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LORAYNE LAURIA DE OLIVEIRA
Análise da expressão de genes de choque térmico regulados
pelos sistemas HrcA e CtsR em Staphylococcus saprophyticus
Orientadoras: Marcia Giambiagi-deMarval e Marinella Silva Laport
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF. PAULO DE GOÉS
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO DE 2010
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas (Microbiologia)
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FICHA CATALOGRÁFICA
Oliveira, Lorayne Lauria
Análise da expressão de genes de choque térmico regulados pelos sistemas HrcA e
CtsR em Staphylococcus saprophyticus / Lorayne Lauria de Oliveira – Rio de Janeiro:
UFRJ / IMPPG, 2010.
xiv, 65
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas)
Universidade Federal do Rio de Janeiro / Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, 2010.
Orientadoras: Marcia Giambiagi-deMarval e Marinella Silva Laport
Referências bibliográficas: f. 61-65
1. Staphylococcus saprophyticus 2. Choque térmico 3. PCR quantitativo em tempo real
(qRT-PCR) 4. HrcA 5. CtsR 6. 16S rRNA I. Giambiagi-deMarval Marcia e Laport
Marinella Silva. II. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Mestrado em
Ciências Biológicas. III. Análise da expressão de genes de choque térmico regulados
pelos sistemas HrcA e CtsR em Staphylococcus saprophyticus
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FOLHA DE APROVAÇÃO
Lorayne Lauria de Oliveira
Análise da expressão de genes de choque térmico regulados pelos sistemas HrcA e
CtsR em Staphylococcus saprophyticus
Rio de Janeiro, 23 de fevereiro de 2010
Orientadora (Profa. Marcia Giambiagi-deMarval, Ph.D, UFRJ)
Orientadora (Profa. Marinella Silva Laport, Ph.D, UFRJ)
Membro (Prof. Rafael Silva Duarte, Ph.D, UFRJ)
Membro (Profa. Célia de Almeida Soares, Ph.D, UFG)
Membro (Prof. Turan Urmeny, Ph.D, UFRJ)
Revisora (Profa. Eliane de Oliveira Ferreira, Ph.D, UFRJ)
4
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Microbiologia Molecular,
Departamento de Microbiologia Médica, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes,
Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a
orientação das Profas. Marcia Giambiagi-deMarval e Marinella Silva Laport.
5
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para mais
uma etapa vencida em minha vida.
Agradeço a Deus, fonte de minha inspiração e fé nos momentos difíceis.
À Dra. Marcia Giambiagi-deMarval, pela orientação, incentivo e carinho.
À Dra. Marinella Silva Laport por ter aberto as portas do seu laboratório, pela
orientação, amizade e confiança no meu trabalho.
À Dra. Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues que abriu as portas do
Departamento de Microbiologia Médica para mim de forma doce e gentil. Meu respeito e
carinho.
Ao Dr. Turán Peter Urmenyi pelo espaço cedido em seu laboratório e pelos
conselhos sobre os experimentos de qRT-PCR.
Ao Dr. Deivid de Carvalho pelo tempo dedicado, amizade e pela paciência.
À Dr. Eliane de Oliveira Ferreira, pela amizade e compreensão.
À minha mãe, meu exemplo e alicerce. Sempre ao meu lado, me incentivando e
dedicando todo seu amor a mim e minha irmã. Sem você não teria chegado até aqui.
Ao meu pai, pelas longas conversas.
À minha avó, Russa (in memorian), que sempre mostrou admiração pelas minhas
escolhas e me deu apoio em tudo que decidi fazer.
À minha irmã pelos momentos de descontração, pelas conversas na madrugada e
pelo amor por mim.
Às minhas tias queridas, Fátima e Thaís, obrigada pelo carinho de vocês.
À minha madrinha e tia, Eva. Você ocupa um lugar especial no meu coração. Hoje
supre a falta que minha avó faz. Obrigada por tudo, sempre.
À minha amiga irmã, Georgia, pelos conselhos, risadas e pela eterna amizade.
Ao Bruno, por me fazer acreditar que recomeçar é possível.
Aos amigos e professores do IMPPG pelo auxílio prestado nas diversas etapas deste
trabalho e pelo agradável convívio.
6
Às meninas e meninos mais que especiais do Laboratório de Microbiologia
Molecular: Elaine, Lívia, Natália, Olinda, Juliana, Paulinha, Naira, Marcinha, Vivi,
Palloma, Cleyton, Wesley e Orlando. Vocês foram fundamentais nessa caminhada.
Um agradecimento especial à Elaine, Lívia e Natália que tornaram a viagem a Porto
de Galinhas um momento mais que único.
Ao CNPq, pela bolsa de mestrado a mim concedida.
7
DEDICATÓRIA
“A morte não é nada”
Eu somente passei para o outro lado do caminho.
Eu sou eu, vocês são vocês.
O que eu era para vocês, eu continuarei sendo.
Me deem o nome que vocês sempre me deram,
Falem comigo como vocês sempre fizeram.
Vocês continuam vivendo no mundo das criaturas, eu
estou vivendo no mundo do Criador.
Não utilizem um tom solene ou triste,
Continuem a rir daquilo que nos fazia rir juntos.
Rezem, sorriam, pensem em mim
Rezem por mim.
Que meu nome seja pronunciado como sempre foi, sem
ênfase de nenhum tipo.
Sem nenhum traço de sombra ou tristeza.
A vida significa tudo o que ela sempre significou.
O fio não foi cortado.
Porque eu estaria fora de seus pensamentos,
Agora que estou apenas fora de suas vistas?
Eu não estou longe, apenas estou do outro lado do
caminho...
Você que ai ficou, siga em frente,
“A vida continua, linda e bela como sempre foi.”
(Santo Agostinho)
Dedico a você vó Russa (in memoriam), que sempre
esteve ao meu lado em todos os momentos da minha
vida. Um dia a gente se encontra...
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RESUMO
Lorayne Lauria de Oliveira
Análise da expressão de genes de choque térmico regulados pelos sistemas HrcA e
CtsR em Staphylococcus saprophyticus
Orientadoras: Marcia Giambiagi-deMarval e Marinella Silva Laport
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia),
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Staphylococcus saprophyticus é um importante patógeno responsável por infecções
comunitárias do trato urinário (UTIs), em mulheres jovens. Todos os organismos
apresentam a expressão das proteínas de choque térmico (HSPs) DnaK, GroEL e diversas
Clps. Estas proteínas têm função de chaperonas moleculares e atuam no enovelamento de
proteínas recém sintetizadas ou desnaturadas, podendo também participar da degradação
das mesmas. As HSPs promovem a habilidade da célula em resistir a condições ambientais
adversas e parecem estar envolvidas na patogênese bacteriana. As proteínas DnaK (HSP70)
e GroEL (HSP60) são reguladas pelo sistema HrcA e as proteínas da família das Clps
(HSP100), pelo sistema CtsR. Ambos repressores, HrcA e CtsR, se ligam às regiões
promotoras em sequências específicas, CIRCE (HrcA) e “CtsR box” (CtsR). Nosso
trabalho teve por objetivo analisar a expressão das HSPs reguladas pelos sistemas HrcA e
CtsR em S. saprophyticus. Foi observado um crescimento celular a 37ºC. No entanto, foi
demonstrada uma redução do crescimento a 42ºC, 45ºC e a 48ºC, após seis horas de
incubação, indicando que a partir de 42ºC pode-se considerar uma condição de estresse
para S. saprophyticus. Após duas horas de incubação em temperaturas de estresse, células
viáveis foram ainda detectadas a 48ºC e 50ºC, não tendo sido observado nenhum
crescimento a 52ºC e 55ºC. Utilizando-se a ferramenta BLAST observou-se que as
sequências de aminoácidos das proteínas DnaK, GroEL e Clps, obtidas do genoma de S.
saprophyticus ATCC 15305, apresentavam alto grau de identidade com àquelas de outras
espécies do gênero Staphylococcus. Os operons dnaK e groE apresentaram a sequência
CIRCE em suas regiões promotoras. Enquanto que os genes clpB, clpC, clpP e o operon
dnaK apresentaram a sequência “CtsR box” nestas regiões. Foi avaliada a indução de
DnaK, GroEL e ClpB através de marcação isotópica de proteínas totais com
35
S-Met. Para
avaliar os níveis de expressão dos genes hrcA e ctsR foram realizados ensaios de PCR
9
quantitativo em tempo real (qRT-PCR) nas temperaturas de 42ºC, 45ºC e 48ºC. Observou-
se que o choque térmico induz a expressão dos mRNAs de hrcA e ctsR em todas as
temperaturas analisadas. Experimentos de termocinética foram realizados utilizando a
temperatura de 48ºC por 10, 20 e 30 min. Nesses experimentos, diferenças no padrão de
indução da expressão dos genes hrcA e ctsR foram observadas. A maior indução vista para
o gene hrcA foi no tempo de 20 min e para o gene ctsR foi no tempo de 30 min. Os
resultados obtidos mostram a participação dos sistemas de regulação HrcA e CtsR na
resposta ao choque térmico em S. saprophyticus.
Palavras-chave: Staphylococcus saprophyticus; choque térmico; HrcA; CtsR; qRT-PCR;
16S rRNA.
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2010
10
ABSTRACT
Lorayne Lauria de Oliveira
Análise da expressão de genes de choque térmico regulados pelos sistemas HrcA e
CtsR em Staphylococcus saprophyticus
Orientadoras: Marcia Giambiagi-deMarval e Marinella Silva Laport
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia),
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Staphylococcus saprophyticus is an important pathogen responsible for community-
acquired urinary tract infections (UTIs), in young women. All organisms express heat-
shock proteins (HSPs) DnaK, GroEL and several Clps. These proteins function as
molecular chaperones acting on the folding of newly synthesized or denaturated proteins,
and could participate in their degradation. The HSPs promote the cells ability to resist to
adverse environmental conditions and seem to be involved in bacterial pathogenesis. The
DnaK (HSP70) and GroEL (HSP60) proteins are regulated by the HrcA system, while Clps
proteins (HSP100) are regulated by the CtsR system. Both repressors, HrcA and CtsR,
bound to the promoter regions located in the specific sequences CIRCE (HrcA) and “CtsR
box” (CtsR). Our purpose was to analyze the expression of the HSPs regulated by these two
regulation systems in S. saprophyticus. It was observed an expressive cell growth at 37°C.
However, it was demonstrated a marked reduction at 42°C, 45°C and 48°C, after six hours
of incubation, indicating that temperatures above 42ºC could be consider a stress condition
to S. saprophyticus. Within two hours of incubation at stress temperatures, viable cells were
still detected at 48°C and 50°C, whereas no growth was observed at 52°C or 55°C. Using
the BLAST tool, we observed that DnaK, GroEL and Clps proteins, obtained from the S.
saprophyticus ATCC 15305 genome, presented a high level of identity with species of the
Staphylococcus genus. The dnaK and groE operons presented the CIRCE sequence in their
promoters. Meanwhile the genes clpB, clpC, clpP and the dnaK operon presented the “CtsR
box” sequence in their promoter regions. The induction of DnaK, GroEL and ClpB was
evaluated through isotopic labeling with
35
S-methionine. Gene expression of hrcA and ctsR
was evaluated by quantitative real time PCR (qRT-PCR) assays at the stress temperatures
of 42°C, 45°C and 48°C. The heat shock induced a rise on the mRNAs expression at all
temperatures assayed. Thermokinetic experiments were performed using the 48°C
temperature for 10, 20 and 30 minutes, showing differences in the hrcA and ctsR gene
expression. The highest induction of the hrcA gene was observed at 20 minutes, and for the
11
ctsR gene it was at 30 minutes. The results here presented demonstrate the participation of
regulatory systems HrcA and CtsR, in the heat shock response in S. saprophyticus.
Keywords: Staphylococcus saprophyticus; heat-shock; HrcA; CtsR; qRT-PCR; 16S rRNA
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2010
12
ÍNDICE
1 Introdução.....................................................................................................................
1.1 Gênero Staphylococcus........................................................................................
1.2 Staphylococcus saprophyticus..............................................................................
1.3 Proteínas de choque térmico.................................................................................
1.4 Mecanismos de regulação dos genes de choque térmico.....................................
1.5 PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR).......................................................
2 Objetivos......................................................................................................................
2.1 Objetivo geral.......................................................................................................
2.2 Objetivos específicos e abordagem experimental................................................
3 Materiais e Métodos...................................................................................................
3.1 Meios de cultura, condições de cultivo e armazenamento da estirpe...................
3.2 Tampões e soluções utilizados para a análise de ácidos nucleicos e proteínas....
3.2.1 Análise de RNA..............................................................................................
3.2.2 Análise de proteínas.......................................................................................
3.3 Géis utilizados para eletroforese..........................................................................
3.4 Curva de crescimento...........................................................................................
3.5 Curva de sobrevivência........................................................................................
3.6 Análise de proteínas.............................................................................................
3.6.1 Marcação isotópica de proteínas com
35
S-metionina.....................................
3.6.2 Eletroforese de proteínas (SDS-PAGE).........................................................
3.7Análise de mRNA..................................................................................................
3.7.1 Extração de RNA............................................................................................
3.7.2 Síntese de cDNA............................................................................................
3.7.3 PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR).................................................
3.8 Bioinformática......................................................................................................
13
4 Resultados...................................................................................................................
4.1 Curvas de crescimento..........................................................................................
4.2 Curvas de sobrevivência.......................................................................................
4.3 Marcação isotópica de proteínas
35
S-metionina...................................................
4.4 Análise da identidade/similaridade das sequências de aminoácidos das
proteínas DnaK, GroEL e Clps........................................................................................
4.5 Análise “in silico” dos operons dnaK, groE, clpC e dos genes clpB e clpP........
4.5.1 Organização genômica do operon dnaK.........................................................
4.5.2 Organização genômica do operon groE.........................................................
4.5.3 Organização genômica do operon clpC e dos genes clpB e clpP...................
4.6 PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR).......................................................
4.6.1 Padronização...................................................................................................
4.6.2 Avaliação da indução da expressão dos genes hrcA e ctsR durante o
choque térmico................................................................................................................
4.6.3 Termocinética da expressão dos genes hrcA e ctsR durante o choque
térmico.............................................................................................................................
5 Discussão.....................................................................................................................
6 Referências Bibliográficas.........................................................................................
ABREVIAÇÕES
ATCC - “American Type Culture Collection”
14
BHI – “Brain Heart Infusion” (infusão de coração e cérebro)
cDNA – DNA complementar
CIRCE - “Controlling Inverted Repeat of Chaperone Expression” (repetição invertida
controladora da expressão de chaperonas)
Ct- “threshold cycle”
DEPC - dietilpirocarbonato
DNA - ácido desoxirribonucléico
DNase - desoxirribonuclease
dNTPs – desorribonucleotídeos 5’-trifosfatados
DO – densidade ótica
DTT - ditiotreitol
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
HSPs – “heat shock proteins” (proteínas de choque térmico)
ITUs - Infecções do trato urinário
kDa – quilodalton (s), 1.000 Da
MM - marcador molecular
M – molar
MEM – meio mínimo essencial
MOPS – ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico
mRNA – ácido ribonucléico mensageiro
ORF - “open read frame” (sequência de leitura aberta)
PBS – “phosphate buffer saline” (tampão salina fosfato)
pb - pares de bases
PCR – “Polymerase Chain Reaction” (reação em cadeia da polimerase)
pH – potencial hidrogeniônico
qRT-PCR – “Real Time quantitative Reverse Transcription PCR” (PCR quantitativo em
tempo real)
rRNA - ácido ribonucléico ribossomal
RNA – ácido ribonucléico
RT-PCR – “Reverse transcription polymerase chain reaction” (PCR com transcriptase
reversa
15
35
S-Met – metionina marcada com enxofre radioativo
SCN - Staphylococcus coagulase-negativo
SCP - Staphylococcus coagulase-positivo
SD – “Shine-Dalgarno”
SDS – “Sodium Dodecyl Sulfate” (dodecil sulfato de sódio)
SDS-PAGE – “Sodium Dodecil Sulfate – Polyacrilamide Gel Eletrophoresis”
TE – EDTA-Tris
TEMED – N,N,N’,N’ – tetrametiletilenodiamina
TIGR – “The Institute for Genomic Research”
Tris – hidroximetil – aminometano
TSB – “Tryptic Soy Broth” (caldo de triptona de soja)
UPEC - Escherichia coli uropatogênica
UV – ultravioleta
1 Introdução
1.1 Gênero Staphylococcus
16
O gênero Staphylococcus é composto por cocos Gram-positivos, catalase-positivos,
aeróbios e/ou anaeróbios. Eles são imóveis e se assemelham, morfologicamente, a cachos
de uva, característica que deu nome ao gênero. Seus membros pertencem à família
Staphylococcaceae, não esporulam e possuem baixo conteúdo de G+C no genoma.
Atualmente, esse gênero apresenta cerca de 41 espécies e 24 subespécies e seus micro-
organismos crescem em temperatura ótima entre 30°C - 37°C e em até 10% de NaCl
(KLOOS & BANNERMAN, 1999; EUZÉBY, 2010).
Os estafilococos são os principais colonizadores da epiderme humana, sendo
também encontrados no trato respiratório superior, compondo a microbiota anfibiôntica
normal (BANNERMAN & PEACOCK, 2007). Suas espécies são diferenciadas,
primariamente, por sua capacidade de produzir ou não a enzima coagulase. Dessa forma,
podemos encontrar dois grandes grupos: Staphylococcus coagulase-positivos (SCP) que são
capazes de produzir a enzima coagulase, uma das enzimas responsáveis pela coagulação do
plasma sanguíneo e Staphylococcus coagulase-negativos (SCN), onde se encontram todas
as espécies desse gênero que não produzem essa enzima (KLOOS & BANNERMAN,
1999; BANNERMAN & PEACOCK, 2007).
Dentre os SCP, S. aureus pode ser considerada a principal espécie de importância
médica, estando associada a infecções tanto hospitalares como comunitárias, além de
apresentar grande incidência na medicina veterinária. Tal valor clínico se deve à
combinação dos diferentes fatores de virulência produzidos por essa bactéria, à sua
capacidade invasora e à emergência de estirpes resistentes a diferentes antibióticos. A
maioria das estirpes dessa espécie produz enzimas e citotoxinas que, além da coagulase,
incluem as hemolisinas, nucleases, proteases, hialuronidases e colagenases (MADIGAN,
MARTINKO & PARKER, 2004; BANNERMAN & PEACOCK, 2007).
Já os SCN constituem o grupo onde é encontrada a maior parte das espécies desse
gênero. Durante muitos anos, eles foram considerados como: saprófitas ou menos
virulentos para os seres humanos (OTTO, 2004). Atualmente, eles estão entre os principais
agentes causadores de infecções hospitalares, sendo considerados patógenos oportunistas
importantes, uma vez que, apesar de estarem em equilíbrio com a microbiota do
hospedeiro, podem se tornar organismos patogênicos. Geralmente, as infecções causadas
por SCN são promovidas pelo uso de dispositivos invasivos e também pela capacidade
17
dessas bactérias aderirem à superfície desses dispositivos. Além disso os SCN também
podem aderir às células do hospedeiro, podem se evadir das defesas do sistema imune, bem
como se multiplicar e fabricar produtos que causem danos ao paciente, podendo causar
bacteriemia ou mesmo sepse (KLOOS & BANNERMAN, 1994; BENNETT &
BRACHMAN, 1998).
Nas últimas décadas, mais de 30 espécies pertencentes ao grupo dos SCN foram
descritas, tendo sido relatadas como espécies envolvidas em infecções humanas, tais como:
S. epidermidis, S. capitis, S. hominis, S. haemolyticus, S. saccharolyticus, S. warneri, S.
lugdunensis, S. saprophyticus e S. cohnii (VON EIFF, PETERS & HEILMANN, 2002;
OTTO, 2004). Dentre essas espécies, S. saprophyticus destaca-se pela sua prevalência em
infecções comunitárias, sendo a segunda espécie mais isolada em infecções urinárias,
principalmente em mulheres entre 15 a 44 anos (ORDEN-MARTÍNEZ, MARTÍNEZ-RUIZ
& MILLÁN-PÉREZ, 2008).
1.2 Staphylococcus saprophyticus
S. saprophyticus consiste em um uropatógeno, coagulase-negativo, pertencente à
microbiota anfibiôntica humana, presente, em uma grande variedade de sítios na superfície
do corpo mas, principalmente, na região periuretral e mucosas do trato genito urinário
(KLOOS & BANNERMAN, 1994).
Nos casos de cistites agudas sem complicações em mulheres não hospitalizadas,
90% desses quadros infecciosos tem como agentes etiológicos a Escherichia coli e S.
saprophyticus (GUPTA, SCHOLES & STAMM, 1999). As complicações mais graves em
mulheres, associadas a infecções por S. saprophyticus, incluem pielonefrite aguda, sepse,
nefrolitíase e endocardite. Em homens pode ocasionar infecções do trato urinário (ITUs),
uretrites, epididimites, prostatites e nefrolitíase (RAZ, COLODNER & KUNIN, 2005).
Em 2005, o sequenciamento completo do genoma de S. saprophyticus ATCC 15305
foi realizado por Kuroda e colaboradores. Segundo os autores, análises genômicas
comparativas com estirpes de outras duas espécies de estafilococos, S. aureus e S.
epidermidis, revelaram a presença de 582 ORFs (“open read frame”) específicas para S.
18
saprophyticus, estando algumas delas envolvidas com a presença de fatores de virulência
(KURODA et al., 2005).
Desse modo, foi visto que todos os genes que codificam fatores de virulência
encontrados em S. aureus, como coagulases, hemolisinas, enterotoxinas, proteínas de
ligação a matriz extracelular e exoenzimas estão ausentes no genoma de S. saprophyticus.
Porém, muitas estirpes desse micro-organismo produzem adesinas específicas, chamadas de
UafA (fator de uroaderência A). Além disso, foi visto que uma única ORF é possivelmente
codificadora de uma proteína de ancoragem da parede celular, que está envolvida também
na adesão bacteriana às células da bexiga, sendo esta característica associada ao processo
inicial de colonização do trato urinário (KURODA et al., 2005).
Além das adesinas, já foram caracterizadas para S. saprophyticus quatro principais
proteínas de superfície: Ssp, proteína associada à superfície identificada como uma lipase;
Aas, uma autolisina responsável pela ligação à fibronectina, aglutinação de eritrócitos de
ovelha e autólises; UfaA, que auxilia a aderência às células uroepteliais; e SdrI, proteína de
ligação ao colágeno. Todas essas proteínas de superfície são importantes para a fixação de
S. saprophyticus aos tecidos do hospedeiro, ajudando na sua patogênese (SAKINÇ et al.,
2009-a,b). Outro fator que contribui para a virulência dessa espécie é a presença de um
abundante sistema de transporte envolvido tanto no processo de osmotolerância quanto no
transporte de íons inorgânicos. Esse sistema facilita à adaptação a urina, na qual o pH,
osmolaridade, concentração de uréia, íons inorgânicos e outras substâncias orgânicas são
instáveis e variáveis (KURODA et al., 2005).
A produção de uréase, enzima que é conhecida por ser um importante fator de
virulência para infecções persistentes do trato urinário, também já foi descrita em S.
saprophyticus. Essa enzima já foi encontrada em outras espécies bacterianas, como Proteus
mirabilis e Klebsiella pneumoniae, mas não no patotipo de E. coli uropatogênica (UPEC)
que geralmente está envolvido nos casos de infecção. A urease é produzida nos estágios
iniciais de proliferação celular (fase log), o que pode ser considerado como um importante
evento para infecções causadas por essas bactérias (KURODA et al., 2005). Em S.
saprophyticus, a atividade elevada da urease pode contribuir para o crescimento persistente
e invasivo dessa bactéria na bexiga, uma vez que essa espécie não pode obter amônia por
redução de nitrito a nitrato. Desse modo, essa enzima constitui uma vantagem adaptativa
19
para essa espécie, uma vez que, hidrolisa a uréia permitindo o uso de amônia por esse
micro-organismo (KURODA et al., 2005).
Embora três espécies de estafilococos (S. saprophyticus, S. aureus e S. epidermidis)
possuam o operon da urease composto pelo cluster de genes ureABCEFG na mesma
orientação do cromossomo, o sistema de regulação da expressão ou o mecanismo de
ativação do mesmo parece ser diferente para S. saprophyticus. Como a organização dos
genes dessa bactéria é muito similar com outros estafilococos, foi sugerido que deve haver
um sistema de regulação específico que pode estar envolvido na expressão da sua urease
(KURODA et al., 2005).
Recentemente, estudos mostraram que apenas S. saprophyticus ATCC 15305 possui
em seu genoma o gene com homologia para D-serina deaminase (dsdA) encontrado em E.
coli uropatogênica (UPEC). Essa enzima é dependente de piridoxal fosfato e permite que as
UPECs degradem D-serina em amônia e piruvato, utilizando esse aminoácido como fonte
de energia. A homologia observada entre S. saprophyticus e UPEC ainda não foi
encontrada em outras espécies próximas filogeneticamente, como S. xylosus e S. cohnii,
além de não ter sido detectada em amostras de S. aureus, S. epidermidis e outras 13
espécies de estafilococos analisadas (SAKINÇ et al., 2009-a).
A D-serina é um aminoácido encontrado em altas concentrações na urina humana e
é tóxico para bactérias não–uropatogênicas, podendo levar a inibição da multiplicação
celular das mesmas. Sendo assim, somente as UPECs e S. saprophyticus são capazes de
tolerar esse composto e o utilizam para detoxificação, o que pode ser considerada como
uma propriedade geral de bactérias uropatogênicas, constituindo uma vantagem adaptativa
nesse tipo de ambiente (SAKINÇ et al., 2009-a).
Assim, a adesão uroepitelial, a presença de proteínas de superfície, de um sistema
de transporte, a produção de urease, bem como de D-serina deaminase observados em S.
saprophyticus são consideradas como importantes fatores de virulência para a sua
uropatogenicidade. Isso sugere que essa bactéria possa ter evoluído para se adaptar
especificamente ao ambiente urinário, revelando ser uma das mais importantes espécies,
dentre as bactérias Gram-positivas, na uropatogênese de ITUs não complicadas (KURODA
et al., 2005).
20
Outra característica observada no genoma de S. saprophyticus é a presença de genes
que codificam proteínas de estresse, como DnaK, GroEL e Clps. Pouco se sabe sobre os
mecanismos de regulação que atuam na expressão dessas proteínas em S. saprophyticus,
mas foi visto que as mesmas promovem, aos organismos que as expressam, a habilidade de
resistir às condições ambientais adversas (HOURY, 2001).
1.3 Proteínas de choque térmico
É observado que in vitro, pequenas proteínas que possuem domínios simples
conseguem, rapidamente, através de enovelamentos espontâneos, protegerem seus resíduos
hidrofóbicos expostos a ação do ambiente celular. Ao contrário, grandes proteínas
compostas por múltiplos domínios possuem normalmente um enovelamento ineficiente.
Isso se dá devido à formação de intermediários parcialmente enovelados, incluindo cadeias
desenoveladas que tendem a se agregar. Muitas vezes, esse processo de agregação se torna
irreversível devido à formação de pontes de hidrogênio e de forças hidrofóbicas. Isso faz
com que as proteínas não adquiram a conformação correta, o que deve ser evitado in vivo
através da ação das chaperonas moleculares (HARTL & HAYER-HARTL, 2002).
As chaperonas moleculares são caracterizadas como polipeptídeos que promovem o
enovelamento, desenovelamento, montagem, desmontagem, reparo e degradação de outras
proteínas, sem participarem da estrutura final das mesmas (BANEYX, 1994). Algumas
chaperonas embora, constitutivamente, expressas são sintetizadas em altos níveis quando
são submetidas a condições de estresse sendo, então, classificadas como proteínas de
estresse ou proteínas de choque térmico (HSPs - “heat-shock proteins”) (HARTL &
HAYER-HARTL, 2002).
As HSPs são proteínas constitutivas, encontradas em todos os organismos
(SCHUMANN, 2003). Elas foram inicialmente classificadas em famílias de acordo com a
massa molecular que apresentavam, por exemplo, HSP100, HSP90, HSP70, HSP60,
HSP10 e as pequenas HSPs (SHINNICK, 1991). No entanto, desde a década passada, as
HSPs são classificadas pela função que exercem, sendo agrupadas como chaperonas
moleculares e/ou proteases. As proteases estão envolvidas em degradação de proteínas
enoveladas incorretamente e, em muitos casos, trabalham juntas com as chaperonas na
21
degradação de proteínas inativas (GOTTESMAN, 1996; GOTTESMAN, WICKNER &
MAURIZI, 1997).
As chaperonas moleculares podem ser divididas em dois grupos de acordo com a
localização celular das mesmas. Desse modo, em um grupo encontram-se as chaperonas
que se ligam pós-traducionalmente em proteínas recém-sintetizadas como componentes
solúveis do citosol (HSP70/40 e HSP60/10), e no outro grupo estão as que governam o
destino das cadeias nascentes do ribossomo pela sua ligação tanto ao ribossomo como nos
polipeptídeos emergentes, controlando os passos de enovelamento durante a síntese de
proteínas (como “trigger factor”) (WEGRZYN & DEUERLING, 2005).
Assim, quatro principais sistemas de chaperonas são observados no citoplasma de E.
coli: (1) o fator desencadeante (“trigger factor” - TF); (2) o sistema HSP70; (3) o sistema
HSP60 e (4) as Clp/ATPases, ou HSP100 (HOURY, 2001).
O fator desencadeante (“trigger factor”) foi inicialmente descoberto em E. coli como
uma proteína citosólica associada ao ribossomo. A existência de chaperonas associadas a
ribossomos é um princípio altamente conservado, sendo esse fator encontrado em quase
todas as bactérias e em cloroplastos. Ele tem uma função de chaperona juntamente com o
principal sistema bacteriano HSP70, na estabilização de cadeias nascentes no estado
competente para posterior enovelamento (HOURY, 2001; WEGRZYN & DEUERLING,
2005).
A primeira chaperona a interagir com a cadeia de polipeptídeo nascente é a HSP70.
Os aspectos de funcionamento e organização estrutural do sistema HSP70 são melhores
entendidos para HSP70 eubacteriana, chamada DnaK, sua co-chaperona HSP40 ou DnaJ, e
seu fator de mudança de nucleotídeo, HSP20 ou GrpE (BUKAU & HORWICH, 1988). A
proteína DnaK consiste de dois domínios, um amino-terminal, mais conservado, de
aproximadamente 40 kDa, que contém um sítio de ligação para o ATP, e um carboxi-
terminal de 25 kDa que contém o sítio de ligação ao substrato (HENDRICK & HARTL,
1993). Ela reconhece características estruturais comuns a muitas cadeias nascentes, como
cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos expostos em conjunto com uma estrutura de
polipeptídeo central acessível (HARTL & HAYER-HARTL, 2002). Os peptídeos são
ligados a DnaK em estado primário, uma vez que seus dois cofatores protéicos, DnaJ e
GrpE, reconhecem cadeias polipeptídicas em sua conformação primária, exercendo duas
22
funções primordiais no processo fisiológico: prevenir a agregação do peptídeo nascente
com outras proteínas e evitar que parte da cadeia peptídica que emerge do ribossomo inicie
o enovelamento sem a presença de toda a cadeia ou domínio (HOURY, 2001). Assim, o
domínio amino-terminal de DnaJ se liga a DnaK e acelera a hidrólise de ATP pela DnaK,
facilitando assim a captura do substrato (peptídeo). Já o seu domínio carboxi-terminal
funciona como uma chaperona no reconhecimento de peptídeos hidrofóbicos e pode, então,
recrutar DnaK para as cadeias nascentes. O cofator GrpE induz a liberação de ADP por
DnaK e religa ATP ao complexo peptídeo nascente-DnaK, completando o ciclo de reação
(Figura 1) (HARTL & HAYER-HARTL, 2002).
Um outro sistema de chaperonas é aquele formado pelas chaperoninas. Essas
proteínas formam uma classe conservada de complexos anéis duplos de aproximadamente
800 kDa delimitando uma cavidade central. Elas são conhecidas como HSP60 ou GroEL e,
geralmente, são encontradas apenas em eubactérias e em organelas de origem
Baixa afinidade
Ligação ao
peptídeo
Ligação ao peptídeo
A
ATPase
B
Liberação do
peptídeo
Alta afinidade
Figura 1: Esquema da estrutura e ciclo de reação da chaperona DnaK (HSP70) de E. coli. (A)
Estrutura do domínio ATPase e o do domínio de ligação ao substrato (peptídeo). Os locais de
interação dos cofatores DnaJ e GrpE com DnaK estão indicados por setas. (B) Modelo simplificado
do ciclo de reação do sistema DnaK. O cofator DnaJ (J) se liga a DnaK e acelera a hidrólise de ATP
pela DnaK (1); após a hidrólise de ATP em ADP, a ligação ao substrato (S) se torna mais estável
(2); o cofator GrpE (E) induz a liberação de ADP por DnaK (3) e religa ATP ao complexo peptídeo
nascente-DnaK (4), completando o ciclo de reação (adaptado de HARTL & HAYER-HARTL,
2002).
1
2
3
4
23
endossimbiótica, como mitocôndrias e cloroplastos. Os mecanismos das chaperoninas
diferem, fundamentalmente, do sistema HSP70 embora em ambos os casos a ligação e a
liberação da proteína seja regulada pelo ATP (HARTL & HAYER-HARTL, 2002).
A família HSP60 ou GroEL apresenta 40% de identidade entre si e é formada por um
tetradecâmero (monômeros de 60 kDa) composto por dois anéis heptaméricos empilhados
formando uma cavidade central e, devido a essa conformação estrutural, as mesmas estão
incluídas numa classe de proteínas conhecidas como chaperoninas. Elas agem com um
cofator denominado GroES (HSP10), ajudando no enovelamento de cadeias proteicas
inativas, que estão com suas superfícies hidrofóbicas expostas (HARTL & HAYER-
HARTL, 2002).
A proteína GroEL é funcionalmente assimétrica. A sua reação começa através da
ligação do substrato (polipeptídeo desenovelado) à porção terminal livre do complexo
GroEL-GroES. Em seguida, ocorre a ligação de sete moléculas de ATP e de GroES. A
seguir, o substrato se desloca dentro da cavidade proteica (GroEL), o enovelamento ocorre
em torno de dez segundos e sete moléculas de ATP são hidrolisadas. Ocorre, então, a
dissociação de sete moléculas de ADP e de GroES. Caso ainda existam polipeptídeos com
superfícies hidrofóbicas expostas, estes serão recapturados e os ciclos de enovelamento
serão repetidos até que eles tenham adquirido a conformação correta (Figura 2) (HOURY,
2001).
24
Hidrólise de ATP
Transição
estrutural
Ativação da
bomba de ATP
Repetição
do ciclo
Começo
do ciclo
Figura 2: Modelo simplificado de ação do complexo GroEL-GroES sobre um polipeptídeo inativo
(desenovelado). O polipeptídeo inativo (I) se liga a um dos anéis do complexo GroEL-GroES;
ocorre a ligação de GroES a GroEL juntamente com sete moléculas de ATP; com a hidrólise das
moléculas de ATP, pode ocorrer o enovelamento do polipeptídeo na cavidade de GroEL; ocorre a
liberação de GroES, de sete moléculas de ADP e do polipeptídeo ativo (N) ou inativo (I). No caso
do polipeptídeo inativo (I), o complexo aceptor é regenerado, começando novamente a reação
(adaptado de HOURY, 2001).
25
Outras proteínas que também participam da resposta ao choque térmico são as
Clp/ATPases. Elas são tipicamente membros da família de proteínas de choque térmico
HSP100 e fazem parte de um grupo de proteínas que podem desempenhar diversas funções,
como desenovelar outras proteínas, desagregar proteínas pré-formadas, bem como, marcá-
los como alvo para degradação (HOURY, 2001).
As Clp/ATPases ou HSP100 também podem ser induzidas pela alta temperatura, por
estresse oxidativo, por altas concentrações de sal ou etanol e limitação de ferro disponível
(SCHIRMER et al., 1996). Essas proteínas constituem uma família de proteínas
relacionadas que são altamente conservadas e universais sendo, então, membros da
superfamília AAA (ATPases Associadas com uma variedade de Atividades celulares).
Essa superfamília é caracterizada por um segmento conservado de cerca de 220
aminoácidos, que contém sítios conservados necessários para ligação e hidrólise do ATP,
chamados de Walker A e Walker B. A presença de um ou dois sítios de ligação de ATP
(domínios Walker) divide essas proteínas em duas classes (FREES et al., 2004).
As Clps de classe 1 possuem dois sítios de ligação ao ATP (ATP-1 e ATP-2) e a
variabilidade do espaço entre estes sítios, assim como, a ocorrência de sequências-
assinatura (“signature”) específicas, são a base para a subdivisão dentro da família das
Clp/ATPases de classe 1 em ClpA, ClpB, ClpC, ClpD, ClpE e ClpL. Já as Clps de classe 2
são compostas por proteínas, como a ClpX e ClpY. As proteínas dessa classe contêm um
único domínio de ligação ao ATP (Figura 3) (FREES et al., 2004).
Uma parte do funcionamento das Clp/ATPases foi compreendida quando mostrou-
se que, ClpA e ClpX tinham atividades de reativação e remodelagem que são típicas de
chaperonas moleculares. Além disso, é visto que ClpA e ClpX podem se associar com a
peptidase ClpP formando um complexo proteolítico Clp, com estrutura semelhante ao
proteassoma eucariótico. Nesse complexo proteolítico, os componentes ATPase servem
especificamente para reconhecer e subsequentemente desenovelar e translocar o substrato
dentro da câmara proteolítica ClpP para degradação (FREES et al., 2004).
Embora ClpP seja designada como uma proteína Clp, protease caseionolítica, ela
não está relacionada com a família das Clp/ATPases e tem somente atividade de peptidase.
Para desempenhar sua atividade proteolítica, a ClpP precisa estar associada com membros
da família das Clp/ATPases. Assim, a ClpP atuará como uma serina-protease, prevenindo o
26
acúmulo de proteínas inativas, sendo somente um subgrupo de Clp/ATPases capaz de
interagir com a ClpP. Isso ocorre graças à presença de um tripeptídeo (IGF) chamado de
domínio P, que é reconhecido por ClpP e é encontrado em ClpA, ClpC, ClpE e ClpX, mas
não em ClpB e ClpL (Figura 3) (FREES et al., 2007).
Figura 3: Esquema das Clp/ATPases A, B, C, E, L e X. As Clp/ATPases contêm um ou
dois domínios de ligação ao ATP (AAA-1, AAA-2). P, domínio de ligação da ClpP.
(adaptado de FREES et al., 2007).
27
Em E. coli, a expressão de ClpA não é afetada pelo estresse, ao passo que tanto a
expressão de ClpB quanto de ClpX são induzidas pelo choque térmico. Foi visto que ClpB
possui um papel indispensável na solubilização de grandes agregados protéicos, agindo em
cooperação com o sistema de chaperona DnaK (FREES et al., 2004).
Diferenças funcionais entre as Clp/ATPases encontradas em Bacillus subtilis
(principal modelo para Gram-positivas) e as descritas em E.coli foram observadas. Um
exemplo dessa diferença é no caso da ClpC de B. subtilis, que ao contrário de outras
Clp/ATPases caracterizadas, tem baixa atividade ATPase própria e depende de cofatores
para ganhar atividade de chaperona (FREES et al., 2007).
O cofator melhor caracterizado de ClpC, é chamado de MecA. Ele facilita a
oligomerização de ClpC dentro de um complexo contendo ambos ClpC e MecA. A
formação desse complexo é um pré-requisito para todas as atividades mediadas por ClpC,
incluindo a atividade ATPase, reconhecimento do substrato e interação com ClpC. Em E.
coli, proteínas adaptadoras são requeridas somente para modular o reconhecimento do
substrato (FREES et al., 2007).
Ainda em B. subtilis, a literatura relata que ClpE é uma Clp/ATPase que apresenta
dois sítios de ligação ao ATP e um motivo “dedo” de zinco na região N-terminal (“zinc
finger motif”) (DERRÉ, RAPOPORT & MSADEK, 2000). Acredita-se que a região do
motivo “dedo” de zinco esteja envolvida na ligação de proteínas com enovelamento
inadequado e outras evidências mostram um importante papel na interação entre proteínas
(BERG, 1990; MACKAY & CROSSLEY, 1998).
1.4 Mecanismos de regulação dos genes de choque térmico
A resposta ao choque térmico é resultado da indução de um conjunto de genes
conhecidos como genes de choque térmico. A regulação da expressão desses genes ocorre,
primeiramente, durante a transcrição. Esses genes são expressos constitutivamente sob
condições normais e são organizados em diferentes classes (regulons) que podem ser
reguladas por um fator sigma alternativo, um ativador ou um repressor transcricional. Esses
regulons constituem um único estimulon (conjunto de todos os regulons de uma espécie),
chamado de estimulon do choque térmico (SCHUMANN, 2003).
28
Três fatos devem ser considerados no mecanismo de regulação do choque térmico:
(1) a transcrição constitutiva na ausência de estresse, (2) o rápido aumento na síntese das
proteínas do choque térmico que normalmente ocorre dentro de dois a três minutos após a
indução pelo choque térmico e (3) um lento decréscimo no desaparecimento das mesmas,
após dez minutos (SCHUMANN, 2003).
Em B. subtilis, o estimulon compreende pelo menos seis classes de genes de choque
térmicas sendo, as classes I e III as principais delas (SCHUMANN, 2003). Essas classes se
destacam em relação ao mecanismo de regulação do choque térmico, sendo a classe I
formada pelo operon heptacistrônico dnaK e pelo o operon bicistrônico groEL, e a classe
III formada pelo operon tetracistrônico clpC e pelos genes, clpP e clpE (SCHUMANN,
2003).
Assim, em B. subtillis o operon dnaK é formado pelos genes hrcA, seguido pelos
genes grpE, dnaK e dnaJ, e por três ORFs (Figura 4). Os genes desse operon constituem o
sistema de chaperona DnaK (HSP70) e sua expressão começa a partir de dois promotores
(SCHUMANN, 2003). O primeiro promotor do operon dnaK, P
A1
,
precede todos os genes
estruturais e é reconhecido pelo fator σ
A
(SCHUMANN, 2003). Este fator sigma é
constitutivo e é responsável pela expressão da maioria dos genes de B. subtilis
(HALDENWANG, 1995). O segundo é um promotor interno constitutivo dependente de σ
A
(P
A2
), localizado entre dnaK e dnaJ (Figura 4B) (SCHUMANN, 1996).
Ambos transcritos
primários estão sujeitos à regulação pós-transcricional através de um sítio de
processamento localizado entre hrcA e grpE, e de sítios de degradação (SCHUMANN,
2003).
O operon groE é formado pelos genes groES e groEL e codifica, respectivamente,
as chaperonas GroES (HSP10) e GroEL (HSP60) (Figura 4A). Análises transcricionais
mostraram que o operon groE gera um transcrito bicistrônico (SCHUMANN, 2003).
Os operons dnaK e groE são negativamente regulados pelo repressor HrcA. Este
repressor é codificado pelo gene hrcA (o primeiro gene do operon dnaK) e interage com
uma sequência altamente conservada, conhecida como CIRCE (“Controlling Inverted
Repeat of Chaperone Expression”) (ZUBER & SCHUMANN, 1994) (Figura 4). Essa
sequência operadora apresenta uma repetição invertida de nove pares de base
29
(TTAGCACTC-N
9
-GAGTGCTAA), localizada entre o sítio inicial da transcrição e o da
tradução dos operons dnaK e groE (MOGK et al., 1997).
Figura 4: Representação esquemática do regulon HrcA. O regulon consiste de dois operons: operon
groE e operon hrcA. (A) Operon groE, composto pelos genes groES e groEL, está sob o controle de
um promotor (P
A
). (B) Operon dnaK, composto pelos genes hrcA, grpE, dnaK, dnaJ e por três ORFs
cuja expressão dos está sob o controle de dois promotores (P
A1
e P
A2
) . Ambos operons estão sob o
controle negativo do repressor HrcA, que se liga numa região conservada formada por duas sequências
repetidas e invertidas (CIRCE). As estruturas em grampo representam um sítio de processamento (entre
hrcA e grpE), três sítios de terminação da transcrição (entre dnaK e dnaJ, depois da ORF 50 e de
groEL), e três potenciais sítios de degradação (dentro de 3 genes distais do operon dnaK) (adaptado de
SCHUMANN, 2003).
A
B
CIRCE
CIRCE
30
Após o estresse pelo calor, o repressor HrcA se dissocia imediatamente de CIRCE
(sítio operador) para permitir um aumento rápido da transcrição dos operons dnaK e groE.
Além disso, devido à resposta ao choque térmico ser desligada 5-10 minutos depois do
estímulo de estresse, o repressor deve se ligar novamente na região operadora
(SCHUMANN, 2003).
Evidências experimentais sugerem que a atividade desse repressor é modulada pelo
sistema da chaperonina GroE. Desse modo, primeiro o repressor HrcA é liberado dos
ribossomos como uma proteína inativa (definida pela sua incapacidade de se ligar ao seu
operador) e para se tornar ativa, ela precisa interagir com o sistema da chaperonina GroE.
Uma vez ativa, HrcA é capaz de se ligar ao seu operador. Depois de dissociar-se de seus
sítios de ligação ao DNA, HrcA está novamente presente em sua forma inativa e precisa de
outra interação com o sistema GroE (GroEL/GroES) para se converter em sua forma ativa
(Figura 5) (MOGK et al., 1997). Na ausência de estresse térmico, quantidades suficientes
de proteínas GroEL/GroES livres estão disponíveis para manter a maioria das moléculas de
HrcA na sua conformação ativa. Porém, imediatamente após a exposição ao choque
térmico, GroEL e GroES são requeridos por proteínas inativas que surgem como resultado
do estresse (SCHUMANN, 2003). Como consequência, proteínas HrcA recém-sintetizadas
e dissociadas dos seus operadores irão permanecer em sua forma inativa, permitindo que a
RNA-polimerase inicie a transcrição dos operons de choque térmico em uma taxa mais
elevada. Assim, quanto mais proteínas desenoveladas no citoplasma, mais chaperoninas
(GroEL/GroES) estarão livres para converter HrcA inativa em sua forma ativa. Como
resultado, ocorre um desligamento gradual do regulon HrcA até que um estado basal seja
alcançado (SCHUMANN, 2003).
31
A classe III do estimulon de choque térmico de B. subtilis é formada pelo operon
tetracistrônico clpC e pelos genes clpE e clpP, todos fazem parte do regulon ctsR e
codificam proteínas da família Clp/ATPases (HSP100) e a protease ClpP (Figura 6).
Sendo assim, os genes clpC e clpE codificam as subunidades ATPases, e clpP
codifica as subunidades proteolíticas de duas proteases dependentes de ATP, ClpCP e
ClpEP. Essas proteínas podem ser induzidas por altas temperaturas, estresse oxidativo, altas
Figura 5: Ciclo de reação HrcA-GroE. Dentro das células, o repressor HrcA está presente na forma
ativa (enovelada) ou inativa (desenovelada). (A) Na ausência de estresse térmico, o sistema GroE
converte a maioria das moléculas de HrcA inativas para forma ativa, o que faz com que HrcA se
ligue na região operadora CIRCE, causando a repressão da expressão dos genes dos dois operons
que estão sob o controle de HrcA (operons groE e dnaK). (B) Na forma inativa, o repressor HrcA
fica incapaz de se ligar a CIRCE, o que leva à transcrição aumentada do operons regulados por esse
repressor (adaptado de SCHUMANN, 2003).
HrcA ativa após interação
com sistema GroEL/GroES
GroE livre
Interação do
sistema GroE com
proteínas HrcA
inativas
HrcA inativa incapaz de se ligar ao sítio operador /
Transcrição do operon groE e dnaK
Liberação de HrcA
inativa do ribossomo
CIRCE
CIRCE
Ausência
de estresse
térmico
A
B
32
concentrações de sal ou etanol e limitação de ferro disponível (KRÜGER, VOLKER &
HECKER, 1994; ROUQUETTE et al., 1996; SCHIRMER et al., 1996).
O gene clpE possui dois promotores do tipo σ
A
e o operon clpC e o gene clpP
possuem um promotor dependente de σ
B
e um promotor dependente de σ
A
.
Os promotores
dependentes de σ
A
estão sob o controle negativo do repressor CtsR (SCHUMANN, 2003).
Esse repressor é composto por pelo menos três domínios funcionais: (i) um domínio de
dimerização; (ii) um domínio “hélice-volta-hélice” responsável pela ligação ao DNA; e (iii)
e uma região central rica em glicina (DERRÉ, RAPOPORT & MSADEK, 2000). CtsR
impede a ligação da RNA-polimerase e reconhece uma repetição direta de sete pares de
bases (GGTCAAA/XAX/GGTCAAA) altamente conservada, chamada de “CtsR box”,
localizada a montante de todas as três unidades transcricionais (o operon clpC e os genes
clpP e clpE) (Figura 6) (DERRÉ, RAPOPORT & MSADEK, 2000).
CtsR box
CtsR box
CtsR box
C
Figura 6: Representação esquemática da organização estrutural do regulon CtsR. Este regulon
consiste em três unidades transcricionais, o operon tetracistrônico clpC, formado pelos gens ctsR,
mscA, mcsB e clpC (A), e dois operons monocistrônicos, clpE (B) e clpP (C). Todos os três operons
estão sob o controle negativo do repressor CtsR que pode se ligar em duas ou mais repetições
diretas (“CtsR box”), indicadas pelas setas ( e ) (adaptado de SCHUMANN, 2003).
A
B
33
Os genes do regulon CtsR são expressos em níveis basais a 37ºC e são fortemente
estimulados após um estímulo de calor. Esse mecanismo de regulação parece ser baseado
na manutenção de um nível de expressão constitutiva de CtsR a 37ºC, seguido por uma
inativação transitória do repressor após exposição ao estresse. O nível de CtsR é controlado
pela protease ClpXP (DERRÉ et al., 1999).
Esse regulon ainda é formado por mais outros dois genes, mcsA e mcsB (Figura 6).
Os mesmos dão origem às proteínas McsA e McsB que agem como moduladores do
repressor CtsR. Assim, McsA revela semelhanças com proteínas “dedo” de zinco, que
funcionam como proteínas de ligação ao DNA ou participam na mediação das interações
proteína-proteína. Já McsB possui semelhanças com arginina quinase e está envolvida na
inativação de CtsR (KRÜGER et al., 2001). Além disso, McsA pode auxiliar CtsR tanto na
aquisição quanto na estabilização do mesmo em sua conformação ativa e McsB, através de
fosforilações, marca esse repressor para a proteólise mediada por ClpCP (KRÜGER et al.,
2001).
1.5 PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
Com objetivo de analisar a expressão dos genes de choque térmico regulados pelos
sistemas HrcA e CtsR em Staphylococcus saporphyticus foi utilizada a técnica de PCR
quantitativo em tempo real.
De modo convencional, a reação em cadeia da polimerase (PCR) pode amplificar
uma sequência de ácido nucleico presente em uma amostra, através de processos cíclicos
que gerarão um grande número de cópias idênticas, sendo as mesmas facilmente analisadas.
Isso tornou possível, por exemplo, a manipulação de DNA para fins de clonagem,
engenharia genética e sequenciamento.
Porém, como uma técnica de análise, o método de PCR convencional possui sérias
limitações. Em primeiro lugar é necessário amplificar a sequência de DNA e, então,
analisar seu produto. Desse modo, a quantificação é difícil, uma vez que esse tipo de PCR
dá origem essencialmente à mesma quantidade de produto amplificado, independentemente
da quantidade inicial de moléculas de DNA molde. Essa limitação foi resolvida em 1992
através do desenvolvimento da PCR em tempo real por Higuchi e colaboradores (1992). Na
PCR em tempo real, a quantidade de produto formado é monitorada durante o curso da
34
reação através de corantes ou sondas fluorescentes. O sinal fluorescente gerado é
proporcional a quantidade de produto formado e o número de ciclos de amplificação
requeridos para obter uma quantidade particular de moléculas de DNA são registrados.
Existe uma variedade muito grande de moléculas químicas fluorescentes disponíveis
para esse tipo de reação. Em uma delas, a fluorescência emitida pelas moléculas analisadas
se dá através do uso do corante “SYBER Green I”. Esse corante é o mais comumente
utilizado em reações de PCR em tempo real e só emite fluorescência quando se liga de
forma não específica em DNA dupla fita. Quando se encontram livres na solução esses
corantes não fluorescem devido às vibrações moleculares, que atraem seus componentes
aromáticos. Assim, eles convertem a energia da excitação eletrônica em calor que se dissipa
no solvente circulante (KUBISTA et al., 2006).
Durante os ciclos iniciais em uma reação de PCR em tempo real, o sinal é fraco e
não pode ser distinguido do “background”, o que faz com que o aumento da fluorescência
não possa ser detectado. A seguir, quando há produto suficientemente acumulado ocorre a
emissão de um sinal fluorescente detectável, que aumenta exponencialmente. Esse sinal irá
aumentar até atingir um limiar, onde passará a ficar mais distante e saturará (Figura 7). A
saturação ocorre devido ao esgotamento de algum componente crítico da reação, como por
exemplo, oligonucleotídeos ou dNTPs (KUBISTA et al., 2006). É interessante notar que
em um experimento típico de PCR em tempo real, todas as curvas de resposta saturam no
mesmo nível. Por isso, as medições dos pontos finais da PCR não dizem nada sobre a
quantidade inicial de moléculas alvo; elas somente distinguem uma amostra positiva de
uma negativa.
Por outro lado, as curvas de resposta são separadas na fase exponencial da reação, o
que reflete a diferença nas quantidades iniciais de moléculas alvo. Essa diferença existente
entre as moléculas alvo é, então, quantificada pela comparação do número de ciclos de
amplificação que serão requeridos para alcançar um determinado nível de sinal de
fluorescência detectável. O número de ciclos no qual o sinal de fluorescência passa a ser
detectável é chamado de “threshold cycle” ou Ct (Figura 7). O valor de Ct é medido na
fase exponencial da reação quando os reagentes ainda não estão limitados, e assim a PCR
em tempo real pode ser usada para calcular de forma confiável e precisa o montante inicial
35
do alvo presente. Este quando se encontra presente em menor quantidade exige mais ciclos
para exibir um sinal fluorescente detectável.
Figura 7: Curva resposta da PCR em tempo real mostrada em escala logarítmica. Um
limiar é fixado acima do “background” e o número de ciclos necessários para atingir esse
limiar é chamado de Ct. Durante os primeiros ciclos o sinal é fraco e não pode ser
distinguido do “background”. Os pontos de cruzamento com a linha limite são os valores
do Ct plotados versus o logaritmo do número inicial de moléculas molde presentes em
duas amostras-padrão. Conforme a quantidade de produto vai acumulando, o sinal de
amplificação vai aumentando exponencialmente. Posteriormente, os níveis de sinal são
saturados (adaptado de KUBISTA et al., 2006).
Fase exponencial
de crescimento
Número de ciclos
Fluorescência
Linha limite
Fase platô
“Background”
Ct Ct
36
A PCR em tempo real se aplica em diagnósticos laboratoriais, na detecção de ácidos
nucleicos em alimentos, em vetores utilizados em protocolos de terapia gênica, em
organismos geneticamente modificados, em áreas da microbiologia veterinária, oncologia,
detecção de patógenos, análise de expressão de genes, de polimorfismo de único
nucleotídeo (SNP), de aberrações cromossômicas e mais, recentemente, atua também na
detecção de genes (MACKAY, 2004; KUBISTA et al., 2006).
As análises podem ser feitas através de quantificação absoluta ou relativa. Portanto,
em um experimento onde se utilize o método de quantificação absoluta, o interesse está em
descobrir uma propriedade intrínseca de uma determinada amostra. Já na quantificação
relativa, o objetivo é determinar a quantidade relativa de um ácido nucleico alvo em uma
quantidade equivalente de amostra (ELEAUME & JABBOURI, 2004). A expressão de
genes pode ser analisada através da quantificação relativa utilizando um gene de referência
como normalizador da reação. A identificação de um gene de referência não é algo trivial e
em muitos casos o uso de múltiplos genes de referência pode ser necessário para uma
quantificação exata (VANDESOMPELE et al., 2002).
A aplicação mais comum da PCR em tempo real é no estudo da expressão de genes.
Esses estudos são de grande importância, visto que, a função de uma parte importante do
genoma de diversos seres vivos é ainda desconhecida, assim como, a relação entre enzimas,
substâncias de sinalização e diversas moléculas menores, cujo conhecimento ainda é
bastante limitado (DEEPAK et al., 2007). O gene 16S rRNA é o mais utilizado como gene
de referência, já tendo sido descrito em trabalhos anteriores como sendo ideal para estudos
de expressão de genes (GREISEN et al., 1994; VANDECASTEELE et al., 2001;
VAUDAUX et al., 2002).
37
2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
O objetivo dessa dissertação foi estudar a resposta ao choque térmico em
Staphylococcus saprophyticus, analisando as proteínas de choque térmico DnaK, GroEL e
ClpB, assim como, a expressão dos genes hrcA e ctsR, que compõem o sistema de
regulação de choque térmico, HrcA e CtsR.
2.2 Objetivos específicos e abordagem experimental
1) Analisar a capacidade de crescimento das células de S. saprophyticus a 37ºC e nas
temperaturas de 42ºC, 45ºC e 48ºC, assim como, a capacidade de sobrevivência nas
temperaturas de 48ºC, 50ºC, 52ºC e 55ºC;
2) Analisar a indução da expressão das proteínas de choque térmico DnaK, GroEL e ClpB
nas temperaturas de 42ºC, 45ºC e 48ºC através da marcação de proteínas com
35
S-Met;
3) Analisar a identidade/similaridade das sequências de aminoácidos das proteínas DnaK,
GroEL e Clps de S. saprophyticus e de outras espécies de Staphylococcus utilizando a
ferramenta BLAST;
4) Analisar “in silico” a organização genômica e a região promotora dos operons dnaK,
groE e clpC e dos genes clpB e clpP, utilizando-se as sequências obtidas a partir do genoma
da estirpe de S. saprophyticus ATCC 15035 sequenciado no TIGR, visando detectar
sequências específicas dos sistemas de regulação HrcA e CtsR;
5) Analisar a indução dos mRNAs dos genes hrcA e ctsR nas temperaturas de 42ºC, 45ºC e
48ºC, utilizando-se PCR quantitativo em tempo-real (qRT-PCR), visando verificar a
indução da expressão destes genes;
6) Comparar a diferença de expressão dos genes hrcA e ctsR durante o choque térmico
através de experimentos de termocinética, submetendo as células de S. saprophyticus à
38
temperatura de 48ºC por tempos superiores a 10 min, utilizando-se PCR quantitativo em
tempo-real (qRT-PCR).
39
3 Materiais e Métodos
3.1 Meios de cultura, condições de cultivo e armazenamento da estirpe
Este estudo foi realizado utilizando-se a estirpe Staphylococcus saprophyticus
ATCC 15305. Essa é a linhagem tipo da espécie e foi isolada a partir de urina humana.
Meio caldo BHI (Difco): Este meio foi utilizado acrescido de glicerol a 30%
(v/v) para estoque da estirpe e a mesma foi armazenada a -20ºC.
Meio TSB (Difco): O caldo TSB foi utilizado para a curva de crescimento.
Já para a curva de sobrevivência, foi utilizado o meio TSB ágar (1,5%).
Meio MEM (Difco): Este meio foi utilizado nos experimentos de marcação
isotópica das proteínas.
Solução salina: NaCl 0,85% (p/v) em água destilada.
3.2 Tampões e soluções utilizados para a análise de ácidos nucleicos e proteínas
3.2.1 Análise de RNA
Tampão MOPS 10X: MOPS (40 mg/ml) (Sigma); acetato de sódio 1 M;
EDTA (Reagen) 0,5 M - pH 8,0.
Solução de guanidina isotiocianato 5M: Tris-HCl (Promega) 50 mM;
guanidina isotiocianato (Promega) 4 M; EDTA 25 mM; pH 7,5
Solução de guanidina hidroclorídrica: guanidina hidroclorídrica (Promega)
6 M; EDTA 25 mM; pH 7,5.
40
3.2.2 Análise de proteínas
Tampão de tratamento: Tris-HCl 0,5 M - pH 6,8; SDS 4% (p/v); 2-
mercaptoetanol 10% (v/v) (Reagen); de glicerol 20% (v/v).
Tampão de transferência: Tris-base (Promega) 25 mM; glicina 193 mM
(Reagen); metanol 20% (v/v) (Merck).
Tampão de corrida eletroforética: Tris-base 25 mM; glicina 193 mM
(Reagen); SDS 0,1% (p/v).
Tampão PBS (pH 7,4): NaCl 137 mM (Merck); KH
2
PO
4
20 mM (Reagen);
Na
2
HPO
4
80 mM (Reagen); KCl 2,7 mM (Merck).
Solução de acrilamida-bis-acrilamida: acrilamida 29% (p/v) (Plus One); bis-
acrilamida 1% (p/v) (BIO-RAD).
Solução descorante I: metanol 50% (v/v) (Merck); ácido acético 10% (v/v)
(MercK).
Solução descorante II: metanol 5% (v/v); ácido acético 7% (v/v).
3.3 Géis utilizados para eletroforese
Gel desnaturante de agarose/formaldeído para RNA: agarose 1,2% (p/v)
(Invitrogen); MOPS 1X; formaldeído 3% (v/v) (Merck) em água tratada com
DEPC.
Gel de separação 10% para proteína: acrilamida bis-acrilamida 10% (p/v);
Tris-HCl 0,25M - pH 8,8; SDS 0,1% (p/v); glicerol 0,1% (v/v); persulfato de
amônio 2% (p/v) (BIO-RAD); TEMED 0,1% (v/v) (Plus One).
Gel de empilhamento 4,8% para proteína: acrilamida bis-acrilamida 4%
(p/v); Tris-HCl 0,25M - pH 6,8; SDS 0,1% (p/v); persulfato de amônio 2%
(v/v); TEMED 0,1% (v/v).
41
3.4 Curva de crescimento
Com o objetivo de analisar a capacidade de crescimento de S. saprophyticus ATCC
15305 em temperaturas maiores do que 37ºC, células bacterianas foram crescidas em caldo
BHI a 37ºC sob agitação por 18 h. Após o crescimento, a cultura foi diluída 100 vezes em
caldo BHI e a densidade ótica (DO
600nm
= 0,5) determinada, sendo esse momento chamado
de tempo inicial (t=0). Em seguida, alíquotas de 3 ml dessa cultura foram incubadas à
temperatura de 37°C (controle) e nas temperaturas de 42ºC, 45ºC e 48ºC para que fosse
analisado o crescimento sob possíveis condições de choque térmico.
Desse modo, a curva de crescimento foi determinada através da medição do
crescimento celular a cada 60 min de incubação, mediante a determinação da densidade
ótica (DO
600nm
= 0,5), até que as culturas atingissem a fase estacionária. Esse experimento
foi realizado de forma independente por cinco vezes.
3.5 Curva de sobrevivência
Para analisar a capacidade de sobrevivência nas temperaturas de 48ºC, 50ºC, 52ºC e
55ºC as células bacterianas foram inicialmente crescidas em caldo BHI a 37ºC sob agitação
por 18 h. Em seguida, como mencionado no item 3.4, a cultura foi diluída 100 vezes em
caldo BHI e a densidade ótica (DO
600nm
= 0,5) determinada, sendo esse momento chamado
de tempo inicial (t=0).
A sobrevivência bacteriana foi determinada pela titulação das culturas nos tempos 0,
1, 2 e 3 horas, através da determinação das UFCs/ml (unidades formadoras de colônia por
mililitro de cultura). Essa titulação foi realizada através da diluição seriada (1:10) de 10
-2
a
10
-5
das culturas submetidas às temperaturas de estresse. De cada diluição, 100 μl foram
retirados e semeados em ágar TSB. As culturas foram incubadas a 37ºC por 18 h e o
número de células viáveis foi determinado (UFC/ml = n
o
de colônias x inverso diluição x
10) para a plotagem da curva de sobrevivência. Esse experimento foi realizado de forma
independente por cinco vezes.
42
3.6 Análise de proteínas
3.6.1 Marcação isotópica de proteínas com
35
S-metionina (
35
S-Met)
Buscando analisar a indução das proteínas de choque térmico DnaK, GroEL e ClpB
nas temperaturas de estresse 42ºC, 45ºC e 48ºC, a marcação isotópica dessas proteínas foi
feita utilizando-se
35
S-Met. Sendo assim, a estirpe S. saprophyticus ATCC 15305 foi
cultivada em caldo BHI a 37ºC por 18 h, sob agitação. A seguir, a cultura foi diluída 1:4 no
mesmo caldo, incubada a 37ºC por 1 h e centrifugada por 1 min a 2.152 xg (Eppendorf,
modelo 5418). Esse material foi, então, lavado em salina 0,85% (p/v) e solubilizado em
MEM sem metionina ao qual foram adicionados, aproximadamente, 100 μCi/ml de
35
S-Met
(ICN - Pharmaceuticals). A solução obtida foi divida em alíquotas iguais, que foram
mantidas a 37ºC ou submetidas ao choque térmico de 42ºC, 45ºC e 48ºC por 30 min.
A seguir, para que fossem obtidos extratos proteicos de cada temperatura, as
aliquotas foram centrifugadas por 1 min a 13.000 xg, lavadas em solução salina 0,85%
(p/v) e incubadas com lisozima (20 mg/ml) (SIGMA) e lisostafina (0,1 mg/ml) (SIGMA)
por 2 h a 37ºC.
Para que a análise por eletroforese em SDS-PAGE fosse feita, foram adicionados 50
μl de tampão de tratamento. As amostras foram aquecidas a 100ºC por 5 min e a seguir,
para obtenção do sobrenadante, foram centrifugadas a 13.000 xg por 5 min. O sobrenadante
foi estocado a -20ºC (LAPORT et al., 2001).
3.6.2 Eletroforese de proteínas (SDS-PAGE)
Para a realização da eletroforese unidimensional de proteínas (SDS-PAGE), o gel de
poliacrilamida foi preparado segundo descrito por Laemmli (1970). Esse gel constou de um
sistema vertical e descontínuo, formado por um gel de empilhamento (“stacking gel”) e um
gel de separação (“running gel”). O gel de empilhamento corresponde a 1/3 do volume do
gel de separação, conforme descrito no subitem 3.3.
O gel de poliacrilamida foi submetido à eletroforese a uma corrente de 20 mA em
tampão de corrida por 1 h e 50 min. Em seguida, foi realizada uma autorradiografia.
43
3.7 Análise de mRNA
3.7.1 Extração de RNA
Para a obtenção do RNA total, a estirpe S. saprophyticus ATCC 15305 foi crescida
em 3 ml de caldo BHI a 37ºC por 18 h, sob agitação. Em seguida, a cultura foi diluída 20
vezes no mesmo caldo e incubada novamente a 37ºC, até que o crescimento bacteriano
atingisse 10
8
células/ml o que corresponde, aproximadamente, a uma DO
600nm
de 0,5. Após
o processo de crescimento da estirpe, foram transferidas alíquotas de 1 ml da cultura para
diferentes microtubos. Um destes microtubos foi mantido à temperatura de 37°C e outros
foram submetidos ao choque térmico a 42ºC, 45ºC ou 48ºC por 10 min.
As suspensões obtidas, após o tratamento térmico, foram centrifugadas a 13.000 xg
por 5 min, os sobrenadantes foram desprezados e os sedimentos foram lavados em 1 ml de
tampão TE 1X, homogeneizando-se em vórtex. Uma nova centrifugação a 13.000 xg por 5
min foi realizada, desprezando-se os sobrenadantes. Os sedimentos foram, então,
solubilizados em uma solução de TE 1X com lisozima (20 mg/ml) e lisostafina (0,2
mg/ml), sendo incubados a 37ºC por 1-2 h, para que houvesse a lise celular.
Decorrido o tempo citado anteriormente, toda a manipulação foi realizada no gelo.
Foram adicionados 600 μl de uma solução composta de guanidina isotiocianato 5 M e de β-
mercaptoetanol preparada no momento de uso, sendo necessária a homegeinização até que
a solução ficasse translúcida. Posteriormente, foram adicionados 200 μl de etanol absoluto
para que o RNA fosse precipitado e a solução foi invertida diversas vezes. Em seguida, foi
realizada uma centrifugação a 11.000 xg (Eppendorf, modelo 5417R) por 5 min a 4ºC e os
sobrenadantes foram descartados.
Uma solução composta de guanidina hidroclorídrica 6 M e mercaptoetanol (Merck)
foi preparada no momento de uso e foram adicionados 50 μl da mesma em cada microtubo,
juntamente com 0,05 volume de ácido acético 1 M e 0,5 volume de etanol absoluto. Cada
microtubo com essa mistura foi invertido por diversas vezes e deixado por 10 min a -20ºC.
Uma centrifugação a 5.500 xg por 10 min a 4ºC foi realizada e os sobrenadantes
descartados. Após, foi adicionada 100 μl água livre de RNase e uma incubação a 65ºC por
10 min foi realizada para solubilizar o RNA.
44
Posteriormente, os RNAs obtidos para cada temperatura, foram precipitados através
da adição de acetato de sódio (1/10 do volume) e etanol (2,5 do volume) e armazenados a -
20ºC. No dia seguinte, o RNA armazenado foi centrifugado a 13.000 xg por 20 min a 4ºC,
o sobrenadante removido, o precipitado lavado com etanol 70% (v/v) e submetido a uma
centrifugação de 13.000 xg por 5 min a 4ºC. Por último, 50 μl água livre de RNase foi
adicionada e a estocagem feita em freezer -70ºC.
3.7.2 Síntese de cDNA
O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total obtido, através da submissão das
células da estirpe S. saprophyticus ATCC 15305 a temperatura de 37ºC e nas temperaturas
de estresse de 42ºC, 45ºC e 48ºC. Este cDNA foi utilizado para os experimentos de qRT-
PCR com o objetivo de estudar a expressão concomitante dos genes hrcA e ctsR.
Desse modo, para a obtenção do cDNA, o primeiro passo foi tratar previamente o
RNA total através de uma reação constituída de 1U da enzima “RQ1 RNase-Free DNase”
(Promega), do tampão 1X da enzima e água livre de RNase em quantidade suficiente para
um volume final de 50 μl. Essa mistura foi mantida a 37ºC por 1 h e depois de decorrido
esse tempo, foi adicionada a solução de parada (“Stop Solution”; Promega) a uma parte
desse material e o mesmo foi mantido a 65ºC por 10 min para bloquear a reação da enzima.
A síntese da primeira fita do cDNA foi realizada utilizando 5 µg do RNA já tratado
previamente com DNase, 1,4 mM de cada desoxiribonucleotídeo, 250 ng/μl de
oligonucleotídeos randômicos (d6) (GE - Healthcare) e água livre de RNase para um
volume final de 14 μl. A mistura foi incubada a 65ºC por 5 min para desnaturação do RNA
e em seguida, foram adicionados DTT (Invitrogen™) na concentração final de 0,01 M,
tampão de síntese de primeira fita (Invitrogen™) na concentração final de 1X, 200 U da
enzima “Super-Script III Reverse Transcriptase” (Invitrogen™) e a mistura de reação foi
incubada a 25ºC por 5 min, a 50ºC por 60 min e a 75ºC por 15 min. O controle negativo da
reação foi feito utilizando a mistura de reação sem a adição da enzima “Super-Script III
Reverse Transcriptase” (Invitrogen™). O cDNA obtido foi guardado a -70ºC até o
momento do uso para o qRT-PCR.
Além dos cDNAs gerados para os experimentos de qRT-PCR que tinham como
objetivo de estudar a expressão concomitante dos genes hrcA e ctsR, foram gerados
45
cDNAs para experimentos de cinética. Nesses experimentos foram utilizados RNAs
extraídos após a submissão das células bacterianas na temperatura de estresse de 48°C por
10, 20 e 30 min.
3.7.3 PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
Experimentos de quantificação relativa foram realizados nesse trabalho, uma vez
que um dos objetivos das nossas análises era estudar a indução dos mRNAs dos genes hrcA
e ctsR nas temperaturas de estresse (42ºC, 45ºC e 48ºC), visando verificar a expressão
concomitante dos diferentes genes em cada temperatura.
Para avaliar a expressão dos genes alvos (hrcA e ctsR) a temperatura de 37ºC foi
escolhida como calibrador da reação, e a expressão desses genes foi avaliada segundo o
aumento ou diminuição da expressão em relação ao calibrador.
Nesse trabalho, foi utilizado o gene 16S rRNA como gene de referência, já que o
mesmo já havia sido descrito em trabalhos anteriores como sendo ideal para estudos de
expressão de genes (GREISEN et al., 1994; VANDECASTEELE et al., 2001; VAUDAUX
et al., 2002). Esse gene possui expressão constitutiva e não sofre variações na sua
expressão quando submetido às condições de choque térmico. Anteriormente à escolha do
16S rRNA, outros dois genes de expressão constitutiva haviam sido utilizados, porém
nenhum deles mostrou-se útil como normalizadores da reação. São eles: o gene tpi que
codifica uma enzima do metabolismo da glicose, a triosefosfato isomerase, e o gene gmk
que codifica uma enzima do metabolismo de ácidos nucléicos, a guanilato quinase. As
sequências dos oligonucleotídeos utilizados e os tamanhos dos fragmentos amplificados
pelos mesmos encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1: Oligonucleotídeos desenhados para amplificação do cDNA por PCR.
Genes
Oligonucleotídeos
Tm
Tamanho esperado do
fragmento amplificado
46
hrcA
“HrcA Forw” - direto
5’GACCTTTCCTCTACATTGAG 3’
“HrcA Rev.” - reverso
5’CCTGATGTAAACACAACCAC 3’
49,9ºC
51,4ºC
164 pb
ctsR
“CtsR Forw” - direto
5’GACGTTGTTGAAATTCGACG 3’
“CtsR Rev.” - reverso
5’GTGATTCGAATGTAACCACC 3’
52,3ºC
51,2ºC
149 pb
16S rRNA
“16SrRNA Forw” - direto
5’GGCAAGCGTTATCCGGAATT 3’
“16SrRNA Rev.” - reverso
5’GTTTCCAATGACCCTCCACG 3’
55,9ºC
56,1ºC
150 pb
tpi
“Tpi Forw” - direto
5’ACCAATCGTTTGTGTAGGTG 3’
“Tpi Revs” - reverso
5’GATTGCCCAGATTGGTTCGT 3’
52,9ºC
55,6ºC
151 pb
gmk
“gmk frw menor” – direto
5’TCATTTACGTGAGCGCTTAG 3’
“gmk rev” - reverso
5’CGTTGCTTAGCTAACTCAAC 3’
52,6ºC
51,4ºC
153 pb
47
Além dos experimentos de análise da expressão dos genes hrcA e ctsR, foram feitos
experimentos de termocinética para avaliar a diferença de expressão desses genes quando
submetidos ao estresse térmico por tempos superiores a 10 min. Desse modo, os cDNA
utilizados nos experimentos de termocinética foram gerados a partir de RNAs extraídos de
células submetidas a temperatura de estresse de 48°C por 10, 20 e 30 min. O gene 16S
rRNA e a temperatura de 37°C também foram utilizados, respectivamente, como
normalizador e calibrador das reações.
As amplificações da qRT-PCR foram realizadas no termociclador ABI Prism 7500
(Applied Biosystems). As reações de amplificação foram compostas por cDNA, “2X Power
SYBR Master Mix” (Applied Biosystems), 150 nM de cada iniciador (direto e reverso) para
os genes hrcA, ctsR e 16S rRNA e água livre de DNase em quantidade suficiente para um
volume final de 25 μl. Em seguida, essas reações foram distribuídas em placas de 96 poços
e curvas de diluição foram feitas para definir qual a melhor faixa de concentração em que
houvesse máxima eficiência da reação para todos os genes. Tanto nas reações cujo cDNA
foi gerado (reações nas quais foi adicionada a enzima “Super Script III Reverse
Transcriptase” - Invitrogen™), quanto naquelas cujo cDNA não foi sintetizado (reações nas
quais não foi adicionada a enzima “Super Script III Reverse Transcriptase” - Invitrogen™),
as curvas de diluição mostraram que a eficiência máxima da reação foi obtida com a
diluição de 10X. Cada cDNA foi amplificado em triplicata.
A quantificação relativa da expressão de RNA (a partir do cDNA) foi feita
utilizando o método do ∆Ct comparativo, a partir dos valores obtidos de cinco
experimentos independentes. Esse método é expresso pela fórmula 2
-(∆Ct)
, onde o Ct refere-
se ao ciclo de entrada e foi determinado em cada placa de diluição pelo sistema de detecção
de sequência de PCR em tempo real 7500 (Applied Biosystems). Após a determinação dos
valores de Ct, a diferença entre o Ct do RNA alvo menos o Ct do gene de referência
(controle interno) foi avaliada (SCHMITTGEN & LIVAK, 2008).
48
3.8 Bioinformática
Os estudos de bioinformática foram utilizados para análise das sequências de
aminoácidos das proteínas DnaK, GroEL, ClpA, ClpB, ClpC e ClpP de S. saprophyticus
ATCC 15305 quanto à identidade/similaridade com as proteínas de outros micro-
organismos, assim como, quanto à presença de domínios específicos. As ferramentas
utilizadas para estas análises foram BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e
CLUSTAL W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw).
As regiões promotoras também foram analisadas para observação da presença de
sequências CIRCE ou sequências “CtsR box”, que caracterizam o sistema de regulação ao
qual pertencem os genes hrcA e ctsR, respectivamente. As sequências foram obtidas no
TIGR (“The Institute for Genomic Research”, http://www.tigr.org).
49
4 Resultados
4.1 Curvas de crescimento
Com o objetivo de analisar a capacidade de crescimento da estirpe S. saprophyticus
ATCC 15305 sob diferentes temperaturas, as células bacterianas foram mantidas à 37ºC ou
submetidas às temperaturas de 42ºC, 45Cº e 48ºC. Desse modo, observou-se que as células
bacterianas controle, ou seja, aquelas que foram mantidas a 37ºC durante as seis horas de
incubação, alcançaram o final da fase exponencial de crescimento obtendo uma DO
600nm
de
0,5, como observado na figura 1. Porém, quando as células foram submetidas ao estresse
térmico, o final da fase exponencial foi alcançado numa DO
600nm
máxima de 0,1 para a
temperatura de 42ºC. Considerando as temperaturas de 45º e 48ºC a DO
600nm
observada
ficou abaixo de 0,1, após seis horas de incubação (Figura 1). Esses resultados permitiram
concluir que o estresse térmico a partir de 42ºC, causou uma redução do crescimento
celular da estirpe estudada.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
37°C
42°C
45°C
48°C
DO
600nm
Figura 1 – Análise do crescimento celular da estirpe de S. saprophyticus ATCC 15305. O
crescimento foi determinado em DO
600nm
após o crescimento das células à diferentes
temperaturas (37ºC, 42ºC, 45ºC e 48ºC), em intervalos de 1 h, durante um período total de 6 h.
Na abscissa estão representados os intervalos de 1 h do tempo de incubação e na ordenada o
crescimento bacteriano está representado em DO
600nm.
À direita, encontram-se os símbolos que
representam as temperaturas no gráfico.
horas
50
4.2 Curvas de sobrevivência
Para analisar a capacidade de sobrevivência da estirpe S. saprophyticus ATCC
15305 sob diferentes temperaturas de estresse, as células bacterianas foram submetidas às
temperaturas de estresse de 48ºC, 50ºC, 52ºC e 55ºC por 3 h. A temperatura inicial de 48ºC
foi selecionada, pois nos experimentos de crescimento sob estresse térmico, esta foi a maior
temperatura analisada que não apresentou crescimento bacteriano. A figura 2 mostra que
nas temperaturas de 48ºC e 50ºC ainda foi possível observar a presença de células viáveis
durante as 3 h de incubação. Já para as temperaturas de 52ºC e 55ºC, as curvas de
sobrevivência geradas exibiram um perfil que demonstrou a ausência de células viáveis a
partir da segunda hora em que a estirpe supracitada foi submetida a essas temperaturas de
estresse (Figura 2).
Curva de sobrevivência
0 1 2 3 4
10
-6
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
48°
50°
52°
55º
horas
% sobrevivência
Figura 2 – Análise de sobrevivência da estirpe S. saprophyticus ATCC 15305 sob
temperaturas de estresse. A sobrevivência das células foi determinada a 48ºC, 50ºC, 52ºC e
55ºC em intervalos de 1 h. Na abscissa, estão representados os intervalos de tempo (horas) de
incubação e, na ordenada, a porcentagem de sobrevivência bacteriana na escala log
10
. À
direita do gráfico encontram-se símbolos que representam no gráfico as temperaturas
testadas.
ºC
ºC
ºC
ºC
51
4.3 Marcação isotópica de proteínas com
35
S-Met
Buscando analisar a resposta ao choque térmico da estirpe S. saprophyticus ATCC
15305, uma cultura em fase logarítmica de crescimento foi submetida a um tratamento sob
diferentes temperaturas, na presença de
35
S-Met, conforme descrito no subitem 3.6.1 de
materiais e métodos. A autorradiografia obtida mostrou que houve uma indução da
expressão de proteínas com massas moleculares de, aproximadamente, 60 e 70 kDa
conforme a temperatura aumentava (Figura 3). Baseando-se na massa molecular, essas
proteínas correspondem, possivelmente, à GroEL e DnaK, respectivamente. Ainda foi
observada a indução de uma proteína com massa molecular de, aproximadamente, 100 kDa
conforme havia o aumento da temperatura. Essa massa molecular corresponde,
possivelmente, à proteína ClpB que faz parte da família das Clp/ATPases de classe I.
Outras proteínas de massas moleculares menores também foram induzidas pelo estresse,
provavelmente, fazem parte do grupo de proteínas de choque térmico.
Figura 3 – Análise da indução de proteínas de choque térmico na estirpe S. saprophyticus ATCC
15305. As células foram submetidas ao choque térmico a 42ºC, 45ºC e 48ºC, durante 30 min, na
presença de
35
S-Met. Um controle foi mantido a 37ºC nas mesmas condições de cultivo. As proteínas
foram separadas por SDS-PAGE 10% e visualizadas por autorradiografia. Igual número de células foi
adicionado em cada canaleta. À esquerda, estão indicadas as proteínas induzidas pelo choque
térmico, possíveis DnaK, GroEL e ClpB. À direita, estão indicadas as massas moleculares das
respectivas proteínas em kDa. Proteínas de menor massa molecular também foram induzidas e estão
indicadas por pontas de setas à direita da figura.
DnaK
GroEL
ClpB
37°C
42°C
45°C
48°C
kDa
100
70
60
50
52
4.4 Análise da identidade/similaridade das sequências de aminoácidos das proteínas
DnaK, GroEL e Clps
A homologia das proteínas DnaK, GroEL e Clps foi analisada através da
comparação das sequências de aminoácidos obtidas do genoma da estirpe S. saprophyticus
ATCC 15305 disponibilizado pelo “Institute for Genomic Research” (www.tigr.org).
Utilizando-se a ferramenta BLAST observou-se que as sequências de aminoácidos das
proteínas DnaK, GroEL, ClpA, ClpB, ClpC e ClpP de S. aureus apresentavam mais de 80%
de identidade e mais de 90% de similaridade com as de S. saprophyticus. Quando
comparado com S. epidermidis e S. haemolyticus também foi observado mais de 80% de
identidade e mais de 90% de similaridade para as sequências de aminoácidos das proteínas
DnaK, GroEL, ClpA, ClpB e ClpC. No caso da ClpA de S. epidermidis e ClpP de S.
epidermidis e S. haemolyticus as sequências não estavam anotadas nos respectivos genomas
e por isso não puderam ser realizadas.
Logo, foi visto que as proteínas DnaK, GroEL e Clps de S. saprophyticus
apresentaram um alto grau de homologia com àquelas de outras espécies do gênero
Staphylococcus como observado na Tabela 1.
* - sequência de aminoácido não anotada no genoma dessa espécie.
DnaK
GroEL
ClpA
ClpB
ClpC
ClpP
S. aureus
84% / 98%
84% / 99%
82% / 98%
82% / 89%
90% / 94%
86% / 98%
S. epidermidis
84% / 98%
83% / 100%
*
82% / 89%
91% / 94%
*
S. haemolyticus
86% / 98%
84% / 99%
84% / 98%
83% / 90%
90% / 93%
*
Proteínas
Tabela 1: Comparação (identidade/similaridade) das sequências de aminoácidos das proteínas
DnaK, GroEL, ClpA, ClpB, ClpC e ClpP de S. saprophyticus com sequências homólogas de
outras espécies do gênero Staphylococcus.
Espécies
53
4.5 Análise “in silico” dos operons dnaK, groE, clpC e dos genes clpB e clpP
4.5.1 Organização genômica do operon dnaK
Com o objetivo de identificar os genes que compõem o operon dnaK da estirpe de S.
saprophyticus ATCC 15305, dados do seu respectivo genoma foram obtidos e analisados.
Assim, análises “in silico” foram feitas e mostraram que o operon dnaK é composto por
quatro genes. O primeiro deles é o gene hrcA que possui 981 pb, seguido pelos genes grpE
com 612 pb, dnaK com 1845 pb e dnaJ com 1137 pb (Figura 4). Na região promotora
desse operon foram identificadas as sequências operadoras CIRCE e “CtsR box” (Figura
4). A sequência CIRCE, do sistema de regulação HrcA, está localizada a 12 pb a montante
do sítio inicial de tradução, ATG do gene hrcA (Figura 5). Já a sequência “CtsR box” está
localizada a 56 pb a montante do sítio inicial de tradução e a 12 pb a montante da região
-10. Ainda em relação a localização da sequência “CtsR box”, esta possui uma de suas
repetições sobreposta a região -35 (Figura 5).
Figura 4 – Representação esquemática da organização genética do operon dnaK em S.
saprophyticus. Na região promotora encontra-se as sequências operdoras CIRCE e “CtsR
box” à montante do primeiro gene do operon dnaK, o gene hrcA. À jusante do gene hrcA
(981 pb), encontra-se o gene grpE (612 pb), seguido pelos genes dnaK (1845 pb) e dnaJ
(1137 pb), respectivamente. As setas indicam a direção da transcrição de cada gene.
Figura 5 - Análise “in silico” da região promotora à montante do operon dnaK de S.
saprophyticus. A sequência CIRCE (em vermelho, negrito e sublinhado) encontra-se à montante
do sítio inicial de tradução, ATG (em negrito), de hrcA. A sequência “CtsR box” (em azul, negrito
e sublinhada) encontra-se localizada a montante da região -10, com uma de suas repetições
sobreposta com a região -35. A sequência Shine – Dalgarno (SD) encontra-se à jusante da
sequência CIRCE, em laranja, negrito e sublinhada.
981 pb
612 pb
1845 pb
pb
1137 pb
pb
CIRCE
54
4.5.2 Organização genômica do operon groE
Através da observação do genoma da estirpe de S. saprophyticus ATCC 15305 foi
visto que o operon groE apresenta uma estrutura bicistrônica bastante conservada quando
comprada com outras espécies bacterianas. Desse modo, a estrutura bicistrônica presente é
constituída pelo gene groES com 288 pb, seguido pelo gene groEL com 1623 pb (Figura
6). Através das análises “in silico” realizadas na região promotora desse operon, pode-se
verificar a presença da sequência operadora CIRCE, relacionada ao sistema de regulação
HrcA, localizada à montante do gene groES, a 28 pb do sítio inicial de tradução ATG de
groES (Figura 7).
Figura 6 - Representação esquemática da organização genética do operon groE em S.
saprophyticus. A estrutura bicistrônica formada pelos gene groES (228 pb) seguido pelo
gene groEL (1623 pb) é observada. A sequência operadora CIRCE à montante do
primeiro gene do operon, o gene groES encontra-se indicada na região promotora. As
setas indicam a direção da transcrição dos genes que constituem esse operon.
Figura 7 - Análise “in silico” da região promotora à montante do operon groE de S.
saprophytiucus. A sequência CIRCE (em vermelho, negrito e sublinhado) encontra-
se à montante do sítio inicial de tradução ATG (negrito). A sequência Shine –
Dalgarno (SD) em laranja, negrito e sublinhada encontra-se à jusante da sequência
CIRCE.
288 pb
1623 pb
55
4.5.3 Organização genômica do operon clpC e dos genes clpB e clpP
O operon clpC da estipe S. saprophyticus ATCC 15305 foi analisado e o primeiro
gene observado foi o ctsR com 462 pb, em seguida a esse gene foram encontradas duas
ORFs e, por último, estava presente o gene clpC com 2463 pb. À jusante do gene ctsR foi
encontrada a sequência operadora “CtsR box” (Figura 8). Essa sequência foi vista
representada duplamente, sendo a primeira “CtsR box” localizada a 22 pb a montante do
sítio inicial de tradução ATG, do gene ctsR. A segunda sequência “CtsR box” localiza-se
entre as regiões -10 e -35 (Figura 9).
Figura 8 - Representação esquemática da organização genética do operon clpC. Observa-se
o gene ctsR (462 pb), seguido por duas ORFs e pelo gene clpC (2463 pb). A região de
ligação do repressor CtsR, as sequências operadoras “CtsR box” estão representadas em
negrito e em azul na região promotora e encontra-se à montante do gene ctsR. A seta indica
a direção da transcrição dos genes que constituem esse operon.
Figura 9 - Análise “in silico” da região promotora localizada à montante do gene ctsR de S.
saprophytiucs. As sequências “CtsR box” estão representadas em azul, negrito e sublinhadas.
Encontra-se à jusante da sequência “CtsR box”, a sequência Shine – Dalgarno (SD) (em
laranja, negrito e sublinhada). O sítio inicial da tradução, ATG, do gene ctsR encontra-se em
negrito.
2463 pb
462 pb
CtsR box
56
Para os genes clpB e clpP, foi observado que a organização genética de ambos
apresentava uma sequência operadora “CtsR box”, sendo o gene clpB composto por 2610
pb e o gene clpP por 585 pb (Figuras 10 e 12). As análises “in silico” da região promotora
do gene clpB, mostraram que a sequência “CtsR box” está localizada à jusante da região -
10 e a 51 pb a montante do seu sítio inicial de tradução TTG (Figura 11). No caso do gene
clpP, a sequência “CtsR box” encontra-se à montante da região -10 e a 47 pb do sítio inicial
de tradução ATG, estando uma de suas repetições localizada sobreposta a região -35
(Figura 13).
Figura 10 - Representação esquemática da organização genética do gene clpB. O
gene clpB é composto por 2610 pb e possui na região promotora a sequência
operadora “CtsR box” (em negrito e em azul). A seta indica a direção da
transcrição desse gene.
Figura 11 - Análise “in silico” da região promotora do gene clpB de S.
saprophyticus. A sequência operadora “CtsR box” está representada em azul,
negrito e sublinhada e está localizada à jusante da região -10 e a montante da
sequência Shine – Dalgarno (SD) em laranja, negrito e sublinhada. TTG (negrito)
representa o sítio inicial de tradução de clpB.
2610 pb
57
Figura 12 - Representação esquemática da organização genética do gene clpP. O
gene clpP é composto por 585 pb e possui na região promotora a sequência operadora
“CtsR box” (em negrito e azul). A seta indica a direção da transcrição desse gene.
Figura 13 - Análise “in silico” da região promotora do gene clpP de S. saprophyticus. A
sequência operadora “CtsR box” está representada em azul, negrito e sublinhada e está localizada
à montante da região -10 e da sequência Shine – Dalgarno (SD) (em laranja, negrito e
sublinhada). O sítio inicial da tradução, ATG, de clpP está em negrito.
585 pb
58
4.6 PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
4.6.1 Padronização
Para que as análise de qRT-PCR fossem realizadas, alguns critérios de padronização
foram estabelecidos. Assim, antes que o gene 16S rRNA fosse utilizado como gene
normalizador, dois genes que fazem parte do metabolismo constitutivo de S. saprophyticus
foram testados como normalizadores. O gene tpi que codifica uma enzima do metabolismo
da glicose, a triosefosfato isomerase, e o gene gmk que codifica uma enzima do
metabolismo de ácidos nucleicos, a guanilato quinase. Ambos os genes mostraram
ineficiência como normalizadores da reação, uma vez que os mesmos não apresentaram
amplificações detectáveis quando utilizados nas reações de qRT-PCR, não podendo, então,
serem utilizados como controles internos (Figura 14).
MM hrcA ctsR tpi
gmk
100
pb
600
pb
1500 pb
1 2 3 4 5 6 7
8
Figura 14 - qRT-PCR dos genes hrcA, ctsR, tpi e gmk. As colunas 1, 3, 5 e 7
correspondem às amplificações obtidas a partir dos cDNAs gerados, utilizando-se os
seus respectivos iniciadores para os genes hrcA, ctsR, tpi e gmk. As bandas observadas
para os genes tpi e gmk (colunas 5 e 7) mostram que esses dois genes apresentam uma
menor eficiência de amplificação que aquela vista para os genes hrcA e ctsR. As colunas
2, 4 e 8 indicam a contaminação por DNA nos controles negativos. A coluna 6 não
apresentou contaminação. MM – marcador molecular de 100 pb.
59
Além da escolha de um gene que deveria ser o controle interno, outra etapa de
padronização importante, foi o tratamento dos RNAs extraídos com enzima DNase. Essa
etapa foi necessária porque os controles negativos dos cDNAs gerados (aqueles nos quais
os RNAs não recebiam a enzima “Super-Script III Reverse Transcriptase” e, portanto, não
havia geração de cDNAs) apareciam contaminados por DNA (Figura 15). Sendo assim,
para que as amplificações observadas nos experimentos de qRT-PCR fossem advindas
exclusivamente dos cDNAs gerados, e não de contaminações por DNA restantes (após
extração de RNA total), o RNA extraído nas diferentes temperaturas foi tratado com a
enzima “RQ1 RNase-Free Dnase”, antes da geração de cDNA. Esse tratamento foi
suficiente para resultar controles negativos livres de contaminações por DNA (Figuras 16
e 17).
Figura 15 - RT-PCR utilizando o par de iniciadores para o gene hrcA. O
RNA extraído foi tratado com DNase antes que o cDNA fosse gerado. A
amplificação observada na coluna 1 indica a amplificação a partir do cDNA e
a observada na coluna 2 indica a contaminação por DNA encontrada no
controle negativo da reação de RT-PCR. MM - marcador molecular de 100
pb.
MM
100 pb
600 pb
1500 pb
1 2
60
Figura 16 - RT-PCR utilizando o par de iniciadores para o gene hrcA (164 pb).
O RNA extraído foi tratado previamente com DNAse. A amplificação
observada na coluna 1 indica amplificação a partir do cDNA e a coluna 2
corresponde ao controle negativo livre de contaminação por DNA. MM -
marcador molecular de 100 pb.
MM
100 pb
600 pb
1500 pb
1 2
61
Figura 17 - RT - PCR utilizando-se o par de iniciadores para o gene ctsR (149 pb). O
RNA extraído foi tratado previamente com DNase. A amplificação observada na
coluna 1 indica amplificação a partir do cDNA e a coluna 2 corresponde ao controle
negativo livre de contaminação por DNA. MM - marcador molecular de 100 pb.
MM
1 2
100 pb
600 pb
1500 pb
62
Dessa forma, a quantidade de produto formado na reação de qRT-PCR realizada foi
monitorada através do uso do corante “SYBER Green I”. A expressão dos genes hrcA e
ctsR foi analisada através de quantificações relativas utilizando-se o gene 16S rRNA como
normalizador da reação (controle interno) e a temperatura de 37ºC como calibrador da
mesma, sendo a variação de expressão para cada gene comparada com a expressão
observada na temperatura de calibração (37ºC).
4.6.2 Avaliação da indução dos genes hrcA e ctsR durante o choque térmico
Através das quantificações relativas da expressão dos genes hrcA e ctsR, foi
possível observar que a expressão do gene hrcA aumentou gradativamente conforme
ocorria o aumento da temperatura. A indução observada durante os ensaios nas
temperaturas de 42ºC e 45ºC foi bastante semelhante. Nessas temperaturas, o gene hrcA
teve sua expressão aumentada cerca de 2,5 vezes em relação à temperatura de 37ºC e para a
temperatura de 48ºC esse aumento foi de, aproximadamente, 5 vezes (Figura 18).
O gene ctsR também apresentou uma indução de sua expressão conforme ocorria o
aumento da temperatura, sendo observado para as temperaturas de 42ºC, 45ºC e 48ºC, um
aumento de 2, 3 e 6 vezes, respectivamente, em relação à temperatura de 37ºC.
Portanto, os resultados obtidos mostraram que houve aumento de expressão dos
genes hrcA e ctsR, após a indução das células bacterianas em todas as temperaturas de
estresse testadas. Porém, esses aumentos não apresentaram diferenças significativas
(p>0,05) quando se comparou o aumento da indução de hrcA com ctsR (Figura 18).
63
4.6.3 Termocinética da expressão dos genes hrcA e ctsR durante o choque
térmico
Experimentos de termocinética também foram realizados utilizando RNAs extraídos
após a submissão das células de S. saprophyticus à temperatura de estresse de 48ºC por 10,
20 e 30 min. Esses experimentos mostraram que houve diferença tanto na indução da
expressão do gene hrcA quanto do gene ctsR. O gene hrcA mostrou que sua expressão já
Figura 18 - Indução dos genes hrcA e ctsR sob diferentes temperaturas de choque
térmico, utilizando qRT-PCR. O gene 16S rRNA foi usado como normalizador (controle
interno) e a temperatura de 37°C como calibrador da reação. Na abscissa, estão
representadas as diferentes temperaturas de estresse testadas (42ºC, 45ºC e 48ºC) e, na
ordenada, a variação na expressão do mRNA após a submissão das células as diferentes
temperaturas. O gráfico foi plotado a partir dos valores obtidos de cinco experimentos
independentes.
Temperatura (ºC)
Variação na
expressão do mRNA
64
era induzida a partir de 10 min de choque térmico, sendo a maior indução observada
quando as células foram expostas ao estresse por 20 min. Assim como, observou-se uma
redução da indução do gene hrcA quando as células foram submetidas ao estresse térmico
por 30 min (Figura 19).
Considerando, o gene ctsR, observou-se que ocorria a indução da sua expressão a
partir de 10 min a 48ºC, e conforme o tempo de exposição ao estresse térmico era mantido,
essa expressão aumentava gradativamente. A maior indução do gene ctsR foi observada no
tempo de 30 min de choque térmico (Figura 19).
Figura 19: Termocinética da indução dos genes hrcA e ctsR sob choque térmico de
48ºC utilizando qRT-PCR. O gene 16S rRNA foi usado como normalizador (controle
interno) e a temperatura de 37°C como calibrador da reação. Na abscissa, está
representado a exposição à temperatura de 48ºC com intervalos de 10 min de exposição
e, na ordenada, a variação na expressão do mRNA após a submissão das células ao
estresse térmico. O gráfico foi plotado a partir dos valores obtidos de cinco
experimentos independentes.
Variação na expressão
do mRNA
65
5 Discussão
Staphylococcus saprophyticus é o segundo patógeno mais encontrado em infecções
urinárias comunitárias sendo, principalmente, isolado em mulheres sexualmente ativas com
idade entre 15 e 44 anos (ORDEN-MARTÍNEZ, MARTÍNEZ-RUIZ & MILLÁN-PÉREZ,
2008). Esse uropatógeno faz parte do grupo dos SCN e foi considerado durante muitos
anos como um micro-organismo saprófita e de baixa virulência para os seres humanos.
Atualmente, ele está entre os principais agentes causadores de infecções hospitalares, sendo
considerado um patógeno oportunista importante, uma vez que, apesar de estar em
equilíbrio com a microbiota do hospedeiro, pode se tornar um organismo patogênico
(KLOOS & BANNERMAN, 1994).
Nas últimas décadas, S. saprophyticus foi relatado dentre as espécies de
estafilococos que estavam envolvidas, pelo menos uma vez, em infecções humanas, se
destacando pela sua prevalência em infecções comunitárias (VON EIFF, PETERS &
HEILMANN, 2002; OTTO, 2004; ORDEN-MARTÍNEZ, MARTÍNEZ-RUIZ &
MILLÁN-PÉREZ, 2008).
A estirpe de S. saprophyticus ATCC 15305 teve seu genoma completamente
sequenciado em 2005 e, através de análises genômicas comparativas com linhagens de
outras duas espécies de estafilococos, S. aureus e S. epidermidis, foi mostrado que essa
estirpe apresentava 582 ORFs específicas, sendo algumas delas envolvidas com a expressão
de fatores de virulência (KURODA et al., 2005). Apesar disso, pouco ainda se sabe sobre
os fatores responsáveis pela sua virulência, bem como a sua resposta a diferentes estímulos
de estresse. Desse modo, este trabalho buscou traçar um perfil de resposta ao choque
térmico apresentado pela estirpe S. saprophyticus ATCC 15305, sendo os resultados
apresentados, representantes de uma análise da expressão dos genes hrcA e ctsR que
compõem o sistema de regulação de choque térmico. Esse é um estudo pioneiro e buscou
dentre outras coisas, contribuir para o melhor entendimento do comportamento de resposta
ao choque térmico desse patógeno.
É sabido que bactérias Gram-positivas como Streptococcus, Enterococcus e
Staphylococcus apresentam diferenças significativas na resistência ao calor. As espécies de
Streptococcus são mortas quando submetidas à temperatura de 55ºC por 30 min (KILIAN,
1998), já as de Staphylococcus, observa-se crescimento bacteriano até a temperatura de
66
42ºC (KLOSS, 1998). Dentre os três gêneros apresentados, os Enterococcus formam o
grupo com maior resistência térmica. Desse modo, foi visto que E. faecium exibe um
discreto crescimento a 50ºC (LAPORT et al., 2003) e E. faecalis é capaz de crescer a 52ºC
(RINCE, FLAHAUT & AUFFRAY, 2000). Desse modo, inicialmente buscou-se conhecer
o perfil de crescimento e de sobrevivência da estirpe de S. saprophyticus ATCC 15305 após
a exposição da mesma a temperaturas superiores a 37ºC. Foi observado que as células
bacterianas apresentaram crescimento celular à 37ºC e uma redução do mesmo a 42ºC,
45ºC e a 48ºC durante o período de seis horas de incubação. Esses resultados mostram um
comportamento diferente do observado para E. faecium, uma espécie que já havia sido
estudada em nosso laboratório, que apresentou uma capacidade maior de tolerância ao
estresse térmico e crescimento sob temperaturas superiores a 52ºC (LAPORT et al., 2003).
Além do crescimento, a capacidade dessa estirpe, S. saprophyticus ATCC 15305, de
sobreviver sob temperaturas elevadas foi analisada em temperaturas nas quais nenhum
crescimento pudesse ser detectado. Assim, as células que foram incubadas nessas
condições, apresentaram uma taxa de sobrevivência nas duas primeiras horas a 48º e 50 ºC.
Porém, a partir da segunda hora de tratamento térmico, essas taxas diminuíram, tendo sido
observada pouca ou nenhuma sobrevivência a 52ºC e 55ºC. Esses resultados diferem
daqueles observados por Laport e colaboradores em 2003 para E. faecium que apresentou
ainda uma pequena taxa de sobrevivência a 70ºC por duas horas.
Através da marcação das proteínas com
35
S-Met foi possível verificar a síntese de
proteínas, após o choque térmico nas temperaturas de 42ºC, 45ºC e 48ºC. Assim, algumas
proteínas apresentaram indução conforme ocorria o aumento da temperatura, destacando-se
àquelas com massas moleculares de, aproximadamente, 60 e 70 kDa, que possivelmente
correspondem, à GroEL e DnaK, respectivamente. Elas fazem parte do grupo de
chaperonas moleculares atuantes na resposta ao choque térmico e já haviam sido descritas
em outros trabalhos (LAPORT et al., 2003; HARTL & HAYER-HARTL, 2002). A maior
indução foi observada na temperatura de 45ºC para a possível DnaK, o que está de acordo
com o observado para E. faecium, cujas proteínas termo-induzidas apresentaram uma taxa
de expressão ótima na mesma temperatura (LAPORT et al., 2003). Para a possível GroEL a
maior taxa de indução foi vista na temperatura de 48ºC. Isto está de acordo com o fato de
ser observada uma taxa elevada de sobrevivência bacteriana de S. saprophyticus na
67
temperatura de 48ºC. A autorradiografia produzida mostrou a indução de outra proteína,
com massa molecular de aproximadamente 100 kDa, que também parece ter sido induzida
conforme havia o aumento da temperatura. Essa massa corresponde à proteína ClpB que faz
parte da família das Clp/ATPases de classe I, sendo essa proteína indispensável na
solubilização de grandes agregados protéicos. Embora ClpB não seja requerida sob
condições normais de crescimento, ela pode aumentar a sobrevivência celular quando a
bactéria é exposta ao calor extremo ou a outro estresse rigoroso (& WICKNER, 2008).
Além disso, ClpB, também atua em cooperação com o sistema da chaperona molecular
DnaK, que recupera proteínas inativas e desmonta complexos protéicos, agindo em
conjunto com duas co-chaperonas, DnaJ e GrpE, sob condições de estresse ou em
condições normais (DOYLE & WICKNER, 2009). A interação que ocorre entre o sistema
DnaK e ClpB, já havia sido demonstrada, anteriormente, através de estudos genéticos, que
mostraram haver uma interação molecular complexa dos mecanismos de resposta ao
estresse, tanto transcricionalmente quanto pós-traducionalmente (FLEURY et al., 2009).
Sendo assim, apesar dessa interação ainda não ser completamente compreendida, resultados
recentes fornecem uma direção de como isso ocorre. Foi visto, que o sistema DnaK é
essencial no início do processo de desagregação ajudando, possivelmente, na extração de
polipeptídeos encontrados em agregados e os apresentando para ClpB. Além disso, DnaK
pode modular o ciclo ATPase de ClpB para facilitar o remodelamento de proteínas por
essa Clp/ATPase. E por último, é sabido isto que o sistema DnaK também pode atuar no
final do processo de desagregação, auxiliando na reativação de substratos de proteínas que
não conseguem se remodelar, espontaneamente, após a ação da ClpB (DOYLE &
WICKNER, 2009). Comparando os nossos resultados com de outros cocos Gram-positivos,
observou-se que, em S. aureus, nove proteínas foram induzidas pelo choque térmico,
enquanto que em S. pyogenes apenas as HSPs DnaK e GroEL foram induzidas não tendo
sido observada, neste micro-organismo a indução de nenhuma proteína na faixa de 100 kDa
nas condições utilizadas (LAPORT et al., 2001).
Através de análises por bioinformática foi estudada a homologia das proteínas
DnaK, GroEL e Clp. Essa análise foi realizada através da comparação das sequências
obtidas do genoma de S. saprophyticus ATCC 15305 disponibilizado pelo “Institute for
Genomic Research” (www.tigr.org), utilizando-se a ferramenta BLAST. As sequências de
68
aminoácidos das proteínas DnaK, GroEL, ClpA, ClpB, ClpC e ClpP de S. saprophyticus
apresentavam alta identidade e similaridade com as de S. aureus, S. epidermidis e S.
haemolyticus. Sendo assim, o alto grau de homologia encontrado para as sequências de
aminoácidos das proteínas DnaK, GroEL e Clps de S. saprophyticus com àquelas de outras
espécies do gênero Staphylococcus, pode ser devido ao fato dessas proteínas fazerem parte
de uma sistema de regulação da resposta ao choque térmico altamente conservado e
universal (FREES et al., 2004).
Análises “in silico” adicionais foram feitas, mas desta vez, buscando-se caracterizar
a organização genômica dos operons dnaK, groE e clpC e dos genes clpB e clpP. O operon
groE é formado por uma estrutura bicistrônica, composta pelo gene groES seguido pelo
gene groEL. Em contraste com a organização altamente conservada do operon groE, a
organização do operon dnaK tem sofrido modificações ao longo da evolução (SEGAL &
RON, 1996). Três principais tipos de organização têm sido encontrados para esse operon,
envolvendo modificaçãoes na ordem, adição ou deleção de genes. São elas, hrcA-grpE-
dnaK-dnaJ, observada em B. subtilis, S. aureus, Lactobacillus sakei, Streptococcus mutans,
S. pyogenes E. faecalis e E. faecium (LAPORT et al., 2004; LAPORT et al., 2006); dnaK-
grpE-dnaJ-orfX, observada em Mycobacterium tuberculosis e Streptomyces coelicolor
(SEGAL & RON, 1996); ou dnaK-dnaJ, observada em Agrobacterium tumefaciens,
Brucella ovis, Caulobacter crescentus e E. coli (SEGAL & RON, 1996). Nossas análises
“in silico” mostraram que o operon dnaK de S. saprophyticus consiste de quatro genes com
a seguinte organização hrcA-grpE-dnaK-dnaJ. Esse tipo de organização tem sido descrita
para outras espécies de bactérias Gram-positivas e é considerada a organização básica e
mais comum encontrada para o operon dnaK (SEGAL & RON, 1996). Ela é encontrada,
frequentemente, em diversos organismos, tais como B. subtilis (HOMUTH et al., 1997;
SCHUMANN, 2003), Streptococcus pneumoniae (KIM et al., 2007), Streptococcus mutans
(JAYARAMAN, PENDERS & BURNE, 1997; LEMOS, CHEN & BURNE, 2001;
LEMOS, LUZARDO & BURNE, 2007), S. aureus (OTHA et al., 1994), Lactocacillus
sakei (SCHMIDT, HERTEL & HAMMES, 1999), E. faecalis (LAPORT et al., 2004) e E.
faecium (LAPORT et al., 2006). Em B. subtilis (HOMUTH et al., 1997; SCHUMANN,
2003); S. mutans (JAYARAMAN, PENDERS & BURNE, 1997; LEMOS, CHEN &
BURNE, 2001) e S. aureus (OTHA et al., 1994), genes adicionais têm sido identificados
69
como parte do operon dnaK. Porém, em L. sakei (SCHMIDT, HERTEL & HAMMES,
1999), E. faecalis (LAPORT et al., 2004) e E. faecium (LAPORT et al., 2006) nenhum
gene adicional foi identificado para esse operon, o que corresponde com o observado para
S. saprophyticus. O operon groE de S. saprophyticus apresentou a estutura bicistrônica
bastante conservada (groES-groEL), já observada em diferentes cocos Gram-positivos
como por exemplo, S. mutans (LEMOS, CHEN & BURNE, 2001), E. faecalis e E. faecium
(LAPORT et al., 2006) e Clostridium acetobutylicum (NARBERHAUS & BAHL, 1992). O
operon clpC de S. saprophyticus mostrou uma estrutura formada por quatro genes (ctsR-
orf-orf-clpC), que foi semelhante à observada para B. subtillis (DERRÉ, RAPOPORT &
MSADEK, 1999; SCHUMANN, 2003). Em B. subtillis observou-se que no lugar das duas
ORFs vistas em S. saprophyticus, encontraram-se os genes mcsA e mscB, respectivamente.
Esses genes funcionam como moduladores da repressão de CtsR, estando envolvidos na
regulação da atividade desse repressor (SCHUMANN, 2003). Em S. mutans, a estrutura
deste operon apresenta-se diferente da observada em S. saprophyticus, uma vez que ela é
formada pelo gene tsf (codificador de um fator de enlogação), à montante dos genes ctsR,
clpC e ftf (codificador de um precurssor da levansucrase, enzima pertencente a família das
glicosiltransferases) (LEMOS & BURNE, 2002).
Além da organização estrutural, foi observada ainda nas regiões promotoras dos
operons dnaK e groE, a presença de uma sequência altamente conservada conhecida como
CIRCE. Essa sequência é uma repetição invertida, formada por nove pares de bases
separadas por outros nove pares de bases (TTAGCACTC-N
9
-GAGTGCTAA)
(SCHUMANN, 2003) e funciona como um sítio operador onde se liga o repressor HrcA.
Esse repressor é produto da expressão do primeiro gene do operon dnaK e controla
negativamente a expressão tanto do operon dnaK quanto do operon groE (MOGK et al.,
1997; LEMOS, LUZARDO & BURNE, 2007). Baseando-se nesta organização altamente
conservada do elemento CIRCE e em dados já publicados sobre sua função (SEGAL &
RON, 1996), pode-se sugerir que os elementos CIRCE identificados nos operons dnaK e
groE de S. saprophyticus também representam elementos reguladores neste micro-
organismo. Embora o sistema HrcA/CIRCE seja amplamente difundido entre as bactérias
Gram-positivas (AHMAD, SELVAPANDIYAN & BHATNAGAR, 1999), outras proteínas
repressoras podem estar presentes regulando os operons dnaK e groE (NARBERHAUS,
70
1999). Sendo assim, em muitos casos esses operons também estão sob o controle negativo
do repressor CtsR, que foi inicialmente identificado pelo seu papel na regulação da
expressão dos genes clp (LEMOS, LUZARDO & BURNE, 2007). Esse repressor se liga numa
sequência altamente conservada de sete pares de bases repetida diretamente, chamada de
“CtsR box” (GGTCAAA/XAX/GGTCAAA) (DERRÉ, RAPOPORT & MSADEK, 1999).
Esta sequência foi observada na região promotora do operon dnaK de S. saprophyticus, mas
não no operon groE dessa bactéria. A sequência “CtsR box” já havia sido vista
anteriormente co-existindo com a sequência CIRCE no operon dnaK em S. aureus
(CHASTANET, FERT & MSADEK, 2003), S. salivarius e S. thermophilus (FREES et al.,
2007) e no operon groE em S. aureus e em S. mutans (CHASTANET, FERT & MSADEK,
2003; LEMOS, LUZARDO & BURNE, 2007). O arranjo em “tandem” dos operadores CtsR e
HrcA sugere um novo modelo de dupla regulação da resposta ao choque térmico realizada
por estes dois repressores (CHASTANET, FERT & MSADEK, 2003). O operon clpC,
assim como os genes clpB e clpP também apresentaram em suas respectivas regiões
promotoras a sequência “CtsR box”. No caso do operon clpC, essa sequência foi vista
representada duplamente, sendo uma delas localizada entre as regiões -35 e -10 e a outra à
jusante da região -10, já para o gene clpB a mesma foi encontrada à jusante da região -10 e
para o gene clpP, uma das repetições foi vista sobreposta a região -35 e outra à montante da
região -10. Sendo assim, é possível que a resposta ao choque térmico dos genes clp
estudados para S. saprophyticus, seja regulada também pelo repressor CtsR, assim como,
observado para B. subtillis (SCHUMANN, 2003), Listeria monocytogenes, S. pneumoniae,
L. lactis e C. acetobutylicum (SERVANT & MAZODIER, 2001).
A expressão dos genes hrcA e ctsR foi analisada utilizando-se a técnica de qRT-
PCR. Essa é uma técnica que possui a vantagem de determinar o número de cópias de uma
molécula molde com alta precisão e sensibilidade em um tempo de experimento reduzido,
uma vez que, a etapa de eletroforese não é necessária. O produto formado nesse tipo de
reação é monitorado através do uso de corantes ou sondas fluorescentes e existe uma
variedade muito grande de substâncias químicas fluorescentes disponíveis (CIKOS &
KOPPEL, 2009). A fluorescência emitida pelas moléculas analisadas nesse trabalho se deu
através do uso do corante “SYBER Green I”.
71
A análise da expressão de genes é a aplicação mais comum da técnica de qRT-PCR
e a mesma já foi utilizada em estudos envolvendo S. epidermidis (VANDECASTEELE et
al., 2001) e S. aureus (ELEAUME & JABBOURI, 2004; CHINI et al., 2007). Essa análise
pode ser feita através de quantificações absolutas, cujo objetivo é descobrir uma
propriedade intrínseca de uma determinada amostra, e a outra é através de quantificações
relativas, cujo objetivo é determinar a proporção relativa de um ácido nucleico alvo em
uma quantidade equivalente de amostra (ELEAUME & JABBOURI, 2004). As
quantificações relativas são mais frequentemente utilizadas para estudos de expressão de
genes e nesse tipo de análise é necessário um gene de referência como normalizador da
reação, chamado de controle interno. A escolha desse gene não é algo trivial e é um fato
importante a ser levado em consideração. Em muitos casos o uso de múltiplos genes pode
ser necessário para uma quantificação exata (VANDESOMPELE et al., 2002).
O estudo envolvendo a resposta ao choque térmico utilizando a técnica de qRT-
PCR para S. saprophyticus é algo pioneiro, já que até o presente momento, não há na
literatura registros desse tipo de análise para essa espécie. Desse modo, um dos objetivos
dessa dissertação foi realizar análises quantitativas através da técnica de qRT-PCR para
estudar a expressão dos genes hrcA e ctsR, que compõem o sistema de regulação de choque
térmico, HrcA e CtsR.
Inicialmente, para que as análises quantitativas da expressão dos genes hrcA e ctsR
fossem realizadas, foi preciso escolher um gene de referência para ser utilizado como
normalizador nas reações, ou seja, como controle interno. Esse gene deveria apresentar
determinadas características como: possuir expressão constitutiva e não sofrer variações na
sua expressão, quando submetido às condições testadas como, por exemplo, o choque
térmico. Assim, foram testados dois genes que fazem parte do metabolismo constitutivo de
S. saprophyticus. Foram eles, o gene tpi que codifica uma enzima do metabolismo da
glicose, a triosefosfato isomerase, e o gene gmk que codifica uma enzima do metabolismo
de ácidos nucléicos, a guanilato quinase. Os resultados obtidos para esses dois genes
mostraram que os mesmos não eram eficientes como genes de referência para serem
utilizados como normalizadores da reação de qRT-PCR, o que já havia sido observado para
S. epidermidis (VANDECASTEELE et al., 2001) e S. aureus (ELEAUME & JABBOURI,
2004; CHINI et al., 2007). A ineficiência desses dois genes ocorreu, devido ao fato de que
72
os mesmos não apresentaram amplificações detectávies nas reações de qRT-PCR. Desse
modo, não foi possível utilizá-los como controles internos, sendo testado para tanto, o gene
16S rRNA. As amplificações desse gene foram detectáveis durante a reação de qRT-PCR, e
o mesmo já havia sido descrito em trabalhos anteriores como sendo ideal para estudos de
expressão de genes (GREISEN et al., 1994; VANDECASTEELE et al., 2001; VAUDAUX
et al., 2002).
O gene hrcA faz parte do operon dnak e codifica o repressor do mesmo, a proteína
HrcA. A indução da expressão desse gene ocorre quando o choque térmico faz com que o
repressor HrcA perca sua conformação correta e se desligue do sítio operador do operon
dnak, conhecido como CIRCE. Isso faz com que ocorra um aumento na transcrição dos
genes desse operon, inclusive do gene hrcA, e das proteínas chaperonas originadas a partir
dos genes ali contidos que passam, então, a ser sintetizadas em altos níveis (HARTL &
HAYER-HARTL, 2002). Assim, utilizando o gene 16S rRNA como normalizador (controle
interno) e a temperatura de 37ºC como calibrador das reações, foi possível observar que em
S. saprophyticus, o gene hrcA mostrou uma indução gradativa da sua expressão conforme
ocorria o aumento da temperatura. A indução do gene hrcA, após o choque térmico, já
havia sido observada em B. subtillis (SCHUMANN, 2003) e, em S. saprophyticus, foi visto
para as temperaturas de 42ºC e 45ºC, um perfil de indução bastante semelhante. Na
temperatura de 48ºC, ocorreu a maior indução da expressão desse gene.
Além do gene hrcA, também foi estudada a expressão do gene ctsR, após a submissão
das células bacterianas ao choque térmico, utilizando o mesmo controle interno e a mesma
temperatura de calibração. As análises quantitativas da expressão desse gene mostraram,
assim como observado para hrcA, que a indução de sua expressão aumentava conforme
ocorria o aumento da temperatura, sendo o maior aumento observado para a temperatura de
48ºC. Isso está de acordo com o que já havia sido descrito na literatura, uma vez que, esse
gene dá origem ao repressor CtsR, regulador da expressão das proteínas Clp/ATPases, que
podem ser induzidas por altas temperaturas, estresse oxidativo, altas concentrações de sal
ou etanol e limitação de ferro disponível (KRÜGER, VOLKER & HECKER, 1994;
ROUQUETTE et al., 1996; SCHIRMER et al., 1996). Portanto, os resultados obtidos
mostraram que em todas as temperaturas de estresse testadas, a expressão dos genes hrcA e
73
ctsR foi induzida após o estresse térmico, o que é importante para a sobrevivência
bacteriana.
Além dos experimentos de análise da expressão dos genes hrcA e ctsR, foram feitos
experimentos de termocinética para avaliar a diferença desta expressão, quando submetidos
ao estresse térmico por tempos superiores a 10 min. O gene hrcA mostrou ter sua
expressão induzida quando exposto a 48ºC a partir de 10 min, observando seu ponto ótimo
de indução quando as células foram expostas ao estresse térmico por 20 min, havendo uma
redução da mesma quando o tempo de exposição chegou a 30 min. Já o gene ctsR, mostrou
que a indução da sua expressão foi maior conforme aumentava o tempo de exposição ao
estresse térmico. No tempo de 30 min, foi vista a maior indução da expressão desse gene.
Esta diferença de expressão dos dois sistemas de regulação que operam no choque térmico
de S. saprophyticus poderia ser explicada, pelo fato de que o gene hrcA faz parte do sistema
de regulação de chaperonas que atuam, inicialmente, prevenindo a formação de agregados
protéicos de proteínas recém-sintetizadas (HARTL & HAYER-HARTL, 2002). Já o gene ctsR
faz parte do sistema de regulação das Clp/ATPases que atuam não só como chaperonas,
mas também desempenham o papel de proteases. Desse modo, a atuação desse sistema
ocorre posteriormente à ação das chaperonas, agindo no processo de degradação de
proteínas, tendo um papel fundamental na fisiologia das células de um organismo,
regulando a disponibilidade de algumas proteínas reguladoras de vida curta ou prevenindo
o acúmulo de proteínas anormais (KRÜGER et al., 2001).
Uma vez que, não há até o presente momento na literatura, registros de estudos
envolvendo a resposta ao choque térmico, utilizando a técnica de PCR em tempo real, para
S. saprophyticus, acreditamos que os resultados apresentados nesta dissertação,
contribuirão para um esclarecimento da expressão dos genes de choque térmico regulados
pelos sistemas HrcA e CtsR em S. saprophyticus.
74
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