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LESLIE ECKER FERREIRA
DESENVOLVIMENTO DE UM PAINEL MOLECULAR PARA O
DIAGNÓSTICO DE MICRORGANISMOS ASSOCIADOS À SEPSE
Joinville
2010
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DESENVOLVIMENTO DE UM PAINEL MOLECULAR PARA O
DIAGNÓSTICO DE MICRORGANISMOS ASSOCIADOS À SEPSE
Dissertação apresentada como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre no Programa
de Pós Graduação Mestrado em Saúde e Meio
Ambiente da Universidade da Região de Joinville.
Orientador: Dr. Mauro de Souza Leite Pinho
Co-Orientador: Dr. Paulo Henrique Condeixa de França
Joinville
2010
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"Um galo sozinho não tece a manhã:
ele precisará sempre de outros galos.
De um que apanhe esse grito que ele
e o lance a outro: de um outro galo
que apanhe o grito que um galo antes
e o lance a outro e de outros galos
que com muitos outros galos se cruzam
os fios de sol de seus gritos de galo
para que a manhã, desde uma tela tênue,
se vá tecendo, entre todos os galos.
E se encorpando em tela, entre todos,
se erguendo tenda, onde entrem todos,
no toldo (a manhã) que plana livre de
armação.
A manhã, toldo de um tecido tão aéreo
que, tecido, se eleva por si: luz balão".
(Tecendo a Manhã - João Cabral de Melo Neto)
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Agradeço em primeiro lugar ao Prof. Dr. Mauro de Souza Leite Pinho, por ter
aceitado a orientação, pelo voto de confiança e pelo constante
acompanhamento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Paulo Henrique Condeixa de França, pela co-orientação e sua
dedicação desde o início, pelas discussões técnicas sobre os rumos do projeto
e pela amizade.
Ao Prof. Dr. Anderson Ricardo Roman Gonçalves que foi sem dúvida o grande
mentor do projeto SEPSE e pelas suas sugestões e críticas em todas as
etapas deste trabalho.
A Profa. Dra. Andréa de Lima dos Santos Schneider, chefe da área de
pesquisa, pela compreensão da minha ausência como funcionária durante a
realização das disciplinas do Programa e pela sua valiosa amizade.
A técnica do Laboratório de Microbiologia e grande amiga Andréa Luciane
Soares pela imensa ajuda no preparo e meios de cultura.
As Professoras de microbiologia Neide e Carmem pelo apoio dado nas
dificuldades no campo da microbiologia.
Ao Programa de Mestrado em Saúde e Meio Ambiente, Profa. Dra. Cladir
Zanotelli, Débora e Maria Patrícia por todo o auxílio nas etapas burocráticas.
As meninas dos Laboratórios Andrea, Michele, Millena, Gianinni e Beatriz, por
sempre estarem de braços abertos ajudando em todos os momentos.
Aos bolsistas, estagiários e alunos IC que passaram pelo Laboratório nesse
período: Karilene, Roseane, Talitha, Emanuelle, Bruna, Ana Beatriz, Rodrigo e
Roger.
Aos colegas de mestrado por tornarem as aulas intermináveis divertidas.
A minha família pelo amor e dedicação.
Aos meus amigos que entenderam minha ausência e pelo sorriso no rosto
quando eu estava presente: Débora, Vanessa, Lúcia, Fernanda, Daniela,
Thiago, Léo (o Acre existe!), Simone e Angela.
A FAPESC e a FAP UNIVILLE, pelo apoio financeiro sem o qual jamais esse
estudo seria possível.
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS ......................................................................................... 7
RESUMO ..................................................................................................................................... 9
ABSTRACT .............................................................................................................................. 10
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 11
1. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 14
1.1. Diagnóstico molecular de microrganismos ................................................................... 14
1.1.1. Hemoculturas .................................................................................................................. 16
1.1.2. Reação em Cadeia pela Polimerase ............................................................................ 17
1.1.2.1. Componentes da PCR ................................................................................................ 19
1.1.2.2. Termociclagem da PCR ............................................................................................. 22
1.1.2.3. Desenho de oligonucleotídeos................................................................................. 24
1.1.3. Programas computacionais para planejamento de iniciadores ............................. 26
1.1.4. A PCR no diagnóstico clínico ....................................................................................... 26
1.1.5. Diagnóstico através de sistema Multiplex-PCR ........................................................ 34
1.2. Sepse ..................................................................................................................................... 37
1.2.1. Definição ........................................................................................................................... 37
1.2.2. Epidemiologia .................................................................................................................. 38
1.2.3. Fisiopatologia da Sepse ................................................................................................ 40
1.2.4. Microrganismos associados à sepse .......................................................................... 42
1.2.5. Identificação de microrganismos relacionados à sepse ......................................... 46
2. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 47
2.1. Planejamento de oligonucleotídeos ................................................................................ 47
2.2. Genes Alvo ........................................................................................................................... 47
2.3. Sequências Consenso ....................................................................................................... 48
2.4. Microrganismos em estudo............................................................................................... 49
2.6. Extração de DNA Microbiano ............................................................................................ 51
2.7. Determinação de concentração dos DNA extraídos ..................................................... 51
2.8. Eletroforese .......................................................................................................................... 52
2.9. PCR ........................................................................................................................................ 52
2.10. Resolução do Produto de PCR ..................................................................................... 53
2.11. Testes de Especificidade ............................................................................................... 53
2.12. Limite de Detecção de DNA .......................................................................................... 54
3. DISCUSSÃO E RESULTADOS ...................................................................................... 55
4. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 79
5. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 80
ANEXOS ................................................................................................................................... 89
ANEXO I- PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA MICROBIANO USANDO O KIT
QIAMP- QUIAGEN ................................................................................................................. 90
ANEXO II- CONFIRMAÇÃO DE SUBMISSÃO DO ARTIGO .......................................... 96
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Figura 1 - Amplificação por PCR.......................................................................16
Figura 2 - Incidência e Mortalidade na Sepse, Sepse Grave e
Choque Séptico................................................................................36
Tabela 1 - Número de Moléculas de DNA produzidas por número de ciclos
da PCR............................................................................................24
Tabela 2 - Diagnósticos moleculares para patógenos aprovados
pelo FDA..........................................................................................26
Tabela 3 - Estudos de diagnósticos microbianos por PCR...............................28
Tabela 4 - Sequências nucleotídicas utilizadas para determinação de
sequências consenso......................................................................46
Tabela 5 - Cepas utilizadas para a padronização do PCR...............................47
LISTA DE ABREVIATURAS
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp pares de bases
C Citosina
CFU Unidade formadora de colônia
dATP Deoxiadenosina trifosfatado
dCTP Deoxicitosina trifosfatado
dGTP Deoxiguanina trifosfatado
DNA Ácido Desoxirribonucléico
dNTP’s Desoxirribonucletídeos trifosfatados
dtTP Deoxitmina trifosfatado
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
G Guanina
LCR “Ligase Chain Reaction
NASBA Nucleic Acid Strand-Based Amplification
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PO
4
3-
Fosfato
Q-Beta Amplificação baseada na enzima Q-Beta replicase
RFLP Restriction File Lenght Polymorphism
RNA Ácido Ribonucléico
rpm rotações por minuto
rRNA Ácido Ribonucléico ribossomal
S Unidade de sendimentação ribossomal
SDR Strand Displacement Reaction
T Timina
TA- Temperatura de annealing
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris/Borato/EDTA
TE Tris EDTA
TM Temperatura de fusão (melting)
TMA Transcription- Mediated Amplification
TRIS Triethylammonium
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Sepse é uma infecção generalizada associada à elevada mortalidade em
ambientes hospitalares. São conhecidos alguns dos fatores responsáveis,
como o diagnóstico tardio e a terapia imprecisa à base de antibióticos. Testes
moleculares baseados na técnica PCR (Polymerase Chain Reaction)
apresentam resultados mais rápidos e precisos possibilitando uma terapêutica
com maiores chances de sucesso. OBJETIVO DO ESTUDO: Desenvolver e
padronizar um painel de iniciadores visando à amplificação em parâmetros
únicos de reação de segmentos específicos de DNA de microrganismos
associados com a sepse, permitindo um diagnóstico rápido. MÉTODOS: Cinco
pares de iniciadores para a amplificação de sequências codificantes dos
microrganismos Enterobacter spp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus e Candida spp., foram desenvolvidos e testados quanto
ao limite de detecção e à especificidade por amplificação do fragmento gênico
correspondente as cepas padrão dos microrganismos em estudo.
RESULTADOS: Foram obtidas amplificações empregando as mesmas
condições de reação e termociclagem para os microrganismos: Enterobacter
spp. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida spp. Os
iniciadores desenvolvidos para Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus e Candida spp apresentaram especificidade, entretanto não foi possível
diferenciar entre os microrganismos Enterobacter spp. e Escherichia coli, então
adicionalmente foram planejados iniciadores específicos para Escherichia coli
para o diagnóstico discriminatório entre os microrganismos, quando necessário.
Quanto ao limite de detecção o sistema desenvolvido foi capaz de amplificar
quantidades de 5ng a 500fg de DNA por reação a partir de amostras de sangue
contaminadas propositadamente com as espécies microbianas, confirmando a
possibilidade de aplicação em amostras clínicas. O painel molecular proposto
oferece como vantagem adicional ser um sistema “aberto” quando comparado
com outros métodos como Multiplex PCR e, permitir um diagnóstico rápido.
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Sepsis is a systemic infection related to high mortality rates in hospital
environment. Delayed diagnosis and inadequate antimicrobial therapy are
associated to treatment failures. Microbiological molecular diagnosis based on
PCR (Polymerase Chain Reaction) is regarded as faster and more accurated
procedures, providing higher successful therapeutical rates. AIM OF THE
STUDY: To develop and standardize a panel of primers to PCR amplification of
specific DNA segments of sepsis-related microorganisms according an unique
protocol for a faster diagnosis. METHODS: Five pairs of primers for
amplification of coding sequences of Enterobacter spp., Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida spp., were
designed and tested for sensitivity and specificity for respective standard
microorganism control strains. RESULTS: Amplification using the same
condition for reaction and thermocycling were achieved for Enterobacter spp.,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Candida spp. Good
specificity was obtained by Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
and Candida spp primers, but it was not possible to discriminate among
Enterobacter spp and Escherichia coli, so that an additional pair of primers for
the last microorganism was developed for differential diagnosis when required.
Sensitivity tests showed a threshold for detection from 5 ng to 500 fg DNA
contaminated blood samples, suggesting a relevant potential use in clinical
settings. This molecular panel offers an additional advantage of an „open‟
system when compared to other multiplex detection methods with no delay in
diagnostic time.
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A sepse é a principal causa de óbito em Unidades de Terapia Intensiva
(UTI) (HOTCHKISS e KARL, 2003). O diagnóstico clínico da sepse baseia-se
em critérios amplamente conhecidos. Quando a etiologia é bacteriana, a forma
mais comum, o diagnóstico confirmatório depende de exames microbiológicos
baseados em técnicas de hemoculturas que demoram usualmente de 24 a 72
horas para oferecer resultados confiáveis. A recomendação atual, todavia,
prevê o início de antibioticoterapia de amplo espectro na primeira hora após o
diagnóstico clínico da sepse (DELLINGER et al.,2004). Assim, na grande
maioria das vezes, a terapêutica antibiótica é iniciada de forma empírica,
baseada em critérios clínicos e no conhecimento sobre a microbiota local mais
frequente. Além disso, um percentual razoável de exames microbianos é
negativo, apesar do evidente foco infeccioso em curso. A terapêutica empírica
leva ao uso indiscriminado de antibióticos, o que pode induzir à resistência
bacteriana, efeitos deletérios atribuídos à toxicidade dos mesmos, elevação de
custos do tratamento e aumento da mortalidade, especialmente em pacientes
em condição crítica (KOLLEF et al.,1999). Assim, configura-se a necessidade
de ferramentas laboratoriais que agilizem o diagnóstico etiológico da sepse,
permitindo a implementação de condutas terapêuticas seguras e adequadas
para cada caso.
O uso de exames baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
permite o diagnóstico etiológico de diferentes infecções: bacterianas, virais,
fúngicas, por protozoários, mas é pouco difundido como ferramenta diagnóstica
na sepse. A detecção através da amplificação de uma região comum do
genoma de todas as bactérias pode auxiliar o diagnóstico da sepse quando
existe dúvida etiológica, bem como ampliar o leque de possibilidades
etiológicas, hoje baseadas apenas no raciocínio clínico (CURSONS et
al.,1999). As regiões do genoma bacteriano codificantes para as frações 16S e
23S do RNA ribossomal são altamente conservadas e ubíqüas, ou seja,
encontradas no genoma de bactérias. A utilização de iniciadores específicos
para esta região do genoma bacteriano permite a identificação de bacteremias
e, dependendo do planejamento da seqüência nucleotídica dos iniciadores, a
distinção entre microrganimos Gram-positivos e Gram-negativos.
Adicionalmente, a investigação de regiões genômicas específicas viabiliza o
planejamento e a utilização de iniciadores com capacidade discriminatória entre
espécies, permitindo a identificação de microrganismos frequentemente
encontrados em associação com a sepse, a saber: Pseudomonas aeruginosa,
Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e
Staphylococcus aureus (RANTAKOKKO-JALAVA et al., 2000). Além disso, a
identificação de fungos do gênero Candida pode auxiliar quanto ao diagnóstico
diferencial das sepses graves de etiologia fúngica.
Apesar destas perspectivas de vantagens, o emprego rotineiro da PCR e
derivações para o diagnóstico de infecções em humanos no Brasil é ainda
bastante incipiente (PEREIRA et al., 2004).
Objetivos
Objetivo Geral
Desenvolvimento de um método para o diagnóstico molecular de
principais agentes microbianos correlacionados com a sepse, baseado na
técnica de Reação em Cadeia pela Polimerase.
Objetivos específicos
a) Desenvolvimento de iniciadores de amplificação capazes de detectar os
microrganismos relacionados com sepse através de PCR em condições
únicas de termociclagem;
b) Padronização de reações de PCR em parâmetros únicos de
termociclagem para a detecção de microrganismos relacionados com
sepse;
c) Verificar o limite de detecção do método de PCR desenvolvido;
d) Verificar a especificidade do método de PCR desenvolvido.
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1.1. Diagnóstico molecular de microrganismos
“O desenvolvimento da reação em cadeia da
polimerase (PCR) tem sido frequentemente
comparado ao desenvolvimento da Internet e, embora
este impacto não seja o mesmo fora da comunidade
científica, a comparação funciona bem em outros
níveis. Ambas as invenções têm surgido nos últimos
20 anos, e atualmente é difícil imaginar a vida sem
eles. Ambos têm crescido muito além dos limites de
sua idéia original, criaram oportunidades inimagináveis
antes da sua invenção. Ambos também geraram um
novo vocabulário e profissionais alfabetizados nesse
vocabulário”. J. M. S. Bartlett
Atualmente, há uma variedade de métodos e critérios usados para a
identificação de microrganismos. De modo geral, esses métodos podem ser
separados em duas categorias: métodos fenotípicos e métodos
genotípicos.
Dentro dessa divisão os métodos fenotípicos são descritos por
características observacionais macroscópicas de morfologia como tamanho,
textura e pigmentação das colônias microbianas. Também dentro dessa
classificação estão às morfologias microscópicas como tamanho, forma,
invaginações intracelulares, particularidades das células e disposição das
células quando observadas ao microscópio. As características de coloração,
outro método fenotípico, incluem a habilidade de um determinado
microrganismo expressar uma coloração típica frente a corantes e reagentes,
como no caso da coloração de Gram. As condições ambientais explicitam
outras formas de identificações fenotípicas e estão relacionadas às condições
necessárias de crescimento de cada microrganismo como: temperatura,
presença de oxigênio ou outros gases, condições de pH, ou ainda a presença
de íons ou sais como o cloreto de sódio. Condições nutricionais enfocam a
habilidade dos microrganismos utilizarem várias fontes de carbono e nitrogênio
como substratos nutricionais ou ainda quando se desenvolvem em específicas
condições. E por fim, dentre os métodos fenotípicos estão métodos
bioquímicos como perfis de resistências frente a específicos antibióticos,
propriedades antigênicas e propriedades subcelulares. (WEISSFELD, 1998).
Métodos genotípicos estão baseados nas características genômicas
microbianas e são úteis para identificar microrganismos de forma
complementar ou alternativa aos métodos fenotípicos, sendo aparentemente
mais sensíveis e específicos no processo de detecção, reduzindo em muito a
interpretação subjetiva inerente nos dados morfológicos e biológicos (TANG,
1997). A maioria dos métodos moleculares demanda reagentes e
equipamentos custosos, mas são relativamente fáceis de implementar, sendo
aplicáveis às mais variadas espécies (SINGH et.al., 2006). Entre as diferentes
ferramentas moleculares estão: captura híbrida, RFLP, PCR e suas variantes e
ainda o sequenciamento direto.
1.1.1. Hemoculturas
Os métodos para detecção da presença de bacteremia são
fundamentados no cultivo de sangue em meios de cultura propícios para o
crescimento microbiano. Esses métodos são conhecidos como hemoculturas.
Existem diversos sistemas comerciais para a realização de hemoculturas
manuais e automatizadas, sendo a grande maioria baseada em características
do crescimento microbiano associado ao comportamento desses no meio de
cultura, seja por hemólise, turbidez, produção de gás, “chocolatização” do
sangue e a presença de colônias visíveis (REIMER, 1997).
Os métodos para a realização de hemocultura podem ser tanto
convencionais quanto automatizados. Os automatizados apresentam como
vantagens o menor tempo para detecção dos patógenos e a monitorização
contínua do crescimento microbiano (KARAHAN et al., 2006).
Os principais sistemas de hemocultura automatizados, semi-
automatizados e com monitoração contínua utilizados hoje, descritos por
Koneman (2008), são:
BacT/ALERT
®
AS BIOMÉRIEUX (Organon Teknika, Scarborough,
Canadá);
A geração 9000 do BD BACTEC™ (Becton & Dickinson, NJ USA);
DIFCO ESP® (Difco Laboratories, Detroit, EUA);
MicroScan Blood Culture System 5
®
(Baxter MicroScan, Califórnia, EUA);
BioMerieux Vital (Biomerieux Vitek, Hazelwood MO);
OASIS Blood Culture System
®
(Unipath Ltd., Basisngstoke, United
Kingdom);
OXOID SIGNAL SYSTEM
®
(Oxoid USA, INC., Columbia MD);
SEPTIC-CHEK
®
(Roche Diagnostic Systems, Nutley NJ).
A detecção do crescimento de microrganismos varia entre os diferentes
sistemas, porém, em todos eles, a detecção do crescimento bacteriano não
exige manipulação direta, o que diminui a chance dos resultados falso-
positivos. A monitoração é contínua, reduzindo o tempo de detecção do
crescimento de microrganismos (KARAHAN et al., 2006).
Em resumo, os sistemas de hemocultura automatizados utilizam sensor
colorimétrico e reflexão da luz para monitorar a presença e produção de dióxido
de carbono dissolvido no meio de cultura. Existindo microrganismos na amostra
testada, estes metabolizarão os substratos contidos no meio de cultura. O
crescimento de microrganismos produz o dióxido de carbono, levando o sensor
permeável a gases existente no fundo do frasco a alterar sua cor, indicando a
presença de microrganismos na amostra sanguínea (KARAHAN et al., 2006;
NOLTE et al., 1993).
1.1.2. Reação em Cadeia pela Polimerase
Dentre as diversas técnicas de biologia molecular desenvolvidas após
a caracterização da molécula de DNA em 1953 por Francis e Crick destaca-se
a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR). Proposta primeiramente por
Ghobind Khorana e seus colegas como uma estratégia para desvendar o
mecanismo envolvido na síntese química de genes, somente quinze anos mais
tarde o método foi utilizado na prática através da amplificação de DNA de
células mamíferas e com o uso da DNA polimerase I isolada do microrganismo
Escherichia coli. O aperfeiçoamento da técnica se deu com a substituição da
enzima DNA polimerase I por uma enzima termoestável isolada do
microrganismo Thermus aquaticus, possibilitando que o método da PCR
pudesse ser utilizado rotineiramente nos laboratórios de biologia molecular
(SAIKI et. al., 1985; MULLIS e FALONNA, 1987).
Basicamente a técnica da PCR consiste de uma reação bioquímica in
vitro que permite a síntese de grandes quantidades de uma sequência de
ácidos nucléicos pré-determinada. O procedimento requer o DNA do organismo
a ser tipado (“template”), dois pares de oligonucleotídeos que são desenhados
para delimitar a região da sequência nucleotídica do DNA a ser amplificada, a
enzima DNA polimerase termoestável e seu co-fator enzimático (Cloreto de
Magnésio) e a presença de nucleotídeos para incorporarem o DNA sintetizado
(SINGH, et.al., 2006).
Em seguida, o DNA é amplificado em um termociclador por repetições de
três principais passos:
Desnaturação das fitas do DNA molde;
Anelamento (annealing) de oligonucleotídeos nas regiões
complementares do DNA molde;
Extensão dos oligonucleotídeos pela DNA polimerase para gerar uma
cópia da região genômica determinada (YANG; ROTHMAN, 2004) (Fig.
1).
Entretanto, para que isto ocorra é necessário o conhecimento prévio de
parte da sequência do respectivo DNA bacteriano, uma vez que, a primeira
etapa para a realização da PCR é a construção de um par de oligonucleotídeos
que definem o segmento de DNA de interesse, pois esse irá determinar a
região genômica e poderá diferenciar as espécies em estudo.
Figura 1– Amplificação por PCR (ALBERTS et. al.,1999).
1.1.2.1. Componentes da PCR
A PCR é formada essencialmente de sete componentes:
a. DNA Polimerase Termoestável: Usada na catálise da síntese do DNA
que irá ser amplificado. Atualmente dispomos de uma vasta diversidade de
enzimas variando a taxa de fidelidade, eficiência e habilidade para sintetizar
longos fragmentos de DNA. Reações de PCR padronizadas contém de 2X10
12
a 10X10
12
moléculas da enzima (SAMBROOK et al.,1989).
b. Oligonucleotideos
Dos muitos fatores que influenciam a eficiência e a especificidade da
reação de amplificação, o desenho dos pares de oligonucleotideos é
determinante para garantir o sucesso ou a falha dos protocolos de PCR. Uma
vez planejados os oligonucleotídeos de interesse, esses são encaminhados
para a síntese comercial e purificação por cromatografia (SAMBROOK et
al.,1989).
c. Deoxinucleotideos (dNTPs)
Usualmente a reação da PCR é estabelecida com uma concentração
equimolar dos deoxinucleotídeos (dATP, dTTP,dCTP,dGTP) variando entre 200
a 250μM. Em altas concentrações (maior que 4mM) são inibitórios pois,
sequestram os íons de magnésio (SAMBROOK et al.,1989).
d. Cátions Divalentes:
Todas as DNAs polimerases termoestáveis requerem um cátion
divalente livre, como o Mg
2
, para sua atividade enzimática. A concentração de
magnésio usado na reação deve exceder a concentração dos grupos fosfatos
contidos nos dNTPs e oligonucleotídeos, pois esses podem se ligar ao íon,
desfavorecendo a ligação com a enzima DNA polimerase. Dessa maneira, a
concentração do íon é determinada especificamente pela composição de
oligonucleotídeos e dNTPs usados em cada reação, não sendo estabelecido
uma reação padrão. A faixa de concentração pode variar entre 0,5 a 5mM e,
pode ser determinada por comparação de rendimento de amplificação em série
nessas concentrações. A presença em excesso de agentes quelantes, como
EDTA ou íons carregados negativamente, como PO
4
3-
, influenciam a ligação do
co-fator com a enzima por, também, possuírem afinidade com a carga elétrica
do íon (SAMBROOK et al.,1989). A reação de PCR é afetada diferentemente
em altas e baixas concentrações do íon Mg
2+
. Altas concentrações estabilizam
a dupla-fita de DNA evitando a desnaturação completa, a cada ciclo, do
produto amplificado, reduzindo o rendimento de amplificação. O excesso
estabiliza também, regiões incorretas nas quais, os oligonucleotídeos podem
se hibridizar, resultando em grandes quantidades de produtos de baixa
especificidade. Por outro lado, baixas concentrações de Mg
2+
não promovem a
reação de extensão pela polimerase.
e. Tampão : Como tampão enzimático na PCR é utlizado o TRIS-HCl, com
pH ajustado entre 8,3 a 8,8 em temperatura ambiente e, é adicionado a reação
em uma concentração de 10mM. Quando incubado a 72°C, o pH na reação é
decrescido em uma unidade, chegando ao pH ideal para a atividade
enzimática. (SAMBROOK et al.,1989).
f. Cátion Monovalente: Adicionado diretamente ao tampão da reação, o
cloreto de potássio é empregado em uma concentração de 70 a 100mM.
(SAMBROOK et al.,1989).
g. DNA Template: Contém a sequência gênica a ser amplificada e pode ser
adicionada a PCR na forma de fita simples ou fita dupla. Para a amplificação de
DNA genômico de mamíferos geralmente é empregado acima de um
micrograma de DNA por reação, que contém aproximadamente 3X10
5
cópias
de um alelo de um gene autossômico (SAMBROOK et al.,1989).
1.1.2.2. Termociclagem da PCR
A PCR é uma reação interativa, composta de três fases: desnaturação
da fita de ácido nucléico por calor, anelamento dos oligonucleotídeos com a
sequência de interesse e, extensão dos oligonucleotídeos pela DNA
polimerase. Cada uma destas etapas apresenta características próprias
referentes à:
a. Temperatura
Desnaturação: A temperatura requerida para a desnaturação de DNA dupla
fita é determinada em parte pela quantidade de guanina e citosina presente na
molécula, sendo que quanto maior a proporção G+C maior será o tempo
empregado e maior será a temperatura necessária para separar as fitas do
DNA completamente (SAMBROOK et al.,1989). Adeninas e timinas são ligadas
por ligações duplas de hidrogênio enquanto que citosinas e guaninas
estabelecem ligações triplas, dessa forma estruturas entre G e C são ligadas
mais fortemente e, portanto irão demandar temperaturas mais altas para
dissociarem.
Anelamento de oligonucleotídeos e DNA: A temperatura de anelamento (TA)
é essencialmente determinada pela composição dos oligonucleotídeos, sendo
calculada através do decréscimo de 3 a 5°C da temperatura de fusão (TM) na
qual os pares de oligonucleotídeos se dissociam dos seus templates. Baixas
temperaturas favorecem o aparecimento de bandas inespecíficas e
temperaturas muito altas proporcionam baixo rendimento de produtos
amplificados. Para oligonucleotídeos compostos por até vinte nucleotídeos em
solventes iônicos, a TM, pode ser calculada pela “regra de Wallace” (Suggs et
al. 1981; Thein e Walace, 1986):
T
a
= 4(G+C) + 2(A+T),
Onde A,T,C e G, são as quantidades dos respectivos resíduos dos
oligonucleotídeos em números.
Entretanto, na prática a melhor forma de padronizar a TA é o uso de
termociclagem em escala de gradiente de 2 a 10°C próximas a TM dos dois
pares de oligonucleotídeos (SAMBROOK et al.,1989).
Extensão dos Oligonucleotídeos: A temperatura de extensão equivale a uma
temperatura muito próxima a temperatura ótima requerida para a síntese
catalítica do DNA pela DNA polimerase. No caso, da Taq DNA polimerase essa
temperatura varia entre 72 a 78°C. Nos primeiros dois ciclos, a extensão de um
oligonucleotídeo continua até a sequência complementar encontrar o local do
outro oligonucleotídeo. No próximo ciclo, as primeiras moléculas são
produzidas com o tamanho molecular previsto pela delimitação dos
oligonucleotídeos. Do terceiro ciclo em diante, essa molécula é amplificada
geometricamente e os produtos de amplificação são acumulados de forma
aritmética. A taxa de polimerização dessa enzima é aproximadamente dois mil
nucleotídeos por minuto para cada 1000bp do produto amplificado
(SAMBROOK et al.,1989).
b. Número de ciclos
O número de ciclos demandados para a amplificação depende do número
de cópias de DNA template presente no início da reação e a eficiência da
extensão e a amplificação dos oligonucleotídeos. Uma vez estabelecida a fase
geométrica da amplificação, a reação prossegue até um de seus componentes
serem limitados. Rotineiramente são empregados de 30 a 40 ciclos em uma
reação da PCR (SAMBROOK et al.,1989).
c. Inibidores da PCR
Os principais inibidores da PCR se baseiam no excesso de resíduos da
extração e purificação do DNA utilizado como template como, fenóis, EDTA,
detergentes iônicos e proteinase K. Outros inibidores incluem a heparina e sais
não eliminados durante o processo de extração (SAMBROOK et al.,1989).
Entre os principais problemas durante a otimização de PCR encontram-se:
bandas inespecíficas, baixo rendimento de amplificação, inexistência do
produto amplificado, amplificação dos controles negativos e a formação de
dímeros de oligonucleotídeos.
1.1.2.3. Desenho de oligonucleotídeos
A eficiência de uma reação de PCR está diretamente ligada à
especificidade dos oligonucleotídeos, também denominados como iniciadores
ou primers. As condições termodinâmicas que serão estabelecidas durante a
reação dependem diretamente do planejamento dos oligonucleotídeos. A
eficiência destes iniciadores está diretamente relacionada a algumas
propriedades (SAMBROOK et al.,1989; HYNDMAN & MITSUHASSHI, 2003) a
saber:
Tamanho do produto amplificado: Em geral, planeja-se amplicons que
possuam tamanho variando entre 100 a 1000 pares de base. O limite inferior é
determinado pela capacidade de resolução dos géis de agarose empregados
para a visualização do produto amplificado. Já o limite superior é apontado
pelas dificuldades de se amplificar grandes sequências de DNA.
Composição de bases: O conteúdo de G+C deve estar entre 40 a 60%
garantindo uma equiparidade de distribuição de todos os nucleotídeos.
Comprimento: A região de complementaridade entre os oligonucleotídeos e o
DNA template devem variar entre 18 a 25 nucleotídeos. E entre os pares não
devem diferir mais do que três pares de base.
Sequências repetitivas e autocomplementares: Sequências com essas
características tendem a formar estruturas moleculares denominadas hairpins,
que possuem esse nome por apresentarem a estrutura de um grampo de
cabelo e são formados pela autocomplementaridade de uma extremidade de
uma fita simples de DNA a outra porção dessa mesma fita. A formação de
haipins resulta na baixa eficiência da reação uma vez que a concentração de
primers disponíveis será afetada.
Complementaridade entre os oligonucleotídeos: A sequência terminal 3‟ de
um oligonucleotídeo não pode apresentar a habilidade para se ligar em
qualquer sítio do outro oligonucleotídeo. Isto se deve ao fato de que os
oligonucleotídeos, estão em alta concentração na reação de PCR, qualquer
complementaridade pode ser formada e, a síntese conseqüente resultará em
dímeros. Se dímeros são formados no início da amplificação podem se ligar
aos outros componentes da reação e suprimir a amplificação correta.
Temperaturas de Fusão: O valor da temperatura de fusão entre os
oligonucleotídeos não deve diferir por mais de 5°C.
Porção terminal 3’: A natureza da porção terminal 3‟ do oligonucleotídeo é
crucial para a hibridização dos iniciadores. Preferencialmente, é recomendável,
que a última base dessa região seja G ou C, mas, no entanto não poderá ser
GC OU CG devido o valor alto de ∆G favorecer estruturas haipins e dímeros.
1.1.3. Programas computacionais para planejamento de iniciadores
Atualmente é disponibilizada uma grande variedade de programas
computacionais que predizem oligonucleotídeos baseados na sequência de
interesse, tamanho do produto gerado, faixa de TM, composição G+C, entre
outros fatores que influenciam a reação. Dentre os mais populares softwares
de análise de primers pode-se citar: Fast PCR (KALENDAR; LEE &
SCHULMAN, 2009), Oligo (http://www.oligo.net/index.html), Primer 3 (ROZEN;
SKALETSKY, 2000), Visual OMP (SANTALUCIA, 2007) e Vector (Invitrogen
Corp.São Paulo, Brasil).
1.1.4. A PCR no diagnóstico clínico
Técnicas moleculares como PCR são métodos importantes para detectar
agentes etiológicos de infecção, pois não requerem o cultivo do microrganismo
causal, dependendo apenas da habilidade para detectar a assinatura genômica
do microrganismo. Além disso, possuem uma maior sensibilidade quando
comparados a ensaios imunológicos e métodos de coloração (KLAUSEGGER,
1999). A PCR pode amplificar quantidades diminutas de DNA (10 a 100 cópias
em amostras clínicas) em poucas horas (CUCHACOVICH, 2006) de forma
exponencial como demonstrado na Tabela 1.
Tabela 1 – Número de Moléculas de DNA produzidas por número de ciclos da PCR
Número de Ciclos
da PCR
Numero de
Moléculas de DNA
(2
n
)
0
1
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
7
128
8
256
9
512
10
1024
20
1.048.576
30
1.073.741.824
A PCR e suas técnicas variantes têm simplificado e acelerado o processo in
vitro de amplificação de ácidos nucléicos. Os produtos amplificados,
conhecidos como amplicons, podem ser identificados e analisados por vários
métodos, incluindo hibridização, análise de fragmentos após digestão com
endonucleases de restrição ou ainda a análise direta por sequenciamento,
essas técnicas ampliam significativamente o arsenal de diagnóstico
microbiológico (TANG, 1997).
A partir de 1990 foram desenvolvidos múltiplos protocolos que permitem
identificar de forma específica e rápida bactérias que até então eram
consideradas de difícil diagnóstico, como Mycobacterium spp, Chlamydia spp,
(YAMAMOTO, 2002; YANG; ROTHMAN, 2004). Da mesma forma outros
protocolos desenvolvidos auxiliaram na detecção de genes com relevância
clínica codificantes à resistência a antibióticos e, portanto, maior virulência nos
hospedeiros (BLUM-OEHLER, 2002), (SU, 2002).
A técnica de PCR vem sendo lentamente incorporada à clínica através de
kits comerciais, sobretudo para o diagnóstico de alguns vírus e organismos de
difícil cultivo, como microrganismos anaeróbicos. Pfaller (2001) listou os testes
de diagnóstico moleculares aprovados pelo Food and Drug Administration
(FDA), (Tabela 2).
Tabela 2- Diagnósticos Moleculares para patógenos aprovados pelo
Food and Drug Administration (FDA).
PCR: Reação em Cadeia pela Polimerase; LCR Reação em Cadeia pela Ligase;
SDR:Strand Displacement Reaction; TMA: Transcription- Mediated Amplification; NASBA:
Nucleic Acid Strand-Based Amplification.
Fonte:PFALLER (2001)
Entretanto, a variedade de uso da PCR no diagnóstico clínico é mais
ampla, tanto para diagnóstico de bactérias quanto para fungos e, diversos
estudos foram impulsionados em meados da década de 90 nesse sentido
(Tabela 3).
O uso de oligonucleotídeos universais tem sido bastante explorado para
a detecção de bacteremias, por serem capazes de detectar genes chamados
Teste
Laboratório
PCR
LCR
TMA
Captura Híbrida
Roche
Abbott
Gen-Probe
Digene
LCR
Captura Híbrida
Abbott
Digene
Hibridização
Gen-Probe
SDR
Becton-Dickinson
PCR
TMA
Roche
Gen-Probe
Captura Híbrida
Digene
Captura Híbrida NASBA
Digene
Organon Teknika
Hibridização
Gen-Probe
PCR
Roche
Hibridização
Becton-Dickinson
Hibridização
Gen-Probe
de relógios moleculares, altamente conservados entre espécies e
consequentemente possuírem baixa taxa de mutação, como o gene 16S rRNA
(WOESE, 1987).
Xu et al. (2005), descreveram métodos moleculares para a detecção de
Neisseria meningitidis, agente causal da meningite meningocócica. Os autores
compararam dois métodos moleculares baseados em amplificações de
oligonucleotídeos universais para o patógeno concluindo que os métodos
moleculares são uma ferramenta valiosa para identificação de patógenos,
principalmente aqueles de difícil cultivo e, que os métodos moleculares,
economicamente possuem um custo efetivo menor que métodos
convencionais, considerando o tempo de internação dos pacientes e a
antibioticoterapia empírica.
Tabela 3 – Estudos de diagnósticos microbianos por PCR.
Agente
Método de
Amplificação
Aplicação
Referência
Aureobacterium spp.
PCR
Identificação de isolados clinícos
SAWELJEW P., 1996
Bortella pertussis
PCR
NESTED-PCR
Detecção
BUCK G.E.,1996
REIZENSTEIN E.,1996
Borrelia burgdorferi
NESTED-PCR
Detecção antes, durante e após a terapia
SCHMIDT B., et al., 1996
Brucella spp.
PCR
Detecção e Identificação
MATAR G.M.,KNEISSER I.A. & ABDELNOR,
1996
Burklolderiapseudomallei
PCR
Detecção e Identificação
DHARAKUL T., et al., 1996
Campylobacter spp.
PCR
Identficação por análise do 16S rRNA
CARDARELLA-LEITE P., et al., 1996
CDC grupo IV-c-2
PCR
Tipagem de isolados
MOISSENET D., et al., 1996
Chlamydia trachomatis
PCR, AMPLICOR
PCR
Diagnóstico de Pacientes assintomáticos
Avaliação do Kit Diagnóstico
TOYE B., et al., 1996
PASTERNAK R., et al., 1996
QUINN TC. et al., 1996
Staphylococcus coagulase-
negativa
Multiplex-PCR
Detecção de resistência a metilcilina
VANDENBROUCKE-GRAULS
CMJE.&KUSTERS J.G.,1996
YORK MA., et al., 1996
Corynebacterium diphteriae
PCR
Detecção de toxicidade de linhagens
MIKHAILOVICH VM., et al., 1995
Escherichia coli OH157:H7
Multiplex-PCR
Detecção de toxicidade de linhagens
FRATAMICO PM., et al., 1995
Haemophilus ducreyi
Multiplex- PCR
Detecção direta em espécimes de úlceras
genitais
ORLE KA., et al., 1996
Helicobacter pylori
PCR
Detecção do microrganismo em biópsia
gástrica
LAGE AP., et al., 1996
Legionella pneumophila
PCR
Tipagem molecular de linhagens
GRATTARD F., et al., 1996
Leptospira interogans
PCR
Identificação
ZUERNER RL., ALT D., BOLIN CA, 1995
SDR: “Strand Displacement Reaction”; Q-beta: Amplificação baseada na enzima Q-beta Replicase; LCR: “Ligase Chain Reaction”.
Fonte: ( KONEMAN .et. al, 2008).
Mycobacterium avlium
(Complexo)
PCR
Diferenciação de species
CHEN Z-H, et al., 1996
Mycobacterium tuberculosi
PCR
AMPLICOR PCR,
SDR
PCR
Q-beta
Diagnóstico de Tuberculose Pulmonar
Avaliação do Kit Comercial
Detecção no trato respiratório
Diagnóstico de micobacteremia
Detecção em espécimes clinicas
BENNEDSEN J., et al., 1996 ;
HERRERA EA. & SEGOVIA M.,1996
BERGMANN JS. &WOODS JL., 1996-
CARPENTIER E., et al., 1996- DEVALLOIS A.,
LEGRAND E. &RASTOGI N., 1996-
WOBESER, WL., et al., 1996
DOWN JA., et al., 1996
FOLGUEIRA L., et al., 1996
SHAH JS., et al., 1995
Neisseria gonorrhoeae
LCR
Detecção direta em swab urogenital
CHING S., et al., 1995
Salmonella thypi
PCR
Tipagem e detecção de plasmídeos de
resistência
HERMANS PWM., et al., 1996
Staphylococcus aureus
Multiplex-PCR
Detecção de resistência a metilcilina
VANDENBROUCKE-GRAULS
CMJE.&KUSTERS J.G.,1996
Streptococcus pneumonia
PCR
Detecção de proteínas ligadas a penicilina
UBUKATA K., et al., 1996
Strepococcus pyogenes
PCR
Tipagem das linhagens
BEALL B.,FACKLAN RR. & THOMPSON
T.,1996
Treponema pallidum
Multiplex-PCR
Detecção direta em espécimes de úlceras
genitais
ORLE KA., et al., 1996
Yersinia enterocolitica
PCR
Tipagem das linhagens
WEINANTS V., et al., 1996
Aspergilus spp.
PCR
Detecção de lavados bronco-pulmonares
WERJEIJ PE., et al., 1996
Candida spp.
PCR
Identificação por “fingerprint”
THANOS M., et al., 1996
Pneumocystis carinii
PCR
Detecção de espécimes do trato respiratório
LEIBOVITZ E., , et al., 1996
KLAUSSEGGER et al. (1999), desenvolveram oligonucleotídeos para
diferenciar microrganismos gram-positivos de gram-negativos demonstrando
que o método foi capaz de diferenciar 62 patógenos bacterianos e com
sensibilidade de 10
1
UFC para gram-negativos e 10
3
UFC para gram-positivos.
A detecção de bactérias em sangue por oligonucleotídeos universais
também foi demonstrada por Jordan e Durso (2000), os quais compararam o
sistema com o método comercial BACTEC 9240 em 548 amostras de suspeita
de sepsemia em pacientes da UTI neonatal. Demonstraram que a PCR
apresentou uma maior sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e
negativo de 96, 99,4, 88,9 e 99,8%, respectivamente. Além disto, o método
requer volumes de amostra menores (200 microlitros) do que o sistema
comercial analisado, sendo esta uma vantagem quando se trata de pacientes
neonatos, diminuindo também através desse diagnóstico o tempo de terapia
com antibióticos.
Outras variantes da PCR permitem ainda uma maior especificidade para a
identificação de microrganismos. Um estudo feito por Turenne et al. (2000)
utilizou a técnica de SSCP-PCR (Single Strand Conformation Polymorphism)
baseada em fluorescência para identificar em 272 amostras de hemoculturas
positivas 25 espécies de bactérias frequentemente associadas a bacteremia. O
método foi capaz de determinar a espécie do microrganismo em apenas 7
horas e com o custo de US$ 10,00 por espécie identificada, sendo viável para a
aplicação direta em amostras clínicas (sangue).
1.1.5. Diagnóstico através de sistema Multiplex-PCR
Uma vez padronizadas as aplicações das PCR individuais e comprovada
sua utilidade clínica, ocorreu nos últimos anos o desenvolvimento de um
método diagnóstico denominado como Multiplex-PCR (CHAMBERLAIN et
al.,1988). Estas reações permitem amplificar simultaneamente em um único
tubo diferentes sequências gênicas e consequentemente detectar e identificar
vários genes de interesse.
Por definição, a Reação em Cadeia pela Polimerase Múltipla (Multiplex-
PCR) é uma variante da PCR na qual dois ou mais loci são simultaneamente
amplificados na mesma reação (CHAMBERLAIN et al.,1988). Através deste
método, busca-se amplificar distintas sequências em um único tubo, implicando
na necessidade de que todos os oligonucleotídeos, os iniciadores previamente
desenhados para corresponder ao DNA respectivo de cada bactéria a ser
identificada, assim como os demais reagentes utilizados na PCR, estejam
necessariamente misturados e o programa utilizado seja adequado para
permitir a detecção de cada fragmento específico e não inibir as demais. Com
essa finalidade, alguns parâmetros como a concentração de magnésio e de
iniciadores, a atividade enzimática e a quantidade da DNA polimerase precisam
ser ajustados experimentalmente, o que depende de um desenho experimental
laborioso (SETTANNI e CORSETTI, 2007).
Portanto, as padronizações de PCR múltiplos contribuem para a
detecção simultânea de um número cada vez maior de doenças, a partir de um
número também crescente de tipos de amostras clínicas e necessitando de
menores quantidades de amostra.
O multiplex-PCR é aplicável para detecção de virulência de linhagens
bacterianas como evidenciado por López-Saucedo. et al. (2003), que publicou
o desenvolvimento de um método multiplex PCR para determinar a
enterotoxigenecidade, enteropatogenecidade, enteroinvasividade e a produção
da proteína Shiva em linhagens do patógeno responsável pela diarréia
hemorrágica, Escherichia coli. O método foi capaz de detectar sete lócus
gênicos com alta especificidade e sensibilidade em amostras de alimentos e
espécimes clínicas como fezes. O custo estimado de reação por linhagem foi
de US$2,00, reduzido quando comparado ao método de reações individuais
por PCR, por utilizar menores quantidades de reagentes.
A resistência bacteriana frente a antibióticos tem sido foco de interesse
no desenvolvimento de métodos de amplificação múltiplos como, por exemplo,
a discriminação de cepas de Staphylococcus aureus resistentes ou não a
metilciclina, e coagulase negativa. Maes. et al. (2002), apresentou um método
triplex amplificando o gene 16S rRNA para determinar o microrganismo
S.aureus, o gene mecA para especificar a resistência a metilciclina e o gene
específico nuc para amplificar o gene da termonuclease confirmando a alta
especificidade e sensibilidade do multiplex-PCR quando comparado aos
métodos convencionais.
A estratégia chave para a elaboração de um bom sistema multiplex-PCR
é o desenho de oligonucleotídeos que apresentem um equilíbrio adequado
entre as suas propriedades termodinâmicas e necessariamente devem
amplificar produtos de tamanhos distintos específicos, razões estas que tornam
o método proporcionalmente complexo ao número de pares de
oligonucleotídeos por reação (SINGH, 2006).
Louie et al. (2002) demonstraram que a sensibilidade de um sistema
Multiplex-PCR para detectar o gene nuc do microrganismo S.aureus (MRSA)
era inferior em 100 vezes àquela encontrada com os mesmos pares de
iniciadores em reações individuais comprovando que a cinética reacional da
PCR é mais complexa nos Multiplex-PCR quando comparados aos métodos de
reações únicas de PCR.
Com menores dificuldades para a padronização e também de forma
simultânea de detecção, os painéis moleculares são uma alternativa aos
métodos de Multiplex PCR, constituem-se de um conjunto de iniciadores
planejados para sequências gênicas distintas que atuem em mesmas
condições de termociclagem. Nesse sentido, um estudo recente de Pechorsky
et al, (2009) desenvolveu um set de iniciadores para cinco microrganismos
prevalentes em bacteremias de um Centro Médico em Israel e, comparou aos
métodos convencionais de diagnóstico. Os autores concluem que os métodos
de PCR tipicamente apresentam-se mais sensíveis que hemocultura e, o
sistema desenvolvido pode ser adaptável a microbiota local adicionando
iniciadores para outros microrganismos contribuindo para um diagnóstico em
menor tempo.
Dessa maneira, métodos moleculares para diagnóstico de infecções são
ferramentas extremamente sensíveis e específicas, demonstram aplicabilidade
para diversas espécimes clínicas e os mais variados patógenos e nos últimos
anos tem contribuído efetivamente para o diagnóstico microbiológico.
1.2. Sepse
1.2.1. Definição
Durante quase um século, a sepse foi definida como uma resposta
sistêmica frente a uma infecção, sendo os termos “sepsis” e “septicemia”,
usados alternadamente na prática clínica (RIELDEMANN, 2003).
Em 1992, a Conferência de Consenso sobre Sepse, designou o termo
Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) para qualquer reação
inflamatória secundária a agressões infecciosas ou não (BARBOSA, 2004). Os
termos sepse severa, choque séptico e sepse foram introduzidos para
diferenciar estágios da doença.
Assim, sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica
secundária a um processo infeccioso, sepse severa corresponde à presença
de disfunção orgânica secundária à sepse, choque séptico é a instabilidade
cardiovascular que requer vasopressores e SIRS (Síndrome de Resposta
Inflamatória Sistêmica) é um conjunto de sinais e sintomas que traduz a reação
do organismo frente a diversos fatores, entre eles a presença de infecção
(SILVA, 2004). E a Síndrome de Disfunção de Múltiplos Órgãos (SDMO)
compreende a disfunção orgânica na qual a homeostasia não se mantém sem
intervenção (BARBOSA, 2004).
Sepse, sepse grave, choque séptico e SDMO são momentos
evolutivamente distintos e progressivamente graves da SIRS de natureza
infecciosa (BARBOSA, 2004). A transição de sepse grave para choque séptico
é acompanhada por uma desregulação entre o sistema de fornecimento de
oxigênio e a demanda, a qual resulta em vários graus de déficit de perfusão
(hipoxia tecidual global), incluindo o choque circulatório (RIVERS et.al., 2007).
Infecção e sepse são acompanhadas por sinais clínicos e laboratoriais,
tais como mudanças na temperatura corporal, leucocitose e taquicardia.
Contudo, estes sinais e sintomas de inflamação sistêmica podem resultar de
causas não infecciosas e são tampouco específicas ou sensíveis (BARBOSA,
2004).
1.2.2. Epidemiologia
A sepse é a principal causa de morte nas Unidades de Terapia Intensiva
(UTI) e está entre as principais causas de morte nos Estados Unidos. Em torno
de 2 a 11% das internações hospitalares e nas UTI são por esta doença. Em
2001 a incidência anual estimada foi de 751.000 casos (3 casos/1.000
população) e evolução para óbito em 215.000 casos (28,6%) (ANGUS,2001).
O estudo feito entre os anos de 1979 a 2000 por Martin et al., (2000),
demonstrou que houve um aumento da incidência em torno de 8,7% ao ano. A
mortalidade reduziu de 27,8% nos primeiros anos e para 17,9% nos últimos
cinco anos de avaliação.
Ananne et al. (2003), publicaram dados semelhantes de incidência e
mortalidade quando avaliaram pacientes com choque séptico em um período
de oito anos. As internações na UTI elevaram-se de 7,0 (em 1993) para 9,7
(em 2000) a cada 100 internações. A mortalidade reduziu de 62,1% (em 1993)
para 55,9% (em 2000).
Zuev (2006) confirmou também que a incidência de sepse nos Estados
Unidos é aumentada em 9% ao ano e, os gastos em tratamento excedem 20
bilhões anualmente.
No Brasil, estima-se que sejam diagnosticados anualmente cerca de
400.000 novos casos de sepse grave e 17% dos leitos de UTI sejam ocupados
por esses pacientes. E são gastos anualmente 17 bilhões em tratamento com
pacientes sépticos (AMIB, 2007).
Um estudo de coorte, multicêntrico e prospectivo, em 65 hospitais de
todas as regiões do Brasil estimou a prevalência de sepse nas UTI em 16,7%,
sendo que 19,6% correspondem a sepse, 29,6% sepse severa e 50% choque
séptico. A mortalidade global dos pacientes sépticos foi de 46,6% (243 pa-
cientes). Quando foram avaliados os pacientes com choque séptico, a
mortalidade encontrada foi de 65,3% e na sepse grave de 34,4%. Na região
Sudeste a mortalidade global foi 43%, na região Sul 52,4% e nas regiões
Centro-Oeste, Norte e Nordeste foi 55,4% (SALLES, 2006) (Fig. 2).
Figura 2 – Incidência e Mortalidade na Sepse, Sepse Grave
e Choque Séptico (SALLES, 2006).
O estudo BASES – Brazilian Sepsis Epidemiological Study – (SILVA, et
al., 2004), realizado no período de 2001 a 2002 em cinco unidades de terapia
intensiva situadas em São Paulo e Santa Catarina, encontrou uma taxa de
mortalidade de 21,8% e taxas de incidência de 57,9 (1000 pacientes/dia). As
taxas de mortalidade encontradas para SIRS, sepse, sepse grave e choque
séptico foram de 24,3%, 34,7%, 47,3% e 52,2%, respectivamente.
1.2.3. Fisiopatologia da Sepse
A inflamação é uma resposta do hospedeiro contra agentes infecciosos.
Sepse e SIRS são caracterizadas pela produção excessiva de mediadores
inflamatórios e pela excessiva ativação de células inflamatórias (PEREIRA
JÚNIOR, 1998; BONE.et al., 1991).
Quando a infecção ou bacteremia ocorre, a primeira linha de defesa do
hospedeiro é realizada por células fagocitárias (macrófagos, monócitos e
granulócitos polimorfonucleares) e pela via alternativa do complemento, agindo
de maneira não específica. Logo após, as imunoglobulinas e as células
imunocompetentes iniciam uma resposta imune específica (PEREIRA JÚNIOR,
1998; BONE. et al.,1991; ESISM, 1994; RÉA NETO, et al., 1996).
Os componentes da parede bacteriana são os principais ativadores desta
resposta do hospedeiro: as endotoxinas dos microorganismos Gram-negativos
(principalmente o lipídio A) e o ácido teicóico dos microorganismos Gram-
positivos. Estes componentes desencadeiam uma cascata inflamatória, sendo
inicialmente liberado o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNFα) e a Interleucina-1
(IL-1), que estimulam uma intensa resposta celular, com liberação de
mediadores secundários, quimiotaxia e ativação de granulócitos (THIJS, et al.,
1995). Os mediadores secundários são responsáveis pela reativação das
células fagocitárias e da cascata inflamatória, formando um ciclo vicioso
inflamatório (PEREIRA JÚNIOR, 1998; BONE, 1991; PARRILO, 1993).
As endotoxinas (lipopolissacárides), particularmente o lipídio A
(AKAMINE et al., 1994), são responsáveis pela ativação direta de células
(fagócitos, células endoteliais, linfócitos, fibroblastos, etc) e do sistema
complemento e, pela ativação indireta da cascata inflamatória pela indução da
produção de citocinas pelos macrófagos e monócitos (PEREIRA JÚNIOR,
1998; MOLDAWER, 1994).
As endotoxinas causam a liberação de citocinas diretamente destas
células. Ao mesmo tempo, os microrganismos presentes no foco de infecção
são fagocitados. Isto causa um aumento do consumo de oxigênio pelos
macrófagos e a produção de radicais livres de oxigênio (superóxidos,
peroxidases, etc), juntamente com proteases e hidrolases (lisozimas, elastase,
colagenase, etc), que são capazes de causar danos a estes patógenos. Estas
propriedades fagocíticas e bactericidas são essenciais para a defesa normal do
hospedeiro, mas, quando a ativação dos macrófagos torna-se descontrolada,
estas células contribuem para o desenvolvimento de uma reação inflamatória
generalizada (PEREIRA JÚNIOR, 1998; BONE et al.,1991; THIJS et al., 1995;
LOWRY,1993; FONG et al., 1990).
1.2.4. Microrganismos associados à sepse
Desde a introdução dos antibióticos no início do século vinte, mudanças
significativas ocorreram nas características de infecções hospitalares. Nas
décadas de 40 e 50, as infecções eram geralmente causadas por cocos Gram-
positivos, principalmente pelos βhemolíticos e estafilococos. Nos anos 50, os
estafilococos, resistentes aos antibióticos em uso, emergiram causando surtos
de infecções hospitalares. Já na década seguinte, deram lugar aos bacilos-
Gram negativos entéricos e fungos (RICARDO, 2008).
Durante os anos de 1970 e 1980, os estafilococos readquiriram sua
importância e tornaram-se mais proeminentes. Patógenos nosocomiais
importantes, a partir de 1990, incluem estafilococos coagulase positivos e
negativos, enterococos, bacilos gram-negativos entéricos e não fermentadores
como Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spP., e fungos como Candida
spp.(NNIS, 2004; RICARDO, 2008).
Laupland et al. (2004) apontaram os microrganismos: Staphylococcus
aureus, Escherichia coli e espécies do gênero Streptococcus spp como
principais agentes microbianos associados a sepse em pacientes adultos, nas
Unidades de Terapia Intensiva do Canadá, no período de maio de 1999 a abril
de 2000. Adicionalmente, Richards, Thursky e Buising (2003) encontraram em
pacientes de Unidade de Terapia Intensiva da Australia uma maior prevalência
do microrganismo Staphylococcus spp. coagulase-negativo e Enterococus
spp., seguidos das mesmas espécies bacterianas e fúngicas relatadas por
Laupland (2004). Klingenberg (2005) considerou o microrganismo
Staphylococcus spp. coagulase-negativo, como um dos mais prevalentes
patógenos encontrados em pacientes sépticos neonatos na Noruega.
Babay (2005) verificou a prevalência de microrganismos causadores de
bacteremia entre pacientes pediátricos de UTI no período de janeiro a
dezembro de 2004, no Hospital Universitário King Khalid , na Arábia Saudita e
demonstrou através de hemoculturas que 78,6% dos isolados eram
microrganismos gram-positivos incluindo: Staphylococcus epidermidis (55,4%),
Staphylococcus aureus (9,5%), Streptococcus pneumoniae (4,5%), e
Enterococcus faecalis (4,0%). A prevalência de bactérias gram-negativas foi
20%, encontrando Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae como as mais
frequentes desse grupo e entre os fungos diagnosticados foi relatado a
presença de 1,3% de Candida glabrata.
Rodriguez et al., (2006) realizaram um estudo para determinar a
frequência de espécies do gênero Candida,entre pacientes pediátricos de UTI
de cinco hospitais espanhóis, no ano de 2003, preconizando uma incidência
anual de 32,6 casos em 100.000 nascidos por ano, sendo a espécie com maior
prevalência relatada a espécie Candida parapsilosis (67%).
Nicolleti (2006) diagnosticou em 45 hospitais da Itália os patógenos mais
frequentes associados à infecção bacteriana severa, incluindo sepse, e suas
respectivas susceptibilidades frente aos antibióticos. Dos achados, houve uma
maior prevalência das bactérias Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus e Escherichia coli. Todas ocorreram em mais de 50% entre as infecções
bacterianas analisadas, seguidos por Acinetobacter baumanni, citado em
terceiro lugar entre as UTI e, com menor freqüência, foram encontrado os
microrganismos Staphylococcus epidermidis e Enterococcus faecalis.
Hill et.al., (2006) identificaram os microrganismos relacionados com
bacteremias em um hospital africano no período de novembro de 2003 a
fevereiro de 2005, demonstrando que 73% das bacteremias analisadas,
destacaram-se com uma maior ocorrência os microrganismos: Streptococcus
pneumoniae (45.2%), Staphylococcus aureus (18,3%) e Escherichia coli
(9,7%).
Infecções por P.aeruginosa representam uma alta incidência na etiologia
de sepse e na maioria das vezes apresentam um pior prognóstico no quadro
séptico (LLOPIS et al., 2004; SAKAMOTO et al., 2004; CRIVARO et al., 2009;
SUÁREZ et al., 2009.; MARRA et al., 2006).
Ballester et al. (2008) verificaram a prevalência de sepse em bancos de
dados de 26 hospitais de Valença entre os anos de 1995 a 2004, observando
também a etiologia microbiana correlacionados com cada caso. De todos os
casos de sepse analisados, 21,4%, estavam relacionados com infecção
bacteriana por bactérias gram-negativas, seguidos por 17% por bactérias gram-
positivas e 3,1% por fungos. Os autores ainda demonstraram que a incidência
de bactérias gram-negativas teve sua taxa elevada de 18% (1999) para 22%
(2004), a incidência de bactérias gram-negativas elevou de 16 para 18% e, a
incidência de fungos permaneceu estável em aproximadamente 3%.
Um estudo retrospectivo realizado no Brasil, com o objetivo de verificar a
prevalência de microrganismos, gram-negativos produtores de beta-lactamase
de espectro estendido em neonatos no período de 2002 a 2004, encontrou a
Klebsiella pneumoniae como a bactéria mais prevalente nos recém-nascidos
com diagnóstico de sepse por Gram negativos (47%), seguida de
Pseudomonas aeruginosa (20%), Serratia marcescens (11%) e Enterobacter
cloacae (9%), (TRAGANTE et al., 2008).
Em relação à prevalência dos organismos como causa dos principais
tipos de infecções no Brasil, dados de 2005 a 2008 (3.807 casos) mostraram
que o Staphylococcus aureus permanece como a principal causa de
bacteremia (20,2%), seguido por Staphylococcus coagulase- negativo (14,5%),
Klebsiella spp. (12,1%), Escherichia coli (12%), Acinetobacter spp (9,1%),
Pseudomonas aeuruginosa (8,1%), Enterobacter spp (6,1%), Enterococcus
spp. (5,0%) (SADER et. al., 2001).
Essencialmente, qualquer microorganismo pode causar sepse ou
choque séptico (bactéria, vírus, fungos, protozoários), porém as bactérias são
os agentes etiológicos mais comuns. Frequentemente os casos de sepse estão
associados a bactérias Gram-negativas (E. coli, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter sp, Pseudomonas aeruginosa entre outras). Staphylococcus
aureus e Streptococcus pnemoniae e outras bactérias Gram-positivas são
responsáveis pelos casos remanescentes. Nos pacientes imunossuprimidos os
fungos, bem como as bactérias, podem causar sepse (QUENZER et al., 1994).
Os estudos mencionados demonstram uma heterogeneidade quanto à
etiologia microbiana de sepse existindo uma ocorrência de determinados
microrganismos, mas não há uma exata correlação global da prevalência
etiológica microbiana, evidenciando que a microbiologia de sepse está em
constante modificação e possui diferentes tendências geográficas (LLEWELYN
e COHEN, 2007).
Segundo a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do Hospital
Municipal São José de Joinville SC, entre os microrganismos locais
frequentemente associados à sepse estão: Pseudomonas aeruginosa,
Enterobacter spp, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Acinetobacter
baumanni e fungos do gênero Candida.
1.2.5. Identificação de microrganismos relacionados à sepse
Quando o início de sepse está relacionado à proliferação de
microorganismos a partir de um foco infeccioso, o uso de antibióticos é
imperativo (BORGES, 1996). Quadros séptico por microrganismos Gram-
negativos não podem ser distinguidos da sepse por Gram-positivos
exclusivamente em bases clínicas. Entretanto, fatores epidemiológicos e
aspectos referentes ao caso em questão podem sugerir uma maior
probabilidade da existência de alguns organismos específicos (QUENZER et
al., 1994).
É fundamental a identificação do microrganismo causador da infecção e o
início precoce de antibioticoterapia adequada. Uma antibioticoterapia inicial,
inadequada na sepse encontra-se associada a um aumento da mortalidade em
até cinco vezes. Por outro lado, a antibioticoterapia indiscriminada é
responsável pelo surgimento crescente de bactérias multiresistentes e
infecções fúngicas (AKAMINE et al., 1994).
2
2
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2.1. Planejamento de oligonucleotídeos
A primeira etapa desse estudo consistiu em desenvolver
oligonucleotídeos capazes de identificar e distinguir microrganismos
correlacionados com sepse. Então, foram estabelecidos critérios moleculares
que permitissem alcançar esse objetivo, a saber:
- Escolha de um gene alvo altamente conservado e com suficiente variabilidade
nucleotídica interespecífica;
- Hibridização específica dos oligonucleotídeos nas respectivas seqüências
alvo, sem formação de overlaps ou hairpins com outras regiões do próprio
genoma e de outros microrganismos, ou ainda dos próprios oligonucleotídeos;
- Tamanho distinto para cada produto amplificado e identificação via
eletroforese em gel de agarose;
- Características termodinâmicas compatíveis entre os oligonucleotídeos para
atuarem-nos mesmos parâmetros de termociclagem.
2.2. Genes Alvo
Para a amplificação dos microrganismos Pseudomonas aeruginosa,
Enterobacter spp., Staphylococcus aureus e Acinetobacter baumanni optou-se
por uma região do genoma codificante para a fração 23S do RNA ribossomal.
Para a bactéria Escherichia coli optou-se pelo gene codificande da β-
galactosidase (LacZ) enquanto para os fungos do gênero Candida optou-se
pela região responsável pela fração 18S do RNA ribossomal.
2.3. Sequências Consenso
Foram selecionadas no banco público de dados genômicos “GenBank”
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) até dez seqüências
nucleotídicas para cada gene alvo (Tabela 4). A partir dessas sequências
realizou-se o alinhamento múltiplo com o programa “ClustalW” (THOMPSON;
HIGGINS & GIBSON, 1994), visando a obtenção de sequências consenso de
cada microrganismo com o emprego do software BioEdit (HALL, 1999).
As sequências consenso foram submetidas e analisadas, em conjunto,
pelo software Visual Oligonucleotide Modeling Plataform (SANTALUCIA, 2007)
para a simulação de modelos de “primers” para Multiplex PCR. Os modelos
sugeridos foram testados quanto a especificidade através de alinhamento local
com a ferramenta de bioinformática BLAST (ALTSCHUL, 1990) dos
oligonucleotídeos sugeridos contra todas sequências nucleotídicas disponíveis
no GenBank. Os modelos sugeridos foram considerados validados quando
estes não apresentassem identidade com outro organismo.
TABELA 4.0- Sequências nucleotídicas utilizadas para determinação de sequências
consenso.
Microrganismo
Genes Alvo
Números de Acesso no
GenBank
Acinetobacter baumannii
rRNA23S
NC_009085 ; X87280 ;
CR543861
Candida spp.
rRNA 18S
NW139715.1 ; M60302.1 ;
AB013586.1 ;AJ005123,1;
AY520165.1 ; AB013589.1
; M55527.1 ; EF428135.1 ;
EF424120.1 ; AY055855.1
Enterobacter spp.
rRNA23S
AS549515.2 ; DQ869859.1
; CP000653.1 ;
AY116918.1 ; DQ989185.1
; DQ869860.1
Escherichia coli
LacZ
NC004431 ; V00331 ;
J01695.1 ; AE005174 ;
CP000243 ; U00096
Pseudomonas aeruginosa
rRNA23S
NC002516 ; CP000438 ;
YO0432 ; CP000744 ;
CP000247 ; DI2649.1 ;
DQ682619.1
Staphylococcus aureus
rRNA23S
NC002952 ; K68425.1 ;
BA000018.3 ; BA000033.2
; BX571856 ; AP009351 ;
CP000736; CP000253 ;
BA000017 ; CP000046
2.4. Microrganismos em estudo
Para a padronização do sistema PCR foram adquiridas cepas padrão,
provenientes do banco “American Type Culture Colection”, disponíveis na
Coleção de Culturas Tropical da Fundação André Tosello (Tabela 5),
excetuando as Candida parapsilosis e Candida krusei, que foram cedidas
gentilmente pela professora Msc. Carmen D. T. Heyder (Laboratório de
Microbiologia da Farmácia Escola da UNIVILLE).
TABELA 5 - Cepas utilizadas para a padronização do PCR
Microrganismo
Código ATCC
Acinetobacter baumannii
19606
Candida albicans
Candida krusei
Candida parapsilosis
10231
6258
22019
Enterobacter aerogenes
13048
Escherichia coli
8739
Pseudomonas aeruginosa
9027
Staphylococcus aureus
6538
2.5. Cultivo e Manutenção dos Microrganismos de Estudo
As cepas bacterianas foram cultivadas e mantidas em placas de petri
contendo o meio de cultura NA (Vetec Química, Rio de Janeiro, Brasil,
composto por 5g.L
-1
de Peptona de Carne, 3g.L
-1
de Extrato de Carne e 15g.L
-1
de ágar, e as cepas do gênero Candida foram cultivadas e mantidas em meio
de cultura YMA (Vetec Química, Rio de Janeiro, Brasil), composto por 3g.L
-1
Extrato de Levedura, 3g.L
-1
Extrato de Malte, 5g.L
-1
de Peptona, 10 g.L
-1
de
Glicose e 15g.L
-1
de ágar. Todas as cepas foram incubadas a 35°C (bactérias)
e 28°C (fungos) por 24 a 48 horas em incubador (B.Braun, modelo Certomat S
e estufa modelo: Certomat HK, Melsungen, Alemanha).
2.6. Extração de DNA Microbiano
Para as cepas padrão bacterianas utilizou-se o kit Qiamp DNA Mini Kit
®
(Qiagen, Hilden, Alemanha), segundo o protocolo “Extração de DNA genômico
microbiano a partir de placa de cultura em meio sólido” (ANEXO I). Para as
espécies do gênero Candida foi testado o mesmo método descrito e o método
clássico de extração de DNA, Fenol/Clorofórmio (Sambrock et al.,1998),
entretanto não se obteve DNA com qualidade para amplificação. Optou-se
então para uma adaptação recomendada pelo Kit Qiagen para ruptura física de
células. Para esse propósito, um volume de 1,0 mL de suspensão celular dos
fungos do gênero Candida foi centrifugado por 6 minutos a 13000G em
centrífuga Eppendorf 5415R (Hamburg, Alemanha). Descartou-se o
sobrenadante e as células recuperadas foram lavadas com água destilada e
centrifugadas novamente nas mesmas condições. Ressuspendeu-se as células
em 0,5 mL de água destilada. Foram acrescentadas a esta suspensão 1,25g de
pérolas de vidro de diâmetro de 0,5 mm. As células foram rompidas em Moinho
de Bolas para rompimento celular (Retsch, modelo MM2, Düsseldorf,
Alemanha) por 20 minutos a 120G. Após o rompimento, centrifugou-se
rapidamente a amostra para decantação dos fragmentos celulares. Retirou-se
100µl do sobrenadante e prosseguiu-se a extração de DNA microbiano com o
Kit Qiagen conforme as recomendações do fabricante (ANEXO I).
2.7. Determinação de concentração dos DNA extraídos
A qualidade (pureza) e a concentração do DNA total obtidas em cada
amostra foram verificadas através de leituras espectrofotométricas (260, e
280nm) no equipamento espectrofotômetro (Spectrum, modelo 2000UV,
Xangai, China)
2.8. Eletroforese
Os DNA extraídos foram também verificados via eletroforese em gel de
agarose a 1%, corados com Brometo de Etídeo (0,5g/mL), visualizados em
transiluminador de luz ultravioleta e digitalizados no Sistema de
fotodocumentação digital (MiniBis-Pro, DNR Bio-Imaging Systems Ltd.
Jerusalém, Israel).
2.9. PCR
Os DNA extraídos das cepas padrão foram utilizados para
determinação das melhores condições de termociclagem, ou seja, das
condições ótimas de amplificação dos segmentos gênicos pretendidos.
Inicialmente, optou-se pela padronização individual de cada primer
desenvolvido, determinando as condições ideais para os microrganismos em
estudo. A seguir, as condições ideais individuais foram verificadas quanto a
possibilidade de utilização de uma termociclagem comum a todas as reações.
Para um volume final da reação de 50μL foram acrescentados 50 a
500ng do DNA extraído à mistura de reagentes da PCR contendo 1U de Taq
DNA polimerase (LGC Biotecnologia, São Paulo, Brasil), 10 mM de dNTP‟s (GE
Heathcare, Little Chalfont, Reino Unido) 1X PCR Buffer (LGC Biotecnologia,
São Paulo, Brasil), 20 pmoles de cada primer (sintetizado pela Invitrogen, São
Paulo, Brasil) e de 1 a 2 mM de MgCl
2
(LGC Biotecnologia, São Paulo, Brasil).
Para o estabelecimento de uma temperatura de annealing ótima e
comum a todos os pares de primers desenvolvidos foram testadas
amplificações individuais segundo gradiente de temperaturas variável entre 40
e 60°C, de acordo com a disposição dos tubos no aparelho de termociclagem.
Os ciclos de amplificação foram realizados no termociclador LGC XP
(BIOER Technology Co., Tokio, Japão), consistindo de uma fase inicial a 94°C
por 3 minutos, seguida de 40 ciclos envolvendo 45 segundos a 94°C
(desnaturação), 45 segundos a temperatura de annealing (40 a 60 °C) e 45
segundos a 72°C (extensão). Ao término, realizou-se a extensão final dos
amplicons a 72°C por 10 minutos.
2.10. Resolução do Produto de PCR
Os “amplicons” planejados foram confirmados via eletroforese em gel de
agarose a 1%, corados com Brometo de Etídeo (0,5g/mL), visualizados em
transiluminador de luz ultravioleta e digitalizados no Sistema de
fotodocumentação digital ((MiniBis-Pro, DNR Bio-Imaging Systems Ltd.
Jerusalem, Israel).
2.11. Testes de Especificidade
Os testes de especificidade foram realizados com a utilização de um
painel de DNA microbianos não correspondentes, DNA humano e o DNA
microbiano correspondente ao par de oligonucleotídeos em teste como controle
positivo da reação.
2.12. Limite de Detecção de DNA
O limite de detecção de DNA das reações de PCR foi determinado pela
utilização de séries decimais do DNA de cada microrganismo alvo diluído em
sangue humano (500ng a 50fg). Essa técnica é denominada spike e considera
os efeitos inibitórios de interferentes da reação presentes em amostras clínicas
e ausentes nas cepas “puras” (MONTE, 2005). Para tanto, foi inoculado com o
auxílio de uma alça de platina colônias de células de cada microrganismo de
estudo em uma alíquota de 500 µl de sangue humano, imediatamente após foi
realizado extrações de DNA desse material (sangue contendo as colônias
microrganismos) como descrito no item 2.6. Ao final, para cada DNA
microbiano extraído obteve-se a concentração obtida pela extração por leituras
espectofotométricas conforme descrito no item 2.7 . Uma vez adquiridas as
concentrações foram realizadas diluições para todos os DNA microbianos
obtidos para obter a concentração de 500ng/µl. Então foram realizadas a partir
dessa concentração diluições seriadas de 500ng/µl a 50fg/µl em H
2
O grau
PCR. A partir das diluições obtidas foram realizadas PCR com o par de
iniciador correspondente a cada DNA microbiano obtido. Portanto para cada
par de primer desenvolvido foram realizados oito reações de PCR (500ng,
50ng, 5ng,500pg,50pg,5pg,500fg, 50fg e controle negativo de reação).
Os testes de especificidade e limite de detecção foram realizados em
condições otimizadas de termociclagem e concentração de reagentes na PCR.
3
3
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Conforme as normas do Programa de Pós Graduação em Mestrado em
Saúde e Meio Ambiente da UNIVILLE, este capítulo será apresentado na forma
de artigo científico que foi encaminhado para publicação em periódico científico
(ANEXO II).
PAINEL MOLECULAR PARA DIAGNÓSTICO DE
ESPÉCIES MICROBIANAS ASSOCIADAS À SEPSE
Ferreira L.E
1
., Dalposso K.
2
, Hackbarth B.B.
3
,
Gonçalves A.R.R.
4
, Westphal G.A.
5
, França P.H.C.
6
, Pinho M.S.L.
7
- Universidade da Região de Joinville -
Programa de Pós-Graduação em Saúde e Meio Ambiente
1
,6,7
- Departamento de
Medicina
4,5
- Departamento de Farmácia
2,3
Laboratório de Biologia Molecular
Palavras chaves: Diagnóstico molecular, sepse,PCR
Sepse é uma infecção generalizada associada à elevada mortalidade em ambientes
hospitalares. São conhecidos alguns dos fatores responsáveis, como o diagnóstico tardio e a
terapia imprecisa a base de antibióticos. Testes moleculares baseados na técnica PCR
(Polymerase Chain Reaction) apresentam resultados mais rápidos e precisos possibilitando
uma terapêutica com maiores chances de sucesso. OBJETIVO DO ESTUDO: Desenvolver e
padronizar um painel de iniciadores visando à amplificação em parâmetros únicos de reação de
segmentos específicos de DNA de microrganismos associados com a sepse, permitindo um
diagnóstico rápido. MÉTODOS: Cinco pares de iniciadores para a amplificação de sequências
codificantes dos microrganismos Enterobacter spp., Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida spp., foram desenvolvidos e testados quanto ao
limite de detecção e à especificidade por amplificação do fragmento gênico correspondente às
cepas padrão dos microrganismos em estudo. RESULTADOS: Foram obtidas amplificações
empregando as mesmas condições de reação e termociclagem para os microrganismos:
Enterobacter spp. Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus e Candida spp..Os
iniciadores desenvolvidos para Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida
spp apresentaram especificidade, entretanto não foi possível diferenciar entre os
microrganismos Enterobacter spp. e Escherichia coli, então adicionalmente foram planejados
iniciadores específicos para Escherichia coli para o diagnóstico discriminatório entre os
microrganismos, quando necessário. Quanto ao limite de detecção o sistema desenvolvido foi
capaz de amplificar quantidades de 5ng a 500fg de DNA por reação a partir de amostras de
sangue contaminadas propositadamente com as espécies microbianas, confirmando a
possibilidade de aplicação em amostras clínicas. O painel molecular proposto oferece como
vantagem adicional ser um sistema “aberto” quando comparado com outros métodos como
Multiplex PCR e permitir um diagnóstico rápido.
Apoio Financeiro: Fundo de apoio à Pesquisa UNIVILLE e FAPESC.
Endereço para correspondência:
Universidade da Região de Joinville –
Cx. Postal 246, 89201-972 Joinville, SC, Brasil.
+55-47-34619197;
e-mail: leslie.ferreira@univille.br
57
INTRODUÇÃO
No Brasil, estima-se que sejam diagnosticados anualmente cerca de
400.000 novos casos de sepse grave e 17% dos leitos de UTI sejam ocupados
por esses pacientes (AMIB, 2007). É fundamental a identificação do
microrganismo causador da infecção para o início precoce de antibioticoterapia
adequada, uma vez que a antibioticoterapia indiscriminada é responsável pelo
surgimento crescente de bactérias multiresistentes e infecções fúngicas
(Akamine et al,1994).
Testes moleculares como PCR são métodos importantes para detectar
agentes etiológicos de infecção. Amplificações de segmentos de DNA
bacteriano específicas ou não PCR podem ser úteis para um diagnóstico
precoce com alta sensibilidade para detectar quantidades diminutas de DNA
como10 a 100 cópias em amostras clínicas (Cuchacovich,2006).
O objetivo deste trabalho foi desenvolver e padronizar um painel de
iniciadores para a amplificação de segmentos específicos de DNA de
microrganismos associados à sepse em parâmetros únicos de reação,
permitindo um diagnóstico rápido.
MATERIAIS E MÉTODOS
Planejamento de iniciadores
Foram desenvolvidas sequências iniciadoras (primers) para o
diagnóstico de cinco agentes microbianos associados à sepse, a saber
58
Enterobacter spp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus e Candida spp. Para cada microrganismo em estudo foram
selecionadas até dez seqüências nucleotídicas (Tabela I) no banco de dados
GenBank. Para as bactérias Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp. e
Staphylococcus aureus foram selecionadas sequências relativas ao gene 23S
rRNA, enquanto para o fungo Candida spp. selecionou-se sequências
correspondentes ao gene 18S rRNA. As sequências selecionadas geraram
através do programa “ClustalW” (Thompson et al, 1994) sequências consensos
de cada microrganismo.
Em conjunto, as sequências consensos foram analisadas com emprego do
programa “Visual OMP” (Santalucia, 2007) destinado à simulação de
combinação de primers para “Multiplex PCR”. Os oligonucleotídeos propostos
foram testados in silico quanto a especificidade de reconhecimento através de
alinhamento local BLAST (Altschul et al., 1990), contra as seqüências
nucleotídicas de inúmeros organismos depositadas no GenBank.
O gene LacZ foi definido para o planejamento de primers destinados à
detecção de Escherichia coli e foi estabelecido pelo programa PRIMER3 (Steve
& Skaletsky,2000).
59
TABELA I
Sequências nucleotídicas utilizadas para determinação de sequências consensos.
Microrganismo
Números de Acesso no GenBank
Candida spp.
NW139715.1; M60302.1; AB013586.1;
AJ005123,1; AY520165.1; AB013589.1;
M55527.1; EF428135.1; EF424120.1;
AY055855.1.
Enterobacter spp.
AS549515.2; DQ869859.1; CP000653.1;
AY116918.1; DQ989185.1; DQ869860.1;
Escherichia coli
NC004431; V00331 ; J01695.1 ;
AE005174 ;CP000243 ; U00096
Pseudomonas aeruginosa
NC002516 ; CP000438 ; YO0432 ;
CP000744 ; CP000247 ; DI2649.1 ;
DQ682619.1
Staphylococcus aureus
NC002952 ; K68425.1 ; BA000018.3 ;
BA000033.2 ; BX571856 ; AP009351 ;
CP000736; CP000253 ; BA000017 ;
CP000046
Microrganismos de estudo
Foram adquiridas cepas padrão da Coleção de Cultura Tropical André
Tosselo dos microrganismos: Candida albicans (ATCC 10231), Candida krusei
(ATCC 6258), Candida parapsilosis (ATCC 22019), Enterobacter aerogenes
(ATCC 13048), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 9027) e Staphylococcus aureus (ATCC 6538).
Extração de DNA.
O kit Qiamp DNA Mini Kit
®
(Qiagen,Hilden, Germany) foi empregado
para extração do DNA das cepas padrão bacterianas. Para as cepas padrão
dos fungos do gênero Candida spp. realizou-se previamente a ruptura celular
60
com emprego de esferas de vidros de 0,5µm e após o DNA foi extraído com o
kit Qiamp DNA Mini Kit
®
(Qiagen,Hilden, Alemanha).
Os indicadores de qualidade da extração e a concentração de DNA total
obtida em cada amostra foram verificados através de leituras
espectrofotométricas (260 e 280nm).
Reação em Cadeia da Polimerase.
Para um volume final da reação de 50μL foram acrescentados 50 a
500ng do DNA extraído à mistura de reagentes da PCR contendo 1U de Taq
DNA polimerase (LGC Biotecnologia, São Paulo, Brasil), 10 mM de dNTP‟s (GE
Heathcare, Little Chalfont, Reino Unido) 1X PCR Buffer (LGC Biotecnologia,
São Paulo, Brasil), 20 pmoles de cada primer (sintetizado pela Invitrogen, São
Paulo, Brasil) e de 1 a 2 mM de MgCl
2
(LGC Biotecnologia, São Paulo, Brasil).
Para o estabelecimento de uma temperatura de annealing ótima e comum a
todos os pares de primers desenvolvidos foram testadas amplificações
individuais dentro de gradiente de temperatura variável entre 40°C a 60°C de
acordo com a disposição dos tubos no aparelho de termociclagem.
O ciclo de amplificação foi realizado no termociclador LGC XP (BIOER
Technology Co., Tokio, Japão) e consistiu de uma fase inicial a 94°C por 3
minutos. Em seguida, 40 ciclos que envolviam: 45 segundos a 94°C, 45
segundos a 50°C e 45 segundos a 72°C. E uma extensão final a 72°C por 10
min. Os amplicons obtidos foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose
a 1%, corado com Brometo de Etídeo 1mg/ml, visualizados em transiluminador
61
de luz ultravioleta e digitalizados no Sistema de fotodocumentação (MiniBis-
Pro, DNR Bio-Imaging Systems Ltd. Jerusalem, Israel).
Testes de Especificidade.
Os testes de especificidades foram realizados com a amplificação por
reação cruzada entre DNAs microrganismos não correspondentes aos pares de
primers de estudo e de DNA humano.
Limite de Detecção
Os testes para verificação do limite de detecção foram realizados com
amplificações de uma diluição seriada de 500ng/µl a 50 fg/µl do DNA extraído
de uma amostra de sangue contaminada artificialmente com o microrganismo a
ser investigados com o intuito de promover os efeitos inibitórios de interferentes
da reação de amostras clínicas.
RESULTADOS
As múltiplas combinações de primers sugeridas pelo programa Visual
OMP e as análises subsequentes resultaram em um conjunto de cinco pares
de oligonucleotídeos com seqüências e conformações apropriadas para a
amplificação conjunta dos microrganismos alvo. Entretanto o primer
desenvolvido para Acinetobacter Baumanni não estabeleceu amplificações, e
o par de primers desenvolvido para Enterobacter spp. não apresentou
especificidade amplificando também o microrganismo E.coli . Adicionalmente
foi desenvolvido um par de primer especifíco para E.coli baseado no gene
LacZ. Os pares de primers desenvolvidos para Enterobacter spp., Candida
62
spp., E. coli, P. aeruginosa e S. aureus geraram amplicons de tamanho
molecular de 526, 430, 407, 377, e 198pb respectivamente (Tabela II).
Tabela II
Oligonucleotídeos desenvolvidos
A variação (gradiente) da temperatura de annealing, empregando-se os
primers previstos, resultou no estabelecimento de uma temperatura consensual
de reação possibilitando dessa maneira a amplificação em paralelo de todos os
microrganismos testados (Fig.1). Para a detecção específica de E.coli foi
estabelecida uma nova termociclagem a uma temperatura de annealing de
60°C, diferenciando as reações inespecíficas entre Enterobacter sp e E.coli.
Quanto ao limite de detecção, o sistema é capaz de detectar
concentrações de DNA microbiano em sangue nas concentrações entre 5ng
Oligonucleotídeo
Gene Alvo
Microrganismo
Direção da
fita
Tamanho do
Produto (bp)
GTTAAGGTATTTACATT
TCAGTTATCGTTTATT
rRNA 18S
Candida spp
SENSO
ANTISENSO
430
GTACGATTTGTTGTTA
AAAGAAAGCGTAATA
rRNA 23S
Enterobacter spp
E.coli
SENSO
ANTISENSO
526
GAACATCAAACATTAAA
AATCAGTCGAAGATA
LacZ
E.coli
SENSO
ANTISENSO
407
GTCAGTGTTACCTAA
GAAAGGATCTTTGAA
rRNA 23S
P.aeruginosa
SENSO
ANTISENSO
377
CACCTATTTTCTATCTA
CCTATAATCGTTTTAAT
rRNA23S
S.aureus
SENSO
ANTISENSO
198
63
(Enterobacter sp),5pg (Candida albicans, E.coli, P.aeruginosa e 500fg
(S.aureus) (Fig.2). Quanto a especificidade, excetuando o sistema
desenvolvido para o microrganismo Enterobacter spp. que apresentou reação
cruzada com Escherichia coli (dados não mostrados), todos os outros
apresentaram especificidade quando comparados entre si e DNA humano
(Fig.3).
Fig. 1: Otimização da temperatura de annealing para detecção
simultânea (mesma ciclagem de PCR) dos microrganismos:
1) P.aeruginosa, (2) S.aureus, (3) Candida albicans, Enterobacter
aerogenes (4) e (M) Marcador molecular (100bp Ladder, Fermentas,
Ontario, Canadá).
64
Fig.2: Teste de limite de detecção para S.aureus: 1) 50ng (2) 5ng (3)
500pg,(4) 50 pg (5) 5pg,(6) 500fg (7) 50 fg, (M) Marcador Molecular
(100bp Ladder, Fermentas, Ontario, Canadá).
Fig.3: Especificidade dos sistemas de PCR desenhados para: :
(A) E.coli., (B) S.aureus, (C) P.aeruginosa, (D) Candida spp. (M)
Molecular Standard (100bp ladder, Fermentas, Ontario, Canada)
testados em reações cruzadas com: (1) E.coli, (2) S.aureus, (3)
P.aeruginosa, (4) Candida albicans (5) A. baumannii, (6) E.
aerogenes, (7) S. salivarius, (8) S. mutans, (9) H. sapiens, e (10)
Controle negativo.
DISCUSSÕES
O diagnóstico confirmatório de sepse depende de exames
microbiológicos baseados em técnicas de culturas que demoram usualmente
A)
B)
C)
D)
65
de 24 a 72 horas para oferecer resultados confiáveis. Entretanto, sistemas de
hemocultura automatizados dependem de testes bioquímicos confirmatórios
para a especificação do agente etiológico implicando no uso empírico de
antibioticoterapia (Dellinger et al.,2004). Estudos de comparação entre
hemoculturas e atuais testes diagnósticos moleculares para detecção de
microrganismos associados à sepse, relatam que o uso de diagnóstico por
técnicas de PCR, reduz o tempo do diagnóstico rotineiro em 21 horas (Xu et al.,
2005).
O tempo requerido para a aplicação do painel molecular apresentado
nesse trabalho foi de aproximadamente 6 horas para o diagnóstico específico
de microrganismos, inclusive fungos que, normalmente em testes
microbiológicos convencionais possuem crescimento lento, dificultando a
aceleração do diagnóstico. Contudo a detecção para os microrganismos
Enterobacter spp.com o painel desenvolvido, implica em um acréscimo de
aproximadamente 2h para a realização de um segundo teste de PCR com os
primers desenvolvidos para o microrganismo E.coli, uma vez que o sistema
para Enterobacter spp. não apresentou especificidade.
Outros estudos tem proposto o diagnóstico bacteriano baseado em PCR,
não diferenciando no entanto os microrganismos (Yamamoto,2002;
Rantakokko-Jalava et al., 2000). Klausseberger et al. (1999) detectaram 62
patógenos utilizando sistemas de PCR seguidos de hibridização, sendo este
método no entanto de difícil aplicabilidade cliníca. Existem ainda outros
métodos ultra sensíveis usando o protótipo de microarray para PCR em larga
escala de 800 genes de microrganismos relacionados à sepse (Palka-Santini
et al., 2009). Entretanto, a elevada complexidade e custos deste procedimento
é de difícil implementação em laboratórios clínicos
Diferente dos sistemas de detecção de Multiplex-PCR onde todos os
primers estão em um mesmo tubo, ou seja, uma reação “fechada”, o presente
painel desenvolvido oferece como vantagem ser um sistema “aberto”, onde
múltiplos primers para outros microrganismos podem ser incorporados na
mesma termociclagem não alterando o tempo de diagnóstico.
66
A inclusão de controles internos de amplificação como o emprego de
primers não específicos baseados em sequências conservadas entre espécies
e o uso de rigorosos controles no processo de extração de DNA e amplificação
pode identificar potenciais amplificações falso-positivas (Jordan e Durso,2000)
uma vez que o método apresentado possui alta sensibilidade.
AGRADECIMENTOS
Esse trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado
de Santa Catarina e pelo Fundo de Apoio à Pesquisa da Universidade da
Região de Joinville. Agradecemos também a Professora Msc. Carmem
Diamantina Heyder e a Professora Msc. Roseneide Campos pelo suporte na
área de microbiologia.
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cerebrospinal fluids. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 9 (3): 508-
14.
68
Running Title: PCR for sepsis-related microorganisms
MOLECULAR PANEL FOR DETECTION OF
MICROORGANISMS RELATED TO SEPSIS
Ferreira L.E
1
., Dalposso K.
2
, Hackbarth B.B.
3
,
Gonçalves A.R.R.
4
, Westphal G.A.
5
, França P.H.C.
6
, Pinho M.S.L.
7
Programa de Pós-Graduação em Saúde e Meio Ambiente
1,6,7
- Departamento
de Medicina
4,5
- Departamento de Farmácia
2,3
Universidade da Região de
Joinville,Campus Universitário S/N, 89201-972 Joinville, SC, Brasil.
Key words: Molecular Diagnosis, Polymerase Chain Reaction, Sepsis.
Sepsis is a systemic infection related to high mortality rates in hospital
environment. Delayed diagnosis and inadequate antimicrobial therapy are
associated to treatment failures. Microbiological molecular diagnosis based on
PCR (Polymerase Chain Reaction) is regarded as faster and more accurated
procedures, providing higher successful therapeutical rates. The aim of the
present study was to develop and standardize a panel of primers to PCR
amplification of specific DNA segments of sepsis-related microorganisms
according an unique protocol for a faster diagnosis. Five pairs of primers for
amplification of coding sequences of Enterobacter spp., Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Candida spp., were
designed and tested for sensitivity and specificity for respective standard
microorganism control strains. Amplification using the same condition for
reaction and thermocycling were achieved for Enterobacter spp., P. aeruginosa,
S. aureus and Candida spp. Good specificity was obtained by P. aeruginosa, S.
aureus and Candida spp primers, but it was not possible to discriminate among
Enterobacter spp and E. coli, so that an additional pair of primers for the last
microorganism was developed for differential diagnosis when required.
Sensitivity tests showed a threshold for detection from 5 ng to 500 fg DNA
contaminated blood samples, suggesting a relevant potential use in clinical
settings. This molecular panel offers an additional advantage of an „open‟
system when compared to other multiplex detection methods with no delay in
diagnostic time.
+Financial Support: FAP UNIVILLE and FAPESC.
Corresponding author:
E-mail address: [email protected]
69
INTRODUCTION
It has been estimated an annual incidence of 400 000 new cases of severe
sepsis in Brazil, requiring 17% of intensive care occupation (AMIB, 2007).
Specific identification of causal microbiological agent is essential for treatment
since inadequate antimicrobial therapy is associated to a five-fold mortality and
development of multiresistant microorganisms infections (Akamine et al., 1994).
Despite microbiological tests based on Polymerase Chain Reaction (PCR) are
now current reliable procedures, they have not been usually used in diagnosis
of sepsis. Amplification of generic or specific bacterial DNA segments may play
an important role in early diagnosis with high sensitivity to detect as low as 10 to
100 bacterial copies in clinical blood samples (Cuchacovich,2006).
The aim of this study was to develop and standardize a panel of primers to PCR
amplification of specific DNA segments of microorganisms related to sepsis
according a unique protocol for a faster diagnosis.
MATERIAL and METHODS
Design of primers
It was developed a panel of PCR primers for detection of five microorganisms
related to sepsis, namely Enterobacter spp., Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus and Candida spp. Up to ten nucleotide
sequences of each microorganism were selected from GenBank database
(Table I), retrieved from 23S rRNA gene for P. aeruginosa, Enterobacter spp.
70
and S. aureus and from 18S rRNA for Candida spp. For each respective set a
consensual sequence was generated by ClustalW® software (Thompson et
al.,1994). The consensus sequences were submitted to Visual OMP® software
(Santalucia, 2007) to simulate a set of primers for simultaneous amplification.
Multiple oligonucleotides were then tested in silico regarding specificity by
BLAST against all nucleotide sequences available at GenBank (Altschul et al.,
1990). Alternatively, LacZ gene was defined for primers design for Escherichia
coli using the PRIMER3 ® software (Steve & Skaletsky,2000) .
TABLE I
Nucleotide sequences employed for defining consensus sequences
Microorganism
GenBank access numbers
Candida spp.
NW139715.1; M60302.1; B013586.1;
AJ005123,1; AY520165.1;B013589.1;
M55527.1; EF428135.1; EF424120.1;
AY055855.1.
Enterobacter spp.
AS549515.2;DQ869859.1;CP000653.1;
AY116918.1; DQ989185.1; Q869860.1;
Escherichia coli
NC004431; V00331 ; J01695.1 ;
AE005174 ;CP000243 ; U00096
Pseudomonas aeruginosa
NC002516 ; CP000438 ; YO0432 ;
CP000744; CP000247 ; DI2649.1 ;
DQ682619.1
Staphylococcus aureus
NC002952 ; K68425.1 ; BA000018.3 ;
BA000033.2 ; BX571856 ; AP009351 ;
CP000736; CP000253 ; BA000017 ;
CP000046
71
Microorganisms
Standard strains of Candida albicans (ATCC 10231), Candida krusei (ATCC
6258), Candida parapsilosis (ATCC 22019), Enterobacter aerogenes (ATCC
13048), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)
and Staphylococcus aureus (ATCC 6538) were acquired from the Tropical
Culture Collection of André Tosello Foundation.
DNA preparation
Qiamp DNA Mini Kit
®
(Qiagen,Hilden, Germany) was employed for DNA
extraction from strains maintained in solid media. For Candida spp, DNA
extraction was preceded by cell disruption with glass microspheres. Qualitative
and quantitative assessment of DNA preparation were performed through
spectrophotometric measurements.
Polymerase Chain Reaction
Reactions were performed at a defined volume of 50μL and included 50 to
500ng of whole DNA, 1 U of Taq DNA polymerase (LGC Biotecnologia, São
Paulo, Brazil), 10 mM of dNTP‟s (GE Heathcare, Little Chalfont, United
Kingdon) 1X PCR Buffer (LGC Biotecnologia), 20 pmoles of each primer
(Invitrogen, São Paulo, Brazil) and 1 - 2 mM of MgCl
2
(LGC Biotecnologia). To
achieve a common optimal annealing temperature to all pairs of primers,
individual amplifications were tested in temperature gradients from 40°C to
60°C, according tubes positioning in thermocycler device. Amplification was
performed in LGC XP thermocycler (BIOER Technology Co., Tokio, Japan)
with initial denaturation at 94°C for 3 minutes, followed by 40 cycles
72
encompassing three consecutive 45 seconds periods at 94°C, 50°C and 72°C,
respectively. A final extension cycle at 72°C for 10 minutes closed the
procedure. Amplicons obtained were submitted to electrophoresis in 1%
agarose gel, stained by ethidium bromide (0,5 µg/mL) for UV light analysis and
digitalized (MiniBis-Pro photodocumentation system, DNR Bio-Imaging Systems
Ltd. Jerusalem, Israel).
Specificity tests
Specificity tests were performed employing DNA from humans and
microorganisms other than those established in the present study.
Sensitivity tests
Sensitivity tests were performed employing serial dilutions of DNA extracted
from blood samples artificially contaminated by respective microorganism
strains to prevent possible amplification failure due to inhibitory factors present
in clinical samples.
RESULTS
Analysis of multiple oligonucleotide sequences suggested by Visual OMP ®
software resulted in a panel of four pairs of compatible primers for amplification
of the target microorganisms in a common thermocycling protocol. However,
Enterobacter spp. primers showed crossed amplification to E. coli. Therefore,
an additional pair of primers based on E. coli LacZ gene was developed for
differential diagnosis in a further reaction, when required.
73
Enterobacter spp., C. albicans, E. coli, P. aeruginosa and S. aureus generated
amplicons of 526, 430, 407, 377 and 198 bp, respectively (Table II).
Table II
Primer information
Analysis of the temperature gradients for all primers resulted in a consensual
annealing temperature of 50ºC (Fig.1). The differentiation reaction between
Enterobacter spp and E. coli was performed with 60º C as its annealing
temperature.
Sensitivity analysis showed a threshold for detection of microorganism DNA in
quantities as little as 5 ng (Enterobacter spp), 5 pg (Candida spp, E. coli, P.
aeruginosa) and 500 fg (S. aureus; (Fig. 2). Good specificity results were
obtained with all primers when compared to microbial and human DNA (Fig. 3),
except the above mentioned Enterobacter spp – E. coli crossed reaction (not
shown).
Primer Sequence
Target
Microorganisms
Frame
Size
Product
(bp)
GTTAAGGTATTTACATT
TCAGTTATCGTTTATT
Candida spp
SENSE
ANTISENSE
430
GTACGATTTGTTGTTA
AAAGAAAGCGTAATA
Enterobacter spp
E. coli
SENSE
ANTISENSE
526
GAACATCAAACATTAAA
AATCAGTCGAAGATA
E. coli
SENSE
ANTISENSE
407
GTCAGTGTTACCTAA
GAAAGGATCTTTGAA
P. aeruginosa
SENSE
ANTISENSE
377
CACCTATTTTCTATCTA
CCTATAATCGTTTTAAT
S. aureus
SENSE
ANTISENSE
198
74
Fig.1: Optimized annealing temperature (50ºC) for the simultaneous
detection (same PCR protocol) of (1) P. aeruginosa, (2) S. aureus (3)
C. albicans, and (4) E. aerogenes (M) Molecular Standard (100bp
ladder, Fermentas, Ontario, Canada).
Fig.2: Sensitivity test for S. aureus. (1) 50ng, (2) 5ng, (3) 500pg, (4) 50
pg, (5) 5pg, (6) 500fg, and (7) 50 fg. (M) Molecular Standard (100bp
ladder Fermentas).
75
Fig. 3: Specificity of PCR systems designed for: (A) E.coli (B) S.aureus,
(C) P.aeruginosa, (D) Candida spp. (M) Molecular Standard (100bp
ladder, Fermentas, Ontario, Canada). (1) E.coli, (2) S.aureus, (3)
P.aeruginosa, (4) Candida albicans (5) A. baumannii, (6) E. aerogenes, (7)
S. salivarius, (8) S. mutans, (9) H. sapiens, and (10) Negative control.
DISCUSSION
As current diagnostic procedures for sepsis rely on culture tests requiring a 24-
72 hour period, antibiotic therapy is usually started on empirical basis (Dellinger
et al.,2004 ). On the other hand, comparative studies between hemocultures
and molecular tests for detection of microorganisms related to sepsis have
reported a 21 hours decrease in diagnostic time using PCR techniques (Xu et
al., 2005).
Time required for specific microbiological diagnosis using the molecular panel
developed in present study was approximately six hours, except in cases of
positivity for Enterobacter spp, when additional two hour procedure is required
to differentiate from E. coli. It must be also considered that this panel includes
detection of Candida spp, a slow growth microrganism.
A)
B)
C)
D)
76
Other studies have proposed different methods of PCR-based diagnostic
procedures, with no microorganism differentiation (Yamamoto,2002;
Rantakokko-Jalava et al.,2000). Klauseggger et al.(1999) have detected 62
pathogens using PCR system followed by hibridization. Large scale detection
systems using highly sensitive microarray and PCR methods have been used to
identify 800 sepsis-related microorganism genes (Palka-Santini Maria et al.,
2009). These are very interesting methods but its complexity lacks a potential
clinical availability.
Different from conventional multiplex detection systems where all primers are
mixed in a single „closed‟ reaction kit, the presently described molecular panel
offers an additional advantage of an „open‟ system, where multiple primers
targeting other microorganisms may be added to the unique PCR protocol
reaction with no delay in diagnostic time.
Considering the high sensitivity of PCR-based detection methods, the addition
of other amplification tools such as internal controls using non-specific primers
based on preserved sequences from different species and strict safety protocols
for DNA extraction and amplification must be considered to prevent false-
positive results (Jordan & Durso,2000).
ACKNOLEDGEMENTS
This study was supported by grants from FAPESC (Santa Catarina State
Research Foundation) and FAP-UNIVILLE (Research Fund from University of
77
Region of Joinville). We also thank Professors Carmem Diamantina Heyder and
Roseneide Campos by their support in microbiology issues.
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79
4
4
.
.
C
C
O
O
N
N
C
C
L
L
U
U
S
S
Õ
Õ
E
E
S
S
Foram desenvolvidos cinco pares de primers para a amplificação por
PCR para o diagnóstico molecular de principais agentes microbianos
correlacionados com sepse.
1. Foram desenvolvidos iniciadores de amplificação capazes de detectar
através de PCR, em condições únicas de termociclagem, para os
microrganismos: Candida spp. Enterobacter spp., Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa,e Staphylococcus aureus. Foram planejados
também primers para o microrganismo Acinetobacter baumanni, entretanto
não apresentaram amplificações nas diversas condições de reação
testadas.
2. Os sistemas de PCR para os microrganismos: Candida spp. Enterobacter
spp., Pseudomonas aeruginosa,e Staphylococcus aureus, foram
padronizados em reações de PCR em parâmetros únicos de
termociclagem. O sistema planejado para Escherichia coli foi detectado em
condições de temperatura de annealing díspar (60°C) dos demais sistemas.
3. Os sistemas desenvolvidos detectaram concentrações de DNA microbiano
em sangue nas concentrações entre 5ng (Enterobacter spp.), 5pg (Candida
spp, E.coli, P.aeruginosa) e 500fg (S.aureus).
4. Quanto à especificidade, excetuando o sistema desenvolvido para o
microrganismo Enterobacter spp que detectou o microrganismo E.coli, todos
apresentaram especificidade quando comparados entre si e DNA.
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MIOC] Submission Acknowledgement
Memorias do Instituto Oswaldo Cruz
<[email protected]>
19 de janeiro de
2010 20:25
Para: Leslie Ecker Ferreira <[email protected]>
Manuscript: "MOLECULAR PANEL FOR DETECTION OF
MICROORGANISMS RELATED TO
SEPSIS"
Thank you for your above-mentioned manuscript which you kindly submitted
for publication in the Memorias do Instituto Oswaldo Cruz.
The manuscript will be sent to the Editorial Board for review. We will
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With the online journal management system that we are using, you will be
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Username: leslieferreira
Thank you for considering this journal as a venue for your work.
Sincerely Yours,
Ricardo Lourenco de Oliveira
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