( PDF ) Efeitos da silimarina na fase aguda da infecção experimental pelo Schistosoma mansoni

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Centro de Ciências da Saúde

Faculdade de Farmácia

Efeitos da silimarina na fase aguda da infecção

experimental pelo Schistosoma mansoni

HÍLTON ANTÔNIO MATA DOS SANTOS

Rio de Janeiro

2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Centro de Ciências da Saúde

Faculdade de Farmácia

Efeitos da silimarina na fase aguda da infecção

experimental pelo Schistosoma mansoni

HÍLTON ANTÔNIO MATA DOS SANTOS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,

Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal do

Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários

à obtenção do título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas

Orientador: Prof. Dr. Alexandre dos Santos Pyrrho

Rio de Janeiro

2010

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iii

Ficha Catalográfica

S237e Santos, Hílton Antônio Mata dos.

Efeitos da silimarina na fase aguda da infecção experimental pelo

Schistosoma mansoni/ Hilton Antônio Mata dos Santos; orientador

Alexandre dos Santos Pyrrho. – Rio de Janeiro : UFRJ, 2010.

xiv, 105f. : il. col. ; 30cm.

Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – UFRJ /

Faculdade de Farmácia, 2010.

Inclui bibliografia.

1. Esquistosomiase. 2. Silimarina. 3. Schistosoma mansoni. 4. Fibrose.

I. Pyrrho, Alexandre dos Santos. II. Título.

CDD 615.718

Este trabalho foi realizado no setor de Parasitologia do Departamento de Análises

Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de

Janeiro – UFRJ, sob orientação do professor Alexandre dos Santos Pyrrho.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Efeitos da silimarina na fase aguda da infecção

experimental pelo Schistosoma mansoni.

Hílton Antônio Mata dos Santos

Orientador: Alexandre dos Santos Pyrrho

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos

requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em

Ciências Farmacêuticas.

Aprovada em:

Orientador: Prof. Dr. Alexandre dos Santos Pyrrho

Profª. Drª. Débora Henrique da Silva Anjos

Profª. Drª. Cláudia Lúcia Martins da Silva

Profª. Drª. Suzana Guimarães Leitão

Prof. Dr. Mauro Sola Penna

Profª. Drª. Helena Keiko Toma

Aos meus pais, Sayonara e Hilton, e a

minha irmã Taís, sinônimos de amor e

companheirismo.

vii

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Alexandre dos Santos Pyrrho, pelo exemplo de profissional, pela dedicação,

ensinamento, orientação e oportunidades concedidas;

Ao Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues, pela confiança;

À Profª. Dr. Cláudia Paiva Lima, pela valiosa colaboração, orientação e apoio;

À Profª. Dr. Morgana Castelo Branco, pela dedicação e colaboração;

À Profª. Virginia Frota, pelo excepcional direcionamento;

Aos companheiros de laboratório Epitácio Souza Lima, Carolina Carneiro Rocha,

Fabiana Gonçalves Lino, Letícia Campos da Costa, Pedro Maia Coutinho, Taissa

Mendes, Carina da Silva Souto, Marcella Bade e Cyntia Pereira Marques Rangel pelo

apoio, incentivo, amizade e colaboração na realização deste trabalho.

À minha querida e amada madrinha Vera Regina Mata de Souza, pela sua grandiosa

presença em ocasiões inesquecíveis;

À minha vó Ana Benites dos Santos, que em muitos dias nublados fez o sol aparecer;

À minha vó Maria José Vidal Mata, pela luz viva que me ilumina “in memoriam”;

À Marcella Benchimol Echeverria, pelo amor, tolerância e paciência infinita;

Que o meu bom Deus conceda a todos amor, saúde e paz.

viii

Cresci ouvindo meus pais dizendo...

– Totonho, o cavalo passa para todos...

“O pessimista queixa-se do trote do cavalo;

O otimista espera que ele mude;

O realista se prepara com suas botas e esporas.”

(adaptado de William George Ward)

Agradeço às dificuldades que enfrentei, pois através delas aprendi que a maior alegria

está em cada obstáculo superado.

RESUMO

Na esquistossomíase, o processo inflamatório granulomatoso, reacional à deposição dos

ovos no tecido hepático e a subsequente fibrose, é crucial no curso clínico da infecção. Os

fatores que levam à fibrose perivascular ainda não foram plenamente esclarecidos. Fármacos

imunomodulatórios e antifibróticos, tal como a silimarina, podem favorecer o

desenvolvimento de um curso mais ameno das alterações patológicas provocadas na

esquistossomíase, de modo a proporcionar subsídios para a elaboração de novas estratégias de

controle e suporte desta infecção. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da

silimarina sobre a patogênese da infecção aguda experimental murina pelo Schistosoma

mansoni, avaliando-se as vias de administração oral e intraperitoneal, as doses de 2, 10, e 50

mg/kg, nos intervalos de 24 e 48 horas e o número de inoculações. Foi observado ainda que a

administração de silimarina pela via intraperitoneal não promove o comprometimento na

curva ponderal e na taxa de sobrevivência deste modelo experimental. A análise dos

resultados obtidos indica que o tratamento com silimarina leva a uma redução do processo

granulomatoso periovular e uma redução de aproximadamente 30% da fibrose hepática. Os

grupos de animais tratados com as doses de 2 e 10 mg/kg, nos intervalos de 24 e 48 horas,

respectivamente, apresentaram redução da hepatomegalia, do infiltrado granulomatoso

periovular e da fibrose hepática sugerindo uma menor morbidade. Estas reduções foram ainda

mais significativas com o prolongamento do tratamento. Os resultados obtidos são pertinentes

à avaliação da fase aguda da esquistossomíase mansônica e sugerem um papel relevante da

silimarina nesta infecção.

ABSTRACT

In schistosomiasis, granulomatous inflammatory process, reactive deposition of eggs in

liver tissue and subsequent fibrosis, is crucial in the clinical course of infection. Factors

leading to perivascular fibrosis are not yet fully understood. Immunomodulatory and

antifibrotic drugs, such as silymarin, may favor the development of a milder course of the

pathological changes induced in schistosomiasis, in order to provide subsidies for the

development of new strategies to control and support of this infection. This study aimed to

evaluate the effect of silymarin on the pathogenesis of acute murine experimental

Schistosoma mansoni infection, evaluating the oral and intraperitoneal doses of 2, 10, and 50

mg / kg, at 24 or 48 hours intervals and the different number of inoculations. Moreover, it was

observed that administration of silymarin intraperitoneally does not promote commitment to

weight curve and survival rate in this model. The results obtained indicate that treatment with

silymarin led to a reduction of the granulomatous periovular process and a reduction of

approximately 30% of liver fibrosis. The groups of animals treated with 2 and 10 mg / kg

doses, at intervals of 24 and 48 hours respectively, showed reduction of hepatomegaly,

reduction of granulomatous infiltrate periovular and reduction of liver fibrosis suggesting a

lower morbidity. These alterations were even more significant with prolonged treatment. The

results are pertinent to acute phase of schistosomiasis mansoni and suggest a relevant role of

silymarin in this infection.

ABREVIAÇÕES

ALT Alanina aminotransferase

AST Aspartato aminotransferase

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

CMC Carboximetilcelulose

d Dia

D Doses (número de inoculações)

DPI Dias pós-infecção

HSC Célula estrelada hepática (Hepatic stellate cell)

ICAM Molécula de adesão intercelular (Intercellular adhesion molecule)

IFN Interferon

IL Interleucinas

iNOS Óxido-nítrico sintase induzível

ip Intraperitoneal

Leg Legalon

NF-κB Fator nuclear kappa B (Nuclear factor kappa B)

SEA Antígeno solúvel do ovo (Soluble egg antigen)

Sil Silimarina

TGF Fator de transformação do crescimento

TH Linfócito T auxiliar (Helper)

TNF Fator de necrose tumoral (Tumor necrosis factor)

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 - Distribuição geográfica dos hospedeiros intermediários de S. mansoni.................3

Figura 2 - Ciclo biológico do parasito S. mansoni.................................................................5

Figura 3 - Distribuição da esquistossomose mundial.............................................................7

Figura 4 - Áreas de transmissão da esquistossomose no Brasil..............................................8

Figura 5 - Estrutura química dos principais componentes da silimarina...............................18

Figura 6 - Desenho do primeiro lote experimental...............................................................27

Figura 7 - Desenho do segundo lote experimental...............................................................30

Figura 8 - Desenho do terceiro lote experimental................................................................32

Figura 9 - Desenho do quarto lote experimental..................................................................34

Figura 10 - Modelo da avaliação do infiltrado inflamatório granulomatoso periovular........36

Figura 11 - Curva ponderal (1º Lote)..................................................................................39

Figura 12 - Curva de sobrevivência (1º Lote)......................................................................40

Figura 13 - Ovos no tecido hepático (1º Lote).....................................................................41

Figura 14 - Índices fígado e baço (1º Lote)..........................................................................42

Figura 15 - Curva ponderal dos grupos Normais e Infectados (2º Lote)...............................44

Figura 16 - Curva de sobrevivência (2º Lote)......................................................................45

Figura 17 - Ovos no tecido hepático (2º Lote).....................................................................46

Figura 18 - Índices fígado e baço (2º Lote)..........................................................................47

Figura 19 - Área dos granulomas hepáticos (2º Lote)..........................................................48

Figura 20 - Dosagem de hidroxiprolina (2º Lote)................................................................49

Figura 21 - Curva ponderal (3º Lote)...................................................................................51

Figura 22 - Curva de sobrevivência (3º Lote)......................................................................52

Figura 23 - Ovos no tecido hepático (3º Lote).....................................................................53

Figura 24 - Índices fígado e baço (3º Lote)..........................................................................54

Figura 25 - Área dos granulomas hepáticos (3º Lote)..........................................................55

Figura 26 - Dosagem de hidroxiprolina (3º Lote)................................................................56

Figura 27 - Curva ponderal (4º Lote)...................................................................................58

Figura 28 - Curva de sobrevivência (4º Lote)......................................................................59

Figura 29 - Ovos no tecido hepático (4º Lote).....................................................................60

Figura 30 - Índices fígado e baço (4º Lote)..........................................................................61

Figura 31 - Área dos granulomas hepáticos (4º Lote)..........................................................62

xiii

Figura 32 - Dosagem de hidroxiprolina (4º Lote)................................................................63

xiv

ÍNDICE

RESUMO.............................................................................................................................ix

ABSTRACT...........................................................................................................................x

INTRODUÇÃO.....................................................................................................................1

O Parasito.......................................................................................................................2

Aspectos Epidemiológicos..............................................................................................6

Alterações patológicas....................................................................................................9

Granuloma.....................................................................................................................11

Papel da Imunidade........................................................................................................13

Silimarina......................................................................................................................17

OBJETIVOS.........................................................................................................................22

MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................................23

Fármaco.........................................................................................................................23

Inoculações via oral.......................................................................................................23

Inoculações via intraperitoneal.......................................................................................23

Esterilidade dos materiais...............................................................................................24

Camundongos/Grupos....................................................................................................24

Infecção.........................................................................................................................25

Peso dos camundongos..................................................................................................25

Primeiro Lote experimental.......................................................................................25

Segundo Lote Experimental......................................................................................27

Terceiro Lote Experimental.......................................................................................30

Quarto Lote Experimental.........................................................................................33

Eutanásia.......................................................................................................................35

Pesagem dos órgãos.......................................................................................................35

Quantificação de ovos nos tecidos..................................................................................35

Processamento histológico.............................................................................................35

Dosagem de hidroxiprolina hepática..............................................................................36

Avaliação estatística.......................................................................................................37

RESULTADOS....................................................................................................................38

Primeiro Lote Experimental (administração oral)...........................................................38

Percentual do peso corporal dos camundongos..........................................................38

Curva de sobrevivência.............................................................................................39

Distribuição de ovos nos tecidos................................................................................40

Média do peso dos Órgãos.........................................................................................41

Segundo Lote Experimental (administração intraperitoneal)...........................................42

Percentual do peso corporal dos camundongos..........................................................43

Curva de sobrevivência.............................................................................................45

Distribuição de ovos nos tecidos................................................................................45

Média do peso dos Órgãos.........................................................................................46

Dados Histopatológicos.............................................................................................48

Dosagem de hidroxiprolina........................................................................................49

Terceiro Lote Experimental (administração intraperitoneal)...........................................50

Percentual do peso corporal dos camundongos..........................................................50

Curva de sobrevivência.............................................................................................51

Distribuição de ovos nos tecidos................................................................................52

Média do peso dos Órgãos.........................................................................................53

Dados Histopatológicos.............................................................................................55

Dosagem de hidroxiprolina........................................................................................56

Quarto Lote Experimental (administração intraperitoneal).............................................57

Percentual do peso corporal dos camundongos..........................................................57

Curva de sobrevivência.............................................................................................58

Distribuição de ovos nos tecidos................................................................................59

Média do peso dos Órgãos.........................................................................................60

Dados Histopatológicos.............................................................................................61

Dosagem de hidroxiprolina........................................................................................62

DISCUSSÃO........................................................................................................................64

CONCLUSÃO......................................................................................................................74

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................75

ANEXO I – Submissão do trabalho em periódico de circulação internacional.......................90

INTRODUÇÃO

A esquistossomíase é uma doença milenar. O caso mais antigo desta parasitose foi

identificado, por imunodiagnóstico, em uma múmia egípcia que viveu a mais de cinco mil

anos (DEELDER et al., 1990). As especulações quanto aos estudos filogenéticos do gênero

Schistosoma são controversas já que a ausência de fósseis dificulta estabelecer sua origem

(MORGAN et al., 2001). Porém, há um consenso de que a espécie S. mansoni só foi

introduzida nas Américas durante o tráfego de escravos da África (DESPRES, IMBERT-

ESTABLET e MONNEROT, 1993).

Embora existam registros de junho de 1847 escritos pelo japonês Yoshinao Fujii

descrevendo a sintomatologia da esquistossomíase (TANAKA e TSUJI, 1997), as primeiras

observações científicas sobre o agente etiológico desta infecção ocorreram apenas em 1851,

por Theodor Bilharz (TAN e AHANA, 2007). Somente a partir da década de 50, do século

XX, houve um crescimento exponencial sobre os estudos destes parasitos. Mesmo com

projetos de controle bem sucedidos a esquistossomíase permanece sendo uma das mais

prevalentes infecções parasitárias. Afeta, atualmente, cerca de 200 milhões de pessoas no

mundo (WHO, 2009a), dos quais 120 milhões apresentam a forma sintomática e 20 milhões a

forma grave (CHITSULO et al., 2000) e é considerada a segunda doença parasitária em

mortalidade, precedida apenas pela malária (WHO, 2009b). Esta infecção é responsável por

uma mortalidade anual de aproximadamente 100.000 pessoas (WHO, 1997), podendo chegar

a 250.000 (SAMUELSON e VON LICHTENBERG, 1999). Além disso, estima-se que 700

milhões de pessoas vivam em área de risco de infecção (WHO, 2009a).

A melhoria na eficiência terapêutica dos agentes esquistossomicidas e o avanço

simultâneo dos métodos de diagnósticos proporcionou uma redução da morbidade desta

infecção. Contudo, com a expansão das áreas endêmicas e focos com elevados índices de

reinfecção estimularam os clínicos a realizarem tratamento de grupos de alto risco sem

diagnóstico individual prévio (WHO, 2002), permitindo ao verme uma suscetibilidade menor

– tolerância e resistência – às drogas parasiticidas (FALLON e DOENHOFF, 1994). Por esta

razão, apesar de ser considerada uma doença negligenciada, há justificativa para maiores

investimentos na descoberta de fármacos que possam atuar de forma profilática e

principalmente atenuadora das alterações patológicas (curativa), visto que, as sequelas

individuais já estabelecidas regridem muito lentamente, provocando um grande impacto social

por levar a morbidade de significativa parcela da população na idade produtiva.

O desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento das enfermidades que

acometem o homem depende direta ou indiretamente de recursos naturais. A avaliação

biológica de extratos de plantas na esquistossomose pode revelar novos medicamentos para

terapêutica desta infecção. A silimarina, um composto do Milk Thistle, é utilizada como

remédio para o tratamento de injúrias hepática há quase 200 anos (KVASNICKA et al.,

2003). Suas atividades antioxidante, hepatoprotetora, hepatoregeneradora, imunomodulatória

e antifibrótica podem favorecer o desenvolvimento de um curso mais ameno nas alterações

patológicas provocadas pela esquistossomíase, tornando assim, o uso deste fitoterápico

relevante nesta infecção.

O Parasito

As esquistossomíases, conhecidas também como esquistossomoses ou bilharzioses, são

doenças causadas por parasitos pertencentes ao filo Platelmintos, da classe Trematoda

(Digenea). Sua família Schistosomatidae distingue-se dos outros Digenea por apresentar sexos

separados e, na subfamília, acentuado dimorfismo sexual.

Das espécies adaptadas ao homem, todas do gênero Schistosoma, as mais comuns são –

S. mansoni, S. japonicum, S. haematobium – sendo as espécies S. intercalatum e S. mekongi

menos frequentes, já que tem áreas de distribuição mais restritas e ocasionalmente infectam o

homem. As localizações geográficas das espécies destes parasitos estão condicionadas a

distribuição de determinados gêneros de moluscos, onde cada uma das 3 principais espécies

de parasitos adaptadas ao homem, além de apresentarem características morfológicas e

fisiológicas peculiares, têm um gênero de molusco distinto como hospedeiro intermediário.

Sendo esta uma das justificativas para a presença, no hemisfério ocidental, apenas da espécie

S. mansoni, que tem como hospedeiro intermediário moluscos pulmonados do gênero

Biomphalaria. Este gênero de molusco vive em água doce, fator responsável pela alta

prevalência da infecção principalmente nas regiões tropicais, onde a utilização desta água é de

grande importância para populações locais. A Figura 1 ilustra a distribuição geográfica das 3

espécies reconhecidas como hospedeiras intermediárias de S. mansoni na América do Sul.

Figura 1 - Distribuição geográfica dos hospedeiros intermediários de S. mansoni.

Extraído e adaptado de Paraense (2001).

Os helmintos da espécie Schistosoma mansoni, única do gênero de interesse sanitário

nas Américas, apresentam características que permitem perfeita identificação. O macho mede

aproximadamente 1 cm de comprimento por 0,11 cm de largura é de cor branca e achatado

dorsoventralmente; já a fêmea têm corpo cilíndrico, são mais longas (1,4 cm) e mais finas

(0,016 cm), sua coloração mais escura se deve a maior presença no tubo digestivo de

hemozoína – pigmento derivado da digestão do sangue. Estes vermes se fixam as paredes dos

vasos sanguíneos através de um par de ventosas e apresentam uma sobrevida longa, em média

5 anos, entretanto, existem relatos de indivíduos que mesmo estando fora de áreas endêmicas

por mais de 30 anos ainda possuem o parasito e eliminam ovos (MCKERROW e SALTER,

2002; REY, 2008).

O ciclo biológico do parasito, ilustrado na Figura 2, é complexo e constituído por cinco

estágios (além do ovo) – miracídio, esporocisto, cercária, esquistossômulo e verme adulto

(macho e fêmea). Os casais adultos de S. mansoni vivem preferencialmente nas vênulas do

plexo hemorroidário e ramificações mesentéricas, local onde as fêmeas depositam

aproximadamente 300 ovos/fêmea/dia. Eventualmente alguns destes ovos são carreados pela

corrente circulatória para os espaços intra-hepáticos, enquanto outros ficam aderidos ao

endotélio dos vasos, onde sofrem um processo de “migração” em direção a luz intestinal.

Após 6 ou 7 dias os ovos, que já possuem uma larva evoluída no seu interior denominada

miracídio, atingem a luz intestinal e são eliminados nas fezes. Quando estes ovos entram

indevidamente em contato com coleções de água doce, os miracídios eclodem e buscam

ativamente se aderir e penetrar, com o auxílio de estruturas específicas, no molusco do gênero

Biomphalaria seu hospedeiro intermediário. A invasão neste caramujo pode ocorrer em

qualquer ponto do tegumento e o processo dura de 3 a 15 minutos (REY, 2008). No interior

do molusco, o miracídio perde seu revestimento epitelial ciliado e sofre reorganização celular,

perdendo totalmente seu aspecto anterior ao se transformar em uma estrutura sacular alongada

– esporocisto primário – que dá origem a esporocistos filhos. Estes esporocistos são repletos

de células germinativas em constante multiplicação que se diferenciam para formar um novo

tipo de larva, as cercárias. Estima-se que um único miracídio possa produzir até 200.000

cercárias, todas do mesmo sexo, embora as cercárias não apresentem órgãos genitais

característicos nesta fase (RAGHUNATHAN e BRUCKNER, 1975). Depois de 34-40 dias, as

cercárias abandonam de modo intermitente o molusco infectado, preferencialmente nas horas

mais claras do dia, e mediante a agitação de sua cauda nadam ativamente com o intuito de

localizar e penetrar na pele do hospedeiro definitivo. No processo de penetração, que não

ultrapassa 15 minutos (CUNHA, 1970), as cercárias perdem sua cauda bifurcada

(MCKERROW e SALTER, 2002) e após algumas horas passam por processos de alterações

bioquímicas e morfológicas específicas para se adaptarem ao aumento na temperatura e na

osmolaridade do novo ambiente – hospedeiro definitivo (STIREWALT, 1974) – o parasito

que passa a não mais suportar a água se transforma em esquistossômulo (MCLAREN, 1980) e

permanece na derme ou tecido conjuntivo por dois ou três dias, até atingirem a corrente

circulatória e passivamente serem carreados para o coração direito, de onde são bombeados

para o pulmão (REY, 2008). Durante a fase intrapulmonar, os esquistossômulos sofrem

maturação para, posteriormente atingirem o coração esquerdo, e deslocarem-se para o sistema

vascular intra-hepático, onde há um desenvolvimento acelerado do verme, possivelmente

pelos altos níveis de nutrientes no sangue porta-hepático (KHAMMO et al., 2002). Na

terceira semana após a infecção, ocorre o acasalamento – condição necessária para a

maturação das fêmeas – e a migração dos parasitos para as veias mesentéricas, completando-

se o ciclo biológico após a total maturação dos vermes e início da oviposição (MONE e

BOISSIER, 2004).

Figura 2 - Ciclo biológico do parasito S. mansoni.

Extraído e adaptado de Ross e colaboradores (2002).

Aspectos Epidemiológicos

As alterações na distribuição das áreas endêmicas, nos últimos cinquenta anos, não

diminuiu o número de pessoas infectadas e o potencial de disseminação da esquistossomíase

(SAVIOLI et al., 1997), tornando-a uma das parasitoses mais prevalentes (CHITSULO et al.,

2000). Estimativas recentes sugerem que o gênero Schistosoma expõe 700 milhões de pessoas

ao risco permanente de infecção (WHO, 2009a), sendo mais frequente em localidades com

deficiência de saneamento básico, o que obriga indivíduos de baixo poder aquisitivo à vida

insalubre, pela falta de escolha e disponibilidade de fontes de águas seguras para fins

recreativos, domésticos ou profissionais (HAGAN, NDHLOVU e DUNNE, 1998).

A distribuição geográfica da esquistossomose é ampla (Figura 3), afetando 74 países

distribuídos nas Américas, África, Oriente Médio, Filipinas e Sudoeste Asiático (WHO,

1997). O aumento ou a introdução da esquistossomose em novas áreas pode estar relacionado

com o crescimento populacional, o desenvolvimento de recursos hídricos para a irrigação ou

para produção de energia hidrelétrica (TALAAT et al., 1999), juntamente com o aumento das

dimensões das áreas colonizadas pelos moluscos suscetíveis. Nas Américas, o Brasil é

considerado um dos maiores focos endêmicos da parasitose, não somente pelo número de

enfermos, mas também pela gravidade apresentada por alguns deles.

As áreas de distribuição da esquistossomíase no Brasil localizam-se principalmente em

regiões onde a população é predominantemente de baixo poder aquisitivo (Figura 4). Muitos

fatores parecem condicionar a expansão desta parasitose, como as condições de vida das

populações e até mesmo o incentivo político-econômico na utilização de recursos hídricos na

construção de represas para a produção de energia hidrelétrica, que além de possibilitar o

desenvolvimento do molusco vetor da esquistossomose, facilita a população na utilização

dessas águas, não só para atividades de lazer e para as atividades econômicas como a

agricultura, a irrigação e a pesca, mas também na utilização destas águas para eliminação

dejetos. No entanto, a identificação de casos autóctones nas grandes cidades brasileiras chama

atenção para a urbanização da doença (KATZ e PEIXOTO, 2000), que pode ter origem

através da migração de pessoas infectadas para áreas sem condições de saneamento básico.

Figura 3 - Distribuição da esquistossomose mundial

Extraído: WHO, 2009

Na tentativa de avaliar a necessidade potencial de drogas anti-esquistossomótica foi

feito um levantamento, na década de 80, para calcular a prevalência da população infectada

pelo Schistosoma. Destas estimativas o Brasil apresenta 7 milhões de pessoas infectadas

(UTROSKA et al., 1989), e o risco de infecção esquistossomótica nesta população é maior do

que muitos países da África, sendo de 42,73 milhões de pessoas (WHO, 2009b).

Os relatórios divulgados pelos Comitês de Especialistas da Organização Mundial da

Saúde (WHO, 2002) recomendam que para o controle da morbidade deve-se realizar o

tratamento de grupos de alto risco sem diagnóstico individual prévio, esta estratégia

possibilitou ao Programa Especial de Controle da Esquistossomose (PECE) uma possível

redução na prevalência da infecção em áreas endêmicas, mas não do número de indivíduo

infectados, uma vez que ocorreu um grande crescimento populacional (KATZ e PEIXOTO,

2000).

Figura 4 - Áreas de transmissão da esquistossomose no Brasil

Extraído: Rey (2001). Fonte: FUNASA

Por tanto, com as atividades de controle aparentemente ineficazes, embora bem

elaboradas (FERREIRA e COUTINHO, 1999), juntamente com o avanço dos conhecimentos

moleculares e imunológicos, há o direcionamento das pesquisas para o desenvolvimento de

vacinas contra a esquistossomose, apesar da inexistência de resultados satisfatórios.

O tratamento periódico, nas regiões endêmicas, durante a infância, parece ser um

caminho adequado, por provocar uma redução na morbidade hepática e possibilitar a

diminuição das diferenças sociais intra e inter-regionais, uma vez que a infecção

esquistossomótica pode comprometer o desenvolvimento físico e cognitivo, prejudicando o

desempenho escolar.

No entanto, a quimioterapia preventiva com agentes esquistossomicidas pode induzir a

tolerância em cepas de Schistosoma, como demonstrado por (ROGERS e BUEDING, 1971).

Desta maneira, além da necessidade de medidas que impliquem na melhoria do contexto

social e econômico, como habitações, educação e investimento no saneamento, há também a

necessidade em buscar produtos que possam atuar na reversão das lesões já ocasionadas,

levando assim a redução da morbidade hepática.

Alterações patológicas

A infecção por S. mansoni pode produzir alterações anatomopatológicas. Na maioria

dos indivíduos, geralmente assintomática, a fase aguda é chamada de forma toxêmica ou febre

de Katayama, enquanto a fase crônica, associada com hepatoesplenomegalia e hipertensão

portal, classifica-se em forma hepatointestinal e forma hepatoesplênica intestinal

(compensada e descompensada).

A evolução e sintomatologia do processo patológico, no hospedeiro definitivo,

dependem de uma série de fatores, entre os quais se devem levar em consideração a cepa do

parasito (ANDRADE e SADIGURSKY, 1985), a carga parasitária infectante (CHEEVER,

1968b), o número de reinfecções (SANTOS, DE SOUZA e ANDRADE, 2000), o estado

nutricional (ORSINI et al., 2001), a idade (RICHTER, 2003) e o estado imunológico do

hospedeiro (DAVIES e MCKERROW, 2003).

Após a penetração das cercárias em indivíduos que entraram em contato com águas

contaminadas, pode-se ter início uma reação inflamatória cutânea, hipersensibilidade

imediata, caracterizada por manchas avermelhadas devido a dilatação das arteríolas e

capilares, caracterizando muitas vezes o primeiro estágio de sintomatologia da fase aguda,

com intumescimento e prurido – dermatite cercariana. A resistência dos esquistossômulos a

ação dos anticorpos específicos, deve-se provavelmente a capacidade da membrana

tegumentar do parasito de camuflar sua atividade antigênica através da adsorção de uma

grande variedade de proteínas como antígenos eritrocíticos, imunoglobulinas (GOLDRING et

al., 1976; YONG e DAS, 1983) e fragmentos celulares do hospedeiro. Estes esquistossômulos

atingem os pulmões ainda na primeira semana de infecção e podem desencadear tosse seca,

anorexia, sudorese e astenia (NEVES, DA LUZ e TONELLI, 1966). Muitas vezes estas

reações são assintomáticas até o início da fase de postura dos ovos, que são os agentes

responsáveis por desencadear as maiores alterações patológicas no hospedeiro.

Foi demonstrado, em camundongos BALB/c e C57Bl/6, que a capacidade de oviposição

diária das fêmeas de S. mansoni corresponde respectivamente a 315 e 340 ovos/fêmea/dia

(CHEEVER, MACEDONIA et al., 1994). Estima-se que aproximadamente 50 % dos ovos

eliminados pelas fêmeas cheguem à luz intestinal, sendo os demais carreados pela circulação

portal e retidos nos tecidos provocando um processo inflamatório peculiar denominado reação

granulomatosa (WARREN, 1978). Por esta razão, a patologia da infecção, mais

frequentemente, advém da patogenicidade dos ovos que desencadeiam alterações nos tecidos

onde se encontram, em especial no fígado. Inicialmente, tem-se a formação dos granulomas,

representados por um infiltrado inflamatório celular que circundam os ovos individualmente

devido a resposta imunológica do sistema do hospedeiro aos antígenos liberados pelos ovos

de S. mansoni. Estas estruturas aproximadamente esféricas são constituídas por uma

heterogeneidade de células dispostas em uma matriz extracelular rica principalmente em

colágenos (I e III), proteoglicanas, fibronectina, vitronectina, laminina, tenascina e fibras

elásticas (LENZI et al., 1991).

Contudo, em relação as alterações hepáticas, estas parecem não decorrer apenas do

processo granulomatoso, mas também da liberação de substâncias hepatotóxicas produzidas

pelos ovos do parasito (AMIRI et al., 1992). As manifestações clínicas nesta fase inicial são

dominadas por prostração, cefaléia, leucocitose acompanhada de eosinofilia, diarréia

característica com presença de muco e sangue, anorexia, dor abdominal, podendo ainda

evoluir para uma síndrome febril aguda eosinofílica denominada de febre Katayama. Estes

sintomas frequentemente desaparecem após cerca de 120 dias (MONTENEGRO et al., 1999).

As distribuições dos granulomas periovulares nas ramificações terminais mais finas da

veia porta, geralmente caracterizam uma infecção leve (ANDRADE e PRATA, 1963). Porém

a distribuição destes granulomas em regiões periportais denota uma infecção mais grave, que

é acompanhada pela simultaneidade do processo inflamatório e pelo depósito contínuo dos

ovos, tornando-se elevado o número de granulomas, principalmente na fase crônica da

infecção.

Na forma avançada da esquistossomíase, caracterizada pela fibrose hepática, pode haver

coalescência das zonas de fibrose que ocupam extensas áreas. Dessa forma, as áreas

fibrosadas ao longo dos vasos hepáticos podem levar a uma fibrose perivascular, dita

pipestem, conhecida como fibrose de Symmers (BOGLIOLO, 1957). Ocorrem então lesões

destrutivas e obstrutivas no sistema vascular venoso, caracterizadas pela diminuição da luz

e/ou da elasticidade dos vasos intra-hepáticos afetados, desencadeando um consequente

aumento da pressão da veia porta com possíveis alterações hiperplásicas e/ou hipertróficas nas

estruturas arteriais e biliares. A agressão que sofre a veia porta na esquistossomose provoca a

hipertensão portal, tortuosidade vascular, circulações colaterais e varizes esofagianas, além de

outras alterações que comprometem o indivíduo infectado. Eventualmente, estas varizes

esofagianas (ou gástricas) se rompem provocando hemorragias maciças, responsáveis por um

número considerável de óbitos (ANDRADE, 2009).

O aumento do volume do baço é um componente importante no decorrer da infecção

esquistossomótica. Na fase aguda a esplenomegalia deve-se a proliferação das linhagens

celulares linfocítica e mononuclear fagocítica; contudo, na fase crônica este aumento do órgão

tem como origem a congestão passiva decorrente da hipertensão portal (KELNER, 1992).

Além disso, tem-se observado dilatações congestivas nos seios venosos e espessamento difuso

dos cordões esplênicos que acabam formando inúmeras fístulas entre arteríolas e vênulas

intra-esplênicas, favorecendo assim, a sobrecarga sanguínea no sistema porta, vindo sob alta

pressão, quase que diretamente da artéria esplênica (FREITAS et al., 1999). O espessamento

dos cordões esplênicos deve-se ao aumento dos componentes da matriz extracelular, com a

presença de colágeno tipo IV e laminina (FREITAS et al., 1999).

A infecção esquistossomótica provoca no intestino, inflamação, hiperplasia, ulceração,

microabscessos, alterações na inervação e vasculatura intestinal, podendo desencadear

alterações funcionais (VARILEK et al., 1991). A deposição maciça de ovos em uma mesma

região pode estimular a formação de lesões tumorais no interior da cavidade abdominal, com

extensa fibrose (BICALHO, 1978). Em geral as lesões situam-se no intestino grosso e reto

(GRYSEELS et al., 2006).

O desenvolvimento de circulação colateral pela intensa fibrose hepática e a hipertensão

portal, pode culminar na anastomose porta-cava, facilitando o transporte dos ovos para outros

órgãos (ANDRADE, 2009). Frequentemente estes ovos atingem os pulmões, provocando

aglutinação de plaquetas, formação de granulomas, trombos intravasculares e necrose dos

vasos (REY, 2008). Esta pneumopatia esquistossomática pode provocar hipertensão pulmonar

e consequentemente hipertrofia e insuficiência cardíaca (cor pulmonale).

Outros órgãos podem ser afetados nesta infecção. Há indicações de que a incidência

global de glomerulopatía na esquistossomíase varia entre 5 e 6%, podendo atingir 15% dos

pacientes na forma hepatoesplênica (VAN VELTHUYSEN, 1996). Acredita-se que a

presença de circulações colaterais promovem a incapacidade dos macrófagos e das células de

Kupffer, no ambiente hepática, de capturarem antígenos derivados dos vermes ou dos ovos

(BRITO et al., 1999). Estas circulações colaterais promovem o desvio dos antígenos para a

circulação geral que se depositam principalmente na região mesangial dos glomérulos.

Granuloma

A esquistossomíase é uma doença causada predominantemente pela resposta imune do

hospedeiro aos ovos dos helmintos e as reações granulomatosas que o envolvem. O

granuloma que se desenvolve ao redor dos ovos, é decorrente da eliminação de antígenos do

miracídio, denominados genericamente de SEA (Soluble egg antigens – Antígenos solúveis

do ovo). Estes antígenos são liberados pelo ovo e estimulam células específicas (HANG,

WARREN e BOROS, 1974; WYLER, WAHL e WAHL, 1978), favorecendo assim, a

formação de um infiltrado de células inflamatórias ao redor dos ovos (BOROJEVIC e

GRIMAUD, 1980; BOROS, 1989). As reações granulomatosas destroem os ovos e

sequestram e/ou neutralizam os seus diversos antígenos patógenicos, além disso, estimulam a

fibrogênese no tecido do hospedeiro (WILSON et al., 2007). Majoritariamente a patologia se

desenvolve nos locais de maior acumulação de ovos, intestino e fígado. No entanto a

gravidade da doença fibro-obstrutiva crônica depende diretamente da intensidade e duração da

infecção, já que estes fatores determinam a quantidade de antígenos liberados pelos ovos

(BURKE et al., 2009).

Experimentalmente a infecção pelo S. mansoni vem sendo amplamente estuda em vários

modelos de animais. As observações histopatológicas quanto a resposta granulomatosa em

torno dos ovos se desenvolve em cinco estágios: granuloma de reatividade fraca, exsudativo,

exsudativo-produtivo, produtivo e estágio involutivo (HURST, WILLINGHAM e

LINDBERG, 2000).

O estágio de reatividade fraca é caracterizado pela acumulação gradual de células

mononucleares, neutrófilos e eosinófilos, ao redor dos ovos recém depositados. Este primeiro

aporte celular leva a formação de microabscessos neutrofílicos característicos da fase

exsudativa (BURKE et al., 2009). O surgimento de histiócitos e células epitelióides na

periferia do granuloma, substituindo gradualmente as zonas leucocitárias, representam o

estágio exsudativo-produtivo, havendo nesta etapa a interação de fibrócitos ao redor dos

granulomas. A degeneração e desintegração dos ovos caracterizam a fase produtiva, onde os

fibrócitos e as fibras de colágeno tornam-se mais proeminentes, formando-se ainda uma zona

mais periférica de linfócitos, histiócitos e plasmócitos. A medida que se tem predominância

dos fibrócitos e das fibras de colágeno ocorre a diminuição numérica dos diferentes tipos

celulares que envolvem o granuloma. Com a evolução do processo, os granulomas tendem a

regredir ficando inicialmente reduzidos a estruturas fibróticas e depois a restos hialinos que

podem calcificar ou serem reabsorvidos, caracterizando a fase involutiva (BURKE et al.,

2009).

Embora, inicialmente, os granulomas sejam avasculares, o deslocamento das células

para o centro do granuloma pode estar relacionado com o efeito quimiotático dos antígenos do

miracídio, que costumam se difundir do centro do granuloma para a periferia, além disso, as

células neste processo se aderem de maneira a formarem verdadeiras redes ou circuitos. A

modulação, assim como as variações estruturais e celulares dos granulomas, são específicas

para cada órgão. Na sua totalidade, os granulomas hepáticos além de apresentarem uma

quantidade maior de colágeno do que os intestinais, por serem mais fibrogênicos (GRIMAUD

et al., 1987), apresentam também um número maior de eosinófilos (54%), linfócitos T (11%)

e B (4%) e mastócitos (< 1%), enquanto os granulomas intestinais são constituídos, na região

do íleo, principalmente de macrófagos e um número pequeno de células T e na região do

colon de macrófagos, eosinófilos e linfócitos T (WEINSTOCK e BOROS, 1983). Todavia,

avaliações in vivo demonstram que camundongos desprovidos de eosinófilos apresentam alta

mortalidade associada com retenção de 80 % mais ovos no tecido hepático (OLDS e

MAHMOUD, 1980). Deste modo, os eosinófilos parecem desempenhar um importante papel

sobre a passagem dos ovos para o lúmen intestinal, já que os eosinófilos e os

monócitos/macrófagos parecem ser responsáveis pela corrosão da membrana basal atuando

sobre as células epiteliais de maneira a abrirem canais para a passagem dos ovos para o lúmen

intestinal (LENZI, LENZI e SOBRAL, 1987).

Papel da Imunidade

A resposta imune na esquistossomíase esta envolvida no desenvolvimento de muitas das

alterações patológicas desta infecção. O processo reacional inflamatório granulomatoso,

parece seguir mecanismos diferentes conforme a fase da infecção. Durante o período de

maturação do parasito, que decorre aproximadamente das primeiras 5 semanas de infecção, há

uma expressão imune dominante de linfócitos T CD4

de perfil TH1 (PEARCE et al., 1991;

PEARCE e MACDONALD, 2002; BURKE et al., 2009), com um aumento na produção de

IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-6 e TNF. Após a maturação dos parasitos e o início da oviposição, a

partir da 6

semana de infecção, esta resposta imune é direcionada para o perfil TH2,

apresentando uma resposta inflamatória exsudativa exuberante (PEARCE e MACDONALD,

2002), com aumento na produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. Com a cronicidade da

infecção, a resposta TH2 é modulada e os granulomas que se formam a partir de então

apresentam acentuada diminuição no seu tamanho quando comparados com os da fase

anterior, este processo foi denominado por (DOMINGO e WARREN, 1968) como estágio de

dessensibilização endógena.

Em 2002, de Jesus e colaboradores, estudando as alterações imunológicas de 31

pacientes infectados por Schistosoma mansoni, observaram que durante a resposta TH1, 87%

dos pacientes apresentaram elevadas concentrações de TNF nos níveis séricos e foram

associadas com dores abdominais. Os níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF, IL-1 e IL-6)

foram elevadas em sobrenadantes de cultura de células mononucleares do sangue periférico

(PBMC). Além disso, foram observados níveis elevados de IFN-γ e baixa produção de IL-5 e

IL-10. Sendo assim, as citocinas pró-inflamatórias elevadas da resposta TH1 e as baixas

concentrações dos complexos de resposta TH2 (IL-5 e IL-10) podem explicar o processo

agressivo de resposta imune da fase aguda, relacionando esta etapa a lesão tecidual cardíaca,

pulmonar e hepática (DE JESUS et al., 2002).

A incapacidade do desenvolvimento da resposta TH2 para regular a resposta pro-

inflamátoria – associada com a esquistossomíase aguda – é letal quando esta doença é

analisada em camundongos (PEARCE e MACDONALD, 2002). Utilizando camundongos

C57BL/6, knockout de IL-4, Brunet e colaboradores (1997), tentaram avaliar a resposta TH2

na infecção pelo S. mansoni e mostraram que durante a fase aguda da infecção estes animais

apresentavam uma caquexia severa seguida de morte, possivelmente mediada por TNF e a

correlação com níveis elevados de óxido nítrico nos órgãos. Estes autores pressupõem que a

IL-4 impede a severidade da doença por regularem a ativação de macrófagos.

Durante todo o curso da infecção a resposta humoral desempenha um papel relevante,

tornando-se mais intensa com o início da oviposição. As infecções parasitárias causadas por

helmintos são caracterizadas pela eosinofilia e pelos elevados níveis séricos de IgE

(LAWLEY et al., 1979). A destruição dos esquistossômulos esta associada com a

degranulação dos eosinófilos que é estimulada pela IgE (DESSEIN et al., 1992; WEBSTER et

al., 1996), além disso, a resistência contra a reinfecção pelo S. mansoni, parece estar

vinculada, em humanos, com este imunocomplexo, como demonstrado por Rihet e

colaboradores (1991) ao observarem a resposta imune pré e pós-tratamento, e comparando-as,

posteriormente, com a intensidade das reinfecções, correlacionaram a resistência à infecção –

aos indivíduos que apresentavam maiores concentrações de IgE sérica.

Camundongos infectados com S. mansoni e inoculados com anticorpos monoclonais

neutralizantes de IL-4 e IL-5, revelam que a inativação ou ausência destas citocinas secretadas

pelo perfil TH2, respectivamente inibem as produção de IgE sérico e promovem a ausência de

eosinófilos circulantes e no tecido (SHER et al., 1990). Assim a deflagração na produção de

IgE e de eosinófilos, juntamente com outras manifestações de hipersensibilidade imediata,

estão sob o controle de citocinas secretadas pela resposta TH2 e não pela resposta do tipo TH1

(FINKELMAN et al., 1986; FINKELMAN et al., 1990).

Em indivíduos atópicos (incluindo a asma), assim como nas infecções por helmintos, há

o desenvolvimento das células TH2, dos mastócitos e altos títulos de IgE sérica (PEARCE e

MACDONALD, 2002), no entanto Medeiros e colaboradores (2003) ao avaliarem a evolução

da asma em pacientes com e sem infecção pelo Schistosoma mansoni, observaram um curso

mais leve da asma nos esquistossomóticos. Estes autores sugerem que na esquistossomíase a

síntese de IL-10 pode modular a reação de hipersensibilidade ao diminuir a liberação de

histamina e outros mediadores liberados pelos mastócitos, proporcionando um curso mais

ameno para a asma.

No início da oviposição, a produção das citocinas é direcionada para o perfil TH2.

Embora a resposta TH2 pareça ter um papel crucial nesta infecção, a sua ação prolongada

contribui para o desenvolvimento da fibrose hepática e da morbidade crônica. Foi

demonstrado que camundongos transgênicos deficientes de IL-13 apresentam uma sobrevida

prolongada, correlacionada com o não desenvolvimento de fibrose hepática grave, o que

normalmente ocorre durante a infecção (FALLON et al., 2000). No entanto, os camundongos

com receptores ineficientes de IL-4 apresentaram uma alta mortalidade, relacionada com a

lesão nas células hepáticas e a patologia intestinal (FALLON et al., 2000). Portanto, o

mecanismo pelo qual a IL-13 é capaz de promover a fibrogênese torna esta citocina à

principal responsável pela fibrose hepática, e assim, prejudicial na sobrevivência no modelo

murina nesta infecção (CHIARAMONTE et al., 2001). Já a citocina IL-4 é considerada

benéfica, por apresentar uma atividade inibitória das citocinas IL-1, IL-6 e TNF (RALPH et

al., 1992). Além disso, glicoproteinas presentes nos ovos de S. mansoni parecem induzir a

produção de IL-4 por basófilos de forma antígeno-independente (SCHRAMM et al., 2007).

A alteração da resposta imune para um tipo TH1 dominante tem sido altamente eficaz na

diminuição da deposição de colágeno. Como demonstrado por Hesse e colaboradores (2001)

mediadores associados com a resposta TH1 como o IFN-γ, IL-12 e TNF podem suprimir o

desenvolvimento da resposta TH2, e portanto de IL-13. Contudo, mesmo sendo a

patogenicidade da esquistossomíase decorrente da resposta reacional inflamatória

granulomatosa, o desenvolvimento da reação periovular é de fundamental importância para o

sequestro e/ou inativação das toxinas liberadas pelos ovos, visto que este processo evita a

degeneração das células hepáticas e o possível comprometimento do fígado, como

demonstrado por Amiri e colaboradores (1992). Estes autores observaram que a ausência de

reações granulomatosas promove extensas áreas de necrose e acentuada mortalidade em

camundongos imunodeficientes SCID (Severe Combined Immuno-Deficiency), que

apresentam macrófagos normais, porém ausência de linfócitos T ou B funcionais, nesta

infecção.

Em avaliações envolvendo camundongos knockout para IL-10, observa-se um aumento

de IFN-γ, IL-2, IL-1β, TNF, porém apesar da polarização da resposta TH1, não há redução

significativa nas citocinas do perfil TH2 (WYNN et al., 1998). O papel de imunomodulação

exercido pela citocina IL-10 na fase crônica desta infecção tem sido amplamente estudado

(FLORES VILLANUEVA, REISER e STADECKER, 1994; BOOTH et al., 2004; SARAIVA

e O'GARRA, 2010). Esta citocina é essencial para estabelecer a resposta específica polarizada

dos linfócitos T helper CD4 in vivo. Deste modo a IL-10 parece controlar as respostas TH1 e

TH2, exercendo uma função “estabilizadora”, evitando a polarização da resposta imune na

infecção esquistossomótica (HOFFMANN et al., 1999), uma vez que a resposta TH1

dominante promove uma alta mortalidade na fase aguda e a polarização para a resposta TH2

uma severa morbidade associada a fibrose (HOFFMANN, CHEEVER e WYNN, 2000).

A deposição de colágeno e matriz extracelular, não é atribuída apenas aos fibroblastos e

miofibroblastos. Desde que foram descritas por von Kupffer em 1876, as células estreladas

hepáticas (HSC), anteriormente denominadas de células de Ito, lipócitos ou células

perisinusoidais, despertam interesse dos patologistas (MOREIRA, 2007). Diversos estudos

têm sido realizados na tentativa de elucidar os processos de ativação das células estreladas,

que no seu estado quiescente são as principais responsáveis pelo armazenamento de vitaminas

lipossolúveis (vitamina A) na forma de éster de retinila (WAKE, 1971). No entanto, estas

células que normalmente distribuem-se na proporção de uma a cada vinte hepatócitos e

representam 1,4% do volume total do fígado (MOREIRA, 2007), desempenham um papel

fundamental na fibrogênese hepática, independente da etiologia (BRIDLE, CRAWFORD e

RAMM, 2003). A atividade desta célula é amplificada in vivo pela depleção de antioxidantes,

como normalmente ocorre em hepatopatias (FRIEDMAN, 2000). Foi demonstrado por

(SVEGLIATI BARONI et al., 1998) em cultura de células estreladas, condicionadas em meio

de hepatócitos, que o estresse oxidativo promove um aumento da proliferação celular e da

síntese de colágeno. Além do mais o TGF-β1, que pode ser produzido de forma autócrina por

estas células, parece desempenhar um importante papel no processo da fibrogênese, visto que

a inibição da síntese de TGF-β1 em modelo experimental reduz significativamente a fibrose

hepática (KONDOU et al., 2003).

As severas sequelas, as reinfecções após o tratamento e os altos índices de mortalidade

causados pela esquistossomíase mostram a necessidade de novos modelos experimentais na

tentativa de revelar medicamentos para terapêutica desta infecção e elucidar fatores ainda

obscuros. Desta forma, este trabalho se propõe a estudar um modelo experimental que utiliza

a silimarina como agente imunomodulador/ hepatoprotetor /antioxidante agindo na fase aguda

da infecção esquistossomótica.

Silimarina

As plantas medicinais são utilizadas desde as mais antigas civilizações. Os

conhecimentos empíricos de suas atividades foram transmitidos para grupos étnicos de acordo

com a própria necessidade humana. Com o desenvolvimento da ciência e da tecnologia, as

plantas medicinais tornaram-se objetos de análise.

A terapêutica moderna se desenvolve direta ou indiretamente de produtos de origens

naturais para tratar enfermidades que acometem o homem. Além disto, os produtos

fitoterápicos estão sendo cada vez mais utilizados no Brasil e no resto do mundo. Nos EUA é

relatado que doze a dezessete por cento da população adulta utilizam produtos à base de

plantas (JOHNSON et al., 2000). O Instituto Nacional de Saúde dos EUA (National Institute

of Health - NIH) realizou uma pesquisa ambulatorial e verificou que um em cada seis

pacientes utilizam produtos fitoterápicos adicionados no tratamento prescrito (JOHNSON et

al., 2000). Estes dados ampliam a necessidade de maiores pesquisas visando caracterizar os

componentes de produtos naturais quanto a suas ações e interações sobre o organismo

humano, e em especial sobre o sistema imune.

Agentes imunomodularórios podem auxiliar o sistema imune de pacientes com

infecções. Inúmeros estudos relatam o “milke thistle” (Silybum marianum (L.) Gaertn.), como

um excelente agente imunoestimulatório (RAMASAMY e AGARWAL, 2008;

GHARAGOZLOO et al., 2010). O Silybum marianum é citada como um dos medicamentos

mais antigos, o chá das sementes desta planta era utilizado por Dioscorides, na Grécia antiga,

para o tratamento de veneno de cobra (FLORA et al., 1998). Porém foi Plínio, o velho, um

naturalista romano, quem descreveu o Silybum marianum como sendo excelente para

problemas biliares (LUPER, 1998).

A silimarina é um extrato lipofílico (GALHARDI et al., 2009) isolado das sementes e

dos frutos do Silybum marianum, uma planta herbácea, pertencente à família das Asteraceae e

nativa de uma estreita área do Mediterrâneo. Mesmo com o uso desta planta para o tratamento

de injúrias hepáticas e da vesícula biliar há mais de 2000 anos, as investigações clínicas são

relativamente recentes.

A planta ganhou proeminência na década de 60, quando Janiak & Hänsel isolaram os

princípios ativos do extrato e Pelter & Hänsel elucidaram as estruturas química. Os principais

componentes (Figura 5) isolados e caracterizados estruturalmente da silimarina são silibina,

isosilibina, silicristina e silidianina (SONNENBICHLER et al., 1999). No entanto, Johnson e

colaboradores (2002) descrevem o produto como uma mistura de sete isômeros denominados

taxofolina, silicristina, silidianina, silibina A, silibina B, isosilibina A e isosilibina B. Uma

série de outros flavolignóides pode ser encontrados nas sementes, incluindo dehidrosilibina,

desoxisilicristina, desoxisilidianina, silandrina, silibinoma, silihermina, e neosilihermina

(KVASNICKA et al., 2003).

Silibina

Isosilibina

Silicristina Silidianina

Figura 5 - Estrutura química dos principais componentes da silimarina.

Extraído e adaptado de Sonnenbichler e colaboradores (1999).

As sementes do S. marianum também contêm betaína, que apresenta comprovado efeito

hepatoprotetor (LUPER, 1998). Atualmente, a silimarina é utilizada como controle positivo

na avaliação de novos fármacos que possam apresentar atividade hepatoprotetora

(CHANNABASAVARAJ, BADAMI e BHOJRAJ, 2008).

Além disso, a silimarina é constituída de ácidos graxos essenciais o que pode contribuir

para sua atividade antiinflamatória (LUPER, 1998). Outro importante produto é a silibina –

componente com maior grau de atividade biológica – que além de ser relatada em inúmeros

trabalhos com atividade hepatoprotetora (NAJAFZADEH et al., 2010)), também apresenta

ação quimiopreventiva para câncer in vitro e in vivo (KAUR e AGARWAL, 2007).

Além da silibina, tem-se observado em avaliações in vitro, que dois diasteroisomeros

presentes na silimarina, a isosilibina A e isosilibina B, também apresentam atividade

antineoplásica. Deep e colaboradores (2007), ao avaliarem células de câncer de próstata

humanas LNCaP e 22Rv1, observaram que ambos diasteroisomeros promovem a inibição do

crescimento e morte celular juntamente com um forte controle sobre ciclina G1 e a indução da

apoptose nas duas linhagens celulares. Deste modo a silimarina tem se mostrado uma boa

candidata para o tratamento de diversas neoplasias (KOHNO et al., 2002; GALLO et al.,

2003; SINGH e AGARWAL, 2004; TYAGI et al., 2006; DEEP e AGARWAL, 2007; DEEP

et al., 2008), como demonstrado em numerosos ensaios clínicos que buscam avaliar a eficácia

terapêutica da silimarina, já que este produto apresenta influência sobre as expressões

reguladoras do ciclo celular e sobre proteínas envolvidas na apoptose, modulando o

desequilíbrio entre a sobrevivência celular e a apoptose (RAMASAMY e AGARWAL, 2008).

Outros importantes papéis da silimarina estão relacionados às atividades de

estabilização de membrana, antiperoxidação lipídica, antioxidante, hepatoregeneradora,

imunomodulatória, antifibrótica, hipocolesterolêmico e cardioprotetor (KREN e

WALTEROVA, 2005; CROCENZI e ROMA, 2006). Além disso, a silimarina pode ter um

longo tempo de ação no fígado (HE et al., 2002) e não é hepatotóxica baseadas em

observações clínicas, já que apresenta valores muito altos de dose letal 50 - LD50 (FLORA et

al., 1998). Conforme Rainone (2005) a silimarina apresenta recirculação enterohepática, o que

resulta em um aumento de sua concentração nas células hepáticas maior do que no plasma.

Estudos em animais sugerem um amplo espectro de efeito hepatoprotetor da silimarina,

podendo desta maneira proteger animais expostos a diversas lesões tóxicas (HOOFNAGLE,

2005), como Amanita phalloides (ANTWEILER, 1977; VOGEL et al., 1984), tetracloreto de

carbono (RAUEN et al., 1973), galactosamina (RAUEN e SCHRIEWER, 1971) e etanol

(SONG et al., 2006).

Recentemente a ação antioxidante foi demonstrada em diferentes modelos (TOKLU,

TUNALI-AKBAY et al., 2007; TOKLU, TUNALI AKBAY et al., 2007). As propriedades

imunoestimulatórias da silimarina são descritas em diversos estudos in vivo e in vitro. Flora e

colaboradores (1998) afirmam que os efeitos hepatoprotetores da silimarina são múltiplos:

apresentando atividade antioxidante; aumento do conteúdo glutationico celular; efeitos

estabilizantes na membrana; aumento da síntese protéica; e ativação do RNA polimerase.

Corroborando este dado, Machicao e Sonnenbichler (1977) demonstraram in vitro, que a

atividade enzimática da RNA polimerase I é estimulada pela silibina. Outro trabalho

demonstrou que a silimarina acelera a síntese das subunidades ribossomais 28S, 18S e 5S,

promovendo também a formação de ribossomos completos (SONNENBICHLER e ZETL,

1984). Além disso, a silimarina parece alterar a expressão genética do fígado, como se tem

demonstrado em camundongos normais através do aumento da expressão de TGF-β1 e c-myc

(HE et al., 2002).

Estudos demonstram que os linfócitos T são de fundamental importância para a inibição

e reparação nos estágios de danos hepáticos. A administração de silimarina em pacientes com

cirrose alcoólica estimula a proliferação de linfócitos T (LANG et al., 1988). Esta

proliferação dos linfócitos também é observada em camundongos (AGOSTON et al., 2001).

No entanto, já foi demonstrado que a silibina (componente de maior grau de atividade da

silimarina) pode suprimir a proliferação induzida dos linfócitos T (MERONI et al., 1988).

Como observado in vivo por Johnson e colaboradores (2002) ao avaliarem que a silimarina

provoca uma diminuição e uma inibição dos linfócitos T quando administrada em baixas

concentrações, porém quando utilizado em altas doses estimulam o processo inflamatório.

Estas populações de células são sensíveis à silimarina tanto in vivo quanto in vitro.

O papel antifibrótico da silimarina no modelo experimental já é conhecido. Boigk e

colaboradores (1997) induziram ratos a uma fibrose portal progressiva através de uma

completa oclusão dos ductos biliares, processo este que tende a culminar em ascite e

hepatoesplenomegalia. Estes autores observaram que os ratos não tratados com silimarina

apresentaram um aumento do colágeno hepático de até nove vezes, quando comparados com

o grupo controle, enquanto os ratos tratados com silimarina obtiveram uma redução de 35%

na formação de hidroxiprolina. Uma possível explicação vem a partir de dados bioquímicos

que mostram que a silimarina suprime a expressão do procolágeno α-1 (I) e de

metaloproteinases 1 provavelmente pela diminuição de mRNA TGF-β1 em ratos com fibrose

biliar secundária (JIA et al., 2001). O efeito antifibrótico da silimarina também é demonstrada

em outros modelos experimentais que induzem a fibrose utilizando toxinas hepáticas como a

dimetilnitrosamina (LIN et al., 2007). Desta maneira, devido à atividade antifibrótica

atribuída à silimarina, este produto pode atuar na morbidade provocada pela esquistossomíase,

já que grande parte das lesões nesta infecção são decorrentes da deposição de fibrose hepática.

Mesmo com a ampla utilização da silimarina em várias condutas terapêuticas, há

mecanismos subjacentes desconhecidos. Os estudos em animais experimentais e até mesmo in

vitro, não contribuem apenas para compreender os mecanismos da silimarina, mas também

para prever novas aplicações terapêuticas (CROCENZI e ROMA, 2006) podendo assim,

proporcionar subsídios para a elaboração de novas estratégias de controle e suporte para a

esquistossomíase. Desta forma, as ações apresentadas pela silimarina (imunomoduladoras,

hepatoprotetoras/hepatoregeneradoras, antioxidante, e antifibrótica) podem auxiliar

minimizando a morbidade observada na infecção pelo Schistosoma mansoni.

Ainda que não se tenha uma avaliação direta da silimarina sobre o sistema do parasito,

Hessien e colaboradores (2009) avaliaram os efeitos da silimarina frente diversas

hepatopatias. Estes autores também avaliaram a capacidade da silimarina em atenuar as lesões

provocadas pelo Schistosoma mansoni durante os primeiros 42 dias de infecção, período este

que de acordo com inúmeros trabalhos, antecede o ápice das alterações anatomopatológicas

de fase aguda da esquistossomíase (ROMANHA, 1999; NETO, 2001; PYRRHO et al., 2002),

visto que a maturação dos parasitos e início da oviposição ocorrem por volta da 6

semana de

infecção (PEARCE e MACDONALD, 2002). Estes autores concluem que a silimarina

promove a regressão da patologia induzida por diferentes etiologias, de modo que há

possibilidade de redução substancial da progressão de cirrose e de carcinoma hepatocelular.

O Centro Nacional para Medicina Complementar e Alternativa (NCCAM) em

colaboração com o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK)

realizou um seminário de pesquisa para o desenvolvimento da silimarina na terapia de

doenças hepáticas e destacou como elemento crítico a necessidade de se padronizar o produto

silimarina para as investigações clínicas, bem como realizar estudos pilotos de fase I e II para

definir a dose ideal e o regime de doses (HOOFNAGLE, 2005).

Trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo de estudo demonstraram que a

utilização de dexametasona – um produto com atividade imunomodulatória – pode

proporcionar um curso mais ameno na infecção esquistossomótica (PYRRHO et al., 2002;

PYRRHO et al., 2004). Neste trabalho nosso objetivo foi avaliar a ação da silimarina na fase

aguda da esquistossomíase.

OBJETIVOS

Gerais:

• Avaliar a ação da silimarina sobre a infecção aguda experimental murina pelo

Schistosoma mansoni

Específicos:

• Avaliar a ação da silimarina sobre os parâmetros de morbidade – curva ponderal,

taxa de sobrevivência e hepatoesplenomegalia – quando o fármaco é administrado

na infecção esquistossomótica aguda.

• Avaliar o impacto da administração da silimarina utilizando diferentes esquemas

posológicos em animais infectados pelo parasito.

• Avaliar a ação da silimarina sobre aspectos histopatológicos quanto à formação de

granulomas hepáticos e a consequente fibrose na infecção esquistossomótica aguda.

• Verificar possíveis alterações nos aspectos parasitológicos nos animais infectados

tratados ou não com silimarina.

• Verificar as alterações bioquímicas clínicas encontradas nos animais infectados e

infectados e tratados com silimarina nos diferentes momentos da infecção.

MATERIAL E MÉTODOS

Fármaco

Para as administrações orais foi utilizado uma suspensão comercial de silimarina,

LEGALON

- extrato seco do Silybum marianum (L.) Gaertn. (Laboratório ALTANA, Lote

704166, padronizada para 75 a 80,9% de silibina, silidianina, silicristina e isosilibina). Para

administração intraperitoneal foi usada, durante todos os ensaios, a silimarina adquirida da

Sigma-Aldrich (Lote # 107K0762, padronizada para 47% de silibina, determinada por

CLAE).

Inoculações via oral

Sendo a via oral mais preconizada no homem pela sua conveniência, segurança e

economia, foi utilizado em um primeiro momento, uma suspensão comercial de silimarina.

Essa fase do experimento além de testar a via de administração, serviu também para avaliar a

dose (2, 10, 50 e 250 mg/kg). Todos os animais foram tratados pela manhã, com intervalos de

24 horas entre as inoculações e receberam ao total 10 doses, respeitando nosso desenho

experimental. Ao longo das inoculações foi feito um acompanhamento do peso dos animais e

anotadas as datas das eventuais mortes que ocorreram nos diversos grupos. Estes dados

serviram para a confecção da curva ponderal e de sobrevivência, respectivamente.

Inoculações via intraperitoneal

A via de administração intraperitoneal além de substituir classicamente a via

intravenosa em camundongos tem sido a mais utilizada experimentalmente para a

administração de silimarina em roedores.

Em função das características físico-químicas da silimarina, a diluição foi feita em

carboximetilcelulose a 1% com “água para injetáveis”. Tal suspensão foi realizada visando

diminuir a velocidade de deposição da silimarina, uma vez que há um aumento da

viscosidade.

As injeções foram aplicadas pela manhã na cavidade peritoneal e o volume para as

inoculações sempre foi de 100 µL.

As doses de silimarina usadas foram de 40, 200 e 1000 µg por animal, o que

corresponde, respectivamente a 2, 10 e 50 mg/kg. Estas doses foram administradas em

intervalos de 24 e 48 horas e o número de inoculações respeita cada desenho experimental.

Ao longo das inoculações foram realizadas avaliações dos pesos dos animais e anotadas as

datas das eventuais mortes ou alterações comportamentais que ocorreram nos diversos grupos.

Estes dados serviram para a confecção da curva ponderal e de sobrevivência.

Esterilidade dos materiais

Para as inoculações sempre foram utilizadas seringas descartáveis e as soluções com

água e carboximetilcelulose, antes da diluição do fármaco, eram autoclavadas a 121ºC por 15

minutos, sendo a manipulação destas soluções sempre realizada em capela de fluxo laminar

para evitar contaminações. Após esse procedimento, os medicamentos foram acondicionados

em tubos de ensaios previamente autoclavados, vedados, recobertos com papel alumínio e

armazenados em local com temperatura controlada de ± 1ºC. Para o controle microbiológico

amostras dos produtos eram separadas e submetidas a culturas em caldo Brain Heart Infusion

(BHI), a 37º C, por até 7 dias e em ágar sangue, a 35º C por 24 a 48 horas, na tentativa de

isolar microorganismos presentes nos produtos a serem inoculados. Esta etapa foi elaborada

em colaboração com o Laboratório de Bacteriologia Clínica do Departamento de Análises

Clínicas e Toxicológicas da UFRJ.

Camundongos/Grupos

Para realização dos experimentos foram utilizadas fêmeas de camundongos isogênicos

da linhagem BALB/c, de 7 a 8 semanas de idade, provenientes do Biotério Central do

Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da UFRJ. Os animais foram então mantidos

nas instalações do biotério do Laboratório de Imunoparasitologia e Analises Toxicológicas,

onde receberam alimentação balanceada e água ad libitum, com ambiente climatizado

(21 ± 2º C) e condições padronizadas de luminosidade, ciclo claro-escuro de 10/14 h.

A gaiola dos camundongos, constituída de polipropileno, era recoberta com maravalha e

a sua manutenção realizada 2 vezes por semana. Após o período de adaptação dos

camundongos no biotério e antes da infecção pelo S. mansoni, os animais foram submetidos

ao tratamento com MEBENDAZOL

(Laboratório EMS, Lote 189656) na apresentação de

20 mg/mL de suspensão, para evitar a interferência de outras infecções parasitárias no

resultado final do experimento.

Foram criados grupos de animais que não sofreram inoculações, grupos tratados com

silimarina nas doses indicadas e grupos inoculados apenas com o veículo (água para injeção e

carboximetilcelulose a 1%).

Durante este trabalho foram realizados cinco lotes experimentais.

O presente projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética de Uso

de Animais em Pesquisa (CEUA) do Centro de Ciências da Saúde da UFRJ, o número do

protocolo aprovado é DBFCICB032.

Infecção

Os camundongos foram infectados com cercárias de S. mansoni (cepa BH - Belo

Horizonte, Minas Gerais), oriundas de moluscos de Biomphalaria glabrata, previamente

infectados, expostos à luz artificial, para obtenção das cercárias. Após a aquisição das

cercárias fornecidas pela Drª. Lygia dos Reis Corrêa do Laboratório de Malacologia da

Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, os camundongos eram expostos a um lava-pés, com

objetivo de evitar possíveis interferentes – fezes e urina – no processo de fixação das

cercárias. A infecção dos animais foi feita por via transcutânea em banho individual de água

desclorada por 30-40 minutos com ± 80 cercárias vivas previamente quantificadas com o

auxílio de lupa estereoscópica (Olympus SZ40). A carga parasitária média utilizada neste

modelo experimental não altera sistematicamente a taxa de mortalidade dos animais, uma vez

que o acompanhamento fora planejado para ser feito por 55 dias.

Peso dos camundongos

Os camundongos foram marcados e pesados duas vezes por semana durante os 55 dias

do experimento para avaliação do percentual do peso corporal através da curva ponderal

provocada pela infecção e/ou tratamento.

Primeiro Lote experimental

O primeiro lote experimental utilizou o Legalon

– suspensão comercial de silimarina

administrada pela via oral. Nesta etapa foram analisadas diferentes concentrações de

silimarina, respeitando o mesmo intervalo entre as doses. Os camundongos foram divididos

em sete grupos, os grupos normais foram compostos por um número amostral de seis animais

e os infectados apresentaram nove animais por grupo.

Os sete grupos do experimento com Legalon

eram:

• Normais (N) → animais não infectados e não tratados com Legalon

• Normais + Legalon

250 (N+Leg 250 -10D- 24h) → animais não infectados e

tratados com 250 mg/kg de Legalon