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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP
CAMPUS DE JABOTICABAL
MANANOLIGOSSACARÍDEO E Β-GLUCANO NA
SUPLEMENTAÇÃO DIETÁRIA PARA JUVENIS DE
TILÁPIA-DO-NILO MANTIDOS EM TANQUES-REDE
Andressa Daniela Liranço de Sousa
Bióloga
JABOTICABAL
Estado de São Paulo
2010
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP
CAMPUS DE JABOTICABAL
MANANOLIGOSSACARÍDEO E Β-GLUCANO NA SUPLEMENTAÇÃO DIETÁRIA
PARA JUVENIS DE TILÁPIA-DO-NILO MANTIDOS EM TANQUES-REDE
Autora: Andressa Daniela Liranço de Sousa
Orientadora: Prof
a
Dra. Elizabeth Romagosa
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Aquicultura da UNESP, como parte das exigências
para a obtenção do título de DOUTORA EM
AQUICULTURA.
JABOTICABAL
Estado de São Paulo
2010
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Sousa, Andressa Daniela Liranço
F72m
Mananoligossacarídeo e β-glucano na suplementação dietária
para juvenis de tilápia-do-nilo mantidos em tanques-rede/ Andressa
Daniela Liranço de Sousa. – – Jaboticabal, 2010
xiii, 52 f. : il. ; 28 cm
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista – Centro de
Aquicultura, 2010
Orientador: Elizabeth Romagosa
Banca examinadora: Paulo Cesar Ciarlini, Fabiana Pilarski,
Leonardo Tachibana, Irene Bastos Franceschini Vicentini.
Bibliografia
1. Desempenho zootécnico. 2. Hematologia. 3.Oreochromis
niloticus. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aquicultura.
CDU 639.043
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
“Agrada-te do Senhor
e Ele satisfará aos teus desejos do teu coração.
Entrega o teu caminho ao Senhor,
confia nele, e o mais Ele fará.
Descansa no Senhor e espera nele...”
Salmo 37. 4, 5, 7
Minha gratidão sincera a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram
para a realização desta tese, participando de todos os momentos bons e difíceis
.
Agradeço,
pela orientação, confiança, estímulo, críticas, auxílio, paciência e grande amizade
demonstrada durante a realização deste trabalho,
à Dra. Elizabeth Romagosa
pela oportunidade de melhorar meus conhecimentos que me foi dada,
ao Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura/CAUNESP
pela bolsa a mim concedida,
à Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior-CAPES
pela solicitude e atenção sempre presentes,
à Sra Veralice Cappatto
e funcionários do CAUNESP
pelo auxílio prestado às análises estatísticas,
à Prof. Dra. Silvia Helena Venturolli Perri – UNESP – Araçatuba
pelo solicitude e cooperação que possibilitaram a execução do nosso projeto,
ao Prof. Dr. Paulo Cesar Cialrini – UNESP – Araçatuba
à Laine Margareth Gabas
pela tão importante ajuda na análise laboratorial e atenção recebidas,
ao Prof. Dr. Gilberto Moraes
ao Prof. Mc. Rodrigo Yamacami Camilo
à Profa. Dra.Claucia Aparecida Honorato
pela cessão das dependências, peixes concedidos, colaboração e amizade,
à Empresa Escama Forte Ltda. ME
pela ração gentilmente concedida e preparada,
a Rações FRI-RIBE S.A
pela solicitude no fornecimento do suplemento prebiótico usado no nosso experimento,
à BIORIGIN
®
pela sugestões e críticas no Exame Geral de Qualificação
à Prof. Dr. Leonardo Tachibana – Pesca APTA – São Paulo
à Prof. Dr. Giovani Sampaio Gonçalves – Pesca – S. J. Rio Preto
pela felicidade de tua presença, companhia e amor,
ao meu irmão Lucas
pelo amor, confiança, apoio e estímulo sempre presentes nos momentos difíceis, elevando
minha autoconfiança e certeza da capacidade de realização,
aos meus pais Hercília e Daniel
SUMÁRIO
Páginas
INTRODUÇÃO 01
REVISÃO DA LITERATURA 02
1. TILÁPIA-DO-NILO 02
2. TANQUE-REDE 03
3. PREBIÓTICO 03
4. MANANOLIGOSSACARÉDEIO 04
5. β - GLUCANO 05
6. FISIOLOGIA E ESTRUTURA GERAL DO SIST. DIGESTÓRIO 06
7. HEMATOLOGIA 07
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICA 08
OBJETIVO GERAL 14
RESUMO 15
ABSTRACT 16
INTRODUÇÃO 17
MATERIAL E METODOS 18
RESULTADOS E DISCUSSÃO 21
CONCLUSÃO 26
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 27
ANEXO 39
LISTA DE FIGURAS
TABELA 01 - Composição percentual e química das rações experimentais
durante a realização do experimento.
TABELA 02 - Médias (
x
) respectivos desvios padrão (s) dos parâmetros: peso e
comprimento final, fator de condição (K), consumo de ração, ganho de peso
diário (GPD), conversão alimentar aparente (CAA) e sobrevivência, segundo as
rações e período coletado.
TABELA 03 - Média (
x
) e desvio padrão (s) dos parâmetros hematológicos: Ht
(hematócrito), Hb (hemoglobina total), PPT (proteína total), eritrócito, CHCM
(concentração de hemoglobina corpuscular média), VCM (volume corpuscular
médio) segundo as rações e períodos de coleta.
TABELA 4 - Média (
x
), desvio padrão (s) e mediana (Md) dos parâmetros da
contagem diferencial: neutrófilo, monócito e linfócito em %,segundo as rações e
períodos de coleta.
TABELA 05 - Média (
x
) e desvio padrão (s) da altura vilosidades, altura da
paredes, espessura do epitélio, segundo as rações e períodos de coleta.
FIGURA 01 - Parâmetros físicos químicos da água durante os 90 dias de
experimento.
FIGURA 02 - Vilosidades do intestino de tilápia-do-nilo alimentadas com dietas
suplementadas com prebióticos.
FIGURA 03 - Atividade inespecífica das enzimas digestivas no trato
gastrointestinal (A = proteolítica; B= amilase; C = lipase) de tilápia-do-nilo
alimentadas com dietas contendo prebióticos durante os 90 dias.
RESUMO
Este experimento foi conduzido em um empreendimento aquícola, tendo como objetivo a
utilização de mananoligossacarídeo (MOS) e ß-glucano, na suplementação dietária do lote
experimental, com o intuito de acompanhar o desempenho zootécnico e relacioná-lo aos parâmetros
hematológicos, alterações morfológicas do intestino e atividade enzimática (protease, lípase e
amilase) de 3000 juvenis de tilápias-do-nilo, mantidos em tanques-rede, com peso médio inicial de
24g ± 0,26. Utilizaram-se nove tanques-rede (6,0 m
3
) constituindo-se de três tratamentos e três
repetições: Tratamento 1: ração comercial sem suplementação (controle); Tratamento 2: 0,1% por
tonelada de MOS; Tratamento 3: 0,03% por tonelada de beta glucano purificados. A ração continha
36 % de proteína bruta (PB), incorporados no premix MOS e β-glucano purificado (BIORIGIN
®
).
Os exemplares foram alimentados três vezes ao dia de acordo com a sua biomassa, e, mensalmente,
os ajustes foram determinados de acordo com as biometrias. Os parâmetros analisados, físicos e
químicos da água (temperatura, °C, oxigênio dissolvido, mg L
-1
, pH e condutividade elétrica, us cm
-
1
); zootécnicos (peso inicial e final - Pti e Ptf, comprimento total inicial e final - Cti e Ctf, relação Pi
x Ct,, fator de condição - K, conversão alimentar aparente -CAA, ganho de peso diário - GPD, taxa
de crescimento específico - TCE, taxa de eficiência protéica - TEP e sobrevivência – S);
hematológicos (hematócrito, hemoglobina, proteína total, contagem diferencial de leucócitos -
CDL, contagem de eritrócitos - Er, contagem total de leucócitos - CTL, contagem total de
trombócitos - CTT, volume corpuscular médio e concentração -VCM e hemoglobina corpuscular
média – CHCM); morfologia da parte anterior do intestino (altura, altura da parede e espessura do
epitélio das vilosidades) e atividade enzimática (protease, lípase e amilase). Observou-se que os
peixes que receberam a dieta suplementada com β-glucano, usado na proporção de 0,03% por
tonelada de ração e no período de 90 dias, apresentaram condição favorável do sistema imune,
ampliação na superfície de absorção da região anterior intestinal e, consequentemente, um aumento
na atividade das enzimas digestivas indicando maior eficiência na utilização dos nutrientes dos
juvenis de tilápia-do-nilo, proporcionando desempenho zootécnico satisfatório em relação às outras
dietas (MOS e controle). Este produto pode ser usado como suplemento alimentar para a espécie
quando mantidas em tanques-rede.
1
INTRODUÇÃO
No Brasil, durante as últimas décadas, a piscicultura tem sofrido constantes transformações,
consolidando-se na principal atividade do agronegócio brasileiro, vindo até a substituir em parte, o peixe
proveniente da pesca extrativa (FIRETT et al., 2007). No contexto internacional, nosso país se insere
com grande potencial para a piscicultura, pois além do seu território fluvial, conta com o favorecimento
de suas condições climáticas para a criação de peixes de água doce (PAVANELLI et al., 2002).
Em 2005, o Brasil ocupava o 18º lugar no ranking mundial de produção aquícola
(51.653.329,00 t), com 0,5% da produção mundial (269.697,50 t); era o 12º em termos de receitas
geradas, com 1,4% do total, destacando-se como o segundo lugar em importância na produção
aquícola da América do Sul, logo após o Chile. A produção da aquicultura continental foi de
179.746,0 toneladas, o que representa 17,8 % do total da produção de pescado nacional
(1.009.073,0 t) (IBAMA, 2007).
As regiões sul e sudeste representam as de maior produtividade piscículas e, dentre as espécies
cultivadas, destaca-se a tilápia, Oreochromis spp., pertencente à família Cichlidae, segundo grupo
de peixes mais produzido mundialmente que, apesar das imprecisões estatísticas, estima-se que seja
o gênero mais produzido no Brasil (ZIMMERMANN e FITZSIMMONS, 2004).
Nativa da África, Israel e Jordânia, a tilápia foi introduzida no Brasil, em 1971, mais
precisamente na região Nordeste, através do Departamento Nacional de Obras Contra as Secas –
DNOCS (FREITAS e GURGEL, 1984). É uma das espécies mais indicadas para a criação intensiva
devido a sua alta e rápida taxa de crescimento, flexibilidade às mudanças ambientais, fácil
reprodução e rusticidade, entre outras (EL-SAYED, 2006). É conhecida também e considerada
como um peixes magro pois apresenta 1,0 a 2,0g de gordura, o que favorece seu processamento, tal
como, salga, secagem e congelamento, além de possuir carne branca de textura firme e ausência de
espinhos em “Y” (HUET, 1973).
A intensificação da produção é a melhor maneira para aumentar a eficiência produtiva,
entretanto isso acarreta maior susceptibilidade às doenças em consequência da deterioração da
qualidade da água e do aumento das condições de estresse (GATLIN III et al., 2006). Além disso, o
alto custo da ração de peixes vem sofrendo um questionamento considerável, optando-se pela
diminuição dos excessos de nutrientes nas formulações das dietas. Assim, buscam-se alternativas
para uma dieta equilibrada, com alto valor nutricional, que supram as necessidades desses animais,
sem que sejam muito onerosas. Dentre essas, os suplementos alimentares (probiótico, prebiótico e
imunoestimulante) poderão, futuramente, incluírem-se na alimentação para, consequentemente,
auxiliarem na estimulação dos mecanismos de defesa na redução de enfermidades. Espera-se dessa
2
forma, alcançar um desempenho zootécnico satisfatório com melhores condições de saúde, higidez
e redução da carga de bactérias indesejáveis do trato intestinal dos peixes, aumentando-se a taxa de
sobrevivência.
O mananoligossacarídeo (MOS) é um prebiótico extraído de células de levedura, facilmente
adicionado à dieta dos peixes (SILVA e NÖRNBERG, 2003). Deve-se enfatizar outro aditivo, o
beta glucano, que são macromoléculas formadas por blocos de glicose, encontrado em células de
levedura e fungos. Tem ação capaz de melhorar a resposta imune inata ou não específica, por
interagir diretamente com os macrófagos. Segundo OLIVEIRA et al., (2007), os prebióticos são
promissores suplementos alimentares de fácil comercialização. Ambos aditivos têm como função
aumentar a resistência do hospedeiro, além de modular os mecanismos de defesa específicos e não
específicos contra-patógenos oportunistas (GALINDO-VILLEGA e HOSOKAWA, 2004), visando
a maximizar a eficiência produtiva, com a melhora dos custos e da rentabilidade (GATLIN III et al.,
2006).
REVISÃO DE LITERATURA
1. Tilápia-do-nilo
As características da espécie tilápia nilótica incluem-na como um dos peixes de maior
potencial para a piscicultura mundial (FITZSIMMONS, 2000: SHELTON, 2002).
Por ser uma espécie rústica e onívora, alimenta-se de espécimes de baixo nível trófico, cresce
com rações de baixo custo, quando criada em sistemas extensivos. Graças aos avanços
significativos do manejo em sistema intensivo (tanques-rede), conjugado à obtenção de uma
variedade de híbridos e linhagens comerciais de grande aceitação, as tilápias podem ser alimentadas
com dietas práticas a custos reduzidos e com elevado valor nutritivo (WATANABE et al., 2002;
NOGUEIRA, 2003; PEZZATO et al., 2004)
Atualmente, a criação de tilápias em tanques-rede corresponde a menos de 10% da produção
aquícola total na América Latina e Caribe, porém tem estimado seu crescimento em 30%, até 2010
(FITZSIMMONS, 2000; WATANABE et al., 2002).
Em meados da década de 90, a quantidade anual de pescado mundial foi de 13 e 16 kg/per
capita (FAO, 2007), e, em 2004, atingiu 45,5 milhões de toneladas, excluindo-se as plantas
aquáticas (FAO, 2008).
O Brasil ocupa o sexto lugar entre os maiores produtores de tilápia, e é responsável por 3,3%
do total da produção (FAO, 2008). As regiões Sul e Sudeste produzem de 20 a 25 mil toneladas por
ano (LOVSHIN, 2000), com potencial de 46,2% e 15,1%, respectivamenete (BORGHETTI e
3
OSTRENSKY, 1998). Entretanto, o Nordeste mostra incremento na produção e atinge 115%,
ultrapassando as demais regiões. Parte significativa dessa produção de tilápia é destinada aos
pesque-pague (NOGUEIRA e RODRIGUES, 2007) ou frigoríficos, com a finalidade de produzir
filés ou peixes inteiros eviscerados (SEBRAE, 2008).
2. Tanque-rede
O sistema intensivo (tanque-rede) é uma excelente alternativa para o aproveitamento de
corpos d’água inexplorados pela piscicultura convencional (COLT e MONTGOMERY, 1991) e de
ambientes aquáticos existentes, dispensando o desmatamento de grandes áreas, o que se evita
problemas de erosão e assoreamento (CARDOSO et al., 2005). O sistema de criação em tanques-
rede tem crescido rapidamente nos últimos 20 anos. Atualmente, está em rápida evolução, como
resposta às pressões da globalização e da crescente demanda por produtos aquáticos (TACON e
HALWART, 2007). Também contribui para tal crescimento o fácil manejo e rápido retorno do
investimento (CHRISTENSEN, 1989). A produção em sistemas intensivos envolve um aporte
tecnológico, maior número de peixes adensados, elevada taxa de renovação de água, promovendo a
remoção dos metabólitos e dejetos produzidos pelos peixes (HALWART et al., 2007).
Dentre as vantagens da criação de tilápias em tanques-rede destacam-se, o baixo custo de
implantação desse sistema (60 a 70%) e o retorno do capital investido (BOZANO et al, 1999;
AYROZA, 2009), a facilidade na obtenção dos índices zootécnicos e, no caso das tilápias, pode
eliminar também problemas associados à recrutagem de desovas não desejáveis (CAMARGO,
2007). Como desvantagens destacam-se: a dependência de dietas nutricionalmente completas; altas
densidades de estocagem causando o estresse dos peixes; fuga dos peixes sem possibilidade de
recuperação e o uso de águas públicas – conflitos e legislação (CAMARGO, 2007; AYROZA,
2009). Segundo ONO e KUBITZA (2003), os peixes confinados apresentam acesso restrito ao
alimento natural disponível no ambiente, sendo necessário o fornecimento de ração balanceada,
suprindo exigências nutricionais.
3. Prebióticos
Na indústria de rações, nos últimos 50 anos, os antibióticos têm sido usados na produção
animal, em diferentes espécies de interesse zootécnico, tanto para tratamento de infecções
bacterianas do trato gastrintestinal, como no papel de agentes promotores do crescimento. A
utilização de antibióticos com o objetivo de melhorar o ganho de peso e a conversão alimentar
4
ocorreu inicialmente de forma discreta, evoluindo posteriormente para o uso amplo e generalizado
na indústria de alimentação animal (FLEMMING, 2005).
É fato notório e crescente a restrição, em todo o mundo, ao uso de antibióticos em doses sub -
terapêuticas como aditivos da nutrição animal devido à possibilidade do desenvolvimento de
resistência bacteriana (FURLAN et al., 2004).
Neste contexto, ingredientes de origem microbiana como prebióticos merecem especial
atenção. Como uma das alternativas, utilizou-se da levedura do gênero Saccharomyces cerevisae,
organismos unicelulares, abundantemente encontrados na natureza em frutas cítricas, cereais e
vegetais. Representa uma espécie de valor econômico, pois algumas cepas são utilizadas em muitos
processos industriais na elaboração de produtos fermentados. As leveduras sofrem modificações
genéticas e seleções, ao longo do tempo, a fim de se adaptarem a processos específicos com maior
grau e viabilidade técnica e econômica (BROCK, 1994). Segundo GIBSON e ROBERFROID
(1995) e BLONDEAU (2001), as leveduras são capazes de atuar positivamente no sistema
imunológico e na absorção de nutrientes no intestino anterior, seja como um substrato seletivo para
um determinado grupo de bactérias comensais benéficas. A parede celular da levedura,
Saccharomyces cerevisae, possui 80 a 85% de polissacarídeos, principalmente mannanos e
glucanos (STRATFORD, 1994). Espera-se que o uso desse aditivo reflita de forma desejável no
desempenho zootécnico, quadro sanguineo, bem-estar do peixe e da qualidade da água.
Mananoligossacarídeo (Mos)
Um dos oligossacarídeos mais pesquisado com ação prebiótica é o mananoligossacarídeo
(MOS), derivado da parede celular de leveduras Saccharomyces cerevisiae. Segundo SPRING et
al., (2000), para se obtê-lo a parede celular é separada do conteúdo intracelular e o líquido contendo
MOS é evaporado à baixa temperatura (spray dry) para evitar a destruição da parte funcional da
molécula. O mananoligossacarideo age como protetor do mecanismo de defesa dos vertebrados em
geral. Estudos demonstram que a mannose, quando adicionada à dieta, reduz a colonização de
bactérias patogênicas no organismo do animal (LIMA, 2008).
Estudos de metilação indicam que a manose é ligada por ligação alfa 1-6,1-2 e 1-3, e
representada principalmente por mananoligossacarídeos (BALLOU, 1977). Estes apresentam uma
alta afinidade ligante, oferecendo um sítio de ligação competitiva para bactérias patogênicas Gram
negativas, que apresentam a fímbria tipo I específica, elementos de aderência bacteriana. Essas
bactérias ao se ligarem aos MOS não atuam sobre os sítios de ligação dos enterócitos, movendo-se
5
com o bolo fecal e não colonizando o trato intestinal com microorganismos patógenos (OYOFO et
al., 1989; NEWMANN, 1994).
Em ensaios com juvenis de Cyprinus carpio, CULJAK et al., (2004) descreveram que a adição de
0,6% de mananoligossacarídeo na dieta durante 46 dias resultou em acréscimo no crescimento, maior
absorção de proteínas e aumento na taxa de sobrevivência, quando comparadas ao grupo controle.
SALZE et al., (2008) observaram que larvas de bijupirá, Rachycentron canadum, alimentadas
com dietas suplementadas com 0,2% de MOS apresentaram vilos intestinais mais desenvolvidos
(2,04 μm) quando comparados às que não receberam ração suplementada (1,18 μm).
Os estudos sobre mananoligossacarídeos em dietas para peixes ainda são recentes e seus
efeitos sobre o sistema imune devem ser levados em consideração, principalmente com relação a
forma de administração, dosagem e regime alimentar para cada espécie (SAKAI, 1999).
Beta Glucano (β – glucano)
Há anos vem se constatando que substâncias biológicas podem influenciar os mecanismos de
defesa não específicos em diferentes espécies animais, sendo agrupadas sob a denominação de
imunoestimulantes e produzidas por fontes naturais ou sintéticas. Dessa maneira, conceitua-se
imunoestimulante como uma substância capaz de aumentar a atividade do sistema imune do peixe
por meio da interação direta entre as células do sistema (FALCON, 2007). As principais respostas
dessa interação resultam em aumento da atividade dos macrófagos, fagocitose por neutrófilos e
monócitos, maior produção de linfócitos, imonoglobulinas e lisozimas (RAA, 1996; SAKAI, 1999).
O interesse das indústrias aquícolas por imunoestimulantes cresce principalmente devido ao
estresse constante ao qual os peixes são submetidos em sistema intensivo. Assim, seu uso é uma
alternativa que pode reduzir danos e também atuar como medida profilática (VOLPATTI et al., 1998).
Na promoção de respostas imunes efetivas contra agentes infecciosos oportunistas, tem sido
demonstrado o efeito dos glucanos, substâncias retiradas de células de leveduras ou fungos ou a
partir da parede celular de microorganismos, contendo moléculas de 1,3 e 1,6 B-glucano
(ROBERTSEN et al,. 1994; SAKAI, 1999; GANNAM e SCHROCK, 2001). O imunoestimulante
reduz o nível da glicose, na corrente sanguínea, quando ingerido parcialmente hidrolisado ou
microparticulado, promovendo maior facilidade de absorção pelo organismo, com efeitos mais
apreciados (PARKS et al., 2003).
O beta glucano é encontrado nos cereais, com concentrações maiores em aveia e cevada, com
valores na faixa de 2,0 a 6,0% (GENC et al., 2001) . A parede celular da levedura é constituída por
6
cerca de 40% de B-glucano, 40% de α-manano, 8,0% de proteína, 7,0% de lipídeos, 3,0% de
substâncias inorgânicas, 2,0% de quitina e hexosaminas (HOUGH, 1990).
Em tilápia-do-nilo, Oreochromis niloticus, CAIN et al., (2003) relataram que a administração
de glucano, na dieta por seis semanas, elevou a percentagem de monócitos circulantes (3,9 para
5,5%), entretanto, na terceira semana de administração do suplemento, verificou-se a redução na
concentração de cortisol, o que indica que a suplementação com este prebiótico na dieta pode servir
como um redutor de estresse.
5. Fisiologia e Estrutura Geral do Sistema Digestório
O conhecimento adequado da biologia de uma espécie de peixe é de suma importância para sua
criação. Para tal, há necessidade de se estudar a fisiologia do trato digestório da espécie e suas
interações, estabelecendo-se condições propícias para o seu cultivo o que é possível pela elaboração de
dietas que atendam as exigências das mesmas (BALDISSEROTTO, 2002). Entretanto, os peixes
apresentam hábitos alimentares diferenciados que conduzem à exploração de uma grande diversidade de
itens alimentares disponíveis, naturais ou industrializados (ROTTA, 2003).
Em geral, a tilápia tem um esôfago muito curto, apenas um canal de ligação com o estômago,
separado do intestino longo e espiralado por um esfíncter (GARGIULO et al., 1996). De acordo
com CACECI et al., (1998), o estômago da tilápia é composto pelas regiões proximal, média e
terminal, com quatro camadas: a serosa, a muscular, a mucosa e a submucosa. Segundo
BALDISSEROTTO, (2002), o estômago da maioria dos peixes secreta enzimas proteolíticas,
auxiliando na digestão que ocorre na região anterior do intestino ou nos cecos pilóricos.
O intestino da tilápia é longo e espiralado, tipicamente de herbívoro, cuja dimensão em
indivíduos adultos, corresponde de 7 a 13 vezes o tamanho total do corpo, tendo a função completar
a digestão iniciada no estômago. Na porção anterior do intestino ocorre a absorção de nutrientes em
suas formas menores, enquanto a segunda é responsável pela entrada de macromoléculas por
pinocitose (ROTTA, 2003). Ao longo do intestino, pode-se observar os vilos, evaginações da
mucosa (epitélio e lâmina própria) que se projetam na luz do intestino, aumentando a área de
superfície na digestão e absorção intestinal (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004), constituídos pelas
células caliciformes, enterócitos e enteroendócrinas (BOLELI et al., 2002).
Em aves, a digestão e absorção intestinal estão relacionadas com a proliferação celular que
ocorre nas criptas. À medida que suas células sofrem mitose são transferidas para a região basal do
vilo a fim de que ocorra a diferenciação celular e, só então, deslocam-se para a região apical dos
vilos para exercerem sua função (BOLELI et al., 2002). O desenvolvimento da mucosa intestinal é
7
medido pela altura e densidade dos vilos, relacionados com a renovação celular pelo epitélio da
mucosa intestinal e corresponde ao aumento no numero de suas células epiteliais.
6. Hematologia
A análise dos padrões sanguíneos fornece subsídios importantes para o auxílio do diagnóstico
e prognóstico de condições mórbidas em populações de peixes (MODRÁ et al., 1998). Os
parâmetros relativos à série vermelha permitem identificar os processos anemiantes, enquanto o
leucograma pode ser empregado no diagnóstico dos processos infecciosos e outros estados de
desequilíbrio homeostático (MAHONEY e MCNULTY, 1992).
O sangue, um tecido líquido, móvel, do tipo conjuntivo, que está praticamente em equilíbrio
com os outros tecidos, constitui-se em uma das grandes forças homeostáticas do organismo
(KALASHNIKOVA, 1979). Segundo RANZANI-PAIVA (2005), as características hematológicas
dos peixes sadios apresentam ampla variação, principalmente, em função dos fatores internos, bem
como, ambientais. Para utilizar o sangue como instrumento de diagnóstico de doenças de peixes é
preciso, inicialmente, conhecer os valores hematológicos normais, levando-se em conta as
características de cada espécie e do local onde vivem. Relatos de LI e GAITLIN (2004) descrevem
a ação dos prebióticos no quadro sanguineo de peixes.
Eritrócitos são as células mais numerosas do sangue, cuja função é transportar oxigênio e gás
carbônico pelo seu componente principal, a hemoglobina (TAVARES-DIAS e MORAES, 2004).
Leucócitos são geralmente observados nas extensões sangüíneas e, segundo JAKOWSKA
(1959), resultam de estímulos ambientais que afetam a sanidade dos peixes. São formados pelos
linfócitos, neutrófilos, monócitos, eosinófilos e basófilos.
Trombócitos são células nucleadas, predominantemente elípticas, com núcleo fusiforme e
hipercorados (TAVARES-DIAS e MORES, 2004). São responsáveis pela defesa orgânica
(leucócitos e trombócitos) predominantes nas extensões de espécies dulciaquícolas, como as tilápias
(TAVARES-DIAS et al., 2000).
Características hematológicas foram avaliadas em Oreochromis niloticus em condições
laboratoriais, sistema extensivo e intensivo (tanque-rede), respectivamente por MARTINS et al.,
(2004), TAVARES-DIAS e FAUSTINO (1998) e TAVARES-DIAS et al., (2000).
Com o crescimento da piscicultura são evidentes os problemas relacionados à criação
intensiva, uma vez que o manejo inadequado promove estresse nos peixes, causando diminuição da
resistência às enfermidades (SHRIMPTON et al., 2001). Os prebióticos podem atuar indiretamente
sobre o sistema imune e enzimático, capacitando a produção de substâncias com propriedades
8
imunoestimulatórias e interação com o sistema imune, em vários níveis, incluindo a produção de
citocinas, proliferação de células mononucleares, fagocitose macrofágica, eliminação e indução de
síntese de grandes quantidades de imunoglobulinas. (SILVA e NÖRNBERG, 2003).
PALIC et al., (2006) estudaram Pimephales promelas, alimentados com 1% de glucano na
dieta em três grupos: estresse agudo, estresse crônico e não estressados e, puderam verificar que a
administração desse suplemento aumentou o número dos neutrófilos do grupo de estresse crônico.
SIWICKI et al., (1994) estudaram o efeito do glucano e dois tipos de leveduras sobre a
resposta imune não específica da truta arco-íris (Oncorhynchuis mykiss), e concuiram que o
hematócrito não diferiu significativamente entre os tratamentos e a porcentagem de linfócitos foi
significativamente superior nas dietas contendo levedura (Saccharomyces cerevisae). DUNCAN e
KELSIUS (1996) verificaram que a suplementação com glucano para bagre-do-canal promoveu o
acréscimo na migração e fagocitose dos macrófagos e neutrófilos.
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14
OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito da suplementação de dietas com mananoligossacarídeo (MOS) e β-glucano no
desempenho zootécnico, hematológico, morfológico intestinal e na atividade enzimática de tilápias-
do-nilo Oreochromis niloticus, mantidas em tanque-rede.
Aquaculture Nutrition
15
MANANOLISSOCARÍDEO E Β-GLUCANO NA SUPLEMENTAÇÃO DIETÁRIA PARA
JUVENIS DE TILÁPIA-DO-NILO MANTIDOS EM TANQUES-REDE
Resumo – Este experimento foi conduzido em um empreendimento aquícola, tendo como
objetivo a utilização de mananoligossacarídeo (MOS) e ß-glucano, na suplementação dietária do
lote experimental, com o intuito de acompanhar o desempenho zootécnico e relacioná-lo aos
parâmetros hematológicos, alterações morfológicas do intestino e atividade enzimática (protease,
lípase e amilase) de 3000 juvenis de tilápias-do-nilo, mantidos em tanques-rede, com peso médio
inicial de 24g ± 0,26. Utilizaram-se nove tanques-rede (6,0 m
3
) constituindo-se de três tratamentos e
três repetições: Tratamento 1: ração comercial sem suplementação (controle); Tratamento 2: 0,1%
por tonelada de MOS; Tratamento 3: 0,03% por tonelada de beta glucano purificados. A ração
continha 36 % de proteína bruta (PB), incorporados no premix MOS e β-glucano purificado
(BIORIGIN
®
). Os exemplares foram alimentados três vezes ao dia de acordo com a sua biomassa,
e, mensalmente, os ajustes foram determinados de acordo com as biometrias. Os parâmetros
analisados, físicos e químicos da água (temperatura, °C, oxigênio dissolvido, mg L
-1
, pH e
condutividade elétrica, us cm
-1
); zootécnicos (peso inicial e final - Pti e Ptf, comprimento total
inicial e final - Cti e Ctf, relação Pi x Ct,, fator de condição - K, conversão alimentar aparente -
CAA, ganho de peso diário - GPD, taxa de crescimento específico - TCE, taxa de eficiência
protéica - TEP e sobrevivência – S); hematológicos (hematócrito, hemoglobina, proteína total,
contagem diferencial de leucócitos - CDL, contagem de eritrócitos - Er, contagem total de
leucócitos - CTL, contagem total de trombócitos - CTT, volume corpuscular médio e concentração -
VCM e hemoglobina corpuscular média – CHCM); morfologia da parte anterior do intestino (altura,
altura da parede e espessura do epitélio das vilosidades) e atividade enzimática (protease, lípase e
amilase). Observou-se que as tilápias-do-nilo que receberam a dieta suplementada com β-glucano,
usado na proporção de 0,03% por tonelada de ração e no período de 90 dias, apresentaram condição
favorável do sistema imune, ampliação na superfície de absorção da região anterior intestinal e,
consequentemente, um aumento na atividade das enzimas digestivas indicando maior eficiência na
utilização dos nutrientes dos juvenis de tilápia-do-nilo, proporcionando desempenho zootécnico
satisfatório em relação às outras dietas (MOS e controle). Este produto pode ser usado como
suplemento alimentar para a espécie quando mantidas em tanques-rede.
Palavras – Chave: atividade enzimática, desempenho zootécnico, hematologia, morfologia
intestinal, Oreochromis niloticus.
16
MANNANOLIGOSACCHARIDE AND β-GLUCAN IN DIETARY SUPPLEMENTATION
FOR NILE TILAPIA JUVENILES KEPT IN CAGES
Abstract – This experiment was conducted at an aquicolous enterprise with the objective of
evaluating the use of mannanoligosaccharide (MOS) and ß-glucan as dietary supplements in an
experimental lot in order to follow the zootechnical performance, establishing a relationship with
the hematological parameters, the morphological alterations of the intestine, and the enzymatic
activity (protease, lipase and amylase) of 3000 Nile tilapia juveniles kept in cages, with initial mean
weight of 24g ± 0.26. Nine net tanks (6.0 m
3
) were used, with three treatments and three
replications: Treatment 1: commercial feed without supplementation (control); Treatment 2: 0.1%
per ton of MOS; Treatment 3: 0.03% per ton of purified beta glucan. The feed contained 36 % of
crude protein (CP) incorporated into the premix MOS and purified beta glucan (BIORIGIN
®
). The
fishes were fed three times a day according to their biomass, where the adjustments were
determined monthly according to the biometry. The analysed parameters were: physical and
chemical parameters of the water (temperature, °C, dissolved oxygen, mg L
-1
, pH and electrical
conductivity, us cm
-1
); zootechnical (initial and final weight - Wti and Wtf, initial and final total
length - Lti and Ltf, relationship Wi x Lt, condition factor - K, apparent feed-conversion - AFC,
daily weight gain - DWG, specific growth rate - SGR, protein efficiency ratio - PER and survival
rate - S); hematological; (hematocrit, hemoglobin, total protein, leucocyte differential count - LDC,
red blood cell count - RBC, total leucocyte count - TLC, total thrombocyte count - TTC, mean
corpuscular volume - MCV, and mean corpuscular hemoglobin concentration – MCHC);
morphology of the front part of the intestine (height, height of the wall and thickness of the
epithelium of the villi) and enzymatic activity (protease, lipase e amylase). The nile tilápia that had
received the diet supplemented with β-glucan used at a proportion of 0.03% per ton of feed in a
period of 90 days showed a favourable condition of the immune system, increase in the absorption
surface of the front part of the intestine and consequently, growth in the activity of the digestive
enzymes, denoting higher efficiency in the use of the nutrients in the Nile tilapia juveniles,
providing satisfactory zootechnical performance in comparison with the other diets (MOS and
control). This product may be used as a dietary supplement for this species when kept in net tanks.
Key words: enzymatic activity, zootechnical performance, hematology, intestine morphology,
Oreochromis niloticus.
17
INTRODUÇÃO
A piscicultura vem apresentando significativo avanço na produção aquícola, destacando-se
entre as espécies criadas a de tilápia-do-nilo, cuja produção corresponde a 6,7% da produção global
de peixes cultivados (FAO, 2007; OSTRENSKI e BOEGER, 2008). Sua criação em tanques-rede
destaca-se por ser esta capaz de suprir as necessidades de manutenção do animal e de assegurar sua
eficiência em termos econômicos (AYROZA, 2009). Porém, como em qualquer sistema de criação
a ração oferecida deve ser nutricionalmente balanceada para suprir as exigências da espécie, o que
implica em altos custos (KUBITZA, 2003; PEZZATO et al., 2004). Com o crescimento dessa
atividade, surgem problemas relacionados ao manejo inadequado que levam a situações de estresse
e ao aparecimento de enfermidades (SHRIMPTON, et al., 2001). Uma das alternativas para
enfrentar essas dificuldades é a utilização de ingredientes de origem microbiana, particularmente os
prebióticos (LI e GAITLIN, 2004). Entre eles, destacam-se os mananoligossacarídeos (MOS) e β-
glucano derivados da parede celular de levedura, Saccharomyces cerevisiae. São compostos
utilizados como alternativa aos promotores de crescimento, mantendo o equilíbrio benéfico da
microbiota intestinal, em animais jovens ou em iminente condição de estresse (SILVA e
NÖRNBERG, 2003).
O MOS e β-glucano agem como estimulantes dos mecanismos de defesa dos peixes. Estudos
demonstram que a mannose, quando adicionada à dieta, reduz a colonização de bactérias patógenas
no organismo do animal (LIMA, 2008). Os glucanos atuam aumentando a atividade de macrófagos,
a fagocitose por neutrófilos, monócitos e linfócitos, e a produção imunoglobulinas e lisozimas
(RAA, 1996; SAKAI, 1999; FALCON, 2007). Em peixes, os prebióticos atuam promovendo
respostas imunes contra agentes infecciosos, segundo VOLPATTI et al., (1998), através da
produção de células mediadoras da resposta imune (SIWICKI et al., 1993; VERLHAC et al., 1996).
Estes diagnósticos e os prognósticos são determinados como procedimentos de rotina, por meio de
parâmetros hematológicos (RANZANI-PAIVA e SILVA-SOUZA, 2004). Entretanto, resultados de
18
investigações sobre a utilização de prebióticos em peixes são ainda limitados e alguns contraditórios
(LI e GAITLIN III, 2004).
Este trabalho foi desenvolvido com juvenis de tilápia-do-nilo, Oreochromis niloticus,
mantidos em tanques-rede, cujo objetivo foi a avaliação do seu desempenho zootécnico frente à
suplementação dietária dos prebióticos, MOS e ß-glucano. Esta avaliação teve como base as
variações de parâmetros hematológicos, alterações morfológicas do intestino e mudanças nas
atividades enzimáticas de protease, lípase e amilase digestivas.
MATERIAL E MÉTODOS
Este experimento foi realizado na empresa Piscicultura Escama Forte Ltda ME, na cidade de
Zacarias - SP, instalada nas águas do Reservatório da Usina Hidrelétrica de Nova Avanhandava, no
Baixo Rio Tietê. Inicialmente, 3000 exemplares revertidos de Oreochromis niloticus, por tanque-rede
na fase juvenil, com média de peso inicial de 24±0,26g (Pi), pertencentes à linhagem Chitralada.
Foram distribuídos aleatoriamente em nove tanques-rede (TR) de secção quadrada com 4,0 m
2
de
lâmina e 1,5 m de coluna d’água. Os peixes foram alimentados três vezes ao dia até a saciedade. A
ração oferecida por tanque foi pesada antes e ao final, para avaliação do consumo total. A ração
utilizada foi comercial (FRI-RIBE S.A), contendo 36% de proteína bruta (PB), à qual foram
incorporados através de premix (BIORIGIN): mananoligossacarídeo, MOS (22,0% de
mananoligossacarídeo e 20,0% de β-glucano) e beta glucano, ß-glucano (70,0% de ß
1-3
glucano
e ß
1-6
glucano purificado). A adição foi feita pela empresa FRI-RIBE S.A., sem alterações na formulação da
ração (Tabela 1). O período de arraçoamento dos peixes foi de 90 dias (outubro a dezembro de 2006).
Os tratamentos obedeceram ao seguinte desenho experimental: 1) ração comercial sem suplementação
(controle); 2) adição de 0,1% de MOS por tonelada de ração; 3) adição de 0,03% de β-glucano por
tonelada de ração. Os parâmetros físicos e químicos da água, temperatura e oxigênio dissolvido,
foram monitorados diariamente. O pH e a condutividade elétrica foram registrados mensalmente. Os
19
valores desses parâmetros, apresentados na figura 1, são semelhantes aos descritos por CAMARGO
(2007) para o mesmo local e sistema de produção da espécie.
Durante o experimento foram realizadas três biometrias a intervalos regulares de 30 dias. Em
cada biometria, os peixes foram anestesiados, seguindo-se os princípios éticos de manipulação
animal estabelecido pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA,
htpp://www.cobea.org.br). Após anestesiadas, as tilápias foram pesadas e medidas, para a
determinação dos seguintes parâmetros: 1) relação peso-comprimento (K= Pf /Cf
b
) em que Pf é o
peso final e Cf o comprimento final, enquanto b é obtido por meio da equação alométrica da relação
peso/comprimento, y = ax
b
Para cada biometria foram coletados dois animais de cada tanque-rede, totalizando seis peixes
por tratamento. Os peixes foram puncionados na veia caudal para a retirada de 1,0 mL de sangue,
utilizando-se agulhas (0,70 x 25 mm), seringas descartáveis (5,0 mL) e tubos plásticos (2,0 mL)
siliconizados e heparinizados
; 2) fator de condição (K), em que o coeficiente “b” da relação Pf x Cf, é
definido como o coeficiente de alometria; 3) ganho em peso diário (GPD = Pf-Pi/t), em que t =
tempo em dias); 3) conversão alimentar aparente (CAA = CTR/GP), em que CTR = consumo total
de ração e GP = ganho de peso; 4) taxa de crescimento específico (TCE = ln Pf– ln Pi x 100dias);
5) taxa de eficiência protéica (TEP = GP x 100/ CR % PB dieta); 6) sobrevivência (S%), calculada
pela relação percentual entre o número de peixes no início e no final do experimento.
1
. As amostras de sangue foram mantidas a 4ºC por 1 hora até o
processamento. Após a coleta de sangue os animais foram sacrificados por punção da medula
espinhal, eviscerados, e retirado o trato digestório completo, descartando-se o conteúdo digestivo. O
trato digestório foi transferido para banho de gelo e conservado a -20
o
C para posterior retirada do
intestino e determinações analíticas.
1
Vacutainer, BD, São Paulo, SP .
20
Análises hematológicas e determinações hematimétricas
Alíquotas de sangue foram transferidas para tubos de microhematócrito, centrifugadas a 4.500
x g por 5 minutos e lidas em cartões padronizados conforme preconiza o National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Os valores de hematócrito estão expressos em percentual
(%). As concentrações de proteína plasmática total (PPT) foram avaliadas através do plasma de
cada tubo de microhematócrito em refratômetro manual e expressas em g dL
-1
. Realizaram-se as
determinações de hemoglobina (Hb) em duplicata pelo método da cianohemoglobina, utilizando-se
o reativo de Drabkin comercial
2
e leitura de absorbância óptica
3
a 540 nm. A fim de evitar
interferência, a leitura da reação de hemoglobina foi realizada após a separação por centrifugação
do material nuclear suspenso. As concentrações de Hb estão expressas em g dL
-1
. Para a contagem
dos eritrócitos (Er) realizada manualmente em câmara de Neubauer, utilizou-se o líqüido diluidor de
Natt-Herrick. A contagem diferencial dos leucócitos (CDL) e dos trombócitos (CTT) aconteceu por
meio de lâminas coradas com HE, totalizando 200 células e para a contagem total de leucócitos
(CTL), houve avaliação de 2000 células. Para o cálculo dos índices hematimétricos: volume
corpuscular médio e concentração (VCM), hemoglobina corpuscular média (CHCM) e
concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), foram avaliados obedecendo-se à
metodologia preconizada por THRALL (2004).
Preparações histológicas
Fragmentos da parte anterior do intestino foram fixados em solução de Bouin por 8 horas,
incluídas em blocos de parafina, cortados em secções transversais de 5,0 µm, e corados em
hematoxilina-eosina (HE). Os cortes foram observados em microscópio óptico Olympus, modelo
BX41, acoplado a um sistema para captura de imagens Olympus DP11-N. As análise determinaram:
1) altura das vilosidades (ápice das vilosidades até o início da camada muscular); 2) altura total das
2
Líquido de Drabkin, Newprov, Maringá-PR.
3
Espectrofotômetro CELM E205D, São Paulo-SP.
21
vilosidades (ápice da vilosidade até o termino) e, 3) densidade do epitélio das vilosidades,
utilizando-se o software Image-Pro Plus®.
Determinações enzimáticas
O restante do intestino foi homogeneizado em solução tampão NaHPO
4
0,01M/ Tris 0,01M
pH 7,0 em glicerina 1:1(v:v) sob banho de gelo, com homogeneizador rotativo a 1000 rpm por 1
minuto. Após homogeneizado, houve a centrifugação a 12000 x g por 10 minutos e o sobrenadante
foi utilizado como fonte de enzima. As atividades de protease total foram feitas utilizando-se
caseina como substrato e em seguida estabelecido o teor de aminoácidos livres no sobrenadante
(WALTER 1984). As atividades lipolíticas foram ensaiadas segundo a ALBRO (1985) usando-se
como substrato o p-NO-fenil meristato. Para verificação das atividades amilohidrolíticas, também
analisadas, utilizou-se a solução de amido solúvel 2% como substrato de reação o teor de glicose
livre estabelecido pelo método da glicose oxidase (BERNFELD, 1995).
Análise estatística
O desenho experimental obedeceu a um delineamento, compreendendo três tratamentos com
três repetições. Os parâmetros estudados foram submetidos à análise de variância, tendo-se aceitado
um nível de 5% de significância. Para o caso de diferenças significativas foi aplicado o teste de
Tuckey e na comparação das médias, o pacote estatístico SAS (2005). A comparação das variáveis
hematológicas foi executada através do teste não paramétrico de KRUSKAL-WALLIS, os períodos
de coleta, comparados pelo teste de FRIEDMAN e a utilização do teste de DUNN para a
comparação múltipla.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os exemplares de tilápia-do-nilo submetidos ao tratamento com MOS e β-glucano
apresentaram valores médios de peso e comprimento significativamente maiores, em relação ao
22
controle, a partir de 60 dias de arraçoamento (Tabela 2). Essas alterações puderam ser observadas
também por meio da análise morfológica do trato digestório mostrando aumento significativo da
densidade e comprimento das vilosidades (Figura 2). Resultado semelhante foi descrito com a
mesma espécie e sistema de criação, porém alimentada com levedura (MEDRI et al., 1999). Neste
caso foram relatados baixos valores de crescimento e peso, fato atribuído ao adensamento
populacional. Relatos semelhantes aos nossos resultados foram observados por PEREIRA DA
SILVA e PEZZATO (2000). Entretanto, alevinos de tilápia-do-nilo criadas em viveiros escavados e
alimentadas com levedura como suplemento vitamínico também apresentam discreto aumento nos
valores médios de peso (BACCARIN e PEZZATO, 2001). Quando alimentada com teores menores
de proteína (28,0% PD/3000 kcal ED/kg), porém com adição de vitamina C (400 e 600 mg/kg) e ß-
glucano (0,1-0,8%) essa espécie apresentou desempenho satisfatório já a partir de períodos de
tempo menores (seis semanas) que aquele observado no presente trabalho (FALCON, 2007). Larvas
de tilápias mostram igualmente resultados promissores com a suplementação de MOS à alimentação
por um período de 21 dias (SAMRONGPAN et al., 2009). Entretanto, alevinos de tambaqui,
Colossoma macropomum, alimentados com dietas suplementadas com resíduo de cervejaria (cevada)
mostraram uma redução nos valores de peso e comprimento, discordante das descritas em tilápias
(CRUZ, 1997). Essas variações fisiológicas merecem destaque, visto que a adição de prébioticos
exige um conhecimento prévio das respostas fisiológicas da espécie frente ao suplemento.
O aumento nos valores de GP em peixes poderia estar relacionado à provável degradação do
glucano por ação da glucanase, promove o deslocamento de mais proteínas (efeito poupador de
proteínas) para o crescimento (LOPÉZ et al., 2003). Todavia, em peixes, não existem ainda
evidências sobre sua capacidade de digestão de ß-glucano ou de sua ação sobre o valor de GP (AI et
al., 2007), tal como observado em camarões, Penaeus monodon (WIGGLESWORTH e GRIFFITH,
1994). Não somente estudos com tilápia mostram GP pela adição de glucanos à ração, mas também
em “yellow croaker”, Pseudosciaena crocea, alimentado em dietas adicionadas com valores
inferiores a 0,09% de glucano, por 56 dias, observa-se aumento nos valores de GP, apesar de não
23
haver diferenças significativas nos valores de GPD (AI et al., 2007). Valores maiores de GP foram
descritos em truta arco-iris, alimentadas com levedura (RUMSEY et al., 1991). Outro importante
parâmetro para avaliação do crescimento é o fator de condição, considerado um índice corporal
capaz de refletir interações entre os peixes e o meio ambiente, o que representa um indicativo do
bem-estar da espécie (TAVARES-DIAS et al., 2008). No presente estudo, observou-se um
crescimento do tipo isométrico com b, variando entre 3,108 (controle), 3,173 (MOS) e 3,016 (ß-
glucano) na equação da relação peso-comprimento. Segundo LANDELL (2007), estudando tilápias-
do-nilo criadas em tanques-rede de 18,0 m
3
Os valores de CAA, que oscilaram entre 1,5 e 2,6, não apresentaram variações significativas
entre os tratamentos e coletas durante o período experimental. Entretanto os valores de S, C, TCE,
TEP mostraram diferenças significativas somente entre as coletas, quando houve um crescimento
do consumo de alimento ao longo do desenvolvimento, também uma situação de invariabilidade dos
valores TCE nos tratamentos com prebióticos e uma redução dos valores da TEP nos três
tratamentos (Tabela 2). Resultados similares foram descritos por FALCON (2007), que também não
observou diferença nos valores de CAA para tilápias alimentadas com o suplemento glucano e
níveis de vitamina C. Valores constantes de CAA sugerem que os aumentos de GPD não devem
estar diretamente correlacionados a mecanismos digestivos, mas a alterações de outra ordem
fisiológica, capazes de alterar, por exemplo, valores de taxas metabólicas e até mesmo promover
respostas bioquímicas celulares mais específicas, direcionando as proteínas para o crescimento de
massa muscular. Apesar dos valores GPD se apresentarem iguais entre os tratamentos, observou-se um
aumento do mesmo em cada tratamento ao longo das coletas. Juvenis de dentex, Dentex dentex,
(HIDALGO et al., 2006) e de “snapper” Pagrus auratus-Sparidae, (COOK et al., 2003) alimentados
com prebiótico não apresentaram diferenças significativas nos valores de TCE. Além disso, truta arco-
, em sistema dividido em fases de criação de 30 a 870g,
estas apresentaram o mesmo padrão de crescimento, com b inferior, variando entre 2,9077 e 3,0344.
Desta forma, na espécie em estudo, o provável efeito da suplementação de β-glucano na dieta esteja
relacionado ao aumento da resposta imune e ao bem-estar do peixe.
24
iris, Oncorhynchus mykiss, (RAMSEY et al., 1991) e alevinos de tilápia (BACCARIN e PEZZATO,
2001) mostraram significativo decréscimo de eficiência, quando alimentados com levedura.
Neste trabalho os valores médios de hematócrito e hemoglobina em juvenis de tilápia-do-nilo
não mostraram variações significativas entre os tratamentos (Tabela 3). Todavia, ao longo das
coletas a concentração de Hb mostrou uma tendência geral de redução, mais pronunciada na
segunda coleta. Considerando-se que as variações de Hb foram gerais, poder-se-ia atribuir sua
redução a fatores externos, como os ambientais ou de outra ordem, sem atribuí-las aos tratamentos.
Estes relatos estão de acordo com os de TAVARES DIAS e MORAES (2004), entretanto
discordam de Ictalurus punctatus alimentada com glucano, mananoligossacarídeo e levedura, que
apresentaram elevação nos valores de hematócrito quando receberam β-glucano na concentração de
1000 mg por kg de ração por quatro semanas (WELKER et al., 2007). Ao longo do período
experimental, observou-se uma redução do número de eritrócitos, fato não observado nos peixes
que receberam complemento com β-glucano. Essa redução poderia ser atribuída à perda de
hemácias devido a hemorragias, observadas nos peixes controle e naqueles tratados com MOS. A
CHCM refletiu, como era, de se esperar, as variações de Hb total, entretanto, os valores constantes
de Ht acompanhados de redução da CTH sejam advindos de um aumento do VCM. É preciso
destacar que essa variável apresentou valores maiores nos peixes tratados com β-glucano. Híbridos
de esturjão, Acipenser ruthenus x A. baerii apresentaram igualmente redução do número de
eritrócitos (CTE) e aumento gradativo, cerca de até 40% dos valores de VCM, em função do
aumento nos níveis de imunoestimulantes ofertados na dieta (JENEY e JENEY, 2002). O quadro
observado no presente trabalho sugere ligeira anemia macrocítica, cuja ligação aos tratamentos
merece ser confirmada. Valores invariáveis de PPT podem indicar a presença de um equilíbrio
iônico sanguíneo, além de sugerirem regularidade nutricional e assegurarem que as perdas
sanguíneas observadas devem ter sido discretas sem alterações de volemia. A redução de PPT,
associada à presença de prebióticos, é descrita em pacu, Piaractus mesopotamicus alimentado com
25
dietas suplementadas com ≥ 0,3% de glucano ( SCHORER, 2008), entretanto, tilápias tratadas com
diferentes níveis de levedura e derivados não apresentaram alterações de PPT (HISANO et al., 2006).
A tabela 4 mostra que os peixes tratados com ß-glucano apresentaram discreto aumento do
número de linfócitos. Resposta semelhante foi observada com tilápias alimentadas com dietas
suplementadas com Vitamina C e β-glucano (FALCON, 2007). Exemplares de truta arco-iris
(Oncorhynchus mykiss) alimentadas com dietas suplementadas com 1,0% de β-glucano e
submetidos a estresse de transporte apresentaram linfocitose, neutropenia e monocitopenia,
entretanto, valores menores de suplementação parecem não interferir na produção de células de
defesa após o estresse (JENEY et al., 1997). Formas imaturas de eritrócitos associadas a
hemoparasitos, foram freqüentemente observadas no presente trabalho, especificamente em tilápias
anêmicas oriundas dos tratamentos controle e MOS. Tais observações coincidiram com os menores
percentuais de sobrevivência descritos nesses dois grupos. Na contagem diferencial de trombócitos,
neutrófilos e monócitos não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos.
Entretanto, o número de neutrófilos e monócitos nos peixes controle e tratados com MOS manteve-se
superior quando comparado aos que receberam ß-glucano. Provavelmente, esse quadro seja decorrente
do adensamento populacional, fato que, normalmente, leva esses animais à condição de estresse.
A análise estrutural da porção anterior do intestino (Figura 2; Tabela 5) mostra diferenças
significativas nos valores de altura das vilosidades, altura total das vilosidades e espessura do
epitélio das vilosidades nos tratamentos MOS e β-glucano. Tilapia-do-nilo alimentada com
Flavofeed
®
mostrou respostas semelhantes às observadas neste trabalho quando avaliada a altura
das vilosidades de acordo com FRABEGAT (2006). Truta arco-iris, Oncorhynchus mykiss,
alimentada com dietas suplementadas com Bio-mos apresentaram aumento na altura e espessura das
vilosidades, segundo STAYKOV et al., (2007). BURREL et al., (2001) estudando salmão do
Atlântico descreveram respostas estruturais positivas encontradas no intestino de peixes
alimentados com dietas suplementadas com nucleotídeos. Segundo HISANO et al., (2006) essas
respostas morfológicas intestinais podem ter ocorrido devido ao maior teor de
26
mananoligossacarídeo e nucleotídeos inserido na dieta, o que pode ter influenciado o trato intestinal
e sua microbiota. Além disso, respostas em relação à altura das vilosidades foram também
registradas em truta arco-iris, O. mykiss, alimentada com proteína de soja (ESCAFFRE et al., 2007),
nutriente vegetal rico em polissacarídeos estruturais. As alterações observadas neste trabalho
mostraram um caráter benéfico sobre as características morfológicas do trato intestinal,
promovendo o aumento na área de absorção da mucosa de tilápias-do-nilo alimentadas com dietas
suplementadas com MOS. Alterações semelhantes foram relatadas em não- ruminantes alimentados
com dietas adicionadas de prebióticos (SILVA e NÖRNBERG, 2003).
Na figura 3A, peixes alimentados com β-glucano apresentaram inibição da atividade
proteolítica inespecífica. Entretanto, a presença de MOS na dieta permitiu a preservação dessa
atividade. Pôde-se observar que as atividades de amilase e lípase não foram alteradas pela adição de
MOS ou β-glucano (Figura 3B e 3C). Ao longo do tempo a adição de MOS na dieta gerou uma
tendência de aumento, enquanto na dieta suplementada com β-glucano houve redução da atividade
de amilase. Pôde-se verificar que a atividade da lípase aumentou no decorrer das coletas em tilápias
que receberam β-glucano na dieta. Segundo ALMEIDA (2006) este comportamento alimentar em
peixes é considerado como uma adaptação à variação na composição da dieta. A habilidade dos
peixes em processar a comida é fundamental e depende de características como o perfil enzimático
do canal alimentar da espécie (FAGBENRO et al., 2000). Há um consenso sobre a variação
proporcional da secreção de amilase, lipase e protease devido à variação do conteúdo ou nível dos
seus substratos na dieta (LHOSTE et al., 1994). O mesmo foi descrito para tainha (Mugil platanus)
por GALVÃO et al., (1997) e para jundiás (Rhamdia quelen) por LUNDSTEDT et al., (2002).
CONCLUSÃO
O produto β-glucano usado na proporção de 0,03% por tonelada de ração, no período de 90
dias, aumentou a superfície de absorção no intestino, bem como a atividade enzimática, podendo
implicar em maior eficiência na utilização dos nutrientes. Desse modo, pode-se inferir alterações
27
benéficas dos parâmetros hematológicos induzindo a um desempenho zootécnico satisfatório dos
juvenis de tilápia-do-nilo em relação às outras dietas, sugerindo que este produto pode ser usado
como suplemento alimentar para a espécie, quando mantidas em tanques-rede.
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31
Tabela 1. Composição percentual e química das rações experimentais durante a
realização do experimento
Ingredientes (%)
Controle
D – MOS
1
D- GLU
2
3
Milho moído
31,20 31,20 31,20
Farelo de trigo
5,00 5,00 5,00
Farelo de soja
19,20 19,20 19,20
Quirera de arroz
12,00 12,00 12,00
Glúten de milho
7,46 7,46 7,46
Farinha de penas
5,00 5,00 5,00
Farinha de peixe
5,00 5,00 5,00
Farinha de vísceras de aves
12,00 12,00 12,00
NaCL
0,24 0,24 0,22
Vixil ligonossufonato - aglutinante
1,00 1,00 1,00
Suplemento vitamínico e mineral
0,50
4
0,50 0,50
Cloreto de colina %
0,50 0,50 0,50
LD Metionina
0,90 0,90 0,90
MOS
-- 0,1 --
ß- glucano
--
--
0,03
Composição %
Proteína Bruta
36,00
36,00
36,00
Extrato Etéreo
4,64
4,64
4,64
Fibra Bruta
3,25
3,25
3,25
Matéria Mineral
7,75
7,75
7,75
Cálcio
1,55
1,55
1,55
Fósforo
1,00
1,00
1,00
Extrativo não nitrogenado
50,19
5
50,19
50,19
1
CONTROLE - ração comercial sem suplementação (controle).
2
D- MOS -1kg MOS por tonelada de ração;
3
D- GLU- 300g ß- glucanos purificados por tonelada de ração;
4
– Vitaminas e Minerais, quantidade kg/ração: 2.000,00 colina, 0,2143% sódio, 0,2531% cloro, 0,7819% potássio, 0,1979% magnésio, 0,3231%
enxofre, 268,88 mg de ferro, 21,10 mg de cobre, 21,40 mg manganês, 198,07 mg de zinco, 0,054 md cobalto, 4,84 mg iodo, 0,478 mg selênio,
14.056,67 UI vitamina A, 3.000,48 UI vitamina D3, 200 mg vitamina E, 6,00 mg vitamina K3, 8,01 mg vitamina B1, 10,93 mg vitamina B2, 10,89
mg vitamina B6, 23,21 mcg vitamina B12, 134,45 mg niacina, 27,56 mg acido pantotenico (B3), 1,30 mg acido fólico, 0,256 biotina, 400 mg
vitamina C.
5
- ENN = MS –(PB+MM+FB+EE)
32
Tabela 2. Médias (
x
) respectivos desvios padrão (s) dos parâmetros: peso e comprimento final,
fator de condição (K), consumo de ração, ganho de peso diário (GPD), conversão alimentar
aparente (CAA) e sobrevivência, segundo as rações e período coletado.
Parâmetros
Coleta
s
Ração (
x
±
s)
Controle
MOS
β-glucano
Peso final (g)
1
55,33 ± 2,31 cA 61,33 ± 4,16 cA 67,67 ± 4,51 cA
2
110,33 ± 7,09 bB 128,00 ± 4,36 bAB 136,67 ± 6,66 bA
3
179,00 ± 28,05 aB 201,33 ± 18,15 aAB 219,67 ± 6,66 aA
x
114,88 130,22 141,33
Comprimento final
(cm)
1
14,37 ± 0,31 cA 14,90 ± 0,46 cA 14,63 ± 0,15 cA
2
17,93 ± 0,40 bB 18,00 ± 0,00 bAB 18,80 ± 0,17 bA
3
20,90 ± 0,53 aB 21,73 ± 0,46 aA 21,93 ± 0,55 aA
x
17,73 18,21 18,45
Fator de condição
(K)
1
1,404 ± 0,142 aB 1,162 ± 0,057 aC 2,069 ± 0,129 aA
2
1,400 ± 0,029 aB 1,331 ± 0,045 aB 1,961 ± 0,042 aA
3
1,407 ± 0,149 aB 1,149 ± 0,043 aC 1,986 ± 0,147 aA
x
1,403 1,214 2,005
Ganho de peso
diário (GPD, gdia
-1
1
)
1,74 ± 0,13 bA 2,07 ± 0,23 bA
2,43
±
0,25 bA
2
2,39 ± 0,34 abA 2,90 ± 0,31 abA 3,00 ± 0,47 bA
3
3,27 ± 1,13 aA 3,49 ± 0,69 aA 3,95 ± 0,38 aA
x
2,46 2,82 3,12
Conversão
alimentar aparente
(CAA)
1
2,59 ± 1,11 aA 1,88 ± 1,17 aA 1,52 ± 0,16 aA
2
2,24 ± 0,89 aA 1,59 ± 0,36 aA 1,48 ± 0,51 aA
3
1,88 ± 1,90 aA 1,70 ± 0,76 aA 1,10 ± 0,41 aA
x
2,23 1,72 1,36
Sobrevivência
(S,%)
1
69,6 ± 10,3 aA
73,5 ± 2,4 aA 75,2 ± 2,1 aA
2
68,6 ± 0,8 bA
72,7 ± 0,3 bA 73,0 ± 0,3 aA
3
63,8 ± 2,7 abA 68,8 ± 2,7 abA 71,0 ± 1,8 aA
x
67,3 71,6 73,0
Consumo Ração
(CR,kg)
1
38,95 ± 1,42 cA 39,62 ± 1,65 cA 33,08 ± 8,84 cA
2
127,72± 8,44 bA 128,88 ± 0,00 bA
124,26
±
0,00 bA
3
174,54 ± 8,70 aA 189,02 ± 0,00 aA
165,67 ± 35,87 aA
x
113,73 119,17
107,67
Taxa
crescimento
específico (TCE)
1
4,63±0,229 bA 5,20±0,372 aA 9,52±0,372 aA
2
6,62±0,278 bA 7,24±0,215 aA
10,25±0,147 aA
3
9,57±0,747 aA 7,54±0,144 aA
10,54±0,435 aA
x
6,94 6,66
10,10
Taxa de eficiência
protéica (TEP)
1
40,31±4,24 aA 47,03±14,13 aA 68,26±3,33 aA
2
27,68±5,15 bA 33,05±5,56 bA
35,48±3,52 bA
3
22,74±6,98 bA 22,63±9,85 bA
30,62±4,50 bA
x
30,24
34,23
44,78
Médias seguidas de letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
33
Tabela 3. Média (
x
) e desvio padrão (s) dos parâmetros hematológicos: Ht (hematócrito), Hb
(hemoglobina total), PPT (proteína total), eritrócito, CHCM (concentração de hemoglobina
corpuscular média), VCM (volume corpuscular médio) segundo as rações e períodos de
coleta.
Parâmetros Coletas
Ração (
x
±
s)
Controle
MOS
β-glucano
Ht
(%)
1
32,00
±
2,76
aA
34,33
±
6,68
aA
36,00
±
6,81
aA
2
31,40 ± 3,05 aA 34,33 ± 4,08 aA 32,33 ± 2,94 aA
3
33,33
±
2,80
aA
34,00
±
4,34
aA
34,33
±
2,66
aA
x
32,24 34,22 34,22
Hb
(g dL
-1
1
)
7,22
±
0,44
aA
7,42
±
0,77
aA
6,96
±
0,72
aA
2
5,41
±
0,26
cA
5,89
±
0,63
cA
5,68
±
0,60
bA
3
6,47 ± 0,47 bA 6,62 ± 0,81 bA 6,93 ± 0,36 aA
x
6,36
6,64
6,49
PPT
1
3,70
±
0,33
aA
3,93
±
0,74
aA
4,72
±
0,75
aA
2
3,54
±
0,17
aA
4,03
±
0,44
aA
3,92
±
0,33
aA
3
3,70 ± 0,40 aB 4,32 ± 0,43 aA 4,25 ± 0,67 aAB
x
3,64
4,09
4,29
CHCM
(g dL
-1
1
)
22,39
±
1,95
aA
22,42
±
3,52
aA
19,59
±
1,65
abA
2
17,30
±
1,07
bA
17,21
±
0,82
cA
18,62
±
1,72
bA
3
19,46
±
1,02
bA
19,48
±
0,49
bA
20,24
±
0,76
aA
x
19,71
19,70
19,48
VCM
(fL)
1
1,63
±
0,28
bB
1,71
±
0,34
bAB
2,07
±
0,24
bA
2
2,02
±
0,52
aA
2,15
±
0,37
aA
1,85
±
0,27
bA
3
2,02
±
0,17
aB
2,20
±
0,24
aAB
2,51
±
0,35
aA
x
1,89
2,02
2,14
CTT
(10
4
1
µL)
39,2 ± 15,2 aA 32,2 ± 10,5aA 19,3 ± 6,2bA
2
22,2 ± 10,6aA 16,8 ± 5,8aA 19,0 ± 2,4aA
3
15,7 ± 7,4aA 15,7 ± 4,4aA 13,0 ± 5,3aA
x
25,7
21,56
17,1
Er
(10
4
1
µL)
202,33± 32,23 aA 202,00 ± 27,57 aA 173,50 ± 22,56 aA
2
157,20
±
35,53
bA
161,33
±
25,38
bA
178,50
±
34,45
aA
3
166,67
±
24,04
bA
138,67
±
18,78
bA
156,67
±
28,32
aA
x
181,1 167,33 169,69
Médias seguidas de letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
34
Tabela 4 - Média (
x
), desvio padrão (s) e mediana (Md) dos parâmetros da contagem diferencial:
neutrófilo, monócito e linfócito em %,segundo as rações e períodos de coleta.
Parâmetros Coletas
Ração (
x
± s)
Controle
MOS
β-glucano
Neutrófilos
1
32,1 ± 8,8 aA 23,0 ± 7,9 aA 26,9 ± 4,3 aA
2
25,0 ± 12,6 aA 22,9 ± 13,8 aA 13,6 ± 7,6 bA
3
24,6 ± 5,6 bA 14,6 ± 1,0 aB 13,5 ± 1,5 bB
x
27,23
20,16
18,0
Monócitos
1
6,2 ± 3,2 aA 1,7 ± 1,2 aB 1,7 ± 1,4 aB
2
5,6 ± 1,7 aA 5,6 ± 5,4 aA 4,5 ± 1,6 aA
3
7,4
±
5,2
aA
2,0 ± 1,6 aB 1,9 ± 0,8 aB
x
6,4 3,1 2.7
Linfócitos
1
61,0 ± 6,2 aB 74,5 ± 8,4 aA 69,6 ± 2,7 bAB
2
69,0 ± 13,7 aA 70,2 ± 17,7 aA 82,0 ± 9,2 aA
3
66,1 ± 3,5 aB 80,7 ± 2,8 aA 82,7 ± 2,0 aA
x
65,33 75,13 78,1
Médias seguidas de letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05)
35
Tabela 5. Média (
x
) e desvio padrão (s) da altura das vilosidades, altura das paredes e espessura do
epitélio, segundo as rações e períodos de coleta.
Parâmetros
Coletas
Ração (
x
±
s)
Controle
MOS
β-glucano
Altura das
vilosidades
(µm)
1
32,02
±
2,11
bA
33,17
±
7,06
cA
36,20
±
7,19
bA
2
57,38
±
7,36
aB
61,71
±
6,56
bAB
64,90
±
14,48
aA
3
61,87
±
3,67
aB
69,02
±
11,27
aA
69,15
±
11,41
aA
x
50,42
54,63
56,74
Altura total das
vilosidades
(µm)
1
33,20
±
2,21
bA
34,73
±
7,19
bA
40,18
±
7,66
bA
2
61,30
±
8,19
aB
71,38
±
6,97
aA
71,09
±
16,52
aA
3
66,71
±
4,40
aB
76,30
±
13,99
aA
74,12
±
10,99
aAB
x
53,73 60,80 61,79
Espessura Epitélio
vilosidades
(µm)
1
1,33
±
0,23
cB
1,67
±
0,43
bB
2,78
±
0,59
cA
2 3,43 ± 0,64 bB 6,93 ± 1,26 aA 6,35 ± 1,29 bA
3
7,67
±
1,30
aA
6,48
±
1,18
aB
8,41
±
0,92
aA
x
4,14 5,02 5,84
Médias seguidas de letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05)
36
Figura 1 – Parâmetros físicos químicos da água durante os 90 dias de experimento
7,5
8,0
8,5
9,0
out nov dez
coletas
pH
130,0
140,0
150,0
160,0
170,0
out nov dez
coletas
Condutividade (us/cm
-1
)
20,0
25,0
30,0
35,0
out nov dez
coletas
Temperatura (°C)
7,0
8,0
9,0
10,0
out nov dez
coletas
Oxigênio Dissolvido
(mg/L
-1
)
37
Figura 2 – Vilosidades do intestino de tilápia-do-nilo alimentadas
com dietas suplementadas com prebióticos
β-glucano
β-glucano
Controle
MOS
Altura da
vilosidade
Altura total
Espessura do
epitélio da
vilosidade
5µm
38
Figura 3 – Atividade inespecífica das enzimas digestivas no trato
gastrointestinal (A = proteolítica; B= amilase; C = lipase) de tilápia-do-nilo
alimentadas com dietas contendo prebióticos durante os 90 dias
A
B
C
39
ANEXO
Vista Geral do local
Detalhe do Tanque-rede
Pesagem
Medição
40
Tilápia-do-nilo - despesca
Retirada de sangue por punção caudal
Punção caudal
Lâmina para esfregaço
41
Ertrócitos
Linfócito
Neutrófilo
Monócitos
42
Retirada do intestino
Fixação do intestino
Vilosidades intestinais
Vilosidades intestinais
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