( PDF ) Análise da comunidade bacteriana de Cecropia pachystachya e o seu potencial para produção de antibióticos

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

MARIA GABRIELA DE BENEDICTIS DELPHINO

ANÁLISE DA COMUNIDADE BACTERIANA DE CECROPIA

PACHYSTACHYA E O SEU POTENCIAL PARA PRODUÇÃO DE

ANTIBIÓTICOS

Mogi das Cruzes, SP

2010

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

MARIA GABRIELA DE BENEDICTIS DELPHINO

ANÁLISE DA COMUNIDADE BACTERIANA DE CECROPIA

PACHYSTACHYA E O SEU POTENCIAL PARA PRODUÇÃO DE

ANTIBIÓTICOS

Dissertação apresentada do Programa de Pós-Graduação da

UMC como parte dos requisitos para a obtenção do grau de

mestre em Biotecnologia.

Profº Orientador. Dr. Welington Luiz de Araújo

Mogi das Cruzes, SP

2010

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FICHA CATALOGRÁFICA

Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central

Delphino, Maria Gabriela de Benedictis

Análise da comunidade bacteriana de Cecropia

pachystachya e o seu potencial para produção de

antibióticos / Maria Gabriela de Benedictis Delphino. –

2010.

63 f.

Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) -

Universidade de Mogi das Cruzes, 2009

Área de concentração: Genética e microbiologia

Orientador: Profº Drº Welington Luiz de Araújo

1. Endofíticos 2. Embaúbas 3. Patógenos 4.

Controle biológico I. Araújo, Welington Luiz de

CDD 632.96

DEDICO

À minha avó Maria Gagliardi De Benedictis

OFEREÇO

Aos meus pais, Sebastião e Fátima,

a meu namorado Everton,

e a meus irmãos Maurício, Rodrigo e Daniel.

AGRADECIMENTOS

Agradeço bastante a todos que tanto me auxiliaram na realização desta pesquisa:

À Universidade de Mogi das Cruzes e ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia,

Em especial ao Professor Dr. Welington Luiz Araújo pela confiança, pelo apoio e pela

mão segura que me guiou pela vielas da ciência,

A Professora Dra Kátia Mazzei que sempre me incentivou, ensinou e apoiou todos os

trabalhos de pesquisa no Parque Estadual da Cantareira,

A toda equipe de trabalho do Parque Estadual da Cantareira, que “me abriram as portas”

para todas as pesquisas no local,

A todos os professores da UMC que sempre compartilharam conhecimentos e orientações,

Ao grupo maravilhoso com o qual convivi no Laboratório de Biologia Molecular e

Ecologia Microbiana / NIB - Núcleo Integrado de Biotecnologia, que se tornaram grandes

amigos: Carol Bertini, Emy, Fernanda, Flávia, Luciana, Janaína, Maria Cristina, Marília,

Maristela e Roberta,

Com um grande beijo ao Almir, a Aline, a Juliana e à Fernanda Cristina que tanto me

guiaram e me colocaram no caminho certo,

A todos os meus amigos, tenho a agradecer a amizade, carinho, apoio, incentivo e

coragem que sempre me deram em todos os momentos;

Finalmente, agradeço à minha família, em especial aos meus Pais (minha mãe Fátima que

sempre me incentivou e me ajudou na realização deste trabalho), Irmãos, Cunhados e

principalmente meu namorado Everton, pelo estímulo, pela presença sempre atenta, amor,

carinho dedicado, compreensão, ajuda, apoio, incentivo, paciência e encorajamento que sempre

me deram ao longo de todos esses anos!

Maria Gabriela Delphino

RESUMO

Microrganismos endofíticos colonizam os espaços intercelulares dos tecidos vegetais, sem causar

quaisquer danos a estes. Desta forma, este nicho ecológico ocupado pelos endófitos, os

favorecem para o controle biológico de patógenos e pragas, pois neste local poderiam competir

por nutrientes e espaço com os patógenos, bem como produzir substâncias tóxicas a estes

organismos ou ainda, induzir a planta a desenvolver resistência às doenças. Estudos recentes têm

mostrado que pelo menos 15 gêneros de bactérias são capazes de controlar doenças fúngicas ou

bacterianas em culturas de interesse, destes, os gêneros Bacillus e Pseudomonas apresentam um

maior potencial para o controle efetivo de fungos e bactérias. O objetivo geral deste projeto foi de

avaliar a diversidade de bactérias endofíticas de plantas de Embaúbas (Cecropia pachystachya)

presentes no Parque Estadual da Cantareira, no município de São Paulo, bem como a capacidade

destas bactérias em produzir antibióticos contra S.aureus, C. albicans, E.coli e F. oxysporum.

Foram realizadas três coletas de Embaúba durante o período de 2008. Em cada coleta foram

selecionadas três plantas em pontos distintos do Parque e para cada planta selecionada foram

extraídos cinco ramos. Após a coleta foi avaliada a densidade bacteriana para cada ramo e feita a

realização de testes de antagonismos com diferentes patógenos. Foi observado que a densidade

bacteriana em Cecropia sp. variou entre as coletas, sendo observado uma densidade de 2,4 x10

UFC por grama de tecido vegetal. Pode-se concluir que a terceira coleta demonstrou maior

densidade bacteriana. Os isolados encontrados com maior freqüência foram do gênero Bacillus e

Pseudomonas. Estas bactérias podem estar inibindo a ação de inúmeros microrganismos

patógenos presentes nos mesmos vegetais. Dentre os testes de antagonismos realizados, foi

observado que 1% dos isolados foram capazes de inibir in vitro a bactéria patogênica

Staphylococcus aureus. Já os testes realizados com a bactéria Escherichia coli mostraram que

1,01% dos isolados endofíticos avaliados foram capazes de inibir in vitro a bactéria. Houve uma

inibição mais relevante ao fungo Fusarium oxysporum, onde 6,13% dos isolados foram capazes

de inibir este fitopatógeno. Não houve inibição ao patógenos C.albicans. Dentre todas as

inibições, pode-se perceber que Bacillus sp e Pseudomonas sp se mostraram muito eficazes aos

patógenos testados, sugerindo portanto, um controle biológico destes patógenos em Cecropia sp.

Palavras-chave: Endofíticos, Embaúbas, Patógenos e Controle Biológico.

ABSTRACT

Endophytic microorganisms colonize the intercellular spaces of plant tissues without causing any

damage to them. Thus, this ecological niche occupied by the endophytes, the favor for the

biological control of pathogens and pests, for this site could compete for nutrients and space with

the pathogens and produce substances toxic to the organisms or even induce the plant to develop

resistance to disease. Recent studies have shown that at least 15 genera of bacteria are able to

control fungal diseases or bacterial cultures of interest, of the genera Bacillus and Pseudomonas

have a greater potential for effective control of fungi and bacteria. The aim of this project was to

assess the diversity of endophytic bacteria of plants trumpet trees (Cecropia pachystachya)

present Cantareira State Park, in São Paulo, and the ability of these bacteria to produce antibiotics

against S. aureus, C. albicans, E. coli and F. oxysporum. Were three collections Embauba during

the period of 2008. At each harvest plants were selected from three different sites of the Park and

for each selected plant were extracted five branches. After the collection was evaluated in

bacterial density for each branch and made the testing of antagonism with different pathogens.

Was observed that the bacterial density in Cecropia sp. varied among the samples, and observed a

density of 2.4 x103 UFC per gram of plant tissue. It can be concluded that the third collection

showed higher bacterial density. Isolates most frequently found were of the genus Bacillus and

Pseudomonas. These bacteria may be inhibiting the action of many pathogenic microorganisms

present in the same plant. Among the tests performed antagonism was observed that 1% of the

isolates were able to inhibit in vitro the pathogenic bacterium Staphylococcus aureus. The tests

performed with the bacterium Escherichia coli showed that 1.01% of the endophytic isolates

evaluated were able to inhibit in vitro the bacterium. There was a disqualification most relevant

to the fungus Fusarium oxysporum, where 6.13% of the isolates were able to inhibit this

pathogen. There was no inhibition to the pathogen C.albicans. Among all inhibitions, can be

seen that Bacillus sp and Pseudomonas sp were very effective against pathogens tested,

suggesting therefore, a biological control of pathogens in Cecropia sp.

Keywords: Endophytic, Embaubas, pathogens and Biological Control.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 01

Embaúbas (Cecropia pachystachya).....................................

FIGURA 02

Parque Estadual da Cantareira...............................................

FIGURA 03

Média da densidade bacteriana das três coletas

...

........

.........

FIGURA 04

Presença de halos de inibição contra Staphylococcus

aureus produzido pelos isolados Bacillus sp (09),

Pseudomonas sp (12) e Enterobacter sp (15) indicados

pelas setas (dados obtidos pelo GenBank).............................

FIGURA 05

Presença de halos de inibição contra Escherichia coli

produzido pelos isolados Pseudomonas sp (12) e

Enterobacter sp (15) indicados pelas setas (dados

obtidos pelo GenBank)..........................................................

FIGURA 06

Observação de halos de inibição nos isolados selecionados:

A: Controle; B: Sem inibição; C: Formação de Halo de

Inibição em 02 (Bacillus sp); D: Formação de Halo de

Inibição em 01(Bacillus sp) e 02 (Bacillus sp) (Dados de

identificação obtidos pelo GenBank).....................................

FIGURA 07

Porcentagem de bactérias endofíticas capazes de inibir

fungos e bactérias e patogênicas............................................

SUMÁRIO

1 APRESENTAÇÃO.......................................................................... 9

2 INTRODUÇÃO............................................................................... 10

2.1Aspectos Gerais

...............................................................................

2.2 Revisão da Literatura

......................................................................

2.3 Microrganismos Endofíticos

..........................................................

2.4 Bactérias Endofíticas

.........................................

.............................

2.5 As Embaúbas

..................................................................................

2.5.1 Estudos farmacológicos com as Embaúbas

.................................

2.6 Infecções bacterianas causadas em animais herbívoros

.................

2.7 Biologia Molecular no estudo de ecologia microbiana

..................

3 OBJETIVOS.................................................................................... 21

3.1 Objetivo Geral

....................

............................................................

3.2 Objetivos Específicos

.....................................................................

4 MÉTODO......................................................................................... 22

4.1 Caracterização da área de estudo

....................................................

4.2 Coleta de amostras

..........................................................................

4.2.1 Isolamento de Bactérias Endofíticas

...........

................................

4.3 Teste de Antibiose

..........................................................................

4.3.1 Testes com bactérias e levedura patogências

..............................

4.3.2 Inibição do fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum

.............

4.4 Caracterização molecular das bactérias

..........................................

4.4.1 Extração do DNA bacteriano

......................................................

4.4.2

Amplificação do 16s Dna..........................................................

4.4.3

Seqüenciamento do 16s Dna......................................................

5 RESULTADOS................................................................................ 29

5.1 Densidade Bacteriana

.....................................................................

5.2 Diversidade bacteriana associada à Cecropia sp

............................

5.2.1 Diversidade bacteriana associada à embaúba

.......

.......................

5.3 Produção de Agentes antimicrobianos

...........................................

6 DISCUSSÃO.................................................................................... 36

7 CONCLUSÕES............................................................................... 45

REFERÊNCIAS................................................................................. 46

1 APRESENTAÇÃO

A teoria de que bactérias não patogênicas residem em tecidos de plantas foi

formulada por Perotti em 1926 (HALLMANN et al., 1997). Porém, estudos sobre a

colonização de tecidos internos de plantas sadias por bactérias datam de 1870, com os

trabalhos de Pasteur e outros pesquisadores (HOLLIS, 1951). Os primeiros relatos

consideraram as bactérias endofíticas como contaminantes resultantes da desinfestação

superficial incompleta ou como patógenos fracamente virulentos (HOLLIS, 1951).

Pesquisas recentes demonstraram que bactérias endofíticas podem promover o

crescimento das plantas e reduzir os sintomas de doenças causadas por diversos patógenos

(HALLMANN et al., 1997).

Os principais mecanismos pelos quais as bactérias endofíticas promovem o

crescimento de plantas são a fixação de nitrogênio (BODDEY e DOBEREINER, 1995) e

o controle biológico de fitopatógenos, seja este pelo antagonismo direto da microflora

deletéria ou pela indução de resistência sistêmica (HALLMANN et al., 1997). No

entanto, as bactérias endofíticas podem também promover o crescimento de plantas pela

produção de hormônios vegetais ou de substâncias análogas (ARSHAD e

FRANKENBERGER, 1991).

Com relação às doenças, as bactérias endofíticas mostraram-se eficientes agentes

de biocontrole de diversos patógenos, tanto de origem fúngica quanto bacteriana

(HALLMANN et al., 1997).

Diversos microrganismos estão presentes em plantas, tais como, em Cecropia sp,

causando inúmeros benefícios e/ou malefícios nestes vegetais, como também nos animais

que se alimentam dos mesmos.

2 INTRODUÇÃO

2.1

Aspectos Gerais

Bactérias endofíticas estão presentes em todas as espécies vegetais, permanecendo em

estado de latência ou colonizando ativamente os tecidos de forma local ou sistêmica. Por

ocuparem um nicho ecológico semelhante àqueles ocupados por patógenos, as bactérias

endofíticas apresentam grande potencial para o controle biológico (HALLMANN et al., 1997).

Este controle pode ser resultante de diversos mecanismos: competição por espaço e

nutrientes na planta hospedeira; produção de compostos antimicrobianos (PLEBAN et al.,1997);

indução de resistência sistêmica (M'PIGA et al., 1997; BENHAMOU et al., 1998; DUIJFF et al.,

1997).

2.2 Revisão de Literatura

Endófitos são microrganismos que habitam o interior das plantas, sendo encontrados em

órgãos e tecidos vegetais como folhas, ramos e raízes sem causar doenças e sem produzir

estruturas externas visíveis (AZEVEDO et al., 2000).

A comunidade endofítica é constituída principalmente por fungos e bactérias que, ao

contrário dos microrganismos patogênicos, não causam prejuízo à planta hospedeira (PEIXOTO

NETO et al., 2002).

Trabalhos de pesquisa relatando a ocorrência de microrganismos endofíticos,

principalmente o isolamento e caracterização de fungos e bactérias, são relativamente recentes,

constatando-se sua existência em gramíneas (CLAY, 1988; SILVA et al., 1995), ericáceas

(PETRINI, 1984) araceas, bromeliaceas e orquidaceas (PETRINI et al., 1981), e em plantas

herbáceas e arbustivas (SCHULZ et al., 1993). A versatilidade bioquímica e diversidade de

endofíticos representam uma enorme variedade de genes que são ainda desconhecidos. Está se

descobrindo cada vez mais funções gênicas, particularmente para remediação ambiental e

propósitos industriais.

Assim, o uso de bactérias e fungos abre novas áreas de exploração biotecnológica, que

dita a necessidade de isolar, caracterizar e determinar a biodiversidade microbiana em diferentes

espécies de plantas (EMBRAPA, 2009).

A avaliação da diversidade de bactérias diazotróficas presentes nos tecidos, nos diferentes

estágios de desenvolvimento da planta, pode ajudar a compreender o papel desses

microrganismos em seu habitat natural (RODRIGUES et al.), 2006.

Endofíticos são usados para controle biológico, para características agronômicas

melhoradas e para agentes farmacológicos. Dentre os gêneros mais estudados como agentes de

controle biológico estão Bacillus e Pseudomonas (EMBRAPA, 2009).

A família Cecropiaceae é composta por espécies utilizadas para fins medicinais,

distribuídas em seis gêneros, sendo Cecropia o mais importante. Este gênero é conhecido

popularmente por embaúba e formado por 75 espécies tropicais encontradas ao redor de florestas

densas, lagos e áreas devastadas (TANAE et al., 2007).

Um grande número de microrganismos podem viver associados às plantas do gênero

Cecropia podendo trazer inúmeros benefícios ou também causando inúmeras doenças.

2.3 Microrganismos Endofíticos

Um grande número de microrganismos pode viver associado aos vegetais, tanto em sua

superfície como em seu interior. Entre eles, estão os que podem ser classificados como

microrganismos epifíticos ou simplesmente epífitos, os quais habitam a superfície dos órgãos e

tecidos vegetais e os microrganismos endofíticos ou simplesmente endófitos, os quais habitam o

interior das plantas hospedeiras e que se distinguem de outro grupo, os patógenos que são

capazes de causar doenças em plantas (MENDES e AZEVEDO, 2007).

Praticamente todos os principais grupos de microrganismos convivem com vegetais, mas

os fungos e bactérias são os mais comumente encontrados em interações microrganismos-plantas

(PROSSER, 2007)

Estima-se que o número de células microbianas que vivem em contato com vegetais é

bastante superior ao número de células que formam o próprio hospedeiro. São várias as razões

para que as investigações na área de endófitos sejam continuadas e ampliadas, como por

exemplo: a) os microrganismos compõem uma das maiores fontes de diversidade genética

disponível entre os seres vivos (PROSSER et al., 2007); b) faltam informações nos aspectos

ecológicos, genéticos e fisiológicos para elucidar a interação microrganismo-planta; c) vários

endófitos apresentam produção de antibióticos e outros metabólitos de interesse farmacológico

(ZHANG et al.,2006); d) eles podem ser utilizados como bioindicadores de alterações ecológicas

(HELANDER e RANTIO-LEHTIMÄKI, 1990); e) atuam como agentes no controle biológico de

pragas e doenças (WHITE JR e COLE, 1985; BUCHENAUER, 1998); f) produzem

microherbicidas para controle de ervas daninhas (CERKAUSKAS, 1988); g) podem funcionar

como vetores para a expressão de genes em plantas hospedeiras (HAAPALAINEN et al., 1998);

e h) vários endófitos são indicadores de deficiências nutricionais de plantas (BLODGETT et al.,

2007).

A grande maioria dos estudos com endófitos tem sido realizada em plantas de clima

temperado, entretanto, recentemente, plantas de clima tropical têm sido pesquisadas quanto à

presença, quantidade e diversidade de fungos endofíticos encontrados (AZEVEDO e ARAÚJO,

2007).

Os microrganismos endofíticos podem atuar na promoção do crescimento da planta por

meio da produção de substâncias, tais como auxinas, giberelinas e citocininas, as quais podem

melhorar a absorção de minerais e o aproveitamento hídrico pela planta (JAMES et al., 2002;

OLIVEIRA et al., 2002; BAZZICALUPO e OKON, 2000).

As interações endófito/planta, ainda não são muito bem compreendidas, mas podem ser

simbióticas, neutras ou antagônicas (neste caso, estudadas pela fitopatologia). Nas interações

simbióticas os microrganismos produzem ou induzem a produção de metabólitos primários e

secundários que podem conferir diversas vantagens à planta tais como: a diminuição da

herbivoria e do ataque de insetos, o aumento da tolerância a estresses abióticos e o controle de

outros microrganismos (ARAÚJO, 1996; RODRIGUES e DIAS FILHO, 1996; PEREIRA,

1993). Exemplo de metabólitos que podem ser induzidos pelos endófitos são as fitoalexinas,

substâncias de baixo peso molecular com atividades antimicrobianas, produzidas pelas plantas

ante a ação de microrganismos ou de agentes estressantes (CORDEIRO NETO e DIETRICH,

1992). Da parte dos fungos, pode-se citar a produção de micotoxinas, metabólitos secundários

que podem causar doenças em humanos e outros animais (CLAY, 1988; D'MELLO e

MACDONALD, 1997).

Ultimamente, tem sido investidos recursos em pesquisas, para disponibilizar fontes

alternativas de nutrientes às plantas, e em metodologias alternativas de controle de patógenos,

com enfoque no uso de microrganismos endofíticos (KUSS et al., 2007; BARROSO e NAHAS,

2008; RYAN et al., 2008; LUCON et al., 2009).

2.4 Bactérias Endofíticas

Os primeiros relatos consideraram as bactérias endofíticas como contaminantes

resultantes da desinfestação superficial incompleta ou como patógenos fracamente virulentos

(HOLLIS, 1951). Entretanto, pesquisas recentes demonstraram que bactérias endofíticas podem

promover o crescimento das plantas e reduzir os sintomas de doenças causadas por diversos

patógenos (HALLMANN et al., 1997).

A presença de bactérias endofíticas em tecidos de plantas saudáveis tem sido relatada para

muitas espécies cultivadas, em diferentes estágios de crescimento. As comunidades endofíticas

variam espacialmente na planta (FISHER et al., 1992) ou podem ser dependentes da interação

com outras bactérias endofíticas ou patogênicas (QUADT-HALLMANN et al., 1997).

Bactérias endofíticas têm mostrado efeitos benéficos na promoção do crescimento vegetal

e saúde em diversas culturas, sendo que os principais modos de ação descritos são: fixação de

nitrogênio, produção de fitormônios e compostos antifúngicos, ou ainda, indução de resistência

sistêmica (LODEWYCKX et al., 2002; SESSITSCH et al., 2002; INIGUEZ et al., 2004;

KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004; COMPANT et al., 2005; MEHNAZ e LAZAROVITS,

2006; ROSENBLUETH e MARTÍNEZ-ROMERO, 2006).

Os gêneros mais comumente isolados incluem: Bacillus, Burkholderia, Enterobacter,

Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas (HALLMANN et al., 1997). Em plantas de citrus

cultivadas no estado de São Paulo e Minas Gerais, (ARAÚJO et al., 2001) isolaram-se as

seguintes espécies: Alcaligenes sp., Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Burkhloderia cepacia,

Curtobacterium flaccumfaciens, Enterobacter cloacae, Methylobacterium spp, Nocardia sp.,

Pantoea agglomerans, Streptomyces sp. e Xanthomonas campestris. Pantoea agglomerans e

Sphingomonas sanguinis foram isoladas como endófito de batata doce no Japão (ADACHI et al.,

2002). Zinniel et al., (2002) identificaram pela primeira vez a natureza endofítica da

Microbacterium testaceum em várias plantas hospedeiras. Krechel et al., (2002) encontraram em

batata (Solanum tuberosum cv. Cilena) os endófitos bacterianos, Pantoea agglomerans e

Stenotrophomonas maltophilia, os quais pertencem ao subgrupo das g-Proteobacteria, que foram

as espécies isoladas com maior freqüência. Pantoea agglomerans é também citada como bactéria

endofítica de milho e outras espécies de plantas (QUADT-HALLMANN et al., 1997), enquanto

S. maltophilia é um colonizador endofítico comum de batata (GARBEVA et al., 2001).

2.5 As Embaúbas (Cecropia pachystachya)

A Cecropia pachystachya (embaúba), também conhecida pelos nomes de umbaúba,

imbaúba, embaúva, umbaúba-do-brejo, árvore-da-preguiça, umbaubeira, pau-de-lixa, umbaúba-

branca, árvore-da-preguiça, entre outras (HIKAWCZUK et al.,1998; HASHIMOTO, 2002), é

característica de solos de maior umidade, típica da borda de matas, clareiras grandes e de estradas

e tem preferência pelos locais ensolarados, sendo rara sua presença no interior de matas fechadas.

Floresce de setembro a outubro e frutifica de maio a junho. O desenvolvimento das plantas no

campo é rápido. Os frutos são procurados pelas aves e servem de alimento a várias espécies de

peixes, como pacu, piracanjuba e outros (BALBACHA, 1960).

Essa planta se distribui desde o México até a Argentina. No Brasil, situa-se

principalmente no litoral do Nordeste, passando por Sudeste, Centro-Oeste e chegando até Santa

Catarina. Está presente tanto na área dos cerrados quanto na de florestas variadas e formações do

complexo atlântico (ESALQ, 2004).

Fazem parte da família Urticaceae, possuem de 5 a 10 m de altura. Seus troncos são de 15

a 20 cm de diâmetro e ramificados apenas na região superior. Possuem madeira fraca e

crescimento rápido. Apresentam folhas simples, palmatífidas, com incisões que às vezes atingem

o pecíolo, formando de 9 a 13 segmentos, com face superior áspera e a inferior com densa

camada de pêlos esbranquiçados. Seus pecíolos são pilosos e possuem de 10 a 55 cm de

comprimento (VIVATERRA, 2009) (Fig. 01).

São espécies dióicas, com inflorescências masculinas ramificadas, segmentos organizados

aos pares, mais ou menos pêndulas. As femininas, também aos pares, são pêndulas na

frutificação, com bráctea pilosa. O eixo da infrutescência apresenta-se carnoso, com numerosos

frutos oblongos embutidos (cerca de 2 mm de comprimento).

É a "embaúba" mais comum de terrenos úmidos e alagadiços, podendo, contudo ocorrer

também em terrenos mais drenados. Abriga formigas no interior de seu tronco oco. A preguiça

tem nas folhas jovens um dos seus alimentos preferidos. Por este motivo também é chamada de

“árvore-da-preguiça” ou “pau-de-lixa”.

Preferem locais sombreados e úmidos. A flor e as sementes aparecem como um pequeno

cacho no topo da árvore (VIVATERRA, 2009). Os frutos que aí se desenvolvem são ingeridos

por muitas aves, morcegos e macacos, que espalham suas sementes (WESTPHALEN, 2006).

De acordo com Ludwig et al. (2008), a Cecropia pachystachya é o vegetal menos

abundante nas regiões de mata ciliar insular e continental Alto Rio Paraná, no Sul do Brasil, e

mesmo assim é considerado o vegetal mais consumido durante todo o ano pelos primatas da

espécie Alouatta caraya que vivem em ambas regiões.

Figura 1: Embaúbas (Cecropia pachystachya)

Fonte: MELO (2009).

Segundo Lorenzi (1998), a madeira de embaúba, em condições adversas, é extremamente

suscetível ao ataque de organismos xilófagos (bactérias, fungos etc.). É muito usada no

tratamento de diabetes, tosse, bronquite e apresenta poderoso efeito diurético.

As espécies do gênero Cecropia estão entre as plantas que oferecem alimento abundante

durante todo o ano, sendo utilizadas como recurso alimentar tanto por aves "frugívoras

oportunistas", que se alimentam principalmente de insetos (TREJO PÉREZ, 1976), como por um

grande número de espécies predominantemente frugívoras, ambos os grupos potencialmente

importantes para sua dispersão.

Como em todas as plantas, existem nas Embaúbas inúmeros microrganismos que podem

ser considerados como Endófitos, como também podem existir espécies patógenas que se

ingeridas por diversos animais podem causar inúmeras doenças.

2.5.1 Estudos farmacológicos com as Embaúbas

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), as espécies vegetais são a

melhor e maior fonte de fármacos para humanidade. Estudos etnobotânicos têm demonstrado o

uso popular de plantas no tratamento das leishmanioses tanto por via oral, como na aplicação

tópica sobre as lesões cutâneas (FRANÇA et al., 1993; 1996; MATHIAS e EMILY, 1993;

SILVA et al., 1995; MOREIRA et al., 2002). Muitos vegetais apresentam em sua composição

substâncias das classes dos alcalóides, terpenos, lignanas, chalconas, flavonóides e lactonas

sesquiterpênicas, compostos descritos na literatura como eficazes na atividade leishmanicida

e/ou anti-Leishmania (IWU et al., 1994; QUEIROZ et al., 1996; TORRES-SANTOS, 1999;

KAM et al., 1999; ROCHA et al., 2005).

Tribos indígenas na Amazônia utilizam a embaúba para propriedades antiinflamatórias,

geralmente para reumáticas, renais e inflamações pulmonares. Para isso, preparam uma infusão

com as folhas, podendo também ser usado para diabetes, asma e outros problemas respiratórios.

Os povos indígenas, Palikur, da Guiana embrulham as folhas grandes em torno de fraturas

ósseas, hematomas e feridas, além de utilizarem para desinfetar a genitália e aliviar a dor após o

parto (TAYLOR, 2005).

No Brasil, as Embaúbas são utilizadas para todos os tipos de queixas respiratórias (como

asma, bronquite, tosse, coqueluche e pneumonia). Também é usado para diabetes, doença de

Parkinson, distúrbios renais, pressão alta, e para aumentar a força de contração do músculo

cardíaco. É considerado eficaz contra a doença de Parkinson na Colômbia e para facilitar o parto

e a menstruação. A folha é usada na Guatemala para inúmeros tratamentos, tais como, asma,

edema, reumatismo, diabetes, febre, aterosclerose e gonorréia (TAYLOR, 2005).

A planta é muito popular no México, onde é usada para diabetes, tosse, inflamação,

diarréia, irritação da bexiga, asma, obesidade, distúrbios do fígado, pressão arterial elevada, e

verrugas (TAYLOR, 2005). Em Cuba, praticamente todas as partes da planta é empregada. O

látex é considerado corrosivo e adstringente, e é usado topicamente contra verrugas, calos, herpes

(e outras doenças venéreas), e úlceras cutâneas. A casca do caule da Embaúba é usada para

reduzir o muco; já o fruto é considerado emoliente (calmante e suaviza a pele) (TAYLOR, 2005).

As folhas são consideradas para reduzir a dor, e são usadas para a asma, doenças hepáticas,

edema e promover a menstruação Em outras partes da América Latina e da Amazônia, são

freqüentemente apresentados como uma "cura" para a asma após apenas uma semana depois de

tomar um chá feito a partir de suas folhas, entretanto, este resultando não foi confirmado com em

investigação clínica (TAYLOR, 2005).

Estudos realizados com Cecropia pachystachya em corações de ratos demonstraram

efeitos sedativos, sugerindo que esse efeito pode ser útil no tratamento contra a tosse

(CONSOLINI et al., 2005).

2.6 Infecções bacterianas causadas em animais herbívoros

Inúmeros animais alimentam-se de diversas espécies de vegetais, tais como Embaúbas.

Esses vegetais podem conter inúmeras bactérias consideradas como endófitos além de

microrganismos fitopatógenos. Dentre os animais que mais consomem folhas e frutos de

Embaúbas (Cecropia sp), podemos citar especialmente na região da Serra da Cantareira, as

espécies de primatas Alouatta fusca (Bugios).

É bem sabido que a saúde dos animais silvestres tem sido prejudicada pela fragmentação

e degradação de habitats, pelo isolamento de populações, e pela maior proximidade com humanos

e seus animais domésticos (DASZAK et al., 2000). É claro também que a semelhança

filogenética entre primatas não humanos e humanos permite a susceptibilidade a vários agentes

etiológicos em comum (BENNETT et al., 1995), sendo que aproximadamente 150 enfermidades

compartilhadas já foram reconhecidas e descritas (FIENNES,1967).

Animais mantidos em cativeiro ou transportados, mesmo que por um curto período, podem

ser expostos a uma variedade de patógenos, e se tornarem carreadores potenciais de doenças

infecciosas (BAKER e SORAE, 2002). Doenças virais, bacterianas, fúngicas e parasitárias são

importantes causas de morbimortalidade em primatas cativos (DINIZ et al., 1994) e artigos sobre

zoonoses emergentes e reemergentes têm ressaltado a necessidade de vigilância a coleções

estáveis devido ao possível contágio humano (BENNETT et al., 1995 e DUBOIS, 1996).

Percebendo que embora exista um número significativo de informações sobre

enfermidade de primatas brasileiros, estas informações estão dispersas e acessíveis apenas pela

consulta em periódicos especializados, o Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos

Naturais Renováveis – IBAMA, através do Centro de Proteção de Primatas Brasileiros, órgão

executivo para ações de manejo com primatas da fauna brasileira, vem realizando mapeamento

das ocorrências de doenças em populações silvestres e cativas a fim de montar uma base

estruturada de dados (VALENÇA et al., 2005).

Entre os anos de 1933 e 1951, uma redução de 50% na população de bugios (Alouatta

palliata) da ilha de Barro Colorado no Panamá foi atribuída a epizootias de Febre Amarela

(COLLIAS e SOUTHWICK, 1952).

Leveduras do gênero Candida pertencem à microbiota de mucosas e pele de mamíferos,

sendo descritas, em todo o mundo, como agente etiológico de micoses oportunistas em diversas

espécies de animais domésticos e silvestres, tais como inúmeros primatas (RAPOSO et al., 1996;

SIERRA et al., 2000; LACAZ et al., 2002; MORETTI et al., 2004; CLEFF et al., 2005).

A cavidade bucal e os dentes dos macacos, de um modo geral, constituem meio

hiperséptico, associando floras saprófitas e patogênicas extremamente polimorfas, além de

enzimas e produtos de degradação biológica, muitas vezes tóxicos. Estes microrganismos são

conseqüência dos hábitos alimentares dos animais, que incluem desde frutas variadas até

pequenos roedores e insetos ou ao costume de levar constantemente as mãos contaminadas à

boca, mesmo com matéria fecal. Por outro lado, os microrganismos podem, também, fazer parte

da própria microbiota dos animais, tal como relatado por Kloos et al., (1976), que isolaram a

partir da superfície cutânea de primatas não humanos: Staphylococcus spp, Staphylococcus

aureus de narinas e abdômen e Staphylococcus sciuri ocasionalmente das narinas.

Rayan et al. (1987) verificaram para cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus

epidermidis, entre outras bactérias isoladas a partir da cavidade oral de macacos Rhesus (Macaca

mulatta), sensibilidade de 100% frente ao cefoperazone, 96% ao cloranfenicol e 89% à

ampicilina.

A diarréia ocasionada por Escherichia coli compromete tanto a saúde humana como a dos

animais, como primatas. A enfermidade pode ser ocasionada por cepas enterotoxigênicas de

E.coli, as quais precisam se aderir à mucosa intestinal por meio de fímbrias e produzir uma ou

mais enterotoxinas, que levam ao desenvolvimento de diarréia e desidratação, podendo resultar

na morte dos animais (DEAN-NYSTROM et al.,1997).

As doenças nutricionais são as patologias não infecciosas mais comuns em primatas

mantidos em cativeiro. Doenças ósseo - metabólicas e deficiência de micro-nutrientes têm sido

descritas e ainda são questões de saúde importantes em primatas mantidos como animais de

estimação, em condições de manejo insatisfatórias (DINIZ, 1997) .

Inúmeras bactérias estão presentes nos vegetais. Esses microrganismos podem estar

relacionados com os vegetais que os primatas se alimentam, e podem causar diversas

intoxicações nos mesmos. Embora bactérias produtoras de toxinas também sejam usualmente

ingeridas, a patogenicidade não se expressa por meio de uma etapa infecciosa in vivo. A produção

de altas doses de toxinas depende do tipo de contaminação do alimento e das condições

oferecidas para a multiplicação dos microrganismos como, por exemplo, Clostridium botulinum,

Staphylococcus aureus e Bacillus cereus (TRÍBOLI,1995).

Um estudo sobre parasitos gastrointestinais em primatas mantidos em cativeiros é

importante para o manejo da colônia de primatas e para a manutenção da saúde das pessoas que

trabalham com esses animais, pois muitos destes parasitas são potentes causadores de zoonoses

(BRACK, 1987 apud MUNENE et al., 1998). Também é importante verificar se esses animais

podem estar se comportando como transmissores de parasitas para o meio ambiente por estarem

infectados. Vários estudos têm demonstrado que primatas não humanos são naturalmente

infectados por parasitas que são patogênicos para o homem (HIRA, 1963; HAREGURA, 1983;

MUCHENI, 1992; BURCE, 1993 apud MUNENE et al., 1998). No entanto, primatas não

humanos utilizados em pesquisa biomédica precisam ser estudados quanto à presença de

diferentes patógenos, pois estes podem comprometer as pesquisas para as quais eles são

utilizados (MUNENE et al., 1998).

Bactérias como Bacillus cereus são encontradas em brotos de vegetais e podem causar

grandes distúrbios em primatas, tais como a gastroenterite (TRÍBOLI, 1995). Grande parte desses

microrganismos, além de estarem alojados em diversos vegetais, podem estar também

disseminados em ambientes aquáticos. Bactérias como Listeria monocytogenes, Clostridium

botulinum, C. perfringens, Shigella sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae, S. boydii estão incluídas

neste caso e podem ser transmitidas além do ambiente aquático, por meio do contato via oral-

fecal e pelo contato dos animais. Estão associadas também as áreas densamente povoadas e sem

saneamento básico, condições higiênicas deficientes e moscas hospedeiras destes microrganismos

(TRÍBOLI, 1995).

Dentre os gêneros mais estudados como agentes de controle biológico estão Bacillus e

Pseudomonas. Entretanto, um grande número de bactérias apresenta antagonismo contra vários

tipos de fungos e bactérias patogênicas. Em batata (Solanum tuberosum) e trevo vermelho

(Trifolium pratense) foram isoladas 25 espécies de bactérias endofíticas, de 18 gêneros, das quais

74% apresentaram in vitro antibiose ao fungo patogênico Rhizoctonia solani (STURZ et al.,

1998). Em arroz, foram isoladas bactérias endofíticas que apresentaram forte atividade

antifúngica contra R. solani, Pythium myriotylum, Guamannomyces graminis e Heterobasidium

annosum (MUKHOPADHYAY et al.,1996).

Grande parte dessas bactérias pode causar diversos distúrbios gastrointestinais em animais

de sangue quente, podendo muitas vezes, causar a morte, se a doença não for tratada. Alem

dessas bactérias, outras que habitam o interior da planta utilizada como alimentos pelos animais

poderiam atuar no controle de espécies bacterianas patogênicas, diminuindo a incidência dessas

infecções em condições naturais.

2.7 Biologia Molecular no estudo de ecologia microbiana

A evolução das metodologias de biologia molecular aplicada ao estudo do meio ambiente

tem contribuído significativamente para um grande avanço do conhecimento sobre a diversidade

microbiana. Resultados de estudos independentes de isolamento e cultivo, baseados em

amplificação e sequenciamento de fragmentos do gene 16S rRNA (rDNA 16S), demonstraram

que a diversidade de microrganismos em amostras ambientais é vasta. Contudo, apenas uma

pequena fração destes (<10% em solos e <1% em ambientes aquáticos) é usualmente recuperada

em estudos baseados em isolamento e cultivo. A aplicação destas metodologias no estudo da

diversidade de bactérias tem permitido a descoberta de uma gama extensa de novas linhas

evolutivas neste grupo (Divisões). Como resultado destes estudos, o número de Divisões foi

ampliado de 12, em 1984, para 36, em 1991 (HUGENHOLTZ et al., 1998 a, b).

Metodologias moleculares que independem do cultivo, baseadas em extração direta de

ácidos nucléicos de amostras ambientais, associada às técnicas de hibridização com sondas

grupo-específicas e/ou PCR, clonagem e sequenciamento, vêm permitindo uma avaliação mais

precisa da diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos grupos de organismos,

nunca antes cultivados. Entretanto, estas metodologias não nos permitem ter acesso ao potencial

metabólico destes novos organismos, uma vez que as etapas de isolamento e cultivo são

suprimidas dos estudos (CANHOS e MANFIO, 2001).

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

O objetivo geral deste projeto foi avaliar a diversidade de bactérias endofíticas de plantas

de Embaúba (Cecropia pachystachya) do Parque Estadual da Cantareira, no município de São

Paulo, bem como a capacidade destas bactérias em produzir antibióticos contra microrganismos

patogênicos.

3.2 Objetivos específicos

Os objetivos específicos foram:

- isolar bactérias endofíticas de Embaúba (Cecropia sp.) presentes no Parque Estadual da

Cantareira;

- Avaliar a capacidade destas bactérias endofíticas em produzir antibióticos contra as

bactérias patógenas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, e fungos como Candida albicans e

Fusarium oxysporum.

- Relacionar essas bactérias que estão sendo identificadas com possíveis patologias que

acomete inúmeros vertebrados, tendo como destaque os primatas.

4 MÉTODO

4.1 Caracterização da área de estudo

O local de estudo é o Parque Estadual da Cantareira, Núcleo Pedra Grande, localizado no

Estado de São Paulo, nos Municípios de São Paulo, Caieiras, Mairiporã e Guarulhos. As coletas

foram realizadas no município de São Paulo, Núcleo Pedra Grande, localizado a 23º22' S e 46º36'

W (Fig. 02).

O Parque Estadual Turístico da Cantareira (criado pelo Decreto Estadual nº 41.626 de

1963) é uma Unidade de Conservação de Proteção Integral Paulista que abrange parte da Serra da

Cantareira (a maior floresta urbana nativa do mundo), tendo sido, como tal, tombado pela

UNESCO em 1994.

Este parque é um fragmento da Mata Atlântica com várias espécies de fauna e flora. A

Serra da Cantareira foi batizada pelos tropeiros que faziam o comércio entre São Paulo e outras

regiões do país, nos séculos XVI e XVII. A grande quantidade de nascentes e córregos ali

encontrados forneciam água, que era armazenada em cântaros (jarros para armazenar água) e,

depois de cheios, eram colocados em prateleiras, as chamadas cantareiras. O Parque compreende

parte da Serra, mas não toda ela.

Atualmente com 7.916,52 ha (79 milhões de metros quadrados de Mata Atlântica)

distribuídos por quatro municípios da Grande São Paulo, a área do Parque foi tombada no final

do século XIX, para garantir o abastecimento de água para a cidade de São Paulo. Possui quatro

núcleos de visitação: Pedra Grande, Águas Claras, Engordador e Cabuçu.

4.2 Coleta de Amostras

As bactérias endofíticas foram isoladas de Embaúbas presentes no Parque Estadual da

Cantareira, já que servem de alimento para inúmeros animais, principalmente primatas como os

bugios (Alouatta fusca).

Para realização do projeto foram realizadas três coletas, nos períodos de março, julho e

agosto de 2008. Durante principalmente o período de junho e julho, muitos animais se alimentam

com maior freqüência das Embaúbas, já que faz parte da época de frutificação. Por este motivo,

foram realizadas duas coletas em épocas mais próximas, julho e agosto.

Figura 2. Parque Estadual da Cantareira (Núcleo Pedra Grande) com os três pontos de coleta (legenda) realizadas

em 2008 (Coordenadas 23º 26’ S e 46º 38’ W) (Google Earth versão 5.0).

1ª col

2ª coleta

3ª coleta

Em cada coleta, foram retirados cinco caules com folhas de cada indivíduo, sendo

utilizadas três plantas por época de amostragem, ou seja, três locais de coleta. A coleta abrange

uma boa parte dos caules de plantas jovens e sadias. A quantidade de caules jovens coletados e os

locais de coleta diferenciados permitem maior ocorrência e diferenciação de microrganismos.

Além disso, por meio de observações, pôde-se perceber a preferência de primatas como os

Bugios (principalmente os indivíduos adultos), pelas plantas mais jovens e localizadas na mata

mais fechada do que em trilhas abertas.

Os caules possuíam aproximadamente 1cm de diâmetro. Os materiais foram guardados

em sacos plásticos devidamente identificados com o número da amostra e o ponto de onde foram

retirados por meio da localização do GPS (Sistema de Posicionamento Global).

Em todas as coletas realizadas, os cinco caules retirados dos indivíduos número 1, 2 e 3

estavam localizados nas coordenadas aproximadas 23º 26’ S e 46º 38’ W (Fig.02).

Ao final de cada coleta, as amostras vegetais foram transportadas ao Laboratório de

Biologia Molecular e Ecologia Microbiana (LABMEM) do Núcleo Integrado de Biotecnologia

(NIB), localizado na Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), onde foram processadas em

menos de 24 horas.

4.2.1 Isolamento de Bactérias Endofíticas

Para o isolamento de bactérias endofíticas, as folhas presentes nos caules foram

descartadas. Os caules de Embaúbas foram desinfetados superficialmente por meio de uma série

de lavagens: etanol 70% por 1 min, solução de hipoclorito de sódio 2% por 5 min, etanol 70%

por 30 segundos e dois enxágües em água destilada esterilizada (ARAÚJO et al., 2001).

Alíquotas da água utilizada na última lavagem foram semeadas sobre meio TSB (Trypic

Soy Broth suplementado com 1,5% de ágar) 5% para avaliar a eficiência do processo de

desinfecção. Após desinfecção superficial, o fragmento vegetal foi macerado em tampão PBS (5

mL de PBS para cada 1 g de tecido vegetal) e posteriormente 100 µL de diluições apropriadas

foram semeadas sobre meio TSB 5% suplementados com benomyl (50 µg mL

) para inibição do

crescimento fúngico e incubadas a 28°C por até 21 dias para observação do crescimento

bacteriano.

Após crescimento bacteriano, o número de colônias foi contado e o resultado foi expresso

em unidades formadoras de colônia por grama de tecido vegetal (UFC. g

-1

). Posteriormente,

colônias representativas da diversidade bacteriana foram coletadas aleatoriamente, purificadas

por meio de estrias de esgotamento e estocadas em glicerol 20% a -70

4.3

Teste de Antibiose

Este experimento foi realizado de acordo com o protocolo de Lima et al., (2003), com

algumas adaptações.

Todos os patógenos desafiantes utilizados pertencem à coleção de microrganismos do

Laboratório de Biologia Molecular e Ecologia Microbiana (LABMEM) do Núcleo Integrado de

Biotecnologia (NIB), localizado na Universidade de Mogi das Cruzes (UMC).

Os testes de antibiose foram realizados com os seguintes patógenos:

a) Staphylococcus aureus – bactéria Gram-positiva, patogênica, causadora de doenças

respiratórias e cardíacas; principal causadora de infecções hospitalares.

b) Escherichia coli - bactéria Gram-negativa, patogênica para humanos e animais.

c) Candida albicans - fungo leveduriforme, patogênico, responsável pela candidíase no

trato vaginal e oral.

d) Fusarium oxysporum – fungo patogênico para animais e vegetais.

4.3.1 Testes com bactérias e levedura patogênicas

Este experimento foi realizado com os seguintes patógenos: Staphylococcus aureus,

Escherichia coli e a levedura Candida albicans.

Primeiramente foram selecionadas bactérias das três coletas para realização deste

experimento (120 bactérias da primeira coleta; 66 bactérias da segunda coleta e 222 bactérias da

terceira coleta). Essa variação no número de isolados por época se deve ao fato das densidades

variarem de acordo com as coletas.

Os isolados foram colocados em placas de Petri, em meio de cultura sólido TSB (Meio

caseína de soja

)

5% a 28°C para crescimento durante 48 horas. Foram feitas três repetições por

placa e os isolados foram colocados aleatoriamente de acordo com a posição, devido ao controle

de patogenicidade em relação ao sistema quorum sensing, pois algumas bactérias podem inibir a

patogênica, ou não quando interagem com outros isolados.

Foram colocados 16 isolados por placa, e apenas uma placa com 8 isolados no total,

foram 25 placas com 16 isolados, e 1 placa com 8. As bactérias patogênicas foram crescidas em

meio líquido apropriado (TSB) por 24 horas.

Após o crescimento de cada bactéria patogênica, foi feita uma diluição de 10

-2

do meio

líquido com a bactéria patogênica, em meio semi-sólido (com metade do ágar, em torno de 6,5 g)

do mesmo tipo, ou seja, 2ml de meio líquido + bactérias em 98ml de meio semi sólido. Para a

realização da diluição a temperatura do meio estava a aproximadamente 40°C.

Após crescimento, as bactérias endofíticas foram inativadas com vapor de clorofórmio, e

posteriormente as placas foram invertidas, com a tampa semi-aberta, para que todo o clorofórmio

evaporasse e secasse a tampa. No fluxo, foi derramado o meio semi-sólido com a bactéria

patogênica (em torno de 100ml) sobre os isolados mortos. Após isso, os isolados foram

incubados a 28°C, e observados no dia seguinte a presença ou não de halos.

4.3.2 Inibição do fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum

Para a realização deste experimento foi utilizada a técnica de cultura pareada. Para isso,

foram colocados dois isolados bacterianos endofíticos por placa de Petri, com meio BDA (Batata,

dextrose, Ágar). Os isolados foram colocados nas extremidades das placas e o fungo Fusarium

oxysporum colocado no centro da placa.

Foram feitas placas de controle, ou seja, com o patógeno e sem nenhum isolado, para

verificação do tempo de crescimento.

Os isolados e os patógenos foram incubados a 28°C, e observados após cinco dias,

conforme o crescimento da placa de controle, para verificação da inibição ou crescimento dos

isolados em relação ao patógeno.

Foram selecionadas bactérias das três coletas para realização deste experimento (80

bactérias da primeira coleta; 50 bactérias da segunda coleta e 120 bactérias da terceira coleta).

Para cada resultado obtido que demonstrasse reação de inibição ou crescimento ao

patógeno, foi feita uma segunda repetição e para os que deram resultados diferenciados da

primeira e da segunda repetição, foi feito um terceiro teste para a confirmação dos resultados.

4.4 Caracterização molecular das bactérias

4.4.1 Extração do DNA bacteriano

As bactérias foram crescidas em 5 mL de meio TSB 5% por 24 horas a 150 rpm. Dois mL

da cultura foram centrifugados e lavados em 500 µL tampão TE (1M de Tris-HCl pH 8 e 10M de

EDTA), novamente ressuspendidas em 500 µL tampão TE, e adicionados 30µL de SDS 10% e

pérolas de vidro (0,1mm, Sigma). As células foram rompidas por meio de agitação em

homogeneizador de células (mini bead beater, Biospect) e em seguida, foi adicionado 1 volume

de fenol, homogeneizado por inversão e centrifugado a 14000 X g por 5min. O sobrenadante foi

coletado, acrescido um volume de clorofane (fenol 1:1 Clorofórmio) e centrifugado novamente a

14000 X g por 5min. O sobrenadante foi novamente coletado e adicionado um volume de

clorofórmio e novamente centrifugado a 14000 X g por 5min. Por fim, a fase aquosa foi coletada,

adicionado 0,6 volumes de isopropanol e 20 µL de cloreto de sódio 5M, incubado a temperatura

ambiente por 5min. A suspensão foi centrifugada a 14000 X g por 5min, o sobrenadante

descartado, e o DNA lavado com etanol 70% gelado e secado a 37°C por 40 minutos. A

qualidade e quantidade do DNA foram avaliadas em gel de agarose (1%).

4.4.2 Amplificação do 16s rDNA

A técnica de PCR foi utilizada para amplificação do 16s do rDNA das bactérias endofíticas

de Cecropia sp. Para realização da técnica foram utilizados os primers R1387 (5´-

CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3´) e P027F (5´-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -

3´), os quais são específicos para o domínio Bactéria. A PCR foi realizada em um volume final de

50 µL contendo tampão da enzima 1 X, 3,75 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTPs, 0,2 µM de

cada primer, 0,1U/µL de Taq DNA Polimerase. A reação da amplificação foi realizada em

termociclador, programado para realizar uma desnaturação inicial a 94°C por 4 minutos, 35

ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 62,5°C por 1 minuto e extensão de

primers 72°C por 1 minuto, seguida de extensão final a 72°C por 10 minutos. Após a

amplificação, 5µL da reação de PCR foram avaliados por eletroforese em gel de agarose (1%)

4.4.3 Seqüenciamento do 16s rDNA

As amostras purificadas foram seqüenciadas no Laboratório de Genômica, NIB/UMC sob

responsabilidade da Profª. Dra. Regina L. C. B. de Oliveira. Para a identificação dos isolados

bacterianos, as sequências foram submetidas à consulta de similaridade de nucleotídeos por meio

do programa Blastn ("Basic Local Alignment Search Tool") (ALTSCHUL et al., 1997), para

comparação com sequências homólogas depositadas no banco de dados público mundial

GenBank (National Center for Biotechnology Information – NCBI) (BLAST, 2009). Dessa forma

foram consideradas as seqüências que apresentaram os maiores valores de similaridade.

RESULTADOS

5.1 Densidade Bacteriana

Foram realizadas três coletas de Embaúba (Cecropia sp.) durante o ano de 2008. Em cada

coleta foram selecionadas três plantas em pontos distintos do Parque e para planta selecionada

foram extraídos cinco ramos. A densidade bacteriana foi estimada em cada amostra de Cecropia

sp. coletada no parque da Serra da Cantareira. Na primeira coleta, realizada no período de março

de 2008, foi observado que a densidade bacteriana foi de aproximadamente 10

UFC por grama

de tecido vegetal fresco, e que esta densidade não variou entre as plantas amostradas. O número

de bactérias nestas amostras foi muito baixo sugerindo que esta planta hospeda um número

pequeno de bactérias cultiváveis nas condições utilizadas.

Foi observado que a densidade bacteriana em Cecropia sp. demonstrou grandes variações

entre as coletas, sendo observado uma densidade de 2,4 x10

UFC por grama de tecido vegetal.

Embora não tenha sido observada diferença significativa entre os valores de densidade

bacteriana, pode ser sugerido que a densidade bacteriana apresentou uma tendência de aumentar

nas épocas seguintes (Fig. 03), sugerindo que possa ocorrer uma pequena variação na densidade

bacteriana de acordo com a época amostrada.

Figura 3: Média da densidade bacteriana com os respectivos desvios-padrão em três épocas de coletas:

coleta 1: março de 2008, coleta 2: julho de 2008 e coleta 3: agosto de 2008, respectivamente.

5.2 Diversidade bacteriana associada à Cecropia sp.

Foi observado por meio do seqüenciamento parcial do 16S rDNA que a comunidade

bacteriana endofítica de Cecropia sp é composta por bactérias de pelo menos 5 famílias, sendo

elas Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Xanthomonadaceae, Bacillaceae e Paenibacillaceae

(Tabela 01).

Da família Pseudomonadaceae foram identificadas seis bactérias do gênero Pseudomonas.

Já da família Enterobacteriaceae foram identificados dois gêneros: Enterobacter (duas bactérias)

e Erwinia (uma bactéria). Da família Xanthomonadaceae foram identificados os gêneros

Stenotrophomonas e Dyella (apenas uma bactéria de cada), da família Bacillaceae seis isolados

de Bacillus sp e, por fim, da família Paenibacillaceae foi identificado um isolado do gênero

Paenibacillus sp (Tabela 01).

5.2.1 Diversidade bacteriana associada à embaúba

Ao nível molecular, a similaridade de seqüência pode indicar uma origem comum de

genes, ou seja, seqüências similares podem indicar relação filogenética. As análises moleculares

foram submetidas ao programa BLASTn ("Basic Local Alignment Search Tool") (ALTSCHUL

et al., 1997) para comparação com seqüências similares depositadas no banco de dados público

mundial GenBank (National Center for Biotechnology Information – NCBI) (BLAST, 2009)

(Tabela 01).

Por meio dessas comparações moleculares pode-se perceber que a comunidade bacteriana

isolada de Cecropia é composta por grupos distintos de bactérias, sendo as famílias Bacillaceae e

Pseudomonadaceae as dominantes (Tabela 01).

Tabela 1: Identificação dos isolados bacterianos endofíticos.

a Família Gênero

CP01 Bacillaceae Bacillus

CP02 Bacillaceae Bacillus

CP03 Pseudomonadaceae Pseudomonas

CP04 Pseudomonadaceae Pseudomonas

CP05 Enterobacteriaceae Enterobacter

CP06 Xanthomonadaceae Stenotrophomonas

CP07 Bacillaceae Bacillus

CP08 Bacillaceae Bacillus

CP09 Pseudomonadaceae Pseudomonas

CP11 Enterobacteriaceae Erwinia

CP12 Pseudomonadaceae Pseudomonas

CP14 Xanthomonadaceae Dyella

CP15 Enterobacteriaceae Enterobacter

CP32 Pseudomonadaceae Pseudomonas

CP33 Bacillaceae Bacillus

CP34 Bacillaceae Bacillus

CP35 Pseudomonadaceae Pseudomonas

CP36 Paenibacillaceae Paenibacillus

As identificações foram obtidas pelo banco de dados genético GenBank (BLAST, 2009) (CP:Cecropia

pachystachya).

Os isolados foram classificados até gênero, e com isso, foi observado, que os gêneros

Pseudomonas e Bacillus estão em maior freqüência no interior de Cecropia sp., sugerindo que

podem desempenhar um papel ecológico no desenvolvimento desta planta.

5.3 Produção de agentes antimicrobianos

Para caracterização da comunidade bacteriana endofítica de Cecropia sp., 408 isolados

foram coletados aleatoriamente e testados quanto à capacidade de inibir in vitro Candida

albicans, Staphylococcus aureus e Escherichia coli.

Foi observado que nenhum isolado endofítico de Cecropia sp. foi capaz de produzir

composto antimicrobiano contra C. albicans, fato este caracterizado pela ausência de halo de

inibição. Entretanto, foi observado que 1% (408 isolados no total) dos isolados foram capazes de

inibir in vitro a bactéria patogênica Staphylococcus aureus, mostrando que esta comunidade

bacteriana é capaz de inibir este importante patógeno de primatas (Fig.05). Foi observado que os

isolados capazes de inibir S. aureus foram obtidos da terceira coleta (agosto de 2008), mostrando

também que ocorreu uma variação fisiológica da população bacteriana entre as épocas

amostradas.

Figura 04. Presença de halos de inibição contra Staphylococcus aureus produzido pelos isolados

Pseudomonas sp (CP09), Pseudomonas sp (CP12) e Enterobacter sp (CP15) indicados pelas setas

(dados obtidos pelo GenBank).

Também foi observado que 1,01% (408 isolados no total) dos isolados endofíticos

avaliados foram capazes de inibir in vitro a bactéria Escherichia coli, mostrando que esta

comunidade bacteriana também é capaz de inibir esta Enterobacteriaceae patogênica à primatas

(Fig. 06). Estes isolados foram obtidos na segunda (66 isolados) e terceira (222 isolados) coletas.

Nenhum isolado foi capaz de inibir S. aureus e E. coli simultaneamente.

Figura 05. Presença de halos de inibição contra Escherichia coli produzido pelos isolados

Pseudomonas sp (CP12) e Enterobacter sp (CP15) indicados pelas setas (dados obtidos pelo

GenBank).

A capacidade destas bactérias endofíticas em inibir o fungo fitopatogênico Fusarium

oxysporum também foi avaliada. Para esta análise foram selecionados 250 isolados, sendo 80 da

primeira coleta, 50 da segunda coleta e 120 da terceira coleta (valores distintos devido à variação

bacteriana ter sido diferenciada em cada coleta). Foi observado por meio da formação de halo de

inibição (Fig. 06), que 6,13% dos isolados foram capazes de inibir este importante fitopatógeno.

A primeira imagem da Figura 06 (A) mostra somente o crescimento do Fusarium

oxysporum, no qual denominamos como controle. Já a imagem B da mesma figura mostra que

não houve inibição dos dois isolados bacterianos selecionados que foram adicionados juntamente

com o fungo. A imagem C da Figura 06 nos mostra que o isolado bacteriano número 02 inibiu o

crescimento do fungo próximo a ele, formando assim, um halo de inibição. O isolado CP01 não

mostrou o mesmo resultado de CP02. Já a imagem D da mesma figura mostra que os dois

isolados bacterianos selecionados formaram halos de inibição do fitopatógeno (isolados CP01 e

CP02), mostrando que podem apresentar potencial para utilização em campo para o controle

biológico deste fitopatógeno.

Figura 06. Observação de halos de inibição nos isolados selecionados: A: Controle; B: Sem inibição; C: Formação

de Halo de Inibição em CP02 (Bacillus sp); D: Formação de Halo de Inibição em CP01(Bacillus sp) e CP02

(Bacillus sp) (Dados de identificação obtidos pelo GenBank).

As inibições contra o fungo Fusarium sp aconteceram principalmente com os isolados

identificados como Bacillus sp (Fig.06) e Pseudomonas sp (os isolados CP03 e CP08 também

demonstraram inibição ao Fusarium sp). Esta freqüência de inibição ao fitopatógeno Fusarium

oxysporum variou de acordo com a época amostrada, visto que na população obtida da primeira,

segunda e terceira coletas, a freqüência foi de 5,83%, 13,33% e 3,33%, respectivamente.

Figura 07. Porcentagem de bactérias endofíticas capazes de inibir fungos e bactérias e patogênicas, em cada coleta

(1ªcoleta: 03/2008; 2ªcoleta: 07/2008 e 3ªcoleta: 08/2008).

6 DISCUSSÃO

Vários mecanismos estão envolvidos na promoção de crescimento das plantas por

bactérias endofíticas. Estes, porém, podem ser divididos em diretos e indiretos. Quando o

estímulo do crescimento das plantas é direto, o endófito produz fitormônios ou substâncias

análogas destes reguladores de crescimento capazes de estimular o desenvolvimento das plantas

(BASHAN e HOLGUIN,1997). Quando o estímulo é indireto, o crescimento é estimulado pela

redução da população de microrganismos deletérios ou patogênicos às plantas, ou seja, pelo

controle biológico de fitopatógenos, sendo este pelo antagonismo direto ou pela indução de

resistência sistêmica (HALLMANN et al., 1997).

Foram encontradas em plantas de Embaúba (Cecropia pachystachya) um total de

bactérias endofíticas de 2,4 x10

UFC .g

-1

de tecido vegetal. Não houve grandes variações de

densidades bacterianas ao longo das três coletas, embora essa densidade apresentou uma

tendência de aumentar nas épocas seguintes, sugerindo que possa ocorrer uma variação na

densidade bacteriana de acordo com a época amostrada.

Esse número foi obtido após o agrupamento das bactérias, levando-se em consideração

suas características macroscópicas e microscópicas. Este isolamento, provavelmente, subestima a

população total daqueles microrganismos, em termos de diversidade, uma vez que somente foram

selecionadas as bactérias capazes de se desenvolverem nos meios de cultura utilizados. Tais

limitações se aplicam à maioria dos estudos baseados em métodos baseados no cultivo, embora

estas técnicas forneçam indicações relativas da estrutura da população microbiana.

Em relação à densidade bacteriana, foi observado na primeira e na segunda coleta que foi

relativamente baixa. Esses valores, a princípio, mostraram que provavelmente essa planta

hospeda um número pequeno de bactérias cultivadas nas condições utilizadas.

Mas, na terceira coleta, pode-se perceber um valor muito mais elevado de bactérias

isoladas. Esse aumento considerável de isolados pode ter relação ao local de coleta, já que esta

última foi realizada em mata mais fechada, ou seja, sem a presença de trilhas, do que as outras.

Por ser uma região mais preservada, este último local com Embaúbas apresenta menor impacto

ambiental e, por conseguinte poderia apresentar uma maior diversidade.

As plantas constituem um complexo ecossistema onde comunidades bacterianas

interagem continuamente, competindo por nutrientes e água nos diferentes tecidos do hospedeiro.

O número de diferentes espécies e a população de uma determinada espécie dentro da

comunidade são parâmetros essenciais para definir a sua estrutura e diversidade (LIU et al.,

1997). Portanto, o conhecimento da diversidade endofítica é importante para a compreensão da

ecologia da comunidade bacteriana na planta. Este conhecimento pode ser aplicado para melhorar

a produtividade e facilitar o manejo de culturas de interesse agronômico.

No controle biológico exercido por antibiose, geralmente existe relação entre densidade

de inóculo dos biocontroladores e efetividade do controle por eles proporcionado, tanto quando

se avalia a severidade quanto a incidência da doença. Modelos linear, logístico e loglogístico já

foram utilizados para descrever tais relações (WANG et al., 2005; KIEWNICK e SIKORA,

2006), quer o controle seja exercido por fungos ou por bactérias. A não existência de correlação

positiva entre maiores quantidades do biocontrolador e a efetividade de controle é um atributo

geralmente associado à indução de resistência, quando ativada por compostos químicos

(GODARD et al.,1999; TROTEL-AZIZ et al., 2006) ou por microrganismos (LARKIN e

FRAVEL, 1999; KILIC-EKICI e YUE, 2003).

Os microrganismos podem produzir uma variedade muito grande de metabólitos tanto

primários quanto secundários, incluindo enzimas (STAMFORD et al., 1998), aminoácidos

(KLEINKAUF e VON DOHREN, 1990), vitaminas, antibióticos, pigmentos (DEMAIN, 1992),

agentes moduladores de respostas imunológicas (TRILLI et al., 1978), toxinas (BACH e

KIMATI, 1999), agentes anti-tumorais (WANG et al., 2000), fatores de crescimento de plantas

(ALEXOPOULOS e MIMS, 1996), anti-helmínticos (RODRIGUES et al., 2000) e anti-micóticos

(LI et al., 2001; LI e STROBEL, 2001).

Diversos trabalhos têm objetivado obter agentes de controle biológico potencialmente

eficientes e, para isso, um grande número de antagonistas tem sido pré-selecionado em testes de

antagonismo in vitro, em razão das dificuldades apresentadas pelos métodos de seleção realizados

em campo, como: custo, mão de obra, tempo e espaço (AMORIM e MELO, 2002; SHIOMI et

al., 2008; LUCON et al., 2009).

Dos sobrenadantes de cultura dos 658 isolados bacterianos endofíticos, selecionados para

os ensaios de antagonismo in vitro, apenas 30 (4,56%) apresentaram atividades antagônicas

contra um ou mais microrganismo-teste utilizados nestes ensaios (Figs. 05, 06 e 07), mostrando

que a freqüência deste grupo de microrganismos parece ser baixa.

A análise da produção de compostos antimicrobianos contra Candida albicans, mostrou

que independente do local e época de amostragem, nenhuma bactéria endofítica foi capaz de

inibir in vitro este patógeno humano. Entretanto, foi observado que 1,01% desta comunidade

endofítica foi capaz de inibir a bactéria Staphylococcus aureus e na mesma porcentagem essa

comunidade inibiu a bactéria Escherichia coli.

No teste de antagonismo in vitro com Fusarium oxysporum das 250 bactérias

selecionadas, 23 inibiram significativamente o crescimento micelial deste fungo. Houve inibição

ao crescimento do fungo em inúmeras placas, tanto no primeiro teste realizado como também na

repetição. Isso mostra que muitos isolados apresentaram um grau de reação maior ao fungo

Fusarium oxysporum do que com os outros patógenos.

A colônia fúngica nas proximidades das colônias bacterianas apresentou duas formas de

crescimento: numa delas havia competição entre as colônias dos microrganismos, com o fungo

evitando crescer sobre a colônia bacteriana; na outra forma, não houve qualquer inibição do

crescimento, tendo ocorrido crescimento fúngico sobre a colônia bacteriana.

De acordo com os dados obtidos, pode-se perceber que Pseudomonas sp e Bacillus sp

mostraram apresentar grandes inibições contra o fungo Fusarium sp. Segundo Melo e Valarini

(1995), Bacillus subtilis isolada do rizoplano de feijoeiro na região de Guaíra, SP, tem

demonstrado como potente antagonista contra alguns patógenos de raízes de feijoeiro, como F.

solani f. sp. phaseoli, Sclerotinia sclerotiorum e Rhizoctonia solani.

Em alguns casos os metabólitos ao invés de inibirem o crescimento das bactérias

ocasionaram sua maior propagação, fato também observado por Araújo (1996) ao realizar ensaios

de culturas pareadas entre bactérias endofíticas, isoladas de citrus, com diferentes fungos.

O antagonismo microbiano é um fenômeno complexo e a seleção de antagonistas com

base apenas em resultados in vitro não deve ser a única estratégica de seleção, por não

demonstrar boa correlação com os trabalhos de campo (GAVA, 1998). Entretanto, a detecção de

populações bacterianas capazes de produzir compostos antimicrobianos pode indicar estratégias

de interação microbiana na planta, bem como potencial aplicação biotecnológica destes

microrganismos.

O melhor conhecimento da atividade antimicrobiana das plantas, certamente propiciaria

um impulso, tanto direto como indireto, para a melhora nas condições de vida de populações de

países em desenvolvimento, considerando-se a importância das plantas medicinais, não apenas

como recurso terapêutico, mas também como fonte de recursos econômicos (DI STASI et

al.,1996).

Os gêneros Pseudomonas e Bacillus foram os mais freqüentes na comunidade bacteriana

cultivável de Cecropia sp.. Estes gêneros têm sido constantemente descritos como agentes

produtores de compostos antimicrobianos (RAAIJMAKERS et al., 2002).

De acordo com Zavala, et al. (1997), as Embaúbas possuem atividade antibacteriana in

vitro contra Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas sp, Salmonella sp e Shigella sp.

Bacillus cereus é amplamente distribuído na natureza e comumente encontrado no solo e

produz substâncias nematicidas que inativam ovos de nematóides (OKA et al., 1993). Esta

bactéria produz uma enzima colagenolítica/ proteolítica capaz de degradar as proteínas

cuticulares de estádios pré e pós-parasíticos de Meloidogyne javanica, interrompendo seu ciclo de

vida (SELA et al., 1998). Já Peer e Schippers (1989) observaram que plântulas de tomate tratadas

com o isolado de Pseudomonas sp. aumentaram tanto o crescimento das plantas quanto a

população do antagonista. Segundo os autores, a densa colonização deste isolado deslocou os

organismos deletérios ao crescimento das plantas.

Pseudomonas spp. fluorescentes são bactérias Gram-negativas e produzem um pigmento

verde-amarelado fluorescente em meio B de King et al., (1954), observado sob luz com

comprimento de onda próximo do ultravioleta. De acordo com Stanier (1969), esses organismos

podem ser encontrados na água e no solo. As espécies mais importantes desse grupo são

Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas putida, geralmente estudadas com o objetivo de avaliar

a promoção de crescimento em plantas, e Pseudomonas aeruginosa, considerada patogênica a

animais.

A diversidade metabólica de bactérias do grupo fluorescente do gênero Pseudomonas dá a

essas bactérias uma grande habilidade para adaptação a vários ambientes, tais como solo e

rizosfera.

Bactérias do gênero Bacillus são Gram-positivas e podem ser aeróbias, facultativas ou

anaeróbias. São resistentes ao calor e a outros agentes destrutivos (STANIER, 1969). Podem

oxidar uma ampla faixa de compostos orgânicos e em alguns casos são fermentativas. A maioria

delas tem exigências nutricionais simples, requerendo no máximo alguns aminoácidos ou

vitaminas B como fatores de crescimento (STANIER, 1969). Formam endósporos – característica

que as coloca entre os esporulados – e apresentam a habilidade de produzir antibiótico (FREITAS

e PIZZINATTO, 1997). A formação de endósporos aumenta a resistência aos fatores adversos.

Dessa forma, podem ser armazenados, como inoculantes, por um período mais longo, e possuem

maior tempo de permanência no solo, além da facilidade de aplicação.

De forma semelhante, Shishido et al., (1995) verificaram que isolados endofíticos de

Bacillus sp. e Streptomyces sp. estimularam o crescimento de mudas de coníferas, controlando os

patógenos responsáveis pela inibição do crescimento destas plantas.

Alguns trabalhos relatam o gênero Bacillus como a principal bactéria endofítica de

determinadas plantas (HALLMANN et al., 1997). As espécies de Bacillus mais frequentemente

citadas como endófitos são: Bacillus cereus (ARAÚJO et al., 2001), Bacillus subtilis (BAI et al.,

2002), Bacillus megaterium, Bacillus insolitus, Bacillus brevis (STURZ et al., 1998), Bacillus

pumilus e Bacillus lentus (Araújo et al., 2001), sendo encontradas nas mais diversas espécies

vegetais tais como: Zea mays L. (LALANDE et al., 1989), Gossypium hirsutum L. (MISAGHI e

DONNDELINGER, 1990), Beta vulgaris (JACOBS et al., 1985), e Solanum tuberosum

(HOLLIS, 1951).

Chanway (1997) obteve aumentos de 33% e 57% na biomassa de plântulas de pinheiro

tratadas com os isolados PW2 e SM3-RN de Bacillus polymyxa e Pseudomonas chloroaphis,

respectivamente. O autor também relatou aumentos na altura e no comprimento de raízes das

plântulas inoculadas com estes isolados variando entre 23% e 132%.

Guo et al., (1996, 2001) selecionaram os isolados de rizobactérias promotoras de

crescimento como promissores agentes de biocontrole pela combinação do halo de inibição

formado e a capacidade de crescimento nas raízes.

Os isolados Serratia sp., Pseudomonas e Bacillus sp., produtores de halo de inibição,

foram testados por Guo et al., (2004) no controle da murcha bacteriana causada por Ralstonia

solanacearum, chegando a atingir de 63,3% a 94,1% de controle e aumento da produtividade de

46,3% a 78,5%.

Medeiros et al. (2002), testando 50 isolados de bactérias endofíticas e epifíticas obtidas

de melão e outras culturas, através da bacterização de sementes, selecionou o isolado Bacillus

sp. como eficiente no controle dessa doença em condições de casa de vegetação. Visando a

proteção de plantas de melão contra a infecção no campo, plantas de meloeiro com sete dias

foram pulverizadas com isolados de Bacillus, com potencial para utilização no controle da

mancha-aquosa (MEDEIROS et al., 2003). Gaing e Gaur (1991), trabalhando com feijão,

observaram que uma estirpe de Bacillus subtilis aumentou a produção de grãos, biomassa,

absorção de P e N, em solo deficiente de P suplementado com fosfato de rocha.

A família Enterobacteriaceae também estava presente nos isolados identificados em

Cecropia sp. Foram identificados dessa família o gênero Enterobacter e Erwinia. A espécie

Enterobacter cloacae é considerada um patógeno de importantes culturas. Na década de 70 esta

espécie foi isolada de sementes de arroz sem que o seu envolvimento no processo de doenças

fosse constatado (TANII et al., 1974). Na década de 80, Coother e Dowing (1986) noticiaram a

patogenicidade da E. cloacae em cebolas armazenadas. No Brasil, a fitopatogenicidade desta

bactéria foi primeiramente observada em melões coletados na região nordeste do país (ROBBS et

al., 1995). Enterobacter cloacae é também descrita como um antagonista de Pythium sp., que

causa podridão das raizes de pepino e também aumenta a supressão do solo, em solos infectados

com Fusarium oxysporum.

Bactérias do gênero Enterobacter são também citadas como endófitos em plantas de

Citrus jambhiri (GARDNER et al., 1982), Zea mays L. (FISHER et al.,1992), Gossypium

hirsutum (MCINROY e KLOEPPER, 1995), Citrus sinensis (LACAVA et al., 2004), Citrus

reticulata (LACAVA et al., 2004), dentre outras. Entre as diferentes espécies pertencentes à

família Enterobacteriaceae, o gênero Erwinia constitui se num dos mais importantes e tem sido

relatado por diferentes autores como um dos principais contaminantes na cultura de tecidos

(LEIFERT et al., 1989; CASSELLS E TAHMATSIDOU, 1996; TANPRASERT e REED, 1998).

O gênero Erwinia foi originalmente proposto por Winslow et al, (1917) baseado na

patogenicidade das estirpes e pertence a família Enterobacteriaceae. Contêm células em forma de

bastonete, peritríquias, anaeróbias facultativas, não esporulantes, Gram-negativas, fitopatogênicas

e estão associadas às plantas causando doenças de murcha ou podem viver como saprófitas sendo

constituintes da flora epifítica do solo. Também podem causar doenças em seres humanos

(PÉROMBELON, 1992). Na última edição do Krieg e Holt, 1984, foram descritas quinze

espécies resultando numa nomenclatura bastante confusa.

Atualmente, o gênero foi renomeado para Pantoae e inclui as antigas espécies Erwinia

herbicola, Enterobacter agglomerans e Erwinia milletiae (BEJI et al., 1988) sendo que as duas

primeiras fixam nitrogênio. Os isolados clínicos são classificados como pertencentes ao gênero

Enterobacter e os isolados de plantas no gênero Pantoae (LELLIOTT e DICKEY, 1984).

A espécie Pantoea herbicola inclui várias estirpes que podem ocorrer na superfície da

planta ou em lesões. Nas lesões causadas por outras bactérias fitopatogênicas, é considerada

como um organismo secundário. Esta espécie não tem sido descrita como agente causal primário

de qualquer doença. Desta forma, é considerada como uma bactéria oportunista, podendo estar

presente também em animais, solo, água e ar (LELLIOTT e DICKEY, 1984).

Existem relatos que esta espécie poderia estar associada ao raquitismo da soqueira de

cana-de-açúcar. Testes de patogenicidade causaram, em cana inoculadas, uma descoloração

vascular semelhante àquela causada pela bactéria do raquitismo da soqueira. Desta forma, foi

considerada como integrante do complexo bacteriano associado ao raquitismo juntamente com

Xanthomonas albilineans e Pseudomonas (GALLI et al., 1980).

Segundo Krieg e Holt (1984), todas as espécies do gênero Erwinia estão associadas a

plantas, quer como patógenos (causadoras de podridão), saprófitas ou ainda constituintes da flora

epifítica. Os gêneros Xanthomonas e Pseudomonas talvez sejam os mais relatados na literatura

como contaminantes de cultivos in vitro (DUHEM et al., 1988; REED et al., 1998;

TANPRASERT e REED, 1998). O gênero Pseudomonas engloba grande número de espécies,

tanto saprófitas como patogênicas às plantas. Normalmente as bactérias pertencentes a este grupo

são móveis, aeróbicas estritas, não esporogênicas e apresentam catalase positiva (KRIEG e

HOLT, 1984).

O gênero Stenotrophomonas é citado como endófito em plantas de cana-de-açúcar e em

plantas de trigo e tem também sido relacionado com o melhor crescimento de girassóis em estufa

(FAGES e ARSAC, 1991).

Dentre os isolados identificados, foi observado que alguns isolados apresentam potencial

para o controle biológico de agentes patogênicos. Como mostrado nas figuras 06 e 07, os isolados

CP09 (Figura 06), CP12 e CP15 (Figuras 06 e 07) foram capazes de inibir os patógenos E.coli e

S.aureus.

De acordo com os dados obtidos pelo GenBank, o isolados CP09e CP12 foram

identificados como Pseudomonas sp, enquanto o isolado CP15 foi identificado como

Enterobacter

sp. Os isolados CP01 e CP02 classificados como Bacillus sp demonstraram grande capacidade de

inibição ao fitopatógeno Fusarim oxysporum.

A atuação do Fusarium é bem estudada em plantas de campo, pois este é um fungo

agressivo, responsável pela síndrome da queda dos frutos, assim como outras espécies, tais como:

Ceratocystis paradoxa, Colletotrichum gloeosporioides, Cladosporium sp., Aspergillus sp.,

Verticillium sp., Penicillium sp., Alternaria alternata e Rhizopus sp. (MOTA e GASPAROTTO,

1998).

Um experimento realizado com 62 isolados de Pseudomonas spp. fluorescentes obtidos de

diversas culturas mostrou que alguns isolados apresentaram antagonismo contra Pythium spp.,

Botrytis cinerea, Phytophthora nicotianae e Fusarium oxysporum in vitro. Os isolados de

rizosfera de morango, alface, beterraba e limão foram os que tiveram maior porcentagem de

antagonismo (SARATHCHANDRA et al., 1993).

Ainda que os testes de antagonismo in vitro nem sempre apresentem o mesmo resultado in

vivo (FREITAS e PIZZINATTO, 1991), há que defenda o seu uso, com base no fato de que a

detecção de isolados com características antagônicas eficientes poderiam facilitar uma primeira

seleção, já que freqüentemente se trabalha com um grande número de isolados (LUCON e

MELO, 1999).

Djordjevic et al. (1987) sugerem que através de um longo período de evolução, muitos

fitopatógenos tornaram-se tão compatíveis com a planta hospedeira e que, com o passar do

tempo, foram causando cada vez menos danos e possivelmente promovendo algum benefício.

Desta forma, uma bactéria pode ser fitopatogênica por um lado e benéfica por outro como, por

exemplo, por meio da fixação biológica de nitrogênio (FBN).

Os efeitos benéficos da inoculação de bactérias em plantas e sementes, com vistas à

promoção de crescimento vegetal, já estão bem discutidos e documentados (NAIK et al., 2008;

RYAN et al., 2008), embora o processo de bacterização de tecidos vegetais possa gerar efeitos

deletérios ou nulos, em relação ao desenvolvimento da planta, como mostrado por PROBANZA

et al. (1996), sobre o efeito negativo de Bacillus subtilis no comprimento da parte aérea e de

raízes de pínus (Pinus taeda L.), e de Pseudomonas fluorescens sobre o crescimento de amieiro

(Alnus glutinosa).

As bactérias endofíticas presentes em diversos vegetais, tais como a Cecropia sp podem

estar inibindo a manifestação de diversos agentes patogênicos em animais tais como os primatas,

que possuem seu hábitat natural no Parque Estadual da Cantareira, e com isso, impedindo a

manifestação de inúmeras doenças.

Na natureza, os primatas não-humanos, apresentam comportamento gregário, vivem em

bandos e alimentam-se, principalmente, de frutos, brotos, flores e insetos. Adaptam-se bem a

cativeiros, porém, em alguns casos, apresentam comportamento estereotipado, em virtude do

estresse causado pela remoção de seu hábitat, transporte, convívio com humanos, manejos e

carências alimentares. Esses fatores favorecem a ocorrência de enfermidades oportunistas, como

micoses, principalmente causadas por dermatófitos, Candida spp., Aspergillus spp. e

Cryptococcus spp. (EMMONS, 1990; KINDLOVITS, 1999).

Animais como os bugios são conhecidos como animais de difícil manutenção em cativeiro

por não adaptação a dietas e conseqüente susceptibilidade a doenças (MILTON, 1980). A

escassez de informações sobre parâmetros fisiológicos destas espécies (PORTER, 1971) acaba

limitando a possibilidade de se determinar o perfil sanitário destes animais.

O contato com o homem, com animais domésticos e sinantrópicos, e a contaminação de

alimentos têm sido relatadas como as principais fontes de infecção para primatas não-humanos

cativos (CORRÊA e PASSOS, 2001). Além disso, a mudança na dieta destes animais em

cativeiro poderia resultar em um desequilíbrio nas populações microbianas do trato intestinal,

visto que na mata, o alimento obtido pode ser uma fonte de uma diversidade microbiana mais

ampla.

As interações solo-planta-microrganismos são complexas e seus efeitos individuais são

difíceis de ser estudados. As bactérias observadas neste trabalho, nas condições em que elas

foram isoladas, podem representar um componente importante no crescimento das Embaúbas do

Parque Estadual da Cantareira, além de provavelmente estarem inibindo a ação de alguns

microrganismos patógenos.

7 CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que:

- As bactérias do gênero Bacillus, Enterobacter e Pseudomonas são espécies dominantes

no interior de Embaúba (Cecropia sp.) presentes no Parque Estadual da Cantareira;

- A densidade destas bactérias não mostrou grandes variações entre as épocas amostradas.

- A freqüência de bactérias endofíticas de embaúba capazes de inibir as bactérias

patógenas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, e os fungos Candida albicans e

Fusarium oxysporum é baixa.

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