( PDF ) Seleção e caracterização de peptídeos miméticos a proteínas tumorais no estadiamento clínico-patológico do câncer de próstata

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

FACULDADE DE MEDICINA

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS A

PROTEÍNAS TUMORAIS NO ESTADIAMENTO CLÍNICO-PATOLÓGICO

DO CÂNCER DE PRÓSTATA

Patrícia Tieme Fujimura

Uberlândia – MG

2010

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Patrícia Tieme Fujimura

SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS A

PROTEÍNAS TUMORAIS NO ESTADIAMENTO CLÍNICO-PATOLÓGICO

DO CÂNCER DE PRÓSTATA

Orientador: Carlos Ueira Vieira

Co-orientador: Luiz Ricardo Goulart

Uberlândia – MG

2010

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Uberlândia como requisito

parcial para obtenção do Título de Mestre

em Ciências da Saúde (Área Genética

Molecular).

Orientador: Prof. Dr. Carlos Ueira

Vieria

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III

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

FACULDADE DE MEDICINA

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS MIMÉTICOS A

PROTEÍNAS TUMORAIS NO ESTADIAMENTO CLÍNICO-PATOLÓGICO

DO CÂNCER DE PRÓSTATA

Patrícia Tieme Fujimura

Comissão Examinadora:

Orientador: Prof. Dr. Carlos Ueira Vieira

Examinadores Titulares: Dr. Guilherme Lino Rocha de Souza (UFG)

Dra. Cristiana Soares de Sousa (FUCAMP)

Dra. Maria Aparecida de Souza (UFU)

Data da Defesa: 23/02/2010

As sugestões da Comissão Examinadora e as Normas PGCS para o formato da

dissertação foram contempladas.

________________________________

Prof. Dr. Carlos Ueira Vieira

Uberlândia, 23/02

Uberlândia – MG

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

F961s

Fujimura, Patrícia Tieme, 1981-

Seleção e caracterização de peptídeos miméticos a proteínas tumo-

rais no estadiamento clínico-patológico do câncer de próstata [manus-

crito] / Patrícia Tieme Fujimura. - 2010.

95 f. : il.

Orientador: Carlos Ueira Vieira.

Co-orientador: Luiz Ricardo Goulart.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia, Progra-

ma de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

Inclui bibliografia.

1.1 1. Próstata - Câncer - Teses. 2. Peptídios - Teses. I. Vieira, Carlos

Ueira. II. Goulart Filho, Luiz Ricardo, 1962- . III. Universidade Federal

2.1 de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. IV.

Título.

CDU: 616.65-006.6

Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação

DEDICATÓRIA

Gostaria de dedicar, em especial, meus

esforços e a minha a pesquisa:

aos meus pais e ao meu irmão, que sempre

me apoiaram e tiveram presentes no meu

crescimento pessoal, me ensinando a ser um

bom profissional; e a cima de tudo a ser

humano, paciente e sábio

ao Carlos Henrique Baziza, que sempre

esteve do meu lado dando apoio,

principalmente, nos momentos difíceis;

aos pacientes, que doam parte de si para a

realização dessa pesquisa e, finalmente,

às pessoas que acreditaram em mim,

enquanto pesquisadora, para a realização

desse projeto.

O sorriso é o caminho

para a

porta da felicidade

Morisada Fujimura

VII

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Dr. Carlos Ueira, pela oportunidade,

confiança, e, principalmente, pelo exemplo de dedicação e de

vontade de fazer pesquisa;

Ao meu co-orinetador Luiz Ricardo Goulart, que me apoiou e

me disponibilizou o laboratório para a realização desta

pesquisa

Às minhas amigas, Carol Reis, Ana Paula Carneiro, Carol

Siqueroli, Juliana Franco, Fabys e Thaíse pelo carinho e pela

ajuda nos momentos difíceis da pesquisa;

Yara Cristina P. Maia, pela bela amizade e por ser

sempre paciente, graciosa e delicada comigo;

Ao Xiton, Rafael, Galber e Rone Cardoso, pela

amizade e carinho;

Ao Fausto Capparelli, pela amizade sincera e pela força

em momentos de fraqueza;

A Ângela Sena pela amizade, carinho, mas

principalmente, por ter doado parte de seu tempo para a

conclusão desse trabalho;

A todos os meus amigos de laboratório que me

proporcionaram momentos de alegria e distração;

Ao CNPQ que financiou esta pesquisa;

A UFU por oferecer um ensino e pesquisa de qualidade;

VIII

RESUMO

O câncer de próstata (CaP) tem sido considerado a segunda causa de óbitos por

tumor em homens, sendo superado apenas pelo câncer de pulmão. A investigação

clínica do CaP baseia-se no exame físico, através do toque retal, na ultrassonografia

transretal e no exame sorológico do PSA. No entanto, devido a altas taxas de falso-

positivo associado à hiperplasia benigna da próstata (HPB), têm estimulado muitos

pesquisadores a identificar novos antígenos ou genes específicos do câncer de próstata,

a estudar o reconhecimento molecular em câncer, além de buscar ferramentas

inovadoras de diagnósticos e prognósticos, que ao serem associados aos novos

biomarcadores, promovem o desenvolvimento de plataforma de detecção mais rápido

que auxilie a conduta clínica a terapias específicas. Neste trabalho, foram isolados

peptídeos reconhecidos por anticorpos purificados a partir do soro de pacientes com

câncer de próstata por meio da metodologia de Phage Display, e padronizou-se o

acoplamento dos fagos às microesferas para o desenvolvimento de uma plataforma de

diagnóstico. Para seleção dos peptídeos foi realizado um bioppaning subtrativo, seguida

de uma seleção positiva utilizando uma biblioteca de peptídeos Ph.D.-C7C expressa na

superfície do fago filamentoso M13. O DNA dos clones selecionados foi seqüenciado,

traduzido, e os diversos clones foram submetidos aos ensaios de ELISA e

bioinformática. A análise das seqüências de clones selecionados apresentou um motivo

comum FPWL os quais relacionavam com o estadiamento do tumor pT1 e pT2, e

especificamente com câncer associado à neoplasia intra-epitelial prostática. Um clone

com a seqüência diferente reconheceu as imunoglobulinas presente no estadiamento T4

nenhum para pT3. Em relação à bioinformática, o consenso gerado pelos peptídeos mais

reativos alinhou-se as proteínas do envelope do capsídeo viral do endovírus humano

(HERV), reforçando as hipóteses que infecção viral associado à inflamação pode estar

relacionada aos processos de tumorigênese. Já para o procedimento de acoplamento dos

clones nas microesferas utilizou-se diferentes tampões em diversos pHs, e verificou que

a conjugação foi eficiente, exceto para o tampão Fosfato de sódio 1,2M pH 10,2. Dessa

forma, explorar a resposta humoral diferencial (autoanticorpos) do câncer associado à

metodologia de Phage Display, pode nos fornecer potenciais alvos de tumorais, que

podem ser utilizados em diagnóstico, prognóstico e terapêutica da doença. Além disso,

o desenvolvimento de uma de metodologias novas de diagnóstico pode fornecer

resultados mais rápidos e com menor custo.

Palavras chaves: Phage Display, marcadores tumorais, etiologia do câncer,

microsesferas e plataformas de diagnósticos.

ABSTRACT

Prostate cancer is the second cause of deaths by tumor in men, surpassed only to lung

cancer. Currently, PSA (prostate-specific antigen) is clinical test of choice for PCa

detection and treatment. However, the limitations of the PSA test such as large number

of false positive results and unnecessary biopsies indicate the need for other means of

screening for this neoplasm. Identification of new genes or antigens specific for prostate

cancer, study of molecular recognition, and innovation in cancer diagnostics, can

provide the development of new biomarkers, specific therapies, as well as provide faster

diagnostic to assist doctors. This work was performed a screening method based on

phage display to select peptides recognized by the repertoire of circulating tumor-

associated antibodies and standardized the coupling of the phages to microspheres for

the development of a diagnostic platform to obtain or biomarkers in the discovery of

new etiologies for the tumor. We isolated peptides recognized by purified antibodies

from serum of prostate cancer patients. For selection of peptides was performed a

subtractive bioppaning, followed by positive selection using a library of peptides Ph.D.-

C7C expressed on the surface of filamentous phage M13. The DNA from selected

phages was sequenced, translated, and the various clones were subjected to ELISA

assays and bioinformatics. Analysis of the sequences of selected clones had a common

reason FPWL, which were linked with tumor staging pT1 and pT2, and specifically to

cancer associated with prostatic intraepithelial neoplasia. One clone with a different

sequence recognized the tumor staging pT4 and none for pT3. Procedure for the

coupling of the phages used in the microspheres is different in different pH buffers and

found that the combination was effective, except for the sodium phosphate buffer 1.2 M

pH 10.2. Exploiting the differential humoral response to cancer through may identify

molecular markers and targets for diagnostic and therapeutic intervention. Furthermore,

the development of a new diagnostic methods can provide results faster and with less

cost.

Key words: Phage Display, tumor markers, cancer etiology, immunomagnetic beads,

diagnostic platforms.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AIP- Atrofia inflamatória proliferativa

BLASTp – (Basic Local Alignment Search Tool), programa de busca por alinhamento.

BSA- (Bovine Serum Albumin), Soro Albumina Bovina

CEP/UFU- Cômite de Ética e Pesquisa da UFU

cDNA- DNA complementar

CaP- câncer de próstata

DAB- 3-3’ – (diaminobenzidine tetrahydrochloride), tetrahidrocloreto diaminobenzidina

DNA- Ácido desoribonucléico

DNA2PRO- Programa do RELIC destinado a tradução do DNA

ELISA- (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), Imunoensaio enzimático

EUA- Estados Unidos da América

HC- Hospital das Clínicas

HE- Hematoxilina e eosina

HPB- Hiplerplasia beningna da próstata

HRP- (Horse radish peroxidase), marcação com peroxidase

INCA- Instituto Nacional do Câncer

IPTG- (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)

LB- Meio de cultura Luria-Bertani

MOTIF2- Programa disponível no RELIC para busca de motivos

NEG- Negativo

NIP- neoplasia intra-epitelial prostática

OD- Densidade ótica

OPD- Orto-fenilenodiamina

pIII- Proteína três do capsídeo do fago

pVI- Proteína seis do capsídeo do fago

pVII- Proteína sete do capsídeo do fago

pVIII- Proteína oito do capsídeo do fago

pIX – Proteína nove do capsídeo do fago

PBS- Tampão fosfato salino

pH- Potencial Hidrogeniônico

Ph.D.- C7C- Biblioteca comercial de Phage Display de 7 aminoácidos conformacionais

RELIC- (Receptor Ligands Contacts), site com programas disponíveis on-line para análise

de seqüências peptídicas

SEL- selvagem

T.A- Temperatura ambiente

TNM- Estadiamento: Tamanho do tumor (T); acometimento de nódulos (N); metástase à

distância (M)

TBS- Tampão Tris-Nacl

TBST Tampão Tris-Nacl com tween 20

UFU- Universidade Federal de Uberlândia

UNIPROT- (Universal Protein Resource)

XGal- 5-Bromo-4-cloro-3indolil- α-D-galactosídeo

XII

LISTA DE NOTAÇÕES

°C- Graus Celsius

dL- decilitro

g- gramas

M- Molar

mcg- micrograma

mg- miligrama

mim- minuto

mL- mililitro

mM- milimolar

mUI- miliunidades

N- normal

ng- nanogramas

pmol- picomol

rpm- rotações por minuto

μL- microlitro

μm- micrometro

XIII

Lista de Aminácidos:

Alanina

Ala

Arginina

Arg

Asparagina

Asn

Ácido aspártico

Asp

Cisteína

Cis

Ácido glutâmico

Glu

Glutamina

Gln

Glicina

Gly

Histidina

His

Isoleucina

Ile

Leucina

Leu

Lisina

Lys

Metionina

Met

Fenilalanina

Fen

Prolina

Pro

Serina

Ser

Treonina

Thr

Triptofano

Trp

Tirosina

Tyr

Valina

Val

XIV

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Fago filamentoso................................................................................................8

Figura 2. Ataque nucleofílico de amino primário ou secundário a microesfera

magnética.........................................................................................................................11

Figura 3. Estratégia para identificação de epítopos tumorais antigênicos usando

biblioteca de peptídeo randômico por Phage Display.....................................................20

Figura 4. Ensaio de beads-ELISA para o acoplamento de IgGs.....................................31

Figura 5. Ensaio de beads-ELISA para o teste de enriquecimento.................................33

Figura 6. Painel de pré-validação dos clones reconhecidos por IgG de pacientes com

CaP em diferentes estadiamento......................................................................................36

Figura 7. Análise do primeiro grupo de clones selecionados especificamente pelos

anticorpos dos diferentes tipos de pool de soro de pT1, pT2, pT3, pT4 de pacientes.....37

Figura 8. Análise de clones selecionados especificamente pelos anticorpos dos

diferentes tipos de pool de soro de pT1, pT2, pT3, pT4 de pacientes.............................38

Figura 9. Análise de clones selecionados especificamente pelos anticorpos dos

diferentes tipos de pool de soro de pT1, pT2, pT3, pT4 de pacientes.............................39

Figura 10. Ensaio de Beads-ELISA,com fagos e BSA acoplado nas microesferas........44

Figura 11. Teste de bloqueio da pIII...............................................................................45

LISTA DE TABELAS

Tabela I. Caracterização clínica das amostras utilizadas.................................................17

Tabela II. Relação do tipo e da quantidade dos tampões utilizados versus o teste de

acoplamento do fago selecionado (F1 - CaP)..................................................................28

Tabela III. Seleção dos fagos com peptídeos ligantes aos anticorpos policlonais IgG

anti-CaP. Título obtido (pfu) no processo de seleção dos fagos por imunoafinidade.....32

Tabela IV. Freqüência dos clones de fagos seqüenciados em diferentes

estadiamentos...................................................................................................................34

Tabela V. Alinhamento dos peptídeos selecionados pelo Programa clustalW................40

Tabela VI. Alinhamento das seqüências consenso dos peptídeos selecionados,

mostrando as similaridades encontradas com as proteínas anotadas no banco de dados

do GeneBank pelo BLAST, com os números de acesso no Swissprot, e sua regiões de

prováveis epítopos antigênicos lineares feita de acordo com o programa

Bepipred...........................................................................................................................41

Tabela VII. Freqüência de pacientes positivos para o teste de ELISA sobre o valor total

de pacientes diagnosticado nos três clones......................................................................42

Tabela VIII. Comparação de dados estatísticos epidemiológicos entre o CaP geral e CaP

associado ao NIP.............................................................................................................43

Tabela IX. Quantificação dos beads em Câmara de Neubauer........................................44

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................1

1.1 Epidemiologia e etiologia do câncer de próstata................................................2

1.2 Aspectos Imunológicos.......................................................................................3

1.3 Aspectos moleculares.........................................................................................4

1.4 Detecção do câncer e Phage display...................................................................6

1.5 Plataforma tecnológica.......................................................................................9

2 OBJETIVO..........................................................................................................13

2.1 Objetivos Gerais...............................................................................................14

2.2 Objetivos Específicos.......................................................................................14

3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................15

3.1 Obtenção das amostras e seleção das amostras................................................16

3.2 Acoplamento das IgGs nas microesferas proteína G........................................18

3.3 Seleção dos peptídeos recombinantes...............................................................19

3.3.1 Biopanning (Seleção de Fagos).....................................................................19

3.3.2 Titulações.......................................................................................................21

3.3.3 Análise de enriquecimento do panning: Teste Bead-ELISA.........................22

3.3.4 Extração de DNA de Fagos...........................................................................22

3.3.5 Sequenciamento.............................................................................................23

3.3.6 Pré-screening Phage-ELISA.........................................................................24

3.3.7 Screening dos fagos escolhidos com soros de pT1, pT2, pT3, pT4.............24

3.3.8 Análise de dados pela Bioinformática...........................................................25

3.3.9 Screening dos fagos escolhidos com soros individuais.................................26

3.4 Desenvolvimento de uma plataforma de diagnóstico.......................................27

3.4.1 Avaliação dos diferentes tampões para o teste de acoplamento....................27

3.4.2 Teste de Bead-ELISA : Certificação do acoplamento...................................28

3.4.3 Teste de Bloqueio da Região da pIII.............................................................29

3.5 Análise estatística.............................................................................................29

4 RESULTADOS...................................................................................................30

4.1 Acoplamento das IgGs nas microesferas proteína G........................................31

4.2 Seleção de peptídeos recombinantes................................................................31

4.2.1 Biopanning e Titulações................................................................................31

4.2.2 Análise do Enriquecimento: Teste Bead-ELISA...........................................33

4.2.3 Extração de DNA e Seqüenciamento dos Clones de Fagos..........................33

4.2.4 Pré-Validação de Mimetopos por Phage-ELISA..........................................35

4.2.5 Screening dos Fagos Selecionados com Soros de pT1, pT2, pT3, pT4........37

4.2.6 Bioinformática...............................................................................................40

4.2.7 Screening dos fagos escolhidos com soros individuais.................................42

4.3 Padronização da plataforma biotecnológica.....................................................43

4.3.1 Quantificação dos Beads na Câmara de Neubauer e Teste de Bead-ELISA

para a certificação do acoplamento.........................................................................43

4.3.2 Teste de bloqueio da pIII...............................................................................45

5 DISCUSSÃO.......................................................................................................46

6 CONCLUSÕES...................................................................................................54

7 REFERENCIAS...................................................................................................56

ANEXOS................................................................................................................76

________________________________1. INTRODUÇÃO

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

1.1Epidemiologia e etiologia do câncer de próstata

O câncer tem sido considerado um problema de saúde publica tanto em países

desenvolvidos como em países em desenvolvimento. De acordo com os dados da

American Cancer Society ocorreram mais de 12 milhões de casos novos em todo

mundo no ano de 2007, sendo que 5,4 milhões ocorreram em países economicamente

desenvolvidos e 6,7 milhões em países emergentes.

Em especial, o câncer de próstata, também conhecido como doença de idosos

(BRAWLEY, ANKERST, THOMPSON, 2009), é o tumor não-epitelial mais

comumente diagnosticado nos homens americanos (JEMAL, SIEGEL, WARD, et al,

2009). Em 2006, o câncer de próstata representou cerca de 20% dos cânceres não

cutâneo detectados em homens europeus, colocando-o no topo da lista dos cânceres

diagnosticados (FERLAY, AUTIER, BONIOL, et al, 2007). Estimou-se que, em

2009, 192.280 americanos iriam ser diagnosticados com câncer de próstata, e mais de

27.000 homens iriam morrer dessa doença, tornando-a o segundo causador de morte

por câncer em homens (JEMAL, SIEGEL, WARD, et al, 2009). No Brasil, esta

doença é a segunda patologia mais comum entre os homens, estimando cerca de

52.350 novos casos para 2010 (INCA, 2010).

Em relação à etiologia do câncer de próstata, esta permanece obscura e seus

tumores variam desde a forma indolente, com baixas taxas de evolução, para forma

extremamente agressiva, com rápidas taxas de crescimento (GIMBA, BARCINSKI,

2003). Algumas causas multifatoriais, tais como a interação entre fatores genéticos,

andrógenos (hormonais), alimentares e ambientais, podem estar relacionadas com o

desenvolvimento do tumor. Dentre os fatores de risco que amplamente associam ao

CaP estão a idade, etnia, a dieta e o estilo de vida (KLEIN, SILVERMAN, 2008).

Além disso, estudos epidemiológicos têm demonstrado aumento de risco ao

desenvolvimento do tumor associada às infecções sexualmente transmissíveis,

sugerindo que a inflamação pode estar relacionada com etiologia do câncer de

próstata, já que células produzem numerosas substâncias oxidantes com potencial de

causar dano celular ou genômico na próstata. Estudos mais recentes relatam que, as

contribuições sobre conhecimento da malignância de agentes infecciosos, como

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

bactérias e vírus, tem sido útil na compreensão de como os processos celulares básicos

culminam no câncer (DENNIS et al, 2002; HAYES et al, 2000; PAGANO et al, 2004;

EISERICH et al, 1998).

1.2 Aspectos Imunológicos

Existem evidências que os diversos tipos de cânceres, como coloretal

(COOMBER, WARD, 2001), de testículo e próstata (FOSSA et al, 2004), pulmão

(BAZHIN et al, 2004; YAGIHASHI et al, 2005a), mama (MADRID, 2005;

YAGIHASHI et al, 2005b; CANELLE et al, 2006), carcinoma hepatocelular

(COVINI et al, 1997), melanoma (HOUGHTON et al, 2001) e cânceres ginecológicos

(KORNEEVA et al, 2000) têm a capacidade de estimular resposta imune humoral. E a

melhor compreensão do significado biológico dessa resposta pode ser benéfica para

pacientes com cânceres, já que poderiam ser utilizados nos diagnóstico ou

classificação do tumor, no potencial terapêutico ou no uso no tratamento da doença

(FORRESTER et al, 2007). Além disso, o estudo da autoimunidade associada ao

tumor pode oferecer esclarecimentos não apenas na patogênese de doenças

autoimunes em geral, mas talvez até em eventos que direcionam alguns tipos de

cânceres (TAN, 2001).

Pesquisas têm mostrado que o sistema imunológico pode ser eliciado por duas

vias, sendo a primeira em resposta contra os antígenos associados ao tumor (TAA), e a

segunda contra os antígenos específicos ao tumor (TSA) (FINN, 2008). Esses

antígenos tumorais, geralmente, são modificações na estrutura ou expressão de

proteínas próprias, as quais permitem o reconhecimento de epítopos associados a

tumores como estranhos (TAN, 2001).

O reconhecimento imunológico inicia-se quando pequenas quantidades de

antígenos tumorais, produzido pelos cânceres, são capturadas e processadas pelas

células apresentadoras de antígeno (APCs). Os fragmentos processados do antígeno

tumoral ligam-se às fendas de ligação dos peptídeos das moléculas do complexo

principal de histocompatibilidade (MHC) e este complexo de antígeno/MHC são

expressos na superfície das APCs. O complexo interage com o receptor de células T

auxiliares, permitindo uma resposta imune direcional a uma proteína específica, ao se

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

multiplicar e diferenciar-se. Além disso, as células T auxiliares antígeno específico

têm a capacidade de estimular os linfócitos B a se proliferarem e diferenciarem, pela

interação de moléculas co-estimulatórias (CD40 e CD40L) e citocinas. Uma vez

ativadas, as células B específicas, podem produzir e liberar autoanticorpos circulantes,

os quais podem servir como repórteres para identificar aberrações nos mecanismos

celulares durante a tumorigênese (WANG, 2008 e ABBAS, 2005).

A presença de autoanticorpos no soro de pacientes com câncer tem sido relatada

em infinidade de trabalhos tais como autoanticorpos contra p53 (CRAWFORD et al,

1982; COOMBER, WARD, 2001), fator de crescimento de fibroblasto (ZIMERING,

THAKKER-VARIA 2002), proteínas ribossomais (SCHEURLE, 2000), proteínas

heat shock (KORNEEVA et al, 2000), α-metilacetil CoA (SREEKUMAR et al, 2004),

mucina (VON MENSDORFF-POUILLY et al 2000), proteína HER2 (DISIS et al,

1997), estas duas últimas envolvidas na inibição da progressão tumoral. Em especial,

para câncer de próstata, vários trabalhos têm sido publicados (MINTZ et al, 2003,

FOSSA et al, 2004, WANG et al, 2005, BRADFORD et al, 2006, DUNPHY et al,

2006, LARSSON et al, 2006). Em 2006, Bradford et al. apresentaram um perfil

protéico aparentemente superior ao PSA após a seleção de 22 peptídeos sintéticos

imunorreativos contra autoanticorpos do soro de pacientes com câncer de próstata

com sensibilidade de 81.6% e especificidade de 88.2%. Assim, a detecção de

autoanticorpos no soro de pacientes com CaP pode fornecer uma forma menos

invasiva e mais precisa de diagnóstico, além de novas abordagens terapêuticas, como

por exemplo, o uso de triagem de autoanticorpos (CASIANO et al, 2006).

1.3 Aspectos moleculares

Estudos têm mostrado que há existência de mais de 100 tipos de cânceres e

diversos subtipos, sendo que a maioria deles ou, praticamente todos, compartilham

alterações essenciais na fisiologia celular ou nas múltiplas vias que, em conjunto,

ditam o crescimento tumoral. Dentre as alterações que ocorrem têm-se a auto-

suficiência em sinais de crescimento, insensibilidade aos sinais de inibição de

crescimento, evasão a apoptose, potencial ilimitado de replicação, autonomia

angiogênica e capacidade para invadir tecidos e produzir metástases (HANAHAN,

WEINBERG, 2000).

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

O câncer de próstata é originado por aberrações genéticas que inativam genes

supressores de tumor e ativam proto-oncogenes (PORKKA, VISAKORPI, 2004).

Estas alterações desorganizam a homeostase tissular por aumentar desregradamente à

divisão celular ou por diminuir a apoptose, causando o aparecimento dos tumores

(GATTAS, 2003). A maioria das mutações é adquirida ao longo do desenvolvimento

do câncer (mecanismo da tumorigêneses), no entanto, algumas podem ser herdadas,

resultando na predisposição da patologia (PORKKA, VISAKORPI, 2004).

Por muito tempo atribuiu-se a origem do tumor prostático como determinada

apenas pela estimulação hormonal da testosterona, porém, atualmente se sabe que o

desenvolvimento tumoral é também regido por componentes genéticos e ambientais

(NWOSU et al, 2001), sendo em 10% dos casos por transmissão hereditária e os

demais por alterações genéticas esporádicas (GATTAS, 2003). Além disso, pesquisas

têm sugerido que a atrofia inflamatória da próstata (AIP) e a neoplasia intraepitelial

prostática (NIP) de alto grau sejam precursores para muitos carcinomas prostáticos, já

que são altamente freqüentes nas próstatas com adenocarcinoma e por apresentarem

alterações genéticas em comum. Por essas e outras características, a NIP tem sido

relatada como doença precursora do CaP, entretanto, nenhuma evidencia convincente

tem mostrado ser a AIP um precursor para a NIP de alto grau e/ou carcinogênese

(BOSTWICK, 1999; JARMULOWICZ, 1999; DE MARZO et al. 2001).

Muitos esforços têm sido destinados ao melhor entendimento dos complexos

mecanismos moleculares envolvidos na ontogênese e progressão do CaP (GIMBA,

BARCINSKI, 2003) Além disso, a presença de modificações moleculares e e

moléculas alvo interessantes têm sido associadas à progressão do tumor prostático e

ao desenvolvimento de resistência a terapia (CAVARRETTA et al, 2005). Os métodos

que são usados para caracterizar as aberrações genéticas encontradas nessa doença

neoplásica incluem estudos familiares designados a mapear loci hereditários, estudos

cromossomais para a identificação de anomalias que possam localizar oncogenes ou

supressores de tumor e diversos estudos de expressão gênica (LI, NELSON, 2001;

KARAN et al, 2003).

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

Marcadores biológicos têm sido de grande importância para o diagnóstico e

tratamento do CaP por mais de 50 anos e a identificação de novos genes e novos

produtos envolvidos no processo tumoral tem crescido rapidamente. Novos produtos

gênicos têm sido identificados no sangue de pacientes com câncer de próstata por

técnicas proteômicas (BOK, SMALL, 2002). Proteínas biomarcadores presente no

soro oferecem grande promessa para detecção não invasiva, para a classificação, bem

como para o estadiamento do câncer de próstata. Arranjos de anticorpos parecem ser

adequados para a descoberta de marcadores sorológicos, pela possibilidade de

comparação da abundância relativa de centenas de proteínas (GIMBA, BARCINSKI,

2003).

1.4 Detecção do câncer e Phage display

Atualmente, o PSA (antígeno prostático-específico) é o teste clínico de escolha

para a detecção e prognóstico CaP. No entanto, as limitações do PSA, vinculado ao

excesso de resultados falso-positivos principalmente relacionados à hiperplasia

prostática benigna (HPB), indicam a necessidade de outros meios de rastreio para esta

neoplasia (BANEZ et al, 2003; FORD et al, 2005). HPB caracteriza-se por aumento

notório do componente acinar prostático em relação aos componentes intersticial e

capsular, acarretando, por conseqüência, aumento volumétrico da próstata. Esse

aumento benigno ocorre sempre após os 35 anos de idade, sendo responsável por

vários sintomas do trato urinário inferior em homens (STAMEY, MCNEIL, 1992;

CATALONA et al., 2002; KRUMHOLTZ et al., 2002; CATALONA, 2004). Câncer

de próstata e HPB, apesar de conferirem risco e prognósticos bastante diferentes aos

pacientes, incidem sobre a mesma faixa etária. A neoplasia prostática, em estágios

iniciais, apresenta alterações clínicas e laboratoriais semelhantes à hiperplasia

benigna, dificultando o diagnóstico preciso no caso de ambas as doenças coexistirem.

Esses fatos dificultam sensivelmente a diferenciação dessas patologias

(KRUMHOLTZ et al., 2002; CATALONA, 2004).

Além da dosagem do PSA, compõe ainda o rastreamento das anomalias prostáticas

o exame físico da próstata (toque retal), sendo que o diagnóstico final tanto do CaP

quanto da HPB são obtidos pelo exame patológico do material da biopsia da próstata.

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

O estadiamento (TNM- anexo I) é o desfecho mais utilizados em estudos sobre fatores

prognósticos clínicos em câncer de próstata. No entanto, o estadiamento clínico,

baseado em grande parte no toque retal, possui importantes limitações. Já o

estadimento patológico é realizado a partir da biopsia, sendo que este exame físico é

recomendado para todo paciente com toque retal duvidoso, independentemente do

valor do PSA, já que 25% dos homens com CaP apresentam níveis de PSA abaixo do

suspeito (ARAGÃO, 2003). No entanto, a biopsia é um exame invasivo, com riscos de

infecção e extremamente desagradável para o paciente.

A identificação de novos antígenos ou genes específicos do câncer de próstata

pode prover novos biomarcadores e também fornecer instrumentos para o

desenvolvimento de novas modalidades de tratamento (BUSSEMARKERS et al.

1999), já que biomarcadores protéicos proporcionaram um grande impacto sobre

tratamento clínico de doenças humanas, especialmente câncer (WHITEAKER, 2007).

Peptídeos selecionados por Phage Display têm grande potencial para serem

utilizados como marcadores de tumores prostáticos e em diagnóstico do câncer de

próstata (LEINONEN et al. 2000). Essa metodologia consiste no princípio de que

polipeptídeos podem ser expressos na superfície de bacteriófagos filamentosos pela

inserção de um segmento de DNA codificante no genoma dos mesmos, de modo que o

peptídeo ou proteína expressado fique exposto na superfície da partícula viral

fusionado a uma proteína endógena, pIII ou pVIII conforme a Figura 1(BARBAS et

al, 2001).

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

Figura 1. Fago filamentoso. A) Composição do gene III, mostrando o sítio de ligação de

clonagem para introdução do gene adicional; B) Partícula viral com as proteínas pIII, pVI, pVII, pVIII

e pXI; C) Cristalografia dos domínios D1 e D2 da proteína III (Holliger e Williams, 1999), as alfa-

hélices estão coloridas em vermelho e as fitas β em ciânico

A biblioteca combinatória de peptídeos, Phage display, emergiu como um recurso

de triagem para a identificação de peptídeos ligantes em molécula alvo. Essa

tecnologia tem sido aplicada em vários estudos tais como interações de proteína

ligante; maturação de afinidade de peptídeos ligantes isolados previamente;

mapeamento epítopo ligantes em sítios e identificação de especificidade de enzima

substrato. Além disso, apresenta grande impacto na imunologia, biologia celular,

desenvolvimento de medicamentos e outros fármacos (AZZAZY, HIGHSMTH, 2002;

OHKUBO et al 2001; WILLATS, 2002).

Vários trabalhos têm relatado a identificação de peptídeos, por Phage Display, que

mimetizam biomoléculas específicas em diversos tipos de câncer, como por exemplo,

mama (HANSEN et al, 2001a; HANSEN et al, 2001b), hepatocarcinoma (DU et al,

2006), mieloma (DYBWAD et al, 2003), fibrosarcoma (POPKOV et al, 2000),

coloretal (COOMBER E WARD, 2001), câncer gástrico (HU et al, 2006), próstata e

testículo (FOSSA et al. 2004), entre outras. As aplicações dos peptídeos expressos em

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

bacteriófagos em câncer têm sido as mais variadas, dentre elas mapeamento da

diversidade tumoral (HANSEN et AL, 2001b, DYBWAD, 2003, LIU et al, 2004) a

seleção de peptídeos que inibem metástase (HU et al, 2006); peptídeos miméticos de

oncogenes (STEPHEN, 1995; MADRID, 2005); receptores vasculares (ZURITA, et

al, 2003; ARAP et a, 2002) e peptídeos relacionados a fatores de crescimento

(CAMPA et al, 2002; HETIAN et al, 2002).

A tecnologia de Phage Display tem sido largamente empregada no estudo do

câncer de próstata (ROMANOV et al, 2001, ZURITA et al, 2004, LIU et al, 2004,

KELLY et al, 2008, CONRAD et al, 2009). Esses trabalhos têm identificado peptídeos

relacionados com marcadores e proteínas prostáticas, como receptor de andrógeno AR

(HSU et al, 2003), PSA (WU et al, 2004, FERRIEU-WEISBUCH et al, 2006)

calicreína 2 (HEKIM et al, 2006), receptor α da interleucina 11 (ZURITA et al 2004).

Dessa forma, através desta metodologia é possível à identificação de proteínas capazes

de detectar o câncer anteriormente aos métodos tradicionais, predizer o estadio atual

do tumor, além de permitir o desenvolvimento de tratamentos mais eficientes para o

câncer por meio de endereçamento vascular dos peptídeos (NILSSON et al, 2000) e de

alvos em imunoterapia (POPKOV, 2000).

1.5 Plataforma tecnológica

O desenvolvimento de ferramentas inovadoras de diagnóstico e prognóstico que

efetivamente exploram biomarcadores para a gestão dos cânceres humanos é uma

necessidade do mundo contemporâneo (CASSIANO, et al, 2006). Várias tecnologias

vêm sendo utilizadas na identificação e detecção desses biomarcadores através de

autoanticorpos como eletroforese em gel bi-dimensional (CANELLE et al 2006),

microarrays (PATWA et al, 2009), Ressonância Plasmônica de Superfície –SPR-

(AVRAMIS et al, 2009), SEREX (WANG, 2009), biossensores (CONROY et al,

2009), e Phage Display (PASSARELLA, 2009).

Melhoria nas técnicas de microtecnologia abriu novos campos na bioquímica

analítica e no desenvolvimento de plataformas de detecção. A vantagem de explorar

técnicas de microreações é o uso de pequenos volumes de reagente, menor produção

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

de resíduos tóxicos, aumento do número de análises por unidade de volume, análises

mais rápidas e por fim uma boa relação custo-eficácia (HÄRMÄ et al., 2000).

Muitos ensaios e testes de diagnósticos têm utilizado partículas de tamanho

submicron ou microesferas (beads), em substratos ou suportes como base em reações

imunológicas para diagnóstico e pesquisa. Microesferas ou beads são partículas de

polímeros esféricos de diferentes tamanhos e compostas por diversos materiais tais

como poliestireno, sílica e magnéticas, dependendo da utilização. Por apresentarem

superfícies ativadas com diversos grupamentos químicos, tornam essas partículas

adequadas para a ligação de uma infinidade de substâncias. Depois de ativadas, podem

ser preparadas para o acoplamento de ligantes. A adsorção de um ligante é um

processo em que vários fatores físico-químicos estão envolvidos. A quantidade e

modo no qual o ligante é adsorvido dependem da natureza do mesmo, das

características da superfície sólida e das condições da solução tamponante (PEULA-

GARCIA et al., 2002).

A vantagem da utilização das microesferas é que, por apresentarem uma vasta

gama de tamanhos disponíveis comercialmente, variando de nanopartículas (50 nm)

para micropartículas (até 20 μm) podem ser utilizados em investigação de imunologia

celular (beads menores - 50 nm) e quando conjugados com anticorpos separam alvos

(beads maiores - 1-5 μm), a fim de melhorar o desempenho dos testes ELISA,

reforçando a sensibilidade e diminuindo o tempo de incubação (GUNDERSEN et al.,

1992; GEHRING et al., 2004).

Em especial, as microesferas magnéticas têm sido amplamente utilizadas em

diagnósticos e pesquisa básica para captura de biomoléculas e células. Tipicamente,

exibem propriedades superparamagnéticas em que há magnetização apenas na

presença de um campo magnético, sem, contudo, permanecerem magnetizadas quando

há a remoção do mesmo, característica única das escalas nanométricas (CAMILO,

2006).

A microesfera magnética de grupamento epóxi é caracterizada como um suporte

sólido com ampla variedade de separação e de manipulação biomagnética. A

superfície hidrofílica garante excelentes habilidades de dispersão e baixas interações

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

não-específicas. Por apresentarem um pequeno tamanho (2,8 µm) e uma ampla área de

superfície (2-5 m

/g), tornando-as particularmente adequadas para isolamento de

proteínas de uma amostra, para os bioensaios e para a seleção de ligantes de afinidade

(INVITROGEN, 2008).

A reação entre o grupamento epóxi e os ligantes de afinidade em geral, como

proteínas, ácidos nucléicos e várias pequenas moléculas, tem sido aplicado com

sucesso e ocorre pela via de adição nucleofílica de amino primário ou secundário e de

grupamento sulfidril no anel do grupamento epóxi (WHEATLEY; SCHMIDT JR,

1999).

Já o acoplamento do bacteriófago M-13 nos beads ocorre na região n-terminal da

proteína do capsídeo. De acordo com Straus (2007), o bacteriófago possui

aproximadamente 60Å de diâmetro e 1-2 micrômetros de comprimento (dependendo

da cepa). O capsídeo proteico é uma concha helicoidal formada por milhares de

subunidades de ~50 resíduos idênticos, formando a principal proteína que protege o

DNA central, sendo que a parte n-terminal encontra-se para fora do capsídeo e a c-

termimal para o interior do mesmo, interagindo com o material genético. O esquema

abaixo mostra o ataque da molécula nucleofílica à microesfera:

Figura 2. Esquema ilustrativo do ataque nucleofílico de amino primário ou secundário a

microesfera magnética (Fonte: Invitrogen)

Assim, a possibilidade de desenvolver múltiplas plataformas diagnósticas através

da interação entre antígenos, selecionados por Phage Display e conjugados a

___________________________________________________________________INTRODUÇÃO

microesferas, e anticorpos séricos, pode gerar resultados com rapidez, especificidade,

sensibilidade e baixo custo, características encontradas nos sensores biológicos. A

originalidade desta proposta está apoiada associação da técnica de Phage Display a

um sistema de beads na busca da inovação e validação de testes laboratoriais para a

detecção precoce do CaP.

______________________________________2. OBJETIVOS

_____________________________________________________________________OBJETIVOS

2.1 Objetivos Gerais

O presente trabalho teve como objetivo selecionar peptídeos miméticos de

proteínas tumorais prostáticas imunorreativos contra IgGs de pacientes com câncer de

próstata nos diferentes estadiamentos clínico-patológicos através da metodologia de

Phage Display e padronizar o acoplamento entres os peptídeos selecionados e

microesferas imunomagnéticas para desenvolver uma plataforma biotecnológica.

2.2 Objetivos Específicos

• Estabelecer um serviço de vigilância junto aos setores de Urologia no Hospital

de Clínicas (UFU) para triagem dos pacientes e coleta do material biológico;

• Selecionar peptídeos miméticos a proteínas tumorais ligantes a IgGs

circulantes dos diferentes estadiamentos clínico-patológicos de CaP, por Phage

Display;

• Realizar um screening em soro para identificação de reatividade dos clones

com as amostras de pacientes com câncer em diferentes estadiamentos, doença

benigna e controle por meio da técnica de ELISA;

 Realizar o alinhamento dos peptídeos com a bioinformática

• Correlacionar o painel de marcadores selecionados com os dados clínicos dos

pacientes;

• Padronizar o acoplamento de peptídeos miméticos expressos pela pIII dos

fagos as microsferas imunomagnéticas de grupamento epóxi para desenvolver um

diagnóstico de imunoensaio, o Beads-ELISA.

________________________3. MATERIAL E MÉTODOS

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Obtenção e seleção das amostras

As amostras de câncer de próstata e controle foram coletadas no Hospital de

Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia, pela equipe médica e ambulatorial

do setor de Urologia, mediante autorização dos pacientes, os quais assinaram um

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo I). O procedimento de coleta

foi realizado no contexto da rotina do setor cirúrgico, sem causar desconforto

adicional aos pacientes. Após a coleta, as amostras (tecido e sangue) foram levadas

ao laboratório de Nanobiotecnologia da UFU, processadas, identificadas por seus

números de prontuários e armazenadas a -80°C. Este trabalho foi aprovado pelo

comitê de Ética em Pesquisa da UFU sob o processo n°005/2001 e todas as

técnicas de manipulação dos materiais biológicos seguiram normas do Código de

Ética em Pesquisa com Humanos (Resolução CNS N° 196/96).

A seleção dos pacientes deste estudo foi baseada nos seguintes critérios:

 Critérios de inclusão: foram incluídos no estudo pacientes acima de 45

anos de idade com o exame de toque retal suspeito e/ou níveis séricos de

PSA ≥ 2.5 ng/mL que foram submetidos ao rastreamento ambulatorial

realizado pelo setor de Urologia do Hospital de Clínicas da UFU, como

prostatectomia radical ou transvesical no caso de câncer e HPB. O

rastreamento também considerou esses pacientes com ou sem história

familiar de câncer de próstata. Amostras de sangue periférico foram

coletadas em tubos vacuntainerTM contendo K2EDTA 7,2 mg. Um grupo

composto por 60 indivíduos voluntários saudáveis com idade média de 22

anos (mínima de 14 e máxima de 29 anos) foi utilizado como grupo

controle nas análises em sangue periférico.

 Critérios de exclusão: foram excluídos do estudo pacientes que não

passaram pelo exame de prostectomia ou aqueles caso em que a doença não

pôde ser confirmada pelo exame clínico-patológico. No caso do grupo

controle, excluiu-se todos os homens acima de 30 anos.

Neste estudo foram utilizados 42 soros de pacientes com adenocarcinoma de

próstata (CaP) em diferentes estadiamentos; 32 soros de pacientes com hiperplasia

benigna da próstata (HPB) e 39 soros de sadios conforme a Tabela I.

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

Tabela I Caracterização clínica das amostras utilizadas

Pacientes diagnosticados clinica e/ou patologicamente com CaP

Número de pacientes

BIOPANNIG

ELISA

Idade média

Mínimo e máximo

64.1

55-76

63,2

54-75

Nível médio de PSA (ng/mL)

Mínimo e máximo (ng/mL)

10,31

2,5-24,3

11,2

2,5-22

Gleason

Porcentagem de n

amostral

Porcentagem de n

amostral

≤ 6

≥ 7

80%

20%

74%

26%

Estadiamento

Porcentagem de n

amostral

Porcentagem de n

amostral

pT1

pT2

pT3

pT4

30%

10%

18,18%

72,72%

9,09%

Pacientes diagnosticado clinica e/ou patologicamente como HPB

Número de pacientes

Idade média

Mínimo e máximo

57-76

55-73

Nível médio de PSA (ng/ml)

Mínimo e máximo (ng/mL)

22,57

2,5 – 66

21,2

2,5-36

Indivíduos controles

Número de pacientes

Idade média

Mínimo e máximo

22,94

19-30

20,3

19-30

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

3.2 Acoplamento das IgGs nas microesferas proteína G

A purificação de IgGs a partir do soro de pacientes com CaP de cada

estadiamento (pT1, pT2, pT3 e pT4), com HPB e do controle, foi feita por meio de

microesferas magnéticas (beads magnéticos) conjugadas a proteína G (Dynabeads-

Invitrogen) como plataforma.

Para cada 2x10

partículas (100ul do estoque), lavadas anteriormente três vezes

com tampão MES (0,1 M pH=5,0) para ativar as microesferas, adicionou-se 100uL

de pool de soro dos estádios do CaP (pT1, pT2, pT3 e pT4), de HPB e de controle,

seguida da incubação por 40 minutos sob agitação a temperatura ambiente (T.A).

As microesferas adsorvidas com anticorpos foram, então, lavadas novamente três

vezes com tampão MES (0,1 M pH=5,0) com a finalidade de retirar os anticorpos

não ligantes.

Para realizar a ligação covalente entre a microesfera e os anticorpos, o sistema

beads-anticorpo foi lavado duas vezes com 1ml de tampão trietanolamina (0,2M

pH=8,2) e, ressuspendido e 1mL de tampão de ligação covalente (20mM de dimetil

pimelinidato x 2HCl em tampão trietanolamina) por 30 minutos sob agitação a

T.A. A neutralização da reação da ligação covalente foi feita pela incubação do

sistema beads-anticorpos com 1mL de tampão Tris (50mM pH=7,5) por 15

minutos a temperatura ambiente. Em seguida, as miroesferas foram feitas as

lavadas com TBS-T 0,1% de tween e bloqueadas por 1hora a 37°C com a solução

de bloqueio (5% de BSA em TBS-T 0,05% de tween) e ressuspendidas em 200ul

de TBS.

Para certificar-se do acoplamento, 5ul de beads contendo IgG, dos diferentes

grupos, foram incubados por 1 hora a 37°C com anti-IgG (VH+ VL da Sigma)

humana diluído na proporção 1:5000 na solução de bloqueio e com anti-IgY na

proporção 1:5000 para o controle da reação. Após a incubação, os beads foram

lavados 3 vezes com TBS-Tween 0,1% e reveladas com substrato de

tetrametilbenzidina (TMB). A reação foi interrompida com ácido sulfúrico 2N e

efetuada a leitura a 450 nm em leitor de microplacas (Titertek Multiskan Plus, Flow

Laboratories, USA).

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

3.3 Seleção dos Peptídeos Recombinantes

3.3.1 Biopanning (Seleção de Fagos)

Foram utilizadas 10µL (1x10

partículas virais) de uma biblioteca randômica

de peptídeos fusionados em fagos (Ph.D.-C7C da NEW ENGLAND

BioLabs

Inc.), diluída em 190ul de TBS-Tween 0,1% para a seleção de ligantes de

IgG de pacientes de CaP nos quatros estadiamentos. A biblioteca é composta de 7

aminoácidos randômicos expresso na região da pIII do bacteriófagos, os quais são

flanqueados por um par de resíduos de cisteína, que quando oxidados durante a

montagem do fago formam uma ligação dissulfeto.

A seleção foi realizada com 20ul das microesferas de proteína G acopladas com

IgGs dos diferentes grupos. Para a seleção negativa, a biblioteca de Phage Display

foi incubada, por 30 minutos a T.A, com as microesferas acopladas com IgGs de

controles, e em seguida, as microesferas foram precipitadas por centrifugação e o

sobrenadante foi transferido a outro tubo contendo microsferas acopladas com IgGs

de outro grupo controle. Este procedimento foi realizado por 3 vezes com grupo

controle e 2 vezes com grupo de HPB.

Para a seleção positiva, o sobrenadante de fagos, previamente incubado com

IgGs de pacientes com HPB, foi transferido para um tubo contendo microsferas

acopladas com IgGs de pacientes com câncer do estadiamento pT1, e este foi

incubado por 30 minutos a T.A. Posteriormente, precipitou as microesferas e o

sobrenadante foi transferido para outro tubo contendo microsferas com IgG do

estadiamento pT2. As microsferas contendo o sistema beads-anticorpo do estádio

pT1 mais o fago foram lavadas 10 vezes com TBS-T 0,1%, e os fagos selecionados

foram eluídos com 500ul de glicina pH 2,0 e neutralizada com 75ul de Tris pH 9.

Esses passos foram repetidos para o estádios pT2, pT3 e pT4, conforme a Figura 3.

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

Figura 3. Estratégia para identificação de epítopos tumorais antigênicos usando biblioteca

de peptídeo randômico por Phage Display. Fonte: Hanash, S. Harnessing immunity for cancer

markers Discovery, Nature biotechnology. V. 21. 2003. .

Após a seleção, a amplificação dos fagos foi feita pela inoculação de um meio

Luria Bertani (LB- Triptona 10g/L, extrato de levedura 5g/L, NaCl 10g/L),

contendo tetraciclina, com uma colônia isolada de Escherichia coli da linhagem

ER2738. O meio foi incubado sob agitação a 37°C até a fase early-log (OD 600 ~

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

0,3). Ao atingir esta fase, a cultura bacteriana foi inoculada com 500ul dos eluatos

dos fagos e incubados a 37°C por 4-5 horas sob forte agitação.

Em seguida, a cultura foi centrifugada a 4°C a 10000rpm por 10 minutos e o

sobrenadante foram transferidos para um tubo esterilizado contendo uma solução

de PEG/NaCl (20% de Polietilenoglicol 8000 e 2,5 M de NaCl – solução estéril) na

quantidade de 1/6 do volume do sobrenadante. A solução foi incubada por 12-16

horas a 4°C para a precipitação do fago e posteriormente, centrifugada a 10000 rpm

por 15 minutos a 4°C para descartar o sobrenadante. O precipitado foi, então,

suspendido em 1mL de TBS e reprecipitado com 1/6 do volume de PEG/NaCl, por

1hora no gelo. Centrifugou-se a 14000rpm por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante

foi descartado. O precipitado foi ressuspendido em 200uL de TBS a 0.02% de

NaN3, obtendo-se então o eluato amplificado, posteriormente titulado e

armazenado a 4°C. A cada ciclo do bioppaning foi invertido a ordem de incubação

dos fagos ao estadiamentos do tumor, sendo que a estrigência das lavagens variou

de 0,1 a 1% em cada ciclo.

3.3.2 Titulações

A titulação é um procedimento utilizado para determinar a quantidade de

partículas virais durante entrada e saída de cada ciclo do “Biopanning”. A solução

de fagos foi submetida a diluições seriadas crescentes exponenciais sob log10 em

meio LB. Para eluatos não amplificados de cada estadiamento foram utilizadas as

diluições de 10

-1

até 10

-4

e no caso das soluções com eluatos amplificados a faixa

de diluição utilizada foi entre 10

-8

-11

. Para cada diluição acrescentou-se 200μL

da cultura de ER2738 na fase mid-log (densidade óptica 600nm ~0,5) e a solução

foi agitada rapidamente e incubada por 5 minutos a temperatura ambiente. As

células bacterianas, agora infectadas, foram transferidas para tubos de cultura

contendo 3mL de Ágar-Top a 45°C e espalhadas sobre uma placa de Petri contendo

meio LB sólido, com IPTG/Xgal e tetracilina. As placas foram incubadas a 37°C,

durante 16 horas e após este período, as colônias formadas nas placas foram

contadas e quantificadas, multiplicando-se cada valor obtido de colônias nas placas

LB sólido pelo fator de diluição com intuito de obter o título dos fagos.

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

3.3.3 Análise de Enriquecimento do Panning: Teste Beads-ELISA

Para verificar o enriquecimento dos clones dos estadiamentos (pT1, pT2, pT3 e

pT4) a cada ciclo do “Bioppaning”, foi realizado um teste de imunoensaio

enzimático (beads-ELISA) tendo os beads como plataforma adotada. Em uma

placa de microtitulação de 96 poços não carregada foi depositado em triplicada 1ul

de microesferas acopladas com as imunoglobulinas G de cada estadiamento. Em

seguida, fez-se a diluição de 1x10

dos fagos eluídos não amplificados de cada

ciclo na solução de BSA 5% diluído em TBS-T 0,05%, os quais foram incubados

com as microesferas por 1 hora sob agitação a T.A . Com um aparato magnético, as

microesferas foram precipitadas, lavadas 6 vezes com TBS-T 0,5% e incubadas

com o anticorpo monoclonal anti-M13 conjugado com peroxidase (GE Healthcare)

na diluição de 1:5000 em BSA 5% diluído em TBS-T 0,5%, por 1hora a

temperatura ambiente sob agitação. As microesferas foram novamente precipitadas,

lavadas 6 vezes e reveladas com tampão orto-fenilenodiamina (OPD) a 1mg/mL

acrescida de 3% de água oxigenada (H

). A reação foi interrompida pela adição

de ácido sulfúrico 4N. A reatividade foi obtida em leitor de placas (Titertek

Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA) pela leitura a 492nm.

3.3.4 Extração de DNA de Fagos

As colônias, oriunda das placas tituladas dos 3° e 4° ciclos do biopanning,

foram isoladas e transferidas para poços de placas de cultura (tipo deepwell),

contendo 1,2mL de cultura de ER2738 em fase early-log (OD 600 ~ 0,3) para a

extração do DNA dos fagos. Nos poços da primeira linha da placa foram

adicionadas colônias dos fagos pT1, nos poços da segunda linha, fagos pT2 e,

assim, sucessivamente. A placa foi, então, vedada com um adesivo perfurado e

incubada a 37°C, por 24 horas, sob vigorosa agitação (250 rpm). Para isolar os

fagos das bactérias, as placas foram centrifugadas a 3700 rpm, a 20°C, durante 30

minutos. Então, 800μL do sobrenadante foram transferidos para outra placa e

incubados, por 10 minutos, com 350μL de PEG/NaCl. Após o período de

incubação, a placa foi centrifugada a 3700 rpm, a 20°C, durante 40 minutos para

precipitação dos fagos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e 100μL de

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

Tampão iodeto (10mM de Tris-HCl pH 8,0, 1mM de EDTA e 4M de NaI) foram

adicionados aos fagos precipitados. As placas foram agitadas vigorosamente por 40

segundos e 250μL de etanol absoluto foi acrescentado. Após uma incubação de 10

minutos, à temperatura ambiente, as placas foram centrifugadas (3700 rpm, 20°C,

10 minutos) e o sobrenadante descartado. O DNA dos fagos foi lavado com 500μL

de etanol a 70% e recentrifugado nas mesmas condições. Finalmente, o DNA

precipitado remanescente foi diluído em 20μl de água Milli-Q. A qualidade do

DNA fita simples foi verificada pela corrida eletroforética em gel de agarose 0,8%

corado com solução de brometo de etídeo.

3.3.5 Sequenciamento

Na reação de sequenciamento, foram utilizados 500ng de DNA molde, 5pmol

do primer -96 gIII (5’-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’ - Biolabs) e

Premix (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit. – Amersham Biosciences). A

reação de 35 ciclos foi realizada em um Termociclador de placas (MasterCycler-

Eppendorf) nas seguintes condições: Desnaturação (a 95°C por 20 segundos);

anelamento do primer (a 50°C por 15 segundos) e extensão (a 60°C por um

minuto). A precipitação do DNA sequenciado foi feito com 1μL de Acetato de

Amônio e 27,5μL Etanol. Posteriormente, a placa foi centrifugada por 45 minutos,

a 3700 rpm e o sobrenadante descartado. Adicionou-se 150μL de Etanol 70% ao

DNA precipitado e centrifugou-se por 15 minutos, a 3700 rpm. A solução de

Etanol foi descartada, a placa permaneceu invertida sobre um papel toalha e nesta

posição foi pulsada a 800 rpm, durante um segundo. A placa foi coberta por papel

alumínio e permaneceu em repouso durante 5 minutos para evaporar o etanol

remanescente. Os precipitados resultantes foram ressuspendidos em 10ul do

tampão de diluição (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit. – Amersham

Biosciences). A leitura do sequenciamento foi realizada no sequenciador

automático MegaBace 1000 (Amersham Biosciences) no Laboratório de

Nanobiotecnologia (UFU).

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

3.3.6 Pré-Screening Phage-ELISA

Para analisar a reatividade dos clones às IgGs dos pacientes com CaP, HPB e

negativo, foi realizado o ensaio de ELISA. As placas de microtitulação (NUNC

Maxisorp) carregadas foram sensibilizadas com 100μg/poço de anticorpo

monoclonal anti-M13 (GE Healthcare) sem marcação diluído em tampão carbonato

50mM pH 9,6 por 16 horas a 4°C. Decorrido o tempo de sensibilização, as placas

foram bloqueadas com tampão de bloqueio (TBS-T 0,05% suplementado com 5%

de leite desnatado) por 1 hora a 37ºC. As placas foram lavadas três vezes com

TBS-Tween a 0,5% e incubadas com 100μL/poço de cultura dos fagos selecionado

de cada estadiamento e de cultura de fago selvagem (fago que não expressa

nenhuma proteína exógena) para controle das reações por 1 hora a 37°C.

Posteriormente, as placas foram lavadas cinco vezes e os clones miméticos as

proteínas tumorais de cada estádios foram incubadas por 1 hora a 37°C com o

respectivo pool de soro CaP de cada estadiamento, HPB e sadios (controle

negativo) – na concentração de 1:500, diluídos em tampão de bloqueio.

Após este período, as placas foram lavadas cinco vezes e incubadas com anti-

IgG humana conjugado com peroxidase (Sigma) diluído 1:5000 em TBS-T 0,05%

suplementado com 5% de leite desnatado, durante 1 hora a 37°C. Após 5 lavagens

com TBS-T 0,5%, a ligação antígeno/anticorpo foi detectada pela adição de tampão

orto-fenilenodiamina (OPD) a 1mg/mL acrescida de 3% de água oxigenada (H

A reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico 4N. A reatividade foi

obtida em leitor de placas (Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA) pela

leitura a 492nm.

3.3.7 Screening dos Fagos Escolhidos com Soros de pT1, pT2, pT3, pT4

Os fagos mais reativos do ELISA pré-screenig foram amplificados e testados

com os pool de soro CaP pT1, pT2, pT3 e pT4, HPB e negativo para analisar se os

clones são capazes de discriminar os estádios clínico-patologico doença e manter

uma reatividade baixa quanto incubados com o soro de HPB e negativo.

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

As placas de microtitulação foram sensibilizadas com 40μg/poço de anticorpo

monoclonal anti-M13(GE Healthcare) sem marcação diluído em tampão carbonato

50mM pH 9,6 por 16 horas a 4°C. Após a sensibilização, descartou-se o

sobrenadante, e as mesmas foram bloqueadas com PBS-T 0,05% suplementado

com 5% de leite desnatado por 1 hora a 37°C. Em seguida, lavou-se as placas três

vezes com PBS-T 0,5% de tween e diluíu os fagos a 10

/poço em PBS-T 0,05%

suplementado com 5% de leite desnatado e incubou por 1 hora a 37°C. Lavou-se,

novamente, três vezes com PBS-T 0,5% de tween, e incubou com pool de soro dos

pT1, pT2, pT3 e pT4, além de HPB e controle, na proporção de 1:500 diluído em

PBS -T 0,05% suplementado com 5% de leite desnatado por 1 hora a 37°C. Lavou-

se a placa cinco vezes com PBS-T 0,5% de tween e, em seguida, incubou-as com

anti-IgG humana conjugado com peroxidase (Sigma) diluído 1:5000 em PBS-T

0,05% suplementado com 5% de leite desnatado, durante 1 hora a 37°C. Lavou-se,

novamente, cinco vezes com PBS-T 0,5% e a ligação antígeno/anticorpo foi

detectada pela adição de tampão orto-fenilenodiamina (OPD) a 1mg/mL acrescida

de 3% de água oxigenada (H

). A reação foi interrompida pela adição de ácido

sulfúrico 4N. A reatividade foi obtida em leitor de placas (Titertek Multiskan Plus,

Flow Laboratories, USA) pela leitura a 492nm.

3.3.8 Análise de Dados pela Bioinformática

Após o sequenciamento e a determinação dos fagos específicos para cada

estadiamento, as seqüências de DNA foram traduzidas pelo programa

DNA2PRO12. Este programa é designado para tradução de seqüências de insertos

tanto de bibliotecas da New England Biolabs (Ph.D.-12TM or Ph.D.-C7CTM)

quanto de outras bibliotecas de interesse que contiverem as seqüências inicial e

final do vetor, no caso o bacteriófago M13. O programa automaticamente localiza a

posição do inserto, traduz o mesmo e indica qualquer erro possível na seqüência,

tais como códons inesperados ou erros na seqüência próxima

(http://relic.bio.anl.gov/dna2pro12.aspx).

O alinhamento dos peptídeos selecionados foi testado utilizando os programas

CLUSTAL W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html/). O programa

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

CLUSTAL W2 inclui ainda na análise a formulação da seqüência consenso. As

similaridades entre os peptídeos selecionados e as proteínas depositadas foram

realizadas utilizando a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), um

conjunto de programas que comparam (alinham) as seqüências a serem

investigadas com todas as depositadas nos bancos de dados de ácidos nucléicos e

proteínas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Dentro do Blast a busca foi

realizada no “Protein blast” utilizando como database o “swissprot protein

sequences (swissprot)”, algoritmo - blastp (protein-protein BLAST) e restrita a

humanos (human - taxid: 9606).

As proteínas que apresentaram similaridade com as seqüências dos peptídeos

foram pesquisadas no banco de dados UniProtKB Swiss-Prot

(http://www.expasy.org/) para identificação do seu número de acesso e obtenção de

maiores informações sobre as mesmas.

Para identificar possíveis epítopos antigênicos lineares, foi verificado se os

alinhamentos fornecidos pelo programa blast-p prediz com uma possível região

estimuladora na produção de anticorpos, utilizando-se o programa de predição de

epítopos antigênico lineares Bepipred (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred).

Essas predições são feitas através de métodos que utilizam uma escala de

tendências como estrutura secundária, hidrofilicidade, acessibilidade,

randomicidade, e assim dão valores para cada aminoácido.

3.3.9. Screening dos Fagos Escolhidos com Soros individuais

Após a triagem dos fagos mais reativos com os estadiamento do câncer, os

clones SPLFPWL, LFPWLGS, NLLFPWL foram testados com soros individuais

de pacientes com CaP, HPB e negativo para analisar o valor preditivo positivo,

negativo, sensibilidade especificidade e odds ratio. Para isso, as placas de

microtitulação foram sensibilizadas com 40μg/poço de anticorpo anti-M13(GE

Healthcare) sem marcação diluído em tampão carbonato 50mM pH 9,6 por 16

horas a 4°C. Após a sensibilização, descartou-se o sobrenadante, e as mesmas

foram bloqueadas com PBS-T 0,05% suplementado com 5% de leite desnatado por

1 hora a 37°C. Em seguida, lavou-se as placas três vezes com PBS-T 0,5% de

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

tween e diluíu os fagos a 10

/poço em PBS-T 0,05% suplementado com 5% de

leite desnatado e incubou por 1 hora a 37°C Lavou-se, novamente, três vezes com

PBS-T 0,5% de tween, e incubou com de soro de pacientes individuas CaP, de

HPB e controle, na proporção de 1:500 diluído em -T 0,05% suplementado com

5% de leite desnatado por 1 hora a 37°C. Lavou a placa cinco vezes com PBS-T

0,5% de tween e, em seguida, incubou com anti-IgG humana conjugado com

peroxidase (Sigma) diluído 1:5000 em PBS-T 0,05% suplementado com 5% de

leite desnatado, durante 1 hora a 37°C. Lavou-se, novamente, cinco vezes com

PBS-T 0,5% e a ligação antígeno/anticorpo foi detectada pela adição de tampão

orto-fenilenodiamina (OPD) a 1mg/mL acrescida de 3% de água oxigenada (H

A reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico 4N. A reatividade foi

obtida em leitor de placas (Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA) pela

leitura a 492nm.

3.4 Desenvolvimento de uma Plataforma de Diagnóstico

3.4.1 Avaliação dos diferentes tampões para o teste de acoplamento

A padronização do acoplamento dos peptídeos selecionados por Phage Display

aos beads (microesfera magnética) foi realizado com intuíto de desenvolver uma

plataforma de diagnóstico. O procedimento de acoplamento do fago selecionado

baseou-se no protocolo (Dynal ®). Utilizou-se a proporção de 10

beads/ ml

(Dynabeads M-270 Epoxy - Dynal cat. N. 143.02, solução estoque a 3mg/ml) para

3µg de fago (2,4.10

de partículas virais) e para a solução de 5ug/ml de BSA como

controle de reação.

A realização do procedimento de acoplamento foi feito pela combinação dos

diferentes tampões (fosfato de sódio 0,1M pH 7,4; fosfato de sódio 1,2M pH 10,2 e

sulfato de amônio 3M pH 7,4) durante cinco ensaios. No primeiro ensaio de

acoplamento utilizou-se 30µL de beads, os quais foram incubados com o fago

selecionado em 30 µL de tampão fosfato de Na pH 7,4, 0,1M e 30 µL de sulfato de

amônio 3M, sob agitação a 37ºC por 24 horas. Em seguida, os beads foram lavados

três vezes com 200 µL de solução PBS e ressuspendidos em 60 µL de tampão

fosfato. Do segundo ao quinto ensaios realizou-se os mesmos procedimentos porém

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

variando os tampões, bem como a sua quantidade (Tabela II). Os beads controles

com BSA também foram submetidos aos mesmo cinco ensaios.

Tabela II Relação do tipo e da quantidade dos tampões utilizados versus o teste de acoplamento do

fago selecionado (F1 - CaP).

Ensaios

Tampões

Sulfato de amônio

3M pH 7,4

Fosfato de sódio

0,1M pH 7,4

Fosfato de sódio

1,2M pH 10,2

1°

30µL

2°

60µL

3°

45µL

15µL

4°

60µL

5°

45µL

15µL

Para verificar se houve perda de beads além de padronização da quantidade de

beads a serem utilizados nos futuros testes, foi realizada a contagem das

microesferas na câmara de neubauer. Diluíu-se, primeiramente, 10 ul de beads em

990ul de água destilada. Posteriormente, pipetou-se 10ul da solução e colocou na

câmara de neubauer para realizar as contagens. Contou-se os quatro quadrantes e

calculou a quantidade de microesfera por mL através da seguinte fórmula:

Beads/mL: média dos quatro quadrantes x fator de correção (10) x diluição

x 1000mL

3.4.2 Teste de Beads-ELISA : Certificação do acoplamento

Para analisar se os fagos foram acoplados ao beads, foi feito um teste de beads-

ELISA. Em uma placa de microtitulação não carregada foi depositado 1ul de beads

acoplado com os fagos nos diversos tampões, sendo que para cada acoplamento foi

feito 6 repetições. O beads-BSA acoplado nos diferentes tampões foi repetido

também 6 vezes e utilizado como controle da reação. Posteriormente, os beads

acoplados foram incubados com 100ul de anti-M13 marcado com peroxidase (GE

Healthcare) diluído em 1:5000 em solução de PBS-BSA 5% por 1 hora a

___________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS

temperatura ambiente sob agitação. Lavou-se três vezes os beads com PBS-Tween

0,1% e a revelação foi executada com orto-fenilenodiamina (OPD) a 1mg/mL

acrescida de 3% de água oxigenada (H

). A reação foi interrompida pela adição

de ácido sulfúrico 4N, enquanto a reatividade foi obtida em leitor de placas

(Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA) pela leitura a 492nm.

3.4.3 Teste de Bloqueio da Região da pIII

Para verificar se há o bloqueio da região pIII quando há o acoplamento ocorre

na região n-terminal, os fagos acoplados aos beads foram titulados. Primeiramente,

os beads foram submetidos a diluição seriada de 10 vezes. Então, 1ul de beads foi

diluído de 10

-1

até 10

-2

. A diluição 10

-2

foi acrescida de 200μL da cultura de

ER2738 na fase mid-log (OD600 ~0,5) e incubada por 15 minutos a temperatura

ambiente. As células bacterianas foram transferidas para tubos de cultura contendo

3mL de Ágar-Top a 45°C e espalhadas sobre a placa de Petri, contendo meio LB

sólido, com IPTG/Xgal e tetracilina. As placas foram incubadas a 37°C, durante 16

horas. Após este período, verificou-se se houve a formação de colônias azuis.

3.5 Análise Estatística

As análises estatísticas foram feitas para verificar o acoplamento dos anticorpos

e fagos nas diferentes microesferas, bem como, a positividade e especificidades dos

clones reativos ao CaP. O teste utilizado foi ANOVA seguido de pós-teste

Bonferroni, com intervalo de confiança 95%. Para o teste de sensibilidade,

especifidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e odds ratio foi

realizado Teste Exato de Fisher. As análises e os gráficos foram realizados pelo

software estatístico GraphPad Prism 4.0, assumindo significância quando p <0,05.

________________________________4. RESULTADOS

______________________________________________________________________RESULTADOS

4.1 Acoplamento das IgGs nas microesferas proteína G

Para quantificar e verificar a eficiência do isolamento dos anticorpos dos pacientes

com CaP (pT1, pT2, pT3 e pT4), com HPB e do controle por meio de microesferas

magnéticas (beads magnéticos) proteína G, foi realizado o teste de beads ELISA.

Como pode ser visto na Figura 4, o acoplamento das IgGs mostrou-se significativo

quando comparou-se os dados com o controle.

Neg 1

Neg 2

Neg 3

HPB 1

HPB 2

pT1

pT2

pT3

pT4

Controle

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

D.O a 450nm

Figura 4. Ensaio de beads-ELISA para o acoplamento de IgGs: O eixo Y representa a leitura

média da absorbância a 450nm e no eixo X representa os diferentes grupos em que os anticorpos foram

acoplados no beads e testado tanto com anti-IgG humana quanto com anticorpo irrelevante como

controle da reação. * representa o valor de p<0,05 quando compara-se o acoplamento dos IgGs dos

diferentes grupos com o controle da reação. A barra superior em cada coluna representa o desvio

padrão de N=2.Teste estatístico utilizado para análise foi ANOVA um critério com pós teste de

Bonferroni, Software GraphPadPrisma versão 4.0.

Além disso, não houve diferença significativa entre os valores da absorbância dos

acoplamentos dos grupos Negativos, HPBs e CaPs.

4.2 Seleção de Peptídeos Recombinantes

4.2.1 Biopanning e Titulações

Para a seleção dos peptídeos ligantes aos anticorpos policlonais IgGs dos

diferentes estadiamento do câncer de próstata, a especificidade dos peptídeos foi

assegurada por três passos de subtrações negativas com o grupo controle e das duas

subtrações com HPB, utilizando IgGs purificadas acoplada a microesferas proteína-G.

Já a eluição ácida possibilitou a seleção positiva dos fagos ligantes a IgGs de

pacientes com CaP .

_________________________________________________________________________RESULTADOS

A quantidade de fagos selecionados durante os quatro ciclos de seleção foi

estimada pela titulação dos eluatos amplificados e não amplificado de cada ciclo,

(Tabela III). Os títulos de entrada dos fagos no “biopanning” foram sempre maiores

que os títulos de saída, pois os fagos com maior afinidade aos anticorpos contra o

tumor ficam ligados as IgGs tumorais por interação peptídeo/anticorpo e o restante

dos fagos com baixa ou sem afinidade foi removido durante as lavagens. Nas

amplificações ocorre o inverso, indicando a eficiência do processo.

Tabela III. Seleção dos fagos com peptídeos ligantes aos anticorpos policlonais IgG anti-CaP. Título

obtido (pfu) no processo de seleção dos fagos por imunoafinidade

Ciclos

Número de Partículas de Fagos

Entrada

Saída

1º Ciclo de

seleção

Biblioteca

original

1x10

pT1

7x10

pT2

5x10

pT3

2x10

pT4

6x10

2º Ciclo de

seleção

Pool de fagos

1x10

pT1

5x10

pT2

3x10

pT3

1x10

pT4

5x10

3º Ciclo de

seleção

Pool de fagos

1x10

pT1

1x10

pT2

1,6x10

pT3

4x10

pT4

7x10

4º Ciclo de

seleção

Pool de fagos

1x10

pT1

3x10

pT2

8x10

pT3

1x10

pT4

3x10

_________________________________________________________________________RESULTADOS

4.2.2 Análise do Enriquecimento: Teste Beads-ELISA

Para verificar o enriquecimento do pool de mimetopos de CaP selecionados

durante os ciclo do bioppaning , utilizou-se a estratégia de beads ELISA. No quarto

ciclo, pôde-se observar um enriquecimento significativo dos fagos com afinidade aos

anticorpos presentes no soro de pacientes com CaP, principalmente, entre o 1° e 4°

ciclo e o 2° e 4° ciclo (p ≤ 0,001) (Figura 5).

pT1

pT2

pT3

pT4

1° round 2° round 3° round 4° round

a, b

Estadiamento clínico

Abs. 492nm

Figura 5. Ensaio de beads-ELISA para o teste de enriquecimento: O eixo Y representa a leitura

média da absorbância feita no espectrofotômetro a 490nm e no eixo X representa os diferentes grupos

de anticorpos acoplado no beads testado com pool de fagos do primeiro, segundo, terceiro e quarto

ciclo (C). As letras indicam os grupos em que houveram diferença significativa nos estadiamentos

tumorais pelo teste de ANOVA um critério, com pós teste de correção de Bonferroni no software

GraphPad Prisma 4.0. c- 4°ciclo vs 3°, 2° e 1° ciclos com p<0,001; b- 3° ciclo vs 1° ciclo com valor de

p<0,01.

Quando comparado com os outros grupos do teste de enriquecimento, o

estadiamento pT3 foi aquele que menor teve um enriquecimento significativo.

4.2.3 Extração de DNA e Seqüenciamento dos Clones de Fagos

Dentre os 196 clones seqüenciados, 81 apresentaram seqüências válidas (sem erros

de seqüenciamento), e apenas 43 seqüências apresentaram-se diferentes. A Tabela IV

mostra a freqüência de cada clone nos diferentes estadiamentos.

_________________________________________________________________________RESULTADOS

Tabela IV . Freqüência dos clones de fagos seqüenciados em diferentes estadiamentos.

Peptídeos

Frequência

dos peptídeos

Freqüência absoluta

pT1

pT2

pT3

pT4

SPLFPWL

12/81

LPTRTSH

7/81

SSIFPWL

5/81

NLSSSWI

5/81

NLLFPWL

4/81

SSGPPHS

3/81

LGAPFSR

3/81

GLYSFSK

2/81

SSAGSLF

2/81

LFPWLGS

2/81

SALFPWL

2/81

PSLFPWL

2/81

LFPWLSS

2/81

LFPLLPG

1/81

GFPLPHL

1/81

ESSCFLG

1/81

DVFPWLP

1/81

VPAWNPH

1/81

LSSSASL

1/81

CSFSASC

1/81

TTLSPHL

1/81

TTMSPLL

1/81

LGLPFSN

1/81

LGHPFLR

1/81

LFPWLAP

1/81

STLAPSL

1/81

STLLPQL

1/81

SVLFPWL

1/81

PLLSITA

1/81

TSRLGHL

1/81

VSICSVD

1/81

_________________________________________________________________________RESULTADOS

EATRPAT

1/81

NPVFPWL

1/81

LFPWLPG

1/81

SSLFPWL

1/81

PPSSRPS

1/81

PSPASSF

1/81

HALFPWL

1/81

NTSPLHQ

1/81

QPSSHSL

1/81

SPIFPWL

1/81

SPDSSAL

1/81

LFPWLPD

1/81

TOTAL

4.2.4 Pré-Validação de Mimetopos por Phage-ELISA

Os fagos eluídos do terceiro e quarto ciclo de cada estadiamento do biopanning

foram submetidos ao ensaio de Phage-ELISA com pool de soro de pacientes com CaP

para verificar a reatividade ao alvo. A normalização da quantidade de partículas virais

entre os clones a serem testados foi feita pela sensibilização do anticorpo anti-M13 na

placas de microtitulação. Utilizou-se o fago selvagem como controle negativo de

reação, além de indivíduos sadios.

A Figura 6 demonstra a reatividade dos anticorpos anti-CaP presentes nos soros

dos pacientes contra os clones. Os clones que obtiveram uma absorbância média

superior ao controles saudáveis e ao fago selvagem foram selecionados como os

prováveis mimetopos de câncer.

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

pT 1.1

pT 1.2

pT 1.3

pT 1.4

pT 1.5

pT 1.6

pT 1.7

pT 1.8

pT 1.9

pT 1.10

pT 1.11

pT 1.12

pT 1.13

pT 1.14

pT 1.15

pT 1.16

pT 1.17

s el

C lon es pT 1

OD 490nm

Neg

HP B

C aP

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

pT 2.1

pT 2.2

pT 2.3

pT 2.4

pT 2.5

pT 2.6

pT 2.7

pT 2.8

pT 2.9

pT 2.10

pT 2.11

pT 2.12

pT 2.13

pT 2.14

s el

C lon es pT 2

OD 490nm

Neg

HP B

C aP

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

pT 3.1

pT 3.2

pT 3.3

pT 3.4

pT 3.5

pT 3.6

pT 3.7

pT 3.8

pT 3.9

s el

C lon es pT 3

OD 490n m

Neg

HP B

C aP

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

pT 4.1

pT 4.2

pT 4.3

pT 4.4

pT 4.5

pT 4.6

pT 4.7

pT 4.8

pT 4.9

pT 4.10

pT 4.11

pT 4.12

pT 4.13

pT 4.14

pT 4.15

pT 4.16

s el

C lon es T 4

OD 490nm

Neg

HP B

C aP

Figura 6. Painel de pré-validação dos clones reconhecidos por IgG de pacientes com CaP em diferentes estadiamento. Os clones foram capturados por anticorpo anti-

M13 e incubados com soros de pacientes com câncer, HPB e indivíduos saudáveis. Para comparação, o fago selvagem foi submetido às mesmas condições. Os 11clones do

pT1(A), 8 fagos do pT2 (B), 2 fagos pT3 (C), e 1 fago pT4 (D) selecionados mostraram uma alta afinidade de ligação, quando comparado ao selvagem. Totalizando, desse modo, 22

fagos, sendo que 16 são diferentes.

________________________________________________________________________RESULTADOS

4.2.5 Screening dos Fagos Selecionados com Soros de pT1, pT2, pT3, pT4

Após selecionar os 16 fagos distintos, os mesmos foram submetidos ao teste Phage-

ELISA para verificar se os mimetopos apresentam reatividade cruzada entre os quatros

tipos de sorológico do CaP (pT1, pT2, pT3, pT4), além de HPB e controle. Além disso,

o teste possibilitou analisar a predominância de um peptídeo específico a cada

estadiamento. As Figuras 7-9 mostram a reatividade dos 16 peptídeos selecionados no

screening nos diferentes estadiamentos.

splfpwl

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35



,b

*



grupos analisados

Abs 492nm

svlfpwl

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

,a,d

,d

grupos analisados

Abs 492nm

salfpwl

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35



,b

,g

grupos analisados

Abs 492nm

spifpwl

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35





*



grupos analisados

Abs 492nm

ssifpwl

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

,g







grupos analisados

Abs 492nm

Figura 7. Análise do primeiro grupo de clones selecionados especificamente pelos anticorpos dos

diferentes tipos de pool de soro de pT1, pT2, pT3, pT4 de pacientes. Os clones foram agrupados de

acordo com as similaridades químicas dos aminoácidos. A escala no eixo y mostra a absorbância a

492nm correspondente aos fagos ligantes. Os dados estão representados pela média ± desvio padrão. As

letras e símbolos representam os valores positivos para as diferenças de médias e os valores significativos

para o câncer, e letras iguais mostram grupos em que não houveram diferenças. α - pT1 vs pT3, pT4,

HBP, NEG, selvagem, com p <0.001; a-pT1 vs; pT4, NEG, com p <0,01; b - pT2 vs pT1, com p <0,01; β

- pT2 vs pT3, pT4, HPB, NEG, selvagem com p <0.001; g- pT4 vs pT3, NEG com p<0,05; γ-pT4 vs pT3,

HPB, NEG, sel com p<0,05, ε- pT4 vs pT3 com p< 0,01. O teste estatístico utilizado foi ANOVA um

critério, com pós teste de correção de Bonferroni feito pelo software GraphPad Prism versão 4.0.

________________________________________________________________________RESULTADOS

lfpwlpd

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35





grupos analisados

Abs 492nm

lfpwlss

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35



,c







*,

grupos analisados

Abs 492nm

lfpwlgs

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

,a,









,

grupos analisados

Abs 492nm

lfpwlpg

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35





*, ,d

*,d

,e

d,e

grupos analisados

Abs 492nm

nllfpwl

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35









grupos analisados

Abs 492nm

npvfpwl

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35



*



*

grupos analisados

Abs 492nm

halfpwl

pT1

pT2

pT3

pT4

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35



grupos analisados

Abs 492nm

Figura 8. Análise de clones selecionados especificamente pelos anticorpos dos diferentes tipos

de pool de soro de pT1, pT2, pT3, pT4 de pacientes. Os clones foram agrupados de acordo com as

similaridades químicas dos aminoácidos em A e B. A escala no eixo y mostra a absorbância a 492nm

correspondente aos fagos ligantes. Os dados estão representados pela média ± desvio padrão As letras e

símbolos representam os valores positivos para as diferenças de médias e os valores significativos para o

câncer, e letras iguais mostram grupos em que não houveram diferenças. .α - pT1 vs pT3, pT4, HPB,

NEG, selvagem, com p <0.001; a- pT1 vs NEG com p<0,01, ●- pT1 vcs HPB ou vs pT4 e NEG com

p<0,05, β - pT2 vs pT3, pT4, HPB, NEG, selvagem com p <0.001; c- pT2 vs pT1 com p<0,05; γ-pT4 vs

pT3, HPB, NEG, sel com p<0,05. O teste estatístico utilizado foi ANOVA um critério, com pós teste de

correção de Bonferroni feito pelo software GraphPad Prism versão 4.0.

________________________________________________________________________RESULTADOS

pspassf

pT1

pT2

pT3

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

grupos analisados

Abs 492nm

ppssrps

pT1

pT2

pT3

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

grupos analisados

Abs 492nm

tsrlghl

pT1

pT2

pT3

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

,c

grupos analisados

Abs 492nm

lgapfsr

pT1

pT2

pT3

HPB

NEG

SEL

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35



grupos analisados

Abs 492nm

Figura 9. Análise de clones selecionados especificamente pelos anticorpos dos diferentes tipos

de pool de soro de pT1, pT2, pT3, pT4 de pacientes. Os clones foram agrupados de acordo com as

similaridades químicas dos aminoácidos. A escala no eixo y mostra a absorbância a 492nm

correspondente aos fagos ligantes. Os dados estão representados pela média ± desvio padrão. As letras e

símbolos representam os valores positivos para as diferenças de médias e os valores significativos para o

câncer. β-pT2 vs pT1, pT3, pT4, NEG, Sel com p<0,001, C- pT2 vs HPB, p<0,05; α- pT4 vs outros

grupos com p<0,001.O teste estatístico utilizado foi ANOVA um critério, com pós teste de correção de

Bonferroni, feito pelo software GraphPad Prisma versão 4.0.

Como pode ser observado nas Figuras 8-10, os fagos foram separados em painéis de

acordo com a semelhança química do aminoácido. Nestas figuras, todos os clones que

apresentaram o motivo FPWL foram significativamente reativos para IgG do soro de

pacientes com câncer de próstata, especialmente para os estadiamento pT1 e pT2,

quando comparada a outros grupos com o valor de p variando de 0,05 a 0,001.

Embora muitos clones tenham apresentado diferença significativa em favor de

tumor do estadiamento pT2, dois (NPVFPWL e HALFPWL) clones não mostram

diferença significativa quando foram comparados ao pT1. Em contraste, os clones

TSRLGHL e LGAPFSR mostraram reatividade significativa apenas com os estádios

pT2 e pT4, respectivamente, enquanto os clones PSPASSF e PPSSRPS demonstraram

________________________________________________________________________RESULTADOS

baixa reatividade para todos os grupos (Figura 10) e nenhum fago foi encontrado para o

estadiamento pT3 apesar de alguns clones terem sido selecionados durante o

bioppaning.

4.2.6 Bioinformática

Com intuito de identificar uma região conservada ou um motivo comum nos

peptídeos selecionados, realizou-se o múltiplo alinhamento pelo programa clustal w

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). O programa possibilitou, também, a

formulação de um consenso, criando uma seqüência peptídica (Tabela V).

Tabela V . Alinhamento dos peptídeos selecionados pelo Programa clustalW.

Clones

Alinhamento pelo clustal W

pT1.5; pT2.6; pT3.9

---LFPWLSS

pT1.5

---LFPWLGS

pT1.10

-SPIFPWL--

pT1.6; pT2.7; pT3.9

-SSIFPWL--

pT1.11; pT2.11; pT3.6

-SPLFPWL--

pT1.1

-SVLFPWL--

pT2.12

-SALFPWL--

pT2.13

-HALFPWL--

pT1.14

---LFPWLPG

pT2.9

---LFPWLPD

pT1.12

-NPVFPWL--

pT1.11; pT2.5; pT3.7

-NLLFPWL--

pT4.15

-TSRLGHL--

pT1.4

LGAPFSR---

Consenso

-S+LFPWLPS

Para a identificação de possíveis epítopos lineares foi realizada uma busca no

BLAST (blastp), utilizando a seqüência consenso de peptídeo gerado pelo programa

clustal w e o banco de dados de seqüências de proteínas Swissprot, restrito a proteínas

________________________________________________________________________RESULTADOS

humanas. As proteínas que se alinharam foram submetidas ao ensaio in silico Bepipred

de predição de epítopos antigênico lineares, com o objetivo de saber se as regiões

alinhadas correspondiam às regiões preditas, ou seja, regiões que por método

matemático poderiam gerar a produção de anticorpos. A última coluna da Tabela VI

mostra as regiões de prováveis epítopos antigênico lineares dos peptídeos selecionados

alinhado com a proteína.

Tabela VI Alinhamento das seqüências consenso dos peptídeos selecionados, mostrando as similaridades

encontradas com as proteínas anotadas no banco de dados do GeneBank pelo BLAST, com os números de

acesso no Swissprot, e sua regiões de prováveis epítopos antigênicos lineares feita de acordo com o

programa Bepipred.

Peptídeo

consenso

Alvos

Potenciais

Swissprot

Alinhamento

Value

Provável

região

antigênica

S+LFPW

LPS

HERV-

R(b)_3p24.3

provirus

ancestral Env

polyprotein

P60509

Query 1 S--LFPWLPS 9

SL+PWLPS

Sbjct274 SPNLWPWLPS 283

276 a 283

HERV-

H_19p13.11

provirus

ancestral Env

polyprotein

P61549

Query 1 SLFPWLPS 8

SL PWLPS

Sbjct 223 SLHPWLPS 230

5.5

228-230

HERV-

H_2q24.1

provirus

ancestral Env

polyprotein

Q9N2J8

Query 1 SLFPWLPS 8

SL PWLPS

Sbjct 237 SLHPWLPS 244

5.5

242-244

Como pode ser observado pela Tabela VI, o peptídeo consenso mostrou similaridade

com as proteínas retrovirais e o seu alinhamento apresentou como uma possível região

antigênica avaliado pelo programa Bepipred.

________________________________________________________________________RESULTADOS

4.2.7 Screening dos Fagos Escolhidos com Soros individuais

Para analisar o comportamento dos fagos individuais, bem como testar a

sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo risco relativo (VPP E

VPN), e odds ratio, testou os clones (SPLFPWL, LFPWLGS, NLLFPWL) que

apresentavam um motivo em comum. Para o teste de ELISA foram comparados 22

pacientes com CaP, 22 pacientes com HPB e 21 pacientes negativos. Dos 22 pacientes

com câncer, 4 pacientes analisados apresentavam, neoplasia intra-epitelial prostática

(NIP)

A Tabela VII demonstra o número de pacientes que apresentaram Índice ELISA

(I.E) maior que 1 (pacientes positivos par o teste) para os 3 clones e se houve diferença

significativa para o teste de Fisher:

Tabela VII .Freqüência de pacientes positivos para o teste de ELISA sobre o valor total de pacientes

diagnosticado nos três clones.

SPLFPWL*

(Positivo/ total)

LFPWLGS

(Positivo/ total)

NLLFWL+

(Positivo/ total)

CaP

5/22

CaP NIP

3/ 4

2/4

3/ 4

HPB

2/22

4/22

0/22

NEG

0/21

1/21

*valor de p<0.04; +valor de p<0.02 para o teste de Fisher tanto para o CaP geral como CaP NIP

Para o teste de sensibilidade, os clones apresentaram a mesma porcentagem de 23%,

porém a especificidade bem como o risco relativo, odds ratio, VPP, VPN. Porém ao

calcular os dados de sensibilidade, especificidade, odds ratio, risco relativo, VPP e

VPN, para o caso de câncer associado à NIP, o fago LFPWLGS diferenciou nos

resultados como mostra a Tabela VIII.

________________________________________________________________________RESULTADOS

Tabela VIII- Comparação de dados estatísticos epidemiológicos entre o CaP geral e CaP associado ao

NIP

SPLFPWL*

(CaP geral/ CaP

NIP)

LFPWLGS

(CaP geral/ CaP

NIP)

NLLFWL+

(CaP geral/ CaP

NIP)

Risco relativo

2.44/10,2

1,9/3,4

2,84/10,2

Odds ratio

6,03/24

3,01/5,0

12,1/24

Sensibilidade

23%/75%

23%/50%

23%/75%

Especificidade

95%/98%

91%/83%

98%/98%

VPP

71%/60%

56%/40%

83%/60%

VPN

71%/94,1%

71%/88%

71%/94,1%

*valor de p<0.04; +valor de p<0.02 para o teste de Fisher tanto para o CaP geral como CaP NIP

Valores gerados pelo programa Prisma cálculo de Contingência

4.3 Padronização da Plataforma Biotecnológica

4.3.1 Quantificação dos Beads na Câmara de Neubauer e Teste de beads ELISA para

a certificação do acoplamento

Após a seleção do fago ligante a IgG de pacientes com câncer de próstata, acoplou

o fago na microsfera de grupamento epóxi para o desenvolvimento de uma nova

plataforma de diagnóstico. Para verificar se houve perda de microesferas durante o

acoplamento e as lavagens, as mesmas foram contadas pela câmara de Neubauer, visto

que os beads possuem um tamanho semelhante a uma célula (2,8 um). A Tabela IX

mostra quantificação das microesferas.

________________________________________________________________________RESULTADOS

Tabela IX. Quantificação dos beads em Câmara de Neubauer.

Beads-

BSA

Unidades

/ml

Beads-

fago

Unidades/

Beads-

sel

Unidades/

1°

2,75x 10

1°

1,49 x 10

1°

2,58 x 10

2°

2,53x 10

2°

1,9 x 10

2°

1,15 x 10

3°

2,3 x 10

3°

2,13 x 10

3°

1,65 x 10

4°

2,53x 10

4°

2,3 x 10

4°

2,53 x 10

5°

2,65x 10

5°

2,33 x 10

5°

2,30 x 10

Os dados apresentados pela Tabela IX mostram que não houve perda relevante entre

os diferentes alvos acoplados (BSA, fago selecionado e selvagem) e nem entre os

diferentes tampões.

Para analisar se os fagos foram acoplados ao beads, foi feito um teste de beads-

ELISA. Conforme observado na Figura 11, houve uma diferença significativa (p<0,001)

entre a absorbância média do fago acoplado no beads quando comparado com o beads

controle (BSA), porém, não foi observada nenhuma diferença significativa entre os

diferentes tampões.

1° ensaio

2° ensaio

3 °ensaio

4° ensaio

5 ° ensaio

Fago BSA

Ensaios realizados

Abs. 492nm

Figura 10. Ensaio de beads-ELISA,com fagos e BSA acoplado na microesfera. O eixo Y

representa a leitura média da absorbância a 492nm e no eixo X apresentam os diferentes ensaios de

acoplamento. Colunas representam a média (n = 6); barras mostram o desvio-padrão O teste estatístico

ANOVA dois ou mais critério, com pós teste de correção de Bonferroni, mostra a diferença estatística de

p <0,001 entre o fago acoplado e o controle.

________________________________________________________________________RESULTADOS

4.3.3 Teste de bloqueio da pIII

Com a certificação do acoplamento dos fagos aos beads, realizou-se uma titulação

destes para verificar se ocorria o bloqueio da região da pIII do fago, região onde está

inserido o mimetopo. Como pode ser observado pela Figura 12, houve a formação de

colônias azuis, demonstrando que a proteína III do fago não se encontra bloqueada.

Figura 11. Teste de bloqueio da pIII . Formação de colônias azuis mostra a capacidade

infectiva do fago na bactéria. Letras representam as titulações dos fagos acoplados no beads na diluição

a 10

-2

em diferentes tampões. A - fago acoplado no tampão sulfato de amônio 3M pH 7,4 e fosfato de

sódio 0,1M pH 7,4 na proporção 1:1(ensaio 1), B- fago acoplado no tampão sulfato de amônio 3M pH 7,4

(ensaio 2), C - fago acoplado no tampão sulfato de amônio 3M pH 7,4 e fosfato de sódio 1,2 M pH 10,2

na proporção 3:1 (ensaio 3), D - fago acoplado no tampão fosfato de sódio 1,2 M pH 10,2 (ensaio 4), E-

fago acoplado no tampão sulfato de amônio 3M pH 7,4 e fosfato de sódio 0,1M pH 7,4 na proporção 3:1,

F- Controle da reação.

Quando se compara as placas dos diferentes ensaios verifica-se que ocorre uma

maior formação de colônias nos ensaios 1, 2, 3 e 5 (Figuras 12A, B, C, E),

demonstrando que o 4ᵒ ensaio, não seja adequado para o acoplamento de fago, visto que

houve menor formação de colônias (Figura 12D). A Figura 12F representa o ensaio

controle, indicando que os beads acoplados ao BSA não apresentam poder de

infectividade ou contaminação.

_____________________________________5. DISCUSSÃO

__________________________________________________________________________DISCUSSÃO

A identificação de antígenos tumorais, que eliciam a produção de anticorpos a partir

da resposta imune, pode ser útil na detecção do câncer bem como em imunoterapia

(HANASH, 2003). Muitos pesquisadores têm verificado que pacientes com câncer

podem produzir autoanticorpos (SAHIN et al, 1995; CHEN et al, 1998; STOCKERT et

al, 1998; BRICHORY et al, 2001, MINENKOVA, 2003), e atualmente, há um crescente

entusiasmo para a aplicação de técnicas proteômicas para a identificação de marcadores

biológicos na fase inicial da doença, além do desenvolvimento de plataformas para

diagnóstico não invasivo do câncer e monitoramento da progressão do tumor

(CASIANO et al, 2006)

Com o intuito de encontrar novos alvos reativos ao sistema imune, este estudo

propôs a identificação de antígenos tumorais a partir de autoanticorpos em pacientes de

câncer de próstata de diferentes estádios através da técnica de Phage Display. Além

disso, padronizou-se o acoplamento dos peptídeos antigênico, expresso em fagos, em

microesfera de grupamento epóxi para o desenvolvimento de plataforma de imuno-

ensaio enzimático baseado em micropartículas.

A seleção de epítopos miméticos ao adenocarcinoma foi feita utilizando uma

biblioteca conformacional de peptídeos de sete aminoácidos (New England Biolabs,

Ph.D.-C7C). Escolheu-se essa biblioteca porque se supõe que o reconhecimento das

IgGs de CaP por peptídeos conformacionais seria melhor do que peptídeos lineares.

Pesquisas têm demonstrado que peptídeos, que incorporam algumas características

conformacionais, têm implicações importantes no desenvolvimento de vacinas e no

reconhecimento dos anticorpos (DAKAPPAGARI et al, 2005; SUNDARAM et al,

2004). Bukawa H et al 1995 e Cabezas et al. 2000 investigaram o uso de epítopos

conformacionais do vírus de imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) para estudar as

respostas dos anticorpos específicas ao vírus. Eles demonstraram que a conformação do

peptídeo V3 e V5 da glicoproteína gp120 foram capazes de provocar uma resposta

imune, diferentemente do epítopo linear. Além disso, apenas os peptídeos com loops

obtiveram anticorpos neutralizadores de vírus em coelhos vacinados.

__________________________________________________________________________DISCUSSÃO

O panning em fase de solução em partículas magnéticas de proteína G foi a escolha

do procedimento metodológico e a plataforma, a qual foi dividido em dois passo o

acoplamento dos anticorpos e a seleção de peptideos.

A captura de IgG pela microesfera mostrou-se eficiente visto que houve alta

absorbância apresentada pelo reconhecimento do anti-IgG aos anticorpos acoplado no

beads, comparado ao controle (reconhecimento do anticorpo irrelevante ao IgG-beads).

Além disso, a baixa absorbância do controle mostra a eficiência do bloqueio, garantindo

uma boa seleção de mimetopos de câncer de próstata. A escolha do beads proteín-G

como plataforma foi devido à correta orientação, que a proteína-G, favorece ao

anticorpo, potencializando o seu uso (HÄRMÄ et al, 2000), da baixa ligação

inespecífica e baixa contaminação das micropartículas (WHITEAKER et al, 2007),

além da diminuição do impedimento estérico entre o anticorpo e o antígeno (KIM et al,

2009), quando se compara às seleções feitas em placas de poliestireno.

Já para a panning, utilizou-se a estratégia de seleção negativa para aumentar a

seleção de peptídeos ligantes a IgG associado ao tumor. Este tipo de seleção, já tem sido

desenvolvido por Mikhail Popkov et al. 2004, com o objetivo de remover a reação

cruzada com antígenos de clones comum em Phage Display, em pesquisas de neurônios

de rato (HOU et al, 2004), de carcinoma hepatocelular metastática (JIA, 2006) e de

câncer de próstata (MINTZ et al, 2003).

Durante os ciclos de seleção, verificou-se o aumento esperado do título de fago, já

que os clones, que apresentam maior imuno-afinidade, ficaram retidos aos anticorpos

para subseqüente eluição e amplificação para o ciclo seguinte, enquanto que os fagos

com baixa ou sem afinidade aos anticorpos são lavados e removidos. Apesar da maioria

dos fagos com baixa afinidade serem removidos durante as lavagens dos ciclos, o

excesso de anticorpo presente no beads e o excesso de fagos podem favorecer a ligação

inespecífica, ou ainda esses clones podem interagir diretamente com a microesfera,

sendo necessário o aumento da estringência (Tween-20), o qual variou de 0,1 a 1%.

O resultado de Beads-ELISA mostrou que o enriquecimento dos pools de fagos

específicas do terceiro e quarto ciclo do panning exibiram ligação significativa a IgG do

câncer , quando comparados com o pool de fago do primeiro e segundo ciclo. Este

__________________________________________________________________________DISCUSSÃO

enriquecimento sugestiona alta reatividade de ligação e consequentemente o sucesso do

panning. McCafferty, 1996, relatou que dois fatores, a afinidade e o nível de exibição,

afetam diretamente a eficiência da seleção. A existência de ligantes que expõe peptídeos

com grande afinidade em biblioteca de Phage Display melhora seu enriquecimento

mesmo se o nível de exposição seja baixo.

No ensaio de Phage-ELISA, dos 16 fagos selecionados no ELISA pré-validação, 14

clones apresentavam alta afinidade de ligação especificamente com IgG de CaP. Desses

14, 12 peptídeos continham aminoácidos análogos e exibiam imuno-reatividade

similares, isto é, estes clones eram reconhecidos especificamente pelos anticorpos

presentes no estadiamento tumoral pT1 e pT2, sugerindo que o motivo compartilhado

FPWL mimetizam a mesma região da proteína. Além disso, a não reatividade dos

PSPASSF e PPSSRPS reforça a idéia de que o motivo foi realmente selecionado

positivamente. Interessantemente, para o estádio pT3 nenhum clone foi reconhecido,

enquanto que para o estádio pT4, o clone LGAPFSR exibiu reatividade exclusiva. A

importância de selecionar alvos tumorais em diferentes estádios é que esses alvos

ajudariam a determinar o melhor tratamento, bem como o prognóstico (CHO-CHUNG,

2006). Além disso, a detecção precoce, com estágio I e II, em câncer de próstata,

continua a ser a abordagem mais promissora para melhorar a sobrevivência em longo

prazo dos pacientes com câncer (OTT et al, 2009).

O uso da metodologia de Phage Display para encontrar alvos ou ligantes tumorais

tem tido resultados promissores entre os pesquisadores. Zhong et al (2008), verificou

que a combinação de três tipos de peptídeos expressos pelos fagos apresentavam 80%

de sensibilidade e 100% especificidade na predição do estado da amostra, enquanto o

cada um separadamente prediziam 77,0% de sensibilidade e especificidade de 82,8%

entre 87 amostras de pacientes e 87 amostras de controle. Tong et al (2008) encontrou

fagos ligantes a autoanticorpos em cacinoma e Ran et al (2008) relatou que auto-

anticorpos contra antígenos expressos phage-derivadas de tecidos de câncer poderiam

ser utilizados como marcadores do soro para detecção de câncer de cólon.

Uma abordagem alternativa para a identificação de ligantes e de identificação de

alvos em potencial através de programas de bioinformática é a busca de seqüências

__________________________________________________________________________DISCUSSÃO

consenso entre os clones selecionados. Pelo programa clustal w foi encontrado um

consenso (S+LFPWLPS) que continham tanto o motivo como a presença de alguns

aminoácidos presentes em outros fagos mais não na maioria. O consenso compartilha

similaridade de seqüência com uma variedade de proteínas humanas, especialmente

com as proteínas de retrovírus endógenos humanos (HERV-provírus poliproteínas Env

ancestral), já que houve repetição de subtipos do endovírus no alinhamento e do total de

8 aminoácido do consenso, 7 são alinhado.

Muitos estudos têm mostrado a relação entre o vírus e o câncer, por exemplo, as

proteínas E6 e E7 de papilomavírus humano oncogênico (HPV) se ligam e inativam

proteínas celulares supressor de tumor (PAGANO, et al 2004). Em outros casos, os

vírus podem indiretamente causar câncer induzindo a destruição crônica de

compensação e substituição de células, como Hepatite B e vírus C, que podem criar um

ambiente celular inflamatória, onde produzem numerosas substâncias oxidantes com

potencial de causar dano celular ou genoma da célula (MÜNGER, HOWLEY, 2002;

KLEIN, 2008). Devido a isso, o vírus pode ser candidato para marcador sorológico, ou

agente etiológico do câncer de próstata.

As proteínas com seqüências compartilhadas com retrovírus endógeno humano

(HERV) são muito interessantes, já que relacionam com a etiologia da CaP e outros

cânceres, como os de ovário (WANG-JOHANNING et al, 2006), de mama (WANG-

JOHANNING et al, 2001), testicular (GOEDERT et al, 1999) , câncer gastrointestinal

(WENTZENSEN et al, 2007) . Retrovírus endógeno humano (HERVs) são

descendentes de retrovírus exógenos que se tornaram genes celulares pela integração as

células da linhagem germinal (LEIB-MOSCH, 1990). Embora se tenha verificado que

os genomas HERV geralmente estão com defeito, eles representam um reservatório de

genes virais que podem ser ativados de forma espontânea, por eventos de recombinação,

ou pela radiação e agentes químicos. A função biológica dos retrovírus humanos

relacionados com seqüências permanece desconhecida, mas há especulações de que eles

desempenham papel na carcinogênese, autoimunidade, e imunossupressão em seres

humanos (BOESE et al, 2000; TAMURA et al 1994; KERSHAW et al, 2001; YANG;

PERRY-LALLEY, 2000; MANGENEY et al, 2001).

__________________________________________________________________________DISCUSSÃO

No caso da relação entre o desenvolvimento do câncer e os retrovirus endógenos, os

HERVs podem produzir partículas retrovirais competentes para a replicação, os quais

são capazes de formar novas inserções proviral que induzem tumores por mutagênese de

inserção (ou seja, integração de provírus com seus potentes elementos promotores e

potenciadores próximo a um protooncogene), ou que promovam o crescimento do

tumor por imunossupressão. Especialmente, neste último caso, a expressão dos

antígenos em células tumorais podem provocar uma resposta imunológica antitumoral

envolvendo, entre outros, os anticorpos e células T citotóxicas (CTL). Idealmente, as

respostas imunes antitumorais resultam na eliminação das células cancerosas. No

entanto, a expressão das proteínas imunossupressoras do envelope de retrovírus

endógenos nas células do tumor pode levar a um aumento da população de células T

reguladoras (Treg), promovendo a supressão da atividade antitumoral de células

citotóxicas, o que leva à fuga de células tumorais da imunovigilância (escape do tumor)

e conseqüentemente invasões do crescimento do câncer. (RUPRECHT et al 2008).

Além disso, verificou-se também que RNAsel defectivo pode permitir maior infecção

viral já que este gene é efetor de resposta inata via interferon gama, via degradação de

partículas virais e apoptose celular (URISMAN et al, 2006).

Em concordância a bioinformática, a baixa sensibilidade dos fagos SPLFPWL,

LFPWLGS, NLLFWL aos pacientes individuais com CaP em geral já era esperada,

visto que, a associação entre o desenvolvimento do tumor e o vírus é também pequena.

De acordo com os resultados da pesquisa de Wang-Johanning et al (2006) verificou-se

que somente 55% dos pacientes com câncer de ovário apresentaram títulos positivos

para o anticorpo contra a proteína de superfície HERV-K, 40% foram positivo para o

anti-HERV-E e 30% foram positivos para anticorpos contra EV3. Já o trabalho de

Ishida et al (2008) mostrou que a proteína NGO-Pr-54, homólogo ao HERV-K,

identificado pela metodologia de SEREX, apresentou resposta imune de somente de

5,1% em pacientes com câncer de bexiga, 4,1% em câncer de fígado, 3,4% em câncer

de pulmão, 5,6% em câncer de ovário e 4,2% em câncer de próstata. Apesar de a

resposta humoral ser baixa, a importância do estudo da associação entre o vírus e o

desenvolvimento do tumor está na busca de novas etiologias ou no reforço das

pesquisas já existentes sobre infecção e câncer. No entanto, ao relacionar a sensibilidade

__________________________________________________________________________DISCUSSÃO

dos fagos com o câncer de próstata associado à neoplasia intra-epitelial prostática,

verifica-se que a sensibilidade sobe para 50% a 75%, reforçando a hipótese que a

infecção por vírus pode levar a inflamação e consequentemente o desenvolvimento do

tumor. Klein et al (2008) relatou que as infecções podem levar a inflamação crônica, e

estas gerarem espécies reativas a oxigênio (ROS), o que lesa as células e promove a

atrofia inflamatória proliferativa (AIP) e a neoplasia intra-epitelial prostática (NIP). A

hiperproliferação, e as rápidas divisões podem levar ao acumulo de mutações,

promovendo o aparecimento do tumor.

Mediante disso, verifica-se que existem muitas etiologias para o câncer de próstata,

e o desenvolvimento de biomarcadores associado a plataformas eficientes de

diagnóstico torna-se necessário. Com relação ao desenvolvimento de plataformas de

detecção, os imunoensaios são extremamente vitais para diagnósticos clínicos, análises

ambientais e estudos bioquímicos.

No diagnóstico clínico, existe uma demanda para a análise rápida que auxilie no

diagnóstico preciso e tratamento da doença de um paciente ou condições do prejuízo.

Atualmente, imunoensaios enzimáticos (ELISA), realizado em placa de microtitulação é

a técnica mais comum utilizada para os imunoensaios. No entanto, com a demanda por

menor tempo de análise, menor volume de amostra e maior sensibilidade, outras

técnicas estão sendo exploradas para executar imunoensaios (LIMA et al, 2007).

Neste ponto, os sistemas de diagnósticos baseado em beads oferecem alternativa

atrativa para detecção de auto-anticorpos em soro humano, quando estes são acoplados

com epitopo antigênico (KOURILOV, STEINITZ, 2002).

No teste Beads-ELISA para a verificação do acoplamento do fago nos beads houve

uma diferença significativa entre o controle e o fago acoplado nos diversos tampões,

certificando-se a imobilização do clone selecionado a microesfera, mas a não

observação de diferença de acoplamento entre os tampões, permite analisar que por esse

teste não é possível avaliar o melhor tampão. De modo geral, imobilização dos alvos é

dependente da superfície da estrutura da partícula, bem como das condições da solução

tais como pH, temperatura, estringência iônica e outros (KAWAGUCHI, 2000).

__________________________________________________________________________DISCUSSÃO

Para o teste de bloqueio da pIII, verificou-se que a formação de colônia azul permite

concluir que a ligação do n-terminal do fago com o grupamento epóxi, não ocorre via

pIII, mas com maior probabilidade pela via da pVIII. A região da pIII contém três

domínios (N1, N2, CT), sendo que N1 e N2 (n-terminal) estão envolvidos com a

infecção do vírus na Ecoli ER2738 e o do CT na estabilidade do fago. Assim, o

bloqueio da pIII, via reação com o grupamento epóxi, seria prejudicial no

desenvolvimento de diagnóstico via microesfera, visto que é nessa região é que se

encontra o epítopo mimético às regiões antigênicas do câncer.

Ao se comparar as placas dos diferentes ensaios, pode-se verificar que o ensaio 4 foi

a placa que menor produziu colônias azuis, sugerindo que esse tampão não seja

adequado para esse tipo de acoplamento. Apesar de ser o tampão mais básico, visto que

imobilização de pequenas moléculas em grupamentos epóxi ativados é geralmente

acompanhada de valores alto de pH, de 9 a 11, devido ao desprotonamento do grupo

amino (WHEATLEY, SCHMIDT, 1999), a menor concentração salina durante o

acoplamento (outros tampões apresentaram uma molaridade salina superior a 1,5), pode

ter influenciado, haja vista que alta molaridade salina concentra grupos nucleofílicos da

molécula perto dos sítios ativos do grupamento epóxi do suporte (WHEATLEY, 1991;

WHEATLEY, et al., 1996).

___________________________________6. CONCLUSÕES

Os resultados da seleção e caracterização de peptídeos em diferentes estadiamentos

clínico-patológicos do câncer de próstata permitiram concluir que:

 Por meio da tecnologia de Phage Display foi possível selecionar peptídeos

imunorreativos contra os anticorpos circulantes em pacientes com câncer de

próstata em diferentes estadiamentos, apresentando baixa reação cruzada

com outras IgGs tais como HPB e controles saudáveis.

 Foi possível encontrar peptídeos especificamente para o estadiamento do

tumor precoce (pT1 e pT2) e para a fase avançada do tumor pT4, sendo que

nenhum peptídeo foi relevante para o estadiamento pT3.

 A semelhança entre o peptídeo consenso e as proteínas do capsídeo viral

HERVs fornecida pela bioinformática, sugere que o endovírus humano

poderia estar envolvido na etiologia do câncer, e por conseguinte, ser um

provável marcador tumoral ou ser utilizado em vacina de peptídeos, já que o

HERVs são de interesse como o potencial patógeno indutor da doença.

 A identificação dos fagos com a associação do câncer de próstata com NIP

possibilita a reafirmar as hipóteses que, através de infecções ocorre

processos inflamatórios que podem estar envolvidos no desenvolvimento do

tumor. Mas será importante avaliar a reatividade dos peptídeos

selecionados com maior número de pacientes com CaP, e incluir nas

análises outras doenças como a prostatite, doenças auto-imunes, e outros

câncer.

 Paralelamente, o desenvolvimento de uma nova plataforma que utiliza

microesferas magnéticas e peptídeos expressos pela pIII do fago, permite

um menor tempo do diagnóstico e um menor custo.

__________________________________7. REFERÊNCIAS

________________________________________________________________________REFERENCIAS

ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. Imunidade contra tumors. In:_________________.

Imunologia celular e molecular. Rio de Janeiro: Elsevier. Cap. 17, p. 401-421, 2005

ARAGÃO, A. J. O exame físico na avaliação do câncer de próstata. In:

WROCLAWSKI, E. R.; BENDHACK, D. A.; DAMIÃO, R.; ORTIZ, V. Guia Prático

de Urologia. São Paulo: Segmento. cap. 130, p. 437-438, 2003.

ARAP, W.; KOLONIN, M. G.; TREPEL, M.; LAHDENRANTA, J.; CARDO-VILA,

M.; GIORDANO, R. J.; MINTZ, P. J.; ARDELT, P. U.; YAO, V. J.; VIDAL, C. I.;

CHEN, L.; FLAMM, A.; VALTANEN, H.; WEAVIND, L. M.; HICKS, M. E.;

POLLOCK, R. E.; BOTZ, G. H.; BUCANA, C. D.; KOIVUNEN, E.; CAHILL, D.;

TRONCOSO, P.; BAGGERLY, K. A.; PENTZ, R. D.; DO, K. A.; LOGOTHETIS, C.

J.; PASQUALINI, R. Steps toward mapping the human vasculature by phage display.

Nat Med. New York. v. 8 n. 2 p. 121-127. Fev. 2002.

AVRAMIS, V. I.; AVRAMIS, E. V.; HUNTER, W.; LONG, M. C. Immunogenicity of

Native or Pegylated E. coli and Erwinia Asparaginases Assessed by ELISA and Surface

Plasmon Resonance (SPR-Biacore) Assays of IgG Antibodies (Ab) in Sera from

Patients with Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL). Anticancer Research. Attiki. v.

29. n. 1. p. 299-302. Jan. 2009.

AZZAY, H. M. E.; HIGHSMITH, W. E. Phage display technology: clinical

applications and recent inNovations. Clin Biochem, Canada. v.35. n. 6. p.425-445, Set.

2002.

BANEZ, L. L.; P. PRASANNA, L. SUN, A. ALI, Z. ZOU, B.L. ADAM, D.G.

MCLEOD, J.W. MOUL, S. SRIVASTAVA. Diagnostic potential of serum proteomic

patterns in prostate cancer. Journal of Urology. Hagerstown. v. 170. n. p. 442-446.

Ago. 2003.

BARBAS, C.F.III, BURTON, D.R., SCOTT, J.K., SILVERMAN, G.J. Phage Display:

A Laboratory Manual. Plain View, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

BAZHIN, A. V.; SAVCHENKO, M. S.; SHIFRIN, O. N.; DEMOURA, S.A.;

CHIKINA, S. Y.; JAQUES, G.; KOGAN, E. A.; CHUCHALIN, A. G.; PHILIPPOV,

________________________________________________________________________REFERENCIAS

P.P. Recoverin as a paraneoplastic antigen in lung cancer: the occurrence of anti-

recoverin autoantibodies in sera and recoverin in tumors. Lung Cancer. Oxford. v. 44.

p. 193-198. Maio. 2004.

BOESE, A.; SAUTER, M.; GALLI, U.; BEST, B.; HERBST, H.; MAYER, J.;

KREMMER, E.; ROEMER, K.; MUELLER-LANTZSCH N. Human endogenous

retrovirus protein cORF supports cell transformation and associates with the

promyelocytic leukemia zinc finger protein. Oncogene. Basingstoke. v. 19. n. 38. p.

4328–4336. Set. 2000.

BOK, R. A.; SMALL, E. J. Bloodborne biomolecular Markers in prostate cancer

development and progression. Nature Reviews Cancer. London. v. 2, n. 12. p. 918-

926, Dez. 2002.

BOSTWICK, D. G. Prostatic intraepithelial neoplasia. In: KAISARY, A. V.,

MURPHY, G. P., DENIS, L., GRIFFITHS, K. Textbook of prostate cancer: Pathology,

Diagnosis and Treatment. London: Martin Dunitz, cap. 3, p. 35-50, 1999.

BRADFORD, T. J.; WANG, X.; CHINNAIYAN, A. M. Cancer immunomics: Using

autoantibody signatures in the early detection of prostate cancer. Urologic Oncology:

Seminars and Original Investigations. Nova York. v. 24. n. 3. p. 237–242, Mai./Jun.

2006.

BRAWLEY, O. W.; ANKERST, D. P.; THOMPSON, I. M. Screening for prostate

cancer. CA Cancer J. Clin, Atlanta, v. 59, n. 3, p. 264-273, Maio/Jun. 2009.

BRICHORY, F. M.; MISEK, D. E.; YIM, A. M.; KRAUSE, M. C.; GIORDANO, T. J.;

BEER, D. G.; HANASH, S. M. An immune response manifested by the common

occurrence of annexins I and II autoantibodies and high circulating levels of IL-6 in

lung cancer. Proc. Natl. Acad .Sci. U.S.A. Washington. v. 98. n. 17. p. 9824-9829.

Ago. 2001.

BUKAWA, H.; FUKUSHIMA, J.; HAMAJIMA, K.; KIMURA, M.; TSUJI, T.; XIN,

K. Q.; OKUDA, K. Antibody responses raised against a conformational V3 loop

________________________________________________________________________REFERENCIAS

peptide of HIV-1. Microbiology and immunology. Tokyo. v. 39. n. 8. p. 607-614.

1995.

BUSSEMAKERS, M. J.; BOKHOVEN, A.; VAN VERHAEGH, G. W.; SMITH, F. P.;

KARRTHAUS, H. F.; SCHALKEN, J. A.; DEBRUYNE, F. M.; RU, N.; ISAACS, W.

B. DD3:A new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer

Research, Philadelphia. v. 59. n. 23. p. 5975-5979. Dez. 1999.

CABEZAS, E.; WANG, M.; PARREN, P. W.; STANFIELD, R. L.; SATTERTHWAIT,

A. C. A structure-based approach to a synthetic vaccine for HIV-1. Biochemistry.

Washington. v. 39. n. 47. p. 14377–14391. Nov. 2000.

CAMILO, R. L, Síntese e caracterização de nanopartículasmagnéticas de ferrita de

cobalto recobertas por3-aminopropiltrietoxissilano para uso comomaterial híbrido

em nanotecnologia. São Paulo (Doutorada em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear

– Materiais)-Universidade de São Paulo, 2006. 187p.

CAMPA. M. J.; SERLIN, S. B.; PATZ Jr.; E.F. Development of Novel tumor imaging

agents with phage-display combinatorial peptide libraries. Acad Radiol. New York. v.

9. n. 8. p. 927-932. Ago. 2002.

CANELLE, L.; BOUSQUET, J.; PIONNEAU, C.; HARDOUIN, J.; CHOQUET-

KASTYLEVSKY, G.; JOUBERT-CARON, R.; CARON, M. A proteomic approach to

investigate potential bioMarkers directed against membrane-associated breast cancer

proteins. Electrophoresis. Weinheim. v. 27. n. 8. p. 1609-1616. Abr. 2006.

CANELLE, L.; BOUSQUET, J.; PIONNEAU, C.; HARDOUIN, J.; CHOQUET-

KASTYLEVSKY, G.; JOUBERT-CARON, R.; CARON, M. A proteomic approach to

investigate potential bioMarkers directed against membrane-associated breast cancer

proteins. Electrophoresis. Weinheim. v. 27. n. 8. P. 1609-1616. Abr. 2006.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

CASIANO, C. A.; MEDIAVILLA-VARELA, M.; TAN, E. M.. Tumor-associated

Antigen Arrays for the Serological Diagnosis of Cancer. Molecular & Cellular

Proteomics. Bethesda. v. 5. n. 10. p. 1745-1759. Mai. 2006.

CASIANO, C.A.; MEDIAVILLA-VARELA, M.; TAN, E.M. Tumor-associated antigen

arrays for the serological diagnosis of cancer. Mol Cell Proteomics, Nova York, v. 5,

n.10. p. 1745-1759. Maio. 2006.

CATALONA, W. J. Prostate Cancer Screening. British Journal Of Urology

International. Irlanda. v. 94, n. 7, p. 964-966, 2004.

CATALONA, W.J.; ANTENOR, J.A.; ROEHL, K.A.; MOUL, J.W. Screening For

Prostate Cancer In High Risk Populations. The Journal Of Urology. Baltimore. v. 168.

n. 5. p. 1.980-1.984. Nov. 2002.

CAVARRETTA, I. T. R.; CULIG, Z.; KLOCKER, H.; EDER, I. E. Novel Experimental

Therapeutic Approaches for Prostate Cancer. EAU Update Series. Canada. v. 3. n. 4. p.

227-239. Dez. 2005.

CHEN, Y.T.; GURE, A.O.; TSANG, S.; STOCKERT, E.; JÄGER, E. Identification of

multiple cancer/testis antigens by allogeneic antibody screening of a melanoma cell line

library. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. Washington. v. 95. n. 12. p. 6919-23. Jun. 1998.

CHO-CHUNG, Y. S. Autoantibody biomarkers in the detection of cancer. Biochim.

Biophys. Acta. Amsterdam. v. 1762. n. 6. p. 587-591. Jun. 2006.

CONRAD, F.; ZHU, X .; ZHANG, X.; CHALKLEY, R. J.; BURLINGAME, A. L.;

MARKS, J. D.; LIU, B. Human antibodies targeting cell surface antigens

overexpressed by the hormone refractory metastatic prostate cancer cells: ICAM-1 is a

tumor antigen that mediates prostate cancer cell invasion. Journal of Molecular

Medicine. Berlim. v. 87. n. 5. p. 507-514. Mai. 2009.

CONROY, P. J.; HEARTY, S.; LEONARD, P.; O’KENNEDY, R. J. Antibody

production, design and use for biosensor-based applications. Seminars in Cell &

Developmental Biology. Amsterdan. v. 20. n. 1. p. 10–26. Fev. 2009.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

COOMBER, D.W.; WARD, R.L. Isolation of human antibodies against the central

DNA binding doMain of p53 from an individual with colorectal cancer using antibody

phage display. Clin Cancer Res. Philadelphia. v. 7. n. 9. p- 2802-2808. Set. 2001.

COVINI, G.; VON MTIHLEN, C.A.; PACCHETTI, S.; COLOMBO, M.; GHAN, E. K.

L. Diversity of antinuclear antibody responses in hepatocellular carcinoma. J Hepatol.

New York. v. 26. n. 6. p.1255-1265. Jun. 1997.

CRAWFORD, L.V.; PIM, D.C.; BULBROOK, R.D. Detection of antibodies against the

cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer. Int J Cancer, Weinheim.

v. 30. n. 4. p. 403-408. Out. 1982.

DAKAPPAGARI, N. K.; LUTE, K. D.; RAWALE, S.; STEELE, J. T.; ALLEN, S. D.;

PHILLIPS, G.; REILLY, R. T.; KAUMAYA, P. T. P. Conformational HER-2/neu B-

cell Epitope Peptide Vaccine Designed to Incorporate Two Native Disulfide Bonds

Enhances Tumor Cell Binding and Antitumor. Activities J. Biol. Chem. Bethesda. v.

280. n. 1. p. 54 – 63. Jan. 2005.

DE MARZO, A. M., PUTZI, M. J., NELSON, W. G. New concepts in the pathology of

prostatic epithelial carcinogenesis. Urology. v. 57(Suppl. A4), p. 103-114. 2001.

DENNIS, L. K.; DAWSON, D. V. Meta-analysis of measures of sexual activity and

prostate cancer. Epidemiology. Philadelphia. v. 13. n. 1. p. 72–79. Jan. 2002.

DISIS, M. L.; PUPA, S. M.; GRALOW, J. R.; DITTADI, R.; MENARD, S.;

CHEEVER, M. A. High-titer HER-2/neu protein-specific antibody can be detected in

patients with early-stage breast cancer. J Clin Onco., Baltimore. v. 15. n. 11. p. 3363-

3367. Nov. 1997.

DU, B.; QIAN, M.; ZHOU, Z.; WANG, P.; WANG, L.; ZHANG, X.; WU, M.;

ZHANG, P.; MEI, B. In vitro panning of a targeting peptide to hepatocarcinoma from a

phage display peptide library. Biochem Biophys Res Commun. San Diego. v. 342. n.

3. p. 956-962. Abr. 2006.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

DUNPHY, E. J.; JOHNSON, L.E.; OLSON, B.M.; FRYE, T.P.; MCNEEL, D.G. New

approaches to identification of antigenic candidates for future prostate cancer

immunotherapy. Update on Cancer Therapeutics. Canada. v. 1, n. 2, p. 273-284, Jun.

2006.

DYBWAD, A.; LAMBIN, P.; SIOUD, M.; ZOUALI, M. Probing the specificity of

human mieloma proteins with a random peptide phage library. Scand J Immunol,

Oxford. v. 57, n. 6, p. 583-590, Jun. 2003.

EISERICH, J. P.; HRISTOVA, M.; CROSS, C. E.; JONES, A. D.; FREEMAN, B. A.;

HALLIWELL, B.; VLIET, A. V. D. Formation of nitric oxide-derived inflammatory

oxidants by myeloperoxidase in neutrophils. Nature. Cambridge. v. 391. p. 393-397.

Jan. 1998.

FERLAY, J.; AUTIER, P.; BONIOL, M.; HEANUE, M.; COLOMBET, M.; BOYLE, P.

Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006. Ann Oncol. Canada,

v. 18, n. 3, p. 581–92, Fev. 2007.

FERRIEU-WEISBUCH, C.; MICHEL, S.; COLLOMB-CLERC, E.; POTHION, C.;

DELEAGE, G.; JOLIVET-REYNAUD, C. Characterization of prostate-specific antigen

binding peptides selected by phage display technology. J Mol Recognit. Chichester.

v.19. n.1. p.10-20. Jan-Fev. 2006.

FINN, J. O. Cancer Imunology. N England of J of Medicine, Nova York. v. 358, n. 25,

p. 2704-2715. Jun. 2008.

FORD, M. E.; HAVSTAD, S. L.; DEMERS, R..; JOHNSON, C. C.. Effects of false-

positive prostate cancer screening results on subsequent prostate cancer screening

behavior. Cancer Epidemiol. BioMarkers Prev. Philadelphia. v. 14. n. 1. p. 190-194.

Jan. 2005.

FORRESTER, S.; QIU, J.; MANGOLD, L.; PARTIN, A.; MISEK, D.; PHINNEY, B.;

WHITTEN, D.; ANDREWS, P.; DIAMANDIS,

E.; OMENN, G. S.; HANASH, S.;

HAAB, B. B. An experimental strategy for quantitative analysisof the humoral

________________________________________________________________________REFERENCIAS

immune response to prostate cancer antigens using natural protein microarrays.

Proteomics. Weinheim. v. 1. n. 5. p. 494-505. Abr. 2007.

FOSSA, A.; ALSOE, L.; CRAMERI, R.; FUNDERUD, S.; GAUDERNACK, G.;

SMELAND, E.B. Serological cloning of cancer/testis antigens expressed in prostate

cancer using cDNA phage surface display. Cancer Immunol Immunother,.

Heidelberg. v. 53. n. 5. p. 431-438. Jan. 2004.

GARCIA, M.; JEMAL, A; WARD, E. M.; CENTER, M. M.; HAO, Y.; SIEGEL, R. L.;

THUN, M. J.; Global Cancer Facts & Figures 2007. Atlanta, GA: American Cancer

Society, 2007. Disponível em:<

http:/www.cancer.org/downloads/STT/Global_Facts_and_Figures_2007_rev2.pdf>

Acesso em: 20 Jan. 2010.

GATTAS, N. Genética e câncer de próstata. In: WROCLAWSKI, E. R.; BENDHACK,

D. A.; DAMIAO, R.; ORTIZ, V. Guia Prático de Urologia. São Paulo: Segmento, cap.

128, p. 433-434, 2003.

GEHRING, A. G.; IRWIN, P. L.; REED, S. A.; TU, S. I.; ANDREOTTI, P. E.;

AKHAVAN-TAFTI, H.; HANDLEY, R. S. Enzyme-linked immunomagnetic

chemiluminescent detection of Escherichia coli O157: H7. J. Immunol. Methods.

Amsterdam. v. 293. n. 1-2. p. 97-106. Out. 2004.

GIMBA, E. R. P.; BARCINSKI, M. A. Molecular aspects of prostate cancer:

implications for future directions, Int. braz j urol. Rio de Janeiro. v. 29. n. 5. p. 401-

411. Set./Out. 2003.

GOEDERT, J .J.; SAUTER, M. E.; JACOBSON, L. P.; VESSELLA, R. L.;

HILGARTNER, M. W.; LEITMAN, S. F.; FRASER, M. C.; MUELLER-LANTZSCH,

N. G. High Prevalence of Antibodies against HERV-K10 in Patients with Testicular

Cancer but not with AIDS1. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. Philadelphia. v. 8.

n. 4. p. 293-296. Nov. 1999.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

GUNDERSEN, S. G.; HAAGENSEN, I.; JONASSEN, T. O.; FIGENSCHAU, K. J.;

DE JONGE, N.; DEELDER, A. M.. Magnetic beads antigen capture enzyme-linked

immunoassay in microtitre trays for rapid detection of schistosomal circulating anodic

antigen. J. Immunol.Methods. Amsterdam. v. 148. n.1-2. p. 1-8. Abr. 1992.

HANAHAN D.; WEINBERG, R.A. The hallMarks of cancer. Cell, Nova York. v. 100,

n. 1. p. 57-70. Jan. 2000.

HANASH, S. Harnessing immunity for cancer marker discovery. Nat Biotechnol. New

York. v. 21. n. 1. p. 37-38. Jan. 2003.

HANSEN, M. H.; OSTENSTAD, B.; SIOUD, M. Antigen-specific IgG antibodies in

stage IV long-time survival breast cancer patients. Molecular Medicine. Nova York. v.

7, n. 4, p. 230-239, Abr. 2001a.

HANSEN, M. H.; OSTENSTAD, B.; SIOUD, M. Identification of immunogenic

antigens using a phage-displayed cDNA library from an invasive ductal breast

carcinoma tumor. Int J Oncol, Grecia. v. 19, n. 6, p. 1303-1309, Dez. 2001b.

HÄRMÄ, H.; TARKKINEN, P.; SOUKKA, T.; LÖVGREN, T.; Miniature Single-

Particle Immunoassay for Prostate-specific Antigen in Serum Using Recombinant Fab

Fragments. Clinical Chemistry. Washington. v. 46. n. 1. p. 1755-1761. Nov. 2000.

HAYES, R. B.; POTTERN, L. M.; STRICKLER, H.; RABKIN, C.; POPE, V.;

SWANSON, G. M.; GREENBERG, R. S.; SCHOENBERG, J. B.; LIFF, J.;

SCHWARTZ, A. G.; HOOVER, R. N.; FRAUMENI JR, J. F. Sexual behaviour, STDs

and risks for prostate cancer. Br. J. Cancer. London. v. 82. n. 3 p. 718–725. Fev. 2000.

HEKIM, C.; LEINONEN, J.; NARVANEN, A.; KOISTINEN, N.; ZHU, L.;

KOIVUNEN, E.; VA¨ ISANEN, V.; STENMAN, U. H. Novel Peptide Inhibitors of

Human Kallikrein 2. The Journal of Biological Chemistry. Bethesda. v. 281. n. 18. p.

12555–12560. Mai. 2006.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

HETIAN, L.; PING, A.; SHUMEI, S.; XIAOYING, L.; LUOWEN, H.; JIAN, W.; LIN,

M.; MEISHENG. L.; JUNSHAN, Y.; CHENGCHAO, S. A Novel peptide isolated from

a phage display library inhibits tumor growth and metastasis by blocking the binding of

Vascular endothelial growth factor to its kinase doMain receptor. J Biol Chem.

Bethesda. v. 277. n. 45. p. 43137-43142. Ago. 2002.

HOU, T. S.; DOVE, M.; ANDERSON, J. Z.; ZHANG, J.; MACKENZIE, C.;

Identification of polypeptides with selective affinity to intact mouse cerebellar granule

neurons from a random peptide-presenting phage library. J. Neurosci. Methods.

Amsteram. v. 138. n. 1-2. p. 39-44. Set. 2004.

HOUGHTON, A.N.; GOLD, J.S.; BLACHERE, N.E. Immunity against cancer: lessons

learned from melanoma. Current Opinion in Immunology. New York. v. 13. p.134–

140. Abril. 2001.

HSU, C. L.; CHEN, Y. L.; YEH, S.; TING, H. J.; HU, Y. C.; LIN, H.; WANG, X.;

CHANG, C. The use of phage display technique for the isolation of androgen receptor

interacting peptides with (F/W)XXL(F/W) and FXXLY new signature motifs. J Biol

Chem. Bethesda. v. 278. n. 26. p. 23691-23698. Jun. 2003.

HU, S.; GUO, X.; XIE, H.; DU, Y.; PAN, Y.; SHI, Y.; WANG, J.; HONG, L.; HAN,

S.; ZHANG, D.; HUANG, D.; ZHANG, K.; BAI, F.; JIANG, H.; ZHAI, H.; NIE, Y.;

WU, K.; FAN, D. Phage display selection of peptides that inhibit metastasis ability of

gastric cancer cells with high liver-metastatic potential. Biochem Biophys Res

Commun, San Diego. v. 341, n. 4, p. 964-972, Março. 2006.

Instituto Nacional de Câncer. Coordenação de Prevenção e Vigilância. O câncer de

próstata: consenso do Ministério Nacional da Saúde. Rio de Janeiro: INCA, Janeiro, 02,

2010. Disponível

em:<http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/prostata/defini

cao> Acesso em: 07 de Janeiro de 2009.

INVITROGEN Dynabeads® Protein G. Disponível:

<http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/100.03D04D_Dynabeads_Protein_G_

(rev004).pdf>. Acesso em 20 de Jun. de 2008.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

ISHIDA, T. ; OBATA, Y. , OHARA, N.; MATSUSHITA, H. ; SATO, S. ;

UENAKA, A. ; SAIKA, T.; MIYAMURA, T.; CHAYAMA, K.; NAKAMURA, Y.;

WADA, H.; YAMASHITA, T.; MORISHIMA, T.; OLD, L.J.; NAKAYAMA, E.

Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using

autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. New York. v. 8. n.

15. p. 1-10. Nov. 2008.

JARMULOWICZ, M. R. The role of pathology in biopsy, diagnosis and management

of prostate cancer. In: KAISARY, A. V., MURPHY, G. P., DENIS, L., GRIFFITHS,

K. Textbook of prostate cancer: Pathology, Diagnosis and Treatment. London:

Martin Dunitz, 1999.

JEMAL, A.; SIEGEL, R.; WARD, E.; HAO, Y.; XU, J.; THUN, M. J. Cancer statistics.

CA Cancer J. Clin. Atlanta, v. 59, n. 3, p. 225-249, Maio/Jun. 2009.

JIA, W. D.; SUN, H. C.; ZHANG, J. B.; XU, Y.; QIAN, Y. B.; PANG, Y. B.; WANG,

L.; QIN, L. X.; LIU, Y. K. N.; TANG, Z. Y. A novel peptide that selectively binds

highly metastatic hepatocellular carcinoma cell surface is related to invasion and

metastasis. Cancer Lett. Irlande. v. 247. n. 2. p. 234-242. Jun. 2006.

KARAN, D.; LIN, M. F.; JOHNSSON, S. L.; BATRA, S. K. Current status of the

molecular genetics of human prostatics adenocarcinomas. Int J Cancer. Nova York. v.

103. n. 3. p. 285-293. Jan. 2003.

KAWAGUCHI, H.; Functional polymer microspheres, Prog. Polym. Sci. Oxford. v. 25.

n. 8. p-1171-1210. Out. 2000.

KELLY, K. A.; SETLUR, S. R.; ROSS, R.; ANBAZHAGAN, R.; WATERMAN, P.;

RUBIN, M. A.; WEISSLEDER, R.. Detection of Early Prostate Cancer Using a Hepsin-

Targeted Imaging Agent. Cancer Research. Philadelphia. v. 68. n. 7. p. 2286-2291.

Abr. 2008.

KERSHAW, M. H.; HSU, C.; MONDESIRE, W.; PARKER, L. L.; WANG, G.;

OVERWIJK, W. W.; LAPOINTE, R.; YANG, J. C.; WANG, R. F.; RESTIFO, N. P.;

________________________________________________________________________REFERENCIAS

HWU, P. Immunization against endogenous retroviral tumor-associated antigens.

Cancer Res. Philadelphia. v. 61. n. 21. p. 7920–7924. Nov. 2001.

KIM, H. J.; AHN, K. C.; TECHERA, A. G.; SAPIENZA, G. G. G.; GEE, S. J.;

HAMMOCKA, B. D. Magnetic beads-based phage anti-immunocomplex assay

(PHAIA) for the detection of the urinary biomarker 3-phenoxybenzoic acid to assess

human exposure to pyrethroid insecticides. Analytical Biochemistry. San Diego. v.

386. n. 1. p. 45-52. Mar. 2009.

KLEIN, E. A.; SILVERMAN, R. Inflammation, infection, and prostate cancer. Current

Opinion in Urology. London. v.18. n. 3. p. 315–319. Mai. 2008.

KORNEEVA, I.; BONGIOVANNI, A.M.; GIROTRA, M.; CAPUTO, T.A.; WITKIN,

S.S. Serum antibodies to the 27-kd heat shock protein in women with gynecologic

cancers. Am J Obstet Gynecol, New York. v. 183. n. 1. p. 18-21. Julho. 2000.

KOURILOV, V.; STEINITZ, M. Magnetic-beads enzyme-linked immunosorbent assay

verifies adsorption of ligand and epitope accessibility. Analytical biochemistry. San

Diego. v. 311. n. 2. p. 166-170. Dez. 2002.

KRUMHOLTZ, J. S.; CARVALHAL, G. F. RAMOS, C.G.; SMITH, D.S.; THORSON,

P.; YAN, Y. HUMPHREY, P.A.; ROEHL, K.A.; CATALONA, W.J. Prostate specific

antigen cutoff of 2.6 ng/ml for prostate cancer screening is associated with favorable

pathologic tumor features. Urology. Nova York. v. 60, n. 3, p. 469-474, Set. 2002.

LARSSON, A.; RONQUIST, G.; WULFING, C.; ELTZE, E.; BETTENDORF, O.;

CARLSSON, L.; NILSSON, B.O.; SEMJONOW, A. Antiprostasome antibodies:

possible serum Markers for prostate cancer metastasizing liability. Urol Oncol, Nova

York. v. 24, n. 3, p. 195-200, Maio-Junho. 2006.

LEIB-MOSCH, C.; BRACK-WERNER, R.; WERNER, T.; BACHMANN, M.; FAFF,

O.; ERFLE, V.; HEHLMANN, R. Endogenous retroviral elements in human DNA.

Cancer Res. Philadelphia. v. 50. n. 17. p. 5636s-5642s. Set. 1990.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

LEINONEN, J., WU, P., KOIVUNEN, E., NARVANEN, A., STENMAN, U.H.

Development of novel peptide ligands modulating the enzyme activity of prostate-

specific antigen. Scand J Clin Lab Invest Suppl, v. 233, p. 59-64, 2000.

LI, P. E.; NELSON, P. S. Prostate cancer genomics. Cur. Urol Rep. London. v. 2. n. 1.

p. 70-78. Fev. 2001.

LIMA, C. T.; ZHANG, Y. Beads-based microfluidic immunoassays: The next

generation. Biosensors and Bioelectronics. Amsterdam. v. 22. n. 7. p. 1197-1204. Fev.

2007.

LIU, B.; CONRAD, F.; COOPERBERG, M. R.; KIRPOTIN, D. B.; MARKS, J. D.

Mapping Tumor Epitope Space by Direct Selection of Single-Chain Fv Antibody

Libraries on Prostate Cancer Cells. Cancer Research, Philadelphia v. 64. n. 2 p. 704–

710. Jan. 2004.

MADRID, F.F. Autoantibodies in breast cancer sera: candidate bioMarkers and

reporters of tumorigenesis. Cancer Letters, Heidelberg. v. 230. n. 2. p. 187-198. Dez.

2005.

MANGENEY, M.; DE PARSEVAL, N.; THOMAS, G.; HEIDMANN, T. The full-

length envelope of an HERV-H human endogenous retrovirus has immunosuppressive

properties. J Gen Virol. England. v. 82. n. 10. p. 2515–2518. Out. 2001.

MCCAFFERTY, J. Phage display: factors affecting panning efficiency. In: B.K. Kay, J.

Winter, J. McCafferty, (Eds), Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory

Manual. Academic Press Inc., San Diego, CA, 1996, pp. 261–276.

MINENKOVA, O.; PUCCI, A.; PAVONI, E.; DE TOMASSI, A.; FORTUGNO, P.;

GARGANO, N.; CIANFRIGLIA, M.; BARCA, S.; DE PLACIDO, S.;

MARTIGNETTI, A.; FELICI, F.; CORTESE, R.; MONACI, P. Identification of tumor-

associated antigens by screening phage-displayed human cDNA libraries with sera from

tumor patients. Int. J. Cancer. New York. v. 106. n. 4. p. 534-44. Set. 2003.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

MINTZ, P.J.; KIM, J.; DO, K.A.; WANG, X.; ZINNER, R.G.; CRISTOFANILLI, M.;

ARAP, M.A.; HONG, W.K. TRONCOSO, P.; LOGOTHETIS, C.J.; PASQUALINI, R.;

ARAP, W. Fingerprinting the circulating repertoire of antibodies from cancer patients.

Nat Biotechnology. Nova York. v. 21, n.1, p. 57-63. Jan. 2003.

MÜNGER, K.; HOWLEY, P. M. Human papillomavirus immortalization and

transformation functions. Virus Res. Irlande. v. 89. n. 2. p. 213-228. Nov. 2002.

NILSSON, F.; TARLI, L.; VITI, F.; NERI, D. The use of phage display for the

development of tumor targeting agents. Adv Drug Deliv Rev. Irlande. v. 43. n. 2-3.

p.165-196. Set. 2000.

NWOSU, V.; CARPTEN, J.; TRENT, J. M.; SHERIDAN, R. Heterogeneity of genetic

alterations in prostate cancer: evidence of the complex nature of the disease. Human

Molecular Genetics. Oxford. v. 10 n. 20. p. 2313-2318. Out. 2001.

OHKUBO, S.; MIYADERA, K.; SUGIMOTO, Y.; MATSUO, K.; WIERZBA, K.;

YAMADA, Y. Substrate phage as a tool to identify Novel substrate sequences of

proteases. Comb Chem High Throughput Screen. Bussum. v. 4. n. 7. p. 573-83. Nov.

2001.

OTT, J. J.; ULLRICH, A.; MILLER, A. B. The importance of early symptom

recognition in the context of early detection and cancer survival. European Journal of

Cancer. Oxford. v. 45. n. 16. p. 2743-2748. Nov. 2009.

PAGANO, J. S.; BLASER, M.; BUENDIA, M. A.; DAMANIA, B.; KHALILI, K.;

RAAB-TRAUB, N.; ROIZMAN, B. Infectious agents and cancer: criteria for a causal

relation. Semin. Cancer Biol. Amsterdam. v. 14. n. 6. p. 453-471. Dez. 2004

________________________________________________________________________REFERENCIAS

PASSARELLA, R. J.; ZHOU, L.; PHILLIPS, J. G.; WU, H.; HALLAHAN, D. E.;

DIAZ, R. Recombinant Peptides as BioMarkers for Tumor Response to Molecular

Targeted Therapy. Clin Cancer Res. Philadelphia, v. 15. n. 20. P. 6421-6429. Out.

2009.

PATWA, T. H.; LI, C.; POISSON, L. M.; KIM, H. Y.; PAL, M.; GHOSH, D.;

SIMEONE, D. M.; LUBMAN, D. M. The identification of phosphoglycerate kinase-1

and histone H4 autoantibodies in pancreatic cancer patient serum using a natural protein

microarray. Eletrophoresis. Weinheim. v. 30. n. 12. p. 2215 – 2226. Jun. 2009.

PEULA-GARCIA, J. M.; MOLINA-BOLIVAR, J. A.; VELASCO, J.; ROJAS, A.;

GALISTEO-GONZÁLEZ, F. Interaction of Bacterial Endotoxine (Lipopolysaccharide)

with Latex Particles: Application to Latex Agglutination Immunoassays. Journal of

Colloid and Interface Science. San Diego. v. 245. n. 2. p. 230–236. Jan. 2002.

POPKOV, M.; RADER, C.; BARBAS, C. F. Isolation of human prostate cancer cell

reactive antibodies using phage display technology. Journal of Immunological

Methods. Amsterdam. v. 291. n. 1-2. p. 137-151. Ago. 2004.

POPKOV, M.; SIDRAC-GHALI, S.; ALAKHOV, V.; MANDEVILLE, R. Epitope-

specific antibody response to HT-1080 fibrosarcoma cells by mimotope immunization.

Clin Cancer Res, Philadelphia. v. 6, n. 9, p. 3629-35, Set. 2000.

PORKKA, K. P.; VISAKORPI, T. Molecular mechanisms of prostate cancer.

European Urology. Nova York, v. 45. n. 6.; p. 683-691. Jun. 2004.

RAN, Y.; HU, H.; ZHOU, Z.; YU, L.; SUN, L.; PAN, J.; LIU, J.; YANG, Z. Profiling

Tumor-Associated Autoantibodies for the Detection of Colon Cancer. Clin Cancer

Res. Philadelphia. v. 14. n. 9. p. 2696-700. Mai. 2008.

ROMANOV, V. I.; DURAND, D. B.; PETRENKO, V. A. Phage display selection of

peptides that affect prostate carcinoma cells attachment and invasion. The Prostate.

New Tork. v. 47. n. 4. p. 239-251. Jun. 2001.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

RUPRECHT, K.; MAYER, J.; SAUTER, M.; ROEMER, K.; MUELLER-LANTZSCH

N. Endogenous retroviruses and cancer. Cellular and molecular life sciences.

Heidelberg. v. 65, n. 21, p. 3366-3382. Nov. 2008.

SAHIN, U.; TURECI, O.; SCHMITT, H.; COCHLOVIUS, B.; JOHANNES, T.;

SCHMITS, R.; STENNER, F.; LUO, G.; SCHOBERT, I.; PFREUNDSCHUH, M.

Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host.

Proc. Natl. Acad .Sci. U.S.A. Washington. v. 92. n. 25. p. 11810-11813. Dez. 1995.

SCHEURLE, D.; DEYOUNG, M.P.; BINNINGER, D.M.; PAGE, H.; JAHANZEB, M.;

NARAYANAN, R. Cancer gene discovery using digital differential display. Cancer

Res, Philadelphia. v. 60, n. 15, p. 4037-4043. Ago. 2000.

SREEKUMAR, A.; LAXMAN, B.; RHODES, D. R.; BHAGAVATHULA, S.;

HARWOOD, J.; GIACHERIO, D.; GHOSH, D.; SANDA, M. G.; RUBIN, M. A.;

CHINNAIYAN, A.M. Humoral immune response to alpha-methylacyl-CoA racemase

and prostate cancer. J Natl Cancer Inst, Oxford. v. 96. n. 11. p. 834–843. Jun. 2004.

STAMEY, T. A.; MCNEIL, J. E. Adenocarcinoma of the prostate. Campbell’s

Urology. 6 ed. Edited by Walsh P C; Retik AB Stamey T A; Vaughan Jr. E D.

Philadelphia Saunders Co.; v. 2, p. 1.159-1.221, 1992.

STEPHEN, C. W.; HELMINEN, P.; LANE, D. P. Characterisation of epitopes on

human p53 using phage-displayed peptide libraries: insights into antibody-peptide

interactions. J Mol Biol. Oxford. v. 248. n. 1. p. 58-78. Abr. 1995.

STOCKERT, E.; JAGER, E.; CHEN, Y. T.; SCANLAN, M. J.; GOUT, I.; KARBACH,

J.; ARAND, M.; KNUTH, A.; OLD, L. J. A survey of the humoral immune response of

cancer patients to a panel of human tumor antigens. J. Exp. Med. New York. v. 187. n.

8. p. 1349-54. Abri. 1998.

STRAUSS, S. K; SCOOT, W. R. P; SYMMOUNS, M. F; MARVIN, D. A, On the

structures of filamentous bacteriophage Ff (fd, f1, M13), Eur Biophys J, v. 37, p-521-

527, 2007.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

SUNDARAM, R.; LYNCH, M .P.; RAWALE, S. V.; SUN, Y.; KAZANJI, M.;

KAUMAYA, P. T. P. De Novo Design of Peptide Immunogens That Mimic the Coiled

Coil Region of Human T-cell Leukemia Virus Type-1 Glycoprotein 21 Transmembrane

Subunit for Induction of Native Protein Reactive Neutralizing Antibodies. J. Biol.

Chem. Bethesda. v. 279. n. 23. p. 24141-24151. Jun. 2004.

TAMURA, N.; SUZUKI, K.; IWASE, A.; YAMAMOTO, T.; KIRA, S. Retroviral

infection as a putative pathogen for sarcoidosis. Nippon Rinsho. Tokyo.v. 52. n. 6. p.

1503–1507. Jun. 1994.

TAN, E. M. Autoantibodies as reporters identifying aberrant cellular mechanisms in

tumorigenesis. J Clin Invest, Michigan. v. 108. n. 10. p. 1411-1415. Nov. 2001.

TONG, Y. Q.; ZHANG, Z. J.; LIU, B.; HUANG, J.; LIU, H.; LIU, Y.; GUO, F. J.;

ZHOU, G. H.; XIE, P. L.; LI, Y. H.; ZUO, C. H.; HU, J. Y.; LI G. C. Autoantibodies as

potential biomarkers for nasopharyngeal carcinoma. Proteomics. Weinheim. v. 8. n. 15.

p. 3185-3193. Ago. 2008.

URISMAN, A.; MOLINARO, R. J; FISCHER, N.; PLUMMER, S. J; CASEY, G.;

KLEIN, E. A.; MALATHI, K.; MAGI-GALLUZZI, C.; TUBBS, R. R; GANEM, D.;

SILVERMAN, R. H; DERISI, J. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate

tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS pathogens. San

Francisco. v. 2. n. 3. p. 0211-0225. Mar. 2006.

VON MENSDORFF-POUILLY, S.; VERSTRAETEN, A. A.; KENEMANS, P.;

SNIJDEWINT, F. G.; KOK, A.; VAN KAMP, G. J.; PAUL, M. A.; VAN DIEST, P. J.;

MEIJER, S.; HILGERS, J. Survival in early breast cancer patients is favorably

influenced by a natural humoral immune response to polymorphic epithelial mucin. J

Clin Oncol, Baltimore. v. 18. n. 3. p. 574-583. Fev. 2000.

WANG, K.; XU, X.; NIE, Y.; DAI, L.; WANG, P.; ZHANG, J. Identification of tumor-

associated antigens by using SEREX in hepatocellular carcinoma. Cancer Letters.

Irlande. v. 281. n. 2. p. 144-150. Ago. 2009.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

WANG, X.; YU, J.; SREEKUMAR, A.; VARAMBALLY, S.; SHEN; R.;

GIACHERIO, D.; MEHRA, R.; MONTIE, J. E.; PIENTA, K. J.; SANDA, M. G.;

KANTOFF, P. W.; RUBIN, M. A.; WEI, J. T.; GHOSH, D.; CHINNAIYAN, A. M.

Autoantibody Signatures in Prostate Cancer. N Engl J Med. Boston. v. 353. n. 12. p.

1224-1235. Set. 2005.

WANG, X. Autoantibody Biomarkers in Prostate Cancer. Lab Med. Nova York. v. 39.

n. 3. p. 165-171. Mar. 2008.

WANG-JOHANNING, F.; FROST, A. R.; JOHANNING, G. L.; KHAZAELI, M. B.;

LOBUGLIO, A. F.; SHAW, D. R.; STRONG, T. V. Expression of human endogenous

retrovirus k envelope transcripts in human breast cancer. Clin. Cancer Res.

Philadelphia. v. 7. n. 6. p. 1553-1560. Jun. 2001.

WANG-JOHANNING, F.; LIU, J.; RYCAJ, K.; HUANG, M.; TSAI, K..; ROSEN, D.

G.; CHEN, D. T.; LU, D. W.; BARNHART, K. F.; JOHANNING, G. L. Expression of

multiple human endogenous retrovirus surface envelope proteins in ovarian cancer. Int.

J. Cancer. New York. v. 120. n. 1. p. 81-90. Jan. 2006.

WENTZENSEN, N.; COY, J. F.; KNAEBEL, H. P.; LINNEBACHER, M.; WILZ, B.;

GEBERT, J.; VON KNEBEL DOEBERITZ, M. Expression of an endogenous retroviral

sequence from the HERV-H group in gastrointestinal cancers. Int. J. Cancer. New

York.Irlande. v. 121. n. 7. p. 1417-1423. Out. 2007.

WHEATLEY, J. B.; JR SCHMIDT , D. E..; Salt-induced immobilization of affinity

ligands onto epoxide activated supports. J Chromatography A. Amsterdam. v. 849.

n.1. p- 1–12. Jul. 1999.

WHEATLEY, J. B; LYTTLE, M. H; HOCKER, M. D, SCHMIDT, D. E. JR., Salt-

induced immobilizations of DNA oligonucleotides on an epoxide-activated high-

performance liquid chromatographic affinity support. J Chromatography A.

Amsterdam.v. 726. n. 1-2. p. 77-90. Mar. 1996.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

WHEATLEYA, J. B. Effect of antigen size on optimal ligand density of immobilized

antibodies for a high-performance liquid chromatographic support, J Chromatography

A. Amsterdam. v. 548. n. 1-2. p. 243-253. Jul. 1991.

WHITEAKER, J. R.; ZHAO, L.; ZHANG, H. Y.; FENG, L. C.; PIENING, B. D.;

ANDERSON, L.; PAULOVICH, A. G. Antibody-based enrichment of peptides on

magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers.

Analytical Biochemistry. San Diego. v. 362. n. 1. p. 44-54. Mar. 2007.

WHITEAKER, J. R.; ZHAO, L.; ZHANG, H. Y.; FENG, L.; PIENING, B. D.;

ANDERSON, L.; PAULOVICH, A. G. Antibody-based enrichment of peptides on

magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum bioMarkers.

Analytical Biochemistry. San Diego. v. 362. n. 1. p. 44–54. Mar. 2007.

WILLATS, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol Biol.

Dordrecht. v. 50. n. 6. p. 837-54. Dez. 2002.

WU, P.; ZHU, L.; STENMAN, U. H.; LEINONEN, J. Immunopeptidometric assay for

enzymatically active prostate-specific antigen. Clin Chem. Washington. v. 50. n. 1. p.

125-129. Jan. 2004.

YAGIHASHI, A.; ASANUMA, K.; KOBAYASHI, D.; TSUJI, N.; SHIJUBO, Y.;

ABE, S.; HIROHASHI, Y.; TORIGOE, T.; SATO, N.; WATANABE, N. Detection of

autoantibodies to livin and survivin in Sera from lung cancer patients. Lung Cancer.

Irlande. v. 48. n. 2. p. 217-221. Maio. 2005b.

YAGIHASHI, A.; OHMURA, T.; ASANUMA, K.; KOBAYASHI, D.; TSUJI, N.;

TORIGOE, T.; SATO, N.; HIRATA, K.; WATANABE, N. Detection of autoantibodies

to survivin and livin in sera from patients with breast cancer. Clin Chim Acta. Irlande.

v. 362. n. 1-2. p. 125-130. Dez. 2005a.

YANG, J. C.; PERRY-LALLEY, D. The envelope protein of an endogenous murine

retrovirus is a tumor-associated T-cell antigen for multiple murine tumors. J

Immunother. Hagerstown. v. 23. n. 2. p. 177–183. Abri. 2000.

________________________________________________________________________REFERENCIAS

ZHONG, L.; GE, K..; ZU, J. C.; ZHAO, L. H.; SHEN, W. K.; WANG, J. F.; ZHANG,

X. G.; GAO, X.; HU, W.; YEN, Y.; KERNSTINE, K. H. Autoantibodies as potential

biomarkers for breast cancer. Breast Cancer Res. United Kingdom v. 10. n. 3. p. 2-8.

Mai. 2008.

ZIMERING, M. B.; THAKKER-VARIA, S. Increased fibroblast growth factor-like

autoantibodies in serum from a subSet of patients with cancer-associated

hypercalcemia. Life Sciences. Amesterdan v. 71. n. 25. p. 2939–2959. Nov. 2002.

ZURITA, A. J.; ARAP, W.; PASQUALINI, R. Mapping tumor vascular diversity by

screening phage display libraries. J Control Release. Amsterdan. v. 91. n. 1-2. p. 183-

186. Ago. 2003.

_________________________________________ ANEXOS

Anexo 1 – Estadiamento, classificação TNM para o câncer de próstata.

Estadiamento e classificação TNM para o câncer de próstata (fonte: Brasil.

Ministério da Saúde, 2000 ).

T - Tumor Primário (a classificação patológica é idêntica à clínica com exceção à

inexistência de pT1).

TX O tumor primário não pode ser avaliado.

T0 Não há evidência de tumor primário.

T1 Tumor não diagnosticado clinicamente, não palpável ou visível por meio de

exame de imagem.

T1a Achado histológico incidental em 5% ou menos de tecido ressecado.

T1b Achado histológico incidental em mais de 5% de tecido ressecado.

T1c Tumor identificado por biópsia por agulha (p.ex., devido a PSA de rastreamento

elevado).

T2 Tumor confinado à próstata.

T2a Tumor que envolve uma metade de um dos lobos ou menos.

T2b Tumor que envolve mais da metade de um dos lobos, mas não ambos os lobos.

T2c Tumor que envolve ambos os lobos.

T3 Tumor que se estende através da cápsula prostática.

T3a Extensão extracapsular (uni- ou bilateral).

T3b Tumor que invade vesícula(s) seminal(ais).

T4 Tumor está fixo ou invade outras estruturas adjacentes, que não as vesículas

seminais: colo vesical, esfíncter externo, reto, músculos elevadores do ânus, ou

parede pélvica.

N - Linfonodos Regionais.

NX Os linfonodos regionais não podem ser avaliados.

N0 Ausência de metástase em linfonodo regional.

N1 Metástase em linfonodo regional.

M - Metástase à Distância.

MX A presença de metástase à distância não pode ser avaliada.

M0 Ausência de metástase à distância.

M1 Metástase à distância.

M1a Linfonodo(s) não regional(ais).

M1b Osso(s).

M1c Outra(s) localização(ões).

Anexo II

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA

Termo de Consentimento

O Laboratório de Nanotecnologia dirigido pelo Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho

juntamente com o Serviço de Urologia, do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de

Uberlândia, estão realizando um estudo genético relacionado ao Câncer de Próstata. O

projeto consiste no estudo da Biologia Molecular do Câncer de Próstata. Para realização dos

exames laboratoriais será necessária a coleta de 10 ml de sangue periférico, e biópsias de

tecido normais e tumores da próstata. Cabe ressaltar, que todo material utilizado será estéril

e descartável, e no caso das biópsias, serão realizadas juntamente com os procedimentos

rotineiros do centro cirúrgico do Hospital de Clínicas, sem qualquer desconforto adicional

ao paciente. O material coletado será enviado ao laboratório de Genética Molecular da

Universidade Federal de Uberlândia, onde serão realizados os exames de RNA e DNA. É

direito do paciente em pedir esclarecimentos a respeito da finalidade da pesquisa, destino do

material coletado e resultados dos exames realizados. Espera-se que, com este estudo seja

possível detectar em que estágio de desenvolvimento se encontra a doença no paciente, bem

como definir os possíveis biomarcadores a serem utilizados na detecção precoce, auxiliando

o tratamento. Almeja-se com isso, estabelecer um programa de tratamento precoce e

integrado do paciente, a fim de prevenir o desenvolvimento da doença.

Os pacientes e contatos familiares que concordam em participar da pesquisa poderão

desistir de fazê-lo a qualquer momento, sem que haja nenhum prejuízo próprio. Pelos

presentes termos apresentados por este documento, Eu, concordo em colaborar com a

pesquisa, declarando estar ciente dos riscos, benefícios e direitos.

Assinatura____________________________________________________________

Testemunhas____________________________________________________________

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