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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
Laboratório de Neurofisiologia e Neuroanatomia Comparada
Mecanismos opioidérgicos envolvidos na
antinocicepção induzida
comportamentalmente e por estimulação
mesencefálica no teleósteo Leporinus
macrocephalus
Fabiana Luca Alves
Ribeirão Preto
2010
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Fabiana Luca Alves
Mecanismos opioidérgicos envolvidos na
antinocicepção induzida
comportamentalmente e por estimulação
mesencefálica no teleósteo Leporinus
macrocephalus
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de Doutor em
Ciências
Área de Concentração: Fisiologia
Orientadora: Profa. Dra. Anete Hoffmann
Ribeirão Preto
2010
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Autorizo a reprodução total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou
eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Alves, Fabiana Luca
Mecanismos opioidérgicos envolvidos na antinocicepção induzida
comportamentalmente e por estimulação mesencefálica no teleósteo Leporinus
macrocephalus. Ribeirão Preto, 2010, 113p.
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP.
Área de concentração: Fisiologia
Orientadora: Profa. Dra. Anette Hoffmann
1. Peixe. 2. Nocicepção. 3. Teste da formalina. 4. Analgesia. 5. Teto óptico
Aos meus pais,
Marilda e José,
por todo amor e confiança
"A cada dia que vivo, mas me convenço,
de que o desperdício da vida,
está no amor, que não damos,
nas forças que não usamos,
na prudência egoísta que nada arrisca,
e, que, esquivando-se do sofrimento,
perdemos também a felicidade"
Carlos Drummond de Andrade
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo milagre da vida e por mais esta vitória.
À Profa. Dra. Anette Hoffmann, pela orientação, pela confiança e incentivo depositados,
pelo exemplo de profissional e pessoa, e principalmente, pelo carinho e amizade durante
todos esses anos.
À Profa. Dra. Leda Menescal de Oliveira, pela valiosa contribuição no desenvolvimento
desse trabalho, sua colaboração foi fundamental para a realização dos estudos em
nocicepção e na correção final, e principalmente, pela amizade adquirida.
À Profa. Dra. Elizabeth Spinelli de Oliveira, pelas importantes sugestões na fase final
desse trabalho, mas principalmente pela amizade e confiança adquiridas nesses muitos
anos de convivência.
Ao Prof. Dr. Norberto Cysne Coimbra e Prof. Dr. Gilson Luiz Volpato, que prontamente
se dispuseram a participar da banca de defesa dessa tese, com comentários relevantes
que ajudaram muito na concepção final desse estudo.
À Aparecida de Souza Fim Pereira, não só pelo apoio técnico e por me ensinar as
técnicas neurofisiológicas, mas também pela sua amizade, paciência e dedicação, que
foram essenciais para a realização desse trabalho.
À toda a minha família, pelo carinho e incentivo constantes, e pela alegria que é poder
contar com vocês sempre.
Às amigas do laboratório Ana Catarina, Terence, Lilian e Silvana, sempre prontas a
ajudar, obrigada pela amizade e contribuição nesse trabalho.
Ao Augusto pela amizade, pelos momentos vividos e pela ajuda que me deu ao longo do
Doutorado.
Às minhas grandes e queridas amigas Karla, Flávia, Fer, Camila, Marina, Múmia, Beth,
Lisa, Renata, Márcia, Carol, Lívia e Fabíola pela amizade valiosíssima, pelo apoio e por
estarem sempre do meu lado. É muito bom tê-las por perto.
Aos meus outros amigos de Ribeirão Preto, pelo companheirismo e amizade, por todas
as noites perdidas, pelas conversas, pelas risadas e acima de tudo por fazerem da minha
vida um pouco mais divertida.
Aos amigos de sempre: Matheus, Márcio, João e Mariulza pela amizade e a agradável
convivência nesses anos.
À Elisa Maria Aleixo, Cláudia de Barcellos Vanzela, Fernando César Rastello e Carlos
Alberto Belini, por realizarem todo o trabalho burocrático, pelo carinho e amizade.
Ao Rubens Fernando de Melo, o Rubinho, por todo o cuidado na preparação histológica,
e principalmente pela amizade durante todos esses anos.
Aos demais professores, pós-graduandos, alunos e técnicos do Departamento de
Fisiologia da FMRP/USP que direta ou indiretamente contribuíram para a execução desse
trabalho.
À CAPES, pelo apoio financeiro prestado no decorrer desse trabalho.
Lista de Abreviaturas
CHOR- comissura horizonta
CPCS- camadas profundas do colículo superior
DIV- ventrículo diencefálico
FOR- formalina
FR- fascículus retroflexus
LC- locus coerulus
LLF: fascículo lateral longitudinal
MLF: fascículo medial longitudinal
MOR- morfina
NAL- naloxona
NIII: núcleo oculomotor
NMR- núcleo magno da rafe
PGZ: zona cinzenta periventricular do teto ótico
PPV: parte ventral do núcleo periventricular pretectal
RVM- bulbo rostromedial
SA- substância de alarme
SAL- salina
SCP- substância cinzenta periaquedutal
SCPd- substância cinzenta periaquedutal dorsal
SNC- sistema nervoso central
TL: torus longitudinalis
TeO- teto óptico
TeOm- teto óptico medial
TeOl- teto óptico lateral
TPM- trato pretectomamilar
TTB: trato tectobulbar
TEV: ventrículo tectal
VAL divisão lateral da válvula cerebelar
VAM: divisão medial da válvula cerebelar.
VPL- núcleos talâmicos ventral posterior lateral
VPM- núcleos talâmicos mediais
ÍNDICE
Resumo.......................................................................................................................................... 01
Abstract.......................................................................................................................................... 02
1- Introdução........................................................................................................ 03
1.1- Fisiologia da dor...................................................................................................................... 03
1.2- Sistema endógeno da inibição da dor.................................................................................... 09
1.3- Modulação endógena da dor.................................................................................................. 09
1.4- Analgesia induzida pelo medo ............................................................................................... 15
1.5- Aspectos filogenéticos da nocicepção.................................................................................... 16
1.6- Nocicepção em peixes............................................................................................................ 17
1.6-1- Nociceptores ....................................................................................................................... 18
1.6-2- Tratos ascendentes da informação nociceptiva.................................................................. 19
1.6-3- Teto óptico e a nocicepção ................................................................................................ 21
1.6-4- Receptores opióides e endorfinas..................................................................................... 23
1.6-5- Analgésicos reduzem respostas nociceptivas.................................................................... 23
1.7- Testes algesimétricos............................................................................................................ 25
1.7-1- Teste da formalina............................................................................................................... 26
1.7-2- Teste do ácido acético......................................................................................................... 27
1.7-3- Teste da capsaicina............................................................................................................ 28
2- Objetivos.......................................................................................................... 29
3- Material e Métodos.......................................................................................... 30
Considerações sobre a espécie estudada.................................................................................... 30
3,1- Animais.................................................................................................................................. 31
3.2- Teste nociceptivo.................................................................................................................... 31
3.2-1- Teste da formalina............................................................................................................... 31
3.2-2- Capsaicina........................................................................................................................... 33
3.3- Drogas.................................................................................................................................... 33
3.4- Análise dos Dados e Quantificação ....................................................................................... 33
3.4-1- Batimentos operculares....................................................................................................... 33
3.4-2- Atividade natatória............................................................................................................... 34
3.5- Obtenção da substância de alarme de co-específico............................................................ 34
3.6- Procedimento cirúrgico........................................................................................................... 35
3.6-1- Anestesia............................................................................................................................. 35
3.6-2- Implantação da cânula-guia na região do crânio................................................................ 35
3.6-3- Microinjeção central de drogas........................................................................................... 36
3.6-4- Histologia............................................................................................................................. 37
3.7- Protocolos experimentais....................................................................................................... 37
3.8- Análise estatística.................................................................................................................. 50
4- Resultados....................................................................................................... 52
5- Discussão......................................................................................................... 72
6- Conclusões...................................................................................................... 91
7-Referências Bibliográficas............................................................................... 93
8- Apêndice................................................................................................................... 105
RESUMO
ALVES, F. L. Mecanismos opioidérgicos envolvidos na antinocicepção induzida comportamentalmente
e por estimulação mesencefálica no teleósteo Leporinus macrocephalus. Tese de Doutorado em
Ciências Fisiológicas - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2010.
A habilidade dos peixes em perceber a dor é um assunto controverso. Alguns autores argumentam
que a dor resulta da ativação de várias regiões do córtex cerebral, restringindo assim a sua percepção aos
humanos e primatas. No entanto, recentes pesquisadores têm demonstrado que existem algumas
semelhanças entre os peixes e os vertebrados superiores em relação à estrutura básica do sistema nervoso
envolvida na percepção dolorosa. O objetivo deste estudo foi examinar as respostas do piauçu evocadas pela
injeção subcutânea de formalina a 3% (teste algesimétrico muito empregado em mamíferos), pesquisar a
existência de um sistema analgésico endógeno e sua ativação comportamental, bem como estudar a
participação do teto óptico, como possível componente desse sistema. As alterações dos batimentos
operculares e da atividade natatória foram utilizadas como indicadores nociceptivos.
Nossos dados demonstraram que a injeção subcutânea de formalina a 3% na região próxima à
nadadeira adiposa induziu um aumento dos batimentos operculares, o qual foi bloqueado pela injeção
sistêmica de morfina (agonista opióide) nas doses de 50mg/kg, 100mg/kg, mas não de 30mg/kg. A injeção
prévia sistêmica de morfina 50mg/kg também bloqueou o aumento da atividade natatória. O pré-tratamento
com naloxona (antagonista opióide) nas doses de 10mg/kg e 20mg/kg não foram suficientes para reverter o
efeito da morfina, porém o bloqueio da resposta foi obtido com a dose de 30mg/kg. Essas respostas
neurovegetativas e comportamentais demonstraram que os peixes não reagem passiva e reflexamente a um
potente estímulo doloroso, mostrando uma possível capacidade de experimentar a dor. No entanto, os
animais não responderam à injeção subcutânea de capsaicina, que é um dos componentes vanilóides ativos
da pimenta e pode evocar uma sensação de formigamento e ardor e atua ativando canais de cátions não
seletivos, chamados de VR-1, nas terminações nervosas de fibras amielínicas do tipo C.
Além disso, o aumento da atividade natatória decorrente de injeção subcutânea de formalina a 3% foi
bloqueado (ou reduzido) após a exposição dos animais à substância de alarme de um co-específico,
mostrando que o sistema analgésico endógeno pode ser mobilizado em situações que potencialmente
sinalizam predação. Esse efeito é bloqueado pela naloxona (20mg/kg) mostrando sua natureza opióide.
Assim, podemos sugerir que a antinocicepção permite que um animal ameaçado, em uma situação de perigo
iminente, apresente comportamentos de defesa (freezing) prevenindo que os comportamentos recuperativos
interfiram nos esforços defensivos, aumentando a sua chance de sobrevivência.
Observamos também que a microinjeção central de morfina 1,1 nmol/0,1µl no teto óptico medial,
reduz a atividade natatória induzida pela injeção subcutânea de formalina a 3%. Nos vertebrados não-
mamíferos o teto óptico é uma estrutura homóloga ao colículo superior, que sabidamente está envolvido em
defesa e antinocicepção. Dessa forma, parece razoável que o teto óptico esteja envolvido com respostas
defensivas e de antinocicepção, bem como de orientação e aproximação frente ao estímulo novo, pois a
decisão de se orientar frente a esse estímulo está intimamente ligada com a decisão de evitá-lo. Caso a
decisão escolhida seja evitar tal estímulo é necessário que as respostas antinociceptivas sejam deflagradas
juntamente com comportamentos defensivos, já que durante um confronto presa-predador é importante
amenizar a sensação aversiva.
ABSTRACT
ALVES, F. L. Opioid mechanisms involved in the antinociception induced behaviorally and
mesencephalic stimulation, in the teleost Leporinus macrocephalus. Doctoral thesis, Faculty of
Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2010.
The ability of teleost to experience pain is a highly controversial issue. Some authors argue that
pain results from the activation of several regions of the cerebral cortex, restricting it for the humans and
others primates. However, recent researches have demonstrated that some similarities exist between
teleosts and mammalians in their basic structures of the nervous system related with the pain perception.
The purpose of this study was to examine the responses of piauçu evoked by subcutaneous injection of
3% formalin, the presence of the endogenous analgesic system and its behavioral activation, as well as,
the participation of the optic tectum in the antinociception in these animals. The alterations in the
opercular beat rate and swimming activity were used as nociceptive indicators.
Our results demonstrated that the subcutaneous injection of 3% formalin in the region underlying
the adipose fin induces an increase in the opercular beat, which was blocked for the systemic injection of
morphine (opioid agonist) at 50mg/kg, 100 mg/kg but not at 30mg/kg. In addition, previous systemic
injection of morphine at 50mg/kg also blocked the enhances of swimming activity. The pretreatment with
naloxone (opioid antagonist) at 10mg/kg and 20mg/kg were not able to reverse the effect of morphine,
but this response was blocked by naloxone at 30mg/kg. These neurovegetative and behavioral
responses demonstrate that the fish does not react merely passively and reflexively to a potentially
painful stimulus, showing a relevant capacity to experiencing pain. However, the animals did not respond
to the subcutaneous injection of capsaicin.
Besides, the enhances of swimming activity due to subcutaneous injection of 3% formalin was
blocked (or reduced) after the exposition of animals to alarm substance. The endogenous analgesic
system can be activated in situations that show predation signals. This effect was blocked by naloxone at
20mg/kg showing its opioid nature. We suggest that antinociception allows a threatened animal, in a
situation of imminent danger, provide defensive behaviors preventing recuperative behaviors that
interfere with the defensive efforts, increasing their chance of survival.
We also observed that the animals that received the central microinjection of morphine at 1,1
nmol/0,1µl in the medial optic tectum, after subcutaneous injection of 3% formalin, show a reduction of
the swimming activity. In non-mammalian vertebrates the optic tectum is homologous to the superior
colliculus. Thus, it seems reasonable that the optic tectum is involved with defensive responses and
antinociception, as well as orientation and approach to this stimulus. The decision to orient in opposite of
this stimulus is closely linked to the decision to avoid it. If the decision chosen is to avoid such
stimulation, it is necessary that the antinociceptive responses will be triggered together with defensive
behavior, since during a prey versus predator confrontation is important to diminish the aversive
sensation.
INTRODUÇÃO
1.1-Fisiologia da Dor
A nocicepção é a capacidade do animal detectar e reagir a um estímulo nocivo aplicado em
um determinado tecido (ACHAVAL, e cols., 2005; SNEDDON, 2003). Por outro lado, a percepção
desse estímulo é denominada dor, a qual tem um componente sensorial e um emocional. Dessa
forma, a dor pode ser definida como uma experiência sensorial e emocional desagradável
associada com o atual ou potencial dano tecidual ou descrita em termos deste dano, segundo
estipulado pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP, 1994).
Portanto, a resposta dolorosa possui dois componentes: um que discrimina o estímulo
nocivo quanto à sua intensidade, localização, duração, padrão temporal e qualidade, chamado de
sensorial-discriminativo; e outro que atribui emoções à experiência dolorosa, sendo responsável
pelas respostas comportamentais à dor, denominado de afetivo-motivacional (ALMEIDA e cols.,
2004; MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008). Ela é uma experiência complexa que envolve não
somente a transdução de estímulos nocivos provenientes do ambiente em que estamos inseridos,
mas também o processamento cognitivo e emocional desta informação transduzida, por estruturas
supra-espinhais (JULIUS e BASBAUM, 2001).
A dor é essencial para a sobrevivência dos indivíduos num ambiente potencialmente hostil
e, normalmente, serve como um instrumento de advertência, isto é, um sistema de alarme ativado
em resposta à agressão ao organismo. Evolutivamente, a dor tem importante função protetora,
uma vez que informa as condições em que se encontram os meios externo e interno do animal. A
ativação do sistema de dor normalmente promove um conjunto de respostas como aquelas que
caracterizam o comportamento defensivo (reflexos de retirada, fuga, retraimento, imobilidade) e o
recuperativo (lambidas, imobilidade e etc). Respostas neurovegetativas como aumento da pressão
arterial, taquicardia, taquipneia (HAUGEN, 1968) podem ocorrer em paralelo.
A habilidade de responder a um estímulo nocivo proveniente do ambiente é uma
característica básica dos animais e isso implica na presença de nociceptores (ACHAVAL e cols.,
2005). Os nociceptores são terminações nervosas livres de neurônios aferentes primários ativados
por estímulos intenso que podem causar lesão tecidual e, em consequência, dor. Eles podem ser
encontrados nos diferentes tipos de tecidos como pele (maior proporção), músculos, articulações,
meninges, ossos e vísceras (MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008). Os neurônios nociceptivos
primários apresentam os corpos celulares localizados dentro dos glânglios trigeminal e da raiz
dorsal do nervo espinal, projetando seus axônios para conduzir estímulos provenientes de
receptores situados respectivamente na cabeça e no tronco e membros.
Com base em critérios anatômicos e funcionais, as fibras projeções dos neurônios
nociceptivos são classificadas em dois tipos:
a) Fibras do tipo C: As fibras do tipo C são amielínicas, de pequeno diâmetro, e com velocidade
de condução na faixa de 0,5 a 2,0 m/s, as quais respondem a estímulos térmicos, mecânicos e
químicos, sendo, por isso, denominadas de polimodais. Correspondem a 80% das fibras
envolvidas na condução da mensagem nociceptiva e são responsáveis pela dor de duração lenta
ou secundária, estando relacionadas com a dor crônica, difusa e de difícil localização (MILLAN,
1999; JULIUS e BASBAUM, 2001; MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).
b) Fibras do tipo A: As fibras do tipo A δ são mielinizadas, de diâmetro médio, com velocidade de
condução entre 5 e 30 m/s (MILLAN, 1999; JULIUS e BASBAUM, 2001), correspondem a 20% das
fibras e são responsáveis pela dor rápida ou primária. Trata-se de uma dor aguda, bem localizada
e discriminativa, resultante de um estímulo pontual (MILLAN, 1999; JULIUS e BASBAUM, 2001;
MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).
Os nociceptores são capazes de detectar estímulos nocivos externos e convertê-los em
sinais eletroquímicos na forma de potenciais de ação. Esses, por sua vez, serão conduzidos para o
sistema nervoso central (SNC): (1) à coluna dorsal da medula espinal; (2) e ao núcleo espinal do
nervo trigêmeo, para o processamento neural dessa informação nociceptiva. Os principais
neurotransmissores envolvidos na transmissão nociceptiva nos aferentes primários são a
substância P e o glutamato (CALNE e cols., 1996; PURVES e cols., 2001).
O limiar para desencadear a nocicepção deve ser alto o suficiente para não interferir com a
percepção de outras modalidades sensoriais, mas baixo o suficiente para desencadear uma
resposta antes que o tecido seja lesado. No entanto, esse limiar não é fixo, e pode ser modulado
por estruturas nervosas centrais, mostrando uma grande plasticidade neural.
No interior da medula, as projeções aferentes dos neurônios sensitivos primários fazem
sinapses com os neurônios sensitivos secundários, os quais ascendem para o encéfalo formando
tratos aferentes, que transmitem a informação nociceptiva para estruturas rostrais, incluindo
formação reticular, substância cinzenta periaquedutal, tálamo, hipotálamo, complexo amigdalóide
entre outras (ALMEIDA e cols., 2004).
A via ascendente da dor mais importante é a espinotalâmica, que compreende os tratos
neoespinotalâmico e paleoespinotalâmico (Fig 1). O trato neoespinotalâmico apareceu
recentemente na evolução e co-existe com o paleoespinotalâmico, mais antigo e comum a todos
os vertebrados.
a) Trato neoespinotalâmico:
O trato neoespinotalâmico ascende pela substância branca do funículo ântero- lateral da
medula espinhal e alcança os núcleos talâmicos ventral posterior lateral (VPL) e certos núcleos
talâmicos mediais (VPM), que, por sua vez, se projetam para o córtex somatosensorial, sendo
assim processado o estímulo nociceptivo da dor (RUSSO e cols., 1998; PURVES e cols., 2001;
MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008). Na evolução, esse trato só apareceu em mamíferos superiores
e, por apresentar poucas sinapses ao longo do seu trajeto ascendente, conduz as informações
nociceptivas com alta velocidade e, por isso, está envolvido na transmissão da dor rápida ou aguda
relacionada com o componente sensorial-discriminativo da dor (MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).
b) Trato paleoespinotalâmico
O trato paleoespinotalâmico também ascende pelo funículo ântero-lateral e seus axônios
se projetam por meio de colaterais para vários níveis do encéfalo antes de alcançar os núcleos
mediais do tálamo. Essas estruturas encefálicas incluem núcleos da formação reticular do tronco
encefálico inferior (trato espinorreticular), do mesencéfalo, como a substância cinzenta
periaquedutal (trato espinomesencefálico) e do hipotálamo (trato espino-hipotalâmico). Assim, o
trato paleoespinotalâmico transmite informações nociceptivas para várias regiões supraespinhais
relacionadas com diferentes funções. Nos núcleos mediais do tálamo, ocorrem as sinapses com os
neurônios de terceira ordem, que se projetam para o córtex do cíngulo e a ínsula. O trato
paleoespinotalâmico é filogeneticamente mais antigo, aparecendo nos répteis; porém, nesses
animais não existe essa projeção cortical. Além disso, é multissináptico, conduz as informações
nocivas à baixa velocidade e está relacionado com a dor lenta ou crônica (RUSSO e cols., 1998;
MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008). Ele está envolvido com o componente afetivo-motivacional da
dor.
Figura 1: Representação esquemática das principais vias ascendentes ântero-laterais de transmissão da dor.
Trato neo-espinotalâmico (em vermelho) e trato paleoespinotalâmico (em azul). Menescal-de-Oliveira, 2008.
Neurociência da Mente e do Comportamento. Abreviações: FAL: funículo ântero-lateral, SCP: substância
cinzenta periaquedutal, SI: somatosensorial primário.
Medula Espinal
Bulbo
Mesencéfalo
T. Paleoespinotalâmico
FAL
Fibras
A e C
Formação
reticular
SI
Ínsula
Tálamo
SCP
Recentemente, foi descoberta a existência de outros tratos ascendentes que trafegam
contralateralmente pelo funículo dorsolateral da medula espinhal. Esses tratos são o
espinoparabraquio-amigdaloide e o espinoparabraquio-hipotalâmico (Fig 2), que estão
relacionados respectivamente com as respostas relativas ao componente afetivo-motivacional da
dor e as respostas autonômicas e endócrinas que acompanham o processo doloroso (MILAN,
1999; MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).
Figura 2: Representação esquemática das principais vias ascendentes dorsolaterais de transmissão da dor.
Trato espinoparabraquio-amigdalóide (em vermelho) e trato espinoparabraquio-hipotalâmico (em azul).
Menescal-de-Oliveira. Neurociência da Mente e do Comportamento (2008).
Hipotálamo
Complexo
amigdaloide
Núcleo
Parabraquial
Trato Espinoparaquio-
hipotalâmico
Trato Espinoparabraquio-
amigdalóide
Funículo dorsolateral
Fibras
A e C
Ponte
Funículo dorsolateral
Gânglio da raiz dorsal
do nervo espinal
Medula Espinal
1.2-Sistema endógeno de inibição da dor
Um importante mecanismo usado pelo organismo em situações de emergência é a
redução da capacidade de perceber a dor (MENESCAL-DE-OLIVEIRA e HOFFMANN, 1993). Em
situações de perigo iminente, tais como aquelas que envolvem confronto agonístico, em que é
imprescindível a mobilização de mecanismos de defesa ou de dominância ou de adaptação a
circunstâncias extremas e ameaçadoras detectadas no ambiente, urge o recrutamento de algum
sistema que module ou suprima a dor (FREITAS, 2005). Esse sistema analgésico é de suma
importância, uma vez que as reações comportamentais recuperativas que seguem a percepção da
dor são por ele bloqueadas, pois seriam extremamente desvantajosas para a sobrevivência do
indivíduo em casos de confronto agonístico.
Portanto, a diminuição da resposta nociceptiva permite ao animal ameaçado apresentar
diversas respostas defensivas tais como: congelamento, fuga ou luta, prevenindo que os
comportamentos associados à dor interfiram nos esforços defensivos. Assim, a antinocicepção tem
sido considerada como parte da reação de defesa. Ela pode ser induzida por diferentes formas de
estresse como: presença de um predador natural, ou mesmo o odor de um co-específico, restrição
física, rotação, restrição alimentar, desidratação, isolamento, conflito social, choque elétrico,
natação forçada, estímulo auditivo intenso dentre outros (LEITE-PANISSI, 2001).
1.3-Modulação endógena da dor
A primeira evidência experimental da existência de um sistema analgésico endógeno foi
reportada por Reynolds (1969), o qual verificou que a estimulação elétrica do tronco encefálico,
incluindo a substância cinzenta periaquedutal do mesencéfalo produzia uma potente analgesia em
ratos acordados submetidos a uma cirurgia abdominal. Esses animais não apresentaram nenhuma
manifestação comportamental ou motora relacionada à dor.
Há vários neurotransmissores envolvidos em diferentes níveis do SNC na modulação da
informação nociceptiva tais como opióides endógenos, neuropeptídeos, serotonina, noradrenalina,
glicina, aspartato, dopamina e acetilcolina.
Os opioides endógenos são fortes candidatos a neurotransmissores envolvidos na rede
neural responsável pela inibição da dor. Nos últimos anos, têm-se acumulado evidências
sugestivas da ação analgésica de opioides em determinados sítios do sistema nervoso periférico e
central. Receptores opioides foram identificados em terminais de pequeno diâmetro na medula
espinal (STEIN e cols., 1990). Sob uma vasta gama de condições experimentais e clínicas, uma
série de opioides e seus antagonistas evidenciam efeitos analgésicos e algésicos periféricos
respectivamente (RUSSELL e cols., 1987; STEIN e cols., 1991; CZEONKOWSKI e cols., 1993). A
administração sistêmica de substâncias opioides, como a morfina, promove conhecidos efeitos
antinociceptivos em pacientes sofrendo de dor intensa (GEAR e cols.,1997).
Vários trabalhos têm demonstrado semelhanças entre os mecanismos envolvidos na
analgesia produzida pela morfina e pela estimulação de certas estruturas do SNC (BOLLES e
FANSELOW, 1982; MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008). A morfina é uma substância narcótica
retirada da papoula, com potente ação analgésica. Para produzir esse efeito, a morfina se liga a
receptores opioides, principalmente do tipo µ, que se encontram distribuídos em diversos locais do
SNC.
Além dos receptores opioides, foram revelados no SNC de mamíferos polipeptídeos
endógenos denominados de endorfinas, que apresentam propriedades analgésicas importantes. A
ação analgésica desses peptídeos endógenos, representados principalmente por metil-encefalina,
leucinaencefalina (encefalinas), dinorfina e -endorfina, também está relacionada com o
acoplamento dos mesmos com os diferentes tipos de receptores opioides (BOLLES e FANSELOW,
1982; MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008)
Estudos dos mecanismos neurais destas substâncias têm apresentado provas do
envolvimento de -endorfina e encefalinas, em algumas formas de antinocicepção (BOLLES e
FANSELOW, 1982; BASBAUM e FIELDS, 1989). A -endorfina injetada nos ventrículos cerebrais
(BELLUZI, 1976), na substância cinzenta periaquedutal (LOH e cols., 1976) ou sistemicamente
(TSENG e cols., 1976) induz analgesia, sendo essa resposta revertida pelo naloxona. As
encefalinas estão localizadas particularmente em regiões envolvidas no controle e na transmissão
da informação nociceptiva (VECINO e cols., 1990). Essas regiões incluem medula espinal, núcleos
da rafe, formação reticular, substância cinzenta periaquedutal e tálamo.
Dessa forma, a maior densidade de receptores opioides endógenos coincide com os locais
do sistema nervoso central, cuja estimulação induz analgesia, e é onde atua a morfina produzindo
o seu efeito analgésico (MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).
Estruturas do tronco encefálico exercem um papel fundamental na modulação das
informações nociceptivas. Essas estruturas, quando ativadas, enviam impulsos descendentes que
inibem a transmissão da dor pelos neurônios do corno dorsal da medula espinhal. As principais
estruturas envolvidas na modulação endógena da dor são a substância cinzenta periquedutal
(SCP) e o bulbo rostromedial (RVM), que inclui o núcleo magno da rafe (NMR) e o complexo
reticular/paragigantocelular, e o locus coerulus (LC). Outros trabalhos têm demonstrado que a
estimulação elétrica das camadas profundas dos colículos superior e inferior elicia respostas
comportamentais como fuga e congelamento, acompanhadas de antinocicepção (COIMBRA e
BRANDÃO, 1997).
Desde o trabalho seminal de Reynolds (1969), a participação da SCP na modulação de
respostas nociceptivas tem sido bastante estudada (FARDIN e cols., 1983; COIMBRA e
BRANDÃO, 1997; COIMBRA e cols., 2006). Monassi (1999) mostrou que a estimulação da SCP
ventrolateral com o carbacol (agonista colinérgico) produziu antinocicepção na cobaia.
Estimulações elétricas aplicadas em diferentes partes da SCP geraram respostas comportamentais
como: efeitos motores (SCP ventral) e aversivos (SCP dorsal e dorsolateral). Nessas condições, a
analgesia foi observada em decorrência da estimulação de praticamente toda a SCP (FARDIN e
cols., 1983).
Essas respostas antinociceptivas mediadas pela SCP provavelmente ocorrem de maneira
indireta, por meio de conexões com outras regiões do tronco cerebral, principalmente por
projeções excitatórias para o RVM ou LC (da SILVA, 2006; MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).
Poucos neurônios da SCP se projetam diretamente para o corno dorsal da medula espinal.
A SCP pode ser ativada por informações provenientes da amígdala e do hipotálamo,
desencadeadas em situações de medo ou de estresse. Ela pode ser considerada a via final
comum das respostas de defesa incluindo a antinocicepção, já que lesões sediadas na amígdala e
no hipotálamo não alteram essas respostas induzidas pela sua estimulação, enquanto que a lesão
da SCP impede o aparecimento ou atenua respostas obtidas pela estimulação das outras duas
estruturas centrais (FERNANDEZ DE MOLINA e HUNSPERGER, 1959; BANDLER 1988;
BLANDER e DEPAULLIS, 1991).
Tem sido proposto que a ativação do sistema descendente de inibição de dor por opioides
endógenos pode resultar da liberação dos neurônios da SCP da inibição GABAérgica. Existem
relatos de que a administração de um antagonista GABA
A
na SCP ventrolateral promove
antinocicepção (ROYCHOWDHURY E FIELDS, 1996). Os opioides endógenos parecem produzir
efeitos antinociceptivos por inibir os interneurônios GABAérgicos inibitórios, o que resulta na
desinibição de neurônios de projeção da SCP que, por sua vez, fazem conexões excitatórias com o
bulbo rostroventromedial (RVM) (Fig 3).
O RVM tem efeito inibitório sobre a transmissão nociceptiva espinal (VANEGAS e
SCHAIBLE, 2004), principalmente pela ativação do núcleo magno da rafe (NMR), cujos neurônios
serotoninérgicos se projetam para a medula espinal, pelo funículo dorsolateral e fazem conexões
inibitórias com neurônios das lâminas I, IV e V (KANDEL, 2000). O NMR é o principal núcleo do
RVM e apresenta intensas conexões com a SCP. Foi demonstrado que a lesão do NMR abole a
analgesia produzida pela estimulação da SCP (BEHBEHANI e FIELDS, 1979). O NMR representa
uma das principais vias de saída para as respostas antinociceptivas produzidas pela estimulação
da SCP, e a sua ativação pode estar relacionada com a modulação da informação nociceptiva (da
SILVA, 2006).
Há também evidências de que o efeito antinociceptivo da estimulação do núcleo magno da
rafe pode ser bloqueado por injeções de naloxona diretamente na medula espinal, implicando
mecanismos mediados por opioides endógenos na antinocicepção ao nível espinal (ZORMAN e
cols., 1982).
Deste modo, o sistema endógeno de modulação da dor pode ser recrutado durante
situações de medo, estresse ou mesmo quando o animal é ferido no confronto presa-predador,
indicando que o controle da dor tem um alto valor adaptativo e a analgesia, nesse caso, pode ser
atribuída em parte, à participação do sistema opioide endógeno atuando sobre áreas específicas
do tronco encefálico e da medula espinal.
Colículo superior
O colículo superior dos mamíferos está localizado na superfície dorsal do mesencéfalo. É
uma estrutura laminar que possui seis camadas de axônios e corpos celulares alternados e está
dividido em três zonas: superficial, intermediária (central) e periventricular (BUTLER e HODOS,
1996). As fibras aferentes da retina terminam topograficamente na zona superficial do colículo
superior (camadas mais superficiais) e são essencialmente de natureza visual sensorial. Outras
projeções aferentes multissensoriais (visuais, auditivas e somáticas) se projetam para as camadas
mais profundas do colículo superior, bem como projeções provenientes dos núcleos da base e do
cerebelo. As camadas mais profundas do colículo superior são essencialmente de natureza
multimodal e pré-motora (BUTLER e HODOS, 1996). O colículo superior está envolvido no
posicionamento dos olhos e da cabeça em relação aos estímulos que provêm do meio ambiente,
em movimentos sádicos dos olhos e na predação (BUTLER e HODOS, 1996; COMOLI, 1997;
FURIGO e cols., 2009). Além disso, vários trabalhos têm demonstrado o envolvimento do colículo
superior em respostas defensivas e de antinocicepção (COIMBRA e BRANDÃO, 1997; COIMBRA
e cols., 2006). Efeitos antinociceptivos associados com outras manifestações comportamentais
induzidas por estímulos aversivos foram obtidos estimulando o colículo superior (FARDIN e cols.,
1983). As camadas mais profundas do colículo superior apresentam um papel importante na
integração de respostas defensivas e analgesia (COIMBRA e cols., 2006).
Figura 3: Representação esquemática das vias descendentes analgésicas endógenas que modulam a
atividade dos neurônios de transmissão da informação nociceptiva no corno dorsal da medula espinal.
Menescal-de-Oliveira. Neurociência da Mente e do Comportamento (2008). Abreviações: AM: amígdala; FDL:
funículo dorso-lateral, HT: hipotálamo; NMR: núcleo magno da rafe; SCP: substância cinzenta periaquedutal.
Corno dorsal
da medula
espinal
Medula
Espinal
Sistema
1.4-Analgesia induzida pelo medo
É fato que o medo condicionado pavloviano pode produzir analgesia e apresenta um papel
fundamental no aprendizado aversivo e na motivação, segundo recentes teorias (BOLLES e
FANSELOW, 1980). Chance e cols. (1978) foram os primeiros a mostrarem que a exposição a um
estímulo ambiental previamente associado com um choque pode produzir analgesia no teste da
retirada da pata. MacLeann e cols. (1980) também observaram analgesia no teste da retirada da
pata e da placa quente. Fanselow and Baackes (1982) em seus experimentos utilizaram dois
métodos de avaliação independentes de medo e de dor. O medo foi quantificado pela ocorrência
do "freezing" (imobilidade defensiva) e a dor pela reação do animal à injeção de formalina na pata.
O choque associado ao estímulo aumentou tanto o freezing (indicando medo) como diminuiu a
resposta à formalina (indicando analgesia).
Nos peixes, estímulos químicos presentes na água podem ativar respostas de medo
(JESUTHASAN e MATHURU, 2008). Isso foi observado pela primeira vez por Karl von Frisch
(1938). Ele notou que quando o peixe “minnow” europeu Phoxinus phoxinus é atacado por um
predador e sofre danificação mecânica da epiderme ocorre a liberação de uma substância
(denominada substância de alarme) capaz de induzir respostas defensivas em coespecíficos. A
resposta comportamental observada pelo autor consistiu numa atividade natatória aleatória com
aumento da coesão do cardume e o afastamento dos indivíduos da fonte alarmante. Essa resposta
ficou conhecida como reação de alarme.
Nas décadas seguintes, outros autores demonstraram a existência da reação de alarme
em outras espécies de peixes, embora os padrões comportamentais difiram entre as espécies
(JESUTHASAN e MATHURU, 2008). Em uma revisão da década de 1977, Pfeiffer propôs que os
peixes que apresentam a substância e a reação de alarme estariam restritos à superordem
Ostariophysi, que representa aproximadamente 70% de todas as espécies de peixes de água
doce.
A substância de alarme é produzida por células epidérmicas especializadas denominadas
de células club (PFEIFFER, 1963). Acredita-se que o componente ativo da substância de alarme
seja o mesmo ou similar em todos os Ostariophysi, uma vez que pode ser reconhecida por co-
específicos ou por heteroespecíficos simpátricos (SCHUTZ, 1956; WISENDEN e cols., 1995). O
óxido nítrico (NO) seria um agente sinalizador potencial desse sistema feromonal. (BROWN e cols,
2000; BROWN e cols., 2001; KELLY e cols., 2006). Os peixes utilizam principalmente o sistema
olfatório para detectar a substância de alarme (VON FRISH, 1941). Ide e cols. (2003) mostraram
que a integridade do sistema olfatório em matrinxãs juvenis é essencial para o reconhecimento da
substância de alarme.
A reação de alarme é uma resposta comportamental complexa que pode ser utilizada na
investigação da neurobiologia do medo no sistema nervoso dos vertebrados (JESUTHASAN e
MATHURU, 2008). Essa resposta pode servir para se induzir o medo em peixes no laboratório
(SPEEDIE e GERLAI, 2008) e este associado a um estímulo nocivo pode ser uma ótima
ferramenta no estudo da analgesia endógena nesses animais.
1.5-Aspectos filogenéticos da nocicepção
A nocicepção está presente em um grande número de filos e todos os vertebrados
apresentam nociceptores (SNEDDON, 2004). ROMERO e cols. (1994) e ACHAVAL e cols. (2005)
demonstraram que o caramujo do gênero Megalobulimus pode ser utilizado como modelo animal
para o estudo da função nociceptiva. Dessa forma, a habilidade de responder a um estímulo nocivo
está presente em todos os animais (LEÓN-OLEA, 1993), porém o grau de mobilização do
organismo em resposta ao estímulo é variável e depende da evolução do sistema nervoso,
podendo manifestar-se como um ato reflexo comandado pela medula espinal ou por um sistema
ganglionar, no caso dos invertebrados e no caso dos humanos, passando pela experiência
emocional. (HOFFMANN, 2008).
A dor é experimentada pelo sistema nervoso que frente à informação nociceptiva elabora
respostas e sensações que variam em função da diferenciação do sistema em cada espécie,
sendo que os animais que apresentam um sistema nervoso mais complexo são dotados do
componente subjetivo (HOFFMANN, 2008). Na evolução, a diferenciação que permitiu o
desenvolvimento da discriminação sensorial refinada, das emoções e da capacidade cognitiva,
ocorreu na região do telencéfalo. O neocórtex se desenvolveu na região ocupada pelo pallium
dorsal em anfíbios. Ele teria se diferenciado pela transformação radical desse precursor, em
decorrência da adição de novos tipos celulares e conexões (STRIEDTER, 2005).
1.6-Nocicepção em peixes
Para demonstrar se um animal é capaz de perceber a dor, é preciso primeiro mostrar se
ele é capaz de perceber o estímulo nociceptivo, e segundo se ele responde a esse estimulo com
mudanças fisiológicas (inflamação, alterações cardiovasculares e respiratórias) e comportamentais
(SNEDDON, 2003a).
Muitos trabalhos relacionados com dor têm sido desenvolvidos em mamíferos, já que o seu
entendimento permite inferir com maior aproximação os mecanismos envolvidos em humanos.
Recentemente, outros vertebrados como anfíbios e aves têm sido estudados, embora ainda exista
pouca informação a respeito desse assunto nesses animais.
Em relação aos peixes, a questão da percepção dolorosa é controversa, apresentando dois
enfoques distintos. Rose (2002) argumenta em seus trabalhos que a emoção não pode ser
detectada nestes animais, por não apresentarem um neocórtex, e comparados com os mamíferos,
possuírem um telencéfalo indiferenciado. Ela rejeita a hipótese de dor em peixes, pois estes não
apresentam os substratos neurais essenciais para a percepção consciente da dor. Assim,
baseados nessa definição apenas humanos e outros primatas seriam capazes de experimentar a
sensação dolorosa, ignorando toda a literatura existente que prova que outros animais também são
aptos a perceberem a dor, mesmo sem terem o neocórtex desenvolvido.
Em contraposição, outros autores vêm tentando provar que existem vários fatores que
contribuem para o processamento da dor nos peixes, desses podemos destacar a presença de:
nociceptores, estruturas cerebrais e suas diversas conexões, receptores opioides e outras
substâncias envolvidas na nocicepção, alterações comportamentais e analgesia endógena.
1.6.1-Nociceptores
Experimentos recentes têm demonstrado a existência de percepção dolorosa em peixes.
Sneddon (2003b) mostrou que apesar da maioria das fibras aferentes primárias serem do tipo A δ,
fibras do tipo C também estão presentes no nervo trigeminal na truta Oncorhynchus mykiss (Fig 4).
Da mesma forma que em mamíferos, o nervo trigeminal está relacionado com o processamento de
informações mecânicas, químicas e nociceptivas das regiões oral e facial dos peixes (SNEDDON,
2003b). Também existe um grande número de nociceptores espalhados na região da cabeça, da
boca e ao redor das guelras (SNEDDON e cols., 2003a), bem como nas nadadeiras caudais,
dorsais e peitorais (CHERCHOVA e cols., 1997). Estudos eletrofisiológicos mostraram que os
nociceptores polimodais achados nesta espécie apresentam propriedades similares (diâmetro das
fibras, velocidade de condução, dentre outras) àquelas encontradas nos mamíferos.
Figura 4: Secção do ramo maxilar do nervo trigeminal da truta mostrando a presença de fibras do tipo A δ e
C. SNEDDON, Brain Research Review (2004).
Contudo, existe uma quantidade muito inferior de fibras do tipo C no nervo trigeminal
quando comparados a outros animais (SNEDDON, 2002). Tipicamente, as fibras C compreendem
50% a 60% do total de fibras deste nervo em anfíbios, aves e mamíferos, sendo que os teleósteos
apresentam apenas 4 % dessas fibras (LYNN, 1994). Esse número reduzido de fibras C em peixes,
e o aumento de sua proporção nos vertebrados terrestres, podem ser explicados evolutivamente
pela passagem do modo de vida aquático para o modo de vida terrestre. Os vertebrados terrestres
podem estar sujeitos a uma maior chance de injúria devido à força da gravidade, gases nocivos,
temperaturas extremas. Ao invés disso, no ambiente aquático, a flutuação contém a gravidade, as
substâncias químicas podem ser diluídas e não existem grandes variações de temperatura como
as que ocorrem em terra (SNEDDON, 2004). No ambiente terrestre, o aumento à exposição a
estímulos aversivos e o aparecimento de novos tipos de predadores e presas favoreceram a
seleção de um sistema de alarme mais eficiente, com uma maior quantidade de nociceptores.
Portanto, talvez os peixes não sofreram uma pressão seletiva para desenvolver um sistema
nociceptivo tão complexo quanto o de mamíferos, já que na água o risco de um dano tecidual é
muito menor. No entanto, os peixes apresentam esse sistema, pois eles podem estar sujeitos ao
contato com poluentes, alimentos venenosos, ferimentos na boca como resultado de agressão,
tentativa de capturar a presa e pesca, como também ataque de predador. Logo, a nocicepção é
uma característica adaptativa, uma vez que é de suma importância que esses animais tenham um
sistema sensorial capaz de perceber possíveis injúrias e reagir apropriadamente a elas.
Outros estudos de anatomia de inervação periférica feitos em três espécies de
elasmobrânquias não detectaram nociceptores, nem fibras do tipo C, embora as fibras do tipo A δ
estejam presentes (LEONARD, 1985). Isso pode representar uma divergência evolutiva entre os
teleósteos e linhagens de peixes cartilaginosos, em decorrência da qual teriam perdido as fibras
amielínicas, característica que foi mantida e que permaneceu ao longo da evolução dos demais
vertebrados (SNEDDON, 2004).
1.6.2-Tratos ascendentes da informação nociceptiva
Como já foi discutido, já está bem estabelecido que em mamíferos as principais vias
ascendentes de transmissão nociceptiva transitam por duas zonas distintas na medula espinal:
funículo dorsolateral e funículo ântero-lateral. Pelo funículo dorsolateral transitam as vias espino-
parabraquio-hipotalâmica e a espino-parabraquio-amigdaloide, ambas relacionadas com o
componente afetivo-motivacional da dor. Pelo funículo ântero-lateral transitam as vias
paleoespinotalâmica e a neoespinotalâmica, sendo que a primeira também está relacionada com
aspectos subjetivos da dor, enquanto que a segunda com o componente sensorial-discriminativo.
Nos anfíbios, existem vias que correm pelos funículos dorsolateral e ântero-lateral da
medula espinal (MUÑOZ e cols., 1997). No entanto, como não existem comprovações funcionais, é
difícil postular, a não ser por analogias com os mamíferos, quais modalidades de informação estas
vias veiculam. O conhecimento das regiões encefálicas por elas aferentadas pode nos fornecer
indícios acerca das funções as quais estas vias estão envolvidas (HOFFMANN, 2008). As fibras do
funículo dorsolateral se conectam nos anfíbios com a formação reticular e uma região subcerebelar
denominada de núcleo parabraquial (NEARY, 1995), lembrando as vias espino-parabraquiais
presentes nos mamíferos. As fibras do funículo ântero-lateral terminam na formação reticular, em
estruturas mesencefálicas como o toro, tectum e tegmentum e em núcleos talâmicos dorsais e
ventrais. É importante ressaltar que nos anfíbios tanto o toro como o tectum estão envolvidos na
elaboração de respostas ligadas aos comportamentos de captura de presa e defesa. Já a
formação reticular possui neurônios de grande diâmetro cujos axônios formam uma via
descendente envolvida na motricidade. Essa via retículo-espinal é a mais antiga das vias motoras
presentes nos vertebrados e está envolvida em respostas motoras a estímulos nocivos.
(HOFFMANN, 2008). Os peixes (Elasmobrânquios e Teleósteos) apresentam tanto as áreas
cerebrais quanto as conexões necessárias para o processamento da informação nociceptiva. Os
principais tratos envolvidos na nocicepção são os tratos trigeminal, que leva a informação da
região da cabeça, e o trato espinotalâmico, que conduz a informação de todas as outras partes do
corpo para o encéfalo. Esses dois tratos estão presentes nos anfíbios, répteis e peixes
(SNEDDON, 2004). O trato trigeminal dos peixes se projeta para regiões encefálicas relevantes
como tálamo, cerebelo, e bulbo, os quais estão envolvidos na dor e na nocicepção em mamíferos
(SNEDDON, 2002). Já a via espinal ascendente (sem distinção quanto aos funículos pelos quais
transitam), conecta-se com a formação reticular, núcleo motor dorsal do vago, bulbo, cerebelo,
nucleus intercollicularis, tectum e tálamo (EBBESSON e HODDE, 1981). Estudos hodológicos
demonstraram que um componente dessa via, no caso a conexão com a formação reticular, é
comparável à via espinorreticular do trato espinotalâmico dos mamíferos (HOFFMANN, 2008).
Entretanto, temos que considerar que em mamíferos a via espinotalâmica conduz apenas as
informações nociceptivas, enquanto que nos peixes veicula a informação da sensibilidade somática
de diversas modalidades, sendo uma delas a nocicepção.
1.6.3-Teto óptico e a nocicepção
Nos vertebrados não-mamíferos o teto do mesencéfalo é chamado de tectum, o qual é
dominado por uma região retinorrecipiente chamada de teto óptico, homólogo ao colículo superior
nos mamíferos (BUTLER e HODOS, 1996). Embora o teto óptico receba majoritariamente
aferências oriundas da retina, essa região pode ser considerada mais que um centro de
processamento visual, uma vez que recebe informações topograficamente organizadas
provenientes de outras modalidades sensoriais como nocicepção (ARIËNS KAPPERS, 1920 in
apud ARRIBA e POMBAL, 2007), audição, tato, e quando presentes, recepção de estímulos
ópticos do espectro infravermelho e eletrosensibilidade (BUTLER e HODOS, 1996). Além disso,
também pode estar relacionado com respostas de captura de presa (McCONVILLE e LAMING,
2006), defesa e de localização e orientação frente ao estímulo (BUTLER, 1992). Assim, o teto
óptico é um dos principais centros de integração sensório-motora (MEEK e NIEUWENHYS, 1998)
e uma das estruturas encefálicas mais conservadas nos vertebrados (BUTLER e HODOS, 1996).
O teto óptico pode ser dividido em três zonas principais: superficial, central e periventricular
(BUTLER e HODOS, 1996). Essas, por sua vez, são subdivididas em várias camadas de células e
fibras que podem variar substancialmente em diferentes grupos e espécies (MEEK e
NIEUWENHYS, 1998). Nos teleósteos, o teto é formado por sete camadas (MEEK e
NIEUWENHYS, 1998) e pode ser dividido em duas regiões funcionais formadas pelas camadas
superficiais e pelas camadas intermediárias e profundas, sendo que as primeiras são sítios de
projeções da retina, enquanto que as outras recebem informações, além das visuais, de outras
modalidades sensoriais (ITO e cols., 1980; MEEK, 1983; BUTLER e HODOS, 1996) vindas de
diferentes áreas do SNC.
As projeções aferentes tectais se originam de múltiplas regiões das partes mais caudais do
tronco encefálico dos teleósteos, incluindo a formação reticular, locus coeruleus, rafe inferior,
núcleo medial octavolateral e medula espinal rostral (BUTLER e HODOS, 1996). Alguns estudos
clássicos descreveram a presença de fibras ascendentes do funículo lateral da medula espinal
para o teto óptico. Segundo Ariëns Kappers, 1920 in apud Arriba e Pombal (2007), essas fibras
constituem um sistema sensorial secundário transmitindo informações táteis, nociceptivas e
térmicas para o teto óptico.
Vários trabalhos já demonstraram que a estimulação das camadas profundas do colículo
superior dos roedores está relacionada à produção de respostas defensivas seguidas por
antinocicepção (COIMBRA e BRANDÃO, 1997). Em relação aos não-mamíferos, informações
sobre o teto óptico apontam também para o envolvimento dessa estrutura com respostas
defensivas. Em lagartos Iguana iguana, o teto estimulado eletricamente produz respostas de
escape (DISTEL, 1978). Em Carassius auratus estimulações elétricas de alta intensidade (150 µA)
nas camadas intermediárias e profundas do teto óptico posterior evocam movimentos
característicos das respostas de escape tais como: contrações dos músculos axiais ipsilaterais e
giros da nadadeira que provocam giros do corpo (HERRERO e cols., 1998). Al-Akel e cols. (1986)
demonstraram que estimulações elétricas no teto óptico de peixes, nadando livremente num
aquário, provocaram aumento da atividade natatória dos animais, ereção da nadadeira dorsal e
movimentos rápidos de natação.
Do ponto de vista funcional, parece inteiramente razoável uma estrutura envolvida com
essas respostas também estar envolvida com analgesia, já que durante um confronto entre presa e
predador é importante amenizar a sensação aversiva e, consequentemente, suprimir respostas
recuperativas, permitindo a expressão do comportamento defensivo, essencial para a
sobrevivência do indivíduo. No entanto, pouco se sabe acerca do envolvimento do teto óptico em
respostas antinociceptivas em teleósteos.
Todos os trabalhos realizados até hoje sobre analgesia em peixes, têm utilizado apenas
abordagens farmacológicas mediante a injeção sistêmica de morfina e avaliando sua ação das
respostas induzidas por estímulos nocivos. Nenhum trabalho foi feito a este respeito tentando
delimitar as estruturas centrais e os neurotransmissores envolvidos em dor e analgesia, fazendo
uso de microinjeções centrais de drogas em animais acordados com cânulas implantadas. Desse
modo, é de suma importância investigar o efeito de administrações centrais de drogas no teto
óptico dos peixes para observar se essa estrutura está envolvida na nocicepção e na analgesia
endógena, uma vez que existe uma homologia desta estrutura com o colículo superior dos
mamíferos.
1.6.4-Receptores opioides e endorfinas
Outro fator que deve ser levado em conta para determinar a nocicepção em peixes é se
existe ou não receptores opioides endógenos e endorfinas, pois estas substâncias estão
fortemente envolvidas na rede neural relacionada com a dor em mamíferos. Assim, identificar a
presença desses receptores e peptídeos endógenos é um fator crucial para saber se a nocicepção
ocorre.
Nos mamíferos, os receptores endógenos e as endorfinas se concentram
preferencialmente em regiões como medula espinal, núcleo da raphe, formação reticular,
substância cinzenta periaquedutal e tálamo. Os peixes apresentam receptores opioides com um
padrão de distribuição semelhante aos outros vertebrados (VECINO e cols., 1990). Os opioides
eliciam analgesia por meio de três tipos distintos de receptores em mamíferos (NEWMAN e cols.,
2000) e esses foram identificados na zebrafish, Danio rerio (STEVENS, 2004). Quando o goldfish
foi submetido a condições estressantes, houve um aumento de pro-opiomelanocortina, o precursor
das encefalinas e endorfinas, como aquelas encontradas em humanos (DENZER e LAUDIEN,
1987). No entanto, há baixa distribuição de receptores do tipo µ em goldfish. Nos anfíbios e répteis,
a distribuição desses receptores é intermediária e é bastante abundante nos ratos (STEVENS,
1988; STEVENS, 2004).
1.6.5-Analgésicos reduzem respostas nociceptivas
Sabe-se muito pouco sobre analgesia em peixes, pois só recentemente é que foram
identificados nociceptores nesses animais. Os poucos trabalhos existentes sobre esse assunto só
dizem respeito ao efeito da morfina.
Trabalhos feitos com truta Oncorhynchus mykiss mostraram que a injeção subcutânea de
ácido acético, tanto na região da cauda quanto nos lábios, provocou mudanças comportamentais e
neurovegetativas. Foram registrados dois tipos de comportamentos, o "rubbing", que consiste em
esfregar o lábio (onde a substância foi injetada) na parede do aquário e o "rocking", em que o
animal fica se movimentando de um lado a outro e raspando a nadadeira peitoral (próxima à
injeção) no cascalho. Esses comportamentos não foram encontrados nos animais que receberam
injeção de salina. Naqueles animais em que a morfina foi administrada (300mg/kg), ocorreu uma
drástica redução dessas respostas. Em relação às respostas neurovegetativas, houve um grande
aumento da frequência dos batimentos operculares nos animais que receberam ácido acético, e
esta resposta foi abolida com a aplicação de morfina. (SNEDDON, 2003a). Sneddon e cols.
(2003b) realizaram experimentos em trutas para tentar avaliar o quanto um objeto novo, que induz
medo, introduzido no ambiente, afeta a resposta de dor. Ela investigou o estado de atenção dos
peixes medindo o tempo que os animais demoravam pra se aproximar do objeto, quando eles
eram submetidos à injeção de salina e ácido acético. Os animais que receberam a injeção de ácido
acético passavam mais tempo próximos ao objeto. Os resultados desse trabalho sugerem que o
estímulo nocivo captura a atenção do animal que ignora a presença do objeto novo. A injeção
intramuscular de morfina teve um significante efeito analgésico, fazendo com que a resposta de
medo voltasse nos animais.
Esses comportamentos mostrados pela truta após a injeção do ácido acético são
respostas complexas, sugerindo o envolvimento de processos neurais mais sofisticados, do que
simples reflexos. Assemelham-se a algumas respostas relacionadas com dor nos mamíferos
como, por exemplo, o ato de esfregar no local lesado para tentar mimorar a intensidade da dor
observada em humanos. Assim, podemos concluir que esses comportamentos são fortes
indicadores da existência da percepção dolorosa nos peixes.
Ehrensing e cols. (1982) demonstraram que peixes goldfish (Carassus auratus)
aprenderam a evitar choque elétrico. A voltagem aplicada era aumentada até que o animal
apresentasse em resposta um nado agitado, indicando que ele percebeu o estímulo nocivo.
Porém, quando era injetada morfina por via subcutânea (30mg/kg) ocorria um aumento do limiar,
isto é, era necessária uma voltagem maior para que o animal reagisse. Neste experimento,
também foi feito o pré-tratamento com naloxona e MIF-1 (antagonistas opióides), injetados
intracranialmente, e foi observado que estas drogas bloquearam o efeito analgésico da morfina
(EHRENSING e cols., 1992).
As respostas ao estímulo nocivo parecem ser espécies-específicas e as mudanças
comportamentais podem ser distintas de acordo com a modalidade do estímulo. Com isso, são
necessários estudos em diferentes espécies de peixes submetidos a diferentes testes
algesimétricos para estabelecer quais dessas respostas podem ser consideradas universais a
todos os teleósteos.
Por conseguinte, estudos relacionados com a nocicepção em peixes são relevantes para
estipular normas com vistas a sua manipulação. Atualmente, vem aumentando a produção de
peixes para a alimentação, lazer, ornamentação dentre outros, e todas essas práticas podem
causar estresse no animal, fazendo com que seja necessário o desenvolvimento de condutas
apropriadas para o seu bem estar. Essas práticas devem sempre incluir considerações sobre as
condições dos peixes e evitar o mínimo desconforto possível. A imposição desse desconforto em
atividades somente para o prazer dos homens (como por exemplo: pesca desportiva e aquarismo)
são inaceitáveis (VOLPATO, 2009). Com isso, reconhecer que esses animais são capazes da
percepção dolorosa é o primeiro passo para se desenvolver projetos que amenizem o sofrimento
do animal em situações como a pesca e até mesmo nas experimentações científicas.
Os peixes podem ser considerados ótimos modelos para o estudo da nocicepção, pois o
seu custo é baixo, um grande número de animais pode ser mantido nos aquários dos laboratórios e
muitas espécies podem facilmente se adaptar ás condições do laboratório. Além disso, é
fundamental o estudo comparado da nocicepção nos vertebrados, para se entender cada vez mais
a evolução desse sistema sensorial.
1.7-Testes algesimétricos
Existem vários tipos de testes para se estudar a nocicepção nos animais, principalmente
em mamíferos. Uma das formas de classificá-los é de acordo com o tipo de estímulo nocivo
utilizado, que pode ser de natureza mecânica, térmica ou química.
A estimulação química envolve a administração de agentes algésicos. Os estímulos
químicos são claramente diferentes de outras formas de estimulação, pois por serem injetados no
animal, esse não consegue se afastar da fonte do estímulo, caracterizando-os assim como sendo
de longa duração e progressivos. Outra propriedade importante é que nesses testes
algesimétricos, nunca o limiar nociceptivo é medido, mas sim a modalidade e a duração das
respostas comportamentais induzidas por tal estimulação. Portanto, esses modelos experimentais
são, sem dúvida, os mais próximos em natureza da dor clínica (LE BARS e cols., 2001). Os
principais estímulos químicos nocivos utilizados para o estudo da nocicepção são: formalina, ácido
acético e capsaicina.
1.7.1-Teste da formalina
O teste de formalina é um modelo tradicional usado no estudo da dor persistente
(DUBUISSON e DENIS, 1977; CULMAN e cols., 1997). A formalina é injetada subcutaneamente na
região plantar da pata do rato produzindo diferentes respostas comportamentais que podem ser
facilmente quantificadas. Após a formalina, o animal apresenta sacudidas rápidas da pata que
recebeu a injeção bem como o comportamento de lamber e /ou de leves mordidas. Nos ratos a
resposta à injeção é bifásica, apresentando uma fase inicial (0 a 5 minutos) evocada pelo efeito
direto da formalina sobre os nociceptores, conhecida como fase neurogênica, seguida por uma f
ase persistente associada a um processo inflamatório (a partir dos 15 minutos, após a injeção de
formalina), atingindo um platô após cerca de uma hora, denominada de fase inflamatória. Entre as
duas fases há um período intermediário de pouca ou nenhuma dor, onde as respostas nociceptivas
são reduzidas ou suprimidas (DUBUISSON e DENIS, 1977). Nesse teste, dependendo das
concentrações de formalina, diferentes intensidades de respostas comportamentais podem ser
avaliadas. Aloisi e cols. (1995) mostraram que ratos que receberam a injeção de formalina 10%
apresentavam maior número e intensidade de respostas comportamentais evocadas pela dor
quando comparados com animais que receberam injeção de formalina 0,1%.
O teste da formalina vem sendo adaptado para o estudo da nocicepção em várias espécies
de animais como: camundongos (ROSLAND, 1991), gatos (SHIMA e cols., 1987), primatas
(ALREJA e cols., 1984), coelhos (CARLI e cols., 1981), crocodilos (KANUI e cols., 1990) e anfíbios
(OYADEYI e cols., 2007). A injeção de formalina induziu uma resposta bifásica em sapos
semelhante àquela encontrada em roedores, embora o curso temporal seja um pouco distinto,
sugerindo mecanismos fisiológicos diferentes (OYADEYI e cols., 2007). Em relação aos peixes,
não existem dados na literatura que mostram a utilização da formalina para se estudar a
nocicepção nestes animais. Logo, é de extrema importância que o teste da formalina seja testado
nas mais variadas espécies para avaliar a sua universalidade, uma vez que não se sabe se o curso
temporal e os mecanismos fisiológicos após a sua aplicação são semelhantes àqueles obtidos com
os roedores (TJOLSEN, 1992).
1.7.2-Teste do ácido acético
O teste do ácido acético é comumente utilizado em anfíbios e mamíferos. Esse teste é
realizado em animais conscientes, a fim de avaliar o nível de dor ou desconforto e a eficácia dos
analgésicos testados (LE BARS e cols., 2001). Algumas respostas comportamentais utilizadas
como indicadores nociceptivos nos mamíferos, dependendo do local da injeção (subcutânea ou
intraperitoneal) de ácido acético são: retração ou movimento das patas traseiras, contração
muscular, contorções abdominais, lamber, esfregar e vocalizar (LE BARS e cols., 2001;
WHEELER-ACETO e cols., 1990).
Nos roedores, após a injeção intraperitoneal de ácido acético, observam-se respostas que
consistem em uma sequência de contorções e extensões do abdômen, algumas vezes
acompanhada por torções do tronco e extensão dos membros posteriores do animal. Esse
comportamento foi denominado de contorção abdominal (WHITTLE, 1964). Nesse teste é feita a
contagem do número de contorções que o animal realiza por unidade de tempo. O teste do ácido
acético também é um modelo comportamental válido para o estudo da nocicepção nos anfíbios
(OYADEYI e cols, 2007). Esse teste foi adaptado para o estudo da nocicepção nos peixes. O ácido
acético é injetado nos lábios dos animais e as respostas ventilatórias e comportamentais são
quantificadas (SNEDDON, 2003a, 2003b; NEWBY e STEVENS, 2008; REILLY e cols., 2008).
1.7.3-Teste da capsaicina
A capsaicina é um dos componentes vanilóides ativos da pimenta e pode evocar uma
sensação de formigamento e ardor e atua ativando canais de cátions não seletivos, chamados de
VR-1, nas terminações nervosas de fibras amielínicas do tipo C (JORDT e JULIUS, 2002; JULIUS
e BASBAUM, 2001; SZALLASI e BLUMBERG, 1999). Em relação aos peixes, não existem dados
na literatura que mostram a utilização da capsaicina para se estudar a nocicepção nesses animais.
Dessa forma, um dos objetivos desse estudo é verificar se os peixes respondem a aplicação desse
estímulo nocivo, já que a injeção de capsaicina é bastante utilizada para o estudo da dor em
roedores (WINTER e cols., 1995).
2 - OBJETIVOS
Investigar uma nova metodologia para o estudo da nocicepção em peixes.
Investigar a existência de um sistema analgésico endógeno no peixe Leporinus
macrocephalus, mediante uma estratégia comportamental. Em outras palavras, o animal
será exposto a uma situação que envolve risco de predação (reação de alarme) e em
seguida será avaliado o limiar nociceptivo fazendo uso do método desenvolvido no item
anterior.
Investigar a possível participação do teto óptico do peixe Leporinus macrocephalus na
antinocicepção, usando o método desenvolvido no primeiro item destes objetivos.
3 - MATERIAL E MÉTODOS
Considerações sobre a espécie estudada
Leporinus macrocephalus, conhecido popularmente como piau ou piauçu, nativo da bacia do Prata
e bacia do Rio Paraguai (GARAVELLO e BRITSKI, 1988), é uma espécie onívora com tendência a
herbivoria que pode ser capturada na beira e no canal dos rios, baías e a jusante de quedas
d’água, principalmente nas proximidades da vegetação (PNDPA, 2003). É um peixe de escamas
de corpo curto e grosso com boca grande e terminal. A sua coloração é cinza escuro,
principalmente por causa da borda lateral escura das escamas, apresentam três manchas
escuras, alongadas verticalmente, sendo a mais posterior muitas vezes difusa (Fig.5).
O
piauçu Leporinus macrocephalus apresenta a seguinte posição sistemática:
Classe: Actinopterygii
Divisão: Teleostei
Superordem: Ostariophysi
Ordem: Characiformes
Família: Anostomidae
Subfamília: Anostominae
Gênero: Leporinus
Espécie: Leporinus macrocephalus
Figura 5: Foto do piauçu Leporinus macrocephalus
Fonte: http://www.ana.gov.br/gefap/Fotos
3.1-Animais
Foram utilizados piauçus juvenis, sem distinção de sexo, com peso corporal variando de 15
a 35g e medindo 10 a 12,5 cm de comprimento. Os animais foram adquiridos de uma distribuidora
local chamada Projeto Peixe, situado no município de Orlândia-SP. Todos os experimentos foram
feitos de acordo com as normas do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) e
aprovado pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo (no. 021/2007).
Os animais foram colocados em aquários individuais (30 X 25 X 15 cm), com água
declorificada e continuamente aerada e filtrada e submetidos ao ciclo de claro/escuro de 12: 12
horas, com temperatura de 26 ± 1ºC. A alimentação foi realizada uma vez ao dia, com ração
peletizada para peixes (PURINA), na quantidade de 3% da biomassa.
3.2-Teste nociceptivo
3.2.1-Teste da formalina
Na tentativa de reproduzir em peixe o modelo de dor proposto para o rato (DUBUISSON e
DENNIS, 1977), soluções de formalina foram injetadas subcutaneamente na região próxima a
nadadeira adiposa, sendo esta utilizada como uma marca para padronizar o local de injeção
(Fig.6). A maioria dos trabalhos de nocicepção em peixes usa o ácido acético como um estímulo
nocivo e os lábios para a sua aplicação (NEWBY e STEVENS, 2008; SNEDDONN, 2003b). A
região próxima à nadadeira adiposa foi escolhida para a injeção de formalina a 3%, pois é uma
área com grandes concentrações de nociceptores. Os peixes apresentam um desenvolvido
sistema nociceptivo com nociceptores presentes em todo o corpo (CHERVOVA e cols., 2000). As
regiões mais sensíveis ao estímulo nocivo são: as regiões de implantação das nadadeiras caudais,
dorsais e peitorais, a pele ao redor dos olhos e do epitélio olfatório (CHERCHOVA, 1997). A alta
densidade de nociceptores na região das nadadeiras pode estar relacionada com o fato de que
elas são mais prejudicadas durante a atividade de construção de ninhos e interações agressivas
(LORENZ, 1984 in apud CHERCHOVA, 1997).
Esse teste também já foi adaptado para outros mamíferos como gatos e também em
primatas (CULMAN e cols., 1997) e para o crocodilo (PORRO e CAVAZZUTTI, 1993) e provou ser
um método útil para produzir dor. Três diferentes concentrações de formalina (1%, 3% e 5%) foram
utilizadas em trabalhos anteriores do laboratório como um estímulo nocivo em peixes Oreochromis
niloticus, sendo que a concentração de 3% provou ser a mais eficiente para reduzir a magnitude da
resposta cardíaca reversível induzida por um estímulo visual de uma sombra em movimento (IDE e
HOFFMANN, 2002). Trabalhos-piloto feitos no laboratório demonstraram que a concentração de
formalina 6% injetada na região próxima à nadadeira adiposa ocasionou a morte dos peixes ou
perda de postura. Dessa forma, a concentração escolhida no presente trabalho foi de 3% e ela é
menor que a normalmente utilizada em mamíferos (5%).
Os animais foram removidos da água com auxílio de uma rede de nylon, enrolados em
pano umedecido, colocados sobre uma mesa por alguns segundos para a injeção subcutânea das
drogas e imediatamente devolvidos para a água. As alterações dos batimentos operculares e da
atividade natatória foram utilizadas como indicadores nociceptivos. No final do experimento foram
sacrificados por anestesia profunda com MS222 (tricaine methane sulfonate, 0,2g/l; Sigma, St.
Louis, MO).
3.2.2-Capsaicina
Os peixes receberam a injeção subcutânea de diferentes concentrações (10µg/0,2µl e
100µg/0,2µl) de capsaicina na região próxima à nadadeira adiposa.
3.3-Drogas
No presente estudo, foram utilizadas as seguintes drogas: sulfato de morfina (Sigma, St.
Louis, MO) e naloxona (Tocris Bioscience), dissolvidos em solução Ringer para peixes, que
também foi utilizada como veículo controle. As doses utilizadas foram 30mg/kg, 50mg/kg e
100mg/kg de morfina, 10mg/kg, 20mg/kg e 30mg/kg de naloxona. O volume da injeção sistêmica
foi de 0,1ml/10g do peso do peixe. Em relação à microinjeção central, foram utilizadas as doses
de 1,1nmol/0,1µl de morfina e 0,37nmol/0,1µl.
3.4- Análise e Quantificação dos Dados
3.4.1-Batimentos operculares:
Os batimentos operculares ou bucais foram acessados visualmente. Com o auxílio de um
cronômetro, o tempo necessário para que ocorressem 20 batimentos sucessivos foi contado e a
frequência ventilatória (batimentos/min) foi avaliada (adaptado de BARRETO e cols., 2003).
A frequência ventilatória para cada intervalo de tempo foi normalizada subtraindo o seu
valor pelo valor basal e a diferença obtida foi dividida pelo valor basal. O índice 1 dos dados
normalizados correspondem a um aumento de 100% do valor basal. As médias das porcentagens
dos valores normalizados são apresentadas.
Figura 6: Foto de piauçu Leporinus macrocephalus. A seta mostra o
local da injeção, próxima à nadadeira adiposa.
3.4.2-Atividade natatória:
Uma filmadora acoplada a um computador através de um “free software” de captura de
imagem Virtual Dub 1.6.16, foi colocada frontalmente ao aquário para a filmagem de todo o
experimento. Para quantificar a atividade natatória, a parede posterior do aquário foi dividida em
linhas verticais e horizontais, formando nove quadrantes de 12,3 X 7 cm. As paredes laterais foram
revestidas com papel opaco, a fim de isolá-los de estímulos visuais de outros coespecíficos
mantidos em aquários vizinhos.
A atividade natatória foi quantificada pela contagem do número de vezes em que o animal
se deslocou pelas diferentes células, utilizando a boca como ponto de referência. Esse
procedimento foi feito utilizando-se do programa de linguagem Basic, ETOREG6P BPC,
desenvolvido por Schmidek & Schmidek (1998). A atividade natatória foi expressa como a
diferença (delta de locomoção) do número de deslocamentos após (pós-estímulo) e antes (Linha
de base) da injeção subcutânea de salina, formalina a 3% ou capsaicina.
3.5-Obtenção da substância de alarme de coespecíficos
O extrato de pele de coespecíficos é usualmente empregado por vários grupos de pesquisa
como estímulo químico, visto que induz a resposta de alarme. Em nossos experimentos usamos a
pele de espécimes juvenis de piauçu para obtenção do extrato. Esses animais foram sacrificados
por concussão e a pele de ambos os lados do corpo foi removida a partir do pedúnculo caudal até
próximo à região opercular. Cada 21 cm
2
de pele foi homogeneizada em 50 ml de água destilada,
utilizando-se de um homogenizador Polytron. Posteriormente, a solução passou por um processo
de filtração por vácuo para remoção de escamas e tecidos remanescentes. Alíquotas de 1ml foram
estocadas a -4ºC por no máximo dois meses. Alguns minutos antes da sua utilização, elas eram
descongeladas gradualmente em temperatura ambiente.
3.6-Procedimento cirúrgico
3.6.1-Anestesia
Os animais foram anestesiados por imersão numa solução com 0,20 g/l de MS222 (tricaine
methane sulfonate: Sigma, St. Louis, MO), até a interrupção dos movimentos operculares e
somáticos. Foram retirados da água e envolvidos com algodão umedecidos para evitar danos ao
epitélio cutâneo e permaneceram durante toda a cirurgia sob ventilação hidráulica contínua,
através das guelras, com água aerada contendo solução anestésica de manutenção
(0,1g/l:MS222). O nível anestésico foi monitorado durante todo o procedimento cirúrgico por
observação direta dos movimentos da boca e da cauda.
3.6.2-Implantação da cânula-guia na região do crânio.
Os animais foram submetidos ao implante unilateral de cânulas-guias sobre a região do
mesencéfalo visando o teto óptico (TeO), para administração central das drogas.
Para facilitar o procedimento cirúrgico, foi desenvolvida uma caixa de acrílico com um
prendedor de cabeça, no qual os animais foram mantidos fisicamente restritos para a realização de
intervenções na região cefálica (Fig.7). A essa caixa de contenção está acoplado um
micromanipulador Prior para a realização dos procedimentos estereotáxicos. As dimensões e
características dessa caixa estão descritas em CORRÊA e cols. (1998).
Todo o procedimento cirúrgico foi realizado com auxílio de uma lupa binocular com luz
polarizada (Carl Zeiss, OPMI 1-FC). Após a fixação da cabeça na caixa e assepsia da pele que
recobre o crânio, foi feita uma incisão cutânea longitudinal para a exposição da calota craniana.
Posteriormente, foram feitos orifícios com o auxílio de broca odontológica, para a implantação da
cânula-guia. Esta possui 7mm de comprimento e foi confeccionada a partir de segmentos de
agulhas hipodérmicas com 5,5 mm de diâmetro externo. Os orifícios ao redor da cânula foram
obstruídos por misturas de partes iguais de glicerina e vaselina e o crânio, fechado com acrílico
autopolimerizável (Symplex: DFL, Ind. Com. Ltda) e cola instantânea (Super Bonder: Loctite). Com
o término da cirurgia e recuperação da anestesia, os animais retornaram aos seus respectivos
aquários e os experimentos foram realizados dois dias após o procedimento cirúrgico.
Figura 7: Fotografia da caixa cirúrgica confeccionada em acrílico com o prendedor de cabeça e o
micromanipulador que permite a realização dos procedimentos estereotáxicos.
3.6.3-Microinjeção central das drogas
A aplicação das drogas foi feita com o auxílio de uma microsseringa Hamilton de 2µl,
conectada a uma agulha Mizzy com 0,3 mm de diâmetro externo por um segmento de polietileno
PE 10. A agulha de injeção, o polietileno e a microsseringa foram preenchidos com salina. Após
este procedimento, o êmbolo foi pressionado até o fim da seringa eliminando parte desta salina.
Em seguida, um pouco de ar foi aspirado para formar uma pequena bolha que serve para separar
os dois líquidos e, finalmente, a solução com a droga foi aspirada. Terminado o processo, o
conjunto formado pela agulha, polietileno e microsseringa estava preenchido com salina, a droga e
a bolha de ar separando os dois líquidos. Nos grupos que receberam salina, a microsseringa foi
totalmente preenchida com essa solução.
A microinjeção demorava aproximadamente 60 segundos e era efetuada após introdução
da agulha Mizzy na cânula-guia até a profundidade da estrutura visada. A agulha permaneceu no
local por mais 60 segundos, para evitar o refluxo da solução injetada durante a retirada da agulha.
O tamanho das agulhas utilizadas para a microinjeção central das drogas no teto óptico medial e
lateral foram de 9mm e 12mm, respectivamente.
3.6.4-Histologia
Ao término dos experimentos, os animais receberam a microinjeção central de 0,1µl de
Azul de Evans a 2%, a fim de facilitar a identificação do sítio da microinjeção. Para isso, os peixes
foram sacrificados por anestesia profunda por MS222 (tricaine methane sulfonate: Sigma, St.
Louis, MO). A cabeça foi destacada do corpo e mergulhada em solução de formalina a 10%.
Posteriormente o cérebro foi retirado da caixa craniana e enviado para o processamento
histológico.
Depois de incluídos em parafina, cortados e corados com Cresyl Violeta, os cortes foram
observados ao microscópio de luz (Zeiss), os sítios das microinjeções reconhecidos e plotados em
desenhos esquemáticos do cérebro com o auxílio do programa "Adobe Ilustrator". Por sua vez,
também foram feitas as fotomicrografias das secções transversais do cérebro mostrando sítios das
microinjeções da drogas. As fotomicrografias foram feitas utilizando-se um microscópio AXIOPHOT
(Zeiss) e filme em branco e preto TMAX-100 (Kodak), ou por meio de aquisição digital das imagens
utilizando-se uma câmera Cânon Power Shot G5 acoplada ao microscópio de luz.
Os animais em que o exame histológico dos cortes seriados do cérebro mostrou que as
microinjeções não atingiram o teto óptico foram automaticamente descartados das análises dos
dados ou foram usados para demonstrar a especificidade da ação da droga sobre um dado sítio
3.7-Protocolos experimentais
EXPERIMENTO 1: DESENVOLVIMENTO DE UM NOVO TESTE PARA AVALIAR A
NOCICEPÇÃO EM PEIXES
Objetivo:
O objetivo deste experimento foi investigar se a administração subcutânea de formalina a 3%
ou de capsaicina na região próxima à nadadeira adiposa do piauçu Leporinus macrocephalus induz
respostas facilmente reproduzíveis e quantificáveis como indicadores de nocicepção. Elegeu-se
observar a possibilidade de avaliar além do componente motor da resposta, um componente
autonômico de fácil acesso, no caso os batimentos operculares.
A) Injeção subcutânea de formalina a 3%
A partir de experimentos pilotos, verificou-se que a injeção subcutânea de formalina a 3%
induz nítidas modificações dos batimentos operculares e do movimento. Estas duas observações
foram feitas em grupos separados, visto que para a contagem visual dos batimentos operculares,
o animal precisava ser mantido num recipiente restrito.
1- Administração subcutânea de formalina a 3% e os batimentos operculares
Procedimento experimental
Primeira fase:
Os animais foram colocados em uma caixa experimental (40 X 11 X 8 cm) durante uma
hora para aclimatação (Fig.8). O experimentador ficava sentado em frente a essa caixa para fazer
a contagem visual dos batimentos operculares, como já descrito anteriormente. O procedimento de
observação consistiu em duas etapas sucessivas: (1) cinco minutos do registro dos batimentos
operculares (Linha de base) e (2) sessenta minutos de registro dos batimentos operculares (Pós-
estímulo) após a administração subcutânea de 20 µl de salina ou formalina a 3% na região próxima
a nadadeira adiposa. Os batimentos operculares foram registrados minuto a minuto, porém os
dados foram agrupados de cinco em cinco minutos para facilitar uma posterior análise dos dados.
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
5 minutos (Linha de Base)
60 minutos (Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
5 minutos (Linha de Base)
60 minutos (Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
Figura 8: Fotografia da caixa experimental confeccionada em acrílico utilizada para a contagem
dos batimentos operculares.
Grupos experimentais:
Grupo salina (n = 7): Os animais receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo formalina a 3% (n = 7): Os animais receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a
3%.
Segunda fase:
Os animais foram pré-tratados com diferentes doses de morfina a 30mg/kg, a 50mg/kg e a
100mg/kg (0,1 ml/10g do peso do peixe). Sessenta minutos após, os batimentos operculares foram
registrados durante cinco minutos (Linha de base) e, nos quinze minutos seguintes, após a
administração subcutânea de 20µl ou formalina a 3% (Pós-estímulo) na região próxima a
nadadeira adiposa
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
5 minutos
(Linha de Base)
15 minutos
(Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
Injeção sistêmica
de morfina e salina
55 minutos
de repouso
30mg/kg
50mg/kg
100mg/kg
60 minutos
5 minutos
(Linha de Base)
15 minutos
(Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
Injeção sistêmica
de morfina e salina
55 minutos
de repouso
30mg/kg
50mg/kg
100mg/kg
5 minutos
(Linha de Base)
15 minutos
(Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
Injeção sistêmica
de morfina e salina
55 minutos
de repouso
5 minutos
(Linha de Base)
15 minutos
(Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
5 minutos
(Linha de Base)
15 minutos
(Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
Injeção sistêmica
de morfina e salina
55 minutos
de repouso
Injeção sistêmica
de morfina e salina
55 minutos
de repouso
30mg/kg
50mg/kg
100mg/kg
60 minutos60 minutos
Grupos experimentais:
Grupo salina + salina (n = 7): Os animais receberam a injeção sistêmica de salina (0,1 ml/10g do
peso do peixe) e depois receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo salina + formalina a 3% (n = 7): Os animais receberam a injeção sistêmica de salina (0,1
ml/10g do peso do peixe) e depois receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
Grupo morfina na dose de 30mg/kg + formalina a 3% (n = 7): Os animais receberam a injeção
sistêmica de morfina na dose de 30mg/kg (0,1 ml/10g do peso do peixe) e depois receberam a
injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
Grupo morfina na dose de 50mg/kg + formalina a 3% (n = 8): Os animais receberam a injeção
sistêmica de morfina na dose de 50mg/kg (0,1 ml/10g do peso do peixe) e depois receberam a
injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
Grupo morfina na dose de 100mg/kg + formalina a 3% (n = 8): Os animais receberam a injeção
sistêmica de morfina na dose de 100mg/kg (0,1 ml/10g do peso do peixe) e depois receberam a
injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
2- Administração subcutânea de formalina a 3% e a atividade natatória.
Procedimento Experimental
Primeira Fase:
Durante os experimentos, os peixes foram monitorados por uma câmera Sony CCD-TRV
318, que foi colocada em frente do aquário. O protocolo experimental consiste em cinco minutos de
registro da atividade natatória (Linha de base) e cinco minutos de registro (Pós-estímulo), após a
administração subcutânea de 20µl de salina ou formalina a 3% na região próxima a nadadeira
adiposa.
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
Grupos experimentais:
Grupo salina (n = 8): Os animais receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo formalina a 3% (n = 8): Os animais receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a
3%.
Segunda Fase:
Os peixes receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina (SAL) ou formalina a 3%
(FOR) na região próxima a nadadeira adiposa, quinze minutos após a injeção sistêmica de morfina
50mg/kg ou salina nas seguintes combinações: SAL + SAL, SAL + FOR, MOR + SAL e MOR +
FOR. Alguns animais receberam a injeção subcutânea de formalina a 3%, sessenta minutos após
a injeção sistêmica de morfina na dose de 50mg/kg. A atividade natatória foi medida cinco minutos
antes (Linha de base) e cinco minutos (Pós-estímulo) após a aplicação do estímulo nocivo e a
salina como controle.
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
Injeção sistêmica
de morfina
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
10 minutos
de repouso
50mg/kg
15 minutos
Injeção sistêmica
de morfina
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
10 minutos
de repouso
50mg/kg
15 minutos
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(Pós-estímulo)
Injeção de Formalina 3%
ou Salina
10 minutos
de repouso
50mg/kg
15 minutos15 minutos
Grupos experimentais:
Grupo salina + salina (n = 7): Os animais receberam a injeção sistêmica de salina e após quinze
minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo salina + formalina a 3% (n = 6): Os animais receberam a injeção sistêmica de salina e após
quinze minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
Grupo morfina + salina (n = 8): Os animais receberam a injeção sistêmica de morfina na dose de
50mg/kg e após quinze minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo morfina + formalina a 3% (n = 7): Os animais receberam a injeção sistêmica de morfina na
dose de 50mg/kg e após quinze minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a
3%.
Grupo morfina + formalina a 3% (n = 6): Os animais receberam a injeção sistêmica de morfina na
dose de 50mg/kg e após sessenta minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a
3%.
Terceira Fase:
Os peixes receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina ou formalina a 3% na região
próxima a nadadeira adiposa, dez minutos após a injeção sistêmica de naloxona (NAL) 10mg/kg
nas seguintes combinações: NAL + SAL e NAL + FOR. A atividade natatória foi medida cinco
minutos antes (Linha de base) e cinco minutos (Pós-estímulo) após a aplicação do estímulo nocivo
e a salina como controle.
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
Os animais foram pré-tratados com naloxona nas doses de 10mg/kg, 20mg/kg e 30mg/kg
dez minutos antes da injeção sistêmica de morfina na dose de 50mg/kg seguida cinco minutos
após da aplicação de 20µl de formalina a 3% na região próxima a nadadeira adiposa nas seguintes
combinações: NAL 1 + MOR + FOR, NAL 2 + MOR + FOR e NAL 3 + MOR + FOR. A atividade
natatória foi medida cinco minutos antes (Linha de base) e cinco minutos (Pós-estímulo) após a
aplicação do estímulo nocivo e a salina como controle.
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
Inje
ç
ão sistêmica
de
naloxona
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
Inje
ç
ão de
Formalina
3%
ou Salina
5 minutos
de repouso
10 minutos
10mg/kg
Inje
ç
ão sistêmica
de
naloxo
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
Inje
ç
ão de
Formalina
3%
ou Salina
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
Inje
ç
ão de
Formalina
3%
ou Salina
5 minutos
de repouso
10 minutos 10 minutos
10mg/kg
Grupos experimentais:
Grupo naloxona + salina (n = 7): Os animais receberam a injeção sistêmica de naloxona na dose
de 10mg/kg e após dez minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo naloxona + formalina a 3% (n = 8): Os animais receberam a injeção sistêmica de naloxona
na dose de10mg/kg e após dez minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a
3%.
Grupo naloxona 1+ morfina + formalina a 3% (n = 4): Os animais foram pré-tratados com naloxona
na dose de 10mg/kg, dez minutos após receberam a injeção sistêmica de morfina na dose de
50mg/kg e após cinco minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
Grupo naloxona 2 + morfina + formalina a 3% (n = 7): Os animais foram pré-tratados com naloxona
na dose de 20mg/kg, dez minutos após receberam a injeção sistêmica de morfina na dose de
50mg/kg e após cinco minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
Grupo naloxona 3 + morfina + formalina a 3% (n = 8): Os animais foram pré-tratados com naloxona
na dose de 30mg/kg, dez minutos após receberam a injeção sistêmica de morfina na dose de
50mg/kg e após cinco minutos receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
B) Administração subcutânea de capsaicina
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
Inje
ç
ão de
Formalina
3%
ou Salina
Pr
é
-
tratamento
com
naloxona
10 minutos
de repouso
Inje
ç
ão sistêmica
de morfina (50mg/kg)
10mg/kg
20mg/kg
30mg/kg
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
Inje
ç
ão de
Formalina
3%
ou Salina
Pr
é
-
tratamento
com
naloxon
10 minutos
de repouso
Inje
ç
ão sistêmica
de morfina (50mg/kg)
10mg/kg
20mg/kg
30mg/kg
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
Inje
ç
ão de
Formalina
3%
ou Salina
Pr
é
-
tratamento
com
naloxon
10 minutos
de repouso
Inje
ç
ão sistêmica
de morfina (50mg/kg)
10mg/kg
20mg/kg
30mg/kg
Neste caso, nos ativemos à análise dos movimentos do animal, visto que a droga se
mostrou inefetiva.
Procedimento experimental
O protocolo experimental consiste em cinco minutos de registro da atividade natatória
(Linha de base) e cinco minutos de registro (Pós-estímulo), após a administração subcutânea de
20µl de capsaicina ou veículo na região próxima a nadadeira adiposa.
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (Pós-estímulo)
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (Pós-estímulo)
Injeção de capsaicina
ou veículo
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (Pós-estímulo)
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (Pós-estímulo)
Injeção de capsaicina
ou veículo
Grupos experimentais:
Grupo veículo (n = 8): Os animais receberam a injeção subcutânea de 20µl de veículo.
Grupo capsaicina 1 (n = 7): Os animais receberam a injeção subcutânea de 10µg/20µl de
capsaicina.
Grupo capsaicina 2 (n = 7): Os animais receberam a injeção subcutânea 100µg/20µl de
capsaicina.
EXPERIMENTO 2: MOBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL DO SISTEMA ANALGÉSICO
ENDÓGENO
Objetivo:
O objetivo deste experimento foi investigar se a resposta natatória decorrente da injeção
subcutânea de formalina a 3% na região próxima a nadadeira adiposa é modificada após a
exposição prévia à substância de alarme (Primeira Fase). Em outras palavras, se o estresse
causado por uma situação potencialmente ameaçadora (presença da substância de alarme) é
capaz de mobilizar o sistema analgésico endógeno. Confirmando-se esta última hipótese, o
experimento da primeira fase foi repetido em animais pré-tratados com naloxona (Segunda Fase),
com o intuito de verificar se a eventual analgesia é de origem opióide.
Procedimento Experimental:
Primeira Fase:
Durante os primeiros cinco minutos (Linha de base) a atividade natatória dos animais foi
registrada. Após isso, foi introduzido na superfície do aquário 1ml de substância de alarme de
coespecífico ou água destilada (veículo usado para dissolver a SA), utilizando para isso uma
seringa de 1ml. Tanto a resposta comportamental quanto a atividade natatória foram registradas
nos cinco minutos seguintes. Depois disso, o animal recebeu a injeção subcutânea de 20µl de
salina ou formalina a 3% na região próxima a nadadeira adiposa seguida de mais cinco minutos de
registro da atividade natatória (Pós-estímulo).
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
Grupos experimentais:
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
Inje
ç
ão de
Formalina
3%
ou Salina
1ml de SA ou
á
gua destilada
aplicada no aqu
á
rio
5 minutos
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
Inje
ç
ão de
Formalina
3%
ou Salina
á
gua destilada
aplicada no aqu
á
rio
5 minutos
Grupo Água destilada + salina (n = 7): Foi aplicado 1ml de água destilada na superfície do aquário
e cinco minutos depois os amimais receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo Água destilada + formalina a 3% (n = 7): Foi aplicado 1ml de água destilada na superfície do
aquário e cinco minutos depois os amimais receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a
3%.
Grupo SA + salina (n = 7): Foi aplicado 1ml de SA na superfície do aquário e cinco minutos depois
os amimais receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo SA + formalina a 3% (n = 7): Foi aplicado 1ml de SA na superfície do aquário e cinco
minutos depois os amimais receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
Segunda Fase:
Os animais receberam injeção sistêmica de naloxona na dose de 20mg/kg ou salina e a
atividade natatória foi registrada durante cinco minutos (Linha de base). Após, foi introduzido na
superfície do aquário 1ml de substância de alarme de coespecífico. Tanto a resposta
comportamental quanto a atividade natatória foram registradas nos cinco minutos seguintes.
Depois, o animal recebeu a injeção subcutânea de 20µl de salina ou formalina a 3% na região
próxima a nadadeira adiposa seguida de mais cinco minutos de registro da atividade natatória
(Pós-estímulo).
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos
Inje
ç
ão de
naloxona
20mg/kg ou salina
Inje
ç
ão de
formalina
3% ou salina
SA no aquá
rio
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(Linha de Base)
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos
5 minutos
(P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos
Inje
ç
ão de
naloxon
20mg/kg ou salina
Inje
ç
ão de
formalina
3% ou salina
Grupos experimentais:
Grupo salina + SA + salina (n =7): Os animais receberam a injeção sistêmica de salina, cinco
minutos depois foi aplicado no aquário 1ml de SA e nos cinco minutos seguintes receberam a
injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo salina + SA + formalina a 3% (n = 7): Os animais receberam a injeção sistêmica de salina,
cinco minutos depois foi aplicado no aquário 1ml de SA e nos cinco minutos seguintes receberam a
injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
Grupo Naloxona + SA + salina (n = 8): Os animais receberam a injeção sistêmica de naloxona
20mg/kg, cinco minutos depois foi aplicado no aquário 1ml de SA e nos cinco minutos seguintes
receberam a injeção subcutânea de 20µl de salina.
Grupo Naloxona + SA + formalina a 3% (n = 7): Os animais receberam a injeção sistêmica de
naloxona 20mg/kg, cinco minutos depois foi aplicado no aquário 1ml de SA e nos cinco minutos
seguintes receberam a injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
EXPERIMENTO 3: ENVOLVIMENTO DO TETO ÓPTICO NA ANTINOCICEPÇÃO
Objetivo:
O objetivo deste experimento é de investigar se a administração central de drogas no teto
óptico do peixe Leporinus macrocephalus modula a resposta natatória induzida pelo estímulo
nociceptivo.
Procedimento Experimental
Primeira Fase:
Os procedimentos utilizados na cirurgia estão descritos na seção "procedimento cirúrgico".
Após o período pós-operatório de dois dias, os animais receberam a microinjeção central de
morfina (1,1nmol/ 0,1µl) ou salina no teto óptico (TeO) e depois foram submetidos à administração
sistêmica de 20µl de salina ou formalina a 3% na região subjacente à nadadeira adiposa. A
atividade natatória foi medida cinco minutos antes (Linha de base) e cinco minutos após a
aplicação do estímulo nocivo e a salina como controle (Pós-estímulo).
O esquema a seguir representa a seqüência experimental obedecida:
Grupos experimentais
Grupo salina + salina (n = 5): Os animais receberam a microinjeção central de 0,1µl de salina no
TeO medial e a injeção sistêmica de 20µl de salina..
Grupo salina + formalina a 3% (n = 7): Os animais receberam a microinjeção central de 0,1µl de
salina no TeO medial e a injeção sistêmica de 20µl de formalina a 3%.
Grupo morfina + salina (n = 7): Os animais receberam a microinjeção central de 1,1nmol/ 0,1µl de
morfina no TeO medial e a injeção sistêmica de 20µl de salina.
Grupo morfina + formalina a 3% (n = 6): Os animais receberam a microinjeção central de 1,1nmol/
0,1µl de morfina no TeO medial e a injeção sistêmica de 20µl de formalina a 3%.
Grupo salina + salina (n = 7): Os animais receberam a microinjeção central de 0,1µl de salina no
TeO lateral e a injeção sistêmica de 20µl de salina..
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (P
ó
s
-
est
í
mulo)
Microinje
ç
ão
central de morfina
Inje
ç
ão subcutânea de
formalina
3% ou salina
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (P
ó
s
-
est
í
mulo)
5 minutos (Linha de Base)
5 minutos (P
ó
s
-
est
í
mulo)
Microinje
ç
ão
central de morfin
ou salina
ç
ão subcutânea de
formalina
3% ou salina
Grupo salina + formalina a 3% (n = 8): Os animais receberam a microinjeção central de 0,1µl de
salina no TeO lateral e a injeção sistêmica de 20µl de formalina a 3%.
Grupo morfina + salina (n = 7): Os animais receberam a microinjeção central de 1,1nmol/ 0,1µl de
morfina no TeO lateral e a injeção sistêmica de 20µl de salina.
Grupo morfina + formalina a 3% (n = 6): Os animais receberam a microinjeção central de 1,1nmol/
0,1µl de morfina no TeO lateral e a injeção sistêmica de 20µl de formalina a 3%.
Segunda Fase:
Os animais receberam a microinjeção central de naloxona (0,37nmol/ 0,1µl), um minuto
após, receberam a microinjeção central de morfina (1,1nmol/ 0,1µl) ou salina no teto óptico (TeO) e
depois foram submetidos à administração sistêmica de 20µl de formalina a 3% na região
subjacente à nadadeira adiposa. A atividade natatória foi medida cinco minutos antes (Linha de
base) e cinco minutos após a aplicação do estímulo nocivo (Pós-estímulo).
Grupos experimentais
Grupo naloxona + salina + formalina a 3% (n = 6): Os animais receberam a microinjeção central de
0,37nmol/0,1µl de naloxona, seguida da microinjeção central de 0,1µl de salina no TeO medial e a
injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
Grupo naloxona + morfina + formalina a 3% (n = 6): Os animais receberam a microinjeção central
de 0,37nmol/0,1µl de naloxona, seguida da microinjeção central de 0,1µl de morfina no TeO medial
e a injeção subcutânea de 20µl de formalina a 3%.
3.8-Análise estatística
Os resultados foram analisados pelo teste de análise de variância de uma via (One Way
ANOVA), seguido pelo teste e post-hoc de Tukey e de Student-Newman-Keuls. Também foram
analisados pelo teste de análise de variância de duas vias (Two Way ANOVA) para medidas
repetidas, seguido pelo teste e post-hoc de Tukey. Para os testes estatísticos foi utilizado um nível
de significância de 0,001 e para os post-hoc foi adotado um nível de significância de 0,05. O
programa estatístico utilizado foi o SigmaStat. Os resultados foram expressos como média ± EPM.
4 - RESULTADOS
4.1-EXPERIMENTO 1: DESENVOLVIMENTO DE UM NOVO TESTE PARA ACESSAR NOCICEPÇÃO EM PEIXES
A injeção subcutânea de formalina a 3% induziu aumento dos batimentos operculares que
persistiu durante todo o experimento e os valores em cada tempo experimental foram diferentes
(p<0,05) quando comparados com aqueles que receberam a injeção de salina (Fig.9). O efeito
máximo foi observado nos quinze primeiros minutos após a injeção de formalina a 3% e esse
aumento foi de aproximadamente 45%. Nos animais que receberam a injeção subcutânea de
formalina a 3%, os valores dos batimentos operculares dos tempos experimentais de cinco e dez
minutos foram diferentes em relação aos tempos de 35 até sessenta minutos.
A injeção subcutânea de formalina a 3% precedida pela injeção sistêmica de salina (SAL +
FOR) provocou aumento de 58% dos batimentos operculares, o qual foi diferente (q = 6,819;
p<0,001) do aumento induzido pela injeção subcutânea de salina precedida pela injeção sistêmica
de salina (SAL + SAL). Quando a injeção subcutânea de formalina a 3% foi precedida pela injeção
sistêmica de morfina na dose de 50mg/kg e de 100mg/kg (MOR + FOR), os valores dos batimentos
operculares foram menores e diferentes (q = 6,767; p<0,001 e q = 6,819; p = 0,001
respectivamente) daqueles observados nos animais do grupo SAL + FOR, porém não foram
diferentes (q = 0,276; p = 0,847 e q = 1,381; p = 0,597 respectivamente) do grupo SAL + SAL. O
aumento dos batimentos operculares no grupo MOR a 30mg/kg não foi diferente (q = 2,076; p =
0,152) daqueles observados no grupo SAL + FOR (Fig.10).
Após a injeção subcutânea de formalina a 3%, na região próxima a nadadeira adiposa,
alguns peixes (10%) exibiram perda do equilíbrio que durou alguns minutos e depois retornaram à
posição normal. Outros peixes mostraram prolongada perda do equilíbrio (mais do que uma hora)
com redução da frequência ventilátoria. Essas respostas foram mais frequentes na fase inicial dos
experimentos quando a concentração e o volume da solução de formalina (estímulo nocivo) ainda
não tinham sido estabelecidos. Todos os peixes apresentaram uma mudança local na coloração
da pele (aproximadamente de 1,5 cm de comprimento) após a administração subcutânea de
formalina a 3%.
Quando aplicada subcutaneamente, a formalina a 3% induziu aumento da atividade
natatória durante todo o experimento (cinco minutos) e em todos os tempos experimentais, o qual
foi diferente (p<0,05) quando comparados com os animais que receberam a injeção de salina (Fig.
11) no tempo de um minuto após a aplicação do estímulo nocivo.
O aumento da atividade natatória provocada pelo mesmo (SAL + FOR) foi reduzido
significantemente pela injeção sistêmica prévia de morfina nas doses de 50mg/kg (MOR 15 + FOR
e MOR 60 + FOR) (q = 4,873; p = 0,005 e q = 4,059; p = 0,008 respectivamente). O delta de
locomoção nos grupos MOR 15 + FOR e MOR 60 + FOR não foi diferente do grupo em que a
injeção sistêmica de morfina (MOR + SAL) (q = 3,120; p = 0,036 e q = 3,670; p = 0,038
respectivamente) ou salina (SAL + SAL) (q = 3,029; p = 0,099 e q = 3,570; p = 0,077
respectivamente) foi aplicada antes da injeção subcutânea de salina na região próxima a nadadeira
adiposa (Fig.12).
A redução do aumento da atividade natatória induzida pelo estímulo nocivo observada
após a injeção sistêmica de morfina (MOR 15 + FOR) não foi revertida em animais pré-tratados
com naloxona nas doses de 10mg/kg (NAL 1 + MOR + FOR) (q = 2,072; p = 0,320) e 20mg/kg
(NAL 2 + MOR + FOR) (q = 2,020; p = 0,162), porém o bloqueio da resposta foi obtido com a dose
de 30mg/kg (NAL 3 + MOR + FOR (q = 5,033; p = 0,003) (Fig.13). O delta de locomoção nos
grupos NAL 1 + MOR + FOR e NAL 2 + MOR + FOR não foi diferente do grupo NAL 1 + SAL (q =
0,519; p = 0,716 e q = 1,017; p = 0,754, respectivamente) mas foi menor e diferente do grupo NAL
1 + FOR (q = 5,124; p = 0,005 e q = 5,640; p = 0,001, respectivamente). O delta de locomoção no
grupo NAL 1 + FOR não foi diferente do grupo NAL 3 + MOR + FOR (q = 1,531; p = 0,287).
Quando aplicado subcutaneamente, a capsaicina não induziu alteração da atividade
natatória. Os valores médios do delta de locomoção dos grupos capsaicina a 10µg/20nl e a
100µg/20nl não se diferenciaram daqueles observados no grupo veículo (F = 0,209; df = 2; p =
0,813) (Fig.14).
Figura 9: Sequência temporal dos valores normalizados (%) dos batimentos operculares (média ± EPM) durante
sessenta minutos após a administração de salina (n = 7) ou formalina a 3% (n = 7) na região próxima a nadadeira
adiposa no piauçu Leporinus macrocephalus. * Indica diferença estatística em relação ao grupo salina em cada
tempo. # Indica diferença estatística nos cinco e dez minutos em relação aos tempos experimentais de 35 até
sessenta minutos do grupo formalina a 3% (p<0,05) (Two Way ANOVA para medidas repetidas seguida do teste de
post-hoc Tukey, p<0,05).
Figura 10: Média (±EPM) dos valores normalizados dos batimentos operculares (%) quinze minutos após
injeções subcutâneas de salina ou formalina a 3% nas seguintes circunstâncias: após injeção sistêmica de
salina (SAL + SAL) (n = 7) e (SAL + FOR) (n = 7); injeção sistêmica de morfina a 30mg/kg (MOR 30mg/kg +
FOR) (n = 7); injeção sistêmica de morfina a 50mg/kg (MOR 50mg/kg + FOR) (n = 8); injeção sistêmica de
morfina a 100mg/kg (MOR 100mg/kg + FOR) (n = 8). Letras iguais indicam que não há diferença estatística e
letras diferentes indicam diferença estatística (F = 9,293; df = 4; p<0,001) (Anova seguida do teste de post-hoc
Student-Newman-Keuls, p<0,05).
Figura 11: Sequência temporal (média ± EPM) da atividade natatória (delta de locomoção) após a
administração de salina (n = 8) ou formalina a 3% (n = 8) na região próxima a nadadeira adiposa no
piauçu Leporinus macrocephalus. * Indica diferença estatística em relação ao grupo salina em cada
tempo. # Indica diferença estatística no primeiro minuto em relação aos tempos experimentais
subseqüentes em animais do grupo formalina a 3% (p<0,05) (Two Way ANOVA para medidas repetidas
seguida do teste de post-hoc Tukey, p<0,05).
Figura 12: Efeito da morfina sobre a média (± EPM) da atividade natatória (delta de locomoção) do piauçu
submetido a um estímulo nocivo (formalina a 3% subcutaneamente). Injeção subcutânea de salina (n = 7)
após quinze minutos da injeção sistêmica de salina (SAL + SAL); injeção subcutânea de formalina a 3% (n =
6) após quinze minutos da injeção sistêmica de salina (SAL + FOR); injeção subcutânea de salina (n = 8) após
quinze minutos da injeção sistêmica de morfina a 50mg/kg (MOR + SAL); injeção subcutânea de formalina a
3% (n = 8) após quinze minutos da injeção sistêmica de morfina a 50mg/kg (MOR 15 + FOR); injeção
subcutânea de formalina a 3% (n = 6) após sessenta minutos da injeção sistêmica de morfina a 50mg/kg
(MOR 60 + FOR) Letras iguais indicam que não há diferença estatística e letras diferentes indicam diferença
estatística (F = 10,391; df = 4; p<0,001) (ANOVA seguida do teste de post-hoc Student-Newman-Keuls,
p<0,05).
Figura 13: Efeito do pré-tratamento com naloxona no bloqueio da resposta natatória (delta de locomoçao)
(média, ± EPM) ao estímulo nocivo (formalina a 3%) pela morfina. Injeção subcutânea de formalina a 3% (n =
7) após a injeção sistêmica de morfina a 50mg/kg (MOR + FOR); injeção subcutânea de salina (n = 7) após a
injeção sistêmica de naloxona a 10mg/kg (NAL 1 + SAL); injeção subcutânea de formalina a 3% (n = 8) após a
injeção sistêmica de naloxona a 10mg/kg (NAL 1 + FOR); pré-tratamento de naloxona a 10mg/kg seguida da
injeção sistêmica de morfina a 50mg/kg antes da injeção subcutânea de formalina a 3% (n = 4) (NAL 1 + MOR
+ FOR); pré-tratamento de naloxona a 20mg/kg seguida da injeção sistêmica de morfina a 50mg/kg antes da
injeção subcutânea de formalina a 3% (n = 7) (NAL 2 + MOR + FOR); pré-tratamento de naloxona a 30mg/kg
seguida da injeção sistêmica de morfina a 50mg/kg antes da injeção subcutânea de formalina a 3% (n = 8)
(NAL 3 + MOR + FOR). Letras iguais indicam que não há diferença estatística e letras diferentes indicam
diferença estatística (F = 11,150; df = 5; p<0,001) (Anova seguida do teste de post-hoc Student-Newman-
Keuls, p<0,05)
Figura 14: Médias (± EPM) da atividade natatória (delta de locomoção) após a administração de veículo (n =
8), capsaicina 10µg (n = 7) e capsaicina 100µg (n = 7) na região próxima a nadadeira adiposa no piauçu
Leporinus macrocephalus. (F = 0,209; df = 2; p = 0,813) (ANOVA).
4.2-EXPERIMENTO 2: MOBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL DO SISTEMA ANALGÉSICO ENDÓGENO
Como primeira etapa, observamos a ocorrência da resposta de alarme, evidenciada pela
diminuição da atividade natatória, em peixes expostos ao extrato de pele de coespecíficos. A
média do delta de locomoção apresentou uma redução significante quando os animais eram
expostos previamente a substância de alarme (T = 276, 500; p<0,001) em relação aos animais que
receberam água destilada (Fig.15).
O aumento da atividade natatória induzido pela aplicação subcutânea de formalina a 3% foi
bloqueado pela exposição do animal à substância de alarme. Isso pode ser visto quantitativamente
na Fig 16, onde a média do delta de locomoção do grupo em que se aplicou formalina a 3%
subcutânea juntamente com exposição à substância de alarme (SA + FOR) (n = 7) foi menor e
diferente do grupo em que se aplicou formalina a 3% subcutânea e se adicionou água destilada
(AD+ FOR) (n = 7) (q = 10,691; p<0,001), porém não diferiu dos grupos em que se aplicou salina
subcutânea em presença de água destilada (AD + SAL) (n = 7) (q = 0,985; p = 0,897) ou de
substância de alarme (SA + SAL) (q = 2,259; p = 0,399) (n = 7).
O naloxona (20mg/kg) injetado sistemicamente reverte o efeito antinociceptivo da
substância de alarme, sobre a resposta motora decorrente da aplicação subcutânea de formalina a
3%. Isso pode ser visto na Fig 17 onde a média do delta de locomoção dos animais em que o
naloxona foi injetado previamente em animais tratados com formalina a 3% subcutânea e expostos
à substância de alarme (NAL + SA + FOR) foi maior e diferente daquela observada nos animais
expostos à substância de alarme em três situações controle distintas: pré-tratados com salina
sistêmica e com injeção subcutânea de salina (SAL + SA + SAL) ou formalina a 3% (SAL + SA +
FOR) e em animais pré-tratados com naloxona sistêmica e salina subcutânea (NAL + SA + SAL).
Figura 15: Média (± EPM) da atividade natatória (delta de locomoção) do piauçu após a aplicação no aquário
de água destilada (AD) (n = 14) ou substância de alarme (SA) (n = 14). O asterisco indica que há diferença
estatisticamente significativa entre as amostras (T = 276, 500; p<0,001) (Mann-Whitney Rank Sun Test).
Figura 16: Efeito da exposição dos peixes a substância de alarme, após a injeção subcutânea de formalina a
3% sobre a atividade natatória (delta de locomoção) (média, ± EPM). Injeção subcutânea de salina (n = 7)
após a aplicação de água destilada no aquário (AD + SAL); injeção subcutânea de formalina a 3% (n = 7)
após a aplicação de água destilada no aquário (AD + FOR); injeção subcutânea de salina (n = 7) após a
aplicação de substância de alarme no aquário (SA + SAL); injeção subcutânea de formalina a 3% (n = 7) após
a aplicação de substância de alarme no aquário (SA + FOR). Letras iguais indicam que não há diferença
estatística e letras diferentes indicam diferença estatística (F = 32,732; df = 3; p<0,001)(ANOVA seguida do
teste de post-hoc Tukey, p<0,05).
Figura 17: Efeito do pré-tratamento com naloxona, seguida da exposição dos peixes a substância de alarme,
antes da injeção subcutânea de formalina a 3% sobre a atividade natatória (delta de locomoção) (média, ±
EPM). Pré-tratamento com salina seguida pela aplicação no aquário da substância de alarme antes da injeção
subcutânea de salina (SAL + SA + SAL) (n = 7); pré-tratamento com salina seguida pela aplicação no aquário
da substância de alarme antes da injeção subcutânea de formalina a 3% (SAL + SA + FOR) (n = 7); pré-
tratamento com naloxona a 20mg/kg seguida pela aplicação no aquário da substância de alarme antes da
injeção subcutânea de salina (NAL + SA + SAL) (n = 8); pré-tratamento com naloxona a 20mg/kg seguida pela
aplicação no aquário da substância de alarme antes da injeção subcutânea de formalina a 3% (NAL + SA +
FOR) (n = 7). Letras iguais indicam que não há diferença estatística e letras diferentes indicam diferença
estatística (F = 6,128; df = 3; p = 0,003) (ANOVA seguida do teste de post-hoc Student-Newman-Keuls,
p<0,05).
4.3-EXPERIMENTO 3: Administração central de drogas no teto óptico e a atividade natatória.
A microinjeção central de morfina (1,1nmol/0,1µl) no TeO medial, seguida da injeção
subcutânea de formalina a 3% (MOR + FOR), na região próxima à nadadeira adiposa, provocou
diminuição da atividade natatória, a qual não foi diferente daquela observada nos animais que
receberam a microinjeção central de morfina (1,1nmol/0,1µl), seguida pela injeção subcutânea de
salina (MOR + SAL) e dos animais que receberam a microinjeção central de salina (0,1µl), seguida
da injeção subcutânea de salina (SAL + SAL) (q = 3,145 ; p = 0,033 e q = 0,345; p = 0,809
respectivamente). Quando a microinjeção de salina no TeO medial foi seguida da injeção
subcutânea de formalina a 3% (SAL + FOR), os valores do delta de locomoção foram maiores e
diferentes daqueles observados nos animais dos grupos SAL + SAL (q = 8,028; p<0,001) MOR +
FOR (q = 8,703; p<0,001) e MOR + SAL (q = 5,044 ; p = 0,006) (Fig.18). A redução do aumento da
atividade natatória induzida pelo estímulo nocivo observada após a microinjeção central de morfina
(1,1nmol/0,1µl) no teto óptico medial (MOR + FOR) foi revertida pela microinjeção central de
naloxona (0,37nmol/0,1µl), seguida da microinjeção central de morfina (1,1nmol/0,1µl) e injeção
subcutânea de formalina a 3% (NAL + MOR + FOR) no teto óptico medial (q = 8,222; p<0,001) e
não foi diferente dos grupos NAL + SAL + FOR e SAL + FOR (q = 0,881; p = 0,538 e q = 0,115; p =
0,936, respectivamente).
A microinjeção central de morfina (1,1nmol/0,1µl) no TeO lateral, seguida da injeção
subcutânea de formalina a 3% (MOR + FOR), na região próxima à nadadeira adiposa, não foi
diferente daquela observada nos animais que receberam a microinjeção central de salina (0,1µl),
seguida da injeção subcutânea de formalina a 3% (SAL + FOR) (q = 0,351; p = 0,806), mas os
valores do delta de locomoção foram maiores e diferentes dos grupos SAL + SAL (q = 6,671;
p<0,001) e MOR + SAL (q = 6,835; p<0.001). Quando a microinjeção de salina no TeO lateral foi
seguida da injeção subcutânea de formalina a 3% (SAL + FOR), os valores do delta de locomoção
foram maiores e diferentes daqueles observados nos animais dos grupos SAL + SAL (q = 6,774;
p<0,001) e MOR + SAL (q = 6,925; p = 0,031) (Fig.19).
As representações diagramáticas apresentadas nas figuras 20, 21 e 22 mostram
esquemas de secções frontais do mesencéfalo do Leporinus macrocephalus ao longo da extensão
crânio-caudal. Essas representações evidenciam os sítios de microinjeções centrais de morfina a
1,1nmol/0,1µl, naloxona 0,37nmol/0,1µl e de salina. Para auxiliar o reconhecimento das estruturas
cerebrais usamos o Atlas de Neuroanatomia do zebra fish (1996), já que não existe atlas de
espécies aqui estudadas.
A figura 23 mostra uma fotomicrografia de um corte frontal do mesencéfalo do Leporinus
macrocephalus, com um exemplo típico do local da microinjeção central das drogas de um animal
representativo do grupo.
Figura 18: Redução da atividade natatória (delta de locomoção) (média, ± EPM) induzida pela microinjeção
de morfina no teto óptico medial em animais submetidos ao estímulo nocivo (injeção subcutânea de formalina
a 3%). Microinjeção central de salina (0,1µl) no teto óptico medial (n = 5) e injeção subcutânea de salina (SAL
+ SAL); microinjeção central de salina no teto óptico medial (n = 8) e injeção subcutânea de formalina a 3%
(SAL + FOR); microinjeção central de morfina a 1,1nmol/0,1µl no teto óptico medial (n = 8) e injeção
subcutânea de formalina a 3% (MOR + FOR); microinjeção central de morfina a 1,1nmol/0,1µl no teto óptico
medial (n = 6) e injeção subcutânea de salina (MOR + SAL); microinjeção central de naloxona 0,37nmol/0,1µl,
seguida da microinjeção central de salina (0,1µl) (n = 6) no teto óptico medial e injeção subcutânea de
formalina a 3% (NAL + SAL + FOR); microinjeção central de naloxona 0,37nmol/0,1µl, seguida da
microinjeção central de morfina a 1,1nmol/0,1µl no teto óptico medial (n = 6) e injeção subcutânea de
formalina a 3% (NAL + MOR + FOR). Letras iguais indicam que não há diferença estatística e letras diferentes
indicam diferença estatística (F = 15, 281; d = 5; p<0,001) (ANOVA seguida do teste de post-hoc Student-
Newman-Keuls, p<0,05).
Figura 19: Aumento da atividade natatória (delta de locomoção) (média, ± EPM) induzida pela microinjeção
de morfina no teto óptico lateral em animais submetidos ao estímulo nocivo (injeção subcutânea de formalina
a 3%). Microinjeção central de salina (0,1µl) no teto óptico lateral (n = 5) e injeção subcutânea de salina (SAL
+ SAL); microinjeção central de salina no teto óptico lateral (n = 6) e injeção subcutânea de formalina a 3%
(SAL + FOR); microinjeção central de morfina a 1,1nmol/0,1µl no teto óptico lateral (n = 6) e injeção
subcutânea de salina (MOR + SAL); microinjeção central de morfina a 1,1nmol/0,1µl no teto óptico lateral (n =
7) e injeção subcutânea de formalina a 3% (MOR + FOR). Letras iguais indicam que não há diferença
estatística e letras diferentes indicam diferença estatística (F = 15,441; d = 3; p<0,001) (ANOVA seguida do
teste de post-hoc Tukey, p<0,05).
Figura 20: Representação esquemática de secções frontais em planos representativos do mesencéfalo do
piauçu Leporinus macrocephalus. Abreviações: CAMS: comissura ansulata; DIV: ventrículo diencefálico; FR:
fascículus retroflexus; LLF: fascículo lateral longitudinal; MLF: fascículo medial longitudinal; NIII: núcleo
oculomotor; PPV: parte ventral do núcleo periventricular pretectal; PGZ: zona cinzenta periventricular do teto
ótico; TEO: teto ótico; TEV: ventrículo tectal; TL: torus longitudinalis; TPM: trato pretectomamilar; TTB: trato
tectobulbar; VAL: divisão lateral da válvula cerebelar; VAM: divisão medial da válvula cerebelar.
crânio/caudal
SA L + SAL
SAL + FOR
MOR + SAL
MOR + FOR
100µm
Figura 21: Representação esquemática de secções frontais em planos representativos do mesencéfalo do piauçu Leporinus
macrocephalus. Abreviações: CAMS: comissura ansulata; DIV: ventrículo diencefálico; FR: fascículus retroflexus; LLF:
fascículo lateral longitudinal; MLF: fascículo medial longitudinal; NIII: núcleo oculomotor; PPV: parte ventral do núcleo
periventricular pretectal; PGZ: zona cinzenta periventricular do teto ótico; TEO: teto ótico; TEV: ventrículo tectal; TL: torus
longitudinalis; TPM: trato pretectomamilar; TTB: trato tectobulbar; VAL: divisão lateral da válvula cerebelar; VAM: divisão
medial da válvula cerebelar.
100µm
crânio/caudal
NA L + SAL + FOR
NAL + MOR + FOR
Figura 22: Representação esquemática de secções frontais em planos representativos do mesencéfalo do piauçu Leporinus
macrocephalus. Abreviações: CAMS: comissura ansulata; DIV: ventrículo diencefálico; FR: fascículus retroflexus; LLF:
fascículo lateral longitudinal; MLF: fascículo medial longitudinal; NIII: núcleo oculomotor; PPV: parte ventral do núcleo
periventricular pretectal; PGZ: zona cinzenta periventricular do teto ótico; TEO: teto ótico; TEV: ventrículo tectal; TL: torus
longitudinalis; TPM: trato pretectomamilar; TTB: trato tectobulbar; VAL: divisão lateral da válvula cerebelar; VAM: divisão
medial da válvula cerebelar.
SA L + SAL
SAL + FOR
MOR + SAL
MOR + FOR
100µm
crânio/caudal
Figura 21: Fotomicrografia de uma secção frontal do mesencéfalo de um peixe representativo do grupo
mostrando a localização do sítio da microinjeção no TeO (seta).
TeO
TL
5 – DISCUSSÃO
A administração subcutânea de formalina a 3%, mas não a de salina, induziu alteração no
padrão respiratório do piauçu Leporinus macrocephalus. Os peixes apresentaram aumento da
frequência ventilatória durante todo o tempo do experimento. Esses resultados são similares
àqueles relatados por outros autores em estudos feitos em várias espécies de peixes, em
consequência de diferentes tipos de estímulos nocivos aplicados em regiões distintas do corpo.
Sneddon (2003b) demonstrou que trutas anestesiadas Oncorhynchus mykiss exibiram aumento da
frequência ventilatória por até 180 minutos após a injeção de ácido acético a 0,1% nos lábios.
Newby e Stevens (2008), usando a mesma substância, mas em concentrações maiores, (ácido
acético a 2% e a 5%) demonstraram que zebrafish e truta tiveram a mesma resposta observada
por Sneddon (2003b), embora a sua duração fosse de aproximadamente de 360 minutos.
Esse aumento drástico da frequência ventilatória é semelhante às modificações
respiratórias ocorridas em mamíferos durante um evento nociceptivo (KATO e cols., 2001). Ele
pode ser considerado como uma resposta fisiológica a uma estimulação dolorosa, uma vez que,
uma das funções do sistema respiratório é suprir o corpo com quantidades suficientes de oxigênio
para os diferentes tipos de comportamento. É natural que os peixes também aumentem a
frequência ventilatória com o intuito de repor o débito de oxigênio (NEWBY e STEVENS, 2008). Os
batimentos operculares são normalmente utilizados para inferir o estado fisiológico de estresse nos
peixes (LUCAS e cols., 1993). Entretanto, a magnitude da resposta muitas vezes não reflete a
gravidade do estímulo, visto ser uma variável muito sensível a leves distúrbios (BARRETO e
VOLPATO, 2004).
O estímulo nocivo usado neste trabalho também afetou a atividade natatória do piauçu.
Durante todo o tempo do experimento, os peixes que receberam a injeção subcutânea de formalina
a 3% mostraram aumento da atividade natatória refletida pelo aumento do delta de locomoção, a
qual não foi observada quando os animais receberam a injeção subcutânea de salina. Após a
aplicação do estímulo nocivo, maiores valores de atividade natatória foram observadas no primeiro
minuto, demonstrando que o piauçu responde prontamente à aplicação de formalina. Em peixes,
como em outros vertebrados, a resposta comportamental frente ao estímulo doloroso é assegurada
pelo aumento dos movimentos destinados a eliminar o animal da sensação aversiva
(CHERCHOVA, 1997). A atividade natatória, que é o padrão comportamental mais frequente dos
peixes, envolve a integração de numerosos processos fisiológicos (SCHRECK, 1990 in apud
EIFAD-EUROPEAN INLAND FISHERIES ADVISORY COMMISSION, 2004) e pode ser
considerado um índice sensível para se estimar as respostas de estresse e nocicepção em peixes.
A atividade natatória de peixes submetidos a estímulo nocivo difere daquela observada em peixes
que não receberam a aplicação do mesmo. Respostas como: nadar em águas rasas, nadar
letargicamente na superfície ou nadar erraticamente, bem como o aumento da velocidade de
natação e do tempo gasto a manter essa velocidade elevada podem ser bons indicadores de
estresse ou nocicepção em peixes (PLUMB, 1994 in apud EIFAD-EUROPEAN INLAND
FISHERIES ADVISORY COMMISSION, 2004).
Neste estudo, também mostramos o efeito analgésico ou antinociceptivo da morfina
(agonista opioide, preferencialmente de receptores µ) no piauçu Leporinus macrocephalus, uma
vez que a injeção sistêmica de morfina na dose de 50mg/kg e de 100mg/kg bloqueou o aumento
da frequência ventilatória induzida pelo estímulo nocivo. Além disso, a injeção sistêmica prévia de
morfina na dose de 50mg/kg também reduziu o aumento da atividade natatória induzida pelo
estímulo nocivo. As menores doses de naloxona (antagonista opioide) usadas neste presente
trabalho (10mg/kg e 20mg/kg) não foram suficientes para reverter o efeito antinociceptivo da
morfina, porém isso foi conseguido com o pré-tratamento com 30mg/kg de naloxona.
O efeito antinociceptivo da morfina já é bastante conhecido em mamíferos, especialmente
em humanos, no entanto, poucos trabalhos têm estudado sua ação em peixes. Foi demonstrado
em goldfish aumento do limiar da resposta natatória ao choque elétrico após aplicação da morfina
sistêmica, efeito esse revertido pelo naloxona (JANSEN e GREENE, 1970). Elrensing e Mitchell
(1982) demonstraram que a aplicação intracranial de morfina no goldfish diminuiu, de forma
dose/dependente, a natação agitada induzida pelo choque elétrico. O pré-tratamento com os
antagonistas opioides naloxona e MIF-1 reverteram o efeito da morfina. Ademais, mudanças
comportamentais relacionadas à dor após administração de morfina têm sido estudadas em trutas
(SNEDDON, 2003b).
As doses usuais de morfina usada em roedores submetidos a testes nociceptivos variam
de 1-5mg/kg, aproximadamente 10 a 50% menores das do que usadas neste estudo. No entanto, a
administração sistêmica de altas doses de morfina (10-100mg/kg) é essencial para produzir
antinocicepção em anfíbios (PEZZALA, 1983; STEVENS, 1988; STEVENS e KIRKENDALL, 1993).
É possível que em não mamíferos como em goldfish (JANSEN e GREENE, 1970), lagartos (MAUK
e cols, 1981) e galinhas (BARDO e HUGHES, 1978) a morfina seja uma droga analgésica pouco
potente, requerendo altas doses para se obter analgesia (STEVENS e KIRKENDALL, 1993;
STEVENS, 1988). Nordgreen e cols. (2009) demonstraram em seus experimentos que as doses de
40mg/kg e 50mg/kg de morfina não apresentaram efeito analgésico no teste do limiar térmico
realizado em goldfish. A morfina se liga preferencialmente a receptores opioides do tipo µ, cuja
distribuição é grande em ratos, intermediária em tartarugas e sapos, e muito pequena em goldfish
(STEVENS, 1988; STEVENS, 2004).
No protocolo experimental desenvolvido neste estudo, o tempo gasto entre a injeção da
morfina e a aplicação do estímulo nocivo foi de quinze e sessenta minutos, não ocorrendo
nenhuma diferença estatística na magnitude da antinocicepção entre esses dois tempos. Segundo
Newby e cols. (2006 e 2008), a injeção intraperitoneal de 40mg/kg de morfina no peixe
Pseudopleuronectes americanus apresentou um efeito analgésico após 50 minutos da sua
aplicação. Além disso, o valor máximo da concentração plasmática de morfina em goldfish foi
alcançado 30 minutos após a injeção intramuscular (NORDGREEN e cols., 2009). É importante
ressaltar que existem consideráveis diferenças entre as espécies em relação à farmacocinética da
morfina. O "clearance" da morfina na corrente sanguínea após a injeção intraperitoneal é muito
mais lenta em duas espécies de peixes Pseudopleuronectes americanus e de Oncorhynchus
mykiss do que aquelas encontradas em mamíferos, além de existirem variações em relação à
farmacocinética entre essas espécies de peixes (NEWBY e cols, 2006). Logo, é de extrema
importância que novos estudos, referentes à analgesia e ao sistema opioide dos teleósteos sejam
realizados.
A injeção de formalina a 3% afetou de forma inesperada o comportamento natatório em
alguns indivíduos. Alguns peixes (10%) apresentaram perda de equilíbrio antes de retornarem à
atividade natatória normal, o que pode ser identificado como sendo um potente indicativo de
nocicepção. Newby e Stevens (2008) observaram que nove das 16 trutas, que receberam acido
acético a 2% ou a 5% nos lábios, mostraram perda de equilíbrio. Diferentes indivíduos têm
diferentes graus de tolerância dolorosa, e isso é uma possível explicação para a variabilidade das
respostas dos peixes após a aplicação do estímulo nocivo. Alguns peixes podem ter tolerância
maior, ou alto limiar nociceptivo (NEWBY e STEVENS, 2008). Essas diferentes respostas à
nocicepção refletem diferenças espécie-específicas ou interindividuais.
Alguns autores têm se preocupado com o cuidado que se deve ter ao se extrapolar
resultados de diferentes táxons quando o assunto é o bem estar dos peixes (HUNTINGFORD e
cols., 2006). É essencial usar diferentes parâmetros para acessar o bem estar em peixes e isso
deve ser dependente da espécie (REILLY e cols., 2008) Indicadores nociceptivos devem ser
desenvolvidos examinando uma variedade de espécies de peixes tendo em conta as diferenças
interespecíficas e intraespecíficas.
Mesmo em peixes, os efeitos negativos da experiência nociva são complexos, sugerindo
que regiões rostrais estejam envolvidas nesse processo e assim exista um potencial para a
percepção dolorosa. No piauçu Leporinus macrocephalus, as respostas comportamentais e
neurovegetativas são afetadas pela estimulação nociva, indicando que esses animais podem
perceber e reagir a ela como alguns autores sugerem (BRAITHWAITE e HUNTINGFORD, 2004;
BRAITHWAITE e BOULCOTT, 2007; NEWBY e STEVENS, 2008; SNEDDON, 2004, 2003a,
2003b, 2003c). A dor é essencial para a sobrevivência do indivíduo em um ambiente
potencialmente hostil. Ela tem um papel fisiológico e funciona como um sistema de alarme ativado
para a percepção de algo que está ameaçando a integridade física do organismo (CHAPMAN e
cols., 1999). Evolutivamente, a dor tem uma importante função protetora, uma vez que informa
sobre as condições externas e internas do animal.
Em nossos experimentos, além da formalina, tentamos usar a capsaicina, como estímulo
nocivo. A capsaicina é um dos componentes vaniloides ativos da pimenta e pode evocar uma
sensação de formigamento e ardor ativando canais de cátions não seletivos, chamados de VR1
(membros da família dos canais de cátions TRP), nas terminações nervosas de fibras amielínicas
do tipo C (JORDT e JULIUS, 2002; JULIUS e BASBAUM, 2001; SZALLASI e BLUMBERG, 1999).
Estudos eletrofisiológicos e genéticos têm mostrado que o VR1 também pode ser ativado pelo
calor (> 43 ºC) e contribui para a detecção pelos neurônios sensoriais primários do estímulo nocivo
térmico, substanciando a idéia de que o receptor da capsaicina é um integrador polimodal de
estímulos nocivos químicos. A capsaicina é bastante utilizada para o estudo da dor em roedores
(WINTER e cols., 1995).
Neste estudo, os peixes receberam a injeção subcutânea de diferentes concentrações
10µg/0,2µl e 100µg/0,2µl de capsaicina na região próxima à nadadeira adiposa, porém os animais
não responderam à aplicação desse estímulo nocivo, não mostrando nenhuma alteração na
atividade natatória. As concentrações utilizadas nesse estudo estão muito acima das usualmente
usadas para camundongos e ratos.
Trabalhos realizados com toupeiras africanas desprovidas de pelos (Heterocephalus
glaber) mostraram que esses animais são comportamentalmente insensíveis à capsaicina a julgar
pela ausência de respostas comportamentais (PARK e cols., 2008). Aves e anfíbios também são
insensíveis a esse estímulo nocivo (JORDT e JULIUS, 2002; HAWKINS e cols., 1999). Isso pode
ser explicado pelo fato de que as aves apesar de possuírem o gene TRPVI, que codifica os canais
sensíveis aos prótons e ao calor, esses não são ativados pela capsaicina, somente pelo estímulo
térmico (JORDT e JULIUS, 2002). Assim, parece que a sensibilidade da capsaicina ao TRPV1 é
uma característica adquirida nos mamíferos durante o curso da evolução, e essa forte pressão
seletiva pode ter favorecido o estabelecimento de nichos ecológicos distintos entre as espécies
(JORDT e JULIUS, 2002). Os mamíferos, como potenciais consumidores da planta da pimenta,
são repelidos por ela, enquanto que os pássaros são favorecidos como vetores para a dispersão
da semente (TEWSBURRY e NABHAN, 2001). Em contraste, as toupeiras africanas desprovidas
de pelos tem canais de íon TRPV1 e nociceptores que são potencialmente ativados pela
capsaicina, embora, como já descrito anteriormente, não proporcionem mudanças nos padrões
comportamentais (PARK e cols., 2008).
Os peixes, como as aves e anfíbios, não são sensíveis a capsaicina. Talvez esses animais,
por não serem consumidores naturais da planta da pimenta, não sofreram pressão seletiva que
favorecesse o desenvolvimento de um sistema de detecção dessa substância. No entanto,
recentes trabalhos têm demonstrado que esses animais percebem o calor como um estímulo
nocivo, embora a presença de nociceptores específicos ainda não foi totalmente elucidada
(NORDSGRREN e cols., 2009). Frente aos nossos achados, optamos por usar nas etapas
subseqüentes do trabalho, o teste da formalina e avaliar apenas a resposta motora, visto que este
permite manter o animal livre (não contido) no aquário.
O plano básico do encéfalo dos teleósteos é semelhante em todos os vertebrados, porém,
nos teleósteos, o SNC é menor em relação ao tamanho corpóreo e menos complexo em estrutura
do que nos mamíferos (KOTRSCHAL e cols., 1998). Os peixes, como outros representantes de
diferentes classes de vertebrados, apresentam um telencéfalo e a massa cinzenta que o recobre é
denominada de pallium. Ao longo do processo evolutivo, o pallium se diferenciou e expandiu em
decorrência da adição de novos tipos celulares e conexões, sendo que nos mamíferos consiste de
uma estrutura laminar complexa denominada córtex cerebral ou neocórtex (STRIEDTER, 2005). O
telencéfalo foi a região cerebral que mais modificação sofreu no processo evolutivo.
Tem sido argumentado que a falta de áreas telencefálicas corticais superiores em peixes
não permite a experiência dolorosa (ROSE, 2002 e 2007). Rose (2002) argumenta que a
experiência psicológica da dor requer um neocórtex bem desenvolvido, particularmente aquele do
lobo do córtex frontal, restringindo essa percepção aos humanos e aos outros primatas. Os
comportamentos dos peixes são deflagrados pela ativação de estruturas encefálicas presentes no
tronco encefálico e os hemisférios cerebrais (telencéfalo) desses animais agiriam apenas na sua
modulação. A dor apresenta um componente sensorial e emocional, portanto, a nocicepção não
pode resultar em dor a menos que a atividade neural associada a ela seja conscientemente
percebida. Assim, os peixes não apresentam consciência e nem a capacidade de perceber a dor e
o sofrimento.
Para outros autores, a presença do neocórtex pode não necessariamente ser um pré-
requisito para a percepção dolorosa (BRAITHWAITE e HUNTINGFORD, 2004; BRAITHWAITE e
BOULCOTT, 2007; NEWBY e STEVENS, 2008; SNEDDON, 2004, 2003a, 2003b, 2003c). Pode ser
possível que outras partes do encéfalo, e não somente o cortéx, tenham adquirido a capacidade de
gerar estados emocionais negativos ou sofrimento nos vertebrados não-mamíferos, incluindo os
peixes (EIFAD-EUROPEAN INLAND FISHERIES ADVISORY COMMISSION, 2004). Nossos
resultados corroboram com esta última hipótese, pois indicam que alterações nos padrões
respiratórios e locomotores não são meramente respostas reflexas, pois é possível reverter esses
comportamentos pela administração de um analgésico. Uma simples resposta reflexa a um
estímulo nocivo pode indicar uma função nociceptiva; entretanto, efeitos adversos em relação aos
comportamentos normais dos animais podem indicar componentes fisiológicos que são indicativos
de sofrimento, e sugerem que os animais podem ser capazes da percepção dolorosa (EFSA,
2009). Respostas reflexas ocorrem instantaneamente e com poucos segundos; porém, algumas
respostas dos peixes podem ser prolongadas por 3 a 6 horas (SNEDDON, 2006).
As vias neurais que conectam várias estruturas prosencefálicas são fundamentais para a
consciência e a percepção dolorosa e do medo em mamíferos (WILLIS e WESTLUND, 1997).
Existem extensas interconexões entre o telencéfalo, diencéfalo e mesencéfalo nos peixes (RINK e
WILLIMANN, 2004). A organização das regiões do pallium dos peixes, consideradas precursoras
do córtex, é não-laminar e bastante simples, todavia, existem evidências que sugerem que elas
tenham se desenvolvido em estruturas altamente especializadas para o processamento da
informação sensorial (BUTLER, 2000). O telencéfalo dos peixes recebe extensas projeções neurais
do tálamo e de núcleos especializados e regiões paliais parecem estar envolvidas no
processamento somatossensorial (possivelmente nocicepção via nervo trigeminal), visual, olfatório,
gustatório, auditivo dentre outras modalidades sensoriais (ITO e cols., 1986; PRECHTL e cols.,
1998).
O processamento da informação nociceptiva é uma característica consistente do sistema
nervoso de todos os vertebrados e ele já ocorre em regiões subcorticais como a medula espinal e
o tronco cerebral, gerando respostas defensivas e recuperativas adequadas. Embora o pallium
seja incapaz de sustentar estados avançados de consciência, o sistema nervoso desses animais
permite processos como percepção, aprendizado e memória, tornando-os aptos a evitar estímulos
e situações que causam desconforto e nocicepção (HOFFMANN, 2008). O telencéfalo dos peixes
contém várias estruturas cerebrais que podem ser funcionalmente homólogas àquelas associadas
à dor e medo nos mamíferos (CHANDROO e cols., 2004; PORTAVELLA e cols., 2004).
Recentemente, registros eletrofisiológicos têm medido atividade elétrica no prosencéfalo da truta e
no goldfish durante a estimulação nociva e é diferente da estimulação neural (DUNLOP e LAMING,
2005).
A consciência é uma função do sistema nervoso que comporta vários fenômenos (Roth,
2001) e segundo Edelman e Tononi (2000) ela pode ser dividida em dois tipos: consciência
primária e expandida.
1) Estados gerais da consciência ou consciência primária: A consciência primária não tem uma
ligação clara com um conteúdo mental. Ela é responsável pelo controle da vigilância, da fadiga, do
conforto, da percepção da duração temporal e do layout espacial e serve de suporte para tipos
mais específicos ou complexos da consciência. Esses diferentes estados gerais da consciência
podem ser afetados seletivamente por lesões específicas do sistema nervoso e essas estruturas
foram conservadas ao longo da evolução entre os vertebrados. Uma dessas estruturas é a
formação reticular do tronco cerebral, onde se situam alguns agrupamentos celulares que originam
vias ascendentes que se projetam difusamente para todas as regiões anteriores do sistema
nervoso, inclusive para as regiões neocorticais, diferenciadas mais recentemente (HOFFMANN,
2008).
2) Consciência expandida: A consciência expandida comporta estados como percepção consciente
do ambiente e do próprio corpo, atividades mentais (pensar, imaginar, lembrar e planejar),
consciência autobiográfica, percepção da realidade e autopercepção. O crescente
desenvolvimento do pallium nos mamíferos, sobretudo das áreas associativas do neocórtex,
facultou o aparecimento dessa consciência (EDELMAN e TONONI, 2000).
Portanto, é possível que nos peixes haja a presença da consciência primária como uma
função do sistema nervoso (CHANDROO e cols., 2004) e esse tipo de consciência pode ser uma
explicação plausível para se tentar entender os mecanismos da percepção consciente da dor em
peixes. Estruturas subcorticais, existentes nos vertebrados não mamíferos, contribuem de forma
substancial para a geração e manutenção da consciência primária, e são imprescindíveis para a
geração da consciência expandida, e sua destruição resulta na perda da consciência em
mamíferos (HOFFMANN, 2008). Tem sido sugerido que a consciência evoluiu gradativamente, e
que diferentes espécies de animais podem apresentar diferentes graus de consciência (DUNCAN,
1996). Os estados de experiência emocional não são dependentes de altos graus de consciência
(como é encontrado nos humanos e possivelmente em algumas espécies de animais como os
símios), mas sim de formas básicas. Sabe-se que essas formas de consciência são necessárias
para a execução de alguns tipos de habilidades e comportamentos e, dessa forma, pode ser
possível determinar quais espécies de animais possuem essas características (FLECKNELL,
2008). Entretanto, a capacidade de peixes em experimentar a dor ainda não está esclarecida,
sendo necessário realizar uma abordagem acurada sobre as capacidades mentais desses animais
requerendo um aumento no conhecimento da neuroanatomia e uma compreensão de como essas
estruturas medeiam respostas comportamentais (HOFFMANN, 2008).
Analgesia endógena
Em interações do tipo presa versus predador, a habilidade de reconhecer antecipadamente
a ameaça de um perigo em potencial tem papel fundamental na sobrevivência da presa para
qualquer espécie, sendo que essa fase constitui a primeira etapa da cascata defensiva
(PFEIFFER, 1977; MARX e cols., 2008). Algumas espécies animais ao se defrontarem com uma
situação de risco são capazes de emitir sinais que podem ser reconhecidos por coespecíficos e/ou
heteroespecíficos simpátricos a fim de alertá-los (LILEY, 1982; WISENDEN e cols., 1995). As
categorias de sinais emitidos durante uma situação de risco afetam as mais diversas modalidades
sensoriais e incluem sinais químicos, sonoros, elétricos e visuais.
Quando os peixes (Superordem Ostariophysi) são atacados por um predador e sofrem
lesão mecânica da epiderme, a substância de alarme é liberada induzindo respostas
comportamentais defensivas nos coespecíficos. Nossos resultados confirmam os dados obtidos
por Barbosa Júnior (2008) que demonstrou em seus experimentos que juvenis de piauçus
Leporinus macrocephalus apresentam um sistema feromonal de alarme bem característico, visto
que a estimulação com o extrato de pele de coespecíficos desencadeia respostas
comportamentais defensivas principalmente o "freezing" comportamental ou a redução da atividade
locomotora. Tal fato é corroborado pela existência de células club epidérmicas, que são
responsáveis pela produção da substância de alarme.
Nesse estudo mostramos que os animais expostos à substância de alarme (SA) e que
receberam injeção subcutânea de formalina 3 % apresentaram redução da atividade natatória
(delta de locomoção), indicando uma prevalência de resposta defensiva (imobilidade) sobre a
resposta ao estímulo nocivo (aumento da locomoção). Como já foi demonstrada em nossos
experimentos, a alteração da atividade natatória pode ser um ótimo parâmetro para se quantificar a
nocicepção. Assim, a partir de nossos resultados, podemos aventar que pode estar ocorrendo uma
diminuição da resposta nociceptiva desses animais ao estímulo nocivo quando estes se encontram
em uma situação de perigo iminente, deflagrado pela presença da SA.
Tem sido sugerido que o sistema analgésico endógeno é um importante componente do
sistema defensivo, pois sua ativação, que induz uma diminuição da sensibilidade nociceptiva, e
permite que um animal ameaçado ou ferido apresente comportamentos de defesa como:
congelamento, fuga e luta, prevenindo que os comportamentos recuperativos associados à dor
interfiram nos esforços defensivos (BOLLES e FANSELOW, 1980). A ativação de um sistema
analgésico se faz necessária para que a presa possa efetuar de forma adequada a estratégia
defensiva compatível com a situação ameaçadora vigente. Assim, conjuntamente com os
mecanismos que estimulam as respostas comportamentais de defesa, há também ativação de
sistemas analgésicos endógenos (CARLI e cols., 1976).
Durante o encontro com o predador, ou até mesmo em uma situação de agressão co-
específica, a maioria dos animais pode apresentar algum dano tecidual. Dessa forma, a inibição da
informação nociceptiva e a ativação do sistema defensivo durante o perigo podem aumentar a
chance de sobrevivência dos mesmos (HARRIS, 1996), uma vez que uma das funções do sistema
defensivo é de maximizar o tempo e a energia disponíveis para a reprodução, minimizando o
tempo e a energia gastos em injúria evitando a morte (FANSELOW e SIGMUND, 1986). Logo, é
fundamental, a ocorrência dessas respostas antinociceptivas em animais de diferentes filos
(HARRIS, 1996), mostrando que o sistema analgésico endógeno é antigo e evolutivamente
conservado.
Os sistemas analgésico e de defesa podem ser ativados pelos mesmos estímulos, fato
que é discutido há algum tempo desde que foi demonstrado que um estímulo nocivo, como o
choque elétrico na pata de ratos e camundongos, provocava profunda antinocicepção (RODGERS
& RANDALL, 1987). Alguns estímulos são, portanto, capazes de desencadear respostas
antinociceptivas e de defesa. Existem vários trabalhos que demonstram que as respostas
antinociceptivas podem ser eliciadas por sinais de perigo inato como a presença de um predador
natural e pela liberação de odores de coespecíficos estressados, como também por sinas de
perigo aprendido. Os trabalhos realizados por Lester e Fanselow (1985) mostraram que ratos
expostos à presença do gato (predador natural) tiveram o sistema analgésico endógeno ativado,
pois esses animais apresentaram uma redução da resposta ao teste da formalina. Fanselow e
Sigmund (1986) demonstraram que, os ratos submetidos à imobilidade dorsal sem terem sido
previamente adaptados, apresentaram analgesia quando submetidos ao teste da placa quente.
Essa restrição dorsal seria semelhante ao comportamento de predadores naturais e machos
coespecíficos que direcionam os seus ataques nas superfícies dorsais do pescoço e das costas
dos ratos (BLANCHARD & BLANCHARD, 1977).
Fanselow e Baackes (1982) demonstraram em seus experimentos que quando os ratos
eram colocados em situação de risco (esses animais recebiam previamente um choque),
apresentavam resposta de congelamento (freezing) e cessavam a sua resposta ao teste da
formalina. No entanto, quando esses animais não recebiam o choque ocorria o inverso. O medo foi
medido pela ocorrência do congelamento e a dor foi medida pela reação do animal ao teste da
formalina. Esses achados são consistentes com a ideia de que o medo ocasionado pelo choque
causa analgesia. Leite-Panissi e cols. (2001) mostraram em cobaias a ocorrência de analgesia
após a indução de imobilidade tônica por manobras de contensão e inversão postural. A analgesia
foi aferida pelos testes de formalina e placa quente.
Nossos resultados corroboram esses dados da literatura, pois após a injeção subcutânea
de formalina a 3% ocorreu diminuição da atividade natatória em peixes expostos à substância de
alarme. As repostas dos animais emitidas na presença da SA (reação de alarme) são consideradas
inatas. Dessa forma, podemos propor que o contato com a substância de alarme poderia evocar
um estado afetivo negativo, no caso, o medo, resultante da ativação de um sistema motivacional
responsável pelos comportamentos defensivos (RHUDY e cols., 2004).
É importante ressaltar que ao contrário do estudo das emoções em humanos, que
conseguem verbalizar as suas experiências subjetivas, o seu estudo nos outros animais necessita
do uso de técnicas comportamentais que permitem quantificar as mudanças ocorridas. Em
humanos, o medo é uma emoção negativa que surge em reposta à percepção do perigo e envolve
alterações de componentes comportamentais e fisiológicos como: aumento da sudorese,
taquicardia, aumento das concentrações plasmáticas da glicemia, cortisol e catecolaminas. Essa
combinação de respostas perfaz o medo; porém, não necessariamente fazem parte de um
processo único, podendo ser separados em eventos distintos. Dessa forma, podemos investigar o
medo quantificando esses processos separadamente, mesmo não sendo possível concluir que
eles tenham a consciência emocional. Alguns autores têm argumentado que o medo tem um papel
essencial em induzir alguns tipos de respostas antinociceptivas, que podem ser revertidas pelos
efeitos analgésicos da morfina sistêmica (HARRIS, 1995).
De acordo com Bolles e Fanselow (1980), o medo e a dor são sistemas motivacionais
independentes e competem entre si exercendo funções biológicas distintas. O medo associado a
um evento doloroso resulta em comportamentos defensivos e inibe a dor. Existem também
evidências de que o medo inibe a dor em humanos (RHUDY e cols., 2004). Em peixes, um número
de diferentes comportamentos que responde a potentes estímulos ameaçadores tem sido descrito,
dependendo da espécie, e incluem respostas de escape como partida rápida ("startle")
(CHANDROO e cols., 2004; YUE e cols., 2004), movimentos erráticos, "freezing" e afundar na
água (BEREJIKIAN e cols., 1999). Portanto, o medo pode ser definido como um sistema funcional
do comportamento defensivo representando parte do repertório comportamental inato espécie-
específico essencial para sobrevivência do indivíduo e da espécie. Ele tem a função de proteger os
seres vivos contra situações perigosas, ameaçadoras e aversivas (MISSLIN, 2003).
Os estímulos sensoriais de dor estão ligados a comportamentos defensivos e já se sabe
que, anatomicamente, existe superposição de substratos neurais que estão ligados ao
comportamento dor/medo no teto mesencefálico (BASBAUM, e JESSELL, 2002). Fanselow (1991)
sugeriu que respostas de hipoalgesia e de defesa são controladas por um mesmo sistema que é
composto, principalmente, por complexo amigdaloide e pela substância cinzenta periaquedutal.
Nos mamíferos, regiões amidaloides e hipocampais do cérebro estão envolvidas no estado de
medo, embora outras áreas também participem. Estudos em peixes têm demonstrado que essas
respostas parecem ser dependentes de mecanismos cognitivos e que estruturas telencefálicas
desses animais podem ser homólogas a regiões límbicas dos mamíferos (EFSA, 2009).
Bolles e Fanselow (1980) propuseram um modelo para explicar o comportamento
medo/dor chamado de modelo perceptivo recuperativo (PDR). Em conseqüência de uma lesão
dolorosa dois comportamentos podem ser ativados: o comportamento recuperativo, responsável
pelo restabelecimento do indivíduo; ou o comportamento defensivo, que inibe tanto o
comportamento recuperativo quanto a dor e promove a percepção ambiental e a defesa. Dessa
forma, o medo ativa mecanismos endógenos que inibem o sistema motivacional da dor, pois a
expressão deste sistema pode competir e até mesmo ser incompatível com o comportamento
defensivo (RHUDY e cols., 2004).
O modelo PDR pode ser dividido em três fases: perceptiva, defensiva e recuperativa
(BOLLES e FANSELOW, 1980). A fase perceptiva é uma fase breve onde ocorre a detecção do
estímulo e sua aprendizagem, a qual é condicionante, ou seja, um estímulo que serve como sinal
de memória daquele que gerou um trauma poderá evocar comportamentos defensivos. O papel
dessa aprendizagem é fazer com que o estímulo condicionado induza uma expectativa do estímulo
não condicionado. Se o estímulo não condicionado ocorre novamente as suas características reais
são confrontadas com as características esperadas. Qualquer discrepância entre os sinais
percebidos e esperados gera correções pelo sistema de aprendizagem de forma a evitar
expectativas errôneas no futuro. É a expectativa do estímulo não condicionado, que gera o
comportamento defensivo.
A fase defensiva é o momento no qual ocorre a reação ao estímulo com o aumento do
medo e diminuição da dor ativando o sistema analgésico endógeno e gerando comportamento
defensivo. Já na fase recuperativa, ocorre a cura da injúria com a ativação do sistema motivacional
da dor pelo dano tissular e inibição de qualquer outro tipo de motivação. Nesta fase prevalece o
comportamento recuperativo com cuidados corporais e repouso e o indivíduo se torna dependente
e afetado (BOLLES e cols., 1980).
A maioria dos trabalhos relacionados com dor tem sido desenvolvido em mamíferos já que
o seu entendimento está diretamente associado com os mecanismos envolvidos em humanos.
Recentemente, outros vertebrados como peixes (SNEDDON, 2003), anfíbios (STEVENS, 2004) e
aves têm sido extensamente estudados (GENTLE, 1993; GENTLE e CORR, 1995) embora ainda
exista pouca informação a respeito deste assunto nestes animais. Nosso estudo apresentou um
dado novo na literatura, indicando a possível presença de um sistema analgésico endógeno em
peixes. Os nossos resultados demonstraram que a analgesia endógena desencadeada nos peixes
após a exposição dos mesmos à SA é de natureza opioide, pois ela foi bloqueada pelo pré-
tratamento com naloxona. Os animais que foram pré-tratados com essa droga apresentaram um
aumento da atividade natatória em resposta à injeção subcutânea de formalina.
Durante as respostas defensivas, a ativação do sistema analgésico endógeno parece ter
seletividade, ou seja, o tipo de analgesia pode ser opioide ou não opioide, dependendo da
natureza do estímulo e também da reação defensiva que desencadeia (RODGERS e RANDALL,
1987). Existem várias diferenças entre respostas defensivas como fuga, luta, "freezing" e
imobilidade tônica, sendo pouco provável que a analgesia produzida nessas duas situações seja a
mesma. Durante uma resposta de defesa ativa (por exemplo, fuga ou luta) a analgesia associada
parece ser não-opioide, de dissipação rápida (± 10 min), enquanto que em respostas defensivas
inibitórias (como é o caso da imobilidade tônica) a analgesia associada seria opioide, de dissipação
mais demorada (± 40 min). Outro fator que corrobora a ativação seletiva do sistema analgésico
endógeno é a freqüência com que se desencadeiam os diversos tipos de comportamento de
defesa. Como os comportamentos ativos são mais facilmente deflagrados que comportamentos
inibitórios, a ativação de um sistema não-opioide parece mais compatível, pois, caso contrário,
existiria o risco da ocorrência da tolerância (RODGERS e RANDALL, 1987). Essa proposta foi
confirmada por Leite-Panissi (2001) que demonstrou que em cobaias a analgesia ativada pela
imobilidade tônica foi bloqueada pelo pré-tratamento com naloxona, sugerindo a ativação de
mecanismos analgésicos endógenos, que envolvem sinapses opioides.
Teto óptico e antinocicepção
Os resultados deste estudo fornecem evidências de que o teto óptico do peixe Leporinus
macrocephalus pode ser parte do circuito neural envolvido na elaboração de respostas
antinociceptivas. Foi demonstrado que animais que receberam a microinjeção central de morfina
no teto óptico medial (TeOm) na concentração de 1,1nmol/0,1µl, seguida da injeção subcutânea
de formalina a 3%, tiveram redução do aumento da atividade natatória induzido pelo estímulo
nocivo e foi diferente dos animais do grupo controle. Como já foi anteriormente discutido, o
aumento da atividade natatória pode ser utilizado como um parâmetro fidedigno para se
quantificar as respostas dos peixes frente ao um estímulo nocivo, visto que o mesmo é abolido ou
diminuído pela injeção sistêmica de morfina. O efeito antinociceptivo da morfina no teto óptico é
sítio específico, pois ele não ocorreu em animais que receberam a microinjeção de morfina no teto
óptico lateral (TeOl) na concentração de 1,1nmol/0,1µl, seguida da injeção subcutânea de
formalina a 3%. Dessa forma, podemos notar que existem regiões específicas no teto óptico
capazes de gerar respostas antinociceptivas, no caso a região mais medial.
Em vertebrados não mamíferos, o teto óptico está envolvido no processamento de
informações sensoriais de outras modalidades, além de visual, incluindo nocicepção (ARIËNS
KAPPERS, 1920 in apud ARRIBA e POMBAL, 2007), audição, tato, e quando presentes, estímulos
luminosos no comprimento de onda infravermelho e eletrosensibilidade (BUTLER e HODOS,
1996). Também pode estar relacionado com respostas de captura de presa (McCONVILLE e
LAMING, 2006), defensivas e de localização e orientação frente ao estímulo (BUTLER, 1992).
Investigações em anfíbios têm mostrado que o teto óptico desses animais está envolvido na
elaboração de respostas defensivas que podem ser moduladas por estruturas prosencefálicas
(INGLE, e cols., 1983). O teto óptico pode ser considerado como sendo homólogo ao colículo
superior dos mamíferos (BUTLER E HODOS, 1996).
O colículo superior desempenha um importante papel na transformação das informações
sensoriais em comandos motores, que são necessários para orientar um animal em direção à
origem do estímulo. Muitas informações visuais, auditivas e somatosensoriais são utilizadas para
facilitar essa tarefa, e o colículo superior é particularmente efetivo em ampliar mínimas pistas,
através de mecanismos de integração encontrados em uma vasta população de neurônios
multisensoriais. Os neurônios que respondem a diferentes estímulos apresentam projeções, que
formam a maior parte dos componentes que constituem as vias descendentes que trafegam para
áreas do tronco cerebral e da medula espinal, controlando a musculatura dos olhos, boca, ouvidos,
cabeça e pescoço (REDGRAVE e cols., 1996a). Conseqüentemente, essa estrutura age como
sendo uma interface multimodal, onde muitos sinais sensoriais influenciam a maquinaria do tronco
cerebral para coordenar os movimentos posicionando os órgãos sensoriais periféricos em direção
a uma localização no espaço (DEAN e cols., 1989; REDGRAVE e cols., 1996a; REDGRAVE e
cols., 1996b).
Além disso, o colículo superior apresenta a função de determinar a reação imediata do
animal a um evento novo inesperado, incluindo a ativação de mecanismos motores emocionais
(REDGRAVE, 1996b) Presumidamente, uma das propriedades desse sistema motor emocional é
primeiramente responder a um potencial estímulo ameaçador fazendo com que alguns estados
centrais emocionais, como o medo e a ansiedade, possam ser mantidos mesmo após o
desaparecimento desse estímulo. Estudos desenvolvidos em roedores são consistentes com essa
idéia. Estados de medo e de ansiedade provocados pela exposição ao predador produzem
mudanças comportamentais de longa duração e tem implicações para a sobrevivência do animal
(BLANCHARD e BLANCHARD, 1989). Por exemplo, uma exposição de aproximadamente 15
minutos ao gato pode iniciar nos ratos padrões de comportamentos defensivos acompanhados
pela inibição de comportamentos alimentares, reprodutivos e agressão intraespecífica com
duração de até 24 horas (REDGRAVE, 1996b). Assim, o colículo superior também é fundamental
para a elaboração desses comportamentos defensivos (REDGRAVE e cols., 1996b).
Portanto, recentes estudos têm demonstrado que quando o colículo superior de roedores é
estimulado (elétrica ou quimicamente), dois tipos de respostas podem ser desencadeados e estes
aparecem ser dependentes de projeções descendentes distintas e que estão provavelmente
sujeitas a diferentes influências sensoriais e prosencefálicas (DEAN e cols., 1989):
a) Respostas de orientação juntamente com movimentos de monitoramento do ambiente ou de
aproximação. Essas respostas podem ser desencadeadas pela estimulação de vias descendentes
contralaterais (saem majoritariamente das camadas intermediárias do colículo superior) que se
conectam com várias estruturas mediais pontinas e bulbares pelo feixe pré-dorsal.
b) Comportamentos defensivos como fuga ou luta juntamente com alterações cardiovasculares e
analgesia (SOPER e MELZACK, 1982), os quais são apropriados numa situação de emergência
como o aparecimento do predador. Esses comportamentos podem ser ativados por vias
descendentes que trafegam caudalmente e ventralmente conectando-se principalmente com
estruturas pontinas e mesencefálicas, como a substância cinzenta periaquedutal, núcleo
cuneiforme e formação reticular medial (REDGRAVE e cols., 1987).
Já está bastante estabelecido que o sistema encefálico da aversão, formado pelo
hipotálamo medial, complexo amigdaloide, e estruturas mesencefálicas, como a substância
cinzenta periaquedutal dorsal (SCPd), camadas profundas do colículo superior (CPCS) e colículo
inferior, constituem os principais substratos neurais para a integração de estados aversivos no
sistema nervoso central (ADAMS, 1979; GRAEFF, 1990). Tem sido demonstrada a existência de
conexões recíprocas entre o colículo inferior, colículo superior e a SCPd (HERRERA e cols., 1988).
Esses achados são consistentes com a demonstração de conexões funcionais entre essas
estruturas, e em particular, com funções relacionadas a respostas induzidas por estímulos
aversivos como, por exemplo, a regulação da expressão comportamental de estados de medo e
mudanças no processamento nociceptivo que acompanha esses estados (BRANDÃO e cols.,
1994).
Existem inúmeras evidências que os padrões defensivos são organizados em uma série
hierárquica de respostas. O aumento gradual da intensidade de estimulações elétricas da
substância cinzenta dorsal (SCPd), camadas profundas dos colículos superior e inferior dos ratos
induz, de maneira progressiva, respostas defensivas características como fuga, "freezing" e
esquiva comportamental (BRANDÃO e cols., 1999). Em geral essas respostas são acompanhadas
por analgesia (COIMBRA e cols., 1992; COIMBRA e BRANDÃO, 1997; FANSELOW, 1991).
Dessa forma, os nossos resultados apontam para um efeito antinociceptivo da estimulação
química, com morfina, do teto óptico medial do peixe Leporinus macrocephalus, corroborando com
relatos da literatura. Vários trabalhos têm demonstrado o envolvimento do colículo superior em
respostas defensivas e de antinocicepção (COIMBRA e BRANDÃO, 1997; COIMBRA e cols.,
2006). Efeitos antinociceptivos associados com outras manifestações comportamentais defensivas
foram obtidos estimulando o colículo superior (FARDIN e cols., 1983). Trabalhos têm mostrado em
ratos a presença de neurônios nociceptivos, principalmente nas camadas intermediárias dessa
estrutura (REDGRAVE e cols., 1996a; REDGRAVE e cols., 1996b).
Em relação aos neurotransmissores envolvidos na elaboração de respostas
antinociceptivas, inúmeros neuropeptídeos foram investigados. Berson e cols. (1991)
demonstraram a presença de encefalinas, que são os ligantes endógenos dos receptores opioides,
no colículo superior, principalmente em pequenas populações de neurônios localizados quase que
exclusivamente nas camadas mais superficiais e com poucas fibras positivas nas camadas mais
profundas. Muito embora neurônios β-endofinérgicos e encefalinérgicos tenham sido mais
recentemente descritos nas camadas profundas do colículo superior, colículo inferior e SCP
(EICHENBERGER e cols., 2002; OSAKI e cols., 2003). Os peixes apresentam receptores opioides
com um padrão de distribuição semelhante ao de outros vertebrados (VECINO e cols., 1990).
A principal via inibitória da dor tem sido descrita como sendo uma conexão da SCP com
estruturas mais caudais do tronco encefálico, como o RVM e dali se conectando com a medula
espinal. Os neurônios da SCP, os quais se projetam para o RVM, encontram-se sob inibição tônica
dos interneurônios GABAérgicos. Os agonistas opioides inibem estes interneurônios, e excitam os
neurônios aferentes da SCP, causando a ativação da células-off do RVM, que se projetam para o
corno dorsal da medula espinal e inibem a transmissão nociceptiva. Ao mesmo tempo, inibem as
células-on do RVM que possuem ações contrárias no corno dorsal espinal, facilitando a
transmissão nociceptiva (MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008; BEHBEHANI, 1995). Os achados de
Eichenberger e cols. (2002), usando técnicas de tracejamento, reforçam as conexões existentes
entre as camadas profundas do colículo superior com a SCP. Mensah-Brown e cols. (2006)
mostraram, através de técnicas de imuno-histoquímica, a distribuição de leu e met encefalinas nas
camadas intermediárias do colículo superior de camelos com fibras projetando para a SCP.
Recentes relatos demonstraram que a estimulação dessas estruturas, pode gerar processos
antinociceptivos (CASTILHO e cols., 1999) tanto de natureza opioide (NICHOLS e cols., 1989),
quanto monoaminérgica (COIMBRA e cols., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997).
Na medida em que as expressões dos diferentes comportamentos em resposta a um
estímulo são determinadas pela ativação de circuitarias específicas presentes no colículo superior,
é natural que os neurônios nociceptivos dessa estrutura apresentem um importante papel na
iniciação dos comportamentos defensivos (MCHAFIEE e cols., 2001). Enquanto que a
representação somatosensorial no colículo superior das vibrissas e da face apresenta baixo limiar
e é especializada na elaboração de comportamentos exploratórios, a representação nociceptiva
evoluiu em paralelo com as reações de retirada, protegendo o corpo, especialmente a face, de
injúrias físicas (REDGRAVE e cols., 1996).
No entanto, tem que ser levar em conta que, em situações em que o estímulo nocivo
permanece em contato contínuo com a pele, as respostas de retirada não seriam apropriadas, pois
nestas condições seria mais interessante para o animal que ele se orientasse em direção ao
estímulo desconfortável no sentido de removê-lo. Redgrave e cols. (1996a) mostraram em seus
experimentos que uma significante população de neurônios nociceptivos do colículo superior tem
acesso, via axônios cursando o feixe pré-dorsal, a regiões contralaterais do tronco encefálico
implicados na elaboração de comportamentos de orientação e aproximação. Assim, é possível que
os neurônios nociceptivos possam efetuar respostas de orientação em direção ao estímulo nocivo
pela utilização das mesmas vias descendentes que os neurônios de baixo limiar utilizam para
iniciar a orientação em direção ao um estímulo inócuo (REDGRAVE e cols, 1996a).
Em uma perspectiva evolutiva, regiões cerebrais filogeneticamente antigas estão
envolvidas na elaboração de respostas que lidam com tomadas de decisões que são críticas para
a sobrevivência e muitos aspectos dessas funções foram conservadas em roedores (REDGRAVE
e cols., 1996a). O teto óptico é uma das estruturas encefálicas mais conservadas nos vertebrados
(BUTLER e HODOS, 1996). Do ponto de vista funcional, parece inteiramente razoável que tanto o
colículo superior quanto o teto óptico de vertebrados não-mamíferos estejam envolvidos com
respostas defensivas e de analgesia, bem como de orientação e aproximação frente ao estímulo
novo, porque a decisão de se orientar frente a esse estímulo está intimamente ligada com a
decisão de evitá-lo. A habilidade de distinguir sinais de emergência e eventos neutros é uma
característica encontrada em todas as espécies; entretanto, os detalhes que fazem com que um
evento seja considerado emergencial variam entre elas, uma vez que as regras de decisões a
serem tomadas têm que levar em conta os relativos custos e benefícios de orientar ou fugir
(REDGRAVE e cols., 1996a). Caso a decisão escolhida seja evitar tal estímulo, é de extrema
importância que respostas antinociceptivas sejam deflagradas juntamente com as respostas
defensivas, já que durante um confronto entre presa e predador é importante amenizar a sensação
aversiva e conseqüentemente suprimir respostas recuperativas, permitindo a expressão do
comportamento defensivo, essencial para a sobrevivência do indivíduo.
6 - CONCLUSÕES
A injeção subcutânea de formalina a 3% na região próxima à nadadeira adiposa induz
aumento dos batimentos operculares e da atividade natatória no peixe Leporinus
macrocephalus.
O aumento dos batimentos operculares e o aumento da atividade natatória são reduzidos
pela injeção sistêmica de morfina.
Essas respostas neurovegetativas e comportamentais demonstram que os peixes não reagem
passiva e reflexamente a um potente estímulo doloroso, mostrando uma possível capacidade
de experimentar a dor, uma vez que essas respostas são reduzidas pela administração prévia
de um analgésico, no caso a morfina.
A injeção subcutânea de capsaicina não altera a atividade natatória no peixe Leporinus
macrocephalus, indicando que esses animais não respondem a esse tipo de estímulo
nocivo.
O teste da formalina é aqui proposto como um eficiente teste algesimétrico para peixes e
sua fácil avaliação quantitativa, por meio do monitoramento da atividade natatória é
adequado em situações experimentais que exigem a liberdade de movimentos do animal
dentro do aquário.
O aumento da atividade natatória decorrente da injeção subcutânea de formalina a 3% é
bloqueado (ou reduzido) após a exposição dos animais à substância de alarme de um co-
específico, mostrando a existência de um sistema analgésico endógeno no peixe em estudo
Esse sistema pode ser mobilizado em situações que potencialmente sinalizam predação, como
aquela deflagrada pela presença da substância de alarme
A analgesia induzida pela substância de alarme é revertida pelo pré-tratamento com
naloxona mostrando a sua natureza opioide.
A microinjeção central de morfina no teto óptico medial, e não no lateral reduz a atividade
natatória induzida pela injeção subcutânea de formalina a 3%, mostrando a existência de
regiões específicas nessa estrutura capazes de gerar respostas antinociceptivas. O teto óptico
é homólogo ao colículo superior de mamíferos. Do ponto de vista funcional, é importante que
o teto óptico esteja envolvido com respostas defensivas e analgesia, já que durante um
confronto presa versus predador é necessário amenizar a sensação aversiva e
consequentemente suprimir respostas recuperativas, permitindo a expressão do
comportamento defensivo, essencial para a sobrevivência do indivíduo. Esse é o primeiro
estudo da literatura que aponta para uma estrutura do sistema nervoso central envolvida
na antinocicepção em peixes. Estudos futuros são necessários para definir as demais
estruturas que compõem o sistema analgésico endógeno nesses animais.
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Tabela I: Dados individuais dos valores normalizados dos batimentos operculares durante sessenta minutos após a injeção subcutânea de salina ou
formalina 3% na região próxima a nadadeira adiposa.
Valores normalizados dos batimentos operculares (%)
Salina
Animal
5 min
10 min
15 min
20 min
25 min
30 min
35 min
40 min
45 min
50 min
55 min
60 min
1
19,51198
6,768327
4,238492
0,402635
-2,66371
0,566609
1,811466
2,098318
7,986725
4,521511
12,28624
4,667117
2
3,524308
1,53582
3,002237
3,471307
3,559878
6,994975
8,986915
4,344648
12,59614
3,594405
5,976742
-0,24351
3
5,258106
1,184548
3,899678
3,102416
0,779688
1,309784
1,327221
3,63024
-0,05655
-2,19045
-3,21304
-0,63415
4
24,8373
20,34948
14,28074
9,486714
8,478768
5,654482
6,201834
0,560142
3,408915
5,093103
5,864386
6,252274
5
-3,4523
3,298417
4,618762
4,387091
0,401912
-2,91432
0,930212
1,550497
-5,92119
-4,13901
-0,30967
-1,5182
6
-1,8792
-2,94965
-1,41251
-5,67296
-2,19951
-0,92922
-2,10554
-0,07628
-3,60673
-4,73382
-3,56747
-2,5658
7
8,965605
9,392659
1,452446
7,913855
3,017151
1,26616
-0,9021
1,754309
-1,38872
-3,99589
-2,86044
-0,43792
MÉDIA
8,10
5,6
4,2
3,2
1,6
1,7
2,3
1,9
1,8
-0,2
2,0
0,7
DESVPAD
10,5
7,6
4,8
4,9
3,8
3,5
3,9
1,5
6,5
4,4
6,1
3,3
EPM
4,0
2,8
1,8
1,8
1,4
1,3
1,4
0,5
2,4
1,6
2,3
1,2
Valores normalizados dos batimentos operculares (%)
Formalina 3%
Animal
5 min
10 min
15 min
20 min
25 min
30 min
35 min
40 min
45 min
50 min
55 min
60 min
1
27,9924
29,10429
27,50065
22,88339
20,58872
22,1764
18,92109
18,2895
17,43844
15,30428
11,45002
10,36164
2
6,254724
8,233903
8,370004
6,867945
5,728039
4,270154
2,837569
2,567112
1,225263
-0,72886
-1,32617
-2,07532
3
32,69426
28,21915
25,48228
21,00356
14,04917
10,32896
0,396563
-1,93233
-5,40366
-8,00161
-12,2976
-5,31207
4
52,00757
44,07123
48,71398
49,10869
49,06484
34,41685
33,61377
35,79262
34,96374
34,42259
28,142
26,28712
5
50,00371
72,96446
64,81973
53,74052
48,13112
39,50299
39,19847
34,95138
30,9532
27,31135
26,74874
29,37239
6
33,46527
35,22004
36,20463
27,14783
19,02473
11,16249
4,261355
3,581913
10,03082
17,06268
22,91335
30,7389
7
95,41895
100,0105
94,09233
92,51109
97,19164
107,1927
112,0127
118,6002
125,5076
128,13
127,2178
128,242
MÉDIA
42,5
45,4
43,5
39,0
36,2
32,7
30,1
30,2
30,6
30,5
28,9
31,0
DESVPAD
27,8
31,0
28,6
28,6
31,5
35,3
39,2
41,8
44,3
45,5
45,8
45,3
EPM
10,5
11,7
10,8
10,8
11,9
13,3
14,8
15,8
16,7
17,2
17,3
17,1
Tabela II: Dados individuais dos valores normalizados dos batimentos operculares quinze minutos após injeções subcutâneas de salina (SAL) ou
formalina 3% (FOR) nas seguintes circunstâncias: após a injeção sistêmica de salina (SAL) ou morfina (MOR) nas três doses: 30mg/kg, 50mg/kg
e 100mg/kg.
Valores normalizados dos batimentos operculares (%)
Animal
SAL + SAL
SAL + FOR
MOR 30mg/kg + SAL
MOR 50mg/kg + FOR
MOR 100mg/kg + FOR
1
16,38
37,84
35,91
20,36
15,07
2
28,00
42,07
68,18
16,26
-0,47
3
-4,75
33,75
31,95
27,45
18,77
4
7,21
77,82
64,32
9,62
19,53
5
22,29
81,45
49,93
3,18
28,22
6
33,08
83,96
32,37
5,03
8,55
7
-5,12
43,37
25,30
5,90
41,45
8
36,7
47,7
MÉDIA
13,9
57,2
44,0
12,5
18,7
DESVPAD
15,3
22,6
17,0
9,1
13,5
EPM
5,8
8,6
6,4
3,2
4,8
Tabela III: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que
receberam a injeção subcutânea de salina ou formalina 3% na região próxima a nadadeira
adiposa, durante cinco minutos.
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Salina
Animal
1 min
2 min
3 min
4 min
5 min
1
4,00
1,00
1,00
3,00
1,00
2
-14,40
-23,40
-9,40
-21,40
-23,40
3
-12,80
-13,80
-13,80
-13,80
-13,80
4
36,20
13,20
-3,80
-1,80
-7,80
5
6,60
4,60
-1,40
-1,40
-1,40
6
-30,00
-31,00
-31,00
-31,00
-31,00
7
15,20
5,20
8,20
1,20
-0,80
8
1,80
0,80
-0,20
-0,20
-0,20
MÉDIA
0,8
-5,4
-6,3
-8,2
-9,7
DESVPAD
20,2
15,5
12,0
12,5
12,0
EPM
7,2
5,5
4,2
4,4
4,3
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Formalina 3%
Animal
1 min
2 min
3 min
4 min
5 min
1
32,00
14,00
11,00
8,00
4,00
2
30,00
17,00
41,00
25,00
57,00
3
56,00
12,00
0,00
0,00
0,00
4
50,00
19,00
6,00
7,00
13,00
5
54,00
33,00
19,00
36,00
21,00
6
80,00
26,00
13,00
19,00
12,00
7
53,00
39,00
14,00
9,00
7,00
8
44,00
56,00
0,00
0,00
0,00
MÉDIA
49,9
27,0
13,0
13,0
14,3
DESVPAD
15,7
15,0
13,2
12,7
18,7
EPM
5,5
5,3
4,7
4,5
6,6
Tabela IV: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que
receberam a injeção subcutânea de salina (SAL) ou formalina 3% (FOR) na região próxima a
nadadeira adiposa, após a injeção sistêmica de salina (SAL) ou morfina 50mg/kg (MOR).
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
SAL + SAL
SAL + FOR
MOR + SAL
MOR 15 + FOR
MOR 60 + FOR
1
2,00
170,00
-6,00
10,00
38,00
2
-45,00
41,00
22,00
54,00
55,00
3
-22,00
165,00
-93,00
20,00
36,00
4
11,00
69,00
-3,00
61,00
28,00
5
39,00
48,00
17,00
50,00
36,00
6
-2,00
100,00
19,00
29,00
60,00
7
-24,00
0,00
9,00
8
-2,00
MÉDIA
-5,9
98,8
-5,8
33,3
42,2
DESVPAD
27,4
57,0
37,0
21,6
12,5
EPM
9,7
21,6
12,3
7,6
5,1
Tabela V: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que receberam
a injeção subcutânea de salina (SAL) ou formalina 3% (FOR) na região próxima a nadadeira
adiposa, após a injeção sistêmica de naloxone (NAL 1) 10mg/kg.
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
NAL 1 + SAL
NAL 1 + FOR
-4,00
34,00
2
0,00
94,00
3
4,00
79,00
4
20,00
33,00
5
2,00
42,00
6
9,00
96,00
7
-4,00
96,00
8
59,00
MÉDIA
3,8
66,6
DESVPAD
8,4
27,9
EPM
3,1
9,8
Tabela VI: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que foram
pré-tratados com naloxona nas diferentes doses de 10mg/kg (NAL 1) 20mg/kg (NAL 2) e 30mg/kg
(NAL 3), seguida da injeção sistêmica de morfina (MOR) 50mg/kg antes da injeção subcutânea de
salina (SAL) ou formalina 3% (FOR) na região próxima a nadadeira adiposa.
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
NAL 1 + MOR + FOR
NAL 2 + MOR + FOR
NAL 3 + MOR + FOR
1
-20,00
1,00
59,00
2
-6,00
31,00
87,00
3
73,00
7,00
96,00
4
-6,00
19,00
83,00
5
32,00
75,00
6
-10,00
40,00
7
16,00
147,00
8
57,00
MÉDIA
10,2
13,7
80,5
DESVPAD
42,3
15,4
20,6
EPM
21,1
5,8
6,9
Tabela VII: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que
receberam a injeção subcutânea de veículo ou capsaicina nas doses de 10µg e 100µg na região
próxima a nadadeira adiposa.
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
Veículo
Capsaicina 10µg
Capsaicina 100µg
1
54,00
33,00
4,00
2
41,00
41,00
0,00
3
29,00
59,00
82,00
4
-9,00
3,00
28,00
5
13,00
4,00
39,00
6
38,00
-40,00
16,00
7
33,00
28,00
14,00
8
12,00
MÉDIA
26,3
18,2
26,1
DESVPAD
19,9
32,4
28
EPM
7,0
11,4
10,5
Tabela VIII: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) após a aplicação no
aquário de água destilada (AD) ou substância de alarme (SA).
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
AD
SA
1
8,00
-52,00
2
0,00
2,00
3
0,00
16,00
4
1,00
-62,00
5
2,00
-20,00
6
2,00
-37,00
7
1,00
-10,00
8
5,00
-18,00
9
-6,00
-25,00
10
0,00
-138,00
11
-8,00
-26,00
12
-14,00
-25,00
13
32,00
-91,00,
14
-10,00
-109,00
MÈDIA
0,9
-42,5
DESVPAD
10,7
43,7
EPM
2,8
11,6
Tabela IX: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que
receberam a injeção subcutânea de salina (SAL) ou formalina 3% (FOR) na região próxima a
nadadeira adiposa, após a aplicação no aquário de água destilada (AD) ou substância de alarme
(SA).
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
AD + SAL
AD + FOR
SA + SAL
SA + FOR
1
44,00
173,00
-53,00
13,00
2
8,00
94,00
1,00
36,00
3
33,00
188,00
-14,00
7,00
4
0,00
89,00
-46,00
-9,00
5
12,00
108,00
-19,00
34,00
6
11,00
113,00
-29,00
-6,00
7
11,00
93,00
32,00
-31,00
MÉDIA
17,0
122,6
-18,3
6,2
DESVPAD
15,6
40,7
28,9
6,3
EPM
5,18
13,5
10,2
2,4
Tabela X: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que foram pré-
tratados com naloxona 20mg/kg (NAL) ou salina (SAL), seguida da exposição à substância de
alarme (SA), antes da injeção subcutânea de salina (SAL) ou formalina 3% (FOR) na região
próxima a nadadeira adiposa.
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
SAL+ SA + SAL
SAL+ SA + FOR
NAL+ SA + SAL
NAL+ SA + FOR
1
-44,00
18,00
-18,00
80,00
2
-22,00
2,00
-22,00
28,00
3
62,00
40,00
-55,00
58,00
4
-18,00
-40,00
-17,00
17,00
5
9,00
33,00
-7,00
28,00
6
5,00
-7,00
-6,00
61,00
7
-16,00
16,00
3,00
25,00
14,00
MÉDIA
-3,4
8,9
-13,5
42,4
DESVPAD
33,8
27,0
20,5
21,9
EPM
12,0
9,5
7,3
8,3
Tabela XI: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que
receberam a microinjeção central de salina (SAL) ou morfina 1,1nmol/0,1µl no teto óptico medial
(TeOm), seguida da injeção subcutânea de salina (SAL) ou formalina 3% (FOR) na região próxima
a nadadeira adiposa.
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
SAL + SAL
SAL + FOR
MOR + SAL
MOR + FOR
1
-27,00
73,00
46,00
3,00
2
-28,00
90,00
31,00
-70,00
3
43,00
53,00
23,00
-83,00
4
-26,00
59,00
-30,00
-36,00
5
-82,00
119,00
12,00
0,00
6
87,00
20,00
30,00
7
228,00
-23,00
8
63,00
21,00
MÉDIA
-24,0
96,5
17,0
-19,8
DESVPAD
44,4
57,2
25,8
41,1
EPM
19,8
21,6
9,1
14,5
Tabela XII: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que
receberam a microinjeção central de naloxona 0,37nmol/0,1µl (NAL) ou salina (SAL), seguida da
microinjeção central de morfina 1,1nmol/0,1µl (MOR) no teto óptico medial (TeOm) e da injeção
subcutânea de formalina 3% (FOR) na região próxima a nadadeira adiposa.
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
NAL + SAL + FOR
NAL + MOR + FOR
1
65
92
2
89
53
3
47
55
4
53
74
5
50
81
6
88
103
Media
65,3
76,3
DESVPAD
18,9
19,9
EPM
7,7
8,1
Tabela XIII: Dados individuais da atividade natatória (delta de locomoção) de animais que
receberam a microinjeção central de salina (SAL) ou morfina 1,1nmol/0,1µl no teto óptico lateral
(TeOl), seguida da injeção subcutânea de salina (SAL) ou formalina 3% (FOR) na região próxima a
nadadeira adiposa.
Atividade Natatória (Delta de Locomoção)
Animal
SAL + SAL
SAL + FOR
MOR + SAL
MOR + FOR
1
52,00
118,00
22,00
87,00
2
42,00
137,00
42,00
87,00
3
44,00
79,00
70,00
106,00
4
25,00
108,00
42,00
127,00
5
4,00
64,00
26,00
142,00
6
114,00
9,00
65,00
7
86,00
MÉDIA
33,4
103,3
35,2
100,0
DESVPAD
19,2
26,9
21,2
28,5
EPM
8,5
12
9,4
10,7
Mecanismos opioidérgicos envolvidos na antinocicepção
induzida comportamentalmente e por estimulação mesencefálica
no teleósteo Leporinus macrocephalus
F. L. Alves
1
, A S. F. Pereira
1
and A. Hoffmann
1
1
Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.
Correspondence: F. L. Alves,
1
Departamento de Fisiologia, Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, USP.
Av. Bandeirantes, 3900, 14049-900, Ribeirão Preto, SP, Brasil
Tel: + 55 16 6023199, Fax: + 55 16 6330017. E-mail: [email protected]
Running Title: A new test to access nociception in the fish
Keywords: formalin test; swimming activity; opercular beat rate; fish; pain
Abstract
The ability of fish to experience pain is a highly controversial issue. Some authors argue that pain
results from the activation of several regions of the cerebral cortex, restricting it for the humans and
primates. However, recent researches have demonstrated that some similarities exist between fish
and higher vertebrates in their basic structures of the nervous system related with the pain
perception. The formalin and capsaicin test are common pain tests used in mammals to determine
nociceptive threshold and the efficacy of analgesics. The purpose of this study was to examine the
responses of piauçu evoked by subcutaneous injection of 3% formalin and capsaicin. The alterations
in the opercular beat rate (% of the normalized values) and swimming activity (delta of locomotion)
were used as nociceptive indicators. The subcutaneous injection of 3% formalin in the region
underlying the adipose fin induces an increase in the opercular beat rate that was maximal in the
first 15 minutes and an increase in swimming activity which attained its maximum value one
minute after stimuli application. In both cases, the values were statistically different from those
observed after subcutaneous injection of saline in the respective times. However, fish that received
the subcutaneous injection of capsaicin 10µg and 100µg did not respond to this noxious stimulus,
showing any change in the swimming activity.
The systemic injection of morphine (opioid agonist) 50mg/kg, 100 mg/kg but not the 30mg/kg dose
blocked the increase of the opercular beat rate induced by 3% formalin. In addition, the previous
systemic injection of morphine 50mg/kg also blocked the enhances of swimming activity. The
pretreatment with naloxone (opioid antagonist) 10mg/kg and 20mg/kg were not able to reverse the
effect of morphine, but this response was blocked with the dose of 30mg/kg. Some fish showed
anomalous swimming behavior like loss of equilibrium in consequence of the noxious stimulation.
These neurovegetative and behavioral responses demonstrate that the fish does not react merely
passively and reflexively to potentially painful stimulus, showing a relevant capacity to
experiencing pain.
Keywords: Formalin test; Capsaicin; Swimming activity; Opercular beat rate; Fish; Nociception
1. Introduction
Nociception is the detection of potentially injurious stimuli and give rises to pain which usually has
not only a sensory component but is also an emotional experience (Sneddon, 2004). The capacity of
fish to perceive a painful stimulus is still in debate. Many groups suggest that fish are incapable of
pain perception, because they possess an undifferentiated telencephalon. Fish are merely
responsive, passively reacting to stimuli with little or no ability for cognition or self-awareness
(Rose, 2002). On the other hand, others argue that there is now evidence that fish possess the same
types of specialized receptors as birds and mammals that allow the detection of noxious stimulus
(nociceptors). Besides, the nervous system and brain of several species of fish appear sufficiently
complex to permit us to conclude that they have the capacity for fear and suffering (Braithwaite and
Boulcott, 2007; Sneddon et al 2003a).
Noxious stimulation of nociceptors in the skin around the snout of fish generates neural activity that
can be electrophysiologically recorded, and induces a number of behavioral and physiological
changes (Braithwaite and Boulcott, 2007). Recent researches reported that the rainbow trout react to
subcutaneous 0.1% acetic acid injection, with anomalous behaviors such as rocking whilst resting
on the substrate. Furthermore, fish were observed rubbing their snouts, where the noxious stimulus
had been administered, on the walls and the substrate of the tank, subsequent to local noxious
stimulation. These anomalous behaviors were not seen in handled controls or saline-injected fish.
Additional observations reported the enhancement of respiratory rate. These responses were
attenuated with pretreatment of morphine (Sneddon, 2003b).
The presence of a nociceptive system is clearly an essential component for the perception of pain,
but alone it does not provide support that fish have an awareness of painful stimuli. It is necessary
to demonstrate that higher order cognitive processes such as mental state or affective state are
involved. However, quantifying the "motivational affected state of an animal"-a concept
encompassing not just pain but also fear, hunger, thirst and pleasure-is difficult owing to its
subjectivity (Braithwaite and Boulcott, 2007). Nowadays, empirical works are beginning to test
these concepts in fish to determinate whether our interactions with them cause negative responses
that generate suffering. Trout treated with noxious stimulus (acetic acid or bee venom) showed
prolonged suppression in their motivation to feed. It took these fish 170 min on average before they
started to approach the food in contrast to the 80 min it took for the control and saline injected fish
to start feeding (Sneddon, 2003b).
Related to these studies, fear responses were investigated in fish that had experienced a noxious
stimulus (Sneddon et al., 2003c). The fear responses were quantified as the amount of time a fish
spent avoiding a novel object that had been temporally placed in the tank. The authors observed that
the fear response was reduced in fish that had experienced a noxious stimulus and this reduction
was reversed with the application of morphine.
It is important to note that very little is known about the capacity of nociception in fish and there are
considerable species-specific differences. It is vital to test other species for their capacity for pain
perception to understand if all fish have this faculty and to develop validated behavioral criteria for
the assessment of welfare (Reilly et al., 2008). The purpose of this study is to validate the formalin
and capsaicin test as a new methodology for the study of nociception in fish, measuring alterations
in the ventilatory frequency and swimming activity in the piauçu Leporinus macrocephalus.
2. Material and Methods
All experiments were performed in compliance with the guidelines set up by COBEA (Brazilian
College of Animal Experimentation) and approved by the Ethics Committee of the School of
Medicine of Ribeirão Preto (no. 021/2007).
2.1. Animals
One hundred and fifty-seven juveniles piauçu Leporinus macrocephalus, average weight 15-35g,
10-12.5cm in length were obtained from a commercial supplier (Fish Project, Sales de Oliveira, São
Paulo, Brazil) and were housed indoors in the laboratory. Fish were individually kept in glass
aquaria (30 x 25 x 15 cm) with substrate in the bottom, containing aerated, filtered and
dechlorinated water, maintained at 26 ± 1°C. They were fed once a day with commercial flake food
(PURINA) and subjected to a 12:00 h light 12:00 h dark period.
2.2. Nociceptive test
2.2.1 Formalin test
Formalin solutions were injected subcutaneously in the region underlying the adipose fin. It was an
attempt to replicate in fish the formalin pain model proposed for the rat (Dubuisson and Dennis,
1977), which was also adapted for other mammals and for the crocodile (Porro and Cavazzutti,
1993) and proved to be a useful method for producing pain. Formalin in three different
concentrations (1%, 3% and 5%) was formerly used in the laboratory as a noxious stimulus in fish
Oreochromis niloticus. The 3% formalin proved to be the most efficient concentration to reduce the
magnitude of the reversible cardiac arrest induced by a moving shadow (Ide e Hoffmann, 2002).
The highest concentration used in this work (3%) was lower that the usually employed in mammals
(5%).
2.2.2 Capsaicin test
Capsaicin is a vanilloid active compound pepper that can evoke a sensation of tingling and burning
pain by activating a nonselective cation channel, called VR1, on sensory nerve endings of
unmyelinated C fibres (JORDT and JULIUS, 2002; JULIUS and BASBAUM, 2001; SZALLASI
and BLUMBERG, 1999). The capsaicin is usually used for the pain study in rodents (WINTER et
al, 1995). The fish received subcutaneous injection of different concentrations of capsaicin (10µg
and 100µg) in the region underlying the adipose fin.
2.3. Drugs
Morphine sulfate (Sigma) and naloxone hydrochloride (Tocris Bioscience) were dissolved in Ringer
solution for fish, which was also used as a control vehicle. The doses used were 30mg/kg, 50mg/kg
and 100mg/kg for morphine and 10mg/kg, 20mg/kg and 30mg/kg for naloxone applied
systemically. The volume of the systemic injection was 0.1 ml/10g fish weight
2.4. Data collection and evaluation
Opercular beat: Opercular or buccal movements were visually accessed and with the aid of a
chronometer, the lapse of time necessary for 20 successive beats to occur was counted and the
ventilatory rate (beats/min) evaluated (adapted from Barreto et al., 2003). The opercular beat rate
(gill movements per minute) was evaluated before and until 60 minutes after s.c. injections of saline
or 3% formalin. The opercular beat rate for each interval was normalized by subtracting its value
from the basal value and dividing the difference thus obtained by the basal value. Index 1 of the
normalized data corresponded to an increase of 100% with respect to the basal value. The means of
the percentages of the normalized values are presented
Swimming Activity: A nine-cell rectangular grid (12.3 x 7cm) was drawn on the outside of the back
wall of the aquarium to aid in video analysis, and lateral walls were covered with brown paper to
avoid outside disturbances. To evaluate the swimming activity quantitatively, the number of grid
lines the animal crossed during the experiment was counted with the aid of a basic computer
program GW BASIC (Schmidek and Schmidek, 1988). The swimming activity is expressed as the
difference (delta of locomotion) of the number of crossing after (poststimulus) and before (baseline)
the application of the noxious stimulus
2.5. Experimental Protocol
2.5.1 Experiment 1: Subcutaneous administration of formalin and the opercular beat rate
First phase: The fish were placed into individual experimental boxes (40 X 11 X 8 cm) for one hour
acclimation. The observation procedure consisted of two successive steps: (1) five minutes of
opercular beat recording (baseline) and (2) sixty minutes of opercular beat recording (poststimulus)
after the subcutaneous administration of the 0.2µl of saline (n = 7) or 3% formalin (n = 7) in the
region underlying the adipose fin. The animals were removed from the box and placed on wet paper
towel for the formalin or saline administration and immediately returned to the water.
Second phase: The fish received the previous systemic injection of saline (SAL) or different doses
of morphine (MOR) 30mg/kg, 50mg/kg and 100mg/kg (0.1 ml/10g fish weight). Sixty minutes
later, the opercular beat was recorded during five minutes (baseline) and in the following fifteen
minutes after the subcutaneous administration of 0.2µl of 3 % formalin (FOR) or saline (SAL)
(poststimulus) in the region underlying the adipose fin. The experimental groups were: SAL + SAL
(n = 7), SAL + FOR (n = 7), MOR 30mg/kg + FOR (n = 7), MOR 50mg/kg + FOR (n = 8) and
MOR 100mg/kg + FOR (n = 8).
2.5.2 Experiment 2: Subcutaneous administration of formalin and the swimming activity.
First phase: During experiments, fish were monitored by a Sony CCD-TRV 318 video camera
placed in front of the aquarium. The experimental protocol consisted in five minutes swimming
activity recording (baseline) and five minutes recording (poststimulus) after the administration of
0.2µl of saline (n = 8) or 3% formalin (n = 8) in the region underlying the adipose fin.
Second phase: The fish received subcutaneous injections of 0.2µl of 3% formalin (FOR) or saline
(SAL) in the region underlying the adipose fin, fifteen minutes after systemic injection of morphine
50mg/kg (MOR) or saline (SAL) in the following combinations: SAL + SAL (n = 7), SAL + FOR
(n = 6), MOR + SAL (n = 8) and MOR 15 + FOR (n = 7). Some fish received subcutaneous
injections of 0.2µl of 3% formalin, sixty minutes after systemic injection of morphine (MOR 60 +
FOR) (n = 6). Swimming activity was measured five minutes before (baseline) until five minutes
after the noxious stimulus and saline as its control (poststimulus).
Third phase: The fish received subcutaneous injections of 0.2µl of 3% formalin (FOR) or saline
(SAL) in the region underlying the adipose fin, ten minutes after systemic injection of naloxone
10mg/kg (NAL) in the following combinations: NAL + SAL (n = 7) and NAL + FOR (n = 8).
Swimming activity was measured five minutes before (baseline) until five minutes after the noxious
stimulus and saline as its control (poststimulus).
The animals were pretreated with naloxone 10mg/kg, 20mg/kg and 30mg/kg ten minutes before
systemic injection of morphine 50mg/kg followed five minutes later by the 0.2µl of 3% formalin
applied in the region underlying the adipose fin in the following combinations: NAL 1 + MOR +
FOR (n = 4), NAL 2 + MOR + FOR (n = 7) and NAL 3 + MOR + FOR (n = 8). Swimming activity
was measured five minutes before (baseline) until five minutes after the noxious stimulus and saline
as its control (poststimulus).
2.5.2 Experiment 3: Subcutaneous administration of capsaicin and the swimming activity.
During experiments, fish were monitored by a Sony CCD-TRV 318 video camera placed in front of
the aquarium. The experimental protocol consisted in five minutes swimming activity recording
(baseline) and five minutes recording (poststimulus) after the administration of 0.2µl of vehicle (n =
8) or capsaicin 10µg (n = 7) and 100 µg (n = 7) in the region underlying the adipose fin.
2.6. Data analysis
Data were analyzed statistically by One-way analysis of variance (ANOVA) followed by the
Student-Newman-Keuls Method with the level of significance set at p<0.05 and by the Two-way
analysis of variance (ANOVA) for repeated measures, followed by the Tukey test with the level of
significance set at p<0.05.
3. Results
3.1. Experiment 1: Opercular beat rate
The subcutaneous administration of 3% formalin induces an increase in the opercula rate which
persisted throughout the experiment and the values in each experimental time are different (p<0.05)
when compared with those of saline injected (Fig 1). The maximal effect was observed within the
first 15 minutes after formalin injection, when the increase was approximately of 45 %. In the
animals that received subcutaneous injection of 3% formalin, the values of the opercular beat in the
times 5 and 10 minutes were different to the times 35 until 60 minutes.
The subcutaneous injection of 3% formalin preceded by systemic injection of saline (SAL + FOR)
induced an increase of 58% of the opercula beat rate, which was different (q = 6.819; p<0.001) from
the increase induced by the s.c. injection of saline preceded by systemic saline (SAL + SAL). When
the s.c. injection of 3% formalin was preceded by systemic morphine 50mg/kg and 100mg/kg
(MOR + FOR) the opercular beat rate was lower and different (q = 6.767; p<0.001 and q = 6.819; p
= 0.001 respectively) than that observed in SAL + FOR injected animals but does not differ (q =
0.276; p = 0.847 and q = 1.381; p = 0.597 respectively) from the SAL + SAL group. The increase in
beat rate in the group MOR 30mg/kg + FOR was not different (q = 2.076; p = 0.152) from that
observed in the SAL + FOR group (Fig 2).
3.2. Experiment 2: Swimming activity and general behavior
After the subcutaneous injection of 3% formalin underlying the adipose fin, some fish (10%)
exhibited a loss of equilibrium that lasted several minutes and then returned to the normal position.
There were fish that showed a prolonged loss of equilibrium (even more than one hour) with a
reduction of the breathing rates. This response was more frequent in the initial phase of the work
when the concentrations and the volume of the noxious stimulus were not yet established. These
individuals were excluded from the experiments. All fish showed a local change in coloration
(approximately 1.5cm in length) after the subcutaneous administration of 3% formalin in the region
underlying the adipose fin.
When applied subcutaneously, 3% formalin induces an increase in swimming activity during all the
experiment (five minutes) in all experimental times, that was different (p<0.05) when compared
with saline injected animals (Fig 3). The effect was maximal one minute after the application of the
noxious stimulus.
The increase in locomotion induced by the nociceptive stimulus (SAL + FOR) significantly reduced
by the previous systemic injection of morphine 50mg/kg (MOR 15 + FOR and MOR 60 + FOR) (q
= 4,873; p = 0,005 and q = 4,059; p = 0,008 respectively). The delta of locomotion in the group
MOR 15 + FOR and MOR 60 + FOR was not different from that of the group in which systemic
morphine (MOR + SAL) (q = 3,120; p = 0,036 and q = 3,670; p = 0,038 respectively) or saline
(SAL + SAL) (q = 3,029; p = 0,099 and q = 3,570; p = 0,077 respectively) were applied before the
subcutaneous injection of saline in the region underlying the adipose fin (Fig 4A).
The reduction of the increase of the swimming activity induced by the noxious stimulus observed
after systemic morphine injections (MOR 15 + FOR) was not reversed in animals pretreated with
naloxone in the doses of 10mg/kg (NAL 1+ MOR + FOR) (q = 2,072; p = 0,320) and 20mg/kg
(NAL 2+ MOR + FOR) (q = 2,020; p = 0,162), but the response was blocked with the dose of 30
mg/kg (NAL 3+ MOR + FOR) (q = 5,033; p = 0,003) (Fig 4 B). The delta of locomotion in the
NAL 1 + MOR + FOR and NAL 2 + MOR + FOR group was not different from that observed in
NAL 1 + SAL treated animals (q = 0,519; p = 0,716 e q = 1,017; p = 0,754 respectively), but was
lower and different from the NAL 1 + FOR group (q = 5,124; p = 0,005 e q = 5,640; p = 0,001
respectively). The delta of locomotion in the NAL 1 + FOR was not different from the NAL 3 +
MOR + FOR (q = 1,531; p = 0,287).
3.3 Experiment 3: Subcutaneous administration of capsaicin and the swimming activity.
When applied subcutaneously, capsaicin did not induce an increase in swimming activity. The
average values of the delta of locomotion of groups capsaicin 10μg and 100μg were not different
from those observed in the vehicle group (F = 0.209, df = 2, p = 0.813) (Fig 5).
Figure 1: Temporal display of the normalized values (%) of the opercular beat rate (mean ± S.E.M)
over sixty minutes after the administration of saline (n = 7) or 3% formalin (n = 7) in the region
underlying the adipose fin in the piauçu Leporinus macrocephalus. * Denotes statistical difference
with respect to the saline group at the same time. # Denotes statistical difference in the five and ten
minutes with respect to the thirty-five until sixty experimental times in the 3% formalin injected
animals. (p<0.05) (Two Way ANOVA for repeated measures followed by Tukey post-hoc test,
p<0.05).
Figure 2: Means (± S.E.M) of normalized opercular beat rate (%) fifteen minutes after subcutaneous
injections of saline or 3% formalin in the following circumstances: after systemic injection of saline
(n = 7) (SAL + SAL) and (SAL + FOR) (n = 7); systemic injection of morphine 30mg/kg (MOR
30mg/kg + FOR) (n = 7); systemic injection of morphine 50mg/kg (MOR 50mg/kg + FOR) (n = 8);
systemic injection of morphine 100mg/kg (MOR 100mg/kg + FOR) (n = 8). Equal letters indicate
non-statistical significance and different letters indicate statistical difference. (F = 9.293, df = 4,
p<0.001; ANOVA, followed by Student-Newman-Keuls Method post-hoc test).
Figure 3: Temporal display (mean ± S.E.M) of swimming activity (delta of locomotion) after the
administration of saline (n = 8) or 3% formalin (n = 8) in the region underlying the adipose fin in
the piauçu Leporinus macrocephalus. *Denotes statistical difference with respect to the saline
group at the same time. # Denotes statistical difference in the first minute with respect to the
subsequent experimental time in the 3% formalin injected animals (p<0.05) (Two Way ANOVA for
repeated measures followed by Tukey post-hoc test, p<0.05).
Figure 4: Means (± S.E.M) of swimming activity (delta of locomotion) of piauçu. (A) Subcutaneous
injection of saline (n = 7) after fifteen minutes of systemic injection of saline (SAL + SAL);
subcutaneous injection of 3% formalin (n = 6) after fifteen minutes of systemic injection of saline
(SAL + FOR); subcutaneous injection of saline (n = 8) after fifteen minutes of systemic injection of
morphine 50mg/kg (MOR + SAL); subcutaneous injection of 3% formalin (n = 7) after fifteen
minutes of systemic injection of morphine 50mg/kg (MOR 15 + FOR); subcutaneous injection of
3% formalin (n = 6) after sixty minutes of systemic injection of morphine 50mg/kg (MOR 60 +
FOR) (F = 10,391; df = 4; p<0.001). (B) Subcutaneous injection of 3% formalin (n = 7) after
systemic injection of morphine 50mg/kg (MOR + FOR); subcutaneous injection of saline (n = 7)
after systemic injection of naloxone 10mg/kg (NAL 1 + SAL); subcutaneous injection of 3%
formalin (n = 8) after systemic injection of naloxone 10mg/kg (NAL 1 + FOR); pretreatment of
naloxone 10mg/kg followed systemic injection of morphine 50mg/kg before the subcutaneous
injection of 3% formalin (n = 4) (NAL 1 + MOR + FOR); pretreatment of naloxone 20mg/kg
followed systemic injection of morphine 50mg/kg before the subcutaneous injection of 3% formalin
(A)
(B)
(n = 7) (NAL 2 + MOR + FOR); pretreatment of naloxone 30mg/kg followed systemic injection of
morphine 50mg/kg before the subcutaneous injection of 3% formalin (n = 8) (NAL 3 + MOR +
FOR) (F = 11,150; df = 5; p<0.001). Equal letters indicates non-statistical significance and different
letters indicates statistically difference (ANOVA followed by Student-Newman-Keuls Method post-
hoc test, p<0.05).
Figure 5: Means (± S.E.M) of swimming activity (delta of locomotion) after the subcutaneous
injection of vehicle (n = 8), capsaicin 10µg (n = 7) and capsaicin 100µg (n = 7) in the region
underlying the adipose fin in the piauçu Leporinus macrocephalus (F = 0,209; df = 2; p = 0,813)
(ANOVA).
4. Discussion
The subcutaneous administration of 3% formalin induces alteration in the respiratory rate in the
piauçu Leporinus macrocephalus. The fish showed an increase in the ventilatory frequency all the
time of the experiments (sixty minutes). These results are similar to those reported by others in
some studies in fish of different species in consequence of different sorts of noxious stimulus
applied to distinct regions of the body. Sneddon (2003b) reported that the anesthetized rainbow
trout Oncorhynchus mykiss exhibited an increase of the respiratory frequency throughout the
experiment (180 min) after injection of 0.1% acetic acid in the lips. Newby and Stevens (2008),
using the same substance but in higher concentrations (2% and 5% acetic acid), demonstrated that
non-anesthetized zebra fish and rainbow trout had the same response as in the study by Sneddon
(2003b), although, the duration time was about 360 min.
This drastic enhance is analogous to respiratory change occurring in mammals and humans during a
nociceptive event (Kato et al., 2001). It can be considered a physiological response to a painful
stimulation, since a function of the respiratory system is to supply the body with sufficient amounts
of oxygen to the different types of behavior. It is natural that also the fish increase the ventilatory
frequency in order to repay the oxygen debt (Newby and Stevens, 2008). The opercular beat rate is
usually used to infer the state of physiological stress in fish and to assess fish welfare (Lucas et al.,
1993). However, changes in their magnitude often do not reflect the severity of the stimulus
(Barreto and Volpato, 2004). In addition, several other neurovegetative responses can be observed
during pain perception such as increased blood pressure, tachycardia, anxiety and psychomotor
modifications (Pimenta, 2000).
The noxious stimuli used in this work also affected the piauçu’s swimming activity. During all the
time of the experiment, fish that received 3% formalin showed an increase in the swimming activity
reflected in the enhance of the delta of locomotion, which was not observed when the animals
received the subcutaneous injection of saline. Furthermore, the first minute after application of the
noxious stimulus showed the highest values of swimming activity, demonstrating that the piauçu
responds promptly to the formalin application. In fish as in other vertebrates, the behavioral
response to a painful stimulus is provided by the increase of the movements aimed to remove the
animal of the aversive sensation (Cherchova, 1997). Swimming activity, the most general behavior
pattern of fish, involves the integrated effects of numerous physiological processes (Schreck, 1990
in apud EIFAD-European Inland Fisheries Advisory Commission, 2004). Estimation of swimming
activity can provide a sensitive index to general stress and pain in fish. The swimming activity of
fish under painful conditions, compared with that of fish not subjected to pain, is different.
Swimming into shallow water, swimming lethargically at the surface, lying listlessly on the pond or
tank bottom, floating downstream or swimming erratically can be indicators of stress or nociception
in the fish (Plumb, 1994 in apud EIFAD-European Inland Fisheries Advisory Commission, 2004).
Critical swimming speed and the length of time a certain swimming velocity can be maintained all
may be used as an indicator of pain (EIFAD-European Inland Fisheries Advisory Commission,
2004).
In this study we show the antinociceptive effect of morphine (opioid agonist) in piauçu Leporinus
macrocephalus since morphine 50mg/kg and 100mg/kg blocked the increase of ventilatory
frequency induced by the noxious stimulus. In addition, the previous systemic injection of morphine
50mg/kg also reduced the increase of the swimming activity induced by the noxious stimulus. The
doses of naloxone 10mg/kg and 20mg/kg were unable to reverse the antinociceptive effect of
morphine, but this was achieved with pretreatment of naloxone 30mg/kg.
The antinociceptive effect of morphine is already well known in mammals, especially humans; but,
few works have studied it in the fish. Jansen and Greene (1970) demonstrated that goldfish showed
an increase in the threshold of swimming response to electric shock after systemic application of
morphine and this was reversed by naloxone. Elrensing and Michell (1982) have shown that the
intracranial application of morphine in goldfish decreased agitated swimming induced by electric
shock, in a dose- dependent way. The pretreatment with the opioid antagonists naloxone and MIF-1
reversed the effect of morphine. Furthermore, changes in pain related-behavior with morphine
administration have previously been found in trout (Sneddon, 2003b).
The typical dose of morphine in rodents submitted to pain tests range from 1-5mg/kg, about 10-to-
50 fold less than the dose we use in the present work. However, the systemic administration of high
doses of morphine (10-100mg/kg) is essential to produce analgesia in amphibians (Pezzala, 1983;
Stevens, 1988; Stevens and Kirkendall, 1993). It is possible that in non-mammals like goldfish
(Jansen and Greene, 1970), lizards (Mauk et al, 1981) and chickens (30mg/kg) (Bardo and Hughes,
1978) the morphine sulfate is a weak analgesic drug requiring high doses to obtain analgesia
(Stevens and Kirkendall, 1993; Stevens, 1988). Nordgreen et al (2009) demonstrated in their
experiments that the doses of morphine 40mg/kg and 50mg/kg did not show antinociceptive effect
on thermal threshold in goldfish. Besides, morphine binds preferentially to µ opioid receptors
whose distribution is greatest in rats, intermediate in turtles and frogs, and very small in goldfish
(Stevens, 1988; Stevens, 2004).
For the experimental protocol developed in this study, the time between the injection of morphine
and the application of noxious stimulation was fifteen and sixty minutes and there were no
statistical difference in the magnitude of antinociception between these two times. According to
Newby et al (2006, 2007 and 2008), the intraperitoneal injection of 40mg/kg of morphine in the fish
Pseudopleuronectes americanus showed an analgesic effect after fifty minutes of its application.
Moreover, the maximum plasma concentration of morphine in goldfish was achieved 30 minutes
after intramuscular injection (Nordgreen et al, 2009). It is also important to emphasize that there are
considerable differences between fish species in relation to the morphine pharmacokinetics. The
clearance of morphine in the blood after intraperitoneal injection was slower in two species of fish
Pseudopleuronectes americanus and Oncorhynchus mykiss than that found in mammals. Moreover,
the pharmacokinetic data showed considerable variation between fish species (Newby et al., 2006).
The 3% formalin injection affected negatively the swimming behavior in some individuals. Some
piauçu (10%) showed loss of equilibrium before returning to normal swimming, which was
identified as being potentially indicative of pain. Newby and Stevens (2008) observed that nine of
16 trout that received either 2% or 5% acetic acid injection in the lips showed loss of equilibrium.
Different individuals have different pain tolerances, and this is a possible explanation for the
variability in response of the fish after the noxious stimulus application. Some fish may have had a
higher pain tolerance, or a higher nociceptive threshold than others (Newby and Stevens, 2008).
These different responses to nociception reflect species-specific differences.
Indeed, some commentators have warned for the danger of extrapolating results from different taxa
when concerned with issues of fish welfare (Huntingford et al., 2006). It is essential to use different
parameters to assess fish welfare and this should be dependent upon species (Reilly et al., 2008).
Nociceptive indicators should be developed by examining the variety of fish species due the
interspecifics and intraspecific differences.
The major works of nociception in fish used the acetic acid as the noxious stimulus and the lips to
its application. (Newby and Stevens, 2008; Sneddon, 2003b). The studies in the piauçu Leporinus
macrocephalus demonstrated that the formalin test is a good experimental model for research on
nociception. In addition, the opercular beat rate and swimming activity are useful parameters to
quantify it in fish. Formalin test is a standard persistent pain test in animals like rats, cats and
primates (Culman et al., 1997). The region underlying the adipose fin was chosen for the 3%
formalin injection since it has an area with great concentration of nociceptors. Fish possess a
developed system of pain sensitivity with nociceptors present on the whole body (Chervova et al.,
2000). The most sensitive to noxious stimuli in the species studied in this work were the blade of
the caudal fin, dorsal and pectoral fins, skin around eyes and the epithelium of olfactory sac
(Chervova et al., 1997). The high density of nociceptors on fins is likely to be related to the fact that
fins are damaged in fish during the nest-building activity or aggressive interactions (Lorenz, 1984 in
apud Chervova et al., 1997).
However, fish that received a subcutaneous injection of different concentrations of capsaicin (10µg
and 100µg) in the region underlying the adipose fin, did not respond to this noxious stimulus. The
animals showed any change in the swimming activity, indicating that they are possible insensitive
to the capsaicin. The concentrations used in this study are higher than those usually used for mice
and rats. Avian and amphibian are also insensitive to this noxious stimulus (Jordt and Julius, 2002,
Hawkins et al, 1999). Thus it appears that the capacity to detected capsaicin is a recent acquisition
of mammalian vanilloid receptors (Jordt and Julius, 2002). During the course of evolution, the
selective pressure may have favored the establishment of distinct ecological niches between species.
Mammals, as potential consumers of the pepper plant, are repelled by it, while the avian are favored
as vectors for seed dispersal (Tewksburry and Nabhan, 2001). Fish are neither consumer nor seed
dispersal of natural pepper plant. So perhaps these animals have not developed a specialized system
to detect the capsaicin.
The negative effects of a noxious experience are complex, suggesting that higher processing is
involved and thus there is a potential for pain perception. In piauçu Leporinus macrocephalus the
behaviors and neurovegetative responses are affected by noxious stimulation, indicating that these
animals can perceive and react to it as some authors suggest (Braithwaite et al, 2004; Braithwaite
and Boulcott, 2007; Newby and Stevens, 2008; Sneddon, 2004, 2003a, 2003b, 2003c). The pain is
essential for the survival of individuals in a potentially hostile environment. It is an alarm system
activated in response to injury to the body. Evolutionarily, the pain has an important protective
function, since it informs about the external and internal conditions of the animal.
Our results indicate that the alterations in the respiratory and locomotor pattern are not merely
reflex responses, since it is possible to reverse these behaviors by the administration of an analgesic.
With respect to the occurrence of pain in fish, the opinions are controversial. Rose (2002) proposed
that the cortical regions, essential for human pain experience, are not present in the brain of fish,
and therefore, the pain experience is not possible. For others, the presence of a neocortex may not
necessarily be a prerequisite for the perception of pain (Braithwaite and Boulcott, 2007; Newby and
Stevens, 2008; Sneddon, 2004, 2003a, 2003b, 2003c). It is therefore possible that parts of the brain
others than the cerebral cortex have evolved the capacity for generating negative emotional states or
suffering in non-mammalian vertebrates, including fish (EIFAD-European Inland Fisheries
Advisory Commission, 2004).
5. Conclusion
The processing of the nociceptive information is a consistent feature of the nervous system in all
vertebrates groups, including fish. However, the capacity of non-mammalians to experiencing pain
is still in debate, since "pain" is a conscious perception and it is not known if nonhumans have the
capacity for awareness that may be needed for the pain perception to exist. In the present study the
ventilatory frequency and the swimming activity increase after the 3% formalin injection, indicating
that the piauçu respond in a non reflexive way to the painful stimulation, in view of the fact that,
these responses can be blocked by the use of analgesics. Our data suggest that the formalin test can
be used as a workable model and the ventilatory frequency and swimming activity are reliable
parameters for evaluation of nociception. But, it is necessary to study this new methodology in
other species of fish in different experimental paradigms to propose it as a universal test.
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