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Leonardo Pereira Franchi
Citotoxicidade e genotoxicidade de nanotubos de carbono purificados e
não purificados, sintetizados por deposição química de vapor, em
linhagem de fibroblastos de pulmão de hamster Chinês (V79)
Ribeirão Preto
2010
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção de título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração:Genética
Orientadora:
Profª. Dra. Catarina Satie Takahashi
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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Franchi, Leonardo Pereira
Citotoxicidade e genotoxicidade de nanotubos de carbono purificados
e não purificados, sintetizados por deposição química de vapor, em linhagem de
fibroblastos de pulmão de hamster Chinês (V79).
Ribeirão Preto, 2010. 75p.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto. Universidade de São Paulo.
Área de concentração: Genética.
Orientadora: Profª. Dra. Catarina Satie Takahashi
1. Citotoxicidade. 2. Genotoxicidade. 3. Nanotubos de carbono. 4. Ensaio
Cometa. 5. Teste do micronúcleo.
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Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro das seguintes entidades e
instituições:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
(FAEPA-HC/FMRP-USP)
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
(FMRP-USP)
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo (FFCLRP-USP)
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................................I
ABSTRACT..........................................................................................................................II
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................1
1.1 Nanociência, nanotecnologia e nanopartículas..............................................................1
1.2 Nanotoxicologia e Nanogenotoxicologia .......................................................................2
1.3 Nanotubos de carbono.....................................................................................................4
1.4 Métodos de síntese e purificação de nanotubos de carbono...........................................5
1.5 Nanotubos de carbono e penetração celular...................................................................8
1.6 Aplicações dos nanotubos de carbono...........................................................................10
1.7 Interações entre CNT e constituintes do meio de cultura.............................................13
1.8 Toxicidade de nanotubos de carbono............................................................................14
2. OBJETIVOS....................................................................................................................16
3. MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................17
3.1 Nantubos de carbono e substâncias químicas utilzadas...............................................17
3.1.1 Nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT)...............................17
3.1.2 Nanotubos de carbono do tipo “cup-stacked” (CSCNT)...............................18
3.1.3 Dispersão dos nanotubos de carbono.............................................................18
3.1.4 Controle positivo - Doxorrubicina (DXR)......................................................19
3.1.5 Controle negativo............................................................................................20
3.1.6 Citocalasina B..................................................................................................20
3.2 Cultura de células da linhagem V79.............................................................................20
3.3 Viabilidade celular.........................................................................................................21
3.4 Enaio clonogênico..........................................................................................................22
3.5 Ensaio Cometa................................................................................................................23
3.5.1 Ensaio Cometa para detecção de danos oxidativos........................................25
3.6 Teste do micronúcleo ....................................................................................................25
3.6.1 Índice de Divisão Nuclear (IDN)....................................................................28
3.7 Análise estatística dos dados..........................................................................................28
4. RESULTADOS................................................................................................................29
4.1 Viabilidade celular ........................................................................................................29
4.1.1 Efeito dose-resposta (Viabilidade celular).....................................................31
4.1.2 Valores de IC
50
(Viabilidade celular).............................................................31
4.2 Ensaio clonogênico........................................................................................................32
4.3 Concentrações testadas nos experimentos de genotoxicidade......................................35
4.4 Ensaio Cometa em V79..................................................................................................35
4.5 Teste do micronúcleo em células V79...........................................................................37
4.5.1 Índice de Divisão Nuclear (IDN)....................................................................37
4.5.2 Frequência de micronúcleos (MN).................................................................38
4.5.3 Frequência de pontes nucleoplasmáticas (PN)..............................................38
5. DISCUSSÃO....................................................................................................................40
5.1 Aspectos gerais...............................................................................................................40
5.2 Citotoxicidade de nanotubos de carbono.......................................................................41
5.2.1 Ensaios de viabilidade celular.........................................................................41
5.2.2 Ensaio clonogênico.........................................................................................45
5.3 Genotoxicidade de nanotubos de carbono.....................................................................46
5.3.1 Detecção de quebras de fita do DNA e danos oxidativos...............................47
5.3.2 Detecção de danos cromossômicos pelo teste de micronúcleo.......................48
5.4 Disposições finais...........................................................................................................50
6. CONCLUSÕES...............................................................................................................53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................62
ANEXO A (Gráficos de Viabilidade celular)....................................................................04
ANEXO B (Gráfico de Ensaio clonogênico).....................................................................10
ANEXO C (Gráfico de Índice de Divisão Nuclear).........................................................89
ANEXO D (Gráfico da Frequência de Micronúcleos).....................................................39
ANEXO E (Gráfico da Frequência de Pontes Nucleoplasmáticas)................................31
RESUMO
Muitas nanoestruturas vêm sendo desenvolvidas, e atualmente uma das áreas de
maior atividade é o estudo de nanotubos de carbono (CNT). Os CNT consistem
exclusivamente de átomos de carbono arranjados em uma série de anéis benzeno
condensados em uma estrutura tubular, com diâmetro em escala nanométrica. Existem
diferentes tipos de nanotubos, dentre eles podem-se destacar os: (i) nanotubos de carbono
de paredes múltiplas (MWCNT) e, (ii) nanotubos de carbono "cup-stacked" (CSCNT),
ainda pouco estudados, que consistem de múltiplas camadas de grafeno arranjados em
forma de cone, as quais exibem pontas abertas em sua superfície externa e um canal central
vazio. Muitas aplicações biológicas foram propostas para os CNT incluindo biosensores,
veiculadores de drogas e vacinas entre outros biomateriais. Contudo, antes que estes
materiais possam ser incorporados, há a necessidade de se conhecer seus efeitos citotóxicos
e genotóxicos. No presente trabalho, avaliaram-se os efeitos de amostras purificadas
(MWCNT e CSCNT_pu) e amostras não purificadas de CNT (CSCNT_np – contendo Co e
Mn como resíduos metálicos e CSCNT_Fe contendo Ferro como resíduos), sintetizadas
pelo método CVD, sob a viabilidade celular (kit XTT Roche), capacidade de formação de
colônias e, indução de danos no DNA (ensaio Cometa e teste do Micronúcleo) em células
V79. Após 24 h do tratamento, observou-se uma redução significativa (p<0,05) da
viabilidade celular para todos os CNT testados em concentrações maiores ou iguais a 25
µg/mL. Apesar desta citotoxicidade inicial, com o aumento do tempo pós-exposição as
células V79 mostraram uma recuperação da viabilidade celular. Além disso, CSCNT_pu e
CSCNT_np apresentaram o maior efeito sofre a viabilidade celular, que podem ser
explicadas pelas características físico-químicas destes tubos e da presença dos catalisadores
metálicos cobalto e manganês. A capacidade de formar colônias também foi afetada pelos
CNT testados. Após 7 dias de exposição, o número de colônias foi reduzido (p<0,05) em
cerca de: 35 e 52% por 25 e 50 µg/mL de MWCNT; 29% por 50 µg/mL de CSCNT_pu; e
55, 66, 94 e 99% por 6.25, 12.5, 25 e 50 µg/mL de CSCNT_np, respectivamente.
CSCNT_Fe não demonstrou reduções significativas no número de colônias. MWCNT e
CSCNT_np avaliados pelo ensaio Cometa não induziram um aumento significativo de
quebras no DNA. Já quando os danos oxidativos foram avaliados, por meio do emprego das
enzimas hOGG1 e Endo III observamos um aumento significativo de danos no DNA. Em
baixas concentrações (1.5 a 12.5 µg/mL) MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np e CSCNT_Fe
não afetaram o índice de divisão nuclear. MWCNT induziu (p<0,05) uma frequência de 42
micronúcleos nas concentrações de 6.25 e 12.5 µg/mL. Levando-se em conta que não
houve um aumento proeminente de quebras no DNA induzidas (detectados pelo ensaio
Cometa) por MWCNT, pode ser definido que uma atividade clastogênica/aneugênica
caracteriza o mecanismo de ação de MWCNT. MWCNT também aumentou discretamente
a frequência de pontes nucleoplasmáticas, e um aumento significativo foi observado na
concentração de 3.125 µg/mL de CSCNT_pu. Indicando que estes CNT estão envolvidos
na indução de quebras e rearranjos cromossômicos em células V79. Em conjunto, os
resultados apontam para uma resposta geral positiva na indução de danos no DNA.
ABSTRACT
Many nanostructures have been developed, and currently the area of major activity
is the study of carbon nanotubes (CNT). The CNT consisting of carbon atoms arranged in a
series of benzene rings condensed in a tubular structure with diameters in the nanometer
scale. There are different kinds of nanotubes, among them it is possible highlight: (i) multi-
walled carbon nanotubes (MWCNT), and (ii) cup-stacked carbon nanotubes (CSCNT), yet
little studied, consisting of multiple graphene layers arranged in a cone shape, with open
edges on its outer surface and a center channel empty. Many biological applications have
been proposed for the CNT including biosensors, drug and vaccines delivery and other
biomaterials. However, before these materials can be incorporated, there is a need to know
their cytotoxic and genotoxic effects. In this study, we evaluated the effects of purified
samples (MWCNT and CSCNT_pu) and not purified samples (CSCNT_np - containing Co
and Mn as metallic residues, and CSCNT_Fe containing iron as residues), synthesized by
CVD method, on cell viability (kit XTT Roche), colony-forming ability and induction of
DNA damage (Comet assay and micronucleus test) in V79 cells. After 24 h of treatment,
we observed a significant reduction (p <0.05) of cell viability, for all CNT tested, at
concentrations greater than or equal to 25 µg/mL. Despite this initial cytotoxicity, with
increasing time post-exposure, V79 cells showed a recovery of cell viability. In addition,
CSCNT_pu and CSCNT_np had the greatest effect on cell viability, which can be
explained by physical and chemical characteristics of these tubes and the presence of metal
catalysts. The ability to form colonies was also affected by the CNT tested. After 7 days of
exposure, the number of colonies was reduced (p <0.05): 35 and 52% by 25 and 50 µg/mL
of MWCNT, 29% by 50 µg/mL of CSCNT_pu, and 55, 66, 94 and 99% by 6.25, 12.5, 25
and 50 µg/mL by CSCNT_np, respectively. CSCNT_Fe not showed significant reductions
in the number of colonies. MWCNT and CSCNT_np evaluated by Comet assay did not
induce a significant increase in DNA breaks. However, when the oxidative damage was
evaluated through the use of enzymes Endo III and hOGG1 a significant increase in DNA
damage was observed. At low concentrations (1.5 to 12.5 µg/mL) MWCNT, CSCNT_pu,
CSCNT_np and CSCNT_Fe not affect the nuclear division index. MWCNT induced (p
<0.05) frequency of 42 micronuclei at concentrations of 6.25 and 12.5 µg/mL. As we not
observed an increase of single or double DNA strand breakage (Comet assay) induced by
MWCNT, it can be defined a clastogenic/aneugenic activity as mechanism of action of
MWCNT. MWCNT also slightly increased the frequency of nucleoplasmatic bridges, and a
significant increase was observed at a concentration of 3.125 µg/mL of CSCNT_pu.
Indicating that CNT are involved in the induction of chromosomal breaks and
rearrangements in V79 cells. Together, the results indicate a generally positive response in
the induction of DNA damage.
1. INTRODUÇÃO
1.1 Nanociência, nanotecnologia e nanopartículas:
A idéia de ciência em escala nanométrica surgiu em um seminário do físico,
ganhador do prêmio Nobel, Richard Feynman em 1959, e a extraordinária possibilidade da
nanociência em relação à manipulação molecular foi discutida por Drexler em 1986. O
rápido desenvolvimento em nanotecnologia levou, assim como avanços tecnológicos, à
predição de grandes benefícios e também de grandes perigos à humanidade e aos
ecossistemas.
Nanopartículas (NP) podem ser definidas como substâncias que contenham pelo
menos uma dimensão menor do que 100 nm (Colvin, 2003). Em geral as nanopartículas
podem ser categorizadas como materiais baseados em carbono tais como fulerenos e
nanotubos de carbono; nanopartículas inorgânicas baseadas em metais óxidos (óxido de
zinco, óxido de ferro, dióxido de titânio, óxido de cério); metais (ouro, prata e ferro); e
pontos quânticos (sulfido de cádmio, selenido de cádmio) (Colvin, 2003).
A mistura de NP de diferentes origens também pode ser realizada. Estes materias
apresentam-se de diferentes formas, como, por exemplo, esferas, tubos, hastes e prismas.
Assim, a nanotecnologia visa a inclusão e a integração destas estruturas nanométricas como
componentes de materiais e sistemas (Ju-Nam
& Lead, 2008).
Em algumas estimativas, a nanotecnologia promete exceder os impactos da
Revolução Industrial e está projetado que em 2015 se torne um mercado de um trilhão de
dólares. As NP já estão sendo usadas em materiais esportivos, pneus, roupas resistentes a
manchas, protetores solares, cosméticos e eletrônicos, e também poderá ser amplamente
utilizado na medicina em aplicações terapêuticas e para diagnósticos (como contrastes para
imagens e como carreadores de drogas) (NEL et al., 2006).
Em 2004, a produção anual, de NP alcançou 1000 toneladas. Estima-se que
atualmente existam cerca de 800 produtos de uso diário baseados em nanotecnologia e que
muitos novos nanoprodutos entrarão no mercado nos próximos anos (Rejeski & Lekas,
2008).
O principal objetivo em nanociência é tentar entender como os materiais se
comportam quando o tamanho está próximo à dimensão atômica. Uma das metas da ciência
é a miniaturização e, consequentemente a nanotecnologia vem recebendo considerável
atenção. Além da possibilidade de novas aplicações e dispositivos das nanoestruturas, a
grande popularidade deste campo refere-se aos fenômenos que ocorrem na escala
nanométrica, sendo estes de interesse de físicos, químicos, biólogos, engenheiros
mecânicos e elétricos, e cientistas computacionais (Cohen, 2001).
Com a diminuição do tamanho aumenta-se exponencialmente a porcentagem dos
átomos que se encontram na área de superfície das partículas, consequentemente tornando
estes materiais altamente reativos. Esta relação superfície/volume, juntamente com o
pequeno tamanho e forma, confere propriedades específicas distintas do material massivo
de mesma composição química (Auffan et al., 2009). E assim novas propriedades podem
surgir, tais como catalisadores desejáveis para reações químicas (Oberdörster et al., 2005).
Nanopartículas com tamanhos menores que 20-30nm são caracterizadas por um excesso de
energia em sua superfície e são termodinamicamente instáveis (Auffan et al., 2009).
Além das propriedades físico-químicas serem atribuídas ao pequeno tamanho das
NP, propriedades incomuns também se devem à composição química (pureza,
cristalinidade, propriedades elétricas, etc.), estrutura da superfície (reatividade da
superfície, grupos da superfície, cobertura orgânica ou inorgânica, etc.), solubilidade, forma
e agregação. Embora pareçam impressionantes a partir do ponto de vista físico-químico, as
novas propriedades de nanomateriais levanta preocupações a cerca de efeitos adversos em
sistemas biológicos (Nel et al., 2006).
1.2 Nanotoxicologia e Nanogenotoxicologia:
Embora os produtos baseados em nanomateriais beneficiem seus usuários e o
crescimento da economia global, como consequência haverá um aumento da exposição de
pesquisadores, trabalhadores e consumidores aos materiais potencialmente perigosos os
quais podem causar efeitos nocivos (Singh et al., 2009). Trabalhadores envolvidos na
síntese, transporte ou manuseio de nanopartículas já estão sendo expostos a estes materiais
que são produzidos principalmente em forma de pó a granel (Hussain, 2009).
As NP estão sendo designadas para uma ampla variedade de aplicações, de cunho
terapêutico, diagnóstico, eletrônico, etc. Assim, com uma necessidade óbvia da avaliação
toxicológica de partículas e fibras na escala nanométricas, nasce o campo da
Nanotoxicologia, atualmente definida como a “ciência de nanodispostivos e nanoestrururas
que lida com seus efeitos em organismos vivos” (Donaldson et al., 2007).
A exposição às NPs pode ocorrer por inalação, contato com a epiderme e ingestão.
A via de inalação tem sido a rota mais estudada quando comparado com as outras (Borm &
Kreyling, 2004). No entanto, como também estão sendo designadas para aplicações
terapêuticas e diagnósticas pode ocorrer a exposição ao trato digestivo e aos vasos
sanguíneos poderá ocorrer (Donaldson et al., 2007).
Na verdade, alguns estudos já demonstram que NP não são inerentemente seguras e
que afetam o comportamento biológico em nível celular, subcelular e protéico (Service,
2004; Colvin, 2003; Royal Society, 2004). Além disso, ao entrarem no organismo as NPs
podem depositar-se em órgãos alvos, e assim, acionar respostas nocivas (Nel et al., 2006;
Yang et al., 2010).
Se os nanomateriais podem deslocar-se através do corpo existe uma variedade de
mecanismos diretos e indiretos não desejáveis que podem ser deflagrados, entre eles
aqueles que podem promover danos à molécula de DNA. Nanomateirais são capazes de
penetrar em células por diferentes mecanismos, e subsequentemente entrar no núcleo: por
difusão através da membrana nuclear (se forem pequenos o suficiente); transporte através
do poro nuclear; ou podem entrar no núcleo por acaso quando a mitose ocorre durante o
processo de divisão celular no momento em que a membrana nuclear se dissolve e se forma
novamente em cada célula filha resultante (Singh et al., 2009).
Uma vez que as NP encontram-se dentro do núcleo, então uma interação direta entre
elas e o DNA ou a proteínas relacionadas ao DNA podem levar a danos físicos no material
genético. Chen e von Mikecz (2005) mostraram que NP de dióxido de silica entram no
núcleo e provocam a formação de aglomerados de proteínas nucleares que podem levar à
inibição da replicação, transcrição e proliferação celular.
Alternativamente, danos no DNA podem ocorrer por mecanismos indiretos, nos
quais não há interação física com a molécula de DNA, mas com proteínas envolvidas com
processo de divisão celular. Além disso, podem induzir outras respostas celulares que
induzem genotoxicidade, tais como estresse oxidativo, inflamação e sinalização celular
errada (Singh et al., 2009).
A presença de resíduos dos catalisadores metálicos (usados no processo de síntese),
e a grande área de superfície dos nanomateriais podem promover a geração de espécies
reativas de oxigênio (EROs). Atualmente, a geração de EROs é considerada a maior
causadora de toxicidade das NP (Donaldson et al., 2007). Como consequência, a exposição
às nanopartículas pode afetar, por meio da formação de EROs, a cascata de sinalização
celular que controla a proliferação celular, processos inflamatórios e morte celular. O
ataque oxidativo ao DNA tem se mostrado um dos efeitos que governam a genotoxicidade
de nanopartículas (Karlsson et al., 2008; Papageorgiou et al., 2007).
1.3 Nanotubos de carbono:
Uma das áreas de maior atividade em nanociência é o estudo de nanotubos de
carbono (CNT) (Service, 2004) que desperta imenso interesse para o emprego como
dispositivos e materiais biomédicos. Muitas aplicações para os CNT foram propostas
incluindo biosensores, veiculadores de drogas, vacinas entre outros biomateriais (Lin et al.,
2004).
Os CNT foram descobertos por Iijima em 1991, representando uma forma
alotrópica do carbono com uma nanoestrutura que pode ter a proporção do comprimento
em relação ao diâmetro maior do que 1.000.000 (
Shvedova et al., 2009)
Os CNT consistem exclusivamente de átomos de carbono unidos por ligações
covalentes que estão arranjados em uma série de anéis benzeno condensados em uma
estrutura tubular (Lacerda et al., 2006). Dependendo de sua forma estrutural, podem
apresentar comportamento metálico ou semi-condutor (Klumpp et al., 2006) e ainda
apresentar-se como materiais de superfícies hidrofóbicas. O diâmetro destas estruturas varia
de 0,8 a 100 nm, enquanto o comprimento pode alcançar a escala de micrômetros (Kim et
al.,2002; Popov, 2004).
Existem diferentes tipos de CNT (Figura 1), dentre eles podem ser destacados:
SWCNT – CNT de paredes simples composto por uma única folha de grafeno; MWCNT –
CNT de paredes múltiplas, que possuem várias folhas de grafeno arranjadas de forma
concêntrica; e os CSCNT -
po
ntas abertas em sua superfície externa e um canal central vazio
dos CSCNT apresenta-
se menos hidrofóbicas quando comparadas às dos nanotubos de
Figura 1. Nanotubos de
carbono: a) paredes simples (SWCNT); b) paredes múltiplas (MWCNT); c) do tipo
"cup-stacked" (CSCNT). [
Figura adaptada de
1.4
Métodos de síntese e purificação de
Existe uma variedade de técnicas de síntese de CNT
& Simard, 2006
). Dentre elas podem ser citadas como principais as seguintes: método de
O método CVD é um dos mais utilizados devido às con
(Rosolen et al., 2006
). Gases como metano (CH
CNT do tipo "cup-
stacked", ainda pouco estudados, que
consistem de múltiplas camadas de grafeno arranjados em forma de cone
, as quais exibem
ntas abertas em sua superfície externa e um canal central vazio
.
Além disso, a superfície
se menos hidrofóbicas quando comparadas às dos nanotubos de
paredes bem organizadas MWCNT e SWCNT (Moraes et al., 2008).
carbono: a) paredes simples (SWCNT); b) paredes múltiplas (MWCNT); c) do tipo
Figura adaptada de
Choi et al., (2005)].
Métodos de síntese e purificação de
nanotubos de carbono:
Existe uma variedade de técnicas de síntese de CNT
(
Awasthi et al.,2005; Kingston
). Dentre elas podem ser citadas como principais as seguintes: método de
deposição química de vapor (CVD), descarga por arco elétrico e ablação por laser. Todos
estes métodos de crescimento consistem basicamente
na decomposição de compostos de
carbono em carbono atômico, seguido pelo crescimento de nanoestruturas de carbono sobre
partículas catalisadoras, tais como Co, Mo, Ni, Fe, etc.
(Montoro & Rosolen,
2006)
O método CVD é um dos mais utilizados devido às con
dições experimentais serem
de um custo inferior à dos outros métodos descritos, além de se poder ter um controle maior
dos elementos envolvidos e, sobretudo, as condições térmicas requeridas que estão abaixo
dos 1000 °C. O método CVD envolve a reação de de
composição de um vapor ou gás
precursor, como fonte de carbono, geralmente um hidrocarboneto, na presença de um
catalisador metálico em atmosfera inerte. As partículas catalisadoras ficam depositadas
sobre um substrato (por exemplo, Al
2
O
3
, zeólito, Si, MgO
) ou materiais de carbono
). Gases como metano (CH
4
), (Reyhani et al., 2007), acetileno (C
stacked", ainda pouco estudados, que
, as quais exibem
Além disso, a superfície
se menos hidrofóbicas quando comparadas às dos nanotubos de
carbono: a) paredes simples (SWCNT); b) paredes múltiplas (MWCNT); c) do tipo
Awasthi et al.,2005; Kingston
). Dentre elas podem ser citadas como principais as seguintes: método de
deposição química de vapor (CVD), descarga por arco elétrico e ablação por laser. Todos
na decomposição de compostos de
carbono em carbono atômico, seguido pelo crescimento de nanoestruturas de carbono sobre
2006)
.
dições experimentais serem
de um custo inferior à dos outros métodos descritos, além de se poder ter um controle maior
dos elementos envolvidos e, sobretudo, as condições térmicas requeridas que estão abaixo
composição de um vapor ou gás
precursor, como fonte de carbono, geralmente um hidrocarboneto, na presença de um
catalisador metálico em atmosfera inerte. As partículas catalisadoras ficam depositadas
) ou materiais de carbono
), (Reyhani et al., 2007), acetileno (C
2
H
2
),
propileno (C
3
H
6
) (Huang et al., 2003) e líquidos como o xileno (C
6
H
4
(CH
3
)
2
) (Andrews et
al., 1999), são algumas fontes de carbono utilizadas no processo de CVD.
O método CVD possui muitas vantagens em relação a outros, pois pode sintetizar
nanotubos com alta pureza, alto rendimento, crescimento seletivo e alto alinhamento
(Andrews et al., 1999), sendo a síntese de CSCNT somente observada, até o momento, por
meio desse método (Rosolen et al., 2006).
O método de descarga de arco elétrico foi utilizado na obtenção dos primeiros CNT
registrados (Iijima et al., 1992). Este método baseia-se em uma descarga elétrica gerada
entre dois eletrodos de grafite, que são mantidos a uma pequena distância um do outro
(menos que 1mm), para que a corrente passe e gere um plasma, aquecendo a grafite que
logo depois é condensado na forma de fuligem que contém CNT. O processo ocorre em
uma câmara de aço selada, geralmente em um gás inerte. A temperatura do plasma entre os
eletrodos é próxima a 4000 °C e, nesse sistema, a grafite é sublimada do eletrodo positivo e
depositada no eletrodo negativo ou nas paredes da câmara. O material depositado contém
nanotubos, normalmente do tipo MWCNT (MacKenzie et al., 2008).
No método de ablação por laser a grafite é vaporizada através da irradiação direta de
laser sobre a grafite na presença de atmosfera inerte (Guo et al., 1995). O carbono é
vaporizado da superfície de um bastão sólido de grafite, em fluxo de hélio ou argônio de
velocidade de 0,2 – 2 cm/s e pressão de 500 torr. Geralmente a vaporização pode variar de
1200 a 4000 °C que é próxima à temperatura de fusão do grafite (MacKenzie et al., 2008).
Este método produz MWCNT sem a adição de catalisadores metálicos, enquanto, estes são
necessários para a síntese de SWCNT (Guo et al., 1995).
Contudo, todos os métodos de produção de CNT podem gerar impurezas tais como
nanopartículas de grafite, carbono amorfo, fuligem, fulerenos e resíduos dos catalisadores
metálicos. E a quantidade de impurezas comumente aumenta com a diminuição do
diâmetro dos CNT.
Diante de todas essas considerações a respeito da síntese dos CNT, em muitas das
suas possíveis aplicações tecnológicas, as impurezas presentes durante o processo de
síntese tornam-se um grande problema, já que podem alterar o comportamento dos
nanomaterais. Por exemplo, nas aplicações biológicas os catalisadores utilizados no
crescimento dos CNT podem estar envolvidos na toxicidade destes materiais.
Neste contexto, a purificação dos CNT representa uma importante etapa. E na
tentativa de se obterem nanotubos com maior grau de pureza, vários procedimentos de
purificação são apresentados na literatura (Rinaldi et al., 2010; Lu et al., 2010). Esses
métodos podem ser divididos em três categorias principais: purificação química, física ou
uma combinação de ambos.
O método químico purifica os CNT baseados na idéia de oxidação seletiva - onde as
impurezas carbonáceas são oxidadas a um ritmo mais rápido que os nanotubos de carbono,
e da dissolução de impurezas metálicas por ácidos. Este método pode efetivamente remover
carbonos amorfos e partículas metálicas, exceto aquelas presas em partículas de grafite
poliédricas (Banerjee et al., 2005).
Em geral, a oxidação química inclui a oxidação em fase gasosa (usando ar, O
2
, Cl
2
,
H
2
O, etc.); oxidação em fase líquida (tratamentos com ácidos, etc.); e oxidação
eletroquímica. Contudo, o método químico sempre influencia na estrutura dos CNT devido
a oxidação envolvida (HOU et al., 2008). A desvantagem deste método reside no fato de
que ele frequentemente abre as pontas dos nanotubos, produz cortes, gera danos estruturais
na superfície e introduz grupos funcionais oxigenados (−OH, −C=O, −COOH) (Banerjee et
al., 2005; Niyogi et al., 2002).
A oxidação em fase gasosa é caracterizada por abrir as pontas do nanotubos ou
destruir a estrutura dos CNT sem aumentar defeitos nas paredes ou introduzir grupos
funcionais. A oxidação em fase líquida introduz grupos funcionais e defeitos,
preferencialmente, nas paredes dos tubos, e pode cortar os CNT em pequenos pedaços com
diferentes comprimentos. A oxidação eletroquímica é adequada para a purificação de
arranjos de CNT sem destruir o alinhamento. O problema mais sério desta técnica é que a
estrutura dos nanotubos de carbono pode ser destruída pelos reagentes e, portanto, limita
suas aplicações em algumas áreas, por exemplo, como dispositivos eletrônicos (Hou et al.,
2008).
O método físico separa CNT das impurezas baseados nas diferenças de tamanho,
gravidade, solubilidade e propiedades magnéticas. Em geral, o método físico é usado para
remover folhas de grafite, nanoesferas de carbono, agregados ou separar CNT com
diferentes índices de diâmetro/comprimento. Algumas técnicas como cromatografia e
eletroforese podem separar os CNT de acordo com suas diferenças em comprimento ou
condutividade (Hou et al., 2008). Em princípio, o método físico não requer oxidação e,
portanto previne os CNT de danos. No entanto, este método é sempre complicado,
demorado e menos efetivo em remover as impurezas.
O terceiro tipo de purificação combina os méritos da purificação física e química, e
é comumente denominado de purificação de multi-passos. Este método pode levar à
produção de CNT de alta qualidade com alto rendimento, sendo efetivo na remoção de
impurezas carbonáceas e metálicas. Este método tem sido amplamente utilizado
recentemente. E o mais importante, pode-se seletivamente abrir pontas, cortar e adicionar
grupos funcionais nas paredes dos CNT e ainda separá-los de acordo com o comprimento
ou condutividade (Hou et al., 2008).
O ponto chave deste método geral é como combinar diferentes métodos de acordo
com o requerimento e qualidade que se deseja dos CNT. Embora, considerável progresso
tenha sido feito, alguns méritos das técnicas físico-químicas não foram completamente
usadas e combinadas. Por exemplo, alguns métodos físicos capazes de remover partículas
metálicas (separação magnética, extração Sc−CO
2
, etc.) são raramente reportadas em
combinação com purificação em fase gasosa. Essa combinação pode melhorar muito o
rendimento da purificação de fase gasosa, devido à eliminação precoce de partículas de
metal, que podem catalisar a oxidação dos CNT (Pillai et al., 2007).
1.5 Nanotubos de carbono e penetração celular:
Devido à sua estrutura tubular e a relação área de superfície/volume, os CNT podem
facilmente penetrar várias barreiras biológicas em mamíferos, plantas e microorganismos
(Liu et al., 2009; Kang et al., 2008). A visão geral é que os nanotubos de carbono são
absorvidos pelas células por endocitose dependente de clatrina (Kam et al., 2006). SWCNT
revestido de proteínas ou DNA mostraram-se entrar nas células de forma dependente de
energia. Embora a maioria dos dados publicados esteja de acordo com o modelo de
endocitose, a internalização celular independente de energia também foi relatada
(Kostarelos et al., 2007).
Embora muitos progressos tenham sido feitos no entendimento de como os CNT
atravessam a membrana lipídica de um determinado tipo de célula, os detalhes dos
mecanismos propostos ainda são debatidos. Tais considerações são importantes na medida
em que a incapacidade de compreender os mecanismos de captação de materiais em
nanoescala e sua influência sobre a toxicidade pode criar um nível de imprevisibilidade
tóxica (Wick et al., 2007).
Levando-se em conta a natureza hidrofóbica dos CNT e com base nos resultados de
Raffa et al. (2010) pode-se concluir que, quando as células são cultivados com meio de
crescimento contendo CNT, estes adsorvem espontaneamente sobre a membrana celular e o
processo de internalização ocorre por inserção e difusão de nanotubos através das
membranas celulares.
Já no modelo de internalização celular proposto por Mu et al. (2009) os CNT de
carbono são divididos em duas classes, agrupados e individualizados. Agrupamentos de
CNT são absorvidos pelas células por endocitose dependente de energia. E estes
agrupamentos de MWCNT, nos endossomos, podem liberar nanotubos únicos, os quais
então atravessam a membrana do endosomo e escapam para o citoplasma.
Alternativamente, CNT bem dispersos (individualizados) atravessam a membrana celular e
entram nas células diretamente. Os pesquisadores relataram a presença de MWCNT curtos
no interior do núcleo celular. Além disso, os autores observaram que os MWCNTs são
recrutados para os lisossomos para posterior excreção da célula.
Assim, dois mecanismos principais têm sido amplamente considerados: (1)
endocitose/fagocitose e (2) nanopenetração.
Endocitose representa o engolfamento de uma partícula extracelular pela célula, por
exemplo, vírus (~ 100 nm, em tamanho), através da criação de uma vesícula que é, então,
integrada à célula. Fagocitose é semelhante à endocitose, mas geralmente envolve a
captação de partículas maiores, tais como bactérias (~ 1 µm), e é característico de um
subgrupo de células imunes - fagócitos (p.ex., neutrófilos, macrófagos, células dendríticas).
Estes processos são dependentes de energia e são impedidos em baixas temperaturas e em
ambientes com baixos níveis de ATP (Mukherjee et al., 1997; Marsh & McMahon, 1999).
Vários estudos indicam a endocitose/fagocitose como o mecanismo de absorção celular de
nanotubos de carbono (Kam et al., 2004; Kam et al., 2006; Liu et al., 2005).
Nanopenetração é um processo passivo independente de energia, onde os
nanotubos se difundem através da membrana celular. Também foi postulado que os
nanotubos de carbono poderiam se comportar similarmente a peptídeos de penetração
celular (PPCs), que representam seqüências poli-catiônicas que aumentam absorção de
proteínas em células de mamíferos (Pantarotto et al., 2004).
A carga de superfície também desempenha um papel importante no governo da
absorção celular de nanomateriais. A membrana plasmática é carregada negativamente
(devido aos fosfolipídios na superfície externa), assim como o ambiente intracelular, assim
os nanomateriais aniônicos (carregados negativamente) podem sofre endocitose em uma
taxa mais baixa do que aqueles que são catiônicos (carga positiva) (Gratton et al., 2008).
Outro fato importante a cerca de como CNT atravessam a membrana de células se
baseia no comprimento e formato dos CNT (Kostarelos, 2003; Nel et al., 2006). Por
exemplo, os nanotubos de carbono mais curtos (~ 0,22 µm de comprimento) foram
encontrados melhor integrados aos fagócitos e macrófagos do que nanotubos mais longos
(0,8 µm). Verificou-se que a maioria dos nanotubos de carbono curtos injetados no tecido
subcutâneo em ratos estavam no citoplasma dos macrófagos após 4 semanas, enquanto os
nanotubos de carbono mais longos foram encontrados ainda livres e flutuantes provocando
inflamação (Sato et al., 2005).
Poland et al. (2008) chegaram a conclusões semelhantes após injeção intraperitoneal
de CNT de comprimento longo e curto em camundongos. No entanto, comparando-se os
trabalhos, nota-se que o comprimento atóxico afirmado no estudo de Poland et al. (2008)
foi de ~ 10 µm, sendo pertinente ressaltar a possível influência de defeitos ao longo do
comprimento dos CNT sobre sua toxicidade. Uma das principais fontes de discrepância nos
estudos pode originar-se das diferenças entre defeitos e densidades de energia dos diversos
CNT utilizados nos experimentos.
Outro ponto de destaque é sobre a localização subcelular dos CNT. Nanotubos
foram encontrados principalmente no citoplasma, endossomo e lisossomo. Relatos
descrevem que os nanotubos de carbono penetram nas células, sem entrar no núcleo
(Lacerda et al., 2006; Zhang et al., 2007 Kang et al., 2008), enquanto outros relatos
constataram que SWCNT entram no núcleo (Pantarotto et al., 2004; Porter et al., 2007;
Mooney et al., 2008; Cheng et al., 2009) e essa entrada pode ser reversível (Cheng et al.,
2009). Yang et al. (2010) descreveu que os lisossomos e as mitocôndrias são os principais
alvos dos SWCNT.
1.6 Aplicações dos nanotubos de carbono:
As propriedades notáveis de CNT que os tornam interessantes incluem a
condutividade elétrica e térmica, força, tenacidade, elasticidade, resistência e durabilidade.
CNT podem melhorar materiais já existentes tornando-os mais leves e/ou resistentes ou
mais resistentes ao desgaste, os quais podem ser utilizados em várias aplicações que vão de
artigos de esporte (ex.: raquetes de tênis) a compósitos para aeronaves (Firme III &
Bandaru, 2010).
Por apresentarem características de flexibilidade, os nanotubos podem ser usados
em instrumentos de microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de tunelamento.
As vantagens é que melhoram a resolução quando comparados com o silício convencional.
Por serem estruturas cilíndricas, geométricas, rígidas, ocas e de diâmetros em escala
nanométrica, tem sido cogitado o uso para estocagem de líquidos ou gases em seu interior,
através do efeito de capilaridade (Wang & Chen, 2007).
Nanotubos de carbono tem sido também a promessa para a construção cívil. A
incoporporação de CNT no cimento permitiu a formação de um concreto mais resistente. O
cimento é um material de construção comumente utilizado devido ao seu baixo custo e alta
resistência à compressão (Li et al., 2007).
Nanotubos de carbono têm sido utilizados como complemento da matriz de
compósitos do cimento para melhorar comportamentos mecânicos e elétricos do material,
bem como os comportamentos eletromecânicos e eletromagnéticos. Tendo o melhor
desempenho entre os materiais de carbono, espera-se que os nanotubos de carbono possam
melhorar significativamente o desempenho dos compósitos de cimento (Li et al., 2007).
Outro grande interesse é o emprego de CNT na produção ou melhoria de
biomateriais, tais como próteses para artroplastia, placas ou parafusos para fixação da
fratura, suporte para a regeneração óssea, sistemas de entrega de drogas, sensores químicos
e biológicos, etc.
O grupo de pesquisa liderado pelo Prof. Rosolen obteve sucesso na utilização de
nanotubos de carbono como filtros para cigarros. Utilizando CNT em forma de pequeno
filtro, conseguiu-se zerar as substâncias de alcatrão e nicotina de dois maços de cigarros,
numa simulação com uma máquina fumante. Com o auxílio de espectrometria de massa e
infravermelho comprovou-se a excelente capacidade de remoção de nicotina, alcatrão e
outros gases existentes na fumaça pelos nanotubos. A descoberta pode abrir perspectivas
não só para a área de saúde, mas para a utilização de CNT como filtros para indústrias que
despejam diariamente toneladas de substâncias nocivas no ar e na água (Upadhyayula et al.,
2009).
SWCNT e MWCNT foram utilizados como vetores de agentes de contrastes para
imagens por ressonância magnética e se mostraram também bastante efetivos (Sitharaman
et al., 2005; Richard et al., 2008). Estudos posteriores mostram que a liberação dos agentes
é extremamente sensível ao valor de pH em uma escala de 7,0-7,4. Por causa da diferença
no valor do pH entre tumor e tecidos normais, acredita-se que os nanotubos serão um
excelente candidato para o diagnóstico precoce de tumor (Hartman & Wilson, 2007).
Curiosamente, a absorção óptica intrínseca de SWCNT tem sido usada para matar células
cancerosas fototérmicamente com radiação NIR (espectroscopia no infravermelho próximo)
(Kam et al., 2005).
Nanotubos de carbono tem sido cogitado para aplicação na engenharia de tecidos
ósseos (Sahithi et al., 2010). Esta idéia baseia-se no fato dos CNT serem leves, fortes, e
poderem ser formulados para imitar as estruturas nanométricas iniciais dos componentes
dos ossos, tais como a hidroxiapatita e o colágeno. Além disso, as funções das células
ósseas são estimuladas com corrente elétrica e, portanto, materiais condutores (como os
CNT) também podem desempenhar um importante papel na promoção da atividade dos
osteoblastos (células formadoras de osso) (Supronowicz, 2002).
O uso de nanotubos de carbono como substratos/suportes para o crescimento de
células neurais também tem sido uma área de investigação ativa. Nanotubos de carbono
sem-funcionalização ou funcionalizado com grupos químicos diferentes, tem se mostrado
biocompatíveis com adesão celular neuronal e crescimento. Nanotubos de carbono
funcionalizados podem modular o desenvolvimento neuronal de forma graduada. Sendo
que células neurais, como as células-tronco e as gliais, foram cultivadas com sucesso sobre
substratos de CNT (Lee & Parpura, 2009).
As superfícies exteriores dos nanotubos de carbono podem absorver diversas
moléculas e ligar-se a vários grupos químicos para solubilização e/ou direcionamento,
enquanto a cavidade interior é capaz de encapsular pequenas moléculas e íons (Cai et al,
2008). Sendo assim, uma das maiores investidas para a aplicação de nanotubos é como
transportador molecular. Sendo capaz de transportar peptídios, proteínas, ácidos nucléicos e
outras moléculas bioativas; servirá como um efetivo veículo de agentes terapêuticos no
tratamento de tumores (Cai et al, 2008).
As características marcantes para um sistema eficiente de administração de drogas
(“Drug delivery”) incluem a sua capacidade de executar de forma controlada e orientada a
entrega de medicamentos, as quais os nanotubos de carbono têm mostrado possuir
(Foldvari & Bagonluri, 2008).
Três métodos de interação entre nanotubos de carbono e componentes
farmacologicamente ativos são possíveis em sistemas de entrega de drogas. O primeiro
método de interação é como um absorvente poroso para prender componentes ativos dentro
de uma malha ou conjunto de CNT. O segundo é através da ligação funcional do composto
com as paredes exteriores dos CNT. A terceira abordagem envolve o uso dos canais de
CNT como nanocateteres (Foldvari & Bagonluri, 2008).
Zhang et al. (2009) desenvolveram um sistema de entrega controlada de drogas,
baseados em SWCNT, o qual transportava a droga doxorrubicina (DXR). A droga se liga
aos nanotubos em pH fisiológico (pH 7,4) e só é liberada em um pH mais baixo, por
exemplo, pH lisossomal e ou pH característico de determinados tumores. Ácido fólico foi
usado como agente de direcionamento para células HeLa, e assim seletivamente liberar
DXR no interior do ambiente ácido dos lisossomos. Os pesquisadores observaram inibição
da proliferação de células HeLa e concluiram que o sistema global de drogas em nanoescala
é mais seletivo e eficaz do que o próprio fármaco livre, e deve resultar em redução de
toxicidade geral e, consequentemente, reduzir os efeitos colaterais de pacientes, e também
permitir uma menor quantidade da droga a ser aplicada.
Kam e Daí (2005) utilizaram SWCNT como um sistema de entrega de proteínas.
Foi desenvolvido um complexo de nanotubo-proteína citocromo C, e os pesquisadores
observaram a indução de apoptose em uma linhagem celular de fibroblastos (NIH-3T3)
cultivada conjuntamente com o complexo. SWCNTs também foram utilizados com
sucesso para entrega de acetilcolina no cérebro para o tratamento da doença de Alzheimer
induzida em camundongos (Yang et al., 2010).
A utilização de SWCNT como vetor para transfecção de siRNA em células HeLa
foi demonstrada por Kam et al. (2005). O transporte e a entrega do siRNA em células HeLa
foi realizado com sucesso. Além disso, o silenciamento dos genes lamina A/C foi mais
eficiente com CNT do que com o agente de transfecção lipofectamina.
1.7 Interações entre CNT e constituintes do meio de cultura:
Células de mamíferos são cultivadas em meios de cultura contendo soro bovino
fetal. Estes meios de cultura contem uma grande quantidade de proteínas séricas e uma
variedade de componentes orgânicos e inorgânicos. Devido às propriedades físico-químicas
de CNT estes constituintes podem ligar-se aos CNT e serem internalizados pelas células
(Zhu et al., 2009).
A interação entre MWCNT e proteínas séricas foi demonstrada por Zhu et al.
(2009). O pesquisador relata que a interação, entre MWCNT e proteínas do soro presentes
no meio de cultura, começa imediatamente após a mistura, com cinética de adsorção,
indicando que as proteínas do soro adsorvidas nos CNT atingem valores máximos em
pouco menos de 5 min. E que após o equilíbrio, MWCNT aumentou seu peso em cerca de
45%. Estes CNT contendo proteínas apresentam propriedades físico-químicas diferentes
dos nanotubos “puros”. Zhu et al. (2009) encontrou variações no comportamento biológico,
induzido por proteínas séricas adsorvidas aos CNT. As taxas de absorção de MWCNT
foram cerca de 3-4 vezes maior em meio sem soro do que em meio de cultura com soro. E a
citotoxicidade foi ~10% mais elevada em meio sem soro.
Além disso, qualquer superfície hidrofóbica é um local preferencial para a
deposição de biomoléculas e, portanto, sendo inerentemente hidrofóbico, CNT bem
dispersos irão absorver a maioria das biomoléculas dos nutrientes presentes no meio de
cultura (Hussain et al., 2009).
Neste sentido, outra questão interessante surge das observações feitas por Casey et
al. (2008). SWCNT foram dispersos em meio de cultura comercial e então removidos do
meio por ultracentrifugação e filtração. Foi demonstrada a capacidade de depleção de
constituintes do meio de cultura por SWCNT. O esgotamento de nutrientes do meio de
cultura, causado devido à adsorção de biomoléculas sobre SWCNT, aparecem como uma
explicação dada pelos autores, para a citotoxicidade de SWCNT em células A549. Tal
depleção privaria as células de nutrientes essenciais ocasionando assim um tipo de
citotoxicidade indireta, e que deve ser diferenciada de uma citotoxicidade inerente aos
nanomateriais.
Em contrapartida, o uso de meio sem soro para evitar as interações entre partículas e
proteínas tem levantado questões a respeito da relevância biológica destes experimentos por
Jones e Grainger (2009), uma vez que uma exposição in vivo não poderia ocorrer na
ausência de proteínas.
1.7 Toxicidade de nanotubos de carbono:
Shvedova et al. (2003) investigaram os efeitos de SWCNT sobre queratinócitos
imortalizados (HaCat), e células epiteliais dos brônquios. As exposições aos SWCNT
resultaram em geração de ROS, peroxidação de lipídios, estresse oxidativo, disfunção
mitocondrial e mudanças na morfologia celular.
Pantarotto et al. (2004) estudaram a citotoxicidade de SWCNT-funcionalizados por
citometria de fluxo (FACS). Utilizando-se reagentes fluorescentes específicos para
detecção de apoptose e necrose descobriu-se que na concentração de 10 µM os SWCNT
induziram 80% de morte celular.
Cui et al. (2005) investigaram a citotoxicidade de SWCNT e, mostraram que estes
CNT inibiram a proliferação de células renais embrionárias humanas (HEK 293) através da
indução de apoptose e diminuíram a capacidade
de adesão celular. Nestes experimentos
células HEK 293 foram cultivadas em meio contendo concentrações de SWCNT variando
de 0.78 µg/mL a 200 µg/mL. Análise do ciclo celular mostrou que 25µg/mL de SWCNT
induziu parada do ciclo na fase G
1.
Os autores ainda verificaram, por análise de
“microarray”, que SWCNT pode induzir a super-expressão de genes associados ao ciclo
celular , tais como p16, bax, p57, hrk, cdc42 e cdc37, a sub-expressão de genes do ciclo
celular, tais como cdk2, cdk4, cdk6 e ciclina d3, e sub-expressão dos genes associados a
transdução de sinal, tais como mad2, jak1, ttk, pcdha9 e erk.
CNT não purificados usualmente contêm catalisadores metálicos como, por
exemplo, ferro, níquel, cobalto e manganês os quais poderiam explicar a geração de
radicais livres e estresse oxidativo (Klumpp et al., 2006).
Contudo, Tamura et al. (2004) conduziram uma investigação sobre os efeitos
citotóxicos de CNT purificados sobre neutrófilos isolados de sangue humano. Após
exposição por 1h com CNT purificados, observou-se um aumento significativo de ânions
superóxidos e produção de TNF-α
(uma citocina pró-inflamatória) pelas células. Também
foi observado diminuição da viabilidade celular.
Os tipos de nanotubos usados nos estudos são de extrema importância. A
comparação da citotoxicidade induzida por diferentes materiais compostos de carbono em
macrófagos alveolares mostrou que SWCNT provoca o maior efeito tóxico quando
comparado com MWCNT (Oberdörster et al., 2005).
Zhu et al. (2007) realizaram o primeiro estudo sobre a genotoxicidade de CNT. Os
pesquisadores investigaram os efeitos de MWCNT em células-tronco embrionárias de
ratos. Os danos ao DNA induzidos por MWCNT foram indicados por análises de Western
blot da enzima de reparo por excisão de base 8-oxoguanina-DNA-glicosilase (OGG1), esta
enzima repara bases guaninas que sofreram lesões produzidas por ROS. A análise
demonstrou que após o tratamento houve um aumento da expressão de OGG1. Também
foram feitas análises para duas proteínas de reparo de quebras bifilamentares de DNA,
Rad51 e XRCC4 envolvidas em reparo por recombinação homóloga e junção de
extremidades
não homólogas, respectivamente e, as duas proteínas foram superexpressas
em resposta ao tratamento com MWCNT.
Além disso, Zhu et al. (2007) também analisaram o nível de expressão da proteína
p53 e, observaram que após 2h de exposição houve um aumento de expressão da proteína.
E por fim, foi encontrado que o tratamento com MWCNT causou um aumento de 2 vezes a
freqüência de mutação nas células-tronco embrionárias de ratos.
Portanto, existe uma variedade de aplicações, incluindo aplicações biomédicas, para
os CNT (Cohen, 2001; Lin et al., 2004; Bianco et al., 2005). Contudo, antes que estes
materiais possam ser incorporados como implantes biomédicos, veículos carreadores de
drogas/vacinas ou biosensores, entre outros materiais, há a necessidade de se estabelecer
sua biocompatibilidade e de se conhecer seus efeitos citotóxicos e genotóxicos.
Assim, no presente trabalho realizou-se uma avaliação citotóxica/genotóxica
comparativa entre diferentes tipos de CNT purificados e não purificados, sintetizados pelo
método de deposição química de vapor, em células da linhagem V79 (Fibroblasto de
pulmão de Hamster Chinês).
2. OBJETIVOS
2.1 Objtetivo geral
O presente estudo teve como objetivo principal traçar um quadro da atividade
citotóxica e genotóxica entre diferentes amostras de nanotubos de carbono (purificadas e
não purificadas), sintetizados por meio de deposição química de vapor, possibilitando um
diagnóstico mais preciso no que se refere aos seus efeitos tóxicos.
2.2 Objetivos Específicos
1) Estudar os efeitos citotóxicos de nanotubos de carbono de paredes múltiplas e do
tipo “cup-stacked” na linhagem de células V79 (fibroblasto de pulmão de Hamster
Chinês). Esses efeitos foram avaliados por ensaios de viabilidade celular (XTT) e
sobrevivência clonogênica;
2) Estudar os efeitos genotóxicos de nanotubos de carbono de paredes múltiplas e do
tipo “cup-stacked”. Esses efeitos foram avaliados pelo ensaio Cometa (com a
utilização de enzimas para detecção de danos oxidativos) e teste do micronúcleo.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Nanotubos de carbono e substâncias químicas utilizadas:
Os nanotubos de carbono utilizados foram sintetizados pela doutoranda Elaine
Yoshiko Matsubara sob orientação do Prof. Dr. José Maurício Rosolen, do Departamento
de Química da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP.
Foram utilizadas quatro amostra diferentes de nanotubos de carbono (MWCNT,
CSCNT_pu, CSCNT_np e CSCNT_Fe), todas sintetizadas pelo método de deposição
química de vapor:
3.1.1 Nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT):
Os MWCNT usados foram sintetizados pela decomposição de etanol sobre os
catalisadores metálicos cobalto e manganês incorporados ao substrato de MgO a 650 ºC.
Após a síntese, as partículas catalíticas foram removidas por imersão da amostra em HCl
concentrado por 20 minutos em temperatura ambiente e então lavados, exaustivamente,
com água MiliQ, e secas à temperatura de 100 ºC. Esta etapa foi aplicada para remover as
partículas e o substrato usado no crescimento dos CNT. Os MWCNT usados tinham
diâmetro de 25 a 60 nm.
3.1.2 Nanotubos de carbono do tipo “cup-stacked” (CSCNT):
Utilizou-se três tipos de amostras de nanotubos do tipo “cup-stacked”, todas usando
uma mistura de etanol e metanol como fonte de carbono:
Uma das amostras foi sintetizada com ferro como catalisador
(CSCNT_Fe). Esta amostra não foi purificada após o processo de síntese,
e possui diâmetro de aproximadamente 150 nm;
Os outros dois tipos foram sintetizados com cobalto e manganês como
catalisadores metálicos. Uma parte da amostra não foi purificada
(CSCNT_np), enquanto a outra foi submetida ao processo de purificação
com HCl para remoção das partículas catalisadoras (CSCNT_pu),
diâmetro aproximado de 60 nm.
Portanto, CNT purificados (MWCNT e CSCNT_pu) e não purificados (CSCNT_np
e CSCNT_Fe ) foram analisadas quanto a citotoxicidade e genotoxicidade neste trabalho.
3.1.3 Dispersão dos nanotubos de carbono:
Uma propriedade inerente de muitos nanomateriais é a sua hidrofobicidade e,
portanto, uma propensão a se aglomerar, especialmente, sob condições fisiológicas. Com
relação à exposição humana, por conseguinte, é provável que na maioria das circunstâncias
nanomateriais estejam sob a forma de agregados, em vez de unidades individuais. Além
disso, dado que testes de (geno)toxicidade, tanto in vivo quanto in vitro, envolvem a
administração em uma solução aquosa ou em um meio aquoso (com exceção para estudos
de inalação), a probabilidade é que as respostas à exposição será uma consequência da
forma aglomerada de nanomateriais (Singh et al., 2009).
Vários métodos vêm sendo utilizados para aumentar a hidrofilicidade dos
nanomateriais, seja através do uso de surfactantes ou modificação química
(funcionalização) de suas superfícies. Como resultado a estas modificações, as respostas
(geno)tóxicas também são alteradas. Algumas tentativas de solubilizar CNT através da
modificação da superfície relataram toxicidade reduzida, ocasionados pela funcionalização
(Sayes et al., 2006; Singh et al., 2006). Em contrapartida, outros estudos mostraram que
CNT foram mais citotóxicos quando estabilizados com um surfactante (Kuo et al., 2007).
O uso de surfactantes pode gerar um falso cenário de exposição, pois não estariam
presentes na maioria das situações de exposições fisiológicas. Há também a possibilidade
de que os surfactantes podem causar um resultado positivo por si só. Assim, os surfactantes
podem instaurar outro grau de complexidade que podem confundir os resultados finais.
Portanto, a forma aglomerada do material pode ser mais representativa do local de trabalho
ou cenários de exposição do consumidor (Singh et al., 2009).
Considerando as questões citadas acima, no presente trabalho optou-se por realizar a
dispersão dos CNT por sonicação. Para isso foi utilizado um sonicador com sonda (Vibra-
Cell, SONICS) operando na frequência de 20 KHz, potência 130w, amplitude 80%, por um
tempo de 60s. A dispersão foi feita em água miliQ na concentração de 0,5 mg/mL, mas
trabalhos da literatura (Jacobsen et al., 2008; Pacurari et al., 2008; Wirnitzer et al., 2009)
utilizaram soluções estoque ainda mais concentradas.
Os CNT foram esterilizados por autoclavagem antes do processo de sonicação. A
dispersão era realizada, imediatamente, antes dos tratamentos das culturas. Desta dispersão
foram feitas diluições seriadas nos meios de culturas para o tratamento das células.
Há que se ressaltar que o processo de sonicação para dispersão de CNT, envolve a
quebra e a inserção de defeitos nos nanotubos que podem reduzir o seu comprimento
(Glória et al., 2007). Geralmente, durante a sonicação os CNT podem ser quebrados em
sítios defeituosos (Raffa et al., 2008).
Para os experimentos de sobrevivência clonogênica foram utilizados frascos de
cultura (TPP) de 25 cm
2
de área, contendo 5 mL de meio de cultura. Já para os
experimentos de viabilidade celular, teste do micronúcleo e ensaio Cometa foram utilizadas
placas de cultura (TPP) de 12 poços, contendo 1 mL de meio de cultura. Cada poço tem
área de 3,5 cm
2
.
As concentrações utilizadas nos testes são apresentadas em duas formas diferentes:
(massa/volume: µg/mL) – usualmente a medida mais utilizada em
experimentos de cito- e genotoxicidade;
(massa/área: µg/cm
2
) – medida recomendada para estudos in vitro que
envolvem partículas e fibras (Oberdörster et al., 2005). Será apresentado nos
gráficos e tabelas dentro de colchetes [µg/cm
2
].
3.1.4 Controle positivo - Doxorrubicina (DXR):
A doxorrubicina é um antibiótico da família das antraciclinas utilizado para
tratamento de neoplasias malignas. Seu uso em ensaios para mutagênese e antimutagênese
deve-se a sua capacidade de provocar danos ao DNA e aos cromossomos (Antunes &
Takahashi, 1999; Quiles et al., 2002).
Os mecanismos propostos para a ação citotóxica ou citostática da doxorrubicina são:
intercalação na fita de DNA e como conseqüência a inibição da síntese de macromoléculas;
formação de radicais livres o que provoca danos no DNA, peroxidação lipídica, ligação no
DNA e alquilação; DNA “cross-linking”; interferência na abertura da dupla fita de DNA,
interferência na atividade da helicase; ação direta na membrana celular; inibição da
topoisomerase II; indução de morte celular por apoptose (Gewirtz, 1999).
Assim, o agente DXR foi usado como controle positivo, na concentração de 0,15
µg/mL – tratamento por 2 h, dos experimentos de genotoxicidade. Utilizou-se a forma
comercial Doxolem®: Cloridrato de doxorrubicina (Figura 2) (Registro CAS #23214-92-8
e 25316-40-9, Eurofarma Laboratórios Ltda, Campo Belo – SP, Brasil e Zodiac Produtos
Farmacêuticos S/A , Pindamonhangaba – SP, Brasil).
Figura 2: Estrutura molecular da doxorrubicina.
3.1.5 Controle negativo:
Água MiliQ autoclavada foi utilizada como controle negativo dos experimentos.
3.1.6 Citocalasina B:
A citocalasina B (CitB) é um inibidor de polimerização da proteína actina requerida
para a formação do anel de microfilamentos que induzem a contração do citoplasma e
clivagem da célula em duas células filhas (citocinese) (Carter, 1967). No teste do
micronúcleo, o uso da CitB leva ao bloqueio da citocinese, mas não da divisão nuclear,
resultando em um acúmulo de células binucleadas, a partir de células que passaram por
apenas um ciclo de divisão (Fenech & Morley, 1985).
A CitB ( Sigma), foi diluída em dimetilsulfóxido (DMSO – Sigma) a fim de se obter
uma solução de uso na concentração de 1 mg/mL. Esta solução foi mantida ao abrigo da luz
em refrigeração a 4°C até o momento de seu uso na concentração final de 5 µg/mL de meio
de cultura.
3.2 Cultura de células da linhagem V79:
Sistemas testes de curta duração são amplamente utilizados na detecção de agentes
mutagênicos e antimutagênicos ambientais (Kuroda et al., 1992). Entre esses sistemas,
destaca-se a cultura de células de mamíferos in vitro, como a cultura de linfócitos de sangue
periférico humano, as linhagens celulares provenientes de hamster Chinês, como por
exemplo, as células CHO (células de ovário) e células V79 (fibroblasto de pulmão)
(Takahashi, 2003).
Entre as vantagens desses sistemas-teste, destacam-se a facilidade na padronização
das condições experimentais (temperatura, pH, composição do meio de cultura, densidade
populacional) devido à uniformidade metabólica e comportamental do material,
possibilidade dos tratamentos das células serem realizados em várias fases do ciclo celular,
rapidez; economia, boa reprodutibilidade, organização dos cromossomos e de seu DNA
igual às células in vivo (Rabello-Gay et al., 1991)
Portanto, para a avaliação dos efeitos citotóxicos e genotóxicos dos CNT foram
utilizadas culturas de células V79. As linhagens celulares foram estocadas em nitrogênio
líquido (-195 °C) em alíquotas de 1x10
6
células/mL em uma solução de congelamento
(50% meio de cultura, 50% soro bovino fetal e 10% glicerol). Para a realização dos
experimentos, as células foram descongeladas e cultivadas em 10 mL de meio de cultura
Ham-F10+D-MEM na proporção 1:1 (Sigma) suplementado com 10% de soro bovino fetal
(Cultilab), 1,2 g/L de bicarbonato de sódio (Reagen), antibióticos (0,06 g/L penicilina, 0,10
g/L de estreptomicina (Sigma), 1% de Kanamicina (Gibco) e 1% de Ciprofloxacina (forma
comercial Hifloxan® – Halexistar) e HEPES (2,38 g/L – Serva), em frascos de cultura de
25 cm
2
de área, a 37 °C, 5% CO
2
. As células utilizadas estavam entre a 3ª e a 8ª passagem.
Células desta linhagem possuem ciclo celular de 12-14 horas.
De acordo com as explicações de Jones e Grainger (2009), optamos por utilizar
culturas de células V79 em meio de cultura Ham-F10+D-MEM (1:1) suplementado com
10% de soro bovino fetal para todos os testes realizados. Jones e Grainger (2009) propõem
que a utilização de meio sem soro usado sem um objetivo específico pode produzir uma
condição altamente artificial de cultura que não é particularmente relevante ao "mundo
real" do cultivo de células. Além disso, visando-se exposições prolongadas – 24 e 48 h –
(justificadas pela característica de biopersistência de nanomateriais), o efeito da ausência de
soro pode ter consequências drásticas para a viabilidade celular.
3.3 Viabilidade celular:
Para a
realização destes experimentos foi
(Roche Applied Science).
O princíp
alaranjado. Assim,
essa conversão ocorre somente nas células viáveis. Portanto, esse
experimento
tem a finalidade de determ
exposição aos CNT.
As células
foram expostas por 24h a diferentes diluições de CNT
12,5 µg/mL)
sendo cada tratamento feito em duplicata em placas de cultivo de
Após a exposição, os p
oços foram lavados por 2x com solução de Hank's. E nos tempos de
24 h, 48 h (5x10
4
céls. semeadas)
3), avaliou-
se a viabilidade celular. Após os respectivos tempos de incubação, lavou
XTT/electron (
na proporção de 50:1
em um espectrofotômetro.
O resultado da
diretamente p
roporcional ao número de
Figura 3:
Esquema representativo dos protocolos de tratamento para análise de viabilidade celular com
Proliferation Kit II”
. As culturas celulares foram expostas aos CNT por 24h, e o
realização destes experimentos foi
utilizado o “
Cell Proliferation Kit II
O princíp
io da técnica é baseado na clivagem do sal amarelo
tetrazolium XTT pelas células metabolicamente ativas formando um corante formazam
essa conversão ocorre somente nas células viáveis. Portanto, esse
tem a finalidade de determ
inar a quantidade de células
viáveis após a
foram expostas por 24h a diferentes diluições de CNT
(
200; 100; 50; 25;
sendo cada tratamento feito em duplicata em placas de cultivo de
oços foram lavados por 2x com solução de Hank's. E nos tempos de
céls. semeadas)
e 120 h (1x10
4
céls. semeadas) após o tratamento
se a viabilidade celular. Após os respectivos tempos de incubação, lavou
culturas com solução de Hank's. Imediatamente após a lavagem foram adicionadas às
células 500 µL de meio DMEM sem fenol vermelho, e então,
60 µ
L da solução
na proporção de 50:1
) permanecendo em cultura por
30 minutos. Passado
este tempo o volume foi transferido para uma cubeta
e foi realizada a leitura c
O resultado da
absorbância, medida em 492 e 690 nm, é
roporcional ao número de
células viáveis em cada tratamento.
Esquema representativo dos protocolos de tratamento para análise de viabilidade celular com
. As culturas celulares foram expostas aos CNT por 24h, e o
efeito deste tratamento foi
analisado nos tempos de 24, 48 e 120 h após a exposição.
Cell Proliferation Kit II
”
io da técnica é baseado na clivagem do sal amarelo
tetrazolium XTT pelas células metabolicamente ativas formando um corante formazam
essa conversão ocorre somente nas células viáveis. Portanto, esse
viáveis após a
200; 100; 50; 25;
sendo cada tratamento feito em duplicata em placas de cultivo de
12 poços.
oços foram lavados por 2x com solução de Hank's. E nos tempos de
céls. semeadas) após o tratamento
(Figura
se a viabilidade celular. Após os respectivos tempos de incubação, lavou
-se as
culturas com solução de Hank's. Imediatamente após a lavagem foram adicionadas às
L da solução
30 minutos. Passado
olorimétrica
absorbância, medida em 492 e 690 nm, é
Esquema representativo dos protocolos de tratamento para análise de viabilidade celular com
“Cell
efeito deste tratamento foi
A partir da curva de dose-resposta obtida com o ensaio, calculou-se a IC
50
(IC
50
representa a concentração de uma substância requerida para inibir 50% da viabilidade
celular in vitro). O valor foi estimado por meio de regressão não linear utilizando-se o
programa estatístico GraphPad Prism versão 5.0 para Windows (GraphPad Software, San
Diego California).
3.4 Ensaio clonogênico:
Ensaio clonogênico ou teste de sobrevivência clonogênica é um ensaio in vitro
baseado na capacidade de uma única célula crescer e se tornar uma colônia. A colônia é
definida como sendo composta por pelo menos 50 células. O ensaio, essencialmente, testa a
capacidade de cada célula na população sofrer divisões “ilimitadas”. É o método para
detecção de morte celular reprodutiva (Franken et al., 2006).
Foi utilizado o método de plaqueamento antes do tratamento (Franken et al., 2006).
Células em crescimento exponencial foram semeadas em um número de 300 células/frasco
25cm
2
. Após o período de 8 h da semeadura, tempo suficiente para que as células se
fixassem ao frasco de cultura e menor que o tempo de duplicação das células (para garantir
que somente células únicas fossem tratadas), as células foram expostas a diferentes
concentrações de CNT (50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/mL) por 7 dias. Cada tratamento foi
feito em triplicata. As células foram incubadas em estufa a 37ºC, 5% CO
2
. Após este
período as colônias formadas foram fixadas (metanol/ácido acético/água na proporção 1:1:8
v/v), e coradas com Giemsa. A contagem foi realizada com o auxílio de uma lupa.
A partir da curva de dose-resposta obtida com este ensaio, também calculou-se a
IC
50
como citado no item anterior.
3.5 Ensaio Cometa:
O ensaio cometa, ou técnica da eletroforese celular em microgel, tem demonstrado
sensibilidade como uma técnica para a avaliação do dano e reparo no DNA em uma
variedade de tipos celulares, induzidos por uma variedade de agentes químicos e físicos.
Em comparação com outros métodos também sensíveis, o ensaio é relativamente preciso e
econômico no uso de materiais (Rojas et al., 1999).
O teste foi desenvolvido por Singh et al. (1988), seu princípio básico é o da lise de
membranas celulares e proteínas nucleares (incluindo as histonas), e subseqüentemente, da
descompactação do DNA sob condições alcalinas (Singh, 2000). Em seguida ocorre a
indução da migração eletroforética do DNA liberado em matriz de agarose.
Quando visto ao microscópio, o DNA migrado adquire a forma aparente de um
cometa, com cabeça - a região nuclear, e a cauda - que contém fragmentos ou fitas de DNA
que migraram na direção do ânodo (Klaude et al., 1996).
A versão alcalina do teste é usada para detectar quebras de fita simples e duplas e,
sítios álcali-lábeis nas moléculas de DNA, que são induzidas, por exemplo, por radiações
ionizantes, agentes alquilantes, oxidantes, etc.
Antes do ensaio cometa foi realizado um teste de viabilidade celular com azul de
tripan 0,4%. Pela utilização de um contador manual, contaram-se 100 células em
microscópio de luz transmitida. A coloração permite diferenciar células viáveis (não
coradas) de células não viáveis (coradas em azul), sendo consideradas aptas para a análise
do cometa aquelas culturas que apresentaram uma viabilidade celular acima de 70%.
As células (1x10
5
) foram expostas por 24 h a uma amostra purificada (MWCNT) e
outra não purificada (CSCNT_np), em placas de 12 poços. Após o tratamento as culturas
foram lavadas 2x com solução de Hank’s. As células, então, foram suspendidas por
tripsinização e 500 µL da suspensão celular foi transferido para um microtubo de 1,5 mL,
submetidos à centrifugação de 1.000 rpm, a 4ºC, por 5 minutos. Em seguida, desprezou-se
o sobrenadante e ressuspendeu-se o “pellet”, sendo acrescentados 160 µL de agarose de
baixo ponto de fusão (37°C) 0,5%, misturando-se levemente. O material de cada microtubo
foi transferido para duas lâminas recém preparadas com a primeira camada de agarose de
ponto de fusão normal 1,5%. Foram colocadas as lamínulas sobre o material e, em seguida,
estas foram levadas à geladeira por 5 minutos sendo as lamínulas retiradas após esse
tempo.
As lâminas foram mergulhadas em solução de lise (NaCl 2,5 M, Na2EDTA 100
mM, Tris 10 mM, Triton X-100 1% e DMSO 10%, pH 10,0) por 24 horas, permanecendo
em geladeira durante todo o tempo. As lâminas foram retiradas da solução e mergulhadas
em solução tampão de eletroforese (NaOH 0,3 M e Na
2
EDTA 1 mM, pH > 13) por 25
minutos a 4ºC, sendo assim, levadas para a cuba de eletroforese. Transcorridos 25 minutos
em corrente eletroforética (25 V [1 V/cm, 300 mA] a 4°C), as lâminas foram mergulhadas
em solução de neutralização (Tris-HCl 0,4 M, pH 7,5) por 15 minutos. Após a
neutralização, as lâminas foram secas à temperatura ambiente, e então, fixadas em etanol
100%.
Para a coloração do material, foram adicionados 30 µL de solução de iodeto de
propídeo (concentração final de 2,5 µg/mL) sobre a lâmina, sendo esta recoberta por uma
lamínula. O material foi analisado em microscópio de fluorescência (ZEISS, filtro 516- 560
nm e barreira de filtro de 590 nm), em aumento de 40x. Foram analisadas 50
células/lâmina, sendo observadas as células com contorno circular (núcleos sem danos de
DNA) ou em forma de cometa (núcleos com danos no DNA), no qual a extensão da cauda
reflete a distância de migração dos fragmentos de DNA, seguida de captura de imagem
digital (Câmera Axiovision Zeiss). As imagens obtidas foram analisadas pelo programa
TryTek Comet ScoreTM, FreeWare v1.5, onde se obtém a quantificação de danos no
DNA, baseado nos pixels dos fragmentos.
3.5.1 Ensaio Cometa para detecção de danos oxidativos:
O Ensaio Cometa detecta primordialmente quebras no DNA. No entanto, com a
modificação de algumas etapas de seu procedimento, existe a possibilidade de se detectar
outros tipos de lesões no DNA, como bases oxidadas, principal modificação provocadas
pelas EROs. Com esta finalidade, as lâminas foram incubadas com endonucleases de
reparo que permite a expressão de danos específicos de base na forma de quebra de fita
simples. Assim foram ulilizadas as enzimas hOGG1 e Endo III para detecção de danos
oxidativos no DNA como proposto por Speit et al. (2004).
A detecção de danos oxidativos pelo ensaio cometa ocorre com o acréscimo de uma
etapa ao protocolo padrão (descrito no item anterior) do ensaio cometa. Depois da etapa de
lise, as lâminas devem ser imersas, 3 vezes, em tampão F (HEPES 40 mM; KCl 0,1 M;
EDTA 0,5 mM e 0,2 mg/mL, pH 8,0) por 5 minutos cada, a 4°C. Em seguida foram
adicionados sobre as lâminas 50 µL de enzima diluída em tampão F (0,1 U/gel). As lâminas
foram então cobertas por lamínulas e incubadas em uma câmara úmida (Hybrite) por 30
minutos para hOGG1 e 45 minutos para EndoIII, a 37°C. E então seguiu-se o protocolo
padrão, citado no item anterior.
3.6 Teste do micronúcleo:
O estudo do dano genético ao nível cromossômico é essencial para a genética
toxicológica, pois as mutações cromossômicas são um importante evento da carcinogênese.
Entre os métodos mais utilizados para avaliar danos cromossômicos destaca-se o teste do
micronúcleo (MN).
Matter e Schimid (1971) estabeleceram o teste do micronúcleo (MN) em células de
medula óssea de camundongos, sendo sua versão in vitro utilizando cultura de linfócitos
periféricos humanos, proposta como um teste para a detecção de agentes carcinogênicos
(Heddle, 1976). Segundo Salvadori et al. (2003), essa versão evoluiu rapidamente no
campo da genética toxicológica por ser um método simples para a avaliação de vários tipos
de danos citogenéticos, além das contínuas inovações em seu protocolo que sinalizam para
a ampliação da aplicabilidade do teste.
O micronúcleo (MN) pode ser definido como uma pequena massa nuclear
delimitada por membrana e separada do núcleo principal que se forma durante a telófase da
mitose ou meiose, quando o envoltório nuclear é reconstituído ao redor das células filhas.
Desse modo, são resultantes de fragmentos cromossômicos acêntricos ou de cromossomos
inteiros que se perderam do núcleo principal. Assim sendo, o MN representa perda de
cromatina em consequencia de dano cromossômico estrutural (fragmento) ou dano no
aparelho mitótico (Fenech, 1997) (Figura 4).
Outro marcador importante de danos possível de se observar com este teste são as
pontes nucleoplasmáticas (PN). As PN são marcadores de instabilidade genômica que se
expressam como ligações contínuas entre os núcleos das células binucledas. São resultantes
de rearranjos cromossômicos envolvendo mais de um centrômetro (ex. cromossomos
dicêntricos) ou cromátides que migram para pólos opostos da célula durante a anáfase
(Figura 4).
Figura 4. Diagrama mostrando a origem do micronúcleo (MN) a partir de um fragmento cromossômico ou de
um cromossomo inteiro (a). Formação de ponte nucleoplasmática (PN) a partir de um cromossomo dicêntrico
nos quais os centrômeros são puxados para pólos opostos da célula. [Adaptado de Fenech (2000)].
A contagem de micronúcleos e pontes nucleoplasmáticas nos ensaios in vitro foi
realizada em células binucleadas obtidas com a adição de citocalasina B (CitB), o que
permite uma medida mais precisa da freqüência destes danos citogenéticos (Fenech, 1997).
A técnica de obtenção de células binucleadas foi introduzida por Fenech e Morley (1985), e
permite a análise destes danos na primeira divisão celular após o tratamento com o agente a
ser testado.
Neste estudo foi realizada a técnica para a observação de micronúcleos e pontes
nucleoplasmáticas (PN) em células V79 binucleadas:
Foram semeadas em 1x10
5
células para tratamento por 24 h, e 5x10
4
para o
tratamento por 48 h com os CNT (Figura 5). Após os tratamentos as culturas foram lavadas
por 2x com Hank’s, tripsinizadas e centrifugadas por 5 minutos a 900 r.p.m. O “pellet” foi
então ressuspenso em solução hipotônica gelada (KCl-0,075 M), adicionou-se 3 gotas de
formaldeído e homogeneizou-se cuidadosamente com pipeta Pasteur. Esta suspensão
celular foi centrifugada novamente por 5 minutos a 900 r.p.m. e ressuspendida em 3 mL de
fixador (metanol/ácido acético 3:1 v/v). Esta operação é repetida por mais duas vezes e, o
s
obrenadante descartado. A suspensão celular é
água destilada a 4°C.
As lâminas foram
coradas com solução de Giemsa
(Na
2
HPO
4
0,06M e KH
2
PO
4
0
secas ao ar e submetidas a
análise
Foram avaliadas
1000 células binucleadas com citoplasma bem preservado.
Figura 5:
Esquema representativo dos protocolos de tratamento para o teste de micronúcleo (MN). Foram
3.6
.1 Índice de Divisão Nuclear (IDN)
O índice de divisão nuclear (IDN) foi determinado pela analise de 1000 células por
obrenadante descartado. A suspensão celular é
gotejada
em uma lâmina com um filme de
coradas com solução de Giemsa
5
% diluído em tampão fosfato
0
,06M – pH 6,8) por 5
minutos, lavados com água destilada,
análise
por microscopia de luz transmitida (aumento de 400x)
1000 células binucleadas com citoplasma bem preservado.
critérios para identificação de micronúcleos
foram baseados em Fenech (
2000).
a) Exposição por 24 h
b) Exposição por 48 h
Esquema representativo dos protocolos de tratamento para o teste de micronúcleo (MN). Foram
realizados dois tempos de tratamento: sendo as culturas expostas, aos CNT, por 24 h
(a) e 48 h (b).
.1 Índice de Divisão Nuclear (IDN)
:
O índice de divisão nuclear (IDN) foi determinado pela analise de 1000 células por
lâmina. Somente as células com o citoplasma bem preservado, contendo de 1 a
foram computadas com auxilio de contador de células digital e microscópio de luz
em uma lâmina com um filme de
% diluído em tampão fosfato
minutos, lavados com água destilada,
por microscopia de luz transmitida (aumento de 400x)
.
1000 células binucleadas com citoplasma bem preservado.
Os
2000).
Esquema representativo dos protocolos de tratamento para o teste de micronúcleo (MN). Foram
(a) e 48 h (b).
O índice de divisão nuclear (IDN) foi determinado pela analise de 1000 células por
lâmina. Somente as células com o citoplasma bem preservado, contendo de 1 a
4 núcleos
foram computadas com auxilio de contador de células digital e microscópio de luz
transmitida. O IDN foi calculado de acordo com Eastmond e Tucker (1989), usando a
seguinte fórmula:
IDN = [M1 + 2(M2) + 3(M3) + 4(M4)]/ N
Onde M1 - M4 são os números de células com 1, 2, 3 e 4 núcleos, respectivamente;
N é o número total de células analisadas.
3.7 Análise estatística dos dados:
Foi realizado um mínimo de três experimentos para cada parâmetro analisado. Os
resultados dos experimentos são expressos como média e desvio padrão. Os dados dos
grupos tratados foram comparados ao controle negativo dos respectivos experimentos. Os
dados em todo o estudo foram analisados usando os testes: “One-Way ANOVA” seguida
do teste de Tukey. O valor de p <0,05 foi considerado significativo. Para realização dos
testes usou-se o programa estatístico SigmaStat para Windows Versão 3.5, Jandel
Corporation.
Uma análise de regressão linear foi aplicada para se examinar a existência de efeito
dose-resposta. O significado estatístico foi analisado usando-se o teste-t.
4. RESULTADOS
4.1 Viabilidade celular:
Foram realizados experimentos de viabilidade celular com a linhagem V79
utilizando o “Cell Proliferation Kit II” (XTT). Após um período de 24 h na presença de
CNT, as culturas foram lavadas por 2x com solução de Hank's e reincubadas com meio de
cultura completo sem CNT. Foram avaliadas diversas concentrações dos nanotubos em
estudo (6,25; 12,5; 25; 50 µg/mL para CSCNT_pu, CSCNT_np, CSCNT_Fe; e 6,25; 12,5;
25; 50; 100 e 200 µg/mL para MWCNT) e comparadas ao controle negativo. A
quantificação das células viáveis foi realizada nos tempos 24 h, 48 h (5x10
4
céls. semeadas)
e 120 h (1x10
4
céls. semeadas) após a exposição.
Após 24 h do tratamento, observou-se uma redução significativa (p<0,05) de 26 a
89% de células viáveis nas concentrações de 25 a 200 µg/mL de MWCNT. Neste tempo
também houve redução significativa nas concentrações de 25 e 50 µg/mL de CSCNT_pu
(43 e 70%), CSCNT_np (37 e 55%) e CSCNT_Fe (31 e 52%), respectivamente, quando
comparadas ao controle negativo (Tabela 1, Anexo A).
Em 48 h após a exposição, MWCNT induziu 54 a 88% de citotoxicidade nas
concentrações de 50 a 200 µg/mL (p<0,05). Enquanto, CSCNT_np induziu 37 e 62% de
citotoxicidade nas concentrações de 25 e 50 µg/mL (p<0,05), respectivamente. CSCNT_pu
e CSCNT_Fe reduziram significativamente a viabilidade, somente, na concentração de 50
µg/mL (respectivos 45 e 27%) (Tabela 2, Anexo A).
Tabela 1: Porcentagens da viabilidade celular, da linhagem V79, observada 24 h após a exposição à
MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np, CSCNT_Fe, o ensaio utilizou o “Cell Proliferation Kit II” (XTT):
Viabilidade Celular (Tempo 24 h)
MWCNT
1
CSCNT_pu CSCNT_np CSCNT_Fe
µg/mL
[µg/cm
2
]
Média(%)
(±)DP Média(%)
(±)DP
Média(%)
(±)DP
Média(%)
(±)DP
CN
100 8 100 16 100 11 100 15
DXR
83 5 82 6 84 6 79 3
6,25 [1,75]
100 4 78 12 105 14 98 7
12,5 [3,5]
98 7 75 15 100 6 85 10
25 [7]
74* 15 57* 19 63* 19 69* 11
50 [14]
69* 7 30* 9 45* 12 48* 12
100 [28]
18* 13 NT - NT - NT -
200 [56]
11* 5 NT - NT - NT -
1
As concentrações 100 e 200 µg/mL só foram avaliadas para MWCNT. NT: concentrações não testadas.
(*) Diferença estatisticamente significativa quando comparada ao controle negativo (p<0,05).
CN: controle negativo; DXR: doxorrubicina (0,15 µg/mL - tratamento por 2 h).
Foram realizados 4 experimentos independentes, sendo cada experimento realizado em duplicata. (±) DP: Desvio Padrão.
Tabela 2: Porcentagens da viabilidade celular, da linhagem V79, observada em 48 h após a exposição à
MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np, CSCNT_Fe, o ensaio utilizou o “Cell Proliferation Kit II” (XTT):
Viabilidade Celular (Tempo 48 h)
MWCNT
1
CSCNT_pu CSCNT_np CSCNT_Fe
µg/mL
[µg/cm
2
]
Média(%)
(±)DP Média(%)
(±)DP
Média(%)
(±)DP
Média(%)
(±)DP
CN
100 6 100 5 100 4 100 2
DXR
73 7 81 12 75 21 77* 10
6,25 [1,75]
114 23 93 7 92 7 89 5
12,5 [3,5]
111 18 93 6 91 5 92 4
25 [7]
73 20 83 11 63* 16 86 4
50 [14]
46* 25 55* 15 38* 19 73* 8
100 [28]
44* 15 NT - NT - NT -
200 [56]
12* 5 NT - NT - NT -
1
As concentrações 100 e 200 µg/mL só foram avaliadas para MWCNT. NT: concentrações não testadas.
(*) Diferença estatisticamente significativa quando comparada ao controle negativo (p<0,05).
CN: controle negativo; DXR: doxorrubicina (0,15 µg/mL - tratamento por 2 h).
Foram realizados 4 experimentos independentes, sendo cada experimento realizado em duplicata. (±) DP: Desvio Padrão.
A viabilidade celular também foi analisada após 120 h da exposição aos CNT. Nesses
ensaios, reduções de 27 e 55% (p<0,05) das células vivas foram encontradas para as
concentrações de 100 e 200 µg/mL de MWCNT. Uma redução de 25% (p<0,05) foi
observada para CSCNT_np na concentração de 50 µg/mL. Porém, não foram observadas
reduções significativas para CSCNT_pu e CSCNT_Fe. DXR induziu uma diminuição
significativa de ~38% de células vivas, em relação ao controle negativo. (Tabela 3, Anexo
A).
Tabela 3: Porcentagens da viabilidade celular, da linhagem V79, observada em 120 h após a exposição à
MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np, CSCNT_Fe, o ensaio utilizou o “Cell Proliferation Kit II” (XTT):
Viabilidade Celular (Tempo 120 h)
MWCNT
1
CSCNT_pu CSCNT_np CSCNT_Fe
µg/mL
[µg/cm
2
]
Média(%)
(±)DP Média(%)
(±)DP Média(%)
(±)DP Média(%)
(±)DP
CN
100 6 100 7 100 9 100 5
DXR
62* 9 61* 17 67* 10 58* 8
6,25 [1,75]
82 9 91 17 89 9 81 19
12,5 [3,5]
77 7 96 5 86 1 88 13
25 [7]
85 9 86 4 79* 4 86 18
50 [14]
90 4 76 2 75* 2 84 14
100 [28]
73* 6 NT - NT - NT -
200 [56]
45* 16 NT - NT - NT -
1
As concentrações 100 e 200 µg/mL só foram avaliadas para MWCNT. NT: concentrações não testadas.
(*) Diferença estatisticamente significativa quando comparada ao controle negativo (p<0,05).
CN: controle negativo; DXR: doxorrubicina (0,15 µg/mL - tratamento por 2 h).
Foram realizados 3 experimentos independentes, sendo cada experimento realizado em duplicata. (±) DP: Desvio Padrão.
4.1.1 Efeito dose-resposta (Viabilidade celular):
O tratamento de células V79 com CNT diminuiu a viabilidade celular de forma
dose-dependente nos tempos de 24 e 48h após o tratamento (r≤-0,895, p<0,05, teste-t). Para
a viabilidade apresentada no tempo de 120 h após a exposição aos CNT, exceto para
CSCNT_Fe (r=-0,477, p>0,05, teste-t), verificou-se efeito dose-resposta para MWCNT,
CSCNT_pu e CSCNT_np (r≤-0,887, p<0,05, teste-t).
4.1.2 Valores de IC
50
(Viabilidade celular):
A partir da curva de dose-resposta obtida com os ensaios de viabilidade celular
utilizando-se o Kit XTT, calculou-se a IC
50
da viabilidade celular in vitro para os tempos de
24 h, 48 h e 120 h após a exposição. O valor foi estimado por meio de regressão não linear
utilizando-se o programa estatístico GraphPad Prism versão 5.0 para Windows (GraphPad
Software, San Diego California).
Assim, observando-se os tempos de 24 e 48 h após a exposição, nota-se que, exceto
para CSCNT_np, há um aumento da concentração de CNT requerida para a inibir 50% da
viabilidade celular. O que indica menor citotoxicidade de MWCNT, CSCNT_pu e
CSCNT_Fe com o passar do tempo após a exposição. Também é possível notar que as
IC
50
's no tempo de 120 h são ainda maiores, indicando uma recuperação da viabilidade
celular (Tabela 4, Anexo A).
Para o tempo de 120 h após a exposição, a menor IC
50
observada pertence a
CSCNT_np (115,0 µg/mL), seguido de CSCNT_pu (158,1 µg/mL), CSCNT_Fe (177,5
µg/mL) e, finalmente, MWCNT (199,8 µg/mL) (Tabela 4).
Tabela 4: Concentrações de nanotubos de carbono responsáveis por inibir 50% da viablidade (kit XTT) da
linhagem V79, nos tempos de 24, 48 e 120 h após a exposição:
Número de
Tempo após
IC
50
(µg/mL)
céls. semeadas
a exposição MWCNT CSCNT_pu
CSCNT_np
CSCNT_Fe
5x10
4
24 h
61,3 ± 1,4 28,6 ± 1,1 59,0 ± 1,5 55,9 ± 1,2
48 h
69,8 ± 1,4 83,4 ± 1,2 45,0 ± 1,3 134,5 ± 1,2
1x10
4
120 h
199,8 ± 1,4 158,1 ± 1,1 115,0 ± 1,2 177,5 ± 1,6
Valores de IC
50
±DP (µg/mL)
4.2 Ensaio clonogênico:
Os efeitos dos CNT sobre a formação de colônias da linhagem V79, também foram
analisados. No ensaio de clonogenicidade, as colônias formadas (com mais de 50 células)
são contadas, sendo possível avaliar a capacidade reprodutiva das células tratadas.
Trezentas células semeadas foram expostas, continuamente por 7 dias, à diferentes
concentrações de CNT (3,125; 6,25; 12,5; 25; 50 µg/mL).
Após 7 dias de exposição, o número de colônias foi reduzido (p<0,05) em cerca de:
35 e 52% por 25 e 50 µg/mL de MWCNT; 29% por 50 µg/mL de CSCNT_pu; e 55, 66, 94
e 99% por 6,25; 12,5; 25 e 50 µg/mL de CSCNT_np, respectivamente. DXR reduziu
significativamente o número de colônias em aproximadamente 59%, quando comparado ao
controle negativo. CSCNT_Fe não demonstrou reduções significativas no número de
colônias (Tabela 5, Anexo B).
Os CNT diminuiram a capacidade de formação de colônias, da linhagem V79, de
forma dose-dependente para os tratamento com MWCNT, CSCNT_pu e CSCNT_np (r≤-
0,841, p<0,05, teste-t). Já para a exposição à CSCNT_Fe (r=-0,743, p>0,05, teste-t), não se
verificou efeito dose-resposta.
Tabela 5: Porcentagens do número de colônias formadas após 7 dias de exposição à MWCNT, CSCNT_pu,
CSCNT_np, CSCNT_Fe:
Ensaio clonogênico (7 dias)
MWCNT
1
CSCNT_pu CSCNT_np CSCNT_Fe
µg/mL
[µg/cm
2
]
Média
(%) (±)DP
Média
(%) (±)DP
Média
(%) (±)DP
Média
(%) (±)DP
CN
100 12 100 14 100 7 100 5
DXR
44* 10 42* 19 44* 11 35* 19
3,125 [0,625]
99 11 87 6 86 6 94 3
6,25 [1,25]
89 12 92 6 45* 17 89 5
12,5 [2,5]
79 15 92 6 34* 13 86 9
25 [5]
65* 9 89 8 6* 3 80 12
50 [10]
48* 11 71* 7 1* 1 83 3
(*) Diferença estatisticamente significativa quando comparada ao controle negativo (p<0,05).
CN: controle negativo; DXR: doxorrubicina (0,15 µg/mL - tratamento por 2 h).
Foram realizados 4 experimentos independentes, sendo cada experimento realizado em triplicata. (±) DP: Desvio Padrão.
A IC
50
também foi calculada para o efeito dos nanotubos sobre a capacidade de
células da linhagem V79 formar colônias. A maior inibição de colônias foi observada por
CSCNT_np, seguido de MWCNT, CSCNT_pu e por último CSCNT_Fe. (Tabela 6).
Tabela 6: Concentrações de nanotubos de carbono responsáveis por inibir 50% da formação de colônias da
linhagem V79:
CSCNT_pu
CSCNT_np
CSCNT_Fe
Além do efeito dos CNT sobre o número de colônias formadas da linhagem V79,
também pode ser descrito
o efeito
MWCNT (50 µg/mL). (Figur
a
Tabela 7
Número de colônias
Área total das colônias
Área média das colônias
Figura 10:
Colônias de células V79 após 7 dias de incubação com (a) somente meio de
Tabela 7: Efeitos de
50 µg/ml de MWCNT
(“Image Processing
and Analysis in Java
4.3
Concentrações testadas nos experimentos de genotoxicidade
Para os experimentos de genotoxicidade (teste do micronúcleo e ensaio cometa)
CSCNT_pu, CSCNT_np e
CSCNT_Fe.
(a)
Figura 6:
Ensaio clonogênico (7 dias)
IC
50
(µg/ml)
MWCNT
47,6 ± 1,1
CSCNT_pu
132,3 ± 1,3
CSCNT_np
6,2 ± 1,3
CSCNT_Fe
150,1 ± 1,3
Valores de IC
50
±DP (µg/mL)
Além do efeito dos CNT sobre o número de colônias formadas da linhagem V79,
o efeito
das partículas sobre o tamanho
das colônias. Observou
que MWCNT causou uma redução, também, no tamanho das colônias formadas.
semeadas formaram colônias menores quando expostas aos
CNT, como
demonstrado
a
6, Tabela 7).
CN MWCNT (50 µg/mL)
94 62
0,465 cm
2
0,143 cm
2
5x10
-3
cm
2
2x10
-3
cm
2
Colônias de células V79 após 7 dias de incubação com (a) somente meio de
cultura
(CN: controle negativo) e (b) 50 µg/ml de MWCNT disperso em meio de cultura completo.
frascos de cultura, área fotografada de ~15 cm
2
. Barra de escala: 1cm.
50 µg/ml de MWCNT
após, 7 dias de exposição, sobre o tamanho da área superficial das
colônias da linhagem V79. Análise descritiva, obtida por meio da área fotografada e processada por ImageJ
and Analysis in Java
”: http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html) .
Concentrações testadas nos experimentos de genotoxicidade
:
Para os experimentos de genotoxicidade (teste do micronúcleo e ensaio cometa)
foram utilizadas as concentrações 1,5625; 3,125;
6,25 e 12,5
µg/mL de
CSCNT_Fe.
As concentrações 6,25 e 12,5
µg/mL obtiveram
(b)
Além do efeito dos CNT sobre o número de colônias formadas da linhagem V79,
das colônias. Observou
-se
que MWCNT causou uma redução, também, no tamanho das colônias formadas.
As células
demonstrado
para
cultura
completo
(CN: controle negativo) e (b) 50 µg/ml de MWCNT disperso em meio de cultura completo.
Fotografias de
após, 7 dias de exposição, sobre o tamanho da área superficial das
colônias da linhagem V79. Análise descritiva, obtida por meio da área fotografada e processada por ImageJ
Para os experimentos de genotoxicidade (teste do micronúcleo e ensaio cometa)
µg/mL de
MWCNT,
µg/mL obtiveram
viabilidade igual ou superior a 70% para todos os tipos de nanotubos, quando analisadas
com kit XTT.
4.4 Ensaio Cometa em V79:
O Ensaio Cometa foi usado, em sua versão padrão (ST), para estudar a indução de
quebras de fita simples e duplas e, sítios álcali-lábeis nas moléculas de DNA. Também
foram utilizadas as enzimas hOGG1 e Endo III para detecção de danos oxidativos no DNA,
induzidos pelos CNT, em células da linhagem V79. As culturas de V79 foram expostas por
24 h à MWCNT e CSCNT_np. A porcentagem de DNA na cauda foi usada como
parâmetro de indução de danos no DNA.
MWCNT e CSCNT_np não induziram danos com diferenças estatisticamente
significativas na versão padrão (ST) do ensaio (p>0,05), quando comparadas ao seu
respectivo controle negativo. No entanto, uma relação dose-resposta pode ser notada no
moderado aumento de danos apresentado por MWCNT (r=0,894, p<0,05, teste-t) na versão
ST.
No entanto, quando as enzimas hOGG1 ou Endo III foram adicionadas, foi possível
observar a indução de danos com diferenças estatísticas, em relação aos seus respectivos
controles negativos:
-MWCNT induziu danos oxidativos (≥ 15% de DNA na cauda) em todas as
concentrações testadas, quando analisados com a enzima hOGG1 (p<0,05). E
quando analisadas com a enzima Endo III, foi observado a indução significativa de
danos oxidativos (26% de DNA na cauda) na maior concentração testada (12,5
µg/mL) de MWCNT( Tabela 8, Anexo C). Sendo observado uma relação dose-
dependente no tratamento com as duas enzimas para MWCNT ( r≥0,881, p<0,05,
teste t).
-CSCNT_np induziu 19 e 17% de DNA na cauda (p<0,05) nas
concentrações de 3,125 e 12,5 µg/mL, respectivamente; embora sem diferença
estatística foi observado uma média de 20% de DNA na cauda na concentração de
6,25 µg/mL (p=0,08), induzida por CSCNT_np detectados com a enzima hOGG1.
Já quando analisadas com a enzima Endo III, foi observado a indução de 26% de
DNA na cauda (p<0,05) na maior concentração testada (12,5 µg/mL) de CSCNT_np
(Tabela 8, Anexo C). Efeito dose-resposta foi notado somente para o tratamento
com o uso da enzima Endo III (r=0,906, p<0,05, teste t).
Quando se comparou as concentrações pareadamente da versão padrão e a versão
com as enzimas hOGG1 ou Endo III (ex.: 12,5 µg/mL ST x 12,5 µg/mL hOGG1),
verificou-se diferença na concentração de 12,5 µg/mL de MWCNT, que induziu 27% de
DNA na cauda com hOGG1, enquanto 15% de DNA na cauda foi detectado para versão
ST (p<0,05). Nesta mesma concentração, CSCNT_np induziu 26% de DNA na cauda com
Endo III contra 10% da versão ST (p<0,05) (Tabela 8).
MWCNT e CSCNT_np não mostraram diferenças (p>0,05) quanto a indução de
danos, quando comparou-se as concentrações pareadamente nos três protocolos estudados:
versão ST, hOGG1 e EndoIII (ex.: 12,5 µg/mL ST MWCNT x 12,5 µg/mL ST
CSCNT_np). (Tabela 8).
Tabela 8: Danos no DNA detectados pelo ensaio cometa (porcentagem de DNA na cauda), na linhagem V79,
expostas por 24 h a MWCNT e CSCNT_np:
Ensaio Cometa (% de DNA na cauda)
Tratamento: ST hOGG1 EndoIII
µg/mL [µg/cm
2
]
Média (%) DP
Média (%) DP
Média (%) DP
CN
7 1 6 2 8 2
DXR
17* 1 14* 1 22* 5
MWCNT
1,5625 [0,4375]
11 1 16* 2 11 0
3,125 [0,875]
11 4 15* 2 19 5
6,25 [1,75]
11 3 15* 1 14 2
12,5 [3,5]
15 5 27*# 2 26* 10
CSCNT_np
1,5625 [0,4375]
10 3 9 1 15 7
3,125 [0,875]
11 4 19* 4 17 5
6,25 [1,75]
8 5 20 14
15 3
12,5 [3,5]
10 2 17* 1 26*# 6
(*) Diferença estatisticamente significativa, quando comparado ao respectivo controle negativo (p<0,05).
(#) Diferença estatisticamente significativa, comparação entre concentrações pareadas (ex.:12,5x12,5) STxhOGG1 e STxEndoIII
(p<0,05).
CN: controle negativo; DXR: doxorrubicina (0,15 µg/mL – tratamento por 2 h – tempo de colheita: 5h após o término do tratamento).
Foram realizados 3 experimentos independentes, sendo cada experimento realizado em triplicata. (±) DP: Desvio Padrão.
4.5 Teste do micronúcleo em células V79:
4.5.1 Índice de Divisão Nuclear (IDN):
O índice de divisão nuclear é um parâmetro eficiente para se demonstrar a resposta
mitogênica ou efeito citostático de agentes em estudo pelo teste de micronúcleo.
O IDN observado foi cerca de 1,69 para controle negativo e grupos tratados (DXR e
CNT), no tempo de 24 h de exposição (Tabela 9, Anexo D). Para o tempo de 48 h de
exposição, o IDN foi de aproximadamente 1,42 para controle negativo e grupos tratados
(Tabela 9, Anexo D). Não foi observada diferença estatisticamente significativa dos grupos
tratados em relação ao controle negativo, em seus respectivos tempos de tratamento.
4.5.2 Frequência de micronúcleos (MN):
Micronúcleos são expressos em células em divisão, que contenha fragmentos
cromossômicos acêntricos e/ou cromossomos inteiros incapazes de migrar para os pólos da
célula durante a mitose. Foram analisadas a frequência de MN em células binucleadas,
obtidas com a adição de citocalasina B, em dois tempos de exposição (24 e 48 h) à
MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np e CSCNT_Fe.
Embora seja possível notar um discreto aumento na frequência de MN induzidos
por CSCNT_pu (p>0,05), não se verificou aumento significativo de micronúcleos
induzidos pelos nanotubos testados em células V79 expostas por 24 h. Também não se
observa a relação dose-resposta, ou seja o aumento da dose não acarreta no aumento de
células com MN, em nenhuma das partículas estudadas. DXR induziu uma frequência
significativa de MN. (Tabela 9, Anexo D).
Quando as células foram expostas por um período de 48 h, MWCNT induziu
(p<0,05) uma frequência de 42 micronúcleos nas concentrações de 6,25 e 12,5 µg/mL.
Além disso, verifica-se também um aumento na média de células com MN nas culturas
tratadas com CSCNT_np, embora esse aumento não apresente significado estatístico
(p>0,05). A relação dose-resposta também não foi observada para as células expostas por
48 h aos CNT. DXR, novamente, induziu uma frequência significativa de MN. (Tabela 9,
Anexo D).
4.5.3 Frequência de pontes nucleoplasmáticas (PN):
Pontes nucleoplasmáticas são ligações contínuas entre os núcleos de uma célula
binucleada e são resultantes, principalmente, de cromossomos dicêntricos nos quais os
centrômeros são puxados para pólos opostos durante a anáfase.
Na exposição por 24 h aos CNT, a maior frequência de PN foi observado para
CSCNT_pu. Ocorrendo um aumento estatisitcamente significativo, somente, na
concentração de 3,125 µg/mL, em relação ao controle negativo. Para a avaliação de PN
também não se observou efeito dose-resposta. DXR induziu uma frequência de 60 PN
(p<0,05) (Tabela 9, Anexo D).
Em relação a exposição de 48 h aos CNT, o maior índice de PN foi observado para
MWCNT (p>0,05), embora não ocorra diferença estatística em relação ao controle
negativo. Uma relação dose-resposta (r=0,902, p<0,05, teste-t) também pode ser detectada
neste discreto aumento. DXR induziu uma frequência de 72 PN (p<0,05) (Tabela 9, Anexo
D).
Tabela 9: Índice de divisão nuclear, frequência de micronúcleos e pontes nucleoplasmáticas observadas após
24 e 48 h de exposição à MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np e CSCNT_Fe, na linhagem de células V79:
Tratamento
µg/mL [µg/cm
2
]
Índice de
Divisão Nuclear (IDN)
Frequência de MN Frequência de PN
24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h
Média (±)DP
Média (±)DP
Média (±)DP
Média (±)DP
Média (±)DP
Média (±)DP
CN
1,74 0,12 1,46 0,15 14 3 18 6 11 6 11 5
DXR
1,76 0,07 1,39 0,04 150* 22 184* 12 60* 14 72* 26
MWCNT
1,5625 [0,4375]
1,69 0,06 1,52 0,14 20 2 35 6 2 2 12 1
3,125 [0,875]
1,68 0,04 1,54 0,20 23 5 33 4 10 11 20 7
6,25 [1,75]
1,72 0,05 1,46 0,09 18 4 42* 11 12 9 26 6
12,5 [3,5]
1,68 0,04 1,41 0,09 20 6 42* 10 15 10 28 6
CSCNT_pu
1,5625 [0,4375]
1,73 0,09 1,43 0,13 16 5 15 8 24 6 9 7
3,125 [0,875]
1,70 0,08 1,42 0,19 26 11 22 16 33* 7 15 6
6,25 [1,75]
1,63 0,07 1,42 0,16 29 13 23 19 19 5 10 4
12,5 [3,5]
1,67 0,04 1,39 0,19 26 3 22 13 19 7 13 4
CSCNT_np
1,5625 [0,4375]
1,78 0,05 1,40 0,14 21 6 24 6 16 7 14 4
3,125 [0,875]
1,76 0,04 1,38 0,15 15 7 32 19 9 5 17 6
6,25 [1,75]
1,74 0,02 1,31 0,09 15 1 31 10 11 7 16 5
12,5 [3,5]
1,68 0,11 1,34 0,10 10 5 35 11 3 2 18 9
CSCNT_Fe
1,5625 [0,4375]
1,64 0,12 1,45 0,28 14 3 20 5 5 2 11 5
3,125 [0,875]
1,66 0,12 1,47 0,24 18 5 21 4 7 3 13 11
6,25 [1,75]
1,63 0,10 1,42 0,19 17 3 20 5 5 3 12 4
12,5 [3,5]
1,63 0,14 1,42 0,20 15 3 24 4 4 2 18 9
(*) Diferença estatisticamente significativa quando comparada ao controle negativo (p<0,05).
CN: controle negativo; DXR: doxorrubicina (0,15 µg/mL – tratamento por 2 h).
Foram realizados 3 experimentos independentes.. (±) DP: Desvio Padrão.
5. DISCUSSÃO
5.1 Aspectos gerais:
Os nanotubos de carbono (CNT) são considerados os super-materiais do século 21,
e juntamente com esse fato, trazem novos paradigmas para campos diversos, incluindo
eletrônica, integridade estrutural, engenharia biomédica, engenharia de tecidos, “drug
delivery”, nano-injetores, neuro-engenharia, terapia gênica, e tecnologia de biossensores.
Isso se deve principalmente ao fato dos CNT apresentarem propriedades elétricas e
mecânicas exclusivas.
Apesar dessas características atraentes, a toxicidade dos nanotubos de carbono vem
se tornando uma preocupação, com vários grupos de estudo, apontando para sua
semelhança com as fibras de asbestos (amianto). Recentemente, Murr et al. (2005)
relataram que a exposição in vitro a SWCNT ou MWCNT causou citotoxicidade
semelhante ao amianto em células RAW 264.7, determinada por MTT. Resultados
semelhantes de citotoxicidade foram relatados para as linhagens celulares: macrófagos
RAW 264.7 (Soto et al. 2005), células epiteliais humanas A549 e macrófagos humanos
THB-1 (Soto et al., 2007), e macrófagos alveolares de porco-da-guiné (Jia et al., 2005).
Portanto, devido à estrutura fibrosa desses nanomateriais, paralelos foram
elaborados com o amianto e, consequentemente, é possível que nanotubos, nanofibras e
nanofios devam se encaixar ao paradigma da toxicidade de fibras o qual é baseado em uma
alta razão de aspecto (tradução literal de “aspect ratio” – a razão da dimensão maior
dimensão em relação à sua menor dimensão) e biopersistência, levando a prolongadas
respostas inflamatórias (Singh et al., 2009).
Nanopartículas têm uma tendência para formar aglomerados, isso porque são
atraídos uns pelos outros por forças de van der Waals. Os nanomateriais fibrosos
representam uma situação ainda mais complexa. Além de agregação, as fibras podem
formar um emaranhado, alterando sua rigidez, as dimensões e a área de superfície da
estrutura original (Thess et al., 1996; Maynard et al., 2004; Shvedova et al., 2005). No
presente trabalho aglomerados de nanotubos de carbono foram detectados como
precipitados sobre as células em inspeção microscópica (aumento de 400x) nas maiores
concentrações testadas, como observado em vários outros estudos (Jacobsen et al., 2008;
Pacurari et al., 2008; Wirnitzer et al., 2009).
5.2 Citotoxicidade de nanotubos de carbono:
A maioria das pesquisas toxicológicas baseia-se primeiramente em testes de
toxicidade in vitro para pavimentar o caminho para futuras aplicações in vivo. No entanto,
visando aplicações biomédicas de CNT, vários estudos in vivo já foram iniciados, enquanto
muitas questões dos estudos in vitro encontram-se ainda sem respostas (tais como, questões
relativas à administração segura de CNT para uma determinada tarefa e da sensibilidade
específica para um determinado tipo celular). A sondagem de tais questões em teste in vitro
é de fundamental relevância, por exemplo, até o momento não se verifica uma relação
linear entre massa e tolerância à toxicidade.
A toxicidade in vivo e in vitro de CNT tem sido atribuída a vários fatores, tais como,
comprimento dos tubos, tipo de funcionalização, concentração, duração da exposição, o
método de exposição, e até mesmo da presença de dispersante utilizado para solubilizar os
nanotubos. Além disso, contradições sobre a toxicidade de CNT marcam o estudo destes
nanomateiris, e assim os aspectos da toxicidade destes materiais permanecem incertos
(Firme III &
Bandaru, 2010).
5.2.1 Ensaios de viabilidade celular:
Vários pesquisadores têm alertado que os CNT podem interferir com os corantes de
vários ensaios de viabilidade celular (Monteiro-Riviere & Inman, 2006; Worle-Knirsch et
al. 2006; Davoren et al. 2007; Pulskump et al., 2007). Além da interferência física devido à
absorção de luz e espalhamento, Casey et al. (2007) relatou evidências espectroscópicas de
que SWCNT interage diretamente com vários corantes usados para avaliar a citotoxicidade.
Portanto, os estudos utilizando o ensaio com MTT para citotoxicidade estão agora em
debate. No entanto, dentre estes testes de viabilidade, os ensaios que utilizam LDH, WST-1
e XTT são consideradas confiáveis por Simon-Deckers et al. (2008).
Neste estudo foram realizados experimentos de viabilidade celular com a linhagem
V79 utilizando o “Cell Proliferation Kit II” (XTT). Após um período de 24 h na presença
de CNT, as culturas foram lavadas por 2x com solução de Hank's e reincubadas com meio
de cultura completo sem CNT. A quantificação das células viáveis foi realizada nos tempos
24, 48 h (5x10
4
céls. semeadas) e 120 h (1x10
4
céls. semeadas) após a exposição.
Observamos uma redução significativa maior que 30% (24 h após o tratamento) na
concentração de 25 µg/mL, em todos os CNT testados. CSCNT_pu foi o que apresentou
maior efeito de redução da viabilidade.
Nanotubos de carbono do tipo “cup-stacked” mostram-se como menos hidrofóbicos
que MWCNT e SWCNT, isso porque é um tipo de CNT rico em ligações oscilantes de
carbono, além de possuírem arestas abertas e uma grande proporção de defeitos estruturais.
A área de superfície deste CNT equivale a 146 m
2
g
-1
maior que a área de superfície de
MWCNT (130 m
2
g
-1
segundo Sotto et al., 2009), e menor que a área de SWCNT (731 m
2
g
-1
segundo Jacobsen et al., 2008). A estrutura do CSCNT, composta por várias arestas abertas
e ainda com alta densidade de defeitos, pode levar a uma superfície mais reativa do que as
paredes de MWCNT e SWCNT, aumentando a interação dos nanotubos com outras
espécies químicas (Moraes et al., 2008). O que poderia explicar os efeitos observados na
viabilidade.
Quando se compara os valores de IC
50
nos tempo pós-exposição 24 e 48 h, pode-se
notar que somente CSCNT_np apresentou um efeito maior sobre a redução da viabilidade,
com o aumento do tempo. O grau de contaminação por metais catalisadores nas amostras
de CNT parece ser um fator na magnitude da citotoxicidade in vitro, CSCNT_np não
passou pelo processo de purificação. Shvedova et al. (2007) relataram que SWCNT
sintetizados por HiPco ou ablação a laser e com um teor de 30% de ferro e 20% de níquel,
respectivamente, gerou radicais hidroxila e causou uma diminuição significativa da
viabilidade e declínio nos níveis de glutationa em células epiteliais de brônquios humanos
BEAS-2B.
Fatores extrínsecos tais como resíduos de catalisador, podem contribuir para
toxicidade apresentada pelos CNT. Por exemplo, Fe, Co, Ni, etc., catalisadores utilizados
no processo de síntese, podem constituir de 25 a 40% de peso de CNT (Shvedova et al.,
2003). Estes metais incorporados podem catalisar espécies oxidativas em células e tecidos
através da geração de radicais livres (ZHANG et al., 2007; LACERDA et al., 2006). Uma
espécie oxidativa gerada durante uma resposta inflamatória natural pode interagir com
esses metais de transição para desencadear cascatas ciclo-redox que sequestram
antioxidantes endógenos e causam danos oxidativo aos tecidos (Kagan et al., 2005).
Embora, usando os ensaios de viabilidade celular, criticados, “Alamar blue”,
“Neutral red” e MTT, foram reportados para SWCNT contendo resíduos de ferro um alto
potencial citotóxico em células A549 ou BEAS-2B (Herzog et al., 2007), células BEAS-2B
(Shvedova et al., 2004), e macrófagos RAW 264.7 (Kagan et al., 2006). Amostras de
SWCNT com baixa contaminação com ferro foram descritos como significativamente
menos tóxicos (Kagan et al. 2006; Herzog et al., 2007). E ainda, o tratamento de SWCNT
não purificados, com um quelante de ferro para remover contaminantes, demonstrou
reduzir significativamente tanto a geração de oxidantes quanto a citotoxicidade (Shvedova
et al., 2004).
Em contrapartida, Davoren et al. (2007) relataram um nível substancialmente mais
baixo de citotoxicidade para SWCNT contendo 10% de ferro (p/p) em células A549. Além
disso, dois outros estudos demonstraram baixa citotoxicidade para SWCNT não purificados
(contendo grande quantidade de resíduos de ferro), SWCNT purificados (quantidade de
ferro reduzida), e MWCNT purificados (pequena quantidade de ferro) em células A549 e
macrófagos alveolares de rato NR8383 (Worle-Knirsch et al. 2006; Pulskump et al., 2007).
Embora esses autores tenham realizado
os ensaios de viabilidade usando o MTT, a
citotoxicidade também não foi relatada com uso de outros ensaios, como LDH, iodeto de
propídeo, WST-1, apoptose, ou potencial de membrana mitocondrial.
Interessantemente, Monteiro-Riviere et al. (2005) demonstraram que mesmo após a
purificação, MWCNT levaram a uma resposta de irritação em queratinócitos epidérmicos
humanos (HEK). MWNT purificados foram incubados por um período de 48 h, os
nanotubos foram localizados dentro das células e induziram a produção de citocinas pró-
inflamatórias (IL-8) e conduziram a uma diminuição da viabilidade celular. A falta de
partículas catalisadoras levou os autores a concluírem que os nanotubos por si só
representam um potencial perigo dermatológico, necessitando de uma completa avaliação
toxicológica antes da exposição pública. Nós também observamos que CSCNT após a
purificação induziu citotoxicidade.
Bottini et al. (2006) comparou a toxicidade de MWCNT purificados e MWCNT
oxidados em linfócitos T. O pesquisador verificou que MWCNT oxidados se mostraram
mais tóxicos e foram capazes de induzir apoptose em dose de 400 µg/ml, o que corresponde
a aproximadamente 10 milhões de nanotubos de carbono por célula. O autor ainda
descreveu que a dose menos tóxica verificada foi igual a 40 µg/ml de nanotubos de
carbono, o que corresponde a ~10
6
CNT por célula, com base em uma média de
comprimento igual a 1 µm e um diâmetro de 40 nm, dando uma massa molecular média de
5x10
9
Da. O autor estabelece esse valor como um limite de nanotubos por célula a ser
aplicada na área da nanomedicina. Neste trabalho para um tratamento de 24 h, não se
observou efeito citotóxico, para todos os nanotubos testados, em concentrações menores
que 12,5 µg/ml.
De acordo com Kam et al. (2005) e Lu et al. (2004), a toxicidade dos CNT pode
ocorrer dentro de um intervalo de concentração abrangendo seis ordens de grandeza (isto é,
a partir de 5 ng/mL a 10 mg/mL de CNT). Embora as diferenças nos métodos
experimentais sejam comumente responsabilizadas por essa variabilidade, as razões pelas
quais elas ocorrem podem ter outras origens:
- os nanotubos de carbono utilizados para a experimentação cobrem uma ampla
gama de comprimentos de nanômetros a micrômetros. Cada CNT pode ser intrinsecamente
diferente, devido a limitações na fabricação de nanotubos estruturalmente idênticos, com o
mínimo de impurezas. Além disso variações sutis na carga local e global, e resíduos de
catalisador (normalmente Fe, Co, Mn e Ni) são estão presentes nos tubos (Firme III &
Bandaru, 2010).
- outra questão interessante é se todos os nanotubos de carbono entram de fato em
contato com todas as células.
Estes fatos explicariam a amplitude de variações observadas para as concentrações
citotóxicas às células tratadas com CNT.
No entanto é importante ressaltar que existe uma tolerância celular, em um
determinado intervalo de concentrações, aos nanotubos. Simon-Deckers et al. (2008)
mostraram que a liberação de lactato desidrogenase - LDH (marcador de ruptura e danos na
membrana plasmática das células) foi baixa quando as concentrações de incubação
aumentaram até 50 µg/mL de MWCNT, no entanto, a partir deste ponto uma forte liberação
de LDH foi observada.
Tendências negligenciáveis de toxicidade no fígado e no pulmão (indicados através
de níveis constantes MDA) após a exposição por via intravenosa a SWCNT, em
concentrações crescentes, também foram observadas. No entanto, na condição experimental
de 1 mg por rato, os níveis de MDA aumentaram significativamente (Yang et al., 2008a).
Depois de um nível constante de baixa toxicidade em que não se verificou alteração dos
níveis de MDA com o aumento da dosagem de CNT, também foi notado, uma inflexão
súbita nos níveis de MDA em células embrionárias de rato (PMEF), na concentração de
100 µg/mL (Yang et al., 2008b).
Uma relação tão drástica entre a toxicidade e a concentração de CNT implica em
uma fronteira nítida entre baixa toxicidade e um grande evento tóxico quando uma
concentração crítica específica é atingida (e que ainda dependente do tipo celular), isso
indica que há um grau de tolerância inata ao CNT (Firme III & Bandaru, 2010).
Mais fascinante do que a tolerância aos CNT são os dados que revelam o que parece
ser uma regeneração celular pós-exposição. Observamos que as células V79 tratadas por 24
h com MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np e CSCNT_Fe alcançaram níveis de viabilidade
similar ao do controle negativo após 120 h (todos com mais de 70% de células vivas na
concentração de 50 µg/mL). Jacobsen et al. 2008, realizou experimentos onde células
epiteliais mutantes de pulmão (FE1-Meta
MT
) foram expostas a 100 µg/mL de SWCNT no
meio de cultura, o meio de cultura contendo CNT era substituído a cada 3 dias. Entre 3 e 69
dias, o número de células viáveis foram em média 48% menor do que o controle. No
entanto, no final do dia 69 de estudo as células foram lavadas com PBS e incubadas com
meio de cultura sem CNT, e após 3 dias a viabilidade foi analisada, e o número de células
voltou a um nível similar ao do controle.
Hirano et al. (2008)
também mostram um aumento do número de células viáveis
(linhagem de macrófagos J774.1), após uma tendência de toxicidade inicial, no entanto é
necessário ressaltar que neste estudo o número de células semeadas foi diferente para
diferentes concentrações (o número de células semeadas foi maior quando incubadas com 1
mg/mL em comparação com o tratamento com 100 µg/mL de CNT).
Raja et al. (2007) propõem a possibilidade de que as células incubadas com
nanotubos de carbono em cultura possam levar a ciclos iniciais de senescência, com
consequente proliferação após uma certa concentração crítica ser atingida. Estes resultados
dão origem à possibilidade de que as células têm cascatas de reações as quais permitem a
resistência à toxicidade induzida pelos CNT, e que estas são dependentes do ambiente.
Entretanto, os mecanismos detalhados ainda permanecem sem explicação.
Outra explicação recentemente levantada por Ghafari et al. (2008) é a de que os
nanotubos de carbono podem ser ingeridos e excretados ativamente pelas células com
efeitos tóxicos mínimos (por exemplo, como nas bactérias Tetrahymena thermophila).
5.2.2 Ensaio clonogênico:
O ensaio clonogênico tem se mostrado o método mais confiável para a avaliação da
toxicidade in vitro de nanotubos de carbono (Herzog et al., 2007; Casey et al., 2008;
Gellein et al., 2009). Nós avaliamos os efeitos de MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np e
CSCNT_Fe sobre a formação de colônias da linhagem V79. Observou-se uma drástica
inibição no número de colônias por CSCNT_np, seguido de uma redução MWCNT,
CSCNT_pu e por último CSCNT_Fe.
SWCNT reduziram o número de colônias de células BEAS-2B e HaCaT (Herzog et
al., 2007). Gellein et al. (2009) avaliou o efeito de quatro diferentes tipos de MWCNT nas
linhagens A549, NHIK3025 (células de carcinoma de cérvix humano) e RBE4 (células
endoteliais de cérebro de rato). MWCNT induziu uma diminuição do número de colônias,
principalmente, em células RBE4 em concentrações que variaram de 5 a 20 µg/mL. O
maior efeito na formação de colônias foi observado para MWCNT com diâmetro de cerca
de 50 nm.
Além disso, Herzog et al. (2007) relatam a possibilidade de se distinguir entre os
efeitos sobre a viabilidade celular e proliferação celular, incluindo o tamanho da colônia
como um parâmetro adicional no ensaio clonogênico. Através de uma análise quantitativa
do tamanho das colônias, Herzog et al. (2007) demonstrou que SWCNT afetou o tamanho
das colônias das três linhagens testadas (BEAS-2B, HaCaT e A549). Também observamos
a diminuição do tamanho de colônias de células V79 expostas aos CNT testados no
presente estudo (análise apenas descritiva).
A depleção de nutrientes em conseqüência da exposição às partículas de carbono
pode afetar a viabilidade das células e, portanto, a formação da colônia, mas sobretudo
, o
tamanho das colônias é afetado. Sabe-se que as células em ambiente com deficiência de
nutrientes respondem diminuindo a proliferação celular, e que no ensaio conduz
a colônia de tamanhos reduzidos (Zenin et al., 1982; Ozturk et al., 2003; Herzog et al.,
2007).
Curiosamente, observamos que CSCNT_Fe (crescidos com ferro e sem processo de
purificação) foi o que teve menor impacto sobre a capacidade de formar colônias na
linhagem V79. Estes nanotubos apresentam-se com formato espiral e possuem o maior
diâmentro dos nanotubos testados. Segundo Bottini et al. (2006) a estrutura molecular e a
topologia são fatores essenciais na toxicidade de materiais carbonáceos. Simon-Deckers et
al. (2008) relatou que não houve diferenças na toxicidade de MWCNT não purificados e
purificados com ferro sendo utilizado como catalisador. O autor levanta a possibilidade de
que os resíduos de Ferro estariam encapsulados dentro MWCNT e, portanto, os resíduos
não estariam disponíveis diretamente na superfície externa dos tubos, Guo et al., (2007)
também propõem a mesma questão. Resíduos de ferro foram encontrados, frequentemente,
encapsulados em CSCNT_Fe.
5.3 Genotoxicidade de nanotubos de carbono:
A penetração de nanomateriais e da nanotecnologia, essencialmente, em todas as
esferas da sociedade, e um número crescente de produtos de consumo que possam conter
nanotubos de carbono levanta preocupações também sobre seus possíveis efeitos
genotóxicos (Kagan et al., 2005; Donaldson, 2006; Roco, 2006; Silva & Nalwa, 2007)
Devido ao seu pequeno tamanho e grande área superficial, associado a outras propriedades
físico-químicas, tais como contaminantes metálicos e as cargas de superfícies, os
nanomateriais podem ter propriedades genotóxicas ainda imprevisíveis.
Os estudos mostram uma patogenicidade para os CNT que lembram as verificadas
para amianto. Além disso, se levarmos em conta a relação com as fibras asbestos, sendo
estas fibras capazes de promoverem danos cromossômicos estruturais e numéricos,
juntamente com mutações pontuais (Palekar et al., 1987; Dopp et al., 1995; Dopp et al.,
1998; Xu et al., 1999; Unfried et al., 2002), e que os CNT não só foram capazes de
penetrarem nas células, mas também de penetrarem no núcleo (Porter et al., 2007), a
avaliação do seu potencial genotóxico torna-se uma preocupação fundamental.
Interessantemente resultados recentes já demonstram o potencial carcinogênico do
MWCNT (Takagi et al. 2008; Sakamoto et al., 2009).
5.3.1 Detecção de quebras de fita do DNA e danos oxidativos:
Avaliamos a indução de quebras e danos oxidativos no DNA, pelo ensaio Cometa,
em células V79 expostas por 24 h a MWCNT e CSCNT_np. Não se verificou a indução de
quebras no DNA
pelas amostras testadas. No entanto, quando a indução de danos
oxidativos foi avaliada, com a utilização das enzimas hOGG1 ou Endo III, foi possível
observar a indução de danos com diferenças estatísticas, em relação aos seus respectivos
controles negativos.
Jacobsen et al., (2008) também não verificaram a indução de quebras quando
células mesoteliais foram expostas à SWCNT. No entanto, quando os danos oxidativos
foram avaliados com o uso da enzima FPG um aumento significativo de danos foi
detectado. Zeni et al., (2008) verificou que o tratamento por 6 h com SWCNT também não
induziu quebras no DNA de linfócitos humanos.
Além disso, Karlsson et al. (2008) mostraram um aumento significativo de quebras
no DNA causados por MWCNT em células epiteliais A549, mas curiosamente não foram
detectadas lesões oxidativas do DNA, com o uso da enzima FPG.
No entanto, existem outros estudos que observaram resultados diferentes em relação
à mesma técnica (ensaio Cometa). Kisin et al. (2007) concluíram que SWCNT de pureza
elevada, e de 1,3 µm de comprimento induziram significativas quebras de DNA na dose de
96 µg/cm
2
após 3 e 24 h de exposição, em células V79. Uma mistura de CNT (contendo
~50% de SWCNT) induziu um aumento dose-dependente em danos no DNA nas
concentrações de 1 a 100 µg/cm
2
(Lindberg et al., 2009). Pacurari et al., (2008 a, b)
também encontraram quebras no DNA, na dose de 25 µg/cm
2
de SWCNT e MWCNT.
Enquanto Yang et al., (2008 b) observou indução significativa de quebras para SWCNT nas
concentrações 5 e 10 µg/mL.
Zhu et al. (2007) demonstraram também a expressão aumentada de duas isoformas
da proteína de reparo por excisão de base (OGG1). Além disso, também verificaram a
expressão da proteína fosforilada Rad 51, de histonas H2AX fosforilada na serina 139 e de
XRCC4 (conjunto de proteínas expressas em resposta a quebra de fita dupla) após o
tratamento com MWCNT e ainda verificou aumento da frequência de mutações gênicas em
células tronco embrionárias de camundongos.
Histonas H2AX fosforiladas foram encontradas por Pacurari et al. (2008 a, b) e
Cveticaninet al. (2010), em células mesoteliais e fibroblastos humanos HDMEC
respectivamente, tratadas com SWCNT e MWCNT. Além disso, a expressão dos
biomarcadores de estresse e danos no DNA, p53, PARP, AP-1, NF-κB, p38, ERK1/2 e Akt
foram relatados para células tratadas com SWCNT e MWCNT (Zhu et al., 2007; Pacurari et
al., 2008 a, b).
5.3.2 Detecção de danos cromossômicos pelo teste de micronúcleo:
O índice de divisão nuclear (IDN) é um parâmetro eficiente para se demonstrar a
resposta mitogênica ou efeito citostático de agentes em estudo pelo teste de micronúcleo.
Não observamos qualquer efeito dos CNT testados sobre o IDN das células V79, nas
concentrações testadas.
MWCNT não alterou o IDN em células humanas de câncer pulmonar (MCF-7), em
células epiteliais de pulmão de rato (RLE) e em linfócitos humanos segundo Muller et al.
(2008 a; b), e Szendi e Varga (2008). Uma inibição mitótica induzida por SWCNT foi
detectada por Szendi e Varga (2008). Algumas concentrações de uma mistura de CNT
testadas por Lindberg et al. (2009) causaram inibição mitótica. Já Cveticaninet al., (2010)
observaram uma inibição no IDN de linfócitos humanos quando tratados tanto com
SWCNT quanto por MWCNT. No entanto, nota-se que neste último estudo os CNT foram
suspensos em dimetilsulfóxido (DMSO) o que torna difícil uma comparação direta entre os
estudos.
Nós observamos um aumento de células micronucledas induzidas por MWCNT,
quando tratadas por 48 h. Com este mesmo tempo de tratamento, verificou-se também um
aumento na média de células com micronúcleo nas culturas tratadas com CSCNT_np,
embora esse aumento não apresentasse significado estatístico. Não foi observada a indução
de micronúcleos por CSCNT_pu e CSCNT_Fe.
Experimentos in vitro com MWCNT conduzidos por Muller et al. (2008 a; b),
também mostraram a indução de micronúcleos, em células RLE e MCF-7. Com o uso da
técnica de FISH o autor ainda verificou que MWCNT induziu tanto eventos clastogênico
quanto aneugênicos. Cveticaninet al. (2010) também verificaram um aumento expressivo
de micronúcleos induzidos por MWCNT em linfócitos.
Lindberg et al. (2009) observaram que uma mistura de SWCNT e outros CNT
induziram um aumento na frequência de micronúcleos, in vitro, em células BEAS-2B
expostas por 48 h.
Uma única instilação intratraqueal de MWCNT aumentou a freqüência de
micronúcleos em pneumócitos tipo II de pulmões de ratos (in vivo), e provocou também
uma forte inflamação pulmonar (Muller et al., 2008 a).
No entanto, utilizando o teste de aberração cromossômica em células V79,
Wirnitzer et al. (2009) mostraram que baytubes® (uma forma aglomerada de MWCNT)
não induziu metáfases aberrantes em doses de até 10 µg/ml. Szendi e Varga (2008),
também não verificaram indução de danos no DNA analisados pelo teste de MN e troca de
cromátides irmãs por MWCNT.
O teste de micronúcleo quantifica eventos clastogênicos e aneugênicos resultados da
fragmentação do cromossomo ou perda de cromossomos inteiros, respectivamente, que se
atrasam durante a divisão celular e, assim, são “encapsulados” dentro de micronúcleos em
vez dos núcleos das células-filha. Já o ensaio Cometa mede quebras de DNA não reparadas
e sítios álcali-lábeis. O dano medido pelo teste do micronúcleo é o que permanece depois
da divisão celular e, portanto, é mais informativo do que danos ainda não reparados, assim,
possuem um peso maior na avaliação de genotoxicidade (Van et al., 1997).
Interessantemente, a incidência de danos no DNA (detectados pelo ensaio cometa,
versão padrão) ocasionados por MWCNT, não foram altos o suficiente para se
correlacionar com a indução observada de micronúcleos. Cveticaninet al. (2010) também
não encontraram uma alta incidência de foci γH2AX, mas observou uma forte indução de
micronúcleos. Indicando, assim que MWCNT atua principalmente como um agente
clastogênico e aneugênico.
Pontes nucleoplasmáticas (PN) são ligações contínuas entre os núcleos de uma
célula binucleada
e são resultantes, principalmente, de cromossomos dicêntricos nos quais
os centrômeros são puxados para pólos opostos durante a anáfase.
No presente trabalho observamos um aumento na frequência de PN em células V79
tratadas com CSCNT_pu por 24 h. Ocorrendo um aumento estatisticamente significativo,
somente, na concentração de 3,125 µg/mL. Em relação à exposição de 48 h aos CNT, o
maior índice de PN foi observado para MWCNT, embora não verificado diferença
estatística. Cveticaninet al. (2010) notaram que MWCNT também induziu a formação de
PN durante na anáfase.
Após 24 horas de exposição à SWCNT células BEAS-2B apresentaram
centrossomos fragmentados, múltiplos pólos do fuso mitótico, pontes na anáfase e número
de cromossomos aneuplóides. Por meio de microscopia confocal, Sargent et al. (2009)
demonstrou que nanotubos dentro do núcleo estavam em associação com a tubulina celular
e mitótica, e também com a cromatina. Especificamente, os nano tubos foram observados
anexados ao centrossomo formando estrutura semelhante ao fuso como que parece puxar o
DNA para o centrossomo.
5.4 Disposições finais:
O efeito dose-resposta é um conceito fundamental sob o qual a toxicologia é
baseada. Na toxicologia convencional, a dosimetria é baseada na concentração de
exposição. No entanto, no caso de nanomateriais há um debate em relação à dosimetria. Já
que não há uma relação tão óbvia com a concentração baseada na massa das NP (Dhawan
et al., 2009).
A área de superfície tem sido apontada como um parâmetro melhor para se entender
a resposta celular à exposição com NP. De acordo com Nel et al., (2006) o tamanho e a área
de superfície são duas propriedades importantes do ponto de vista toxicológico. O número
de partículas presentes no meio de exposição representa outro candidato a dosimetria no
lugar da massa ou área de superfície (Wittmaack et al., 2007).
A seleção de uma dosimetria adequada para nanotoxicidade in vitro ainda não é
suficiente para entender a resposta celular. É necessário considerar muitos outros fatores
associados com as nanopartículas. No caso de químicos solúveis a dose de exposição em
um sistema in vitro é considerada como equivalente a dose entregue, sendo a massa e a
concentração consideradas atributos centrais com impacto direto sobre a resposta celular
(Dhawan et al., 2009). Teeguarden et al. (2007) definiu três diferentes níveis de dose para
toxicologia de nanopartículas in vitro: dose administrada, dose entregue e dose celular. A
dose administrada ou concentração em meio de cultura é a medida mais comum na
toxicologia clássica. Mas sugere-se que diferentemente de químicos solúveis, partículas
podem depositar-se, difundir-se e aglomerar-se dependendo de suas características físico-
químicas (tamanho, forma, densidade, etc.) e características do meio de cultura celular.
Esses fatores agindo juntos podem afetar a concentração de nanopartículas que,
verdadeiramente, atingem as células a partir da dose administrada e subsequentemente,
afetam a resposta celular.
Acredita-se que o mecanismo-chave responsável pelos efeitos genotóxicos
exercido por nanomateriais envolve o estresse oxidativo, que se refere a um desequilíbrio
redox em células, geralmente resultado do aumento intracelular de espécies reativas de
oxigênio (EROs) e da diminuição de antioxidantes. EROs são moléculas altamente reativas
que podem perturbar a homeostase do meio intracelular por reagir desfavoravelmente com
macromoléculas celulares, incluindo DNA, proteínas e lipídios. EROs induzem danos no
DNA do tipo quebras de dupla-fita, modificações de bases (por exemplo, formação de 8-
hidroxideoxiguanosina) e “cross-links” de DNA, que se não forem reparados têm o
potencial para iniciar e promover a carcinogênese (Toyokuni et al., 1998).
As EROs podem ser do tipo primária ou secundária. EROs primária (por exemplo,
superóxido, O2-) podem ser geradas através de processos metabólicos ou através da
ativação do oxigênio, que resulta na formação de uma molécula reativa nucleofílica, por
exemplo, ânion superóxido, embora este radical não reaja diretamente com o DNA ou
polipeptídios, eles podem interagir com outras moléculas, tais como metais de transição ou
com enzimas, resultando na produção de EROs secundária (por exemplo, radicais ˙OH),
que são os principais indutores de danos no DNA. Na verdade, a maioria dos radicais ˙OH
gerados in vivo vem da quebra de peróxido de hidrogênio catalisada por metais segundo a
reação de Fenton: 2O
2
-
+ 2H+ → H
2
O
2
+ O
2
(reação da dismutase), seguida de M
n
+ H
2
O
2
→ M
(n+1)
+˙OH + OH
-
(reação de Fenton com M representando um metal de transição)
(Valko et al., 2006).
Nanomateriais podem causar danos ao DNA indiretamente, pela
promoção de
estresse oxidativo e resposta inflamatória. Contudo, este mecanismo parece não estar
agindo sozinho, se pequeno o suficiente, nanopartículas podem passar através das
membranas celulares e ganhar acesso ao núcleo onde podem interagir diretamente com o
DNA e com estruturas celulares que estabelecem a homeostase fisiológica, causando danos.
Além disso, mesmo que nanomateriais não tenham acesso ao núcleo, eles ainda podem
entrar em contato direto com o DNA durante a mitose, quando a membrana nuclear se
desfaz, fornecendo bases para o aparecimento de aberrações.
Os dados existentes sobre genotoxicidade de CNT, embora ainda limitados e
conflitantes, apontam para uma resposta geral positiva. Surpreendentemente, os resultados
de experimentos in vitro também confirmam que CNT são capazes de induzir
genotoxicidade primária, diferente da linha que presumia que a resposta genotóxica destes
nanomateriais devia-se a uma ação inflamatória em experimentos in vivo.
Especificamente a respeito de CNT, foram verificados que danos no DNA podem
ser causados por dano mecânico e não somente devido ao efeito oxidativo. SWCNT
parecem interagir com os elementos estruturais da célula, com aparente ligação ao
citoesqueleto (Porter et al., 2007; Sargent et al., 2009), DNA telomérico (Li et al., 2006a), e
em seqüências de DNA ricas em GC nos cromossomos (Li et al., 2006b). A intercalação de
SWCNT no DNA pode desestabilizar a hélice, resultando em uma mudança
conformacional (Li et al., 2006a), que poderia induzir a instabilidade e quebras
cromossômicas.
Assim, dada a grande incerteza sobre a segurança dos nanomateriais, é imperativo
que se compreenda e, posteriormente, minimizem-se os riscos toxicológicos potenciais
associados a estes materiais, não só para proteger a saúde humana e o ambiente, mas
também para evitar uma parada equivocada no avanço na nanotecnologia e nanociência.
6. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos sobre o tratamento de células V79 com os nanotubos
MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np e CSCNT_Fe, possibilitaram as seguintes conclusões
em termos de viabilidade celular, capacidade clonogênica e indução de danos no DNA:
1. Os nanotubos testados demostraram uma citotoxicidade inicial, no entanto com
o aumento do tempo pós-exposição as células V79 mostraram uma recuperação
da viabilidade celular. Além disso, CSCNT_pu e CSCNT_np apresentaram o
maior efeito sofre a viabilidade celular, que podem ser explicadas pelas
características físico-químicas destes tubos e da presença dos catalisadores
metálicos cobalto e manganês.
2. A capacidade de formar colônias também foi afetada pelos CNT testados.
Observou-se que o efeito não foi só no número mas também no tamanho das
colônias, indicando que estes CNT afetam a viabilidade e a capacidade
proliferativa das células V79. Novamente, o maior efeito foi verificado para
CSCNT_np, indicando o efeito dos catalisadores.
3. MWCNT e CSCNT_np avaliados pelo ensaio Cometa não induziram um
aumento significativo de quebras no DNA. Já quando utilizou-se as enzimas
hOGG1 e Endo III observamos um aumento significativo de danos no DNA.
Revelando que danos oxidativos são um dos participantes dos efeitos biológicos
observados para os CNT.
4. Em baixas concentrações (1.5 a 12.5 µg/mL) MWCNT, CSCNT_pu,
CSCNT_np e CSCNT_Fe não afetaram o índice de divisão nuclear,
demonstrando não possuirem efeito citostático nestas concentrações.
5. MWCNT foi capaz de aumentar a frequência de micronúcleos. Levando-se em
conta que não houve um aumento proeminente de quebras no DNA induzidas
(detectados pelo ensaio Cometa) por MWCNT, pode ser definido que uma
atividade clastogênica/aneugênica caracteriza o mescanismo de ação de
MWCNT.
6. MWCNT também aumentou discretamente a frequência de pontes
nucleoplasmáticas, e um aumento significativo foi observado para CSCNT_pu
indicando que estes CNT estão envolvidos na indução de quebras e rearranjos
cromossômicos em células V79.
7. Em conjunto, os resultados obtidos indicam uma ação indutora de citotoxicidade
e indutora de danos oxidativos e cromossômicos pelos nanotubos de carbono
aqui estudados.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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