( PDF ) Frequências alélicas e genotípicas das isoformas CYP2B6 e CYP2C8 na população de Moçambique

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Mestrado em Biologia Celular e Molecular

Frequências alélicas e genotípicas das isoformas CYP2B6 e

CYP2C8 na população de Moçambique

PAULO ARNALDO

Rio de Janeiro

2010

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Ministério da Saúde

FIOCRUZ

Fundação Oswaldo Cruz

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

PAULO ARNALDO

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como

parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em

Ciências, área de Biologia Celular e Molecular.

Orientadores:

Dr. Adalberto Rezende Santos

Dr. Philip Noel Suffys

Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias

Instituto Oswaldo Cruz (IOC)-FIOCRUZ

RIO DE JANEIRO

2010

Frequências alélicas e genotípicas das isoformas CYP2B6 e CYP2C8 na

população de Moçambique

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Ministério da Saúde

FIOCRUZ

Fundação Oswaldo Cruz

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

PAULO ARNALDO

Frequências alélicas e genotípicas das isoformas CYP2B6 e CYP2C8 na população

de Moçambique

Orientadores:

Dr. Adalberto Rezende Santos

Dr. Philip Noel Suffys

Data da Aprovação: 10/02/2010

BANCA EXAMINADORA:

TITULARES:

Dra. Dalma Maria Banic - FIOCRUZ

Dra. Ana Carolina Paulo Vicente - FIOCRUZ

Dra. Fernanda Carvalho de Queiroz Mello - UFRJ

SUPLENTES:

Dr. Harrison Magdinier Gomes - FIOCRUZ

Dr. Antônio Basílio de Miranda - FIOCRUZ (revisor)

Rio de Janeiro, 10 de Fevereiro de 2010

Aos meus pais,

Meus irmãos,

Minha irmã Angelina, que não se encontra mais entre nós, mas que sempre me encorajou,

Mimmy, minha companheira e

Meus Amigos

...A Eles dedico este trabalho.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Dr. Adalberto Rezende Santos, pela orientação e oportunidade da realização

deste trabalho que embora fosse multicêntrico com dificuldades de várias ordens, me fez acreditar

que era possível fazê-lo, dando incentivos, ensinamentos científicos e conselhos. Desta, eu nunca

me vou esquecer!

Ao Chefe do Laboratório e meu co-orientador Dr. Philip Noel Suffys pela co-orientação e pela

oportunidade da realização deste trabalho em seu laboratório.

Ao Dr. Harrison, que sempre esteve ali..., como pai comprometido, dando incansavelmente o

máximo apoio possível em todas as dificuldades surgidas durante o curso e execução deste

trabalho, Harrison você é o CARA!

Ao amigo “tricolor” Dr. Antônio Basílio de Miranda (Baza) por toda a sua receptividade em sua

casa, partilha dos conhecimentos de bioinformática para a análise dos resultados e pela revisão

deste manuscrito. Muito obrigado por tudo!

Ao meu chefe e co-orientador Dr. Ricardo Thompson pelas suas sugestões, apoio constante e

confiança em toda a minha jovem carreira profissional, Obrigado Chefe!

A Karla Fernandes do SIEX-Fiocruz pelo seu empenho incondicional para liberação em tempo

recorde das amostras, sem as quais este trabalho teria ficado só pelos sonhos.

Especial gratidão para Márcia Quinhones, Chyntia, Amanda, Lizânia, Sidra, Adalgiza, Diego e

Márcia pelo auxílio na realização dos experimentos e a todos do laboratório, Lia, Alexandre, Luís

Cláudio, Jablonsky, Adriano, Leo, Luís Nei, Luciene, Atiná, Jorge Luís, Rafael e Vinícius pela

partilha dos momentos durante a realização deste trabalho.

Aos funcionários dos bancos de sangue dos Hospitais envolvidos (Macanza, Vieira, Bacar Flôr,

Venâncio, Benedito e Crescência) pelo seu apoio na coleta das amostras e a todos os doadores de

sangue envolvidos no estudo, sem os quais não seria possível a realização deste trabalho.

Aos amigos Dinis, Crizolgo e Jerônimo que sempre estiveram prontos para me ajudar sempre que

precisei. Muito obrigado meus amigos.

Aos amigos do laboratório e do pavilhão de Hanseníase pela partilha dos momentos alegres

durante as peladas, chopps, etc. Muito obrigado pelo convívio!

Ao CNPq e ao Ministério Ciência e Tecnologia de Moçambique que me concederam a bolsa para

este curso.

Aos meus pais e meus irmãos, pelo carinho, amor, força, incentivo e apoio que sempre deram em

todas as minhas decisões durante a minha formação. Parece pouco dizer por palavras... Muito

obrigado a vocês.

A minha querida Mimmy que embora distante, foi paciente, carinhosa e sempre me incentivou. A

você vai toda a minha gratidão.

A Esperança do INS/CNBS pela compreensão e apoio dado na submissão do projeto ao comitê de

ética.

A todos que não os mencionei aqui, mas que direta ou indiretamente participaram neste trabalho

vai o meu muito obrigado e

A Deus.

Obrigado!

vii

“No meio de qualquer dificuldade encontra-se a oportunidade.”

Albert Einstein

viii

A malária é uma doença infecciosa que ao lado da AIDS e da tuberculose, constituem as três

principais causas de mortalidade no mundo, sendo responsáveis por cerca de seis milhões de

mortes por ano. De acordo com a OMS, de 300 a 500 milhões de novos episódios de malária e

mais de dois milhões de mortes ocorrem por ano, principalmente entre crianças menores de cinco

anos na África sub-Sahariana. Devido à indisponibilidade de uma vacina viável contra a malária,

uma das principais estratégias para o controle da mesma tem sido o diagnóstico precoce e o

tratamento com antimaláricos seguros e eficazes. No entanto, a eficácia deste tratamento é

limitada pela emergência de cepas de Plasmódium falciparum (P. falciparum) resistentes aos

antimaláricos. Hoje, o conhecimento sobre a contribuição dos fatores genéticos do hospedeiro

envolvidos na resposta terapêutica das principais classes de antimaláricos é limitado. Contudo,

sabe-se que variações genéticas em genes humanos que codificam para enzimas envolvidas na

biotransformação de diferentes fármacos podem contribuir para diferenças interindividuais na

resposta terapêutica ou toxicidade a várias drogas, estando relacionadas aos desfechos de falha

terapêutica e efeitos adversos. As isoenzimas CYP2B6 e CYP2C8 humanas, ambas envolvidas na

metabolização de uma ampla variedade de fármacos, incluindo antimaláricos, são codificadas por

genes polimórficos, caracterizados por diferentes polimorfismos de base única (SNPs). Algumas

destas variantes caracterizam fenótipos de metabolização lenta e possivelmente estão envolvidas

na modulação do metabolismo dos antimaláricos. Considerando esta hipótese, este estudo teve

como objetivos: (i) análise descritiva das variantes alélicas nos genes CYP2B6 e CYP2C8 em

populações moçambicanas provenientes de três regiões distintas e (ii) obter as frequências

genotípicas e haplotípicas dos polimorfismos identificados. O estudo serviu igualmente para

fornecermos informações capazes de nortear futuros estudos de associação para avaliar o impacto

destes polimorfismos na eficácia terapêutica e/ou eventos adversos. Para atingir esses objetivos,

amostras de sangue de 360 doadores de sangue foram coletadas num cartão de filtro “FTA Classic

Cards” (Whatman) e genotipadas por PCR-RFLP. As frequências das variantes alélicas no

CYP2B6 foram 0,060 (64C>T), 0,426 (516G>T), 0,00 (777C>A), 0,41 (785A>G) e 0,004

(1459C>T), enquanto a frequência da variante selvagem foi de 0,183. Para o gene CYP2C8 as

frequências das variantes alélicas foram: 0,048, 0,005, 0,16 e 0,00 para as mutações 416G>A,

792C>G, 805A>T e 1196A>G, respectivamente. Não foram encontradas diferenças significativas

entre as frequências das mutações encontradas na variável gênero para os dois genes. Também

não foram encontradas diferenças significativas na distribuição das frequências genotípicas e

haplotípicas entre indivíduos das três regiões estudadas, mostrando uma distribuição homogênea

das mutações nas populações incluídas neste estudo. Nossos resultados mostram que os

polimorfismos presentes nos genes CYP2B6 e CYP2C8, sabidamente envolvidos na alteração do

metabolismo de uma variedade de drogas, ocorrem nas populações estudadas, corroborando os

resultados reportados em outros estudos realizados em populações africanas. Assim, fazem-se

necessários estudos de associação incluindo estes genes para um melhor entendimento sobre a

importância destes polimorfismos no tratamento da malária nestas populações.

Malaria is an infectious disease that alongside AIDS and tuberculosis are the three leading causes

of death worldwide, accounting for about six million deaths per year. According to the World

Health Organization, 300 to 500 million new cases of malaria and more than two million deaths

occur each year, mostly among children under five in sub-Saharan Africa. Due to the

unavailability of a viable vaccine against malaria, one of the main strategies for the control of

malaria has been the treatment of the disease with safe and effective antimalarial drugs. However,

the effectiveness of this treatment is limited due to the emergence of drug-resistant strains of P.

falciparum. Today, knowledge about the contribution of host genetic factors involved in drug

response to the major classes of antimalarial drugs is limited. However, it is known that genetic

variability in human genes coding for drug-metabolizing enzymes may contribute to

interindividual differences in drug response or toxicity and have been attributed to treatment

failure and adverse drug reactions. CYP2B6 and CYP2C8 isoenzymes, both involved in the

metabolism of a wide variety of drugs, including antimalarials, are encoded by polymorphic

genes, characterized by different single nucleotide polymorphisms (SNPs). Some of these variants

are often linked to slow metabolism phenotypes, and possibly are involved in modulating the

metabolism of antimalarials. Considering the latter hypothesis, our goals were: (i) to describe the

genetic profile of the CYP2B6 and CYP2C8 genes in Mozambican populations from three

different regions and (ii) to estimate the genotype and haplotype frequencies of the identified

polymorphisms. The study also aimed to provide information to guide future association studies

in order to assess their impact on therapeutic efficacy and/or adverse events. To reach these goals,

blood samples from 360 blood donors were collected on filter cards “FTA Classic Cards”

(Whatman) and genotyped by PCR-RFLP. The frequency of the allelic variants in CYP2B6 gene

were 0,060 (64C>T), 0,426 (516G>T), 0,00 (777C>A), 0,41 (785A>G) and 0,004 (1459C>T),

while the frequency of the wild variant was 0, 183. For the CYP2C8 gene the frequency of the

allelic variants were 0,048, 0,005, 0,16 and 0,00 for 416G>A, 792C>G, 805A>T and 1196A>G,

respectively. No significant difference between mutations frequencies were found between

genders in both genes. No significant differences were found in the distribution of genotype and

haplotype frequencies between individuals from the three geographical regions, showing a

homogeneous distribution of these mutations in our study population. Our results show that

polymorphisms in the genes CYP2B6 and CYP2C8, known to be involved in altered metabolism

of a variety of drugs, occur in the populations studied, confirming the results reported in other

studies in African populations. Thus, further association studies including these genes in order to

reach a better understanding of the importance of these polymorphisms in the treatment of malaria

in these populations are warranted.

A Adenina

a.C Antes de Cristo

ACT

Artemisinine Combination Therapy-Terapia combinada com derivados de artemisinina

AL Arteméter mais Lumefantrina

Artesunato

Amodiaquina

AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

BSA Albumina de Soro Bovino

C Citosina

CAR Constitutive Androstane Receptor

CoA Coenzima A

CNBS

Comitê Nacional de Bioética para Saúde

CYP450 Citocromo P450

DDT

Dicloro-difenil-tricloroetano

DMSO Dimethil Sulfoxide

DNA Ácido Desoxirribonucléico

dNTP Deoxinucleotídeos Trifosfato

EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético

FMO Sistema de Monooxigenases contendo Flavina

G Guanina

HCB

Hospital Central da Beira

HCH

Hexaclorociclohexano

HCM

Hospital Central de Maputo

HCN

Hospital Central de Nampula

HGJM

Hospital Geral José Macamo

HGM

Hospital Geral de Mavalane

HRC Hospital Rural de Chokwé

HIV Vírus da Imunodeficiência Adquirida

HPP

Hospital Provincial de Pemba

HRC

Hospital Rural de Chokwé

Interleucina

IC 95% Intervalo de confiança a 95%

MAO Monoamino-Oxidases

MgCl

Cloreto de Magnésio

MISAU

Ministério da Saúde de Moçambique

OMS Organização Mundial da Saúde

OR Odds Ratio- Razão de Chance

pb Pares de Base

PBREM

Phenobarbital-responsive enhancer module

PCR Polimerase Chain Reaction-Reação de Polimerização em Cadeia

PNCM

Programa Nacional de Controle da Malária

PXR Pregnane X Receptor

RNA Ácido Ribonucléico

RPM Rotações por minuto

RFLP

Reaction Fragment Lengh Polymorphism- Polimorfismo do tamanho de fragmento de restrição

SERCA

Sarco-endoplasmic reticulum calcium

SNPs Polimorfismos de Base Única

T Timina

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris Borato-EDTA

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TE Tris-EDTA

TNF

Fator de Necrose Tumoral

Tris Trishidroximetilamino Metano

WHO World Heath Organization - Organização Mundial da Saúde

VNTR

Variable Number of Tandem Repeats

xii

FIGURA 2.1. Estimativa de incidência de malária por 1000 habitantes no mundo...................

FIGURA 2.2. Distribuição da malária em Moçambique.............................................................

FIGURA 2.3. Ciclo biológico do Plasmodium falciparum.........................................................

FIGURA 2.4. Eritrócito infectado por Plasmodium falciparum.................................................

FIGURA 2.5. Local de ação das drogas antimaláricas................................................................

FIGURA 2.6. Biotransformação da artemisinina em seus derivados..........................................

FIGURA 2.7. Biotransformação da amodiaquina em N-desethylamodiaquina..........................

FIGURA 2.8. Relação entre farmacocinética e farmacodinâmica..............................................

FIGURA 2.9. Principais mecanismos moleculares que podem causar alterações no metabo-

lismo de fármacos................................................................................................

FIGURA 2.10. Esquema da reação do CYP450..........................................................................

FIGURA 2.11. Percentual das isoformas do sistema CYP450 no fígado e exemplos de subs-

tratos, inibidores e indutores................................................................................

FIGURA 2.12. Nomenclatura das isoenzimas da superfamília CYP450....................................

FIGURA 2.13. Distribuição das mutações não-sinôminas estudadas no gene CYP2B6.............

FIGURA 2.14. Distribuição das mutações estudadas no gene CYP2C8.....................................

FIGURA 4.1. Mapa de Moçambique ilustrando os locais de coleta de amostras nas três

regiões..................................................................................................................

FIGURA 4.2. Gene CYP2B6, estratégia de amplificação...........................................................

FIGURA 4.3. Ilustração da estratégia de amplificação do gene CYP2B6, alelos *2, *3, *4,*5

e *9 e a representação do resultado obtido após a digestão utilizando as

enzimas Hae II, Bsr I, Sty I e Bgl II em gel de agarose 2%.................................

FIGURA 4.4. Gene CYP2C8, estratégia de amplificação...........................................................

FIGURA 4.5. Gene CYP2C8*2, *3 e *4, com estratégia de amplificação. Representação do

resultado obtido após a digestão utilizando as enzimas Bcl I, Bse RI, Xmn I e

Taq I em gel de agarose 4%.................................................................................

FIGURA 4.6. Ilustração da placa de sequenciamento.................................................................

FIGURA 4.7. Ilustração da página inicial do programa SeqScape.............................................

FIGURA 4.8. Ilustração da janela do programa SeqScape v.2.6 onde pode ser observado o

alinhamento das amostras e as sequências referência e consenso ......................

xiii

FIGURA 4.9. Ilustração da janela do programa SeqScape v.2.6, onde pode ser observada

uma amostra na qual foi identificada uma mutação............................................

FIGURA 4.10. Identificação dos SNPs através da visualização do cromatograma no

programa SeqScape, mostrando os três possíveis genótipos...............................

FIGURA 5.1. Gel de agarose 2% mostrando a padronização da PCR em amostras de DNA

no cartão de filtro FTA.......................................................................................

FIGURA 5.2. Gel de agarose 2% ilustrando a amplificação do gene CYP2B6 para a geno-

tipagem dos alelos CYP2B6*2, *3, *4, *5, *6, *7 e *9................

.......................

FIGURA 5.3. Eletroforese em gel de agarose 2% mostrando o perfil de restrição após a

digestão do material amplificado para os sistemas CYP2B6*2 (64C>T) e *5

(1459C>T.............................................................................................................

FIGURA 5.4. Eletroforese em gel de agarose a 2% mostrando o perfil de restrição após a

digestão do material amplificado para os sistemas CYP2B6*3 (777C>A),*6

(516G>T, 785A>G), *7 (516G>T, 785A>G, 1459C>T) e *9 (516G>T)...........

FIGURA 5.5. Gel de agarose 4% ilustrando a amplificação do gene CYP2C8 (exons 3, 5 e 8)

para a genotipagem dos alelos CYP2C8*2, *3 e *4

............................................

FIGURA 5.6. Gel de agarose 4% ilustrando a digestão do material amplificado dos sistemas

CYP2C8*2, *3 e*4...............................................................................................

FIGURA 5.7. Identificação do SNP 516G>T no gene CYP2B6, visualizado através do

cromatograma apresentado pelo programa SeqScape.........................................

xiv

TABELA 2.1. Principais enzimas e vias de metabolização de drogas.....................................

TABELA 2.2. Diferentes classes terapêuticas de fármacos biotransformados por enzimas

codificadas por CYP2B6...................................................................................

TABELA 2.3. Distribuição dos SNPs frequentemente reportados em diferentes

populações........................................................................................................

TABELA 2.4. Diferentes classes terapêuticas de fármacos metabolizados pela CYP2C8,

classificados de acordo a contribuição da isoenzima no seu metabolismo.......

TABELA 2.5. Distribuição das variantes alélicas encontradas no gene CYP2C8 em

diversas populações..........................................................................................

TABELA 5.1. Protocolos padronizados utilizados para a amplificação do gene CYP2B6,

exons 1, 4, 5 e 9................................................................................................

TABELA 5.2. Protocolos padronizados utilizados para a amplificação do gene CYP2C8,

exons 3, 5 e 8....................................................................................................

TABELA 5.4.1.1. Distribuição das frequências genotípicas absolutas e alélicas dos SNPs

identificados no gene CYP2B6 na população estudada....................................

TABELA 5.4.1.2. Frequências de mutações e suas combinações do gene CYP2B6 entre 360

indivíduos estudados..................................................................................

TABELA 5.4.1.3. Distribuição das frequências alélicas das mutações estudadas no gene

CYP2B6 nas amostras analisados de acordo com o gênero..............................

TABELA 5.4.1.4. Distribuição das frequências alélicas em populações das três regiões

estudadas...........................................................................................................

TABELA 5. 4.1.5. Frequência dos haplótipos identificados no gene CYP2B6.......................

TABELA 5. 4.1.6. Análise da distribuição das frequências haplotípicas por região............... 75

TABELA 5.4.2.1. Distribuição das frequências genotípicas absolutas e alélicas dos SNPs

identificados no gene CYP2C8 na população estudada....................................

TABELA 5.4.2.2. Distribuição das mutações identificadas no gene CYP2C8 entre 360

indivíduos estudados.........................................................................................

TABELA 5.4.2.3. Distribuição das frequências alélicas do gene CYP2C8 encontrados nos

indivíduos analisados de acordo com o gênero................................................

TABELA 5.4.2.4. Distribuição das frequências alélicas em populações das três regiões

estudadas...........................................................................................................

TABELA 5.4.2.5. Frequência dos haplótipos identificados no gene CYP2C8

(n=360)..........

TABELA 5.4.2.5. Distribuição das frequências haplotípicas por região................................. 79

xvi

GRÁFICO 5.1. Distribuição dos indivíduos estudados de acordo com a idade...........

...............

GRÁFICO 5.2. Distribuição dos indivíduos segundo as características de gênero e

ascendência...................................................................................................................................

xvii

2.1.

REVE

ISTÓRICO

................................................................................................................... 4

2.2.

PIDEMIOLOGIA

....................................................................................................................... 6

2.2.1.

LASSIFICAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DA MALÁRIA

................................................................... 7

2.2.2. Situação da malária em Moçambique ............................................................................. 9

ICLO BIOLÓGICO DOS PARASITOS DA MALÁRIA HUMANA

.................................................... 11

2.4.

ATOGÊNESE DA

ALÁRIA

.................................................................................................... 13

2.5.

RATAMENTO

UIMIOTERÁPICO DA

ALÁRIA

...................................................................... 15

2.5.1. Artemisinina .................................................................................................................. 18

2.5.2. Amodiaquina ................................................................................................................. 20

2.6.

ECANISMO DE AÇÃO E VARIABILIDADE NO EFEITO DOS FÁRMACOS

.................................... 21

2.7.

IOTRANSFORMAÇÃO DOS FÁRMACOS

................................................................................... 22

2.8.

ATORES QUE AFETAM A BIOTRANSFORMAÇÃO DE FÁRMACOS

.............................................. 24

2.9.

ARMACOGENÉTICA X

ARMACOGENÔMICA

......................................................................... 25

2.10. Características do Sistema Citocromo P450 ................................................................. 26

2.11. Nomenclatura ................................................................................................................. 28

2.12. Famílias e Subfamílias ................................................................................................... 29

2.12.1. CYP2B6 ....................................................................................................................... 30

2.12.2. CYP2C8 ....................................................................................................................... 36

xviii

3.1.

BJETIVO

ERAL

................................................................................................................... 40

3.2.

BJETIVO

SPECÍFICO

.. ......................................................................................................... 40

4.1.

IPO DE ESTUDO

.................................................................................................................... 41

4.2.

OCAL DO ESTUDO

................................................................................................................ 41

4.3.

ÁLCULO AMOSTRAL

............................................................................................................ 41

4.4.

ERÍODO DE ESTUDO

.............................................................................................................. 41

4.5.

OPULAÇÃO DE ESTUDO

........................................................................................................ 42

4.6.

ELEÇÃO DOS

ARTICIPANTES

............................................................................................... 42

4.6.1. Critérios de inclusão ..................................................................................................... 42

4.6.2. Critérios de exclusão ..................................................................................................... 43

4.7.

ROCEDIMENTOS

ABORATORIAIS

........................................................................................ 43

4.7.1. Coleta de amostras e extração de DNA ........................................................................ 43

4.7.2. Preparação do cartão FTA para a PCR ....................................................................... 43

4.7.3. Amplificação do DNA e Genotipagem .......................................................................... 44

4.7.4. Estratégias de Amplificação .......................................................................................... 44

4.7.4.1. CYP2B6 ...................................................................................................................... 44

4.7.4.2. CYP2C8 ...................................................................................................................... 47

4.7.5. Purificação dos produtos da PCR para o sequenciamento .......................................... 48

4.7.6. Reação de sequenciamento ........................................................................................... 49

4.7.7. Sequenciamento automatizado ...................................................................................... 50

4.7.8. Análise das sequências obtidas através do sequenciamento ......................................... 51

4.8.

MATERIAIS ........................................................................................................................ 56

4.8.1. Detecção dos produtos amplificados ............................................................................ 56

4.8.2. Digestão dos produtos amplificados por enzimas de restrição. ................................... 56

4.9.

ANÁLISE

DOS

DADOS ...................................................................................................... 59

4.10.

ASPECTOS

ÉTICOS ......................................................................................................... 59

4.11.

SUPORTE

FINANCEIRO ................................................................................................. 59

5.1.

ARACTERÍSTICAS DOS INDIVÍDUOS ESTUDADOS

................................................................... 60

xix

5.2.

ADRONIZAÇÃO DOS PROCEDIMENTOS TÉCNICOS UTILIZADOS

.............................................. 61

5.2.1. Sistemas CYP2B6*2,*3,*4,*5,*6, *7 e *9 .................................................................... 61

5.3.

EQUENCIAMENTO E ANÁLISE DOS

SNP

S ENCONTRADOS NOS GENES

CYP2B6

CYP2C8,

ATRAVÉS DO

“S

CAPE

”. ..................................................................................................... 68

NÁLISE DESCRITIVA DOS POLIMORFISMOS NA POPULAÇÃO ESTUDADA

. .............................. 70

5.4.1. Gene CYP2B6 ................................................................................................................ 70

5.4.2. Gene CYP2C8 ................................................................................................................ 75

6.1.

NÁLISE DAS FREQUÊNCIAS DOS POLIMORFISMOS ESTUDADOS NO GENE

CYP2B6 ............... 81

6.2.

NÁLISE DAS FREQUÊNCIAS DOS POLIMORFISMOS ESTUDADOS NO GENE

CYP2C8 ............... 86

6.4.

ONSIDERAÇÕES FINAIS

........................................................................................................ 89

INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

A malária é uma doença parasitária, na maioria dos casos febril e aguda de elevada

prevalência e morbidade, causada pelo protozoário do gênero Plasmodium, um parasito

intracelular que se transmite de pessoa a pessoa por fêmeas de mosquitos do gênero Anopheles.

Em sua forma típica a infecção é caracterizada por acessos febris com intervalos que variam de

um a três dias dependendo da espécie de parasito infectante, acompanhado de cefaléias, calafrios,

tremores e sudorese intensa, podendo ocorrer formas leves e assintomáticas em casos de baixa

parasitemia principalmente em indivíduos com imunidade parcial adquirida por infecções

anteriores. Apesar de importantes avanços no entendimento da doença, a malária ainda é um dos

principais problemas de saúde pública nos países tropicais. Estima-se que cerca de 300 a 500

milhões de novos episódios de malária ocorrem por ano, com uma alta taxa de mortalidade,

especialmente na África sub-Sahariana, onde se estima que quase um milhão de crianças morre

anualmente devido à doença (Snow et al., 1999; Suh et al., 2004; WHO, 2006).

A malária ocorre principalmente nos países da África, Ásia e América Latina,

principalmente devido às precárias condições socioeconômicas e as deficiências nas políticas de

saúde pública destes locais. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a malária

representa cerca de 10% do total de doenças presentes em África, sendo responsável por 30-50%

dos internamentos e até 50% das visitas ambulatoriais em unidades hospitalares em áreas com

alta transmissão (WHO, 2002). Segundo Whitehead e colaboradores, 2001, isto resulta da

combinação de diversos fatores como: as condições climáticas e ecológicas ideais para a

reprodução do mosquito vetor (Anopheles spp), a predominância da espécie mais virulenta, o

Plasmodium falciparum (P. falciparum) na sub-região e a ineficiência dos programas de controle

devido à limitação de recursos e a instabilidade socioeconômica (Whitehead et al., 2001).

Devido a não disponibilidade de uma vacina contra a malária, o tratamento

quimioterápico e profilático constitui um dos principais instrumentos de controle da mesma. Nos

últimos 70 anos, desde a introdução de antimaláricos sintéticos, apenas um pequeno número de

drogas antimaláricas têm sido considerado adequado para uso clínico. No entanto, o

desenvolvimento de cepas de parasitos resistentes às drogas disponíveis, acompanhado da

dificuldade na área de descoberta/desenvolvimento de novas drogas, constitui os principais

problemas no controle da doença (Winstanley, 2000; Na-Bangchang e Karbwang, 2009). Em

paralelo, o conhecimento sobre os mecanismos básicos da farmacocinética e farmacodinâmica,

INTRODUÇÃO

bem como a contribuição de fatores genéticos do hospedeiro, particularmente associados com o

metabolismo das principais classes de antimaláricos usados para o tratamento da malária nas

diferentes populações das áreas endêmicas ainda é limitado (Guzmán e

Carmona-Fonseca, 2006;

Mehlotra et al., 2006).

Sabe-se hoje que as variações em genes que codificam para as enzimas do citocromo

P450 (CYP450) têm um impacto importante sobre o metabolismo dos medicamentos (Code et

al., 1997; Lang et al., 2001), podendo contribuir de forma significativa para as diferenças

interindividuais tanto em relação à resposta imunológica como terapêutica (Guengerich, 2001). O

sistema P450 é uma superfamília de enzimas que desempenha papel fundamental no metabolismo

oxidativo de numerosas reações, incluindo o metabolismo de ácidos graxos, biotransformação

xenobiótica, além da síntese e metabolismo de substratos endógenos (Nebert e Russell, 2002). A

atividade das isoformas do CYP450 pode ser afetada por vários fatores, incluindo fatores

ambientais, genéticos e fisiológicos, que se refletem no metabolismo dos fármacos (Ingelman-

Sundberg et al., 1999; Nebert e Russell, 2002). Polimorfismos genéticos podem determinar as

variações interindividuais tanto na expressão como na atividade, função e estabilidade de diversas

enzimas importantes do sistema CYP450. Dentre as subfamílias de enzimas que compõem o

sistema enzimático CYP450, as subfamílias CYP1, CYP2 e CYP3 são as mais relevantes e

responsáveis pela metabolização da maior parte dos fármacos dependentes do sistema CYP450

(Venkatakrishnan et al., 2001).

No caso específico das drogas antimaláricas, as variações em genes metabolizadores

podem acarretar diferenças na biotransformação dos fármacos, podendo afetar tanto a eficácia

como a toxicidade, além de contribuir para a resistência através da alteração das concentrações

plasmáticas das drogas (Gonzalez, 1992; Hastings et al., 2002; White, 2004). Alguns estudos

realizados em indivíduos saudáveis e infectados com malária mostram variações interindividuais

nos parâmetros farmacocinéticos, efeitos adversos e níveis de toxicidade dependendo da dose e

via de administração dos antimaláricos atualmente utilizados (Krishna et al., 2001; Hien et al.,

2004; Karunajeewa et al., 2006). Assim sendo, acredita-se que a base para esta variabilidade

interindividual da resposta observada nestes estudos pode incluir polimorfismos nos genes

metabolizadores destas drogas. Portanto, a identificação de fatores responsáveis por variações na

biotransformação de fármacos com implicações terapêuticas são de relevância fundamental,

principalmente em zonas endêmicas da malária, onde as populações estão sujeitas a longa

exposição aos medicamentos antimaláricos. Além disso, a determinação de tais variações

INTRODUÇÃO

genéticas poderia não só fornecer o perfil das isoformas do sistema CYP450 na população, como

também permitir a definição de subgrupos potencialmente em risco de efeitos adversos e/ou falha

terapêutica, maximizando a eficácia do tratamento.

Com base no exposto, o presente estudo teve como objetivo estimar a prevalência de

isoformas do CYP450 (CYP2B6 e CYP2C8) em populações de regiões distintas e endêmicas

para a malária em Moçambique.

REVISÃO DA LITERATURA

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Breve Histórico

Conhecida desde a mais remota antiguidade, a malária é uma das doenças parasitárias

com impacto mais profundo na história da humanidade acometendo o homem desde a pré-

história, tendo surgido provavelmente em África de onde se disseminou para outras áreas

tropicais e subtropicais de todo o mundo (Avery et al., 2002). Na história da medicina geral,

dados pré-históricos documentam a ocorrência de doenças sugestivas da malária. O alargamento

do baço (esplenomegalia) documentado em múmias Egípcias à cerca de 3000 a.C, a febre mortal

cíclica e o grande número de remédios supostamente curativos, mencionados nas escrituras de

Papiro de Ebers a 1570 a.C, nos registros antigos na região entre os rios Tigres e Eufrates (~ 2000

a.C) e na Índia (cerca de 1500-800 a.C), sugeriam provável ocorrência de infecção malárica.

A malária era bem conhecida na China muito antes de Cristo. O “Nei Ching” (livro dos

princípios fundamentais da medicina chinesa), elaborado a 2700 a.C, já se refere aos paroxismos

febris, associados ao alargamento do baço (esplenomegalia) e tendência da ocorrência de

epidemias bem como da descrição mitológica da doença que atribuía os sintomas de dor de

cabeça, calafrios e febre, de três demônios relacionando a doença à punição de deuses e à

presença de maus espíritos (Bruce-Chwatt, L.J., 1988; Carter e Mendis, 2002). Várias ervas

chinesas usadas por médicos como remédios, incluindo o Ch'ang Shan (Dichroa febrifuga) e

Qinghaosu (Artemísia annua), hoje reconhecida pela sua potente atividade antimalárica, foram

descritos em manuais de medicina clássica chinesa.

Os registros concretos de febres intermitentes da malária foram documentados a 400 a.C

na Grécia indicando a presença de infecção, que foi caracterizada pelo médico grego Hipócrates

(~ 460-370 a.C) no seu “Livro de Epidemias” como originada por flagelados causadores de

doenças febris semelhantes às causadas por Plasmodium malariae (P. malariae) e Plasmodium

vivax (P. vivax) (Avery et al., 2002). Hipócrates reconheceu a ocorrência sazonal da doença

(verão e outono), a sua relação com o meio ambiente, notando que as febres eram restritas a áreas

pantanosas. Além disso, estabeleceu a relação entre o aumento do baço e os pântanos, embora

nunca tenha colocado a hipótese dos elementos causais envolvidos na gênese dessas doenças

(Gardiner et al., 2005). Posteriormente, diversos médicos gregos e romanos deixaram referências

de que a doença ocorria em epidemias, comprovadas pela citação: “uma doença horrível que vem

todo verão e mata”, ficando conhecida como “Febre Romana” e a expressão mal' aria (mau ar),

REVISÃO DA LITERATURA

foi utilizado para explicar que os vapores emanados dos pântanos eram a origem da doença

(Avery et al., 2002).

Durante quase 1.500 anos se espalhando em todo o mundo, pouco se sabia sobre a doença

e seu tratamento. Até que, no final do século XIX, ocorreu um evento marcante e revolucionário

na história da infecção malárica na população humana que foi a descoberta dos parasitos

causadores da malária por Laveran em 1880. Posteriormente, em 1897, o médico escocês Ronald

Ross, descreveu o modo de transmissão da doença em aves através da picada do mosquito

Anopheles. Em 1898, o médico italiano Batista Grassi (1854-1925) confirmou o mecanismo de

transmissão no homem, recebendo o prêmio Nobel em 1902. A descrição do ciclo esporogônico

do parasito causador da malária humana por Grassi, Marchiafava, Bignami e Ross, culminou com

a descrição do ciclo de transmissão da malária e o mecanismo da disseminação da doença (Gilles

e Lucas, 1998).

Desde essa altura uma abordagem geral para eliminar os fatores que contribuem para a

multiplicação e disseminação de parasitos causadores da malária foi aprovada, particularmente no

sul da Europa. A descoberta da primeira droga antimalárica ocorreu no século XVII com a

observação por missionários jesuítas da utilização por populações indígenas da América do Sul

da casca de uma árvore nativa para o tratamento de alguns tipos de febre. O uso dessa casca

extraído de uma árvore local (que recebeu o nome de “Cinchona”) espalhou-se rapidamente pela

Europa e passou a ser conhecido como “pó dos jesuítas”. O seu princípio ativo, a quinina, foi

isolado em 1820, sendo ainda hoje considerada como uma droga antimalárica efetiva, embora já

tenha sido registrada resistência a mesma (Gardiner et al., 2005).

Durante a primeira metade do século XX, muitas pesquisas foram dedicadas ao controle

da malária, especialmente no sentido de reduzir ou eliminar a presença de criadouros do inseto

transmissor. As atividades de controle da malária através da gestão ambiental foram efetivadas

com sucesso em vastas áreas da Ásia, Europa e Américas (Ault, 1994; Najera, 2001).

Simultaneamente, o desenvolvimento de antimaláricos sintéticos (como a cloroquina e a

primaquina) e outros compostos sintéticos com atividade inseticida como o dicloro-difenil-

tricloroetano (DDT) e hexaclorociclohexano (HCH ou BHC), deram mais ímpeto na melhoria das

técnicas de controle da malária (Gardiner et al., 2005).

Aliados as medidas de controle do vetor, o acesso ao diagnóstico laboratorial e o

tratamento eficaz e imediato, possibilitaram uma redução significativa da malária. Porém, ainda

hoje a doença continua a ser um dos principais problemas de saúde em mais de 100 países,

REVISÃO DA LITERATURA

principalmente países em desenvolvimento das regiões tropicais, incluindo África, Ásia e

América Latina (Sachs e Malaney, 2002; WHO, 2008).

2.2. Epidemiologia

Depois de elucidado o ciclo de transmissão da malária, e adotado o conceito da sua

erradicação em 1955, a Organização Mundial da Saúde lançou a campanha global para eliminar a

doença utilizando os poderosos inseticidas “residuais” e drogas antimaláricas altamente eficazes

disponíveis. Essa campanha erradicou a malária em alguns países e reduziu a incidência em

outros. No entanto o ressurgimento da malária foi significante nos últimos 30 anos (Gardiner et

al., 2005). Hoje a malária continua a ser uma das doenças parasitárias que ainda causa mais

mortes em todo mundo, sendo um dos principais problemas de saúde em cerca de 109 países dos

quais a maioria estão situados na África sub-Sahariana (Figura 2.1) (WHO, 2008).

Figura 2.1. Estimativa de incidência de malária por 1000 habitantes no mundo (WHO, 2008: World

Malaria Report. 2008).

O risco de ocorrência de malária depende fundamentalmente da interação entre o

hospedeiro humano, o parasita e o mosquito vetor. O agente etiológico da doença é o protozoário

do gênero Plasmodium, o qual é transmitido por mosquitos do gênero Anopheles. Existem quatro

principais espécies de plasmódio que infectam humanos, a saber: P. falciparum, P. vivax, P.

Estimativa d

a incidência

da malária por 1000 hab.

REVISÃO DA LITERATURA

malariae e P. ovale (Snow et al., 1999). Recentemente, infecções causadas por P. knowlesi têm

sido reportadas no sudeste da Ásia (Gardiner et al., 2005). O P. falciparum é a espécie mais

prevalente e responsável pelo maior número de infecções devido à sua alta virulência, rápida taxa

de reprodução assexuada no hospedeiro vertebrado e a capacidade de sequestramento de

eritrócitos infectados nos vasos sanguíneos de órgãos internos, oferecendo risco elevado de

desenvolvimento da malária cerebral e outras complicações. Adicionalmente, o parasito vem

tornando-se resistente aos antimaláricos comumente usados (Winstanley, 2000). A transmissão

ocorre através da exposição a picadas de mosquitos fêmeas infectantes do gênero Anopheles. Os

mosquitos do complexo Anopheles gambiae e Anopheles funestus são os vetores mais eficazes da

malária humana, implicados na transmissão da doença em várias regiões da África tropical

(Levine et al., 2004).

2.2.1. Classificação epidemiológica da malária

A transmissão da malária flutua em grande parte, com as variações nas características

geográficas, condições climáticas, ecológicas, vetores e da espécie do parasito, bem como a

situação socioeconômica, comportamento e distribuição das populações humanas. Devido à

complexidade epidemiológica em cada área onde a malária ocorre, existem várias formas de

classificação, a saber: intensidade de transmissão, estabilidade de transmissão e estratificação

epidemiológica de risco (Carter e Mendis, 2002). Com base em exames clínicos (exame do baço

ou esplenomegalia), exames laboratoriais e entomológicos ou pela detecção passiva e ativa de

casos (Baird et al., 2002) a classificação da malária dependendo da intensidade de transmissão foi

definida segundo o percentual de baços papáveis em crianças com idade compreendida entre 2 a

9 anos em:

 Holoendêmica - quando mais de 75% das crianças entre 2 e 9 anos têm o baço palpável

com índice baixo nos adultos.

 Hiperendêmica - quando um percentual de 50 a 75% das crianças dos 2 a 9 anos possuem

baço aumentado e o índice esplênico nos adulto for também elevado.

 Mesoendêmica - quando entre 11 e 50% das crianças entre 2 e 9 anos têm esplenomegalia.

 Hipoendêmica - quando menos de 10% das crianças com idade entre 2 e 9 anos têm

esplenomegalia.

REVISÃO DA LITERATURA

Segundo a estabilidade, a endemicidade da malária é classificada em estável e instável:

áreas com malária estável são áreas nas quais existe uma intensa transmissão do Plasmodium e as

pessoas estão constantemente expostas assegurando o desenvolvimento de imunidade contra a

malária exceto para as crianças de baixa idade que em pouco tempo vão ter a sua primeira

experiência com o parasita. Nestas áreas de malária estável os adultos são normalmente

assintomáticos ou oligossintomáticos e apresentam uma baixa parasitemia. Áreas com malária

instável são áreas nas quais a intensidade de transmissão não é tão alta e a incidência varia de

mês para mês ou de ano para ano. Encontram-se nos locais onde a espécie vetora pica o homem

de modo infrequente, e para que exista transmissão é necessária uma densidade alta do vetor.

Nestas áreas o grau de imunidade da população é muito variável, sendo que as crianças

frequentemente escapam da infecção; porém, pode aparecer malária epidêmica que representa

uma forma extrema de malária instável que ocorre quando a população ou um pequeno grupo de

pessoas está exposto a um aumento nas taxas de transmissão num determinado momento do

tempo.

Devido a uma série de situações epidemiológicas existentes em cada país ou região, a

realidade sobre o risco de malária também é estudada em cada lugar. A Organização Mundial da

Saúde estabeleceu a estratificação epidemiológica do risco da malária classificando em áreas de

alto, médio, baixo e sem risco dependendo do índice parasitário anual (IPA), uma medida

malariométrica construída usando como numerador o número de casos de malária num

determinado ano e num local específico e como denominador a população em risco desse lugar

para o mesmo período de tempo por cada mil habitantes. Por exemplo, no Brasil as áreas de risco

de malária são divididas em: Alto risco: IPA≥50, Risco médio: IPA≥10 e ≤50, Baixo risco:

IPA>1 e <10 e Sem risco: IPA <1.

REVISÃO DA LITERATURA

2.2.2. Situação da malária em Moçambique

Em Moçambique, a malária apresenta alto risco de transmissão em quase todo o país

devido às condições ambientais e socioeconômicas que favorecem a proliferação do mosquito

vetor e a exposição da população (Figura 2.2). A maior parte dos casos é observada nas regiões

rurais, onde vive a maioria da população. A malária é endêmica em todo o país, variando entre as

áreas mesoendêmicas e hiperendêmicas; a transmissão é perene, com picos durante e após a

estação das chuvas. No entanto, esta pode variar dependendo da quantidade de chuva e

temperatura do ar observado em cada ano e também em função das condições locais específicas.

O Plasmodium falciparum é a espécie mais frequente e responsável por cerca de 90% de todas as

infecções maláricas, sendo também associada aos casos mais graves da doença.

Em Moçambique a malária é causa comum da procura pelos cuidados de saúde e de

internamentos nas enfermarias dos hospitais do país. A doença representa cerca de 40% do total

das consultas externas e 60% de todos os internamentos em pediatrias dos hospitais rurais e

gerais em todo o País. Adicionalmente, a malária contribui para a elevada taxa de mortalidade

materna (1.500 por 100.000 nascimentos) com uma taxa de letalidade variando entre 1,8 e 9,9%.

É também o maior problema em mulheres grávidas nas zonas rurais. Aproximadamente 34% das

mulheres grávidas estão infectadas pelo parasito, sendo as primigrávidas as mais afetadas, com

uma prevalência de 31%. A anemia associada à malária é também um grave problema e acomete

68% das mulheres grávidas (MISAU/PNCM, 2007b).

As principais estratégias do controle da malária incluem: o controle do vetor

(pulverização, uso de redes mosquiteiras tratadas com insecticidas, larvicidas, saneamento do

meio e eliminação de charcos), a educação para a saúde e o manejo adequado dos casos

sintomáticos. O manejo de casos consiste no diagnóstico precoce e correcto (clínico e

laboratorial) e tratamento precoce e eficaz da doença.

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.2. Distribuição da malária em Moçambique

(http://www.mara.org.za/pdfmaps/MozDistribution.PDF)

REVISÃO DA LITERATURA

2. 3. Ciclo biológico dos parasitos da malária humana

O ciclo biológico dos protozoários da família Plasmodidae é caracterizado por duas fases

de multiplicação. A fase assexuada (esquizogônica), que ocorre no hospedeiro vertebrado e a fase

sexuada (esporogônica) que tem lugar no hospedeiro invertebrado, o mosquito do gênero

Anopheles (Figura 2.3).

Os seres humanos habitualmente se infectam por esporozoítos contidos nas glândulas

salivares de mosquitos fêmeas infectados, que ao picarem o homem para tomar a sua refeição de

sangue, inoculam-nos na pele. Após inoculação, os esporozoítos permanecem na pele por até 3

horas, de onde se movem ativamente de forma aleatória, até que encontrem um vaso sanguíneo e,

nela penetram e alcançam a circulação sanguínea. No entanto, nem todos os esporozoítos

alcançam a corrente sanguínea, alguns permanecem no local da picada, sendo provavelmente

eliminados por células fagocíticas, outros escapam da destruição e permanecem na pele,

tornando-se intracelulares, e cerca de 20% entram na circulação linfática e atigem os linfonodos,

onde são eventualmente degradados. Os esporozoítos que alcançam a corrente sanguínea chegam

ao fígado e invadem os hepatócitos por um processo mediado por moléculas de adesão da

proteína parasitária denominada circunsporozoíta (CSP). Estas proteínas cobrem a superfície dos

esporozoítos, com proteoglicanos permitindo a passagem destes pela camada de células

sinusoidais como células de passagem. Depois de atravessar esta camada, os esporozoítos iniciam

o processo de invasão dos hepatócitos através do reconhecimento das moléculas sulfatadas da

membrana destes, mediada pela proteína CSP as quais se aderem, penetram sem ruptura da

membrana plasmática da célula hospedeira resultando na formação do vacúolo parasitóforo. No

interior dos hepatócitos, os esporozoitos se desenvolvem por esquizogonia, dando origem a

esquizontes tissulares que evoluem para estágios invasivos denominados merozoítos. Esta fase do

ciclo é denominada pré-eritrocítica com a duração de 5 a 15 dias (período prepatente)

dependendo da espécie de Plasmódio e da premunição do indivíduo infectado. Ao final desta

fase, os hepatócitos sofrem ruptura, com liberação de 10.000-30.000 merozoítos na corrente

sanguínea, que se fixam aos eritrócitos da circulação e neles penetram tornando-se parasitos

intracelulares móveis, denominados trofozoítos. Dentro do eritrócito, o parasita amadurece e

passa por uma fase de multiplicação que constitui o estágio eritrocítico. No caso de infecções por

P. vivax e P. ovale os parasitos podem permanecer dormentes, como hipnozoítos no fígado,

durante anos antes de desenvolver infecção clínica, podendo assim resultar em recidivas após

REVISÃO DA LITERATURA

longos períodos da infecção inicial. Durante a fase eritrocítica, o parasita modifica o ambiente no

interior do eritrócito tornando-o habitat adequado para a sua sobrevivência. A membrana

eritrocitária torna-se mais permeável a pequenas moléculas e metabólitos necessários para o

crescimento do parasita.

O desenvolvimento e multiplicação assexuada dos parasitas no interior dos eritrócitos

constituem o estágio eritrocítico e resulta na formação de trofozoítos e esquizontes maduros. Os

eritrócitos contendo esquizontes rompem-se liberando de 8 a 24 merozoítos, que são responsáveis

pelas crises febris ou “paroxismos” malariais. Os merozoítos liberados podem invadir outros

eritrócitos repetindo o ciclo. A duração do ciclo eritrocitário é de 48 horas para o P. vivax, P.

ovale e P. falciparum e 72 horas para P. malariae. No decurso da fase eritrocitária, alguns dos

merozoítos se diferenciam em formas sexuais (gametócitos), porém, os mecanismos que estão

envolvidos neste desenvolvimento diferencial ainda não foram esclarecidos. Os gametócitos

formados ao serem novamente ingeridos pelo mosquito iniciam com o ciclo sexuado. Os

gametócitos masculinos e femininos ao serem ingeridos pelo mosquito são liberados no intestino

do inseto, onde ocorre a divisão do núcleo dos gametócitos masculinos em oito microgametas

flagelados que deixam os eritrócitos e se movem ativamente para fertilizar um macrogameta

(gametócito feminino), formando o “zigoto”. Em seguida, o zigoto dentro do intestino, se

desenvolve num oocineto móvel que penetra o epitélio do intestino médio e fixa-se por baixo da

lâmina basal formando um oocisto. O oocisto fixado na lâmina basal amadurece e dá origem a

esporozoítos que se movem através do hemocelo e se acumulam nas células acinais da glândula

salivar, estando prontos para infectarem novo hospedeiro ao serem inoculados no próximo

repasto do mosquito (Good et al., 2005).

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.3. Ciclo biológico do Plasmodium falciparum (Good et al., 2005).

2.4. Patogênese da Malária

A infecção malárica é assintomática durante a fase pré-eritrocítica. Os sintomas da

malária começam a manifestar-se durante a fase eritrocítica da infecção, podendo se apresentar

com grande variedade. Normalmente, os indivíduos infectados apresentam episódios de febre que

são acompanhados de tremores ou “calafrios”. Estes “paroxismos” de febre e calafrios são os

sintomas clássicos da malária, embora, naturalmente, possam ocorrer em outras doenças

(Mackintosh et al., 2004). Em geral, a patogênese da infecção é muito complexa e reflete a

interação entre fatores do hospedeiro e do parasito, incluindo o envolvimento de mecanismos

imunológicos relacionados com a manifestação clínica da doença (Dondorp et al., 2004).

REVISÃO DA LITERATURA

O processo é iniciado quando os esporozoítos de Plasmodium entram nas células

hepáticas do hospedeiro logo após a inoculação na circulação sanguínea. Em poucos dias os

esporozoítos inoculados se desenvolvem em esquizontes durante o ciclo pré-eritrocítico que se

rompem liberando enorme quantidade de merozoítos que invadem os eritrócitos (Figura 2.4). Os

distúrbios circulatórios generalizados são decorrentes da invasão e destruição dos eritrócitos, e

dos efeitos de produtos de excreção do parasito, material celular do hospedeiro e os complexos de

anticorpos que estimulam os macrófagos e as células endoteliais para a liberação de citocinas

pró-inflamatórias. Na malária grave ocorre secreção em cascata de citocinas como o fator de

necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1ß) e interferon gama (IFN-γ) que por sua

vez induzem a liberação de outras citocinas, incluindo interleucina-8 (IL-8), interleucina-12 (IL-

12) e interleucina-18 (IL-18) (Weatherall et al., 2002). Simultaneamente, são também liberadas

citocinas antiinflamatórias como a interleucina-6 (IL-6) e a interleucina-10 (IL-10) (Keller et al.,

2004; Good et al., 2005). A maior parte dos sinais e sintomas da malária, particularmente os

“paroxismos maláricos” como calafrios e tremores, sensação de calor e cefaléia intensa, queda de

temperatura, sudorese e febre devem-se a ação das citocinas. Estas são também envolvidas na

disfunção placentária, supressão da eritropoiese, disfunção hepática e inibição da gliconeogênese

(Luty et al., 2000).

Na malária causada por P. falciparum pode ocorrer o sequestro dos eritrócitos infectados,

caracterizado pelo seu “desaparecimento” do sangue periférico devido à formação de

protuberâncias ou knobs na superfície dos eritrócitos infectados permitindo a adesão destes nas

células do endotélio vascular, fenômeno conhecido por citoaderência. Este fenômeno pode

resultar num bloqueo do fluxo sanguíneo através dos capilares e vênulas afetadas, provocando

obstrução da microcirculação e o fluxo de oxigênio, levando a glicólise anaeróbia e acidose

láctica (Mackintosh et al., 2004). Quando esta obstrução ocorre em órgãos vitais (cérebro e rins)

pode resultar em complicações fatais, tais como insuficiência renal, coma e malária cerebral

(Dondrop et al., 2004; Mackintosh et al., 2004).

Em indivíduos não imunes, incluindo viajantes provenientes de regiões não endêmicas à

malária e crianças com idade inferior a cinco anos, a malária causada por P. falciparum é

indicado um diagnóstico e início imediato do tratamento, devido à alta propensão de

desenvolvimento de complicações com alto risco de morte.

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.4. Eritrócito infectado por Plasmodium falciparum (http://wiz2.

pharm. wayne.edu/module/antiparasitic.html).

2.5. Tratamento Quimioterápico da Malária

Em geral, o tratamento quimioterápico e profilático da malária destina-se a eliminação das

formas do parasito que se multiplicam na circulação sanguínea, de modo a reduzir e eliminar a

parasitemia nos indivíduos infectados, assim como o bloqueio da ligação entre os estágios

exoeritrocítico e eritrocítico, impedindo assim o desenvolvimento de ataques de malária. No caso

de infecções causadas por P. vivax, P. ovale, o tratamento também é destinado à eliminação de

formas dormentes do parasito no fígado, a fim de evitar recaídas.

Os medicamentos antimaláricos podem ser utilizados na profilaxia assim como no

tratamento de ataques agudos. Desta forma podem ser classificados de diferentes formas. A

forma mais comumente utilizada baseia-se no modo de atuação das drogas nos diferentes estágios

do ciclo biológico do parasito. Sendo assim, os fármacos antimaláricos são classificados em:

agentes esquizonticidas sanguíneos; agentes esquizonticidas teciduais; agentes profiláticos e

agentes que bloqueiam a transmissão entre o homem e o mosquito (Figura 2.5) (Frédérich et al.,

2002).

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.5. Local de ação das drogas antimaláricas (Rang et al., 2001).

Os antimaláricos que atuam sobre as formas eritrocíticas do plasmódio são destinados

para cura clínica ou supressiva, designados esquizonticidas, e utilizados para o tratamento de

ataques agudos. Este grupo inclui as quinolonas, por exemplo, quinina e mefloquina; várias 4-

aminoquinoleinas, como a cloroquina, amodiaquina, halofantrina e antimaláricos que interferem

na síntese do folato, como as sulfonas assim como a artemisinina e seus derivados. Também

fazem parte deste grupo alguns antibióticos, como a tetraciclina e a doxicilina que são utilizados

em combinação com os anteriormente citados. Já as 8-aminoquinoleinas (primaquina e

tafenoquina), atuam sobre formas teciduais do parasito no fígado produzindo a cura radical e

reduzindo a disseminação da infecção através da ação sobre as formas sexuais do parasito (os

gametócitos). Os antimaláricos utilizados para a quimioprofilaxia incluem a cloroquina (excluída

no tratamento da malária devido à resistência), mefloquina, proguanil, pirimetamina, dapsona e

doxiciclina, que atuam no bloqueio da ligação entre os estágios exoeritrocíticos e o eritrocítico. A

primaquina, o proguanil e a pirimetamina são utilizados na prevenção da transmissão, exercendo

REVISÃO DA LITERATURA

ação adicional sobre os gametócitos, prevenindo assim o aumento na carga de parasitos no

reservatório humano (Rang et al., 2001).

Nos países endêmicos, incluindo Moçambique, a quimioterapia da malária é feita

empregando-se uma combinação de medicamentos que vêm sendo utilizado há décadas, como

tratamento padrão. Estes incluem entre outros a cloroquina, mefloquina, quinina,

sulfadoxina/pirimetamina e amodiaquina. Contudo, devido ao surgimento e disseminação de

cepas de P. falciparum resistentes, a sensibilidade a estas drogas é limitada (Balint, 2001; Olliaro

e Taylor, 2003;). A artemisinina e seus derivados semi-sintéticos, artesunato, dihidroartemisinina,

artemeter, arteeter e artelinato, constituem a única classe de antimaláricos para os quais ainda não

foi registrada resistência. São medicamentos com ação mais potente e rápida contra o plasmódio

(Noedl, 2005). Apesar da sua longa história de uso na China, estas drogas só recentemente

ficaram disponíveis a nível mundial para o tratamento da malária, sendo normalmente utilizados

em combinações fixas com outras drogas de diferentes mecanismos de ação e alvos moleculares,

como a amodiaquina, pirimetamina, mefloquina, sulfadoxina ou lumefantrina (Wilairatana et al.,

2002; German & Aweeka, 2008). No atual cenário, para reduzir o aparecimento de cepas

resistentes de P. falciparum é recomendada como terapia ideal da malária não complicada a

combinação fixa de medicamentos antimaláricos, utilizando derivados de artemisinina

“Artemisinine Combination Therapy” (ACT) (Whitty et al., 2004). Nesse contexto, as principais

combinações fixas recomendadas pela OMS incluem: (artesunato+amodiaquina,

artemeter+lumefantrina, artesunato+mefloquina e artesunato+sulfadoxina-pirimetamina).

Em Moçambique os esquemas de tratamento da malária adotados pelo Ministério da

Saúde, no âmbito da terapia combinada (ACT) variam de acordo com a classificação do paciente.

Basicamente, o tratamento consiste em três linhas: a primeira linha que compreende a

administração da combinação da dose fixa de Arteméter + Lumefantrina (AL), em dose única,

imediatamente após o diagnóstico, de um a quatro comprimidos duas vezes ao dia de 20mg de

arteméter e 120 mg de lumefantrina por comprimido, durante três dias consecutivos. A segunda

linha compreende a co-administração por três dias consecutivos de Artesunato + Amodiaquina

(AS + AQ) (4 mg/kg e 10 mg/kg de peso/dia respectivamente). Para os casos de pacientes com

contra-indicações às duas linhas anteriores, como malária grave ou resistente é proposta a terceira

linha de tratamento na base de Quinino, administrado por via oral ou intravenosa

(MISAU/PNCM, 2007a).

REVISÃO DA LITERATURA

2.5.1. Artemisinina

A artemisinina e seus derivados representam a classe de antimaláricos mais importantes

até hoje conhecida. A artemisinina é um extrato químico obtido da Artemisia annua L., utilizada

na China há mais de 2.000 anos, onde é denominada Qing hao. O seu princípio ativo, qinghaosu

ou artemisinina, foi purificado em 1972 e testado com sucesso no tratamento da malária em 1979

(Klayman et al., 1985). Entretanto, só a partir da década de 80 houve a sua disseminação mundial

(Lee et al., 2002). É uma lactona sesquiterpênica que contém em sua estrutura uma função

endoperoxidase a qual se atribuiu a sua potente atividade antimalárica e alto índice terapêutico

em relação aos outros antimaláricos. A artemisinina é um esquizonticida sanguíneo de ação

rápida e eficaz no tratamento de ataques agudos da malária, incluindo cepas de P. falciparum

multidroga resistentes bem como a malária cerebral. Os seus análogos sintéticos (artesunato,

arteméter e arteter) são hidrossolúveis, exibem maior atividade antimalárica, sendo bem

absorvidos (van Agtmael et al., 1999). A biotransformação da artemisinina ocorre no fígado,

principalmente através de reação de fase I e desalquilação oxidativa por enzimas do citocromo

P450 e outros sistemas enzimáticos. São rapidamente absorvidas após administração oral e possui

um período de meia vida de 1 a 3 horas após a ingestão. A metabolização da artemisinina é

mediada primariamente pela enzima CYP2B6, com contribuição secundária de CYP3A4 e

CYP2A6 (Svensson e Ashton, 1999) (Figura 2.6). A artemisinina é um potente indutor do próprio

metabolismo e outras famílias do citocromo P450 como o CYP2C19 (Svensson e Ashton, 1999;

Burk et al., 2005). Essa indução enzimática pode resultar em interações com outras drogas,

levando-se em conta que a artemisinina é administrada em associação com outras drogas que são

substratos do citocromo P450 (Giao e de Vries, 2001).

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.6. Biotransformação da artemisinina em seus derivados (Kerb et al., 2009).

O mecanismo de ação da artemisinina ainda não é bem conhecido, podendo, no entanto,

envolver a lesão da membrana do parasito por radicais livres gerados após a clivagem da ligação

peróxido em sua estrutura ou alquilação covalente das proteínas (Wu, 2002). Basicamente, mais

de 70% da hemoglobina do eritrócito infectado é digerida resultando na liberação da heme e

ferro

durante a fase eritrocítica do parasito. O grupamento heme liberado é extremamente

tóxico para o parasita sendo, no entanto, neutralizado através da polimerização em hemozoína.

Além disso, os plasmódios são ricos em grupamentos heme e ferro

resultantes da proteólise da

hemoglobina dos eritrócitos infectados. A interação da artemisinina com o grupamento heme no

interior do parasita induz a clivagem da ponte peróxido liberando radicais livres (Meshnick et al.,

1991). Estes radicais são a chave principal das reações químicas responsáveis pelo estresse

oxidativo e danos no sistema membranar do parasito que o levam a morte.

Outro mecanismo de ação da artimisinina ainda não muito bem esclarecido inclui a

inibição da enzima do retículo sarcoendoplasmático Ca

ATPase (SERCA) do P. falciparum,

com grande especificidade, comprometendo o transporte membranar do parasito mediado por

esta enzima (Eckstein-Ludwig et al., 2003; Golenser et al., 2006).

Artemisinina

Deoxidihidro-

artemisinina

Deoxi-

artemisinina

9,10-dihidro-

artemisinina

Metabólitos inativos

Compostos ativos

Dihidroartemisinina

Cristal -7

REVISÃO DA LITERATURA

2.5.2. Amodiaquina

A amodiaquina é uma 4-aminoquinoleina que tem sido amplamente utilizada para o

tratamento da malária ao longo dos últimos 50 anos. É altamente eficaz contra os estágios

eritrocitários de todas as quatro espécies de Plasmodium e cepas de P. falciparum resistentes à

cloroquina. A amodiaquina foi introduzida no tratamento da malária em 1940. No entanto, nos

meados de 1980, a sua administração aumentou bastante devido ao uso profilático principalmente

em viajantes para áreas endêmicas a malária. Contudo, logo surgiram vários relatos sugerindo

altos níveis de toxicidade, particularmente agranulocitose (estimado 1:2.100 usuários com uma

taxa de letalidade de 1:31.000) (Hatton et al., 1986; Phillips-Howard e West, 1990) e

hepatotoxicidade (1:15.600) (Raymond et al., 1989; Phillips-Howard e West, 1990). Em 1990, a

amodiaquina foi removida da lista de drogas antimaláricas pela Organização Mundial da Saúde.

Entretanto, uma revisão posterior sugeriu que a toxicidade da amodiaquina foi primeiramente

observada em indivíduos não africanos que faziam tratamento profilático por longo prazo, tendo

se restabelecido em 1996 como uma opção para o tratamento da malária não complicada (Olliaro

et al., 1996). Com o aparecimento de resistência a cloroquina, a amodiaquina é utilizada para o

tratamento da malária em muitos países da África tanto em associação com outros antimaláricos

bem como em monoterapia. Não obstante, a ocorrência de possíveis efeitos colaterais em longo

prazo resultantes da utilização concomitante continua questionável, especialmente em indivíduos

com longa exposição (Cavaco et al., 2005).

A estrutura da amodiaquina é muito semelhante à cloroquina, diferindo apenas pela

presença do anel aromático (p-hidroxianilina) na sua cadeia lateral (Foley e Tilley, 1998). A sua

biotransformação hepática é catalisada pela enzima CYP2C8 em seu metabólito primário,

designado N-desethylamodiaquina (Rahman et al., 1994; Li et al., 2002) (Figura 2.7). O seu

mecanismo de ação consiste na inibição da digestão da hemoglobina pelo parasito e reduz o

suprimento de aminoácidos necessários para a viabilidade do mesmo. Além disso, através da sua

ligação por afinidade aos grupamentos heme livres, inibe a heme polimerase do parasito, enzima

responsável pela polimerização da heme em pigmento malárico (hemozoína) (O´Neill et al.,

1997).

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.7. Biotransformação da amodiaquina em N-desethylamodiaquina (Gil e Berglund, 2007).

2.6. Mecanismo de ação e variabilidade no efeito dos fármacos

A resposta aos fármacos depende de múltiplos fatores, cujos efeitos podem ser

sinergéticos ou inibitórios. Para que uma droga possa produzir efeitos precisa estar nos seus

locais de ação em concentrações adequadas. Embora a dose e a via de administração sejam

determinantes nas concentrações obtidas, a sua absorção, distribuição, localização nos tecidos e

biotransformação são também determinantes no efeito final da droga. O estudo dos processos de

distribuição das drogas e seus metabólitos nos diferentes tecidos é denominado farmacocinética, e

incluem os mecanismos de absorção, transporte, metabolização e eliminação das drogas. A

farmacodinâmica estuda as interações dos fármacos com os seus alvos, denominados receptores.

A variabilidade de cada um destes fatores pode ter como causa os fatores genéticos ou ambientais

e/ou ambos. Estudos anteriores demonstraram que o metabolismo dos fármacos é determinado

em grande parte por fatores hereditários e, dessa maneira, os fatores genéticos explicam a maior

parte da variação das taxas metabólicas de muitos fármacos (Vesell, 2000). A maioria dos efeitos

da droga tem determinantes poligênicos com a interação de vários produtos gênicos sobre a

farmacocinética e farmacodinâmica, incluindo as diferenças herdadas relacionadas aos receptores

e a deposição das drogas, por exemplo, enzimas metabolizadoras e receptores (Benet, 1996). A

relação entre a absorção, distribuição, ligação, biotransformação das drogas e as consequências

na concentração no local de ação está resumida na figura abaixo (Figura 2.8).

Amodiaquina

N-desethylamodiaquina

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.8. Relação entre farmacocinética e farmacodinâmica (Adaptado de Siest et al., 2003).

2.7. Biotransformação dos fármacos

As substâncias xenobióticas na sua maioria possuem características lipofílicas que

permitem a sua passagem pelas membranas biológicas. Entretanto, as propriedades físico-

químicas dos fármacos dificultam a sua eliminação do organismo. Deste modo, a

biotransformação dos fármacos e outros compostos xenobióticos em metabólitos mais

hidrossolúveis é essencial à sua excreção, bem como à cessação das suas atividades biológicas e

farmacológicas (Buxton, 1996). Em geral, as reações de biotransformação geram metabólitos

inativos mais polares, facilmente excretados pelo organismo. Entretanto, em alguns casos o

organismo produz metabólitos com atividade biológica potente ou propriedades tóxicas (Buxton,

1996).

Os sistemas enzimáticos envolvidos na biotransformação de muitos fármacos estão

localizados principalmente no fígado (retículo endoplasmático liso das células

hepáticas

microssomais), embora possam ser encontrados em outros órgãos, como os pulmões, rins e

epitélio gastrointestinal em menores concentrações (Hardman et al., 1996;

Lin e Lu, 1998

Metabolismo

hepático

REVISÃO DA LITERATURA

O metabolismo ou as reações de biotransformação dos fármacos são classificados em dois

tipos: reações de funcionalização da fase I e reações de biosíntese da fase II (conjugação) (Tabela

2.1). As reações de fase I introduzem ou expõem um grupo funcional (-OH, -NH

ou SH) do

fármaco original convertendo-o em um metabólito mais polar através de reações de oxidação,

redução e hidrólise. Em geral, as reações de fase I dão origem a metabólitos farmacologicamente

inativos, menos ativos ou, em alguns casos, mais ativos que a molécula original. Quando o

metabólito resultante da biotransformação for a forma ativa, o composto original é denominado

pró-fármaco. Os metabólitos provenientes da fase I podem ser eliminados ou participarem das

reações da fase II, denominadas reações de síntese ou de conjugação, que resultam na formação

de uma ligação covalente do fármaco ou metabólito primário com um substrato endógeno como

ácido glicurônico, sulfato, glutationa, aminoácidos ou acetato. Em geral, esses conjugados são

altamente polares e inativos sendo rapidamente excretados na urina e nas fezes (Hardman et al.,

1996).

Tabela 2.1. Principais enzimas e vias de metabolização de drogas.

Classe de

Enzimas

Tipo de reação Enzimas

Fase I

Oxidação

Hidroxilação, N-e O-Desalquilação,

desaminação

Sistema de monooxigenases do citocromo P450

Desalogenação oxidativa

N-e S-Oxidação Sistema de monooxigenases contendo flavina

(FMO)

Desidratação Álcool desidrogenase e aldeído desidrogenase

Desidratação de aminas Monoamino-oxidase

Redução

Redução de compostos de carbonil Carbonil redutases

Hidrólise

Hidrólise de epóxidos Epóxido hidrolase

Hidrólise de ésteres Carboxilesterases

Hidrólise de peptídeos Peptidases

Outros

Oxidação de ánions de superóxidos Superóxidos desmutases

Oxidação de peróxidos Peroxidases

Fase II

Conjugação Glucuronosilação UDP-glicuronil transferase

Sulfonação Sulfotransferases

Acetilação N-acetiltransferases

Metilação O-, N e S-metiltransferases

Glutationa S-conjugação Glutationa S-transferases

REVISÃO DA LITERATURA

2.8. Fatores que afetam a biotransformação de fármacos

A variação na biotransformação de xenobióticos e na resposta ao tratamento por um

determinado fármaco é extensa e pode ser decorrente de vários fatores que incluem fatores

genéticos, idade, sexo, fisiologia do indivíduo, uso concomitante de outras substâncias que

induzem ou inibem enzimas biotransformadoras, além de doenças hepáticas e a interação entre

fármacos. Sabe-se, no entanto, que os fatores genéticos representam uma importante fonte destas

variações. Normalmente, tais fatores são polimorfismos existentes nos genes que codificam para

enzimas biotransformadoras de fármacos que, dependendo da sua localização no gene, podem

resultar em alterações na expressão e/ou na atividade de sítios de ligação de medicamentos

(Weinshilboum, 2003), na diminuição da estabilidade do RNA mensageiro correspondente, ou

ainda em uma modificação da estrutura conformacional da proteína. Como consequência, essas

alterações podem levar à redução ou aumento da atividade da proteína codificada e até mesmo na

ausência da enzima (Thorisson e Stein, 2003) (Figura 2.9).

Figura 2.9. Principais mecanismos moleculares que podem causar alterações no metabolismo de

fármacos.

REVISÃO DA LITERATURA

2.9. Farmacogenética x Farmacogenômica

Há muito tempo se sabe que pacientes tratados com as mais diversas drogas apresentam

variabilidade de resposta e de susceptibilidade ou toxicidade aos medicamentos. Essas variações

podem ser decorrentes de vários fatores. Considerando que os fatores genéticos podem contribuir

para a maior parte das variações interindividuais na resposta a muitos medicamentos comumente

usados, a farmacogenética e a farmacogenômica vêm sendo promovidos recentemente. A

farmacogenética é o estudo das variações genéticas responsáveis pelas respostas variáveis aos

medicamentos incluindo diferenças na eficácia, interações entre drogas e risco de

desenvolvimento de reações adversas, ou seja, como a hereditariedade afeta a resposta à droga

(Ingelman-Sunderberg, 2001). Já a farmacogenômica estuda como a identificação sistemática de

todos os genes humanos, seus produtos, a variação inter e intra-individual na expressão e função

dos mesmos podem ser utilizados tanto para prever um tratamento ideal para cada indivíduo

assim como para projetar novos medicamentos. O termo farmacogenômica foi criado no âmbito

do projeto do genoma humano, porém, as diferenças entre farmacogenética e farmacogenômica

são insignificantes, sendo, no entanto, na prática os dois termos utilizados alternadamente. A

farmacogenômica amplia o conceito de farmacogénetica que, além do estudo de genes isolados e

seus efeitos sobre diferenças interindividuais nas enzimas metabolizadoras, engloba as funções e

as interações de todos os genes do genoma humano, incluindo as enzimas responsáveis pela

biotransformação de fármacos (Ozdemir et al., 2001). As duas áreas de estudo visam otimizar o

tratamento através da personalização terapêutica, com base nas características genéticas dos

indivíduos, buscando identificar genes cujos produtos modulem as respostas terapêuticas,

influenciando basicamente na farmacocinética e farmacodinâmica de medicamentos ou estejam

associados a reações adversas a medicamentos (Mukherjee e Topol, 2003; Shastry, 2006).

Um dos principais focos da farmacogenética envolve as enzimas metabolizadoras de

fármacos. As variações genéticas presentes nos genes que codificam para essas enzimas podem

resultar em alterações na sua atividade, tendo como consequência o aparecimento de desfechos

desfavoráveis, como reações adversas, falência terapêutica e/ou toxicidade (Ingelman-

Sunderberg, 2001). O genoma humano possui aproximadamente 99,9% de homologia nas

sequências de DNA de todos os indivíduos. Entretanto, ao longo deste, mais de um milhão de

bases podem ser diferentes entre os diferentes indivíduos. Variações nessas sequências que

ocorrem na população geral de forma estável, encontradas com frequência de 1% ou mais, são

denominadas polimorfismos genéticos. As formas mais comuns de polimorfismos genéticos são

REVISÃO DA LITERATURA

deleções, mutações, substituições de base única ou SNP (Single Nucleotide Polymorphisms), ou

variações no número de sequências repetidas (VNTR), micro e minisatélites (Evans e Reiling,

1999). Os SNPs são comuns e constituem cerca de 90% de toda a variação genética na população

humana que ocorre com uma frequência aproximada de um a cada 1.250 pares de bases. Os SNPs

podem ocorrer ao longo da sequência de um determinado gene em qualquer região, sendo os mais

comuns aqueles que ocorrem nas regiões regulatórias e codificante. A maioria dos SNPs

localizados na região codificante apresenta mutações “missense” que levam a troca do

aminoácido correspondente, enquanto que as outras são mutações silenciosas ou neutras. No caso

dos genes que codificam para enzimas envolvidas na biotransformação de fármacos, tais

mutações podem resultar em diferenças na resposta terapêutica individual devido às alterações na

farmacocinética e/ou na farmacodinâmica dos fármacos, sendo, no entanto, citados como

instrumento importante na investigação de bases genéticas de diversas doenças assim como na

predição do tipo de desfecho da resposta terapêutica de um determinado indivíduo em relação ao

tratamento por um determinado fármaco (Wang e Moult, 2001; Roses, 2002).

2.10. Características do Sistema Citocromo P450

O citocromo P450 (CYP450) é uma superfamília de enzimas encontradas em todos os

cinco reinos biológicos. Eles são responsáveis pelo metabolismo de vários compostos endógenos,

e participam da ativação e desativação de muitos agentes cancerígenos e na biotransformação de

xenobióticos. Foi identificado pela primeira vez na década de 1950, como pigmento em

microssomas hepáticos e nomeado por apresentar um pigmento rosado (P de Pink) com o

espectro máximo de absorbância a 450nm, quando reduzido e ligado ao monóxido de carbono. O

pigmento foi posteriormente caracterizado como uma hemoproteína P450 e associado ao

metabolismo de drogas e esteróides nos meados de 1960 (Nebert e Russell, 2002). As isoenzimas

que compõem o sistema CYP450 são mono-oxigenases que catalisam a transformação de

componentes lipofílicos em intermediários hidrofílicos e estão envolvidas no metabolismo de

fase I. O mecanismo catalítico de oxidação, ilustrado na reação da Figura 2.10, envolve a

incorporação de um átomo de oxigênio molecular para o substrato com consequente formação de

uma molécula de água e um metabólito mono-oxigenado (Gonzaléz, 1989; Ekins et al., 1997;

Guengerich, 2001).

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.10. Esquema da reação do CYP450. R-H-substrato; R-OH- produto hidroxilado

XOOH-peróxido (X = H ou resíduos orgânicos (Anzenbacher e Anzenbacherová, 2001).

Nos humanos, as enzimas do citocromo P450 estão localizadas em maior quantidade nas

células microssomais do fígado (Lewis, 2004). Também são expressas em todo o trato

gastrointestinal e em quantidades menores nos pulmões, nos rins, na próstata, no epitélio nasal e

da pele, nas gônadas, nas mamas, na placenta, no baço, no pâncreas e no cérebro. Estima-se que

todo o conteúdo do retículo endoplasmático presente nas células hepáticas esteja composto por

isoenzimas que constituem o sistema CYP450, podendo também ser encontradas nas membranas

mitocondriais (Lin e Lu, 1998). Acredita-se que aproximadamente 90% do metabolismo

oxidativo e mais de 50% de toda eliminação dos fármacos utilizados em algum regime

terapêutico seja mediada, parcialmente, pelas enzimas do complexo enzimático CYP450, as quais

apresentam também um importante papel na síntese de hormônios, na síntese de colesterol e no

metabolismo de substratos endógenos (Evans e Relling, 1999; Wienkers e Heath, 2005).

A clonagem e o sequenciamento do DNA complementar de enzimas do CYP e o

sequenciamento do genoma humano demonstraram a existência de 115 genes do sistema CYP450

humanos potencialmente funcionais, sendo 57 ativos e 58 pseudogenes

(http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html). Dos 57 genes ativos, doze desempenham um

papel importante no metabolismo de vários xenobióticos, incluindo vários fármacos de uso

clínico (Ingelman-Sundberg, 2004). As enzimas das famílias CYP1, CYP2 e CYP3 são

responsáveis por 70-80% de todo o metabolismo da fase I dos fármacos de uso clínico, enquanto

REVISÃO DA LITERATURA

as outras participam do metabolismo de componentes endógenos. As enzimas mais ativas

pertencem às subfamílias CYP2C, CYP2D e CYP3A (Evans e Relling, 1999) (Figura 2.11).

Figura 2.11. Percentual das isoformas do sistema CYP450 no fígado e exemplos de substratos,

inibidores e indutores (Pelkonen et al., 2008).

2.11. Nomenclatura

A nomenclatura da superfamília CYP450 é baseada na similaridade entre as seqüências de

aminoácidos (Nelson et al., 1996) (Figura 2.12). Enzimas que apresentam mais de 40% de

similaridade são agrupadas na mesma família que é indicada por um algarismo arábico (ex.

CYP2). Aquelas que possuem mais de 55% de similaridade em suas seqüências são agrupadas na

mesma subfamília que é representada por uma letra após o número arábico indicativo da família

(ex. CYP2B). Cada membro da subfamília (isoenzima) é representado por outro número arábico

que vem em seguida a letra indicativa da subfamília (ex. CYP2B6). Quando em itálico, a sigla

refere-se ao gene que codifica a proteína em questão (ex. CYP2B6).

Rifampicina

Fenobarbial

Rifampicina

Fenobarbial

Rifampicina

Carbamazepine

Dexametazone

Etanol

Isoniazida

Fumo

Omeprazol

Fenoba

rbial

Rifampicina

Fenobarbial

Rifampicina

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.12. Nomenclatura das isoenzimas da superfamília CYP450.

2.12. Famílias e Subfamílias

A família CYP2 é muito diversificada e inclui um número importante de enzimas CYP

metabolizadoras de drogas. No homem foram descritas 20 enzimas pertencentes a esta família e

13 subfamílias diferentes. Na subfamília CYP2A foram identificadas as isoformas CYP2A6,

CYP2A7 e CYP2A13. Destas, a CYP2A6 é a mais expressa no fígado e representa

aproximadamente 10% do total das enzimas CYP hepáticas, estando envolvida na ativação de

alguns pró-carcinógenos, tais como aflatoxina B1ou nitrosaminas presentes no fumo de tabaco;

no metabolismo da nicotina e na biotransformação de alguns fármacos (Pelkonen et al., 2008). A

isoenzima CYP2B6 é o único membro da subfamília CYP2B identificado no homem e

responsável pela biotransformação de compostos tóxicos e alguns fármacos (Bathelt et al., 2002).

Na subfamília CYP2C foram identificados em humanos quatro isoformas, a saber: CYP2C8,

CYP2C9, CYP2C18 e CYP2C19. Entre eles, a CYP2C9 apresenta-se em maior concentração no

fígado humano, sendo responsável pelo metabolismo de grande número de drogas de uso

terapêutico, incluindo drogas inflamatórias ou hipoglicemiantes. A CYP2C19 é também expressa

no fígado e é responsável pelo metabolismo de um número significativo de drogas (Anzenbacher

e Anzenbacherova, 2001). A CYP2C8 é expressa em diversos níveis no fígado e sua importância

no metabolismo de drogas ainda é pouco conhecida. No entanto, entre os seus substratos

encontram-se substâncias endógenas como o ácido retinóico e retinol além de algumas drogas de

uso terapêutico (Soyama et al., 2001).

CYP2B6

Família

Subfamília

Isoforma

Variante alélica

REVISÃO DA LITERATURA

2.12.1. CYP2B6

Contrariamente às outras isoenzimas hepáticas do citocromo P450 predominantes no

fígado como a CYP3A4, a isoenzima 2B6 (CYP2B6) foi inicialmente considerada uma enzima

de baixa expressão hepática em humanos, com participação secundária no metabolismo de

xenobióticos (Wrighton e Stevens, 1992). No entanto, estudos recentes demonstraram que a

mesma pertence a um conjunto de enzimas CYP hepáticas importantes no metabolismo de

diversas drogas, representando cerca de 2-10% do conteúdo total das enzimas CYP hepáticas

(Code et al., 1997; Ekins et al., 1998). Além disso, a sua importância no metabolismo de

xenobióticos tem sido confirmada com a identificação de um número crescente de novos

substratos, sua inducibilidade por uma série de substâncias químicas estruturalmente diversas

(Tabela 2.2), e o número relativamente elevado de polimorfismos genéticos que contribuem para

a sua grande variação interindividual (Yamano et al., 1989; Code et al., 1997; Stresser e Kupfer,

1999; Lang et al., 2001). Como a maioria das outras isoformas do CYP, a CYP2B6 é

essencialmente expressa no fígado e envolvida no metabolismo de primeira passagem de drogas

ingeridas, mas pode ser encontrada em outros tecidos extra-hepáticos, incluindo: cérebro, rins,

intestino, endométrio, macrófagos bronco-alveolares, linfócitos e pele (Gervot et al., 1999; Ding

e Kaminsky, 2003).

O gene que codifica para o CYP2B6 foi mapeado no braço longo do cromossomo 19,

entre as posições 19q12 e 19q13. 2, e está localizado juntamente com o pseudogene CYP2B7P

com o qual estão intimamente relacionados vários outros membros da família de genes da família

CYP2. Este gene consiste em nove exons que codificam para 491 aminoácidos (Philips et al.,

1985; Santisteban et al., 1988; Yamano et al., 1989). A sua indução é mediada pelos receptores

nucleares PXR (Pregnane Xenobiotic Receptor) e CAR (Constitutive Androstane Receptor) que

interagem com o PBREM (phenobarbital-responsive enhancer module) e outros fatores

transcricionais que se ligam ao promotor permitindo a transcrição do gene (Sueyoshi et al. 1999;

Goodwin et al., 2001; Wang et al., 2003a). A maior parte dos mecanismos de regulação

transcricional do gene CYP2B6 assemelha-se com os de vários genes metabolizadores de drogas e

muitos indutores da CYP2B6 também induzem CYP3A4 e UGT1A1 (Geick et al., 2001;

Sugatani et al., 2001). Por outro lado, alguns dos indutores também são substratos para CYP2B6,

podendo acelerar o seu próprio metabolismo afetando a sua depuração ou toxicidade. Exemplos

REVISÃO DA LITERATURA

de auto-indução amplamente utilizados incluem as drogas anticâncer ciclofosfamida e ifosfamida,

o antiretroviral efavirenz, e o antimalárico artemisinina (Simonsson et al., 2003; Wang et al.,

2003b).

Apesar de ser uma enzima pouco estudada, quando comparadas as outras enzimas da CYP

bem estabelecidas como CYP2D6 e CYP2C19, as variações genéticas do CYP2B6 e sua

importância clínica bem como as variações interindividuais na sua expressão e atividade foram já

reportadas e o número de estudos de farmacogenética cresce rapidamente. Até o momento foram

caracterizados 28 variantes alélicas e uma série de subvariantes de CYP2B6 (*1B a *29) foram

descritas (http://www.cypalleles.ki.se), os quais consistem na combinação de várias mutações

pontuais nas regiões codificante e promotora. No entanto, estudos funcionais mostram uma

variedade de fenótipos codificados pelos alelos polimórficos, que incluem a diminuição

significativa da atividade catalítica ou a perda completa da expressão do gene (Lang et al., 2001;

Rotger et al., 2007; Hoffmann et al., 2008). As variações genéticas foram identificadas em toda a

sequência do gene, tanto na região codificante como promotora. Embora a maioria dos SNPs

identificados resulte em alterações não funcionais, os SNPs importantes apresentam frequências

de até 50% em determinadas populações, tendo impacto significativo na farmacocinética de

vários medicamentos tais como o inibidor da transcriptase reversa do HIV, efavirenz e o

anticâncer ciclofosfamida (Lang et al., 2001).

REVISÃO DA LITERATURA

Tabela 2.2. Diferentes classes terapêuticas de fármacos biotransformados por enzimas

codificadas pelo gene CYP2B6.

Classe Terapêutica Fármaco

Quimioterapêuticos

Ciclofosfamida

Ifosfamida

Tamoxifen

Anti

retrovirais

Efavirenz

Nevirapina

Antidepressivos

Bupropion

Anti

epilé

ticos

Metilfenobarbital

Ácido valpróico

Antiarrítmicos

Mexiletine

Procainamida

Antimaláricos Artemisinina

Antiinflamatórios

Tazofelone

Aminop

rine

Antipirina

Anestésicos

Propofol

Cetamina

Pentobarbital

Ropivacaína

Lidoca

Sevoflurano

Opióides

Metadona

Petidina

Esteróides

Estrona

Testosterona

Psicotrópicos

Diazepam

Temazepam

Clotizazepam

Midazolam

REVISÃO DA LITERATURA

A primeira análise sistemática dos polimorfismos genéticos realizado por Lang e

colaboradores em nove exons da região codificante permitiu a identificação de nove SNPs, dos

quais cinco são não-sinônimas e quatro são mutações silenciosas. De forma isolada ou em

combinação, esses SNPs resultaram em seis diferentes alelos designados como CYP2B6 *2

(64C> T), *3 (777C> A), *4 (785A> G), *5 (1459C> T), *6 (516G> T e 785A> G), e *7 (516G>

T, 785A> G e 1459C> T) (Figura 2.13). Entre eles, o alelo *6, caracterizado pela combinação das

mutações 516G> T no exon 4 e 785A> G no exon 5, foi detectado em cerca de 15-40% de

populações asiáticas e mais de 50% de Afro-americanos (Lang et al., 2001; Guan et al., 2006;

Mehlotra et al., 2006). Adicionalmente, estudos recentes relatam a descoberta de um splicing

aberrante do RNA mensageiro do gene CYP2B6 no mesmo alelo, o qual carece dos exons 4, 5 e

6, apresentando uma proteína com função reduzida (Hoffmann et al., 2008). Neste estudo, os

portadores do alelo CYP2B6*6 heterozigotos e em homozigose, apresentaram uma diminuição

significativa da atividade catalítica e expressão da proteína, em comparação com os portadores do

alelo selvagem CYP2B6*1. O alelo CYP2B6*5 é mais frequente em populações caucasianas (14-

25%) e foi também associado à diminuição na expressão da proteína e atividade catalítica da

enzima (Lamba et al., 2003).

Outros alelos novos caracterizados na região codificante incluem: CYP2B6 *16 (785A> G

e 983T> C), *18 (983T> C), *27 (593T> C), e *28 (1132C> T), bem como quatro alelos de

fenótipo nulo *8 (415A> G), *11 (136A> G), *12 (296G> A), e *15 (1172T> A)

(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2b6.htm).

Figura 2.13. Distribuição das mutações não-sinôminas no gene CYP2B6; em vermelho estão repre-

sentados os SNPs de interesse neste estudo e em preto UTR (Zhou et al., 2009).

REVISÃO DA LITERATURA

Além dos SNPs localizados na região codificante, os SNPs que ocorrem em sequências

regulatórias e intrônicas também têm impacto sobre a expressão do gene. Dado o fato do gene

CYP2B6 ser altamente induzível e regulado ao nível transcricional, a identificação de SNPs na

região promotora tem sido objeto de pesquisa por diversos grupos (Zukunft et al., 2005; He et al.,

2006), sendo vários os SNPs identificados na região promotora

(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2b6.htm). Entre eles, destaca-se o SNP -750T>C que foi

reportado em 49% de indivíduos de origem caucasiana, 83% Africano-americanos e 79% em

hispânicos. No entanto, apesar desta mutação estar localizada num possível sítio de transcrição, a

caracterização funcional revelou que os alelos associados com essa mutação só resultaram em

mudanças moderadas na expressão de RNA mensageiro (Lamba et al., 2003).

O gene CYP2B6 desempenha papel crucial na biotransformação de várias drogas

clinicamente importantes, incluindo ciclofosfamida, efavirenz, ifosfamida, tamoxifeno e

artemisinina (Chang et al., 1993; Svensson e Ashton, 1999; Rotger et al., 2007). A sua

importância clínica na inibição da enzima alteração da expressão dos alelos polimórficos pode ser

exemplificada com o antiretroviral efavirenz. De acordo com Marzolini e colaboradores,

concentrações plasmáticas altas do efavirenz são responsáveis por efeitos secundários em

indivíduos com HIV tratados com esta droga e contribuem para uma elevada taxa de abandono e

insucesso terapêutico nesses indivíduos (Marzolini et al., 2001). Entre os alelos polimórficos

identificados, evidências recentes mostram que o alelo CYP2B6*6, principalmente a mutação

516G>T está fortemente associada à elevação da concentração plasmática da droga e ao

aparecimento de efeitos neurológicos relacionados com o uso da droga (Haas et al., 2004). No

entanto, a ocorrência dessas mutações mostra grande variedade étnica em diferentes populações

estudadas (Tabela 2.3).

REVISÃO DA LITERATURA

Tabela 2. 3. Distribuição dos SNPs frequentemente reportados em diferentes populações.

Guan et al., 2006, b- Hiratsuka et al., 2002,

- Cho et al., 2004, d- Lang et al., 2001, e,f,i- Lamba et al., 2003, g- Klein et al., 2005, h- Ferreira et al., 2007.

SNP

Chineses Japoneses Coreanos Europeus

(Germânicos)

Euro-descendentes

(Americanos)

Afro-

americanos

Africanos Africanos Hispânicos

(n=368)

(n=530)

(n=716)

(n=430)

(n=86)

(n=58)

(n=103)

(n=82)

(n=14)

64C>T

0,03 0,05 0,03 0,05 0,09 0 0,24 0,14

516G>T

0,21 0,16 0,14 0,29 0,22 0,29 0,68 0,49 0,43

777C>A

0 0 0 0,005 0 0 0 0

785A>G

0,28 0,26 0,19 0,33 0,04 0,17 0,48 0,14

1459C>T

0,003 0,01 0,01 0,14 0,13 0,09 0

REVISÃO DA LITERATURA

2.12.2. CYP2C8

A isoenzima 2C8 do citocromo P450 (CYP2C8), juntamente com CYP2C9, CYP2C18 e

CYP2C19 são isoenzimas humanas pertencentes à subfamília CYP2C, sendo coletivamente

responsáveis pelo metabolismo de cerca de 20% de fármacos de uso clínico (Gray et al., 1995).

Além disso, são todas polimórficas e compartilham uma identidade significativa; porém, possuem

diferenças importantes no que diz respeito aos locais e níveis de expressão de proteínas bem

como o tipo de substratos reconhecidos, características essas que em grande parte, determinam a

sua relevância no metabolismo de drogas (Evans et al., 2004). A isoenzima CYP2C8 constitui

cerca de 7% do total das enzimas microssomais do citocromo P450, sendo responsável pelo

metabolismo de primeira passagem de cerca de 5% das drogas, podendo ser também encontrada

em vários tecidos extra-hepáticos como: rins, intestino, glândulas adrenais, cérebro, glândulas

mamárias, ovários e coração, assim como em tumores de câncer de mama (Klose et al. 1999;

Knüpfer et al., 2004). Os principais substratos da CYP2C8 incluem o ácido araquidônico e ácido

retinóico, assim como os agentes terapêuticos apresentados na Tabela 2.4 (Rahman et al., 1994).

A sua indução é mediada por múltiplos receptores nucleares (Ferguson et al., 2005) e a

quercetina e o trimetoprim constituem os principais inibidores da CYP2C8 (Sousa e Marletta,

1985; Wen et al., 2002).

REVISÃO DA LITERATURA

Tabela 2.4. Diferentes classes terapêuticas de fármacos metabolizados pela CYP2C8, classificados de

acordo a contribuição da isoenzima no seu metabolismo.

Classe terapêutica

Fármaco

Outras enzimas CYP com papel no

metabolismo

Maior contribuição da

CYP2C8

no metabolismo

Antiarrítmico

Amiodarona

CYP3A4, CYP1A2, CYP2C19, CYP2D6

Antimalárico

Amodiaq

uina

CYP3A4, CYP1A1, CYP1B1

Hiperlipidemia

Cerivastatina

CYP3A4

Antimalárico

Cloroquina

CYP3A4, CYP12D6

Taxano

Paclitaxel

CYP3A4, CYP3A

Antidiabético

Repaglinide

CYP3A4

Antidiabético

Rosiglitazona

CYP2C9, CYP3A4

Antidiabético

Troglitazona

CYP3A4

Contribuição intermediária da CYP2C8 no metabolismo

Antiepilético

Carbamazepina

YP3A4 (maior)

Linfomas e leucemias

Ciclosfamida

CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19

Antibacteriano

Dapsona

CYP2C9 (maior)

Antiinflamatório

Diclofenac

CYP2C9 (maior

CYP3A4, CYP2C19

Antiarrítmico

Diltiazem

CYP3A4, CYP2C9

Hiperlipidemia

Fluvastatina

CYP2C9 (maior

CYP3A4

Câncer

Ifosfamida

CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19

Opióides

Metadone

CYP3A4,

CYP2D6,

CYP2B6

Antiinflamatório

Tenoxicam

CYP2C9 (maior)

Hipertensão

Verapamil

CYP3A4 (maior), CYP3A5

O gene que codifica para a isoforma CYP2C8 está localizado no cromossomo 10q24,

juntamente com mais três genes da subfamília CYP2C na seguinte ordem: Cen- 2C18-2C19-2C9-

2C8-Tel. A estrutura completa do gene CYP2C8 tem um tamanho de 31 kilobases, sendo

constituído por nove exons que possuem polimorfismos de base única identificados nas regiões

codificantes e não codificantes (Klose et al., 1999). O alelo selvagem (CYP2C8*1A) apresenta

expressão e atividade normal da enzima CYP2C8. No entanto, vários SNPs têm sido descritos em

diferentes populações, caracterizando outros alelos. Quatro variantes alélicas que codificam a

substituição de aminoácidos foram descritas e designadas CYP2C8*2, *3, *4 e *5 (Figura 2.14)

(Dai et al., 2001; Soyama et al., 2001; Bahadur et al., 2002). Os alelos mais frequentes são

CYP2C8*2 e CYP2C8*3.

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 2.14. Distribuição das mutações não-sinônimas no gene CYP2C8; em vermelho estão

representados os SNPs de interesse neste estudo e em preto UTR (Zhou et al., 2009).

O alelo CYP2C8*2 ocorre com a frequência de 18% em populações africanas e orientais,

sendo raro em populações caucasianas. É caracterizado por uma substituição 805A>T no exon

cinco, que resulta numa proteína com aproximadamente 15% da atividade catalítica do alelo

selvagem. Já o alelo CYP2C8*3 ocorre com maior frequência em populações caucasianas (23%)

sendo bastante raro em africanos (Tabela 2.5). É caracterizado por duas substituições de

aminoácidos, 416G>A e 1196A>G nos exons três e oito (Dai et al., 2001; Bahadur et al., 2002).

Indivíduos que apresentam o alelo CYP2C8*3 possuem baixa expressão hepática da enzima,

resultando em uma diminuição da atividade hepática de CYP2C8 em comparação com indivíduos

portadores do alelo selvagem. Yasar e colaboradores relataram um desequilíbrio de ligação

incompleto deste alelo com o alelo CYP2C9*2, onde 96% dos indivíduos de origem caucasiana

portadores do alelo CYP2C8*3 eram também portadores do alelo CYP2C9*2 (Yasar et al., 2002).

O alelo CYP2C8*4 é caracterizado por uma substituição 792C>G no éxon cinco. No entanto, a

sua importância na expressão do gene continua por elucidar. O alelo CYP2C8*5 apresenta

deleção de uma base na posição 475 que resulta em uma mutação do tipo “mudança de fase” no

códon 159 e uma introdução de um “códon de parada” prematuro no resíduo 177 resultando

numa enzima com falta de 64% da estrutura da proteína, incluindo o sitio de reconhecimento,

sendo, portanto inativa (Bahadur et al., 2002; Soyama et al., 2002). Existem ainda outros alelos

REVISÃO DA LITERATURA

descritos (*6, *7, *8, *9,*10,*11,*12,*13 e *14), porém a frequência dos mesmos é muito baixa e

sua importância não é bem conhecida (http://www.cypalleles.ki.se/cyp2c8.htm).

Tabela 2.5. Distribuição das variantes alélicas encontradas no gene de CYP2C8 em diversas populações.

Africanos Asiáticos Afro-

americanos

Europeus

Alelo

Zanzibar

(n=165)

Gana

(n=200)

Malásia

(n=57)

Japoneses

CYP2C8*2

0.139

0.168

0.035

0.000

0.180

0.150

0.004

0.016

CYP2C8*3

0.021

0.000

0.053

0.007

0.020

0.080

0.069

0.198

CYP2C8*4

0.006

0.000

0.045

0.075

a, f

Cavaco et al., 2005, b- Röwer et al., 2005,

- Muthiah et al., 2005, d-Nakajima et al., 2003,

e- Dreisbach et al., 2005, King et al., 2005.

OBJETIVOS

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral:

 Determinar a prevalência dos polimorfismos dos genes CYP2B6 e CYP2C8 do complexo

P450 humano em indivíduos sadios provenientes de três regiões distintas de Moçambique.

3.2. Objetivo Específico:

• Determinar as frequências alélicas, genotípicas e haplotípicas destes polimorfismos na

população estudada.

METODOLOGIA

4. METODOLOGIA

4.1. Tipo de estudo

Estudo descritivo observacional.

4.2. Local do estudo

Toda a coleta de material biológico, bem como o preenchimento do instrumento de coleta

de dados foi realizada em diferentes unidades de saúde das regiões estudadas de Moçambique. O

estudo foi realizado em sete hospitais situados em três regiões distintas do país, a saber:

Províncias de Cabo Delgado e Nampula; na região Norte, Província de Sofala, na região Centro,

e Província de Gaza e Cidade de Maputo, na região Sul. Na região Norte o material biológico

(sangue) foi coletado no Hospital Provincial de Pemba (HPP) e Hospital Central de Nampula

(HCN). Na região Centro foi coletado no Hospital Central da Beira (HCB) e no Hospital Rural de

Chokwé (HRC), Hospital Central de Maputo (HCM), Hospital Geral José Macamo (HGJM) e

Hospital Geral de Mavalane (HGM), na região Sul (Figura 4.1). Os hospitais referenciados são de

nível secundário (HRC), terciário (HPP, HGJM e HGM) e quaternário (HCN, HCB) de referência

para doenças em geral.

Após a coleta o material foi encaminhado para o Laboratório de Biologia Molecular

Aplicado a Micobactérias do Instituto Oswaldo Cruz-Fiocruz, no Rio de Janeiro, Brasil, onde

foram realizados todos os procedimentos laboratoriais e análise de dados.

4.3. Cálculo amostral

Tendo em vista a ausência de dados referentes à frequência dos polimorfismos estudados

em Moçambique, foi efetuado um estudo piloto. Assim, assumindo a frequência da ocorrência

desses polimorfismos de 50% a um nível de confiança de 95% foi estimado um tamanho amostral

de 384 voluntários, calculado através do programa EPIINFO versão 3.5.

4.4. Período de estudo

A duração total do estudo foi de 24 meses. A população estudada foi recrutada no período

compreendido entre outubro e dezembro de 2008.

METODOLOGIA

Figura 4.1. Mapa de Moçambique ilustrando os locais de coleta de amostras nas três

regiões.

4.5. População de estudo

Foram arrolados para o estudo indivíduos sadios entre doadores de sangue, atendidos nos

bancos de sangue dos hospitais selecionados no período de recrutamento dos participantes.

4.6. Seleção dos Participantes

4.6.1. Critérios de inclusão

Foram incluídos no estudo, de modo sistemático, indivíduos de ambos os gêneros,

independente de cor, etnia e religião,

com as seguintes condições:

 Nacionalidade Moçambicana,

 Idade compreendida entre 18 a 65 anos,

 Aceitar em participar do estudo de forma voluntária,

 Assinar o termo de consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Apêndice 1).

NORTE

CENTRO

SUL

HCB (Sofala)

HPN (Nampula)

HPP (C.Delgado)

HRC (Gaza)

HCM, HGJM e

HGM

(Maputo)

METODOLOGIA

4.6.2. Critérios de exclusão

Não foram incluídos no estudo os indivíduos com as seguintes condições:

 Inaptos para doar sangue,

 Portadores de doença crônica,

 Indivíduos que estavam sob tratamento para qualquer enfermidade.

4.7. Procedimentos Laboratoriais

4.7.1. Coleta de amostras e extração de DNA

Foram colhidos aproximadamente 200µL de sangue, depositados em cartão de filtro do

tipo “FTA Classic Cards” (Whatman) e seco a temperatura ambiente. O cartão de filtro do tipo

FTA permite a coleta, transporte, armazenagem e isolamento dos ácidos nucléicos a temperatura

ambiente. Após a coleta das amostras, os cartões de filtro secos e devidamente identificados

foram armazenados em sacos plásticos contendo sílica gel e enviados para o Laboratório de

Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias do Instituto Oswaldo Cruz.

4.7.2. Preparação do cartão FTA para a PCR

O cartão de filtro FTA contendo a amostra foi preparado para a realização da PCR

segundo as instruções do fabricante. Basicamente, cada cartão com amostra foi perfurado em

discos de 1,2mm de diâmetro, com um Harris Micro-punch (Whatman). Os discos foram lavados

(3x) com 200µL de reagente de purificação de FTA e (2x) com 200µL, 1mM TE (10mM Tris-

HCl, 0,1mM EDTA, pH 8,0), sendo incubadas por 5 minutos em cada etapa de lavagem. As

lavagens foram necessárias para reduzir potenciais inibidores da PCR presentes no sangue. Os

discos lavados foram secos a 56°C num bloco de aquecimento durante 10 minutos. Após esta

etapa, o material foi usado para amplificação.

METODOLOGIA

4.7.3. Amplificação do DNA e Genotipagem

A amplificação e a genotipagem dos fragmentos de interesse nas regiões codificantes dos

genes estudados (CYP2B6 e CYP2C8) foi feita por PCR-RFLP utilizando diferentes pares de

oligonucleotídeos e endonucleases de restrição. Para a confirmação dos padrões heterozigotos,

uma fração dos produtos da PCR em amostras portadoras das mutações estudadas foi

sequenciada.

A padronização das condições de amplificação para cada gene foi realizada em um

termociclador “Veriti Thermal Cycler - Applied Biosystems” com a utilização de um bloco com

capacidade de gradiente de temperatura que permite uma variação da temperatura de anelamento,

a fim de obter melhor rendimento das reações de PCR. Adicionalmente foram também testadas

diferentes quantidades de discos de cartão FTA, concentrações de magnésio, dNTPs e aditivos.

4.7.4. Estratégias de Amplificação

4.7.4.1. CYP2B6

Para a amplificação das quatro regiões de interesse, que incluíram os exons: um, quatro,

cinco e nove, com fragmentos de 723pb, 526pb, 640pb e 1401pb, respectivamente, foram

utilizados em todas as reações oligonucleotídeos específicos descritos anteriormente (Lang et al.,

2001) como ilustra a figura abaixo (Figura 4.2).

Figura 4.2: Gene CYP2B6, estratégia de amplificação mostrando o tamanho dos

fragmentos amplificados em cada exon (Lang et al., 2001)

640bp

Tamanho do exon

723bp

526bp

1401bp

METODOLOGIA

A genotipagem dos alelos CYP2B6*2,*3,*4,*5,*6, *7 e *9 foi realizada através de RFLP,

onde são detectadas alterações nas sequências. Desta maneira, as amostras que apresentam os

SNPs que caracterizam os alelos mutantes, criam ou obstruem sítios de restrição para as enzimas

Hae II (alelos *2 e *3, Sty I (*4), Bgl II (*5), Bsr I (*9), Bsr I e Sty I (*6), Bsr I; Sty I e Bgl II (*7)

(Lang et al., 2001).

Os alelos CYP2B6*2 e *3 (C

→ T e C

18045

→A) mudam a sequência CGCGA nos exons

um e cinco modificando o sítio de reconhecimento para a enzima Hae II (CGTGA e CGAGA).

Em relação ao alelo CYP2B6*4 (A

18053

→G), a mudança da sequência GGAAC no exon cinco

altera o sítio de reconhecimento para a enzima Sty I (GGGAC). No alelo CYP2B6*5 (C

25505

→T)

ocorre a criação de um sítio de reconhecimento para a enzima Bgl II (GTCTA) pela mudança da

sequência GCCTA no exon nove, enquanto que o alelo CYP2B6*9 (G

15631

→T) muda a sequência

TGACC criando um sítio de reconhecimento para a enzima Bsr I (TTACC) no exon quatro

(Figura 4.3).

METODOLOGIA

Figura 4.3: Ilustração da estratégia de amplificação do gene CYP2B6, alelos *2, *3, *4, *5 e *9 e a

representação do resultado obtido após a digestão utilizando as enzimas Hae II, Bsr I, Sty I e Bgl II em

gel de agarose 2%.*1/*1- perfil homozigoto selvagem; *1/*2,*1/*3,*1/*4,*1/*5 e *1/*9 - perfis

heterozigotos; *2/*2,*3/*3,*4/*4,*5/*5 e *9/*9- perfis homozigotos mutantes.

METODOLOGIA

4.7.4.2. CYP2C8

Para a amplificação das regiões de interesse neste gene, foram utilizados

oligonucleotídeos já descritos por Dai e colaboradores para os exons três, cinco e oito com os

fragmentos de 347pb, 312pb e 117pb, respectivamente e por Nakajima e colaboradores para o

exon cinco, com 167pb (Figura 4.4) (Dai et al., 2001; Nakajima et al., 2003).

Figura 4.4: Gene CYP2C8, estratégia de amplificação mostrando o tamanho dos

fragmentos amplificados em cada exon (Nakajima et al., 2003).

A genotipagem dos alelos CYP2C8*2, *3 e *4 foi realizada atravéz de RFLP onde são

detectadas alterações nas sequências, permitindo a identificação das mutações utilizando as

enzimas Bcl I (*2), Bse RI e Xmn I (*3) e Taq I (*4).

O alelo CYP2C8*2 (A

11054

→T) muda a sequência TGATCA no exon cinco modificando o

sítio de reconhecimento para a enzima Bcl I (TGTTCA). O alelo CYP2C8*3 (G

2130

→A e

30411

→G) muda a sequência GAGGAG alterando um sítio de reconhecimento para a enzima Bse

RI (GAGGAA) no exon três, enquanto a sequência CAAAG elimina o sítio de reconhecimento

da enzima Xmn I (CAGAG) no exon oito. Por último, o alelo CYP2C8*4 (C

11041

→G) muda a

sequência TATCGA alterando o sítio de reconhecimento da enzima Taq I (TATGGA) (Figura

4.5).

347pb (*2)

167pb (*4)

Tamanho do exon

312pb(*3) 117pb (*3)

~31 kb

METODOLOGIA

Figura 4.5: (A) Ilustração da estratégia de amplificação do gene CYP2C8*2, *3 e *4. (B) Representação

do resultado obtido após a digestão utilizando as enzimas Bcl I, Bse RI, Xmn I e Taq I em gel de agarose

4%. *1/*1-perfil homozigoto selvagem; *1/*2,*1/*3e*1/*4- perfis heterozigotos;*2/*2,*3/*3 e*4/*4-

perfis homozigotos mutantes.

4.7.5. Purificação dos produtos da PCR para o Sequenciamento

A purificação do DNA foi realizada utilizando o Kit “ChargeSwitch® PCR Clean-Up”

(Invitrogen). O “ChargeSwitch®” é um sistema que permite a purificação rápida e eficiente de

produtos de PCR de sais, dNTPs e outros reagentes que não sejam ácidos nucléicos, baseado

numa esfera magnética que fornece uma superfície de ligação dependente da carga e pH do

METODOLOGIA

tampão circulante, facilitando a purificação dos ácidos nucléicos. Basicamente, o processo de

purificação consiste na adição de 25 ou 50µL de produto de PCR num microtubo de 1,5mL

estéril, onde são adicionados posteriormente 25µL ou 50µL de tampão de purificação (NS) e nele

adicionados 3µL ou 10µL de esferas magnéticas “Charge Switch Magnetic Beads” e incubadas à

temperatura ambiente durante 1 minuto, após homogeneização. Depois da incubação, o tubo

contendo a amostra é colocado numa estante imantada por 1 minuto ou até as esferas formarem

um precipitado. Em seguida, sem remover o microtubo da estante, o sobrenadante é retirado e

descartado, mantendo-se no microtubo o precipitado com as esferas. Após este passo, retira-se o

microtubo da estante e nele são adicionados 65µL ou 150µL de tampão de lavagem (WB) e

homogeneizado, sem permitir a formação de bolhas, e novamente colocado na estante por 1

minuto até o reagrupamento das esferas. Este procedimento de lavagem é repetido por mais uma

vez. Após a lavagem o produto é eluído através da adição de 20µL de tampão de eluição (ES),

homogeneizado gentilmente com pipeta e incubado por 1 minuto à temperatura ambiente.

Finalmente, o microtubo é recolocado na estante por 1 minuto ou até as esferas formarem um

precipitado. Sem remover o microtubo da estante, transfere-se com cuidado o sobrenadante

contendo o produto de PCR purificado para microtubos de 0,5mL e armazenado à -20ºC.

4.7.6. Reação de Sequenciamento

A reação de sequenciamento foi realizada em placa específica de sequenciamento como

ilustra o esquema apresentado na Figura 4.6, onde metade correspondia as amostras de produtos

de PCR purificados contendo o oligonucleotídeo senso e a outra metade com as mesmas amostras

contendo o oligonucleotídeo anti-senso. A preparação do mix e a reação de sequenciamento

foram realizadas ao abrigo da luz. A amplificação foi realizada num termociclador “Veriti

Thermal Cycler – Applied Biosystems” nas seguintes condições: 40 ciclos de 96ºC durante 10

segundos, 50ºC durante 5 segundos e 60ºC por 4 minutos. Após a amplificação, os produtos

contidos na placa foram precipitados através da adição de 30µL de isopropanol a 75%, seguido

de agitação da placa por 10 segundos e incubada por 15 minutos à temperatura ambiente, sempre

ao abrigo da luz (coberta com papel laminado). Em seguida a placa foi centrifugada a 2616,32 g

por 45 minutos à 20ºC.

METODOLOGIA

Figura 4.6: Ilustração da placa de sequenciamento (i) - amostras de 1 a 12 amplificados

com oligonucleotídeo senso, (ii) - amostras de 1 a 12 amplificados com oligonucleotídeo

anti-senso.

Depois da centrifugação, a placa foi invertida sobre um papel toalha, para retirar o

sobrenadante e posteriormente centrifugado na posição invertida, por 30 segundos a 14,72 g.

Após este passo foram adicionados 50µL de etanol 75% e submetidos à nova centrifugação por

15 minutos a 2616,32 g, numa temperatura de 20ºC. Posteriormente a placa foi, novamente,

invertida sobre papel toalha e centrifugada na posição invertida, por 30 segundos a 14,72 g. O

precipitado foi seco no termociclador a 60ºC por 10 minutos. Finalmente, as amostras foram

ressuspendidas em 10µL de formamida e deixada por 3 minutos a 95ºC para desnaturação. Após

essa etapa, a placa foi colocada imediatamente no gelo (choque-térmico) para evitar o anelamento

e depois levada para o sequenciador.

4.7.7. Sequenciamento automatizado

O sequenciamento automático é feito mediante o uso de nucleotídeos de terminação e

uma marcação que permite a identificação das cadeias resultantes. Esta marcação é feita

empregando moléculas fluorogênicas, ou seja, compostos capazes de emitir fluorescência quando

excitados por uma fonte de luz. No sistema utilizado na FIOCRUZ Plataforma

METODOLOGIA

PDTIS/FIOCRUZ, da “Applied Biosystems”, é empregada para a excitação dos fluoróforos uma

fonte de luz a laser de argônio acoplado a um sistema ótico, capaz de direcionar o feixe de laser

sobre as amostras a serem analisadas. O sinal de fluorescência gerado pela excitação com laser é

direcionado pelo sistema ótico a um sistema digital que decodifica o sinal eletrônico,

transmitindo-o ao computador acoplado, onde através de programas específicos o sinal é

traduzido numa sequência de DNA.

Neste sistema, as reações de sequenciamento são realizadas utilizando o “kit ABI

PRISM



Big Dye



Terminator v 3.1” (PE Applied Biosystems) segundo as instruções do

fabricante, que são adaptadas às condições do laboratório. Neste sistema a marcação fluorescente

encontra-se na extremidade 3’ do nucleotídeo de terminação, sendo que cada cor gerada

corresponde a uma base específica. Em cada reação de sequenciamento, são utilizados,

aproximadamente, 20ng do produto amplificado e os iniciadores utilizados nas respectivas

reações de PCR.

As reações foram analisadas no sequenciador de 48 capilares “ABI PRISM

3730 Genetic

Analyzer” (Applied Biosystems), instalado no Laboratório de Biologia Molecular e

Bioinformática da FIOCRUZ/ Plataforma PDTIS.

4.7.8. Análise das sequências obtidas através do Sequenciamento

As sequências obtidas após o sequenciamento foram analisadas pelo programa “SeqScape

versão 2.6 da Applied Biosystems” (Figuras 4.7). O “SeqScape” é uma ferramenta que permite o

alinhamento e a comparação de sequências obtidas diretamente do sequenciador automático

contra uma sequência referência para uma rápida identificação de variantes nas sequências

analisadas (Figura 4.8 e Figura 4.9). O programa permite alinhar e comparar múltiplas amostras

mostrando o eletroferograma e o índice de qualidade de cada sequência (Figura 4.10), permitindo

assim a realização de dois tipos de análise em simultâneo, a saber: 1) Identificação de variantes

nucleotídicas e aminoacídicas que consiste no reconhecimento de posições que se diferem da

sequência referência, classificando-as como variantes conhecidas ou desconhecidas, 2)

Identificação de genótipos, alelos ou haplótipos de uma biblioteca, através da busca em

bibliotecas e bases de dados de genótipos, alelos, ou haplótipos, identificando alelos que mais se

assemelham com a sequência resultante do seuqenciamento do fragmento de interesse nos

sentidos senso e anti-senso (sequência consenso).

METODOLOGIA

Figura 4.7: Ilustração da página inicial do Programa “SeqScape”.

METODOLOGIA

Figura 4.8. Ilustração da janela do programa “SeqScape v.2.6”onde pode ser observado o alinhamento das amostras e as sequências referência e

consenso.

Presença de

SNP em azul

Sequência

Consenso

Sequência

Referência

Sequências de

diferentes amostras

alinhadas

METODOLOGIA

Figura 4.9. Ilustração da janela do programa “SeqScape v.2.6” onde pode ser observada uma amostra na qual foi identificada uma

mutação.

Presença de Mutação

METODOLOGIA

Figura 4.10: Identificação dos SNPs através da visualização do cromatograma no programa “SeqScape”

mostrando os três possíveis genótipos. [A] e [C] amostras homozigotas, [B] amostra mutante

heterozigota.

Um pico a preto referente a Guanina (GG)

Dois picos (a preto e vermelho) referentes a Guanina e Timina (GT)

Um pico a vermelho referente a Timina (TT)

[A]

[B]

[C]

METODOLOGIA

4.8. MATERIAIS

4.8.1. Detecção dos produtos amplificados

 Tampão de corrida Tris/Borato/EDTA (TBE) (10x)

Tris-base 108 g/L

Ácido bórico 55 g/L

EDTA (0,5M)

40 mL

 Tampão de aplicação de amostra (5x) - “Gel Loading buffer”

Azul de Bromofenol 0,25 %

Xileno Cianol 0,25 %

Ficoll 400 15 %

4.8.2 Digestão dos produtos amplificados por enzimas de restrição.

4.8.2.1. Alelos CYP2B6 *2 e *3 (Exons 1 e 5)

 Enzima Hae II

A incubação foi feita a 37º C durante 4 horas

4.8.2.2. Alelo CYP2B6 *9 (Exon 4)

 Enzima Bsr I

A incubação foi feita a 65º C durante 16 horas

Tampão NB3(10X) 2 µL

Produto amplificado 10 mL

Hae II (20 U/µL) 0,05µL

dH20 até volume total de 20 µL

Tampão NB3(10X) 2 µL

Produto amplificado 10 mL

BsrI (5 U/µL)

0,2µL

dH20 até volume total de 20 µL

METODOLOGIA

4.8.2.3. Alelo CYP2B6 *4 (Exon 5)

 Enzima Sty I

A incubação foi feita a 37º C durante 4 horas

4.8.2.4. Alelo CYP2B6 *5 (Exon 9)

 Enzima Bgl II

A incubação foi feita a 37º C durante 4 horas

4.8.2.5. Alelo CYP2C8 *2 (Exon 5)

 Enzima Bcl I

A incubação foi feita a 50º C durante 16 horas

4.8.2.6. Alelo CYP2C8 *3 (Exon 3 e 8)

 Enzima Bse RI

A incubação foi feita a 37º C durante 16 horas

Tampão NB3(10X) 2 µL

Produto amplificado 10 mL

Sty I (10 U/µL)

0,5µL

dH20 até volume total de 20 µL

Tampão NB3(10X) 2 µL

Produto amplificado 10 mL

Bgl II (10 U/µL)

0,1µL

dH20 até volume total de 20 µL

Tampão NB3(10X) 2 µL

Produto amplificado 10 mL

Bcl I (15 U/µL)

0,07µL

dH20 até volume total de 20 µL

Tampão NB2(10X) 2 µL

Produto amplificado 10 mL

Bse RI (4 U/µL)

0,25µL

dH20 até volume total de 20 µL

METODOLOGIA

 Enzima Xmn I

A incubação foi feita a 37º C durante 16 horas

4.8.2.7. Alelo CYP2C8 *4 (Exon 5)

 Enzima Taq I

A incubação foi feita a 65º C durante 4 horas

Tampão NB2(10X) 2 µL

Produto amplificado 10 mL

Xmn I (20 U/µL)

0,05µL

dH20 até volume total de 20 µL

Tampão NB3(10X) 2 µL

Produto amplificado 10 mL

Taq I (20 U/µL)

0,05µL

dH20 até volume total de 20 µL

METODOLOGIA

4.9. ANÁLISE DOS DADOS

As informações de cada participante incluído no estudo foram depositadas numa planilha

elaborada no programa “Microsoft Excel” e transportados para “SPSS 11.5 for Windows”, onde

foram codificadas para posterior análise. Quando as mutações pontuais testadas não fossem

encontradas, os indivíduos foram considerados portadores de alelo selvagem CYP2B6*1 e

CYP2C8*1 para os genes CYP2B6 e CYP2C8, respectivamente. A análise foi feita de acordo com

a natureza dos dados, comparando as frequências alélicas por gênero e as frequências alélicas,

genotípicas e haplotípicas por região dos indivíduos envolvidos no estudo. A análise estatística

foi feita utilizado o teste χ

ou teste exato de Fisher a um nível de significância de 95%. O

número observado de cada mutação foi comparado com o esperado para uma população em

equilíbrio de Hardy-Weinberg, usando o teste χ

, tendo sido considerados significativos os

valores de p <0,05.

4.10. ASPECTOS ÉTICOS

O protocolo do presente estudo foi aprovado pelo Comitê Nacional de Bioética para

Saúde de Moçambique no dia 28 de Julho de 2008 com o número 199/CNBS e Comitê de Ética

da FIOCRUZ no Rio de Janeiro no dia 28 de Abril de 2009 com o número 040/09 (Apêndice 3).

4.11. SUPORTE FINANCEIRO

Este projeto foi financiado pelo:





 Ministério da Saúde de Moçambique (MISAU);





 Laboratório de Biologia Molecular Aplicado a Micobactérias (IOC- FIOCRUZ)

RESULTADOS

5. RESULTADOS

5.1. Características dos indivíduos estudados

Foram elegíveis e incluídos no estudo 384 voluntários entre 18 a 65 anos (idade média de

30 anos) (Gráfico 5.1). Destes, três foram excluídos por não satisfazerem os critérios de inclusão

no estudo; adicionalmente, vinte e uma amostras foram também excluídas devido a dificuldades

de amplificação, não podendo ser genotipadas. As frequências genotípicas esperadas na

população estudada foram consistentes com a Lei do equilíbrio de Hard-Weinberg em todos os

SNPs estudados.

Gráfico 5.1. Distribuição dos indivíduos estudados de acordo com a idade.

Média = 30,2

Mediana = 28

Desvio padrão = 9.74

Idade

(em anos)

RESULTADOS

O gráfico 5.2 mostra as características sócio-demográficas da população estudada. Pode

se observar que os indivíduos incluídos no estudo foram todos de ascendência africana e na sua

maioria do gênero masculino nas três regiões onde as amostras foram coletadas.

Gráfico 5.2. Distribuição dos indivíduos segundo as características de gênero e ascendência.

5.2. Padronização dos procedimentos técnicos utilizados

5.2.1. Sistemas CYP2B6*2,*3,*4,*5,*6, *7 e *9

Com vista à determinação das condições ideais para as reações de amplificação do gene

CYP2B6 em amostras de DNA imobilizadas em cartão de filtro FTA, foram realizados vários

testes para a padronização dos sistemas conforme descrito a seguir: a) adição de diferentes

quantidades de discos do cartão FTA de 1,2mm de diâmetro na mistura de reação para a

amplificação (Figura 5.1), b) diferentes concentrações de cloreto de magnésio, c) diferentes

aditivos (Tween 20, Glicerol, Betaína, BSA e DMSO) e d) diferentes temperaturas de anelamento

através de gradiente de temperatura.

Com base nos experimentos realizados, foram estabelecidas as condições de amplificação

de todos os sistemas do gene CYP2B6 nas seguintes condições: temperatura de anelamento de 50

a 60°C, de 1,5 a 3,0mM de MgCl

0,2mM de dNTPs, de 1 a 2,5 U de Taq polimerase e 4 a 6

discos de cartão FTA de 1,2mm de diâmetro, 20pmol de cada oligonucleotídeo num volume final

de reação de 25µL a 50µL conforme especificado individualmente na Tabela 5.1. As

amplificações são mostradas na Figura 5.2.

RESULTADOS

Tabela 5.1. Protocolos padronizados utilizados para a amplificação do gene CYP2B6, exons 1, 4, 5 e 9.

Exon

Sequências de oligonucleotídeos

Ciclagem

Tamanho do

produto

(a)

F- 5´-ACATTCACTTGCTCACCT- 3´

R-5´-GTAAATACCACTTGACCA- 3

723pb

(b)

F- 5’-GGTCTGCCCATCTATAAAC- 3’

R- 5´-CTGATTCTTCACATGTCTGCG- 3´

526pb

(c)

F- 5´-GACAGAAGGATGAGGGAGGAA- 3´

R- 5´-CTCCCTCTGTCTTTCATTCTGT- 3

640pb

(d)

F- 5´-TGAGAATCAGTGGAAGCCATAGA-3´

R-5´-TAATTTTCGATAATCTCACTCCTGC-3´

1401pb

(a, b e c) -

A PCR foi realizada em 25µL de mistura de reação com tampão 1X, 1U de Taq polimerase

(Invitrogen), 2,5mM de MgCl

e 10% de Glicerol e 4 discos de cartão FTA. (d) – A PCR foi realizada em 50µL

de mistura de reação com tampão 1X, 2,5U de Taq polimerase (Invitrogen), 1,5mM de MgCl

, 0,5% de Tween 20

e 0,01% de BSA. Para a amplificação, 6 discos de cartão FTA foram adicionados na mistura de reação.

95º C 5’

95º C 30’’

50º C 30’’

72º C 60’’

72º C 10’

4º C ∞

30X

95º C 5’

95º C 30’’

56º C 30’’

72º C 40’’

72º C 10’

4º C ∞

30X

95º C 5’

95º C 30’’

59º C 30’’

72º C 60’’

72º C 10’

4º C ∞

30X

95º C 5’

95º C 30’’

59º C 30’’

72º C 60’’

72º C 10’

4º C ∞

30X

RESULTADOS

Figura 5.1. Gel de agarose 2% mostrando a padronização da PCR em amostras de DNA

no cartaão de filtro FTA. Os números de 1 a 10 indicam o número de discos de 1,2mm

adicionandos no mix da PCR. M- marcador molecular (DNA ladder 100pb).

Figura 5.2. Gel de agarose 2% ilustrando a amplificação do gene CYP2B6 para a

genotipagem dos alelos CYP2B6*2, *3, *4, *5, *6, *7 e *9. Os números de 1 a 4 indicam a

numeração das amostras. M- marcador molecular (DNA ladder 100pb).

M 1 2 3 4

2 3 4

2 3

4 5 6 7 8 9 10

RESULTADOS

A digestão do material amplificado dos sistemas CYP2B6*2 (64C>T) e *5 (1459C>T)

(Figura 5.3) e CYP2B6*3 (777C>A), *6 (516G>T, 785A>G) *7 (516G>T, 785A>G, 1459C>T) e

*9 (516G>T) (Figura 5.4) foi realizada conforme descrito anteriormente (Lang et al., 2001),

usando uma unidade de enzima por amostra; no entanto, para o sistema CYP2B6*4 foram usadas

cinco unidades de enzima por amostra.

Figura 5.3. Eletroforese em gel de agarose 2% mostrando o perfil de restrição após a digestão do

material amplificado para os sistemas CYP2B6*2 (64C>T) (A) e *5 (1459C>T) (B). *1/*1- perfil

homozigoto selvagem; *1/*2 e*1/*5- perfis heterozigotos. M - marcador molecular (DNA ladder

100pb).

[A] [B]

RESULTADOS

Figura 5.4.

Eletroforese em gel de agarose 2% mostrando o perfil de restrição após a digestão do

material amplificado para os sistemas CYP2B6*3 (777C>A) (A),*6 (516G>T, 785A>G) (B, C) *7

(516G>T, 785A>G, 1459C>T) e *9 (516G>T) (C). *1/*1- perfil homozigoto selvagem; *1/*4 e

*1/*9- perfis heterozigotos; *4/*4 e *9/*9- perfis homozigotos mutantes. M - marcador molecular

(DNA ladder 100pb).

[A]

[C]

[B]

RESULTADOS

5.2.2. Sistemas CYP2C8*2, *3 e *4

Similarmente ao ocorrido no gene CYP2B6, as condições de amplificação do gene

CYP2C8 foram padronizadas para a PCR a partir de amostras de sangue impregnado num cartão

de filtro FTA. Os sistemas CYP2C8*2 e *3 foram padronizados utilizando as seguintes

condições: volume final de 50µL da mistura da reação com tampão 1X, 2,5mM de MgCl

0,2mM de dNTPs, 0,25µM de cada oligonucleotídeo e 1U/µL de Taq polimerase, 10% de

Betaína e 5 discos de cartão FTA de 1,2mm. O sistema CYP2C8*4 foi padronizado num volume

final de 25µl da mistura da reação, 2,5mM de MgCl

, 1X de tampão, 250µM de dNTPs, 0,4µM

de cada oligonucleotídeo, 10% de glicerol e 1U de Taq polimerase e 3 discos de cartão FTA de

1,2 mm (Tabela 5.2). A Figura 5.5 mostra as amplificações dos respectivos produtos.

Tabela 5.2. Protocolos padronizados utilizados para a amplificação do gene CYP2C8, exons 3, 5 e 8.

Exon

Sequências de oligonucleotídeos

Ciclagem

Tamanho do

produto

F- 5’-AGGCAATTCCCCAATATCTC -

3’

R- 5`- ACTCCTCCACAAGGCAGTGA-3

347pb

F-5’-AAGATACATATATCTTATGACATG-3’

R- 5’-ATCCTTAGTAAATTACAGAAGG-3’

312pb

F- 5’-CTTCCGTGCTACATGATGACG-3’

R- 5`-CTGCTGAGAAAGGCATGAAG-3

117pb

F- 5’- AAAGTAAAAGAACACCAAGC-3’

R- 5’-AAACATCCTTAGTAAATTACA-3’

1401pb

95º C 5’

94º C 20’’

55º C 20’’

72º C 10’’

72º C 5’

4º C ∞

38X

º C 5’

94º C 30’’

48º C 30’’

72º C 30’’

72º C 5’

4º C ∞

30X

RESULTADOS

Figura 5.5. Gel de agarose 4% ilustrando a amplificação do gene CYP2C8, exons 3, 5 e 8

para a genotipagem dos alelos CYP2C8*2, *3 e *4. Os números de 1 a 5 indicam a

numeração das amostras. M- marcador molecular de 100pb

Para os sistemas CYP2C8*2,*3, a digestão do material amplificado foi realizada

conforme descrito anteriormente (Dai et al., 2001) e para o sistema CYP2C8*4 (Nakajima et

al., 2003). A Figura 5.6 mostra os perfis de digestão do material amplificado para a

genotipagem dos alelos CYP2C8*2, *3 e *4.

2 3

M 1 2 3

M 1 2 3 4 5

RESULTADOS

Figura 5.6. Gel de agarose 4% ilustrando a digestão do material amplificado nos sistemas: CYP2C8*2

(A) *3 (C, D) e *4 (B). *1/*1- perfil homozigoto para o genótipo selvagem; *1/*2, *1/*3 e *1/*4-

perfis heterozigotos; *2/*2- perfil homozigoto mutante. M - marcador molecular (DNA ladder 100bp),

P- produto não digerido.

5.3. Sequenciamento e análise dos SNPs encontrados nos genes CYP2B6 e CYP2C8, através

do “SeqScape”.

Após a genotipagem de todas as amostras pela técnica de PCR-RFLP, parte das amostras

portadoras das mutações foi submetida ao sequenciamento para a confirmação dos SNPs

encontrados. Assim, após a purificação, os produtos da PCR foram sequenciados utilizando os

mesmos oligonucleotídeos usados para a amplificação do DNA genômico. De forma a obter

sequências completas e de boa qualidade, as reações de sequenciamento foram realizadas nos

dois sentidos (senso e anti-senso). Após o sequenciamento, verificou-se a perda de uma pequena

parte da sequência nas extremidades em todas as amostras devido à má qualidade das sequências

[A]

[B]

[D]

[C]

RESULTADOS

obtidas. Entretanto, tal perda não comprometeu a região de interesse referente ao produto

amplificado em todas as amostras.

Para a análise das sequências obtidas nas amostras analisadas foi utilizado o programa

“SeqScape v.2.6” (Applied Biosystems). Foram utilizadas as sequências de RNA mensageiro

AC023172 e NM

000770 como referência para o alinhamento com as sequências obtidas dos

genes CYP2B6 e CYP2C8, respectivamente, possibilitando a identificação e a confirmação de

todos os SNPs genotipados por RFLP em ambos os genes

(Figura 5.7).

Figura 5.7. Identificação do SNP 516G>T no gene CYP2B6, visualizado através dos cromatogramas

apresentados pelo programa “SeqScape”. [A] - genótipo mutante heterozigoto, [B] - genótipo mutante

homozigoto.

516G>T

Dois picos pretos (Guanina) e o pico vermelho (Timina), genótipo GT

Um pico vermelho (Timina) genótipo TT

[A]

[B]

RESULTADOS

5. 4. Análise descritiva dos polimorfismos na população estudada.

5.4.1. Gene CYP2B6

Trezentos e sessenta amostras foram amplificadas e genotipadas para a detecção das

mutações 64C>T, 516G>T, 777C>A, 785A>G e 1459C>T (Tabela 5.4.1.1 e Tabela 5.4.1.2). As

mutações mais prevalentes foram 516G>T (42.6%), 785A>G (41%), tendo sido detectadas tanto

em heterozigose como em homozigose, as mutações 64C>T, 777C>A e 1459C>T, as quais

apresentaram frequências de 6,0%, 0% e 0,4%, respectivamente, foram encontradas em menor

percentagem.

Tabela 5.4.1.1. Distribuição das frequências genotípicas absolutas e alélicas dos SNPs identificados no

gene CYP2B6 na população estudada (n=360).

SNP Genótipo Número

de amostras

Frequência

absoluta

Frequência

alélica (%)

CC 325 0, 902

64C>T

CT 28 0, 077

TT 7 0, 019

(fa)T 6,0%

GG 112 0, 311

516G>T

GT 191 0, 530

TT 57 0, 158

(fa)T 42,6%

CC 360 1,00

777C>A

CA 0 0,00

(fa)A

0 0,00

AA 131 0, 363

785A>G

AG 165 0, 458

GG 64 0, 177

(fa)G 41%

CC 357 0, 991

1459C>T

CT 3 0, 008

TT 0 0,00

(fa)T 0,4%

(fa) - frequência alélica.

RESULTADOS

A Tabela 5.4.1.2 mostra a distribuição das mutações e as suas combinações nos

indivíduos analisados. Podemos observar que em sessenta e seis (18,3%) dos 360 indivíduos

testados não foi detectada nenhuma das mutações descritas na literatura, grupo portador do alelo

selvagem CYP2B6*1. Noventa e quatro (26,1%) indivíduos foram portadores de apenas uma

mutação e duzentos (55,5%) apresentaram diferentes combinações das mutações. Pôde-se

observar também que a combinação das mutações 516G>T e 785A>G era mais frequente, tendo

sido detectada em 30% dos indivíduos testados na forma heterozigótica e 6,38% em homozigose.

Tabela 5.4.1.2. Frequências de mutações e suas combinações do gene CYP2B6 entre 360

indivíduos estudados.

SNP Aminoácido

trocado

Genótipo Nº de

indivíduos

Frequência

(%)

Nenhum

WT* WT*

66 18,3

C64T

R22C

CT 6 1,7

A785G

K262R

AG 21 5,8

A785G

K262R

GG 11 3,05

G516T

Q172H

GT 40 11,1

G516T

Q172H

TT 15 4,16

C1459T

R487C

CT 1 0,27

G516T

Q172H

GT 108 30

A785G

K262R

G516T

Q172H

6,1

A785G

K262R

G516T

Q172H

6,38

A785G

K262R

C64T

R22C

G516T

Q172H

GT 10 2,77

A785G

K262R

G516T

Q172H

A785G

K262R

AG 2 0,55

C64T

R22C

G516T

Q172H

A785G

K262R

AG 1 0,27

C1459T

R487C

G516T

Q172H

A785G

K262R

GG 1 0,27

C1459T

R487C

RESULTADOS

Continuação da Tabela 5.4.1.2.

SNP Aminoácido

trocado

Genótipo Nº de

indivíduos

Frequência

(%)

G516T

Q172H

4,44

A785G

K262R

C64T

R22C

1,11

A785G

K262R

C64T

R22C

0,27

A785G

262R

G516T

Q172H

0,83

C64T

R22C

G516T

Q172H

C64T

R22C

CT 2 0,55

A785G

K262R

G516T

Q172H

C64T

R22C

CT 1 0,27

A785G

K262R

G516T

Q172H

C64T

R22C

CT 1 0,27

A785G

K262R

C64T

R22C

0,27

A785G

K262R

C64T

R22C

0,27

A785G

K262R

C64T

R22C

G516T

Q172H

GT 2 0,55

A785G

K262R

C64T

R22C

G516T

Q172H

TT 1 0,27

A785G

K262R

(*) - Selvagem

Após a avaliação das frequências e das combinações das mutações detectadas, a variável

gênero foi testada para verificar a influência da mesma na distribuição das mutações encontradas.

Em ambos os grupos de gênero, as mutações 516G>T e 785A>G foram as mais prevalentes. Pode

se observar que, em nossa população de estudo, todas as mutações estudadas foram mais

frequentes em indivíduos do gênero feminino do que indivíduos do gênero masculino; no entanto,

a diferença entre os dois gêneros não foi significativa (Tabela 5.4.1.3).

RESULTADOS

Tabela 5.4.1.3. Distribuição das frequências alélicas das mutações identificadas no gene CYP2B6 nas

amostras analisadas de acordo com o gênero.

Masculino Feminino

(N= 522) (N= 198)

SNP alelo frequência frequência p-valor OR IC (95%)

64C>T

C 0,94 0,93

0,05 0,06 0, 524 1,25 [0,60 - 2,57]

516G>T

G 0,60 0,52

0,40 0,48 0, 060 1,37 [0,97 -1,93]

785A>G

A 0,60 0,55

0,39 0,44 0, 207 1,24 [0,88 -1,75]

777C>A

C 1,00 1,00

0,00 0,00 n.d n.d n.d

1459C>T

C 0,99 0,99

0, 001 0,01 0, 184* 5,32 [0,38 - 148,82]

N- número de alelos, n.d - Não determinado, (*) - Teste exato de Fisher

A distribuição das mutações detectadas foi também analisada por região. A comparação

estratificada das frequências alélicas das mutações em questão entre as três regiões estudadas não

mostrou diferença significativa (Tabela 5. 4.1.4).

Tabela 5. 4.1.4. Distribuição das frequências alélicas em populações das três regiões estudadas.

REGIÃO

SNP Norte (N=196) Centro (N=120) Sul (N=404) p-valor

frequência frequência frequência

64C

041

050

070

344

516G>T

382

408

448

294

777C>A

n.d

785A>G

382

416

415

719

1459C>T

008

005

0, 930*

- número de alelos, (n.d) - Não determinado, (*) - teste exato de Fisher

RESULTADOS

Face ao número de SNPs encontrados em heterozigose na população estudada, para a

identificação dos possíveis haplótipos e a determinação das respectivas frequências foi utilizado o

programa bioestatístico PHASE versão 2.1. Dentre as 360 amostras analisadas foram

identificados 12 haplótipos para os cinco SNPs identificados na região codificante do gene

CYP2B6 (Tabela 5.4.2.4). Pode se observar que o haplótipo 1 (selvagem) foi o mais frequente,

seguido pelo haplótipo 7, constituído pela combinação dos SNPs 516G>T e 785A>G (alelo

CYP2B6*6) (24,7%).

Tabela 5. 4.1.5. Frequência dos haplótipos identificados no gene CYP2B6 (n=360).

Haplótipos 64 C>T 516 G>T 777 C>A 785 A>G 1459 C>T

Frequência (%)

C G C A C 40,9

C G C A T 0,2

C G C G C 12,5

C G C G T 0,07

C T C A C 15,4

C T C A T 0, 006

C T C G C 24,7

C T C G T 0,13

T G C A C 2,12

T G C G C 1,6

T T C A C 0,52

T T C G C 1,5

Para verificar possíveis diferenças na distribuição dos haplótipos entre as três regiões

estudadas procedemos a uma comparação estratificada das frequências haplotípicas encontradas.

Para o efeito, foram selecionados somente os haplótipos que se apresentaram em altas

frequências: haplótipo 1 (CGCAC), haplótipo 3 (CGCGC), haplótipo 5 (CTCAC) e haplótipo 7

(CTCGC). Após esta análise observou-se que a diferença na distribuição destes haplótipos nas

três regiões não foi significativa (Tabela 5.4.1.6).

RESULTADOS

Tabela 5. 4.1.6. Análise da distribuição das frequências haplotípicas por região.

REGIÃO

Haplótipo Norte (N=196) Centro (N=120) Sul (N=404) p-valor

freq.

(%)

freq.

(%)

freq.

(%)

CGCAC

(46,4)

(45,0

)

174

(43,1)

0, 627

CGCGC

(13,3)

(9,2)

(8,42)

0, 247

CTCAC

(13,3)

(11,7)

(12,9)

0, 915

CTCGC

(23,5)

(27,5)

114

(28,2)

0, 271

N - número de alelos, (*) - entre parênteses está indicado o percentual dos haplótipos.

5.4.2. Gene CYP2C8

Para a análise deste gene 360 amostras foram amplificadas e genotipadas para quatro

mutações não-sinôminas. As frequências genotípicas e alélicas, assim como as combinações das

mutações detectadas nos indivíduos analisados estão apresentados na Tabela 5.4.2.1 e na Tabela

5.4.2.2, respectivamente.

A frequência da mutação 805A>T (CYP2C8*2) foi a mais alta, tendo sido detectada em

16% dos indivíduos analisados, sendo 30,8% em heterozigose e somente 0,83% homozigotos. A

frequência da mutação 792C>G (CYP2C8*4) foi muito baixa e representou 0,5%. O alelo

CYP2C8*3 que resulta da combinação das mutações 416G>A e 1196A>G não foi detectado. No

entanto, um percentual de 4,8% dos indivíduos analisados foram portadores da mutação 416G>A,

sendo 8,6% em heterozigose e 0,5% em homozigose.

RESULTADOS

Tabela 5.4.2.1. Distribuição das frequências genotípicas absolutas e alélicas dos SNPs identificados no

gene CYP2C8 na população estudada (n=360).

SNP Genótipo Número de

amostras

Frequência

Absoluta

Frequência

alélica (%)

AA 246 0, 683

805A>T

AT 111 0, 308

TT 3 0, 008

(fa)T 16%

GG 327 0, 908

416G>A

GA 31 0, 086

005

(fa)A 4,8%

AA 360 1,00

1196A>G

AG 0 0,00

(fa)G

0 0,00

CC 356 0, 988

792C>G

CG 4 0, 011

(fa)G 0,5%

(fa) - frequência alélica.

A distribuição das mutações e as suas combinações entre os indivíduos analisados estão

descritos na Tabela 5.4.2.2. Podemos observar que duzentos e dezessete (60,3%) indivíduos

testados não apresentaram nenhuma das mutações descritas, sendo, portanto portadores do alelo

selvagem CYP2C8*1. Cento e trita e cinco (37,5%) indivíduos foram portadores de apenas uma

mutação, enquanto que somente oito (2,22%) foram portadores da combinação das mutações

416G>A e 805A>T, ambas em forma heterozigótica.

RESULTADOS

Tabela 5.4.2.2. Distribuição das mutações identificadas no gene CYP2C8 entre 360 indivíduos estudados.

SNP Aminoácido trocado

Genótipo Nº de indivíduos

Freq

ência

(

)

Nenhum

WT*

217 60,3

G416A R139K GA 23 6,38

G416A R139K AA 2 0,56

C792G I264M CG 4 1,11

A805T I269F AT 103 28,6

A805T I269F TT 3 0,83

G416A R139K GA

2,22

A805T I269F AT

(*) - Selvagem

Para verificar a influência da variável gênero na distribuição das mutações encontradas

neste gene, as frequências alélicas das mutações detectadas foram testadas em relação a esta

variável demográfica. A mutação mais prevalente em ambos os grupos foi a 805A>T. No

entanto, não foi observada diferença estatística significativa na distribuição das frequências

alélicas nos dois gêneros (Tabela 5.4.2.3).

Tabela 5.4.2.3. Distribuição das frequências alélicas do gene CYP2C8 encontrados nos indivíduos

analisados de acordo com o gênero.

Masculino

(N=522)

Feminino

(N=198)

SNP alelo frequência frequência p-valor OR

IC (95

)

805A>T A

0,84 0,84

0,16 0,16 0, 790 0,94 [0,59 -1,50]

416G>A G

0,96 0,94

0,04 0,06 0, 356 1,40 [0,64 -3,01]

1196A>G A

1,00 1,00

0,00 0,00 n.d n.d n.d

792C>G C

0, 996 0,99

0, 004 0,01 0, 304* 2,65 [0,27 - 26,47]

N - número de alelos, n.d - Não determinado, (*) - Teste exato de Fisher

RESULTADOS

A tabela 5.4.2.4 mostra a distribuição das mutações detectadas por região. Após a

comparação estratificada das frequências alélicas das mutações identificadas nas três regiões

estudadas, nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada.

Tabela 5.4.2.4. Distribuição das frequências alélicas em populações das três regiões estudadas.

REGIÃO

SNP Norte (N=196) Centro (N=120) Sul (N=404) p-valor

frequência frequência frequência

805A>T

0, 193 0,15 0,50 0, 377

416G>A

0, 025 0,05 0, 059 0, 193

1196A>G

0,00 0,00 0,00 n.d

792C>G

0,00 0, 016 0,004 0, 497

N - número de alelos, n.d - Não determinado.

A determinação dos haplótipos e as respectivas frequências, realizada através do

programa bioestatístico PHASE versão 2.1.1, permitiu a identificação de cinco haplótipos para os

quatro SNPs identificados na região codificante neste gene (Tabela 5.4.2.5). Dos cinco haplótipos

identificados, o haplótipo 3, correspondente ao genótipo selvagem dos SNPs estudados, foi o

mais frequente com um percentual de 78,6%. Dentre os haplótipos constituídos por variantes

alélicas, o haplótipo 4 foi o mais frequente com um percentual de 15,9%. A tabela 5.4.2.6 mostra

a distribuição dos haplótipos mais frequentes, o haplótipo 3 (GCAA) e o haplótipo 4 (GCTA), na

população estudada nas três regiões. Não foi observada diferença significativa entre as três

regiões geográficas após comparação estratificada das frequências destes haplótipos.

RESULTADOS

Tabela 5.4.2.5. Frequência dos haplótipos identificados no gene CYP2C8 (n=360).

Haplótipos

416 G>A 792 C>G 805 A>T 1196 A>G

Frequência

(%)

A C A A

4,4

A C T A

0,4

G C A A

78,6

G C T A

15,9

G G A A

0,6

Tabela 5. 4.2.6. Distribuição das frequências haplotípicas por região.

REGIÃO

Haplótipo Norte (N=196) Centro (N=120) Sul (N=404) p-valor

freq.

(%)

freq

.(%)

freq.

(%)

GCAA

155

(

79,1

)

(

)

328

(

81,2

)

0, 793

GCTA

)

(

)

(

16.8

)

0, 737

N - número de alelos, (*) - entre parênteses está indicado o percentual dos haplótipos.

DISCUSSÃO

6. DISCUSSÃO

A malária, em especial a causada por P. falciparum, continua entre as principais causas de

morbi-mortalidade nos países em desenvolvimento, com especial relevância na África sub-

sahariana, onde a resistência aos antimaláricos comumente usados é generalizada. A emergência

da resistência, particularmente do P. falciparum, tem contribuído bastante para o ressurgimento

global da malária nos últimos anos, tendo já se desenvolvido em quase todas as classes de drogas

antimaláricas (White, 2004). Apesar de a resistência ser um dos principais fatores de insucesso

terapêutico, vários outros fatores, como os fatores genéticos do hospedeiro, particularmente

envolvidos na resposta terapêutica, uso incorreto ou doses subterapêuticas, estado nutricional ou

interações com outros medicamentos podem contribuir para a modulação da resposta terapêutica

(Baird, 2002). Sendo a malária uma infecção sanguínea, a resposta ao tratamento é determinada

pela concentração da droga ou do metabólito ativo no sangue. Neste contexto, as variações na

concentração plasmática dos antimaláricos podem, além de afetar a eficácia terapêutica,

contribuir para a seleção de parasitos resistentes e ao aparecimento de efeitos colaterais (Hastings

et al., 2002). Esta variabilidade pode ter como causa vários fatores que podem incluir variações

na absorção, distribuição, metabolismo e excreção das drogas.

Nos últimos anos, os conhecimentos sobre a biologia molecular têm tido um impacto

importante no entendimento da biologia humana, incluindo a ação dos fármacos e outros

xenobióticos. Com a conclusão do Projeto Genoma Humano a farmacogenética emergiu, e um

dos avanços importantes no campo de pesquisas farmacogenéticas é a avaliação do impacto nos

cuidados da saúde e nas práticas médicas pela possibilidade de uma farmacoterapia

individualizada através do estudo genotípico de cada indivíduo, adaptando o fenótipo a resposta

segura aos medicamentos, diminuindo a probabilidade de eventos adversos. Os polimorfismos

encontrados em enzimas envolvidas na biotransformação de fármacos tem sido um dos focos

principais nas pesquisas farmacogenéticas. A maioria dos genes que codificam para enzimas

envolvidas na metabolização de fármacos utilizados na prática clínica é polimórfica e muitas

vezes as variações genéticas nesses genes ocorrem em alta frequência.

O sistema CYP450 é uma superfamília de heme-proteínas amplamente distribuída em

todos os seres vivos e estão envolvidas no metabolismo de uma variedade de drogas, substâncias

endógenas e xenobióticas, incluindo antimaláricos. Variações genéticas em enzimas

metabolizadoras de drogas pertencentes aos diversos membros destas superfamílias são

DISCUSSÃO

responsáveis pela variabilidade interindividual e interétnica da resposta terapêutica,

suscetibilidade a doenças, ocorrência de efeitos colaterais e interações medicamentosas. Assim

sendo, a determinação de marcadores genéticos que possam ajudar a predizer os desfechos

terapêuticos do tratamento por antimaláricos mais usados na atualidade pode ajudar a

compreender os padrões de resposta terapêutica e melhor direcionar não somente a indicação do

uso do medicamento correto bem como o esquema posológico adequado para determinados

indivíduos, promovendo uma utilização racional dos antimaláricos preservando assim a sua

eficácia terapêutica em regiões onde o insucesso do tratamento da malária representa um sério

problema. As isoenzimas CYP2B6 e CYP2C8 do sistema CYP450 são as principais isoformas

deste complexo enzimático, responsáveis pela metabolização da artemisinina, seus derivados e a

amodiaquina, respectivamente, antimaláricos que se encontram entre as principais opções

terapêuticas em países endêmicos, incluindo Moçambique. Vários polimorfismos de base única

com importância tanto na regulação da expressão gênica quanto na atividade das enzimas têm

sido reportados nestes genes. Tendo em vista a importância que esses polimorfismos podem ter

na modulação da resposta terapêutica destes antimaláricos, resolvemos no presente estudo

caracterizar a diversidade alélica dos genes CYP2B6 e CYP2C8 através de PCR-RFLP em

indivíduos sadios provenientes de regiões distintas de Moçambique. Trata-se de um estudo

preliminar para conhecer o perfil dos polimorfismos dos genes referidos em termos de frequência

alélica, genotípica e haplotípica nas comunidades endêmicas a malária de modo a obter

informações de base capazes de nortear futuros estudos para avaliar o impacto prático desses

polimorfismos no tratamento da malária.

6.1. Análise das frequências dos polimorfismos estudados no gene CYP2B6

O gene CYP2B6 está envolvido na biotransformação de uma ampla variedade de fármacos

de uso clínico, incluindo a artemisinina e alguns dos seus derivados (Grace et al., 1998; Svensson

e Ashton, 1999). Polimorfismos de base única têm sido descritos neste gene por vários autores,

no entanto, as suas frequências variam de acordo com as populações estudadas (Hiratsuka et al.,

2002; Guan et al., 2006; Mehlotra et al., 2006). No momento, poucos dados existem sobre a

ocorrência desses polimorfismos em populações de regiões africanas endêmicas a malária, onde

os antimaláricos são usados com maior frequência. Neste estudo, analisamos a prevalência das

variantes alélicas já descritas no gene CYP2B6 em populações moçambicanas. Os resultados

DISCUSSÃO

obtidos mostram evidências da ocorrência destas mutações na população estudada. As variantes

alélicas 516G>T e 785A>G que caracterizam o alelo CYP2B6*6 se apresentaram com maior

frequência na nossa amostragem, com percentuais de 42,6% e 41%, respectivamente. O SNP

64C>T que caracteriza o alelo CYP2B6*2 foi a terceira variante mais frequente, tendo sido

detectada em 6% dos indivíduos analisados. Após a análise da combinação dos diferentes SNPs

encontrados foram identificadas 18 combinações para todas as mutações estudadas como

apresentado na Tabela 5.4.1.2. A combinação das mutações 516G>T e 785A>G (CYP2B6*6),

tanto em homozigose como em heterozigose, foi observada com maior frequência, indicando a

ocorrência comum do alelo *6 nesta população. Poucos estudos descrevendo a frequência deste

alelo foram reportados em populações africanas. Num estudo realizado em 103 crianças com

malária não complicada em Zanzibar, Ferreira e colaboradores reportaram uma prevalência de

32% do alelo CYP2B6*6 (Ferreira et al., 2008), enquanto que Nyakutira e colaboradores

reportaram a prevalência de 49% do mesmo alelo em 70 pacientes com HIV/AIDS em tratamento

com efavirenz no Zimbábue (Nyakutira et al., 2008). Noutro estudo envolvendo indivíduos

provenientes de regiões africanas endêmicas a malária,

Melhotra e colaboradores reportaram uma

prevalência de 42% de portadores do alelo CYP2B6*6 em 166 indivíduos incluídos no estudo

(Melhotra et al., 2006). Embora os números amostrais utilizados nesses estudos fossem

relativamente inferiores em relação ao número amostral do nosso estudo, as frequências de 32%,

49% e 42% reportados nesses estudos não diferem tanto das encontradas em nosso estudo,

mostrando ocorrência frequente destas mutações em populações de origem africana. Estudos

realizados em populações de origem asiática reportaram frequências das mutações 516G>T e

785A>G variáveis entre 14% a 47% (Cho et al., 2004; Hiratsuka et al., 2002), enquanto que em

populações caucasianas as frequências reportadas variaram entre 25,5% a 28,7% (Lang et al.,

2001; Lamba et al., 2003).

O alelo CYP2B6*5, caracterizado pela mutação 1459C>T que gera uma troca do

aminoácido Arg

487

Cys no exon nove, está associado a uma diminuição de oito vezes da atividade

enzimática em indivíduos homozigóticos em relação aos indivíduos de genótipo selvagem, tendo

um considerável impacto na atividade da mesma (Lang et al., 2001). Em nosso estudo, esta

mutação foi encontrada em apenas três indivíduos de forma heterozigótica. Este achado sugere

uma ocorrência menos frequente desta mutação na nossa população de estudo. Em um estudo

realizado em populações de origem caucasiana, Lamba e colaboradores reportaram uma

prevalência de 14% (Lamba et al., 2003), significativamente maior que a encontrada em nosso

DISCUSSÃO

estudo (0,4%). Tratando-se de duas populações etnicamente distintas a diferença observada pode

explicar, em parte, a acentuada diferença étnica da atividade enzimática relatada na literatura. Em

um estudo realizado por Kim e colaboradores em microssomas hepáticos indivíduos etnicamente

diferentes (asiáticos e caucasianos), observaram níveis de expressão das enzimas de CYP1A2 e

CYP2B6 três vezes superiores em amostras dos indivíduos caucasianos, enquanto o nível de

expressão das enzimas da CYP2E1 foi sete vezes superior em indivíduos de origem asiática (Kim

et al., 1997). Tais variações no nível de expressão podem ser explicadas por polimorfismos nas

regiões reguladoras dos genes (Lamba et al., 2003).

A mutação 777C>A, que caracteriza o alelo CYP2B6*3, não foi detectada em nenhum dos

indivíduos analisados. Estudos anteriores em populações de origem não africana (caucasiana e

asiática) detectaram frequências inferiores a 0,5%, sugerindo a ocorrência rara desta variante

alélica (Lang et al., 2001; Hiratsuka et al., 2002; Lamba et al., 2003; Guan et al., 2006).

Embora as frequências observadas sejam significativamente diferentes entre as diferentes

populações, o significado funcional dos polimorfismos encontrados no gene CYP2B6 sobre o

metabolismo da artemisinina e seus derivados, bem como o seu impacto no desfecho terapêutico,

continua por ser determinado. Estudos in vitro analisando a expressão heteróloga demonstraram

que os polimorfismos que codificam para os alelos de CYP2B6 *5, *6 *7 e *9 podem afetar tanto

a regulação da expressão gênica quanto a quantidade e biodisponibilidade enzimática (Ariyoshi et

al., 2001; Jinno et al., 2003). Outros estudos realizados em microssomas hepáticos humanos

também demonstraram resultados similares (Lang et al., 2001; Lamba et al., 2003). Em pacientes

com AIDS tratados com os antiretrovirais amplamente utilizados, efavirenz e nevirapina, estudos

farmacocinéticos mostram que indivíduos homozigotos para o alelo CYP2B6*6 (516G>T e

785A>G) apresentavam níveis plasmáticos de efavirenz, significativamente elevados e

associados a efeitos neuropsicológicos, quando comparados com indivíduos portadores do alelo

selvagem (CYP2B6*1) (Marzolini et al., 2001; Haas et al., 2004; Rotger et al., 2005). Além dos

antiretrovirais, estas variações também foram associadas a alterações no metabolismo e

farmacocinética de outras drogas como o antidepressivo bupropiona (Hesse et al., 2004),

antineoplásico e imunossupressor ciclofosfamida (Xie et al., 2003; Nakajima et al., 2007) e do

anticonvulsante metilfenobarbital (Kobayashi et al., 2004). Artemisinina e seus derivados

pertencem a uma classe de drogas, que são rapidamente absorvidos e eliminados após

administração. A sua concentração plasmática atinge o ponto máximo num intervalo de 1 a 3

horas, dependendo da formulação e via de administração (Teja-Isavadharm et al., 2001; Hien et

DISCUSSÃO

al., 2004). Adicionalmente, a capacidade de auto-indução que resulta na aceleração do próprio

metabolismo, bem como a indução de outras famílias do citocromo P450 (Svensson e Ashton,

1999; Burk et al., 2005), levantam a possibilidade de interações medicamentosas com outras

drogas, levando-se em conta que a artemisinina e os seus derivados são co-administrados com

outras drogas substratos do citocromo P450 (Giao e de Vries, 2001). Estudos anteriores têm

mostrado grandes variações interindividuais nos parâmetros farmacocinéticos, efeitos adversos e

níveis de toxicidade dependendo da dose e via de administração da artemisinina, artesunato e

dihydroartemisinina, quer em indivíduos saudáveis como em pacientes com malária (Krishna et

al., 2001; Hien et al., 2004; Karunajeewa et al., 2006). A base para a variabilidade interindividual

da resposta observada nestes estudos parece incluir polimorfismos em genes metabolizadores.

Nesse contexto, a alta frequência destes polimorfismos observada na nossa população de estudo

sugere que os mesmos poderão estar influenciando o nível de resposta terapêutica dos

antimaláricos, bem como de outros medicamentos substratos das enzimas codificadas por este

gene. Em um estudo realizado em Coreanos, Cho e colaboradores reportaram frequências alélicas

do gene CYP2B6 significativamente diferentes, quando comparados a outras populações (Cho et

al., 2004). Nessa população, estudos posteriores em pacientes com malária mostraram que a

concentração plasmática máxima do antimalárico primaquina foi cinco vezes superior em

pacientes Coreanos comparado aos pacientes de origem Indiana e Tailandesa, enquanto que a

concentração do metabolito activo, a carboxiprimaquina, foi de 2,5 a 5 vezes menor, indicando

diferenças étnicas no metabolismo desta droga (Kim et al, 2004).

A fim de verificar a influência do gênero na distribuição das mutações estudadas,

analisamos a frequência das mutações 64C>T, 516G>T, 785A>G e 1459C>T por gênero. Nesta

análise, não foi observada diferença significativa na ocorrência destas mutações entre os dois

grupos (Tabela 5.4.2.3). No entanto, embora não tenham sido observadas diferenças

significativas, a frequência destas mutações foi elevada nos indivíduos do gênero feminino em

relação aos indivíduos do gênero masculino. Tendo em conta o número reduzido de indivíduos do

sexo feminino analisados neste estudo, é de se esperar que um aumento do número amostral

possa trazer diferença significante na ocorrência destas mutações entre os dois gêneros. Tais

diferenças podem resultar em variações significativas da expressão do gene entre os dois gêneros

reportados na literatura (Lamba et al., 2003). Com efeito, marcadas diferenças na expressão e

atividade do gene CYP2B6 foram reportadas por Lamba e colaboradores, onde indivíduos do

gênero feminino apresentaram quantidades elevadas de RNA mensageiro em relação a indivíduos

DISCUSSÃO

do gênero masculino (Lamba et al., 2003). Contudo, estas observações poderiam ser explicadas

por diferenças gênero-específicas, já reportadas, no metabolismo de certas drogas, substratos de

enzimas codificadas pelo gene CYP2B6. Segundo Wang e colaboradores, o nível relativo de RNA

mensageiro do regulador transcricional do CYP2B6, CAR (Constitutive Androstane Receptor) é

maior em indivíduos do gênero feminino em relação aos do masculino podendo ser responsável

por diferenças na taxa de transcrição do gene CYP2B6 nos dois gêneros (Wang e Negishi, 2003).

A etnia é uma variável com uma contribuição muito importante na variabilidade

interindividual no metabolismo de drogas, eficácia terapêutica e toxicidade (Evans et al., 2001 e

Chowbay et al., 2005). Vários SNPs nos genes do sistema CYP têm sido determinados com o

objetivo de explicar as variações interétnicas das respostas terapêuticas a um grande número de

drogas de uso clínico. No entanto, a frequência dos SNPs funcionais varia muito entre os

diferentes grupos étnicos estudados. Os povos que habitam atualmente Moçambique são

incluídos no grande grupo de populações africanas “os Bantu”, que povoa quase toda a África a

Sul do Sahara (Campbell e Tishkoff, 2008). Dentro deste grupo existem várias subdivisões

étnicas distribuídas ao longo das três regiões administrativas do país, dos quais os grupos Suahili,

Macuas-Lomués, Macondes ocorrem na região norte; Nhanjas e Sena na região centro e os

Tsongas no sul do país, constituem as etnias majoritárias. Neste estudo, não encontramos

diferenças significativas entre as frequências dos polimorfismos estudados em populações

provenientes das três regiões estudadas, sugerindo uma distribuição homogênea destes

polimorfismos nesta população. No entanto, esta análise carece de alguma acurácia já que, em

nosso estudo, apesar dos indivíduos incluídos terem sido agrupados de acordo com o local de

origem onde predominam as etnias majoritárias anteriormente citadas, nenhum tipo de marcador

de etnia foi genotipado para determinar com precisão a etnicidade dos indivíduos analisados.

Finalmente, quando analisamos a combinação dos diferentes SNPs identificados no gene

CYP2B6 através do programa estatístico PHASE versão 2.1, identificamos 12 combinações

haplotípicas como ilustrado na Tabela 5.4.1.5. Entretanto, quando comparamos a distribuição dos

haplótipos mais frequentes entre os indivíduos provenientes das três regiões distintas não

observamos diferença significativa, mostrando uma distribuição homogênea dos haplótipos

analisados em nossa população.

DISCUSSÃO

6.2. Análise das frequências dos polimorfismos estudados no gene CYP2C8

A isoforma CYP2C8 representa cerca de 7% do total das enzimas pertencentes ao sistema

CYP450 expresso no organismo humano (Shimada et al., 1994) sendo responsável pelo

metabolismo de cerca de 5% das drogas eliminadas na fase I do metabolismo de drogas. A

CYP2C8 é altamente polimórfica e responsável pela biotransformação de vários fármacos de uso

clínico, incluindo os antimaláricos, cloroquina e amodiaquina. Neste estudo, analisamos a

prevalência das mutações 805A>T, 416G>A e 1196A>G e 792C>G, que caracterizam os alelos

CYP2C8*2,*3 e *4, respectivamente. A frequência de cada polimorfismo foi determinada na

população de estudo, como se pode observar na tabela 5.4.2.1. O alelo selvagem CYP2C8*1 foi

observado com maior frequência (60,3%). Entretanto, um percentual de 16% dos indivíduos

analisados foi de portadores do alelo CYP2C8*2 enquanto que o alelo CYP2C8*4 foi detectado

em 0,05% dos indivíduos. O alelo CYP2C8*3, que inclui os dois SNPs específicos 416G>A e

1196A>G (Dai et al., 2001), não foi encontrado na população estudada. De acordo com Dai e

colaboradores, os SNPs 416G>A e 1196A>G geralmente ocorrem de forma simultânea numa

estreita ligação (Dai et al., 2001; Bahadur et al., 2002). No entanto, esta ligação não foi

observada no nosso estudo, uma vez que em nenhum dos indivíduos portadores da mutação

416G>A detectamos a mutação 119A>G. A presença isolada da mutação 416G>A em nossa

amostragem pode ser a possível explicação para esta observação uma vez que todos os mutantes

para o SNP 416G>A foram re-testados tendo resultado no mesmo perfil.

Os alelos CYP2C8*2 e CYP2C8*3 são os alelos funcionais frequentemente reportados no

gene CYP2C8. As suas prevalências variam de acordo com os grupos étnicos. Estudos realizados

por Dai e colaboradores mostraram que o alelo CYP2C8*2 ocorre com baixa frequência (1,6%) e

quase é inexistente em populações de origem caucasiana, enquanto que os alelos CYP2C8*3,

(14%) e CYP2C8*4 (7,4%) eram mais comuns (Dai et al., 2001; Weise et al., 2004). Em

contraste, o alelo CYP2C8*2 tem sido observado com maior frequência em populações africanas

e afro-americanas (18%). Os alelos CYP2C8*3 (2%) e CYP2C8*4 (0,6%) são raramente

encontrados (Dai et al., 2001; Daly, 2003). Poucos estudos descrevendo a frequência destes

alelos em populações de regiões africanas endêmicas à malária foram reportados. No estudo

realizado numa região endêmica a malária na ilha de Zanzibar, Cavaco e colaboradores

reportaram frequências alélicas de CYP2C8*2 (13,9%), CYP2C8*3 (2,1%) e CYP2C8*4 (0,6%),

respectivamente, em 165 pacientes com malária pediátrica (Cavaco et al., 2005). Em uma

DISCUSSÃO

população de crianças no norte de Gana, o alelo CYP2C8*2 foi detectado com uma frequência de

16,7% (Röwer et al., 2005),

enquanto Adjei e colaboradores também reportaram a frequência de

17,9% em crianças do sul do mesmo país (Adjei et al., 2008). Nossos resultados mostram que a

frequência de 16% do alelo CYP2C8*2 encontrado na nossa população é semelhante às

frequências reportadas em estudos realizados em outras populações africanas como Gana (16,7%)

(Röwer et al., 2005), (17,9%) (Adjei et al., 2008) e em afro-americanos (18%) (Dai et al., 2001).

Entretanto, a ligeira diferença observada em relação à frequência de 13,9% reportada em

Zanzibar (Cavaco et al., 2005) pode estar relacionada com o menor tamanho amostral utilizado

neste estudo em relação ao nosso.

Funcionalmente, sabe-se que as variantes alélicas CYP2C8*2 e *3 codificam para

enzimas com atividade reduzida, associadas a diferenças significantes dos parâmetros cinéticos

do paclitaxel e do ácido araquidônico quando comparados ao alelo selvagem (Dai et al., 2001). A

biotransformação da amodiaquina em seu metabólito primário, N-desethylamodiaquina, ocorre

rapidamente após administração oral, via CYP2C8 e outras enzimas extra-hepáticas como

CYP1A1 e CYP1B1 produzindo um metabólito desconhecido (Li et al., 2002). Estudos

anteriores têm reportado uma ampla variabilidade interindividual dos parâmetros

farmacocinéticos em indivíduos tratados com amodiaquina (Winstanley et al., 1990). Num estudo

clínico envolvendo 275 pacientes com malária, Parikh e colaboradores mostraram que os níveis

de clareamento intrínseco da amodiaquina eram três vezes menores em portadores do alelo

CYP2C8*2 em relação aos indivíduos portadores do genótipo selvagem. Nesse estudo, nenhuma

reação adversa específica ou evidência de impacto sobre o desfecho terapêutico ou toxicidade

associada aos genótipos dos indivíduos foi registrada, embora efeitos colaterais como dor

abdominal fossem mais comuns em portadores do alelo mutante (Parikh et al., 2007); no entanto,

o possível impacto dos polimorfismos presentes no gene CYP2C8 sobre a eficácia da

amodiaquina pode ser influenciado por outros fatores, tais como o desequilíbrio de ligação com

outros alelos do sistema CYP450 que codificam para fenótipos de metabolizadores lentos, como

o gene CYP2C9 (Yasar et al., 2002).

Além dos efeitos no desfecho terapêutico, um dos elementos não menos importantes

relacionados com os polimorfismos em genes metabolizadores da amodiaquina são os efeitos

colaterais, como toxicidade hepática e agranulocitose associados ao uso profilático ou longa

exposição à droga. Os mecanismos envolvidos na toxicidade da amodiaquina não são bem

conhecidos; no entanto, estudos in vitro têm associado à amodiaquina e o seu metabólito, N-

DISCUSSÃO

desethylamodiaquina, a efeitos inibitórios sobre as células da medula óssea e células progenitoras

dos neutrófilos (Labro et al., 1991; Aymard et al., 1992). Outros estudos sugerem que a

toxicidade da amodiaquina esteja também associada a uma auto-oxidação não enzimática da

amodiquina em soluções aquosas neutras, dando origem a um intermediário altamente reativo

designado quinonaimina que é responsável por reações adversas em alguns pacientes devido à

formação de imunocomplexos através da sua ligação com proteínas celulares (Winstanley et al.,

1990). A capacidade da N-desethylamodiaquina na formação deste intermediário é reduzida

comparada a amodiaquina. Neste contexto, a lenta conversão da amodiaquina em N-

desethylamodiaquina em indivíduos com o genótipo CYP2C8 de metabolização lenta pode

predispor a formação da quinonaimina, aumentando o risco de toxicidade (Li et al., 2002; Gil e

Berglund, 2007). A toxicidade da amodiaquina foi anteriormente reportada em indivíduos de

origem não caucasiana, e o alto nível de toxicidade observado nesses indivíduos pela utilização

do medicamento como profilático pode estar associado à prevalência elevada do alelo CYP2C8*3

em caucasianos em relação aos africanos. Segundo Parikh e colaboradores, ainda que o impacto

do alelo CYP2C8*2, mais prevalente em África, no metabolismo da amodiaquina seja

relativamente menor em relação ao alelo CYP2C8*3, um aumento do uso da droga em indivíduos

portadores do alelo CYP2C8*2 poderá levar a uma diminuição gradual da tolerância e aumento

da toxicidade nesses indivíduos (Parikh et al., 2007). Assim sendo, o aumento do uso da

amodiquina para o tratamento da malária em regiões endêmicas faz necessária a realização de

estudos de monitoramento dos eventos adversos relacionados com a droga, bem como a sua

associação com o perfil genotípico dos alelos de CYP2C8 para melhor se entender o impacto

destes polimorfismos no tratamento da malária com amodiaquina.

DISCUSSÃO

6.4. Considerações finais

O tratamento da malária é assunto de crucial importância em Moçambique e nos países

africanos onde a malária é endêmica. Os antimaláricos são administrados em grande escala, na

maioria dos casos em situações em que os pacientes se apresentam com febre sem nenhuma

confirmação laboratorial da presença do parasito. Um conhecimento detalhado sobre a influência

da variabilidade genética do hospedeiro na eficácia e segurança dos medicamentos usados no

tratamento da malária em populações-alvo é de importância fundamental para um melhor manejo

do tratamento da malária.

O presente estudo se mostra pioneiro nesta população contemplando a análise de vários

polimorfismos em genes envolvidos na metabolização de antimaláricos e de outras drogas

largamente utilizados. Os dados gerados neste estudo constituem uma informação importante a

ser incorporada nos programas de farmacovigilância praticados em Moçambique, podendo ser

também de grande valia para futuros estudos de associação na população moçambicana, onde a

alta prevalência da malária e outras doenças como a Tuberculose e a AIDS faz com que a maior

parte da população seja exposta ao tratamento concomitante. Adicionalmente, o nosso estudo

teve como foco principal e exclusivo, identificar quais as variantes alélicas de CYP2B6 e

CYP2C8 estariam presentes na população e suas respectivas frequências. No entanto, vários

outros polimorfismos funcionais com impacto significativo no metabolismo dos antimaláricos

ocorrem em outros genes, como por exemplo, os genes UGT1A9 e UGT2B7 (Maruo et al., 2005),

cujos produtos estão envolvidos no metabolismo da dihidroartemisinina (Ilett et al., 2002);

consequentemente para um completo entendimento da influência do “background” genético na

metabolização e efeito dos antimaláricos, faz-se necessário a inclusão destes e outros genes

envolvidos em futuros estudos.

REFERÊNCIAS

7. CONCLUSÕES

• Nossos resultados mostram que as variantes alélicas presentes nos genes CYP2B6 e

CYP2C8, sabidamente envolvidos na alteração do metabolismo de uma variedade de

drogas, ocorrem nas populações estudadas, corroborando os resultados reportados em

outros estudos realizados em populações africanas.

• Não foi observada nenhuma diferença na distribuição dos polimorfismos encontrados nas

três regiões estudadas.

• A alta frequência de alelos que codificam para fenótipos de metabolizadores lentos

observada neste estudo indica que uma fração significativa da população moçambicana

estará potencialmente em risco de falha terapêutica ou de efeitos adversos aos

antimaláricos e outros medicamentos substratos das enzimas codificadas por estes genes,

fazendo-se necessária a realização de futuros estudos para um melhor entendimento sobre

a importância destes polimorfismos no tratamento da malária nestas populações.

8. PERSPECTIVAS

• Realizar estudos de associação em indivíduos com malária, incluíndo estes e outros genes

envolvidos na metabolização de antimaláricos para um melhor entendimento sobre a

importância dos mesmos no tratamento da malária.

9. DIFICULDADES

• A realização do estudo com amostras coletadas em Moçambique e processadas no Brasil

foi uma das maiores dificuldades encontradas porque as mesmas foram coletadas durante

o período do curso.

• A padronização da PCR em amostras de sangue impregando no cartão de filtro.

• Apreenção das amostras no Aeroporto internacional de Guarulhos, Sao Paulo pela Polícia

Federal durante o envio de Moçambique ao Brasil, tendo sido liberadas dois meses depois

(de 19 de Janeiro a 23 de Março de 2009).

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APÊNDICES

105

11. APÊNDICES

APENDICE 1- DOCUMENTO DE INFORMAÇÃO AO PARTICIPANTE PARA

CONSENTIMENTO INFORMADO

PROJETO: Frequências alélicas e genotípicas das isoformas CYP2C8 e CYP2B6 na

população de Moçambique

A resposta aos medicamentos no tratamento de doenças varia de indivíduo para indivíduo em quase todo

tipo dos medicamentos utilizados e, vários fatores têm contribuído para essa variabilidade. Hoje é sabido

que para além dos fatores ambientais e fisiológicos, esta variabilidade interindividual da resposta aos

medicamentos está associada a “modificações” na forma como os medicamentos são transformados dentro

do organismo de cada indivíduo. Assim, o Instituto Nacional de Saúde de Moçambique, pretende realizar

em indivíduos saudáveis um estudo para identificar, em nossa população, qual o padrão mais freqüente

das modificações na forma de transformação dos medicamentos usados para o tratamento da malária. As

informações obtidas serão úteis para evitar efeitos indesejáveis durante o tratamento e termos uma idéia se

o mesmo será eficiente.

Você esta sendo solicitado para participar neste estudo, dando uma amostra de sangue e consentindo que

os resultados dos seus exames sejam utilizados neste estudo. Este estudo será coordenado pelo, Dr.

Adalberto Rezende Santos, profissional em atividade no Instituto Oswaldo Cruz do Brasil, pelo Dr.

Ricardo Thompson, profissional em atividade no Ministério da Saúde e será realizado pelo Paulo Arnaldo,

estudante do curso de mestrado em Biologia Molecular e Celular no Instituto Oswaldo Cruz-FIOCRUZ,

Brasil.

1) Procedimento

A participação no estudo inclui responder a um questionário padronizado que registrará os seus dados

pessoais relevantes para entender os resultados das análises que vão ser feitas à sua amostra de sangue. A

participação no estudo implica também que sejam recolhidas cinco gotas do sangue remanescente no tubo

de doação de sangue ou por uma pequena picada no dedo, que serão depositadas e deixadas secar em

papel de filtro. O sangue será utilizado para determinar a capacidade do seu organismo para utilizar alguns

medicamentos.

2) Local do estudo

Os procedimentos de coleta destas amostras serão realizados nos bancos de sangue do Hospital Central de

Maputo, Hospitais Provinciais da Beira, Nampula e Pemba, Hospitais Gerais José Macamo e Mavalane e

no Hospital Rural de Chokwé.

APÊNDICES

106

3) Riscos/Desconfortos

Não haverá riscos adicionais para além dos envolvidos na doação de sangue, pois iremos somente coletar

o sangue que restar no tubo de coleta sangue ou por uma pequena picada no dedo, para um papel de filtro.

4) Participação Voluntária

A participação neste estudo é voluntária. Ao dar consentimento escrito para participar no estudo,

compromte-se a cumprir com os procedimentos do estudo. Contudo, se decidir em não participar neste

estudo, ou interromper a sua participação a qualquer momento, o seu acesso e qualidade de cuidados de

saúde não serão afetados.

5) Custos e Compensações para os participantes

Não haverá custos para si, caso decida pela participação neste estudo. Os custos dos exames laboratoriais

por realizar serão cobertos pelo estudo, nem serei compensado pela participação no estudo.

6) Benefício

Não haverá nenhum benefício directo e imediato para si. Contudo, o conhecimento que resultará deste

estudo é importante para melhorar o tratamento da malária, o que poderá vir a beneficiar a si ou à sua

família no futuro.

7) Confidenciabilidade dos dados

Procedimentos serão adoptados pelos responsáveis por este estudo para proteger a confidencialidade das

informações por si fornecidas. A amostra e outros dados que lhe digam respeito serão identificadas

somente com as iniciais do seu nome, impedindo assim a sua identificação. Somente os pesquisadores

envolvidos neste estudo terão acesso aos resultados e informação nos questionários.

TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO

Frequências alélicas e genotípicas das isoformas CYP2C8 e CYP2B6 na população de Moçambique

Eu, ______________________________________________________________, acredito ter sido

suficientemente esclarecido (a) a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim sobre o

estudo “Frequências alélicas e genotípicas das isoformas CYP2C8 e CYP2B6 na população de

Moçambique”, responsável pelo metabolismo dos medicamentos antimaláricos. Ficou claro para mim

qual é o propósito do estudo, os procedimentos a serem seguidos, seus desconfortos e riscos, benefícios e

a garantia da confidencialidade. Receberei uma cópia deste consentimento para mantê-lo comigo. Se tiver

qualquer dúvida sobre a minha participação neste estudo, poderei utilizar os seguintes números de

APÊNDICES

107

telefone: +258 (21) 31 10 38 ou +258 82 2748 900, para contactar o Dr. Ricardo Thompson ou Paulo

Arnaldo no Ministério da Saúde para o devido esclarecimento.

Como já foi esclarecida (o) anteriormente, toda informação pessoal será mantida em sigilo.

A participação em pesquisa é voluntária e após consentimento informado escrito. Entretanto, mesmo

depois de ter dado consentimento informado escrito tenho o direito de retirar o consentimento antes da

coleta da amostra de sangue, sem que isso afete quaisquer dos meus direitos individuais, incluindo acesso

futuro a cuidados médicos em qualquer Hospital do País. Se eu desejar e concordar em participar, devo

assinar na linha abaixo.

_________________________________________________________ _____/_____/_____

Nome do Voluntário: Data

______________________________________________________________________

Assinatura ou impressão digital do Voluntário

______________________________________________________________________

Assinatura da Testemunha

______________________________________________________________________

Nome do Entrevistador

______________________________________________________________________

Assinatura do Entrevistador

APÊNDICES

108

APÊNDICE 2 - QUESTIONÁRIO PARA ENTREVISTA DOS PARTICIPANTES

requências alélicas e genotípicas das isoformas CYP2C8 e CYP2B6 na população de

Moçambique

1. Iniciais do Participante:

|____|____|____|

2. Data de coleta da amostra:

____/____/____

3. Código do participante: |__|__|__|__|__|__|

4. Data de Nascimento:

____/____/____

4.1. Idade:

|____|

(anos)͙

5. Gênero:

|____|

Masculino

|____|

Feminino

6. Ascendência:

|____|

Africana

|____|

Européia

|____|

Outra

7. Naturalidade: 7.1. Província:_____________________________________________

8. Distrito: ______________________________________________________________

9. Precisa ser informado sobre os seus exames

|____|

Sim

|____|

Não

APÊNDICES

109

APÊNDICE 3 – FOLHAS DE APROVAÇÃO DOS COMITÊS DE ÉTICA EM PESQUISA

APÊNDICES

110

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