( PDF ) Padrões de distribuição de heterocromatina e regiões organizadoras de nucléolos em "cascudos" (Siluriformes, Loricariidae) do rio Xingú

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS E BIOLOGIA

CELULAR

PADRÕES DE DISTRIBUIÇÃO DE HETEROCROMATINA E REGIÕES

ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS EM “CASCUDOS”

(SILURIFORMES, LORICARIIDAE) DO RIO XINGÚ

EMANOEL OLIVEIRA DOS SANTOS

BELÉM – PARÁ

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS E BIOLOGIA

CELULAR

PADRÕES DE DISTRIBUIÇÃO DE HETEROCROMATINA E REGIÕES

ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS EM “CASCUDOS”

(SILURIFORMES, LORICARIIDAE) DO RIO XINGÚ

EMANOEL OLIVEIRA DOS SANTOS

BELÉM – PARÁ

2006

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Neurociências e Biologia

Celular, da Universidade Federal do Pará, como

parte dos requisitos para a obtenção do título

de Mestre.

Área de Concentração: Biologia Celular

Orientador: Prof. Dr. Edivaldo H. C. de Oliveira

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“Um homem sempre lembrará de

duas coisas em sua vida:

seus pais e seus filhos.”

(Autor Desconhecido)

“Num axioma que aplicais às vossas ciências.

Não há efeito sem causa. Procurai a causa de

tudo o que não é obra do homem e a vossa

razão responderá de Quem é.”

Allan Kardec

Dedico este trabalho a meus filhos:

Karen, Bruno, Bruna e Karell,

por ordem de chegada

em minha vida.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por Sua Força Infinita de Amor e Justiça.

A meus admiráveis pais, Adalberto e Maria Santos, que me favoreceram a

vida e dentro de suas condições, me deram a oportunidade de crescer em todos os

sentidos, e mesmo sem compreender exatamente o que faço, sempre estiveram ao

meu lado.

Ao Prof. Dr. Edivaldo Herculano C. de Oliveira, meu Orientador, por ter

aceitado este desafio, pela dedicação, pela amizade, pela paciência, pela confiança

depositada em mim, pelas criticas, pelas sugestões, e por tudo de bom que ele

representa a todos que os rodeiam.

Ao Prof. Dr. Julio César Pieczarka e a Profa. Dra. Cleusa Nagamachi pela

atenção e carinho, sempre disponíveis no Laboratório de Citogenética Animal da

UFPA.

Aos colegas de Laboratório que foram muitas vezes consultados por mim, nos

momentos das muitas dúvidas, alguns destes “irmãos científicos” como a Marcela, o

Fábio, e a Patrícia (baiana), e também, a Carol, o Danilo (negão), o Anderson

(andarilho), a Susana, o Paulo e a Liane, a Daniela, o Pablo, a dona Conceição

e ao Augusto e o Jaime Jr. por auxiliarem na identificação de algumas espécies.

Ao Técnico do Laboratório Jorge Rissino, grande companheiro do chá de

canela de todas as tardes, que entre as muitas virtudes, só possui um grande

defeito: torcer muito mal no futebol.

A Karine, minha esposa, que me apoiou e incentivou em todos os

momentos_ sem você e nossos bebês, o caminho até aqui teria sido mais dificil.

A Marina, minha admirável sogra, pelas palavras de incentivo e força nos

momentos certos.

A meus filhos Uely, Nuno, Nuninha e Karell que tiveram paciência, e mesmo

dentro do seu mundo infantil, compreenderam a ausência do seu papai em vários

momentos.

A meus irmãos: Adalberto, Aldeisa, Acácio, Antonio, Cristina, Everaldo,

Elizabeth e Rosangela, que estando próximos ou distantes, de alguma forma, me

apoiaram neste percurso.

Aos meus avós (in memorian), Ulisses, Vicentina, Alberto e Irene, muito

carinho e muitas saudades.

A Profa. Selma Gomes que me alfabetizou, e não desistiu deste seu aluno

num momento muito delicado de sua vida, além de que, mostrou-me o valor da

profissão de ser Professor.

Ao casal Kazuko e Getúlio Tsuchiyama pela amizade, carinho, conselhos e

incentivo para desenvolver este trabalho, que muito mais do que patrões, sempre

estiveram presentes como amigos de uma longa jornada.

E a todas as pessoas, que não foram citadas, que ao longo deste percurso

contribuíram para a minha formação pessoal e profissional.

Finalmente ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia

Celular, extendo-se a todos os professores deste programa, a UFPA, ao IBAMA por

fornecer algumas espécies estudadas, e a CAPES pelo apoio financeiro durante a

realização do curso.

RESUMO

Três espécies de cascudos - Glyptoperichthys xinguensis, Pseudacanthicus sp.,

Scobinancistrus aureatus – pertencentes a família Loricariidae, do Rio Xingu-PA,

foram estudados citogeneticamente usando marcação convencional por Giemsa,

bandeamento C, Ag- NOR e marcação DAPI. O número diplóide foi o mesmo nas

espécies, com 2n=52. Contudo, algumas diferenças cromossomicas puderam ser

identificadas. Nenhum heteromorfismo cromossômico sexual foi identificado. Blocos

de heterocromatina constitutiva apresentaram uma distribuição similar entre as

espécies, nas regiões pericentroméricas e nas regiões distais nos braços longos de

alguns pares. Alguns desses blocos foram marcados pelo DAPI, indicando riqueza

de bases A-T. Ag-NOR foi encontrada no braço longo de um par subtelocêntrico e

subtelo/acrocentrico, exceto em Glyptoperichthys xinguensis na qual a marcação Ag-

NOR foi num par submetacêntrico. Os resultados demonstraram que essas espécies

possuindo número diplóide similar, algumas diferenças cromossômicas poderiam ser

usadas em sua identificação.

Palavras-Chaves: Loricariidae, Citogenética, Número Diplióide, Banda C, Ag-NOR,

DAPI.

ABSTRACT

Three species of sucker-mouth - Glyptoperichthys xinguensis Pseudacanthicus sp.,

Scobinancistrus auratus – belonging to family Loricariidae, from Xingu River, PA -

Brazil, were studied cytogenetically using conventional Giemsa staining, C-banding,

Ag-NOR and DAPI staining. Diploid number was the same in all the species, with

2n=52. However, some slight morphologic differences could be identified. No

heteromorphic sex chromosomes were identified. Constitutive heterocrhromatic

blocks showed a similar distribution in the species, in the pericentromeric region and

in the distal region of the long arm of some pairs. Some of these blocks were stained

by DAPI, indicating they are rich in A-T. Ag-NOR label was located on the long arm of

a subtelocentric and subtelo/acrocentric pair, except in Glyptoperichthys xinguensis,

in which the NOR-bearing pair was submetacentric. The results demonstrated that

although these species had similar diploid number, some chromosomal differences

could be used to identify species.

Key Words: Loricariidae, Cytogenetic, Diploid Number, C-Banding, Ag-NOR, DAPI.

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Distribuição da família Loricariidae (ARMBRUSTER, 1997)................................07

Figura 02. Esquema geral de um Loricariidae (NELSON, 1994). .........................................08

Figura 03. Detalhe da boca circular de Pseudacanthicus sp (acari assacu), mostrando o par

de barbilhões (setas maiores) e os dentes bífides (seta menor) ...........................................08

Figura 04. Relações Filogenéticas dos Siluriformes (ARMBRUSTER, 2004). ....................17

Figura 05. Filogenia de HOWES (1983) baseada em osteologia e miologia.........................19

Figura 06. Árvore filogenética para os Loricariidae, proposta por SCHAEFER

(1986,1987).............................................................................................................................20

Figura 07. Árvore filogenética para os Loricariidae proposta por ARMBRUSTER (1997)

baseado em características osteológicas. .............................................................................21

Figura 08. Filogenia das tribos de Hypostominae, proposta por ARMBRUSTER (1997)

baseado em características osteológicas. ............................................................................22

Figura 09. Árvore filogenética para os Loricariidae inferiores proposta por MONTOYA-

BURGOS et al. (1998) baseado em seqüências gênicas de RNAr mitocondrial 12S e 16S.

................................................................................................................................................23

Figura 10. Árvore filogenética para os Loricariidae superiores proposta por MONTOYA-

BURGOS et al. (1998) baseado em seqüências gênicas de RNAr mitocondrial 12S e 16S.

...............................................................................................................................................24

Figura 11. Filogenia de Pterygoplichthys e gêneros relatados por WEBER (1992), baseado

em osteologia e características externas. ..............................................................................26

Figura 12. Vista lateral de Glyptoperichthys xinguensis.

.......................................................40

Figura 13. Vista lateral de Scobinancistrus aureatus. ...........................................................40

Figura 14. Vista dorsal de Scobinancistrus aureatus.............................................................40

Figura 15. Vista ventral-lateral de Scobinancistrus aureatus.................................................41

Figura 16. Vista lateral de Pseudacanthicus sp. ...................................................................41

Figura 17. Vista superior de Pseudacanthicus sp. ...............................................................41

Figura 18. Cariótipo por coloração convencional de Glyptoperichthys xinguensis................51

Figura 19. Metáfase com bandeamento C de Glyptoperichthys xinguensis, as setas indicam

pares ricos em heterocromatina constitutiva. ........................................................................51

Figura 20. Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o

cromossomo portador da NOR em Glyptoperichthys xinguensis. .........................................52

Figura 21. Metáfase de Glyptoperichthys xinguensis. Corada com DAPI, as setas indicam os

cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas. .......................................................52

Figura 22. Cariótipo por coloração convencional de Scobinancistrus aureatus....................54

Figura 23. Metáfase com bandeamento C de Scobinancistrus aureatus, as setas indicam

pares ricos em heterocromatina constitutiva. ........................................................................54

Figura 24. Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o

cromossomo portador da NOR em Scobinancistrus aureatus. .............................................55

Figura 25. Metáfase de Scobinancistrus aureatus corada com DAPI, as setas indicam os

cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas. .......................................................55

Figura 26. Cariótipo por coloração convencional de Pseudacanthicus sp............................57

Figura 27. Metáfase com bandeamento C de Pseudacanthicus sp., as setas indicam pares

ricos em heterocromatina constitutiva....................................................................................57

Figura 28. Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o

cromossomo portador da NOR em Pseudacanthicus sp........................................................58

Figura 29. Metáfase de Pseudacanthicus sp., corada com DAPI, as setas indicam os

cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas.........................................................58

Figura 30. Esquema comparativo das NORs entre os espécimes (a) Glyptoperichthys sp.,

(b) Glyptoperichthys xinguensis, (c) Pseudacanthicus sp. (d) Scobinancistrus

aureatus..................................................................................................................................66

LISTA DE TABELAS

Tabela 01- Sinonímias das tribos propostas por ARMBRUSTER (2004) para a subfamília

Hypostominae. .......................................................................................................................10

Tabela 02- Tribos e gêneros da subfamília Hypostominae e seus sinônimos

(ARMBRUSTER, 2004)..........................................................................................................10

Tabela 03- Hipóteses da Especiação Geográfica na Amazônia durante o período Terciário e

o Quaternário (Cenozóico), como proposto por vários autores, segundo HAFFER (1997). .13

Tabela 04- Mudanças Hidrogeológicas documentadas que teriam influenciado a grande

diversidade de peixes de água doce nos Neotrópicos (MONTOYA-BURGOS, 2003)...........16

Tabela 05- Número Cromossômico e Fórmula Cariotípica das espécies estudadas...........63

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................01

1.1 Considerações Gerais sobre os Peixes..............................................................01

1.2 Considerações Gerais sobre a Ordem Siluriformes, com ênfase na família

Loricariidae.................................................................................................................03

1.3 A Subfamília Hypostominae................................................................................09

1.4 O Contexto Temporal da Diversificação dos Peixes Neotropicais......................12

1.5 Aspectos Filogenéticos da Família Loricariidae.........................................16

1.6 Citogenética de Peixes...................................................................26

1.6.1 Heterocromatina Constitutiva e Fluorocromo A-T específico.........................29

1.6.2 As Regiões Organizadoras de Nucléolo (NORs)............................................31

1.7 Aspectos Citogenéticos dos Siluriformes............................................................32

1.7.1 Dados Citogenéticos na família Loricariidae...................................................33

2 OBJETIVOS........................................................................................................38

2.1 Objetivo Geral....................................................................................................38

2.2 Objetivos Específicos.........................................................................................38

3 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................39

3.1 Espécies Analisadas..........................................................................................39

3. 2 Técnicas Utilizadas..........................................................................................42

3.2.1 Técnica de Indução de Mitoses.......................................................................42

3.2.2 Obtenção dos Cromossomos Mitóticos...........................................................42

3.2.3 Preparação Citológica das Lâminas................................................................44

3.2.4 Técnica de Coloração Convencional...............................................................44

3.2.5 Técnica para o Bandeamento C......................................................................45

3.2.6 Técnica para detecção da Região Organizadora do Nucléolo (NOR).............46

3.2.7 Técnica de Marcação com DAPI......................................................................46

3.2.8 Análise Cromossômica e Captura de Imagens................................................47

3.2.9 Técnica de Revelação Fotográfica...................................................................48

3.3 Medidas Cromossômicas...................................................................................49

4 RESULTADOS......................................................................................................50

4.1 O Cariótipo de Glyptoperichthys xinguensis......................................................50

4.2 O Cariótipo de Scobinancistrus aureatus..........................................................53

4.3 O Cariótipo de Pseudacanthicus sp..................................................................56

5 DISCUSSÃO................................................................................................59

5.1 Análise Cromossômica e Fórmula Cariotípica...................................................60

5.2 Heterocromatina Constitutiva e Fluorocromo A-T específico............................63

5.3 As Regiões Organizadoras de Nucléolo (NORs)..............................................64

5.4 O Uso de Dados Citogenéticos na Identificação de Espécies...........................66

6 CONCLUSÔES....................................................................................................70

7 REFERÊNCIAS ....................................................................................................72

8- ANEXO – Preparo das Soluções..........................................................................82

1 INTRODUÇÃO

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS PEIXES

Os peixes representam à maioria das espécies de vertebrados,

estimando-se em aproximadamente 24.618 o número de espécies válidas, o que

corresponderia aproximadamente à metade dos vertebrados conhecidos, sendo

encontrados em praticamente todos os tipos de massas de água doce e salgada do

planeta (NELSON, 1994). Mesmo sendo a maior diversidade conhecida de

vertebrados, boa parte destes extraordinários animais ainda não é conhecida pela

ciência, o que dificulta seu estudo. Isto se verifica principalmente na América do Sul,

que apresenta a mais rica fauna de peixes de água doce do mundo (AURICCHIO &

SALOMÃO, 2002).

Os peixes ancestrais não possuíam mandíbula, eram bentônicos e

pertencentes à superclasse Agnatha. A maioria dos agnathos está extinta, mas esta

superclasse ainda é representada pelas lampréias e peixes-bruxa. Com a evolução

das mandíbulas e dos apêndices pares, os peixes tornaram-se mais ativos e

capazes de se alimentar de diferentes maneiras. Os peixes mandibulados atuais

estão divididos em dois grandes grupos: Chondrichthyes, com esqueleto

cartilaginoso, e Osteichthyes, com esqueleto ossificado pelo menos em parte, sendo

a maioria dos peixes atuais pertence a este grupo (NELSON, 1994).

Os Chondrichthyes estão divididos em duas subclasses,

Elasmobranchii (tubarões e arraias) e Holocephalii (quimeras). Na Amazônia só foi

registrada a presença de peixes da subclasse Elasmobranchii, a qual está dividida

em apenas duas ordens: Lamniformes e Rajiformes (FERREIRA et al., 1998).

Os Osteichthyes evoluíram de ancestrais desconhecidos há pouco

mais de 400 M.a. Por volta de 150 M.a depois, estes peixes eram superados em

número, primeiro pelos Placodermos, depois pelos Chondrichthyes, mas desde o

inicio do Permiano, os peixes ósseos tem dominado as águas do planeta. Desde o

fim da era Mesozóica estes peixes têm sido os mais abundantes de todos os

vertebrados. Seus hábitats e estruturas parecem ser tão diversos quanto permite a

adaptação comum à vida aquática. A maioria dos peixes desta classe tem crânio,

vértebras, cinturas, raios das nadadeiras e escamas ósseos. Alguns têm cartilagem,

que substituiu secundariamente o osso presente nos ancestrais. Os peixes ósseos

são os únicos vertebrados que possuem as brânquias de cada lado do corpo, no

interior de uma câmara comum recoberta por um opérculo ósseo móvel

(HILDBRAND, 1995).

Os Osteichthyes estão divididos em quatro subclasses, com destaque

à dos peixes cujas nadadeiras dispõem de raios de sustentação, a Actinopterygii

(BRUM, 1995). Nesta subclasse encontramos a maioria dos peixes ósseos, e que se

dispõem em três grupos denominados: Chondrostei (esturjões), Holostei (peixe-

lagarto) e Teleóstei, os quais são considerados como formando uma seqüência

evolutiva pela ordem dos nomes, diferenciando-se em relação ao grau de

ossificação do esqueleto, mobilidade ou pareamento de certos ossos do crânio e da

cintura escapular, forma das nadadeiras dorsal e caudal e presença ou não de

espiráculo (HILDBRAND, 1995).

Os Teleóstei estão distribuídos em cerca de 37 ordens, constituindo o

mais numeroso e bem sucedido grupo de peixes. Dentre os Teleósteos, o grupo

Euteleóstei caracteriza-se por constituir um clado extremamente grande, com cerca

de 31 ordens (NELSON, 1994). Neste grupo destacam-se os Ostariophysi que

apresentam a mais larga distribuição mundial, com quase a totalidade das espécies

dulcícolas, cerca de ¾ dos peixes de água doce do mundo (BRUM, 1995). A

superordem Ostariophysi agrupa cerca de 85% das espécies amazônicas, das quais

43% estão incluídas na ordem Characiformes, 39% na ordem Siluriforme e 3% nos

Gymnotiformes (LOWE-McCONELL, 1987).

A ordem Siluriforme é atualmente dividida em 34 famílias, distribuídas

na Ásia, África, Américas e Europa. Há cerca de 412 gêneros e das 2400 espécies

atuais, aproximadamente 1440 estão no Novo Mundo (NELSON, 1994). Nas águas

doces sul-americanas são encontradas 14 famílias, sendo 12 de ocorrência na

Amazônia brasileira (FERREIRA et al., 1998).

No sistema que compõe o rio Xingu, CAMARGO et al. (2002) listaram

473 espécies pertencentes a 15 ordens e 47 famílias, sendo as ordens mais diversas

em termos de número de espécies: Characiformes (210), Siluriformes (146),

Perciformes (62) e Gymnotiformes (20), e ainda Clupeiformes (10) e Rajiformes (06).

Já ao nível de família, as mais ricas em termos de número de espécies foram:

Characidae (118), Cichlidae (57), Loricariidae (55), Anastomidade (18), Doradidae

(17), Auchenipteridae (16) e Hemiodontidae e Heptapteridae (12 espécies cada).

1.2 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE A ORDEM SILURIFORMES, COM

ÊNFASE NA FAMÍLIA LORICARIIDAE

A diversidade de formas, tamanho corporal e hábitats nos Siluriformes

sul-americanos, especialmente na superfamília Loricaroidea, é extraordinário. Dentre

as famílias de Siluriformes, apenas uma é exclusivamente marinha e duas famílias

apresentam representantes marinhos e de água doce (RAPP PY-DANIEL, 2000).

A maioria das espécies de Siluriformes pode provocar graves

ferimentos com seus espinhos e injetar um veneno, produzido por células

glandulares do tecido epidérmico, localizadas na base desses espinhos. Muitos

destes peixes apresentam o corpo achatado, dorso-ventralmente, adaptados à vida

bentônica. Uma grande parte das espécies é noturna ou crepuscular. Muitas são

carnívoras, mas outras se alimentam principalmente de algas que são raspadas das

folhas, pedras e galhos submersos (NELSON, 1994). Devido a tais hábitos, o estudo

de sua biologia se torna mais difícil (DIAS, 1987). De uma maneira geral, são peixes

mais sedentários e encontram maiores dificuldades para transpor cachoeiras, ou

corredeiras que se interpõem às suas migrações limitadas (BRITSKI, 1981).

Esta ordem agrupa peixes caracterizados pelo corpo sem escama,

coberto por pele nua (lisa) ou por placas ósseas, apresentam barbilhões ao redor da

boca, normalmente em três pares. Os dentes são pequenos e curvos, agrupados em

faixas ou placas semelhantes a uma lixa. As nadadeiras peitorais e dorsais são

geralmente guarnecidas com espinhos providos de serras nas margens (BRITSKI et

al., 1984; FERREIRA et al., 1998).

Este clado inclui desde peixes com mais de 2,5 metros de comprimento

e 200 kg, como a piraíba, até espécies muito pequenas, cujos indivíduos adultos não

passam de três centímetros de comprimento total. Algumas espécies produzem sons

que podem ser ouvidos até fora d’água. A maioria possui a capacidade de respirar ar

na superfície, o que os tornam capazes de habitar ambientes pobres em oxigênio,

não suportados por outros grupos de peixes (FERREIRA et al., 1998).

Nos trópicos, os comedores de detritos aquáticos incluem uma grande

variedade de peixes especializados, o que constitui uma importante ligação na

bioenergética dos ecossistemas (LOWE-McCONNELL, 1987). As famílias

detritívoras mais conhecidas na América do Sul são: Prochilodontidae, Curimatidae e

Loricariidae (DELARIVA & AGOSTINHO, 2001). Como recurso alimentar, algumas

espécies de hábitos detritívoros são comuns e muito abundantes em áreas de

várzea da Amazônia central, representando uma significante parcela dos

desembarques da pesca artesanal e comercial (PETRERE JR., 1978; GOULDING,

1980). Constatou-se que algumas espécies de Loricariidae são preferidas por 65%

da população do Alto Juruá (SILVANO et al., 2001), assim como um importante

recurso pesqueiro na bacia do rio Paraná (AGOSTINHO et al. 1989 apud CAMILO,

2004).

A pesca de Loricariidae como peixes ornamentais constitui uma das

mais importantes atividades comerciais no município de Altamira, envolvendo muitas

famílias de ribeirinhos e empresas especializadas em exportação sediadas na

cidade. Esta atividade iniciou quando importadores estrangeiros começaram a visitar

a região regularmente (ZUANON, 1999). De acordo com listas de exportadores, o rio

Xingu é o local de maior importância no Brasil para a captura de acaris, da família

Loricariidae, comercializados como peixes de aquário (TORRES & CARVALHO JR.,

1996 apud SOUZA, 2003).

A família Loricariidae é a maior entre os Siluriformes e está entre as

maiores famílias de peixes, com aproximadamente 700 espécies (ARMBRUSTER &

SABAJ, 2002). Apresenta, cerca de 70 gêneros distribuídos em seis subfamílias:

Lithogeninae (03 espécies), Neoplecostominae (07 espécies.), Loricariinae (209

espécies), Hypoptopomatinae (79 espécies), Ancistrinae (217 espécies) e

Hypostominae (169 espécies) (ALVES et al., 2005), distribuídas exclusivamente na

região Neotropical desde o Panamá até o Uruguai (ISBRÜCKER, 1991), conforme

Figura 01.

Os representantes desta família, comumente chamados de cascudos

ou limpa-vidro, possuem uma boca sempre inferior, com lábios grandes, alimentam-

se de algas e microorganismos aderidos a substratos duros ou a lama do fundo.

Geralmente fazem ninhos para desovar no fundo ou nos barrancos dos rios

(SILVANO et al., 2001; BURGESS, 1989 apud SOUZA, 2003). A Figura 02

representa de maneira geral a morfologia externa dos peixes da família Loricariidae,

segundo NELSON (1994), e a Figura 03 destaca a boca circular de Pseudacanthicus

sp.

Os peixes desta família ocupam hábitats variados demonstrando assim

uma grande capacidade adaptativa que pode ser exemplificada pela sua respiração,

que além das brânquias, também é realizada pelas paredes vascularizadas do

estomago, fato que lhe permite ficar fora da água por longo período. Alguns

loricariideos tem habito iliófago. Adicionalmente sua alimentação consiste de

vegetais e pequenos invertebrados. Em geral são caracterizados por uma baixa

fecundidade, ocasionada pela liberação de poucos ovos. Em certos casos observa-

se pronunciado dimorfismo sexual (MENEZES, 1949a e 1949b apud CAMILO,

2004).

Figura 01- Distribuição da família Loricariidae (ARMBRUSTER, 1997).

Figura 02 - Esquema geral de um Loricariidae (NELSON, 1994).

Figura 03 - Detalhe da boca circular de Pseudacanthicus sp (acari assacu),

mostrando o par de barbilhões (setas maiores) e os dentes bífides (seta menor).

1.3 A SUBFAMÍLIA HYPOSTOMINAE

Para ARMBRUSTER (2004), os Hypostominae estão divididos em

cinco tribos: Corymbophanini, Rhinelepini, Pterygoplichthini, Hypostomini e Ancistrini,

sendo as três primeiras tribos novas propostas pelo autor. As informações a respeito

de Corymbophanini, Ancistrini e Pterygoplichthini ainda são consideradas limitadas,

enquanto os Rhinelepini já foram estudados em detalhes (QUEVEDO & REIS, 2002).

As principais sinonímias e tribos incluídas na subfamília Hypostominae, segundo

ARMBRUSTER (2004), estão indicadas na tabela 01, enquanto na tabela 02 estão

sumarizados os principais gêneros e seus sinônimos, distribuídos em suas cinco

tribos.

Com a inclusão de Ancistrinae (e exclusão de alguns gêneros antigos

desta), Hypostominae tornou-se a maior subfamília de Loricariidae em número de

espécies, com 366 válidas (ARMBRUSTER, 2004).

A variação de tamanho nesta subfamília é incrível, pois inclui gêneros

pequenos como Lithoxus (50 mm) e Acanthicus, o maior de todos os loricariideos

com tamanho máximo em torno de um metro. Os Hypostominae são tipicamente

mais volumosos que outros Loricariideos e geralmente tem placas espessas

(ARMBRUSTER, 2004).

Tabela 01 - Sinonímias das tribos propostas por ARMBRUSTER (2004) para a

subfamília Hypostominae.

SUBFAMILIA HYPOSTOMINAE KNER,1853

Sinonimia:

Inclue:

Ancistri Kner, 1853

Ancistrini Kner, 1853

Hypostomiden Kner, 1853

Corymbophanini nova tribo

Lictores Kner, 1853

Hypostomini Kner, 1853

Plecostomiformes Bleeker, 1862

Pterygoplichthini nova tribo

Chaetostomidi Fowler, 1958

Rhinelepini nova tribo

Tabela 02 - Tribos e gêneros da subfamília Hypostominae e seus sinônimos

(ARMBRUSTER, 2004).

Tribo Gêneros

Acanthicus

Acanthodemus (= Parancistrus)

Ancistomus (= Hemiancistrus)

Ancistrus

Baryancistrus

Chaetostoma

Cordylancistrus

Dekeyseria

Dolichancistrus

Exastilithoxus

Guyanancistrus (= Pseudancistrus)

Hemiancistrus

Hemiancistrus landoni

Hopliancistrus

Hypancistrus

Hypocolpterus (= Chaetostoma)

Lasiancistrus

Leporacanthicus

Leptoancistrus

Lipopterichthys (= Chaetostoma)

Lithoxancistrus (= Pseudancistrus)

Lithoxus

Megalancistrus

Neblinichthys

Oligancistrus (= Spectracanthicus)

Ancistrini

Panaquolus (= Panaque)

Tribo Gêneros

Panaque

Paralithoxus (= Lithoxus)

Parancistrus

Peckoltia

Peckoltichthys (= Peckoltia)

Pristiancistrus (= Ancistrus)

Pseudacanthicus

Pseudancistrus

Pseudolithoxus

Scobinancistrus (= Panaque)

Sophiancistrus (= Peckoltia)

Spectracanthicus

Stoniella (= Pseudacanthicus)

Thysanocara (= Ancistrus)

Xenocara (= Ancistrus)

Zonancistrus (= Dekeyseria)

Corymbophanini

Corymbophanes

Aphanotorulus (=. Hypostomus)

Cheiridodus (= Hypostomus)

Cochliodon (= Hypostomus)

Hypostomus

Isorineloricaria (= Hypostomus)

Squaliforma (= Hypostomus)

Hypostomini

Watawata (= Hypostomus)

Glyptoperichthys (= Pterygoplichthys)

Hemiancistrus annectens group

Liposarcus (= Pterygoplichthys)

Pterygoplichthini

Pterygoplichthys

Canthopomus (= Pseudorinelepis)

Monistiancistrus (= Pseudorinelepis)

Pogonopoma

Pogonopomoides (= Pogonopoma)

Pseudorinelepis

Rhinelepini

Rhinelepis

* NOTA: Os gêneros em negrito referem-se às espécies analisadas no presente trabalho.

1.4 - O CONTEXTO TEMPORAL DA DIVERSIFICAÇÃO DOS PEIXES

NEOTROPICAIS

As principais hipóteses propostas para explicar a formação de barreiras

separando populações e causando a diferenciação das espécies vertebradas na

Amazônia são baseadas nos diferentes fatores, como proposto por HAFFER (1997):

(1) Mudanças na distribuição de terra e mar ou na paisagem devido

aos movimentos tectônicos ou flutuações no nível do mar (Hipótese

Paleogeográfica);

(2) O Efeito barreira dos rios amazônicos (Hipótese dos Rios).

(3) Uma combinação do efeito barreira dos largos rios e mudanças de

vegetação no norte e sul da Amazônia (Hipótese do Refúgio dos

Rios).

(4) O isolamento de blocos florestais próximos na periferia da

Amazônia durante períodos climáticos secos do Terciário e do

Quaternário (Teoria dos Refúgios).

(5) Interações de competição entre espécies e isolamento local de

espécies nas regiões periféricas da Amazônia durante a invasão e

contra-invasão, durante os períodos de quente/frio do Pleistoceno

(Hipótese Distúrbio-Vicariante).

(6) Especiação parapátrica através de rápidos gradientes ambientais

sem separação de populações representativas (Hipótese dos

Gradientes).

A tabela 03 sumariza os principais eventos associados a estas hipóteses

sugeridas.

Tabela 03 - Hipóteses da Especiação Geográfica na Amazônia durante o período

Terciário e o Quaternário (Cenozóico), como proposto por vários autores, segundo

HAFFER (1997).

Hipótese

Paleogeográfica

Hipótese

dos Rios

Hipótese

do Refugio

dos Rios

Hipótese dos

Refúgios

Hipótese dos

Distúrbios

Vicariantes

Hipótese

dos

Gradientes

Redução

florestal

durante

períodos

climáticos

secos do

Cenozóico.

Não considerada

(irrelevante)

Não considerada

(irrelevante)

Enfraquecidas;

afetando

apenas nas

porções

periféricas...

ao Norte e

Sul da

Amazônia

Predominante;

regiões

periféricas

Amazônia central

afetada.

Enfraquecidas;

afetando apenas

nas porções

periféricas

ao Norte e

Sul da Amazônia

Não

considerada

(irrelevante)

Barreiras

separando

populações.

Mar continental,

platôs, planícies

inundáveis.

Rios (e suas

inundações).

Rios largos na

Amazônia

central e

áreas não

florestadas

nas regiões de

cabeceira

Florestas abertas

Regiões não

florestadas; rios

regionais.

Florestas

Ecologicamente

inadequadas

Acentuado

gradiente de

meio

ambiente

Flutuações Climáticas durante o Cenozóico

Umidade / períodos secos

Causa da

formação

de barreiras

Movimentos

tectônicos e/ou

flutuações no nível

do mar

Desenvolvimento

de rios ou

dispersão de

fundadores

através de

barreiras de riso

pré-existentes

Bastante

desconhecido

Predominante;

atreves do efeito

da chuva durante

a subida

tectônica e/ou

descida

Períodos frios /

quentes

Zonas

ligadas

através de

ecótones.

Autores

Emsley (1965)

Para borboletas

Sick (1967),

Capparella

(1988),

Hershkovitz

(1977)

Ayres (1986),

Ayres et al.,

(1992),

Capparella

(1991)

Haffer

(1969,1974),

Vanzolini et al.,

(1970), Vrba

(1993)

Colinvaux (1993)

Endler

(1982)

Para LUNDBERG et al. (1998) a formulação e o teste de hipóteses

gerais sobre a diversidade e diversificação dos peixes neotropicais requer

conhecimento sobre sua filogenia e distribuição no tempo e no espaço. Evidências

fósseis diretas demonstram que no final do Mioceno Médio (ca. 10 Ma) a fauna de

peixes Neotropicais era essencialmente moderna, tanto taxonômica como

ecologicamente. Estes registros incluem muitos clados pequenos de peixes

neotropicais modernos, classificados como gêneros, grupos de espécies e até

algumas espécies, tais como Hoplias, Anastomídeos semelhantes a Leporinus,

Serrasalmineos semelhantes a piranhas, Oxydoras, Loricariideos do grupo

Acanthicus, Ciclideos Ciclineos e Geofagíneos. Colocados em um contexto

filogenético de relações em níveis superiores, alguns destes indicam uma

diversificação simultânea ou ainda mais antiga de linhagens aparentadas.

Existem relativamente poucos fósseis de peixes do inicio do

Cenozóico. Fósseis do Oligoceno tardio revelam linhagens modernas diferenciais de

Characiformes. Fósseis do final do Paleoceno do gênero Corydoras e bagres

altamente derivados indicam uma diversidade de Calictídeos e Loricariideos no inicio

do Cenozóico. Muito da diversificação dos modernos peixes neotropicais ocorreu

durante o período de pelo menos 70 Ma, do final do Cretáceo até o Mioceno. De

qualquer forma, eventos da história da Terra entre o final do Mioceno e o Holoceno

tiveram pouca ou nenhuma importância na criação da grande diversidade de peixes

neotropicais nos níveis de família e gênero. A diversificação dos peixes sem dúvida

prossegue, mas desde o Mioceno isto tem ocorrido em níveis taxonômicos menores

(LUNDBERG et al., 1998).

A resolução da filogenia e taxonomia dos grupos ancestrais marinhos,

ao nível de espécie, poderia ser informativo em relação a uma questão biogeográfica

distinta: a idade da invasão dos ancestrais marinhos nas águas doces sul-

americanas e de sua subseqüente radiação nas águas doces do continente

(MALABARBA et al., 1998).

Para LUNDBERG et al. (1998), o isolamento de sistemas de drenagem

periféricos do sul, oeste e norte do Paraná, Amazonas e Orinoco deram

oportunidades para divergência alopátrica, e foi acompanhada pela extinção local de

várias espécies amplamente distribuída de peixes Neotropicais.

A idéia de que o isolamento geográfico pode ter como conseqüência a

diversificação das espécies, faz muito sentido no modelo de evolução darwiniana

(ESTUDOS...,2003). A Teoria dos Refúgios expõe que a principal diversificação dos

organismos Neotropicais ocorreu recentemente e que as forças primárias foram

oscilações climáticas do Pleistoceno (1,8 milhões a 11.000 anos atrás), que

fragmentou e reconectou hábitats várias vezes (MONTOYA-BURGOS, 2003). Mas a

concordância da Teoria dos Refúgios com a Teoria Sintética da Evolução não é

garantia, de que a megadiversidade biológica tenha surgido por esses mecanismos.

Muitos achados desafiam esta teoria, principalmente no que diz respeito à

diversificação da ictiofauna. (ESTUDOS..., 2003).

Estudos baseados em dados morfológicos da biogeografia de peixes

de água doce da América do Sul sustentam uma importante diversificação que

precede o Pleistoceno (MONTOYA-BURGOS, 2003). Os primeiros fósseis dos

peixes atuais da Amazônia datam da época de erguimento dos Andes, no Mioceno

(JÉGU, 1992).

MONTOYA-BURGOS (2003) sugere a hipótese “Hidrogeológica” para

tentar justificar as forças que atuaram na diversificação dos peixes Neotropicais,

segundo a qual todo um conjunto de alterações hidrogeológicas influenciou a grande

diversidade dos peixes de água doce neotropicais. O autor realizou inferências

filogenéticas baseadas na Alça-D (região controle) do DNA mitocondrial de espécies

de Hypostomus coletados em todos os principais sistemas de rios Neotropicais. Os

resultados indicam que os principais episódios geológico-cladogenéticos na história

evolutiva de Hypostomus ocorreram entre 12 e 4 Ma, durante o Mioceno. As

principais alterações hidrogeológicas que teriam influenciado a diversidade dos

peixes de água doce neotropicais estão sumarizados na tabela 04.

1.5 ASPECTOS FILOGENÉTICOS DA FAMÍLIA LORICARIIDAE

Os Loricariidae fazem parte da superfamília Loricaroidea junto com

Astroblepidae, Scoloplacidae, Callichthyidae, Trichomycteridae, e Nematogeneidae.

São descritos como mais proximamente dos Astroblepidae, e juntos representam o

grupo irmão de Scoloplacidae, uma família compreendida por quatro espécies

miniaturas. Este clado tem como grupo irmão a família Callichthyidae, que é o grupo

menos conhecido em termos de inter-relações filogenéticas. Estas quatro famílias

formam os “Loricaroidea avançados” e representam o grupo irmão de um clado

formado por Nematogeneidae, representado por uma única espécie do sul do Chile,

mais Trichomycteridae (ARMBRUSTER, 2004). As inter-relações entre a família

Loricariidae e seus grupos irmãos estão representados na Figura 04.

Tabela 04 - Mudanças Hidrogeológicas documentadas que teriam influenciado a

grande diversidade de peixes de água doce nos Neotrópicos (MONTOYA-BURGOS,

2003).

Mudança Hidrogeológica Ma Referências

1. Isolamento do Lago Maracaibo do Paleo

Amazonas-Orinoco

8 Hoorn (1993)

Hoorn et al.(1995)

Días de Gamero (1996)

2. Fronteira limite entre o paleo Amazonas-

Orinoco e o sistema Paraná

11,8 – 10

Lundberg et al. (1998)

3. Período de abaixamento do nível do mar

(promovendo a colonização rios e a

conexão de deltas)

6 – 5 Vail & Handebol (1979)

Haq et al.(1987)

Wheeler & Ahron (1991)

4. Costa Oeste do rio Paraíba desconecta-

se do Paraná

Mioceno médio

(16-10)

Riccomini et al. (1990)

Riccomini et al. (1991)

5. Fronteira limite entre o Paraná superior e

a Bacia do São Francisco

Terciário

65-1,8

Beurlen (1970)

6.O Rio Uruguai desconecta-se do Paraná

superior

Mioceno

(24 – 5)

Beurlen (1970)

Figura 04- Relações Filogenéticas dos Siluriformes (ARMBRUSTER, 2004).

O grupo dos loricariideos foi primeiramente denominado de

Gonyodontes (SPIX & AGASSIZ, 1829, apud MONTOYA-BURGOS et al., 1998).

Posteriormente a primeira divisão do grupo foi feita por KNER (1853a, 1853b, apud

MONTOYA-BURGOS et al., 1998) colocando-os em dois subgrupos: Loricariinae e

Hypostominae.

BLEEKER (1862, apud MONTOYA-BURGOS et al., 1998) identificou

duas subfamílias: Plecostominae e Loricariinae.

EIGENMAM & EIGENMAM (1890, apud MONTOYA-BURGOS et al.,

1998) propuseram três subfamílias: Loricariinae, Hypoptopomatinae e

Plecostominae.

REGAN (1904, apud MONTOYA-BURGOS et al., 1998) reconheceu

cinco subfamílias: Plecostominae, Hypoptopomatinae, Loricariinae,

Neoplecostominae e Argiinae.

GOSLINE (1945, 1947, apud MONTOYA-BURGOS et al., 1998) fez a

principal revisão para os Loricariidae, substituindo Argiinae por Astroblepinae e

descreveu uma nova subfamília: os Lithogeninae (= Lithogeneinae), colocando

Astroblepinae como o primeiro grupo divergente seguido por Lithogeneinae,

Neoplecostominae e Plecostominae. Este autor propôs que Loricariinae e

Hypoptopominae formam dois grupos distintos, derivados de Neoplecostominae.

ISBRÜCKER (1980) reconheceu Astroblepinae como uma família e

dividiu Plecostominae em duas subfamílias: Hypostominae e Ancistrinae.

Reconheceu assim seis subfamílias: Lithogeninae, Hypoptopomatinae, Loricariinae,

Neoplecostominae, Hypostominae e Ancistrinae.

HOWES (1983), com estudos de miologia cranial e osteologia, não

encontrou em Ancistrinae e Hypostominae características que as apoiassem como

um grupo natural, conforme a Figura 05.

SCHAEFER (1986, 1987) fez a mais completa filogenia morfológica

para a família Loricariidae, propondo sua divisão em seis subfamílias: Lithogeninae,

Neoplecostominae, Hypoptopomatinae, Loricariinae, Ancistrinae e Hypostominae

(ver Figura 06). O autor encontrou caracteres osteológicos exclusivos que apóiam o

monofiletismo de Ancistrinae, Hypoptopomatinae e Loricariinae, mas suas

evidências sugerem que Hypostominae não formaria um grupo monofilético.

Também foi o primeiro a sugerir que, reconhecendo Ancistrinae como subfamília,

tornaria Hypostominae um grupo parafilético.

Figura 05- Filogenia proposta por HOWES (1983) baseada em osteologia e miologia

cranial.

Figura 06- Árvore filogenética para os Loricariidae, proposta por SCHAEFER

(1986,1987).

ARMBRUSTER (1997), usando principalmente características

osteológicas, analisou as cinco subfamílias mais Lithogeneinae, a qual considerou

como uma subfamília de Loricariidae. O autor propôs duas novas subfamílias:

Hemipsilichthiinae e Upsilodinae, considerando esta última o grupo mais basal

dentro da família. Sugere ainda que, para evitar o problema com o parafiletismo de

Hypostominae, Ancistrinae deveria torna-se uma tribo da mesma, ficando

Ancistrinae

Hypostominae

Loricariinae

Hypoptopomatinae

Neoplecostominae

Lithogeneinae

Astroblepidae

Scoloplacidae

Callichthydae

Trichomycteridae

Nematogenyidae

Loric

ariidae

Hypostominae dividida em cinco tribos: Corymbophanini, Rhinelepini, Hypostomini,

Pterygoplichthini e Ancistrini, conforme mostram as Figuras 07 e 08.

Corydoras

Dianema

Hoplosternum

Astroblepus

Lithogenes villosus

Delturus anguillicaudatus

Upsilodus victori

Neoplecostomus microps

Neoplecostomus paranensis

Isbrueckerichthys alipionis

Isbrueckerichthys duseni

Pareiorhina sp.

Pareiorhina rudolphi

Kronichthys sp.1

Kronichthys sp.2

Hemipsilichthys?

Hypoptopoma sp.

Nannoptopom a spectabila

Otocinclus vestitus

Otocinclus vittatus

Microlepidogaster sp.

Parotocinclus britskii

Schizolecis guentheri

Hemipsilichthys bahianus

Hemipsilichthys sp.

Hemipsilichthys cameroni

Hemipsilichthys nudulus

Hemipsilichthys splendens

Crossoloricaria venezuelae

Crossoloricaria sp.

Loricaria cataphracta

Loricariichthys brunneus

Ixinandria montelbelloi

Rineloricaria rupestris

Harttia sp.

Lamontichthys llanero

Sturisoma festivum

Sturisomatichthys citrensis

Corymbophanini

Rhinelepini

Hypostomini

Pterygoplichthini

Ancistrini

Grupo externoNeoplecostominae

Figura 07- Árvore filogenética para os Loricariidae proposta por ARMBRUSTER

(1997) baseado em características osteológicas.

Corymbophanes andersoni

Corymbophanes kaiei

Pogonopoma wertheimei

Pogonopomoides parahybae

Rhinelepis aspera

Pseudorinelepis genibarbis

Aphanotorulus ammophilus 1

Aphanotorulus unicolor 1

Hypostomus squalinus

Hypostomus emarginatus2

Hypostomus emarginatus1

Isorineloricaria spinosissimus 1

Cochliodon cochliodon 1

Cochliodon hondae 1

Cochliodon plecostomoides 1

Hypostomus sp.angled jaws

Hypostomus cordovae

Hypostomus micromaculatus

Hypostomus robinii

Hypostomus plecostomus

Hypostomus plecostomus2

Hypostomus sp.round snout2

Hypostomus albopunctatus

Hypostomus francisci

Hypostomus bolivianus

Hypostomus sp.round snout1

Hypostomus punctatus

Hypostomus commersoni

Hypostomus boulengeri

Hypostomus panamensis 2

Hemiancistrus holostictus 2

Hemiancistrus maracaiboensis 2

Liposarcus multiradiatus 3

Liposarcus pardalis 3

Pterygoplichthys zuliaensis

Glyptoperichthys gibbiceps 3

Glyptoperichthys lituratus 3

Glyptoperichthys punctatus 3

Pterygoplichthys etentaculatus

Ancistrini

Hypostomini

Figura 08- Filogenia das tribos de Hypostominae, proposta por ARMBRUSTER

(1997) baseado em características osteológicas.

MONTOYA-BURGOS et al. (1998), baseados em seqüências gênicas

de RNAr mitocondrial 12S e 16S, classificaram a família em dois grupos, os

Loricariidae inferiores e os Loricariidae superiores (Figuras 09 e 10). Os autores

propuseram o monofiletismo para a subfamília Loricariinae, porém não encontraram

evidencias que apóiem o monofiletismo das outras subfamílias.

Figura 09 - Árvore filogenética para os Loricariidae inferiores proposta por

MONTOYA-BURGOS et al.(1998) baseado em seqüências gênicas de RNAr

mitocondrial 12S e 16S.

Figura 10- Árvore filogenética para os Loricariidae superiores proposta por

MONTOYA-BURGOS et al. (1998) baseado em seqüências gênicas de RNAr

mitocondrial 12S e 16S.

ARMBRUSTER (1997) considera os gêneros Aphanotorulus,

Cochliodon e Isorineloricaria como sinônimos de Hypostomus, e ainda

Glyptoperichthys e Liposarcus como sinônimos de Pterygoplichthys. WEBER &

MONTOYA-BURGOS (2002) e MONTOYA-BURGOS et al. (2002) sugerem, por

meio de dados osteológicos e moleculares, que o gênero Cochliodon também seja

um sinônimo juvenil de Hypostomus.

No entanto, ARMBRUSTER (2000) por meio de revisão dos dados de

ARMBRUSTER (1997), redescreve alguns gêneros, considerando alguns de

validade duvidosa, os quais devem ser colocados dentro de sinonímias, e que outros

grupos monofiléticos representam na verdade gêneros não-descritos. Desconsidera

as duas subfamílias que criara propondo assim, uma nova filogenia para a família

Loricariidae. O autor propõe a divisão de Hypostominae em cinco tribos

denominadas: Corimbophanini, Rhinelepini, Hypostomini, Pterygoplichthini e

Ancistrini, esta última tribo com todos os gêneros da subfamília Ancistrinae. Os

gêneros Delturus, Lithogenes e Upsilodus foram retirados da família Loricariidae,

sugerindo ainda a descrição de Delturus e Upsilodus como uma nova subfamília.

WEBER (1992) sugere que Pterygoplichthys Gill seja um grupamento

parafilético relativamente fechado com Megalancistrus. Para retificar o parafiletismo,

redescreve o gênero Liposarcus Günther e descreve um novo gênero,

Glyptoperichthys, o qual é considerado o irmão de Megalancistrus, como mostra a

Figura 11.

Embora para muitos taxonomistas a origem dos Siluriformes pareça

ser monofilética, o monofiletismo de alguns gêneros como Hypostomus, tem sido

freqüentemente questionada. Isso se deve aos caracteres morfológicos complexos e

confusos e à significativa variabilidade intra-específica encontrada neste gênero e

gêneros intimamente relacionados (WEBER & MONTOYA-BURGOS, 2002). Ao

nível de família, a filogenia ainda permanece confusa, talvez necessitando da

associação de dados morfológicos, com análises genéticas e citogenéticas, para se

chegar a uma filogenia mais esclarecedora com relação aos Loricariidae.

Figura 11- Filogenia de Pterygoplichthys e gêneros relatados por WEBER (1992),

baseado em osteologia e características externas.

1.6 CITOGENÉTICA DE PEIXES

As informações sobre os cariótipos dos peixes ainda são bastante

escassas, cobrindo apenas 14% das espécies conhecidas. Uma das causas desta

escassez de dados é o tamanho reduzido dos cromossomos da grande maioria de

peixes e a baixa resolução das técnicas de bandeamento, que em mamíferos são

bastante desenvolvidas (BRUM, 1995). Porém após certas modificações e

adaptações nas diversas técnicas propostas principalmente para mamíferos, pode-

se atualmente obter excelentes resultados, incluindo-se alguns bandeamentos,

aplicação de fluorocromos e hibridizações in situ.

De modo geral, o número cromossômico diplóide dos peixes varia de

2n=12 a 2n=250, e a quantidade de DNA de 0,4 pg a 140 pg, além de polimorfismos

Megalancistrus

Glyptoperichthys

Pterygoplichthys

Liposarcus

Hypostomus

intrapopulacionais e intraespecíficos (KIRPICHNIKOV, 1981 apud ANDREATA,

1991). A maioria, entretanto, varia de 2n=44 a 2n=60 (OLIVEIRA & GOSZTONYI,

2000). Esta extensa variabilidade do número de cromossomos fez com que autores

propusessem modelos de distribuição e tamanho populacional que explicam esta

variabilidade em determinados grupos de peixes. Estes modelos seguem uma linha

de raciocínio baseada no fato de que o isolamento de bacias hidrográficas com a

formação de populações alopátricas favorece a especiação (ANDREATA, 1991).

Os estudos citogenéticos em peixes neotropicais iniciaram na década

de 60 por pesquisadores europeus e no inicio da década de 70 por pesquisadores

brasileiros (ARTONI, 1996). Esses estudos, baseados inicialmente em cortes de

tecidos ou esmagamento de embriões, testículos ou tecidos hematopoiéticos tiveram

um notável avanço a partir da década de 70, com a utilização da técnica de

suspensão de células e secagem ao ar (CAMILO, 2004).

Os primeiros estudos cariotípicos em peixes ficaram restritos a

caracterização do número cromossômico das espécies. Tentativas de análise de

modelos evolutivos, utilizando dados genéticos e citogenéticos foram feitas

inicialmente por AVISE & GOLD (1977 apud CASTRO, 2004).

Gradativamente as análises cariotípicas deixaram de ter um caráter

restrito, meramente descritivo, passando a abranger populações. A ocorrência de

variabilidade cariotípica tem sido freqüentemente constatada, fato devido

principalmente à expansão das análises citogenéticas populacionais e a melhoria

qualitativa das técnicas de pesquisa nessa área (FENOCCHIO, 1993).

O levantamento feito por ALMEIDA-VAL et al. (1991) constatou que

nos grupos de peixes da região Amazônica há uma tendência conservativa quanto

ao número e estrutura dos cromossomos das famílias Anastomidae, Curimatidae,

Prochilodontidae (Characiformes) e Cichlidae (Perciformes). Entretanto, observa-se

uma diversidade da variabilidade cromossômica nas famílias Erythrinidae

(Characiformes) e Callichthyidae (Siluriformes).

OLIVEIRA et al. (1988) buscaram relacionar números cromossômicos e

filogenia dentro dos Ostariophysi, verificando uma tendência no aumento do número

cromossômico nas linhagens mais derivadas. Por outro lado, foi possível observar

que, enquanto alguns grupos apresentam uma grande variação de número

cromossômico, outros possuem uma constituição cariotípica bastante estável.

ARNASON (1972 apud DE OLIVEIRA, 1996) propõe que essa estrutura cariotípica

parece estar de um modo geral, relacionada à estrutura populacional das espécies.

Assim, grupos caracterizados por uma grande vagilidade e por populações

compostas de grande número de indivíduos mostram uma constituição cariotípica

estável. Em contraste, grupos com baixa vagilidade e pequeno numero de indivíduos

na população apresentam uma grande variabilidade cariotípica interespecífica e

interpopulacional. Um terceiro grupo formado por organismos com baixa vagilidade,

porém com um número elevado de indivíduos na população, apresentam em geral

espécies com diferentes números cromossômicos, como exemplo (OLIVEIRA et al.

1988), Prochilodontidae, Gymnotiformes e Callichthyidae respectivamente.

Dados indicam a descrição de cariótipos para cerca de 2.600 espécies

de peixes em todo o mundo (OZOUF-COSTAZ & FORESTI, 1992 apud CAMILO,

2004), do montante da ictiofauna neotropical, são conhecidos dados citogenéticos

(números haplóides/diplóides) de cerca de 921 espécies, distribuídas em 252

gêneros e 44 famílias (OLIVEIRA et al., 2000).

Cromossomos sexuais são verificados para 40 espécies e 29 possuem

cromossomos supranumerários; o conteúdo de DNA nuclear de 56 espécies varia de

1,04±0,09 pg em Corydoras cf. simulatus (2n=62), a 8,75±1,50 pg, em Corydoras

metae (2n=92). Considerando que a ictiofauna de água doce dos neotrópicos pode

atingir até 5.000 espécies, tem-se que o numero de espécies citogeneticamente

investigadas é bastante diminuto, frente à diversidade encontrada nesta região

(ARTONI et al., 1999).

Na família Loricariidae constata-se a existência de uma ampla

variedade cariotípica numérica, com números entre 2n=36 cromossomos em

Rinelocaria latirostris (GIULINAO-CAETANO, 1998) a 2n=80 cromossomos em

Hypostomus sp. (ARTONI, 1996).

1.6.1 HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA

O termo heterocromatina constitutiva foi proposto por HEITZ (1928,

apud SUMNER, 2003) para denominar regiões do cromossomo que permanecem

condensadas durante todo o ciclo celular. BROWN (1966 apud DE OLIVEIRA, 1996)

reconheceu dois tipos de heterocromatina: A heterocromatina constitutiva que

permanece condensada durante todo o ciclo celular e em todas as células do

individuo, concentrando-se geralmente em blocos nos cromossomos. Aparece em

ambos os homólogos, na mesma posição, e não contem genes estruturais. O

segundo tipo, a heterocromatina facultativa é por definição um tipo de

heterocromatina que ora se comporta como heterocromatina (mantendo-se

condensada durante a interfase), ora como uma típica eucromatina. Alem disso,

aparece em apenas um dos homólogos de cada par, envolvem cromossomos

inteiros, não aparecem em blocos, e não possui nenhuma particularidade quanto a

composição do DNA.

A função da heterocromatina constitutiva ainda é obscura. Inúmeras

propriedades lhe são atribuídas, tais como facilitar a ocorrência de rearranjos,

manter a estrutura do núcleo celular, favorecer o pareamento na meiose e proteger

regiões geneticamente ativas. Freqüentemente, a mesma caracteriza-se por

apresentar-se em estado condensado, com replicação tardia, composta em grandes

extensões por seqüências curtas e altamente repetitivas de nucleotídeos, chamadas

de DNA satélite. Essas seqüências não transcrevem, sendo por isso geneticamente

inativas, localizam-se em regiões especificas do cromossomo, com tendência a

associar-se com outras regiões heterocromáticas (HSU et al., 1975; BIANCHI, 1978;

BABU & VERMA, 1986 apud DE OLIVEIRA, 1996).

A heterocromatina classificada como constitutiva é universalmente

detectada pela técnica de bandeamento C, de SUMNER (1972), com adaptações

locais. Nesta técnica, o pré-tratamento modifica a estrutura do cromossomo. Sabe-

se também que o bandeamento C não revela todos os tipos de heterocromatina,

utilizando-se alternativamente o tratamento com fluorocromos Cromomicina A

(CMA

), Mitramicina (MM) e 4,6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI), que tem sido

comumente usados para localizar heterocromatinas ricas em G-C e A-T, que são

aparentemente homogêneas pelo tratamento com Banda C e Giemsa (SWARÇA et

al., 2003).

Fluorocromos base específicos tem sido utilizados em peixes, mais

freqüentemente para a análise das regiões organizadoras de nucléolos (NORs). O

uso de fluorocromos, no estudo de regiões heterocromáticas, tem sido menos

abrangente (ARTONI, 1996). No entanto, estas têm se mostrado freqüentemente

ricas em GC, em resposta a Cromomicina A

. MAYR et al. (1988), estudando três

espécies de Salmonideos, constataram a presença de vários blocos

heterocromáticos centroméricos ricos em bases A-T, quando tratados com

DAPI/Actinomicina D.

1.6.2 AS REGIÕES ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS (NORs)

As regiões organizadoras de nucléolos são segmentos de DNA onde

se localizam os genes responsáveis pela síntese de RNAr 18S e 28S. Esses genes

podem estar concentrados em único sitio cromossômico do genoma ou ocorrer em

múltiplos sítios, apresentando distribuição distinta para cada espécie (HSU, 1975

apud DE OLIVEIRA, 1996)

A identificação das NORs em cromossomos metafásicos por meio da

técnica de impregnação com nitrato de prata (GOODPASTURE & BLOOM, 1975;

HOWELL & BLACK, 1980) tem sido uma metodologia simples e eficaz, amplamente

empregada em vertebrados.

Apenas as NORs que estiverem ativas na interfase anterior a mitose

durante a qual a célula foi fixada e corada por nitrato de prata são marcadas,

podendo variar a nível inter e intra-especifico, e mesmo inter e intraindividual quanto

ao número, localização, intensidade e tamanho (GOODPASTURE & BLOOM, 1975).

Essas diferenças são atribuídas tanto as atividades funcionais quanto ao número de

cístrons ribossomais (CHEUNG et al., 1989 apud DE OLIVEIRA, 1996).

A ocorrência de NORs simples tem se mostrado muito freqüente,

embora variações intraespecificas e intraindividuais sejam freqüentemente

observadas (ANDREATA, 1991; ARTONI, 1996; FENOCCHIO, 1993; KAVALCO,

2003; SOUZA, 2003; CASTRO, 2004, entre outros). Situações de heteromorfismos

de tamanho das NORs em relação aos seus homólogos são freqüentes (ARTONI,

1996; CASTRO, 2004; KAVALCO et al.,2005). Segundo GOLD (1979 apud ARTONI,

1996) a diferença de tamanho das NORs entre cromossomos homólogos pode ser

em decorrência não apenas do crossing-over desigual, mas também devido a

duplicação acidental do DNA ou distúrbios regionais na replicação do DNA.

1.7 ASPECTOS CITOGENÉTICOS DOS SILURIFORMES.

Estudos citogenéticos em Siluriformes mostram que o número modal é

2n= 58. A ampla dispersão do número diplóide em diversas modas entre seus

membros sugere que rearranjos cromossômicos foram freqüentemente associados

com os processos de especiação neste grupo. Além disso, a alta freqüência de

números diplóides maiores que 2n=58 (24% das espécies cariotipadas) sugere que

eventos de especiação entre os Siluriformes foram relacionados a um aumento no

número cromossômico. Algumas famílias, tais como Callichthyidae e Loricariidae,

além do incremento no número de cromossomos, também tiveram um aumento no

DNA, sugerindo que eventos de poliploidia podem ter estado presente na história

evolutiva destas famílias (OLIVEIRA et al., 1988). De acordo com LEGRANDE

(1981), o ancestral dos bagres provavelmente tinha 2n=58 cromossomos.

Em Siluriformes, vários estudos citogenéticos foram conduzidos nas

subordens Gimnotoidei e Siluroidei. Na subordem Siluroidei, a estrutura cariotípica

parece ser conservada, sendo que 2n= 56±2 deve representar o numero basal.

Contudo, mesmo neste grupo existem exemplos de intensa diversificação cariotípica,

como em Loricariidae com número cromossômico diplóide variando de 2n=44 a 80

(ARTONI et al., 1999).

A ocorrência de polimorfismos devido à ocorrência de cromossomos

supranumerários, pode ser exemplificado na subfamília Loricariinae (SCAVONE &

JÚLIO JR., 1995).

A determinação de um sistema de cromossomos sexuais, do tipo

ZZ/ZW, com heterogametia feminina, foi encontrado em algumas espécies dos

gêneros Loricariichthys (SCAVONE & JÚLIO JR., 1995), Hypostomus (ARTONI et

al., 1998), e Microlepdogaster (ANDREATA et al., 1993), evidenciando-se nestes

casos uma heterocromatização e alteração de tamanho do cromossomo W e

resultando numa diferenciação dos cromossomos sexuais (ARTONI et al., 1999). O

sistema XX/XY foi descrito em Pseudotocinclus tietensis (Loricariidae) (ANDREATA

et al., 1992).

1.7.1 DADOS CITOGENÉTICOS NA FAMÍLIA LORICARIIDAE

Apesar da grande importância que os Loricariidae representam para a

região Amazônica, poucos têm sido os trabalhos científicos referentes a eles. As

análises citogenéticas feitas até agora sugerem que os principais eventos de

diversificação cariotípica foram os rearranjos Robertsonianos (fissões e fusões),

inversões pericêntricas e poliploidia (MICHELE et al., 1977; ANDREATA, 1991,

1993; ARTONI & BERTOLLO, 1996; SOUZA, 2003; CASTRO, 2004).

Dentro da família Loricariidae, a subfamília Hypostominae é o grupo de

peixes com maior número de espécies cariotipadas, principalmente as pertencentes

ao gênero Hypostomus. Apesar da relevância dos seus dados citogenéticos, existe

pouca concordância dos resultados obtidos entre os vários trabalhos. Isto se deve

ao fato de que esta subfamília apresenta enorme variedade de espécies,

amplamente distribuídas, com seus representantes habitando quase todos os rios e

lagos da América do Sul (CASTRO, 2004).

Um dos marcos do inicio dos trabalhos da citogenética de Loricariidae,

está em MICHELE et al. (1977), que descreveram pela primeira vez o cariótipo de

cinco espécies: Plecostomus paulinus com 2n=74, P. ancistroides com 2n=68, P.

strigaticeps com 2n=74, P. macrops com 2n=68 e Loricaria macrodon com 2n=58.

Estes autores sugeriram que os exemplares do gênero Plecostomus tiveram uma

origem tetraplóide e Loricaria uma origem triplóide. Para as espécies de P.

ancistroides e P. macrops foi encontrado um par heteromórfico, possivelmente de

natureza sexual.

ANDREATA (1991) comparou citogeneticamente oito espécies da

subfamília Hypoptopomatinae, Otocinclus affinis com 2n= 54, Microlepdogaster

leucofrenatus com 2n variando entre 54, 55 e 56, M. depressicauda com 2n=54,

Microlepdogaster sp. com 2n=54, Pseudotocinclus tietensis com 2n=54,

Pseudotithyris obtusa com 2n=54 e Parotocinclus maculicauda com 2n=54 e

Otocinus aff. vetitus, com 2n=72. Em M. leucofrenatus foi identificada a presença de

um sistema de diferenciação sexual do tipo ZZ/ZW e de zero a dois cromossomos

supernumerários. As espécies com 2n=54 apresentaram variabilidade na

constituição cariotípica, localização das NORs e padrões de heterocromatina

constitutiva. Todas as espécies apresentaram um único par de NORs. Segundo o

autor, a variabilidade cariotípica encontrada nas espécies e populações com 2n=54

devem estar relacionadas com a ocorrência de rearranjos do tipo inversão

pericêntrica. Já os rearranjos do tipo fissão/fusão cromossômica parecem estar

envolvidos nas relações cariotípicas entre Otocinus aff. vetitus e as demais

espécies.

SCAVONE & JÚLIO JR. (1994) analisaram peixes do gênero Loricaria

provenientes do rio Paraná, encontrando em Loricaria prolixa um número modal

2n=62 e NF= 84, as NORs situadas em apenas um par de cromossomos e a

heterocromatina constitutiva localizada nas regiões centroméricas e nos braços

longos de um par cromossômico acrocêntrico, sendo esse mesmo padrão descrito

para Loricaria sp.. Esses autores encontraram ainda de zero a cinco cromossomos

supernumerários em fêmeas de Loricaria prolixa e Loricaria sp.

SCAVONE & JÚLIO JR. (1995), analisando 26 espécimes de

Loricariichthys platymetopon, encontraram 2n= 54 cromossomos e NF = 84 em

machos e fêmeas, com um heteromorfismo sexual do tipo ZZ/ZW. A

heterocromatina constitutiva marcou apenas as regiões centroméricas dos

cromossomos sexuais, como ocorre no restante dos cromossomos do cariótipo,

além de todo o braço menor de um par submetacêntrico, onde é coincidente com a

NOR.

ARTONI & BERTOLLO (1996) analisaram o cariótipo de dez espécies

da subfamília Hypostominae: Hypostomus ancistroides com 2n=68, Hypostomus

sp.A com 2n=70, Hypostomus sp.B com 2n=72, Hypostomus regani com 2n=72,

Hypostomus sp.C com 2n=72, Hypostomus sp.D

(1)

com 2n=72, Hypostomus sp.D

(2)

com 2n=72, Hypostomus albopunctatus com 2n=74, Hypostomus aff. auroguttatus

com 2n= 76 e Hypostomus sp.E com 2n=80. Diferenças marcantes no número de

cromossomos metacêntricos, submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos

foram observadas. Algumas espécies apresentaram apenas um par portador de

NOR, com diferenças de tamanho entre os homólogos, enquanto em outras

espécies foram encontradas até seis marcações.

ARTONI & BERTOLLO (1999) analisaram o aspecto e a estrutura da

heterocromatina constitutiva de 30 espécies do gênero Hypostomus. O número

diplóide variou de 2n=68 até 2n=80. Foi observada uma grande variação na fórmula

cariotípica, a qual é evidente neste grupo. Dois tipos de heterocromatina, ricas em

G-C e A-T, foram identificadas com o uso de fluorocromos CMA

e DAPI. Em

algumas espécies as bandas C marcaram principalmente regiões teloméricas e

centroméricas dos cromossomos; em outras espécies, foram observadas marcações

intersticiais.

SOUZA (2003) fez uma descrição cariotípica de peixes dos gêneros

Baryancistrus, Parancistrus, Peckoltia e Ancistrus, usando coloração convencional,

identificação de NORs, bandeamento C e cromomicina A

O autor considerou

2n=52 como o número cromossômico basal para a subfamília Ancistrinae. Ele

observou que os principais mecanismos de rearranjos cromossômicos nesta

subfamília são as inversões, sendo que no gênero Ancistrus foi sugerida a

ocorrência de rearranjos Robertsonianos, o que o torna o mais derivado

cariotipicamente, por apresentar uma redução no seu número diplóide para 2n=48.

Na espécie Baryancistrus aff. niveatus foi observada a presença de blocos

heterocromáticos, ricos em pares de bases G-C, demonstrando ser a espécie mais

derivada do gênero, pois as outras espécies apresentaram poucos cromossomos

marcados pelo Ba(OH)

restringindo-se principalmente ao centrômero. Ainda, os

dados cromossômicos identificaram uma maior proximidade cariotípica entre os

gêneros Baryancistrus e Parancistrus.

KAVALCO et al. (2004) analisaram a estrutura cariotípica e a

composição e distribuição da heterocromatina no cariótipo de quatro espécies da

família Loricariidae: Neoplecostomus microps (Neoplecostominae) com 2n=54,

Harttia loricariformis (Loricariinae) com 2n=56, Hypostomus affinis (Hypostominae)

com 2n=66 e Upsilodus sp. (Upsilodinae) com 2n=96. A quantidade e composição

da heterocromatina foram completamente desproporcionais entre as espécies

estudadas, com uma ocorrência abundante e, sobretudo rica em GC em Upsilodus

sp. e escasso e balanceado em H. loricariformis. Todos os cromossomos de H.

affinis são ricos em heterocromatina, ricas em GC e relacionados com NORs. N.

microps apresentou baixa quantidade de heterocromatina intersticial e rica em GC.

KAVALCO et al. (2005) reanalisaram essas quatro espécies,

adicionando dados da localização do rDNA 18s, obtidos por impregnação de nitrato

de prata e por FISH. N. microps apresentou 2n=54, fórmula cariotípica 24M

20SM 10ST e número fundamental de 108, apenas um par portador de NOR foi

encontrado usando nitrato de prata e FISH, numa posição intersticial no braço longo

do cromossomo submetacêntrico do par 14. H. loricariformis apresentou 2n=56,

fórmula cariotípica 16M 22SM 10ST 8A e NF = 106. A NOR do tipo simples foi

localizada na região terminal do braço longo do par cromossômico acrocêntrico 25.

H. affinis apresentou 2n=66, com fórmula cariotípica 14M 14SM 12ST 26A e NF =

106. Observou-se de dois a cinco cromossomos portadores de NOR, com uma

moda igual a 4; com o uso de FISH, cinco regiões rDNA 18S foram observadas.

Upsilodus sp apresentou o maior número diplóide observado em Loricariideos,

2n=96, com uma formula cariotípica 16M 8SM 72A e um NF = 120. As marcações

por nitrato de prata e 18S-FISH indicaram a presença de uma NOR simples,

localizada na região média do par cromossômico metacêntrico 4, na região terminal

do braço longo.

Na subfamília Hypostominae há uma larga variação no numero diplóide

com valores em torno de 2n= 52 em Liposarcus anisitsi a 2n= 80 em Hypostomus

sp. Em consideração ao alto número de espécies de Loricariidae, o número de

espécies cariotipadas, pode ser considerado como baixa e o ponto mais importante

é que apenas espécies de uns poucos gêneros foram bem estudados (ALVES et al.,

2005).

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral.

Caracterizar citogeneticamente, através de técnicas de citogenética

clássica e aplicação de fluorocromos, as espécies Glyptoperichthys xinguensis

(Weber, 1991), Pseudacanthicus sp. (Bleeker, 1862) e Scobinancistrus aureatus

(Isbrüker & Nijssen, 1989), pertencentes à família Loricariidae, subfamília

Hypostominae, sendo as duas espécies primeiramente citadas pertencente à tribo

Pterygoplichthini e as duas últimas à tribo Ancistrini, coletados no rio Xingú, no

Estado do Pará.

2.2 Objetivos específicos.

• Determinar o número diplóide, número fundamental e morfologia cromossômica

das espécies: Glyptoperichthys xinguensis, Pseudacanthicus sp. e

Scobinancistrus aureatus.

• Analisar a distribuição de blocos heterocromáticos nos cariótipos, através da

aplicação de técnicas de bandeamento C.

• Analisar o número e localização das Regiões Organizadoras de Nucléolos

(NORs).

• Estabelecer o padrão de coloração pelos fluorocromo DAPI.

• Inferir sobre possíveis mecanismos da evolução, com base na análise de dados

cromossômicos.

• Fornecer dados adicionais para a identificação taxonômica das espécies e sua

filogenia.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 ESPÉCIES A NALISADAS

No presente trabalho estudamos as características citogenéticas de

três espécies de peixes da família Loricariidae, conhecidos popularmente como

“cascudos”, “acari”, “limpa-vidros” ou “bodós”, coletadas no rio Xingu, município de

Altamira - PA.

Os espécimes foram processados no Laboratório de Citogenética

Animal, do Departamento de Genética da UFPA, e protocolados da seguinte forma:

- Glyptoperichthys xinguensis. – (Figura 12)

Protocolo Nº P 504

P 529

P 611

P 630_02; P 630_03; P 630_04

- Scobinancistrus aureatus. - (Figuras 13,14 e 15).

Protocolo Nº P 842

P 843

P 851

- Pseudacanthicus sp – (Figuras 16 e 17).

Protocolo Nº P 841

P 844

P 858

P 870

P 971

P 972

Figura 12- Vista lateral de Glyptoperichthys xinguensis (Acari). (disponível

em:http://www.homeklbauter.de)

FIGURA 13. Vista lateral de Scobinancistrus aureatus. (Picota-ouro)

FIGURA 14. Vista dorsal de Scobinancistrus aureatus (Picota-ouro).

FIGURA 15. Vista ventral-lateral de Scobinancistrus aureatus (Picota-ouro)

FIGURA 16. Vista lateral de Pseudacanthicus sp. (Assacu)

FIGURA 17. Vista ventral de Pseudacanthicus sp. (Assacu)

3. 2 T ÉCNICAS U TILIZADAS

3.2.1 Técnica de Indução de Mitoses.

Com a intenção de se obter um melhor resultado no índice mitótico, foi

aplicada a técnica de indução de mitoses por fermento, descrita por COLE &

LEAVENS (1971) para anfíbios e répteis, modificada por BERTOLLO et al., (1986),

para peixes, com o seguinte procedimento:

1. Preparar uma solução de fermento biológico (Fleischmann) na seguinte

proporção: 0,5g de fermento, 0,5g de açúcar e 7ml de água destilada;

2. Incubar a solução em estufa (37º C) por cerca de 20 minutos;

3. Injetar a solução intramuscular na região dorso-lateral do peixe, na proporção

de 1ml para 100g de peso do animal;

4. Deixar o peixe em aquário com sistema de aeração e iluminado, por 24 a 36

horas, antes de ser sacrificado.

3.2.2 Obtenção dos Cromossomos Mitóticos.

No estudo dos cromossomos mitóticos foi utilizada a porção anterior do

rim (rim cefálico), que é o órgão hematopoiético nos peixes, preparado segundo a

técnica de “air drying” modificada, para peixes, por BERTOLLO et al. (1978) que

consiste em:

1. Injetar, intraperitonialmente, uma solução aquosa de colchicina 0,025% na

proporção de 1ml/100g de peso do animal;

2. Manter o peixe em tanque aerado por um período de 45 a 60 minutos, em

seguida sacrificar o animal e retirar o rim;

3. Colocar o rim em uma pequena cuba de vidro contendo 10 ml de solução

hipotônica de cloreto de potássio a 0,075M;

4. Dissociar bem o material. Para melhor separação dos blocos celulares, utilizar

uma seringa de vidro desprovida de agulha, aspirando e expirando suavemente

o material;

5. Levar a suspensão obtida para estufa a 37

C por 30 minutos;

6. Ressuspender, cuidadosamente, o material com auxilio de uma pipeta Pasteur

em seguida transferi-lo para um tubo de centrífuga e adicionar quatro gotas de

fixador Carnoy, recém preparado e gelado a uma temperatura de 4ºC;

7. Centrifugar durante 10 min. a 900 rpm, descartando o sobrenadante;

8. Adicionar, com cuidado, 8ml do fixador Carnoy, deixando escorrer através da

parede do tubo;

9. Ressuspender cuidadosamente o material com auxilio de uma pipeta Pasteur;

10. Repetir os itens 7 a 9 por mais duas vezes. Após a última centrifugação e

eliminação do sobrenadante, adicionar fixador em quantidade suficiente para

obter uma suspensão celular de boa concentração (cerca de 1ml de fixador para

cada 0,5 ml de sedimento).

11. Ressuspender com cuidado e guardar em tubos de ependorff no freezer (-18ºC)

ou trabalhar.

3.2.3 Preparação Citológica das Lâminas

A preparação das lâminas para análise seguiu o procedimento abaixo:

1. Retirar o sobrenadante, separado da suspensão celular por sedimentação

provocada por centrifugação a 1000 rpm por 10 min., com uma pipeta

Pasteur,

2. Acrescentar cerca de 2 ml de fixador Carnoy novo e gelado em cada tubo,

ressuspendendo em seguida. Manter metade do tubo imerso em gelo;

3. Colocar uma lâmina limpa imersa dentro de um Becker pequeno, contendo

água destilada, e aquecer em forno microondas por 45 segundos;

4. Pingar 1-2 gotas da suspensão celular, com uma pipeta Pasteur, sobre uma

lâmina levemente inclinada contendo uma película de água de

aproximadamente 60° - 70°C, de forma que a diferença de temperaturas e a

película de água ajudem a melhor espalhar os cromossomos metafásicos;

5. Deixar o material sobre a lâmina secar em temperatura ambiente ou sobre

uma chapa quente (50°-60°);

6. As lâminas são então guardadas em caixas plásticas apropriadas e mantidas

em temperatura ambiente até o momento de utilização.

3.2.4 Técnica de Coloração Convencional

Para a análise convencional das lâminas em microscópio, o material

citológico é corado com Eosina Azul de Metileno, segundo Giemsa (Merck):

1. Diluir, para cada lâmina, 0,3 ml de corante em 3 ml de Tampão Fosfato pH 6,8

(solução final a 10%);

2. Despejar sobre a lâmina a solução e deixar corar por 10 minutos;

3. Lavar com água destilada e deixar secar.

3.2.5 Técnica para o bandeamento C.

A técnica utilizada para a caracterização da heterocromatina

constitutiva (Banda C), foi basicamente aquela descrita por SUMNER (1972), com

algumas alterações.

1. Pingar duas gotas da suspensão celular em uma lâmina e deixar secar;

2. Imergir a lâmina com pelo menos dois dias de envelhecimento numa cubeta

contendo HCl 0,2 N à temperatura ambiente, por 15mim;

3. Lavar em água destilada e deixar secar ao ar;

4. Incubar a lâmina em uma solução de 2xSSC a 60

C por 15mim;

5. Lavar em água destilada e deixar secar;

6. Incubar a lâmina em solução de hidróxido de bário a 2%, filtrada, a 46° por

alguns segundos;

7. Lavar em HCl 0,2N, para interromper a ação do bário;

8. Incubar a lâmina em uma solução de 2xSSC a 60

C por 30mim;

9. Lavar em água destilada e deixar secar;

10. Corar com Giemsa a 10% por 20min.

11. Lavar com água destilada e deixar secar;

12. Observar ao microscópio e fotografar as melhores metáfases.

3.2.6 Técnica para detecção da região organizadora do nucléolo (NOR).

A técnica utilizada para a caracterização das regiões organizadoras de

nucléolo (NOR) foi aquela descrita por HOWELL & BLACK (1980), com algumas

modificações.

1. Adicionar sobre uma lâmina já com material, uma gota de gelatina aquosa a 2%;

2. Adicionar sobre a gota anterior, duas gotas de solução aquosa de nitrato de

prata a 25%. Misturar levemente e cobrir com lamínula de vidro;

3. Incubar numa câmara úmida em banho-maria a 60

C, por alguns minutos,

dependendo do monitoramento da coloração da lâmina;

4. Após o tempo apropriado, lavar em água destilada, possibilitando que a lamínula

seja retirada pela própria água.

5. Corar com Giemsa a 2%, diluído em tampão fosfato pH 6,8, durante 30

segundos

6. Lavar com água destilada e deixar secar ao ar;

7. Levar ao microscópio e fotografar as melhores metáfases.

3.2.7 Técnica de marcação com DAPI

O fluorocromo DAPI (4’-6-diamidino –2-phenylindole) marca

preferencialmente regiões ricas nos pares A-T. O protocolo seguido foi de

SCHWEIZER (1980) com modificações:

1. Desidratar a lâmina envelhecida em uma bateria de álcoois (Etanol), da seguinte

maneira:

2 min. – álcool 70% (2x)

2 min. – álcool 90% (2x)

4 min. – álcool 100% (1x)

2. Armazenar a lâmina em estufa a 37º C por 2h30min.

3. Mergulhar a lâmina em Formamida 70% a 65ºC, por 45 segundos.

4. Passar a lâmina novamente pela bateria de álcoois (Etanol), da seguinte

maneira:

4 min. – álcool 70% (gelado)

2 min. – álcool 70%

2 min. – álcool 90% (2x)

4 min. – álcool 100%

5. Aquecer a solução de uso do DAPI a 37ºC, por 18 minutos, colocando-se o

recipiente em banho-maria, com a lâmina mergulhada;

6. Adicionar uma gota de antifade sobre o material;

7. Cobrir o material com lamínula de vidro 24x50mm, e gentilmente pressionar em

papel filtro, para saída do excesso de soluções;

8. Aplicar esmalte ao redor da lamínula, e a armazenar em câmara escura, na

geladeira, até o momento da análise.

3.2.8 Análise Cromossômica e Captura de Imagens

Para a caracterização cromossômica foram analisados pelo menos 30

metáfases por indivíduo.

Para estabelecer o número modal de NORs, foram analisadas 15

metáfases completas (com número de cromossomos igual à moda para o

espécime).

Metáfases em coloração convencional foram fotografadas em

microscópio Zeiss, em campo claro e com objetiva de imersão, sendo utilizado o

filme Imagelink Kodak e revelador de papel Dektol, que depois foi copiado em papel

F3 da Kodak. As imagens das preparações de banda C, NOR e DAPI foram

capturadas digitalmente com o auxílio de câmera Zeiss AxioCam MRm por meio do

programa Axio Vision 3.1 (controlador da câmera de vídeo e de captura digital de

imagens). No caso da preparação com fluorescência foi feita uma pseudocoloração

das imagens no próprio programa Axio Vision. Na edição final das imagens, foi

utilizado o programa Adobe Photoshop 6.0.

3.2.9 Técnica de Revelação Fotográfica

Os filmes negativos foram revelados com solução reveladora Kodak

D-76 por 10 minutos e fixados em fixador fotográfico Kodak por também 10 minutos.

Os filmes foram lavados em água corrente por aproximadamente 1 hora.

As cópias fotográficas foram feitas por meio de um ampliador

fotográfico, provido de exposímetro, em papel Kodabrome F3 Print RC Kodak,

esmaltado, reveladas em solução reveladora Kodak Dektol por cerca de 30

segundos, lavadas em solução interruptora (1 ml de ácido acético em 1 l de água) e

fixadas em fixador fotográfico Kodak por 15-30 minutos. Todas as soluções foram

feitas segundo as instruções das embalagens.

As fotografias foram deixadas lavando em água corrente por uma hora

e, posteriormente, foram deixadas em temperatura ambiente para secar.

3.3 MEDIDAS CROMOSSÔMICAS

As melhores fotografias foram recortadas e os cariótipos montados e

organizados aos pares e em ordem decrescente de tamanho em uma folha de papel

ou no próprio ambiente do Adobe Photoshop 6.0.

Para determinar o número de braços (número fundamental -NF), foram

considerados os cromossomos Metacêntricos e Submetacêntricos como tendo dois

braços e os Subtelocêntricos/Acrocêntricos como tendo um.

Os cromossomos foram classificados em três grupos (Metacêntricos,

Submetacêntricos e Subtelocêntricos/Acrocêntricos), em ordem decrescente de

tamanho (LEVAN et al., 1964), de acordo com procedimentos adaptados para este

grupo de peixes (ARTONI & BERTOLLO, 1996).

4 R E S U L T A D OS

4.1 O Cariótipo de Glyptoperichthys xinguensis

Analisou-se seis exemplares de Glyptoperichthys xinguensis (Figura

12), sem considerar a tipagem sexual. A análise cariotípica por coloração

convencional mostrou 2n=52 e NF = 84. O cariótipo é constituído por 05 pares

cromossômicos metacêntricos, 11 pares submetacêntricos e 10 pares

subtelocêntricos, conforme a Figura 18.

Blocos evidentes de heterocromatina constitutiva foram encontrados

nas regiões proximal, distal e pericentromérica em vários pares cromossômicos, já

as regiões centroméricas não apresentaram marcações pelo bandeamento C (Figura

19).

As NORs foram detectadas na posição terminal do braço longo de um

único par cromossômico submetacêntrico (Figura 20).

A coloração pelo fluorocromo DAPI evidenciou regiões concordantes

com alguns blocos heterocromáticos revelados no bandeamento C, como indicado

pelas setas na Figura 21.

Figura 18. Cariótipo por coloração convencional de Glyptoperichthys xinguensis.

Figura 19. Metáfase com bandeamento C de Glyptoperichthys xinguensis, as setas

indicam cromossomos ricos em heterocromatina constitutiva.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 23 24 25 26

Figura 20. Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o

cromossomo portador da NOR em Glyptoperichthys xinguensis.

Figura 21. Metáfase de Glyptoperichthys xinguensis corada com DAPI, as setas

indicam os cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas.

4.2 O Cariótipo de Scobinancistrus aureatus

Foram analisados três exemplares de Scobinancistrus aureatus, sem

considerar a tipagem sexual (Figuras 13, 14 e 15). A análise cromossômica por

coloração convencional mostrou 2n=52 e NF = 78. O cariótipo é constituído por 02

pares cromossômicos metacêntricos, 11 pares submetacêntricos e 13 pares

subtelocêntricos, conforme a Figura 22.

Blocos evidentes de heterocromatina constitutiva foram encontrados

nas regiões proximal e distal em vários pares cromossômicos, já as regiões

centroméricas não apresentaram marcações pelo bandeamento C (Figura 23).

As NORs foram detectadas na posição terminal do braço longo de um

par cromossômico subtelocêntrico (Figura 24).

A coloração pelo fluorocromo DAPI evidenciou regiões concordantes

com alguns blocos heterocromáticos revelados no bandeamento C, como indicado

pelas setas na Figura 25.

Figura 22- Cariótipo por coloração convencional de Scobinancistrus aureatus.

Figura 23- Metáfase com bandeamento C de Scobinancistrus aureatus, as setas

indicam pares ricos em heterocromatina constitutiva.

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11

12 13 14 15 16 17

18 19 20 21 22 23

24 25 26

Figura 24- Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o

cromossomo portador da NOR em Scobinancistrus aureatus.

Figura 25- Metáfase de Scobinancistrus aureatus , corada com DAPI, as setas

indicam os cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas.

4.3 O Cariótipo de Pseudacanthicus sp.

Foram analisados quatro exemplares de Pseudacanthicus sp., sem

considerar a tipagem sexual (Figuras 16 e 17). A análise cromossômica por

coloração convencional mostrou 2n=52 e NF = 86. O cariótipo é constituído por 06

pares cromossômicos metacêntricos, 12 pares submetacêntricos e 08 pares

subtelocêntrico/acrocêntricos (Figura 26).

Blocos evidentes de heterocromatina constitutiva foram encontrados

nas regiões proximal e distal em alguns pares cromossômicos, enquanto as regiões

centroméricas não apresentaram marcações pelo bandeamento C (Figura 27).

As NORs foram detectadas na posição terminal do braço longo de um

par cromossômico submetacêntrico (Figura 28).

A coloração pelo fluorocromo DAPI evidenciou regiões concordantes

com alguns blocos heterocromáticos revelados no bandeamento C, como indicado

pelas setas na Figura 29.

Figura 26- Cariótipo por coloração convencional de Pseudacanthicus sp..

Figura 27- Metáfase com bandeamento C de Pseudacanthicus sp., as setas

indicam pares ricos em heterocromatina constitutiva.

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

11 1 2 13 14 15

16 17 18 19 20

21 22 23 24 25

Figura 28- Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o

cromossomo portador da NOR em Pseudacanthicus sp.

Figura 29- Metáfase de Pseudacanthicus sp., corada com DAPI, as setas indicam

os cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas.

5 D I S C U S S Ã O

Um dos grandes problemas encontrados no estudo de Loricariidae é a

dificuldade de se identificar os animais ao nível de espécie. ARTONI (1996)

considera que a identificação dos gêneros de Hypostomus ao nível de espécie,

assim como sua sistemática se apresenta problemática. WEBER & MONTOYA-

BURGOS (2002) consideram que isto se deve aos caracteres morfológicos

complexos e confusos e à significante variabilidade intra-especifica encontrada neste

gênero e gêneros intimamente relacionados. Estudos citogenéticos nesta família

poderiam contribuir enormemente para a Sistemática Filogenética e a Taxonomia.

Dentre os Loricariidae, a subfamília Hypostominae apresenta uma

indiscutível variabilidade cariotípica, seja no numero diplóide, variando de 2n=52 a

2n=96, seja na fórmula cariotípica, nos padrões de bandeamentos ou no numero e

distribuição das NORs (CASTRO, 2004). Também apresentam uma ampla

distribuição geográfica neotropical, constituindo um dos grupos de peixes com maior

numero de espécies (ARTONI, 1996). Graças a estas particularidades esta

subfamília torna-se de grande interesse para estudos citogenéticos, através dos

quais pode-se inferir mecanismos evolutivos.

O cariótipo das espécies analisadas no presente trabalho, pertencentes

à subfamília Hypostominae, ainda não haviam sido descritos, e evidenciam a

ocorrência do número cromossômico diplóide igual a 52 em todas elas. Entretanto,

por outro lado, observou-se variabilidade na morfologia cromossômica, localização

das NORs e padrão de heterocromatina constitutiva nas diferentes espécies.

5.1 ANÁLISE CROMOSSÔMICA E FÓRMULA CARIOTÍPICA

Os estudos cromossômicos em peixes vêm, cada vez mais, fornecendo

informações sobre a variabilidade de cariótipos encontrados inter e

intraespecificamente. Esta variabilidade cromossômica intraespecifica é o que define

o polimorfismo cromossômico, ou seja, diferentes números e/ou fórmulas

cromossômicas para uma mesma espécie. A ocorrência desse polimorfismo deve-se

a rearranjos cromossômicos, que podem levar a mudanças no número diplóide da

espécie (fissão e fusão) ou apenas a mudanças na estrutura do cromossomo

(inversões, deleções, duplicações e translocações) (WHITE, 1977; JOHN, 1980;

GUERRA, 1988 apud CENTOFANE, 2000).

As diferenças existentes entre cariótipos de diferentes espécies e,

quando presentes, de diferentes indivíduos em espécies cromossomicamente

polimórficas, dependem de rearranjos cromossômicos que ocorreram em um

passado recente ou mais remoto, e estes, podem envolver um, dois ou mais

cromossomos simultaneamente, parecendo depender de dois eventos: quebra dos

cromossomos e inserção do segmento de maneira a diferir da posição original (DE

OLIVEIRA, 1996).

Hoje se sabe que a diversidade cromossômica pode ter implicações

filogenéticas, do mesmo modo que outras características morfológicas, dessa forma,

informações cariotípicas como associações e seqüências gênicas, posição do

centrômero e distribuição da eucromatina e da heterocromatina dentro do genoma,

dentre outras, podem ser utilizadas para a elucidação de problemas taxonômicos e,

conseqüente, fazer inferências filogenéticas (BENAZZI, 1973; PIECZARKA, 1995

apud SOUZA, 2003).

Fazendo uma comparação entre o cariótipo hipotético ancestral dos

Siluriformes que provavelmente apresentava 2n=58 (LEGRANDE, 1981), com o

número cromossômico variando de 2n=44 a 80 para a família Loricariidae (ARTONI

et al., 1999), juntamente com o proposto para a subfamília Hypostominae que

apresenta variação de 2n=52 a 80 (ARTONI, 1996), pode-se supor que esta

subfamília deve ser conservada em sua macroestrutura cariotípica, já que na visão

de ARTONI (1996) a subfamília Ancistrinae é uma das mais conservadas e que esta,

segundo ARMBRUSTER (1997) faz parte da subfamília Hypostominae como tribo

Ancistrini.

Segundo ARTONI & BERTOLO (1996) nas espécies com números

diplóides menores predominam cromossomos com dois braços (metacêntricos e

submetacêntricos), situação que de modo geral se inverte nas espécies com maiores

números diplóides, onde predominam subtelo e acrocêntricos, sendo que os

cariótipos com menor número diplóide são considerados os mais conservados,

enquanto que, os cariótipos com números diplóides maiores são tidos como

derivados, sendo a base principal dessas alterações cromossômicas os rearranjos

Robertsonianos, principalmente fissões cêntricas, que teriam incidido com maior

relevância durante a evolução desse grupo, não implicando, contudo, que as

espécies cariotipicamente mais conservadas sejam consideradas menos evoluídas

que as demais.

Esses dados reforçam a idéia de que rearranjos cromossômicos

sucessivos, possivelmente do tipo fissão cêntrica, poderiam estar envolvidos no

processo evolutivo desse grupo e, dessa maneira, pode-se sugerir que um alto

numero diplóide represente um caráter derivado na família Loricariidae (ALVES et

al., 2005). Dados disponíveis para os gêneros Hypostomus, Liposarcus, Rhinelepis,

Pognopoma e Pterygoplichthys, indicam que tanto rearranjos robertsonianos, quanto

inversões pericêntricas atuaram no processo de diversificação cariotípica dos

Hypostominae (KAVALCO, 2003). Entretanto, é possível que esta diversidade

cromossômica seja também reflexo de uma possível origem polifilética dos

Hypostominae, como indicado pelos estudos de filogenia morfológica (SCHAEFER,

1987). Por outro lado, também são encontradas nesta subfamília variações quanto

aos tipos cromossômicos (ARTONI, 1996), o mesmo podendo ser observados em

outras subfamílias e mesmo intrapopulacionalmente, como em Loricariinae

(GIULIANO-CAETANO, 1998).

Os dados cariotípicos obtidos pelo presente estudo, e demonstrados

na Tabela 05, pertinentes às espécies analisadas mostram uma boa semelhança na

macroestrutura cariotípica, com mesmo número diplóide, porém esta semelhança

cariotípica, segundo ARTONI (1996), não indica similaridade genética obrigatória,

podendo indicar um rearranjo Robertsoniano de fissão/fusão cêntrica em

Hypostominae e Loricariinae, sem alterações na macroestrutura do cariótipo, sugere

ainda uma evolução cariotípica nesta subfamília, acontecendo de forma mais ou

menos homogênea, e mantendo conservada a macroestrutura cariotípica. Nota-se

também pequenas diferenças na morfologia cromossômica, CAMILO (2004)

considera que essas diferenças se apresentam apenas na classificação

cromossômica, não inferindo qualquer alteração significativa quanto à configuração

cromossômica, já MARQUES (2002 apud CAMILO, 2004) considera que populações

de espécies com o mesmo número cromossômico, porém coletadas em localidades

diferentes, podem apresentar variações na estrutura cariotípica, devido a diferenças

nas medidas cromossômicas adotadas entre os diferentes autores, devido a classes

cromossômicas muito próximas ou podem mesmo ser resultado de rearranjos

cromossômicos não Robertsonianos, como inversões e translocações, alem da

adição de heterocromatina, caracterizando citótipos distintos.

Tabela 05- Número Cromossômico e Fórmula Cariotípica das espécies estudadas.

Espécie (2n) Fórmula Cariotípica

Glyptoperichthys xinguensis

2n=52 05 M + 11 SM + 10 ST

Scobinancistrus aureatus

2n=52 02 M + 11 SM + 13 ST

Pseudacanthicus sp.

2n=52 06 M + 12 SM + 08 ST/A

5.2 HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA E FLUOROCROMO A-T ESPECÍFICO.

Nos gêneros estudados neste trabalho, observou-se a presença de

poucas marcações bem evidentes e outras mais pálidas, nos cromossomos tratados

pela técnica de bandeamento C. Estas marcações já foram descritas em outros

grupos de peixes (SWARÇA et al. 2003; SOUZA et al., 2003; MILHOMEM et al. 2003

apud CASTRO, 2004). ARTONI (1996) cita a ocorrência destas marcações em

Hypostomus e em outros grupos e considera que espécies com 2n menores

mostram heterocromatina centromérica ricas em G-C e as heterocromatinas

associadas as NORs ricas em A-T, e que espécies com 2n mais elevados, possuem

a totalidade da heterocromatina rica em G-C. No entanto, CASTRO (2004)

analisando Hypostomus plecostomus (2n=52) do Rio Xingu, encontrou a totalidade

da heterocromatina rica em G-C, enquanto outras espécies de Hypostomus, também

analisadas, mostraram heterocromatina rica em A-T (com exceção dos

centrômeros).

Os cromossomos das espécies estudados neste trabalho apresentaram

heterocromatina constitutiva distribuída somente em alguns pares, e na maioria dos

casos nas regiões próximas ao centrômero, pode-se notar também sua ocorrência

na porção distal do braço longo em alguns cromossomos.

Com o tratamento com o fluorocromo DAPI, nota-se que em alguns

pares as marcações banda C/DAPI são coincidentes, indicando a presença de

regiões ricas em bases A-T, porém em outro pares não ocorre esta coincidência, ou

a marcação não se tornou tão evidente a ponto de caracterizá-la. Esta variabilidade

na composição e distribuição da heterocromatina, observada nestes gêneros

estudados, foi observada de modo semelhante em GORNUNG et al. (1997 apud

MORELLI, 1998), estudando Danio rerio, onde também se observaram regiões

bandas C positivas, que também podiam ser notadas com DAPI. Esses dados

sugerem a ocorrência, nas espécies estudadas, de pelo menos dois tipos diferentes

de heterocromatina: as evidenciadas somente com banda C, e um segundo grupo

das evidenciadas com banda C/DAPI. Provavelmente, os blocos heterocromáticos

evidenciados somente por bandeamento C que não foram marcados com o DAPI

correspondem a regiões ricas em bases C-G.

Os exemplares analisados neste trabalho apresentaram padrões de

distribuição heterocromática muito semelhante. Entretanto, através da análise da

distribuição da heterocromatina é possível inferir que esta característica pode ser

utilizada como marcador populacional para o gênero Glyptoperichthys.

5.3 AS REGIÕES ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS (NORS)

Os exemplares aqui estudados apresentaram NORs simples (ver

Figura 30). A ocorrência de NORs simples tem se mostrado muito freqüente entre os

peixes, embora variações intraespecificas e intraindividuais sejam freqüentemente

observadas (ANDREATA, 1991; ARTONI, 1996; FENOCCHIO, 1993; KAVALCO,

2003; SOUZA, 2003; CASTRO, 2004, entre outros). ALMEIDA-TOLEDO & FORESTI

(1985) sugerem que a presença de NORs simples ou NORs múltiplas caracterizam

determinados grupos de peixes.

Situações de heteromorfismos de tamanho das NORs em relação aos

seus homólogos são freqüentes (ARTONI, 1996; CASTRO, 2004; KAVALCO et

al.,2005). Porém nos espécimes aqui analisados, não se pode evidenciar a

ocorrência ou não de heteromorfismo, pois a marcação das NORs evidenciaram um

único cromossomo do par, como portador. GOODPASTURE & BLOOM (1975)

considera a ocorrência deste evento, sugerindo que, somente as NORs que

estiverem ativas na interfase anterior à mitose durante a qual a célula foi fixada e

corada por nitrato de prata são marcadas, podendo variar a nível inter e intra-

especifico, e mesmo inter e intraindividual quanto ao numero, localização,

intensidade e tamanho. Essas diferenças entre as NORs são atribuídas tanto a

atividades funcionais, quanto ao número de cístrons ribossomais (CHEUNG et al.,

1989 apud DE OLIVEIRA,1996).

ARTONI (1996) sugere que a maioria das espécies de Hypostominae

com NORs simples apresenta heteromorfismo de tamanho entre os homólogos,

essas diferenças de tamanho das NORs entre cromossomos homólogos pode ser

em decorrência não apenas do crossing-over desigual, mas também devido a

duplicação acidental do DNA ou distúrbios regionais na replicação do DNA.

Observou-se que os espécimes analisados neste trabalho

apresentaram uma distribuição de NORs semelhante, localizados no braço longo de

um cromossomo subtelocêntrico, com exceção de Glyptoperichthys xinguensis, que

apresentou marcação num cromossomo submetacêntrico, conforme mostra a Figura

30, sugerindo-se a ocorrência de mecanismos de fissão/fusão cêntrica no cariótipo

desta espécie

Figura 30- Comparação entre os cromossomos de NORs entre os

espécimes (a) Glyptoperichthys xinguensis, (b) Pseudacanthicus sp. (c)

Scobinancistrus aureatus.

É interessante notar que além das semelhanças cariotípicas quanto ao

número e tipos cromossômicos, há a presença de uma região organizadora de

nucléolo típico em cromossomos relativamente semelhantes, e em posição definida

nas espécies estudadas. Assim sendo, esses dados sugerem que a evolução

cariotípica no grupo, apresenta-se de certa forma homogênea, mantendo a

macroestrutura do cariótipo relativamente conservada.

5.4 O USO DE DADOS CITOGENÉTICOS NA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES.

Enquanto diversos países vêm investindo e se destacando na

piscicultura, o Brasil se mantém no mercado quase que exclusivamente à custa da

pesca extrativista. O investimento em alguns estudos, como por exemplo, uma

análise detalhada do patrimônio genético das espécies passíveis de serem

exploradas economicamente, ou mesmo de espécies interessantes quanto aos

a b c

aspectos ecológicos, entre outros, teria uma importância não apenas cientifica, mas

também social.

Cromossomos mitóticos oferecem uma oportunidade única de se

observar o genoma nuclear de forma microscópica, além de explorar seus

componentes tanto individualmente como globalmente (o cariótipo). Dessa forma,

dados cromossômicos vêm sendo usados para entendimento de relações

sistemáticas e filogenéticas entre as espécies, assim como para providenciar idéias

sobre os possíveis mecanismos de especiação (DOBIGNY et al., 2004). Em muitos

grupos, eles podem ser usados para comparação entre espécimes de diferentes

populações ou diferentes espécies, e são conseqüentemente, muito úteis para

estabelecer a morfologia primária a nível cromossômico. Além do mais, técnicas de

bandeamento permitem o acesso a informações envolvendo padrões estruturais

(bandeamento GTG-, RHG-, e CBG-) e funcionais (replicação do bandeamento

RBG-) (VIEGAS-PÉQUIGNOT & DUTRILLAUX, 1978).

De acordo com ARTONI (1996) é possível caracterizar individualmente

diferentes espécies, podendo-se considerar como caracteres diagnósticos alguns

dados cromossômicos tais como: numero diplóide, formula cariotípica, número e

posição das NORs, alem da quantidade e distribuição de heterocromatina

constitutiva. Além disso, podem-se observar diferentes tendências evolutivas dentro

de um mesmo grupo fazendo uso dessas informações.

Já foi dito que há uma grande dificuldade em classificar as espécies da

subfamília Hypostominae ao nível de espécie. ARTONI (1996) sugeriu dados

citogenéticos na identificação de espécies do gênero Hypostomus. Nota-se que

apesar da importância dos dados citogenéticos na definição das espécies, poucos

foram os estudos realizados com peixes da Amazônia. Os resultados já obtidos

deixam claro que o grau de variação entre os cariótipos das diversas espécies é

muito grande, o que facilita seu uso para fins sistemáticos.

Apesar de esforços dos órgãos de fiscalização para regulamentar a

pesca de peixes ornamentais, como os da subfamília Hypostominae, o controle

ainda encontra uma grande dificuldade, pois na comercialização dos espécimes de

peixes emprega-se com freqüência o nome comercial para identificar uma

determinada espécie ou variedade. Este muitas vezes imita o nome vulgar que é

dado à mesma a nível regional, ou seja, ele não se baseia na nomenclatura

cientifica e, portanto, acaba causando dúvidas ou interpretações errôneas dos

dados que compõem as estatísticas de exportação dos peixes ornamentais. É

preciso considerar ainda que o valor alcançado por uma determinada espécie será

tanto maior quanto mais exótica e mais rara ela se apresentar, devido aos custos

envolvidos na captura e transporte (TORRES & CARVALHO JR., 1994).

Um exemplo da importância do uso de marcadores cromossômicos na

diferenciação de espécies morfologicamente semelhantes fica bem ilustrado pelos

exemplares pertencentes ao gênero Glyptoperichthys, Scobinancistrus e

Pseudacanthicus. Onde, cujos cariótipos mostraram diferenças na estrutura

cromossômica, apesar do mesmo número diplóide. Por coloração convencional,

observaram-se diferenças entre a morfologia de alguns pares cromossômicos. Além

disso, as diferenças cariotípicas foram ressaltadas ao aplicar-se a marcação das

NORs, que mostraram padrões claramente distintos entre as espécies.

A similaridade cariotípica identificada entre as espécies analisadas

reforça as idéias de ARMBRUSTER (2004) que Hypostominae compõe um grupo

primitivo e conservado dentro da família Loricariidae. Análises citogenéticas em

espécies adicionais, e novas análises morfológicas, juntamente com dados

moleculares podem ser muito importantes para um melhor entendimento das

relações entre os diversos gêneros de Loricariidae, assim como entre suas

subfamílias e mesmo a nível específico.

6 C O N C L U S Õ E S

Por meios dos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se

concluir que:

a) O número diplóide para os espécimes analisados é 2n=52,

mantendo uma macroestrutura relativamente conservada, embora seja

necessária a análise de um maior número de exemplares de cada

espécie;

b) Não se evidenciou nenhum mecanismo cromossômico de

determinação sexual, ao nível das análises efetuadas;

c) Apesar da constância do número diplóide verificado nas espécies, a

macroestrutura do cariótipo apresenta alguma variabilidade, sugerindo-

se a ocorrência de eventos que alteraram a morfologia e não o número

de cromossomos, como inversões e translocações, poderiam estar

relacionadas;

d) O padrão de distribuição e posição da heterocromatina constitutiva

foi, de certo modo, similar em todas as espécies. Alguns blocos

heterocromáticos mostraram-se ricos em bases A-T, na região

pericentromérica e distal em alguns cromossomos das espécies

analisadas;

e) Os exemplares do gênero Glyptoperichthys analisados neste

trabalho apresentaram variações nos padrões de distribuição da

heterocromatina constitutiva e das NORs, quando comparadas aos

outros dois gêneros, sendo possível afirmar que estas características

podem ser utilizada como marcadores para diferenciação destas

espécies, do rio Xingu;

f) As regiões organizadoras de nucléolo foram localizadas em apenas

um par cromossômico subtelocêntrico e subtelo/acrocêntrico, com

exceção de Glyptoperichthys xinguensis, cujo cromossomo portador é

submetacêntrico, sendo que todas as marcações foram localizadas na

mesma posição.

g) A marcação de um único cromossômico do par pelo Nitrato de

Prata, pode indicar algum mecanismo de controle gênico, que somente

uma análise molecular mais detalhada poderia demonstrar;

h) Em Glyptoperichthys xinguensis, a localização da NOR em um

cromossomo submetacêntrico, sugere a ocorrência de uma inversão.

i) O número e a localização das NORs nos cariótipos das espécies

estudadas pode se constituir em uma característica de importância

taxonômica e evolutiva para esta subfamília.

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8 ANEXO : PREPARO DE SOLUÇÔES

A) OBTENÇÃO DOS CROMOSSOMOS MITÓTICOS

A1- Solução Hipotônica de KCl 0,075 M

Dissolver 5,59g de KCl e, água deionizada até atingir o volume de um litro

(1000ml).

A2- Solução de Colchicina 0,025%

Solução Mãe: dissolver 0,05 g de colchicina em água deionizada até o volume

total de 100 ml em um frasco totalmente protegido da luz.

Solução de Uso: diluir 10 ml da solução mãe em 10 ml de água deionizada

em um frasco totalmente protegido da luz.

A3- Fixador Carnoy

Dissolver 3 partes de Metanol para 1 parte de Ácido Acético.

B) COLORAÇÃO CONVENCIONAL

B1- Tampão Fosfato Sörense pH 6,8

 Solução A: dissolver 8,1652 g de Fosfato de Potássio Monobásico

(KH

) em água deionizada até o volume de 1 litro, pH 5,6;

 Solução B: dissolver 10,6794 g de Fosfato de Sódio Bihidratado

(Na

HPO

.2H

O) em água deionizada até o volume de 1 litro, pH 9,8;

 Solução de Uso: misturar volumes iguais de cada solução, ajustando o

pH 6,8 com as próprias soluções A e B.

C) BANDEAMENTO C

C1- Solução de HCl 0,2 N

Solução de HCl 1 N: diluir aproximadamente 83 ml (82,8 ml) de HCl 37% em

água destilada até o volume final de 1 litro.

Solução de HCl 0,2 N: diluir 20 ml da solução de HCl 1N em 80 ml de água

destilada.

C2- Solução Salina 2x Concentrada (2xSSC)

Dissolver 17,532 g de Cloreto de Sódio (NaCl) e 8,82 g de Citrato de Sódio

(Na

O) em 1 litro de água deionizada.

C3- Solução de Hidróxido de Bário (Ba(OH)

2%:

Dissolver 2 g de Hidróxido de Bário em 100 ml de água destilada a 60° C em

um frasco escuro. Deixar em agitador automático por 20-30 minutos. Filtrar a

solução em papel de filtro para o frasco de uso.

C4- Solução de Giemsa 10%

Diluir 0,3 ml de corante Eosina Azul de Metileno em 3 ml de Tampão Fosfato pH

6,8.

C5- Formamida a 70%

Dissolver 70 ml de Formamida em 30 ml de 2xSSC.

D) Ag-NOR

D1- Solução de Gelatina a 2%

Dissolver 0,1 g de gelatina, em pó, incolor e insípida, em 10 ml de água

deionizada e acrescentar ácido fórmico na proporção de 1ml para cada 100ml de

solução.

D2- Solução de Nitrato de Prata (AgNO

) 25%

Dissolver 0,25 g de nitrato de prata em 1 ml de água deionizada.

E) DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol)

 Solução Mãe: diluir 0,1 mg de DAPI em 10 ml de água deionizada.

 Solução de Uso: diluir 0,5 ml desta solução em 50 ml de uma

solução 1:1 de Tampão MclIvaine pH 5,6 e água deionizada.

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