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Bruno Oliveira Piva
Efeito da privação de glicose na
melanogênese exibida por células de
melanoma murino.
Dissertação submetida ao Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, visando a obtenção do grau em Mestre
em Ciências Biológicas (Biofísica)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2009
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Piva, Bruno Oliveira
Efeito da privação de glicose na melanogênese exibida por
células de melanoma murino/ Bruno Oliveira Piva – Rio de
Janeiro: UFRJ / IBCCF, 2009.
xi, 63f.: il.; 31 cm.
Orientador: Bruno Lourenço Diaz
Dissertação (mestrado) – UFRJ, IBCCF, Pós-graduação em
Ciências Biológicas (Biofísica), 2009.
Referências bibliográficas: 55-63
1. Melanoma. 2. Melanogênese. 3. Estresse oxidativo. 4.
MAPK.
I. Diaz, Bruno Lourenço. II. Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. III. Título
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Este trabalho foi realizado no Laboratório de Inflamação do Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob orientação do
Prof. Dr. Bruno Lourenço Diaz, com o apoio das seguintes entidades:
• Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
• Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
(FAPERJ).
Agradecimentos
Ao Professor Bruno Lourenço Diaz, pela orientação e sabedoria. Pelo seu exemplo de
profissionalismo e dedicação.
Aos Professores Cláudio Cannetti e Christianne Bandeira-Melo pelas sugestões e
discussões científicas promovidas durante as apresentações de dados no Laboratório.
À minha namorada Débora pelo apoio dado durante todo o mestrado e pelas conversas
científicas.
À Ana Paula e a Carla pela ajuda nas leituras realizadas no leitor de placa e discussões
sobre transferência eletroforética.
Aos companheiros de grupo Daniel e Rafaela, e de Laboratório, Fabio e Ilka, pelas
conversas descontraídas.
Aos companheiros do extinto grupo de inflamação e câncer, Gustavo, Luciana e Ana
Paula e ao amigo Léo pela ajuda durante os experimentos.
À minha família que sempre me apoiou.
Aos amigos Fernando, Marcello, Ricardo e Caio Lívio pelas animadas rodas de samba
nos momentos de descontração.
Ao CNPq.
Resumo
Células tumorais apresentam defeitos em circuitos regulatórios os quais governam a
proliferação celular e a homeostase em geral. Em uma massa tumoral, a vascularização é
desordenada tornando precária a distribuição de oxigênio e nutrientes, induzindo grande
estresse nas células. Esse estresse é capaz de tornar as células mais resistentes ao tratamento
com quimioterápicos. O melanoma é um tipo de câncer altamente resistente à quimioterapia.
Esta resistência pode estar relacionada a transformações no melanócito e sua habilidade de
sintetizar melanina a qual por sua vez, pode proteger a célula tumoral. O objetivo deste
trabalho foi analisar a regulação da melanogênese induzida por privação de glicose utilizando
como modelo as células de melanoma murino B16F10. Ensaios de cultivo de B16F10 em
DMEM sem glicose foram realizados, demonstrando-se que a privação de glicose foi capaz de
induzir a produção de melanina pelas células. Avaliou-se também a atividade da enzima
tirosinase durante a síntese de melanina, demosntrando-se o pico de sua atividade foi após 15
horas de cultivo em meio sem glicose. Células cultivadas sob privação de glicose por 24 horas
apresentaram a redução na taxa de proliferação, mas não na viabilidade. Demonstrou-se,
também, que as células B16F10 quando cultivadas sob privação de glicose apresentaram
mudança morfológica onde se observou uma reorganização dos filamentos de actina.
Utilizando-se inibidores farmacológicos de MAPK, identificou-se cinases envolvidas na
regulação da melanogênese. Células que exibiam altas concentrações de melanina possuiam
ERK 2 ativada. A inibição de atividade desta cinase por U0126 resultou na inibição da
melanogênese induzida por privação de glicose. A prévia incubação das células com o
inibidor de proteassomo MG132 também induziu a redução da atividade de tirosinase. P38
possui um papel oposto dequele executado pela ERK, onde a sua inibição foi capaz de
aumentar a melanogênse. Demonstrou-se que a ativação da via de AKT não participa na
regulação da melanogênese induzida por privação de glicose, porém AKT é importante na
formação de dendritos. Células cultivadas sob privação de glicose e incubadas com o
antioxidante N-acetilcisteína não apresentaram melanogênese. Conclui-se que privação de
glicose é um estímulo para as células B16F10 levando a um estresse oxidativo e ativação de
multiplas vias de sinalização, resultando em melanogênese e mudanças morfológicas. A
ativação de ERK 2 nessas células parece ser importante na resposta à privação de glicose.
Abstract
Tumor cells have defects in their regulatory circuitry that govern cell proliferation and
homeostasis. In a tumor mass, vasculature is disorganized leading to poor distribution of
oxygen and nutrients that induces high stress levels in cells. Such stress is able to make cells
more resistant to chemotherapy. Melanoma is a type of cancer that is highly resistant
chemotherapy. This resistance may be related to its origin in transformed melanocytes and its
inherent ability to synthesize melanin that may provide protective functions for the melanoma
cell. The objective of this study was to analyze the regulation of melanogenesis induced by
glucose deprivation using as model the B16F10 murine melanoma cells. For this, experiments
of B16F10 proliferation in DMEM without glucose were performed, showing that deprivation
of glucose in the medium was able to induce melanin synthesis in cells. We also analyzed the
activity of tyrosinase, and determined that its peak of activity was found in the period of 15
hours of culture in medium without glucose. Cells cultured in medium without glucose for 24
hours showed a reduction in proliferation rate but with no effect on cell viability. We also
demonstrate that B16F10 under glucose deprivation had a reorganization of actin filaments.
Through experiments with pharmacological inhibitors of MAPK, we identified the kinases
involved in melanogenesis regulation in cells cultured in glucose-free medium. Cells that had
high concentrations of melanin had activated ERK 2. The inhibition of this kinase activation
by U0126, was able to reduce the activity of tyrosinase and inhibit melanogenesis induced by
deprivation of glucose. Previous treatment with MG132 also inhibited melanogenesis induced
by glucose deprivation. p38 has an opposite function from that performed by ERK, where its
inhibition was able to increase synthesis of melanin. We also demonstrated that AKT
activation pathway does not participate in regulation of melanogenesis induced by glucose
deprivation, while it is an important factor in the formation of dendrites. Glucose-deprived
cells treated with antioxidant N-acetylcysteine not exhibited melanogênesis. In conclusion,
glucose deprivation is a potent stimulus for B16F10 melanoma cells leading to oxidative
stress and activation of multiple signaling pathways that lead to melanogenesis and
morphological changes. ERK2 activation seems to be an important component of B16F10
cells response to glucose deprivation.
Lista de Abreviaturas
AKT Proteína cinase B
AMP Monofosfato de adenosina
ATP Adenosina trifosfato
BSA Albumina de soro bovino
DAG Diacilglicerol
DAPI 4,6-diamidino-2-fenilindol
DHE Dihidroetídio
DHI 5,6-dihidroxindol
DHICA 5,6-dihidroxindol-2-acido carboxílico
DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbelco
DMSO Dimetil sulfóxido
DOPA Dihidroxifenilalanina
EDTA Ácido etileno diamino tetracético
ERK Cinase regulada por sinais extracelulares
GAPDH Gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase
GLI - DMEM sem glicose
GLI + DMEM com glicose
GLUT Proteína transportadora de glicose
HIF Fator induzido por hipóxia
Kit Receptor tirosina cinase
L-DOPA 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina
MAPK Proteína cinase ativada por mitógenos
MCF-7 Células de câncer de mama
MCT-1 Proteina transportadora monocarboxilato 1
Mitf Fator de transcrição associado a microftalmia
MSH α/β Hormônios estimuladores de melanócitos α e β
NADPH Fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo
NF-κB Fator nuclear κB
NO Óxido nítrico
OAG Oleiacetilgricerol
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poli-acrilamida em condição desnaturante
PBS Cloreto de sódio tamponado com fosfato
PHEM Tampão contendo Pipes, Hepes, EDTA e Magnésio
PI3K Fosfatidilinusitol 3 cinase
PKC β Proteína cinase C beta
PKC Proteína cinase C
ROS Espécies reativas de oxigênio
SDS Dodecil sulfato de sódio
SFB Soro fetal bovino
TGF-β Fator transformante de crescimento beta
TTBS Tween 20 em cloreto de sódio tamponado com base Tris
UV Radiação ultravioleta
Sumário
1. Introdução...............................................................................................................................1
1.1. Célula tumoral...............................................................................................................1
1.2. Metabolismo tumoral....................................................................................................3
1.3. Privação de glicose e apoptose......................................................................................5
1.4. Melanócitos...................................................................................................................7
1.5. Melanina.......................................................................................................................7
1.6. Melanogênese...............................................................................................................8
1.7. Regulação da melanogênese.......................................................................................10
1.8. Melanoma...................................................................................................................14
2. Antecedentes e Objetivos.....................................................................................................16
3. Materiais e Métodos.............................................................................................................17
4. Resultados.............................................................................................................................22
5. Discussão..............................................................................................................................44
6. Conclusões............................................................................................................................54
7. Referências Bibliográficas....................................................................................................55
1
1. Introdução
1.1. Célula tumoral
Carcinogênese é um processo complexo, descrito por alguns autores como evolução
somática. Para que as células tumorais tenham sucesso no processo de proliferação constante,
algumas mudanças genotípicas e fenotípicas são necessárias. Inúmeros fatores regem o
crescimento celular em determinado microambiente e células que possuem características
novas, capazes de superar estas barreiras impostas terão um sucesso maior em relação as que
não possuem. Portanto, células tumorais possuem defeitos em seus circuitos regulatórios que
governam a proliferação celular e a homeostase. Analisando o genótipo de vários tipos de
células tumorais, Hanahan & Weinberg (2000) descreveram seis alterações essenciais ao
crescimento maligno.
A primeira diz respeito a auto-suficiência na secreção de sinais de crescimento.
Células normais precisam de sinais de crescimento ou mitogênicos para que passem do estado
quiescente para o estado ativo de proliferação. A sinalização é transmitida para dentro da
célula através de receptores transmembrana. Em uma célula normal, sem a presença de sinais
estimulatórios, a célula não prolifera. Em contra partida, uma célula tumoral é capaz de
proliferar mesmo na ausência de sinais mitogênicos externos. Isto se deve ao fato de muitos
dos oncogenes da célula tumoral se expressarem como sinalizadores de crescimento.
A segunda alteração diz respeito a capacidade das células tumorais tornarem-se
insensíveis a sinais anti-proliferativos. Em um tecido normal, múltiplos sinais anti-
proliferativos operam para manter a quiescência celular e a homeostase tecidual. Dentre esses
sinais incluem-se inibidores solúveis, inibidores imobilizados na matriz extracelular e as
moléculas encontradas na superfície de células adjacentes. Células tumorais são refratárias a
esses sinais anti-proliferativos.
A terceira habilidade que uma célula tumoral apresenta é a evasão da apoptose. A
habilidade de uma população de células tumorais de se expandir em número não é
determinada somente pela taxa de proliferação, mas também pela taxa de morte celular. Em
um tecido que esteja em homeostase, a taxa de proliferação é igual a taxa de morte celular.
Em tecidos tumorais, a taxa de proliferação é muito mais elevada do que a taxa de morte
celular, ou seja, células tumorais conseguem escapar da apoptose tornado-se irresponsivas a
sinais pró-apoptóticos.
2
Figura 1. As seis habilidades que uma célula tumoral deve apresentar para o seu
desenvolvimento, segundo Hanahan & Weinberg (2000).
Essas três habilidades descritas até o momento garantem à células tumorais um
crescimento independente de sinais externos. Em princípio, o resultado de um programa de
proliferação desregulado poderia ser capaz de produzir um grande número de células que
constituiriam um tumor macroscópico. Porém, estudos realizados nos últimos trinta anos
demonstraram que a quebra na sinalização célula-célula por si só não é capaz de expandir o
crescimento tumoral. Vários tipos de células de mamíferos possuem um programa de
autonomia celular intrínseco que limita sua multiplicação. Esse programa parece atuar de
forma independente das sinalizações célula-célula descritas anteriormente. Uma célula
tumoral que deseja prosperar deve possuir potencial replicativo ilimitado, ou seja, apresentar
alterações nesse mecanismo regulatório para que possa se multiplicar de maneira indefinida.
Em uma célula humana normal, a cada divisão celular há uma redução de 50 a 200 pares de
bases nos telômeros, tornando-os mais curtos. Quando o telômero se torna muito pequeno, as
células entram em uma via irreversível de parada do ciclo celular (senescência). Por outro
lado, células tumorais apresentam alta atividade da enzima telomerase, responsável pela
adição de repetições TTAGGG nos telômeros, impedindo a diminuição dos mesmo a cada
3
divisão. Portanto, células tumorais apresentam manutenção do comprimento dos telômeros o
que as permite infinitas divisões (Shay et al., 2001).
A quinta característica que uma célula tumoral apresenta é a capacidade de invadir
tecidos e formar metástases. A capacidade de células tumorais de invadir tecidos adjacentes e
posteriormente viajar até sítios distantes, formando novas colônias, é responsável por 90% das
mortes causadas por câncer em humanos (Sporn, 1996). Tal propriedade permite as células
tumorais escaparem da massa tumoral primária e colonizem novos sítios anatômicos, onde
nutrientes e espaço não limitam seu crescimento. A capacidade de uma célula de invadir
tecidos e formar metástases também depende de outra propriedade: promoção de angiogênese.
O oxigênio e os nutrientes distribuídos pelo sistema vascular são cruciais a sobrevivência e
funcionamento celulares obrigando todas as células pertencentes a um tecido a ficarem a uma
distancia de até 100 µm de um vaso sanguíneo. Para que haja crescimento de uma massa
tumoral, as células dessa massa devem estimular o processo de angiogênese local, para que
ocorra distribuição de oxigênio e nutrição localizada. Células tumorais parecem ativar a
angiogênese modificando o balanço de sinais pró-angiogênicos em relação aos seus inibidores
(Hanahan & Folkman, 1996). Além da aquisição das seis habilidades anteriormente descritas,
a célula tumoral precisa também ser capaz de modificar seu metabolismo a fim de se
estabelecer em sítios anatômicos até inóspitos (Kroemer & Poyssegur, 2008).
1.2. Metabolismo tumoral
A primeira alteração no metabolismo de uma célula tumoral foi descrita por Otto
Warburg. Esta consiste em aumento da taxa de glicólise mantida em condições de alta tensão
de oxigênio, com produção elevada de ácido lático (glicólise aeróbica). Esta alteração
metabólica passou a ser conhecida como “fenômeno de Warburg” e está presente em quase
todos os tipos de câncer (Funes et al., 2007). Existem inúmeras razões para que o aumento da
captação de glicose para a geração de ATP seja uma vantagem no crescimento tumoral. Em
uma massa tumoral há flutuação nos níveis de oxigênio em virtude da distância do vaso
sanguíneo em relação às células e pela inconstância hemodinâmica (Braun et al., 1999). Esta
flutuação pode ser letal para as células que necessitam de fosforilação oxidativa para gerarem
ATP, enquanto células que produzem ATP somente a partir da glicólise levam vantagem.
Durante a glicólise anaeróbia há elevada produção de ácidos lático e bicarbônicos, a partir do
piruvato, aumentando a acidez do microambiente. Revisões vêm demonstrando que a
acidificação do ambiente favorece a invasão tumoral [Swietach et al., 2007] e suprimem
4
efetores imunes anticâncer (Fischer et al., 2007). Sonveaux e colaboradores (2008)
demonstraram uma espécie de simbiose metabólica entre células tumorais em hipóxia e em
respiração aeróbia. A grande produção de lactato pelas células em hipóxia durante a glicólise
(dois moles de lactato por mol de glicose) é absorvida pelas células tumorais que realizam
respiração aeróbia. O lactato produzido entra na célula através da proteína transportadora
monocarboxilato 1 (MCT-1) onde é convertido em piruvato e posteriormente utilizado como
substrato na fosforilação oxidativa.
Outra vantagem reside na capacidade das células tumorais metabolizarem a glicose
através da via de pentose de fosfato, gerando NADPH que por sua vez aumenta a atividade
antioxidante célular (Gillies & Gatenby, 2007).
Células tumorais também se utilizam de intermediários da via glicolítica para reações
anabólicas como, por exemplo, o uso de glicose 6-fosfato para sintetizar glicogênio, piruvato
para sintetizar alanina e malato, e fosfato de dihidroxiacetona para sintetizar triglicerídios e
fosfolipídios (Gatenby & Gillies, 2004).
Contudo, para que haja aumento da glicólise em células tumorais é necessário maior
aporte de glicose para a célula. Todas as células possuem moléculas inseridas na membrana
plasmática envolvidas no transporte de glicose do meio extracelular para o meio intracelular,
as quais são conhecidas por proteínas transportadoras de glicose (GLUT). Estas são proteínas
transmembranas homólogas codificadas por genes distintos identificados até o momento
(Shepherd & Kahn, 1999). Os cincos transportadores de glicose (GLUT 1 – 5) estão
distribuídos nos tecidos de maneira específica; cada qual com sua especificidade para
substrato e propriedades cinéticas. GLUT-1 está amplamente distribuído no organismo sendo
constitutivo e altamente expresso em células endoteliais, cerebrais e eritrócitos. Por outro
lado, GLUT-4 não é expresso de maneira constitutiva na membrana plasmática e é encontrado
somente em células das musculaturas esqueléticas e cardíaca, e em células adiposas. 90% de
GLUT-4 encontra-se sequestrado intracelularmente em vesículas. Em resposta à insulina estas
vesículas se dirigem à membrana plasmática onde se fundem aumentando, assim, a
quantidade de GLUT-4 na membrana plasmática e o decorrente transporte de glicose. Quando
a insulina é removida do meio, GLUT-4 é internalizado novamente em vesículas revestidas
por clatrina. GLUT-2 esta presente em células do epitélio intestinal, do fígado e nas células β-
pancreáticas, monitorando a concentração de glicose nas ilhotas pancreáticas. Já GLUT-5
possui baixa afinidade por glicose e está envolvido no transporte de frutose para o interior da
célula (Shepherd & Kahn, 1999).
5
Células tumorais exibem expressão elevada de GLUT-1, -3 ou -4. Inúmeros
mecanismos estão envolvidos no aumento da expressão de GLUT nas células tumorais.
Dentre eles, a ativação de fatores de transcrição sensíveis à baixa concentração de oxigênio no
meio extracelular (HIF –fator induzido por hipóxia). Até o momento foram descritas três
isoformas de HIF (HIF-1,-2 e -3). HIF-1 foi a primeira a ser caracterizada: possui papel crítico
na regulação da resposta celular à hipóxia, pois pode estar presente em todos os tipos
celulares e induzir a expressão de vários genes (Rankin & Giaccia, 2008). HIF-1 é um fator de
transcrição heterodimérico que possui duas subunidades, uma β constitutiva e estável, e outra
α sensível a oxigênio. Na maioria das células e em alguns tipos de câncer, a expressão de
HIF-1α é indetectável sob normóxia. Quando as células são expostas a 1% de oxigênio, a
expressão de HIF-1α é detectada em 30 minutos com pico em 4 horas, mas rapidamente
desaparece se a condição de normóxia é restaurada (Wang et al., 1995; Fang et al., 2008).
HIF-1α é capaz de ativar inúmeros genes relacionados ao metabolismo de ferro, ao tônus
vascular, a proliferação celular, a angiogênese como também genes envolvidos no
metabolismo da glicose (Ke & Costa, 2006). HIF-1 tem sido descrito como o mais importante
fator de transcrição capaz de induzir todos os genes envolvidos no transporte de glicose e
enzimas glicolíticas, permitindo que células tumorais captem glicose proficientemente (Kim
et al., 2007). Estudos in vivo e in vitro demonstraram que a ativação de HIF-1 está
correlacionada com o fluxo glicolítico acelerado em condições de hipóxia, que contribui para
a restauração dos níveis de ATP e crescimento tumoral (Carmeliet et al., 1998; Ryan et al.,
1998). Portanto, em uma massa tumoral os níveis de nutrientes e oxigênio são reduzidos e as
células tumorais necessitam modificar seu metabolismo para sobreviverem neste
microambiente. A ativação de HIF-1 pela diminuição da concentração de oxigênio leva a
aumento na expressão de GLUT na membrana plasmática e modifica a maneira de produção
de ATP, passando a exercer preferencialmente a glicólise a fosforilação oxidativa.
1.3. Privação de glicose e apoptose
A vascularização de tumores sólidos é bastante precária e pouco organizada. Em
virtude do grande crescimento celular desordenado, o centro da massa tumoral se torna um
local inóspito em razão da baixa difusão de oxigênio e de nutrientes. Geralmente as células
que se encontram nesta região do tumor são necróticas ou com altos níveis de estresse.
6
Recentemente, relacionou-se diminuição da concentração de glicose intracelular e os
primeiros passos da morte celular programada. Tal diminuição do transporte de glicose para a
célula não é somente uma consequência da perda da viabilidade celular, mas, também um
fator principal para a execução da apoptose. Morte celular ligada à privação de glicose pode
ser dividida em três grupos separados.
No primeiro grupo, a privação de glicose leva a depleção leve ou moderada de ATP
intracelular. Com a baixa concentração de ATP, é disparada a via de apoptose pela
mitocôndria. O estresse produzido pela baixas concentrações de ATP resulta na
permeabilização da membrana externa mitocondrial associada a translocação de proteínas,
como o citocromo c o ativador de caspase derivado da mitocôndria – SMAC (também
conhecido como Diablo) do espaço intermembranar mitocondrial para o citosol. A
permeabilização da membrana externa mitocondrial é um ponto sem retorno. Considerando
que existe inúmeras vias de morte e sobrevivência celulares, algumas proteínas ativam vias
que decidem o futuro da célula. Estas proteínas reguladoras foram identificadas como
pertencentes à família Bcl-2. Seus membros incluem proteínas pró-apoptóticas, como BAX e
BAK, assim como proteínas anti-apoptóticas, como Bcl-2 e Bcl-Xl. Um terceiro grupo desta
família são as proteínas com homologia 3 as Bcl-2 (BH3), as quais funcionam como proteínas
pró-apoptóticas (BID, BIM, PUMA, BAD, BIK) (Guicciardi & Gores, 2008). Quando BAX
ou BAK é ativada, ela é responsável pela permeabilização da membrana mitocondrial externa
levando à liberação de citocromo c. Por outro lado, a ativação de Bcl-2 ou Bcl-Xl
antagonizam a ativação de BAX e BAK, inibindo a ativação das últimas. Proteínas BH3
podem promover a apoptose por “ativação indireta” onde BIM, BID ou PUMA se ligam a
BAK e BAX ativando-os. Embora ainda discutida a ocorrência desta via de ativação, estudos
recentes suportam a existência de “ativação indireta”. Até o momento não foi demonstrada
nenhuma evidência de ligação direta de BH3 com BAX e BAK [Wilis et al., 2007; Uren et
al., 2007]. Para que esses mecanismos de ativação da via mitocondrial de apoptose ocorram, é
necessária quantidade mínina de ATP intracelular, pois a depleção desta molécula acaba
levando à necrose.
A hipóxia aumenta a expressão de HIF, resultando na estabilização de p53 e na
ativação da via apoptótica associada à proteína. Normalmente, p53 possui meia vida muito
curta, devido a sua rápida degradação nos proteassomos. Quando p53 é estabilizado durante
uma condição de estresse, como por exemplo, sob hipóxia, ela se torna ativa e promove a
transcrição de genes envolvidos na regulação do ciclo celular e na apoptose. Em um modelo
7
de apoptose em hepatócitos, p53 se ligou a BAK provocando oligomerização de BAK e
induzindo permeabilidade da membrana mitocondrial externa (Leu et al., 2004).
A diminuição da captação de glicose e consequentemente a redução da taxa de
glicólise resultam em estresse oxidativo, resultando na ativação de vias de sinalização e morte
celular. Estudos realizados com células de linhagem câncer de mama MCF-7 demonstraram
que quando estas são cultivadas em meio sem glicose há acumulação intracelular de espécies
reativas de oxigênio (ROS), como radicais superóxidos e peróxido de hidrogênio. Este
acúmulo de ROS deve-se principalmente a mudança metabólica da glicólise para a
fosforilação oxidativa (Blackburn et al., 1999).
1.4. Melanócitos
Com a exceção do epitélio pigmentar retiniano, todas as outras células pigmentares em
vertebrados são derivadas da crista neural. A crista neural é composta por uma população
transiente de células, única nos vertebrados, as quais se originam do tubo neural dorsal ou das
dobras neurais, durante o desenvolvimento embrionário. As células da crista neural podem
migrar por diferentes vias para sítios específicos no embrião, onde irão completar seu
processo de diferenciação para formar ossos, cartilagens, tecido adiposo, células endócrinas e
vários tipos de neurônios e células da glia, como também células pigmentares. Células da
crista neural que irão se diferenciar em melanócitos (melanoblastos), migram dorso-
lateralmente no tubo neural, entre os somitos e a ectoderme. Por fim, invadem a ectoderme
quando ocorre diferenciação em melanócitos (Thomas & Erickson, 2008). Melanoblastos são
um grupo de células não pigmentadas que, apesar de não serem totalmente diferenciadas,
expressam marcadores de melanócitos como o receptor com atividade de tirosina cinase (Kit)
e o fator de transcrição associado a microftalmia (Mitf). Esses dois marcadores são essenciais
ao desenvolvimento e a sobrevivência dos melanoblastos, pois uma mutação que afete o
promotor de Mitf é capaz de reduzir o número de melanoblastos (Goding, 2006).
1.5. Melanina
A mais óbvia função associada aos melanócitos é a produção de pigmentos em
organelas especializadas chamadas melanossomos. A pigmentação do cabelo, da pele e dos
olhos é expressão da atividade dos melanócitos. Enquanto na natureza a produção de
pigmentos possui diversos propósitos, nos humanos a pigmentação atua principalmente na
8
proteção da pele contra a radiação ultravioleta. Esta proteção reside na transferência dos
pigmentos produzidos nos melanócitos para os queratinócitos adjacentes. Esse pigmento
transferido foi identificado em 1901 por Otto V. Furth e Hugo Schnneider, e recebeu o nome
de melanina – derivado da palavra grega melas, que significa preto. Existem dois tipos
principais de melanina: eumelanina (pigmento de coloração escura) e feomelanina (pigmento
de coloração avermelhada) (Simon et al., 2008).
Apesar da melanina ter sido descoberta em 1901, até hoje não se caracterizou sua
forma estrutural. Enquanto proteínas, polissacarídeos e ácidos nucléicos são compostos por
unidades monoméricas distintas, e unidas por ligações covalentes, a molécula de melanina é
composta por unidades diferentes unidas entre si por ligações entre átomos de carbono, o que
torna sua caracterização sistemática muito complicada. É conhecido, porém, que a molécula
de eumelanina é formada por unidades de 5,6-dihidroxindol-2-ácido carboxílico (DHICA) e
5,6-dihidroxindol (DHI) e a molécula de feomelanina por unidades de benzotiazinas (Ito,
2003).
Diversas funções foram descritas para a melanina. Umas dessas diz respeito a sua
atividade antioxidante. O alto grau de conjugação dentro do polímero permite o movimento
de elétrons entre uma quinona e resíduos catecólicos, fazendo com que a melanina seja capaz
de trocar um ou dois elétrons, funcionando assim como uma molécula antioxidante. A
melanina é também capaz de se ligar a cátions e de absorver radiações, desde a faixa do
ultravioleta até a do infravermelho. Algumas evidências ainda apontam que a melanina é
capaz de absorver outros tipos de energia, como a presente nas ondas sonoras, e atuar com
função mecânica na célula, através de ligações cruzadas com outras proteínas (Riley, 2003).
Assim, células que apresentam melanina ganham uma série de benefícios em relação as
demais. Em células tumorais, essa molécula proveria aumento de sobrevivência em resposta a
radiações e a produção de espécies reativas de oxigênio (Riley, 2003).
1.6. Melanogênese
Apesar dos inúmeros benefícios adquiridos por células que apresentam melanina, a
síntese da molécula é danosa. Por esta razão, a síntese de melanina ocorre somente em
algumas células (melanócitos) e dentro de organelas especializadas (melanossomos). O
melanossomo é uma organela envolta por uma única membrana lipídica e que possui em seu
interior diversas enzimas envolvidas na síntese de melanina. O passo inicial na melanogênese
é a geração de ortoquinonas. Estas são espécies moleculares reativas, capazes de se ligarem
9
covalentemente à proteínas e ácidos nucléicos. Entretanto, a membrana do melanossomo é
capaz de reduzir a difusão de quinonas com cadeias laterais hidrofílicas para o citoplasma,
restringindo assim as reações ao lúmen da organela (Smit et al., 1999).
A oxidação de tirosina ou da L-DOPA em dopaquinona é o primeiro passo no
processo de melanogênese e quem catalisa esta reação é a tirosinase. Portanto, pode-se dizer
que a tirosinase é uma enzima chave na melanogênese.
Tirosinase é uma enzima binuclear com forma estrutural plana semelhante à
hemocianina. É uma glicoproteína transmembrana com a região C terminal voltada ao citosol
e N terminal localizada dentro do melanossomo. Esta enzima possui dois resíduos de serina
perto da região C terminal que são fosforilados pela proteína citosólica PKCβ, levando a
ativação da enzima (Park et al., 1999). A tirosinase também possui dois átomos de cobre no
seu sítio ativo que são coordenados pelos resíduos de histidina. Quando a enzima está no
estado de oxidação Cu(II), ela se encontra inativa sendo denominada de met-tirosinase. A
ativação da enzima é feita através da redução dos dois átomos de cobre (II) para cobre (I) por
doadores simples de elétrons como L-DOPA, ácido ascórbico ou ânion superóxido (O
2
-
)
(Schallreuter et al., 2007). Com a formação da dopaquinona a partir de tirosina, a primeira é
convertida em ciclodopa (leucodopacromo). Ciclodopa, por sua vez, pode ser convertida em
dopacromo ou novamente em L-DOPA através da alteração do estado redox. Uma vez
convertida em dopacromo, cria-se a molécula que irá produzir as duas unidades fundamentais
da eumelanina: DHICA e DHI (Figura 2). Para converter dopacromo em DHICA, é necessária
a atividade de dopacromo tautomerase (tyrp2) enquanto a descarboxilação em DHI ocorre
espontaneamente (Ito & Nicol, 1974).
Em seguida a formação de DHICA e DHI, estas se unem e resultam no polímero de
eumelanina. Uma vez sintetizada, a eumelanina pode ser estocada, como acontece nas células
pigmentares da retina, ou ser transferida para queratinócitos (caso de melanócitos da pele).
Esta transferência acontece através do transporte de melanossomos, ao longo de microtúbulos,
à periferia do melanócito. Neste, ao chegar a malha cortical de filamentos de actina, a
melanina pode ser transferida para queratinócitos adjacentes. Sabe-se que uma proteína
denominada receptor-2 ativado por protease, presente nos queratinócitos, é essencial para que
ocorra a transferência de melanina. Porém, ainda não se sabe ao certo o mecanismo envolvido
neste fenômeno (van Den Bossche et al., 2006).
10
Figura 2. O processo de formação da eumelanina nos melanossomos. A enzima tirosinase
participa da oxidação de tirosina em dopaquinona e da formação do polímero de eumelanina, tornando
esta enzima essencial no processo de melanogênese.
1.7. Regulação da melanogênese
A produção de melanina por melanócitos relaciona-se a diferenciação celular. Diversas
citocinas e fatores de crescimento têm sido descritos como indutores de migração de
melanoblastos e de diferenciação para melanócitos. Neste contexto, uma das grandes
descobertas foi a caracterização do papel do fator de transcrição associado a microftalmia
(Mitf) e do AMP cíclico na regulação da transcrição de tirosinase.
11
A elevada produção de melanina ocorre geralmente quando o melanócito é estimulado
por fatores externos. Dentre eles, um bastante conhecido é a radiação UV que induz a
produção de melanina e tem como consequência a pigmentação da pele. Porém, uma vez
cessado o estímulo, a produção de melanina volta ao seu nível basal.
A primeira hipótese para explicar o efeito direto da UV na melanogênese envolve
sinalização via PKC: a ativação de fosfolipase C resulta na liberação de diacilglicerol (DAG)
e este, por sua vez, ativaria PKC (Nishizuka, 1986). Inúmeros estudos demonstraram a
participação de PKC na regulação da melanogenese. A adição de oleiacetilglicerol (OAG) em
uma cultura de melanoma humano S91 foi capaz de aumentar a quantidade de melanina nesse
tipo celular (Gilchrest et al., 1996).
Oxido nítrico (NO) também foi descrito como uma molécula que participa da
melanogenese induzida por UV. NO é um radical livre gasoso, sintetizado durante a
conversão da arginina em l-citrulina via oxido nítrico sintase, sendo considerado uma
molécula mensageira intercelular. NO é capaz de ativar guanilato ciclase levando a um
aumento na concentração intracelular de GMP cíclico. Durante a exposição à radiação UV, há
um aumento na produção de NO e consequentemente de GMP cíclico, que estimulam a
melanogênese. Tal indução pode ser inibida pela adição de inibidores de guanilato ciclase e
oxido nítrico sintase (Romero-Graillet et al., 1996).
A melanogenese também pode ser induzida por outros fatores além da radiação UV,
como por peptídios pró-opiomelanocotinas. Lerner & McGuire foram os primeiros a
reconhecer a influência dos hormônios estimuladores de melanócitos α e β (α-MSH/ β-MSH)
na pigmentação da pele humana. α-MSH é capaz de se ligar a um receptor acoplado à
proteína G levando a ativação da proteína Gαs, aumentando a concentração de AMP cíclico
intracelular. Em experimentos in vitro com linhagens de melanoma, o efeito melanogênico do
α-MSH pôde ser reproduzido através do uso de agentes que elevam a concentração de AMP
cíclico, como a toxina da cólera, a forskolina e a isobutilmetilxantina (Englaro et al., 1995).
Portanto, o AMP cíclico possui papel central tanto na melanogênese quanto na diferenciação
dos melanócitos.
Buscà e colaboradores demonstraram em células de melanoma murino que o aumento
de AMP cíclico é capaz de inibir a atividade de fosfatidilinusitol 3-cinase (PI3K) e de p70
S6
cinase (Buscà et al., 1996). PI3K pertence a uma família de enzimas compostas por uma
subunidade regulatória de 85 kDa (p85) contendo um domínio SH2 e SH3, e uma subunidade
catalítica de 110 kDa (p110) que fosforila hidroxil D3 no anel de inusitol do fosfatidilinusitol
12
(Hu & Schlessinger, 1994). PI3K ativa PKB (Akt) e a fosforilação desta cinase está envolvida
em diversas funções celulares, como na progressão do ciclo celular, na angiogênese e no
processo de invasão e formação de metástases pela célula tumoral (Kim & Chung, 2002). A
utilização de inibidores farmacológicos de PI3K e p70
S6
cinase reproduzem o efeito
melanogênico do α-MSH ou da forskolina, sugerindo que a inibição da atividade dessas
cinases a partir do aumento de AMP cíclico intracelular é um evento chave na regulação da
melanogênese. Além de aumentar a melanogênese nos melanócitos, o AMP cíclico é capaz de
induzir a formação de dendritos nessas células. A linhagem de melanoma murino B16 quando
tratada com o inibidor LY294002 de PI3K tem, além da sua melanogênese aumentada, a
formação de inúmeros dendritos (Buscà et al., 1996). Buscà e colaboradores (1998)
observaram que essa alteração na concentração intracelular de AMP cíclico causado pela
inibição da atividade de PI3K, foi capaz de provocar a desorganização de filamentos de actina
em células B16. A proteína Rho, responsável pela organização de actina regulou a
melanogênese nessas células através de AMP cíclico. Quando Rho encontra-se inativa, os
níveis de AMP cíclico intracelular estão elevados, estimulando a transcrição e a expressão de
tirosinase. Esses efeitos foram revertidos quando as células apresentaram ativação constitutiva
de Rho (Busca et al., 1998).
Alguns trabalhos mostraram a participação de proteínas cinases ativadas por
mitógenos (MAPK) na regulação da melanogênese. MAPK ativa a fosforilação de resíduos
específicos de serina/treonina na proteína alvo, regulando ampla gama de respostas celulares.
Existem quatro vias de sinalização distintas que envolvem MAPK, denominadas de acordo
com o subgrupo das cinases envolvidas. Os quatro subgrupos são: cinases reguladas por sinais
extracelulares (ERK) (Sturgill & Ray, 1986; Boulton et al., 1991); cinases da região N-
terminal de c-jun (JNK), também conhecidas como cinases ativadas por estresse (SAPK1)
(Derijard et al., 1994; Kyriakis et al., 1994); P38 MAPK, também conhecida como SAPK 2-4
(Freshney et al., 1994; Han et al., 1994; Rouse et al., 1994) e ERK 5, também conhecida
como a grande MAPK (BMK) (Zhou et al., 1995 e Lee et al., 1995).
A diferença entre as vias de sinalização das MAPK reside nas atividades fisiológicas
que se encontram envolvidas. A via de ERK está envolvida na proliferação e diferenciação
celulares, enquanto a via de JNK e P38 estão envolvidas nas respostas ao estresse e na
apoptose. A via de ERK 5 parece transmitir sinais mitogênicos e de estresse. Porém, certas
funções de cada via são células e condições específicas: a via de sinalização de ERK pode
estar envolvida na resposta a apoptose sob certas condições (Bacus et al., 2001), enquanto a
via de JNK, na sobrevivência e proliferação celulares (Hess et al., 2002).
13
A via de sinalização de ERK é ativada por vários agentes extracelulares, como fatores
de crescimento, hormônios, e neurotransmissores (Naor et al., 2000; Zhang & Liu, 2002;
Chang et al., 2003; Yao & Seger, 2004; Chuderland & Seger, 2005). Tais fatores podem se
ligar a proteína G, presente em receptores de tirosina cinases ou de canais iônicos, ou via
outros mecanismos (Marmor et al., 2004; Rane, 1999).
Englaro e colaboradores (1998) demonstraram que a inibição da via de ERK pelo
inibidor farmacológico PD98059 não foi capaz de inibir a melanogênese induzida pela
elevação de AMP cíclico em células de melanoma murino B16F10. Estes autores já haviam
constatado, em 1995 que a elevação de AMP cíclico intracelular era capaz de induzir a
melanogênese nessas células, resultando na ativação de ERK. Porém, a ativação de ERK na
melanogênese não parece ser a peça principal deste tipo de indução. Por outro lado, Kim e
colaboradores (2007) demonstraram que células de linhagem de melanócitos humanos Mel-
Ab, quando cultivadas em temperaturas maiores que 37 ºC, apresentam inibição de
melanogênese e ativação de ERK. Estes autores também demonstraram que a inibição de P38
pelo inibidor farmacológico SB203580 foi capaz de bloquear a melanogênese.
Figura 3. O aumento de AMP cíclico intracelular leva a ativação da via de ERK, onde uma
vez ativada, fosforila Mitf. Quando Mitf se encontrada fosforilado, ele pode ser ubiquitinado e
degradado nos proteassomos, ou induzir a melanogênese através da expressão de tirosinase. Por outro
lado, o aumento de AMP cíclico inibe PI3K, que por sua vez inibe p70
S6K
, permitindo a ativação de
Mitf e a melanogênese. A inibição de PI3K leva a formação de dendritos através da inibição de Rho.
cAMP
Ras
B-Raf
MEK
ERK
MITF
P
Ser 73
U
Melanogênese
degrada
çã
o
proteassomo
PI3K
Rac
Rho
p70
S6K
MITF
MBOX
Tirosinase
TRP-1 DCT
dendritos
MITF
P
Ser 73
14
TGF- β também desempenha papel regulatório na melanogênese. TGF- β foi capaz de
diminuir a melanogênese e a atividade de tirosinase nas células B16F10 [Murakami et al.,
2008].
Uma célula cancerosa apresenta perda de funções especializadas. No caso das células
melanócitos neoplásicos, a expressão de tirosinase e possivelmente de outras enzimas que
participam da melanogênese se encontram aumentadas (Hara et al., 1994). A alta
melanogênese acompanhada de super expressão de tirosinase em melanócitos malignos,
encontra-se associada a um defeito nos melanossomos (Borovansky et al., 1991).
1.8. Melanoma
A pele é o maior órgão encontrado no corpo humano que apresenta grande potencial
para desenvolver melanona. Este é um tipo de câncer que se inicia a partir dos melanócitos
presentes na pele. Esta doença é capaz de progredir muito rapidamente e é um dos tipos de
câncer que mais causam óbitos no mundo. Nos Estados Unidos, o melanoma é o quinto e o
sexto tipo de câncer mais comum em homens e mulheres, respectivamente (Jemal et al.,
2004). Indivíduos que apresetam histórico familiar de melanoma possuem 30-70 vezes mais
chances de desenvolver a doença em relação à população em geral. O melanoma cutâneo é o
mais prevalente em regiões se tem maior incidência de radiação solar e em populações
formadas por indivíduos de pele clara, em particular da Austrália, da África do Sul e do
sudeste dos Estados Unidos (Kefford et al., 1999).
O único tratamento eficaz contra o melanoma é a retirada cirúrgica das lesões recém
formadas. O melanoma metastático possui um prognóstico de 6 a 9 meses de sobrevida e não
responde as quimio e radioterapias. O avanço no conhecimento das bases genéticas do câncer
permitiu um tratamento mais eficaz contra o câncer de pulmão, de cólon e o carcinoma renal,
mas os tratamentos contra o melanoma continuam pouco efetivos (Ibrahim & Haluska, 2009).
Células B16F10 formam uma linhagem celular de melanoma murino que durante
muito tempo foram utilizadas em experimentos de migração e de invasão, devido ao seu
potencial metastático em camundongos C57BL/6. Quando injetadas de forma subcutânea
nestes camundongos, as células proliferaram e produzem grandes massas tumorais. Quando
injetadas na veia dos animais, estas células apresentam homing para pulmão, aí gerando
inúmeros nódulos metastáticos. A cor enegrecida das massas tumorais é um indicativo que as
células B16F10 são capazes de produzir melanina em condições adversas, em regiões pouco
vascularizadas.
15
Investigações sobre o potencial metastático de uma célula tumoral demonstraram que
num total de 10
5
células de câncer de pulmão injetadas na veia de um camundongo, por volta
de 100 células sobrevivem e formam colônias. Por outro lado, quando essas células eram pré-
tratadas com hipóxia por 24 horas, o número de células viáveis aumentava em quatro vezes.
Em conjunto, estes resultados sugerem que a transformação metabólica ocorrida em células
residentes em ambientes inóspitos induz a seleção de células mais hábeis à metastização
(Rofstad & Danielsen, 1999).
16
2. Antecedentes e objetivos
2.1 Antecedentes
A privação de nutrientes e de oxigênio nas massas tumorais requer às células que
estejam no centro que alterem seu metabolismo para que sobrevivam. Essa alteração pode
tornar a célula tumoral ainda mais resistente a ação de quimioterápicos. O melanoma é
conhecido por ser um câncer de difícil tratamento, pois as células tumorais não respondem
bem a quimioterápicos. Nosso objetivo geral foi o de investigar a regulação da produção de
melanina decorrente da privação de glicose em um modelo celular de melanoma murino.
2.2 Objetivos
- analisar a capacidade proliferativa das células quando submetidas à privação de
glicose;
- realizar uma identificação inicial das vias de sinalização envolvidas na
melanogênese, neste modelo celular;
- analisar o balanço oxidativo das células expostas à privação de glicose; e
- investigar um possível papel funcional associado a melanogênese celular
17
3. Materiais e Métodos
3.1. Materiais
Os inibidores de JNK (SP600125), P38 (SB202190), MEK (U0126) e PI3K
(LY294002) foram obtidos da Biomol. O inibidor MG132 foi obtido da Sigma (Brasil). Os
anticorpos monoclonais IgG de camundongo contra P-P42/44 MAPK (Thr2002/Tyr204, clone
E10), P-Akt (Ser473, clone 587F11) e P-P38 MAPK (Thr180/Tyr182, clone 28B10) foram
obtidos da Cell Signiling (USA). O anticorpo monoclonal contra GAPDH (clone 6C5) e NF-
κB (p65, clone F6) foram obtidos na Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos secundários
conjugados a peroxidase anti-IgG de camundongo produzidos em cabra foram obtidos da Cell
Signaling. Faloidina conjugada a rodamina foi obtida da Invitrogen (Brasil) e a anexina V
conjugada com FITC da Sigma (Brasil). O Panótico utilizado foi produzido pela Laborclin
(Brasil). Os anticorpos secundários anti-IgG de camundongo conjugados com fluorocromos
(Alexa 488 e 546) foram obtidos na Invitrogen (Brasil).
3.2. Células
Amostras de célula da linhagem de melanoma murino B16F10 foram gentilmente
cedidas pela Dra. Valerie A. Fadok (National Jewish Medical and Research Center, Denver,
Co, EUA), e cultivadas em DMEM com 4,5g/L de glicose (Sigma) suplementado com 10%
de soro fetal bovino (Gibco), 100 U/mL de Penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina. As
células foram mantidas em garrafas de cultura de 75 ou 150 cm
2
(Techno Plastic Products) a
37ºC em 5% de CO
2
. Quando atingiam confluência, as células eram lavadas com PBS (KCl
2,67 mM, NaCl 137,93 mM, KH
2
PO
4
1,47 mM e Na
2
HPO
4
8,10 mM, pH 7,2) por duas vezes
e incubadas em solução de 0,25% de tripsina contendo 0,38 g/L de EDTA, por
aproximadamente 5 minutos a 37 ºC. DMEM suplementado com SFB foi utilizado para parar
a atividade da tripsina. As células foram, então, recolhidas para centrifugação a 300 x g, por 5
minutos a temperatura ambiente. Em seguida, foram ressuspendidas em meio fresco. Para os
ensaios, além do meio de cultivo utilizamos, também, DMEM suplementado com 10% de
SFB sem glicose, contendo 100 U/mL de Penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina.
3.3. Indução da melanogênese
Para induzir melanogênese, as células foram plaqueadas (placas de 6 poços com 8 x
10
5
células por poço) por 5 horas. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS
18
e 1 mL (com ou sem glicose) de DMEM recém preparado foi adicionado a cada poço. Após
24 horas, as células foram lavadas duas vezes com PBS, tripsinizadas e recolhidas em tubos
de 1,5 mL, sendo centrifugadas a 2000 RPM por 5 minutos, a temperatura ambiente. O pellet
resultante foi ressuspendido em 100 µL de água MiliQ e armazenado a -20 ºC. Para alguns
ensaios, as células foram tripsinisados após 15, 18, 21 e 24 horas de cultivo. Alguns pellets
foram fotografados com a maquina fotográfica digital Sony H-10 e as imagens processadas no
Adobe Photoshop.
3.4. Tratamentos
As células foram cultivadas por 5 horas em meio DMEM com glicose. Em seguida, o
meio foi aspirado e substituído por DMEM recém preparado tendo ou não glicose, na
presença de cada um dos inibidores de vias de sinalização; U0126 (25 µM), LY294002 (20
µM), SB202190 (30 µM), SP600125 (30 µM) e MG132 (5 µM) ou do antioxidante N-acetil
cisteína (0.5, 5.0 e 50.0 mM). Após 24 horas de incubação, as células foram tratadas com
tripsina, centrifugadas, ressuspensas em 100 µL de água MiliQ e armazenadas a -20 ºC.
3.5. Quantificação de melanina
Os extratos armazenados a -20 ºC foram descongelados e a eles adicionados 500 µL de
etanol-eter (1:1) Observe-se que a melanina é insolúvel em etanol-eter. Essa mistura foi
mantida a temperatura ambiente por 15 minutos e submetidas a centrifugação a 5000 RPM
por 5 minutos. O precipitado resultante foi solubilizado em 100 µL de NaOH (1N) contendo
10% DMSO, aquecido a 80 ºC por 30 minutos, a fim de que ocorrece solubilização da
melanina. 50 µL desta solução foram transferidos para placas de 96 poços e as leituras dos
produtos foram realizadas a 470 nm, no leitor de placa SpectraMax 250 (Molecular Devices)
com o programa SoftMax Pro 4.8 (Molecular Devices).
3.6. Lisado celular
As células foram plaqueadas seguindo o protocolo de indução de melanogênese (3.3).
Após 24 horas, as células foram lavadas duas vezes com PBS e lisadas com o tampão de
extração (Triton 1%, deoxicolato de sódio 0,5%, SDS 0,2%, NaCl 150 mM Hepes 10 mM,
EDTA 2 mM, ortovanadato de sódio 2 mM, NaF 20 mM, AEBSF 1,04 mM, aprotinina 0,8
µM, leupeptina 20µM, estatina 40 µM, pepstatina A 0,15 mM e E-64 0,14 mM). As culturam
foram adicionadas 90 µL desta solução e as células foram recolhidas e transferidas para tubos
19
de 1,5 mL. Aos tubos, foram adicionado, 30 µl de tampão de carregamento (4X) contendo
20% de β- mercaptoetanol (solução estoque 5X: 4,5 g de Tris, 10 mL de glicerol, 10 mL de
0,1% azul de bromofenol, 15 g de SDS em volume final de 75 mL, pH 6,8). As amostras
foram incubadas a 100 ºC por 5 minutos e armazenadas a -20 ºC, sendo normalizadas pelo
número de células.
3.7. Transferência eletroforética
O lisado total foi submetido à SDS-PAGE (10% acrilamida/Bis 29:1) a 28 mA/gel, em
condição desnaturante (Tris Base 30,3 g/L, SDS 10 g/L e Glicina 144 g/L), por
aproximadamente 1 hora e 30 minutos. As bandas resultantes foram transferidas para
membranas de nitrocelulose (porosidade de 0,45 µm, BioAgency), a 250 mA, por 2 horas e a
4 ºC, em tampão de transferência (Metanol 500 mL, água destilada 2 L, Tris Base 7,57 g e
Glicina 36,05 g). Em seguida, as membranas foram incubadas com tampão de bloqueio
contendo 5 % de leite desnatado (Nestlé) ou 5 % de BSA em TTBS (Tris Base 1,2 g, NaCl 9
g, Tween-20 1 mL/1 litro; pH 7,4) por 2 horas. As membranas foram lavadas seis vezes com
TTBS por aproximadamente 5 minutos/vez sob agitação e a temperatura ambiente. A seguir,
foram incubadas com anticorpo primário por 16 horas, sob agitação a 4 ºC. Os anticorpos
primários utilizados foram anti P-P42/44, anti P-P38, anti GAPDH, anti NF-κB ou anti-P-
AKT.
3.8. Atividade de tirosinase
Células em placas de seis poços (8 x 10
5
células por poço) foram cultivadas por 5
horas em DMEM com glicose. Após esse período, o meio foi trocado por DMEM sem glicose
e as células foram cultivadas por até 24 horas. Após, 3, 6, 9, 15, 18, 21 e 24 horas de cultivo
em meio sem glicose, amostram foram coletadas e analisadas. Foi realizada a lise celular de
acordo com 3.6, porém sem adição de β- mercaptoetanol e desnaturação protéica a 100 ºC. O
lisado total foi submetido SDS-PAGE (10% acrilamida/Bis 29:1) a 28 mA/gel em condição
desnaturante (Tris Base 30,3 g/L, SDS 10 g/L e Glicina 144 g/L ) por aproximadamente 1
hora e 30 minutos. As amostras foram normalizadas pelo número de células lisadas. Depois, o
gel foi colocado em pequenos recipientes e lavado com tampão fosfato de sódio (0,1 M) por
30 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, o gel foi incubado com l-DOPA (5 µM) em
tampão fosfato de sódio (0,1 M), por 45 minutos a 37 ºC no escuro. O gel foi lavado
20
novamente em tampão fosfato de sódio (0,1 M) e fotografado com a câmera fotográfica Sony
H-10.
3.9. Imunofluorescência
As células foram cultivadas sobre lamínulas em placas de 24 poços (1.6 x 10
5
células/
poço) por 5 horas, em DMEM com glicose. Depois, o meio foi trocado por DMEM com ou
sem glicose, contendo cada um dos inibidores U0126 (25 µM), LY294002 (20 µM),
SB202190 (30 µM), SP600125 (30 µM) por 24 horas. Estas células foram lavadas duas vezes
em PBS e fixadas com formaldeido (Merck) 3,7% feito em PBS ou com paraformaldeido
nascente (4%) feito em tampão PHEM (25 mM Hepes, 10 mM EGTA, 60 mM Pipes, 2 mM
MgCl
2
, pH 6.9), por 1 hora à temperatura ambiente. Após a fixação, permeabilizaram-se as
células com NP-40 (3% em água) por 40 minutos, e acetona (100% gelada) por 15 minutos, a
-20 ºC. Depois, as lamínulas foram incubadas com ClNH
4
por 15 minutos, a temperatura
ambiente e incubadas com PBS/BSA (3%) por 30 minutos. Após esse período, realizou-se a
incubação com o anticorpo primário anti- P-P42/44 (por 16 horas) ou com faloidina (por três
horas) à 4 ºC. As lamínulas foram bloqueadas novamente com PBS/BSA (por 20 minutos) e a
elas adicionado o anticorpo secundário conjugado com fluorocromo (Alexa 488) por 1 hora, a
temperatura ambiente. Após esta etapa, as lamínulas foram lavadas quatro vezes com água
MiliQ e levadas a reação com DAPI, por 5 minutos. As lamínulas foram lavadas novamente
com água MiliQ e montadas com Vectashield (Vector). As reações foram observadas ao
microscópio de fluorescência Olympus BX51 e as imagens capturadas em câmera Olympus
DP72 (programa Cell; Olympus). As imagens resultantes foram processadas com o auxílio do
programa Adobe Photoshop.
3.10. Viabilidade Celular com azul de Trypan e Anexina V
Antes e após 12, 18 e 24 horas de cultivo em DMEM com glicose, a densidade e
viabilidade celulares foram estimadas. As células foram lavadas em PBS, submetidas a
tripsinização e centrifugação, incubadas com azul de trypan, e contadas em câmara de
Neubauer. Para análise em citômetria de fluxo, foram utilizadas as células após 24 horas de
cultivo em DMEM com ou sem glicose. As células foram lavadas duas vezes com PBS e
tratadas com tripsina. Depois de centrifugadas, as células foram ressuspensas em 500 µL de
PBS e, a seguir, a elas, adicionados 20 µg/mL de iodeto de propídeo ou anexina V. Quando a
marcação foi feita com anexina-V, os tempos de análise foram 12, 15, 18, 21, e 24 horas em
21
DMEM sem glicose: as células foram ressuspensas em 19 µL de tampão de marcação (0,9%
de NaCl, 10 mM Hepes, 2,5 mM de CaCl
2
, pH 7.2) com 1 µL da solução estoque de anexina
V e a incubação realizada por 15 minutos, no escuro, a temperatura ambiente. Depois, as
células foram submetidas a centrifugação e ressuspensas em 500 µL de PBS. Como controle
positivo foram utilizadas células tratadas com 0,6% de saponina e como controle negativo as
mesmas com 2,5 mM de EDTA. As leituras foram efetuadas no citometro de fluxo FACScan
(Bencton & Dickison) em FL3 (Iodeto de Propídeo) ou FL1 (Anexina V) e analisadas com o
auxílio do programa CellQuest Pro (Bencton & Dickison).
3.11. Marcação com dihidroetídio (DHE)
As células foram plaqueadas (8 x 10
5
células por poço) e mantidas em DMEM com
glicose por 5 horas. Após esse período, o meio foi trocado por DMEM com glicose ou sem
glicose, por 24 horas. A marcação com DHE, que reage com radicais superóxidos, foi
realizada com o próprio meio que se encontrava nos poços, adicionando-se 5 µM de DHE,
ficando a 37 ºC no escuro por 20 minutos. Posteriormente, o meio foi lavado com PBS e as
células submetidas a tripsinização. Depois de centrifugadas e ressuspendidas em PBS, as
células foram analisadas por citometria de fluxo em FL3, no programa CellQuest Pro. Quando
a análise foi realizada por microscopia óptica após marcação com DHE, os poços contendo as
células foram lavados com PBS e observados ao microscópio Olympus BX51 (câmera
Olympus DP72 e programa Cell).
Esquema resumindo o procedimento realizado durante os experimentos com células B16F10.
Células cultivadas em DMEM com glicose (GLI+) foram cultivadas em placas de seis poços. Após 5
horas, o meio foi trocado por DMEM sem glicose e teve início a cinética temporal (0-24 horas).
22
4. Resultados
4.1. Indução de melanogênese por privação de glicose
É importante aqui se enfatizar que para se cultivar e se manter linhagens de células
tumorais in vitro é necessária a utilização de meios de cultivo com altas concentrações de
glicose, posto que células tumorais consomem mais glicose do que aquelas não tumorais.
Quando células B16F10 foram plaqueadas em DMEM com alta concentração de glicose (4,5
g/L) e, posteriormente em DMEM sem glicose, elas passaram a apresentar melanogênese. A
quantidade de melanina produzida por células cultivadas por 24 horas em meio sem glicose
foi notória. Células cultivadas em meio com glicose por 24 horas não exibiram nenhuma
indução de melanogênese perceptíveis a olho nu. Para se determinar o tempo necessário para
a ocorrência de melanogênese, realizou-se experimentos de cinética. Células da linhagem
B16F10 foram cultivadas em placas de seis poços por cinco horas, para que todas as células
estivessem aderidas. Em seguida, o meio foi trocado ao equivalente sem glicose e assim
deixadas por até 24 horas. Nos intervalos de 8, 12, 14, 18 e 24 horas, amostras foram
coletadas para se visualizar a quantidade de melanina produzida. Pode-se perceber a olho nu
que o processo de melanogênese teve início após as 14 horas de incubação das células em
meio sem glicose (Figura 4a). Os precipitados resultantes das amostras de 8 e 12 horas
apresentaram colorações muito parecidas com aquelas das amostras controles. Por outro lado,
o precipitado da amostra 19 horas ficou mais escuro que aquela equivalente a de 14 horas.
Entretanto, a amostra de 24 horas ficou mais escurecida que aquela de 19 horas (Figura 4b).
23
a
b
Figura 4. Células mantidas em DMEM sem glicose (GLI-) por até 24 horas. a) Até 12 horas
de cultivo em meio sem glicose não é possível perceber aumento na concentração de melanina. A
partir de 14 horas, as células começam a exibir melanogênese mais acentuada do que aquela que
ocorreu a de 24 horas de cultivo em meio sem glicose. b) Células cultivadas em meio com glicose
(GLI+) no mesmo período de tempo, não apresentaram aumento na concentração de melanina.
Com o propósito de quantificar a melanina encontrada nas células, foi realizada uma
análise espectrofotométrica a 470 nm. As leituras realizadas neste comprimento indicaram
crescente concentração de melanina a medida que se aumentava o tempo de incubação das
células em meio sem glicose. Porém, quando as células eram mantidas durante o mesmo
período de tempo em meio com glicose, elas não apresentaram melanogênese. Portanto, o
24
processo de melanogênese induzido por privação de glicose no meio ocorre de maneira tempo
dependente, sendo iniciada somente após as 12 horas de privação de glicose (Figura 5).
*
Figura 5. Células cultivadas em placas de seis poços (8 x 10
5
células/poço): após 5 horas em
DMEM com glicose, o meio foi trocado por DMEM sem glicose e as células neste foram incubadas
por até 24 horas. As células foram recolhidas e solubilizadas em NaOH 1 N e os produtos analisados
por espectrofotometria a 470 nm. Somente a partir de 14 horas em meio sem glicose foi constatado
aumento na quantidade de melanina, e ocorreu de maneira tempo dependente. * p < 0,001 em relação
ao controle (tempo = 0).
A síntese de melanina é dependente da oxidação de tirosina em DOPA e,
posteriormente, em dopaquinona. A enzima que catalisa essa reação é a tirosinase. Para se
estudar a atividade de tirosinase durante o cultivo sob privação de glicose, foi realizada
eletroforese com lisados obtidos de células cultivadas por até 24 horas .Os géis resultantes
foram incubados em solução contendo 5 µM de DOPA (substrato da enzima tirosinase). Na
presença de DOPA, a enzima ativa reage com o substrato originando marcação escurecida no
gel. As células possuem atividade basal de tirosinase que aumenta de acordo com o tempo de
cultivo em meio sem glicose. O pico de maior atividade de tirosinase ocorreu em 15 horas de
cultivo em privação de glicose. A partir daí, a atividade enzimática começa a decair (Figura
6). Células cultivadas em meio com glicose por 24 horas exibiram atividade da tirosinase mais
0 14 19 24
0.00
0.25
0.50
0.75
tempo (horas)
melanina
µ
µ
µ
µ
g/
µ
µ
µ
µ
l (
λ
λ
λ
λ
=470 nm)
25
baixa que aquela detectada no controle negativo, corroborando com a pouca quantidade de
melanina encontrada nessas células (Figura 6).
60 kDa
Figura 6. Expressão da atividade de tirosinase em células cultivadas por até 24 horas sob
privação de glicose. A enzima expressou maior atividade após 15 horas exibindo diminuição ao longo
do tempo. Células cultivadas por 24 horas na presença de glicose (GLI+) apresentaram menor
atividade da enzima. Imagem representativa de três experimentos.
4.2. Análises morfológicas das células em meio sem e com glicose
Células privadas de glicose por 24 horas apresentaram pequenas alterações
morfológicas. Já aquelas cultivadas em meio com glicose e coradas com Panótico
apresentaram morfologia predominante espraiada (Figura 7a). As células cultivadas por 24
horas em meio sem glicose apresentaram-se mais arredondadas e com menor quantidade de
citoplasma quando coradas com Panótico (Figura 7b). A tal transformação morfológica não se
associa a facilidade das células se soltarem das lamínulas.
Com o intuito de se investigar em detalhes modificações ocorridas no esqueleto das
células cultivadas em meio sem glicose, realizou-se ensaios de marcação com faloidina
conjugada a rodamina. Esta falotoxina liga-se de maneira irreversível a actina filamentosa.
B16F10 cultivadas em meio com glicose apresentaram forte marcação em actina cortical e em
algumas fibras de tensão. Nas células mais espraidas, observou-se marcação pontual no
citoplasma (Figura 8a). Nas células cultivadas sob privação de glicose por 24 horas, a
marcação de actina revelou-se bastante difusa. As células exibiram marcação cortical. (Figura
8b).
26
Figura 7. Microscopia óptica de campo claro de células B16F10 mantidas em DMEM com
(GLI+) ou sem (GLI-) glicose por 24 horas e coradas com panótico. Células mantidas em GLI+
apresentaram morfologias mais espraiadas quanto aquelas mantidas sob privação de glicose (GLI-)
apresentaram-se mais arredondadas. Barra = 30 µm.
27
Figura 8. Células B16F10 reativas a faloidina conjugada a rodamina, vistas por microscopia
de fluorescência. (a) Células cultivadas em meio com glicose (morfologia mais espraiada) apresentam
algumas fibras de tensão (ponta de seta) e marcações pontuais no citoplasma, indicando possíveis
pontos de adesão focal (seta). (b) Células cultivadas sob privação de glicose por 24 horas exibiram
reação ao corante difusa no citoplasma.
Os núcleos reativos a DAPI aparecem em azul. Barra = 10
µm.
28
4.3. Análises da viabilidade das células em privação de glicose
A fim de saber se as células cultivadas em meio sem glicose continuavam viáveis após
24 horas, foram realizados ensaios de viabilidade com azul de trypan. 10
6
células foram
inoculadas e 12, 18 e 24 horas após a troca do meio para sem glicose, alíquotas de suspensão
celular foram coletadas e avaliadas. Após 24 horas de cultivo, 10% do numero total de células
apresentavam coloração positiva para azul de trypan (Figura 9).
Figura 9. Avaliação da densidade e viabilidade de células B16F10 cultivadas por 24 horas em
meio sem glicose (GLI-). Até 12 horas de cultivo, nota-se um aumento no numero de células viáveis
cultivadas sog GLI-. Em 18 horas, densidade de células viáveis atinge seu pico máximo, começando a
decair em seguida. Por outro lado, o numero de células trypan positivas começa a aumentar a partir de
18h de cultivo. Imagem representativa de dois experimentos
Em outro experimento realizado para se determinar a taxa de morte celular induzida
pela ausência de glicose no meio, as células foram previamente incubadas com iodeto de
propídeo e analisadas por citometria de fluxo. Após 24 horas em meio sem glicose, 20% das
células apresentaram marcação positiva para iodeto de propídeo. Em uma cultura cultivada
pelo mesmo período de tempo em meio com glicose observou-se marcação positiva em torno
de 8% (Figura 10). Como o iodeto de propídeo e o azul de trypan só fornecem informações
acerca de alterações de permeabilidade da membrana plasmática, fez-se experimentos
-12h 0h 12h 18h 24h
0
1
2
3
4
5
Trypan (-)
Trypan (+)
GLI (-)
células x10
6
. ml
-1
29
adicionais com anexina V. A anexina V é capaz de se ligar a moléculas de fosfatidilserinas
expostas na membrana plasmática, somente quando as células encontram-se em apoptose. A
marcação com anexina V foi realizada em células cultivadas por 12, 15, 18, 21 e 24 horas em
DMEM sem glicose e em 24 horas nas células cultivadas na presença de glicose. Somente
após 24 horas, as células que se encontravam em meio sem glicose apresentaram aumento
significativo na reatividade a anexina V. Neste período, 13% das células apresentaram
reatividade similar (Figura 11).
Foi realizado um experimento adicional a fim de investigar se as células que se
apresentavam viáveis após 24 horas de cultivo em meio sem glicose seriam capazes de
proliferar em meio com glicose, retornando ao nível dos controles. Depois de ficarem 24
horas em meio sem glicose, as células foram coletadas e ressuspensas em 2 mL de meio com
glicose. Células que não passaram 24 horas sob privação de glicose exibiram taxa de
proliferação mais acelerada, chegando quase a dobrar em número. Células que passaram por
privação de glicose exibiram taxa de crescimento menor, porém mais elevada em relação ao
crescimento encontrado durante as 24 horas de privação de glicose (Figura 12).
Figura 10. Ocorrência (%) de morte celular em culturas mantidas em DMEM com (GLI+) ou
sem (GLI-) glicose por 24 horas. Sob GLI+, 7% das células foram PI positivas enquanto que naquelas
células cultivadas sob GLI- este índice foi de 19%. Portanto, mais de 80% das células quando
cultivadas sob GLI- por 24 horas, mantêm-se viáveis. Experimento conduzido em triplicata.
GLI (+) 24 h GLI (-) 24 h
0
10
20
30
40
50
% células mortas
30
Figura 11. B16F10 cultivadas sob privação de glicose (GLI-) e reagidas com anexina V. Em
12 e 21 horas sob GLI-, não se detectou aumento no número de células PS positivas. Somente em 24
horas houve um aumento em relação ao controle: 13% do total de células reveleram-se PS positivas.
Gráfico representativo de três repetições.
Figura 12. Proliferação celular em meio de cultivo contendo (GLI+) ou não (GLI-). Células
cultivadas em GLI+ apresentam proliferação celular muito maior do que aquelas cultivadas em GLI-.
Quando B16F10 foram cultivadas sob GLI- por 24 horas, e em seguida o meio foi trocado por GLI+, a
proliferação celular chegou ao nível do controle. Experimento conduzido em duplicata.
1
2
h GLI (
-
)
1
5
h GLI (
-
)
1
8
h GLI (
-
)
21 h GLI (-)
24 h GL
I
(-)
24
h
GLI (+)
E
DTA
S
apo
n
i
n
a
0
25
50
75
100
% células PS positivas
0 24 48
0
5
10
15
20
25
30
35
GLI + 24h
GLI - 24h
GLI - 24h/ GLI + 24h
tempo (horas)
celulas x 10
5
31
4.4. Estresse oxidativo na melanogênese
Descreve-se a melanina como molécula capaz de alterar o balanço oxidativo celular.
Em culturas de células B16F10 cultivadas em DMEM com glicose, algumas células
apresentaram melanossomos distribuídos no citoplasma (Figura 13a). Quando as células
foram incubadas com dihidroetídio (DHE) que reage com íons superóxido, e observadas por
microscopia de fluorescência, elas exibiram forte marcação nas mitocôndrias. Algumas
células exibiram marcação ainda mais intensa, dentro e fora das mitocôndrias. Por
microscopia de campo claro, estas células que exibiam tal marcação intensa apresentavam
melanossomos distribuídos pelo citoplasma. (Figura 13).
A melanina pode atuar tanto como molécula antioxidante como pró-oxidante. Quando
o antioxidante N-acetilcisteína (NAC) foi adicionado a culturas celulares mantidas em meio
sem glicose, a produção de melanina foi reduzida de maneira dose –dependente (Figura 14).
Quando analisadas por FACs, células cultivadas sob privação de glicose apresentaram
intensidade de fluorescência bastante parecida com aquela encontrada em células cultivadas
na presença de glicose (Figura 15).
32
Figura 13. Reatividade a DHE 5 µM de B16F10 cultivadas na presença de glicose por 24 horas, e
observadas por microscopia óptica de campo claro (a) e fluorescência (b). Algumas células que
apresentavam melanossomos distribuídos em seus citoplasmas revelaram intensa marcação a DHE
(setas). Barra = 20 µm.
33
Figura 14. Análise da concentração de melanina em células cultivadas por 24 horas na presença
(GLI+) ou ausência (GLI-) de glicose. Células cultivadas sob GLI- apresentam maior índice percentual
de melanina do que aquelas cultivadas sog GLI+. A adição do antioxidante NAC ao meio de cultivo
indiziu de maneira dose-dependente, diminuição na melanogênese anteriormente observada.
Experimento conduzido em duplicata.
Figura 15. Análise realizada por citometria de fluxo da expressão de ROS em células cultivadas em
DMEM com (GLI+) ou sem (GLI-) glicose por 24 horas. A fluorescência decorreu da incubação com
DHE (5 µM). Células cultivadas sob GLI- exibiram fluorescência mádia próxima àquela encontrada
em células cultivadas sob GLI+. Experimento conduzido em triplicata.
GL
I
(
-
)
0 h
GLI
(+
)
2
4
h
GLI
(
-) 24 h
NAC
0
,5 m
M
G
LI (-) 24 h
NAC
5
m
M GLI
(
-)
2
4
h
NAC 5
0
m
M
GLI (
-
)
24
h
0
100
200
300
400
500
% melanina em
8 x10
5
células
GLI (+) 24 h GLI (-) 24 h
0
25
50
75
100
125
Quantidade de ROS (MFI)
34
4.5. Participação de ERK na indução de melanogênese
Com o intuito de se verificar a participação de ERK no processo de melanogênese
induzido por privação de glicose, foram realizados experimentos de imunoeletroforese com
extratos oriundos de células cultivadas em DMEM sem glicose por até 24 horas, foram
incubadas com anticorpo anti-P-P44/P42. As células expressavam constitutivamente P42
fosforilada. Tal expressão decaiu com o tempo, quando as células eram cultivadas na presença
de glicose, visto que depois de 24 horas não havia reatividade ao anticorpo (Figura 16b). P44
(ERK 2) não se apresentou fosforilada em células cultivadas por até 24 horas em DMEM com
com glicose. Quando as células foram cultivadas sob privação de glicose, houve redução na
expressão de P42 fosforilada, observando-se ausência de reação entre 6 e 15 horas de cultivo.
A partir de 15 horas, houve aumento na fosforilação de ERK 2, atingindo pico de reação em
21 horas de cultivo. Após 24 horas de cultivo sob privação de glicose, observou-se redução na
expressão de ERK 2 fosforilada, mas com nível de fosforilação muito mais elevado do que
aquele observado em células cultivadas na presença de glicose. A detecção de ERK 1
fosforilada só pode ser visualizada após 21 horas de cultivo sob privação de glicose, onde se
obteve a fosforilação máxima em ERK 2. Como controle positivo foi utilizada uma amostra
de lisado de células B16F10 expostas à radiação UVB por 15 minutos (Figura 16b). Depois da
exposição a UVB, as células exibiram altas taxas de fosforilação em ERK 1 e 2. Afim de se
examinar se as células cultivadas sob privação de glicose exibiam ERK na sua forma ativa em
alguma região específica citoplasmática, experimentos de imunofluorescência foram
realizados utilizando-se um anticorpo monoclonal anti ERK 1/2 fosforilada. Células
cultivadas por 21 horas na presença de glicose apresentaram fraca reação citoplasmática. Por
outro lado, células cultivadas no mesmo período de tempo na ausência de glicose
apresentaram forte reação citoplasmática para ERK 1/2 fosforilada (Figura 17).
35
a
42 kDa
37 kDa
b
44 kDa
42 kDa
37 kDa
Figura 16. Imunoeletroforese de bandas proteicas originárias de células cultivadas sob
privação de glicose por até 24 horas. Cinco horas após cultivo na presença de glicose (0 hora), as
células exibiram fosforilação em P42 mas não em P44 (a & b). Esse nível de fosforilação decaiu (a)
ficando ausente entre 6 (a) e 15 horas (b) sob privação de glicose. Posteriormente, um pico de
fosforilação foi detectado em 21 horas (b). Nesse momento, foi obtida uma pequena marcação em P44
fosforilada. Após 24 horas, ocorreu redução no nível de fosforilação em ERK2 e ausência de
fosforilação em células cultivadas na presença de glicose (b). Como controle positivo foi utilizada uma
amostra exposta à radiação ultravioleta B (UVB) por 15 minutos (b). Experimento conduzido em
duplicata.
36
Figura 17. Expressão de melanina ems células cultivadas por 24 horas na presença (GLI+) ou
ausência (GLI-) de glicose. Células cultivadas sob GLI- apresentaram maior quantidade (%) de
melanina do que aquelas cultivadas sob GLI+. A adição do inibidor de MEK U0126 (25 µM) ao meio
de cultivo diminuiu a melanogênese induzida por GLI-. Experimento conduzido em triplicata. * P <
0,001 em relação ao GLI (-) 24 horas.
Como ERK na sua forma fosforilada pode desempenhar papel importante na indução
da melanogênese em células cultivadas sob privação de glicose, o inibidor específico de MEK
U0126 foi ensaiado. Quando este inibidor da via de ERK foi utilizado, verificou-se redução
na síntese de melanina nas células cultivadas em meio sem glicose por 24 horas. Por outro
lado, esta redução na melanogênese não foi detectada em células cultivadas em meio com
glicose durante o mesmo período (Figura 18). A incubação de células com U0126 também
alterou a morfologia celular e a capacidade de proliferação das células B16F10. Estas assim
tratadas sob privação de glicose por 24 horas e analisadas por microscopia de fluorescência,
apresentaram-se mais alongadas com forte marcação em fibras de tensão quando reagidas
com faloidina (Figura 19).
GLI (-)
0
h
G
L
I
(+)
2
4 h
U0
126 GL
I
(+
)
2
4
h
G
L
I
(-)
24
h
U01
2
6
G
LI (-) 24 h
DMSO GLI (-)
2
4 h
0
500
1000
1500
*
melanina (%) em
8 x10
5
células
37
Figura 18. Reatividade do anticorpo anti ERK1/2 fosforilada a células cultivadas em meio
com (a) ou sem glicose (b) por 21 horas. a) Células B16F10 apresentaram fraca marcação
citoplasmática quando cultivadas na presença de glicose, enquanto células cultivadas sob privação de
glicose apresentaram forte marcação citoplasmática (b), mas sem evidenciarem marcação nuclear. c)
Reatividade das células ao anticorpo secundário. Barra = 20 µm.
38
Figura 19. Reatividade a faloidina conjugada a rodamina por células B16F10 cultivadas sob
privação de glicose por 24 horas. a) Células sob privação de glicose apresentaram desorganização em
filamentos de actina e morfologia arredondada. b) Quando incubadas com o inibidor de MEK U0126
(25 µM) por 24 horas na ausência de glicose, as células apresentaram profunda modificação
morfológica, exibindo fibras de tensão e “espraiamento”. Barra = 10 µm.
4.6. Participação de AKT, JNK e P38 na indução de melanogênese
A participação de AKT na melanogênese apresentada por células B16F10 foi assim
investigada utilizando-se as mesmas abordagens realizadas para ERK. Análises da expressão
de AKT fosforilada visualizadas por imunoeletroforese demonstraram que a expressão de
AKT decai após 15 horas de cultivo sob privação de glicose. Após 18 horas de cultivo em
DMEM sem glicose, a expressão de fosfo-AKT foi elevada atingido atividade máxima em 21
horas. Em 24 horas de cultivo sob privação de glicose, detectou-se diminuição na fosforilação
de AKT, enquanto a mesma proteína se revelou mais expressa, na sua forma ativa, no mesmo
período em células cultivadas em meio com glicose (Figura 20). A incubação do inibidor
LY294002, da via de AKT, em culturas celulares depletadas de glicose não resultou em
alterações nas quantidades encontrada em relação aquelas cultivadas somente no meio sem
glicose. Em contra partida, quando o inibidor foi adicionado ao meio com glicose, a produção
de melanina por células foi aumentada em relação àquelas cultivadas em meio com glicose
(Figura 21a). Quando as células foram incubadas com LY294002 por 24 horas em meio com
ou sem glicose, elas apresentaram formação de dendritos e reorganização dos filamentos de
actina que se voltavam à região cortical (Figura 22b).
39
60 kDa
43 kDa
37 kDa
Figura 20. Transferência eletroforética de bandas proteicas originárias de células cultivadas
sob privação de glicose por até 24 horas. Cinco horas após plaqueamento (0 hora), as células exibiram
forte fosforilação em AKT. Esse nível de fosforilação decaiu em 15 horas sob privação de glicose e
posteriormente começou a se elevar, atingido pico em 21 horas. Em de 24 horas, houve redução no
nível de fosforilação de AKT (reatividade parecida àquela encontrada em células cultivadas na
presença de glicose). Por outro lado, não se detectou marcação para P38 fosforilado. Como controle
positivo foi utilizada uma amostra exposta à radiação UVB por 15 minutos. Experimento conduzido
em duplicata.
Os dados obtidos com o uso do inibidor de JNK (SP600125), revelam redução na
quantidade de melanina produzida por células cultivadas sob privação de glicose. Por outro
lado, quando este mesmo inibidor foi utilizado em células cultivadas em meio com glicose,
verificou-se efeito contrário (Figura 21b). O inibidor de JNK também foi capaz de alterar a
organização dos filamentos de actina, alterando assim a sua morfologia. Células cultivadas
sob privação de glicose e incubadas com SP600125 por 24 horas apresentaram maior
quantidade tanto de fibras de tensão quanto de prolongamentos citoplasmáticos parecidos com
dendritos (Figura 22c). A morfologia celular exibida após a incubação de células com
SP600125 foi bastante parecida àquela apresentada quando se ensaiou o inibidor de PI3K.
Estes inibidores alteram somente a melanogênese apresentada por células cultivadas na
presença de glicose.
Sob tratamento com o inibidor de p38 (SB202190) houve um pequeno aumento na
melanogênese em células cultivadas sob privação ou não de glicose (Figura 21c). Para se
verificar se p38 se encontrava ativa em algum momento dos experimentos, realizou-se
40
imunomarcação com anticorpo anti-p38 fosforilada. p38 fosforilada não foi detectada em
células cultivadas em meio com ou sem glicose (Figura 20). A inibição da via de p38 também
foi capaz de produzir modificações morfológicas nas células cultivadas sob privação de
glicose. Células incubadas com SB202190 apresentaram reorganização de filamentos de
actina sob a forma de fibras de tensão, e morfologia mais alongada (Figura 22d).
a b
c
Figura 21. Análises de quantidades percentuais de melanina em células B16F10 cultivadas em
DMEM sem glicose por 24 horas na presença ou não de inibidores de MAPK. a) Células cultivadas
sob privação de glicose na presença de U0126 (25 µM) apresentaram menor quantidade de melanina
em relação aquelas controles (GLI-). A adição de LY294002 (20 µM) ao meio com glicose aumentou
G
LI
(
-
)
0
h
G
LI
(
+)
2
4 h
L
Y29
4
002 GL
I
(
+
) 2
4
h
G
LI
(
-)
2
4
h
L
Y
2
9
4
0
0
2
GL
I (-
)
2
4
h
DM
SO
GL
I (-)
2
4
h
0
100
200
300
400
500
melanina (%) em
8 x10
5
células
GLI (
-
) 0 h
GLI (
+
)
2
4
h
S
P
6
0
01
25 GLI (
+
)
24
h
GL
I
(-) 24 h
SP600125
GLI (
-) 2
4
h
D
MS
O GLI (
-) 2
4 h
0
200
400
600
800
1000
1200
melanina (%) em
8 x10
5
células
GLI (-) 0 h
GLI (+) 24 h
SB20
2
190
GL
I
(+) 24
h
GLI (-)
24
h
SB20
21
90
GL
I
(-
)
24
h
DMSO
GLI (-)
24
h
0
500
1000
1500
melanina (%) em
8 x10
5
células
41
a melanogênese. Este efeito não foi detectado quando o inibidor foi adicionado ao meio GLI- (b).
Efeito semelhante foi observado quando SP600125 (30 µM) foi adicionado ao meio de cultivo (c).
Quando SB202190 (30 µM) foi ensaiado, houve aumento na melanogênese tanto em células cultivadas
em GLI- quanto em GLI+ (d). Experimentos conduzidos em duplicata.
Figura 22. Reatividade de células B16F10 a faloidina quando cultivadas sob privação de
glicose por 24 horas, observada por microscopia óptica de fluorescência. a) Células sob privação de
glicose apresentaram desorganização de filamentos de actina e morfologia arredondada. b) Quando
incubadas com LY294002 (20 µM), as células apresentaram formação de dendritos (setas) e poucas
fibras de tensão. c) O tratamento com SP600125 (30 µM) alterou a morfologia celular de maneira
semelhante àquela observada em células tratadas com o inibidor de PI3K. Porém observou-se
formação de fibras de tensão. d) Células tratadas com SB202190 (30 µM) tornaram-se alongadas,
exibindo fibras de tensão. Barra = 10 µm.
42
4.7. Regulação da atividade de tirosinase
Visto que tirosinase exerce papel fundamental na melanogênese, foram realizados
experimentos para se investigar a atividade desta enzima em células cultivadas sob privação
de glicose na presença de inibidores de MEK e P38. Como previamente demonstrado, a
atividade de tirosinase é mais elevada em 15 horas de cultivo sob privação de glicose. Este
tempo de cultivo foi, então, escolhido para se realizar as analises com os inibidores da via de
ERK e P38.
A incubação das células com o inibidor da via de ERK (U0126 25 µM) em meio sem
glicose, por 15 horas, induziu a decréscimos na atividade de tirosinase. A mesma densidade
de células incubadas com o veiculo (DMSO) resultou em atividade maior desta enzima. O
tratamento das células com o inibidor de P38 resultou em atividade de tirosinase semelhante
àquela encontrada nos controles (Figura 23b).
a b
60 kDa
Figura 23. Produção de melanina por células B16F10 ou não na presença do inibidor de
proteassomo MG132 (5 µM), por 24 horas, em meio com ou sem glicose (a). A adição de MG132 ao
meio de cultivo aumentou a concentração de melanina nas células cultivadas em GLI+ ou GLI-. b)
Figura representativa da atividade de tirosinase em células cultivadas por 15 horas sob GLI-. A adição
do inibidor U0126, induziu a diminuição na expressão de atividade de tirosinase. A adição do inibidor
da via de P38 ao meio de cultivo resultou em pequena redução na atividade de tirosinase por parte das
células. A incubação das células em meio contendo o inibidor de proteassomo MG132 reduziu
bastante a atividade da enzima. Experimentos conduzidos em duplicata.
GL
I
(-)
0
h
G
L
I
(+
)
24
h
MG132
2
4h
GLI
(+
)
GLI (-) 24h
M
G13
2
24h
G
L
I (-)
DMSO 2
4
h G
L
I (-)
0
500
1000
1500
2000
% melanina em
8 x10
5
células
43
Como a degradação de tirosinase se faz via proteassomo, ensaiou-se o inibidor MG132
de atividade do proteassomo. A incubação das células com MG132 resultou em aumento de
melanogênese, sob cultivo em meio com ou sem glicose (Figura 23a). A atividade da enzima
poderia estar sendo alterada em virtude do inibidor de proteassomo. Assim, realizou-se um
experimento para se investigar a atividade de tirosinase na presença deste inibidor. O
tratamento das células com MG132 por 15 horas induziu a diminuições na atividade da
enzima, atividade esta muito parecida àquela encontrada no tratamento com o inibidor da via
de ERK (Figura 23b).
MG132 é capaz de inibir a atividade de NF-κB por impedir que a proteína inibitória
IκB seja degradada em proteassomos. Assim sendo, a via de NF-κB poderia de alguma forma,
estar regulando a melanogênese induzida por privação de glicose. Neste contexto, um
anticorpo anti-NF-κB foi ensaiado. NF-κB não se expressou constitutivamente nas células.
Somente a partir 15 horas de cultivo sob privação de glicose detectou-se o antígeno. Porém,
sua expressão diminuiu em células cultivadas por 24 horas na ausência de glicose. Células
cultivadas pelo mesmo período de tempo em meio com glicose apresentaram uma forte reação
para NF-κB (Figura 24).
65 kDa
60 kDa
37 kDa
Figura 24. Imunoeletroforese de extratos originários de células cultivadas sob privação de
glicose por até 24 horas. Cinco horas após o plaqueamento (0 hora), os extratos não exibiram
marcação para NF-κB. Somente após 15 horas foi possível observar-se aumento na expressão deste
fator de transcrição a qual se manteve estável por até 24 horas. Por outro lado, células cultivadas na
presença de glicose por 24 horas revelaram elevada expressão de NF-κB. Como controle positivo foi
utilizada uma amostra exposta à radiação UVB por 15 minutos. Experimento conduzido em duplicata.
44
5. Discussão
A cada ano se observa um aumento no número de publicações relacionadas ao estudo
das respostas celulares ao microambiente tumoral. Assim, conseguir entender o
comportamento celular neste local é um ponto chave para se desenvolver tratamentos mais
eficazes contra diversos tipos de câncer. Dentre os tipos de câncer que acometem o ser
humano, o melanoma é uns dos que apresentam fraca resposta ao tratamento com
quimioterápicos. Este tipo de câncer se desenvolve a partir de célula produtoras de melanina
denominadas melanócitos, onde esta célula quando neoplásica, possui alta expressão de
melanina podendo contribuir para o desenvolvimento tumoral (Riley, 2003). Sendo a
melanina capaz de possuir diversas funções na célula, sua presença pode alterar a fisiologia
celular.
Em nosso estudo, utilizamos como modelo celular a linhagem de melanoma murino
B16F10. Estas células possuem como características principais a capacidade de produzir
grandes quantidades de melanina quando estimuladas e de serem altamente metastáticas in
vivo (Nicolson et al. 1978). Com a finalidade de entender o comportamento celular de
B16F10 em uma massa tumoral, nós desenvolvemos um modelo in vitro para mimetizar as
condições encontradas neste microambiente. Sabe-se que o centro de uma massa tumoral
apresenta uma distribuição precária de nutrientes e oxigênio, e células que se encontram no
centro dessa massa estão num ambiente escasso de oxigênio e nutriente. Normalmente, é
comum de se encontrar no centro da massa tumoral, células necróticas ou em apoptose devido
a fraca distribuição de nutrientes e oxigênio. O cultivo de células tumorais in vitro requer um
meio de cultura rico em glicose, pois estas células possuem um elevado consumo deste
carboidrato em relação àquela célula não neoplásica. Em nosso modelo, nós procuramos
isolar os efeitos da privação de glicose com o intuito de mimetizar as condições encontradas
no centro de uma massa tumoral, mas mantendo a disponibilidade de oxigênio.
O cultivo de B16F10 sob privação de glicose por 24 horas aumentou
consideravelmente a concentração de melanina. Essa produção de melanina parece ser uma
resposta à escassez de glicose no meio de cultivo, visto que as mesmas células cultivadas na
presença deste carboidrato não apresentavam aumento na melanogênese.
A melanogênese tem sido descrita na literatura como uma das características
envolvidas no processo de diferenciação celular de melanócitos (Loercher et al., 2004).
Células precursoras como os melanoblastos, não sintetizam melanina. A migração destas
45
células para a ectoderme e a ativação de Mitf, levam à síntese de melanina, à indução de
vários genes e à formação de dendritos, diferenciando-se assim em melanócitos (Thomas &
Erickson, 2008). Portanto, a melanogênese e as alterações morfológicas causadas pela
formação de dendritos têm sido descritas como características presentes em melanócitos
diferenciados. Em nosso modelo celular, o cultivo sob privação de glicose foi capaz de
produzir somente uma das características descritas acima: a melanogênese. Além da síntese de
de melanina, a proliferação célular em meio sem glicose foi reduzido em relação àquelas
cultivadas na presença deste carboidrato. Essa redução já era esperada em virtude da ausência
de glicose no meio, visto que esta molécula está envolvida na produção de ATP. Durante o
ciclo celular, há um constante monitoramento das condições do meio extracelular com o
propósito de assegurar que a divisão celular ocorra em um ambiente favorável (de Bruin &
Wittenberh, 2009). A ausência de glicose no meio é um sinal suficiente para paralisar as
células na fase G0/G1 do ciclo celular (Cedrola et al., 2004). Apesar da privação de glicose
por 24 horas reduzir a taxa de proliferação celular, esta não inviabilizou as células. Em
experimentos utilizando iodeto de propídeo e anexina V, verificou-se que 80% da cultura
cultivada em DMEM sem glicose por 24 horas permaneceu viável. Como prova disso, a taxa
de proliferação celular tornou a aumentar depois que o meio foi substituido por DMEM com
glicose. Portanto, o estresse causado pela privação de glicose induziu a expressão de um
marcador de diferenciação, a melanogênese, e reduziu a proliferação celular. Contudo, não
conseguiu diminuir a viabilidade celular.
Quando as células eram cultivadas em meio DMEM sob privação de glicose por 24
horas e foram analisadas por microscopia óptica, elas exibiram redução do volume
citoplasmático e uma morfologia arredondada. Esta alteração morfológica seria o resultado da
reorganização de filamentos de actina, deixando a célula com poucos pontos de adesão focal e
fibras de tensão. Células que estão firmemente aderidas ao substrato apresentam uma
aparência “espraiada” com fibras de tensão e inúmeros pontos de adesão focal. A morfologia
arredondada exibida por estas células é comum em células durante o processo de apoptose,
formando blebs de membrana e clivagem de material nuclear. Como os experimentos de
viabilidade celular revelaram que estas células sob privação de glicose se encontravam
viáveis, a relação da morfologia encontrada com apoptose pôde ser descartada.
A adesão celular é capaz de liberar estímulos de sobrevivência e proliferação celular,
mas quando a célula se encontra em suspensão, estes estímulos são cessados [Marastoni et al.,
2008]. Em nosso modelo celular, pode-se dizer que a reorganização do citoesqueleto pode ter
46
levado à redução destes estímulos em virtude da privação de glicose, o que levaria à
diminuição na taxa de proliferação celular observada.
Cedrola e colaboradores (2004) utilizando como modelo as células BL6T que
superexpressam a proteína nPKCδ, demonstraram que a privação de glicose por 168 horas
induziu a síntese de melanina. Em nosso estudo, utilizamos como tempo máximo de cultivo
em DMEM sem glicose o período de 24 horas, pois a partir deste momento as células
começaram a perder aderência ao substrato. Esta grande discrepância de tempo de cultivo
encontrada pode ser explicada através do volume de meio que as células são cultivadas. Todos
os nossos experimentos foram realizados em placas de seis poços com 1 mL de meio por
poço, deixando as células bem próximas ao ar atmosférico simulando uma situação de
normóxia. Certamente, no trabalho realizado por Cedrola e colaboradores (2004), o volume de
meio sem glicose por poço foi maior, permitindo um maior tempo de sobrevivência das
células, apesar dos modelos celulares utilizados serem bastante parecidos. Quando se
aumentou o volume de meio em nossos experimentos, a indução de melanogênese foi
retardada, onde pode-se encontrar células viáveis o período de tempo descrito neste artigo.
Tirosinase é enzima da melanogênese. Em nosso modelo celular, fizemos uma curva
temporal e encontramos o pico de atividade de tirosinase após 15 horas de cultivo sob
privação de glicose. Como essa enzima participa dos passos iniciais e finais da síntese de
eumelanina, era de se esperar que a atividade máxima fosse encontrada antes do tempo de
cultivo onde se obteve maior concentração de melanina (24 horas). A diminuição da atividade
de tirosinase encontrada com 18 horas de cultivo em GLI-, poderia ser explicada pela redução
dos sinais que levariam a síntese de melanina. Dentre os sinais disparados na célula, poderiam
estar incluidos a fosforilação ou desfosrilação de MAPKs, ou até a diminuição do estresse
oxidativo causado pela privação de glicose no meio. Dependendo da concentração intracelular
de espécies reativas de oxigênio (ROS), estas podem atuar na tanto sinalização celular quanto
na indução de efeitos citotóxicos na célula. Em baixas concentrações, ROS podem participar
de vias de sinalizações que induzem a transcrição de diversos genes, na proliferação e
diferenciação celular. Quantidades excessivas de ROS na célula, podem levar a danos no
DNA e nas proteínas (Finkel, 2000 e Fruehauf et al., 2007). Em condições normais, a
homeostase de ROS é mantida através de mecanismos de produção e detoxificação das
mesmas, deixando em uma concentração ideal para participar de sinalizações celulares.
Quando a produção de ROS é maior que a detoxificação, há um aumento do estresse
oxidativo (Finkel & Holbrook, 2000). Na literatura existem alguns trabalhos onde
demonstram o aumento de estresse oxidativo durante o cultivo de células sob privação de
47
glicose. Ahmad e colaboradores (2005) colocaram linhagens de células tumorais humanas em
cultura sob privação de glicose por 8 horas, e demonstraram um aumento na citotoxidade
celular em virtude da geração de peróxido de hidrogênio e ânion superóxido nas mitocôndrias.
Em nosso estudo, verificamos que a privação de glicose não aumentou a concentração de
ânions superóxidos na cultura de células B16F10, não estando assim de acordo com os
resultados descritos na literatura. Valverde e colaboradores (1996) descreveram que a
ativação de tirosinase reduz os efeitos citotóxicos resultantes da geração de ânions
superóxidos em células B16F10. A privação de glicose é capaz de induzir um aumento no
estresse oxidativo onde este poderia atuar na ativação de tirosinase. Portanto, em nosso
modelo celular cultivado sob privação de glicose, podemos sugerir que a atividade de
tirosinase poderia estar sendo regulada pelo aumento no estresse oxidativo, pois após 15 horas
de cultivo sob privação de glicose, a atividade de tirosinase se encontrava elevada, período
este em que se poderia haver um pequeno aumento na produção de ânion superóxido. Após 24
horas de cultivo sob privação de glicose, a produção de ROS nas células B16F10 se
encontrava na mesma intensidade daquelas cultivadas na presença de glicose. Este
concentração de ROS poderia deixar de ativar tirosinase reduzindo assim a atividade da
mesma. Outra explicação para justificar a redução encontrada após 24 horas de cultivo em
meio sem glicose seria que a concentração de melanina já seria suficiente para equilibrar as
defesas antioxidantes da célula.
Com o intuito de verificar se a produção de melanina era decorrente do aumento de
radicais livres intracelulares, foram realizados experimentos com o antioxidante N-
acetilcisteína. Nesses experimentos, verificamos que a adição do antioxidante ao meio de
cultivo sem glicose reduziu a melanogênese, indicando que a produção de melanina nesse
modelo celular é decorrente do estresse oxidativo gerado pela ausência de glicose no meio.
Portanto, a molécula de melanina poderia estar exercendo uma função antioxidativa,
preservando a célula contra as injúrias criadas pelo excesso de radicais livres. Em uma cultura
mantida em DMEM com glicose, algumas células apresentaram melanossomos distribuídos
em seus citoplasmas. Quando foi ensaiado o marcador fluorescente DHE, que possui
afinidade por ânion superóxido, em células cultivadas em DMEM com glicose, ao observa-las
por microscopia óptica de fluorescência, vimos que elas apresentaram uma forte marcação.
Estas células possuiam também melanossomos distribuidos no citoplasma, corroborando
assim com a hipótese previamente descrita.
Além do estresse oxidativo, a regulação da melanogênese pode ser regulada por
diversos fatores, como ativação de fatores de transcrição e vias de sinalização que envolvem
48
a ativação de MAPKs. Alguns trabalhos encontrados na literatura descrevem a participação de
ERK durante a melanogênese. Englaro e colaboradores (1995) utilizando como modelo
células de melanoma murino B16F10, demonstraram que a adição de AMP cíclico ao meio de
cultivo, induziu a melanogênese e levou a ativação de ERK 1 (P44). A ativação de ERK 1
levaria a translocação da mesma para o núcleo, onde ativaria o fator de transcrição AP-1. Em
nosso estudo, demonstramos que a ativação da via de ERK acontecia somente após o cultivo
sob privação de glicose. Sabendo-se que a ausência de glicose no meio eleva a concentração
de AMP cíclico em células B16 (Cedrola et al., 2004), a ativação da via de ERK obtida em
nosso estudo está de acordo com os resultados descritos na literatura (Englaro et al., 1995).
Estudos demonstraram ainda que o aumento de AMP cíclico intracelular em melanócitos ativa
Ras GTPase, levando a fosforilação da cinase B-Raf. Uma vez que esteja ativada a via de
ERK, esta fosforilaria Mitf, induzindo a transcrição dos genes tirosinase e levando a
melanogênese (Buscá & Ballotti, 2000). Apesar da via de ERK ter sido ativada, existe uma
diferença na ERK ativada, onde na literatura há a descrição de fosforilação em ERK 1 (P44) e
em nosso trabalho demonstramos somente a fosforilação em ERK 2 (P42). Essa diferença
encontrada de ativação poderia ser explicada pela mudança de estímulo dado às células, onde
no primeiro caso, a indução da melanogênese era efetuada pelo aumento de AMP cíclico nas
células e no segundo pela privação de glicose. Apesar das duas situações induzirem
respectivamente, de maneira direta ou indireta, um aumento de AMP cíclico intracelular,
durante a privação de glicose poderia haver outras sinalizações que iriam se sobrepor àquela
induzida pela elevação de AMP cíclico, fosforilando somente ERK 2 em vez de ERK 1. A
fosforilação em ERK 2 não parece ativar o fator de transcrição AP-1, como havia sido
descrito na literatura (Englaro et al., 1995), pois a distribuição de P42 fosforilado quando
observado por microscopia óptica de fluorescência nas células cultivadas sob privação de
glicose, era essencialmente citoplasmática. Em nosso estudo, a inibição da via de ERK pelo
inibidor U0126 suprimiu a melanogênese induzida pela privação de glicose, indicando um
papel chave desta MAPK na regulação da melanogênese.
A inibição da via de ERK também foi restaurou a morfologia celular quando as células
eram cultivadas sob privação de glicose. Grande parte das ERKs ativadas vão em direção ao
núcleo para fosforilar substratos neste local. Porém, de 10 a 30% da quantidade total de ERK
fosforilada, ficam no citoplasma ligadas ao citoesqueleto, onde nunca se desprendem. Alguns
trabalhos demonstraram que ERK 2 participa na organização do citoesqueleto, orientando a
actina e o posicionamento de adesões focais (Rubinfeld & Seger, 2005; Reszka et al., 1997).
Portanto, com a inibição da via de ERK, poderia haver uma estabilização na organização do
49
citoesqueleto, mantendo assim, uma morfologia semelhante àquela encontrada nas células
controle. Porém, estudos neste assunto ainda são muito contraditórios, deixando a resposta
deste resultado em aberto.
P38 também é descrita na literatura atuando também na regulação da melanogênese.
Experimentos realizados com a linhagem de melanoma humano Mel-Ab demonstraram que o
cultivo em temperaturas elevadas era capaz de levar a ativação de ERK, diminuindo a
melanogênese. Por outro lado, o aquecimento levou a ativação de P38, onde houve a indução
da melanogênese (Kim et al., 2007). Neste mesmo trabalho, a utilização do inibidor
farmacológico da via de P38 (SB203580) e a incubação deste no meio das células cultivadas a
44ºC, levou a diminuição da atividade de tirosinase, como também à redução da
melanogênese. A utilização deste inibidor também reduziu a síntese de melanina induzida
pelo hormônio estimulador de melanócito α (MSH-α) (Smalley & Eisen, 2000). P38 em nosso
modelo, parece exercer um efeito contrário daquele descrito na literatura. A inibição da
atividade de P38 elevou a síntese de melanina tanto nas células cultivadas na presença como
na ausência de glicose. Com este resultado, demonstrou-se que existe entre os tipos celulares
e estímulos, variações na regulação da melanogênese, não havendo possibilidade de descrever
uma única via regulatória em todas as linhagem de melanócitos. Em nosso trabalho, P38 não
foi encontrado fosforilado em células cultivadas sob privação de glicose, e a inibição desta via
de sinalização pelo SB202190, induziu o aumento na melanogênese. Analisando os resultados
obtidos, podemos sugerir que neste método de indução, a simples inativação de P38 não é
suficiente para induzir a melanogênese, pois esta cinase se encontrou ativada quando as
células foram estimuladas por radiação UVB. Porém, a ativação desta cinase por UVB
poderia ser explicada pelo estresse causado nas células durante a exposição, levando s
ativação desta via, mas não havendo nenhuma participação na regulação da melanogênese.
Portanto, o inibidor de P38 utilizado poderia estar induzindo de forma indireta a
melanogênese nestas células. Quando as células foram tratadas com SB202190, houve uma
pequena redução na atividade de tirosinase. Essa leve redução não estaria de acordo com o
aumento da concentração de melanina encontrada em nossos experimentos. A hipótese
levantada para explicar o papel de P38 seria que a ativação desta cinase seria é consequência
do estresse causado nas células, seja este por privação de glicose, radiação UVB ou cultivo
em altas temperaturas. Portanto, para descrever a função de P38 na regulação da melanogênse
seria necessário verificar outras vias de sinalização ativadas por cada estímulo descrito, e
encontrar alguma interligação entre essas vias e a de P38. Essa interligação entre as vias de
sinalização, poderia explicar também, as alterações morfológicas encontradas quando as
50
células foram cultivadas na presença do inibidor de P38. As células B16F10 cultivadas com
SB202190 exibiram uma morfologia celular muito parecida daquela encontrada nas células
cultivadas com o inibidor da via de ERK. Como o cultivo na presença destes inibidores
apresentou respostas contrárias na regulação da melanogênese, este resultado fortalece a
hipótese de que as alterações morfológicas ocorridas em células cultivadas com o inibidor de
P38 tenham sido efeitos secundários da inibição dessa via de sinalização, e não pela ação
direta da cinase no citoesqueleto.
Outra MAPK avaliada neste estudo foi a cinase ativada por estresse JNK. A ativação
desta cinase em virtude da ausência de glicose no meio de cultura e pela exposição à radiação
ultravioleta foi descrita em células tumorais de próstata humana (Song & Lee, 2006). Em
nosso estudo, vimos que a inibição da via de sinalização de JNK aumentou a melanogênese
em células cultivadas na presença de glicose. Por outro lado, a inibição desta via reduziu a
síntese de melanina em células cultivadas sob privação de glicose. De acordo com os nossos
resultados, JNK poderia estar participando de forma ambígua da regulação da melanogênese
nas células B16F10, pois dependendo dos sinais desencadeados na célula, seja pela presença
ou ausência de glicose no meio, JNK poderia possuir um comportamento diferente. A
privação de glicose é capaz de aumentar o nível de estresse celular, e este, poderia modular a
atividade de JNK. Como as células cultivadas na presença de glicose possuem um nível de
estresse menor em relação àquelas cultivadas sob privação de glicose, essa hipótese não
justificaria o aumento da melanogênese encontrado com a inibição da via de JNK. Portanto,
JNK poderia ter um papel secundário durante a regulação da melanogênese em células
B16F10 cultivadas sob privação de glicose.
A inibição da via de JNK pelo inibidor SP600125 alterou a morfologia das células
B16F10 cultivadas em meio sem glicose. Este inibidor promoveu a formação de dendritos e
fibras de tensão nestas células. Estudos realizados com este inibidor demonstraram que a
inibição da via de JNK reduz a migração de queratinócitos de peixe, fibroblastos 3T3,
queratinócitos epidermais, fibroblastos da derme humana e células de Schwann (Huang et al.,
2003; Javelaud et al., 2003; Kavurma & Klachigian, 2003; Kawauchi et al., 2003; Xia et al.,
2000; Yamauchi et al., 2003; Zhang et al., 2003). Estudos recentes demonstraram ainda que
JNK está envolvida na formação de lamelipódios e filopódios em embriões de Drosophila,
(Martin-Blanco et al., 2000; Kaltschmidt et al. 2002), como também na regulação de fibras de
tensão em células de mamíferos (Zhang et al., 2003). Portanto, a formação de dendritos e
fibras de tensão em células B16F10 cultivadas sob privação de glicose, quando tratadas com o
inibidor SP600125, seria uma reorganização do citoesqueleto em virtude da inibição da
51
atividade de JNK. Este resultado estaria de acordo com os dados encontrados na literatura
onde queratinócitos knock out para MEKK1 (cinase que fosforila JNK) apresentaram acúmulo
de fibras de tensão (Zhang et al., 2003). Apesar da concordância de nossos resultados, não é
possivel generalizar essa conclusão, pois as funções de MAPKs podem variar de acordo com
o modelo celular de estudo escolhido.
A via de sinalização de AKT geralmente é encontrada ativada nos diversos tipos de
câncer. As alterações em células tumorais que são capazes de ativar AKT constituem na
mutação da proteína PTEN, deixando-a na sua forma inativa, ou em mutações nos sítios
catalíticos da subunidade de PI3K. A hiperativação de AKT também pode ocorrer através de
mutações oncogênicas em genes de Ras e pela ativação dos receptores de crescimento
(Brooks-Robey & Hay, 2009; Brugge et al., 2007). Como a constante ativação de AKT é uma
característica presente em células tumorais, há uma concordância que esta cinase poderia
regular o metabolismo celular, mais especificamente a glicólise e a fosforilação oxidativa
(Brooks-Robey & Hay, 2009). A ativação de AKT pode levar a diferentes respostas celulares,
como a ativação de vias anti-apoptóticas, a um aumento dos níveis de ATP intracelulares,
como também a indução de ROS. Em nosso estudo, verificou-se que AKT se encontrava
ativado em células B16F10 cultivadas na presença de glicose, corroborando com a informação
descrita na literatura. Porém, após 15 horas de cultivo sob privação de glicose, as células
B16F10 apresentaram uma menor expressão de fosforilação em AKT. Depois deste momento,
o nível de fosforilação aumentou após 18 e 21 horas de cultivo, voltando a diminuir após 24
horas. Para explicar essa variação de ativação encontrada durante o cultivo sob privação de
glicose, levantamos a hipótese de que ATK estaria desativado nos tempos de cultivo iniciais
pela ação de fosfatases. Fosfatases são proteínas responsáveis pela regulação da
desfosforilação e desativação de MAPKs em mamíferos (Dickinson & Keyse, 2006). Estas
fosfatases poderiam ter sido ativadas com o propósito de cessar o pool de fosforilações
resultantes do processo de tripsinização, visto que AKT se encontrava bastante fosforilado
após 5 horas de cultivo em DMEM com glicose. A fraca ativação de AKT decorrente da ação
de fosfatases, através de um mecanismo de feedback, este poderia elevar novamente a
fosforilação em AKT, gerando sinais anti-apoptóticos nas células, retornado assim o seu nível
de ativação basal após 24 horas de cultivo.
Alguns trabalhos já demonstraram que a via de sinalização de AKT é capaz de
interferir com a organização do citoesqueleto (Wymann & Arcaro, 1994; Wennström et al.,
1994; Kotani et al., 1994). Buscà e colaboradores (1996) utilizando-se da linhagem de
melanoma murino B16F10, demonstraram que o inibidor LY294002 aumentava a
52
melanogênese através da inibição da cinase p70S6, e induzia a formação de dendritos através
da inativação de Rho. p70S6 é uma serina/treonina cinase envolvida na translação e
progressão do ciclo celular, sendo capaz de induzir a expressão e ativação de tirosinase por
mecanismos até agora não desvendados (Busca & Ballotti, 2000). Em nosso modelo celular,
esse inibidor aumentou a síntese de melanina somente em células cultivadas em meio com
glicose, não alterando a melanogênese em células cultivadas sob privação de glicose. Por
outro lado, a presença deste inibidor no meio de cultivo, induziu a formação de dendritos em
B16F10 como ocorrido no estudo feito em 1996 (Buscà et al.). Com base em nossos
resultados, sugerimos que a inibição da via de AKT poderia ser responsável pela formação de
dendritos e que a inibição da cinase p70S6 levaria ao aumento da melanogênese através da
fosforilação de Mitf, visto que AKT se encontrou fosforilado durante o cultivo sob privação
de glicose.
Tirosinase é uma peça chave durante a síntese de melanina. Uma das vias descritas
envolvidas na regulação da atividade de tirosinase, é a adição de ubiquitinas na mesma para
posterior degradação nos proteassomos (Halaban et al., 1997). A elevada degradação de
tirosinase está relacionada com algumas desordens de pigmentação de pele (Halaban et al.,
2000). Ando e colaboradores (2006) demonstraram que a composição dos ácidos graxos pode
afetar a atividade de tirosinase através da degradação da mesma nos proteassomos. Para
verificar se esta via poderia estar regulando a atividade de tirosinase nas células B16F10
cultivadas sob privação de glicose, realizamos um ensaio com o inibidor da atividade de
proteassomo MG132. O tratamento com MG132 diminuiu a atividade de tirosinase, deixando-
a com uma atividade parecida com aquela encontrada em células tratadas com o inibidor da
via de ERK. Porém, a incubação com MG132 aumentou a síntese de melanina neste modelo
celular. Este resultado obtido não estaria de acordo com a atividade de tirosinase encontrada
nos experimentos realizados com MG132, e para tentar entender essa diferença, fomos
investigar se o fator de transcrição NF-κB poderia estar envolvido na melanogênese. NF-κB é
um fator de transcrição que está ligado a diversas etapas do processo tumoral, regulando
genes associados a transformação, proliferação, apoptose, angiogênese e a diferenciação
celular. Normalmente, NF-κB se encontra inativo no citoplasma, e sua ativação é controlada
por proteínas inibitórias (IκB α/β). Após um determinado estímulo, IκB sofre ubiquininação e
degradação proteossomal, permitindo que NF-κB seja translocado para o núcleo e modifique
a expressão de vários genes (Ghosh & Karin, 2002). Em nosso estudo, verificamos que a
expressão de NF-
κB era ausente após 5 horas de cultivo em DMEM com glicose e estava
expresso durante o cultivo sob privação de glicose. NF-κB estava expresso em células
53
cultivadas por 24 horas na presença de glicose. A expressão de NF-κB nas células não
indicaria necessariamente, que este fator esteja ativado, e em nos nossos experimentos não
fizemos a distinção de amostras nucleares e citoplasmáticas. Contudo, podemos sugerir que a
inativação de NF-κB poderia estar participando da melanogênese, visto que a inibição da
atividade proteassomal foi capaz de aumentar a síntese de melanina.
Enfatizamos que a maioria dos dados publicados até o momento sobre a regulação da
melanogênese, advém de experimentos realizados em linhagem de melanoma cultivados na
presença de glicose. Entretanto, análises desta regulação em ambientes carentes de oxigênio,
glicose e com pH ácido, se faz necessário para compreender os reais papéis da melanina
durante o desenvolvimento tumoral.
54
6. Conclusões
Face aos resultados obtidos, concluímos que:
1. A ausência de glicose no meio é capaz de induzir a melanogênese nas células B16F10
aumentado a atividade da tirosinase, reduz a taxa de proliferação, mas não diminui a
viabilidade celular.
2. A privação de glicose induz uma reorganização no citoesqueleto deixando as células menos
“espraiadas” e sem formação de fibras de estresse, apresentando somente uma característica
do processo de diferenciação celular.
3. A melanogênese induzida pela ausência de glicose é regulada pela MAPK ERK 2 e não
ERK 1. A ativação desta cinase é necessária durante a melanogênese, visto que inibição dessa
via reduziu a síntese de melanina nas células e alterou a morfologia.
4. P38 parece exercer um papel secundário na regulação da melanogênese, pois apesar de sua
inibição aumentar a síntese de melanina, esta parece ser uma reação ao estresse causado pelo
inibidor. A alteração na morfologia celular como também uma pequena redução na atividade
da tirosinase provavelmente foram induzidos pelo estresse provocado pelo inibidor de P38.
5. JNK e AKT não possuem nenhum efeito na regulação da melanogênese quando as células
são cultivadas sob privação de glicose. Porém, a inibição dessas vias de sinalização alteram a
morfologia celular através da formação de dendritos, característica presente no processo de
diferenciação celular.
6. O aumento da melanogênese causado pela inibição da atividade do proteassomo parece ser
resultado da inibição de NF-κB, pois o inibidor MG132 diminuiu a atividade da tirosinase.
7. A síntese de melanina é uma resposta ao estresse oxidativo causado pela privação de
glicose, pois o antioxidante N-acetilcisteína foi capaz de reduzir a melanogênese.
55
7. Referências Bibliográficas
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