( PDF ) Caracterização molecular de cichlidae (acanthopterygii; perciformes) da bacia do alto Rio Paraná utilizando gene mitocondrial citocromo C oxidase subunidade I (COI)

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

SARA LÍVIA DA SILVA FERNANDES DA MATTA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE CICHLIDAE

(ACANTHOPTERYGII; PERCIFORMES) DA BACIA DO ALTO RIO

PARANÁ UTILIZANDO GENE MITOCONDRIAL CITOCROMO C

OXIDASE SUBUNIDADE I (COI)

Mogi das Cruzes, SP

2010

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

SARA LÍVIA DA SILVA FERNANDES DA MATTA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE CICHLIDAE

(ACANTHOPTERYGII; PERCIFORMES) DA BACIA DO ALTO RIO

PARANÁ UTILIZANDO GENE MITOCONDRIAL CITOCROMO C

OXIDASE SUBUNIDADE I (COI)

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf

Mogi das Cruzes, SP

2010

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

graduação em Biotecnologia da Universidade

de Mogi das Cruzes como parte dos requisitos

para obtenção do Título de Mestre em

Biotecnologia.

Área de Concentração: Taxonomia Molecular

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DEDICATÓRIA

Gostaria de dedicar essa dissertação de mestrado aos meus pais

Airton e Margarete pelo carinho e incentivo durante todos esses anos,

além de seus esforços para contribuir com minha educação.

Dedico também a Paola Lumazini de Moraes por me fazer

acreditar que tudo é possível e por estar sempre ao meu lado,

comemorando cada conquista.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus, pois sem Ele não haveriam méritos e

conquistas.

Agradeço ao meu orientador Profº Drº Alexandre Wagner Silva Hilsdorf pela

oportunidade de crescimento profissional e ensinamentos durante esses anos.

Aos professores da Pós- graduação em Biotecnologia da Universidade de

Mogi das Cruzes, em especial a Profª Drª Maria Santina de Castro Morini que desde

o início confiou em meu trabalho.

Ao Profº Drº Cláudio de Oliveira da UNESP de Botucatu pela atenção e por

auxiliar em minha pesquisa durante esses dois anos. Agradeço também por ceder

gentilmente às amostras de Cichlidae do Alto Paraná.

Ao Profº Drº Alexandre Pires Marceniuk por me ajudar na identificação

morfológica da nova espécie de Australoheros e correção da dissertação.

Ao Profº Drº Vítor Fernandes Oliveira de Miranda pelos ensinamentos durante

minha graduação e pós-graduação e por aceitar fazer parte da banca de defesa.

A toda minha família, meus pais Airton e Margarete, minhas irmãs Mariana e

Larissa por me ajudar nos dias difíceis e estarem sempre ao meu lado. Aos meus

avôs Lourdes, Osvaldo, Irinéia e Durval pelos carinhos e conselhos durante toda a

minha vida. A Paola por todos esses anos de carinho e incentivo.

Agradeço em especial a Ana Paula e Rogério, pelos dias de alegria que me

ajudaram a esquecer um pouco o mestrado..rs..Aos meus tios Ari, Flávia e Tia Lú.

Agradeço aos meus primos, pelas brincadeiras e risadas.

A todos os amigos do Laboratório de Microbiologia do Núcleo Integrado de

Biotecnologia coordenado pelo Profº Drº Wellington.

As minhas eternas amigas Nathália Urizzi, Nathália Hoff, Lívia e Aline por

todos esses anos de cumplicidade e carinho.

Agradeço de coração as amigas que fiz para a vida toda, que me ajudaram,

me fizeram rir e sempre estiveram ao meu lado: Jú, Fabi, Karlota, Taty, Corina (Cô

uai), Carol, Tamara (Tatá). Vocês são muito especiais. Não esquecendo, ao Gustavo

pelos “grandes conselhos” e por me ajudar nas coletas. Agradeço também a Léia,

que conheci há pouco tempo, mas já me ajudou em várias situações.

A Marisa e Clauber pela amizade e companheirismo, além é claro, das boas

risadas.

Agradeço também a Márcia, por ter me ajudado financeiramente nos

sequenciamentos. A Luisa Simbine pela amizade. A Marie (técnica do Nib) por ser

sempre gentil e prestativa.

Enfim, agradeço a todos que de alguma maneira fizeram parte desses anos

de luta e conquistas.

Muito Obrigado!!!

“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho

original".

Albert Einstein

RESUMO

A taxonomia e a sistemática têm demonstrado um grande desenvolvimento nos

últimos anos, devido à incorporação de técnicas que utilizam marcas no DNA que

diferenciam dois ou mais indivíduos, denominados marcadores moleculares. Esses

métodos permitem avaliar as relações entre os táxons assim como a sua história

evolutiva. Recentemente foi proposto um curto segmento de 648 nucleotídeos da

extremidade 5’ do gene mitocondrial Citocromo c Oxidase I para distinguir e

identificar grupos que possuem classificação incerta, além de alocar as espécies em

categorias taxonômicas corretas. Esse gene foi um dos principais componentes da

padronização da metodologia denominada “DNA barcoding”, cuja finalidade é formar

alianças internacionais de investigação da diversidade da vida eucariótica por meio

da criação de um banco de dados de sequências parciais de DNA do gene COI,

promovendo assim, o processo de automação de identificação das espécies. Deste

modo, o presente trabalho teve por objetivo caracterizar molecularmente às espécies

de peixes pertencentes à família Cichlidae, provenientes da Bacia do Alto Rio

Paraná, utilizando o gene mitocondrial Citocromo c Oxidase subunidade I, bem

como, apresentar evidências de uma nova espécie de Australoheros para os rios de

cabeceiras do Alto Rio Tietê. Foram coletadas de 5 a 10 amostras de tecido de cada

espécie de Cichlidae para a extração de DNA. Posteriormente, o gene COI foi

amplificado, utilizando-se os primers Fish-F2 e Fish-R2. Após a amplificação, as

amostras foram sequenciadas, alinhadas com o aplicativo ClustalW e analisadas por

meio do programa MEGA 4, utilizando o método de Neighbor- Joining modelo

Kimura-2-parameter com bootstrap de 3000 réplicas. Para verificar a existência de

uma nova espécie do gênero Australoheros, foi utilizada a comparação de

sequências do gene Citocromo b com a utilização dos primers Fish-cytB-F e

H15149, além de estudos morfológicos utilizando uma série de medidas e

contagens. Para o Alto Paraná foram caracterizadas 15 espécies de Cichlidae

distribuídas em 9 gêneros. A divergência intraespecífica obtida foi de 0,5% com

mínimo de 0% e máximo de 1%. Já a divergência média interespecífica foi de 19%,

com mínimo de 3% e máximo de 30%. Na análise do gene Citocromo b as

divergências interespecíficas para o gênero Australoheros variaram de 3% a 7%. A

espécie do Alto Tietê diferencia das demais descritas na literatura por meio de

caracteres morfológicos e moleculares. A menor divergência foi encontrada entre as

espécies Australoheros sp. e Australoheros ribeirae e maior divergência entre

Australoheros sp. e Australoheros scitulus. O caractere morfológico que mais se

destacou foi o comprimento do pedúnculo caudal em percentagem do comprimento

padrão, a espécie Australoheros sp. possui maior pedúnculo em comparação com

as demais espécies descritas. Diante destes resultados, podemos inferir que o

espécime encontrado no Alto Tietê trata-se de uma nova espécie. Entretanto,

estudos complementares serão necessários para compreender a biologia,

comportamento e a morfologia da nova espécie de Australoheros encontrada no Alto

Tietê.

Palavras-chave: Taxonomia, DNA barcode, COI, Cichlidae, Australoheros.

ABSTRACT

The taxonomy and systematic have been showing a great development in the last

years due to the incorporation of techniques, which use marks on the DNA that

differentiate two or more individuals, called molecular markers. These methods allow

assess the relationships between the taxons as well as its evolutionary history.

Recently, a short fragment of 648 nucleotides from near the 5’ of mitochondrial gene

cytochrome c oxidase I was proposed to distinguish and identify groups that have

uncertain classification, also allocating the species under correct taxonomic

categories. This gene was one of the main components of the methodology

standardization called “DNA barcoding”, which aims to form international

organizations of the eukaryotic life diversity investigation by creating a database

containing partial sequences of gene cytochrome c oxidase subunit I (COI) of

mitochondrial DNA, promoting the automation of species identification process.

Therefore, the goal of the present study is to characterize fishes of the Cichlidae

family sampled of the Upper Paraná river watershed by using the mitochondrial gene

COI, as well as, to present evidences of a new species of Australoheros genus for

the Upper Tietê River. Five to ten tissue samples of each Cichlidae species were

obtained for DNA isolation. Then, COI was amplified using the Fish-F2 and Fish-R2

primers. After the amplification, the samples were sequenced, aligned, with the

ClustaIW application and analyzed by MEGA 4 program, using the Neighbor-Joining

method, Kimura-2-parameter model with bootstrap of 3000 support. To ascertain the

presence of a new species of Australoheros in the Upper Tietê River, molecular data

by the amplification of cytochrome b sequences with the Fish-cytB-F and H15149

primers, and morphological studies using a series of measures and countings were

used. To Upper Paraná River, 15 species were characterized and distributed under

9 Cichlidae genus. The average of the intraspecific divergence was 0,5%, ranging

from 0% the minimum to 1% the maximum. On the other hand, the average

interspecific divergence was 19%, being 3% the minimum, and 30% the maximum. In

the analysis of cytochcrome b, the interspecific divergences to Australoheros genus

ranged from 3% to 7%. The Upper Tietê species is different from the others

described in the published scientific literature because of morphological and

molecular characters. The lowest divergence was found between the Australoheros

sp. and Australoheros ribeirae species, and the highest, between Australoheros sp.

and Australoheros scitulus. The main morphological character was the caudal

peduncle length in usual length percentage, the Australoheros sp. species has a

bigger peduncle than the other species’ ones. Based on the present data, we can

infer that the species of Australoheros found in Upper Tietê river is a new one.

However, additional studies shall be used to understand the new Australoheros new

specie’s biology, behavior and morphology, found on Upper Tietê river.

Key-words: Taxonomy, DNA barcode, COI, Cichlidae, Australoheros.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Australoheros facetus: espécie tipo do gênero. Fonte: Fishbase

(2009)...................................................................................................25

Figura 2 Mapa ilustrativo dos pontos de coleta dos espécimes de ciclídeos da

Bacia do Alto Paraná............................................................................31

Figura 3

Amostras de DNA de ciclídeos em gel de agarose a 0,8% corado com

brometo de etídio.................................................................................38

Figura 4 Gel de agarose a 1,5% de amostras de DNA amplificadas com o primer

Fish-F2, Fish-R2 para o gene do citocromo c oxidase subunidade 1

(COI) ....................................................................................................40

Figura 5 Divergência média intraespecífica das espécies de ciclídeos

encontrados no Alto paraná ................................................................43

Figura 6 Fenograma das relações entre as espécies de Cichlidae coletadas no

Alto Paraná ..........................................................................................45

Figura 7 Australoheros sp. nova espécie............................................................46

Figura 8 Número de espinhos da nadadeira anal ..............................................50

Figura 9 Número de raios da nadadeira anal .....................................................51

Figura 10 Número de espinhos da nadadeira dorsal............................................51

Figura 11 Número de raios da nadadeira peitoral ................................................52

Figura 12 Número de rastros no primeiro epibranquial ........................................52

Figura 13 Número de rastros no primeiro ceratobranquial ...................................53

Figura 14 Fenograma ilustrando as relações entre as sequências do gene

mitocondrial citocromo b das espécies do gênero

Australoheros .......................................................................................55

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Espécies incluídas no gênero Australoheros e suas distribuições

geográficas...........................................................................................26

Tabela 2 Amostras dos espécimes coletados na bacia do Alto Paraná...............30

Tabela 3 Sequência de primers do gene COI testados nas reações de PCR......33

Tabela 4 Sequência de primers do gene Citocromo b utilizados nas reações de

PCR. ....................................................................................................34

Tabela 5 Reagentes utilizados nas reações de sequenciamento .......................35

Tabela 6 Frequência média de bases ( ATCG) do gene Citocromo c oxidase

subunidade I (COI)...............................................................................41

Tabela 7 Divergência entre as espécies de ciclídeos da bacia do Alto Rio

Paraná..................................................................................................43

Tabela 8 Dados morfométricos de Australoheros sp. ..........................................47

Tabela 9 Dados merísticos de Australoheros sp... ..............................................48

Tabela 10 Divergências genéticas interespecíficas do gene Citocromo b entre as

espécies do gênero Australoheros.......................................................54

LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS

COI Citocromo c oxidase subunidade I

DNA Ácido desoxirribonucleico

dNTP Desoxiribonucleotídeo (A, G, C, ou T)

EDTA Ácido Etilenoaminotetracético

MgCl

Cloreto de Magnésio

µL Microlitro

mM Milimolar

ng Nanograma

pb Pares de bases

PBS Tampão Fosfato de sódio dibásico - fosfato de sódio monobásico

PCR Reação em cadeia da polimerase, do inglês Polymerase Chain Reaction

pmol Picomol

RNA Ácido Ribonucléico

Taq Enzima termoestável derivada da bactéria Thermus aquaticus

TAE Tampão Tris-acetato e EDTA

UV Luz ultravioleta

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................14

1.1 Marcadores Moleculares .....................................................................................14

1.2

DNA Barcoding....................................................................................................16

1.3

Bacia do Alto Rio Paraná ....................................................................................19

1.3.1 Características da bacia do Alto Paraná.......................................................19

1.3.2 Diversidade Ictiofaunística . ..........................................................................21

1.4

Cichlidae..............................................................................................................22

1.4.1 Gênero Australoheros...................................................................................24

2 OBJETIVOS...........................................................................................................28

2.1

Geral....................................................................................................................28

2.2

Específicos ..........................................................................................................28

3 MÉTODO................................................................................................................29

3.1

Coleta das Amostras ...........................................................................................29

3.2

Extração de DNA.................................................................................................32

3.3

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ...........................................................32

3.4

Purificação do Produto de PCR...........................................................................34

3.5

Sequenciamento..................................................................................................34

3.6

Análise Estatística dos Dados .............................................................................35

3.6.1

Análises Moleculares ...................................................................................35

3.6.2

Estudo Morfológico do gênero Australoheros ..............................................36

4 RESULTADOS.......................................................................................................38

4.1 Extração de DNA.................................................................................................38

4.2

Teste para a escolha dos Primers .......................................................................39

4.3

Sequenciamento..................................................................................................40

4.4

Fenogramas e Divergências Genéticas dos Cichlidae do Alto Paraná................41

4.5

Nova espécie de Australoheros para as cabeceiras do Alto Rio Tietê ................46

4.5.1

Dados Morfológicos......................................................................................46

4.5.2

Dados Moleculares.......................................................................................53

5 DISCUSSÃO..........................................................................................................56

5.1

Relações genéticas entre as espécies de Cichildae do Alto Rio Paraná.............56

5.2 Australoheros sp. espécie nova ..........................................................................60

6 CONCLUSÕES ......................................................................................................63

REFERÊNCIAS.........................................................................................................64

1 INTRODUÇÃO

1.1 Marcadores Moleculares

O conhecimento da diversidade biológica é crucial em qualquer estudo

relacionado às ciências da vida, no qual o reconhecimento das espécies assim como

a atividade de nomeá-las é fundamental para o estudo do comportamento, evolução

ou qualquer área relacionada a organismos vivos (SAVAGE, 1995).

Primeiramente foram utilizados dados morfológicos para a identificação das

espécies, pois naquele momento eram as ferramentas disponíveis aos

pesquisadores que deram início aos estudos de sistemática. Com o

desenvolvimento de novas técnicas, o estudo da biodiversidade tornou-se mais

amplo e conciso. Uma das primeiras técnicas a serem utilizadas foi à eletroforese

de proteínas em géis de amido (MANWELL e BAKER, 1963). Sequências de genes

de DNA ribossômico, assim como, de DNA mitocondrial dominaram a sistemática

molecular na década de 80 (AVISE, 1994). Desde o final da década de 70 muitos

pesquisadores começaram a utilizar o DNA mitocondrial em estudos envolvendo

estrutura populacional, relações filogenéticas e como ferramenta para compreender

os vários aspectos biológicos e evolutivos de uma grande variedade de organismos

(WILSON et al.1985; AVISE et al. 1987; MORITZ et al. 1987).

John Avise reconheceu que divergências na sequência do DNA mitocondrial

poderiam fornecer registros da história evolutiva dentro de uma espécie, ligando os

estudos da genética populacional com a sistemática podendo estabelecer

investigações, esses estudos foram chamados de filogeografia (AVISE et al., 1987).

O DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido amplamente utilizado nos estudos

filogenéticos de animais pois, sua taxa de evolução é superior quando comparado

com genes nucleares, resultando no acúmulo de diferenças entre espécies

diretamente relacionadas. A transmissão do DNA mitocondrial garante que as

variações que possam vir a ocorrer sejam geradas apenas por mutações, ao

contrário do genoma nuclear, em que a variação pode ser introduzida por meio de

recombinação (BROWN et al., 1979; MOORE 1995; MINDELL et al., 1997). As

diferenças que ocorrem nas sequências são muito maiores entre espécies do que

dentro da espécie, podendo deste modo, obter a distinção entre grupos

taxonômicos.

A taxonomia e a sistemática têm demonstrado um grande desenvolvimento

nos últimos anos, devido à incorporação de técnicas que utilizam marcas no DNA

que diferenciam dois ou mais indivíduos, denominados marcadores moleculares.

Esses métodos de análise permitem avaliar as relações entre os táxons assim como

a sua história evolutiva (GRECHKO, 2002).

O uso de marcadores genéticos tem como objetivo revelar polimorfismos de

DNA entre indivíduos geneticamente relacionados. Atualmente existem inúmeras

técnicas disponíveis, sendo que cada uma utiliza uma estratégia particular para

detectar tal polimorfismo (SUNNUCKS, 2000). A biologia molecular apresenta uma

vasta área de atuação. Na genética da conservação tem possibilitado estimar níveis

de heterozigose, análise de estruturas populacionais, endemismo, biodiversidade,

identificação e acompanhamento da dispersão de espécies invasoras (SOLÉ-CAVA,

2001).

Os marcadores moleculares têm demonstrando ser uma ferramenta efetiva

para o mapeamento e diagnósticos genéticos, taxonomia molecular, análises da

integridade genética e estudos evolutivos (CARNEIRO et al., 1996). Informações

moleculares são muitas vezes fontes de caracteres que permitem a resolução das

relações filogenéticas e taxonômicas em situações em que a morfologia não pode

resolver. Como exemplo, Sezaki et al. (2005) utilizaram técnicas moleculares para

distinguir duas espécies de enguia a fim de evitar a exploração demasiada e

consequentemente o desaparecimento de uma única espécie. Essas duas espécies

são dificilmente distinguíveis a partir de suas características externas, e, além disso,

possuem valores comerciais diferentes.

As abordagens da taxonomia molecular podem ser definidas como métodos

baseados na comparação de sequências de DNA que permitem a distinção entre

espécimes de acordo com suas variações interespecíficas. Esse método tem

apresentado muitas vantagens tais como: (1) os dados podem ser obtidos a partir de

um número reduzido de exemplares; (2) táxons morfologicamente indistinguíveis

podem ser separados; (3) uma única técnica molecular pode ser aplicada a diversos

táxons (BLAXTER e FLOYD, 2003).

Revisões taxonômicas recentes feitas em aves mostram que espécies

reconhecidas só puderam ser definidas, em partes, com base em divergências

nucleotídicas em seu mtDNA (AVISE e ZINK, 1988; GILL e SLIKAS, 1992; MURRAY

et al., 1994; BANKS et al., 2003).

1.2 DNA Barcoding

Os genes codificadores de proteínas mitocondriais possuem maior

variabilidade quando comparado com genes ribossomais, por isso, são melhores

para distinguir espécies relativamente próximas. Ao mesmo tempo, a análise entre

sequências de genes mitocondriais são mais simples, pois não apresentam

inserções e deleções, que são frequentes em genes ribossomais (FOLMER et al.,

1994). Devido ao seu aparente melhor desempenho, recentemente foi proposto um

segmento de 648 nucleotídeos da extremidade 5’ do gene mitocondrial Citocromo c

Oxidase I (COI ou Cox1). De acordo com Hebert et al. (2003a; 2003b) esse

fragmento seria suficiente, em muitos metazoários, para distinguir e identificar

grupos que possuem classificação incerta, além de alocar os espécimes em

categorias taxonômicas.

Essa região possui uma série de características consideradas vantajosas para

o seu uso como, por exemplo; (1) por ser uma região curta pode ser obtida

facilmente para um grande número de táxons com uma pequena quantidade de

primers; (2) é uma sequência facilmente alinhada; (3) é informativa para distinguir

espécies próximas, pois possui variabilidade semelhante a outros genes

codificadores de proteínas (HEBERT et al., 2003a).

Esse gene foi um dos principais componentes da padronização da

metodologia, denominada “DNA barcoding”, que ganhou importância em 2004 com a

criação do “Consortium for the BarCode of Life (CBOL)”, cujo objetivo é formar

alianças internacionais de investigação da diversidade da vida eucariótica

(MARSHALL, 2005), por meio da criação de um banco de dados de sequências

parciais de DNA do gene COI, promovendo deste modo o processo de automação

de identificação das espécies.

Diversos consórcios foram formados para auxiliar no estabelecimento do

CBOL, de modo a restringir os grupos de estudo. Por exemplo, “The Lepidoptera

Barcode of Life” é um banco de dados de sequências de COI que auxilia na

caracterização das espécies de borboletas e mariposas; “All Birds Barcoding

Initiative” difundido em 2005, visa reunir dados de aproximadamente 10.000

espécies conhecidas de pássaros de todo o mundo; “The Fish Barcode of Life

Initiative (Fish-Bol)” é uma biblioteca eletrônica de referência que contêm sequências

de COI de peixes, tanto de água doce quanto marinhos.

O método de DNA Barcoding usa a divergência entre sequências do gene

Citocromo c oxidase para facilitar a caracterização das espécies. Esse estudo tem

como objetivo a construção de bibliotecas de referência para espécies conhecidas.

Resultados anteriores mostram que o emprego desse método é eficaz para a

identificação das espécies, a qual 95% mostraram sequências de COI distintas

(HEBERT et al., 2003b; 2004; WARD et al. 2005; HAJIBABAEI et al., 2007). Têm

como vantagens a identificação de espécimes imaturos, espécies extintas,

indivíduos em diferentes estágios do ciclo de vida e possíveis espécies crípticas. A

metodologia tem aplicabilidade em grupos de animais como aves, lepidópteras,

peixes, moscas entre outros (HEBERT et al., 2003a; HUBERT et al., 2008; WARD et

al., 2005; IVANOVA et al., 2007).

Em alguns peixes Neotropicais, é complicado compreender os processos de

especiação que originaram a diferenciação em espécies, devido à reduzida

variabilidade morfológica associada a alguns grupos. Nestes casos, estudos

moleculares têm um papel fundamental para esclarecer estes problemas de

identificação, pois são capazes de mostrar a diversidade genética presente nesses

grupos (TURNER et al., 2004).

Segundo Hajibabaei et al. (2007) o DNA Barcode pode auxiliar em outros

estudos como na filogenia, taxonomia e na genética de populações. Na taxonomia

pode ser rotineiramente utilizado para a identificação de espécimes e contribuir para

a investigação de espécies sem definição taxonômica. Em estudos filogenéticos

pode ser um ótimo ponto de partida para a seleção de táxons com ambiguidades

filogenéticas e a utilização das sequências depositadas no banco de dados do

Barcode pode ser utilizada para construção de árvores filogenéticas. Já em Genética

de populações pode oferecer o primeiro sinal de divergências populacionais e

facilitar o estudo comparativo da diversidade populacional de muitas espécies.

Alguns grupos taxonômicos não puderam ser prontamente distinguidos até o nível

de espécie como alguns cnidários bentônicos, grupos de anfíbios e algumas

espécies de gastrópodes, possivelmente porque esses grupos eram formados por

espécies com tempo de divergência bastante reduzido (WAUGH, 2007).

De acordo com Kress et al. (2005) a metodologia de DNA barcode não foi

eficiente para Angiospermas pois, a taxa mutacional do COI em plantas é mais lenta

comparado com animais. Com isso, esses pesquisadores propuseram a utilização

do espaçador intergênico trnH-psbA para a identificação de plantas com flores.

De acordo com Stoeckle et al. (2005) existe uma série de obstáculos para a

aplicação do DNA Barcode entre eles: (1) grupos com baixa diversidade gênica em

suas sequências; (2) espécies que divergiram recentemente; (3) detecção de

híbridos; (4) pseudogenes nucleares (Numts), que são cópias inativas semelhantes

e até mesmo idênticas de genes em outros lugares do genoma. São identificados

quando é feita a tradução para sequências de proteínas, e segundo Mallet e Willmott

(2003), o tamanho do gene não é suficiente para permitir a discriminação entre

espécies.

Algumas críticas também são feitas em relação à metodologia de DNA

Barcode. De acordo com Lipscomb et al. (2003) DNA Barcoding é uma “caricatura

da taxonomia real”, pois reduz a identificação taxonômica a uma tarefa meramente

técnica ao invés de gerar ciência baseada em hipóteses. Porém a proposta do DNA

Barcoding é unir pesquisas moleculares e morfológicas para o aprimoramento do

processo de identificação de espécies (DESALLE et al., 2005).

Outras sequências de DNA também foram sugeridas para esse mesmo fim,

como dos genes mitocondriais 16S rRNA e Citocromo b, porém, por questões de

padronização e pelo aparente melhor desempenho, o CBOL adotou como sequência

padrão o fragmento do gene COI (VENCES et al., 2005).

No Brasil, vários estudos envolvendo DNA barcoding são realizados para

diferentes grupos animais, entre eles, estudos com tartarugas marinhas que ocorrem

no litoral brasileiro (VARGAS et al., 2009), identificação de espécies de pássaros da

família Thamnophilidae e Tyrannidae (VILAÇA et al., 2006; CHAVES et al., 2008),

identificação de mamíferos como quirópteros (REDONDO et al., 2008) e carnívoros

(TRIGO et al., 2008) e identificação de espécies novas de peixes (BENINE et al.,

2009).

Os conjuntos de dados moleculares podem auxiliar em casos onde as

características morfológicas não conseguem esclarecer relações a respeito da

sistemática, formando assim hipóteses mais consistentes.

Pesquisadores que utilizam DNA Barcoding pretendem tornar possível o uso

da metodologia molecular para alocar indivíduos em grupos taxonômicos e facilitar a

descoberta de novas espécies (MORITZ e CICERO, 2004).

1.3 Bacia do Alto Rio Paraná

1.3.1 Características da bacia do Alto Paraná

O Sistema do Alto Paraná, uma das bacias hidrográficas mais importantes do

Brasil, possui aproximadamente 900.000 km

e abrange o norte do Estado do

Paraná, sul do Mato Grosso do Sul, a maior parte do Estado de São Paulo, sul de

Minas Gerais, sul de Goiás e uma área do Paraguai oriental adjacente ao Mato

Grosso do Sul, que inclui o Reservatório de Itaipu, antigamente Salto de Sete

Quedas (BONETTO, 1986; BRITSKI e LANGEANI, 1988). A bacia do Alto Paraná

pertence à região ictiofaunística do Paraná, que inclui o sistema dos Rios da Prata-

Uruguai-Paraná- Paraguai representando o segundo maior sistema de drenagem da

América do Sul (LOWE-MCCONNELL, 1999).

Essa bacia é constituída por vários tipos de fitofisionomias como, Florestas

estacionais semideciduais, Cerrados, Florestas Ombrófilas Mistas, Campos

Rupestres e Matas de Galeria (HUECK e SEIBERT, 1981).

O nível de conservação da planície obedece a um gradiente, de acordo com a

proximidade de centros urbanos. Quanto maior a aproximação das cidades, maior o

nível de antropização (AGOSTINHO e ZAHWSKI, 1996), além de centros urbanos, a

bacia do Alto Paraná drena regiões industriais e agrícolas, constituindo uma região

excessivamente explorada. Esse quadro é responsável pelo empobrecimento da

fauna, principalmente em relação às espécies de grande porte. Esse impacto

assume proporções alarmantes apenas em áreas restritas da bacia, ou seja,

naquelas com maiores concentrações populacionais e industriais na qual os

recursos hídricos são impróprios para o consumo ou exigem elevados custos para

seu tratamento (AGOSTINHO et al., 2002).

Além disso, mais de 70% da produção hidrelétrica do país é gerada nessa

região, devido às inúmeras represas presentes nesse local, transformando os

principais afluentes do rio Paraná (Grande, Tietê, Paranapanema e Iguaçu) em uma

sucessão de lagos artificiais (LOWE-MCCONNELL, 1999).

Esses ambientes muitas vezes são representados por reservatórios artificiais,

o que aumenta consideravelmente a presença de espécies exóticas. Procedimentos

como construção de barragens, uso descontrolado de pesticidas e fertilizantes,

destruição de florestas, principalmente da vegetação ripária, assoreamentos e

introdução de espécies de outras bacias têm afetado fortemente as comunidades de

peixes (BÖLHKE et al., 1978; MENEZES, 1996; CASTRO e MENEZES, 1998).

Riachos e cabeceiras são ambientes que devem receber prioridade em estudos

relacionados à taxonomia, sistemática, evolução e biologia das espécies, pois frente

ao processo de antropização, são os primeiros a serem afetados, e como resultado,

perdemos muita informação a respeito da real biodiversidade local (CASTRO e

MENEZES, 1998; CASTRO, 1999).

O Alto Paraná é uma área que desde o início do Terciário vem sofrendo

atividades tectônicas, o que pode explicar os diversos eventos de captura de

cabeceiras, como ocorrido entre os rio Paraíba do Sul e Tietê (AB’SABER, 1998).

Esses eventos também podem explicar a distribuição de algumas espécies do Alto

Paraná ocorrer em drenagens vizinhas como o rio Paraíba do Sul, Ribeira do

Iguape, Rio São Francisco e algumas drenagens litorâneas (LANGEANI, 1989;

WEITZMAN e MALABARBA, 1999; RIBEIRO, 2006; RIBEIRO et al., 2006; SERRA et

al., 2007).

De acordo com Malabarba (1998) houve no passado conexões entre o rio

Tietê e drenagens costeiras devido a uma antiga adaptação do rio Paraíba, essas

conexões podem ter ocorrido em outras áreas do Alto Paraná, sendo necessários

estudos mais aprofundados, como filogeografia, para a melhor compreensão a

respeito da diversidade aquática deste local.

Diversas espécies comuns são citadas para as porções do Alto Paraná,

Ribeira de Iguape, rios costeiros do sudeste brasileiro e rio São Francisco

(LANGEANI, 1989; OLIVEIRA e BRITSKI, 2000; BRITTO e CASTRO, 2002;

OYAKAWA et al., 2005) e de acordo com Serra et al. (2007) foi encontrada uma

comunidade característica de peixes do Alto Tietê em riachos litorâneos do Estado

de São Paulo.

1.3.2 Diversidade Ictiofaunística

A América do Sul possui a maior riqueza de espécies de peixes de água doce

do mundo, porém, a avaliação e compreensão dessa rica diversidade são afetadas

pelo conhecimento incompleto da ecologia, biologia e sistemática (MENEZES,

1996).

Böhlke et al. (1978) estimaram que o número de espécies de água doce

neotropicais chegaria a 5000. Vinte anos depois, Schaefer (1998) estima um número

de 8.000 espécies, representando um oitavo de toda a biodiversidade estimada de

vertebrados viventes. Deste modo, devido à carência de informação da diversidade,

estão sendo utilizadas metodologias como os marcadores genéticos e moleculares

para peixes Neotropicais visando o conhecimento de características de interesse

econômico, bem como a preservação de unidades evolutivamente significativas

(RYDER, 1986).

De acordo com Castro e Menezes (1998) o sistema do Alto Paraná,

principalmente na região do Estado de São Paulo possui os maiores rios do Estado.

Estes canais são habitados por espécies de médio a grande porte como curimbatás

(Prochilodus spp), piaparas (Leporinus sp.), pintados e cacharas (Pseudoplatystoma

spp) e jaús (Zungaro zungaro). Essas espécies normalmente possuem extensas

distribuições geográficas e importância na pesca comercial e de subsistência.

Associados a estes rios, existe um grande número de riachos e cabeceiras,

habitados por espécies de pequeno porte, com distribuição geográfica restrita, com

pouco ou nenhum valor comercial. Essas espécies são dependentes da vegetação

ripária para sua alimentação, abrigo e reprodução e representam 50% do total de

peixes de água doce descritas para a América do Sul mostrando um elevado grau

de endemismo (BÖHLKE et al., 1978; LOWE-MCCONNELL, 1999).

Em inventário feitos por Langeani et al. (2007) foram encontrados para o Alto

Paraná 310 espécies de peixes distribuídas em 11 ordens e 38 famílias, número

superior a inventário feito anteriormente por Bonetto (1986), no qual foram

apontadas 130 espécies. Foi observada maior riqueza de peixes da ordem

Siluriformes e Characiformes representando cerca de 80% das espécies.

A Ictiofauna do Alto Paraná é constituída, em sua maioria, por espécies

detritívoras (iliófagas e bentófagas) e piscívoras, que também ocorrerem em grande

número de indivíduos, correspondendo a uma considerável biomassa de peixes

capturados (AGOSTINHO e JÚLIO JR., 1999).

1.4 Cichlidae

A família Cichlidae é um grupo monofilético que compreende

aproximadamente 1600 espécies válidas (ESCHMEYER e FONG, 2010). Possui

ampla distribuição geográfica, com representantes encontrados na América do Sul,

Central, Cuba, Espanha, em toda a África, Madagascar, Índia, Sri Lanka, Síria, Israel

e Irã (STIASSNY, 1991; CHAKRABARTY, 2006; SPARKS e SMITH, 2004;

MARESCALCHI, 2005). A monofilia da família é suportada por caracteres

morfológicos (ZIHLER, 1982; GAEMERS, 1984; STIASSNY, 1987) e moleculares

(STREELMAN e KARL 1997; FARIAS et al., 1999; 2000).

O grupo dos ciclídeos é rico em espécies com taxa de especiação

extremamente rápida, formada por peixes altamente especializados (KORNFIELD,

1978; THOMPSON, 1979). São considerados peixes de água doce secundários,

identificados como um grupo que derivou a partir de espécimes marinhos. Existem

casos em que espécies são encontradas vivendo em águas salobras ou nadando

em águas marinhas (MURRAY, 2001).

Ciclídeos possuem hábitos diurnos, formam ninhos, possuem cuidado

parental dos ovos e larvas e são adaptados aos mais variados ambientes, apesar de

ocorrerem com maior frequência em águas calmas.

Em relação ao número de espécies, os ciclídeos africanos são mais

expressivos quando comparados aos ciclídeos Neotropicais, que por outro lado,

apresentam comportamento, morfologia e ecologia variados (Nelson, 2006).

Acredita-se que a divisão entre os ciclídeos Sul Americanos e os Africanos

aconteceu no cretáceo, após a fragmentação da Gondwanna há mais de 100

milhões de anos (STIASSNY, 1987; NELSON, 2006). Após terem se instalado na

América do Sul, conseguiram atingir a América Central e do Norte, principalmente no

México. São encontrados também na Europa, como fósseis, e nas Antilhas

(MURRAY, 2001).

De acordo com Kocher (2004), a partir de um único ancestral, surgiram

aproximadamente 2.000 espécies de ciclídeos em pelo menos 10 milhões de anos

nos lagos do leste da África. Essa informação demonstra a rápida taxa de

especiação que ocorre entre os ciclídeos como um todo.

De acordo com Nelson (2006), a família Cichlidae é taxonomicamente

classificada como:

Classe – Osteichthyes

Sub-Classe – Actinopterygii

Infra-Classe – Teleostei

Divisão – Euteleostei

Infra-Divisão – Neoteleostei

Super-Ordem – Acanthopterygii

Série – Percomorpha

Ordem – Perciformes

Sub-Ordem – Labroidei

Família – Cichlidae

No sistema do Alto Rio Paraná os ciclídeos são representados pelos gêneros

Geophagus Heckel 1840, Crenicichla Heckel, 1840; Cichlasoma Swainson, 1839;

Australoheros Rican e Kullander, 2006; Satanoperca Günther, 1862; Cichla Bloch e

Schneider, 180; Astronotus Swainson, 1839; Gymnogeophagus Miranda Ribeiro,

1918; Oreochromis Günther, 1889 e Tilapia Smith, 1840 (Langeani et al., 2007).

1.4.1 Gênero Australoheros

O gênero Australoheros pertence à subfamília Cichlasomatinae (tribo Heroini)

com espécies encontradas na bacia do Rio da Prata, nos tributários do rio Paraná,

rio Paraguai e principalmente no sistema do rio Uruguai. Sua distribuição se estende

a oeste na cordilheira dos Andes, na Argentina indo para o leste nas drenagens

costeiras do Atlântico, Uruguai e no Brasil, incluindo a drenagem de São Francisco.

Pode ocorrer também na bacia do rio Tocantins. Sua distribuição é superior em

comparação a outros ciclídeos do grupo Heroini, estendendo-se por todo o

continente Sul - americano. É o único gênero dessa tribo que ocorre fora da bacia

Amazônica, e apesar de pertencer aos ciclídeos Sul - americanos, é mais

relacionado com os Heroini da mesoamérica e das Antilhas (RICAN e KULLANDER,

2008).

É um grupo monofilético suportado por sinapomorfias como o padrão de

coloração na fase reprodutiva onde se observa a interrupção das listras (5-7) em sua

parte mediodorsal e presença de xantóforos na base da nadadeira caudal em

juvenis (RICAN e KULLANDER, 2006). A interrupção das listras, anteriormente

considerada como característica diagnóstica para a espécie Cichlasoma facetum,

hoje suporta a monofilia do gênero.

Rican e Kullander (2006) recentemente descreveram o gênero Australoheros,

e a princípio, foram reconhecidas quatro espécies: Australoheros facetus (JENYNS,

1842), Australoheros tembe (CASCIOTTA, GÓMEZ e TORESANI, 1995),

Australoheros scitulus (RICAN e KULLANDER, 2003) e Australoheros kaaygua

(CASCIOTTA, ALMIRÓN e GÓMEZ, 2006). A Tabela 1 apresenta as espécies que

foram posteriormente descritas e suas distribuições geográficas. De acordo com

Rican e Kullander (2008) a biogeografia de Australoheros ao longo do baixo Paraná,

e na maioria da parte ocidental da Argentina, ainda é pouco conhecida, porém

estudos indicam que Australoheros facetus é provavelmente o grupo-irmão de A.

guarani. Australoheros facetus é encontrado somente em drenagens costeiras do

Rio da Prata, mas não ao longo do rio Uruguai (onde Australoheros minuano é

encontrado). Para as drenagens do Alto Paraná, encontramos representantes de A.

guarani, e para essa drenagem não são conhecidos os limites de distribuição de A.

facetus.

A complexidade e a diversidade de formas das espécies, além da grande

distribuição geográfica, tornam o gênero Australoheros um dos mais diversificados

dentro da tribo Heroini (RICAN e KULLANDER, 2008).

Em levantamentos ictiofaunísticos até agora realizados para o Alto Paraná,

foram encontrados para o gênero Australoheros somente a espécie Australoheros

facetus (LANGEANI et al., 2007) (Figura 1). Devido às inúmeras espécies descritas

nos últimos anos, é possível ainda que existam espécies que não foram descritas,

fazendo-se necessários estudos a respeito da taxonomia utilizando ferramentas

moleculares e morfológicas para o reconhecimento do gênero e estimativa da

biodiversidade.

Figura 1

. Australoheros facetus: espécie tipo do gênero. Fonte:

Fishbase (2009)

Espécie Distribuição

Australoheros forquilha Rican e Kullander, 2008 Bacia do Alto Rio Uruguai

(Argentina e Brasil)

Australoheros charrua Rican e Kullander, 2008 Drenagens do Rio Uruguai (Brasil)

Australoheros minuano Rican e Kullander, 2008 Médio e Baixo Rio Uruguai (Brasil

e Uruguai)

Australoheros guarani Rican e Kullander, 2008 Tributários do Baixo Rio Paraguai

(Paraguai)

Australoheros autrani Ottoni e Costa, 2008 Bacia do Rio São João (Sudeste

do Brasil)

Australoheros barbosae Ottoni e Costa, 2008 Bacia do Rio Paraíba do Sul, Rio

Preto (Minas Gerais)

Australoheros ipatinguensis Ottoni e Costa, 2008 Bacia do Rio Doce (Minas Gerais)

Australoheros macacuensis Ottoni e Costa, 2008 Bacia do Rio Macacu (Rio de

Janeiro)

Australoheros macaensis Ottoni e Costa, 2008 Bacia do Rio Macaé (Sudeste do

Brasil)

Australoheros muriae Ottoni e Costa, 2008 Rio Muriaé, Bacia do Rio Paraíba

do Sul (Sudeste do Brasil)

Australoheros paraibae Ottoni e Costa, 2008 Rio do Peixe, Rio Paraíba do Sul

(Brasil)

Australoheros ribeirae Ottoni, Oyakawa e Costa, 2008 Bacia do Rio Ribeira do Iguape

(Brasil)

Australoheros robustus Ottoni e Costa, 2008

Córrego da Areira, Bacia do Rio

Paraíba do Sul (Brasil)

Australoheros saquarema Ottoni e Costa, 2008

Bacia do Rio Mato Grosso,

Sistema Lagoa de Saquarema. RJ

Australoheros taura Ottoni e Cheffe, 2009

Bacia do Alto Rio das Antas, Rio

Grande do Sul (Brasil)

Tabela 1

. Espécies incluídas no gênero Australoheros e suas distribuições geográficas. Fonte:

Eschmeyer (2010).

Australoheros kaaygua Casciotta, Almirón e Gómez,

2006

Bacia do Rio Iguaçu (Brasil e

Argentina) tributários do Alto Rio

Uruguai (Brasil)

Australoheros tembe (Casciotta, Gómez e Toresanni,

1995)

Bacia do Rio Paraná e Rio

Uruguai (Argentina)

Australoheros scitulus (Rican e Kullander, 2003) Tributários do Baixo Rio Uruguai

(Argentina, Uruguai e Brasil)

Australoheros facetus (Jenyns, 1842) Argentina, Brasil, Chile e Uruguai

Continuação da tabela 1.

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

• Caracterizar por meio de dados moleculares as espécies de Cichlidae da

bacia do Alto Rio Paraná utilizando gene mitocondrial Citocromo c Oxidase

subunidade I;

• Apresentar evidências de uma nova espécie de Australoheros para os rios

de cabeceiras do Alto Rio Tietê.

2.2 Específicos

• Realizar o sequenciamento de segmentos parciais do gene mitocondrial

COI para as espécies da família Cichlidae encontradas no Alto Paraná;

• Avaliar o desempenho das sequências do gene COI para a caracterização

das espécies de peixes;

• Apresentar evidências de uma nova espécie de Australoheros para a

bacia do Alto Rio Tietê utilizando dados moleculares e morfológicos.

3 MÉTODO

3.1 Coleta das Amostras

Amostras de tecidos foram adquiridas em colaboração com o Laboratório de

Biologia e Genética de Peixes do Profº Drº Cláudio de Oliveira da Universidade

Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” campus Botucatu.

Os métodos de coleta utilizados na captura dos espécimes incluíram a

técnica de pesca elétrica, redes de espera incluindo puçás, vara e anzol. Após a

obtenção dos indivíduos, partes da nadadeira e músculo foram retirados e

conservados em etanol 95%, e os indivíduos posteriormente fixados em formol 10%

para futuras análises morfológicas. Foram adquiridos de 5 a 10 amostras de tecido

de cada espécie para posterior extração de DNA. Os espécimes foram coletados na

bacia do Alto Rio Paraná em diversas localidades conforme apresentado na Tabela

2. A Figura 2 indica as localidades das coletas ao longo do Alto Rio Paraná.

Espécie Número do Lote/ nº de

acesso do tecido

Localidade Data

Crenicichla haroldoi LBP 6712 (31750) Rio Paraná/Bacia do

Prata

01/VII/2008

Crenicichla britskii LBP 5218 (26402, 26403,

26404, 26405, 26459,

26460, 26461)

Rio Paraná/ Rio do Prata 31/X/2007

Crenicichla sp. LBP 6421 (29973, 29974,

29975, 29976, 29977)

Rio Tibagi/ Bacia do

Prata

05/VI/2008

Crenicichla sp. LBP 2593 (17219, 17220,

17221, 17222, 17223)

Rio Tietê/Miraluz- SP 17/II/2005

Crenicichla sp. LBP 2993 (19658, 19659,

19660)

Rio Tietê/Rio Paraná 23/IX/2004

Cichla piquiti LBP 6720 (32030) Rio Paraná/Bacia do

Prata

01/VII/2008

Cichla kelberi LBP 5192 (26758, 26695,

26693, 26696, 26692)

Rio da Prata/ Rio Paraná 31/X/2007

Cichla sp. LBP 3492 (20147, 20148,

20149, 20150, 20151,

20152, 20153, 20154.)

Rio Tietê/Rio Paraná 01/I/2006

Cichlasoma

paranaense

LBP 5001 (32210, 32211,

32212, 25905, 25906,

25907)

Rio Grande/Rio Paraná 09/IV/2007

Australoheros riberae LBP 4630 (34801, 34802,

34803, 4630, 35523)

Jaguary/ Ribeira de

Iguape

17/XI/2008

Australoheros sp. (6b30, ID62, ID81, ID83,

ID94, ID96, ID102, ID109,

ID112, ID116, ID117,

ID120, ID157.

Cabeceiras do Alto Rio

Tietê

2008/2009

Geophagus

brasiliensis

LBP 5950 (28089, 28090,

28091, 27917, 27919)

Rio Grande/ Bacia do

Prata

10/I/2008

Geophagus

brasiliensis

1B02, ID46, 5B36 Rio Tietê/ Rio Paraitinga/

Rio Jundiaí

24/I/2008

Oreochromis niloticus

ID155(1), (2), (3), (4), (5) Rio Tietê/ Reservatório

Jundiaí

X/2009

Tilapia rendalli ID154 (1), (2), (3), (4), (5) Rio Tietê/ Reservatório

Jundiaí

X/2009

Astronotus

crassipinnis

LBP 5193 (26681, 26680,

26682, 26683, 26684,

26679.)

Rio da Prata/ Rio Paraná

31/X/2007

Satanoperca

pappaterra

LBP 5194 (26745, 26748,

26749, 26747, 26746,

26750)

Rio da Prata/ Rio Paraná

31/X/2007

Tabela 2. Amostras dos espécimes coletados na bacia do Alto Rio Paraná

Figura 2

. Mapa ilustrativo dos pontos de coleta dos espécimes de ciclídeos da Bacia do Alto

Paraná. Nota: Cada ponto representa um local de coleta. Fonte: SpeciesLink (2001)

3.2 Extração de DNA

Para a extração do DNA total foram utilizadas partes da nadadeira peitoral e

rastros branquiais. Foi utilizado o kit de extração Illustra

Tissue&Cells

genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare Life Sciences) de acordo com os

procedimentos descritos pelo fabricante. O protocolo consiste basicamente na

homogeneização do tecido utilizando tampão PBS (Fosfato de sódio dibásico a

50mM, fosfato de sódio monobásico a 50mM, pH 7,4), lise do tecido para a

liberação do conteúdo citoplasmático, remoção do RNA, purificação da amostras

para a remoção das proteínas e posterior precipitação do DNA.

Após a extração, as amostras foram avaliadas quanto a integridade e

concentração de DNA por meio de gel de agarose a 0,8% em tampão TAE 1X

(0.04M Tris-acetato, 0.001M EDTA) corado com brometo de etídio (1mg/mL),

digitalizados sob luz UV e por meio de espectrofotômetro (NanoDrop

ND-1000).

3.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Para a amplificação da região do gene Citocromo c oxidase subunidade I

(COI) foram realizadas reações de PCR contendo DNA template a 50ng/ µL, 10pmol

de primer, 2,5 mM de MgCl

, 1U de Taq DNA Polimerase, 2,5 mM de dNTP e água

esterilizada para um volume final de 50 µL. O programa utilizado para as

amplificações consiste em: 94°C por 3 minutos, 94°C por 1 minuto, 55°C por 1

minuto, 72°C por 1 minuto e 40 segundos em um total de 35 ciclos. As reações

foram realizadas em termociclador (Peltier Thermal Cicler PTC 200-MJ Research).

Géis de agarose a 1,2% (70V) foram feitos para verificar as amplificações e

posteriormente digitalizados em fotodocumentador ImageQuant 300 (GE Healthcare

Life Sciences), utilizando-se luz UV. Para preparação das reações de PCR um

controle negativo foi usado como indicador da não contaminação das demais

amostras, sendo que o mesmo é preparado com todos os componentes, porém, sem

o DNA. As amostras foram preparadas em fluxo laminar com esterilização do

material em raios UV.

Foram testados 4 pares de primers do gene COI para a obtenção de bandas

consistentes. Dois pares foram cedidos gentilmente pelo Profº Drº Cláudio de

Oliveira da Universidade Estadual Paulista. Os primers testados foram: L6252, H

7271, e L5698, H5934. Outros dois pares foram sintetizados de acordo com Ward et

al. (2005) Fish-F1, Fish-R1 e Fish-F2, Fish-R2 (Tabela 3).

Primers Sequência

L6252 5’ AAG GCG GGG AAA GCC CCG GCA G 3’

H7271 5’ TCC TAT GTA GCC GAA TGG TTC TTT T 3’

L5698 5’ AGG CCT CGA TCC TAC AAA GKT TTA GT 3’

H5934 5’ GGG TGC CAA TGT CTT TGT GGT T 3’

Fish-F1 5’ TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 3’

Fish-R1 5’ TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 3’

Fish-F2 5’ TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC 3’

Fish-R2 5’ ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA 3’

Para a caracterização da possível espécie nova de Australoheros sp. foram

utilizados primers do gene Citocromo b (Tabela 4) de acordo com Kocher et al.

(1989) Glu-DGL e H15149 e Irwin et al. (1991) Fish-cytB-F e H15915.

As condições de amplificação do Citocromo b seguem o protocolo descrito

para o gene COI.

Tabela 3. Sequência de primers do gene COI testados nas reações de PCR

Primers Sequência

Glu-DGL 5’ TGA CTT GAA RAA CCA YCG TTG 3’

Fish-cytB-F

5 ACC ACC GTT GTT ATT CAA CTA CAA GAA C’ 3’

H15149 5’ AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A 3’

H15915 5’ AAC TGC CAG TCA TCT CCG GGT TAC AAG AC 3’

3.4 Purificação do produto de PCR

Após a avaliação em gel de agarose, o produto amplificado da região de

interesse foi purificado para a utilização na reação de sequenciamento. As amostras

foram purificadas utilizado o kit “GFX

PCR DNA e Gel Band Purification” (GE

Healthcare), segundo recomendações do fabricante.

A verificação da qualidade das purificações foi feita por meio de eletroforese

em gel de agarose a 1,5% (65V) corado com brometo de etídio.

3.5 Sequenciamento

O sequenciamento foi realizado segundo o método de interrupção de cadeia

(SANGER et al., 1977) utilizando-se o kit DYEnamic ET Terminator premix (GE

Healthcare). As reações foram feitas no Centro de Estudos do Genoma Humano da

Universidade de São Paulo. O protocolo de preparação da reação de

sequenciamento encontra-se na Tabela 5. As condições de temperatura para

realizar as reações foram: 95ºC por 20 segundos, 55ºC por 15 segundos, 60ºC por 1

minuto em um total de 30 ciclos.

Tabela 4. Sequência de primers do gene Citocromo b utilizados nas reações de PCR.

O material foi analisado no equipamento de sequenciamento automático ABI

Prism 3730 (Applied Biosystems). Foram feitas duplicatas de cada amostra para a

obtenção de sequências consenso.

Reagentes Quantidade

Amostra de DNA purificado 1µL (Amostra de DNA a 20 ng)

DYEnamic ET terminator 4 µL (2 µl de buffer tampão e 2 µl de prémix)

Primer (5 pmol/ µL) 1 µL

Água ultrapura Completar para 10 µL de reação.

3.6 Análise Estatística dos Dados

3.6.1 Análises Moleculares

As sequências foram editadas utilizando o programa BIOEDIT Sequence

Alignment Editor 7.0.9 (HALL, 1999) para a obtenção de sequências consenso. É

realizado esse procedimento para que a sequência em estudo seja fidedigna ao

representado no genoma, aumentando a confiabilidade dos resultados.

As análises taxonômicas dos dados moleculares para o gene COI foram

realizadas com o programa MEGA 4 (TAMURA et al., 2007), utilizando o método de

Neighbor- Joining (SAITOU e NEI, 1987) modelo Kimura-2-parameter (KIMURA,

1980) com bootstrap de 3000 réplicas. As sequências foram alinhadas utilizando o

aplicativo ClustalW (THOMPSON et al., 1994).

Tabela 5. Reagentes utilizados nas reações de sequenciamento.

Kimura-2-parameter (K2P) é o modelo que assume diferentes probabilidades

de ocorrer substituições de bases nucleotídicas, ou seja, probabilidades diferentes

de ocorrer transições e transversões. Diferentemente, o modelo Jukes Cantor

assume que as mudanças de nucleotídeos podem ocorrer aleatoriamente, ou seja,

igual probabilidade de ocorrer mudanças de bases. O modelo Kimura-2-parameter

foi utilizado por questão de padronização da técnica de DNA Barcode. Esse é o

melhor modelo quando as distâncias entre os táxons são baixas (NEI e KUMAR

2000).

Neighbor- Joining é um método para a reconstrução de árvores a partir de

uma matriz de distância e de acordo com o princípio da evolução mínima (minimum

evolution). A distância entre cada par de espécies é a soma dos comprimentos dos

ramos que os unem na árvore, combinando os nós da árvore até encontrar uma

combinação que fornece a menor soma de comprimento de ramos, resultando em

árvores sem raiz denominadas fenogramas (SAITOU e NEI, 1987).

Já para a análise das sequências do gene Citocromo b foi utilizado o método

de Evolução Mínima modelo Kimura-2-parameter com bootstrap de 3000 réplicas.

Para o citocromo b foi utilizado esse método, pois a topologia da árvore encontrada

corroborou com a divergência genética par a par entre as espécies. Foi gerada,

contudo, uma árvore de evolução mínima sem raiz. O método da evolução mínima

estima o comprimento total dos ramos de cada possível topologia. Depois de avaliar

todas as possíveis topologias, o método escolhe a topologia com o menor

comprimento total de ramos.

3.6.2 Estudo Morfológico do gênero Australoheros

A análise morfológica foi baseada em caracteres morfométricos e merísticos

descritos por Kullander (1987). Adicionalmente, a nova espécie foi diferenciada por

meio de dados morfológicos encontrados na literatura (Rican e Kullander, 2008;

Ottoni e Costa, 2008; Ottoni, Oyakawa e Costa, 2008; Ottoni e Cheffe, 2009;

Casciotta, Almirón e Gómez, 2006; Casciotta, Gómez e Toresanni, 1995; Rican e

Kullander, 2003). Foram utilizados os valores máximos e mínimos para a

comparação com os dados presentes na literatura.

As medidas morfométricas foram feitas com paquímetro utilizando precisão de

décimo de milímetro, e as contagens foram realizadas utilizando lupa

estereoscópica.

Após a obtenção dos dados morfométricos e merísticos, estes foram inseridos

em planilhas utilizando o programa Microsoft Office Excel 2003 para a análise

estatística.

4 RESULTADOS

4.1 Extração de DNA

As extrações de DNA utilizando o kit Illustra

Tissue&Cells genomicPrep

Mini Spin Kit, apresentaram pouca degradação e DNA suficiente para a realização

da PCR (Figura 3).

Figura 3

. Amostras de DNA de ciclídeos em gel de

agarose a 0,8% corado com brometo de etídio. Nota:

M= Marcador λ-Hind III.

6557 pb

23130

9416 pb

4361

4.2 Teste para escolha dos primers

Foram testados 4 pares de primers para o gene COI e 2 pares para o gene

Citocromo b. Foram avaliados parâmetros como reprodutibilidade, intensidade e

uniformidade das bandas obtidas. Para o COI,

os primers L6252 e H7271 (Oliveira,

C. comunicação pessoal), resultaram em bandas de 1000 pb, porém não foi possível

amplificar todas as amostras do lote. Já os primers L5698 e H5934 (Oliveira, C.

comunicação pessoal.) obtiveram reprodutibilidade, porém as bandas possuíam

aproximadamente 300 pb, o que poderia representar um pseudogene.

Já os pares de primers Fish-F1, Fish-R1 e Fish-F2, Fish-R2 (Ward et al.,

2005), obtiveram reprodutibilidade para todas as amostras e bandas consistentes de

700 pb. Foi escolhido para a amplificação de todas as amostras o par Fish-F2, Fish-

R2, pois as bandas eram mais intensas no gel comparadas com as bandas

utilizando os primers Fish-F1, Fish-R1 (Figura 4). O par de primer escolhido inicia o

anelamento no começo do gene COI, aproximadamente a partir de 40 pb.

Para a amplificação do gene Citocromo b foi utilizado o par de primers Fish-

cytB-F e H15149 devido à uniformidade e reprodutibilidade das bandas que tiveram

resultado superior as bandas amplificadas com o par Glu-DGL e H15915.

As purificações utilizando o kit “GFX

PCR DNA e Gel Band Purification”

foram satisfatórias, a qual foi possível obter quantidade suficiente de DNA para

posterior sequenciamento.

4.3 Sequenciamento

As sequências após serem obtidas, foram alinhadas e editadas para a

construção dos fenogramas e análise dos dados de similaridade. Os cromatogramas

apresentaram picos definidos e sequências concisas.

Figura 4

. Gel de agarose 1,5% de amostras de DNA

amplificadas com o primer Fish-F1, Fish-R1 para o

gene do Citocromo c oxidase subunidade 1 (COI).

Nota: M= Marcador 100 pb.

600 pb

4.4 Fenogramas e Divergências Genéticas dos Cichlidae do Alto

Paraná

Após o sequenciamento e tratamento das sequências consenso, estas foram

analisadas para se obter árvores por meio dos dados moleculares. Foi obtido um

total de 89 sequências do gene COI com 544pb, incluindo 15 espécies dentro de 9

gêneros. Dos 544 nucleotídeos foram observados: 304 sítios conservados, 235 sítios

variados e 18 sítios únicos. A composição nucleotídica indicou maior quantidade de

bases C e T (Tabela 6).

Gene A T C G

COI 23,2% 29,8% 30,3% 16,6%

A média de divergência intraespecífica no grupo dos ciclídeos do Alto Paraná

foi de 0,5%, com o mínimo de 0% e máximo de 1%. Já a divergência média

interespecífica foi de 19%, com mínimo de 3% e máximo de 30%.

Para a espécie Crenicichla britskii a divergência genética intraespecífica foi

de 0%. Espécimes que anteriormente não possuíam classificação, representados

como Crenicichla sp. tiveram divergência de 1% a 3%. Para os demais grupos de

ciclídeos, Crenicichla britskii, obteve divergência média interespecífica de

aproximadamente 25%.

Cichlasoma paranaense obteve divergência intraespecífica variando de 0% a

1% com média interespecífica de 21,5%. A menor divergência interespecífica foi

para a espécie Cichla sp. (18%) e maior para Tilapia rendalli (25%).

Tabela 6

. Frequência média de bases (ATCG) do gene Citocromo c

oxidase subunidade I (COI).

Astronotus crassipinnis teve divergência intraespecífca de 0% e média de

divergência interespecífica de 19,5% com menor divergência para Cichla kelberi

(15%) e maior para Tilapia rendalli (24%).

As espécies Cichla piquiti e Cichla kelberi obtiveram divergência média de

6%.

A divergência intraespecífica para os exemplares da espécie Satanoperca

pappaterra foi de 0%, com média interespecífica de 21,5%. A menor divergência foi

observada em relação às espécies de Geophagus brasiliensis com 18% e

divergência máxima para as espécies de Oreochromis niloticus.

Dentro da espécie Geophagus brasiliensis a divergência foi de 0%, com

média interespecífica de 22,5%. A menor divergência (18%) foi observada para a

espécie Satanoperca pappaterra e maior (27%) para a espécie Crenicichla sp.

proveniente do rio Tibagi, Bacia do Prata.

A espécie nova de Australoheros sp. comparada com a espécie Australoheros

ribeirae tiveram divergência nucleotídica de 4% e para a espécie Australoheros

facetus de 3%. Entre os exemplares de Australoheros sp. a divergência foi de 0%. A

média interespecífica foi de 23%, com menor diferenciação para as espécies Cichla

sp. e Tilapia rendalli e maior para Crenicichla haroldoi.

Já Australoheros ribeirae possui divergência intraespecífica de 0% com média

interespecífica de 23% com maior divergência para a espécie Cichla sp. e menor

para a espécie Crenicichla haroldoi.

Entre os indivíduos pertencentes à espécie Tilapia rendalli a divergência

nucleotídica foi de 0% e média interespecífica de 23%, com menor divergência para

a espécie Australoheros ribeirae (18%) e maior para Crenicichla haroldoi (28%).

Oreochromis niloticus também mostra divergência intraespecífica de 0% porém a

média interespecífica foi de 20,5%, com menor divergência para Tilapia rendalli e

maior para Crenicichla haroldoi. Os dados acima foram sumarizados e apresentados

na Tabela 7, o qual é mostrado à divergência entre as espécies de Cichlidae

coletados no Alto Paraná. A Figura 5 apresenta o padrão das divergências médias

interespecíficas entre os ciclídeos do Alto Paraná.

Figura 5. Divergência média intraespecífica entre de ciclídeos encontrados no Alto Paraná.

Divergência Média Interespecífica dos Ciclídeos do Alto Paraná

Média interespecífica

Crenicihla britiskii

Cichlasoma paranaense

Astronotus crassipinnis

Satanoperca pappaterra

Geophagus brasiliensis

Australoheros sp.

Australoheros ribeirae

Tilapia rendalli

Oreochromis niloticus

Cichla piquiti

Cichla kelberi

Tabela 7. Divergência entre as espécies de ciclídeos da bacia do Alto Rio Paraná

O fenograma na Figura 6 mostra as relações entre os ciclídeos da bacia do

Alto Paraná. Cada ramo representa um conjunto de indivíduos, exceto os ramos que

compreendem as espécies do gênero Crenicichla e Cichla, que estão representados

todos os exemplares analisados. As espécies do gênero Australoheros compartilham

um clado assim como as espécies Oreochromis niloticus e Tilapia rendalli. O

conjunto de espécimes classificados como Cichla sp. podem ser caracterizadas

parte como Cichla piquiti e parte como Cichla kelberi.

O gênero Crenicichla formou um único ramo suportado por 90% de bootstrap,

havendo separação entre as espécies Crenicichla haroldoi e Crenicichla britskii. Os

espécimes Crenicichla sp. de 1 a 11 podem ser classificados como Crenicichla

britskii.

19659

19660

19658

17223

17222

17221

17219

Crenicichla britsk ii

Crenicichla britsk ii(2)

Crenicichla britskii(3)

29973

29974

29976

Crenicichla sp.

20154

Cichla piquiti

20152

20151

20149

Cichla k elberi(3)

20147

20150

Cichla k elberi(5)

Cichla k elberi

Cichla k elberi(2)

Cichla k elberi(4)

0.02

Figura

Fenograma das relações entre as espécies de Cichlidae coletadas no

Alto Paraná utilizando o método de análise Neighbor- Joining modelo Kimura-2-

parameter. Nota: Ex.= Exemplar. A espécie Australoheros ribeirae não pertence à

Bacia do Alto Paraná. Cada ramo representa mais de um exemplar exceto para

as espécies do gênero Crenicichla e Cichla.

Cichlasoma paranaense

Satanoperca pappaterra

Geophagus brasiliensis

Astronotus crassipinnis

Tilapia rendalli

Oreochromis niloticus

Australoheros ribeirae

Australoheros facetus

Australoheros

sp. Tie

tê

Crenicichla haroldoi

Crenicichla sp.(ex.17219)

Crenicichla sp.(ex.17221)

Crenicichla sp.(ex.17222)

Crenicichla sp.(ex.17223)

Crenicichla sp.(ex.19658)

Crenicichla sp.(ex.19659)

Crenicichla sp.(ex.19660)

Crenicichla britskii (ex.26459)

Crenicichla britskii (ex.26460)

Crenicichla britskii (ex.26461)

Crenicichla sp. (ex.29974)

Crenicichla sp.(ex.29976)

Crenicichla

sp.

(ex.29973)

Crenicichla

sp. (

ex.

17220)

Cichla sp (ex.20154)

Cichla piquiti

Cichla sp (ex.20152)

Cichla sp (ex.20151)

Cichla sp (ex.20149)

Cichla cf. kelberi (ex.26692)

Cichla cf. kelberi (ex.26693)

Cichla cf. kelberi (ex.26696)

Cichla

kelberi

(ex.26758

)

Cichla sp.(ex.20147)

Cichla sp. (ex.20150)

Cichla

cf.

kelberi

(

ex.26695

)

100

4.5 Nova espécie de Australoheros para as cabeceiras do Alto

Rio Tietê

4.5.1 Dados Morfológicos

Nos rios de cabeceiras pertencentes à Bacia do Rio Tietê foi reconhecida uma

nova espécie pertencente ao gênero Australoheros, a qual foi diferenciada das

demais espécies do gênero com base em características morfológicas e

moleculares.

A espécie do Alto Tietê (Figura 7) é popularmente chamada de Cará-verde,

por possuir uma coloração verde típica. Possui listras interrompidas na porção

mediodorsal (perto da cabeça), e em juvenis, ocorre à presença de xantóforos na

base da nadadeira caudal. Os dados morfométricos e merísticos são apresentados

nas Tabelas 8 e 9.

Figura 7. Australoheros sp. nova espécie. Fonte: Marceniuk (2009)

Medida N Min- Max Média

Comprimento Padrão (mm) 23 27,7 – 129,5 78,5

Altura do corpo 23 11,4 – 61,7 35,4

Comprimento da nadadeira peitoral 23 7,2 – 38,5 23,1

Comprimento da nadadeira pélvica 23 7,1 – 69,6 40,3

Comp. do último espinho da

nadadeira dorsal

23 3,1 – 20,4 11,7

Altura do pedúnculo caudal 23 4,4 – 24,4 7,2

Comp. do pedúnculo caudal 23 4,3 – 11,3 7,2

Comprimento da mandíbula

superior

23 2,6 – 16,4 9,2

Comp. da mandíbula inferior 23 4,1 – 21,9 12,4

Comprimento da cabeça 23 10 - 44 27,6

Comprimento do focinho 23 3,1 – 18,3 10,6

Diâmetro orbital 23 3,8 – 11,8 8,3

Largura pré-orbital 23 1,2 – 10,1 5,3

Altura da Cabeça 23 9,6 – 48,1 28,1

Largura interorbital 23 3 – 20,8 10,8

Tabela

. Dados morfométricos em porcentagem do comprimento padrão de

Australoheros sp. Nota: N = Número de indivíduos examinados; Min = Medida

mínima; Max =Medida máxima.

Contagens N Min- Max

Espinhos da nadadeira dorsal 23 16 -17

Raios da nadadeira dorsal 23 8 - 11

Espinhos da nadadeira anal 23 7- 8

Raios da nadadeira anal 23 7- 8

Espinhos da nadadeira pélvica 23 1

Raios da nadadeira pélvica 23 5

Raios da nadadeira caudal 23 22

Raios da nadadeira peitoral 23 13- 14

Epibranquial 23 3- 4

Ceratobranquial 23 9 -10

Total de Vértebras 23 26

Pares de costelas 23 10

Vértebras pré- caudais 23 14

Escamas da linha lateral superior 23 16- 17

Escamas da linha lateral inferior 23 7 -10

Morfologicamente, Australoheros sp. difere de Australoheros autrani por

possuir menor número de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9-10; Figura 9), menor

número de rastros no primeiro arco epibranquial (3-4 vs. 5-6; Figura 12) e menor

número de rastros do primeiro arco ceratobranquial (9-10 vs. 14-16; Figura 13).

Australoheros sp. pode ser diferenciada da espécie Australoheros barbosae

por possuir menor número de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9-10; Figura 9), menor

número de rastros no primeiro arco epibranquial (3-4 vs. 6-8; Figura 12) e menor

número de rastros do primeiro arco ceratobranquial (9-10 vs.15-17; Figura13). A

nova espécie difere de Australoheros charrua por possuir maior número de rastros

no primeiro arco epibranquial (3-4 vs. 2; Figura 12) e maior número de rastros do

primeiro arco ceratobranquial (9-10 vs. 6-8; Figura 13).

Australoheros sp. difere das espécies Australoheros facetus e Australoheros

forquilha por possuir menor número de rastros do epibranquial (3-4 vs. 6-7, Figura

12) e maior número de rastros do ceratobranquial (3-4 vs. 2; Figura 13). Difere da

Tabela

. Dados merísticos de Australoheros sp. Nota: N = Número de

indivíduos examinados; Min = Medida mínima; Max =Medida máxima.

espécie Australoheros guarani por ter maior número de rastros do epibranquial (3-4

vs. 2; Figura 12) e maior número de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 8, Figura

13).

A nova espécie é diferenciada de Australoheros ipatinguensis por possuir

menor número de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9; Figura 9), maior número de

espinhos da nadadeira dorsal (16-17 vs. 15; Figura 10) e menor número de rastros

do ceratobranquial (9-10 vs. 13-14; Figura 13).

Australoheros sp. difere da espécie Australoheros kaaygua e Australoheros

tembe por possuir maior número de espinhos da nadadeira anal (7-8 vs. 5-6; Figura

8) e para a espécie Australoheros kaaygua por possuir maior número do

epibranquial (3-4 vs. 2; Figura 12) e maior número de rastros no ceratobranquial (9-

10 vs. 6-8; Figura 13).

Australoheros sp. é diferenciada da espécie Australoheros macacuensis por

possuir menor número de rastros do epibranquial (3-4 vs. 6-7; Figura 12) e menor

número de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 14-15; Figura 13). Difere também da

espécie Australoheros macaensis por possuir menor número de rastros do

ceratobranquial (9-10 vs. 15-16; Figura 13).

A nova espécie é diferenciada de Australoheros minuano por possuir maior

número de raios da nadadeira peitoral (13-14 vs. 12; Figura 11), maior número de

rastros do epibranquial (3-4 vs. 2; Figura 12) e maior número de rastros do

ceratobranquial (9-10 vs. 6-8; Figura 13). Difere também da espécie Australoheros

miriae por possuir menor número de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9-10; Figura 9),

maior número de espinhos da nadadeira dorsal (16-17 vs. 15; Figura 10) e menor

número de rastros do ceratobranquial (9-10 vs. 13-16; Figura 13).

Australoheros sp. difere de Australoheros paraibae por possuir menor número

de rastros do epibranquial (3-4 vs. 7-8; Figura 12) e menor número de rastros do

ceratobranquial (9-10 v.s 13-16; Figura 13). Difere de Australoheros ribeirae por

possui menor número de rastros do epibranquial (3-4 vs. 5-7; Figura 12) e menor

número de rastros do ceratobranquial (9-10 v.s 15-16; Figura 13). Difere também da

espécie Australoheros robustus por possuir menor número de rastros do

ceratobranquial (9-10 vs. 13-16; Figura 13).

A nova espécie difere de Australoheros saquarema por possuir menor número

de raios da nadadeira anal (7-8 vs. 9; Figura 9), e menor número de rastros do

ceratobranquial (9-10 v.s 13-14; Figura 13). Difere da espécie Australoheros taura

por possuir menor número de rastros do epibranquial (3-4 vs. 6-7; Figura 12) e

menor número de rastros do ceratobranquial (9-10 v.s 15-16; Figura 13). E por fim,

difere da espécie Australoheros tembe por possuir maior número de espinhos da

nadadeira anal (7-8 v.s 5-6; Figura 8).

Figura 8. Número de espinhos da nadadeira anal.

Número de espinhos da nadadeira anal

Espécies

Nº de espinhos

Australoheros sp.

Australoheros kaaygua

Australoheros tembe

Figura 10. Número de espinhos da nadadeira dorsal

Figura 9. Número de raios da nadadeira anal

Número de espinhos da nadadeira dorsal

15 15

Espécies

Nº de espinhos

Australoheros sp.

Australoheros muriae

Australoheros

ipatinguensis

Número de raios da nadadeira anal

9 9

Espécies

Nº de raios

Australoheros sp.

Australoheros autrani

Australoheros barbosae

Australoheros muriae

Australoheros ipatinguensis

Australoheros saquarema

Figura 11. Número de raios da nadadeira peitoral

Número de raios da nadadeira peitoral

Espécies

Nº de raios

Australoheros sp.

Australoheros minuano

Número de rastros no primeiro epibranquial

Espécies

Nº de rastros

Australoheros sp.

Australoheros autrani

Australoheros barbosae

Australoheros charrua

Australoheros facetus

Australoheros guarani

Australoheros kaaygua

Australoheros m inuano

Australoheros forquilha

Australoheros m acacuensis

Australoheros taura

Australoheros paraibae

Australoheros ribeirae

1500 pb

Figura 12. Número de rastros no primeiro epibranquial

4.5.2 Dados Moleculares

De acordo com os dados moleculares gerados, foram alinhadas 37

sequências do gene

Citocromo

b de aproximadamente 368pb o qual foi encontrado

321 sítios conservados, 45 sítios variados e 8 sítios únicos. As sequências são

compostas por 31,9% de timina, 27,7% de citosina, 24,7% de adenina e 15,7% de

guanina.

O fenograma ilustrado na Figura 14, mostra que a espécie

Australoheros

sp.

forma uma clado distinto em relação as demais espécies representadas. As

comparações entre as sequências das espécies foram feitas utilizando espécimes

Figura 13. Número de rastros do primeiro ceratobranquial

Número de rastros do primeiro ceratobranquial

Espécies

Nº de rastros

Australoheros sp.

Australoheros autrani

Australoheros barbosae

Australoheros ipatinguensis

Australoheros muriae

Australoheros charrua

Australoheros kaaygua

Australoheros minuano

Australoheros guarani

Australoheros macacuensis

Australoheros paraibae

Australoheros robustus

Australoheros ribeirae

Australoheros taura

Australoheros macaensis

Australoheros saquarema

sequenciados para o presente trabalho e espécimes depositados no banco de dados

GenBank

A espécie do Tietê está mais relacionada com

Australoheros ribeirae

distante de

Australoheros scitulus

, corroborando com a divergência genética de 3%

para A.

ribeirae

e 7% para A.

scitulus

A Tabela 10 reporta a divergência genética entre as espécies do gênero

Australoheros

, demonstrando a divergência intraespecífica da espécie

Australoheros

sp. de 0% e divergência interespecífica variando de 3% a 7%.

Os ramos são sustentados com

bootstrap

acima de 76 indicando robustez dos

grupos formados.

Amostra/Divergência 1 2 3 4 5 6 7

Australoheros

sp.

Australoheros ribeirae

3% 0%

Australoheros kaaygua

4% 3% 0%

Australoheros minuano

4% 4% 4% 0%

Australoheros tembe

5% 4% 4% 6% 0%

Australoheros facetus

5% 3% 4% 4% 4% 0%

Australoheros scitulus

7% 6% 6% 7% 6% 5% 0%

Tabela

. Divergências genéticas interespecíficas do gene Citocromo b entre as

espécies do gênero Australoheros.

Australoheros sp. Tiet

Australoheros sp. Tiet(2)

Australoheros sp. Tiet(3)

Australoheros sp. Tiet(4)

Australoheros sp. Tiet(5)

Australoheros sp. Tiet(6)

Australoheros sp. Tiet(7)

Australoheros sp. Tiet(8)

Australoheros sp. Tiet(9)

Australoheros sp. Tiet(10)

Australoheros sp. Tiet(11)

Australoheros ribeirae

Australoheros ribeirae(2)

Australoheros ribeirae(3)

Australoheros ribeirae(4)

Australoheros ribeirae(5)

Australoheros k aaygua

Australoheros minuano

Australoheros tembe

Australoheros tembe(2)

Australoheros scitulus(2)

Australoheros scitulus(3)

Australoheros scitulus

Australoheros facetus

Australoheros facetus(2)

Australoheros facetus(3)

Australoheros facetus(4)

Australoheros facetus(5)

Australoheros facetus(6)

0.005

Australoheros sp.

Australoheros ribeirae

Australoheros kaaygua (AY998658)

Australoheros minuano

(AY998659)

Australoheros tembe (AY998660)

Aust

raloheros tembe

(AY843373)

Australoheros scitulus (AY998661)

Australoheros scitulus (AY998662)

Australoheros scitulus (AY998663)

Australoheros facetus (AY998667)

Australoheros facetus (AY998666)

Australoheros facetus (AY998664)

Australoheros facetus (AY843387)

Australoheros facetus (AY843386)

100

igura 1

Fenograma ilustrando as relações entre as sequências do gene mitocondrial Citocromo b das

espécies do gênero Australoheros utilizando método de evolução mínima modelo K2P. Nota: Os códigos

entre parênteses indicam o número de acesso no Genbank. O grupo vermelho pertence a bacia do Alto Rio

Tietê. O grupo azul pertence a bacia de Ribeira de Iguape. Verde pertence a bacia do Alto Rio Uruguai.

Roxo pertence à bacia do médio e baixo Rio Uruguai. O grupo em laranja pertence a bacia do Rio Paraná e

Uruguai. O grupo em amarelo pertence a bacia do baixo Uruguai e por fim, o grupo em preto está

distribuídos em diversas bacias na Argentina, Brasil, Chile e Uruguai.

5 DISCUSSÃO

5.1 Relações genéticas entre as espécies de Cichlidae do Alto

Rio Paraná

Por meio da análise do gene COI foram obtidos diversos agrupamentos

específicos e supra-específicos dos ciclídeos do Alto Paraná.

O primeiro agrupamento compreende as espécies

Oreochromis niloticus

Tilapia rendalli

. Essas duas espécies foram usadas para o enraizamento do

fenograma por serem os únicos representantes do grupo dos ciclídeos africanos. As

tilápias foram introduzidas em várias partes do mundo por possuir características

propícias para o cultivo. Os principais objetivos para sua introdução foram o

repovoamento de reservatórios e rios, controle da vegetação aquática e cultivo em

pesqueiros e pisciculturas (ATZ, 1954; RIEDEL, 1965).

Em 1953 foi introduzido na região sudeste do Brasil a primeira espécie de

tilápia,

Tilapia rendalli

originária do antigo Congo Belga (AZEVEDO, 1955). Essa

espécie foi inicialmente trazida para o Brasil para o controle da vegetação que

obstruía as turbinas de hidrelétricas, posteriormente foi levada para o nordeste para

o repovoamento de açudes e o desenvolvimento da piscicultura. Devido ao baixo

rendimento da

Tilápia rendali

, em 1971 foi importada da Costa do Marfim a tilápia

nilótica (

Oreochromis niloticus

) e a tilápia de Zanzibar (

Oreochromis urolepis

hornorum

) (LOVSHIN, 1976).

Em estudos filogenéticos realizados com o grupo dos ciclídeos, é comum as

espécies

Oreochromis niloticus

Tilapia rendalli

compartilharem um mesmo ramo.

Essa hipótese é corroborada por resultados encontrados por Farias

et al

. (1999;

2000),o qual utilizando o gene 16S propuseram a filogenia de Cichlidae, separando

em grupos como Ciclídeos Neotropicais, Africanos, e o grupo basal compartilhado

pelo ciclídeos de Madagascar e Índia. Nesse trabalho, os gêneros

Oreochromis

Tilapia

dividiram um clado, com

bootstrap

de 97. Sparks (2004) propõe para esses

dois gêneros africanos a mesma hipótese, onde

Oreochromis

Tilapia

também

compartilharam um clado com 96 de bootstrap.

Outro agrupamento formado refere-se às espécies do gênero

Australoheros.

Incluído nesse clado, estão as espécies de

Australoheros facetus

, encontrada em

levantamentos ictiofaunísticos para a bacia do Alto Paraná (LANGEANI

et al

., 2007),

Australoheros ribeirae

, endêmica da bacia do Ribeira de Iguape, não pertence ao

Alto Paraná, foi incluída na análise para propor a hipótese de nova espécie para o

grupo dos

Australoheros

do Alto Tietê. Esse grupo foi formado corroborando a

existência de uma nova espécie desse gênero de acordo com a diversidade

interespecífica observada dentro do gênero, variando de 3% a 4% e

bootstrap

100.

Outro clado pode ser observado entre os gêneros

Astronotus

Cichla

. A

espécie

Astronotus crassipinnis

é encontrada recentemente na bacia do Alto Rio

Paraná, possivelmente depois da soltura de exemplares de aquário (GRAÇA e

PAVANELLI, 2007), e anteriormente identificada como

Astronotus ocellatus

(Agassiz, 1831) (KULLANDER, 2003b). Para o Alto Paraná são descritas somente

duas espécies do gênero

Cichla

Cichla kelberi

Cichla piquiti

, as quais foram

introduzidas na bacia. A espécie

Cichla kelberi

, popularmente conhecida como

“tucunaré-amarelo” e originária da bacia Amazônica, foi introduzida para a utilização

na pesca esportiva, e atualmente está entre as espécies mais abundantes da região

(JÚNIOR

et al

., 2003). Anteriormente era reconhecida na bacia do Alto Rio Paraná

como

Cichla monoculus

(Spix e Agassiz, 1831) (KULLANDER e FERREIRA, 2006).

A espécie

Cichla piquiti

, popularmente conhecida como “tucunaré-azul”, possui

distribuição geográfica entre a bacia dos rios Tocantins e Araguaia, e foi introduzida

no Alto Paraná com espécimes provenientes da bacia do rio Tocantins (OLIVEIRA,

2007). Essa espécie era identificada como

Cichla

sp. para o Alto Paraná (GRAÇA e

PAVANELLI, 2007).

Os gêneros

Astronotus

Cichla

estão fortemente relacionados e

compartilham um clado o qual corrobora a hipótese sugerida por diversos autores.

Essa hipótese foi observada utilizando os genes 16S, citocromo

, ATPase e

sequências nucleares (FARIAS

et al

., 1999; 2000; ZARDOYA

et al

. 1996), e como

visto no presente trabalho, essa hipótese também é corroborada utilizando-se o

gene COI.

Os espécimes identificados como

Cichla

sp. foram reconhecidos como

Cichla

piquiti

(exemplares 20154, 20152, 20151 e 20149) por possuir divergência

nucleotídica nula e compartilharem um clado com 99 de

bootstrap

. Os espécimes

Cichla

sp (exemplar 20147). e

Cichla

sp. (exemplar 20150), foram identificados como

Cichla

cf.

kelberi

por compartilhar um clado único

e possuir divergência nucleotídica

de 1%, com um ramo sustentado por bootstrap de 98, indicando robustez do grupo

formado (HEBERT

et al

., 2003a).

Os espécimes identificados a

priori

como

Cichla kelberi

foram classificados

como

Cichla

cf.

kelberi

, pois os exemplares 26695, 26692, 26693 e 26696 não

compartilham o mesmo clado, o qual não foi possível confirmar o exemplar que

representa a espécie

Cichla kelberi

verdadeira. O espécime identificado como

Cichla

aff.

kelberi

(26695) possivelmente pertence a uma outra espécie. Essa hipótese é

sustentada pela divergência nucleotídica encontrada entre esse espécime e os

demais identificados como

Cichla

. kelberi

(exemplar 26758, 26692, 26693 e

26696), com divergência de 3%. Como as espécies de

Cichla

foram introduzidas no

Alto Paraná, é possível que tenha ocorrido à introdução de outras espécies desse

gênero, provenientes de bacias hidrográficas diferentes. Estudos envolvendo maior

número de exemplares são necessários para corroborar essa hipótese.

Os indivíduos pertencentes à espécie

Cichlasoma paranaense

compartilharam um único clado, com divergência genética de 0% entre eles,

indicando que todos pertençam à mesma espécie. Essa espécie possui distribuição

excepcionalmente na Bacia do Alto Rio Paraná (GRAÇA e PAVANELLI, 2007).

Outro agrupamento observado compreende as espécies

Satanoperca

pappaterra

Geophagus brasiliensis

. Esse clado é sustentado por duas hipóteses. A

primeira refere-se à espécie

Satanoperca pappaterra

. Para a bacia do Rio Paraná,

essa espécie era incluída no gênero

Geophagus

Heckel, 1840, e identificada como

Geophagus jurupari

Heckel, 1840. Atualmente sabe-se que a espécie

Geophagus

jurupari

é restrita a bacia do baixo Amazonas, ocorrendo para o Alto Paraná

somente a espécie identificada como

Satanoperca pappaterra

, que possui

distribuição nas Bacias dos rios Amazonas, Guaporé e Paraná-Paraguai

(KULLANDER, 2003a) A outra hipótese refere-se à filogenia do grupo dos ciclídeos.

De acordo com a hipótese filogenética da família Cichlidae,

Satanoperca

faz parte

da subfamília Geophaginae, assim como

Geophagus brasiliensis

(FARIAS 1999;

2000), sustentando a intrínseca relação entre essas duas espécies.

Por fim, o agrupamento formado pelas espécies do gênero

Crenicichla

. As

espécies de

Crenicichla

que não puderam ser identificadas por meio das

características morfológicas foram identificadas na análise do gene COI.

Crenicichlas

sp. (17219, 17221, 17222, 17223, 19658, 19659, 19660, 29974, 29976,

29973) foram reconhecidas como C.

britskii

por possuir divergência de 1% e formar

um clado com

bootstrap

de 90. Quando são observados índices menores de 2%

pode-se inferir que há divergência intraespecífica, ou seja, diferença populacional

que geralmente é inferior 1% (AVISE, 2000). Diferentemente do espécime

Crenicichla

sp. (17220), que possui divergência de 3%, ficando separada das

demais por um clado distinto. Esse indivíduo pode ser classificado como outra

espécie de

Crenicihla

não representada na presente análise.

Para o Alto Paraná são descritas cinco espécies pertencentes ao gênero

Crenicichla

(LANGEANI

et al

., 2007). Contudo, de acordo com Graça e Pavanelli

(2007) foram identificadas somente quatro. Para Langeani

et al

. (2007) é

reconhecida a espécie

Crenicichla jaguarensis

(Haseman,1911). Essas espécies

descritas possuem distribuição pela Bacia do Rio Paraná, e possivelmente, o

espécime

Crenicihla

sp. (17220), pode ser qualquer uma das espécies descritas

para a Bacia do Rio Paraná.

As divergências genéticas encontradas entre as espécies de Cichlidae são

superiores em comparação com Characidae.

Astyanax

Bramocharax

, os quais

possuem valores de divergência abaixo de 2% (VALDEZ - MORENO

et al

., 2009),

indicando a recente formação do grupo (HEBERT

et al

., 2003a).

A divergência nucleotídica máxima encontrada entre gêneros de Cichlidae

apresentada no presente trabalho foi de 29%, a qual é superior quando comparada

com os peixes de água doce da Guatemala e México, que possuem divergência de

16% entre gêneros. Esse índice é ainda superior quando confrontado com os

resultados de Ward

et al

. (2009) que compararam 273 gêneros de peixes e

obtiveram a divergência máxima interespecífica de 24,18% .

As espécies marinhas possuem menores divergências em relação aos peixes

de água doce, o que pode ser observado comparando os ciclídeos do Alto Paraná

com as espécies de peixes marinhos da Austrália, 29%

. 20% (Ward, 2005). A

fragmentação dos rios e lagos de água doce a partir das redes continentais levaram

a maior estruturação genética entre as populações de peixes, acentuando as

divergências nucleotídicas em comparação as espécies marinhas (WARD

et al

1994).

A composição nucleotídica obtida indica maior porcentagem de bases C e T

como observado em grupos de teleósteos (WARD

et al

., 2005, WARD e HOLMES,

2007).

As relações estabelecidas entre os

taxa

por meio da análise do gene COI

refletiram a filogenia do grupo proposta por Farias

et al

. (1999) e Sparks e Smith

(2004) demonstrando que o COI pode ser um indicador na seleção de táxons para

estudos filogenéticos e além disso, as sequências de DNA obtidas nos projetos de

DNA

barcoding

podem ser adicionadas ao conjunto de sequências utilizadas para

elaboração de filogenias (HAJIBABAEI

et al

.,2007). O

barcode

foi eficiente para a

caracterização das espécies de ciclídeos do Alto Paraná.

5.2 Australoheros sp. nova espécie

O conjunto de dados morfológicos e moleculares teve importância

fundamental para propor a hipótese de uma nova espécie de

Australoheros

para o

Alto Rio Tietê.

Historicamente as espécies do gênero

Australoheros

encontradas no sudeste

do Brasil, incluindo a bacia do Alto Paraná, bacia do rio Ribeira de Iguape e a bacia

do rio Paraíba do Sul foram designadas como

Cichlasoma facetum

(Jenyns 1842),

Australoheros facetus

(ARAÚJO e NUNAN, 2005; LANGEANI

et al

., 2007;

PEREIRA e OYAKAWA, 2003 ).

Castro

et al

. (2004), em levantamentos feitos para a bacia do Rio Grande no

estado de São Paulo, identificaram os espécimes possivelmente de

Australoheros

facetus

como

Cichlasoma facetum

. Assim como para o Alto Paranapanema, Martins

e Barrella (2008) classificaram um ciclídeo popularmente conhecido como cara-

verde e identificaram como pertencendo à espécie

Cichlasoma facetum

Estudos anteriores consideravam o gênero

Australoheros

como um pequeno

grupo de espécies, o qual era identificado como

Cichlasoma

Swainson, 1839. Muitas

espécies foram identificadas como

Cichlasoma facetum

(JENYNS, 1842),

especialmente para o Alto Paraná.

No Brasil, a espécie

Australoheros facetus

possui distribuição no Rio Grande

do Sul e principalmente na Bacia do rio Paraná. Para a bacia do rio Paraíba do Sul,

foram descritas recentemente quatro espécies pertencentes ao gênero

Australoheros

para a

bacia do rio Ribeira de Iguape descrita até hoje uma espécie,

Australoheros ribeirae

(OTTONI e COSTA, 2008;

OTTONI, OYAKAWA e COSTA,

2008).

Para a bacia do rio Paraná foi registrada até hoje somente três espécies do

gênero

Australoheros:

A. facetus

A. tembe

A. guarani

(LANGEANI

et al

. 2007;

RICAN e KULLANDER, 2008). De acordo com os resultados apresentados no

presente trabalho, uma nova espécie do gênero

Australoheros

ocorre nas

cabeceiras do Alto Tietê. Esta nova espécie se diferencia por dados morfológicos e

moleculares das espécies recentemente descritas para as bacias vizinhas como

Ribeira de Iguape (OTTONI, OYAKAWA e COSTA, 2008) e Paraíba do Sul (OTTONI

e COSTA, 2008).

Australoheros

sp. compartilha características morfológicas únicas com as

demais espécies do gênero como, listras interrompidas na porção mediodorsal e

juvenis com xantóforos na base da nadadeira caudal (RICAN e KULLANDER, 2006).

As divergências nucleotídicas que separam as espécies de

Autraloheros

variaram de 3% a 7%, similares as encontradas por Rican e Kullander (2006) o qual

obtiveram valores superiores a 4%. Várias espécies da tribo Heroini estão separadas

por divergências de sequencias de Citocromo

menores,

Astatheros alfari

e A.

bussingi

possuem 2,5% de divergência, separando essas duas espécies

(LOISELLE, 1997; MARTIN e BERMINGHAM, 1998). A composição nucleotídica

observada é típica do gene citocromo

encontrada em ciclídeos, onde predominam

bases T e C (FARIAS

et al

., 2001).

Diante dos resultados apresentados no presente trabalho, é válido ressaltar a

importância da conservação de

habitats

, principalmente nas cabeceiras dos rios,

onde há um elevado grau de endemismo. Espécies endêmicas são importantes para

estudos voltados a biodiversidade e qualidade ambiental, principalmente para

espécies que ocorrem em margens de rios, pois se tornam mais suscetíveis as

ações antrópicas. Isso implica no desaparecimento de espécies de peixes que,

muitas vezes, ainda não foram descritas na literatura científica. A taxonomia

utilizando ferramentas moleculares e estudos morfológicos nos leva a entender os

processos relacionados à sistemática de um modo mais conciso, auxiliando deste

modo nos levantamentos da biodiversidade. Além disso, foi proposta a hipótese de

uma nova espécie de

Australoheros

para as cabeceiras do Alto Rio Tietê por meio

de dados moleculares e morfológicos.

6 CONCLUSÕES

 O gene citocromo c oxidase subunidade I oferece novas informações a

respeito da identidade das espécies de Cichlidae coletadas na bacia do Alto Rio

Paraná;

 O gene COI foi efetivo para a identificação das espécies de ciclídeos do Alto

Paraná;

 Foram identificadas para o Alto Paraná 15 espécies distribuídas em 9 gêneros

de Cichlidae de acordo com a análise do gene COI;

 A espécie do gênero Australoheros encontrada no Alto Tietê trata-se de uma

nova espécie; essa hipótese foi proposta por meio de caracteres morfológicos e

moleculares.

REFERÊNCIAS

AB’SABER, N. A. Megageomorfologia do território brasileiro. In: Geomorfologia do

Brasil (Cunha, S. B e Guerra, A. J. T eds). Rio de Janeiro: Bertand Brasil, 1998. p.

71-106.

AGOSTINHO, A. A. e ZALEWSKI, M. A planície alagável do alto rio Paraná:

importância e preservação (Upper Paraná River floodplain: Importance and

Preservation). Maringá: EDUEM, 1996. p. 100.

AGOSTINHO, A. A.; JÚLIO JR., H. F. Peixes da bacia do Alto Rio Paraná. In:

Estudos Ecológicos de Comunidades de Peixes Tropicais. (Lowe-McConnell, R.

H. ed.) São Paulo: Edusp, 1999. p. 374-400.

AGOSTINHO, A. A.; THOMAZ, S. M. e KESHIYU-NAKATANI. A Planície de

Inundação do Alto rio Paraná. In: SEELIGER, U.; CORDAZZO, C. e BARBOSA, F.

Os Sites e o Programa Brasileiro de Pesquisas Ecológicas de Longa Duração.

Belo Horizonte: [s.m], 2002. p. 101-124.

ARAÚJO, J. R. S. e G. W. NUNAN. Ictiofauna do rio Paraíba do Sul: danos

ambientais e sociais causados por barragens, hidrelétricas e poluição no trecho

fluminense. Rio de Janeiro: CPDMA-ALERJ, 2005. p. 59.

ATZ J.W. The peregrinating Tilapia. Animal Kingdom, v. 57, p. 148-155. 1954.

AVISE, J. C.; ARNOLD, J.; BALL, R. M.; BERMINGHAM, E.; LAMB, T.; NEIGEL, J.

E.; REEB, C. A e SAUNDERS, N. C. Intraspecific phylogeography: the mitochondrial

DNA bridge between population genetics and systematics. Annual Review of

Ecology and Systematics, v. 18, p. 489-522, 1987.

AVISE, J. C. e ZINK, R. M. Molecular genetic divergence between avian sibling

species: king and clapper rails, long-billed and short-billed dowitchers, boat-tailed

and great-tailed grackles, and tufted and black-crested titmice. Auk, v.105, p. 516–

528, 1988.

AVISE, J. C. Molecular markers, natural history and evolution. New York:

Chapman e Hall, 1994.

AVISE, J.C. Phylogeography: the history and formation of species. Harvard

University Press. 2000.

AZEVEDO, P. Aclimação da tilápia no Brasil. Chácaras e Quintais, v. 2, p. 191–92,

1955.

BANKS, R. C.; CICERO, C.; DUNN, J. L.; KRATTER, A. W. ; RASMUSSEN, P. C.;

REMSEN, J. V.; RISING, J.A e STOTZ, D. F. Fortyfourth supplement to the

Ornithologists’ Union checklist of North American birds. Auk, v. 120, p. 923–931,

2003.

BENINE, R. C.; MARIGUELA, T. C.; OLIVEIRA, C. New species of Moenkhausia

Eigenmann, 1903 (Characiformes: Characidae) with comments on the Moenkhausia

oligolepis species complex. Neotropical Ichthyology, v. 7, p. 1-168, 2009.

BLAXTER, M e FLOYD, R. Molecular taxonomics for biodiversity surveys: already

and reality. Trends in Ecology and Evolution, v. 18, p. 268-269, 2003.

BÖHLKE, J.; WEITZMAN, S. H. e MENEZES, N. A. Estado atual da Sistemática de

peixes de água doce da América do Sul. Acta Amazônica, v. 8, p. 657- 677, 1978.

BONETTO, A. A. The Paraná river system. In: The ecology of river systems

(Davies, B. R. e Walker, K. F eds.). Dordrecht: Dr. W.Junk Publishers, 1986. p. 541-

555.

BRITSKI, H. A. e LANGEANI, F. Pimelodus paranaensis, sp.n., um novo

Pimelodidae (Pisces, Siluriformes) do Alto Paraná, Brasil. Revista Brasileira de

Zoologia, v. 5, p. 409-417, 1988.

BRITTO, M. R. e CASTRO, R. M .C. New Corydoradine catfish (Siluriformes:

Callichthyidae) from the upper Paraná and São Francisco: the sister group of Brochis

and most of Corydoras species. Copeia, v. 4, p. 1006-1015, 2002.

BROWN, W. M.; PRAGER, E. M.; WANG, A. e WILSON, A. C. Mitochondrial DNA

sequences in primates: tempo and mode of evolution. Journal of Molecular

Evolution, v. 18, p. 225-239, 1979.

CARNEIRO, M. S. ; VILARINHOS, A. D. ; SILVA, S. O. E. ; OLIVEIRA, R. P. ;

NICKEL, O. Suitability of RAPD markers for the early identification of somaclonal

variants of banana. In: Reunião Anual da Sociedade Barsileira de Bioquímica e

Biologia Molecular, 1996, Caxambú. XXV Reunião Anual da Sociedade Brasileira

de Bioquímica e Biologia Molecular, v. 1, p. 39, 1996.

CASCIOTTA, J. R.; GÓMEZ, S. E. e TORESANI, N. I. ‘Cichlasoma’ tembe, a new

cichlid species from the río Paraná basin, Argentina (Osteichthyes: Labroidei).

Ichthyological Exploration of Freshwaters, v. 6, p. 193–200, 1995.

CASCIOTTA, J. R.; ALMIRÓN A. E. e GÓMEZ, S. E. A new species of Australoheros

(Teleostei: Perciformes: Cichlidae) from the río Iguazú basin, Argentina.

Zoologische Abhandlungen Dresden, v. 55, p. 77–83, 2006.

CASTRO, R. M. C. e MENEZES, N. A.. Estudo diagnóstico da diversidade de peixes

do Estado de São Paulo. In: Biodiversidade do Estado de São Paulo, Brasil:

Síntese do conhecimento ao final do século XX (Castro, R. M. C ed.). São Paulo:

WinnerGraph, 1998. p.1-13.

CASTRO, R. M. C. Evolução da Ictiofauna de riachos sul-americanos: padrões

gerais e possíveis processos causais. In: Ecologia de Peixes de Riachos: Estado

Atual e Perspectivas (Caramaschi, E.P.; Mazzoni, R.; Bizerril, C. R. S. F.; Peres-

Neto, P. R. eds.). Ecologia Brasiliensis, Rio de Janeiro, v. 6, p. 139 155, 1999.

CASTRO, R. M. C.; CASATTI, L.; SANTOS, H. F.; MELO, A. L. A.; MARTINS, L. S.

F.; FERREIRA, K. M.; GIBRAN, F. Z.; BENINE, R. C.; CARVALHO, M.; RIBEIRO, A.

C.; ABREU, T. X.; BOCKMANN, F. A.; PELIÇÃO, G. Z.; STOPIGLIA, R. e

LANGEANI, F. Estrutura e composição da ictiofauna de riachos da bacia do rio

Grande no estado de São Paulo, sudeste do Brasil. Biota Neotropica, v. 4, p.1-39,

2004.

CHAKRABARTY, P. Systematics and historical biogeography of Greater Antillean

Cichlidae. Molecular Phylogenetcs and Evolution, v. 39, p. 619–627, 2006.

CHAVES, A. V.; CLOZATO, C.L.; LACERDA, D.R.; SARI, E.H.R.; SANTOS, F.R.

Molecular taxonomy of Brazilian tyrant-flycatchers (Passeriformes, Tyrannidae).

Molecular Ecology Resources, v. 8, p. 1169 - 1177, 2008.

CRIA. SpeciesLink, Dados e ferramentas. Campinas: Centro de Referência em

Informação Ambiental, 2001. Disponível em: http://splink.cria.org.br. Acesso em: 2

de Fevereiro de 2010.

DESALLE, R.; EGAN, M. G.; SIDDALL, M. The unholy trinity: taxonomy, species

delimitation and DNA barcoding. Philosophical Transactions of the Royal Society

B: Biological Sciences, v. 360, p. 1905-1916, 2005.

ESCHMEYER, W. N. (ed.). Catalog of Fishes. Versão eletrônica. Disponível em:

http://www.calacademy.org. Acesso em: 3 de Fevereiro de 2010.

FARIAS, I. P.; ORTI, G.; SAMPAIO, I.; SCHNEIDER, H. e MEYER, A. Mitochondrial

DNA phylogeny of the family Cichlidae: monophyly and fast molecular evolution of

the Neotropical assemblage. Journal of Molecular Evolution, v. 48, p. 703–711,

1999.

FARIAS, I. P.; ORTI, G. e MEYER, A. Total evidence: molecules, morphology, and

the phylogenetics of cichlid fishes. Journal of Experimental Zoology, v. 288, p. 76–

92, 2000.

FARIAS, I. P.;ORTI, G.; SAMPAIO, I.; SCHNEIDER, H.; MEYER, A. The cytochrome

b gene as a phylogenetic marker: the limits of resolution for analyzing relationships

among cichlid fishes. Journal of Molecular Evolution, v. 53, p. 89–103, 2001.

FOLMER, O.; BLACK, M.; HOEH, W.; LUTZ, R. e VRIJENHOEK, R. DNA primers for

amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan

invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology, v. 3, p. 294-299,

1994.

FROESE, R e PAULY, D. Editors 2010. Fishabase. World Wide Web electronic

publication. Disponível em: www.fishbase.org. Acesso em: 01 de Fevereiro de 2010.

GAEMERS, P. A. M. Taxonomic position of the Cichlidae (Pisces, Perciformes) as

demonstrated by the morphology of their otoliths. Netherlands Journal of Zoology,

v. 34, p. 566–595, 1984.

GILL, E. B e SLIKAS, B. Patterns of mtDNA genetic divergence in North American

crested titmice. Condor, v. 94, p. 20–28. 1992.

GRAÇA, W. J. e PAVANELLI, C. S. Peixes da planície de inundação do Alto Rio

Paraná e áreas adjacentes. Maringá: Eduem, 2007. p. 241.

GRECHKO, V.V. Molecular DNA markers in phylogeny and systematics. Russian

Journal of Genetics, v. 38, p. 851-868, 2002.

HAJIBABAEI, M.; SINGER, G. A.; HEBERT, P. D. N.; HICKEY, D. A. DNA barcoding:

how it complements taxonomy, molecular phylogenetics and population genetics.

Trends in Genetics, v. 23, p. 167-172, 2007.

HALL, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and

analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, v. 41,

p. 95-98, 1999.

HEBERT, P. D. N.; CYWINSKA, A.; BALL, S. L. e WAARD, R. D. Biological

identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society, v. 270, p.

313–322, 2003a.

HEBERT, P. D. N.; RATNASINGHAM, S.; DEWAARD, J. R. Barcoding animal life:

cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species.

Proceedings Biological Sciences, v. 270, p. 96-99. 2003b.

HEBERT, P. D. N.; STOECKLE, M. Y.; ZEMLAK, T. S.; FRANCIS, C. M.

Identification of birds through DNA Barcodes. PLoS Biology, v. 2, p. 1567-1663,

2004.

HUBERT, N.; HANNER, R.; HOLM, E.; MANDRAK, N. E.; TAYLOR, E.; BURRIDGE,

M.; WATKINSON, D.; DUMONT, P.; CURRY, A.; BENTZEN, P.; ZHANG, J.; APRIL,

J. e BERNATCHEZ, L. Identifying Canadian freshwater fishes through DNA

barcodes. Plos One 3, p. 2490, 2008.

HUECK, K. e SEIBERT, P. Vegetationskarte von Südamerika. Sttutgart, 1981. v.2

IRWIN, D. M.; KOCHER, T. D.; WILSON, A. C. Evolution of cytochrome b gene in

mammals. Molecular Biology and Evolution, v. 2, p. 13–34, 1991.

IVANOVA, N. V.; ZEMLAK, T. S.; HANNER, R. H.; HEBERT, P. D. N. Universal

primer cocktails for fish DNA barcoding. Molecular Ecology Notes, v. 7, p. 544–548,

2007.

JENYNS, L. Fish: the zoology of the voyage of H. M. S. Beagle, under the command

of captain Fitzroy, R. N., during the years 1832 to 1836. London: Smith Elder and Co,

1842.

JÚNIOR, J. H. J.; CUNICO, A. M.; GUBIANI, E. A.; FERNANDES, R.; DIAS, R. M.;

GRAÇA, W. J.;GOMES, L. C. Ictiofauna. In: A planície de inundação do Alto Rio

Paraná- site 6-PELD/CNPq. Relatório Anual (2003). Coordenação AGOSTINHO,

A.A.; THOMAZ, S.M.; RODRIGUES, L.; GOMES, L.C. Maringá. EDUEM: NUPÉLIA,

p. 77-99, 2003.

KIMURA, M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions

through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular

Evolution, v. 16, p. 111-120, 1980.

KOCHER, T. D.; THOMAS, W. K.; MEYER, A.; EDWARDS, S. V.; PAABO, S. F.;

VILLABLANCA, F. X.; WILSON, A. C. Dynamics of mtDNA evolution in animals:

amplification and sequencing with conserved primers. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, v. 86, p. 6196–6200,

1989.

KOCHER, T. D. Adaptive evolution and explosive speciation: the cichlid fish model.

Nature, v. 5, p. 288-298, 2004.

KORNFIELD, I. Evidence for rapid speciation in African cichlid fishes. Experientia, v.

34, p. 335–336, 1978.

KRESS, W. J.; WURDACK, K. J.; ZIMMER, E. A.; WEIGT, L. A.; JANZEN, D.H. Use

of DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, v. 102, p. 8369-8374,

2005.

KULLANDER, S.O. A new Apistogramma species (Teleostei, Cichlidae) from the Rio

Negro in Brazil and Venezuela. Zoological Scripta, v.16, p. 259-270, 1987.

KULLANDER, S.O. Family Synbranchidae (Swamp-eels). In: REIS, R. E.;

KULLANDER, S. O.; FERRARIS, Jr. C.J. (Ed). Check list of the freshwater fishes

of South na Central America. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2003 a. p. 594-595.

KULLANDER, S.O. Family Cichlidae (Cichlids). In: REIS, R.E.; KULLANDER,S.O.;

FERRARIS, Jr. C.J. (Ed). Check list of the freshwater fishes of South na Central

America. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2003 b. p. 605-654.

KULLANDER, S. O. e FERREIRA, E. J. G. A review of the South American cichlid

genus Cichla, with descriptions of nine species of Teleostei: Cichlidae.

Ichthyological Exploration of Freshwaters, v. 17, p. 289-398, 2006.

LANGEANI, F. Ictiofauna do Alto Curso do rio Tietê (SP): taxonomia.

Universidade de São Paulo, São Paulo, Dissertação de Mestrado, 1989.

LANGEANI, F.; CASTRO, R. M. C.; OYAKAWA, O. T.; SHIBATTA, O. A.;

PAVANELLI, C. S.; CASATTI, L. Diversidade da ictiofauna do Alto rio Paraná:

composição atual e perspectivas futuras. Biota Neotropica, Campinas, v. 7, n. 3, p.

183 -197, 2007.

LIPSCOMB, D.; PLATNICK, N.; WHEELER, Q. The intellectual content of taxonomy:

a comment on DNA taxonomy. Trends in Ecology and Evolution, v. 18, p. 65-66,

2003.

LOISELLE, P. V. Two new cichlid species from the rio Sixaola drainage, Costa Rica.

Aqua, Journal of Ichthyology and Aquatic Biology, v. 2, p.1-10, 1997.

LOWE-MCCONNELL, R. H. Estudos ecológicos de comunidades de peixes

tropicais. São Paulo: EDUSP, 1999. 584p.

LOVSHIN, L.L. Sumário dos métodos para cultivo de tilápias. Fortaleza: DNOCS,

1976. p. 5.

MALABARBA, M. C. Phylogeny of fossil Characiformes and paleobiogegraphy of the

Tremembe Formation, São Paulo, Brazil. In Phylogeny and classification of

Neotropical fishes (Malabarba, L. R.; Reis, R. E.; Vari, R. P.; Lucena, Z. M. S. e

Lucena, C. A. S eds.). Porto Alegre: EDIPUCRS,1998. p. 69-84.

MALLET, J e WILLMOTT, K. Taxonomy: renaissance or Tower of Babel? Trends in

Ecology and Evolution, v. 18, p. 57-59, 2003.

MANWELL, C.; BAKER, C. M. A. A sibling species of sea cucumber discovered by

starch-gel electrophoresis. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 10, p.

39–53, 1963.

MARESCALCHI, O. Karyotype and mitochondrial 16S gene characterizations in

seven South American Cichlasomatini species (Perciformes, Cichlidae). Journal of

Zoological Systematics and Evolutionary Research, v. 43, p. 22–28, 2005.

MARSHALL, E. Will DNA bar codes breathe life into classication?. Science, v.307, p.

1037, 2005.

MARTIN, A. P e BERMINGHAM, E. Systematics and evolution of lower Central

American cichlids inferred from analysis of cytochrome b gene sequences.

Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 9, p. 192–203, 1998.

MARTINS, A.G e BARRELLA, W. Peixes da Serra de Paranapiacaba. Revista

Eletrônica de Biologia, v.1, p. 16-35, 2008.

MENEZES, N. A. Methods for assessing freshwater fish diversity. In Biodiversity in

Brazil (Bicudo, C.E.M e Menezes, N.A. eds.). São Paulo: CNPq, 1996. p. 289-295.

MINDELL, D. P.; SORENSON, M. S.; HUDDLESTON, C. J.; MIRANDA, H. C.;

KNIGHT, A.; SAWCHUK, S. J.; YURI, T. Phylogenetic relationships among and

within select avian orders based on mitochondrial DNA. In: Avian molecular

evolution and systematics (Mindell, D. ed). San Diego: Academic Press, 1997. p.

211–245.

MOORE, W. S. Inferring phylogenies from mtDNA variation: Mitochondrial-gene trees

versus nuclear-gene trees. Evolution, v. 49, p. 718–726, 1995.

MORITZ, C.; T. E. DOWLING e W. M. BROWN. Evolution of animal mitochondrial

DNA. Relevance for population biology and systematics. Annual Review of Ecology

and Systematics, v. 18, p. 269-292, 1987.

MORITZ, C. e CICERO, C. DNA barcoding: promise and pitfalls. PLoS Biology, v. 2,

p. 1529-1531, 2004.

MURRAY, B. W.; MCGILLIVRA, Y. W. B.; BARLOW, J. C.; BEECH, R. N.;

STROBECK, C. The use of cytochrome B sequence variation in estimation of

phylogeny in the Vireonidae. Condor, v. 96, p. 1037–1054, 1994.

MURRAY, A. M. The fossil record and biogeography of the Cichlidae (Actinopterygii:

Labroidei). Biological Journal of the Linnean Society, v. 74, p. 517–532, 2001.

NEI, M e KUMAR, S. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford: Oxford

University Press, 2000.

NELSON, J. S. Fishes of the world. 4.ed.. New York: John Wiley e Sons Inc, 2006.

p. 601.

OLIVEIRA, J. C. e BRITSKI, H. A. Redescrição de Taunaya bifasciata (Eigenmann e

Norris, 1900), comb. nova, um bagre enigmático do Estado de São Paulo

(Siluriformes, Pimelodidae, Heptapterinae). Papéis Avulsos de Zoologia, v. 41, p.

119-133, 2000.

OLIVEIRA, A.V. Relações genéticas entre populações do gênero Cichla introduzidas

na bacia do rio Paraná, evidenciadas por marcadores nucleares e do genoma

mitocondrial. In: Peixes da planície de inundação do Alto Rio Paraná e áreas

adjacentes. Maringá: Eduem, 2007. p. 241.

OTTONI, F. P.; OYAKAWA, O. T. e COSTA, W. J. E. M. A new species of the genus

Australoheros from the rio Ribeira do Iguape basin, São Paulo, Brazil (Labroidei:

Cichlidae: Cichlasomatinae). Vertebrate Zoology, v. 58, p. 75-81, 2008.

OTTONI, F. P. e COSTA, W. J. E. M. Taxonomic revision of the genus Australoheros

Rican e Kullander, 2006 (Teleostei: Cichlidae) with descriptions of nine new species

from southeastern Brazil. Vertebrate Zoology, v. 58, p. 207 – 232, 2008.

OTTONI, F. P e CHEFFE, M. M. A new species of Australoheros from the upper rio

das Antas, laguna dos Patos System, southern Brazil. Spixiana, v. 32, p. 153- 159,

2009.

OYAKAWA, O. T.; AKAMA, A. e ZANATA, A. M. Review of the genus Hypostomus

Lacépède, 1803 from Ribeira de Iguape basin, with descriptions of a new species

(Pisces, Siluriformes, Loricariidae). Zootaxa, v. 921, p. 1-27, 2005.

PEREIRA, E. H. e OYAKAWA, O. T. Isbrueckerichthys epakmos, a new species of

loricariid catfish from the rio Ribeira de Iguape basin, Brazil (Teleostei: Siluriformes).

Neotropical Ichthyology, v. 1, p. 3-9, 2003.

REDONDO, R.A.F.; BRINA, L.P.S.; SILVA, R.F.; DITCHFIELD, A.D. e SANTOS,

F.R. Molecular systematics of the genus Artibeus (Chiroptera: Phyllostomidae).

Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 49, p. 44-58, 2008.

RIBEIRO, A. C. Tectonic history and the biogeography of the freshwater fishes from

the coastal drainages of eastern Brazil: an example of faunal evolution associated

with a divergent continental margin. Neotropical Ichthyology, v. 4, p. 225-246,

2006.

RIBEIRO, A. C.; LIMA, F. C. T.; RICCOMINI, C. e MENEZES, N. A. Fishes of the

Atlantic rainforest of Boracéia: tetimonies of the Quaternary fault reactivation within a

Neoproterozoic tectonic province in Southeastern Brazil. Ichthyological Exploration

Freshwaters, v. 17, p. 157-164, 2006.

RICAN, O. e KULLANDER, S. O. 'Cichlasoma' scitulum: a new species of cichlid fish

from the Río de La Plata region in Argentina, Brazil, and Uruguay. Copeia, v. 2003,

p.794–802, 2003.

RICAN, O. e KULLANDER, S. O. Character and tree-based delimitation of species in

the “Cichlasoma” facetum group (Teleostei, Cichlidae) with the description of a new

genus. Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research, v. 44, p.

136-152, 2006.

RICAN, O. e KULLANDER, S. O. The Australoheros (Teleostei: Cichidae) species of

the Uruguay and Paraná River drainages. Zootaxa, v. 1724, p. 1-51, 2008.

RIEDEL, D. Some remarks on the fecundity of tilapia (T. mossambica Peters) and its

introduction into Middle Central America (Nicaragua) together with a first contribution

towards the limnology of Nicaragua. Hidrobiologia, v. 25, p. 357-388, 1965.

RYDER, O. A. Species conservation and systematics: the dilema of subspecies.

Trends in Ecology e Evolution, v. 1, p. 9-10, 1986.

SAITOU, N e NEI, M. The neighbour-joining method: a new method for

reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, v.4, p. 406-

425, 1987.

SANGER, F; NICKELEN, S; COULSON, A. R. DNA sequencing with chain

terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, v. 74, p. 5463-5467, 1977.

SAVAGE, J.M. Systematics and the biodiversity crisis. BioScience, v. 45, p. 673-

679, 1995.

SCHAEFER, S.A. Conflict and resolution: impact of new taxa on phylogenetic studies

of the neotropical cascudinhos (Siluroidei: Loricariidae). In: Phylogeny and

Classification of Neotropical Fishes (Malabarba, L.R.; Reis, R.E.; Vari, R.P.;

Lucena, Z.M.S e Lucena, C.A.S eds.). Porto Alegre: EDIPUCRS, 1998. p. 375-400.

SERRA, J. P.; CARVALHO, F. R. e LANGEANI, F. Ichthyofauna of the rio Itatinga in

the Parque das Neblinas, Bertioga, São Paulo: composition and biogeography. Biota

Neotropica, v. 7, p. 82-86, 2007.

SEZAKI, K.; ITOI, S.; WATABE, S. A simple method to distinguish two commercially

valuable eel species in Japan Anguilla japonica and A. anguilla using polymerase

chain reaction strategy with a species-specific primer. Fisheries Science, v. 71, p.

414–421, 2005.

SOLÉ-CAVA A. M.. Biodiversidade molecular e genética da conservação. In:

Biologia Molecular e Evolução (MATIOLI, S. R eds.) Ribeirão Preto: Holos, 2001.p.

172-192.

SPARKS, J. S. e SMITH, W. L. Phylogeny and biogeography of cichlid fishes

(Teleostei: Perciformes: Cichlidae). Cladistics, v. 20, p. 501–517, 2004.

STIASSNY, M. L. J. Cichlid familial intrarelationships and the placement of the

Neotropical genus Cichla (Perciformes: Labroidei). Journal of Natural History, v.

21, p. 1311–1331, 1987.

STIASSNY, M.L.J. Phylogenetic intrarelationships of the family Cichlidae: an

overview. In: Cichlid Fishes: Behaviour, Ecology and Evolution (Keensleyside,

M.H.A. ed.). London: Chapman Hall, 1991. p. 1–35.

STOECKLE, M.; WAGGONER, P.E.; AUSUBEL, J.H. Barcoding life, illustrated.

Goals, rationale, results. Disponível em: www.barcoding.si.edu. Acesso em:

25/10/2008, 2005.

STREELMAN, J. T. e KARL, S. A. Reconstructing labroid evolution with single-copy

nuclear DNA. Proceedings of the Royal Society of London B, v. 264, p. 1011–

1020, 1997.

SUNNUCKS, P. Efficient genetic markers for population biology. Tree, London, v.15,

p.199-203, 2000.

TAMURA, K.; DUDLEY, J.; NEI, M. e KUMAR, S. MEGA 4: Molecular Evolutionary

Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution,

v. 24, p. 1596 -1599, 2007.

THOMPSON, K. W. Cytotaxonomy of 41 species of Neotropical Cichlidae. Copeia, v.

1979, p. 679–691, 1979.

THOMPSON, J. D.; HIGGINS, D. G e GIBSON, T. J. CLUSTAL W: improving the

sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,

position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Research, v.

22, p. 4673-4680, 1994.

TRIGO, T.C.; FREITAS, R.O.; KUNZLER, G.; CARDOSO, L.; SILVA, J.C.R.;

JOHNSON, W.E.; O’BRIEN, S.J.; BONATTO, S.L.; EIZIRIK, E. Inter-species

hybridization among neotropical cats of the genus Leopardus, and evidence for an

introgressive hybrid zone between L. geoffroyi and L. tigrinus in southern Brazil.

Molecular Ecology, v. 17, p. 4317- 4333, 2008.

TURNER, T. F.; MCPHEE, M. V.; CAMPBELL, P. e WINEMILLER, K. O.

Phylogeography and intraspecific genetic variation of prochilodontid fishes endemic

to rivers of northern South America. Journal of Fish Biology, v. 64, p. 186– 201,

2004.

VALDEZ-MORENO, M.; IVANOVA, N. V.; ELÍAS-GUTIÉRREZ, M.; CONTRERAS-

BALDERAS, S.; HEBERT, P. D. N. Probing diversity in freshwater fishes from Mexico

and Guatemala with DNA barcodes. Journal of Fish Biology, v. 74, p. 377–402,

2009.

VARGAS, S. M.; ARAÚJO, C. F; SANTOS, F. R. DNA barcoding of Brazilian sea

turtles (Testudines). Genetics and Molecular Biology, v. 32, p. 608-612, 2009.

VENCES, M.; THOMAS, M.; VAN DER MEIJDEN, A.; CHIARI, Y.; VIEITES, D. R.

Comparative performance of the 16S rRNA gene in DNA barcoding of amphibians.

Frontiers in Zoology, v. 2, p. 1-12, 2005.

VILAÇA, S. T.; LACERDA, D. R.; SARI, H. E. R.; SANTOS, F. R. DNA-based

identification to Thamnophilidae (Passeriformes) species: The first barcodes of

Neotropical birds. Revista Brasileira de Ornitologia, v. 14, p. 7-13, 2006.

ZARDOYA, R.; VOLLMER, D. M.; CRADDOCK, C.; STREELMAN, J. T.; KARL, S.

A.; MEYER, A. Evolutionary conservation of microsatellite flanking regions and their

use in resolving the phylogeny of cichlid fishes (Pisces: Perciformes). Proceedings

of the Royal Society of London B, v. 263, p. 1589–1598, 1996.

ZIHLER, F. Gross morphology and configuration of digestive tracts of Cichlidae:

phylogenetic and functional significance. Netherlands Journal of Zoology, v. 32, p.

544-571, 1982.

WARD, R. D.; WOODWARK, M.; SKININSKI, D. O. F. A comparison of genetic

diversity levels in marine, freshwater and anadromous fish. Journal of Fish Biology,

v.44, p. 213-232, 1994.

WARD, R. D.; ZEMLAK, T. S.; INNES, B. H.; LAST, P. R.; HEBERT, P. D. N. DNA

barcoding Australia’s fish species. Philosophical Transactions of the Royal

Society B: Biological Sciences, v. 359, p. 1847-1857, 2005.

WARD, R. D. e HOLMES, B. H. An analysis of nucleotide and amino acid variability

in the barcode region of cytochrome c oxidase I (cox1) in fishes. Molecular Ecology

Notes, v. 7, p. 899–907, 2007.

WARD, R. D.; HANNER, R. H. e HEBERT, P. D. N. The campaign to DNA barcode

all fishes, FISH-BOL. Journal of Fish Biology, v. 74, p. 329–356, 2009.

WAUGH, J. DNA barcoding in animal species: progress, potential and pitfalls.

BioEssays, v. 29, p. 188-197, 2007.

WILSON, A. C.; R. L. CANN, M.; GEORGE, U. B.; GYLLENSTEN, K. M.;

HELMBYCHOWSKI, R. G.; HIGUSHI, E. M.; PALUMBI, R. D.; SAGE, M.

Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics. Biological

Journal of Linnean Society, v. 26, p. 375-400, 1985.

WEITZMAN, S. H. e MALABARBA, L. R. Systematics of Spintherobolus (Teleostei:

Characidae: Cheirodontinae) from Eastern Brazil. Ichthyological Exploration

Freshwaters, v.10, p. 1-43, 1999.

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