >16,00 >16,00
4
5
46
Na tabela 9 é mostrada a porcentagem cumulativa do CI
50
para cada
inibidor em cada concentração para as 11 cepas de C. gattii testadas. Esta
tabela resume a eficácia destes quimioterápicos em concentrações inferiores a
16µg/mL.
Tabela 9: Porcentagem cumulativa do CI
50
de cada inibidor para as 11 cepas de C.
gattii.
Inibidores
Porcentagem cumulativa do CI
50
(µ
µµ
µg/mL) de:
>0,03
0,03
0,06
0,12
0,25
0,50
1,00
2,00
4,00
8,00
16,00
Anfotericina B
0 0 0 18 36 45 63 72 91 100 100
Fluconazol
0 0 0 0 9 9 36 81 91 100 100
Itraconazol
0 0 18 54 72 81 91 100 100 100 100
22,26-Azasterol
0 0 0 0 0 0 0 18 36 72 91
WSP1267
0 0 0 0 9 18 91 100 100 100 100
Epiminolanosterol
9 9 9 9 9 18 27 63 91 91 91
Terbinafina
0 0 0 9 36 91 100 100 100 100 100
4.2 - Microdiluição em caldo da Amiodarona
Por se tratar de um composto pouco solúvel em DMSO e água, a
amiodarona em altas concentrações precipita, prejudicando a leitura
espectrofotométrica. Porém, os resultados podem ser vistos na tabela 10 e
figura 24. As precipitações podem ser observadas a partir de concentrações de
64 e 128µg/mL (região vermelha no gráfico da figura 24), porém, ao analisar os
poços contendo essas diluições em microscópio óptico invertido observamos
redução de crescimento fúngico em relação ao controle.
47
Tabela 10: Concentração inibitória mínima (CI) da amiodarona para cada cepa
de C. gattii.
Concentração (µ
µµ
µg/mL)
Amiodarona
CI
50
CI
90
C. gattii
ATCC 24065
16,00 >32,00
C. gattii
ATCC 32269
8,00 >32,00
C. gattii
ATCC 56990
32,00 >32,00
C. gattii
CN23/10993
32,00 >32,00
C. gattii
HEC 40143
4,00 8,00
C. gattii
CG Bel 3
16,00 32,00
C. gattii
CG Bel 5
>32,00 >32,00
C. gattii
HU 18
>32,00 >32,00
C. gattii
HU 19
>32,00 >32,00
C. gattii
HU 20
>32,00 >32,00
C. gattii
HU 21
>32,00 >32,00
Amiodarona
0
20
40
60
80
100
Controle 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128
Concentração (
µ
µµ
µ
g/mL)
Porcentagem de Inibição
ATCC 24065
ATCC 32269
ATCC 56990
CN 23/10993
HEC 40143
CGBel3
CGBel5
HU 18
HU 19
HU 20
HU 21
Figura 24: Gráfico da porcentagem de inibição de crescimento de cada cepa frente a
diferentes concentrações de Amiodarona (0,25 a 128µg/mL). Região em vermelha:
concentrações onde houve precipitação da droga.
48
4.3 - Microdiluição em caldo e efeito fungicida da Miltefosina, seus
análogos e benzoxazinas
4.3.1 – Seleção de drogas com atividade contra C. gattii - Screening
A cepa de C. gattii ATCC 32269 foi escolhida para o screening de modo
a selecionar qual(is) droga(s) dentre as 16 (miltefosina, 8 análogos e 7
benzoxazinas)
teria(m) um efeito inibitório satisfatório (<16µg/mL). Os
resultados podem ser observados na tabela 11.
As drogas selecionadas estão em cinza, e todas elas apresentaram
concentração fungicida mínima <16µg/mL. Pode-se observar que o valor da
CI
50
, CI
90
e CFM, quando obtidos, são similares, revelando o caráter fungicida
destas drogas.
Tabela 11: Concentração inibitória mínima (CI) e concentração fungicida mínima
(CFM) de cada droga para a cepa de C. gattii ATCC 32269.
Concentração (µ
µµ
µg/mL)
CI
50
CI
90
CFM
Análogos de
Fosfolipídios
Miltefosina
1,00 2,00 2,00
TC19
0,50 1,00 1,00
TC52
>32,00 >32,00 >32,00
TC70
2,00 4,00 4,00
TC104
>32,00 >32,00 >32,00
TC106
>32,00 >32,00 >32,00
TC117
>32,00 >32,00 >32,00
TC135
32,00 >32,00 >32,00
TCAN26
0,50 1,00 4,00
Benzoxazinas
TC101
>32,00 >32,00 >32,00
TC127
>32,00 >32,00 >32,00
TC129
>32,00 >32,00 >32,00
TC130
>32,00 >32,00 >32,00
TC131
(*) 8,00 8,00
TC142
>32,00 >32,00 >32,00
TC143
>32,00 >32,00 >32,00
(*) Não foi possível determinar o CI
50
.
4.3.2 - Microdiluição em caldo e efeito fungicida com todas as cepas
Os resultados do teste de susceptibilidade e do efeito fungicidas dos
seguintes compostos: Miltefosina, TC19, TC70, TCAN26 e TC131, podem ser
vistos na tabela 12 e 13, respectivamente. Nela podemos observar as
concentrações em microgramas por mililitro (µg/mL) capazes de inibir 50% e
49
90% do crescimento em relação ao controle (CI
50
e CI
90
, respectivamente) e as
concentrações fungicidas mínimas de cada droga com cada cepa de C. gattii.
Para alguns compostos não foi possível determinar a CI
50
porque o
fungo crescia até certa concentração e na concentração superior reduzia
drasticamente seu crescimento, chegando muitas vezes a ter crescimento zero,
representando 90 ou 100% de inibição.
Tabela 12: Concentração inibitória mínima (CI) de cada droga para cada cepa de C.
gattii.
Concentração (µ
µµ
µg/mL)
Mi
l
tefosina
TC19
TC70
TC
AN26
T
C131
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
CI
50
CI
90
C. gattii
ATCC 24065
(*) 1,00 (*) 1,00 (*) 4,00 (*) 1,00 (*) 8,00
C. gattii
ATCC 32269
(*) 1,00 (*) 1,00 (*) 4,00 0,50 1,00 (*) 8,00
C. gattii
ATCC 56990
(*) 1,00 (*) 1,00 (*) 2,00 (*) 0,50 (*) 16,00
C. gattii
CN23/10993
(*) 1,00 (*) 1,00 (*) 1,00 (*) 1,00 (*) 4,00
C. gattii
HEC 40143
(*) 1,00 (*) 1,00 1,00 2,00 (*) 0,50 (*) 4,00
C. gattii
CG Bel 3
(*) 1,00 (*) 1,00 2,00 4,00 (*) 0,50 (*) 8,00
C. gattii
CG Bel 5
(*) 2,00 (*) 1,00 (*) 4,00 (*) 1,00 (*) 8,00
C. gattii
HU 18
(*) 2,00 1,00 2,00 0,25 0,50 (*) 1,00 (*) 8,00
C. gattii
HU 19
(*) 2,00 (*) 2,00 (*) 8,00 (*) 1,00 (*) 8,00
C. gattii
HU 20
(*) 1,00 (*) 1,00 (*) 4,00 0,50 1,00 (*) 8,00
C. gattii
HU 21
(*) 2,00 (*) 1,00 (*) 4,00 (*) 0,50 8,00 16,00
(*) Não foi possível determinar o CI
50
.
Tabela 13: Efeito fungicida de cada droga para cada cepa de C. gattii.
CFM (µ
µµ
µg/mL)
Mi
l
tefosina
TC19
TC70
TCAN26
TC131
C. gattii
ATCC 24065
2,00 1,00 4,00 1,00 8,00
C. gattii
ATCC 32269
4,00 1,00 4,00 1,00 16,00
C. gattii
ATCC 56990
2,00 2,00 2,00 0,50 32,00
C. gattii
CN 23/10993
2,00 1,00 2,00 1,00 4,00
C. gattii
HEC 40143
2,00 1,00 2,00 0,50 8,00
C. gattii
CG Bel 3
2,00 1,00 4,00 0,50 8,00
C. gattii
CG Bel 5
4,00 2,00 8,00 2,00 >32,00
C. gattii
HU 18
4,00 2,00 1,00 1,00 >32,00
C. gattii
HU 19
4,00 2,00 16,00 1,00 >32,00
C. gattii
HU 20
2,00 1,00 8,00 1,00 >32,00
C. gattii
HU 21
4,00 1,00 4,00 0,50 >32,00
50
Curiosamente, o TC131, a única benzoxazina que foi eficaz, não
apresentou efeito fungicida para as cepas provenientes do HUCFF/UFRJ nas
concentrações testadas.
A tabela 14 demonstra a porcentagem cumulativa do CI
90
deste grupo de
inibidores nas diferentes concentrações.
Tabela 14: Porcentagem cumulativa do CI
90
de cada inibidor para as 11 cepas de C.
gattii.
Inibidores
Porcentagem cumulativa do CI
9
0
(µ
µµ
µg/mL) de:
0,03
0,06
0,12
0,25
0,50
1,00
2,00
4,00
8,00
16,00
Miltefosina
0 0 0 0 0 63 100 100 100 100
TC19
0 0 0 0 0 91 100 100 100 100
TC70
0 0 0 0 9 18 36 91 100 100
TCAN26
0 0 0 0 36 100 100 100 100 100
TC131
0 0 0 0 0 0 0 18 82 100
4.4 - Associação de drogas - Checkerboard
4.4.1 - Fluconazol associada a Anfotericina B e Terbinafina associada a
Anfotercina B, Fluconazol ou Itraconazol.
Os resultados do checkerboard podem ser observados na tabela abaixo.
Nesta tabela vemos o FICindex e as concentração de cada droga desta
combinação. Os dados apresentados são os menores FICindex obtidos com os
ensaios realizados.
Tabela 15: Concentrações de menor FICindex de cada combinação realizada entre a
terbinafina e os antifúngicos de uso clínico.
Cepa
FICindex (Concentração A (µ
µµ
µg/mL)/Concentração B (µ
µµ
µg/mL))
Flu/Anf
B
Terb/ AnfB
Terb/ Flu
Terb/ Itra
C. gattii ATCC 32269
0,62 (2,00/0,12)
I
0,51 (0,01/0,50)
I
0,27 (0,03/0,50)
S
0,49 (0,25/0,06)
S
C. gattii HEC40143
-/- -/- 0,24 (0,06/0,25)
S
0,75 (0,25/0,25)
I
C. gattii CGBel5
0,53 (2,00/0,06)
I
0,36 (0,12/0,03)
S
0,62 (0,25/0,50)
I
0,26 (0,06/1,00)
S
C. gattii HU 20
1,00 (2,00/0,50)
I
1,00 (0,06/1,00)
I
0,50 (0,25/1,00)
S
0,50 (0,25/1,00)
S
-/- não foi possível determinar o CI
50
de alguma droga
S- Sinergismo
I- Indiferente
51
4.4.2 - Fluconazol associada ao 22,26-Azasterol, WSP 1267 ou
Epiminolanosterol
Os resultados do ensaio de checkerboard do Fluconazol com 22,26-
Azasterol, WSP 1267 ou Epiminolanosterol com a cepa C. gattii ATCC 32269
podem ser vistos na tabela 16. Nela podemos observar a concentração de
cada droga seguida do FICindex desta combinação. Os dados apresentados
são os menores FICindex obtidos.
Tabela 16: Concentrações de menor FICindex de cada combinação realizada entre o
fluconazol e os candidatos a antifúngicos.
Cepa
FICindex (Concentração A (µ
µµ
µg/mL)/Concentração B (µ
µµ
µg/mL))
Flu/Aza
Flu/ WSP
Flu/ EIL
C. gattii ATCC 32269
0,75 (2,00/1,00)
I
1,00 (4,00/0,01)
I
0,18 (0,25/0,25)
S
S- Sinergismo
I- Indiferente
4.4.3 - Amiodarona associada ao Fluconazol ou Anfotericina B
Os resultados do checkerboard podem ser observados na tabela 17.
Nesta tabela vemos o FICindex e a concentração de cada droga desta
combinação. Os dados apresentados são os menores FICindex obtidos nos
ensaios. Não foi possível obter o CI
50
da Amiodarona para todas as cepas,
CGBel5 e HU20, desta forma, o cálculo do FICindex se tornou inviável.
Tabela 17: Concentrações de menor FICindex de cada combinação realizada entre a
amiodarona e os antifúngicos de uso clínico.
Cepa
FICindex (Concentração A (µ
µµ
µg/mL)/Concentração B (µ
µµ
µg/mL))
Amio/AnfB
Amio/ Flu
C. gattii ATCC 32269
0,75 (2,00/0,25)
I
0,50 (2,00/1,00)
S
C. gattii HEC40143
0,56 (1,00/0,03)
I
0,50 (1,00/0,25)
S
C. gattii CGBel5
-/- -/-
C. gattii HU 20
-/- -/-
-/- não foi possível determinar o CI
50
da amiodarona
S- Sinergismo
I- Indiferente
52
5- Medição da Cápsula de Células Tratadas
As células de C. gattii após sofrerem tratamento por 48 horas com o CI
50
da anfotericina B, fluconazol, itraconazol, 22,26-azasterol, WSP 1267,
epiminolanosterol ou terbinafina foram submetidas a ensaios para medição da
cápsula. Os resultados podem ser observados na figura 25, e a média da
expressão e o desvio padrão das medidas estão representado na tabela 18.
Com exceção, da anfotericina B, todos os tratamentos tenderam a um aumento
de expressão de cápsula significativo (p<0,005).
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
Controle Anfotericina B Fluconazol Itraconazol 22,26-Azasterol EIL WSP 1267 Terbinafina
Tamanho da capsula (
µ
µ
µ
µ
m)
Figura 25: Gráfico com o tamanho das expressões de cápsula em micrometros (µm)
de células de C. gattii ATCC 32269 incubadas por 48h na presença ou ausência do
inibidor. (*) diferença significativa em relação ao controle (p<0,005).
Tabela 18: Média e desvio padrão em micrometros (µm) do tamanho da cápsula da
cepa C. gattii ATCC 32269 incubada por 48h na presença ou ausência do inibidor.
Aumento percentual da expressão da cápsula em relação ao controle.
Cepa Média Desvio Padrão
Aumento
percentual
C. gattii ATCC 32269 Controle
1,47 ± 0,60
0
C. gattii ATCC 32269 com Anfotericina B
1,58 ± 0,54 7
C. gattii ATCC 32269 com Fluconazol
2,37 ± 0,90 61
C. gattii ATCC 32269 com Itraconazol
2,07 ± 0,66 41
C. gattii ATCC 32269 com 22,26- Azasterol
2,25 ± 0,79 53
C. gattii ATCC 32269 com Epiminolanosterol
2,36 ± 0,89 61
C. gattii ATCC 32269 com WSP 1267
1,76 ± 0,56 20
C. gattii ATCC 32269 com Terbinafina
1,91 ± 0,72 30
*
*
*
*
*
*
53
6- Efeito das drogas no acúmulo de lipídios neutros e no núcleo
6.1 – Marcação para núcleo (DAPI)
Os resultados da incubação das células com CI
50
dos inibidores da
síntese do ergosterol ou ligante da molécula de ergosterol e marcados com
DAPI podem ser vistos na figura 26. Observamos que o tratamento com as
drogas levou ao surgimento de células anucleadas (figura 26-B, D, E e F),
células com mais de um núcleo (figura 26-H) e núcleos mais alongados (figura
26-C e G). Além destas alterações, notamos mudanças na morfologia da
célula, alargamento do brotamento (figura 26-B, C e E), e na presença de
epiminolanosterol, observamos células bem alongadas (figura 26-F).
6.2 – Marcação para lipídios neutros (Nile Red)
Após a marcação com Nile Red pudemos observar um aumento da
presença de lipídios neutros em vesículas após o tratamento com os inibidores
da biosíntese e ligante da molécula de ergosterol (figura 27). Novamente,
observamos drásticas alterações morfológicas, como alongamento celular
(figura 27-F) e aparente perda do conteúdo citoplasmático (figura 27-E).
54
Figura 26: Microscopia óptica de fluorescência, marcação com DAPI da cepa de C. gattii ATCC 32269. Células incubadas por 48h na ausência
do inibidor (A); Células incubadas por 48h com o CI
50
de anfotericina B (B), fluconazol (C), itraconazol (D), 22,26-azasterol (E),
epiminolanosterol (F), WSP 1267 (G) e terbinafina (H). Células sem núcleo (seta), região de brotamento alargado (seta cheia), núcleo
alongado (cabeça de seta), dois núcleos (asterístico). Barras – 1µm.
5
4
55
Figura 27: Microscopia óptica de fluorescência, marcação com Nile Red da cepa de C. gattii ATCC 32269. Células incubadas por 48h na
ausência do inibidor (A); Células incubadas por 48h com o CI
50
de anfotericina B (B), fluconazol (C), itraconazol (D), 22,26-azasterol (E),
epiminolanosterol (F), WSP 1267 (G) e terbinafina (H). Barras – 1µm.
5
5
56
7- Efeito das drogas na ultra-estrutura
Após avaliar a susceptibilidade da cepa de C. gattii ATCC 32269 frente
aos inibidores da síntese de ergosterol e do ligante da molécula de ergosterol,
esta foi processada para microscopia eletrônica de transmissão.
A parede celular é uma estrutura que se mantém preservada durante
todo o processamento e de fácil observação por ser eletrondensa. Com isso,
através da análise das micrografias pudemos notar que a parede celular das
células tratadas com os inibidores se mostrava com aspecto mais frouxo
quando comparada com a das células controle, além de apresentar fissuras e
rompimentos (figura 28-C, D, E e figura 30-D).
Outros efeitos puderam ser observados em células tratadas com as
drogas, principalmente na membrana plasmática, que se apresentou
desprendida da parede celular e possíveis invaginações (figura 28-B, C e D,
figura 29-A, C e D e figura 30-C).
Apesar da dificuldade de se observar estruturas internas de leveduras
devido ao aspecto denso do citoplasma, após o tratamento com fluconazol,
itraconazol ou terbinafina pudemos notar grande concentração de mitocôndrias
(figura 28-E e figura 30-D).
As células tratadas com 22.26-azasterol, WSP1267 e terbinafina
apresentaram um maior acúmulo de grânulos eletron-densos (figura 29-A,
figura 30-A e D). Foi possível observar o acúmulo de vacúolos eletron-lucentes
no interior do citoplasma, principalmente, quando tratadas com
epiminolanosterol (figuira 29-D). Alterações no brotamento também foram
vistas (figura 30-B). Notamos, também, que muitas células tratadas se
mostravam com aspecto amorfo e algumas com conteúdo citoplasmático
extraído (figura 29-B).
Alterações na cápsula puderam ser observadas, onde células tratadas
com os quimioterápicos apresentavam uma cápsula menos organizada e mais
frouxa (figura 28-C e figura 30-C) quando comparada com as células controle
(figura 28-A).
57
Figura 28: Microscopia eletrônica de transmissão de cepa de C. gattii ATCC
32269. Célula incubada por 48h na ausência do inibidor (A); Célula incubada por 48h
com o CI
50
de anfotericina B (B e C), fluconazol (D e E), itraconazol (F). Cápsula (c),
parede celular (p), mitocôndria (m), detalhe da membrana celular (seta), detalhe da
parede celular (cabeça de seta). Barras – 1µm, Barras no inset – 0,5 µm.
58
Figura 29: Microscopia eletrônica de transmissão de cepa de C. gattii ATCC
32269. Célula incubada por 48h com o CI
50
de 22,26-azasterol B (A e B),
epiminolanosterol (C e D). Cápsula (c), parede celular (p), mitocôndria (m), vacúolos
(v), detalhe de invaginações na membrana celular (seta). Barras – 1µm, barras no
inset – 0,5 µm.
59
Figura 30: Microscopia eletrônica de transmissão de cepa de C. gattii ATCC
32269. Célula incubada por 48h com o CI
50
de WSP 1267 (A e B), terbinafina (C e D).
Cápsula (c), parede celular (p), mitocôndria (m), grânulos (g), detalhe da membrana
celular (seta), detalhe do brotamento (seta cheia), rompimento celular com
extravasamento do conteúdo citoplasmático (cabeça de seta). Barras – 1µm, barras no
inset – 0,5 µm.
60
DISCUSSÃO
A análise dos resultados obtidos dos dados dos prontuários de pacientes
do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do
Rio de Janeiro (HUCFF/UFRJ), no período de 1995 a 2005, identificou 98
casos de criptococose. O período de maior incidência foi entre 1995 e 1997,
nestes 3 anos concentraram-se 50% dos casos atendidos. Como era de se
esperar o número de pacientes imunocomprometidos ou com doenças pré-
existentes representaram 97% dos casos, sendo a sua maioria pacientes HIV+.
No ano de 1995, dos 18 casos atendidos, 13 eram HIV+. Entretanto, em
1997 ocorreu a maior incidência em pacientes HIV+ (16 casos). Após este ano,
o número total de casos diminuiu, assim como em pacientes soropositivos
(<7% ao ano). Do ano de 1997 para o ano de 1998, houve uma redução de
56% dos casos, essa redução pode estar relacionada com a introdução da
terapia anti-retroviral (TARV). Em 1996, o Brasil adotou a política de fornecer
medicamentos da TARV a todos pacientes HIV+ gratuitamente, e só a partir de
1997 os resultados desta medida puderam ser observados (Dourado et al.,
2006). A TARV é um coquetel de medicamentos que tem como objetivo reduzir
a morbidade, mortalidade e melhorar a qualidade de vida de pacientes
soropositivos, por meio da supressão viral. Este fato permite retardar ou evitar
o surgimento da imunodeficiência. Desta forma, com a melhora imunológica
dos pacientes, a incidência de doenças oportunistas neste grupo diminuiu.
Além disso, já foi demonstrado que inibidores da aspartil peptidase, utilizados
na TARV, possuem ação contra espécies de fungo diminuindo a sua
patogenicidade (Palmeira et al., 2008).
Dos casos levantados, a sua maioria estava entre a faixa de 21 a 40
anos. Se levarmos em consideração que a maior parte dos casos são em
pacientes HIV+ e que a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é
contraída através de relação sexual sem proteção, transfusão de sangue e
objetos perfuro-cortantes contaminados é, justamente, nesta faixa etária que se
concentra o grupo de risco de contrair o vírus (Brasil, 2006) e desta forma,
futuramente, contrair a criptococose. Os pacientes acima de 40 anos, em sua
maioria, também eram pacientes HIV+, porém, nesta faixa etária se
61
concentram pacientes com outras doenças de base (17 pacientes dos 22
apresentavam diabetes, lupus, câncer, outra doença ou foram transplantados).
A maior incidência de criptococose está entre os homens, e novamente
uma explicação plausível seria a de que estes representariam um grupo de
maior risco de contrair o vírus HIV (Brasil, 2006). Nos 74 casos analisados de
pacientes HIV+, 57 eram homens.
Pela criptococose ser uma doença que atinge, primeiramente, os
pulmões, há um grande número de pacientes com envolvimento pulmonar.
Porém, como muitas vezes esse envolvimento se dá de forma assintomática,
apenas 11% dos pacientes apresentavam dor torácica e 26% dispnéia (dados
não mostrados). A disseminação do fungo no organismo do hospedeiro,
freqüentemente acomete outros órgãos, principalmente o sistema nervoso
central. Nos casos levantados, podemos observar que grande parte dos
pacientes apresentava um comprometimento cerebral, e estes se queixavam,
principalmente, de dores de cabeça. Poucos relatavam convulsões, confusão
mental, déficit de memória ou tontura.
Outros sintomas como febre, náusea e vômito, também, foram relatos,
porém, nenhum destes são sintomas específicos da doença. O
comprometimento dos olhos, em 34 pacientes, evoluiu para uma cegueira em
26% destes. As lesões cutâneas, também, relatadas na literatura como
características desta doença, foram observadas em 23 pacientes. Problemas
na marcha e nas articulações não foram significativamente observados nos
pacientes do HUCFF/UFRJ.
O Consenso em Criptococose, divulgado em 2008, recomenda o uso da
anfotericina B como antifúngico de primeira escolha, tanto para casos de
criptococose em pacientes imunocomprometidos como para os
imunocompetentes. Porém, mesmo antes desse consenso a prática brasileira
utilizava este antifúngico como estratégia de tratamento. Podemos observar
que dos pacientes atendidos do HUCFF/UFRJ, 84% dos casos tiveram a
anfotericina B como medicamento de primeira escolha. O fluconazol por ser um
antifúngico de fácil penetração na barreira hemato-encefálica, também, foi
utilizado como primeiro tratamento, porém, em menor escala (13%).
Após o período de seis meses, 55% dos pacientes dos casos avaliados,
tiveram êxito com o tratamento e se encontraram livres da infecção, porém,
62
26% foram a óbito. Estes dados corroboram os dados de mortalidade descritos
na literatura mundial da criptococose que varia de 10 a 25%, chegando a 30 a
60% (Mitchell & Perfect, 1995). Quando comparado com os dado no Brasil,
onde é descrito uma incidência de óbito de 45 a 65% (Pappalardo & Melhem,
2003), observamos que os resultados do HUCFF/UFRJ são inferiores.
Das amostras do período de 1995 a 2005 submetidas a identificação,
apenas uma foi CGB+, ou seja, era C. gattii, e conseqüentemente, 20 amostras
eram C. neoformans. A amostra CGB + se tratava do isolado de um paciente
imunocompetente Extrapolando os dados, elevando a freqüência obtida para
todo espaço amostral, teríamos que dentre os 98 pacientes analisados 95%
dos casos de criptococose teriam sido causados por C. neoformans, e somente
5% por C. gattii.
Todas as amostras ATCC, previamente descritas como C. gattii, foram
CGB+ nos 3 ensaios, assim como a amostra C. neoformans conhecida foi
CGB-, dando credibilidade e reprodutibilidade a técnica.
Após identificar as cepas, apenas as pertencentes à espécie C. gattii
foram selecionadas para dar continuidade aos experimentos da presente
dissertação. No total foram 11 cepas, provenientes de pacientes do
HUCFF/UFRJ, isolados da FIOCRUZ/RJ e da UFPA. Por se tratar de uma
levedura encapsulada, o primeiro ensaio realizado foi a medição da cápsula.
Sabe-se que o Cryptococcus sp. possui um tamanho celular entre 5-
20µm e sua cápsula pode chegar a medir 30µm em condições favoráveis para
tal crescimento. Porém, o tamanho da cápsula pode variar entre espécies e até
mesmo dentro de uma mesma amostra, como foi observado no presente
experimento.
Os valores médios da expressão da cápsula das cepas de C. gattii foram
diferentes entre si e variaram entre 1,49µm a 4,49µm. Cepas do mesmo grupo
de isolados ATCC, ambientais, de Belém e de pacientes do HUCFF/UFRJ não
apresentaram um perfil semelhante entre si. Com raras exceções, a expressão
da cápsula possuiu diferença significativa entre as amostras (p<0,0001). As
cepas isoladas de pacientes apresentaram os maiores valores de expressão
quando comparada as cepas de isolados ambientais. Entretanto, a cepa ATCC
32269 foi a que apresentou maior expressão. Esta cepa mesmo tendo sido
mantida em laboratório durante um longo período, parece não ter perdido suas
63
característica de virulência representada pela cápsula. Porém, a menor
expressão também foi observada em uma cepa ATCC (C. gattii ATCC 56990).
Por mais que a cápsula seja uma proteção a fatores ambientais externo, as
maiores expressões são observadas in vivo, enfatizando a função de virulência
desta estrutura.
Os efeitos inibitórios de diferentes quimioterápicos e compostos que se
encontravam ou não em comercialização foram avaliados. Inicialmente, foram
19 inibidores, dentre eles, 4 antifúngicos já utilizados em clínica médica e 15
candidatos a quimioterápicos. O resultado deste screening revelou que apenas
7 possuíam efeitos inibitórios satisfatórios, ou seja, CI
50
<16µg/mL.
Os inibidores selecionados que tem como alvo o ergosterol foram: a
anfotericina B, que atua na própria molécula de ergosterol; os triazóis
(fluconazol e itraconazol), que atuam na síntese do ergosterol na enzima C14α-
demetilase; o 22,26-azasterol e o epiminolanosterol, que agem na ∆
24-25
esterol
metiltransferase; o WSP1267 que atua na esqualeno sintetase; e por fim, a
terbinafina, que também atua na síntese de ergosterol, porém, na enzima
esqualeno epoxidase. Como podemos observar, cada inibidor atua em
diferentes etapas da via até chegar à molécula de ergosterol ou se ligando a
própria molécula, como a anfotericina B.
Os resultados obtidos com estes inibidores revelam, na sua maioria,
uma concentração inibitória mínima de 50% (CI
50
) inferior a 16µg/mL.
Resultado este satisfatório, já que os estudos com novos azóis utilizam
concentração menores ou iguais a 16µg/mL. Com exceção da cepa de C. gattii
HU20 que não mostrou CI
50
inferior a esta concentração para o 22,26-azasterol
e epiminolanosterol, as outras cepas foram susceptíveis in vitro.
Os antifúngicos de primeira escolha (anfotericina B e fluconazol) se
mostraram eficazes com todas as amostras, porém, ao analisarmos as
amostras do HUCFF/UFRJ observamos uma possível resistência a anfotericina
B. Esse perfil pode ser explicado pelo tratamento prévio que estas amostras
receberam. Por terem sido isoladas de pacientes que faziam o uso de
anfotericina B, estas cepas podem ter adquirido uma possível resistência ao
antifúngico, fazendo com que o seu CI
50
fosse mais elevado quando
comparado as cepas estocadas no laboratório.
64
Entre os azóis, o itraconazol se mostrou o mais eficaz, inibindo 72% das
cepas com valores de CI
50
inferiores a 1µg/mL. Já o fluconazol, apenas uma
cepa apresentou CI
50
menor que 1µg/mL. Infelizmente, o itraconazol não tem
sua penetração facilitada na barreira hemato-encefálica, desta forma, não
sendo um antifúngico indicado para o tratamento da meningite criptocócica.
As amostras de C. gattii ATCC, ambientais e de Belém tiveram o CI
50
para o 22,26-azasterol semelhantes ao do fluconazol, entre 2 e 8µg/mL.
Entretanto, as amostras provenientes do HUCFF/UFRJ foram mais sensíveis
ao fluconazol do que ao 22,26-azasterol.
O WSP1267, quando comparado com o epiminolanosterol e 22,26-
azasterol, teve resultados mais satisfatórios. O CI
50
em 72% das amostras foi
de 1µg/mL. Para o epiminolanosterol o CI
50
foi em torno de 2-4µg/mL, menor
do que o 22,26-azasterol que tem como alvo a mesma enzima.
A cepa mais sensível a todos os tratamentos foi a HEC40143, sendo
extremamente susceptível ao epiminolanosterol, no qual inibiu seu crescimento
até na menor concentração utilizada no ensaio (0,03µg/mL).
A terbinafina, antifúngico utilizado no tratamento micoses cutâneas,
também, se mostrou bastante eficaz frente as cepas de C. gattii estudadas. É
sabido que a criptococose, também, causa lesões cutâneas, principalmente, a
infecção causada por C. gattii e, através deste ensaio de susceptibilidade,
podemos sugerir a terbinafina para o tratamento destas lesões. O CI
50
obtido
por esse antifúngico foi semelhante ao do itraconazol, ou seja, em
concentrações inferiores a 1µg/mL foi possível inibir 50% do crescimento de
todas as cepas.
Os resultados referentes à concentração fungicida mínima estão
relacionados com a capacidade fungicida de cada quimioterápico. Sabe-se que
os azóis têm efeito fungistático, porém, as alilaminas (terbinafina) e os
poliênicos (anfotericina B) possuem efeito fungicida.
Os resultados obtidos na presente dissertação mostraram que tanto para
os quimioterápicos com efeito fungicida, quanto para os que possuíam efeito
fungistático, os valores de CFM foram próximos ao CI
90
obtido pela
microdiluição seriada. Os valores da CFM eram, em média, uma ou duas
concentrações acima da CI
90
,
65
O inibidor que apresentou menor efeito fungicida foi o 22,26-Azasterol,
pois em 54% dos casos não foi possível obter a CFM, ao contrário da
anfotericina B que, por possuir ação fungicida, se mostrou a mais eficaz neste
quesito.
O itraconazol, mesmo sendo considerado um antifúngico fungistático,
apresentou um efeito fungicida. Todas as cepas testadas obtiveram CFMs
baixos, com exceção da cepa C. gattii CGBel3. Para as cepas do
HUCFF/UFRJ esse inibidor teve um efeito fungicida melhor do que a
anfotericina B, assim como ocorreu na microdiluição em caldo, e novamente a
explicação para este fato pode ser o tratamento prévio das cepas dos
pacientes. Entretanto, é importante salientar que no tratamento de uma
meningoencefalite causada por Cryptococcus sp. a utilização deste agente é
limitada, devido a sua baixa biodisponibilidade e difícil penetração na barreira
hemato-encefálica.
A terbinafina apresentou ação fungicida, porém, duas cepas do
HUCFF/UFRJ não foram sensíveis a esta ação. Os inibidores WSP1267 e
Epiminolanosterol, apesar de possuírem valores de CI
50
baixos, não
apresentaram efeito fungicida relevante.
Com o objetivo de avaliar o sinergismo dos inibidores de ergosterol foi
realizado o checkerboard. É descrito na literatura um efeito indiferente na
combinação entre anfotericina B e azóis in vitro, porém, in vivo essa
combinação seria eficaz (Cuenca-Estrella, 2004). Em todos os testes
realizados nesta dissertação, os resultados obtidos revelaram que a
conjugação da anfotericina B e fluconazol foi indiferente para as cepas de C.
gattii, ou seja, apenas um quimioterápico estava atuando na inibição. O mesmo
ocorreu com a maioria das combinações realizadas. Apenas a combinação de
terbinafina e fluconazol para as cepas de C. gattii ATCC 32269, HEC40143 e
HU20 obteve bons resultados, apresentando FICindex<0,5. Assim como a
combinação de terbinafina e itraconazol para as cepas ATCC32269, CGBel5 e
HU20. A conjugação da terbinafina e anfotericina B apresentou sinergismo
somente para a cepa CGBel5. Nenhuma combinação testada apresentou
antagonismo, ou seja, um FICindex>4.
Devido a pouca disponibilidade de certos inibidores, foi realizado
somente um ensaio de checkerboard entre fluconazol, 22,26-azasterol,
66
WSP1267 e epiminolanosterol com a cepa C. gattii ATCC 32269. O resultado
obtido foi indiferente para fluconazol com 22,26-azasterol e fluconazol com
WSP 1267. Porém, a combinação do fluconazol e epiminolanosterol revelou o
FICindex mais baixo de todos os experimentos (0,18). Esses dois
quimioterápicos atuam em etapas distintas da via de síntese de ergosterol.
Apesar do 22,26-azasterol ter ação na mesma enzima que o epiminolanosterol,
só este último teve resultado satisfatório no ensaio do checkerboard,
diminuindo seu CI
50
em 4 vezes e o CI
50
do fluconazol em 8. Entretanto, como
foi apenas um ensaio, não podemos afirmar que este resultado seja
significativo.
A amiodarona é um antiarrítmico que atua bloqueando os canais de
potássio. Esta droga já foi descrita como tendo uma atividade antifúngica
contra Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus
neoformans, Fusarium oxysporum e Aspergillus nidulans (Courchesne, 2002).
Esta atividade antifúngica está relacionada com a possível interação desta
droga com o influxo de cálcio nas células (Muend & Rao, 2008). O cálcio
desempenha diversos papéis no metabolismo do fungo, sendo o ciclo celular
um dos mais importantes, e a partir do momento que este se torna menos
disponível no meio é desencadeada a morte celular (Zhang & Rao, 2007).
Os resultados com a amiodarona contra cepas de C. gattii não foram os
esperados. Em primeiro lugar, por se tratar de uma droga com baixa
solubilidade, ao ser diluída para a realização dos ensaios de microdiluição em
caldo, houve precipitação nas concentrações mais elevadas, que prejudicaram
a leitura espectrofotométrica. Em segundo lugar, altas concentrações da droga
não foram capazes de inibir o crescimento em todas as cepas. E em terceiro,
não foi observado efeito fungicida como descrito na literatura (Muend & Rao,
2008).
Nas concentrações onde houveram as precipitações, após o período de
72 horas de incubação, foi realizada a leitura visual com o auxílio de um
microscópio invertido. Foi observada uma inibição de crescimento em relação
ao controle, porém, em nenhuma cepa chegou a 100%. O ensaio do efeito
fungicida, também, foi realizado, porém, não foi possível obter a CFM com
nenhuma das 11 cepas de C. gattii. Mesmo com esses resultados, foi realizado
o checkerboard combinando a amiodarona com os principais antifúngicos da
67
clínica médica, anfotericina B e fluconazol. Apenas a combinação da
amiodarona com fluconazol apresentou efeito sinérgico, mas não para todas as
cepas, somente para a cepa ATCC 32269 e a ambiental HEC40143. A
combinação desta droga com o poliênico teve resultado indiferente para essas
duas cepas, e a para a cepa de Belém CGBel 5 e do HUCFF/UFRJ HU20 não
foi possível efetuar o cálculo do FIC index, pois o CI
50
não foi obtido.
Dentre os grupos de drogas testados nesta dissertação temos a
miltefosina, juntamente com seus análogos, e as benzoxazinas. A miltefosina é
um análogo de lisofosfolipídios (LPAs), e compõe uma ampla classe de
compostos metabolicamente estáveis, que foram desenvolvidos para o
tratamento do câncer há mais de duas décadas (Wieder et al., 1999).
Atualmente, vem sendo observada que este composto tem uma ação contra
Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi, assim como ação antifúngica em alguns
fungos patogênicos (Tong et al., 2007). Em fungos, o seu mecanismo de ação
parece estar relacionado com a inibição da fosfolipase B, enzima que está
ligada a virulência destes micro-organismos (Widmer et al, 2006).
Os resultados com esses compostos foram bastante promissores. O
screening inicial revelou que das 16 drogas testadas, a miltefosina, três
análogos (TC19, TC70 e TCAN26) e uma benzoxazina (TC131) tiveram ação
inibitória contra C. gattii satisfatória (<16µg/mL). Estes 5 compostos, também,
apresentaram ação fungicida em concentrações inferiores a 16µg/mL.
O ensaio com todas as cepas de C. gattii manteve o mesmo perfil de
inibição para esses 5 compostos selecionados, e é curioso notar que muitos
compostos partem da inibição 0 para 100%, ou seja, até certa concentração
não é observado nenhum efeito inibitório, porém, na concentração superior
observamos 100% de inibição do crescimento. Esta inibição está, intimamente,
relacionada com a concentração fungicida. Os valores de CI
90
e CFM
observados para os LPAs foram semelhantes - 0,5 - 4,0 µg/mL - porém, a
concentração de 1,0 µg/mL foi a mais freqüente. A benzoxazina, quando
comparada com os LPAs, foi menos eficaz, pois sua CI
90
foi entre 4,0 –
16µg/mL e para as cepas do HUCFF/UFRJ e em uma cepa de Belém não foi
possível determinar a CFM. Pela falta de disponibilidade destes compostos não
68
foi possível dar prosseguimento aos testes, como por exemplo, o checkerboard
com os antifúngicos utilizados em clínica.
Para avaliarmos a expressão da cápsula do fungo Cryptococcus sp.
incubamos em meio mínimo por 5 dias a 28ºC, porém, para avaliarmos os
efeitos do quimioterápico no tamanho da cápsula, o protocolo precisou ser
alterado. Então, após incubar o fungo na presença ou ausência do inibidor em
meio RPMI 1640 por 48 horas em 35ºC – de modo a simular a temperatura in
vivo e padronizar os parâmetros previamente estabelecidos para os testes de
susceptibilidade – alíquotas foram retiradas e observadas em microscópio
óptico obtendo os resultados vistos na figura 25.
O primeiro dado a ser analisado foi o tamanho da cápsula da cepa
escolhida para o teste, C. gattii ATCC 32269, em relação ao ensaio de medição
da cápsula após o crescimento por 5 dias em meio mínimo. Observamos que o
tamanho da cápsula, no experimento em meio RPMI 1640, reduziu em 67%.
Essa diferença pode ser explicada tanto pelo tempo de incubação quanto pela
composição do meio. Estudos mostram que os polissacarídeos capsulares são
secretados e em seguida incorporados à cápsula já existente, e ao longo do
tempo, devido a essa incorporação, o tamanho capsular aumenta (McFadden,
Zaragoza, & Casadevall, 2006). É sabido, que o meio de cultivo influencia no
tamanho da cápsula e quanto mais rico este for em nutrientes menor é a
expressão de cápsula. Zaragoza e Casadevall (2004), demonstraram por um
trabalho sobre a modulação da expressão da cápsula que em meio contendo
excesso de glicose, pH mais elevado ou maior quantidade de fonte de carbono
o crescimento capsular era inibido. O mesmo pode estar ocorrendo com o meio
mínimo e o RPMI 1640. O meio mínimo é composto por glicose e apenas um
aminoácido e o pH ajustado para 5,5, enquanto o RPMI 1640 tem pH 7,2, 20
aminoácidos, 0,2% de glicose, além de uma suplementação com diferentes
vitaminas e minerais. Desta forma, a diferença dos resultados obtidos nos
diferentes experimentos já era esperada.
Nosanchuk et al. (1999), demonstraram que a expressão de cápsula de
C. neoformans é afetada durante o tratamento com anfotericina B e fluconazol.
O nosso objetivo foi avaliar se essa alteração ocorria em C. gattii tratados com
os inibidores da síntese de ergosterol. Com os resultados obtidos podemos
observar que há um aumento da expressão da cápsula das células tratadas. A
69
análise estatística revelou que a diferença entre o tamanho da cápsula do
controle e das células tratadas com fluconazol, itraconazol, 22,26-azasterol,
epiminolanosterol, WSP1267 e terbinafina é significativa (p<0,005). Os
aumentos foram entre 20-61%, e através desses dados podemos sugerir que
as células de C. gattii ao sofrerem um estresse do tratamento com inibidores de
ergosterol aumentaram a sua expressão de cápsula como forma de proteção.
Apesar de apresentar um aumento não significativo, as células tratadas com
anfotericina B também aumentaram a expressão de cápsula.
Todas as células tratadas com os quimioterápicos anfotericina B,
fluconazol, itraconazol, 22,26-azasterol, epiminolanosterol, WSP1267 e
terbinafina, apresentaram marcação para lipídios neutros aglomerados em
vacúolos no interior das leveduras. O controle, também, apresentou uma
marcação, porém, mais fraca e mais difusa quando comparada aos tratados,
isso se deve por causa da presença natural de lipídios neutros no interior da
célula (Greenspan, Mayer & Fowler, 1985). Porém, quando observamos as
células tratadas vimos um aumento de marcações compartimentadas,
raramente difusas.
Quando observamos as células tratadas com os inibidores e marcadas
com DAPI, notamos a presença de dois núcleos, células sem núcleo e núcleos
alongados. Todas essas alterações estavam ausentes nas células controles.
Essas alterações são indícios, que além de alterar a síntese de ergosterol,
esses inibidores estão influenciando no ciclo celular de C. gattii. O ciclo celular
em Cryptococcus spp., primeiro se dá pela formação do brotamento, seguido
da migração nuclear, divisão nuclear e por fim a divisão celular (Yamaguchi et
al., 2007). A presença de células com 2 núcleos levam a crer que apesar da
sinalização da divisão celular ocorrer, não está havendo a formação do
brotamento, ou pode ser que esteja ocorrendo a divisão celular antes da
migração e divisão do núcleo devido a presença de células sem núcleo.
Dados similares foram observados com Candida spp. quando tratadas
com estes inibidores e em seguida submetidas ao mesmo protocolo de
marcação com Nile Red e DAPI (Ishida et al., 2009).
Com a microscopia de fluorescência, também, pudemos observar melhor
a morfologia da célula devido ao processamento menos agressivo. Desta forma
notamos que as células tratadas aparentavam perda do seu conteúdo
70
citoplasmático, ao contrário do controle. As células tratadas com
epiminolanosterol demonstraram um alongamento, semelhantes a pseudo-
hifas. Já é descrito na literatura que células de Cryptococcus sp. são capazes
de filamentar quando submetidas a estresse (Neilson, Iven & Bulmer, 1978).
Sendo a droga um fator estressante, a presença de pseudo-hifas seria
plausível. É descrito, também, que estas formas filamentosas são menos
virulentas quando comparadas com as leveduras encapsuladas (Neilson,
Fromtling & Bulmer, 1981), desta forma, podemos sugerir que o tratamento
com as drogas está tornando as células menos virulentas.
Outra alteração notada foi em relação ao brotamento, estes se
apresentavam mais largos que os brotamentos vistos nas células controle,
indício que estas drogas estariam afetando a divisão celular do fungo.
Com a microscopia eletrônica de transmissão, pudemos notar que as
células controle apresentavam membranas plasmáticas íntegras, ao contrário
das células que foram incubadas com os inibidores da síntese de ergosterol.
Observamos com clareza o desprendimento da membrana plasmática da
parece celular em células tratadas, assim como a presença de invaginações. É
importante salientar as alterações na parede celular. Mesmo se tratando de
drogas que atuam na síntese da membrana, foi possível observar uma parede
celular danificada e mais frouxa quando comparada com as células controle,
que apresentavam uma parede celular bem compacta.
Não podemos descartar que o processamento de amostras para
microscopia eletrônica de transmissão com o uso de solventes orgânicos e
fixadores químicos pode favorecer a extração da cápsula, tanto das células
controle quanto das tratadas. Porém, observamos que os polissacarídeos da
cápsula das células tratadas com anfotericina, fluconazol e terbinafina se
apresentam mais frouxamente organizados em relação ao controle.
Notamos, também, a presença de vacúolos eletron-lucentes nestas
amostras, que podem corresponder aos corpos lipídicos observados na
microscopia de fluorescência, e a presença do acúmulo de grânulos eletron-
densos, ausentes no controle que não conseguimos ainda identificar.
Devido à densidade do citoplasma das células controle de C. gattii,
poucas organelas podem ser observadas, porém, após o tratamento com os
inibidores observamos mitocôndrias, estruturas membranares e grande
71
fragmentação do conteúdo intracelular. Também, observamos a presença de
células sem conteúdo citoplasmático e aquelas que sofreram lise celular,
ocorrendo então, um extravasamento do conteúdo intracelular.
Atualmente, contamos com poucos antifúngicos para o tratamento de
micoses sistêmicas. Além de possuírem um alto custo, eles requerem um longo
período de uso e quanto maior a exposição a estes, maiores são os efeitos
colaterais e as chances de selecionar cepas resistentes. Os resultados
demonstrados nesta dissertação vêm reforçar a importância de serem
estudadas novas drogas com novos alvos terapêuticos.
72
CONCLUSÕES
Após a análise dos resultados, a presente dissertação nos permite
concluir que:
• A criptococose é uma doença de grande incidência no Rio de Janeiro e
devido a maior ocorrência em pacientes com Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (AIDS) com a introdução da terapia anti-
retroviral (TARV) houve uma queda no número de casos desta infecção,
sendo significativa no ano de 1997 para 1998;
• A anfotericina B foi o antifúngico de primeira escolha na maioria dos
casos, levando a cura em 37% dos pacientes, porém a taxa de
mortalidade desta doença foi alta nos pacientes analisados, mas abaixo
dos dados brasileiros e compatíveis com os dados internacionais;
• As cepas provenientes do HUCFF/UFRJ foram as menos sensíveis ao
tratamento da anfotericina B, porém o itraconazol se mostrou mais eficaz
dentre os 7 inibidores de ergosterol testados, mas no tratamento da
meningoencefalite criptocócica o seu uso é limitado devido a baixa
biodisponibilidade;
• O epiminolanosterol foi mais eficaz que o 22,26-azasterol, mesmo
atuando na mesma enzima;
• A terbinafina, mesmo não sendo usada no tratamento da criptococose,
se mostrou eficaz in vitro;
• A amiodarona não apresentou resultados satisfatórios com as cepas de
C. gattii, além de precipitar em altas concentrações, nem todas as cepas
apresentaram CI
50
;
• A miltefosina, TC19, TC70, TCAN26 e TC131, apresentaram não apenas
efeitos inibitórios, mas também efeitos fungicidas em concentrações
inferiores a 32µg/mL;
• A associação da terbinafina com fluconazol e itraconazol teve efeito
sinérgico ao contrário da associação do fluconazol e anfotericina B.
Porém, a combinação mais promissora foi entre fluconazol e
73
epiminolanosterol, que apresentou o FIC index mais baixo (0,18), ou
seja, apresentou sinergismo;
• Células de C. gattii apresentaram uma maior expressão de cápsula ao
serem incubadas com os inibidores de ergosterol;
• Os inibidores de ergosterol, além de atuarem na membrana plasmática,
influenciaram no ciclo celular, fazendo com que ocorresse divisão celular
sem núcleo e divisão nuclear sem brotamento;
• Estes mesmos quimioterápicos alteraram não apenas a membrana,
formando invaginações e membranas mais frouxas, eles, também,
alteraram a estrutura da parede celular, cápsula, causaram lise celular,
extravasamento do conteúdo citoplasmático e induziram a formação de
corpos lipídicos;
• Devido a essas evidências os novos compostos testados são potenciais
candidatos a antifúngicos no tratamento da criptococose causada por
C. gattii.
74
REFERÊNCIAS
AIRES, E. M. Dor em pacientes HIV-positivos hospitalizados: aspectos clínicos
e terapêuticos. Dissertação de Mestrado - Coordenação dos Institutos de
Pesquisa da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. São Paulo,
2002.
ALEM, M. A. S.; DOUGLAS, L. J. D. Effects of Aspirin and Other Nonsteroidal
Anti-Inflammatory Drugs on Biofilms and Planktonic Cells of Candida
albicans biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Jan. 2004;
48: 41-47.
BERGOLD, A. M.; GEORGIADIS, S. New Antifungic Drugs: A Review. Visão
Acadêmica. 2004; 5: 159 -172.
BRASIL. Ministério da Saúde. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em
Saúde. Programa Nacional de DST e Aids. Boletim Epidemiológico -
Aids e DST. Brasília, 2006.
BUCHANAN, K. L.; MURPHY, J.W. What Makes Cryptococcus neoformans a
Pathogen? Emerging Infectious Diseases. 1998; 4: 71-83.
BURBIEL, J.; BRACHER, F. Azasteroids as antifungals. Steroids. 2003; 68:
587-594.
CHAYAKULKEEREE, M.; PERFECT, J. R. Cryptococcosis. Infectious Disease
Clinics of North American. 2006; 20: 507–544.
CHEN, S. C. A.; SORRELL, T. C. Antifungal Agents. Medical Journal of
Australia. 2007; 187.
CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of
Yeasts; Approved Standard - Third Edition. CLSI document M27-A3.
Clinical and Laboratory Standards Institute. 2008; 28.
75
CORRÊA, M. P. S. C.; OLIVEIRA, E. C.; DUARTE, R. R. B. S.; PARDAL, P. P.
O.; OLIVEIRA, F. M.; SEVERO, C. L. Criptococose em crianças no
estado do Pará, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical. 1999; 32: 505-508.
COURCHESNE, W. E. Characterization of a novel, broad-based fungicidal
activity for the antiarrhythmic drug amiodarone. Journal of Pharmacology
and Experimental Therapeutics. 2002; 300: 195-199.
CUENCA-ESTRELLA, M. Combinations of antifungal agents in therapy–what
value are they? Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2004; 54: 854-
869.
DARZÉ, C.; LUCENA, R.; GOMES, I.; MELO, A. Características clínicas
laboratoriais de 104 casos de meningoencefalite criptocócica. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 2000; 33: 21-26.
DEL VALLE, L.; PIÑA-OVIEDO, S. HIV disorders of the brain; pathology and
pathogenesis. Frontiers in Bioscience. 2006; 11: 718-732.
DOURADO, I.; VERAS, M. A. S M; BARREIRA, D.; BRITO, A. M. AIDS
epidemic trends after the introduction of antiretroviral therapy in Brazil.
Revista Saúde Pública. 2006; 40: 9-17.
DUNCAN, C.; STEPHEN, C.; CAMPBELL, J. Clinical characteristics and
predictors of mortality for Cryptococcus gattii infection in dogs and cats of
southwestern British Columbia. The Canadian Veterinary Journal. 2006;
47: 993-998.
FRANZOT, S. P.; SALKIN, I. F.; CASADEVALL, A. Cryptococcus neoformans
var. grubii: separate varietal status for Cryptococcus neoformans
serotype A isolates. Journal of Clinical Microbiology. 1999; 37: 838-840.
76
GHANNOUM, M. A.; RICE, L. B. Antifungal Agents: Mode of Action,
Mechanisms of Resistance, and Correlation of These Mechanisms with
Bacterial Resistance. Clinical Microbiology Reviews. 1999; 12: 501-517.
GONÇALVES, A. J. R.; ROZEMBAUM, R.; CUNHA, R. Q.; MENEZES, J. A.;
CLEMENTE, H.; MAGALHÄES, A.; PINTO, A. M. M.; LAZERA, M.;
VIEIRA, A. R. M.; ARTILLES, N.; PÉCEGO, M. M.; LONDERO, A. T.
Cryptococcosis in the State of Rio de Janeiro: report of 10 cases and
review of the literature. Arquivos Brasileiros de Medicina. 1988; 62: 395-
8.
GREENSPAN, P.; MAYER E. P.; FOWLER S. D. Nile Red: A Selective
Fluorescent Stain for Intracellular Lipid Droplets. The Journal of Cell
Biology. 1985; 100: 965-973.
GRUPO DO CONSENSO DE CRIPTOCOCOSE. Consenso em criptococose –
2008. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 2008; 41:
524-544.
HAMILTON, J. R.; NOBLE, A.; DENNING, D. W.; STEVENS, D. A.
Performance of Cryptococcus Antigen latex Agglutination Kits on Serum
and Cerebrospinal Fluid Specimens of AIDS Patients before and after
Pronase Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 1991; 29: 333-339.
HULL, C. M.; HEITMAN, J. Genetics of Cryptococcus neoformans. Annual
Review of Genetics. 2002; 36:557-615.
ISHIDA, K.; RODRIGUES, J. C. F.; RIBEIRO, M. D.; VILA, T. V. M.; SOUZA,
W.; URBINA, J. A.; NAKAMURA, C. V.; ROZENTAL, S. Growth inhibition
and ultrastructural alterations induced by Delta24(25)-sterol
methyltransferase inhibitors in Candida spp. isolates, including non-
albicans organisms. BioMed Central Microbiology. 2009; 9: 74.
77
JULIANO, R. S.; SOUZA, A. I.; SCHEIDE, R. Criptococose Felina. Revista de
Patologia Tropical. 2006; 35: 65-70.
KRITSKI, A. L.; RIOS-GONÇALVES, A.; ROZENBAUM, R.; ARTUS, M. C.;
NOGUEIRA, S. A.; ANDRADE, E. M.; CLEMENTE, H. Criptococose do
sistema nervoso central. Relato de seis casos e revisão da literatura.
Revista Brasileira de Neurologia. 1986; 22: 171-178.
KWON-CHUNG, K. J.; BENNETT, J. E.; THEODORE, T. S. Cryptococcus
bacillisporus sp. nov.: Serotype B-C of Cryptococcus neoformans. Int J
Syst Bacteriol. 1978; 28: 616-620.
KWON-CHUNG, K. J.; BOEKHOUT, T.; FELL, J. W.; DIAZ, M. Proposal to
conserve the name Cryptococcus gattii against C. hondurianus and C.
bacillisporus (Basidiomycota, Hymenomycetes, Tremellomycetidae).
Taxon. 2002; 51: 804-806.
KWON-CHUNG, K. J.; POLACHECK, I.; BENNETT, J. E. Improved diagnostic
medium for separation of Cryptococcus neoformans var. neoformans
(serotypes A and D) and Cryptococcus neoformans var. gattii (serotypes
B and C). Journal of Clinical Microbiology. 1982; 15: 535-537.
KWON-CHUNG, K. J.; VARMA, A. Do major species concepts support one, two
or more species within Cryptococcus neoformans? Federation of
European Microbiological Societies Yeast Research. 2006; 6: 574-587.
LEAL, A. L. Diferenciação das espécies de Cryptococcus neoformans e C gattii
utilizando a metodologia de PCR multiplex e determinação do perfil
epidemiológico de pacientes com meningite criptocócica. Dissertação de
Mestrado - Biologia Celular e Molecular. Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, 2002.
78
LEIMANN, B. C.; KOIFMAN, R. J. Cryptococcal meningitis in Rio de Janeiro
State, Brazil, 1994-2004. Cadernos de Saúde Pública (FIOCRUZ). 2008;
24: p. 2582-2592.
LEVIN, D. E. Cell Wall Integrity Signaling in Saccharomyces cerevisiae.
Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2005; 69: 262–291.
LIN, X.; HEITMAN, J. The Biology of the Cryptococcus neoformans Species
Complex. Annual Review of Microbiology. 2006; 60: 69-105.
LUMBRERAS, C.; LIZASOAIN, M.; AGUADO, J. M. Systemic antifungal agents.
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2003; 21: 366-379.
LUO, G.; MITCHELL, T. G. Rapid Identification of Pathogenic Fungi Directly
from Cultures by Using Multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology.
2002; 40: 2860-2865.
MCFADDEN, D.; ZARAGOZA, O.; CASADEVALL, A. The capsular dynamics of
Cryptococcus neoformans. Trends in Microbiology. 2006; 14: 497-505.
MILLER, J. L.; SCHELL, W. A.; WILLS, E. A.; TOFFALETTI, D. L.; BOYCE, M.;
BENJAMIN, D. K.; BARTROLI, J.; PERFECT, J. R. In vitro and in vivo
efficacies of the new triazole albaconazole against Cryptococcus
neoformans. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2004; 48: 384-387.
MITCHELL T. G.; PERFECT, J. R. Cryptococcosis in the Era of AIDS—100
Years after the Discovery of Cryptococcus neoformans. Clinical
Microbiology Reviews. 1995; 8: 515-548.
MOREIRA, T. A.; FERREIRA, M. S.; RIBAS, R. M.; BORGES, A. S.
Cryptococosis: clinical epidemiologycal laboratorial study and fungi
varieties in 96 patients. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical. 2006; 39: 255-258.
79
MUEND, S.; RAO, R. Fungicidal activity of amiodarone is tightly coupled to
calcium infux. Federation of European Microbiological Societies. 2008; 8:
425-431.
NEILSON, J. B.; FROMTLING, R. A.; BULMER, G. S. Pseudohyphal Forms of
Cryptococcus neoformans: Decreased Survival In Vivo. Mycopathologia.
1981; 73: 57-59.
NEILSON, J. B.; IVEY, M. H.; BULMER, G. S. Cryptococcus neoformans:
pseudohyphal forms surviving culture with Acanthamoeba polyphaga.
Infection and Immunity. 1978; 20: 262-266.
NISHIKAWA, M. M.; LAZERA, M. S.; BARBOSA, G. G.; TRILLES,
L.;
BALASSIANO, B. R.; MACEDO, R. C. L.; BEZERRA, C. C. F.; PÉREZ,
M. A.; CARDARELLI, P.; WANKE. B. Serotyping of 467 Cryptococcus
neoformans isolates from clinical and environmental sources in Brazil:
analysis of host and regional patterns. Journal Clinical Microbiology.
2003; 41: 73-77.
NOSANCHUK, J. D.; W. CLEARE, S. P.; FRANZOT; CASADEVALL, A.
Amphotericin B and fluconazole affect cellular charge, macrophage
phagocytosis, and cellular morphology of Cryptococcus neoformans at
subinhibitory concentrations. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 1999;
43: 233-239.
ODDS, F. C.; BROWN, A. J. P.; GOW, N. A. R. Antifungal agents: mechanisms
of action. TRENDS in Microbiology. 2003; 11: 272-279.
PALMEIRA, V. F.; KNEIPP, L. F.; ROZENTAL, S.; ALVIANO, C. S.; SANTOS,
A. L. S. Beneficial Effects of HIV Peptidase Inhibitors on Fonsecaea
pedrosoi: Promising Compounds to Arrest Key Fungal Biological
Processes and Virulence. PLoS ONE. 2008; 3: e3382.
80
PAPPALARDO, M. C. S. M. Criptococose em Aids: estudo clínico e
microbiológico em 35 pacientes acompanhados no Instituto de
Infectologia Emílio Ribas, São Paulo, entre 1995 a 1997. Dissertação de
Mestrado - Coordenação dos Institutos de Pesquisa da Secretaria da
Saúde de São Paulo. São Paulo, 2002.
PAPPALARDO, M. C. S. M.; MELHEM, M. S. C. - Cryptococcosis: a review of
the Brazilian experience for the disease. Revista do Instituto de Medicina
Tropical de São Paulo. 2003; 45:299-305.
PASQUALOTTO, A. C.; DENNING, D. W. New and emerging treatments for
fungal infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2008; 61: i19-
i30.
PLAYFORD, E. G.; KONG, F.; SUN, Y.; WANG, H.; HALLIDAY, C.; SORRELL,
T. C. Simultaneous Detection and Identification of Candida, Aspergillus,
and Cryptococcus Species by Reverse Line Blot Hybridization. Journal of
Clinical Microbiology. 2006; 44: 876-880.
POSTERARO, B.; SANGUINETTI, M.; MASUCCI, L.; ROMANO, L.; MORACE,
G.; FADDA, G. Reverse Cross Blot Hybridization Assay for Rapid
Detection of PCR-Amplified DNA from Candida Species, Cryptococcus
neoformans, and Saccharomyces cerevisiae in Clinical Samples. Journal
of Clinical Microbiology. 2000; 38: 1609-1614.
POTÓN, J.; SÁNCHEZ, M. E. G.; LOPEZ-MENDRANO, R. Guía Práctica de
Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. Revista
Iberoamericana de Micologia. 2001.
QUEIROZ; J. P. A. F.; SOUSA F. D. N; LAGE, R. A.; IZAEL, M. A.; SANTOS; A.
G. Criptococosis - a bibliografic review. Acta Veterinaria Brasílica. 2008;
2: 32-38.
81
RAPPELLI, P.; ARE, R.; CASU, G.; FIORI, P. L.; CAPPUCCINELLI P.; ACETI,
A. Development of a Nested PCR for Detection of Cryptococcus
neoformans in Cerebrospinal Fluid. Journal of Clinical Microbiology.
1998; 36: 3438-3440.
REIS-FILHO, J. B.; NEVES, A. C.; ZYMBERG, S. T.; OLIVEIRA, R. M. C. O
líquido cefalorraquiano inicial nas meningoencefalites por Cryptococcus
neoformans. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo.
1985; 27: 173-178.
REOLON, A.; PEREZ, L. R. R.; MEZZARI, A. Prevalence of Cryptococcus
neoformas in urban pigeons of Porto Alegre (RS) Brazil. Jornal Brasileiro
de Patologia e Medicina Laboratorial. 2004; 8: 293-298.
RODRIGUES, J. C. F.; ATTIAS, M.; RODRIGUEZ, C.; URBINA, J. A.; SOUZA,
W. Ultrastructural and Biochemical Alterations Induced by 22,26-
Azasterol, a D24(25)-Sterol Methyltransferase Inhibitor, on Promastigote
and Amastigote Forms of Leishmania amazonensis. Antimicrobial Agents
and Chemotherapy. 2002; 46; 487-499.
ROZEMBAUM, R.; GONÇALVES A. J. Clinical epidemiological study of 171
cases of cryptococcosis. Clinical Infectious Disease. 1994; 18: 369-80.
SORRELL, T. C. Cryptococcus neoformans variety gattii. Medical Mycology.
2001; 39: 155-168.
SPEED, B.; DUNT, D. Clinical and host differences between infections with the
two varieties of Cryptococcus neoformans. Clinical Infectious Disease.
1995; 21: 28-34.
SUBRAMANIAN S.; MATHAI D. Clinical manifestations and management of
cryptococcal infection. Journal of Postgraduate Medicine. 2005; 51: S21-
S26.
82
TONG, Z;
WIDMER, F.; SORRELL, T. C.; GUSE, Z.; JOLLIFFE, K. A.;
HALLIDAY, C.; LEE, O. C.; KONG, F.; WRIGHT, L. C.; CHEN, S. C. A. In
Vitro Activities of Miltefosine and Two Novel Antifungal Biscationic Salts
against a Panel of 77 Dermatophytes. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 2007; 51: 2219-2222.
WIDMER, F.; WRIGHT, L. C.; OBANDO, D.; HANDKE, R.; GANENDREN, R.;
ELLIS, D. H.; SORRELL, T. C. Hexadecylphosphocholine (Miltefosine)
has Broad-Spectrum Fungicidal Activity and Is Efficacious in a Mouse
Model of Cryptococcosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2006;
50: 414–421.
WIEDER, T.; REUTTER W.; ORFANOS C. E.; GEILEN C. C. Mechanisms of
action of phospholipid analogs as anticancer compounds. Progress in
Lipid Research. 1999; 38: 249-259.
YAMAGUCHI, M.; OHKUSU, M.; BISWAS, S. K.; KAWAMOTO S. Cytological
Study of Cell Cycle of the Pathogenic Yeast. Cryptococcus neoformans.
Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi. 2007; 48:147-152.
ZARAGOZA, O.; CASADEVALL, A. Experimental modulation of capsule size in
Cryptococcus neoformans. Biological procedures online. 2004; 6: 10-15.
ZHANG, Y.; RAO, R. Global Disruption of Cell Cycle Progression and Nutrient
Response by the Antifungal Agent Amiodarone. The Journal of Biological
Chemistry. 2007; 282: 37844-37853.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
