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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
FERNANDO TADEU TREVISAN FRAJACOMO
Efeitos do exercício físico associado à luz contínua na carcinogênese
colônica em ratos
RIBEIRÃO PRETO
2010
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FERNANDO TADEU TREVISAN FRAJACOMO
Efeitos do exercício físico associado à luz contínua na carcinogênese
colônica em ratos
Dissertação apresentada ao Departamento
de Patologia e Medicina Legal da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para o título de
Mestre em Ciências Médicas
Área de concentração: Patologia
Opção: Patologia Experimental
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia
RIBEIRÃO PRETO
2010
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO OU PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Frajacomo, Fernando Tadeu Trevisan
Efeitos do exercício físico associado à luz contínua na carcinogênese colônica em ratos,
Fernando Tadeu Trevisan Frajacomo; Orientador Sérgio Britto Garcia, 2010.
67 p.: il.; 30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Área de concentração: Patologia.
1. Glândula pineal. 2. Luz Contínua. 3. Câncer de cólon. 4. Exercício Físico. 5.
Biomarcadores do câncer
FOLHA DE APROVAÇÃO
Fernando Tadeu Trevisan Frajacomo
Efeitos do exercício físico associado à luz contínua na carcinogênese colônica em ratos
Dissertação apresentada ao Departamento de
Patologia e Medicina Legal da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de Mestre em
Patologia.
Área de Concentração: Patologia Experimental
Aprovado em:________/_________/_________
Banca Examinadora
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição___________________________________Assinatura__________________
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição___________________________________Assinatura__________________
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição___________________________________Assinatura__________________
i
DEDICATÓRIA
A João Trevisan (in memoriam), meu avô, que partiu no dia 10/03/2010 e me
deixou um importante legado de valores. Sua dedicação a sua família e a mim fortaleceram
minha convicção de um caminho de lutas e glórias.
Aos Meus Pais, Mauricio e Fátima, pelo incentivo e perseverança no caminho dos
estudos como forma digna de sucesso e reconhecimento.
A Deus por me proporcionar a oportunidade de crescimento junto de pessoas muito
especiais.
ii
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Dr. Sérgio Britto Garcia, meu orientador e grande figura intelectual, minha
admiração ao senhor pelo exemplo de gestão pessoal e profissional e pelas oportunidades
de crescimento.
Ao Professor Dr. Marcelo Marcos Piva Demarzo, pelo incentivo e o pioneirismo às
pesquisas com exercício físico e o constante apoio no crescimento intelectual, pessoal e do
laboratório.
Ao Professor Dr. Alceu Afonso Jordão Júnior, grande pesquisador e incentivador das
pesquisas. Agradeço por disponibilizar seu laboratório para o enriquecimento deste
trabalho e pela cordial recepção de sua equipe.
A minha família, meu irmão Frederico e minha Avó Erminia Trevisan pelo carinho e apoio
e orgulho que me passam.
Aos colegas de trabalho Cleverson, Tassiana, Vinicius, Jean, Ana Paula, Aline, Patrícia,
João e Célia entre outros pelo apoio e incentivo nessa jornada científica regado a muitas
xícaras de café para alguns e chá para outros.
A Mariane Sayuri Yui por ter me dado todo apoio, carinho e incentivo quando mais
precisei.
Aos Técnicos de laboratório Rosângela Lopes, Auristela e Deise pela disposição de ajudar
e a ensinar qualquer aluno que queira aprender.
Aos meus colegas de graduação do curso de Fisioterapia de FMRP-USP. Meus sinceros
agradecimentos e respeito por pessoas e profissionais de grande sucesso.
Aos amigos de longa data de Ribeirão Preto, Guetianos que sempre proporcionaram
momentos inesquecíveis nesses 8 anos de convivência.
A todos os pós graduandos e aos docentes do departamento que alavancam o nome dessa
instituição.
A secretária Camila de Luca Zambonini Gimenes e Felipe, grande profissional e
competência por me ajudar nas etapas burocráticas desse processo.
Às secretárias do Departamento de Patologia e Medicina Legal: Rosângela, Neide e Edna
Pio (in memoriam) pela competência com que realizam suas funções e pela especial ajuda
a mim no momento em que mais precisei.
Aos Funcionários do Departamento de Patologia e Medicina Legal: Toninho, Felipe,
Henrique e as faxineiras por tornarem esse departamento um exemplo de boa gestão.
A CAPES pelo apoio científico e financeiro.
iii
"Nada lhe posso dar que já não existam em você mesmo. Não posso abrir-lhe outro mundo
de imagens, além daquele que há em sua própria alma. Nada lhe posso dar a não ser a
oportunidade, o impulso, a chave. Eu o ajudarei a tornar visível o seu próprio mundo, e
isso é tudo."
Hermann Hesse (1877-1962)
iv
RESUMO
FRAJACOMO, F.T.T. Efeitos do exercício físico associado à luz contínua na carcinogênese
colônica em ratos. 2010. Dissertação (Mestrado). Departamento de Patologia, Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2010.
O exercício físico tem sido proposto como uma terapia não farmacológica efetiva para a
prevenção e o tratamento de neoplasias, especialmente no trato gastrointestinal, com
destaque ao câncer de cólon. A Glândula Pineal é considerada um orgão importante na
carinogênese, especialmente por modular o ritmo circadiano e por secretar o hormônio
melatonina. O presente estudo visou investigar o papel da glândula pineal sobre a
carcinogênese colônica experimental de ratos submetidos ao exercício físico. Dessa forma,
propusemos investigar biomarcadores colônicos de câncer, focos de criptas aberrante
(FCAs), antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), ciclooxigenase 2 (COX-2) e a
Caspase-3; além de parâmetros oxidativos hepáticos de peroxidaçao lipídica e a glutationa
reduzida (GSH) e da atividade da glândula pineal por meio da expressão dos receptores
colônicos de melatonina. O estudo foi conduzido através dos grupos experimentais com
ratos machos Wistar sendo o grupo controle (C), luz contínua (L), exercício (E) e luz
contínua associada ao exercício (LE). De forma similar, os grupos foram repetidos e
expostos ao carcinógeno químico 1,2-dimetilhidrazina (DMH), tendo recebido quatro
doses de 40 mg/kg por via intraperitoneal. O treinamento físico experimental foi realizado
pelo modelo de natação progressivo, 5 dias por semana, durante 10 semanas. Após o
período de treinamento, os animais foram sacrificados, sendo coletadas amostras de fígado
e colón para análise. O estudo do fígado revelou uma significativa influência do DMH na
modulação dos parâmetros oxidativos. As análises colônicas dos FCAs, PCNA e da COX-
2 mostraram-se moduladas pelo exercício físico bem como aumento do índice de apoptose
quando o mesmo foi realizado em condições normais do ritmo circadiano. Em
contrapartida, a inibição fisiológica da glândula pineal pela exposição à luz contínua foi
determinante para reverter os efeitos do exercício físico sobre o controle desses
biomarcadores colônicos. Em suma, nossos dados apontam para a forte influência da
atividade da glândula pineal sobre o complexo de adaptações do exercício físico no tecido
colônico de ratos Wistar expostos a um carcinógeno químico.
Palavras chave: Glândula pineal, Luz Contínua, Câncer de cólon, Exercício Físico,
Biomarcadores do câncer
v
ABSTRACT
FRAJACOMO, F.T.T. Physical exercise effects associated with continuous light on
colon carcinogenesis in rats. 2010. Dissertation (Master Science Degree). Departament of
Pathology – School of Medicine of Ribeirão Preto – University of São Paulo.
Exercise has been proposed as an effective non-pharmacologic therapy for the prevention
and treatment of cancer, especially in the gastrointestinal tract, with emphasis on colon
cancer. The pineal gland is considered an important organ in carcinogenesis, particularly
by modulating the circadian rhythm and to secret the hormone melatonin. The current
study aimed to investigate the role of the pineal gland on the experimental colon
carcinogenesis in male Wistar rats submitted to physical exercise. Thus, we proposed to
investigate biomarkers of colon cancer, Aberrant Foci Crypt (ACFs), proliferating cell
nuclear antigen (PCNA), cyclooxigenases 2 (COX-2) and apoptotic protein Caspase-3, as
well as oxidative hepatic lipid peroxidation (MDA) and reduced glutathione (GSH and
activity of the pineal gland through the colonic expression of melatonin receptors. The
study was conducted through the experimental groups with male Wistar rats, the control
group (C), continuous light (L), exercise (E) and continuous light associated with exercise
(LE). Similarly, other groups were exposed to the same experimental protocol and
administration of carcinogen 1,2 dimethyl-hydrazine (DMH, 40mg/kg) intraperitoneally.
Exercise training groups were performed progressive swimming exercise 5 d-wk
1
for 10
wk. After training period, the rats were sacrificed and samples of liver were collected to
analysis. The study of the liver revealed a significant effect of DMH on the modulation of
oxidative parameters. Statistical analysis of colonic FCAs, PCNA and COX-2 were shown
to be modulate by physical exercise beyond increase in apoptotic index when it was
performed in normal circadian rhythm. In contrast, the physiological inhibition of the
pineal gland by continuous light exposure was crucial to reverse the effects of exercise on
the modulation of colonic biomarkers. In conclusion, our data demonstrate the strong
influence of the pineal gland activity on the complex adaptations of physical exercise on
colonic tissue from rats exposed to a chemical carcinogen.
Keywords: Pineal Gland, continuous light, colon cancer, physical exercise, cancer
biomarkers.
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Esquema representativo do processo multifatorial da carcinogênese, bem
como as estratégias preventivas de cada estágio 12
FIGURA 2: Seqüência de eventos da carcinogênese de cólon relacionando ao acúmulo de
mutações e a taxa de apoptose. 16
FIGURA 3: Esquema dos grupos experimentais 28
FIGURA 4: Ganho de peso dos animais 34
FIGURA 5: Níveis hepáticos de GSH (nmol/mg prot) 35
FIGURA 6: Níveis hepáticos de MDA (nmol/mg prot) 36
FIGURA 7: Índice de proliferação celular do cólon (i-PCNA) 37
FIGURA 8: Índice de expressão de ciclooxigenase 2 (COX-2) 38
FIGURA 9: Índice de apoptose no cólon (Caspase-3) 39
FIGURA 10: Número de focos de criptas aberrantes nos grupos com DMH 40
FIGURA 11: Índice de receptores de melatonina no cólon 41
FIGURA 12: Fotomicrografia de imuno-histoquímica dos biomarcadores colônicos 42
vii
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
DNA Ácido desoxirribonucleico
DMH 1,2-Dimetilhidrazina
O
6
-MeG O
6
- Metilguanina
GSH Glutationa reduzida
MDA Malondialdeído
FCAs Focos de Criptas Aberrantes
PCNA Antígeno Nuclear de Proliferação Celular
ACSM ColegioAmericano de Medicina Esportiva
AHA Associação Americana do Coração
IGFs Fatores de crescimento de insulina
NK Natural Killers
NMDA N-metil-d-aspartato
SNC Sistema Nervoso Central
MT Receptor de Melatonina
H&E Hematoxilina Eosina
DAB 3,3' – diaminobenzida
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
TCA Ácido Tricloroacético
TRIS (Hidroximetil)Aminometano
DTNB Ácido 5,5-Ditiobis(2-Nitrobenzóico)
TBARS Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
ANOVA Análise de Variância em Uma Via
viii
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO 9
1.1 O câncer de cólon 10
1.2 Carcinogênese de cólon e modelos experimentais 11
1.3 Biomarcadores da Carcinogênese Colônica 13
2. O câncer de cólon e o exercício físico 16
3. Biologia da Glândula Pineal 19
3.1 Glândula Pineal, Melatonina e Carcinogênese 20
3.2 Glândula Pineal, Exercício Físico e Ritmo circadiano 22
4. JUSTIFICATIVA 25
5.OBJETIVOS 26
6. MATERIAL E MÉTODOS 27
6.1 Animais 27
6.2 Delineamento Experimental 27
6.3 Aplicação do carcinógeno 28
6.4 Treinamento 29
6.5 Sacrifício dos animais 29
6.6 Coleta e processamento do material 29
6.7 Focos de Cripta Aberrante (FCAs) 31
6.8 Imuno-histoquímica 31
6.9 Análise de melatonina plasmática 32
6.10 Análises bioquímicas 32
6.11 Análise dos resultados 34
7. RESULTADOS 35
7.1 Peso dos animais 35
7.2 Biomarcadores de estresse oxidativo 35
7.3 Indice de Proliferaçao celular (i-PCNA) nas células epiteliais colônicas 37
7.4 Índice de ciclooxigenase 2 (COX-2) no estroma colônico 38
7.5 Índice de apoptose do cólon pela Caspase-3 no estroma colônico 39
7.6 Focos de criptas aberrantes (FCAs) 40
7.7 Índice de receptor de melatonina no cólon 41
8. DISCUSSÃO 43
9. CONCLUSÃO 50
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51
11 ANEXOS 63
9
1. INTRODUÇÃO
O câncer de cólon é atualmente umas das principais causas de morte por câncer no
mundo. Segundo estimativas da American Cancer Society, boa parte da incidência e
mortalidade de câncer de cólon e reto poderiam ser evitadas se o conhecimento atual sobre
a doença fosse aplicado (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2008). BOOTH et al.,(2002)
alertam para o estilo de vida adotado na maior parte das nações desenvolvidas como
incompatíveis com o genoma humano refletindo no aumento das doenças crônicas. Tal
estilo seria caracterizado pelo sedentarismo, má alimentação e pelo prolongamento da
jornada de trabalho o que leva à excessiva exposição à iluminação artificial.
O importante papel do exercício físico de intensidade moderada a vigorosa e
realizada de forma regular frente à prevenção e ao tratamento de doenças crônicas parece
irrefutável. Dados epidemiológicos confirmam uma redução de 40-50% da incidência de
câncer de cólon e mama associada a uma sobrevida de 50-60% dessas populações
fisicamente ativas (FRIEDENREICH & ORENSTEIN, 2002).
Recentes revisões alertam para a desregulação da atividade da glândula pineal pela
exposição à luz e o risco de câncer. Estudos epidemiológicos e experimentais confirmam o
potencial negativo da desregulação circadiana e da inibição da melatonina noturna sobre o
processo de iniciação e crescimento tumoral (REITER et al., 2007).
A regulação do ritmo circadiano pela glândula pineal recebe forte influência das
condições de claro-escuro (ATKINSON et al., 2007). Contudo, estímulos não fóticos como
exercício são apontados por CAMBRAS et al. (2000) como agentes modulares do ritmo
circadiano de forma dependente do horário e das condições de luz do ambiente.
Em virtude de tais comportamentos estarem presentes em nosso cotidiano, e seu
efeito adjunto ser pouco explorado na literatura, propusemos investigar os efeitos da
10
desregulação da glândula pineal pela exposição à luz contínua sobre um modelo
experimental de câncer de cólon submetido ao exercício físico.
1.1 O câncer de cólon
Estudos experimentais, epidemiológicos e clínicos evidenciam que o câncer colo-
retal é passível de prevenção, especialmente porque a dieta e o estilo de vida são fatores
chaves na modulação do risco deste câncer (ZIEGLER et al., 2003). Tal teoria é suportada
pelo aumento da incidência de câncer de cólon em populações que migraram de regiões de
baixo risco para áreas alto risco, reforçando o papel dos fatores ambientais na
carcinogênese de cólon (POTTER et al., 1993).
O processo de ocidentalização das nações em desenvolvimento foi relacionado à
crescente incidência de câncer colo-retal por todo o globo. Elevada taxa de incidência está
associado ao câncer colo-retal em países desenvolvidos representando 46 novos casos para
cada cem mil habitantes no ano de 2006, somente nos Estados Unidos (CENTER et al.,
2009). No Brasil, as regiões sul e sudeste concentram o dobro da taxa de mortalidade de
câncer colo-retal para homens e mulheres se comparadas às demais regiões do país,
segundo dados do Instituto Nacional do Câncer, evidenciando o importante papel do estilo
de vida e dos fatores ambientais em sua etiologia (INCA, 2010).
HEGDE et al. (2008) sugerem que o diagnóstico precoce para esse tipo de
neoplasia associado a uma intervenção sobre os fatores de risco modificáveis do quadro,
como dieta e a inatividade física, poderiam reverter o alarmante quadro de terceira causa
mais comum de malignidade e a terceira causa de morte por câncer nos Estados Unidos
com cerca de 50 mil mortos somente no ano de 2008.
11
1.2 Carcinogênese de cólon e modelos experimentais
Os mecanismos biológicos que resultam no processo de carcinogênese são
baseados na exposição do organismo a uma grande variedade de agentes carcinogênicos
endógenos ou exógenos, incluindo os agentes químicos, radiação, microoganismos ou
agentes físicos. Frente à exposição do organismo a esses agentes, o processo de múltiplas
etapas da carcinogênese, iniciação, promoção e progressão, podem ser desencadeadas
constituindo uma importante ferramenta no estudo das neoplasias (YUSPA & POIRIER,
1988).
A fase de iniciação tumoral é representada pela alteração do DNA celular resultante
de mutações genéticas ou epigenéticas espontâneas ou induzidas por carcinógenos de
diversas classes. Alterações de genes específicos desencadeiam uma resposta anormal ao
microambiente celular e eventualmente promovem uma vantagem proliferativa em relação
às células normais. No estágio de promoção, o tumor é caracterizado por expansão clonal
das células iniciadas cujo produto está associado com hiperproliferação, apoptose,
remodelação tecidual e inflamação. Por fim, no estágio de progressão, células pré-
neoplásicas desenvolvem a capacidade de invasão tecidual geralmente associada a
alterações de expressão gênica e progressiva instabilidade genômica (ROGERS et al.,
2008).
12
Figura 1: Esquema representativo do processo multifatorial da carcinogênese, bem como
as estratégias preventivas de cada estágio. (adaptado de HURSTING et al., 2006)
Conforme mostrado na figura 1, substâncias reativas carcinogênicas podem
danificar o DNA ou alterar expressão de enzimas detoxicantes do DNA e iniciar a divisão
descontrolada da célula. Nesse contexto, a partir dos estudos conduzidos na década de 60,
a 1,2-Dimetilhidrazina (DMH) passou a ser utilizada como agente indutor de câncer
intestinal demonstrando relativo sucesso na indução de câncer de cólon em várias espécies
de modelos experimentais (DRUCKREY et al., 1967). Dentre suas principais
características estão a alta reprodutibilidade no processo de carcinogênese humana, alto
grau de especificidade ao cólon e a promoção de todas as etapas evolutivas da
carcinogênese conferindo ao DMH um ótimo modelo de carcinógeno químico para o
estudo experimental do câncer do cólon (POVEY et al., 2002).
É descrito por MCLELLAN & BIRD (1988) que a capacidade dos carcinógenos
iniciarem o processo de carcinogênese seja devido à sua interação com o DNA celular sem
causar morte da célula, o que é avaliado pela aberração nuclear. O DMH é considerado um
carcinógeno indireto sendo metabolizado no fígado para a formação de Azoximetano e, por
13
conseguinte, resultar na produção de íons de diazonium eletrofílico no cólon levando à
formação de agentes alquilantes do DNA, como a substância promutagênica O
6
-
Metilguanina (O
6
-MeG), no referido tecido (SAMANTA et al., 2008)
De acordo com LAURIER et al. (1984), o fígado responde ao estresse causado pela
metabolização do DMH, sendo considerado um importante órgão no qual ocorre um
grande número de reações metabólicas. Logo, mudanças em outros órgãos poderão refletir
na atividade metabólica e oxidativa hepática (PILLAI et al., 1999). Os mesmos autores
descrevem que a metabolização do carcinógeno DMH pelo fígado altera a expressão de
enzimas anti-oxidantes como a glutationa reduzida (GSH) bem como as espécies reativas
do ácido tiobarbitúrico, expressa principalmente pelo malonaldeído (MDA), contudo
pouco se sabe a respeito da resposta oxidativa hepática frente à interação do carcinógeno
com outros fatores, como o exercício físico e a exposição à luz contínua.
1.3 Biomarcadores da Carcinogênese Colônica
SHARMA et al. (2001) destacam que a compreensão dos passos moleculares e
bioquímicos responsáveis pela carcinogênese de cólon, como lesões pré-neoplásicas do
cólon, metabolismo do ácido aracdônico e as moléculas chaves na proliferação e apoptose
celular seriam métodos úteis na prevenção dessa doença.
Ratos da espécie Wistar tratados com o DMH, apresentaram focos de criptas
aberrantes (FCAs). Estas alterações relacionadas ao processo inicial de transformação
neoplásica podem ser qualificadas e quantificadas, podendo ser úteis como biomarcadores
da provável progressão para o câncer. As lesões pré neoplásicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas,
14
espessamento epitelial com células proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (SIU et al., 1997; PARK et al., 1997).
Os FCAs em roedores são estudados não somente por mimetizar as etapas precoces
do câncer de cólon em humanos, mas também por responder aos fatores nocivos
ambientais (FENOGLIO-PREISER & NOFFSINGER, 1999). Estudos experimentais
utilizando os FCAs vêm sendo largamente empregados para detectar possíveis fatores que
possam influenciar a carcinogênese colo-retal nos seus estágios iniciais (MCLELLAN et
al., 1991). Ademais, no processo de múltiplas etapas da transformação do epitélio colônico
normal em epitélio neoplásico, vários fatores relacionados à regulação do ciclo celular,
marcadores de estresse oxidativo, resposta imune, resposta inflamatória e vias apoptóticas
são expressas.
A proliferação celular do compartimento criptal é um fenômeno normal e
estritamente controlado (RISIO, 1992). O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)
é utilizado como marcador do ciclo celular, especialmente pela marcação da ciclina E na
fase G1 e S do ciclo, e destaca-se como um biomarcador precoce do câncer de cólon por
refletir o aumento proliferação celular induzida por carcinógenos (NARYZHNY, 2008).
Tal proteína é sintetizada normalmente no ciclo celular normal e nas células tumorais,
contudo sua expressão é bem aumentada em tecidos com alta taxa de divisão (BRAVO &
MACDONALD-BRAVO, 1985).
Fatores inflamatórios e apoptóticos somam-se aos demais biomarcadores nas etapas
subsequentes do câncer de cólon. No primeiro caso, a ciclooxigenase 2 (COX-2), enzima
expressa por citocinas pró-infamatórias em específicas situações patofisiológicas e que
possui uma ação catalisadora na produção de prostaglandinas através do ciclo do ácido
aracdônico, tem alcançado grande destaque na terapia contra o câncer de cólon fortalecidos
15
pela experiência positiva de inibidores seletivos de COX-2 na prevenção da malignidade
colônica (MARNETT & DUBOIS, 2002). Desde os estudos de EBERHART et al., (1994)
forte correlação entre COX-2 e os níveis de proliferação celular do câncer de cólon tem
sido observado em adenomas e carcinomas colônicos apresentando resultados similares
com estudos experimentais com carcinógeno químico (DUBOIS et al., 1996).
A supra-regulação de COX-2, e subsequente aumento de prostaglandina E2 (PGE
2
)
está relacionada com a síntese de células B2 (Bcl-2) e família “AKT”, proteínas anti-
apoptóticas, (GATELY, 2000). O processo de apoptose, caracterizado como uma morte
celular organizada foi previamente descrito por KERR et al.(1972). Em relação ao câncer
de cólon, significativa diminuição da apoptose foi associada ao aumento de outros
biomarcadores específicos.
A apoptose é um importante mecanismo de homeostase e sua resistência é
frequentemente associado ao câncer de cólon (KOORNSTRA et al., 2003). O processo é
mediado pela ação das caspases ou proteases de morte que convergem para a ativação da
Caspase-3 que cliva a maioria dos substratos celulares no processo apoptótico sendo sua
mensuração um fator de grande confiabilidade na determinação da apoptose (KOELINK et
al., 2009).
16
FIGURA 2: Seqüência de eventos da carcinogênese de cólon relacionando ao acúmulo de
mutações e a taxa de apoptose. (Adaptado de HUERTA et al., 2006)
Recentes estudos demonstraram que a instabilidade genética do ambiente estromal
e epitelial contribuem para a gênese do câncer colo-retal (KOORNSTRA et al., 2003). Os
mesmos autores consideram que o compartimento estromal do câncer de cólon representa
um importante fator prognóstico da doença considerando-se que várias proteínas
associadas ao câncer como a COX-2 e a Caspase-3 são expressas nessa região.
Considerando que a detecção precoce dos biomarcadores da carcinogênese colônica
representa uma importante ferramenta nas pesquisas sobre o câncer de cólon, é nessa fase
que importantes terapias preventivas vêm sendo empregadas. Sobretudo, é nessa fase da
carcinogênese que o efeito de terapias preventivas como o exercício físico tem sido melhor
observados (FUKU et al., 2007).
2. O câncer de cólon e o exercício físico.
A importância da atividade física para a saúde pública como modificadora dos
fatores de risco para o desenvolvimento de doenças crônicas foi evidenciada nos últimos
17
anos. Por outro lado, a inatividade física é sugerida como um fator significativo de
mortalidade refletindo em um alarmante estilo de vida ocidentalizado (WENDEL-VOS et
al., 2007).
Atividade física é conceituada como toda e qualquer atividade em que o individuo
tenha um gasto energético maior que seus níveis de repouso, ao passo que o exercício
físico é naturalmente qualquer atividade física, estruturada, planejada e repetitiva que tem
por objetivo o aumento da aptidão física (WINTER & FOWLER, 2009).
O exercício físico regular foi reconhecido pela American College of Sports
Medicine (ACSM) e American Heart Association (AHA) no ano de 1998 como fator
essencial para prevenção e tratamento de doenças crônicas como o câncer (NEWTON &
GALVAO, 2008).
A idéia de que a atividade física poderia ser importante na prevenção do câncer,
entretanto, não é recente. Os primeiros trabalhos datam do ano de 1922, através dos
estudos de SIVERTSEN & DAHLSTROM (1922), em que compararam a taxa de
mortalidade por câncer com o nível de atividade física ocupacional requerida em suas
atividades diárias, observando um decréscimo inversamente proporcional ao nível exigido
de atividade física na ocupação laboral.
FRIEDENREICH & ORENSTEIN (2002), examinaram os aspectos relevantes da
influência do exercício físico sobre a carcinogênese resultando em um volume científico
próximo a 170 trabalhos sobre a temática, sendo que, 51 trabalhos referiam-se ao câncer de
cólon. Baseado nas evidências científicas apresentadas, a World Cancer Research
Fundation e a American Institute for Cancer Research no ano de 1997 classificaram os
estudos científicos sobre a influência do exercício físico no desenvolvimento do câncer de
18
cólon e mama como convincentes, prováveis para câncer de próstata, endométrio e
pulmão, porém incertas para outros sítios primários de neoplasia.
Em um abrangente estudo populacional com um seguimento de 6 anos CHAO et al,
(2004) relataram uma significativa redução de 40% do risco de mortalidade da população
portadora de carcinoma de cólon que realizavam ao menos 7 horas de exercício físico por
semana.
ROGERS et al., (2008) relataram que o exercício físico pode atuar todos os
estágios da carcinogênese. Dessa forma, o exercício pode alterar o processo de iniciação
tumoral por favorecer as vias de detoxicação dos carcinógenos através do aumento dos
níveis de citocromo P450. De forma similar, os mesmos autores destacaram o aspecto
preventivo envolvidos nas fases de promoção e progressão tumoral pelo efeito de remoção
de radicais livres, controle da proliferação celular e dos níveis de apoptose, aumento da
função imune e supressão da angiogênese.
Modelos experimentais e clínicos se tornaram ferramentas eficazes no
entendimento das vias de atuação do exercício físico no controle das etapas da
carcinogênese. Logo, DEMARZO et al., (2008) observaram que sessões regulares de
natação modularam os níveis do marcador de proliferação celular (PCNA) e de COX-2 em
animais expostos ao DMH. FUKU et al. (2007) correlacionaram quatro semanas de
atividade aeróbia moderada em ratos ao menor de FCA e Criptas aberrantes nos animais
treinados. CAMPBELL et al. (2007) relataram diminuição nos níveis das proteínas anti-
apoptóticas de Bcl-2 e aumento das proteínas pró-apoptóticas Bax em homens envolvidos
em um programa de 12 meses de exercício regular, ainda que contraditórios os efeitos
entre gêneros no estudo. Ainda que convincentes as pesquisas que fortalecem o aspecto
benéfico do exercício na modulação tumoral tanto em animais quanto humanos, a interação
19
biológica dos mecanismos de controle interno do organismo como o ritmo circadiano e o
exercício físico no desenvolvimento tumoral permanecem incertos.
3. Biologia da Glândula Pineal
A glândula pineal é um pequeno órgão localizado na linha média do cérebro acima
do terceiro ventrículo e responsável por sintetizar e secretar o hormônio melatonina,
principal composto biologicamente ativo desta glândula, que comunica ao organismo as
condições ambientais de luz e modula várias funções orgânicas (MACCHI & BRUCE,
2004).
Em mamíferos, o ritmo circadiano é endogenamente controlado pelas informações
circadianas primárias captadas pelo núcleo supra-quiasmático que também controlam a
redução dramática na produção de melatonina pela glândula pineal quando a luz é
fornecida durante a noite (JASSER et al., 2006). As informações sobre a luz ambiental são
detectadas intrinsecamente por células ganglionares fotossensíveis da retina cujas
informações projetam-se para o núcleo supra-quiasmático, via trato retino-hipotalâmico. O
glutamato liberado por este trato sinaliza, em partes, as informações foto-dependentes para
o núcleo supra-quiasmático ativando os receptores seletivos N-metil-d-aspartato (NMDA)
para o glutamato e os não NMDA glutamato (COLWELL et al., 1991; PAUL et al., 2003).
A exposição à luz por períodos não usuais sinaliza para o sistema nervoso central
que responde e interpreta o sinal luminoso como dia e ajusta o organismo fisiológico de
acordo com o ritmo circadiano detectado. Logo, essa desregulação circadiana está
associada à inibição da glândula pineal e à subsequente supressão fisiológica da melatonina
noturna, a qual pode manifestar ao longo do tempo, como um desequilíbrio no controle
20
adaptativo de diversas funções orgânicas, destacando-se dentre elas, uma elevação das
taxas de iniciação e progressão tumoral (REITER et al., 2007).
3.1 Glândula Pineal, Melatonina e Carcinogênese
As primeiras correlações entre a glândula pineal e câncer datam do final de século
XIX evidenciadas através da utilização de extratos de pineal para pacientes portadores de
câncer (REITER, 1995). Estudos indicavam ainda que a melatonina teria uma ação
predominantemente oncostática, sendo assim, alguns autores passaram a estudar o seu uso
como adjuvante na terapia oncológica (COLEMAN & REITER, 1992).
A ação oncostática da melatonina em tumores de cólon pode estar correlacionada
com receptores de membrana MT1 e MT2 pertencentes à superfamília da proteína G de
alta afinidade para melatonina (KARASEK et al., 2002). STEBELOVA et al. (2010)
observaram que o tecido colônico expressa os maiores níveis de receptores MT2 do trato
gastrointestinal, sugerindo uma importante ação da melatonina nesse órgão. A expressão
dos receptores de melatonina sobre a variabilidade de luz foi estudada por MASSON-
PEVET et al. (2000) ao observar que a exposição à luz noturna aumenta a expressão e a
afinidade dos receptores de melatonina em ratos. No cólon, todavia, a modulação dos
receptores parece não ser alterada pela variação do ritmo circadiano (STEBELOVA et
al.,2010; SOTAK et al., 2006). Contudo, a influência do exercício físico ou do
carcinógeno DMH sobre a expressão dos receptores de melatonina no tecido colônico
permanece incerta.
Além da glândula pineal, outros órgãos são capazes de sintetizar a melatonina. O
trato gastrointestinal, entretanto, veicula a produção de melatonina de forma independente
21
do ritmo circadiano (BUBENIK, 2008). Diferença na via de atuação também pode ser
encontrada, enquanto a melatonina produzida pela glândula pineal possui um efeito
endócrino, a de origem extra-pineal desempenha um efeito não só endócrino, como
também, autócrino, parácrino e luminal (HUETHER et al., 1992). Especula-se que a
melatonina gerada localmente é consumida pelos tecidos como uma forma de proteção
contra estresse oxidativo, especialmente no trato gastrointestinal e na pele. (REITER et al.,
2002).
O papel da glândula pineal sobre o controle proliferativo intestinal foi estudado
previamente por CALLAGHAN (1997) ao observar um efeito hiperproliferativo no tecido
colônico de animais expostos a pinealectomia cirúrgica. De forma similar, DALIO et al.,
(2006) exploraram os efeitos da pinealectomia sobre o índice mitótico intestinal de ratos.
Os autores associaram o aumento do índice mitótico a um efeito somatório da diminuição
dos níveis de melatonina plasmática e do possível prejuízo do controle hipotalâmico sobre
a taxa proliferativa das criptas colônicas, como sendo vias de ação mediada pela glândula
pineal (DALIO et al., 2006).
ANISIMOV et al., (1999) demonstraram experimentalmente o efeito lesivo da
inibição da melatonina pela pinealectomia cirúrgica na carcinogênese experimental de
câncer de cólon, manifestado pelo aumento de proliferação de criptas de ratos tratados com
DMH. De forma complementar, a utilização da luz como variável foi estudada na
carcinogênese de cólon por PANCHENKO et al. (2008). Tais autores encontraram um
aumento da diferenciação celular e da taxa proliferativa resultando em um aumento
significativo de tumores por animal.
HAUS (2007) observaram que a inibição de melatonina central pela pinealectomia
ou pela exposição à luz constante foi um fator determinante para perda do controle
22
proliferativo. No entanto, há poucos relatos na literatura disponíveis para o entendimento
entre a perda do controle da glândula pineal e o desenvolvimento de neoplasia colônica em
animais submetidos ao exercício físico, conhecido agente modulador das funções orgânicas
e neoplásicas.
3.2 Exercício Físico, Glândula Pineal e Ritmo Circadiano
ATIKNSON et al. (2007) relatam que o período fótico de claro-escuro são potentes
reguladores do ritmo circadiano na maioria dos mamíferos incluindo os humanos. Paralelo
ao estímulo fótico, o exercício físico tem apresentado forte influência sincronizadora ao
ritmo circadiano de roedores de forma dependente do horário da sessão/ões, da intensidade
e das condições da luz do ambiente (CAMBRAS et al., 2000). Entretanto, em ambientes
não laboratoriais, as respostas mostraram-se mais conflitantes (MIYAZAKI et al., 2001)
Em mamíferos, a capacidade fotorreceptora da glândula pineal apresenta uma maior
dependência da função neuroendócrina por estar sob o controle do sistema nervoso central,
através de projeções da retina para estruturas do núcleo supraquiasmático do hipotálamo,
bem como da inervação simpática periférica até atingir a pineal (SCHNEIDER et
al.,1981). O principal neurotransmissor dessas terminações simpáticas é a noradrenalina
que estimula a cascata de síntese de melatonina através de interações com os
adrenoceptores β e α, presentes na membrana dos pinealócitos.
Esse controle noradrenérgico simpático sobre a pineal varia circadianamente, sendo
que, na transição do claro para o escuro, a densidade e afinidade dos receptores β
1
adrenérgicos são máximos (GONZALES-BRITO et al., 1988). Encontram-se ainda
adrenoceptores do tipo α1 que são potencializadores da estimulação β-adrenérgica, mas
23
que não apresentam variação circadiana (LOPES, 2009). Tais características fisiológicas da
pineal reforçam a influência da luz sobre a regulação dos estímulos simpáticos
desencadeados pelos fatores externos reguladores como o exercício físico.
Intensidades de exercício maiores que 50% do VO
2pico
por períodos maiores que 20
minutos estimulam o eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (ATKINSON et al., 2007).
Segundo os autores, é possível que o exercício mais intenso exerça uma modulação
positiva aguda sobre os níveis de melatonina plasmática, via estimulação noradrenérgica da
glândula pineal, uma vez que os adrenoceptores β e α são encontrados na glândula pineal e
estes respondem aos estímulos da noradrenalina. As investigações sobre a intensidade e
duração das sessões de exercício e sua influência na liberação de adrenalina/noradrenalina
permanecem sob intensa pesquisa, em contrapartida, o controle minucioso das condições
de luz parece irrefutável nas pesquisas com exercício e ritmo circadiano.
MISTLBERGER et al. (2003) descreveram uma curva de fase-resposta do exercício
de aproximadamente 12 horas após início de liberação do hormônio de forma dependente
das condições de luz do ambiente Para testar a hipótese da interferência de luz sobre os
ajustes mediados pelo exercício, EDWARDS et al. (2002) realizaram sessões de exercício
em diferentes horas do dia e da noite em humanos por aproximadamente uma hora, a 70%
do VO
2
pico, não encontrando diferenças no ritmo de secreção de melatonina. Na tentativa
de excluir a interferência dos efeitos da luz artificial do ambiente de estudo, BARGER et
al. (2004) realizaram um protocolo semelhante com o cuidado de reduzir a luz artificial
quando o exercício era realizado a noite, encontrando um atraso na curva secretória de
melatonina mais prolongada que o estudo anterior.
Os efeitos do exercício físico sobre a mudança do ritmo circadiano em humanos tem
se baseado na forma da curva de secreção de melatonina típica da sincronização
24
sono/vigília (BUXTON et al., 2003). Dados referentes ao horário de realização do
exercício suportam que o mesmo realizado no período diurno, pode adiantar o ritmo
secretório de melatonina, ao passo que, quando realizado nos períodos noturnos podem
atrasar e estender o ritmo de secreção hormonal pela pineal no período da manhã (BACK
et al., 2007). Curva esta semelhante aos dados obtidos com outras espécies de mamíferos
(MISTLBERGER & SKENE, 2004). Atrasos e adiantamentos do ritmo secretório de
melatonina permitem o ajuste do organismo às mudanças regulares do ambiente,
melhorando a qualidade do sono, níveis de alerta e humor.
Há evidências de que indivíduos fisicamente ativos apresentem menos efeitos adversos
de fuso horário e uma ressincronização mais rápida do ritmo circadiano do que indivíduos
sedentários (REILLY, et al.,2001). Ainda que, o exercício físico possa atuar como fator de
ressincronização circadiana em humanos, as pesquisas esbarram em alguns parâmetros
metodológicos de forte influência sobre a glândula pineal como as condições de luz do
experimento, fatores motivacionais e nutricionais que interferem na purificação da
pesquisa (ATKINSON et al., 2007).
Estudos laboratoriais conduzidos nos últimos 15 anos com diferentes espécies de
roedores fortalecem o efeito do exercício como um modulador não-fótico do ritmo
circadiano (REDLIN & MROSOVKKY, 1997). Há evidências de que os mecanismos de
ajustes em roedores envolvam informações aferentes do estado de repouso-atividade do
núcleo geniculado lateral. Sinais serotonérgicos e adrenérgicos do sistema circadiano do
núcleo médio da rafe e o do lócus cerúleos, respectivamente, são relacionados aos efeitos
do exercício no ciclo circadiano em roedores (ATKINSON et al, 2007). MARCHANT et
al. (1997), após lesarem essas estruturas neurais de ratos cegos, tentaram a sincronização
do ritmo circadiano pelo exercício físico observando que os animais não apresentaram essa
25
sincronização, alertando para importância dessas vias na sincronização não fótica pelo
exercício físico. Contudo, pouco se sabe o quanto esses sinais neurais estariam envolvidos
no seres humanos, uma vez que o exercício desencadeia inúmeras respostas biológicas nos
organismos.
Por fim, conclui-se que pesquisas que envolvam o exercício físico como estímulo não
fótico de regulação circadiana apresenta limitações metodológicas que dificultam a
interpretação dos dados. Algumas espécies de roedores parecem responder melhor aos
estímulos do exercício físico do que os humanos, além disso, variáveis intrínsecas do
exercício como intensidade, duração e horário de sua realização, bem como, a interferência
da luz como fator limitante dos ajustes circadianos carecem de maior padronização.
4. JUSTIFICATIVA
O exercício físico é capaz de inibir parcialmente a carcinogênese colônica, por
mecanismos ainda não completamente elucidados, e atuar como um agente não fótico de
regulação circadiana. Sabe-se que a ação da glândula pineal é importante para que ocorram
os efeitos de controle da proliferação intestinal, mas é desconhecido um eventual papel da
glândula pineal na modulação do exercício físico sobre a carcinogênese colônica, motivo
pelo qual propomos este trabalho.
26
5. OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de um programa regular de exercício
físico em ratos submetidos à luz contínua sobre a carcinogênese colônica induzida
quimicamente por DMH. Para tal, foi investigado sua relação com biomarcadores precoces
do câncer de cólon expressos pelo FCAs, PCNAe Caspase-3 e de seu receptor de
melatonina no cólon além da dosagem dos marcadores de hepáticos de estresse oxidativo
(MDA e GSH).
27
6. MATERIAL E MÉTODOS
6.1 Animais
Foram requisitados 64 ratos Wistar, machos, de aproximadamente 180±20 g ao
início do experimento. Os animais foram provenientes do Biotério Central da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo (FMRP-USP) e mantidos no
biotério do Departamento de Patologia, em condições de temperatura constante (25°C).
Alimentação ocorreu com dieta padrão Purina® para ratos com a composição aproximada
(g/100g): Proteína 21,0; gordura 3,5; carboidratos 60,0; sais 5,3; complexo vitamínico 2,0
com valor energético de aproximadamente 3,5 kcal/g. Água de torneira ad libitum. Os
animais foram acomodados em número de quatro por caixa e o projeto foi aprovado pela
Comissão de Ética em Experimentação Animal da FMRP-USP (protocolo n° 141/2008 –
Anexo).
6.2 Delineamento Experimental
Os animais foram divididos em oito grupos, constituídos por oito animais/grupo.
Quatro grupos foram subdivididos em Controle (C); Luz (L); Exercício (E) e Exercício +
Luz (LE). Os 4 grupos restantes foram igualmente subdivididos em controle; luz; exercício
e exercício+ luz, porém com associação do carcinógeno 1,2-dimetilhidrazina (DMH),
caracterizada pela letra “D”.
28
FIGURA 3: Esquema dos grupos experimentais
Figura 3: C (Controle); L (luz); E (Exercício); LE (Luz e Exercício); D (DMH); LD (Luz e DMH); ED
(Exercício e DMH); LED (Luz, Exercício e DMH); * Período de Exposição ao DMH; ( ); Período de
Exercício; S (Semanas) ; ( ) Luz Contínua
.
Os grupos “L” foram submetidos ao protocolo de luz contínua. A luz contínua tem
por finalidade simular uma pinealectomia fisiológica; suprimindo a produção/liberação
noturna de melatonina de forma similar à pinealectomia cirúrgica em animais (PRATA
LIMA et al., 2004) e humanos (HATONEN et al., 1999). A iluminação artificial da sala do
experimento foi realizada com a utilização de 3 lâmpadas fluorescentes frias (120-cm, 32-
W) por sala, segundo protocolo de DAUCHY et al. (1999).
6.3 Aplicação do Carcinógeno
A solução de 1,2-dimetilhidrazina (Sigma Co) foi preparada no momento da sua
aplicação. O preparo da solução, bem como a sua administração, foi realizado com
equipamentos de proteção individual (aventais, luvas, óculos de proteção e máscaras contra
29
gases). Todos os animais do grupo “D” receberam injeção intra-peritoneal de DMH na
concentração de 40 mg/Kg, duas vezes por semana durante as duas primeiras semanas
(RODRIGUES et al., 2002).
6.4 Treinamento
A modalidade de exercício escolhida foi a natação, realizada em recipientes
plásticos de aproximadamente 60 cm de largura, 65 cm de altura e 100 cm de
comprimento, a uma temperatura mantida à (33 ±1°C).
Os animais dos grupos exercícios (E, LE, ED e LED) foram submetidos ao
treinamento físico, 5 dias por semana durante 10 semanas sem adição de sobrepeso na
cauda dos animas, segundo o protocolo de VENDITTI & DI MEO (1996). As 10 semanas
de treinamento tiveram um caráter progressivo, sendo 20 minutos na primeira semana, com
acréscimo de 20 minutos nas semanas seguintes, até atingir 90 minutos na sexta semana,
mantendo-se este período até a décima semana.
6.5 Sacrifício dos Animais
No presente estudo, todos os animais foram sacrificados mediante imersão na
câmara de CO
2
segundo as normas da Comissão de Ética em Experimentação Animal da
FMRP-USP.
6.6 Coleta e processamento do material
Após a eutanásia, o sangue foi retirado por punção cardíaca, coletado através dos
tubos BD vacutainer SST II Advance® amarelo de 5,0ml. Um ml foi centrifugado a 1500
30
RPM por 15 minutos a 4°C. O soro foi pipetado e armazenado em tubos de ependorfs e
congelado em freezer a uma temperatura de -20°C.
O cólon foi retirado e lavado com solução salina. A peça foi aberta
longitudinalmente pela borda mesentérica. Em seguida, o cólon foi estendido entre duas
placas de papelão com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e imerso
em formol neutro tamponado a 10% durante ao menos vinte e quatro horas. Após esse
período, os tecidos foram retirados da formol e recortados. O processamento histológico
envolveu inicialmente o processo de desidratação através de banhos de imersão em alcoóis
de concentrações crescentes e de tempo pré-determinado (70%, 80%, 90% e 100%).
Posteriormente para a diafanização, os tecidos foram submersos em 3 banhos de xilol por
aproximadamente 1 hora e 20 minutos ao total. Em seguida, as amostras foram embebidas
em banho de parafina liquida a uma temperatura de 60°C, por um período de 4 horas,
seguindo-se então a inclusão do tecido em blocos de parafina. As amostras foram incluídas
horizontalmente com a mucosa para baixo e verticalmente para a obtenção de cortes
longitudinais e transversais, respectivamente. Os blocos foram cortados em micrótomo
para a obtenção de cortes histológicos com 5 µm de espessura e estendidos em lâminas
previamente silanizadas a 4%.
Para montagem das lâminas utilizou-se Entelan (Merck & Co. Inc, AS). As lâminas
foram coradas pelo método de Hematoxilina-eosina (H&E) através de banho de imersão
em Hematoxilina de Harris por 3 minutos e contra coradas com a solução de Eosina
Floxina alcoólica por 30 segundos.
31
6.7 Focos de Cripta Aberrante (FCAs)
Foi realizada análise microscópica da mucosa da porção distal do cólon através do
método de coloração de H&E, utilizando-se microscópio óptico com aumento de 40x para
identificação e quantificação dos FCAs, sendo seu resultado expresso por unidade de área
em cm
2
(BIRD et al.,1987).
6.8 Imuno-histoquímica
As lâminas desparafinadas e hidratadas passaram por um processo de recuperação
antigênica através de incubação em panela a vapor em meio tamponado por 40 minutos
com tampão citrato com pH 6.0. Após resfriamento do material, as peroxidases teciduais
endógenas foram removidas pela adição do peróxido de hidrogênio, e ligações
inespecíficas de anticorpo primário foram evitadas por adição de soro de cavalo na
proporção de 1:50. Aplicou-se o anticorpo primário por duas horas e realizou-se a lavagem
com PBS com pH 7.4. Em seguida, as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário
por 30 minutos, seguindo para o polímero conjugado (Kit PicTureTM MAX Polymer
ZYMED
®
Laboratories) também por 30 minutos e corou-se com DAB por 1 minuto. Os
anticorpos primários utilizados foram: PCNA (Novocastra ®, Novocastra Laboratories
Ltd,UK, clone PC10) em diluição de 1:100; COX-2 (Novocastra ®, Novocastra
Laboratories Ltd,UK, clone 4H12) em diluição de 1:200; Caspase-3 (Novocastra ®
Novocastra Laboratories Ltd,UK, clone JHM62) em diluição de 1:300 e Receptor de
melatonina(MBL international Corporation ® LS-A6618) em diluição de 1:100,
incubados por 12 horas (overnight) em câmara úmida. A imunoreatividade foi considerada
positiva quando detectada coloração no citoplasma das células para marcação de Caspase-
32
3, COX-2 e receptor de melatonina e no núcleo celular para marcação de PCNA. No caso
da marcação estromal, o índice foi obtido pela relação dos espaços intercriptal pelo número
de células fortemente coradas e o índice de marcação epitelial foi determinado pela relação
entre o número total de células e o número de células fortemente coradas ao longo de cada
cripta.
6.9 Análises Bioquímicas
Glutationa reduzida (GSH): A dosagem de GSH foi realizada de acordo com
método descrito por SEDLAK & LINDSAY (1968). Duzentos miligramas de fígado foram
homogeneizados em um Potter com 8 mL de tampão EDTA (0,02M), sob gelo. Deste
homogeneizado, 5 ml foram retirados a 4 mL de água deionizada e 1mL de ácido
tricloroacético (TCA) 50%. Após 15 minutos de espera, agitando ocasionalmente, o tubo
foi centrifugado por 15 minutos a 400 rpm. Do sobrenadante resultante, foram retirados 2
mL e a estes foram adicionados 4 mL de tampão TRIS 0,4M (pH =4,8) e 0,1mL de DTNB
0,01M em metanol. A leitura foi feita no comprimento de onda de 412 nm, 5 minutos após
adição do DTNB, tendo como parâmetro de comparação a cor do EDTA 0,02M, no lugar
do sobrenadante. A concentração de GSH foi calculada baseando-se em curva padrão de
GSH em EDTA 0,02M. Os resultados finais foram expressos em (nmols GSH/mg PT).
Para a determinação de proteína no fígado foi realizada pelo método de LOWRY et
al., (1951) e consistiu em adicionar a 50µL de amostra 150 µL de água e 1mL do reativo
A+B+C. Após o repouso por 10 minutos, foi adicionado 100 µL de Folin (1:1 água).
Repousou-se 30 minutos e a leitura foi realizada a 750. A concentração foi calculada por
meio de uma curva padrão montada a par a partir de 3 diferentes concentrações de
albumina sérica bovina (0.05mg/mL; 0.1mg/mL; 0.2mg/mL).
33
Malonaldeído (MDA): A peroxidação lipídica no fígado foi determinada segundo
método descrito por MIHARA & UCHIYAMA (1978) que consiste na reação do
malonaldeído com o ácido tiobarbitúrico em meio ácido e sob aquecimento por 30 minutos
a 100ºC. Os reagentes utilizados nesta análise foram: solução TCA-TBA-HCl, ou seja,
15% p/v de ácido tricloroacético, 0,375% p/v de ácido tiobarbitúrico em 0,25 N de ácido
clorídrico. Foram homogenizados 100 mg de tecido hepático em 1 mL de KCl 1,15%.
Combinaram-se 1,0 mL deste homogenato com 2,0 mL do reagente TCA-TBA-HCL e
agitou-se bem (em vortex). A solução foi aquecida por 15 min em água fervente (100°C).
Após esfriar, a solução foi centrifugada por 10 min a 10000 RPM, sendo recolhido o
sobrenadante. A absorbância da amostra foi determinada a 535 nm contra um branco. A
concentração de TBARS da amostra foi calculada usando uma curva de calibração de
malonaldeído (MDA).
6.10 Análise dos resultados
Os resultados foram submetidos à analise estatística utilizando o software Graph
Pad Prism 5.1 (San Diego, Califórnia). Foi utilizado o teste de Kolgomorov-Smirnov para
identificar o padrão de normalidade das amostras. Para verificar as diferenças entre as
médias dos grupos para cada variável foi utilizada a Análise de variância em uma via
(One-Way) e em duas vias (Two-Way). Pós-teste de Tukey´s Multiple Comparison para as
amostras One-Way paramétricas e pós teste de Bonferroni para as amostras Two-Way,
considerando um nível de significância de 0.05 e a média foi dada ± erro padrão da média.
34
7. RESULTADOS
7.1 Peso dos animais
A análise de variância aplicada na média de ganho de peso entre o peso inicial e
final dos grupos experimentais revelou que o exercício físico reduziu de forma
significativa o ganho de peso do grupo E e LE em comparação ao seu controle C (p<0.05).
O mesmo não pode ser observado nos grupos expostos ao DMH.
FIGURA 4: influência da Luz Contínua, exercício físico e DMH sobre o ganho de
peso
C
D
0
100
200
300
400
500
C
L
E
LE
*
**
Ganho de Peso (g)
Figura 4: C (controle); L (luz); E (Exercício); LE (luz e Exercício); D (DMH); LD (luz e DMH); ED
(Exercício e DMH); LED (luz , Exercício e DMH). Valores Expressos em média ± EPM., * p<0.001
representa diferença significativa do grupo C com os grupos E e LE) ** p<0.05 representa diferença
significativa do grupo L com os grupos E e LE.
7.2 Biomarcadores de estresse oxidativo
Os valores de peroxidação lipídica (MDA) e da enzima antioxidante GSH
revelaram resultados estatisticamente significativos para os grupos Exercício (E e EL) em
comparação ao seus controles (C e L). Na mesma comparação entre os grupos com DMH,
não foi encontrado diferença estatística. No entanto, pode-se observar que o tratamento
35
com DMH foi determinante para uma diminuição nos valores de MDA (p<0.001) bem
como um aumento da expressão hepática de GSH (p<0.001) se comparado ao bloco do
grupo sem aplicação de carcinógeno, evidenciado através figuras 5 e 6.
FIGURA 5: Influência da Luz Contínua, exercício físico e DMH sobre os níveis
hepáticos de GSH
C
D
0
20
40
60
80
C
L
E
LE
*,**
*,**
GSH ( nmol/ mg prot)
Figura 5: C (controle); L (luz); E (Exercício); LE (luz e Exercício); D (DMH); LD (luz e DMH);
ED(Exercício e DMH); LED (luz, Exercício e DMH). Valores Expressos em média ± EPM., * p<0.05
representa diferença significativa dos grupos C e L com o grupo LE; ** p<0.01 representa diferença
significativa dos grupos C e L com o grupo E.
FIGURA 6: Influência da Luz Contínua, exercício físico e DMH sobre os níveis
hepáticos de MDA
36
C
D
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
C
L
E
LE
*
*,**
MDA ( nmol/mg prot)
Figura 6: C (controle); L (luz); E (Exercício); LE (luz e Exercício); D (DMH); LD (luz e DMH);
ED(Exercício e DMH); LED (luz, Exercício e DMH). Valores Expressos em média ± EPM.; * p<0.01
representa diferença significativa dos grupos C e L com os grupos E e LE; ** p<0.05 representa
diferença significativa do grupo L com o grupo C.
7.3 Índice de Proliferaçao celular (i-PCNA) nas celulas epiteliais colônicas
Foi observado que a admistração do carcinógeno químico elevou o índice de
proliferação epitelial colônica demonstrado pela marcação positiva de PCNA, marcação
esta amenizada nos grupos que não tiveram exposição ao DMH . Destaca-se ainda que o
exercício físico manifesta uma resposta proliferativa de forma dependente do ritmo normal
ou alterado da glândula pineal. Se por um lado, o grupo ED demonstrou uma atenuação,
embora não significativa (p>0.05), do índice de proliferação celular em relação ao seu
controle D. Por outro lado, o grupo LED demonstrou um efeito reverso, ou seja, um
aumento estatisticamente significativo (p<0.001) do índice de proliferação colônico se
comparado aos demais grupos expostos ao DMH.
37
FIGURA 7: Influência da Luz Contínua, exercício físico e DMH sobre os índices de
proliferação celular do cólon (Li-PCNA)
C
D
0.0
0.1
0.2
0.3
C
L
E
LE
*
**,
#
iPCNA
Figura 7: C (controle); L (luz); E (Exercício); LE (luz e Exercício); D (DMH); LD (luz e DMH);
ED(Exercício e DMH); LED (luz, Exercício e DMH). Valores Expressos em média ± EPM., * P<0.001
representa diferença significativa entre o grupo LD com os grupo E, p<0.05; ** representa diferença
significativa entre os grupos LED com o grupo LD, p<0.05; # representa diferença significativa entre
os grupos LED e os grupos D e ED, p<0.001.
7.4 Índice de ciclooxigenase 2 (COX-2) no estroma colônico
A expressão estromal de COX-2 revelou que o carcinógeno químico favoreceu a
expressão da enzima observado pelo aumento dos grupos D. Observa-se também que a
exposição a luz contínua nesse grupo, LD e LED, atuou como um fator favorecedor do
aumento da mesma. Sobretudo, a associação do exercício físico nas condições de luz
contínua favoreceram a maior expressão de COX-2 no grupo LED se comparado ao seu
equivalente sedentário LD, p<0.05.
De forma contrária, o exercício fisico realizado em condiçoes normais de ritmo
circadiano exerceu um efeito modulador em sua expressão conforme observado no grupo
ED
38
FIGURA 8: Índice da expressão de COX-2 no estroma colônico
0
2
4
6
C
L
E
LE
*
#, ##
C D
a, aa
i-COX2
Figura 8: C (controle); L (luz); E (Exercício); LE (luz e Exercício); D (DMH); LD (luz e DMH); ED
(Exercício e DMH); LED (luz, Exercício e DMH). Valores Expressos em média ± EPM., * p<0.01
representa diferença significativa do grupo L com os grupos C, E e LE; # p<0.05 representa diferença
significativa do grupo LD com o grupo D; ## p<0.001 representa diferença significativa do grupo LD
com o grupo ED;
α
p<0.001 representa diferença significativa do grupo LED com os grupos D e ED;
αα
p<0.05 representa diferença significativa do grupo LED com o grupo LD.
7.5 Índice de apoptose do cólon pela Caspase-3 no estroma colônico
A análise estromal do cólon revelou que a administração do DMH estimulou de
forma significativa a apoptose das células da região estromal do cólon. Um aumento
adicional foi observado quando esses grupos foram expostos a outras estímulos como a luz
contínua ou ao exercício físico, grupo LD e ED. No entanto, a realização do exercício
físico em condição de luz contínua reduziu a expressão de Caspase-3 observado no grupo
LED.
39
FIGURA 9: índice de apoptose estromal dosado pela expressãode Caspase-3
C
D
0
2
4
6
C
L
E
LE
*
**, ***
#
#
i-caspase-3
a
Figura 9: C (controle); L (luz); E (Exercício); LE (luz e Exercício); D (DMH); LD (luz e DMH);
ED(Exercício e DMH); LED (luz, Exercício e DMH). Valores Expressos em média ± EPM., * p<0.001
representa diferença significativa do grupo C com seus respectivos grupos; **p <0.001 representa
diferença significativa do grupo L com o grupo E; *** p<0.05 representa diferença significativa do
grupo L com o grupo LE;
α
p<0.001 representa diferença significativa do grupo D com seus respectivos
grupos; # p<0.01 representa diferença significativa dos grupos LD e ED com o grupo LED.
7.6 Focos de criptas aberrantes (FCAs)
O estudo histopatológico dos FCAs foi realizado em todos os grupos que receberam o
carcinógeno químico DMH. Dessa forma, encontrou-se um aumento significativo
(p<0.001) do grupo exposto a luz contínua (LD) em contraste a uma significativa redução
(p<0.001) do grupo exercício (ED), se comparados ao controle (C). Contudo, evidenciou-
se que em situações onde a funcionalidade da glândula pineal está alterada, como na
exposição a luz contínua, a influência do exercicio fisico é prejudicada, demonstrado pelo
aumento significativo dos FCAs.
40
FIGURA 10: Número de focos de criptas aberrantes nos grupos com DMH
D
LD
ED
LED
0
10
20
30
40
50
***
**
*
FCAs/cm²
Figura 10: C (controle); L (luz); E (Exercício); LE (luz e Exercício); D (DMH); LD (luz e DMH); ED
(Exercício e DMH); LED (luz, Exercício e DMH). Valores média ± EPM., * p<0.001 representa
diferença significativa entre o grupo D os grupos LD, ED e LED; ** p<0.001 representa diferença
significativa entre o grupo LD e os grupos ED e LED; *** p<0.001 representa diferença significativa
entre os grupo LED e o grupo ED.
7.7 Índice de Receptores de melatonina no cólon
A expressão dos receptores mostrou forte influência dos grupos exercícios
realizados em condições de ritmo circadiano e normal (E e ED) e uma inadaptação do
mesmo em condições de luz contínua.
41
FIGURA 11. Expressão estromal de receptores de melatonina no cólon
C
D
0
1
2
3
4
C
L
E
LE
*
#
**
##
I-receptor de melatonina
Figure 11: C (controle); L (luz); E (Exercício); LE (luz e Exercício); D (DMH); LD (luz e DMH); ED
(Exercício e DMH); LED (luz, Exercício e DMH). Valores Expressos em média ± EPM.; * p<0.01
representa diferença estatística do grupo C e os grupos E e LE; ** p<0.001 representa diferença
estatística do grupo L e o grupo E; # p<0.05 representa diferença estatística do grupo D e o grupo ED;
## p<0.01 representa diferença estatística do grupo ED e o grupo LED.
42
FIGURA 12: Fotomicrografias de imuno-histoquímica dos biomarcadores colônicos
43
8. DISCUSSÃO
A utilização do exercício físico como intervenção terapêutica não farmacológica
contra diversas doenças crônicas tem se tornado alvo de intensa pesquisa. Sabe-se que o
mesmo realizado de forma regular e de intensidade moderada a vigorosa apresenta efeitos
moduladores sobre o câncer de cólon e no controle endógeno do ritmo circadiano sob a
ação da glândula pineal. Logo, o principal objetivo desse estudo foi investigar a influência
da desregulação da glândula pineal sobre os efeitos do exercício físico na carcinogênese de
cólon. Nesse sentido, evidenciou-se que a exposição dos animais à luz contínua
desempenhou um papel fundamental na reversão dos efeitos anti-carcinogênicos do
exercício físico.
No presente estudo, a exposição à luz contínua apresentou-se como um fator crítico
para o aumento dos FCAs nos grupos LD e LED (p<0.001) se comparados ao grupo D. A
relevância dos fatores externos sobre a modulação da pineal tornou-se ainda mais evidente
no grupo submetido ao exercício associado à luz contínua (LED>LD>D=p<0.001), figura
10. Resultados similares foram encontrados por PANCHENKO et al. (2008) ao evidenciar
que a exposição à luz por períodos, além do ritmo circadiano normal, aumentou o número
de tumores colônicos, níveis de diferenciação e da taxa proliferativa nos animais
empregados no estudo.
CALLAGHAN (1995) relatou o importante controle proliferativo exercido pela
glândula pineal sobre as criptas intestinais, além disso, foi observado pelo autor que a
inibição da pineal em adição a um carcinógeno se manifesta de forma crônica e de forte
influência sobre a malignidade do tumor colônico e a expectativa de vida do animal.
Dentre os marcadores de detecção precoce do câncer de cólon, os FCAs e o PCNA são
44
considerados altamente preditivos na transformação morfológica e proliferativa da mucosa
colônica de animais tratados com DMH (LEE & LIM, 2009). De fato, nossos dados
apresentaram correlação positiva entre os índices de PCNA e os FCAs nos grupos expostos
à luz e ao DMH.
É amplamente aceito na literatura que o desbalanço entre os níveis de proliferação
celular, níveis inflamatórios e de apoptose configuram como o principal evento biológico
do processo de carcinogênese (MORI et al., 1999). Em relação ao controlo do perfil
inflamatório, foi descrito por DEMARZO et al. (2008) uma signficativa redução da COX-2
pelo exercicio fisico regular em animais expostos ao DMH. De forma similar, nosso grupo
ED apresentou similares reduções na COX-2 em relação ao grupo DMH sedentário. Fato
este que não ocorreu com o grupo LED. KATO et a.l (2002) observaram que animais
expostos a situações de estresse durante a fase claro do dia apresentaram maiores níveis de
prostaglandina E2 (PGE
2
) do que os mesmo em situação noturna. Sabendo-se que a PGE
2
está diretamente relacionada a COX-2 e que o grupo LED realizou exercício em luz
contínua, pode-se especular que o aumento da COX-2 seja devido a inadapatação do
animal frente ao desbalanço circadiano.
A importância da glândula pineal e de seu hormônio melatonina sobre o controle da
expressão de COX-2 no tecido colônico pôde ser observado por DONG et al. (2003) em
que o mecanismo de proteção da melatonina sobre as condiçoes inflamatórias do cólon
passam, de certa forma, pelo controle do aumento de COX-2. Nosso dados reportam que a
indução a luz contínua foi um fator favorecedor a expressão de COX-2 no grupo L se
comparado ao grupo controle C. Paralelamente, observa-se que os grupos expostos ao
DMH apresentaram o mesmo comportamento, ou seja, grupo LD e LED se apresentaram
estatisticamente maior em relação ao grupo de ritmo circadiano normal D.
45
Em relação ao perfil apoptótico, LEE & LIM (2009) observaram que células
colônicas expostas ao carcinógeno DMH apresentam uma maior expressão de caspase-3 e
que a maior expressão no ambiente estromal se correlacionava com um bom fator
prognóstico da doença. Em consonância, nossos resultados confirmaram a maior expressão
estromal de caspase-3 nos grupos expostos ao carcinógeno DMH se correlacionaram com
os baixos níveis de PCNA, sobretudo no grupo que realizou exercício físico em condições
normais do ritmo circadiano. A relação entre índices apotóticos e exercicio fisico foi
previmanente demostrado por CAMPBELL et al. (2007) ao correlacionar indidivíduos
portadores de câncer de cólon submetidos a um programa de 12 meses de exercício
apresentaram uma menor expressão de Bcl-2
próximo a região luminal dos homens
exercitados. Considerando a relação inversa entre os níveis de Bcl-2 e Caspase-3, pode
inferir que o exercicio físico atua como um agente favorecedor da apoptose colônica,
conforme observado em nossos grupos exercícios, sobretudo nas condições de ritmo
circadiano normal.
A exposição à luz convencional fluorescente foi considerado por TANAKA et al.
(2008) como um fator favorecedor da expressão de Caspase-3 das células intestinais de
ratos recém nascidos. Nosso estudo corrobora com esses dados no sentido que tanto o
grupo L como o grupo LD apresentaram um aumento significativo de Caspase-3
fortalecendo, neste caso, o efeito agressivo da luz sobre a carcinogênese de cólon.
Sessões regulares de exercício possuem forte evidência científica no combate as
fases iniciais de câncer de cólon (SAMAD et al., 2005; DEMARZO et al., 2008). Nossos
dados puderam confirmar esses efeitos ao apresentar uma significativa redução dos níveis
de FCAs, PCNA e COX-2 no grupo ED (p<0.001). Contudo, o mesmo não foi observado
no grupo LED. BORGES-SILVA et al. (2005b) documentam que importantes efeitos
46
adaptativos do exercício físico são atribuídos à funcionalidade da glândula pineal. Em
condições circadianas normais, a realização do exercício físico pode ser associada à
sincronização do ritmo circadiano seja em humanos (ATKINSON et al., 2007) ou animais
(DIAZ LOPEZ & COLMENERO URQUIJO, 2007). No entanto, o mesmo não ocorreu em
condições de exposição à luz (LAX et al., 1998). CAMBRAS et al. (2000) consideraram a
influência da duração do ciclo de luz, intensidade da mesma e o exercício físico, em ordem
decrescente de importância, como fatores que podem afetar a regulação do ritmo
circadiano e o comportamento da glândula pineal.
O peso corporal é frequentemente investigado em estudos com exercício físico
(WESTERLIND, 2003). ROGERS et al., (2008) consideram que não há relação
consistente entre os efeitos do exercício e o peso corporal sobre a carcinogênese. Dados do
presente estudo sobre o grupo DMH são consistentes com a teoria de que o treinamento
físico exerce efeitos positivos sobre o câncer de cólon por mecanismos independentes da
perda de peso corporal. Similarmente, a glândula pineal tem se mostrado como um fator
independente do ajuste desse parâmetro evidenciado pela pinealectomia (BORGES-
SILVA, et al., 2005a) ou pela luz contínua (MUSTONEN et al., 2002).
A supressão da síntese de melatonina noturna pela glândula pineal em resposta ao
estímulo de luz já está bem documentada na literatura (REITER et al., 2009). Em
humanos, mesmo a exposição a baixos níveis de luz artificial por lâmpadas incandescentes
durante a noite por 39 minutos foi suficiente para reduzir os níveis de melatonina em 50%
(SCHERNHAMMER & SCHULMEISTER, 2004). O exercício físico é considerado um
agente não fótico de regulação circadiana e modulador da curva secretória de melatonina.
A análise do receptor de melatonina no cólon mostrou que o exercício físico realizado em
condições normais de ritmo circadiano favoreceu a expressão de receptores de melatonina
47
nesse tecido, refletindo uma possível resposta modulatória benéfica ao tecido, reiterado
pela redução na expressão de biomarcadores do câncer de cólon.
MISTLBERGER et al. (2003) relatam que a variável luz exerce forte influência
sobre os efeitos modulatórios do exercício físico. Ainda que BUBENIK (1980) tenha
observado um baixo controle da glândula pineal sobre os níveis de melatonina intestinal, é
possível que a secreção da glândula pineal exerça alguma influência sobre os níveis de
melatonina no fluido intestinal (CALLAGHAN, 1997). De fato, quando as sessões de
exercício eram realizados em condições de luz constante, os animais não conseguiram
adaptar de forma significativa os níveis de receptores colônicos de melatonina como
observado no grupo LED.
Nossos resultados sobre a análise hepática revelaram que a exposição à luz contínua
não alterou os parâmetros oxidativos dosados ao passo que a administração de DMH
resultou em profundas alterações do mesmo. O nível de MDA, importante subproduto da
peroxidação lipídica, apresentou-se reduzido nos grupos expostos ao DMH, em contraste, a
enzima antioxidante glutationa reduzida (GSH) se apresentou aumentada nos mesmos
grupos (figura 5 e 6). Estudos prévios encontraram que tecidos malignos são menos
susceptíveis e mais resistentes ao ataque de radicais livres e, por conseguinte, a
peroxidação lipídica é menos intensa (SRIHARI et al., 2008). Embora não tenhamos
realizado o estudo oxidativo no cólon, a análise hepática dos grupos submetidos ao DMH
reforça esta teoria. De fato, radicais promutagênicos como o O
6
-MeG foram encontrados
no fígado 12 horas após a metabolização hepática do carcinógeno DMH sugerindo uma
alteração fenotípica deste órgão (SAMANTA et al.,2008).
PILLAI et al. (1999); MANJU & NALINI (2005) documentaram um baixo nível
de peroxidação associado à elevados níveis de glutationa em tecido colônico de animais
48
expostos ao DMH. Ainda que o DMH não seja considerado um carcinógeno hepático
direto, baixos níveis de câncer de fígado e aumento da proliferação celular hepática foram
associados à metabolização de carcinógenos indiretos como o DMH pelo fígado
(LAURIER et al., 1984).
Nosso estudo demonstrou que os parâmetros oxidativos hepáticos não sofreram
interferência significativa da desregulação do ritmo fisiológico da glândula pineal.
BAYDAS et al (2001) discute que a influência da luz constante sobre os marcadores de
estresse oxidativo parece ser órgão dependente. Os mesmos autores observaram que ratos
expostos a luz contínua apresentaram uma diminuição da GSH e consequente aumento de
MDA somente no tecido cerebral, contudo as análises hepáticas e renais permaneceram
inalteradas após 2 semanas de exposição a luz contínua. Em outro estudo BAYDAS et al.,
(2002) analisou o comportamento diário da GSH e do MDA em ratos submetidos à
pinealectomia. Foi observado que a atividade GSH hepática e os níveis de MDA nesse
mesmo órgão apresentaram um ritmo ao longo de 24 horas semelhante aos ratos normais,
com diferença significativa somente às 4 horas da manhã.
Ainda que a glutationa participe de várias reações no combate ao estresse oxidativo
hepático, DA SILVA et al., (2009) documentaram que as adaptações enzimáticas ao
exercício físico ocorrem pela supra expressão das enzimas Catalase (CAT) e Superóxido
Dismutase (SOD), ao passo que a expressão de GSH e redistribuída do fígado para o
sangue e o músculo esquelético justificando sua diminuição hepática pós treinamento
físico (KARANTH & JEEVARATNAM, 2005). De fato, nossos grupos exercício sem
DMH (E) e (LE) apresentaram uma redução significativa da GSH hepática após o período
de estudo.
49
9. CONCLUSÃO
O presente estudo demonstrou que a desregulação do ritmo circadiano promovida
pela exposição luz contínua parece comprometer de forma significativa os estímulos
adaptativos do exercício físico sobre o tecido colônico e dessa forma torná-lo mais
susceptível às substâncias cancerígenas como o DMH.
Os biomarcadores colônicos utilizados FCAs, PCNA, COX-2 e Caspase-3
mostraram-se eficazes para análise das etapas inicias da carcinogênese. Em conjunto,
pôde-se observar que o grupo LED apresentou o pior prognóstico de evolução do câncer de
cólon, uma vez que seus níveis de FCAs foram acompanhados pelo aumento do PCNA e
de COX-2 bem como uma diminuição da apoptose observada pela Caspase-3. No entanto,
o contrário foi observado no grupo ED.
Os efeitos da luz contínua e, sobretudo do exercício físico, mostraram-se
favorecedores da expressão estromal dos receptores de melatonina. Os níveis de estresse
oxidativo hepáticos analisados, MDA e GSH, mostraram-se dependentes, em especial, da
exposição ao carcinógeno DMH com pouca resposta ao exercício físico ou à luz contínua.
Dessa forma, o estudo alerta para a atividade da glândula pineal frente aos ajustes
sistêmicos do exercício físico em organismos expostos às substâncias cancerígenas ao
organismo.
50
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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