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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
RENATA BESSA PONTES
DESENVOLVIMENTO DE MODELO EXPERIMENTAL DE
NEUROPATIA SENSITIVA PERIFÉRICA INDUZIDA PELO
AGENTE ANTINEOPLÁSICO OXALIPLATINA EM
CAMUNDONGOS
FORTALEZA
2009
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RENATA BESSA PONTES
DESENVOLVIMENTO DE MODELO EXPERIMENTAL DE
NEUROPATIA SENSITIVA PERIFÉRICA INDUZIDA PELO AGENTE
ANTINEOPLÁSICO OXALIPLATINA EM CAMUNDONGOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
programa de Pós-graduação em
Farmacologia da Faculdade de Medicina
da Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para obtenção do título
de Mestre em Farmacologia.
Orientadora:
Profa. Dra. Mariana Lima Vale
Co-orientador:
Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer
(LAFICA) da Universidade Federal do Ceará
FORTALEZA
2009
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P859d Pontes, Renata Bessa
Desenvolvimento de modelo experimental de neuropatia
sensitiva periférica induzida pelo agente antineoplásico
oxaliplatina em camundongos / Renata Bessa Pontes – Fortaleza,
2009.
139 f. : il.
Orientador: Profa. Dra. Mariana Lima Vale
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará.
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza-Ce,
2009
1. Compostos de Platina 2. Doenças do Sistema Nervoso
Periférico 3. Camundongos I. Vale, Mariana Lima (orient.)
II. Título
CDD: 546.645
RENATA BESSA PONTES
DESENVOLVIMENTO DE MODELO EXPERIMENTAL PARA ESTUDO DE
NEUROPATIA SENSITIVA PERIFÉRICA INDUZIDA PELO AGENTE
ANTINEOPLÁSICO OXALIPLATINA EM CAMUNDONGOS
Essa dissertação foi submetida como parte dos requisitos necessários à obtenção
do Grau de Mestre em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal do Ceará
e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca setorial da referida
Universidade.
Data da aprovação: 18/12/2009
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________
Profa. Dra. Mariana Lima Vale
Universidade Federal do Ceará (UFC)
(orientadora)
_______________________________________________
Profa. Danielle Silveira Macedo
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_______________________________________________
Prof. Dr. Thiago Mattar Cunha
Faculdade de Medicina Ribeirão Preto (USP)
Dedico essa dissertação a toda
minha família que tanto me apóia.
Em especial aos meus pais que
sempre acreditaram no meu
sucesso, aos meus irmãos que
sempre estiveram ao meu lado e
ao meu noivo pelo apoio e
dedicação.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por todas as oportunidades em minha vida, pelos dons
da ciência e sabedoria tão necessários para o desenvolvimento desse trabalho.
Muito especialmente à minha orientadora Profa. Mariana Lima Vale pela sua
paciência e apoio transmitindo-me exemplo de competência para a realização desse
trabalho.
Aos professores Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, Marcellus Henrique Loiola
Ponte de Souza e Gerly Anne de Castro Brito que estiveram presentes no
desenvolvimento desse estudo.
Aos voluntários do projeto Flávio Esmeraldo e Marceli Paiva pela participação
neste trabalho.
À Roberto César e Deysi, pela amizade e disposição para ajudar.
Aos amigos do LAFICA: Rosinha, Adriana Lima, Juliana Lino, Antoniella,
Jand-Verne, André Luis, Pedro, Graciela e aos colegas de sala de aula Otacílio, Ana
Paula e Tiago.
Aos Funcionários: Vandinha, Tiara, Carol, Socorro, Aura e Francisco pelo
reiterado carinho e apoio.
A todos os professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, pela
formação que me legaram.
Aos meus pais, amigos incondicionais, pelo eterno e imensurável amor, pela
minha existência e o que dela sou.
Aos meus irmãos, cunhadas, sobrinhos, tios, primos e amigos por sempre
acreditarem na minha dedicação e nos frutos dela colhidos.
Ao meu noivo, Júlio César, amigo e confidente, pelo lindo amor que me
dedica, por me tornar uma pessoa mais feliz e por acreditar em meus e em nossos
sonhos.
À CAPES e ao CNPQ pelo apoio financeiro.
Buscai primeiro o reino de Deus, e a sua justiça, e
todas as coisas vos serão acrescentadas. (Mt 6,
33).
RESUMO
Desenvolvimento de modelo experimental de neuropatia sensitiva periférica induzida
pelo agente antineoplásico oxaliplatina em camundongos. PONTES, Renata Bessa;
LIMA, Mariana Lima. Renata Bessa Pontes. Orientadora: Profa. Dra. Mariana Lima
Vale. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2009.
Oxaliplatina (OXL) é a 3ª geração de agentes platinos com amplo espectro de
atividade antitumoral. Exibe potente atividade citotóxica, incluindo câncer colorretal,
ovariano e pulmonar. Dentre os efeitos tóxicos estão: laringoespasmo, náuseas,
vômitos, fadiga e neuropatia periférica, foco desse trabalho. Essa pesquisa objetivou
desenvolver um modelo experimental para estudo da neuropatia sensitiva periférica
induzida por OXL em camundongos que são animais geneticamente mais
semelhantes ao ser humano, econômicos e dado a existência de espécies diferentes
para vários fatores. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal
da UFC (protocolo nº 70/07). Camundongos Swiss machos (20-40g) foram tratados
com OXL (1-4 mg/kg, EV) por 4 semanas paralelamente aos testes neuropáticos
utilizados para avaliar o desenvolvimento da neuropatia sensitiva e Rota Rod para
verificar comprometimento motor. A hiperalgesia e alodínia térmica foram avaliadas
pelo teste de imersão da cauda (TIC) em água fria (4 ou 10ºC) e em água aquecida
(46 ou 42ºC). O teste de hiperalgesia e alodínia mecânico (HPM; Von Frey) consistiu
na estimulação das patas traseiras com um sensor de força (g) até a sua retirada por
um movimento de “flinch”. Foi ainda verificado a ação analgésica da carbamezepina
(CZP), oxcarbazepina (OZP), gabapentina (GABAP) e indometacina (INDO) no TIC
água fria. Foi realizado a imunohistoquímica das patas traseiras dos animais em 24h
e de 7 a 28 dias. Como resultados observou-se que no HPM houve uma diminuição
significativa (p<0,001) no limiar nociceptivo a partir do 14º dia atingindo o máximo na
dose de 2mg/kg comparado ao grupo controle. No TIC 4ºC houve uma diminuição
significativa (p<0,05) no limiar nociceptivo no 56º dia, no TIC alodínia pelo frio (10ºC)
foi observado uma diminuição significativa (p<0,01) no limiar nociceptivo também no
56º dia, no TIC alodínia pelo quente (42ºC) foi observado uma diminuição
significativa (p<0,05) no limiar nociceptivo a partir do 35º dia. Esses testes atingiram
o máximo na dose de 1mg/kg comparados com o grupo controle e no TIC 46ºC foi
observado uma diminuição significativa (p<0,01) no limiar nociceptivo a partir do 49º
dia atingindo o máximo na dose de 1 e de 4mg/kg comparado ao grupo controle. No
teste Rota Rod nenhuma variação significativa foi observada em nenhum dos
grupos, indicando a ausência de comprometimento motor. O tratamento com CZP
(0,3-30mg/kg), OZP (0,3-100mg/kg) e GABAP (6-54mg/kg) aumentou o limiar
nociceptivo, indicando efeito analgésico e INDO (1-4mg/kg) não demonstrou
atividade analgésica nesse modelo. Na análise da imunohistoquímica ficou
comprovado que existe a participação provável de SP, CGRP e NMDA periféricos e
nitrotirosina. Portanto, o uso de camundongos e do diferente método de
administração da OXL (EV) pode ser utilizado em modelos futuros viabilizando o uso
do fármaco para tratamento do câncer, principalmente o colorretal, com todo o
esquema terapêutico, sem que a NSP interfira nas atividades de vida do paciente
tratado.
Palavras-chave: Compostos de Platina. Doenças do Sistema Nervoso Periférico.
Camundongos.
ABSTRACT
Development of experimental model of peripheral sensitive neuropathy prompted by
the oxaliplatin in mice. Renata Bessa Pontes. Principal guide: Profa. Dra. Mariana
Lima Vale. Department of Physiology and Pharmacology, UFC, 2009.
Oxaliplatin (OXL) is a third-generation platinum-based chemotherapy with
broad spectrum of anti-tumoral activity. Exhibt potent cytotoxic activity including
against cancer colorectal, ovarian and lung cancer. Among the toxic effects are:
laryngospasm, nauseas, vomiting, fatigue and peripheral neuropathy, focus of that
work. That research planned to develop an experimental model for study of the
peripheral neuropathy induced by OXL in mice that are animal genetically more
similar to the human, economic and given the knockout species existence for several
factors. The study was approved by the Committee of Ethics in Animal Research of
the UFC (protocol nº 70/07). Mice Swiss male (20-40g) were treated with OXL (1-4
mg/kg, EV) for 4 weeks in parallel to the neurophatic tests utilized for evaluate the
development of the peripheral neuropathy and Route Rod for verify some motor
compromise. To mechanical hyperalgesia and allodynia thermal were evaluated by
the test of immersion of the tail (TIC) in cold water (4 or 10ºC) and in water heated
(46 or 42ºC). The test of hyperalgesia and allodynia (HPM; Von Frey) consisted of
the stimulation of the rear paws with a sensor of force (g) up to his retreat by a
movement of "flinch". It was still verified the analgesic action of the carbamezepine
(CZP), oxcarbazepine (OZP), gabapentin (GABAP) and indomethacin (INDO) in the
TIC cold water. It was carried out to immunohistochemical of the hands paws of the
animals in 24h and of 7 to 28 days. The results shows that in the HPM had a
significant reduction (p<0,001) in the nociceptive threshold from the 14º day reaching
the maximum one in the dose of 2mg/kg compared to the control group. In the TIC
4ºC had a significant reduction (p<0,05) in the nociceptive threshold in the 56º day, in
the TIC allodynia by the cold one (10ºC) was observed a significant reduction
(p<0,01) in the nociceptive threshold also in the 56º day, in the TIC allodynia by the
hot one (42ºC) was observed a significant reduction (p<0,05) in the nociceptive
threshold from the 35º day. Those tests reached the maximum one in the dose of
1mg/kg compared with the control group and in the TIC 46ºC was observed a
significant reduction (p<0,01) in the nociceptive threshold from the 49º day reaching
the maximum one in the doses of 1 and 4mg/kg compared to the control group. In
the test Route Rod no significant variation was observed in no of the groups,
indicating the absence of motor compromise. The handling with CZP (0,3-30mg/kg),
OZP (0,3-100mg/kg) and GABAP (6-54mg/kg) increased the nociceptive threshold,
indicating analgesic effect and INDO (1-4mg/kg) did not show analgesic activity in
that model. In the analysis of the immunohistochemical was verified that exists the
probable participation of SP, CGRP and NMDA peripheral and nitrotyrosine.
Therefore, the use of mice and of the different approach of administration of the OXL
(EV) can be utilized in future models making feasible the use of the drug for handling
of the cancer, mainly the colorectal, with all the therapeutic plan without that to NSP
interfere in the activities of the treated patient.
Keywords: Platinum Compound. Peripheral Neuropathy. Mice.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Novos casos estimados de câncer por sexo ..................................19
FIGURA 2 Estrutura química de análogos platinos ......................................... 26
FIGURA 3 Mecanismo de ação da oxaliplatina ................................................ 29
FIGURA 4 Expectativa de vida do câncer colorretal metastático .................. 34
FIGURA 5 Administração na veia lateral da cauda........................................... 56
FIGURA 6 Curva dose resposta para escolha da dose de oxaliplatina.......... 57
FIGURA 7 Investigação do efeito de fármacos analgésicos............................ 58
FIGURA 8 Investigação por imunohistoquímica............................................... 60
FIGURA 9 Aparelho eletrônico Von Frey........................................................... 61
FIGURA 10 Teste de imersão da cauda .............................................................. 62
FIGURA 11 Aparelho de Rota Rod ....................................................................... 63
FIGURA 12 Avaliação do desenvolvimento de hiperalgesia mecânica plantar
induzida por oxaliplatina ................................................................. 66
FIGURA 13 Avaliação do desenvolvimento de alodínia térmica ao frio (10ºC)
induzida por oxaliplatina. ................................................................. 68
FIGURA 14 Avaliação do desenvolvimento de alodínia térmica ao calor (42ºC)
induzida por oxaliplatina .................................................................. 69
FIGURA 15 Avaliação do desenvolvimento de hiperalgesia térmica ao frio
(4ºC) induzida por oxaliplatina ......................................................... 71
FIGURA 16 Avaliação do desenvolvimento de hiperalgesia térmica ao calor
(46ºC) induzida por oxaliplatina ....................................................... 72
FIGURA 17 Avaliação do efeito do tratamento crônico com oxaliplatina sobre
da coordenação motora e equilíbrio de camundongos no teste do
Rota Rod ............................................................................................ 74
FIGURA 18 Avaliação da média ponderal dos animais tratados com
oxaliplatina ......................................................................................... 75
FIGURA 19 Efeito do anticonvulsivante carbamazepina (CBZ) sobre a
neuropatia sensitiva periférica já instalada induzida por
oxaliplatina ......................................................................................... 77
FIGURA 20 Efeito do anticonvulsivante oxcarbazepina (OZP) sobre a
neuropatia sensitiva periférica já instalada induzida por
oxaliplatina ......................................................................................... 78
FIGURA 21 Efeito do anticonvulsivante gabapentina (GABAP) sobre a
neuropatia sensitiva periférica já instalada induzida por
oxaliplatina ......................................................................................... 80
FIGURA 22 Efeito do anticonvulsivante indometacina (INDO) sobre a
neuropatia sensitiva periférica já instalada induzida por
oxaliplatina ..........................................................................................81
FIGURA 23 Avaliação do efeito da carbamazepina, oxacarbazepina,
gabapentina e indometacina sobre da coordenação motora e
equilíbrio de camundongos tratados com oxaliplatina no teste do
Rota Rod ............................................................................................ 83
FIGURA 24 Análise histopatológica de pele de pata de camundongos
submetidos ao tratamento com oxaliplatina .................................. 86
FIGURA 25 Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para CGRP
em pele de pata de camundongos submetidos ao tratamento com
oxaliplatina ......................................................................................... 87
FIGURA 26 Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para SP em
pele de pata de camundongos submetidos ao tratamento com
oxaliplatina ......................................................................................... 88
FIGURA 27 Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para NMDA
em pele de pata de camundongos submetidos ao tratamento com
oxaliplatina ......................................................................................... 89
FIGURA 28 Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para TNF
em pele de pata de camundongos submetidos ao tratamento com
oxaliplatina ..........................................................................................90
FIGURA 29 Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para VR1
em pele de pata de camundongos submetidos ao tratamento com
oxaliplatina ......................................................................................... 91
FIGURA 30 Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para
nitrotirosina em pele de pata de camundongos submetidos ao
tratamento com oxaliplatina ............................................................. 92
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Esquemas de combinação FOLFOX................................................ 31
TABELA 2 Características clínicas da neuropatia induzida pela
oxaliplatina.......................................................................................... 36
TABELA 3 Evolução da neurotoxicidade da oxaliplatina ................................ 37
TABELA 4 Estratégias para profilaxia e tratamento da neurotoxicidade
induzida pela oxaliplatina.................................................................. 38
TABELA 5 Seleção de termos e definições de dor (IASP) ............................... 41
TABELA 6 Modelos de dor neuropática em animais ........................................ 48
LISTA DE ABREVIATURAS
AINES Anti-Inflamatórios Não Esteroidais
ANOVA Análise de Variância
Ca
+2
Cálcio
CBZ Carbamazepina
CDME Corno Dorsal da Medula Espinhal
CGRP Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina
Cis[Pt(NH
3
)
2
Cl
2
] Cis-diaminodicloroplatina II
CM Centímetros
CTC INC Critério de Toxicidade Comum do Instituto Nacional do Câncer
DACH 1-2-Diaminociclohexano
DLT Dose Limite de Toxicidade
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DOPA Dopamina
DRG Raiz Dorsal do Gânglio
EMG Eletromiografia
ENM Eletroneuromiografia
EPM Erro Padrão da Média
ERCC1 Excisionrepair cruz complementação grupo 1
EUA Estados Unidos da América
EV Via Endovenosa
FU Fluourouracil
FDA Food and Drug Administration
FOLFOX 5-Fluorouacil, Oxaliplatina e Leucovorin
FOLFOX/BEV 5-Fluorouaci, Oxaliplatina, Leucovorin e Bevacizumab
G Gramas
GABA Ácido gaba-aminobutírico
GABAP Gabapentina
H Horas
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
hMLH1 human mut L homolog
hMSH2 human mut S homolog
hMSH3 human mut S homolog
hMSH6 human mut S homolog
hPMS1 human post meiotic segregation
hPMS2 human post meiotic segregation
IASP Associação Internacional para Estudo da Dor
INDO Indometacina
IP Via Intraperitoneal
IROX FOLFOX 4 e Irinotecano
INC Instituto Nacional de Câncer
L-OHP trans-l-diaminociclohexano oxalatoplatino
LV Leucovorin
MIN Minutos
MM Milímetros
MMR Reparo de má combinação
Na
+
Sódio
NER nucleotide excision repair
NMDA Ácido N-metil-D-aspartato
NSP Neuropatia Sensitiva Periférica
OMS Organização Mundial da Saúde
OPTIMOX Estratégia Stop-and-Go
OSNS Escala de Neurotoxicidade Específica de Oxaliplatina
OXL Oxaliplatina
OZB Oxcarbazepina
Pt Platinos
RNM Ressonância Magnética
RPM Rotações Por Minuto
SNC Sistema Nervoso Central
SNE Sistema Nervoso Entérico
SNP Sistema Nervoso Periférico
SP Substância P
TGI Trato Gastrointestinal
TNF Fator de Necrose Tumoral
UFC Universidade Federal do Ceará
VO Via Oral
VR1 Receptor Vanilóide
XELOX Oxaliplatina e Capecitabina
δ Delta
SUMÁRIO
RESUMO VI
ABSTRACT VII
LISTA DE FIGURAS VIII
LISTA DE TABELAS X
LISTA DE ABREVIATURAS XI
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................17
1.1 Câncer ............................................................................................................18
1.2 Tratamentos para o câncer ..........................................................................20
1.2.1 Cirurgia ......................................................................................................... 21
1.2.2 Radioterapia ................................................................................................. 22
1.2.3 Quimioterapia ............................................................................................... 23
1.3 Classificação química dos quimioterápicos ............................................. 23
1.3.1 Complexos de Platina .................................................................................. 23
1.4 Oxaliplatina (OXL) ........................................................................................ 26
1.4.1 Mecanismo de ação antitumoral da oxaliplatina ...................................... 27
1.4.2 Mecanismo de resistência da oxaliplatina ................................................ 29
1.4.3 Farmacocinética da oxaliplatina ................................................................. 30
1.4.4 Esquemas quimioterápicos ........................................................................ 31
1.4.5 Importância da oxaliplatina no tratamento do câncer .............................. 32
1.4.6 Efeitos colaterais do uso de oxaliplatina .................................................. 34
1.4.6.1 Neurotoxicidade aguda .............................................................................. 35
1.4.6.2 Neurotoxicidade crônica ............................................................................ 35
1.4.6.3 Neurotoxicidade da oxaliplatina aspectos celulares e moleculares ..... 38
1.5 Dor neuropática ............................................................................................ 39
1.5.1 Tratamento da dor neuropática .................................................................. 44
1.6 Modelos animais de dor neuropática ......................................................... 45
1.7 Justificativa e caracterização do problema ............................................... 49
2 OBJETIVOS .................................................................................................. 50
2.1 Objetivo geral ............................................................................................... 51
2.2 Objetivos específicos .................................................................................. 51
3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 52
3.1 Animais ......................................................................................................... 53
3.2 Aspectos éticos ........................................................................................... 53
3.3 Ambientes ..................................................................................................... 53
3.4. Horário dos experimentos .......................................................................... 54
3.5 Observações clínicas .................................................................................. 54
3.6 Aparelhos e instrumentos laboratoriais .................................................... 54
3.8 Drogas, soluções, líquidos............................................................................... 55
3.9 Protocolo experimental e desenho do estudo ....................................... 56
3.9.1 Curva dose-resposta para escolha da dose de oxaliplatina ................... 56
3.8.2 Investigação do efeito de fármacos analgésicos ..................................... 57
3.8.3 Avaliação histopatológica ........................................................................... 58
3.8.4 Investigação por imunohistoquímica ........................................................ 59
3.10 Testes ....................................................................................................... 60
3.10.1 Testes neuropáticos .................................................................................... 60
3.10.1.1 Teste de hiperalgesia/alodínia mecânica plantar (Von Frey eletrônico)
.................................................................................................................. 60
3.10.1.2 Teste de hiperalgesia/alodínia térmica (teste de imersão da cauda)
.................................................................................................................. 61
3.10.1.3 Atividade motora forçada, locomoção e equilíbrio (Rota Rod) ........ 62
3.10 Análise estatística ....................................................................................... 63
4 RESULTADOS .............................................................................................. 64
4.1 Curva dose resposta para escolha da dose de oxaliplatina .................... 65
4.1.1 Estudo da neuropatia sensitiva periférica ................................................. 65
4.1.1.1 Estudo da hiperalgesia mecânica plantar (Von Frey) ............................ 65
4.1.1.2 Estudo da hiperalgesia e alodínia térmica (Imersão da cauda) ............. 67
4.1.2 Estudo da atividade motora forçada, locomoção e equilíbrio ................. 73
4.2 Média ponderal ............................................................................................. 73
4.3 Investigação do efeito de fármacos analgésicos ...................................... 76
4.3.1 Carbamazepina (CBZ) .................................................................................. 76
4.3.2 Oxcarbazepina (OZP) ................................................................................... 76
4.3.3 Gabapentina (GABAP) ................................................................................. 79
4.3.4 Indometacina (INDO) ................................................................................... 79
4.3.5 Estudo da atividade motora forçada, locomoção e equilíbrio analisando o
efeito dos fármacos analgésicos .......................................................................... 82
4.4 Análise histopatológica ................................................................................. 84
4.5 Análise de mediadores periféricos por imunohistoquímica ...................... 84
5 DISCUSSÃO .................................................................................................. 93
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................ 115
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 118
APÊNDICES ........................................................................................................... 131
INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
1.1 Câncer
Neoplasia (neo= novo + plasia = tecido) é o termo que designa alterações
celulares que acarretam um crescimento exagerado dessas células, ou seja,
proliferação celular anormal, sem controle e de forma autônoma, na qual reduzem
ou perdem a capacidade de se diferenciar, em consequência de mudanças nos
genes que regulam o crescimento e a diferenciação celular. A neoplasia pode ser
maligna ou benigna.
As doenças neoplásicas representam um grave problema de saúde pública
em todo o mundo, acometendo, a cada ano, nove milhões de pessoas das quais
aproximadamente cinco milhões, evoluem para o óbito (OMS, 2009). O câncer de
mama é a neoplasia de maior ocorrência entre as mulheres de países desenvolvidos
ou em desenvolvimento. No Brasil é o primeiro ou o segundo câncer mais frequente,
dependendo da região do país (GUIRRO; GUIRRO, 2004).
As neoplasias malignas representam uma classe de doença caracterizada
pelo crescimento descontrolado de células aberrantes. A invasão destrutiva de
órgãos normais por estas células, por extensão direta ou por disseminação à
distância que pode ser através do sangue, linfa ou superfície serosa, leva a perda de
funções dos órgãos atingidos e consequentemente à morte do organismo. Dentre
essas neoplasias malignas há o câncer (SANTOS et al., 2008).
O termo neoplasia significa literalmente “crescimento novo. O termo tumor foi
originalmente aplicado ao intumescimento causado pela inflamação. As neoplasias
também podem induzir intumescimentos; entretanto, com o decorrer do tempo, o uso
não-neoplásico do termo tumor foi abandonado, de modo que, na atualidade, o
termo é sinônimo de neoplasia. A oncologia (do grego oncos = tumor) refere-se ao
estudo dos tumores ou neoplasias. A palavra câncer é o termo comum utilizado para
referir-se a todos os tumores malignos. Embora as origens antigas destes termos
sejam umas tanto incertas, ele provavelmente, deriva do latim caranguejo, câncer,
presumivelmente pelo fato de um câncer “aderir a qualquer parte e agarrar-se de
modo obstinado, como um caranguejo” (COTRAN; KUMAR; COLLINS; 2000).
Podemos definir o câncer como um termo genérico para um grupo de mais de
100 doenças que podem afetar somente uma parte do corpo ou ocorrer em
metástase, sendo esta a maior causa de morte. Em 2008, o câncer correspondeu a
466.730 novos casos de câncer, sendo 231.860 casos em homens e 234.870 em
mulheres. Tendo diferenças por região do país e por sexo como mostra a figura 1
abaixo (SANTOS et al, 2008).
Sexo masculino
Sexo feminino
Pr
ótata
49,530
28 %
Mama
49,400
28 %
Pulmão
17,810
10 %
Ú
t
er
o
18,680
11 %
Estômago
14,080
8 %
Co
lo
rretal
14,500
8 %
Colorretal
12,490
7 %
Pulmão
9,460
5 %
Oral
10,380
6 %
Estômago
7,720
4 %
Esôfago
7,900
4 %
Leu
ce
mia
4,320
2 %
Leucemia
5,220
3 %
Oral
3,780
2 %
Melanoma
de pele
2,950
2 %
Melanoma
de pele
2,9
70
2 %
Outros
55,610
32 %
Es
ôfago
2,650
2 %
O
utros
62,270
35 %
Figura 1 - Novos casos estimados de câncer por sexo.
Fonte: SANTOS et al, 2008
.
O prognóstico da doença e o manuseio terapêutico estão relacionados ao
grau de penetração do tumor, presença de envolvimento de linfonodos regionais e
metástases à distância. Essas características formam a base para o sistema de
estadiamento desenvolvido para esta doença.
Atualmente se acredita que o câncer tenha origem em uma única célula,
como resultado de um acúmulo de anormalidades (mutações) no ácido
desoxirribonucléico (DNA) daquela célula. Quando ocorrem nos genes
fundamentais, como por exemplo, aqueles envolvidos no controle do ciclo celular,
apoptose, reparo do DNA e, essas mutações podem causar crescimento celular
descontrolado e, finalmente, talvez, um tipo celular que adquiriu a capacidade de se
metastatizar. Foi reconhecido um grande número de agentes etiológicos que
causam lesão genética e transformação neoplásica (SPENCE; JOHNSTON, 2003).
É possível obter importantes esclarecimentos sobre a etiologia do câncer a
partir de estudos epidemiológicos que relacionam as influências ambientais, raciais,
possivelmente hereditárias e culturais com a ocorrência de neoplasias malignas.
Além disso, certas doenças associadas a um risco aumentado de desenvolver
câncer podendo fornecer dados esclarecedores sobre a patogenia da malignidade
(COTRAN; KUMAR; COLLINS; 2000).
Nos doentes oncológicos manifestam-se síndromes álgicas frequentes e mais
incapacitantes que em outras condições patológicas. Decorrem de fatores
relacionados direta ou indiretamente com o tumor primário e suas metástases. E
muitas vezes as síndromes álgicas estão relacionadas ou são exacerbadas pelo
tratamento.
Dependendo da fase do câncer, dois ou até três esquemas terapêuticos
podem ser combinados ao mesmo tempo ou de forma sequencial para tratar o
câncer. Os antineoplásicos possuem atividade biológica antiproliferativa que envolve
baixa seletividade e alta toxicidade que limita seu uso no tratamento de doenças
neoplásicas. Dentre os antineoplásicos a oxaliplatina (OXL), objeto de estudo do
presente trabalho, vem se destacando por ser a primeira linha de tratamento de
diversos tipos de câncer dentre eles o colorretal, ovariano, pulmonar e mais
recentemente na terapêutica do câncer de pâncreas.
1.2 Tratamentos para o câncer
O tratamento do câncer consiste em inibir a proliferação excessiva de células
neoplásicas, podendo incluir três tipos principais de tratamento como a cirurgia, a
radioterapia e a quimioterapia. Esses dois últimos métodos podem acarretar efeitos
colaterais.
1.2.1 Cirurgia
A cirurgia é a forma mais antiga de tratamento do câncer. Aproximadamente
60% dos pacientes de câncer serão submetidos à cirurgia isoladamente ou em
combinação com outras terapias. Há sete tipos de cirurgia de câncer classificadas
pelo Instituto Nacional do Câncer - INC (2009):
• Cirurgia preventiva: é usada para impedir o câncer de acontecer, como por
exemplo, em casos de cânceres de cólon que podem ser prevenidos
removendo pólipos pré-cancerosos antes de se tornarem malignos.
• Cirurgia diagnóstica: também é conhecida como biópsia. Neste
procedimento, o cirurgião remove alguns fragmentos ou o todo de um tumor
para exame e determinar se o crescimento é canceroso.
• Cirurgia de estadiamento: é utilizada para determinar a extensão de um
câncer que auxilia no planejamento da melhor forma de tratamento.
• Cirurgia curativa: envolve remoção de um tumor canceroso localizado que
não têm metástases para outras partes do corpo. Pode ser seguido de
radioterapia ou quimioterapia para se certificar que todas as células
cancerosas foram destruídas.
• Cirurgia suportiva: é usada para dar suporte em outros tratamentos de
câncer. Por exemplo, alguns dispositivos de quimioterapia requerem um portal
(dispositivo) a ser inserido debaixo da pele.
• Cirurgia restauradora: devolve a aparência e função normal ou próximo ao
normal após o tratamento de câncer. A cirurgia reconstrutiva mais comum é a
reconstrução da mama após uma mastectomia.
• Cirurgia paliativa: realizada para alívio da dor, fornece via alimentar ou
outras complicações que vêm com câncer avançado. Cirurgia paliativa pode
melhorar a qualidade de vida, mas não é uma cura para o câncer.
1.2.2 Radioterapia
É um método capaz de destruir células tumorais, empregando feixe de
radiações ionizantes. Uma dose pré-calculada de radiação é aplicada, em um
determinado tempo, a um volume de tecido que engloba o tumor, buscando
erradicar todas as células tumorais, com o menor dano possível às células normais
circunvizinhas, à custa das quais se fará a regeneração da área irradiada (INCA,
1993).
As radiações ionizantes são eletromagnéticas ou corpusculares e carregam
energia. Ao interagirem com os tecidos, dão origem a elétrons rápidos que ionizam o
meio e criam efeitos químicos como à hidrólise da água e a ruptura das cadeias de
DNA. A morte celular pode ocorrer então por variados mecanismos, desde a
inativação de sistemas vitais para a célula até sua incapacidade de reprodução
(INCA, 1993).
A resposta dos tecidos às radiações depende de diversos fatores, tais como a
sensibilidade do tumor à radiação, sua localização e oxigenação, assim como a
qualidade e a quantidade da radiação e o tempo total em que ela é administrada.
Normalmente, os efeitos das radiações são bem tolerados, desde que sejam
respeitados os princípios de dose total de tratamento e a aplicação fracionada. Os
efeitos colaterais podem ser classificados em imediatos e tardios, sendo os efeitos
imediatos observados nos tecidos que apresentam maior capacidade proliferativa,
como as gônadas, a epiderme, as mucosas dos tratos digestivo, urinário e genital e
a medula óssea. Os efeitos tardios (mais raros) ocorrem quando as doses de
tolerância dos tecidos normais são ultrapassadas e manifestam-se por atrofias e
fibroses. As alterações de caráter genético e o desenvolvimento de outros tumores
malignos são raramente observados (INCA, 1993).
Todos os tecidos podem ser afetados, em graus variados, pelas radiações.
Normalmente, os efeitos se relacionam com a dose total absorvida e com o
fracionamento utilizado. A cirurgia e a quimioterapia podem contribuir para o
agravamento destes efeitos (INCA, 1993).
1.2.3 Quimioterapia
A quimioterapia é o método que utiliza compostos químicos, chamados
quimioterápicos, no tratamento de doenças causadas por agentes biológicos.
Quando aplicada ao câncer, a quimioterapia é chamada de quimioterapia
antineoplásica ou quimioterapia antiblástica (INCA, 1993).
O primeiro quimioterápico antineoplásico foi desenvolvido a partir do gás
mostarda, usado nas duas Guerras Mundiais como arma química. Após a exposição
de soldados a este agente, observou-se que eles desenvolveram hipoplasia medular
e linfóide, o que levou ao seu uso no tratamento dos linfomas malignos. A partir da
publicação, em 1946, dos estudos clínicos feitos com o gás mostarda e das
observações sobre os efeitos do ácido fólico em crianças com leucemias, verificou-
se avanço crescente da quimioterapia antineoplásica. Atualmente, quimioterápicos
mais ativos e menos tóxicos encontram-se disponíveis para uso na prática clínica
(INCA, 1993).
Os avanços verificados nas últimas décadas, na área da quimioterapia
antineoplásica, têm facilitado consideravelmente a aplicação de outros tipos de
tratamento de câncer e permitido maior número de curas (INCA, 1993).
1.3 Classificação química dos quimioterápicos
1.3.1 Complexos de Platina
O estudo de complexos metálicos para uso na quimioterapia teve grande
impulso depois da descoberta das propriedades antitumorais do cis-
diaminodicloroplatina II (cis[Pt(NH
3
)
2
Cl
2
]), comumente chamado “cisplatina”, e que é
um dos compostos mais utilizados no tratamento do câncer (CHU et al., 2004).
Esse complexo foi primeiramente descrito por Reiset em 1844 e, um ano
após, Peyrone descreveu outro composto com a mesma fórmula molecular, sendo
que apenas em 1893 Werner propôs os dois compostos isômeros: o complexo de
Reiset correspondia ao isômero trans 5, e o de Peyrone à forma cis (CHU et al.,
2004).
Entretanto, as propriedades antitumorais de compostos contendo platina (Pt)
só foram descobertas mais de um século após a descrição dos compostos de Reiset
e Peyrone. No final da década de 60 do século XX, Barnet Rosenberg, um físico,
então trabalhando na Universidade do Estado de Michigan, nos Estados Unidos,
procurava estudar os efeitos do campo elétrico em uma cultura de bactérias
Escherichia coli. Rosenberg observou que a divisão celular era inibida, e durante o
processo, as células de E. coli, como não podiam se dividir, cresciam formando
filamentos alongados. Iniciou-se então uma busca pelos possíveis agentes
responsáveis pelo fenômeno, e as pesquisas mostraram que a Pt do eletrodo se
dissolvia no meio de cultura, que continha sais de amônio, para formar espécies
complexas do metal. Levou-se em consideração a hipótese de formação do sal
(NH
4
)
2
[PtCl
6
] (CHU et al., 2004).
A partir desses resultados, uma série de complexos de Pt foi sintetizada e
submetida a testes em camundongos portadores de sarcoma-180, um modelo de
tumor usado para ensaios farmacológicos. Os compostos que se mostraram mais
eficazes eram todos neutros e de configuração cis e, dentre eles, o que apresentou
maior atividade foi o cis-3, cisplatina (cis[Pt(NH
3
)
2
Cl
2
]), que provocou a regressão
total do tumor em 36 dias, enquanto o seu isômero, trans-diaminodicloroplatina II (5,
transplatina), se mostrou inativo (CHU et al., 2004).
Já no início da década de 70, a cisplatina começou a ser submetida a testes
clínicos, inicialmente em pacientes terminais e posteriormente em tumores
localizados, como câncer de testículo e ovário, tendo sido lançado no mercado
americano em 1979. O carcinoma testicular, que era quase sempre letal, tornou-se
curável em cerca de 80% dos casos quando submetido ao tratamento com esse
composto. Atualmente a cisplatina é usada em vários outros tipos de neoplasias,
como câncer de pulmão, cabeça, esôfago, estômago, linfomas, melanoma,
osteossarcoma, de mama e cérvix, sobretudo em associação com outras drogas, em
vários esquemas terapêuticos (CHU et al., 2004).
A descoberta da atividade antitumoral da cisplatina provou ser possível
encontrar novos complexos metálicos com propriedades terapêuticas excelentes e
constituiu um grande incentivo para o desenvolvimento e procura de novos
complexos metálicos com atividade semelhante (CHU et al., 2004).
Este fármaco tem apresentado potencial terapêutico em grande variedade de
neoplasias humanas. É um dos agentes cito-redutores mais eficazes no tratamento
de vários tumores, sendo particularmente eficaz no tratamento dos tumores do
testículo, ovário, cabeça, pescoço, melanomas malígnos, carcinomas da bexiga e do
pulmão (BEHLING, 2004; AL-SARRAF et al., 1997). Contudo, seu uso clínico está
limitado devido ao surgimento de efeitos colaterais peculiares, tais como a
ototoxicidade e a nefrotoxicidade.
A descoberta das propriedades antitumorais da cisplatina constituiu um marco
na história da Química Medicinal, a qual inicialmente dedicava-se principalmente ao
estudo de compostos orgânicos e produtos naturais. Depois dessa descoberta pode-
se dizer que se abriu uma nova perspectiva, com a inclusão de complexos metálicos
como possíveis agentes terapêuticos. Desde então vários trabalhos se dedicaram a
investigar o mecanismo de ação da cisplatina e compostos correlatos no organismo.
Apesar do inquestionável sucesso da cisplatina na quimioterapia do câncer,
tornava-se urgente melhorar a sua eficiência clínica em termos da resistência e
redução da toxicidade. Na etapa seguinte do desenvolvimento dos complexos de Pt,
pretendia-se a identificação de um novo derivado que mantivesse a atividade
antitumoral da cisplatina, mas reduzisse seus efeitos tóxicos (HARRAP, 1985).
Foram sintetizados milhares de novos complexos com estrutura semelhante à
cisplatina e cerca de mil foram sujeitos a teste pré-clínicos.
A carboplatina é um composto de Pt de segunda geração, tendo origem na
cisplatina e também age interferindo na síntese de DNA (LANORE; DELPRAT,
2004). O espectro e atividade são semelhantes à cisplatina, com exceção da
toxicidade renal e da êmese que aparecem de forma menos intensa. Os efeitos
colaterais descritos com o uso da carboplatina são relacionados a alterações renais
além de efeitos gastrointestinais como anorexia, vômitos e constipação, também
podendo levar a alterações hepáticas. Entretanto, o principal efeito colateral da
carboplatina é hematológico, que se manifesta principalmente por leucopenia,
podendo, também, ocorrer anemia. A mielossupressão pode ser observada entre 10
e 14 dias e pode ser severa (CHUN; GARRET; MACEWVEN, 2001).
Um dos problemas principais associados à cisplatina e carboplatina além da
toxicidade renal e hematológica é a resistência tumoral. Dessa forma o
desenvolvimento de novos complexos de Pt, evolui no sentido de se alterar a
estrutura base por modificação da natureza ou número dos ligandos fixos, com o
objetivo principal de se ultrapassar esse problema da resistência. Dessa
investigação surgiu uma classe principal de complexos, designada por complexos de
terceira geração, baseada no ligando 1-2-diaminociclohexano (DACH), por exemplo,
a oxaliplatina (HOLLIS; AMURDSEN; STERM, 1989).
Os compostos Pt representam uma importante classe de compostos
anticancer e são usados para tratar em larga escala tumores sólidos (Figura 2).
Figura 2 – Estrutura química de análogos platinos.
Fonte: MARSHALL, 2004
1.7 Oxaliplatina (OXL)
A oxaliplatina (OXL), um trans-l-diaminociclohexano oxalatoplatino (L-OHP),
foi desenvolvida na década de 70 como um dos vários compostos platinos 1,2-
Diamino-Ciclo-Hexano (DACH) na tentativa de se obter análogos com índice
terapêutico mais favorável, basicamente menos nefrotoxicidade (CVITKOVIC;
BEKRADDA, 1999). Esses compostos 1,2-DACH provocaram um entusiasmo
imediato por não apresentarem resistência cruzada com a cisplatina e carboplatina e
cisplatina
carboplatina
oxaliplatina
por terem um perfil pré-clinico distinto dos análogos mais antigos. Entretanto o
interesse nesses agentes esfriou após a constatação dos severos efeitos tóxicos
neurológicos nos estudos de fase I com a tetraplatina, um dos compostos 1,2 DACH
mais promissores da época.
Os testes clínicos com OXL, mais de uma década depois, revelaram a sua
poderosa atividade antitumoral e sua toxicidade relativamente favorável. Assim a
OXL provou ser efetiva como primeira e segunda linha no tratamento dos tumores
refratários ao 5- fluorouracil (5-FU). A OXL mostrou-se efetiva contra o câncer
ovariano avançado pré-tratado e não tratado (MACHOVER et al., 1996).
Outro ponto positivo a favor da OXL é que ela não provoca os efeitos tóxicos
renais e hematológicos e nem induz ototoxicidade, comumente observados com
cisplatina. Os efeitos eméticos também são mais bem controlados. A
neurotoxicidade, entretanto, apesar de ser na maioria das vezes reversível, parece
ser o efeito colateral que mais chama a atenção (MACHOVER et al., 1996;
CHOLLET et al., 1996).
Resultados pré-clinicos mostram que a OXL e outros compostos DACH-Pt
são indicados com significante atividade citotóxica em linhadens de células
cancerosas humanas que tinham resistência à cisplatina e à carboplatina.
Especificamente a OXL exibe uma potente atividade citotóxica em larga escala de
células cancerosas como colorretal, ovariano e pulmonar (CHU, 2004). Os efeitos
antitumorais da OXL aumentam o seu uso em combinação com outros agentes
anticancer (CHU, 2004).
1.7.1 Mecanismo de ação antitumoral da oxaliplatina
Como todos os outros compostos Pt a OXL precisa ser convertida em espécie
reativa em reações de desacoplamento e tanto no sangue como no meio
intracelular. Obeserva-se na figura 3 um esquema do mecanismo de ação. Os
nucleófilos fracos como o bicarbonato do sangue ou dihidrogênio fosfato do meio
intracelular desacoplam o grupamento oxalato resultando na formação de
intermediários não estáveis que são rapidamente hidrolisados a espécies platinas
diaqua 1,2-DACH dicloreto (CVITKOVIC, 1998). Esse composto é então convertido a
monocloroplatino de monoaqua-1,2-DACH e a dicloretoplatino de 1,2-DACH os
quais reagem instantaneamente com o DNA celular. Como resultado forma-se
aductos platinados guanina-guanina ou adenina-guanina intracadeia (CHU et al.,
2004).
A ligação dos metabólitos da OXL ao DNA resulta em inibição da síntese e da
função, bem como a inibição da transcrição. Apesar da lesão ao DNA pela OXL
aparentar semelhança com a lesão provocada por cisplatina/carboplatina, os
metabólitos 1,2-DACH-Pt produzidos pela OXL são significativamente mais
citotóxicos do que os metabólitos formados por cisplatina/carboplatina. As
evidências sugerem que o 1,2-DACH formado pela OXL liga-se de forma mais
potente e também é capaz de escapar do reconhecimento pelo complexo de
enzimas de reparo de má combinação (MMR do inglês mismatch repair) que é a
correção de bases mal pareadas do DNA (CVITKOVIC; BEKRADDA, 1999).
A presença do 1,2-DACH retido no DNA previne o bypass replicativo, um dos
mecanismos de resistência observados com o uso de cisplatina (CVITKOVIC;
BEKRADDA, 1999).
O fato dos aductos de OXL escaparem do complexo MMR explica a sua
excelente atividade contra tumores que exibem complexos MMR aberrantes, como é
o caso dos carcinomas colorretais e também explica um efeito melhor do que a
cisplatina em tumores sensíveis a essa droga, assim como tumores refratários à
cisplatina possivelmente respondem bem a OXL (MACHOVER et al., 1996,
CHOLLET et al., 1996).
Aproximadamente 75-85% da dose de OXL liga às proteínas celulares,
preferencialmente nos átomos de enxofre presentes nos resíduos dos aminoácidos
cisteína ou metionina. A determinação da atividade citotóxica de OXL, em relação a
sua potencial ligação a proteínas-chaves nucleares ou citoplasmáticas, ainda está
sendo elucidado (CHU, 2004).
Figura 3 – Mecanismo de ação da oxaliplatina.
Fonte: Pesquisador, 2009.
1.4.2 Mecanismo de resistência da oxaliplatina
Mecanismos gerais de resistência de compostos Pt e OXL tem sido
identificados, incluindo o acúmulo de droga secundariamente a alterações no
transporte celular, aumento da inativação por proteínas contendo grupo sulfidrila
como a glutationa ou enzimas relacionadas com a glutationa e aumento da
reparação de DNA com incremento da expressão de enzimas-chaves como ERCC1
(excisionrepair cruz complementação grupo 1), uma proteína implicada na reparação
do DNA que tem maior expressão na célula do carcinoma escamoso (RAYMOND et
al., 2002) É a principal enzima da cascata NER (nucleotide excision repair),
mecanismo responsável pela reparação do DNA. Esta enzima de 33 kDa é
codificada pelo gene ERCC1, de 15 kb, localizado no cromossoma 19q. Este gene
foi altamente preservado durante a evolução e é expresso em todos os tecidos em
níveis relativamente elevados (CARVALHO et al., 2009).
O sistema de reparo de bases mal pareadas humano MMR é formado por
seis genes capazes de sintetizar proteínas com a função de reparo do DNA: hMSH2
(do inglês human mut S homolog); hMLH1 (do inglês human mut L homolog);
hMSH3 (do inglês human mut S homolog) ; hPMS1 (do inglês human post meiotic
HCO
3
-
+
oxalato
N7
DACH –pt- oxalato
MMR
1,2
-
DACH
-
pt
HCO
3
-
+
oxalato
N7
Transcrição e
Replicação
segregation); hPMS2 (do inglês human post meiotic segregation) e hMSH6 (do
inglês human mut S homolog). As proteínas produzidas por esses genes possuem a
capacidade de remover um segmento de DNA contendo uma alteração na
sequência de bases e posteriormente corrigi-lo (NUNN, 2003).
Alterações na atividade de MMR com aumento da expressão de hMLH1,
hMLH2 ou outras enzimas MMR, conferem resistência para cisplatina/carboplatina,
mas não à OXL. Esses achados conferem particular relevância em pacientes com
câncer colorretal hereditário não poliposo que tem defeitos em MMR, ou em
pacientes com câncer colorretal esporádicos nos quais os defeitos de MMR são
observados em torno de 10-20% e pode explicar a atividade da OXL em câncer
colorretal, mas não a de cisplatina ou carboplatina (CHU, 2004).
1.4.3 Farmacocinética da oxaliplatina
A OXL é extensamente distribuída por todas as células do corpo, com volume
de distribuição mais elevado que a cisplatina. Depois de uma infusão de OXL há
acúmulo de compostos Pt em três compartimentos: plasma, ultra filtrado e associado
à hemácias. Aproximadamente 85% de todos os compostos Pt ligam-se nas
proteínas plasmáticas e 40% nas hemácias dentro de 2-5 horas de administração.
Contudo, esse acúmulo em hemácias tem pequena relevância clínica (CHU, 2004).
Com respeito ao metabolismo, a OXL faz uma extensa conversão não
enzimática para ativar espécies citotóxicas, semelhante ao observado com cisplatina
e carboplatina. Essa é uma reação aquosa que ocorre na presença de cloreto, e as
espécies formadas são monocloro-DACH, dicloro-DACH e monodiaquo-DACH Pt.
Somente uma pequena fração da droga (<2%) é eliminada nas fezes, a OXL é
realmente excretada pelos rins, com mais de 50% pela urina (CHU, 2004).
1.4.4 Esquemas quimioterápicos
Existem diversos esquemas terapêuticos de administração únicas de OXL e
em bolus como:
• Oxaliplatina com 5-fluourouracil e leucovorin (FOLFOX);
• Oxaliplatina 5-fluourouracil, leucovorin e bevacizumab (FOLFOX/BEV);
• Oxaliplatina com capecitabina (XELOX);
• FOLFOX 4 e irinotecano (IROX);
O esquema FOLFOX possui classificações diferentes como visto na tabela
abaixo:
Tabela 1 - Esquemas de combinação FOLFOX (em 2 semanas)
Droga FOLFOX 2 FOLFOX 3 FOLFOX 4 FOLFOX 6 FOLFOX 6
modificado
FOLFOX 7
Oxaliplatina
(OXL)
100mg/m
2
em 2h de
infusão no
dia 1.
85mg/m
2
em 2h de
infusão no
dia 1.
85mg/m
2
em 2h de
infusão no
dia 1.
100mg/m
2
em 2h de
infusão no
dia 1.
85mg/m
2
IV
no dia 1.
130mg/m
2
em 2h de
infusão no
dia 1.
Leucovorin
(LV)
500mg/m
2
em 2h de
infusão nos
dias 1 e 2.
500mg/m
2
em 2h de
infusão nos
dias 1 e 2.
200mg/m
2
em 2h de
infusão nos
dias 1 e 2.
400mg/m
2
em 2h de
infusão no
dia 1.
400mg/m
2
IV no dia 1.
400mg/m
2
em 2h de
infusão no
dia 1.
Fluourouracil
(FU)
1,5-2,0g/m
2
em 24h de
infusão nos
dias 1 dia e
2.
1,5-2,0g/m
2
em 24h de
infusão nos
dias 1 dia e
2.
400mg/m
2
em bolus e
600mg/m
2
Em 22h de
infusão nos
dias 1 e 2.
400mg/m
2
em bolus e
2,4-3,0g/m
2
em 46h de
infusão nos
dias 1 e 2.
400mg/m
2
em bolus no
dia 1 e
2,4g/m
2
em 22h em
IV continuo
em 46h,
nos dias 1 e
2.
2,4g/m
2
em
bolus em
46h de
infusão nos
dias 1 e 2.
Fonte: MARSHALL, 2004.
1.4.5 Importância da oxaliplatina no tratamento do câncer
O antineoplásico OXL obteve uma autorização para comercialização na
França no tratamento de segunda linha do câncer colorretal metastático em 1996 e
no de primeira linha em 1998. Em julho de 1999, a OXL foi registrada no tratamento
de primeira linha do câncer colorretal em estágio avançado, nos principais países
europeus. Em seguida, OXL atendeu as diversas etapas do processo de
reconhecimento mútuo europeu em dezembro de 2003, o que permitiu um registro
para tratamento do câncer colorretal metastático (tanto de primeira quanto de
segunda linha), em associação com 5-FU e ácido folínico (MARSHALL, 2004)
Nos Estados Unidos da América (EUA) a OXL, em associação com o
protocolo 5-FU/LV em infusão, foi aprovada em 2004 para o tratamento de primeira
linha do carcinoma do cólon ou do reto em estágio avançado (primeiro tratamento de
pacientes que apresentam câncer colorretal metastático). Esta mesma associação, à
base de OXL, havia inicialmente recebido aprovação da agência americana, a Food
and Drug Administration (FDA), para o tratamento de segunda linha dessa
população de pacientes (tratamento de pacientes que apresentam câncer colorretal
metastático anteriormente tratados) (MARSHALL, 2004).
Nesse sentido nota-se que o principal uso de OXL está no tratamento do
câncer colorretal de atual importância epidemiológica mundial, visto que, a cada ano,
aproximadamente um milhão de novos casos é diagnosticado em todo o mundo.
Aproximadamente 194.000 novos casos são detectados na Europa e 150.000 nos
EUA. De acordo com a American Cancer Society, o câncer colorretal é a segunda
maior causa de morte relacionada ao câncer nos EUA, representando 10% a 15%
de todas as mortes causadas por câncer. Durante a vida, aproximadamente 1 em 18
indivíduos desenvolve câncer colorretal, e mais de 56.000 indivíduos morrem devido
a este câncer nos EUA a cada ano. Na Europa, 94.000 indivíduos morrem devido ao
câncer colorretal a cada ano (MARSHALL, 2004).
O número de casos novos de câncer de cólon e reto estimado para o Brasil
no ano de 2010 será de 13.310 casos em homens e de 14.800 em mulheres. Estes
valores correspondem a um risco estimado de 14 casos novos a cada 100 mil
homens e 15 para cada 100 mil mulheres. Sem considerar os tumores de pele não
melanoma, o câncer de cólon e reto em homens é o terceiro mais frequente nas
regiões Sul (21/100.000) e Sudeste (19/100.000). Na Região Centro-Oeste
(11/100.000) ocupa a quarta posição. Nas regiões Nordeste (5/100.000) e Norte
(4/100.000) ocupam a quinta posição. Para as mulheres, é o segundo mais
frequente nas regiões Sul (22/100.000) e Sudeste (21/100.000); o terceiro nas
regiões Centro-Oeste (11/100.000) e Nordeste (6/100.000), e o quinto na região
Norte (4/100.000) (BRASIL, 2009).
O câncer colorretal é o câncer que se inicia nas células de revestimento do
cólon ou reto. Quando estas células se disseminam além do cólon para locais
distantes no organismo, o câncer é denominado metastático. As células cancerosas
podem se disseminar ou metastatizar através do sistema hemático ou linfático, ou
crescer diretamente nos tecidos adjacentes ao câncer original (MARSHALL, 2004).
Um diagnóstico de câncer colorretal está associado a um estágio que reflete a
extensão do câncer e se há metástase. Os pacientes com câncer colorretal com
metástase para órgãos ou tecidos distantes são denominados como apresentando
câncer colorretal avançado ou metastático, também conhecido como câncer
colorretal estágio IV (MARSHALL, 2004).
As mortes por câncer se caracterizam por uma demanda física e mental à que
estão expostos tanto os pacientes como seus familiares. Dentre os cânceres o de
colorretal metastático é um dos mais agressivos. Com a introdução de novas drogas
quimioterápicas para o seu tratamento a expectativa de vida aumentou de
aproximadamente 6 meses para 20,3 meses como mostra a figura 4 abaixo:
Exposição total ao tratamento *
Figura 4 – Expectativa de vida do câncer colorretal metastático
Fonte:
1
CUTSEM; VERSLYPE, 2002;
2
DOUILLARD et al., 2000 ;
3
DE GRAMONT et al., 2000;
4
GOLDBERG et al., 2003;
5
HURWITZ et al., 2003 ;
6
SALTZ et al., 2000.
A sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for
diagnosticada em estádio inicial. A sobrevida média global em cinco anos se
encontra em torno de 55% nos países desenvolvidos e 40% para países em
desenvolvimento. Esse relativo bom prognóstico faz com que o câncer de cólon e
reto seja o segundo tipo de câncer mais prevalente em todo o mundo, com
aproximadamente 2,4 milhões de pessoas vivas diagnosticadas com essa neoplasia,
ficando atrás somente do câncer de mama em mulheres (BRASIL, 2009).
1.4.6 Efeitos colaterais do uso de oxaliplatina
Dos compostos Pt a OXL é aquela que apresenta menos efeitos colaterais
graves. Como foi dito, possui pouco efeito hemato, nefro e ototóxico. O efeito que
mais chama a atenção no uso de OXL é a sua toxicidade neurológica que
Sem Drogas ativas
1
Droga ativa (5-FU/LV)
2,3,6
Drogas ativas (5-FU/LV + OXL
ou irinotecan)
2,3,6
Drogas ativas (5-FU/LV + OXL +
irinotecan)
4
Drogas ativas + Anti-VEGF
5
(*) Ou Anti-EGFR (Cetuximab) ou inibidor de Tirosina Quinase do
EGFR (Erlotinib)
~4-6
meses
~12-14 meses
~15 meses
~15-20 meses
0
6
12 18 24
20,3 meses
dependendo do grau de intensidade causa muito desconforto e promove limitação
das dosagens e continuação do tratamento.
A neurotoxicidade manifestada pela OXL apresenta dois distintos sintomas
uma síndrome aguda que pode durar pouco após a infusão e uma dose limite de
toxicidade (DLT), crônica.
1.4.6.1 Neurotoxicidade aguda
As toxicidades agudas mais comuns são: laringoespasmo, náuseas, vômitos,
diarréia e reações de hipersensibilidade (MARSHALL, 2004).
Essa toxicidade aguda é rápida e pode ocorrer durante a infusão ou horas
depois e geralmente é induzida pela exposição ao frio. Pode ser manifestada
toxicidade motora e sensorial, os componentes sensoriais consistem em: parestesia
e/ou disestesia em extremidades e/ou na região oral (MARSHALL, 2004).
1.4.6.2 Neurotoxicidade crônica
Os sintomas crônicos mais comuns, não induzidos pelo frio, são as
disestesias e parestesias de extremidades que persistem entre os ciclos e
aumentam com o acúmulo das doses. Podem ocorrer ataxia, déficit em coordenação
sensório-motora fina. Esses sintomas são reversíveis na maioria dos pacientes do
grau 3 de toxicidade para o grau 1 em 6-12 meses após o término da terapia
(MARSHALL, 2004). As características clínicas mais comuns da neuropatia induzida
por OXL pode ser vista na tabela 2 abaixo.
Tabela 2 - Características clínicas da neuropatia induzida pela oxaliplatina.
OXALIPLATINA
Agudo Crônico
Incidência 85-95% Grau 3/4 em 16%
Dose limite de toxicidade Não Sim
Sintomas Parestesias, disestesias Perestesias, disestesias, ataxia
sensorial
Localização Extremidades, perioral Extremidades
Ativação Exposição ao frio Nada sugerido
Sintomas motores Espasmos musculares raros Nenhum
Início agudo Demorado
Recuperação Rápida, completa Devagar, mas completa
Dependência de
modulação
Sim Provavelmente não
Outros Disestesias faringolaringeal nenhuma
Fonte: GROTHEY, 2003.
A nível crônico verifica-se dor e diminuição da sensibilidade tátil (TA; LOW;
WINDEBANK, 2009), sendo uma das mais significantes toxicidades da OXL a
neuropatia periférica (SAIF; REARDON, 2005).
As neuropatias periféricas podem ser classificadas de acordo com seis
parâmetros principais: a velocidade de instalação: aguda (menos de uma semana),
subaguda (menos de um mês) ou crônica (mais de um mês); quanto ao tamanho da
fibra nervosa: fina, grossa ou mista; o tipo de fibra nervosa: sensitiva, motora,
autonômica ou mista; a patologia: desmielinização, degeneração axonal ou mista;
distribuição: proximal, distal ou difusa e padrão: mononeuropatia ou polineuropatia
(MARCHIORI; HIRATA, 2003).
A OXL tem causado neuropatia periférica que pode ser dividida em duas
categorias. A primeira, a neuropatia sensorial, frequentemente exacerbada pelo frio,
que ocorre geralmente nas primeiras horas e dias após a infusão de OXL e
geralmente é resolvida em poucas horas; a segunda, a neuropatia periférica
cumulativa, é mais duradoura, pode ser classificada em até 3 graus e tem reversão
mais lenta (HWANG, 2004).
A incidência de neuropatia periférica induzida por OXL aguda apareceu ser
estimativamente alta (até 100%) em dois estudos aplicados clínico e neurológico e
exame de eletrofisiologia em 35 pacientes tratados com OXL e capacitabina. A
temperatura fria representou o principal fator de risco de neuropatia periférica
induzida por OXL aguda (GAMELIN et al., 2002).
A evolução da neurotoxicidade da OXL pode ser classificada de acordo com o
Critério de Toxicidade Comum do Instituto Nacional de Câncer (CTC NCI) como
mostra a tabela abaixo:
Tabela 3 - Evolução da neurotoxicidade da oxaliplatina
Grau 1
Grau 2
Grau 3
INC
Assintomático: perca de
reflexos tendínios ou
parestesias, mas não
interferindo na função.
Alteração sensorial ou
parestesia interferindo na
função, mas não interferindo
com atividades de vida diária.
Alteração sensorial ou
parestesia interferindo
nas atividades de vida
diária.
OSNS
Disestesias ou
parestesias que
regridem completamente
antes do próximo ciclo
de terapia.
Disestesias ou parestesias
persistindo entre os ciclos de
terapia.
Disestesias ou
parestesia
causando dano
funcional
Legenda: INC – Instituto Nacional do Câncer. OSNS – Escala de Neurotoxicidade específica de
oxaliplatina
Fonte: PARK et al., 2009.
Como tratamento da neurotoxicidade induzida pela OXL há dois tipos de
tratamento como mostra a tabela 4 abaixo:
Tabela 4 - Estratégias para profilaxia e tratamento da neurotoxicidade induzida pela oxaliplatina
1 – Estratégia Stop-and-go (ex. OPTIMOX)
Stop
Depois da dose acumulada da oxaliplatina ser alcançada
Quando a neurotoxicidade sensorial de um grau ser desenvolvido
GO
Quando a neurotoxicidade sensoriral tiver regredido
Quando a terapia com oxaliplatina for indicada para parar um tumor em progressão
2 – Agentes neuromoduladores
Infusão de cálcio e magnésio
Glutationa
Carbamazepina
Gabapentina
Amifostina
Ácido α-lipólico
Fonte: GROTHEY, 2003
1.4.6.3 Neurotoxicidade da oxaliplatina aspectos celulares e moleculares
A neuropatia periférica crônica induzida por OXL ainda é pouco estudada, no
que diz respeito aos aspectos moleculares e celulares, entretanto, alguns autores
sugerem que o fenômeno possa ser resultado do metabolismo celular diminuído e
transporte axoplasmático resultando da acumulação de compostos de Pt na Raiz
Dorsal do Gânglio (DRG). O exame histológico da neuropatia periférica induzida por
OXL em modelos animais revela perda axonal com atrofia secundária seletiva das
células DRG, assim sugerindo que a neuropatia periférica induzida por OXL deve ser
mais bem descrita como uma neuropatia periférica. Foi sugerido ainda que, além de
mudanças morfológicas e mudanças funcionais nas células de DRG, a ativação
prolongada de canais de sódio (Na
+
) voltagem-dependentes poderia induzir estresse
celular, assim afetando as células sensórias nervosas (ARGYRIOU et al., 2008).
Mais recentemente foi demonstrado que nos primeiros estágios do
desenvolvimento da neuropatia aguda induzida por OXL, fibras nociceptivas
periféricas são lesionadas por estresse oxidativo e que substâncias antioxidantes
previnem esse efeito. Esses mesmos autores sugerem que o fenômeno pode ser um
dos eventos iniciais que podem levar ao desenvolvimento dos sintomas sensitivos
relacionados à neurotoxicidade da OXL (JOSEPH et al., 2008).
1.8 Dor neuropática
A dor é um sinal de alerta que ajuda a proteger o corpo de danos nos tecidos
(CAILLET, 1999; READY, 1992). A dor apresenta dois componentes importantes: o
componente sensorial e o componente emocional/afetivo. O componente sensorial
(nociceptivo), que corresponde ao mecanismo neurofisiológico, permite por meio da
ativação dos receptores, a transmissão e interpretação do estímulo nociceptivo, que
em geral, é forte o suficiente para produzir lesão tecidual. Componente emocional
corresponde à percepção do estímulo doloroso pelo indivíduo que é seguida pela
tomada de consciência e pela reação à dor (ansiedade, medo, pânico, sofrimento), é
uma resposta afetiva à percepção do estímulo doloroso (RAMADABRAN;
BANSINATH, 1996). Ao se tornar crônica pode constituir razão para a incapacidade
funcional e que se manifesta mesmo na ausência de agressões teciduais vigentes,
tal como ocorre em casos de neuropatia periférica ou central (TEIXEIRA;
FIGURERÓ, 2001).
A definição inicial de dor neuropática proposta pela Associação Internacional
para Estudo da Dor (IASP) a considerava como “dor iniciada ou causada por lesão
primária ou disfunção ou perturbação transitória no sistema nervoso periférico (SNP)
ou sistema nervoso central (SNC)” (MERSKEY; BOGDUK, 1994). Posteriormente a
essa definição, por possuir ambiguidades, foi sugerida a definição de dor
neuropática como “devida à lesão primária do SNP ou SNC” (HANSSON, 2002).
Essa definição é mais específica e baseia-se nos diferentes mecanismos
neurofisiopatológicos.
As características da dor neuropática são a dor e sintomas sensitivos que
persistam além do período de cura, presença de fenômenos sensitivos negativos e
positivos e presença também de fenômenos motores positivos e negativos e de
fenômenos autonômicos (BACKONJA, 2003).
Em recente estudo realizado em 15 países europeus e em Israel, estimou-se
uma prevalência de dor crônica em 19% (BREIVIK et al., 2006). Entretanto, a
prevalência específica de dor neuropática ainda não está estabelecida, com
estimativas que vão de 1,5% a 20% (BENNETT, 1998), ou 5% na população geral
(DAOUSI et al., 2004) ou 1,5% (TAYLOR, 1998). Mais recentemente, entretanto, a
prevalência de dor neuropática foi estimada em 7 a 8% (BENNETT; BOUHASSIRA,
2007).
Outros aspectos de impacto sobre as condições de vida levam em
consideração a presença de depressão ou ansiedade, transtorno do sono, questões
relacionadas ao trabalho, expectativas do tratamento, necessidades de reabilitação
e disponibilidade de apoio social da família e amigos (DWORKIN et al., 2003) e
também as co-morbidades psiquiátricas (HARDEN; COHEN, 2003).
A dor nociceptiva é gerada por estímulos que acionam unidades nociceptivas
periféricas e centrais onde é necessária a integridade das vias sensitivas, enquanto
a dor por desaferentação ou dor neuropática refere-se à dor ocasionada por lesão
neural periférica ou central. Podem ser causadas por afecções traumáticas físicas ou
químicas, doenças inflamatórias ou infecciosas degenerativas, oncopáticas,
vasculares, tóxicas (MILLAN, 1999). Nesse sentido o dano parcial ou mesmo a
destruição de nervos periféricos deve estar associado a uma variedade de
síndromes incluindo: hiperalgesia e alodínia, sensações parestésicas ou
disestésicas e dor espontânea (ver tabela 5).
Os descritores verbais de dor neuropática são elementos de grande valia para
o diagnóstico. Pacientes com dor neuropática descrevem-na como sensação de
choque elétrico (53%), queimação (54%), formigamento (48%), frio, picada e prurido.
Uma terminologia apropriada como mostra a tabela 5 (HANSSON, 2002).
Tabela 5 – seleção de termos e definições de dor (IASP)
Termo de dor Definição
Alodínia Dor devido a um estímulo que
normalmente não provoca dor.
Causalgia Síndrome de dor queimante sustentada,
alodínia e hiperpatia após lesão neural
traumática.
Dor central Dor iniciada ou causada por lesão
primária ou disfunção do sistema
nervoso central.
Disestesia Sensação anormal desagradável,
espontânea ou evocada.
Hiperalgesia Resposta aumentada a um estímulo
normalmente doloroso.
Hiperestesia Sensibilidade aumentada a um estímulo
excluindo as sensibilidades especiais.
Hiperpatia Síndrome dolorosa caracterizada por
reação anormalmente dolorosa a um
estímulo, especialmente estímulo
repetitivo, e por limiar elevado.
Neuralgia Dor no território de inervação de nervos.
Parestesia Sensação anormal, espontânea ou
evocada.
Fonte: ALVES NETO et al., 2009
Em seguimento à investigação verbal, torna-se importante a avaliação
multidimensional por escalas. A avaliação da dor neuropática mediante escalas é
ainda uma exaustiva tarefa não-concluída. O alvo das escalas é definir sintomas e
intensidade da dor e diferenciar dor neuropática de dor não-neuropática (ALVES
NETO et al., 2009).
O exame neurológico deverá concentrar-se principalmente no exame da
sensibilidade dolorosa, tátil, pressão, frio e calor, posição segmentar, vibração e tato
discriminativo. A sensibilidade dolorosa deve ser pesquisada com alfinete ou objeto
pontiagudo, a sensibilidade térmica com estímulo térmico (tubos ou bastões com
água) a 20º e 45ºC, a sensibilidade tátil com mecha de algodão, escova ou toque, a
sensibilidade vibratória com o uso de diapasão nos maléolos e articulações das
falanges e a posição segmentar com o movimento articular do polegar e hálux
(HANSSON, 2002).
As outras funções que deverão ser pesquisadas são força, tônus muscular,
reflexos osteotendinosos, coordenação, marcha e também as funções corticais com
uso do mini exame do estado mental. Por meio da análise da motricidade e reflexos,
juntamente com a da sensibilidade, poderão se configurar sinais e sintomas
negativos e positivos que serão coadjuvantes ao diagnóstico de dor neuropática e
sua origem periférica e central (ALVES NETO et al., 2009).
Também poderão ser úteis exames complementares para confirmação do
diagnóstico etiológico, dentre os quais há o estudo da velocidade de condução e a
eletroneuromiografia (ENM), a ressonância magnética (RNM), o teste sensitivo
quantitativo e o estudo de potenciais evocados (ALVES NETO et al., 2009).
O uso de testes farmacológicos como lidocaína tópica, fentolamina
endovenosa, opióide e cetamina, que avaliam o diagnóstico e a resposta terapêutica
estão sendo utilizados (DELLEMIJIN; VAN DUIJN; VANNESTE, 1998; JENSEN;
BARON, 2003).
As condições etiológicas associadas à dor neuropática, dizem respeito a
entidades clínicas decorrentes de fenômenos patológicos que comprometem o SNP
e SNC e são classificados em de etiologias periféricas como dor pós-amputação,
neuropatias periféricas dolorosas, neuralgia trigeminal e glossofaríngea, síndrome
complexa de dor regional, radiculopatias e aracnoidite e de etiologias centrais como
dor central encefálica (doença vascular cerebral, esclerose múltipla, abcesso,
tumores, doenças inflamatórias, epilepsia e doença de Parkinson) e dor central
medular (traumática, siringomielia e sífilis) (ALVES NETO et al., 2009).
Os mecanismos mais importantes envolvidos na gênese da dor neuropática é
a atividade neuronal ectópica nos neurônios lesados e nos gânglios das raízes
sensitivas, as correntes efáticas, a sensibilização das unidades neuronais centrais, o
desenvolvimento de sinapses aberrantes e as reações físicas, psíquicas e
neuroendócrinas associadas à dor e às incapacidades (TEIXEIRA; FIGUEIRÒ,
2001).
Esses mecanismos podem ser periféricos como sensibilização periférica,
descargas ectópicas (neuroma, brotamento colateral e mudança de fenótipo de
neurônios do DRG), acoplamento simpático-sensitivo, excitação cruzada “efática” e
“não-efática” e alterações fenotípicas e podem ser mecanismos centrais como
sensibilização central, alterações da neuroplasticidade e redução ou perda de
mecanismos inibitórios (ALVES NETO et al., 2009).
Quanto aos mecanismos periféricos a sensibilização periférica está vinculada
a uma resposta aumentada dos terminais nociceptivos, decorrente da ação dos
mediadores inflamatórios, o que dá origem a alodínia e hiperalgesia. Isso é
consequência, a nível dos nociceptores, da diminuição do limiar, indução de
descargas ectópicas e aumento na quantidade de canais de Na
+
(DEVOR, 2006).
As descargas ectópicas são constituídas de impulsos elétricos anormais
espontâneos evocados e repetitivos a partir de locais incomuns e diferentes das
terminações nervosas. As fontes incomuns das descargas ectópicas são
constituídas de neuromas, axônios desmielinizados por traumas, processos auto-
imunes, aferentes adjacentes intactos e DRG (DEVOR, 2006). Essa atividade
ectópica é originada em fibras mielinizadas A e não mielinizadas C. Focos de
desmielinização em fibras danificadas por traumatismos são também fontes de
atividades ectópicas por brotamento de fibras (BAKER; BOSTOCK, 1992). Outras
fontes de descargas ectópicas são aferentes residuais intactos expostos aos
produtos de regeneração e mediadores inflamatórios (WU et al., 2001) e corpos
neuronais do DRG (DEVOR, 2006).
As expressões comportamentais de atividade ectópica em animais são
autonomia e comportamentos autodirigidos como lamber-se, vibrar as patas
posteriores e morder-se. Clinicamente, em humanos, são à base do sinal de Tinel
(ALVES NETO et al., 2009).
A excitação cruzada efática é o processo fisiopatológico pelo qual, a partir de
fibra nervosa danificada há o desenvolvimento de curto-circuito elétrico por correntes
iônicas com fibras nervosas adjacentes intactas (SELTZER; DEVOR, 1979). Outro
fenômeno relacionado é a excitação cruzada “não-efática” por mediadores químicos
difusíveis (AMIR; DEVOR, 1996), o que pode ser à base do tic douloureux na
neuralgia do trigêmio (ALVES NETO et al., 2009).
Alterações fenotípicas por expressão gênica modificada de neurônios do DRG
e de neurônios do Corno Dorsal da Medula Espinhal (CDME) constituem importantes
mecanismos de dor neuropática (HÖKFELT et al. 2006). Os genes modificados após
axotomia envolvem os relacionados a neuropeptídeos, receptores, canais iônicos,
enzimas, transmissão sináptica, proteínas de crescimento, citoesqueleto e
mobilidade celular e metabolismo (HÖKFELT et al. 2006).
Quanto aos mecanismos centrais medulares de dor neuropática são
consequentes as lesões periféricas ou centrais e se expressam pelo
desenvolvimento de sensibilização central, alterações neuroplásticas e redução ou
perda de controle inibitório (ALVES NETO et al., 2009). Nesse sentido a
sensibilidade central pode ser resultado de ativação do receptor do ácido N-metil-D-
aspartato (NMDA), aumento do conteúdo do glutamato, aspartato e cálcio (Ca
2+
)
intracelular, além de ativação também de receptores AMPA e receptores
metabotrópicos de glutamato (KAWAMATA; OMOTE, 1996).
Outro fenômeno importante na gênese da dor neuropática é a redução ou
perda de mecanismos inibitórios tanto locais como descendentes, reduzindo assim a
inibição pré e pós-sináptica, expressa também por redução gabaérgica (GABA)
(LAIRD; BENNETT, 1992).
1.8.1 Tratamento da dor neuropática
A dor neuropática, por sua complexidade, é um desafio constante para os
profissionais da dor. O tratamento baseado nas etiologias não é, entretanto, eficaz
em vista da maior importância representada pelos mecanismos subjacentes à
expressão dolorosa. Contudo, o tratamento da etiologia obviamente deve ser
realizado buscando minimizar os mecanismos e sintomas, os quais serão o centro-
alvo do tratamento (ALVES NETO et al., 2009).
A dor neuropática pode ser tratada com abordagens psicológicas, físicas,
cirúrgicas e farmacológicas como: anticonvulsivantes, antidepressivos, opióides,
antiarritmícos, gabaérgicos, antagonistas de NMDA, bloqueios anestésicos, L-
dopamina (DOPA), anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) e neurolépticos
(ALVES NETO et al., 2009). O tratamento farmacológico tem a grande vantagem de
visar aos mecanismos e de poder ser avaliado por ensaios clínicos bem controlados
e desenhados, o que tem sido feito em menor escala em relação aos métodos
físicos, psicológicos e aos métodos cirúrgicos e invasivos, nos quais as limitações
éticas são maiores (ROWBOTHAM, 2005).
Medicamentos de primeira linha como gabapentina (GABAP), lidocaína,
opióides, tramadol e antidepressivos tricíclicos são muito utilizados, assim como os
de segunda linha lamotrigina, carbamazepina (CBZ) e inibidores seletivos da
recaptação da serotonina (DWORKIN et al., 2003).
Os anticonvulsivantes têm seu papel como analgésicos por serem drogas que
exercem seu efeito sobre os canais iônicos envolvidos tanto na epilepsia como na
dor neuropática. Os canais alvo para esse efeito são os de Na
+
e de cálcio (Ca
2+
)
(ALVES NETO et al., 2009). Sendo assim drogas bloqueadoras dos canais de Na
+
que englobam anti-convulsivantes (CBZ, fenitoína, e lamotrigina), anti-arritmicos
(mexiletina, flecainida e tocainida) e anestésicos locais de gênero lidocaína são
bastante utilizadas. Da mesma forma dois dos principais moduladores de canais de
Ca
2+
como a GABAP e a pregabalina são utilizadas também. Ambas se ligam a uma
subunidade α2δ do canal de Ca
2+
(TAYLOR et al., 1998).
1.9 Modelos animais de dor neuropática
Nos estudos experimentais de dor nós, inadequadamente, humanizamos os
animais quando referimos que eles sentem dor já que não são passíveis de serem
aferidas durante os experimentos, pois os testes nociceptivos se baseiam em
respostas comportamentais ou reflexos inatos, que não sabemos se reflete um
estado doloroso do animal. Essa subjetividade que a dor se expressa é que torna
vulneráveis os procedimentos destinados a avaliação dos resultados (TEIXEIRA;
FIGUEIRÓ, 2001).
Inicialmente existe base fisiopatológica para que se faça uma diferenciação
entre hiperalgesia e alodínia, em se tratando de dor experimental. Deve-se lembrar
que a sensibilização dos nociceptores é uma característica comum dos processos
inflamatórios. Alodínia e hiperalgesia são termos usados para descrever essa
sensibilização (FERREIRA, 2003).
Como dito anteriormente a alodínia é um termo destinado à sensação
dolorosa a um estímulo que não causava dor e passou a produzi-la em presença de
sensibilização de nociceptores, cuja qualidade e intensidade não poderia ser
evocada por estímulos idênticos. Visto que allo significa em grego outro, um
estímulo térmico seria percebido como doloroso e um estímulo de pequeníssima
intensidade produziria dor excruciante ou de longa duração. A presença de alodínia
indicaria lesão neuropática, portanto, um sintoma importante para definir um
diagnóstico de comprometimento do tecido nervoso (FERREIRA, 2003).
A hiperalgesia é conceituada como uma resposta aumentada a um estímulo que
normalmente é doloroso (MERSKEY; BOGDUK, 1986). Nos testes dever-se-ia
utilizar o termo hipernocicepção na quantificação do aumento da sensibilidade do
neurônio nociceptivo primário, abolindo os termos hiperalgesia e alodínia nesses
casos, pois são termos usados para referir sintomas humanos, com os quais o teste
experimental com animais pode não ter nenhuma relação (FERREIRA, 2003).
A dor neuropática se refere à dor de origem patológica do sistema nervoso. A
diabete, infecção por herpes zoster, compressão nervosa, trauma neural e doenças
auto-imunes são exemplos de doenças que podem causar dor neuropática.
Infelizmente nenhum tratamento satisfatório está ainda disponível para esse tipo de
dor. Esta consideração levou a um grande interesse em descobrir os mecanismos
subjacentes, sendo acompanhado por um número crescente de modelos animais.
Anteriormente, a maioria dos modelos de dor neuropática inicialmente desenvolvida
em ratos foi modificada para camundongos geneticamente modificados (COLLEONI;
SACERDOTE, 2009).
Obviamente os modelos animais mais úteis de dor seriam aqueles que a
etiologia da dor seria endógena e não induzido pelos experimentos, junto com os
modelos clássicos baseados em ligação periférica do nervo. Nos últimos anos outras
técnicas estão sendo desenvolvidas que imitam as síndromes de dor observada na
clínica frequentemente por tentar induzir a doença associada à dor neuropática.
Embora algumas variáveis devam ser levadas em conta quando se usa modelos
animais para imitar dor neuropática da clínica, um número enorme de modelos que
existem reproduzem e bem caracterizam metas importantes na compreensão de
mecanismos e descobrem o alvo terapêutico para cada doença (COLLEONI;
SACERDOTE, 2009).
A dor neuropática pode ser dividida em periférica ou central baseada na
localização anatômica da lesão ou da doença: no SNP (por exemplo, nervos
periféricos, DRG e raízes dorsais) e SNC (por exemplo, espinha dorsal e tálamo)
(TREEDE et al., 2008).
Essas lesões surgem da neuropatia diabética, infecções virais (vírus de
Herpes e vírus da imunodeficiência humana - HIV), cirurgias importantes ou trauma
(amputação, toracotomia, encarceramento ou compressão), lesão de espinha dorsal,
e golpe. Os exemplos de dor neuropática incluem síndrome do túnel do carpo,
neuralgia trigeminal, neuralgia pós-herpéica, radiculopatia, dor fantasma de membro,
síndromes de dor regionais complexas e as várias neuropatias periféricas, tal como
os derivados de quimioterapia (ZIMMERMANN, 2001).
A procura por novas drogas para aliviar a dor neuropática é prioritária hoje em
dia e a busca por elucidar os mecanismos moleculares dessa dor é um requisito
importante para o desenvolvimento racional de fármacos analgésicos para a terapia
dessa dor crônica (TREEDE et al., 2008).
A pesquisa em animais sempre deve ser avaliada por quatro critérios gerais: a
geração de conhecimento, a capacidade de estudos a serem reproduzidos, a
relevância do estudo e a validação de estados clínicos de dor. Modelos em animais
fornecem sistemas principais para estudos pré-clínicos de dor neuropática e servem
como base experimental para investigações e novas intervenções terapêuticas
(COLLEONI; SACERDOTE, 2009).
Numerosos modelos de dor neuropática podem ser classificados de diferentes
maneiras como modelo de dor central, injúria nervosa periférica, induzida por
patologias, induzida por quimioterápicos e induzida por irritação como mostra a
tabela 6:
Tabela 6 – Modelos de dor neuropática em animais
Dor central Injúria nervosa
periférica
Induzida por
patologias
Induzida por
quimioterápicos
Induzida por
irritação
Síndrome
talâmica
Nervo ciático Pós-herpética Vincristina Irritação
espontânea
Injúria da
espinhal
dorsal
Plexo Braquial
Associada ao
vírus do HIV
Paclitaxel Gênica
Excitotóxico Ligação
nervosa
espinhal
Esclerose
múltipla
Cisplatina
Fotoquímico Injúria parcial
do nervo da
cauda e da
safena
Neuropatia
Diabética
periférica
Neuralgia
trigeminal
Relacionado ao
câncer
Fonte: COLLEONI; SACERDOTE, 2009
1.7 Justificativa e caracterização do problema
A OXL é um agente da família das Pt, originalmente desenvolvido no Japão.
O seu mecanismo de ação é semelhante a outros derivados da platina, porém seu
espectro de ação antineoplásica, difere da cisplatina e carboplatina. Estudos
experimentais mostraram atividade em tumores de cólon resistentes à cisplatina e
também se observou ação sinérgica quando combinada ao 5-FLU (MARSHALL,
2004).
Por ser um fármaco muito utilizado na terapêutica do câncer têm sua
importância clínica muito ressaltada, porém os pacientes que fazem uso prolongado
não conseguem terminar o esquema terapêutico de tratamento por apresentarem
efeito colateral de neuropatia sensitiva periférica (NSP) em extremidades, assim
devido a sua importância clínica a OXL é objeto desse estudo.
Em vista do fator econômico, por ser a OXL um fármaco de alto custo foi
montado o modelo em camundongos, também para reduzir os gastos com a
manutenção dos animais. Estudos em diferentes modelos experimentais são
importantes, pois podem contribuir para o desenvolvimento de novas alternativas
terapêuticas e ajudar no melhor entendimento da fisiopatologia da doença para o
tratamento dos pacientes com câncer.
Contudo, justifica-se a necessidade de um estudo mais aprofundado dos
mecanismos que acarretam a neuropatia periférica, a dor, a hiperalgesia pelo frio e a
dificuldade na execução de movimentos delicados, sendo uma possível
consequência de dano sensitivo ocasionado pela OXL. Em função de não se
conhecer adequadamente os mecanismos envolvidos no desenvolvimento da NSP,
há protocolos e tratamentos clínicos estabelecidos sem, entretanto, haver tratamento
farmacológico adequado para esta entidade visando à importância do seu
entendimento.
OBJETIVOS
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Desenvolver um modelo experimental para estudo da neuropatia sensitiva
periférica induzida por oxaliplatina em camundongos.
2.2 Objetivos específicos
Identificar a natureza sensitiva ou motora da neurotoxicidade induzida por
OXL;
Analisar a hiperalgesia e a alodínia mecânica e térmicas induzidas pela OXL;
Avaliar o efeito de fármacos analgésicos na hiperalgesia e alodínia induzidos
por OXL;
Investigar o perfil periférico de alguns moduladores da nocicepção
(neuropeptídeos, receptores e mediadores) na neurotoxicidade da oxaliplatina.
MATERIAIS E MÉTODOS
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Para a realização do modelo experimental para estudo da NSP pelo agente
antineoplásico OXL foram utilizados camundongos Swiss (Mus muscullus), machos,
pesando entre 25 e 30 gramas (g) provenientes do Biotério Central da Universidade
Federal do Ceará – UFC.
3.2 Aspectos éticos
Os protocolos experimentais utilizados no estudo seguiram as
recomendações da Universidade Federal do Ceará (UFC). O presente estudo foi
submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFC sendo aprovado de
acordo com o protocolo nº 70/07.
3.3 Ambientes
Os camundongos foram colocados, em número aproximadamente de 20 a 25
animais, em gaiolas de plástico medindo 40 centímetros (cm) de comprimento, 31
cm de largura e 17 cm de altura. O fundo destas gaiolas foi coberto por raspas de
madeira e o teto consistia em grade de metal com um espaço para serem colocados
comida e água. Os animais foram deixados em ambiente com temperatura de 25º C,
com exaustão de ar, ciclo claro-escuro de 12 horas (h) e acesso à agua e comida ad
libitum.
Os animais foram alimentados com ração Fri-lab camundongos, tal ração leva
composto de milho moído, farelo de arroz desengordurado, farelo de arroz integral,
farelo de girassol, fosfato monoamônico. Cada 100g de ração contém 23% de
proteína, 22% de água, 4% de extrato etírico, 8% de fibra, 11% de minerais (ferro,
cobalto, cobre, manganês, zinco, iodo), 1% de cálcio, 0,45% de fósforo e vitaminas
(A, B1, B2, B6, ácido nicotínico, ácido pantotênico, C, D3, E, potássio e folato).
3.4 Horário dos experimentos
Todos os experimentos, observações clínicas e comportamentais foram
realizados entre 8 e 18 h. Os animais foram testados 1 vez por semana durante 4
semanas para um dos estímulos.
3.7 Observações clínicas
Diariamente foram realizados exames clínicos atentando para trofismo
muscular, coloração e aspecto do pelo, cor dos olhos, presença de parasitas, sinais
de infecção local ou generalizada, marcha e sinais de autonomia.
3.8 Aparelhos e instrumentos laboratoriais
• Agulhas (0,45 x 13) descartáveis;
• Algodão;
• Aparelho eletronic Von-Frey eletrônico;
• Balança analítica (Sartorious modelo BL2105);
• Balança para pesagem de animais modelo ID-1500 (Filizola®);
• Beckers (SIMAX);
• Bisturi;
• Capela de fluxo laminar, vertical (modelo TROX do Brasil);
• Cassetes;
• Cronômetro;
• Eppendorf (1ml);
• Esparadrapo;
• Filtro;
• Gelo;
• Glicose;
• Caixas térmicas de isopor;
• Luvas descartáveis;
• Micropipetas automáticas (GILSON);
• Papel alumínio;
• Pincel para marcação dos animais (PILOT);
• Ponteiras para as pipetas automáticas estéreis (SIGMA);
• Seringas de 1 e 5ml (BD Plastipak);
• Termômetro;
• Tubos de plástico de 15 e 45ml (FALCON);
• Sonicador (THORNTOW – TT7);
3.7 Drogas, soluções, líquidos
• Água destilada;
• Água filtrada;
• Álcool à 70%;
• Éter etílico P.A. (Dinâmica Brasil);
• Formol à 10%;
• Carbamazepina (AMS 300mg) diluída em cloreto de sódio a 0,9% VO;
• Gabapentina (PFIZER 600 mg) diluída em água filtrada VO;
• Indometacina (Sigma®) diluída em 500mg de bicarbonato de sódio e 10ml de
água destilada IP;
• Oxaliplatina (Sigma® 5 mg) diluída em solução glicosada endovenosa (EV);
• Oxcarbazepina (100mg )diluída em água filtrada VO;
• Solução gliocosada (D-glucose anidra – dextrose synth);
• Solução salina estéril (NaCl 0,9%).
3.11 Protocolo experimental e desenho do estudo
3.11.1 Curva dose-resposta para escolha da dose de oxaliplatina
Os animais foram levemente anestesiados para proceder à injeção via
endovenosa (EV 0,3 ml/30g) de OXL dissolvida em solução glicosada estéril na veia
lateral da cauda do camundongo (Figura 5) utilizando-se agulha de calibre 0,45 x
0,75 em seringa de 1ml. Os animais utilizados como controle receberam solução
glicosada estéril na veia lateral da cauda via endovenosa (EV 0,3 ml/30g). Foi
realizada curva dose-resposta pela aplicação de OXL nas doses de 1, 2 e 4mg/kg
para definir a dosagem experimental a ser utilizada nos outros testes.
Figura 5 - Administração na veia lateral da cauda
Fonte: PESQUISADOR, 2008
No inicio do estudo toda a amostra (n=6-12 camundongos swiss) foram
pesados utilizando uma balança de precisão digital Filizola® e aferido os testes em
tempo zero. Em seguida foi realizada a divisão dos grupos, cada grupo recebeu
nove administrações EV de OXL nas doses de 1, 2 e 4mg/kg durante quatro
semanas e meia, duas vezes por semana e no grupo controle foi administrado via
EV solução glicosada a 5%. Foram realizados os testes nociceptivos/neuropáticos e
de atividade motora forçada concomitantemente às administrações de OXL uma vez
por semana durante 56 dias (quatro semanas e meia). Após a realização dos testes
os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. No início de cada
experimento os animais (n=6-12 camundongos swiss) foram submetidos ao teste
térmico (10ºC) e ao teste de atividade motora forçada antes das nove
administrações de OXL (1mg/kg EV) durante 4,5 semanas (Figura 6).
Figura 6 - Curva dose resposta para escolha da dose de oxaliplatina.
3.8.2 Investigação do efeito de fármacos analgésicos
Para investigar o efeito de fármacos comumente utilizados no tratamento das
neuropatias periféricas, os animais foram administrados com carbamazepina (CBZ:
0,3mg/kg, 1mg/kg, 3mg/kg, 10mg/kg e 30mg/kg), oxcarbazepina (OZP: 0,3mg/kg,
1mg/kg, 3mg/kg, 30mg/kg e 100mg/kg) ou gabapentina (GABAP: 6mg/kg, 18mg/kg e
54mg/kg) todos por via oral (VO). Como controle negativo utilizamos a indometacina
(INDO: 1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg) por via intraperitoneal (IP). Esses fármacos foram
8 injeções de
oxaliplatina
(1, 2 e 4 mg/kg)
Peso
Testes nociceptivos 1 x por semana
Rota Rod 1 x por semana
0
Peso
Testes nociceptivos
nociceptivos
Rota Rod
(limiar inicial)
dias
1 30 56
administrados depois de 4 semanas de tratamento com OXL (1mg/kg), com o
quadro neuropático já instalado, comprovado através de testes mecânicos e
térmicos.
O efeito dos fármacos foi avaliado através do teste térmico frio (10ºC) durante
105min a cada 30min e através do teste motor, realizado em 5,5 RPM no aparelho
de Rota Rod, sendo observados por 2min. Ambos os testes foram realizados após
uma única administração das doses citadas (Figura 7).
Figura 7 - Investigação do efeito de fármacos analgésicos.
3.8.5 Avaliação histopatológica
Para verificação das alterações teciduais microscópicas na pele das patas
traseiras foram realizados cortes histológicos dos grupos tratados com OXL (até o
28º dia) e de animais normais (controle). O tecido foi fixado em formaldeído
tamponado 10% e incluído em parafina. Os cortes foram obtidos através de
micrótomo 4µm, corados em laminas com hematoxilina – eosina e examinados a
microscopia ótica. A análise histopatológica foi realizada pela Profa. Dra. Gerly Anne
de Castro Brito, do Depto. de morfologia da UFC.
dias
TESTE
MOTOR E
TÉRMICO
CBZ (0,3; 1; 3; 10 e 30mg/kg)
OXZ (0,3; 1; 3; 30 e 100mg/kg)
GABA (6; 18 e 54mg/kg)
INDO (1; 2 e 4mg/kg)
0
Grupos controle e de 1mg/kg
Teste térmico 10
o
C
Rota Rod inicial
28
30
8 injeções de oxaliplatina
(1mg/kg)
3.8.6 Investigação por imunohistoquímica
Camundongos swiss receberam injeções de OXL (1mg/kg EV) seguindo o
mesmo protocolo dos outros experimentos. No entanto, grupos de 6 animais foram
eutanasiados por deslocamento cervical a cada semana e foi retirada a pele das
patas traseiras para realização de imunohistoquímica, seguindo o esquema
cronológicos de 24h, 7,14 21 e 28 dias. Ou seja, o protocolo de 2 injeções por
semana foi seguido, com exceção do grupo 24h que recebeu apenas 1 injeção 24h
antes da eutanásia. As peles das patas traseiras foram coletadas com o auxílio de
um bisturi e foram fixadas em formol. Posteriormente foram desidratadas em álcool e
depois em xilol e então parafinadas.
No dia seguinte foram cortadas no plano transversal com 5µm de espessura
com o auxílio de um micrótomo. As secções de tecido foram montadas em lâminas
silanizadas especiais para imunohistoquímica. O ensaio de imunohistoquímica foi
realizado na seguinte sequência: desparafinização e hidratação dos cortes; depois
foi realizada a ativação antigênica (98ºC por 13min) no microondas; inibição da
peroxidase endógena com H
2
O
2
a 3% por 10min; em seguida as secções foram
incubadas em anticorpos policlonais para o peptídeo relacionado ao gene da
calcitonina (CGRP), substância P (SP), receptor vanilóide (VR1), NMDA, fator de
necrose tumoral (TNF - rabbit policlonal IgG, Santacruz Biotechnology) e nitrotirosina
(rabbit policlonal IgG, Santacruz Biotechnology); ficaram over night a 4ºC; no dia
seguinte, incubação com anticorpo secundário biotinilado universal (LSAB – DAKO)
durante 30min; incubação com o complexo strepto-avidina-peroxidade (LSAB –
DAKO) durante 30min; a coloração foi realizada pela adição do diaminobenzedine
DAB-peróxido (H
2
O
2
), e foi feita a contra-coloração com hematoxilina de Mayer; foi
realizada a desidratação e montagem das lâminas que foram examinadas no
microscópio Leica® e foram registradas as fotografias das lâminas das patas (Figura
8).
Figura 8 - Investigação por imunohistoquímica.
3.9 Testes
3.9.1 Testes neuropáticos
3.9.1.1 Teste de hiperalgesia mecânica plantar (Von Frey eletrônico)
A intensidade de hiperalgesia foi avaliada pelo limiar de sensibilidade de cada
animal a um estímulo mecânico produzido pela pressão gradual exercida por um
filamento rígido acoplado a um aparelho que registra a pressão em gramas exercida
na ponta desse filamento.
A estimulação mecânica foi exercida na região plantar das patas traseiras. O
aparelho eletrônico Von Frey (Figura 9) registra a pressão em gramas suficiente
para provocar uma reação descrita como uma flexão da pata seguida por um “flinch”
após a retirada da pata em contato com o aparelho. A hiperalgesia mecânica (grau
de sensibilidade ao estímulo mecânico) foi medida antes (tempo zero) e após a
injeção do tratamento. Foi avaliado o limiar mecânico de cada animal (CUNHA et al.,
2004).
dias
SACRIFÍCIO
(remoção das peles das patas traseiras)
0
1 7 14 21 28
8 injeções de
oxaliplatina
(1 mg/kg)
IM
UNOHISTOQUÍMICA
Figura 9 - Aparelho eletrônico Von Frey.
Fonte: PESQUISADOR, 2009
3.9.1.2 Teste de hiperalgesia/alodínia térmica (teste de imersão da cauda)
• Teste de imersão da cauda em água fria
Baseado no modelo de Necker e Hellon (1978) e Authier et al. (2003), a
cauda do camundongo foi imersa em água (Figura 10) fria mantida a temperatura de
4ºC ou 10ºC para testar hiperalgesia ou alodínia respectivamente, sendo contado o
tempo de permanência até o camundongo levantar a extremidade da cauda em
contato com a água fria.
• Teste de imersão da cauda em água aquecida
A cauda do camundongo foi imersa em água aquecida mantida a temperatura
de 46ºC ou 42ºC para testar hiperalgesia ou alodínia, sendo contado o tempo de
permanência até o camundongo levantar a extremidade da cauda em contato com a
água aquecida (AUTHIER et al., 2003)
0.1
X 0.00001
Figura 10- Teste de imersão da cauda
Fonte: PESQUISADOR, 2009
3.9.1.3 Atividade motora forçada, locomoção e equilíbrio (Rota Rod)
Foi realizado um teste de desempenho baseado na atividade motora forçada
em uma haste alternada, usuado por roedores. Parâmetros incluem o tempo de
marcha (segundos) ou a resistência. O teste é usado para avaliar o equilíbrio e a
coordenação dos animais, em particular em modelos animais experimentais, e os
transtornos neurológicos e os efeitos de drogas (INSIGHT, 2003).
O Rota Rod (Figura 11) é um equipamento em acrílico resistente, motorizado
com aceleração progressiva e invariável de 5 a 25 rotações por minuto (RPM) no
eixo do motor, podendo ser variada, no eixo de atividade, mudando-se a relação de
polias, assim chegando a uma variação de 4 até 37 RPM. Com dimensões de: 440
milímetros (mm) de altura, 370mm de largura, 530mm de comprimento com peso de
12 quilos (INSIGHT, 2003).
Há quatro baias que possuem sistema de detecção de queda do animal
através de impacto, circuito microprocessado para cronometragem de permanência
do animal na baia e contagem de vezes em que o animal caia.
Inicialmente os camundongos foram treinados 24h antes da realização do
experimento, ao serem individualmente posicionados no aparelho de Rota Rod (5,5
RPM). O animal que permaneceu 2 minutos (min) na barra foi selecionado para o
estudo (DUNHAM; MIYA, 1957).
Figura 11 - Aparelho de Rota Rod.
Fonte: INSIGHT, 2003.
3.10 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM).
Para comparação múltipla dos dados paramétricos dos testes comportamentais e
farmacológicos foi utilizado à análise de variância (one way - ANOVA) e o nível de
significância entre os grupos foram determinados pelos testes Bonferroni e Dunnet
para detectar as diferenças entre o grupo controle e os grupos em tratamento.
O número (n) de animais por grupo experimental foi no mínimo de 6. Em
todas as análises estatísticas, considerou-se o nível crítico para rejeição da hipótese
de nulidade menos que 5% (p<0,05).
RESULTADOS
4 RESULTADOS
Considerando-se o caráter relevante do ineditismo do presente trabalho e a
necessidade metodológica de se estabelecer parâmetros para delineamento
experimental da investigação da NSP seguem abaixo os resultados da neuropatia
ocasionada pelo antineoplásico OXL.
4.1 Curva dose resposta para escolha da dose de oxaliplatina
4.1.1 Estudo da neuropatia sensitiva periférica
4.1.1.1 Estudo da hiperalgesia mecânica plantar (Von Frey)
No teste de Von Frey foi observado um aumento significativo (p<0,001) a
partir do 14º dia atingindo o máximo na dose de 2mg/kg (381,72%) comparado ao
grupo controle no 56º dia. No 14º e 21º dias houve aumento no limar de 236,66% e
381,72% respectivamente no grupo de 2mg/kg (p<0,001) comparado com o grupo
controle.
No 28º dia houve aumento significativo de 251,61%, 354,26% e 262,31% nos
grupos de 4mg/kg (p<0,01), 2mg/kg (p<0,001) e 1mg/kg (p<0,01) respectivamente
quando comparados com o controle.
No 35º dia houve aumento significativo de 256,08%, 262,37% e 226,65% nos
grupos de 4mg/kg (p<0,001), de 2mg/kg (p<0,001) e de 1mg/kg (p<0,001) quando
comparados com o controle.
A partir do 42º dia houve aumento significativo de 201,69%, 244,34% e
225,21% nas doses de 4, 2 e 1mg/kg (p<0,001) quando comparados com o grupo
controle. Os grupos são medianamente diferentes nos dias 14 e 21.
No 14º e 21º dias houve aumento significativo de 236,66% no grupo de
2mg/kg (# p<0,05) comparado com o grupo de 4mg/kg (Figura 12).
Figura 12
-
Avaliação do desenvolvimento d
e hiperalgesia mecânica plantar induzida por
oxaliplatina. Oxaliplatina (1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg; n=12) ou veiculo (Controle , n=12) foram
administrados por via EV durante 4,5 semanas. Cada animal recebeu nove injeções (setas). O
teste nociceptivo (alodínia plantar mecânica – Von-Frey eletrônico) foi realizado uma vez por
semana durante 56 dias. Painel A: os pontos representam a média ± EPM da variação do limiar
de retirada da pata em gramas (intensidade de alodínia). Os painéis B e C mostram
separadamente o 14º e 21º dias respectivamente. Os asteriscos indicam a diferença estatística
em relação ao controle (*p<0,05; **p<0,01, ***p<0,001; ANOVA e teste de Bonferroni, painel A). #
indica diferença estatística entre as doses de 2 e 4 mg/kg (# p<0.05; ANOVA e teste de
Bonferroni; painéis B e C).
0 7 14 21 28 35 42 49 56
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Controle
4 mg/kg
2 mg/kg
1 mg/kg
***
***
**
***
***
**
***
***
***
***
***
***
***
***
***
Tempo (dias)
∆
∆
∆
∆
de limiar de retirada da pata
(g)
A
14 dias
C 1 2 4
0
1
2
3
236,66%
#
Oxaliplatina (mg/kg)
∆
∆
∆
∆
de retirada da pata (g))
B
21 dias
C 1 2 4
0
1
2
3
236,66%
#
Oxaliplatina (mg/kg)
∆
∆
∆
∆
de retirada da pata (g)
C
4.1.1.2 Estudo da hiperalgesia e alodínia térmica (Imersão da cauda)
• Alodínia térmica
o Teste da imersão da cauda em água fria (10ºC)
Foi observada uma diminuição significativa no limiar nociceptivo a partir do 49º
dia (p<0,01). Na dose de 4mg/kg houve redução de -33,01% comparado ao grupo
controle no 56º (p<0,01) dia. Houve redução de -22,24% na dose de 1mg/kg
comparado com o controle no 56º dia (p<0,001).
Também se notou uma redução significativa do limiar nociceptivo na dose de
1mg/kg (-31,36%) comparado com o grupo de 2mg/kg (p<0,05) no 56º dia. Os
grupos são medianamente diferentes (p<0,0001) (Figura 13).
o Teste de imersão da cauda em água aquecida (42ºC)
Foi observada uma diminuição significativa (p<0,01) no limiar nociceptivo a partir
do 35º dia. Na dose de 1mg/kg houve redução de -35,44%, -27,27% e -24,48%
comparado ao grupo controle no 42º (p<0,05), 49º (p<0,01) e 56º (p<0,01) dias.
Houve redução de -40,97% na dose de 2mg/kg comparado com o controle no 56º
dia (p<0,05). Também se notou uma redução significativa do limiar nociceptivo na
dose de 4mg/kg (-38,23% e -34,02%) comparado com o controle no 49º (p<0,05) e
56º dia (p<0,05) respectivamente. Os grupos são medianamente diferentes
(p=0,001) (Figura 14).
Figura 13 - Avaliação do desenvolvimento de alodínia térmica ao frio (10ºC)
induzida por oxaliplatina. Oxaliplatina (1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg; n=12) ou veiculo
(Controle, n=12) foram administrados por via EV durante 4,5 semanas. Cada animal
recebeu nove injeções (setas). O teste nociceptivo (teste de imersão da cauda a
10ºC) foi realizado uma vez por semana durante 56 dias. Painel A: os pontos
representam a média ± EPM do tempo de retirada da cauda em segundos
(intensidade de alodínia térmica). O painel B mostra separadamente o 56º dia. Os
asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao controle (**p<0,01,
***p<0,001; ANOVA e teste de Bonferroni; painel A). # indica diferença estatística
entre as doses de 2 e 1 mg/kg (# p<0.05; ANOVA e teste de Bonferroni; painel B).
0 7 14 21 28 35 42 49 56
0
25
50
75
100
Controle
4mg/Kg
2mg/Kg
1mg/Kg
**
***
Tempo (dias)
Tempo de retirada da cauda
(seg)
A
C 1 2 4
0
25
50
75
oxaliplatina (mg/kg)
#
Tempo de retirada da
cauda (seg)
B
0 7 14 21 28 35 42 49 56
0
10
20
30
40
50
60
Controle
4mg/kg
2mg/kg
1mg/kg
*
*
*
**
*
**
Tempo (dias)
Tempo de retirada da cauda
(seg)
Figura 14
-
Avaliação do desenvolvimento de alodínia térmica ao calor (42ºC)
induzida por oxaliplatina. Oxaliplatina (1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg; n=12) ou veiculo
(Controle, n=12) foram administrados por via EV durante 4,5 semanas. Cada animal
recebeu nove injeções (setas). O teste nociceptivo (teste de imersão da cauda a 42ºC)
foi realizado uma vez por semana durante 56 dias. Os pontos representam a média ±
EPM do tempo de retirada da cauda em segundos (intensidade de alodínia térmica).
Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao controle (* p<0.05 e
**p<0,01; ANOVA e teste de Bonferroni).
• Teste de hiperalgesia térmica
o Teste da imersão da cauda em água fria (4ºC)
Foi observado uma diminuição significativa (p<0,01) no limiar nociceptivo no 56º
(p<0,05) dia atingindo -47,08% na dose de 4mg/Kg e -39,79% na dose de 1mg/kg
comparado ao grupo controle. Os grupos não são medianamente diferentes (Figura
15).
o Teste de imersão da cauda em água quente (46ºC)
Foi observado uma diminuição significativa (p<0,001) no limiar nociceptivo a
partir do 49º dia atingindo -57,69% na dose de 4mg/kg (p<0,01) comparado ao grupo
controle, -67,94% na dose de 2mg/kg (p<0,05) e -67,94% na dose de 1mg/kg
(p<0,05). Houve redução de -54,48% na dose de 4mg/kg comparado com o controle
no 56º dia (p<0,05). Os grupos não são medianamente diferentes (Figura 16).
Figura 15
-
Avaliação do dese
nvolvimento de hiperalgesia térmica ao frio (4ºC)
induzida por oxaliplatina. Oxaliplatina (1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg; n=8) ou veiculo
(Controle, n=12) foram administrados por via EV durante 4,5 semanas. Cada animal
recebeu nove injeções (setas). O teste nociceptivo (teste de imersão da cauda a 4ºC)
foi realizado uma vez por semana durante 56 dias. Os pontos representam a média ±
EPM do tempo de retirada da cauda em segundos (intensidade de hiperalgesia
térmica). Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao controle (*
p<0.05; ANOVA e teste de Bonferroni).
0 7 14 21 28 35 42 49 56
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Controle
4 mg/kg
2 mg/kg
1 mg/kg
*
*
Tempo (dias)
Tempo de retirada da cauda
(seg)
Figura 16
-
Avaliação do desenvolvimento de hiperalgesia térmica ao calor
(46ºC) induzida por oxaliplatina. Oxaliplatina (1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg; n=8) ou
veiculo (Controle, n=12) foram administrados por via EV durante 4,5 semanas. Cada
animal recebeu nove injeções (setas). O teste nociceptivo (teste de imersão da cauda
a 46ºC) foi realizado uma vez por semana durante 56 dias. Os pontos representam a
média ± EPM do tempo de retirada da cauda em segundos (intensidade de
hiperalgesia térmica). Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao
controle (* p<0.05 e **p<0,01; ANOVA e teste de Bonferroni).
0 7 14 21 28 35 42 49 56
0
5
10
15
20
25
Controle
4mg/kg
2mg/kg
1mg/kg
**
*
*
*
Tempo (dias)
Tempo de retirada da cauda
(seg)
4.3.2 Estudo da atividade motora forçada, locomoção e equilíbrio
No teste do Rota Rod, com 5,5 RPM, realizado entre o grupo controle e os
grupos com doses diferentes de OXL (1, 2 e 4mg/kg) as médias encontradas foram
semelhantes (controle 118,4; dose de 4mg/kg 116,5; dose de 2mg/kg 119,4 e dose
de 1mg/kg 115,4) não havendo variação significativa em nenhum grupo comparado
com o controle nem entre si (Figura 17).
4.4 Média ponderal
O peso corporal foi medido antes de cada administração de OXL e até o final
dos testes. O peso dos animais não sofreu variação significativa com o
antineoplásico OXL nas diferentes doses administradas (Figura 18).
Figura 17
-
Avaliação d
o efeito do tratamento crônico com oxaliplatina sobre da
coordenação motora e equilíbrio de camundongos no teste do Rota Rod.
Oxaliplatina (1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg; n=8) ou veiculo (Controle, n=8) foram
administrados por via EV durante 4,5 semanas. Cada animal recebeu nove injeções. Os
valores representam a média ± EPM do tempo dos animais no aparelho de Rota Rod
durante 2 minutos a cada semana num total de 9 semanas (56 dias). Foram utilizados 6
animais por grupo. Não houve diferença estatística entre os grupos. (ANOVA e teste de
Bonferroni).
0 7 14 21 28 35 42 49 56
0
25
50
75
100
125
Controle
4mg/kg
2mg/kg
1mg/kg
Tempo (dias)
Tempo de permanência na barra
(seg)/2 min
Figura 18
-
Avaliação da média ponderal dos animais tratados com oxaliplatina.
Oxaliplatina (1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg; n=6) ou veiculo (Controle, n=6) foram
administrados por via EV durante 4,5 semanas. Cada animal recebeu nove injeções. O
peso dos animais foi medido antes de cada administração de OXL, sendo verificado 2
vezes por semana até o final das administrações. Os valores representam a média ± EPM
e não houve diferença estatística em relação ao controle (ANOVA e teste de Bonferroni).
3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
20
25
30
35
40
Controle
4 mg/Kg
2 mg/Kg
1 mg/Kg
Tempo (Dias)
Média ponderal (g)
Após a realização dos testes de hiperalgesia e alodínia mecânico e térmicos
observou-se que o melhor resultado encontrado foi com a dose de 1mg/kg entre os
testes, assim na segunda etapa dos experimentos foi realizado o teste térmico de
alodínia (10º C) e de Rota Rod com diversos fármacos anticonvulsivantes e anti-
inflamatório após a instalação da NSP verificando a dose acumulada (crônico).
4.5 Investigação do efeito de fármacos analgésicos
4.3.1 Carbamazepina (CBZ)
Foi observado que o tratamento com CBZ (0,3-30mg/kg) aumentou o limiar
nociceptivo (p=0,002) indicando efeito analgésico.
Em 75 minutos houve aumento de 197,58%, 199,99%, 190,93% e 202,11%
nos grupos de 1mg/kg, 3mg/kg, 10mg/kg e 30mg/kg respectivamente (p<0,05)
comparados com o grupo controle.
Em 105 minutos houve aumento de 211,11%, 210,47%, 206,66% e 218,41%
nos grupos de 1mg/kg (p<0,01), 3mg/kg (p<0,01), 10mg/kg (p<0,01) e 30mg/kg
(p<0,001) respectivamente comparados com o controle (Figura 19).
4.3.2 Oxcarbazepina (OZP)
Foi observado que o tratamento com OZP (0,3-100mg/kg) aumentou o limiar
nociceptivo (p<0,003) indicando efeito analgésico.
Em 45 minutos houve aumento do limiar em 236,84% no grupo de 100mg/kg
(p<0,01) comparado com o grupo controle.
Em 75 minutos houve aumento de 217,52% no grupo de 100mg/kg (p<0,01)
comparado com o grupo controle.
Em 105 minutos houve aumento de 219,36%, 204,76% e 228,57% nos grupos
de 3mg/kg (p<0,05), 30mg/kg (p<0,05) e 100mg/kg (p<0,01) respectivamente
comparados ao grupo controle.
Os grupos não são medianamente diferentes (Figura
20).
Figura 19
-
Efeito do anticonvulsivante carbamazepina (CBZ) sobre a neuropatia
sensitiva periférica já instalada induzida por oxaliplatina (1mg/kg). Oxaliplatina
(1mg/kg, n=6) foi administrada por via EV durante 4 semanas. Cada animal recebeu oito
injeções. CBZ (0,3mg/kg, 1mg/kg, 3mg/kg, 10mg/kg e 30mg/kg; n=6) ou veiculo (Controle,
n=6) foram administrados por VO. O teste nociceptivo (teste de imersão da cauda a 10ºC)
foi realizado durante 105 minutos em intervalos de 30 minutos. Os pontos representam a
média ± EPM do tempo de retirada da cauda em segundos. Os asteriscos indicam a
diferença estatística em relação ao controle (* p<0.05, **p<0,01 e ***p<0,001; ANOVA e
teste de Bonferroni).
15 45 75 105
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Controle
30mg/kg
10mg/kg3mg/kg
1mg/kg0,3mg/kg
*
***
Tempo (min)
Tempo (seg)
**
Figura 20
-
Efeito do anticonvulsivante oxcarbazepina (OZP) sobre a neuropatia
sensitiva periférica já instalada induzida por oxaliplatina (1mg/kg. Oxaliplatina
(1mg/kg, n=6) foi administrada por via EV durante 4 semanas. Cada animal recebeu oito
injeções. OZP (0,3mg/kg, 1mg/kg, 3mg/kg, 30mg/kg e 100mg/kg; n=6) ou veiculo
(Controle, n=6) foram administrados por VO durante 4 semanas. O teste nociceptivo
(teste de imersão da cauda a 10ºC) foi realizado durante 105 minutos em intervalos de 30
minutos. Os pontos representam a média ± EPM do tempo de retirada da cauda em
segundos. Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao controle (* p<0.05
e **p<0,01; ANOVA e teste de Bonferroni).
15 45 75 105
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Controle
100mg/kg
30mg/kg3mg/kg
1mg/kg
0,3mg/kg
**
** **
*
*
Tempo (min)
Tempo (seg)
4.3.3 Gabapentina (GABAP)
Foi observado que o tratamento com GABAP (6-54mg/kg) aumentou o limiar
nociceptivo (p<0,0001), indicando efeito analgésico. Em 75 minutos houve aumento
de 187,50% nas doses de 6mg/kg (p<0,001), 18mg/kg (p<0,001) e 54mg/kg
(p<0,001) comparado com o controle. Em 105 minutos houve aumento de 166,58%
e 176,63% nas doses de 18mg/kg (p<0,05) e 54mg/kg (p<0,05) respectivamente
comparados ao grupo controle (Figura 21).
4.3.4 Indometacina (INDO)
Foi observado que o tratamento com INDO (1-4mg/kg) não demonstrou
atividade analgésica nesse modelo comparado ao grupo controle (Figura 22).
Figura 21
-
Efeito do anticonvulsivante gabapentina (GABAP) sobre a neuropatia
sensitiva periférica já instalada induzida por oxaliplatina (1mg/kg). Oxaliplatina
(1mg/kg, n=6) foi administrada por via EV durante 4 semanas. Cada animal recebeu oito
injeções. GABAP (6mg/kg, 18mg/kg e 54mg/kg; n=6) ou veiculo (Controle, n=6) foram
administrados por VO durante 4 semanas. O teste nociceptivo (teste de imersão da cauda
cauda a 10ºC) foi realizado durante 105 minutos em intervalos de 30 minutos. Os pontos
representam a média ± EPM do tempo de retirada da cauda em segundos. Os asteriscos
indicam a diferença estatística em relação ao controle (* p<0.05 e ***p<0,001; ANOVA e
teste de Bonferroni).
15 45 75 105
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Controle
6mg/kg
18mg/kg
54mg/kg
***
*
*
Tempo (min)
Tempo (seg)
Figura 22
-
Efeito do anticonvulsivante indometacina (INDO) sobre a neuropatia
sensitiva periférica já instalada induzida por oxaliplatina (1mg/kg). Oxaliplatina
(1mg/kg, n=6) foi administrada por via EV durante 4 semanas. Cada animal recebeu oito
injeções. INDO (1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg; n=6) ou veiculo (Controle, n=6) foram
administrados por IP durante 4 semanas. O teste nociceptivo (teste de imersão da cauda
a 10ºC) foi realizado durante 105 minutos em intervalos de 30 minutos. Os pontos
representam a média ± EPM do tempo de retirada da cauda em segundos. Não houve
significância estatística (ANOVA e teste de Bonferroni).
15 45 75 105
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Controle
4 mg/kg
2 mg/kg
1 mg/kg
Tempo (min)
Tempo (seg)
4.3.5 Estudo da atividade motora forçada, locomoção e equilíbrio analisando
o efeito dos fármacos analgésicos
Foi realizado o teste de Rota Rod com 5,5 RPM entre o grupo controle e os
grupos com de diferentes fármacos nas maiores doses administradas: CBZ
(30mg/kg, VO), OZP (100mg/kg, VO), GABAP (54mg/kg, VO) e INDO (4mg/kg, IP),
cada animal recebeu oito injeções de OXL (1mg/kg, EV).
A partir de 15 minutos foi observada variação significativa entre o grupo de
CBZ (p<0,001) e o grupo controle. Em 75 min foi observada variação significativa
entre o grupo de OXZ (p<0,05) e GABAP (p<0,05) e o grupo controle como mostra a
figura 23.
Figura 23
-
Avaliação do efeito da carbamazepina, oxacarbazepina, gabapentina e
indometacina sobre da coordenação motora e equilíbrio de camundongos tratados
com oxaliplatina no teste do Rota Rod. Inicialmente cada animal recebeu oito injeções
de oxaliplatina (1mg/kg, EV). No dia do teste do Rota Rod veículo (controle) ou
carbamazepina (30mg/kg, VO); oxcarbazepina (100mg/kg, VO); gapapentina (54mg/kg,
VO) ou indometacina (4mg/kg, IP) foram administrados com uma única injeção nas
doses citadas . Os valores representam a média ± EPM do tempo dos animais no
aparelho de Rota Rod durante 2 minutos. Foram utilizados 6 animais por grupo. Os
asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao controle (* p<0,05 e *** p<0,001;
ANOVA e teste de Bonferroni).
0 15 45 75 105
0
25
50
75
100
125
Controle
CBZ (30mg/kg)
OXZ (100mg/kg)
GABAP (54mg/kg)
INDO (4mg/kg)
***
*
*
Tempo (min)
Tempo de permanência na barra
(seg)/2 min
***
***
***
***
***
***
***
4.4 Análise histopatológica da pele das patas traseiras
Foi analisado a nível macroscópico e a nível microscópico (através de análise
histopatológica) se haveria alguma alteração morfológica. Porém nenhuma diferença
foi constatada, não foram observados sinais inflamatórios, nem áreas de necrose e,
também nenhuma alteração do tecido conjuntivo, epitelial e nem alterações de
receptores sensoriais, visíveis ao microscópio óptico, como corpúsculo de Meissner
ou de Paccini (Figura 24)
4.5 Análise de mediadores periféricos por imunohistoquímica
Como outro passo foi investigado a possível participação de neuropeptídios,
receptores e mediadores inflamatórios que poderiam estar presentes e atuando a
nível periférico, através da analise por imunohistoquímica.
Após as administrações de OXL (1mg/kg, EV) foi realizado o sacrifício dos
animais seguindo os esquemas cronológicos de 24h, 7,14 21 e 28 dias e a retirada
da pele das patas traseiras para parafinização e posterior realização de
imunohistoquímica para neuropeptídeos como SP e CGRP, receptores periféricos do
tipo NMDA e VR1 além do principal mediador inflamatório, a citocina TNF.
A imunohistoquímica demonstrou que houve um aumento da expressão dos
mediadores CGRP, SP e NMDA, o que não foi observado com TNF e VR1.
Ao analisar a imunohistoquímica com o anticorpo CGRP da pele das patas
traseiras dos camundongos tratados com OXL observou-se que houve um aumento
da expressão a partir de 24h atingindo o pico máximo em 7 dias, regredindo até o
28º dia quando comparado ao grupo controle (Figura 25).
Na imunohistoquímica para SP da pele das patas traseiras dos camundongos
tratados com OXL observou-se que houve expressão a partir de 24h atingindo o pico
máximo em 7 e 14 dias, regredindo até o 28º dia quando comparado ao grupo
controle (Figura 26).
Ao analisar a imunohistoquímica com o anticorpo NMDA da pele das patas
traseiras dos camundongos tratados com OXL observou-se leve expressão em 7
dias atingindo o máximo em 21 dias, regredindo até o 28º dia quando comparado ao
grupo controle (Figura 27).
Já ao analisar os anticorpos TNF e VR1 não houve alteração da expressão
quando comparado ao grupo controle, como observado nas figuras 28 e 29
respectivamente.
Foi realizada, também, a imunomarcação para nitrotirosina, onde houve
somente discreto aumento a partir do 7º dia até o 21º quando comparado ao grupo
controle, sendo observado principalmente em células da derme (Figura 30).
Figura 24. Análise histopatológica de pele de pata de camundongos submetidos ao
tratamento com oxaliplatina. A e B: Controle Normal; C e D: Oxaliplatina (1 mg/kg), após
as 8 injeções. Não houve diferenças entre o grupo controle e o tratado com oxaliplatina.
Coloração hematoxilina-eosina (painéis A e C 100x; painéis B e D 400x).
Figura 25. Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para CGRP em pele
de pata de camundongos submetidos ao tratamento com oxaliplatina. Os animais
foram tratados com oxalipaltina (OXL; 1 mg/kg; EV), a cada semana e foi retirada da pele
das patas traseiras para realização de imunohistoquímica, seguindo o esquema cronológico
de 24h, 7,14 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção
do grupo 24h que recebeu apenas 1 injeção 24h antes da eutanásia. A: Controle negativo
(Cont. Neg) pele da pata colhida com 7 dias de animais injetados com OXL na ausência do
anticorpo primário. B: O grupo controle (normal) recebeu o veiculo. C a G: O restante das
fotos são animais injetados com OXL e estão indicadas com os respectivos dias de coleta
(400x).
Figura 26. Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para SP em pele de
pata de camundongos submetidos ao tratamento com oxaliplatina. Os animais foram
tratados com oxalipaltina (OXL; 1 mg/kg; EV), a cada semana e foi retirada da pele das
patas traseiras para realização de imunohistoquímica, seguindo o esquema cronológico de
24h, 7,14 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do
grupo 24h que recebeu apenas 1 injeção 24h antes da eutanásia. A: Controle negativo
(Cont. Neg) pele da pata colhida com 7 dias de animais injetados com OXL na ausência do
anticorpo primário. B: O grupo controle (normal) recebeu o veiculo. C a G: O restante das
fotos são animais injetados com OXL e estão indicadas com os respectivos dias de coleta
(400x).
Figura 27. Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para NMDAR em
pele de pata de camundongos submetidos ao tratamento com oxaliplatina. Os animais
foram tratados com oxalipaltina (OXL; 1 mg/kg; EV), a cada semana e foi retirada da pele
das patas traseiras para realização de imunohistoquímica, seguindo o esquema cronológico
de 24h, 7,14 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção
do grupo 24h que recebeu apenas 1 injeção 24h antes da eutanásia. A: Controle negativo
(Cont. Neg) pele da pata colhida com 7 dias de animais injetados com OXL na ausência do
anticorpo primário. B: O grupo controle (normal) recebeu o veiculo. C a G: O restante das
fotos são animais injetados com OXL e estão indicadas com os respectivos dias de coleta
(400x).
Figura 28. Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para TNF em pele de
pata de camundongos submetidos ao tratamento com oxaliplatina. Os animais foram
tratados com oxalipaltina (OXL; 1 mg/kg; EV), a cada semana e foi retirada da pele das
patas traseiras para realização de imunohistoquímica, seguindo o esquema cronológico de
24h, 7,14 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do
grupo 24h que recebeu apenas 1 injeção 24h antes da eutanásia. A: Controle negativo
(Cont. Neg) pele da pata colhida com 7 dias de animais injetados com OXL na ausência do
anticorpo primário. B: O grupo controle (normal) recebeu o veiculo. C a G: O restante das
fotos são animais injetados com OXL e estão indicadas com os respectivos dias de coleta
(400x).
Figura 29. Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para VR1 em pele de
pata de camundongos submetidos ao tratamento com oxaliplatina. Os animais foram
tratados com oxalipaltina (OXL; 1 mg/kg; EV), a cada semana e foi retirada da pele das
patas traseiras para realização de imunohistoquímica, seguindo o esquema cronológico de
24h, 7,14 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do
grupo 24h que recebeu apenas 1 injeção 24h antes da eutanásia. A: Controle negativo
(Cont. Neg) pele da pata colhida com 7 dias de animais injetados com OXL na ausência do
anticorpo primário. B: O grupo controle (normal) recebeu o veiculo. C a G: O restante das
fotos são animais injetados com OXL e estão indicadas com os respectivos dias de coleta
(400x).
Figura 30. Fotomicrografias da marcação por imunohistoquímica para nitrotirosina em
pele de pata de camundongos submetidos ao tratamento com oxaliplatina. Os animais
foram tratados com oxalipaltina (OXL; 1 mg/kg; EV), a cada semana e foi retirada da pele
das patas traseiras para realização de imunohistoquímica, seguindo o esquema cronológico
de 24h, 7,14 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção
do grupo 24h que recebeu apenas 1 injeção 24h antes da eutanásia. A: Controle negativo
(Cont. Neg) pele da pata colhida com 7 dias de animais injetados com OXL na ausência do
anticorpo primário. B: O grupo controle (normal) recebeu o veiculo. C a G: O restante das
fotos são animais injetados com OXL e estão indicadas com os respectivos dias de coleta
(400x).
DISCUSSÃO
5 DISCUSSÃO
Desde 1960, uma grande quantidade de análogos Pt tem sido sintetizada com
o intuito de aumentar a atividade antitumoral ou prevenção do câncer, como por
exemplo a cisplatina, carboplatina e OXL.
Marshall (2004) cita que especificamente a OXL (trans-l-diaminociclohexano-
L-OH) foi desenvolvida em 1970 como uma das dezenas de 1,2-DAOH composto Pt.
Testes clínicos mais de uma década depois revelaram sua magnífica atividade
antitumoral.
A OXL é a terceira geração de agentes Pt tendo demonstrado um amplo
espectro de atividade antitumoral e toxicidade diferente da cisplatina e das drogas
de segunda geração como carboplatina. Por se distribuir em todas as células dos
tecidos, exibe uma potente atividade citotóxica em linhas de células cancerosas
humanas, incluindo câncer colorretal, ovariano e pulmonar.
A toxicidade da OXL difere de outros compostos Pt, dentre eles está o
laringoespasmo, náuseas, vômitos, diarréia, reações de hipersensibilidade, fadiga,
fibrose pulmonar e neuropatia periférica, que é objeto desse estudo.
Drogas quimioterápicas como paclitaxel, cisiplatina, vincristina e OXL são
conhecidas por ter como principal efeito adverso a ocorrência de neuropatias
periféricas. Nesse sentido, diversos autores vêm demonstrando esses efeitos
através de modelos experimentais animais no intuito de estudar o mecanismo pelo
qual esses efeitos aparecem. Segundo Peltier e Russell (2002), a respeito da
neuropatia por vincristina e por paclitaxel já estão bem documentados na literatura
modelos desenvolvidos para o seu estudo. No entanto, a neuropatia induzida por
OXL ainda é pouco estudada a nível experimental e existindo poucos modelos
animais para o estudo.
A neurotoxicidade da OXL pode se manifestar em duas síndromes distintas,
uma síndrome aguda e transitória que pode aparecer durante ou após a infusão do
quimioterápico e uma síndrome de neuropatia periférica sensorial DLT.
A neurotoxicidade aguda e transiente observada com a administração de
OXL, nos estudos de Saif e Reardon (2005), ocorre rotineiramente em muitos
pacientes e consiste de uma toxicidade de inicio rápido ocorrendo nas primeiras
horas de infusão. Os sintomas são peculiares e geralmente são induzidos ou
agravados pela exposição ao frio. Pode haver manifestações de toxicidade motora e
sensitiva. As sensitivas incluem parestesias e/ou disestesias nas extremidades
distais e/ou região perioral. Cerca de 1 a 2% dos pacientes experimentam uma
disestesia laringofaríngea, causando a sensação de dificuldade respiratória. Alguns
sintomas motores, mais raramente, podem acompanhar os sintomas sensitivos
como espasmos tetânicos, fasciculações e contrações musculares prolongadas. Os
sintomas são parecidos com os observados para cisplatina, entretanto a
ototoxicidade parece ser rara com a OXL. Geralmente persistem entre os ciclos de
quimioterapia e aumentam de intensidade com doses cumulativas. Alguns sintomas
motores podem ocorrer como ataxia sensorial e déficit na coordenação motora
sensitiva.
Assim para Hwang (2004), uma síndrome aguda consiste também em
parestesia perioral e distal, disestesia faringolaringeal que com a suspensão da OXL
esses sintomas são revertidos em poucas horas ou dias. Já a forma crônica é
puramente sensorial, neuropatia axonal como a NSP e altas doses de OXL que são
fortemente associadas com a ocorrência de dano neural. Os sintomas da síndrome
crônica podem ser severos a ponto de limitar a realização de atividades diárias pelos
pacientes.
Recentemente foi publicado um trabalho de Ling et al. (2007a), onde se
desenvolveu um modelo de neuropatia sensitiva induzido por OXL em ratos. Esse
modelo avaliou o comportamento de animais recebendo um tratamento crônico com
OXL mediante a estímulos mecânicos e térmicos, assim como o efeito de drogas
comumente utilizadas em doenças neuropáticas como CBZ, GABAP, anestésicos
locais, cálcio e magnésio.
De posse desses dados da literatura, achamos que seria válido também criar
um modelo experimental para o estudo da neuropatia por OXL em camundongos,
visto que são a espécie mais utilizada no desenvolvimento de animais
geneticamente modificados. Além disso, modelos experimentais com camundongos
são mais econômicos, tanto no que diz respeito à quantidade de drogas e reagentes
gastos no estudo, quanto aos gastos com a manutenção dos animais. Nesse
sentido, desenvolvemos um modelo de NSP por OXL em camundongos, baseando-
se no modelo descrito na literatura para ratos de Ling et al.
(
2007a).
Alguns fatores tornaram essa pesquisa dispendiosa como, por exemplo, o
elevado custo da droga, o número de animais necessários para cada grupo
experimental, já que o fenômeno estudado é de difícil avaliação devido ao caráter
subjetivo e por ser fenômeno doloroso crônico (dias-semanas). Estas dificuldades
iniciais foram superadas, visto que a grande maioria dos trabalhos usa ratos ao
invés de camundongos, fato que levou a trabalhar com doses bem menores
facilitando a condição da pesquisa.
Muitos estudos clínicos e investigações epidemiológicas usam machos ao
invés de fêmeas devido às respostas comportamentais. Devido a estes fatos,
decidimos utilizar camundongos machos nos experimentos.
Sabe-se que a NSP de camundongos apresenta semelhanças com a de
humanos, podendo, portanto, ser utilizada em estudos experimentais. Em geral, ao
término da pesquisa, nenhuma deterioração clínica foi observada nos animais, nem
na pele, pelos e cauda.
Antes da primeira administração de OXL nenhuma diferença foi observada
entre os grupos tratados e o controle. Após a nona administração de OXL dois
camundongos morreram um no grupo controle e outro na dose de 1mg/kg nos testes
térmicos após dose acumulada de 36mg/kg. Semelhantemente nos estudos de Ling
et al. (2007a) dois ratos morreram depois da oitava injeção (EV) de OXL e dois ratos
morreram depois da nona no grupo da dose de 4mg/kg quando acumulou a dose de
32mg/kg. Doses mais altas no estudo de Cavaletti et al. (2001) que injetou (IP) 2-
3mg/kg duas vezes por semana, onde três animais morreram durante os
experimentos.
Três hipóteses primárias para as causas da NSP foram propostas: nos
estudos de fase I de Wilson et al. (2002) através do estudo da condução nervosa e
eletromiografia (EMG), no de Grolleau et al. (2001) que sugeriram indução por
hipersensibilidade nervosa, ou por impacto de canais de Na
+
voltagem-dependente
ou por quelação de Ca
+2
e Luo, Wyrick e Chaney (1999) que propuseram a teoria
por agregação de Pt no DRG.
Freudenrich (2007) ressalta que as vias ascendentes da dor na medula
espinhal dorsal podem ser disparados pela dor neuropática induzida por danos aos
nervos periféricos, espinha dorsal e o próprio cérebro. Contudo, a extensão do dano
pode limitar a reação das vias descendentes do cérebro. No caso de dores crônicas,
que persiste um mês além da evolução habitual de uma lesão, Caillet (1999) atribui
os mecanismos periféricos responsáveis à persistência do fenômeno. Argumento
evidenciado em nosso estudo visto que as respostas aos testes deram significância
estatística mesmo após um mês de administração de OXL.
Ta, Low e Windebank (2009) explicam que os modelos em camundongos
também podem ser úteis em mostrar as terapêuticas para tratar dor neuropática.
Contudo os animais responderam significantemente ao estímulo frio e mecânico.
Essa alteração comportamental é semelhante à resposta observada nos pacientes
tratados com OXL.
Schmoll (2002) esclarece quanto às características clínicas e eletrofisiológicas
que a OXL causa um espectro raro de toxicidades neurológicas agudas que não
foram observadas em pacientes recebendo cisplatina nem carboplatina. Os sinais e
sintomas podem começar durante a infusão ou dentro de 1–2 dias de administração
de OXL. Clinicamente, o autor complementa dizendo que alterações sensórias são
mais proeminentes, particularmente induzidas pelo frio e parestesias perioral. Pode
haver respiração curta ou dificuldade em engolir, mas sem qualquer evidência
objetiva de angústia respiratória.
Dados clínicos de estudos de Machover et al. (1996) envolvendo mais de
1000 pacientes mostraram que a incidência de NSP induzida por OXL aguda é muito
alta. Nesses estudos, OXL foi administrada em várias doses variando de 85 a 130
mg/m
2
, enquanto a severidade de NSP induzida por OXL foi classificada pelo
CTCINC como a neuropatia periférica induzida por OXL aguda ocorrendo na maioria
dos pacientes tratados, com índices de incidência, variando de 65% a 98% (a
incidência de NSP induzida por OXL crônica normalmente é relacionado a vários
fatores de risco, inclusive horário de tratamento, única dose por curso, dose
cumulativa, tempo de infusão e neuropatia periférica preexistente).
De Gramont et al. (2000) ressaltam que a NSP induzida por OXL também
pode ser desencadeada por cirurgia. O nível 3 de toxicidade neurosensorial ocorreu
em 18,2% pacientes selecionados aleatoriamente. Toxicidade total de alteração
neurosensitiva foi observada em 68% destes pacientes. A incidência de nível 2 e 3
de neuropatia, respectivamente, calculada para pacientes expostos a OXL, alcançou
10% depois de 3 e 9 ciclos, 25% depois de 8 e 12 ciclos e 50% depois de 10 e 14
ciclos. Isto pode ser atribuído à acumulação de doses de OXL, desde que é
documentado que em doses cumulativas que alcançam 800 mg/m
2
, a ocorrência de
NSP induzida por OXL é altamente possível, enquanto severamente (classificação 3)
de NSP induzida por OXL ocorreu em 15% depois de doses cumulativas de 750–850
mg/m
2
e 50% depois de uma dose total de 1170 mg/m
2
.
No estudo de Andre et al. (2004) o FOLFOX6 induziu neurotoxicidade
envolvendo 94% dos pacientes com 20% de casos nos níveis 3 e 4. No cenário de
adjuvantes, resultados de um teste mosaico envolvendo um total de 2246 pacientes
com etapa II ou III de câncer de cólon mostrou que em pacientes atribuídos ao
FOLFOX4, a incidência de nível 3 de neuropatia sensorial foi de 12,4% durante o
tratamento, diminuindo a 1,1% em 1 ano; classificação 2 de neuropatia foi de 31,5%
durante tratamento, diminuindo 5% em 1 ano e classificação 1 de neuropatia foi de
48,1% durante o tratamento, diminuindo a 24% em 1 ano. Esse estudo mostrou que
o índice informado (64%) de pacientes que manifestaram NSP induzida por OXL
depois da administração do regime de FOLFOX4 ser bastante semelhante ao que foi
previamente informado em vários estudos.
Andre et al. (2004), como em outras publicações prévias, afirmam ainda que a
maioria desses pacientes experimentou suave ou moderada (classificação 1 ou 2)
NSP induzida por OXL. O nível 3 de neurotoxicidade foi observado em 8% dos
pacientes, um índice bastante semelhante ao que foi observado no teste do tipo
mosaico, enquanto foi mais baixo que o observado em outros estudos. Diferenças
na natureza dos estudos e a metodologia aplicada podem explicar as discrepâncias
entre os resultados. A maioria de todos os outros estudos avaliou a eficácia,
tolerabilidade geral e perfil de segurança do FOLFOX4. Nesse estudo foi focalizado
fazer o controle neurológico da NSP induzida por OXL, baseado em escalas clínicas
validadas e gravações longitudinais de eletrofisiologia.
Em um estudo envolvendo 214 pacientes com câncer colorretal metastático,
nível 3 e 4 de neuropatia, Kemeny et al. (2004) apresentaram a ocorrência só em
6% de pacientes designados a serem tratados com o regime de FOLFOX4. O índice
de sintomas sensoriais totais foi de 82% (65% de qualquer neuropatia aguda e 57%
de neuropatia cumulativa). A neuropatia persistente (durando acima de 14 dias) se
classificam em 2 ou 3 foi visto em 18% e 3% no grupo FOLFOX4. Depois que a
exposição ao regime de FOLFOX6, nível 3 e 4 de NSP foi observado em 16% do
total de 60 casos. Por causa dessa e de outras toxicidades, só 36% desses
pacientes receberam igual ou acima de 90% da dose-intensidade. O mesmo grupo
informou subsequentemente que 97% dos pacientes apresentaram neurotoxicidade
depois da administração do FOLFOX7. Nesse levantamento em estudo em humanos
pode-se observar a importância clínica da OXL em induzir a NSP.
Visto que os sintomas são claramente apresentados nos estudos tanto em
humanos como em animais buscou-se produzir um modelo que pudesse demonstrar
resultados mais precisos para que na terapêutica clínica os pacientes pudessem
realizar a terapia completa com uso da OXL sem que com isso acarretasse em NSP.
No presente trabalho foi avaliada principalmente a síndrome crônica de
neuropatia periférica, já que esta pode limitar a continuação do esquema
quimioterápico e é mais difícil de prevenir do que a síndrome aguda, como foi
exposto anteriormente. Com a administração semanal de OXL (2 vezes por semana)
pudemos observar um aumento cumulativo da sensibilidade a estímulos térmicos e
mecânicos, ou seja, que iam aumentando de intensidade conforme os ciclos de
injeções iam se repetindo. Dessa forma observou-se um desenvolvimento de
hiperalgesia e alodínia tanto por estímulos térmicos como mecânicos.
Para Millan (1999) o estudo da NSP é o estudo da alodínia que é um sintoma
típico das alterações sensitivas observadas nas neuropatias periféricas juntamente
com as disestesias e parestesias sendo descrita como dor a um estímulo que
normalmente não provoca dor.
A demonstração de alodínia e de hiperalgesia mecânica vem sendo realizada
comumente pelo teste com filamentos de Von Frey, onde o animal é colocado e
mantido sobre uma superfície vazada, tipo grade e filamentos de diversos calibres
são empurrados contra a superfície plantar das patas traseiras até que o animal
retire a pata e realize o movimento característico de sacudida ou flinch
acompanhado ou não de lambedura da mesma, como citado por Von Frey (1896),
Kim e Chung (1992), Omote et al. (2001) e Sousa e Prado (2001).
No presente estudo realizamos os testes de hiperalgesia e alodínia
mecânicos com o Von Frey eletrônico, visto que diferente do Von Frey filamentos, o
Von Frey eletrônico realiza o mesmo procedimento, entretanto o experimentador não
precisa fazer a troca de filamentos de calibres diferentes, pois o aparelho registra os
diversos níveis de pressão como uma força em gramas que aparece no visor do
aparelho assim que o animal retira a pata em contato com o sensor. Cabe ao
experimentador interpretar se a retirada da pata foi uma reação de comportamento
nociceptivo ou não, o que depende da forma como ele retira a pata. Em nosso
estudo o mesmo pesquisador realizou a avaliação desse teste em todas as fases
dos experimentos.
Assim como no teste com filamentos, onde alguns filamentos são utilizados
preferencialmente para avaliar alodínia, o Von Frey eletrônico ao registrar valores
muito baixos como 1-4 g também pode servir como método de avaliação de alodínia
mecânica como foi demonstrado em ratos por Möller, Johansson e Berg (1998) e
Cunha et al. (2004) utilizando o aparelho Von Frey eletrônico (analgesímetro digital)
demonstrou o desenvolvimento de hiperalgesia mecânica inflamatória em
camundongos.
Cunha e colaboradores (2004) mostraram que camundongos injetados com
substâncias inflamatórias demonstraram um comportamento de hipernocicepção
(conhecido clinicamente como hiperalgesia) a partir da primeira hora após a
administração de carragenina ou de prostaglandina E
2
. Essas duas substâncias são
classicamente conhecidas como indutoras de hipernocicepção/hiperalgesia em ratos
e camundongos. Nos animais injetados o limiar de retirada da pata baixou 8 vezes a
partir da 1ª hora. Foi constatado no nosso estudo que camundongos hígidos
normalmente respondem a uma pressão em gramas em torno de 13 a 15 g,
removendo a pata e geralmente realizando movimentos de flinch com lambedura.
Após a administração de OXL esse limiar começa a baixar chegando a 1-4g nos
últimos dias de experimentação.
A alodínia mecânica em ratos foi testada no estudo de Ling et al. (2007a) com
os filamentos de Von Frey no qual houve diminuição máxima de -87% do limiar no
grupo de 1mg/kg. Ainda citando Ling et al. (2007a) no teste de hiperalgesia
mecânica os grupos de 2 e 4mg/kg tiveram redução máxima de -36% e -48%
respectivamente comparados com o grupo controle. No nosso estudo, foi observado
um aumento significativo no limiar nociceptivo a partir do 14º dia atingindo o máximo
na dose de 2mg/kg, contudo houve aumento significativo também nas doses de
1mg/kg e 4mg/kg.
Ta, Low e Windebank (2009) concluíram que os ratos tratados com OXL
exibiram hiperalgesia ao frio (-4,2ºC) e mecânica (filamentos de Von Frey) como em
nosso estudo. Leonard (2005) afirma que mais de 80% dos pacientes em sua
pesquisa tratados com OXL desenvolveram hiperalgesia, dor e disestesia como
observado nos animais.
Outro parâmetro que comumente é levado em consideração nos estudos
envolvendo neuropatias sensitivas é a sensibilidade a estímulos térmicos. É rotineiro
o uso de duas temperaturas distintas para avaliar os fenômenos de alodínia e
hiperalgesia. Para Millan (1999) a hiperalgesia térmica normalmente é testada com
temperaturas definidas como nocivas, ou seja, acima de 45ºC ou abaixo de 5ºC. Por
outro lado, para testes de alodínia térmica são utilizadas temperaturas entre 40 e
44ºC e entre 6 a 10ºC por serem consideradas não nocivas.
Baseado nesses conceitos realizamos testes térmicos para avaliar o
desenvolvimento de hiperalgesia e alodínia térmica em animais tratados
cronicamente com OXL. As temperaturas utilizadas foram extraídas do trabalho de
Authier et al. (2003) e Ling et al. (2007a). Inicialmente pensamos em utilizar o teste
da placa quente para avaliar a hiperalgesia e alodinia, entretanto o teste apresentou
alguns incovinientes como o condicionamento dos animais (com a periodicidade dos
experimentos os animais aprendiam a sair da placa saltando) e também por não ser
permitido o teste em temperaturas frias.
Optamos, então, pelo teste de imersão da cauda que permite tanto o uso de
estimulos quentes como frios. Assim ficou mais conviniente na hora de comparar
qual tipo de estímulo térmico os animais tratados com OXL respondem com maior
intensidade. Fizemos uma modificação do modelo original no qual os animais são
imobilizados na mão do experimentador. Depois de fazermos várias tentativas de
registro do limiar nociceptivo normal de cada animal com esse tipo de imobilização,
percebemos que a imobilização pelo experimentador causa um certo desconforto ao
animal que fica durante um bom tempo tentando fugir, causando reações falso-
positivas. Decidimos lançar mão de um outro método de imobilização utilizando um
contensor de acrílico transparente. Com essa metodologia conseguimos realizar
registros de limiar mais fidedignos e que se repetiam.
Observamos que com o contensor de acrílico os animais, depois de alguns
minutos, se acostumavam e desistiam de tentar escapar ficando com a cauda
imóvel, o que permitiu melhores resultados. As temperaturas foram constantemente
mantidas e monitorizadas através do uso de caixas isolantes de isopôr e
termômetros.
Tanto os testes térmicos quentes e frios, assim como o teste mecânico foram
realizados em grupos de animais diferentes, de modo que cada animal foi submetido
somente a um tipo de teste, tentando minimizar o nível de estresse. Procuramos
também evitar que os testes fossem feitos no mesmo dia das injeções de OXL.
Observando todos esses cuidados, bem como o local de experimentação
silencioso e com exaustão e iluminação adequadas podemos garantir que nossos
resultados são fidedignos e com o mínimo de variáveis possíveis para um
experimento de comportamento.
De posse do registro do limiar nociceptivo de cada animal, para cada
temperatura testada, foi observado que as doses cumulativas de OXL produzem um
aumento da sensibilidade tanto para as temperaturas de hiperalgesia (4ºC e 46ºC)
assim como para temperaturas não nocivas de alodínia (10ºC e 42ºC). Entretanto,
analisando de uma forma mais comparativa entre essas temperaturas, observa-se
que a intensidade das respostas foi mais significativa para as temperaturas de
alodínia, principalmente a alodínia pelo frio.
Nesse sentido, a dose de OXL que demonstrou melhores resultados foi a de 1
mg/kg para os testes de alodínia e hiperalgesia térmicos pelo frio e a de 2mg/kg nos
testes de hiperalgesia mecânica.
Em um estudo agudo, Ling et al. (2007b) mostraram que uma única injeção
de OXL em ratos não desenvolve hipersensibilidade no teste de imersão da cauda
em água a 46ºC, entretanto desenvolvem hipersensibilidade ao frio a 4ºC e 10ºC. No
estudo crônico de Ling et al. (2007a) em ratos uma rápida diminuição dos limiares
nociceptivos ao frio (4ºC) foi observada em todas as doses tratadas, com uma
máxima redução do limiar nociceptivo de -89% depois da quarta ou sexta injeção.
Em resposta aos estímulos quentes (42 e 46º C) uma máxima redução foi observada
na dose de 2mg/kg depois da sexta a oitava injeção semelhante ao nosso modelo.
No teste de alodínia térmica foi observado uma diminuição significativa no
limiar nociceptivo atingindo o máximo na dose de 1mg/kg comparado ao grupo
controle nas temperaturas de 10 e 42ºC. Também se notou uma redução
significativa do limiar nociceptivo na dose de 1mg/kg que se mostrou
estatisticamente diferente da dose de 2mg/kg na temperatura de 10ºC. Resultado
semelhante ao estudo de Joseph et al. (2008) onde houve redução significativa nos
limiares de alodínia.
No teste de hiperalgesia térmica foi observado uma diminuição significativa no
limiar nociceptivo atingindo o máximo na dose de 4mg/kg e 1mg/Kg em 4ºC e na de
4mg/kg em 46ºC comparados ao grupo controle. Ta, Low e Windebank (2009), no
modelo em ratos, mostraram diferenças de respostas dolorosas (térmicas e
mecânicas). A DLT utilizada foi de 30mg/kg, diferente do nosso estudo que foi em
camundongos com dose acumulada de 9 a 36mg/kg, porém essas diferenças nas
respostas podem ser observadas em pacientes tratados com OXL.
Em estudo mais recente, Ta, Low e Windebank (2009) utilizando
camundongos C57BL6J demonstraram o surgimento de hiperalgesia térmica para
temperaturas altas e baixas com a dose cumulativa de 30mg/kg. Esse estudo
comparou o efeito da OXL e cisplatina. Os mesmos autores observaram que OXL
induz hiperalgesia ao frio que é mais intensa nas primeiras semanas e menos
intensa nas últimas semanas, enquanto que os camundongos não desenvolvem
hiperalgesia a estímulos quentes. Estranha foi a temperatura utilizada por esses
autores (-4.2ºC), a qual elícita nocicepção mesmo em animais hígidos. Ainda no
mesmo trabalho os testes foram apenas de hiperalgesia térmica e alodínia mecânica
onde a OXL demonstrou atividade apenas para estímulo frio e mecânico. Entretanto
não foi realizado testes de alodínia térmica, o que normalmente é averiguado
quando o estudo envolve dor neuropática, outro ponto também não discutido pelos
autores.
Apesar de ser um trabalho de avaliação de neurotoxicidade da OXL em
camundongos vários pontos diferem do nosso estudo, a começar (1) pelo tipo de
camundongo: C57BL6J versus swiss; (2) via de administração: IP versus EV; (3)
esquema de quimioterapia: dois ciclos de 5 injeções com intervalo de 5 dias versus 2
injeções por semana durante 4,5 semanas; (4) temperatura dos testes térmicos -
4.2ºC x 4ºC e 50ºC x 46ºC; (5) ausência da avaliação de alodínia pelo frio e quente.
Os nossos resultados mostram que a OXL parece induzir com mais intensidade um
quadro de alodínia do que hiperalgesia.
No que se referem ao comprometimento motor nossos dados mostram que
OXL não alterou a função motora, o equilíbrio e a força nos animais tratados nem
mesmo com a maior dose, demonstrado através do teste de Rota Rod. O Rota Rod
é um equipamento que mede atividade motora demonstrando alterações de
equilíbrio e coordenação e é utilizado para avaliar danos nos gânglios basais,
cerebelo ou para avaliar efeito de drogas que afetam a função motora. Corroborando
com nossos achados e utilizando outro tipo de teste, o teste de força de preensão
(grip strenght test), Ling et al (2007a e b) demonstraram em ratos e Ta, Low e
Windebank (2009) demonstraram em camundongos que a OXL não causa
impedimento da função motora pelo menos nas doses utilizadas por esses autores,
sugerindo-se que a neurotoxicidade periférica da OXL parece ser primariamente em
fibras sensitivas.
Na NSP induzida por OXL em ratos, Ling et al. (2007a), utilizaram a dose de
2mg/kg (IP) para os testes farmacológicos para testar drogas analgésicas. Os
nossos resultados mostraram, entretanto, que a dose de 1mg/kg (EV) de OXL foi
capaz de induzir a NSP em camundongos. De posse da dose da OXL de efeito
máximo (1mg/kg) passamos a utilizá-la nos experimentos seguintes.
Como controle do estado clínico do animal, o peso corporal foi medido antes
de cada administração de OXL e até o final dos testes onde não se observou
diferença estatística entre o grupo controle e os grupos tratados. Fato semelhante foi
constatado no estudo de Ling et al. (2007a) onde não houve diferença significativa
entre os grupos com uma leve diminuição do peso nos grupos de 2mg/kg e 4mg/kg
(-11% e -18% respectivamente). Como, também, os achados de Ta, Low e
Windebank (2009) onde não houve diferença significativa no peso dos animais
(ratos) tratados com OXL com DLT de 30mg/kg e cisplatina (DLT de 23mg/kg).
Contrariamente, Cavaletti et al. (2001) demonstrou que em ratos houve
diferença significativa entre o grupo controle e os grupos tratados com 2,25 mg/kg
(p<0,05) e 3mg/kg (p<0,001) com decréscimo de peso ao final do experimento. Essa
controvérsia entre os autores pode ser devido à diferença entre vias de
administração da OXL. A via IP foi utilizada ao invés de EV. Em nosso estudo, por
ser crônico demos preferência à via EV.
O tratamento dessa neurotoxicidade não é satisfatório e ainda é um desafio.
Alguns casos persistem mesmo após sucessivas tentativas de tratamento e com o
interrompimento da quimioterapia. São utilizadas na clínica atualmente as drogas
anticonvulsivantes como CBZ, GABAP, OXZ, assim como também infusões de Ca
2+
e magnésio antes da quimioterapia. Entretanto isso não é garantia de prevenção e
nem cura desse efeito colateral da OXL.
Muitos fatores influenciam a resposta comportamental à dor incluindo as
diferenças entre as espécies, a genética e o tipo de dor. A prática clínica é capaz de
propor mudanças de estratégias para prevenir ou tratar neurotoxicidade induzida por
OXL vias terapias de dor convencional como morfina, lidocaína, CBZ, GABAP,
clomipramida ou venlafaxina como citam os autores Carrato, Gallego e Diaz-rubio
(2002), Gamelin et al. (2002), Ling et al. (2007a) e Screnci et al. (2000) e o uso de
cálcio ou magnésio citados por Cersosimo (2005), Durand et al. (2005) e Ling et al.
(2007a).
Em nosso estudo a resposta comportamental ao estímulo de frio, os animais
responderam no teste antinociceptivo ao efeito de drogas comumente utilizadas na
clinica de dor para o tratamento de neuropatias sensitivas. Assim foram testados os
seguintes fármacos: CBZ, OXZ e GABAP e também foi utilizada a INDO como um
controle negativo, pois sendo um anti-inflamatório não esteroidal não apresenta
efeito analgésico comprovado em neuropatias sensitivas.
Os nossos dados mostram que tanto a CBZ, GABAP como a OXZ foram
eficazes em inibir os sintomas de alodínia ao frio, entretanto a INDO, como
esperado, não exerceu efeito inibitório nem mesmo na maior dose utilizada. Ling e
colaboradores (2007a) obtiveram os mesmos resultados para a GABAP, mas
curiosamente a CBZ não demonstrou atividade analgésica significante, apenas uma
tendência a inibir. Os mesmos autores não chegaram a testar a OXZ e nem a INDO.
Esses mesmos autores obtiveram resultados analgésicos com a morfina, apesar de
não ser a droga de escolha pra tratar neuropatias e também com o antidepressivo
venlafaxina e com Mg
2+
. Porém, não testaram se as doses utilizadas produziriam
algum tipo de alteração motora. Adelsberger et al. (2000) sugerem que a OXL pode
bloquear canais de Na
+
voltagem-dependente, assim como a CBZ que por sua vez
deu melhor resultado nos testes.
Grothey (2003) e Argyriou et al. (2008) esclarecem que a OXL age em canais
de Na
+
fazendo uma rápida quelação do Ca
+2
porque é capaz de alterar os canais de
Na
+
voltagem-dependentes através da via que envolve o Ca
+2
. Conforme sugerem
Macdonald e Kelly (1995), Saif e Reardon (2005), Gamelin et al. (2002) e Eckel et al.
(2002), a OXL afeta canais de Na
+
voltagem-dependente levando ao uso de CBZ
para prevenir a neuropatia induzida por OXL. A CBZ diminui as frequências de
repetições dos potenciais de ação por aumentar canais de Na
+
inativos. Grothey
(2003) e Argyriou et al. (2008) propuseram efeito profilático da CBZ em neuropatia
induzida por OXL.
Diferentemente no estudo de Ling et al.(2007a) com uma única administração
IP de CBZ não houve produção de efeito significativo nas três doses administradas.
Já ao administrar OZP, outro anticonvulsivante, foi observado que com o
tratamento nos camundongos aumentou-se o limiar nociceptivo na melhor dose de
100mg/kg comparado com o grupo controle conforme Argyriou et al. (2008) no seu
estudo piloto com 32 pacientes que após o uso da OZP o tratamento foi eficaz da
neuropatia induzida por OXL.
Grothey (2003) e Wong et al. (2005) definem a GABAP como um
anticonvulsivante mais bem tolerado que a CBZ e que melhor resolve os sintomas
da dor neuropática. Na pesquisa de Grothey (2003) pacientes foram tratados com
GABAP assim que os sintomas neuropáticos iniciaram e continuaram fazendo o uso
de GABAP até o final do tratamento não interrompendo o esquema de OXL por
causa da neurotoxicidade.
Como aponta Argyriou et al. (2008) a GABAP é um anticonvulsivante
promissor por sua eficácia em síndromes dolorosas neuropáticas contrariamente o
que Wong et al. (2005) encontrou em seu estudo com 115 pacientes na qual a
GABAP não reverteu a dor e os sintomas agudos da neuropatia por OXL. Porém,
Mariani, Garonne e Granetto (2000) em seu estudo piloto com 15 pacientes tiveram
resultado positivo e em uma abordagem diferente Mitchell et al. (2006) que cita que
a GABAP foi ineficaz. O que pode ter diferenciado seria a dose administrada de
85mg/m
2
e 100mg/m
2
respectivamente.
Para Ling et al. (2007a) a administração oral única de GABAP aumentou o
período de latência nas doses de 100 e 300mg/kg depois de 150min induzindo efeito
anti-alodínico nos ratos.
Nas obras de Chapman et al. (1998) e Fox et al. (2003) descrevem efeitos de
GABAP (30-100mg/kg, IP) como atenuante da alodínia ao frio em outros modelos de
injúria nervosa e em diferentes estímulos térmicos por elucidar diferentes respostas.
Mariani, Garonne e Granetto (2000) ressaltam a eficiência de GABAP em prevenção
e tratamento da neurotoxicidade de OXL. No nosso estudo, em animais, foi
observado que o tratamento com GABAP (VO) aumentou o limiar nociceptivo,
indicando efeito analgésico, sendo a dose de maior efeito a de 54mg/kg a partir de
75min comparado ao grupo controle.
Foi observado que o tratamento com INDO não demonstrou atividade
analgésica nesse modelo comparado ao grupo controle, visto que INDO não é capaz
de tratar dor neuropática devido sua ação ser de anti-inflamatório não-esteroidal cuja
ação consiste em inibir a atividade da enzima cicloxigenase para diminuir a
formação de precursores de prostaglandinas e tromboxanos a partir do ácido
araquidônico.
No presente trabalho foi feita a avaliação do impedimento motor e/ou sedação
promovida pelas maiores doses das drogas testadas. Foi visto que existe uma
diferença significativa no grupo que recebeu CBZ no teste de Rota Rod realizado em
animais neuropáticos tratados com esse fármaco. Isso sugere que talvez na dose
máxima (30 mg/kg) o aumento exagerado do limiar nociceptivo com reversão total
do quadro de alodínia pode ter sido devido à sedação e indução de ataxia,
comumente observado em pacientes que utilizam essa droga principalmente nas
suas primeiras administrações.
Seaf e Reardon (2005) citam que há evidências de acúmulo de OXL no DRG
com adminstração IP. Em sua obra Ta et al. (2006) trataram de mostrar que os
mecanismos dos quimioterápicos de compostos Pt ainda não são completamente
conhecidos, assim como as reações de neurotoxicidade seletiva e a sensibilidade ao
frio induzida por OXL. Neurônios sensoriais periféricos podem ser mais vulneráveis
aos compostos Pt porque eles não são protegidos pela barreira sanguínea cerebral.
Tem se mostrado que o acúmulo de neurônios no DRG tem níveis de compostos Pt
em DNA
Grolleau et al. (2001) citam que a neurotoxicidade da OXL ainda não tem
mecanismo seguramente esclarecido, entretanto, tem sido reportada como uma
consequência da diminuição do metabolismo celular e transporte axonal, resultado
do acúmulo de compostos de Pt sobre as células da raiz dorsal da medula espinhal.
O dano mitocondrial induzido por OXL também foi sugerido ser o causador da
neuropatia como mostrou Argyriou et al. (2008). O dano do consumo celular de
oxigênio mitocondrial é uma medida de citotoxicidade da droga. Em estudo in vitro, o
consumo celular de oxigênio mitocondrial foi comparado entre a cisplatina, OXL e
carboplatina e apesar de uma diferença de acúmulo de Pt no DNA entre cisplatina e
OXL, essa exibiu citotoxicidade semelhante ou maior, indicando que essas lesões de
OXL são mais potentes que lesões de cisplatina.
Recentemente Jamieson et al. (2005) sugeriram uma nova hipótese para o
dano neuronal causado pela OXL. Parece que ela afeta uma subpopulação de
neurônios do DRG causando atrofia, mas não morte celular.
Em 2008 surgiu um estudo de Joseph et al. demonstrando que a OXL
seletivamente danifica nociceptores do tipo IB4 positivos, onde é sugerido que o
mecanismo inicial de dano neural seria diretamente por estresse oxidativo. Contudo,
os estudos realizados pelo referido autor são com doses únicas de OXL e não
mimetizam o dano cumulativo crônico, mas servem de pista e pode ser um
promissor caminho no sentido de buscarmos novas e eficazes terapias para o
problema.
Em resposta a estímulo mecânico, nos estudos de Marinković et al. (2009),
neuropeptídeos foram liberados de terminais periféricos de neurônios sensoriais
aferentes primários, alterando na pele as funções imunes de célula e a
permeabilidade vascular crescente, causando inflamação neurogênica. Os autores
sugerem que ao distender a pele há alteração da fisiologia da célula estimulando a
expressão de neuropeptídeos e que a força mecânica repetitiva eficaz pode estar
estimulando nociceptores mecanosensitivos ou mecanorreceptores celulares,
havendo uma grande expressão de SP e CGRP na epiderme e derme papilar.
Baseando-se nessas novas evidências que apontam para o problema como
um fenômeno que inicialmente acomete fibras aferentes primárias na periferia e
não a nível medular, procuramos investigar de forma piloto a existência de
alterações a nível tecidual nas patas dos animais tratados com OXL.
Para isso, inicialmente tentamos analisar se existia alguma alteração
morfológica a nível macroscópico e a nível microscópico, esse através de análise
histopatológica. Nesse sentido nenhuma diferença foi constatada. Não foram
observados sinais inflamatórios, nem áreas de necrose. Nenhuma alteração do
conjuntivo, epitélio ou alterações de receptores sensoriais, visíveis ao microscópio
óptico, como corpúsculo de Meissner ou de Paccini foram observados. Então
procuramos investigar a possível participação de neuropeptídeos, receptores e
mediadores inflamatórios que poderiam estar presentes e atuando a nível periférico.
Foi investigada a participação de neuropeptídeos como SP e CGRP, receptores
periféricos do tipo NMDA e VR1 (TRPV1) além do principal mediador inflamatório, a
citocina TNF, que vem sendo apontada como mediador químico em alguns tipos de
neuropatias periféricas.
Pons (2007) explica que a SP foi o primeiro neuropeptídeo identificado,
pertencente à família das taquicininas, é pequeno com uma sequência de 11
aminoácidos. Apesar disso se localiza em todas as terminações nervosas do corpo
humano e sua presença é mais significativa nas zonas imunológicas, complementa
Katzung (2005) que é um undecapeptídeo que tem na estrutura Arg-Pro-Lys-Pro-
Gin-Phe-Gly-Leu-Met. Gênese (2009) cita que é sintetizada nos ribossomos como
uma grande proteína sendo convertida enzimaticamente em um peptídeo ativo, esse
peptídeo é distribuído no SNC e SNP onde atua como neurotransmissor.
Na definição de Katzung (2005) a SP está presente no SNC, onde é um
neurotransmissor e no trato gastrointestinal (TGI) onde pode agir como transmissor
no sistema nervoso entérico (SNE) e como hormônio local. É um potente
vasodilatador devido ao seu efeito inibitório direto do peptídeo sobre o músculo liso
arteriolar, esta ação é mediada por receptores específicos que diferem daqueles que
medeiam às ações de outros vasodilatadores. E, também, produz uma ação
hipotensiva acentuada em seres humanos e em várias espécies de animais. A SP
estimula a contração do músculo liso venoso, intestinal e brônquico, causa secreção
nas glândulas salivares, diurese e natriurese nos rins e vários efeitos no SNC e
SNP.
Para Gusman et al. (1997) a SP contribui para sensibilizar os receptores
nociceptivos diretamente na periferia ou na membrana pós-sináptica ou através da
interação com outros elementos algiogênicos. Por exemplo, a SP promove
vasodilatação e liberação de histamina do interior dos mastócitos, que é liberada
num ambiente tecidual e resulta em permeação dos vasos sanguíneos.
Jamieson et al. (2005) argumentam que mudança na expressão do
neuropeptídeo SP tem sido mostrada em modelos animais. Foi demonstrado que a
SP e o CGRP tem estado presentes em fibras tratadas com cisplatina e OXL.
Mantyh et al. (1997) citam que a transmissão de sinais nociceptivos está
associada com a liberação de SP e CGRP das terminações centrais de nociceptores
peptidérgicos que terminam na lamina I e II do CDME. Mcmahon, Bennett e Bevan
(2006) relatam que esses neurônios também liberam os mesmos peptídeos na
periferia pra induzir inflamação neurogênica em vários tecidos-alvo.
Chin et al. (2009) explicam que a liberação de SP e CGRP também vêm
sendo demonstrada não só por estímulos que causam inflamação neurogênica, mas
também em locais de injuria tecidual, como é o caso da injúria por estiramento na
pele demonstrado em camundongos através de imunohistoquímica. Nesse estudo
as fotomicrografias revelam a imunomarcação para SP aumentada em pele de
camundongos submetidos à distensão mecânica, entretanto não são demonstrados
sinais histopatológicos de inflamação neurogênica. Em outro estudo, Marinković et
al. (2009) demonstram que pacientes com neuralgia do trigêmio expressam SP em
axônios periféricos do ramo sensitivo do nervo trigêmio, avaliado em cortes
histológicos por imunohistoquímica também sem evidência de inflamação
neurogênica.
Em outro estudo, Trevisani et al. (2007), demonstraram que a SP é liberada
na periferia por estimulação de receptores TRPV1 (VR1) através de estresse
oxidativo. Quando espécies reativas de oxigênio peroxidam os fosfolipídios da
membrana em resposta a injúria tecidual, inflamação ou estresse oxidativo, o 4-
Hidroxinonenal, um aldeído endógeno é produzido. O estudo mostra que quando
essa substância é injetada em patas de camundongos, provoca nocicepção e
liberação de SP e CGRP por ativação dos receptores TRPV1.
Corroborando com os achados da literatura, quando realizamos o ensaio de
imunohistoquímica na pele das patas retiradas dos animais em quimioterapia com
OXL, encontramos um aumento expressivo da imunomarcação para SP a partir de
24 horas com pico no 7º e 14º dias. A marcação foi observada principalmente na
derme papilar, região logo abaixo da epiderme, coincidindo com a área ricamente
inervada por mecanorreceptores de fino calibre. Esse mesmo perfil
imunohistoquímico da expressão de SP em pele de rato já foi demonstrado em
outros modelos de Axelsson et al. (2009) e Chin et al. (2009) e também a
demonstração por imunofluorescência, essa inclusive mostra a co-localização com
CGRP e receptores TRPV1.
Brain et al. (1985) e Mcculloch et al. (1986) citam que o CGRP é um hormônio
com 32 aminoácidos, sendo um membro da família dos peptídeos, que no homem
existem em duas formas, CGRP-α e CGRP-β. Para Rosenfeld et al. (1983) é um
dos mais abundantes peptídeos produzidos em ambos os neurônios periféricos e
centrais. É o mais potente peptídeo vasodilatador e pode funcionar na transmissão
da dor, desempenhar um papel na homeostase cardiovascular e nocicepção.
No estudo de Ling et al. (2007b) a imunomarcação para CGRP na medula
espinhal lombar 24h depois da administração IP de OXL (6mg/kg) foi semelhante do
grupo de ratos tratados OXL e grupo controle mostrando que há expressão desse
marcador com ou sem a administração de OXL.
Entretanto evidências crescentes, principalmente de Carlton, Zhou e
Coggeshall (1996), vêm mostrando que há um envolvimento da SP e CGRP na
periferia na gênese e manutenção da dor neuropática. Ou seja, há uma liberação
antidrômica periférica de SP e CGRP pelas fibras nociceptivas aferentes durante o
desenvolvimento de quadros de dor neuropática. Esses peptídeos são encontrados
normalmente em fibras C e A delta (δ) e podem ser liberados de modo antidrômico
quando essas fibras são estimuladas.
Já estão bem documentados na literatura por Christensen e Hulsebosch
(1997) e Malmberg e Basbaum (1998) que a SP e o CGRP estão envolvidos na
mediação da dor crônica neuropática e que há um aumento tanto do receptor NK1,
SP e CGRP no CDME em estados neuropáticos. Cahill e Coderre (2002) e Bennett,
Chastain e Hulsebosch (2000) citam que o tratamento com antagonistas NK1 e
CGRP1 a nível medular diminui a hiperalgesia em modelos de dor neuropática em
roedores.
Também, Carlton, Zhou e Coggeshall (1996) e Nakamura-craig e Gill (1991)
mostram que a ativação de receptores NK1 e CGRP1 periféricos pelos agonistas
correspondentes resulta em resposta nociceptiva, o que é bloqueado pelo uso de
antagonistas apropriados. Dessa forma é sugerido que SP e CGRP são liberadas na
periferia por impulsos causados pela injúria neural e devem contribuir para a dor
neuropática. Isso foi bem demonstrado por Jang et al. (2004) em modelo
neuropático de ligadura de nervo espinhal, onde a administração prévia de
antagonistas dos receptores NK1 e CGRP1 na pata ipsilateral à lesão diminuiu a
hiperalgesia induzida pela lesão neural.
Já quando os mesmos antagonistas eram administrados após a instalação da
lesão o antagonista CGPR1, mas não o NK1, como no estudo de Jang et al. (2004)
havia diminuição da intensidade de hiperalgesia induzida. Dessa forma, os autores
concluíram que para a instalação do quadro neuropático a liberação periférica de
ambos os peptídeos é importante, entretanto para a manutenção da hiperalgesia no
estado neuropático o CGRP é mais importante do que SP.
Nossos achados condizem com a literatura no sentido que foi observado um
aumento da imunomarcação para CGRP na pele das patas dos animais que
receberam OXL quando comparado ao controle, principalmente no 7º dia.
Outro aspecto investigado, por Tominaga et al. (1998), foi à presença de
TRPV1, conhecido como receptor de capsaicina, que está presente tanto a nível
central no CDME como a nível periférico, nos terminais dos neurônios sensoriais
aferentes exercendo funções integrativas de estímulos físicos e químicos
relacionados à dor.
Para Liddle e Nathan (2004) o TRPV1 foi caracterizado como canal iônico não
seletivo, estando localizados em fibras de pequeno e médio diâmetros, que
correspondem as fibras C e Aδ tipo II. Esses neurônios aferentes primários sensíveis
à capsaicina estão envolvidos não somente com a percepção da dor de origem
somática e visceral, mas também possuem funções efetoras sensoriais, onde
promovem a liberação dos estoques neuronais de neuropeptídios, SP e CGRP
através de um mecanismo dependente de Ca
2+
.
Com relação ao receptor TRPV1 ou VR1 que está bastante relacionado com a
liberação de SP e CGRP nós não observamos diferenças na imunomarcação no
mesmo tipo de tecido em nenhum dos dias em que as peles foram coletadas. Isso
sugere que OXL provavelmente não deve estar aumentando a expressão desses
receptores. Contudo esse achado não descarta a participação desses receptores no
processo de liberação de SP e CGRP pelas fibras periféricas.
Apesar de SP causar degranulação mastocitária causando vasodilatação e
aumento de permeabilidade vascular, do CGRP ser um potente vasodilatador e
ambas estarem relacionadas à inflamação neurogênica, não foi constatado sinais
inflamatórios no tecido coletado avaliado através da analise histopatológica.
Corrobora com esses dados o fato da pesquisa por imunohistoquímica da produção
de TNF, citocina pivô do cenário inflamatório, não ter demonstrado aumento da
marcação para essa citocina. Talvez a ausência de TNF e de evidências
histopatológicas seja devido ao protocolo de injeção e coleta. As peças histológicas
sempre eram coletadas de 24 a 30h depois da injeção de OXL, período onde
provavelmente o cenário inflamatório já teria sido desfeito.
Katzung (2005) cita que o receptor NMDA é um receptor inotrópico ativado
pelo ácido glutâmico glutamato/aspartato e seu agonista exógeno NMDA. A ativação
dos receptores de glutamato resulta na abertura de um canal iônico não-seletivo
para os cátions. Isso permite o fluxo de Na
+
e de pequenas quantidades de Ca
2+
para dentro da célula e de K
+
para fora da célula. Julga-se que o fluxo de Ca
2+
através desses receptores desempenhe um papel importante na plasticidade
sináptica.
Carlton e Hargett (1995), Coggeshall e Carlton (1998) relatam que além de
ser expresso a nível central o receptor NMDA é encontrado também na periferia e
evidencia um papel modulador para o glutamato na nocicepção periférica. Bhave et
al. (2001), Zhou, Bonasera e Carlton (1996) e Walker et al., (2001) citam que a
ativação dos receptores periféricos pela injeção de glutamato ou de agonistas do
receptor produz nocicepção que é bloqueada por antagonistas apropriados. Assim é
possível que o efeito analgésico produzido pela administração sistêmica de
antagonistas do receptor NMDA pode ser resultado tanto da ação central como
periférica dessas drogas.
Com esse propósito Jang et al. em 2004 demonstraram em um modelo de dor
neuropática que tanto os receptores centrais como periféricos estavam envolvidos
na gênese de hiperalgesia e alodínia associadas ao dano neural. Utilizando o
modelo de ligadura de nervo espinhal, foi demonstrado que o receptor NMDA
periférico é importante não somente para iniciar o processo como também para
manter o estado de hiperalgesia após a lesão.
No presente estudo, não investigamos a participação dos receptores NMDA
periféricos de uma forma direta, entretanto a marcação por imunohistoquímica
realizada nas patas dos animais mostra que possivelmente há um aumento da
população desses receptores, principalmente no 21º dia, visto que a imunomarcação
foi mais intensa nesse dia. Contudo, somente com um estudo mais aprofundado,
talvez utilizando técnicas de biologia molecular como PCR e Western blot
poderíamos confirmar essa suspeita.
Joseph et al. (2008) sugerem que o mecanismo inicial de dano neural da OXL
seria diretamente por estresse oxidativo, sendo inibido por substâncias antioxidantes
como vitamina C e L-carnitina. Nesse sentido procuramos também através de ensaio
imunohistoquímico investigar a expressão de nitrotirosina no tecido retirado das
patas dos camundongos tratados, visto que como citam Craig et al. (2003) e Roman,
Wendland e Polanczyk (2008) a expressão aumentada de resíduos de nitrotirosina
provavelmente reflete o estresse oxidativo aumentado devido à nitração de proteínas
causada pela presença de peroxinitrito ou a outra espécie nitrada relacionada. O que
encontramos foi um discreto aumento de nitrotirosina, principalmente na derme, no
intervalo do 7º ao 21º dia. Sozinho esse dado não nos permite concluir que o
estresse oxidativo seja um fator determinante da toxicidade periférica da OXL. Isso
merece uma investigação futura associada a outros métodos.
Enfim, o propósito do presente estudo, na verdade, foi o de desenvolver um
modelo experimental para estudar o efeito colateral mais importante da OXL em
camundongos. Com esse passo dado temos um longo caminho pela frente na
tentativa de explicar o fenômeno e desvendar o verdadeiro mecanismo dessa lesão.
Não sabemos ao certo se o inicio da lesão é periférico ou central e nem se a
liberação de substâncias na periferia seria uma das causas ou apenas consequência
da sensibilização central. Ainda é preciso investigar alterações a nível medular e
traçar paralelas com os eventos periféricos para entendermos a sequência da lesão.
A possibilidade de uso de animais nocautes nos anima a também testar esse
modelo em outras espécies de camundongos como o BLC57. O modelo ainda
oferece a possibilidade de testarmos novas opções terapêuticas e sugerir um
protocolo de tratamento.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em nosso estudo caracterizamos a neurotoxicidade induzida por OXL em
camundongos, especificamente com alodínia e hiperalgesia térmica e mecânica.
Ratificamos os achados da literatura, pois mostramos que a OXL foi capaz de
induzir NSP na fase crônica. Assim, conclui-se que:
• No teste de hiperalgesia mecânica plantar (Von Frey) a dose de melhor
resposta foi de 2mg/kg a partir do 14º dia de administração de OXL;
• O modelo permitiu estudar as respostas aos testes térmicos obtendo a melhor
dose de 1mg/kg nas temperaturas de 4,10 e 42ºC e de 4mg/kg na
temperatura de 46º C;
• Ao utilizar fármacos para tratar a dor neuropática a CBZ (30mg/kg), a OZB
(100mg/kg) e a GABAP (54mg/kg) obtiveram efeito analgésico em 105min.
• Ao teste mecânico do Rota Rod a CBZ (30mg/kg) produziu melhor resposta
em 5,5RPM.
• Existe a participação provável de SP, CGRP, NMDA periféricos e nitrotirosina;
Portanto, a OXL induz neuropatia periférica em camundongos, essa
neuropatia parece ser predominantemente sensitiva. Ao desenvolver esse modelo
experimental de hiperalgesia e alodínia térmica e mecânica foram obtidos como
resultados que a dose que produz melhor resposta à neuropatia periférica induzida
pelo agente antitumoral OXL foi a dose de 1mg/kg comprovado pelos testes térmicos
e o teste mecânico comprovou ausência de resposta mecânicas ratificando alteração
neuropática e que os sintomas sensitivos são inibidos por fármacos que
normalmente são usados na clínica de dor neuropática.
O uso de agentes neuromoduladores e neuroprotetores deve ser mais bem
explicado para prevenção da neurotoxicidade crônica com o objetivo da não
interrupção do tratamento com OXL. No curso temporal, foi observado em nosso
modelo, a neurotoxicidade periférica lembrando a toxicidade dos pacientes tratados
com OXL.
Os resultados obtidos depois dos diferentes experimentos realizados
indicaram que a neurotoxicidade da OXL depende primariamente da dose
acumulada e das administrações.
Esses resultados podem ser utilizados para estudos futuros com OXL e
sugerem que em um longo período a NSP ao ser instalada poderá ser tratada.
Finalmente, o uso de camundongos e do diferente método de administração da OXL
(EV) pode ser utilizado em modelos futuros viabilizando o uso do fármaco para
tratamento do câncer, principalmente o colorretal, com todo o esquema terapêutico
sem que a NSP interfira nas atividades do paciente tratado.
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