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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibtor 1) análise in silico da sequência
genômica de Nicotiana tabacum e estudo de parceiros de interação
proteína-proteína.
EDWARD JOSÉ STRINI
RIBEIRÃO PRETO, SP
2010
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Genética
SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibtor 1) análise in silico da sequência
genômica de Nicotiana tabacum e estudo de parceiros de interação
proteína-proteína.
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de MESTRE em
CIÊNCIAS – Área de concentração GENÉTICA
GERAL
Aluno Edward José Strini
Orientadora Profa. Dra. Maria Helena de Souza Goldman
Ribeirão Preto
-2010-
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Strini, Edward José
SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibtor 1) análise in silico da sequência genômica de Nicotiana
tabacum e estudo de parceiros de interação proteína-proteína./ Edward José Strini; orientadora
Maria Helena de Souza Goldman – Ribeirão Preto – 2010.
115 p. 52 il.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP – Área
de concentração Genética Geral.
1. SCI1. 2. Nicotiana tabacum. 3. Pistilo 4. Interação proteína-proteína. 5. Duplo-Híbrido. 6.
Pull-down 7. Ciclo celular.
PARECER DA BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. ________________________________________________________________
Instituição ______________________________________________________________
Parecer _________________________________________________________________
Assinatura ______________________________________________________________
Prof. Dr. ________________________________________________________________
Instituição ______________________________________________________________
Parecer _________________________________________________________________
Assinatura ______________________________________________________________
Prof. Dr. ________________________________________________________________
Instituição ______________________________________________________________
Parecer _________________________________________________________________
Assinatura ______________________________________________________________
Ribeirão Preto, _____ de ________________ de 2010.
natureza é exatamente simples, se conseguirmos encará-la
de modo apropriado. Essa crença tem-me auxiliado,
durante toda a minha vida, a não perder as esperanças, quando
surgem grandes dificuldades de investigação."
Albert Einstein
“A
À minha mãe.
MUITO OBRIGADO...
À Profa. Dra. Maria Helena de Souza Goldman, toda minha gratidão pela oportunidade
oferecida, confiança, orientação, apoio e amizade.
Ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto pela oportunidade e
suporte oferecidos durante a realização deste trabalho.
À CAPES, pela bolsa concedida.
À FAPESP pelo suporte financeiro.
À Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, pela utilização de sua estrutura e
recursos.
Ao Prof. Dr. Gustavo Henrique Goldman, do Departamento de Ciências Farmacêuticas,
FFCFRP/USP, pela confiança, utilização de suas estruturas e recursos, e ajuda prestada.
À Profa. Dra. Zilá Luz Paulino Simões, do Laboratório de Genética do Desenvolvimento de
Insetos, Departamento de Genética, FMRP/USP pela utilização dos aparelhos nanodrop.
Ao Prof. Dr. Roy Edward Lason, do Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, pelo empréstimo de recursos importantes para a realização dos experimentos
de Pull-down.
À Profa. Dra. Maria Célia Jamur e à Profa. Dra. Constance Oliver, do Departamento de Biologia
Celular e Molecular da FMRP/USP, pela utilização do aparelho sonicador.
Ao Prof. Dr. Wagner Eustáquio Paiva Avelar, do Departamento de Biologia da FFCLRP/USP,
pela utilização do microscópio.
À Profa. Dra. Maria Cristina da Silva Pranchevicius, da Universidade Federal do Tocantins,
pela amizade e ajuda prestada nos experimentos de Pull-down.
Ao Prof. Dr. Luis Lamberti Pinto da Silva, do Departamento de Biologia Celular e Molecular da
FMRP/USP, pelas informações e conselhos nos experimentos de duplo-híbrido.
Ao Prof. Dr. João Atílio Jorge, do Departamento de Biologia da FFCLRP/USP, pelas
informações sobre manipulação de leveduras e empréstimo de recursos.
À Profa. Dra. Tiana
Kohlsdorf, do
Departamento de Biologia da FFCLRP/USP, por
disponibilizar o acesso à sua estrutura e recursos.
À Dra. Taísa Magnani Dinamarco, do Departamento de Ciências Farmacêuticas, FCFRP/USP,
pelo auxílio na preparação das amostras analisadas por espectrometria de massa.
Às técnicas do Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, FFCLRP/USP, Dra. Andréa Carla
Quiapim da Silva e Viviane Cossalter, pela amizade e exaustiva colaboração na realização
deste trabalho.
Ao Msc. Michael dos Santos Brito, pela amizade, ajuda nos experimentos de Western Blot e
cuidados dispensados às plantas na Casa de Vegetação.
Ao Msc. Henrique César De Paoli, parceiro de SCI1.
À Msc. Ana Paula Gallina, pela amizade e colaboração.
À Dra. Fernanda Andrade Silva Torres, amiga de longa data, pelo auxílio na revisão deste
trabalho.
Ao Dr. Douglas Dalle Luche, pelo auxílio nos experimentos de Western Blot.
Ao amigo André Luis da Silva Breve, pelo companheirismo e ajuda na elaboração da arte
presente na capa deste trabalho.
À Silvia Andrade do Nascimento, técnica do Departamento de Bioquímica da FMRP, por toda
ajuda prestada.
Ao Paulo Rosa Júnior, técnico do Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, FFCLRP, pela
amizade e colaboração.
À Leomina de Jesus da Silva Souza, funcionária do Departamento de Biologia, FFCLRP, pela
convivência e amizade.
Aos amigos do laboratório Cristiane, Danillo, Greice, Luis, Marcella, Nilton e Samantha, pelo
agradável convívio, ajuda e companheirismo.
À minha família que sempre me apoiou.
À todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
Sumário
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................................................xi
LISTA DE FIGURAS................................................................................................................................xii
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................xviii
RESUMO ..................................................................................................................................................xix
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................................................1
1.1
C
ARACTERIZAÇÃO DE
Nicotiana tabacum L. .....................................................................................1
1.2
V
ISÃO GERAL DA FLOR
.......................................................................................................................1
1.2.1 Estrutura e função do pistilo......................................................................................................2
1.3
E
STUDO DE GENES PREFERENCIALMENTE EXPRESSOS NO ESTIGMA
/
ESTILETE DE
N. tabacum.............3
1.3.1 O gene SCI1 de N. tabacum .......................................................................................................4
1.4
M
ECANISMOS GENÉTICOS ENVOLVIDOS NO CONTROLE DO CICLO CELULAR
.......................................5
1.5
M
ECANISMOS GENÉTICOS ENVOLVIDOS NA DIFERENCIAÇÃO DO MERISTEMA FLORAL
........................6
1.6
T
ÉCNICAS PARA INVESTIGAÇÃO DE INTERAÇÃO ENTRE PROTEÍNAS
...................................................7
1.6.1 Duplo-Híbrido ...........................................................................................................................7
1.6.2 Pull-down...................................................................................................................................9
2. OBJETIVOS .........................................................................................................................................12
2.1
O
BJETIVO GERAL
..............................................................................................................................12
2.2
O
BJETIVOS ESPECÍFICOS
...................................................................................................................12
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................................14
3.1
M
ATERIAL
V
EGETAL
........................................................................................................................14
3.2
P
REPARAÇÃO DE CÉLULAS DE
Escherichia coli
COMPETENTES PARA TRANSFORMAÇÃO
(S
AMBROOK
et al.,
1989)............................................................................................................................................14
3.2.1 Células eletrocompetentes ......................................................................................................14
3.2.2 Células competentes para transformação por choque térmico (Método de CaCl
2
) ................15
3.3
T
RANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS DE
E.coli
COMPETENTES
(S
AMBROOK
et al.,
1989...........................15
3.3.1 Eletroporação de E. coli ..........................................................................................................15
3.3.2 Transformação de células competentes de E. coli ...................................................................15
3.4
P
REPARAÇÃO DE
DNA
PLASMIDIAL
.................................................................................................16
3.4.1 Mini-preparação de DNA plasmidial.......................................................................................16
3.5
D
IGESTÃO DO
DNA
UTILIZANDO ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
...............................................................16
3.6
E
LETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
...............................................................................................17
3.7
P
URIFICAÇÃO DE FRAGMENTOS DE
DNA
A PARTIR DE GEL DE AGAROSE
,
UTILIZANDO
FENOL
/
CLOROFÓRMIO
.............................................................................................................................17
3.8
P
REPARAÇÕES DE
RNA ....................................................................................................................18
3.8.1 Isolamento de RNA total em larga escala (Dean et al., 1985).................................................18
3.9
S
EQUENCIAMENTO DE
DNA .............................................................................................................19
3.9.1 Reação de sequenciamento de DNA (PCR) .............................................................................19
3.9.2 Purificação e precipitação da reação de sequenciamento ......................................................19
3.10
C
ONSULTA A BANCO DE DADOS E COMPARAÇÃO ENTRE SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS
..................20
3.11
Q
UANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS
........................................................21
3.12
S
ÍNTESE DE C
DNA
SS
(
SINGLE STRAND C
DNA) ..............................................................................21
3.13
C
LONAGEM DO PRODUTO DE
PCR
NO VETOR
PCR
®
-B
LUNT
II-TOPO
(I
NVITROGEN
) ....................22
3.14
S
ISTEMA
G
ATEWAY
(I
NVITROGEN
).................................................................................................23
3.14.1 Amplificação da sequência codificadora do gene para entrada no Sistema Gateway ..........23
3.14.2 Recombinação da região codificadora do gene, no vetor de entrada pDONR 201 ou pDONR
221 (Invitrogen) ................................................................................................................................24
3.14.3 Transferência da região codificadora do gene, para os vetores de expressão do sistema de
duplo-híbrido ....................................................................................................................................25
3.14.4. Transferência da região codificadora do gene SCI1 para o vetor de expressão de proteína
(pDEST17) ........................................................................................................................................28
3.15
A
NÁLISE IN SILICO DA SEQUÊNCIA GENÔMICA DE
SCI1 ..................................................................29
3.15.1 Comparação das sequências genômicas de SCI1 de N. tabacum e A. thaliana.....................29
3.16
E
STUDO DE POSSÍVEIS PARCEIROS DE
SCI1
ATRAVÉS DE ENSAIOS DE
D
UPLO
-H
ÍBRIDO
..................30
3.16.1 Obtenção das sequências codificadoras e clonagem em vetores específicos.........................31
3.16.1.1 Clonagem da sequência codificadora de MAPK nos vetores pDEST22 e pDEST32..........31
3.16.1.2 Clonagem da sequência codificadora da proteína AGAMOUS no vetor pDEST22 ...........35
3.16.1.3 Clonagem da sequência codificadora de ciclinaD3;2 nos vetores pDEST22 e pDEST32..36
3.16.1.4 Clonagem da sequência codificadora de CDKA nos vetores pDEST22 e pDEST32 ..........38
3.16.1.5 Clonagem das sequências codificadoras de ciclinaA1;1 e ciclinaA2;2 nos vetores
pDEST22...........................................................................................................................................40
3.16.1.6 Clonagem da sequência codificadora de ciclinaA2;2, com o sítio destruction box deletado,
nos vetores pDEST22........................................................................................................................42
3.16.1.7 Clonagem da sequência codificante de SCI nos vetores pDEST22 e pDEST32 .................44
3.16.2 Ensaio de Duplo-híbrido........................................................................................................44
3.16.2.1 Células de leveduras competentes ......................................................................................44
3.16.2.2 Co-transformação em células de S. cerevisiae ...................................................................45
3.16.2.3 Transformação de células de S. cerevisiae por acasalamento............................................46
3.16.2.4 Análise do fenótipo dos transformantes para o gene repórter HIS3...................................48
3.16.2.5 Análise do fenótipo dos transformantes para o gene repórter lacZ....................................49
3.17
E
STUDO DE POSSÍVEIS PARCEIROS DE
SCI1
ATRAVÉS DE ENSAIOS DE
P
ULL
-
DOWN
.........................50
3.17.1 Expressão da proteína heteróloga SCI1 ................................................................................50
3.17.2 Extração de proteínas de estigma e estilete de plantas RNAi-SCI1.......................................51
3.17.3 Ensaio de Pull-down ..............................................................................................................51
3.17.4 Identificação por Espectrometria de Massa das proteínas obtidas no ensaio de Pull-down.52
3.18
T
AMPÕES E
S
OLUÇÕES
....................................................................................................................53
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................................................57
4.1
A
NÁLISE DA SEQUÊNCIA GENÔMICA DE
SCI1
DE
Nicotiana tabacum...............................................57
4.1.1 Busca in silico por elementos cis regulatórios.........................................................................60
4.1.2 Comparação das sequências genômicas de SCI1 de Nicotiana tabacum e Arabidopsis
thaliana .............................................................................................................................................64
4.2
B
USCA DE POSSÍVEIS PARCEIROS DE
SCI1
ATRAVÉS DE ENSAIOS DE DUPLO HÍBRIDO
.......................67
4.2.1 Obtenção das sequências codificadoras e clonagem em vetores específicos...........................67
4.2.1.1 Sequências presentes no banco de dados TOBEST...............................................................67
4.2.1.1.1 Clonagem da sequência codificadora de MAPK nos vetores pDEST22 e pDEST32.........68
4.2.1.1.2 Clonagem da sequência codificadora da proteína AGAMOUS no vetor pDEST22 ..........71
4.2.1.2 Sequências presentes no banco de dados GenBank (NCBI) .................................................74
4.2.1.2.1 Clonagem da sequência codificadora de ciclinaD3;2 nos vetores pDEST22 e pDEST32.74
4.2.1.2.2 Clonagem da sequência codificadora de CDKA nos vetores pDEST22 e pDEST32 .........78
4.2.1.2.3 Clonagem das sequências codificadoras de ciclinaA1;1 e ciclinaA2;2 nos vetores
pDEST22...........................................................................................................................................82
4.2.1.2.4 Clonagem da sequência codificadora de ciclinaA2;2, sem a região destruction box, no
vetor pDEST22..................................................................................................................................84
4.2.1.3 Clonagem da sequência codificante de SCI nos vetores do sistema de duplo-híbrido .........86
4.2.2 Ensaios de duplo-híbrido.........................................................................................................87
4.2.2.1 Análise do fenótipo dos transformantes para os genes HIS3 e lacZ .....................................87
4.3
B
USCA DE POSSÍVEIS PARCEIROS DE
SCI1
ATRAVÉS DE ENSAIOS DE PULL
-
DOWN
.............................92
4.3.1 Expressão da proteína heteróloga SCI1 ..................................................................................92
4.3.2 Extração de proteínas de estigma e estilete .............................................................................93
4.3.3 Ensaio de pull-down ................................................................................................................93
4.3.4 Identificação por espectrometria de massa das proteínas obtidas no ensaio de pull-down ....94
5. CONCLUSÕES ..................................................................................................................................105
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................................107
xi
Lista de Abreviaturas e Siglas
3AT 3-Amino-1,2,4-triazole
AD domínio de ativação do fator de transcrição GAL4 (Activation Domain)
ARF auxin-response factor
BD domínio de ligação ao DNA do fator de transcrição GAL4 (DNA Binding Domain)
CDS CoDing Sequence (Sequência codificadora)
SEX super expressão
DDB deleção do D-Box
DEPC Dimetil pirocarbonato
DMF Dimethylformamide
E/E estigma e estilete
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
KRP Kip-Related Proteins
LiAc Acetato de Lítio
NPA N-1-naphthylphthalamic acid
PEG PolyEthylene Glycol
SC Synthetic Complete médium
SCI1 Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SSH Suppression Subtractive Hybridization
SSZ Stigmatic Secretory Zone
STT Stylar Transmiting Tissue
UTR Untranslated region
X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-D-galactopyranoside
xii
Lista de Figuras
Figura 01: Visão detalhada da estrutura e órgãos constituintes de um botão floral. Fonte:
Mauseth, 1995..............................................................................................................................02
Figura 02: Esquema ilustrativo do sistema de duplo-híbrido......................................................08
Figura 03: Estrutura do plasmídeo PCR
®
-Blunt II-TOPO do Kit Zero Blunt® TOPO® PCR
Cloning Kit (Invitrogen), evidenciando a região do sítio múltiplo de clonagem..........................22
Figura 04: Mapa de restrição do vetor pDONR201 (Invitrogen), destinado a inserção de
produtos de PCR por recombinação, na região entre os nucleotídeos 111 e 2352. ......................25
Figura 05: Mapa do vetor pDONR221 (Invitrogen), destinado a inserção de produtos de PCR
por recombinação, na região entre os nucleotídeos 801 e 2754. ...................................................26
Figura 06: Esquema ilustrativo do vetor de expressão em leveduras pDEST22 (Invitrogen),
destinado a inserção de fragmentos presentes no vetor de entrada, via recombinação, na região
entre os nucleotídeos 2245 e 3841................................................................................................27
Figura 07: Mapa do vetor de expressão em leveduras pDEST32 (Invitrogen). A recombinação
ocorre na região compreendida entre os nucleotídeos 2161 e 3757.............................................27
Figura 08: Mapa de restrição do plasmídeo pDEST17 (Invitrogen), destinado à formação do
vetor de expressão de proteínas em fusão com uma tag de 6 histidinas, sob controle do promotor
T7...................................................................................................................................................28
Figura 09: Esquema ilustrando a estratégia utilizada para amplificação da sequência
codificadora da enzima MAPK através do clone TOBEST063E05.............................................32
Figura 10: Esquema mostrando as sequências dos primers utilizados na amplificação da CDS
da MAPK......................................................................................................................................33
Figura 11: Desenho ilustrativo das sequências dos primers utilizados na amplificação da CDS
de AGAMOUS..............................................................................................................................35
Figura 12: Esquema ilustrativo das sequências dos primers utilizados na amplificação da CDS
da ciclinaD3;2 de N. tabacum......................................................................................................37
xiii
Figura 13: Esquema ilustrativo das sequências dos primers TH-CDKA-Fw e TH-CDKA-Rv,
utilizados na amplificação da CDS da CDKA de N. tabacum.....................................................39
Figura 14: Esquema ilustrativo das sequências dos primers Nt-CYCA1;1-Fw e Nt-CYCA1;1-
Rv, utilizados na amplificação da CDS da ciclinaA1;1 de N. tabacum.......................................40
Figura 15: Esquema ilustrativo das sequências dos primers Nt-CYCA2;2-Fw e Nt-CYCA2;2-
Rv, utilizados na amplificação da CDS da ciclinaA2;2 de N. tabacum.......................................41
Figura 16: Esquema ilustrativo da sequência do primer Nt-CYCA2;2DDB-Fw construído para
iniciar a CDS da ciclinaA2;2 de N. tabacum após o sítio D-Box.................................................43
Figura 17: Esquema ilustrando o mapeamento das culturas em placa de 96 poços para
realização dos testes dos genes repórteres HIS3 e lacZ...............................................................49
Figura18: Esquema ilustrativo da sequência genômica de SCI1 de N. tabacum, obtido na base
de dados do SOL.........................................................................................................................58
Figura 19: Sequência de nucleotídeos do cDNA codificante de SCI1, correspondente a
montagem das sequências dos clones ORF-SCI1 e TOB68F10 (De Paoli et al, submetido)......59
Figura 20: Desenho esquemático ilustrando a constituição da sequência genômica de SCI1 de
Nicotiana tabacum e a localização de alguns elementos cis regulatórios encontrados na
sequência, durante análise in silico..............................................................................................62
Figura 21: Sequência genômica de SCI1 de A. thaliana, com anotações de exons, introns,
regiões 5´e 3´UTRs e elementos cis regulatórios.........................................................................65
Figura 22: Esquema ilustrativo da sequência genômica de SCI1 de A. thaliana........................66
Figura 23: Amplificação da sequência codificadora da enzima MAPK em gel de agarose 1%
marcado com brometo de etídeo. O gel A mostra o resultado da primeira PCR, onde o tamanho
esperado da banda era de 1120 pares de bases. No gel B, o produto da primeira PCR pode ser
comparado com o resultado do segundo ciclo de amplificação. Em C, o produto da PCR2 pode
ser comparado com o resultado da terceira PCR, onde o fragmento gerado (1180pb) encontra-se
pronto para ser inserido no vetor pDONR201.............................................................................69
xiv
Figura 24: Análise por eletroforese em gel de agarose 1% das amostras de DNA de 12 colônias
isoladas (1 a 12), resultantes da transformação de células E. coli DH10B, com a CDS da MAPK
inserida no vetor pDONR201, digeridas com as enzimas SacI e PstI..........................................70
Figura 25: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1%, de amostras de DNA extraídas de 4
colônias isoladas contendo a construção pDEST22_MAPK, e digeridas com a enzima SacI.....71
Figura 26: Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo, onde foram aplicadas alíquotas
da PCR1 e PCR2 utilizadas para amplificação da CDS de AGAMOUS através do clone
TOBEST025G07..........................................................................................................................72
Figura 27: Eletroforese em gel de agarose 1% de alíquotas do DNA extraído de 8 colônias
transformantes, contendo a construção pENTRY-AGAMOUS, digeridas com as enzimas PstI e
EcoRV..........................................................................................................................................73
Figura 28: Gel de agarose 1% contendo amostras de digestões de DNA submetido à
eletroforese. Em A aparecem o marcador, e o padrão de digestão do DNA extraído de 5 colônias,
possivelmente portadoras da construção pDEST22-AGAMOUS, quando digeridos pelas
enzimas PstI e XhoI.. Em B é possível observar o marcador de peso molecular (M) e o padrão
de digestão do DNA extraído de 4 colônias transformantes para a construção pDEST32-
AGAMOUS, quando digeridos com as enzimas PstI e HindIII...................................................73
Figura 29: Alinhamento das sequências dos RNAs mensageiros de 4 ciclinas da família D, uma
ciclinaA e uma ciclinaB de N. tabacum, realizado através da ferramenta ClustalW...................75
Figura 30: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1% de uma alíquota do primeiro ciclo
de amplificação da CDS da ciclinaD3;2 de N. tabacum (A) e após a complementação dos sítios
attB1 e attB2 através da PCR2 (B)...............................................................................................76
Figura 31: Mini-preparações de DNA das colônias oriundas de recombinação de ciclinaD3;2
com o vetor pDONR201. As amostras foram digeridas com enzimas NcoI e PstI e submetidas à
eletroforese em gel de agarose 1%, tampão TBE 0,5x.................................................................77
Figura 32: Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. Em A observa-se
o padrão de digestão enzimática de alíquotas de DNA extraído de 8 clones independentes
portadores da construção pDEST22-CYCD3;2. A digestão foi realizada com as enzimas XhoI e
PstI e todas as amostras mostraram correspondência com o padrão esperado. Em B, o mesmo
xv
procedimento foi realizado com amostras de DNA dos 12 clones referentes à construção
pDEST32-CYCD3;2. A digestão foi realizada com as enzimas XhoI e XbaI e todos os clones
correspondem ao padrão esperado................................................................................................78
Figura 33: Alinhamento realizado pela ferramenta ClustalW da CDS das seguintes CDKs de N.
tabacum encontradas no GenBank: CDKA:4 (AF289467.1), CDKB1-1 (AF289465), CDKB1-2
(AF289466), NtPITSLREalpha (AB195174) e cdc2-homolog (D50738)...................................79
Figura 34: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1% de uma alíquota do primeiro ciclo
de amplificação da CDS da CDKA de N. tabacum (A) e após a complementação dos sítios attB1
e attB2 via PCR2 (B)....................................................................................................................80
Figura 35: Eletroforese em gel de agarose 1% do DNA extraído de 10 clones advindos da
construção pDONR201 + CDKA e digeridas com enzimas AvaI e EcoRI.................................80
Figura 36: Resultado a eletroforese em gel de agarose 1% das amostras de DNA extraídas dos
clones resultantes das construções pDEST22-CDKA (A) e pDEST32-CDKA (B).....................81
Figura 37: Eletroforese em gel de agarose 1% do material resultante da amplificação da CDS
de ciclinaA1;1 e ciclinaA2;2 após PCR1 (A) e após PCR2 (B)...................................................82
Figura 38: Eletroforese em gel de agarose 1%, marcado com brometo de etídeo, resultante da
aplicação de amostras da digestão enzimática do DNA extraído dos clones oriundos das
construções pDONR221 + CYCA1;1 (A) e pDONR221 + CYCA2;2 (B)..................................83
Figura 39: Eletroforese em gel de agarose 1% das mini-preparações de DNA das colônias
oriundas das transformações pDEST22-CYCA1;1 e pDEST22-CYCA2;2 submetidas à digestão
enzimática.....................................................................................................................................84
Figura 40: Eletroforese em gel de agarose 1% do produto da PCR1 (A) e PCR2 (B) utilizadas
para amplificação do CDS da ciclinaA2;2 de Nicotiana tabacum, com o sítio D-box deletado
(DDB)...........................................................................................................................................85
Figura 41: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1% de amostras de DNA dos sete
transformantes, possivelmente portadores da construção pDONR221-CYCA2;2DDB (CDS da
ciclinaA2;2 com sítio D-box deletado inserida no vetor pDONR221) após a digestão com a
enzima PvuII.................................................................................................................................85
xvi
Figura 42: Análise do padrão de digestão enzimático apresentado pelas amostras de DNA
extraídas de 8 clones, resultantes da transformação de células de E. coli DH10B
eletrocompetentes com a construção PDEST22-CYCA2;2DDB, quando submetidas a
eletroforese me gel de agarose 1% e marcadas com brometo de etideo.......................................86
Figura 43: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1% do DNA extraído de 10 clones da
construção pDEST22-SCI1 e submetido à digestão enzimática com HindIII (A). Em B é
mostrado o padrão de digestão do DNA de 8 clones da construção pDEST32-SCI1, quando
digeridos com HindII....................................................................................................................87
Figura 44: Ensaios de duplo-híbrido...........................................................................................90
Figura 45: Investigação da interação de SCI1 com ciclinaA1;1, ciclinaA2;2 e ciclinaA2;2DDB
(com D-box deletado) através de ensaios de duplo-híbrido, utilizando método de acasalamento
de leveduras haplóides a e α (yeast mating-type).........................................................................91
Figura 46: Análise da expressão da proteína His-SCI1 em E. coli, por SDS-PAGE (gel a
12,5%). Na primeira posição do gel aparece o marcador de peso molecular LMW Calibration
Kit for SDS Eletrophoresis (GE Helthcare), seguido pela fração insolúvel do lisado celular de E.
coli expressando His-SCI1 e, por último, a fração solúvel do mesmo lisado, onde é possível
visualizar a presença da proteína desejada...................................................................................92
Figura 47: Gel de poliacrilamida 12,5% obtido após eletroforese de alíquotas de 15 µL do
material utilizado e obtido no ensaio de pull-down......................................................................94
Figura 48: Gel gradiente 4-12% Bis-Tris (Nu PAGE -Invitrogen) obtido após eletroforese da
amostra eluída do ensaio de pull-down, realizado com a proteína heteróloga His-SCI1 expressa
em células de E. coli BL21(DE3)-Rosetta e extrato protéico de estigma e estilete de plantas
Ri14.2 de Nicotiana tabacum.......................................................................................................95
Figura 49: Resultado do alinhamento da sequência de aminoácidos encontrada pelo programa
Mascot, ao analisar o espectro de massa da banda 09, com proteínas do banco de dados do SOL
através do programa tBlastn.........................................................................................................98
xvii
Figura 50: Alinhamento da sequência encontrada pelo programa Mascot durante análise do
espectro de massa referente à banda número 11, com a sequência de maior similaridade presente
no banco de dados do NCBI, utilizando-se a ferramenta tBlastn para realizar a busca...............99
Figura 51: Resultado da pesquisa realizada pela ferramenta tBlastn, utilizando como referência
a sequência protéica obtida pelo programa Mascot ao analisar o espectro de massa resultante da
banda 13.....................................................................................................................................100
Figura 52: Alinhamento da sequência traduzida do contig TOBC091B07 com a sequência de
aminoácidos da proteína TTS-2 (transmitting tissue-specific-2) de N. tabacum, encontrada
durante busca utilizando a ferramenta tBlastn............................................................................101
xviii
Lista de Tabelas
Tabela 01: Relação das combinações isca-presa (construções) co-transformadas em S.
cerevisiae para teste de duplo-híbrido..........................................................................................45
Tabela 02: Relação das combinações isca-presa (construções) transformadas em S. cerevisiae
pelo método de acasalamento.......................................................................................................48
Tabela 03: Relação de elementos cis regulatórios encontrados na sequência genômica de SCI1
de N. tabacum, baseado nas bases de dados PLACE (P) E PLANTCARE (PC).........................61
Tabela 04: Relação de proteínas obtidas no ensaio de pull-down utilizando His-SCI1 como isca e
identificadas por espectrometria de massa......................................................................................96
xix
Resumo
STRINI, E. J. SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibtor 1): análise in silico da sequência
genômica de Nicotiana tabacum e estudo de parceiros de interação proteína-proteína. 2010.
115 p. Dissertação de Mestrado – Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.
O sucesso reprodutivo das plantas é dependente do correto desenvolvimento dos órgãos
sexuais, como o pistilo, o qual é coordenado por vias moleculares complexas que controlam a
proliferação e a diferenciação celular. Em nosso laboratório foi caracterizado o gene SCI1 de
Nicotiana tabacum, que codifica um inibidor de ciclo celular, importante no controle da
proliferação/diferenciação celular nos tecidos do estigma e estilete, nos estádios iniciais do
desenvolvimento floral. A seqüência de aminoácidos revela que o gene codifica uma pequena
proteína rica em lisina, com dois domínios putativos de interação com ciclinas e 15 sítios
putativos de fosforilação. Experimentos com a proteína fusionada a GFP demonstraram que a
proteína apresenta localização nuclear (DePaoli et al., submetido).
Para compreender a estrutura gênica de SCI1, sua seqüência genômica foi estudada. A
análise desta seqüência revelou a presença de 4 exons e 3 introns, assim como seu homólogo em
Arabidopsis thaliana. A comparação das sequências dos cDNAs disponíveis com as sequências
genômicas permite concluir que existem 2 sequências muito similares, mas distintas, para o
gene SCI1 em N. tabacum. Esta espécie é alotetraplóide e, provavelmente, estas 2 sequências
correspondem a genes homeólogos originados das espécies ancestrais N. sylvestris e N.
tomentosiformis. A presença de muitos elementos cis regulatórios, dispersos pela seqüência
genômica, sugere que SCI1 é regulado de forma complexa, incluindo as vias de controle do
ciclo celular e de resposta à auxina.
Com a finalidade de entender como SCI1 exerce suas funções no controle da
proliferação/diferenciação celular, foram realizados ensaios de duplo-híbrido e pull-down para
investigar proteínas-candidatas a interagirem com SCI1. Em ensaios de duplo-híbrido, testes
foram conduzidos utilizando-se SCI1 como isca e seus possíveis parceiros de interação como
presas. Dentre estas, foram testadas: proteínas do ciclo celular, como MAPK, ciclinaA1;1,
ciclinaA2;2, ciclinaA2;2 (com D-box deletado), ciclinaD3;2 e CDKA. Além destas, a proteína
AGAMOUS também foi utilizada devido o seu importante papel na diferenciação do pistilo.
Apesar de pouco conclusivos, os testes de duplo-híbrido, utilizando SCI1 como isca, indicaram
uma interação fraca desta proteína com MAPK, sugerindo que SCI1 possa ser fosforilado por
esta quinase.
xx
A interação da proteína recombinante SCI, sintetizada em células de E.coli BL31(DE)-
Rosetta, com proteínas extraídas de estigmas e estiletes de plantas transgênicas de N. tabacum
com SCI1 silenciado, foi investigada a partir de ensaios de pull-down. As proteínas que
formaram complexos com SCI1 foram identificadas por espectrometria de massa, revelando
resultados interessantes. A identificação de uma fosfatase ácida é mais um indicativo de que
SCI1 possa ser regulado pela adição e subtração de grupamentos fosfato.
Em suma, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que a expressão do gene SCI1 é
regulada pelas vias de controle do ciclo celular e de resposta à auxina, e que a proteína SCI1
sofra fosforilações e defosforilações para realizar suas funções no controle da
proliferação/diferenciação celular nos tecidos do estigma e estilete, durante o desenvolvimento
do pistilo.
Palavras-chave: 1. SCI1. 2. Nicotiana tabacum. 3. Pistilo 4. Interação proteína-proteína. 5.
Duplo-Híbrido. 6. Pull-down 7. Ciclo celular.
xxi
Abstract
STRINI, E. J. “SCI1: (Stigma/style Cell-cycle Inhibtor 1): Nicotiana tabacum genomic
sequence analysis and protein-protein interaction partners study. 2010. 115 p. Master´s
Thesis – Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.
The reproductive success of plants is dependent on the appropriate development of the
sexual organs, like the pistil, which is coordinated by complex molecular pathways that control
cell proliferation and differentiation. The Nicotiana tabacum SCI1 gene has been characterized
in our laboratory. It encodes a cell cycle inhibitor, important for controlling the cell
proliferation/differentiation of the stigma and style tissues, in early stages of flower
development. The SCI1 amino acid sequence reveals a small lysine-rich protein, containing two
putative cyclin interaction domains and 15 putative phosphorylation sites. Experiments with the
SCI1-GFP protein fusion have demonstrated that the protein is nuclear localized (DePaoli et al.,
submetido).
To understand the SCI1 gene structure, its genomic sequence has been studied. The
sequence analysis has revealed the presence of 4 exons and 3 introns, also present in its
Arabidopsis thaliana homologous sequence. The comparison of the available cDNA and
genomic sequences allows concluding that exist 2 very similar but distinct sequences for the
SCI1 gene in N. tabacum. This species is an allotetraploid and, probably, the 2 sequences
correspond to homeologous genes originated from the N. sylvestris e N. tomentosiformis
ancestral species. The presence of several cis regulatory elements dispersed along the genomic
sequence suggests that SCI1 is regulated in a complex form, including the cell cycle control and
auxin response pathways.
With the purpose to understand how SCI1 exerts its functions in the cell
proliferation/differentiation control two-hybrid and pull-down assays were preformed to
investigate candidate proteins for SCI1 interaction. In the two-hybrid assays, the tests were done
using SCI1 as bait and the possible interaction partners as prey. Among the preys MAPK,
cyclinA1;1, cyclinA2;2, cyclinA2;2 (with deleted D-box), cyclinD3;2 and CDKA were tested.
Additionally, the protein AGAMOUS was also used due to its important role in pistil
differentiation. Despite not very conclusive, the two-hybrid experiments using SCI1 and bait
indicated a weak interaction with MAPK, suggesting that SCI1 may be phosphorylated by this
kinase.
xxii
The interaction of the SCI1 recombinant protein produced in E.coli BL31(DE)-Rosetta
cells, with proteins extracted from stigmas and styles of transgenic N. tabacum plants with
silenced SCI1 gene, was investigated through pull-down assays. The proteins forming
complexes with SCI1 were identified by mass spectrometry, unravelling interesting results. The
identification of an acid phosphatase is a further indicative that SCI1 may be regulated by the
addition and removal of phosphate groups.
In summary, the results obtained in the present work suggest that the expression of the
SCI1 gene is regulated by the cell cycle control and auxin response pathways, and that the SCI1
protein suffers phosphorylations and dephosphorylations to perform its functions in the cell
proliferation/differentiation control in the stigma and style tissues, during pistil development.
Key-words: 1. SCI1. 2. Nicotiana tabacum. 3. Pistil 4. Protein-protein interaction. 5. Two-
hybrid. 6. Pull-down 7. Cell cycle.
Introdução
Introdução 1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Caracterização de Nicotiana tabacum L.
As Angiospermas são plantas que se desenvolvem a partir de sementes e cujos órgãos
de reprodução sexuada estão reunidos em flores, ramificações especiais de crescimento limitado.
Representam o grupo mais abundante do reino vegetal, superando todas as outras plantas
vasculares em diversidade, habitat ocupado e utilidade ao homem. Sob o ponto de vista
reprodutivo, diferem das gimnospermas por apresentarem óvulos e sementes encerrados dentro
dos carpelos, que mais tarde desenvolver-se-ão em frutos.
A espécie Nicotiana tabacum L. pertence à família Solanaceae (dicotiledônea), uma das
famílias pertencentes ao grupo das Angiospermas, e é popularmente conhecida como planta-do-
fumo. Originária da América do Sul Ocidental trata-se de uma planta modelo amplamente
utilizada em estudos de biologia molecular de plantas, devido à facilidade de seu cultivo,
inclusive in vitro, e à facilidade de transformação e regeneração de plantas transgênicas.
Relatos da literatura sugerem que a espécie N. tabacum seja alotetraplóide (2n = 48),
originada da hibridação interespecífica de duas espécies diplóides, Nicotiana sylvestris e
Nicotiana tomentosiformis (2n = 2x = 24) (Goodspeed, 1954; Gray et al., 1974). Resultados
obtidos em investigações sobre os genomas mitocondriais e cloroplastidiais apoiam a idéia de
que o genoma maternal de N. tabacum originou-se da espécie ancestral de N. sylvestris (Bland
et al., 1985; Kenton et al., 1993). Através de análises comparativas das sequências intergênicas
presentes no rDNA de N. tabacum, Volkrov et al. (1999) demonstraram que estas são similares
às sequências da espécie de N. tomentosiformis, fornecendo dados que apoiam a hipótese dessa
espécie ser o ancestral paterno de N. tabacum.
1.2 Visão geral da flor
A maior inovação das angiospermas é a flor. Tal como o ramo vegetativo, a flor é
constituída de um eixo (receptáculo) e apêndices laterais (Esau, 1997). Sépalas e pétalas
compõem, respectivamente, o cálice e a corola e representam as partes florais estéreis (Figura 1).
Os estames, em conjunto, constituem o androceu, e os carpelos, livres ou unidos, compõem o
gineceu. Estames e carpelos estão relacionados com a esporogênese, processo pelo qual são
formadas as células reprodutivas (gametófitos). Os termos masculino e feminino, referentes ao
androceu e gineceu, respectivamente, estão relacionados com o desenvolvimento dos
gametófitos masculinos (grão de pólen), a partir de micrósporos originados em microsporângios
Introdução 2
(sacos polínicos) nos estames, e gametófitos femininos (sacos embrionários), a partir de
megásporos originados em megasporângios (nucelos dos óvulos), nos carpelos (Esau, 1997).
Basicamente, o androceu é formado pelo conjunto de estames, cada um constituído de
uma antera presa por um filete. Já o gineceu, quando constituído por dois carpelos sincárpicos, é
denominado pistilo. O pistilo e os estames das flores são órgãos especializados, responsáveis
pelo processo reprodutivo em plantas.
Figura 1: Visão detalhada da estrutura e órgãos constituintes de um botão floral. Fonte: Mauseth (1995).
1.2.1 Estrutura e função do pistilo
O pistilo é composto, na maioria das vezes, por uma porção inferior fértil (ovário) e
uma porção superior estéril (estilete) que eleva uma porção periférica, mais ou menos extensa,
diferenciada em estigma (Esau, 1997). Este órgão floral exerce duas funções principais: a
produção do gametófito feminino (ou saco embrionário) e a discriminação entre diferentes tipos
de grãos de pólen recebidos. A transferência do gametófito masculino (grão de pólen), do
estame ao estigma, dá inicio a um processo que pode resultar na fertilização (Otsu et al, 2004).
Uma vez no estigma, o grão de pólen irá interagir com este tecido. Se estas interações revelarem
a compatibilidade do grão de pólen, será permitida sua adesão ao estigma, hidratação,
germinação e penetração no estilete (Lord, 2003).
A germinação do grão de pólen dá origem ao tubo polínico, que penetra nas camadas
das células estigmáticas (Cheung, 1995). Crescendo nos espaços intercelulares do tecido
Introdução 3
transmissor do estilete, o tubo polínico penetra neste tecido em direção ao ovário, transportando
dois núcleos espermáticos até o saco embrionário (Preuss, 2002). Ao terminar seu percurso pelo
estilete, o tubo polínico penetra no ovário e libera os dois núcleos espermáticos. Um destes
núcleos se funde à oosfera, para originar o zigoto 2n, e o outro se une aos núcleos polares,
originando o endosperma triplóide.
Estudos moleculares indicam que substâncias, presentes no exudato do estigma de flores
da planta-do- fumo, são responsáveis pelo comportamento pós-polinização do grão de pólen nos
tecidos do pistilo (Goldman et al, 1994). Mesmo reconhecendo-se a importância de proteínas
específicas de estigma/estilete no sucesso dos processos de polinização e fertilização, poucas
proteínas foram identificadas e pouco é conhecido sobre o papel destas em tais processos (Lord,
2003).
1.3 Estudo de genes preferencialmente expressos no estigma/estilete de N. tabacum
A biologia molecular tem contribuído muito para um melhor entendimento dos
processos moleculares envolvidos na polinização e fertilização em plantas. DePaoli (2006)
realizou a construção de uma biblioteca de subtração de cDNAs de estigma/estilete de N.
tabacum, a fim de encontrar genes preferencialmente expressos nestes tecidos. Dentre os vários
genes identificados, o clone HS1-002E06 foi escolhido para análise e caracterização (DePaoli et
al., submetido). Estudos de homologia com a sequência completa do cDNA deste clone,
realizados através do programa tblastx, revelaram a similaridade da proteína com proteínas de
função desconhecida presentes em diferentes plantas. Os estudos realizados sugerem que esta
proteína tenha um papel importante na transdução de sinal e no desenvolvimento do
estigma/estilete (DePaoli et al., submetido).
Ainda considerando o estudo de proteínas relacionadas ao processo reprodutivo de
plantas, Quiapim et al. (2009) realizaram um estudo comparativo de expressão gênica nos
órgãos vegetativos e reprodutivos de N. tabacum. Neste trabalho, foram revelados alguns genes
codificando proteínas de função desconhecida, expressos preferencialmente nos órgãos
reprodutivos das plantas, como o clone 092H06. Estudos mostraram que este gene é cerca de 6,6
vezes mais expresso em estigma/estilete do que em outros órgãos de N. tabacum. Devido ao
tamanho reduzido da proteína correspondente (68 aminoácidos) e à presença de alguns domínios
específicos, encontrados na sequência através do programa MotifScan, foi proposto que esta
proteína seja um peptídeo-hormônio. Os resultados preliminares, obtidos com plantas
transgênicas, sugerem que esta proteína possa atuar, em uma ou mais vias de transdução de sinal
envolvidas no processo reprodutivo da espécie em questão (Brito et al., em preparação).
Introdução 4
1.3.1 O gene SCI1 de N. tabacum
Estudos conduzidos por De Paoli et al. (submetido) reportam a identificação e
caracterização de um novo gene específico do estigma e estile, que atua na inibição da
proliferação celular e, coordenadamente, controla a diferenciação apical do pistilo.
Análises in silico, utilizando a sequência de 154 aminoácidos codificada por este gene,
identificaram um domínio N-terminal rico em lisina, um sinal de localização nuclear, dois
domínios putativos de interação com ciclinas e 15 sítios putativos de fosforilação. Baseado no
fato de que sítios de interação com ciclinas são comumente encontrados em proteínas que
interagem com o complexo ciclina/CDK, as quais frequentemente apresentam sítios de
fosforilação que são alvos de proteínas quinases, acredita-se que SCI1 seja controlado por
MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinase), via fosforilação e por outras proteínas.
Análises do padrão temporal de expressão de SCI1, nos estádios de desenvolvimento
floral descritos por Koltunow et al. (1990), mostraram que o nível mais alto de expressão deste
gene ocorre no estágio -3, que coincide com o início da diferenciação da zona secretória do
estigma. Assim, os padrões de expressão temporal e espacial de SCI1 sugerem que seu produto
gênico esteja envolvido no controle da diferenciação da porção superior do pistilo.
Plantas transgênicas de N. tabacum com SCI1 silenciado (RNAi) e superexpresso (SEX)
apresentaram fenótipos bastante interessantes. Plantas RNAi são portadoras de flores onde os
pistilos apresentam um comprimento superior ao encontrado em plantas selvagens (SR1). Este
aumento foi relacionado a um aumento no número de células constituinte da zona secretória do
estigma (SSZ) e do tecido transmissor do estilete (STT) em plantas RNAi. Além disso, foi
observado um nítido aumento na velocidade de desenvolvimento do pistilo nestas plantas em
comparação à selvagem. O contrário foi observado nas plantas de superexpressão. Em conjunto,
estas observações mostram que SCI1 faz parte de uma via de controle do desenvolvimento do
pistilo, envolvida em regular o tamanho deste órgão, possivelmente atuando na inibição da
proliferação celular tecido-específica (De Paoli et al., submetido). Por esta razão, o gene foi
denominado SCI1 (stigma/style cell-cycle inhibitor 1), um novo inibidor de ciclo celular,
diferente dos outros tipos de inibidores de CDK descritos em plantas: CKI (CDK Inhibitor),
KRP (Kip-Related Proteins) (Wang et al., 1997; Vanderpoele et al., 2002) e a proteína
SIAMESE recém descoberta (Churchman et al., 2006).
O fenótipo dos pistilos de plantas transgênicas RNAi mostrou bastante similaridade com
pistilos de Arabidopsis thaliana tratados com NPA (N-1-naphtylphthalamic acid, Nemhauser et
al., 2000), um inibidor do transporte polar de auxina. Adicionalmente, o estudo dos níveis de
transcritos de três genes regulados por auxina (ARF8, Aux/IAA13 e Aux/IAA19) em plantas
RNAi e SEX, mostrou que todos se encontravam induzidos em plantas de superexpressão de
SCI1, enquanto Aux/IAA13 e Aux/IAA19 estavam expressos em menor nível em plantas RNAi.
Introdução 5
Em associação, estes dados sugerem que SCI1 influencie a regulação transcricional de alguns
genes de resposta à auxina e, de alguma forma, esteja relacionado com a sinalização por auxina
no desenvolvimento apical do pistilo.
Em suma, a caracterização de SCI1 revela uma nova classe de proteína capaz de inibir o
ciclo celular de maneira tecido-específica, atuando na sinalização molecular que leva ao
desenvolvimento apical do pistilo por inibição da proliferação celular/diferenciação,
provavelmente participando da via de sinalização por auxina.
1.4 Mecanismos genéticos envolvidos no controle do ciclo celular
Em continuidade à embriogênese, as plantas exibem uma estratégia de crescimento-
aberto (De Veylder et al., 2007), que é caracterizada pela contínua formação de novos órgãos
durante seu ciclo de vida. Esta característica é baseada na presença e manutenção de grupos de
células indiferenciadas nos ramos em crescimento, conhecidos como meristemas. Nestes tecidos,
a intensa proliferação celular é responsável por gerar grandes quantidades de células, que em
resposta a um sistema de diferenciação temporal e espacial, lentamente dão origem aos
diferentes tecidos dos órgãos vegetais.
A proliferação celular é decorrente de sucessivos ciclos celulares. Os maiores
condutores do ciclo celular de plantas são CDKs (cyclin-dependent kinase) A e B (De Veylder
et al., 2007). CDKAs encontram-se constitutivamente presentes durante todo o ciclo celular e
controlam os pontos de transição G1-S e G2-M, enquanto que CDKBs são acumuladas de
acordo com a fase do ciclo celular, alcançando o máximo na transição G2-M. A progressão do
ciclo requer a associação de CDKs com vários tipos de ciclinas. Ciclinas tipo D (CYCD)
formam complexos com CDKAs e regulam a transição G1-S, enquanto que ciclinas tipo A
(CYCA) estão principalmente presentes da fase S a M. Dessa forma, a progressão do ciclo
celular é regulada pela periódica expressão e proteólise de ciclinas mediada por ubiquitina, além
da fosforilação de uma série de proteínas por complexos CDK-ciclina.
Um ponto crítico de decisão no qual as células podem entrar num novo ciclo mitótico é
o ponto de restrição G1, onde está situada a transição G1-S. A ativação dos complexos CDKA-
CYCD promove a progressão do ciclo celular além deste ponto de restrição da fase G1, ativando
genes responsáveis pela transição G1-S. Uma vez alcançando este ponto, a célula é
comprometida a uma nova rodada de ciclo celular (De Veylder et al., 2007).
A atividade dos complexos CDKA-CYCD pode ser inibida pela associação destes com
proteínas inibidoras de CDKs, como CKI/KRP e pela proteína SIAMESE. Apesar dos
reguladores do ciclo celular serem os principais efetores do controle da proliferação celular,
como estas moléculas são ativadas/inibidas pelos mecanismos de controle de proliferação
Introdução 6
celular/diferenciação, acarretando o desenvolvimento da planta, constituem processos pouco
entendidos até o momento. A identificação de vias moleculares que interconectem o controle da
proliferação celular/diferenciação e desenvolvimento, através da regulação do ciclo celular é,
portanto, de importância primordial (De Paoli et al., submetido).
1.5 Mecanismos genéticos envolvidos na diferenciação do meristema floral
O crescimento indeterminado dos meristemas vegetativos e florais é sustentado por um
pequeno grupo de células localizadas na zona central do meristema apical, cuja estabilidade é
mantida pela elevada expressão do gene WUS (WUSCHEL) e SHOOTMERISTEMLESS
(STM). A substituição do meristema vegetativo pelo meristema floral depende de genes
regulatórios florais específicos, cuja expressão está integrada em um programa disparado no
início do desenvolvimento floral. Durante esta transição, o meristema vegetativo é inicialmente
convertido em meristema de inflorescência, o qual irá produzir meristemas florais. A transição
da fase vegetativa para a reprodutiva é controlada por múltiplos sinais ambientais e endógenos,
que convergem em sinais chaves da identidade floral: APETALA1 (AP1), CAULIFLOWER
(CAL) e LEAFY (LFY) (Sablowski, 2007).
Após ser iniciado, o meristema floral produz quatro verticilos que irão se diferenciar em
órgãos florais (sépalas, pétalas, estames e carpelo). A identidade de cada órgão floral é
determinada por uma específica combinação de proteínas, cada uma capaz de controlar um
conjunto de genes requeridos para o desenvolvimento de um determinado órgão floral, como:
APETALA3 (AP3), PISTILLATA (PI) e AGAMOUS (AG). Entre estes genes, o gene
AGAMOUS, ativado pelo gene WUSCHEL (Ikeda et al, 2009), além de seu papel na
determinação dos órgãos florais femininos (estigma, estilete e ovário), onde se apresenta como
um gene chave para a função C no modelo ABC (Yanofsky, 1990; Bowman et al., 1991; Coen
& Meyerowitz, 1991), possui um papel adicional na determinação do meristema floral. Segundo
Sablowski (2007), acredita-se que AG antagonize a função de genes de manutenção do
meristema, como WUS e, desta forma, leve ao término do meristema floral. Recentemente, Sun
et al (2009) mostraram que AGAMOUS é capaz de inativar WUS, mediante a ativação de
KNUCKLES (KNU), que atua como um repressor de WUS. Dessa forma, WUS ativaria a
expressão de AG, enquanto AG atuaria reprimindo a expressão de WUS via KNUCLES. Isto
acarretaria em uma diminuição da população de células do meristema floral, conduzindo-as a
diferenciação em órgãos florais.
Introdução 7
1.6 Técnicas para investigação de interação entre proteínas
Processos como síntese de DNA, ativação transcricional, tradução de proteínas,
localização protéica e transdução de sinal envolvem complexos protéicos (Gietz et al., 1997).
Interações proteína-proteína estão envolvidas em todos os processos celulares, e o mapeamento
destas redes de interações, a fim de elucidar a organização do proteoma em unidades funcionais,
é de extrema importância para sistemas biológicos (Bruckner et al, 2009). Técnicas bioquímicas
clássicas como pull-down e co-imunoprecipitação são viáveis quando informações prévias sobre
a bioquímica e funcionalidade da proteína em estudo estão disponíveis na literatura. Entretanto,
quando o trabalho visa estudar proteínas recém descobertas, como é o caso deste trabalho, a
quantidade de informações sobre as mesmas é mínima. Neste caso, a combinação destas
técnicas com a espectrometria de massa pode constituir uma alternativa interessante.
Encontrar os parceiros de interação da proteína estudada pode ser um bom ponto de
partida, uma vez que o screening de interações proteína-proteína irá revelar informações
inéditas, abrindo novas perspectivas e permitindo um melhor entendimento da fisiologia celular.
Nestes casos, diversos autores (Phizicky & Fields, 1995; Walhout & Vidal, 2001; Parrish et al,
2006; Bruckner et al, 2009; Golemis et al, 2009) sugerem a construção de bibliotecas de cDNA
e screening das mesmas utilizando-se o sistema de duplo-híbrido. Entretanto, a construção deste
tipo de biblioteca não consiste em um procedimento trivial e, muitas vezes, a seleção de alguns
possíveis parceiros para a realização de testes de duplo-híbrido “par a par” pode ser uma
alternativa a ser considerada.
1.6.1 Duplo-Híbrido
O sistema de duplo-híbrido (Two-hybrid System) foi criado e inicialmente descrito por
Fields & Song em 1989. Consiste em um método genético in vivo para detecção de interações
entre proteínas em leveduras Saccharomyces cerevisiae. O sistema se baseia no princípio de que
muitas proteínas, incluindo ativadores de transcrição, consistem de múltiplos domínios que
funcionam independentemente. Quando expressos isoladamente e aproximados por meio de
interações não covalentes, domínios individuais podem funcionar conjuntamente para
reconstituir a atividade da proteína intacta. Detalhes do sistema podem ser observados na Figura
02.
Introdução 8
Figura 02: Esquema ilustrativo do sistema de duplo-híbrido. No caso de células de levedura expressando duas
proteínas híbridas (DB-X e AD-Y) que não interagem, AD-Y não estará fisicamente localizada no promotor e não
ativará a transcrição. Caso as proteínas híbridas sejam parceiras de interação, BD-X e AD-Y estarão localizadas na
região promotora de genes repórteres e a transcrição destes é ativada. Fonte: Manual do Kit ProQuest™ Two-Hybrid
System with Gateway® Technology, CAT. SERIES 10835, Invitrogen.
Fatores de transcrição são compostos por dois domínios, um domínio de ligação ao
DNA (DNA Binding Domain - DBD) e um domínio de ativação (Activation Domain - AD), que
devem necessariamente estar ligados (ou próximos) para ativar a transcrição de um determinado
gene. A idéia central do sistema é criar duas proteínas híbridas para testar se há a ocorrência de
interação entre as mesmas. Para isso, Fields & Song (1989) propuseram o uso dos domínios
DBD e AD do ativador transcricional GAL4 de S. cerevisiae. A presença dos dois domínios é
necessária para ativar a expressão de genes codificantes de enzimas de utilização da galactose.
Uma proteína híbrida é gerada pela fusão, em fase, de um cDNA teste à sequência
codificante de um dos domínios do fator de transcrição GAL4. O domínio de ligação ao DNA
GAL4 é ligado à proteína X e o domínio de ativação GAL4 à proteína Y (Fiels & Song, 1989).
Caso as proteínas X e Y formem complexos proteína-proteína, a proximidade entre os domínios
do GAL4 será reconstituída e a transcrição dos genes regulados por este fator ocorrerá.
Chevray & Nathans (1992) e Vidal et al (1996) incorporaram modificações ao sistema
descrito por Fields & Song (1989), adaptando-o à tecnologia Gateway, que possibilita a inserção
direcional de sequências de cDNA em plasmídeos especiais, através da recombinação entre
Introdução 9
sequências exclusivamente projetadas e presentes nos vetores. Tal tecnologia tornou o sistema
do duplo-híbrido mais fácil e eficiente, possibilitando a ampliação do seu campo de utilização.
O sistema passou a ser viável no screening de bibliotecas de expressão de cDNA – presa (prey
proteins), em busca de proteínas parceiras de interação com proteínas alvo ou isca (bait
proteins).
Desde seu advento, o sistema tem sido utilizado com sucesso em vários trabalhos, como
por exemplo: na descrição de ICKs - Inibidores de Kinases Dependentes de Ciclina (Wang et al.,
1997); no estudo de proteínas reguladoras da atividade repressora do fator ERF3 de N. tabacum
(Koyama et al., 2003); em estudos de proteínas de ativação de RhoGTPases, importantes para
manutenção da polaridade dos tubos polínicos em N. tabacum (Klahre & Kost, 2006); na
descoberta e caracterização de novos parceiros de interação com proteínas MBD7 em
Arabidopsis (Scebba et al, 2007); no estudo da maquinaria de poliadenilação do mRNA em
Arabidopsis (Hunt et al, 2008); e na construção de mapas de interação proteína-proteína (Ding
et al, 2009).
A construção de bibliotecas de cDNA, para uso no sistema de duplo-híbrido, já foi
realizada com sucesso em diversos trabalhos (Walhout et al, 2000; Walhout &Vidal, 2001;
Schoonheim et al, 2007; Mohameda et al, 2009) e, atualmente, existem no mercado kits
comerciais para sua construção, como o Clone Miner cDNA Library Construction Kit
(Invitrogen), que apresenta algumas inovações para melhoria dos resultados. Entretanto, este
tipo de biblioteca apresenta uma série de características que dificultam sua construção. Neste
caso, o que se observa na literatura é a realização de testes de duplo-híbrido “par a par”, onde
possíveis parceiros da proteína estudada, selecionados mediante a caracterização e
enquadramento da mesma nos relatos da literatura, são testados individualmente com a proteína
em estudo.
1.6.2 Pull-down
Métodos de purificação por afinidade são bem apropriados para estudo de complexos
sob condições próximas ao estado fisiológico. Eles permitem que macromoléculas fisicamente
associadas com uma proteína específica, fusionada a uma tag (etiqueta), sejam recuperadas e
identificadas por espectrometria de massa (Gavin et al., 2006). A beleza do estudo de
complexos é que ele permite localizar proteínas com função ainda desconhecida dentro de um
contexto funcional que é providenciado pelos seus parceiros de interação, muitos dos quais
possuem uma função conhecida (Bauer&Kuster, 2003).
Ensaios de pull-down investigam interações entre uma proteína de interesse, expressa
como uma proteína de fusão em Escherechia coli, e seus possíveis parceiros de interação.
Introdução 10
Inicialmente, a proteína portadora da tag é imobilizada em uma resina de afinidade específica
para a tag de fusão. Complexos protéicos podem ser precipitados (ou “puxados para baixo” –
pulled-down) pela aplicação de um lisado de células específico à coluna, o qual contém
proteínas que supostamente interagirão com a proteína estudada, formando complexos. A fonte
destas proteínas depende se o experimento é designado para confirmar uma interação já
detectada por outro método como o duplo-híbrido, ou identificar novas interações. Neste último
caso, o ensaio de pull-down assemelha-se muito à técnica clássica de imunoprecipitação,
diferindo apenas no fato de que uma proteína quimérica específica é utilizada no lugar de um
anticorpo.
Uma vantagem óbvia deste método é que é uma técnica robusta, fácil de ser utilizada e
capaz de recuperar proteínas de interações fracas e pouco abundantes, devido ao fato de grande
quantidade de proteína recombinante estar presente na coluna. Entretanto, devido ao fato dos
complexos de proteínas serem formados no interior de células, a proteína de fusão recombinante
compete com o componente endógeno correspondente e, portanto, o complexo pode não ser
recuperado totalmente, pois todos os componentes do complexo estão ocupados nas interações
proteína-proteína endógenas (Bauer&Kuster, 2003).
Uma vez obtidos os complexos de proteínas, seus componentes podem ser identificados
por espectrometria de massa, devido à rapidez, sensibilidade e versatilidade que esta técnica
apresenta. O avanço na sensibilidade e competência, associado à extensa disponibilidade de
informações sobre as sequências de proteínas e nucleotídeos têm tornado a espectrometria de
massa mais compatível com estudos em biologia (Bauer & Kuster, 2003).
Objetivos
Objetivos 12
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Considerando a importância da reprodução das plantas e o interesse em
compreender a função de genes expressos durante o desenvolvimento do pistilo, este trabalho
teve como objetivo estudar o gene SCI1, expresso preferencialmente nos estigmas/estiletes de N.
tabacum.
2.2 Objetivos específicos
Montar a sequência genômica de SCI1 de N. tabacum a partir de clones de sequências
genômicas presentes em bancos de dados e compará-la a correspondente em A.thaliana;
Realizar a análise in silico da sequência genômica de SCI1 em N. tabacum e A. thaliana
a fim de encontrar elementos cis regulatórios, que forneçam evidências das vias que
regulam a expressão de SCI1;
Amplificar e clonar as sequências codificadoras de alguns candidatos a parceiros de
interação de SCI1 de N. tabacum e realizar testes de interação proteína-proteína por
meio de ensaios de duplo-híbrido;
Identificar novos candidatos a parceiros de interação proteína-proteína com SCI1, a
partir do ensaio de pull-down.
Material e Métodos
Material e Métodos 14
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material Vegetal
Sementes de N. tabacum Petit Havana SR1, cedidas pelo Jardim Botânico da
University of Nijmegen (Holanda), foram semeadas em composto vegetal de fabricação
comercial e bem irrigadas, com água, no dia da semeadura. O processo de crescimento ocorreu
em casa de vegetação, onde a umidade relativa do ar é mantida em 70%, e a irrigação automática
é ativada por mecanismo de “timer”. Os estigmas/estiletes de flores não polinizadas nos 12
estágios de desenvolvimento floral descritos por Koltunow et al. (1990) foram coletados,
imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer -70ºC.
3.2 Preparação de células de Escherichia coli competentes para transformação
(Sambrook et al., 1989)
3.2.1 Células eletrocompetentes
Estriou-se, com uma alça de platina, uma pequena alíquota de suspensão bacteriana
de E. coli, cepa DH10B, em uma placa contendo meio LB sólido (10g/l de triptona, 5g/l de
extrato de levedura, 10g/l de NaCl e 1% de ágar). A placa foi incubada durante 16 horas, a 37ºC.
Uma colônia foi transferida para 5ml de meio LB líquido (10g/l de triptona, 5g/l de extrato de
levedura, 10g/l de NaCl) e incubou-se durante 16 horas, a 37ºC, sob agitação de 300rpm.
Transferiu-se para 200 ml de meio LB, 1ml da suspensão bacteriana e deixou-se a 37ºC, sob
agitação de 300 rpm por 16h (até a leitura da absorbância atingir o ponto ideal -A
600
entre 0,5 e
0,8). A cultura foi então mantida no gelo durante 30 minutos e em seguida centrifugou-se a
5.000 rpm durante 10 minutos, a 4ºC. Removeu-se o sobrenadante e as células foram
ressuspendidas delicadamente em 200ml de água estéril a 4ºC. A suspensão de células foi
novamente centrifugada a 5.000 rpm durante 10 minutos, a 4ºC. Descartou-se o sobrenadante e
as células foram ressuspendidas delicadamente em 100ml de água estéril a 4ºC. Outra etapa de
centrifugação a 5.000 rpm durante 10 minutos, a 4ºC foi realizada. Descartou-se o sobrenadante
e, desta vez, as células foram ressuspendidas delicadamente em 10ml de glicerol 10% a 4ºC.
Centrifugou-se a 5.000 rpm durante 10 minutos, a 4ºC. Nesta última etapa, as células foram
ressuspendidas delicadamente em um volume final de 500µl de glicerol 10% a 4ºC. As alíquotas
foram feitas num volume de 40µl, as quais foram estocadas a -80ºC.
Material e Métodos 15
3.2.2 Células competentes para transformação por choque térmico (Método
de CaCl
2
)
Colônias isoladas de E. coli, cepa DH5α, foram obtidas em placa de Petri contendo
meio LB sólido. Uma colônia isolada foi inoculada em um frasco contendo 50ml de meio LB
líquido. O crescimento das bactérias foi realizado por 16 horas, com agitação vigorosa (200 rpm)
a 37°C. Em seguida, a cultura de bactérias foi transferida para tubo Falcon de 50ml e a
precipitação das células foi realizada através da centrifugação por 6 minutos a 5.000 rpm. A
seguir, o precipitado de células foi ressuspendido, delicadamente, em 20ml de uma solução de
MgCl
2
, 0,1M a 4ºC. A suspensão de células foi centrifugada novamente e o precipitado
ressuspendido, com leve agitação, em 10ml de solução de CaCl
2
0,1M, 4ºC e incubado no gelo
por 15 minutos. As células foram centrifugadas por 6 minutos a 5.000 rpm e novamente
ressuspendidas em 2ml de solução gelada de CaCl
2
0,1M. Uma nova incubação foi feita no gelo
por pelo menos 30 minutos, e a ressuspensão foi misturada com 0,5ml de glicerol 80%. As
células em suspensão foram aliquotadas em tubos Eppendorf, cada um contendo 100µl. Os
tubos de células competentes foram, então, guardados imediatamente no freezer a -80°C, para
uso posterior.
3.3 Transformação de células de E.coli competentes (Sambrook et al., 1989)
3.3.1 Eletroporação de E. coli
Uma alíquota de 1µl da ligação foi adicionada em 40µl de células DH10B
eletrocompetentes, previamente preparadas e aliquotadas em frascos de 1,5ml (item 3.2.1).
Colocou-se a mistura em uma cubeta de eletroporação previamente resfriada no gelo. Submeteu-
se o conjunto a um pulso de 1,8 kV/25 µF (eletroporador Gene Pulse, BioRad). Imediatamente
após a eletroporação, foram adicionados 1000µl de meio LB líquido e as células foram
ressuspendidas delicadamente. A suspensão de células transformadas foi transferida para um
tubo de ensaio, incubando-se durante 1 hora a 37ºC, sob agitação de 200 rpm. Em seguida, a
cultura foi distribuída uniformemente, com o auxílio de uma alça de Drigalski, em placas
contendo meio LB sólido com antibiótico apropriado. As placas foram, então, incubadas a 37ºC
durante 16-20 horas.
3.3.2 Transformação de células competentes de E. coli
Inicialmente 7µl da reação de ligação foram delicadamente misturados com 100µl de
células competentes (CaCl
2
), previamente preparados (item 3.2.2.). Após incubação no gelo
Material e Métodos 16
durante 30 minutos, o tubo foi transferido para um banho estabilizado a 37°C, por 5 minutos.
Após este tempo, o tubo foi transferido imediatamente para o gelo e mantido por 2 minutos,
caracterizando-se o choque térmico. Em seguida, foram acrescentados 500µl de meio LB líquido,
e o mesmo foi novamente colocado em um banho com temperatura estável a 37°C, durante 30
minutos. A mistura do tubo (250µl) foi distribuída uniformemente sobre uma placa com meio LB
sólido, suplementado com antibiótico adequado, para seleção das colônias transformadas. A
placa foi incubada a 37ºC por 16-20 horas.
3.4 Preparação de DNA plasmidial
3.4.1 Mini-preparação de DNA plasmidial
Após a transformação, um número determinado de colônias isoladas foi inoculado
em tubos de ensaio contendo 5ml de meio de cultura LB líquido, suplementado com antibiótico
adequado e em seguida, incubado a 37ºC, sob agitação. Após 16-20 horas de crescimento, as
culturas foram transferidas para tubos de 1,5ml e centrifugadas a 14.000 rpm (Centrífuga
Eppendorf 5415C) por 2 minutos. O precipitado de células de cada tubo foi totalmente
ressuspendido em 175µl de tampão TES (10mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1mM de EDTA, pH 8,0 e
15% Sacarose) e misturado, delicadamente, com 20µl de lisozima (10mg/ml). A preparação foi
mantida à temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, incubada em um banho termo-
estabilizado a 73ºC, durante 15 minutos para romper as células bacterianas. Em seguida, os tubos
foram submetidos a uma centrifugação a 14.000 rpm (centrífuga Eppendorf 5415C) por 15
minutos.
O sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5 ml e a ele foram
acrescentados 1/10 do volume de acetato de sódio 3M e 2 volumes de etanol absoluto. A
precipitação foi feita por 1 hora a -20ºC e, em seguida, centrifugada por 15 minutos a 14.000 rpm
(centrífuga Eppendorf 5415C). O precipitado de DNA foi lavado com etanol 70% e, em seguida,
ressuspendido em 100µl de água milli-Q autoclavada.
3.5 Digestão do DNA utilizando enzimas de restrição
As digestões foram realizadas utilizando-se aproximadamente 10µg de DNA, 2µl de
tampão adequado para a enzima (solução 10x concentrada) e 10 unidades de enzima de restrição,
sendo o volume completado para 20µl com água milli-Q autoclavada. Após o preparo, as
digestões foram colocadas em banho-maria a 37ºC por 2 horas e, posteriormente, submetidas a
uma corrida eletroforética.
Material e Métodos 17
3.6 Eletroforese em gel de agarose
As corridas eletroforéticas foram realizadas em gel de agarose 1%, contendo
0,5µg/ml de brometo de etídeo, imerso em tampão 0,5X TBE (TBE10X: 108g/L de Tris base,
55g/L de ácido bórico, 8,3g/L de EDTA). O brometo de etídeo é um agente intercalante de DNA
e permite a visualização das bandas de DNA, quando exposto à luz ultravioleta. Foi adicionado a
cada amostra 1/5 do volume de tampão de carregamento (0,25% azul de bromofenol, 0,25%
xileno cianol e 15% ficol tipo 400-DL).
Ainda no estado líquido, o gel de agarose foi colocado em uma bandeja apropriada
para inserção de pentes, possibilitando a formação de canaletas, onde as amostras são inseridas.
Após solidificação, o gel foi transferido para uma cuba de acrílico, e esta foi preenchida com
tampão 0,5X TBE, ligado a um gerador que polariza a cuba. Devido ao DNA possuir carga
elétrica negativa, este migra entre os poros do gel em direção ao pólo positivo da cuba. Tal
fenômeno permite a formação de bandas, separadas de acordo com o tamanho molecular do
fragmento de DNA. O tamanho de tais fragmentos foi inferido mediante a comparação com a
migração de fragmentos de marcador de peso molecular (1kb DNA Ladder Plus – Invitrogen),
também aplicado no gel. Ao final, as eletroforeses foram fotografadas.
3.7 Purificação de fragmentos de DNA a partir de gel de agarose, utilizando
fenol/clorofórmio
A porção do gel onde se encontrava o fragmento de DNA de interesse foi excisada
com o auxílio de um bisturi. Uma membrana Millipore, tipo GV, poro de 22µm, foi umedecida
em tampão TE e dobrada na forma de cone. Esta foi inserida em um tubo de 1,5ml, cortado na
sua extremidade superior e com um furo na extremidade inferior, feito com uma agulha quente.
A porção de gel de agarose, contendo o fragmento de DNA, foi colocada dentro do cone feito
com a membrana. O conjunto foi então colocado sobre outro tubo de 1,5ml e todo o aparato foi
centrifugado a 10.000 rpm (Centrífuga Eppendorf 5415C) por 5 minutos. O líquido recuperado
no tubo inferior foi transferido para um novo tubo.
A fim de realizar a limpeza do DNA, 1 volume de fenol foi adicionado à solução. A
mistura foi homogenizada no vortex e em seguida centrifugada a 14.000 rpm por 2 minutos. A
parte superior aquosa, contendo o DNA, foi coletada delicadamente e transferida para outro tubo.
Procedeu-se adicionando 1 volume de clorofórmio (1 volume de álcool isoamílico para 24 de
clorofórmio) e homogenizando a mistura no vortex. As fases foram separadas através da
centrifugação da mistura a 14.000 rpm por 2 minutos. Recolheu-se a parte superior aquosa, a
qual foram adicionados 1/10 do volume de acetato de sódio 3M e 2 volumes de etanol absoluto.
A solução permaneceu em processo de precipitação do DNA por pelo menos 1 hora a -20ºC. Em
Material e Métodos 18
seguida, foi centrifugada a 14.000 rpm durante 15 minutos. Descartou-se o sobrenadante, deixou-
se secar e o DNA foi ressuspendido em volume adequado de água milli-Q autoclavada.
3.8 Preparações de RNA
3.8.1 Isolamento de RNA total em larga escala (Dean et al., 1985)
Todas as soluções para uso com RNA foram preparadas com água milli-Q tratada
com DEPC (Dietil Pirocarbonato) e as vidrarias tratadas a 180ºC em estufa de esterilização por
no mínimo 4 horas. O RNA total foi extraído das diferentes amostras, de acordo com o
protocolo a seguir.
Os tecidos congelados (2 a 10g) foram colocados em nitrogênio líquido e
macerados em graal até se obter um pó fino. O tecido macerado foi transferido para um tubo
tipo Falcon de 50ml, sendo adicionado 9ml de tampão NTES (0,1M NaCl, 0,01M Tris-HCl pH
7,5, 1mM EDTA e 1% SDS) e 6ml de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (24:24:1). Após
agitação, durante 10 minutos no vortex, as amostras foram transferidas para um tubo Corex de
30ml e centrifugadas a 8.500 rpm por 10 minutos.
À fase aquosa foram adicionados 1/10 do volume de acetato de sódio 3M e 2
volumes de etanol absoluto. Após agitação leve, as amostras foram mantidas por pelo menos 1
hora no freezer a -20ºC (o precipitado deve ser claramente visível). Posteriormente, as amostras
foram centrifugadas novamente a 8.500 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado
invertendo-se o tubo, e o precipitado lavado com etanol 70% e dissolvido em 2,5ml de água
milli-Q tratada com DEPC. Em seguida, foram adicionados 2,5ml de acetato de lítio 4M
(precipita principalmente RNA) e as amostras foram mantidas no gelo por dois dias, sendo o
gelo trocado sempre que necessário.
Após dois dias, as amostras foram centrifugadas novamente a 8.500 rpm por 10
minutos e o precipitado dissolvido em 1,8ml água milli-Q tratada com DEPC. Em seguida, foram
adicionados 0,2ml de acetato de sódio 2M pH 4,8 e 4ml de etanol absoluto. Essa mistura foi
homogeneizada e incubada por pelo menos 1 hora no freezer -20°C. As amostras foram
novamente centrifugadas a 8.500 rpm por 10 minutos e, em seguida, o precipitado foi lavado
com etanol 70% e dissolvido em 100µl de água milli-Q tratada com DEPC (ou outro volume
mais adequado, de acordo com a quantidade de RNA). Todas as amostras foram quantificadas e
armazenadas em freezer –70ºC.
Material e Métodos 19
3.9 Sequenciamento de DNA
3.9.1 Reação de sequenciamento de DNA (PCR)
As amostras foram preparadas com o kit de reação ABI Prism Big Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready (Applied Biosystems). Para cada amostra a ser seqüenciada em
microplaca de 96 poços, foram usados aproximadamente 500ηg de DNA (1 a 2µl), 2µl de primer
5 ρmoles/µl, 2µl de “Big Dye” (deoxinucleotídeos, dideoxinucleotídeos fluorescentes, enzima
Taq DNA-Polimerase.), 2µl de tampão de diluição do “Big Dye” (200mM Tris-HCl pH 9,0 e
5mM de Cloreto de Magnésio) e água milli-Q estéril, para completar o volume final de 10µl. A
microplaca foi então selada, levada ao vortex por 1 minuto e centrifugada rapidamente a 1.000
rpm. O programa de PCR utilizado foi:
Desnaturação - 96
o
C por 2 minutos (passo inicial)
Desnaturação - 96
o
C por 45 segundos;
Pareamento - 50
o
C por 30 segundos;
Extensão - 60
o
C por 4 minutos.
Número total de ciclos: 35
Manutenção: 4
o
C por tempo indeterminado.
3.9.2 Purificação e precipitação da reação de sequenciamento
Nesta etapa, as amostras, obtidas na reação em cadeia da polimerase (PCR), são
precipitadas e limpas dos dideoxinucleotídeos fluorescentes não incorporados durante a síntese
de moléculas de DNA. Estes dideoxinucleotídeos livres interferem com a leitura das bases
durante o sequenciamento.
O produto das reações de PCR foi precipitado com 80µl de isopropanol 75% e, após
leve agitação no vortex, foi incubado por 15 minutos a temperatura ambiente. Após
centrifugação a 4.000 rpm por 45 minutos a 20ºC (Centrífuga Eppendorf 5810R), o isopropanol
foi removido completamente por centrifugação (spin até 1.000 rpm), com a placa invertida e
apoiada em papel absorvente. Em seguida, o precipitado foi lavado com 200µL de etanol 70% e,
a seguir, centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos a 20ºC. O etanol foi removido completamente
por centrifugação (spin até 1.000 rpm), com a placa invertida e apoiada em papel absorvente. O
precipitado foi incubado a temperatura ambiente por 1 hora para secar.
Após a precipitação das reações de PCR, cada amostra foi ressuspendida em 10µl de
formamida Hi-Di (Applied Biosystems), a placa foi levada ao vortex por 1 minuto, centrifugada
e colocada a 95ºC por 5 minutos, para desnaturação das amostras. As placas foram colocadas no
seqüenciador ABI 3100 (Applied Biosystems), que contém 16 capilares preenchidos por
Material e Métodos 20
poliacrilamida (POP6.- Applied Biosystems) A corrida eletroforética nos capilares foi realizada
em 15h para cada 96 amostras. O seqüenciador reconhece as bases por meio de diferentes
fluorescências, e as informações são transferidas automaticamente para um computador. A
leitura das bases foi analisada pelo programa de computador, o ABI 3100 Data Collection.
Primers utilizados para obter a sequência completa dos genes utilizados neste trabalho:
T7: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’
SP6: 5’ ATTTAGGTGACACTATAG- 3’
DTV: 5´-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3´
M13R: 5’- CAGGAAACAGCTATGAC -3’
TH-CDKA-Fw: 5´- GCAGGCTTCACCATGGACCAGTATGAAAAAG - 3´
TH-CDKA-Rv: 5´- AAGCTGGGTCTCACGGAACATACCCAAT - 3´
TH-CYCD3;2-Fw: 5´- GCAGGCTTCACCATGGTTTTCCCTTTAGATACTCAGCTCC - 3´
TH-CYCD3;2-Rv: 5´- AAGCTGGGTCTCAACGAGGACTACTGCCCA - 3´
Nt-AGAMOUS-Fw: 5´- AGCAGGCTTCATGGTGTTTCCTAATGAAGAATTTG - 3´
Nt-AGAMOUS-Rv: 5´- AAGCTGGGTCTCAGACAAGCTGGAGAGCAG – 3´
TH-MAPK-Fw: 5´- GCAGGCTTCACCATGGCAACTCCAGTTGAGCCTCCG -3´
TH-MAPK-Rv: 5´- AAGCTGGGTCTCATAGAACAACTTCCATAGCAGCTGAG -3´
Nt-MAPK-Rv1: 5´- ACTTCCATAGCAGCTGAGGCCGCTTCAGGA - 3´
Nt-CYCA1;1-Fw: 5´- AGCAGGCTTCATGGCGACGACYCAGAATAG - 3´
Nt-CYCA1;1-Rv: 5´- AAGCTGGGTCTTAGCAGCTTATGTTCTGGAAG - 3´
Nt-CYCA2;2-Fw: 5´- AGCAGGCTTCATGAGGCATGCAAATATAAAAC - 3´
Nt-CYCA2;2-Rv: 5´- AAGCTGGGTCTTAGAACAGTGATTGGACTGGTTTTG - 3´
Nt-CYCA2;2Del-Fw:5´-
AGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGAATTGCATCAACGGAAG-3´
SeqDONR201-Fw: 5´ - TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC - 3´
SeqDONR201-Rv: 5´- GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC - 3´
DEST22-AD502- Fw: 5´ - TATAACGCGTTTGGAATCACT - 3`
DEST22-32-Rv: 5´ - AGCCGACAACCTTGATTGGAGAC - 3`
DEST32-Fw: 5´ - AACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTG - 3`
3.10 Consulta a banco de dados e comparação entre sequências nucleotídicas
Para identificar a similaridade das sequências clonadas neste trabalho com as
sequências registradas nos bancos de genes, foi utilizado o programa BlastX (Altschul et al.,
1997), que pode ser encontrado no site http://www.ncbi.nih.gov/Blast. Este programa realiza a
tradução da sequência de nucleotídeos que lhe é fornecida, nas 6 possíveis fases de leitura, em
sequências de aminoácidos correspondentes, comparando com o banco de dados de proteína.
Material e Métodos 21
Para se comparar a similaridade entre as bases nucleotídicas de duas sequências foi utilizado o
programa Blast de duas sequências, que pode ser encontrado no site
http://www.ncbi.nih.gov/Blast. Este programa faz o alinhamento de duas sequências
nucleotídicas e encontra similaridades entre elas. Para comparar a similaridade e fazer o
alinhamento entre bases nucleotídicas de três ou mais sequências foi utilizado o programa
ClustalW (Thompson et al., 1994), que pode ser encontrado no site htpp://align.genome.jp/sit-
bin/clustalw.
3.11 Quantificação da concentração de ácidos nucleícos
A quantificação dos ácidos nucléicos foi realizada através dos aparelhos NanoDrop
ND-1000 (Thermo Scientific) e Ultrospec 2100 Pro (Amersham Biosciences). Neste último, uma
amostra de DNA (ou RNA) diluída (1:100) em água é colocada em uma cubeta para que seja
realizada a leitura da mesma em comprimento de onda de 260 nm e 280ηm. No caso de DNA
dupla-fita, uma DO (densidade óptica) igual a 1 corresponde a aproximadamente 50µg/ml (e
40µg/ml para RNA). A razão da DO
260nm
/ DO
280nm
foi utilizada como um parâmetro da
qualidade do ácido nucléico extraído.
3.12 Síntese de cDNAss (single strand cDNA)
A síntese de cDNA a partir do RNA extraído de estigma e estilete (item 3.8.1) foi
realizada utilizando-se a enzima transcriptase reversa III (Superscript® III Reverse
Transcriptase, Invitrogen). Em um tubo de 1,5 ml livre de RNAse foram adicionados 1 µL de
oligo(dT)20 (50 µM), 5 µg de RNA total, 1 µL de dNTP Mix (10 mM de cada: dATP, dGTP,
dCTP e dTTP) e água tratada com DEPC para completar o volume de 13 µL. A mistura foi
aquecida a 65ºC por 5 minutos e imediatamente transferida para o gelo por 2 minutos. Após
uma breve centrifugação, foram adicionados à mistura: 4 µL de First-Strand Buffer 5X, 1 µL de
DTT 0.1M, 1 µL de RNaseOUT™ Recombinant RNase Inhibitor e 1 µL of SuperScript™ III
RT (200 unidades/µL). O conteúdo foi homogenizado, pipetando-se gentilmente, e incubado a
50ºC por 60 minutos. Em seguida, a reação foi inativada, aquecendo-se o tubo a 70ºC por 15
minutos. As amostras foram armazenadas a -20ºC.
Material e Métodos 22
3.13 Clonagem do produto de PCR no vetor PCR
®
-Blunt II-TOPO (Invitrogen)
A partir da purificação dos produtos de PCR foi feita a ligação, adicionando-se 4,0µl
da reação de PCR, 1µl do vetor PCR
®
-Blunt II-TOPO (Figura 03) e 1 µl de sal diluído (1:4). A
reação foi mantida à temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, usada para transformar
células de E. coli eletrocompetentes (DH10B). Após a eletroporação, o material resultante foi
cuidadosamente espalhado em placas de LB contendo 50 µg/ml canamicina para seleção dos
transformantes e incubadas a 37ºC por 16-20h.
Figura 03: Estrutura do plasmídeo PCR
®
-Blunt II-TOPO do Kit Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit (Invitrogen),
evidenciando a região do sítio múltiplo de clonagem.
Material e Métodos 23
3.14 Sistema Gateway (Invitrogen)
3.14.1 Amplificação da sequência codificadora do gene para entrada no
Sistema Gateway
Para introduzir o cDNA do clone estudado no sistema Gateway, foram feitas duas
reações de PCR. Na primeira amplificação, os primers específicos foram utilizados para
amplificar a CDS do gene em questão. Estes primers foram desenhados de forma a conter, nas
suas extremidades, uma parte das sequências correspondentes aos sítios attB1 e attB2. Logo em
seguida, foi feita a segunda amplificação utilizando os primers específicos dos sítios de
recombinação, BP1 e BP2, que complementam a sequência destes sítios. Desse modo a
construção pode ser inserida no sistema Gateway. As duas reações de PCR foram realizadas
como descrito abaixo:
Primeira reação (PCR1): nesta reação, é inserida uma parte dos sítios de
recombinação attB1 e attB2 no fragmento amplificado, a partir de primers específicos.
Montagem da primeira reação:
- 2µl de DNA molde (10ηg/µl)
- 1µl de primer forward (10ρmoles/µl)
- 1µl de primer reverse (10ρmoles/µl)
- 1µl dNTP (10mM)
- 0,7µl enzima TripleMaster (5U/µl - Eppendorf)
- 5µl Buffer high fidelity (10X)
- 39,3µl de água destilada autoclavada (para completar 50µl)
Segunda reação (PCR2): nesta reação os sítios de recombinação attB1 e attB2 que
flanqueiam o fragmento gerado na PCR1 são complementados, utilizando o produto da PCR1 como molde.
BP1- 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC- 3’
BP2- 5’-GACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC- 3’
Montagem da segunda reação:
- 2µl do cDNA obtido na PCR1 purificado do gel de agarose
- 1µl de primer BP1 (10ρmoles/µl)
- 1µl de primer BP2 (10ρmoles/µl)
- 1µl dNTP (10mM)
Material e Métodos 24
- 0,7µl enzima TripleMaster (5U/µl - Eppendorf)
- 5µl Buffer high fidelity (10X)
- 36,3µl de água destilada autoclavada (para completar 50µl)
Condições da reação 2:
Desnaturação (94ºC) 45 segundos
Pareamento (55ºC) 45 segundos
Extensão (72ºC) 45 segundos
Número de ciclos - 35 ciclos
Extensão após os ciclos (72ºC) 5 minutos
3.14.2 Recombinação da região codificadora do gene, no vetor de entrada
pDONR 201 ou pDONR 221 (Invitrogen)
Neste sistema, o gene de interesse é clonado em um vetor de entrada via
recombinação (Kit BP Clonase, Invitrogen) e, posteriormente, pode ser transferido para
diferentes vetores de expressão. Assim, o gene foi inicialmente clonado no vetor de entrada
pDONR 201 ou pDONR221(Figuras 04 e 05) através da reação BP. Nesta reação utilizamos 2µl
(~200ηg) do produto de PCR2, 1µl do vetor pDONR 201 ou pDONR221 (150 ηg), 2µl do
tampão BP (5X), 1µl da mistura da enzima BP clonase, num volume final de 10µl, completados
com água milli-Q autoclavada. A reação foi incubada a 25ºC durante a noite. Após esse tempo,
foi adicionado 1µl de proteinase K (2µg/µl) e foi feita a incubação a 37ºC, durante 10 minutos,
para que ocorresse a degradação de proteínas presentes na reação.
Material e Métodos 25
Figura 04: Mapa de restrição do vetor pDONR201 (Invitrogen), destinado a inserção de produtos de PCR por
recombinação, na região entre os nucleotídeos 111 e 2352. Este vetor de 4,470kb apresenta os genes que conferem
resistência a canamicina (KM
r
) e a cloramfenicol (Cm
r
). O gene ccdB inibe o crescimento quando presente na maioria
das linhagens de E. coli, o que facilita a seleção dos clones desejados. Os sítios attP1 e attP2 são reconhecidos por
recombinases.
3.14.3 Transferência da região codificadora do gene, para os vetores de
expressão do sistema de duplo-híbrido
Após confirmar a inserção da região codificadora do gene, no vetor de entrada, foi
feita uma nova recombinação com os vetores de expressão do sistema de duplo-híbrido:
pDEST22 e pDEST32. Para isso, utilizou-se o Kit LR Clonase (Invitrogen).
Material e Métodos 26
Figura 05: Mapa do vetor pDONR221 (Invitrogen), destinado a inserção de produtos de PCR por recombinação, na
região entre os nucleotídeos 801 e 2754. Este vetor de 4,762kb apresenta os genes que conferem resistência a
canamicina (KM
r
) e a cloramfenicol (Cm
r
). Além disso, apresenta os sítios M13-Fw e M13-Rv para sequenciamento.
O gene ccdB inibe o crescimento quando presente na maioria das linhagens de E. coli, o que facilita a seleção dos
clones desejados. Os sítios attP1 e attP2 são reconhecidos por recombinases.
Em cada reação LR foram utilizados 1µl do vetor de entrada contendo a CDS do
gene estudado (200 ηg), 1µl (150 ηg) do vetor de expressão pDEST22 (Figura 06) ou pDEST32
(Figura 07), 2µl de tampão de reação da enzima LR clonase (5X), 1µl da enzima LR clonase,
num volume final de 10µl, completados com água milli-Q autoclavada. A reação foi incubada a
25ºC durante a noite. Em seguida, foi adicionado 1µl de proteinase K (2µg/µl) à reação e esta
foi incubada a 37ºC durante 10 minutos. Na sequência, o produto da recombinação foi utilizado
para transformação de células de E. coli DH10B eletrocompetentes e plaqueadas em meio LB
com antibiótico de seleção adequado. Para construções que fazem uso do vetor pDET22, a
seleção foi realizada com o antibiótico ampicilina (100mg/ml) e de pDEST32, com gentamicina
(5mg/ml).
Material e Métodos 27
Figura 06: Esquema ilustrativo do vetor de expressão em leveduras pDEST22 (Invitrogen), destinado a inserção de
fragmentos presentes no vetor de entrada, via recombinação, na região entre os nucleotídeos 2245 e 3841. Este vetor
de 8,930kb apresenta os genes que conferem resistência a ampicilina (AMP
r
) e a cloramfenicol (Cm
r
), além de genes
importantes (TRP1) para a biossíntese de triptofano. O vetor é utilizado a fim de produzir proteínas de interesse com
o domínio AD fusionado em sua extremidade N-terminal. Um sinal de localização nuclear também é inserido à
extremidade N-terminal de AD. O gene ccdB inibe o crescimento quando presente na maioria das linhagens de E. coli,
o que facilita a seleção dos clones desejados. Os sítios attP1 e attP2 são reconhecidos por recombinases.
Figura 07: Mapa do vetor de expressão em leveduras pDEST32 (Invitrogen). A recombinação ocorre na região
compreendida entre os nucleotídeos 2161 e 3757. Este vetor de 12,266 kb apresenta os genes que conferem
resistência a gentamicina e a cloramfenicol (Cm
r
), além de genes importantes (Leu2) para a biossíntese de leucina. O
vetor é utilizado a fim de produzir proteínas de interesse com o domínio BD fusionado em sua extremidade N-
terminal. Um sinal de localização nuclear também é inserido à extremidade N-terminal de BD.
Material e Métodos 28
3.14.4. Transferência da região codificadora do gene SCI1 para o vetor de
expressão de proteína (pDEST17)
A construção pENTRY-SCI1 foi realizada por De Paoli et al.(submetido) e cedida
para utilização neste trabalho. Através de uma nova recombinação, reação LR (Gateway LR
Clonase Enzime Mix - Invitrogen), a CDS do gene SCI1 presente na construção pENTRY-SCI1-
3 foi tranferida para o vetor de expressão de proteína pDEST17 (Invitrogen). Este vetor (Figura
08), possui o promotor para a enzima T7 RNA polimerase viral e uma tag de histidina (6
resíduos) estrategicamente posicionada para permitir sua fusão, à extremidade N-terminal da
proteína de interesse, auxiliando em experimentos de purificação e detecção da proteína
recombinante.
Figura 08: Mapa de restrição do plasmídeo pDEST17 (Invitrogen), destinado à formação do vetor de expressão de
proteínas em fusão com uma tag de 6 histidinas, sob controle do promotor T7. Este vetor possui 6354pb, e apresenta
também os genes que conferem resistência à ampicilina (AMP) e ao cloranfenicol (Cm). O gene ccdB inibe o
crescimento quando presente na maioria das linhagens de E. coli, o que facilita a seleção dos clones desejados. Os
sítios attR1 e attR2 são reconhecidos por recombinases.
Na reação LR foi utilizado 1µl (200ηg) da construção pENTRY-SCI1-3 (pDONR
201 + SCI1), 1µl do vetor (pDEST17 – 150ηg), 2µl de tampão de reação da enzima LR clonase
(5X), 1µl da enzima LR clonase, num volume final de 10µl, completados com água milli-Q
autoclavada. A reação foi incubada a 25ºC durante a noite. Em seguida, foi adicionado 1µl de
proteinase K (2µg/µl), para que ocorresse a degradação das proteínas presentes na reação
Material e Métodos 29
enzimática e colocou-se a reação em banho-maria a 37ºC durante 10 minutos. A construção
resultante dessa recombinação foi denominado de pEXP17-SCI1. Após confirmação por
digestão e sequenciamento, este vetor foi utilizado para transformação da linhagem BL21(DE3)
Rosetta, de E. coli, própria para expressão de proteínas.
3.15 Análise in silico da sequência genômica de SCI1
A sequência de nucleotídeos codificante de SCI1 foi obtida por De Paoli et al.
(submetido) através do alinhamento das sequências de dois clones: HS1-002E06, presente na
biblioteca subtrativa SSH (De Paoli, 2006) e TOB068F10, presente na biblioteca TOBEST
(Quiapim et al., 2009), que continham partes diferentes, porém complementares do cDNA de
SCI1. Com a utilização de primers específicos, baseados nas sequências dos clones
anteriormente citados, o autor conseguiu amplificar a sequência codificante completa de SCI1,
nomeada ORF-SCI1.
Utilizando como molde, a sequência ORF-SCI1, a busca pela sequência genômica
correspondente foi feita no banco de dados do SOL (International Solanaceae Genomics
Project - Sol Genomic Networks). Uma vez obtidos os clones genômicos correspondentes, as
sequências foram alinhadas utilizando o programa bl2seq (blast de 2 sequências -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e montada manualmente. A localização de introns e exons foi
realizada através da tradução da sequência, feita com o programa translate do ExPASy
Proteomic Server (http://www.expasy.ch/tools/dna.html), e análise visual comparativa com a
sequência do cDNA. Programas computacionais treinados para realizar a busca por elementos
regulatórios comuns em regiões promotoras, como o PROMOTER SCAN (http://www-
bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan) (Prestridge, 1995) foram utilizados na tentativa de encontrar
a região promotora do gene.
A sequência genômica foi então analisada por programas de busca por elementos cis
regulatórios da expressão em plantas, que comparam a sequência com elementos regulatórios
presentes em bancos de dados como PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE) e
PLANTCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html).
3.15.1 Comparação das sequências genômicas de SCI1 de N. tabacum e A.
thaliana
A busca pela sequência genômica de SCI1 de A. thaliana foi realizada no banco de
dados TAIR (The Arabidopsis Information Resource), utilizando a sequência de SCI1 de N.
Material e Métodos 30
tabacum como molde. Em seguida, a sequência foi analisada de forma semelhante à descrita no
item 3.15.
3.16 Estudo de possíveis parceiros de SCI1 através de ensaios de Duplo-Híbrido
Para realização dos testes, foi utilizado o Kit Proquest Two-Hybrid System (Invitrogen).
Apesar de apresentar algumas inovações, como a disponibilidade de vetores adaptados à
Tecnologia Gateway (Invitrogen), a essência deste sistema ainda é baseada nas idéias de Fields
e Song que descreveram o sistema pela primeira vez em 1989. Basicamente, o sistema consiste
em co-expressar dois supostos parceiros de interação dentro de um recipiente biológico, neste
caso células de leveduras. As proteínas co-expressas são ditas híbridas, pois a construção
utilizada para produção das mesmas foi especialmente elaborada para permitir a fusão, em fase,
de cada parceiro com um domínio específico do fator de transcrição GAL4.
O Kit Proquest Two-Hybrid System (Invitrogen) fornece dois vetores, pDEST22 e
pDEST32, para construção das fusões, mediante recombinação. A inserção, em fase, da CDS de
um gene no vetor pDEST22 permite a expressão da proteína codificada pelo gene fusionada na
extremidade C-terminal do domínio AD (Activation Domain) do fator de transcrição GAL4. Já o
vetor pDEST32 possui as mesmas características, porém a proteína é fusionada à extremidade
C-terminal do domínio BD (Binding Domain) do mesmo fator de transcrição.
Segundo recomendação do fabricante, os primeiros testes devem preferencialmente ser
conduzidos, utilizando-se a proteína de interesse (isca), neste caso SCI1, fusionada ao domínio
BD. Desta forma, a construção BD-SCI1 foi obtida, inserindo a CDS de SCI1, em fase, no vetor
pDEST32. Já a CDS dos possíveis parceiros de interação de SCI1 foram inseridas, também em
fase, no vetor pDEST22. Para confirmação dos resultados, o fabricante sugere que testes
complementares sejam realizados, com as construções inversas, ou seja, onde SCI1 esteja
fusionado ao domínio AD e os possíveis parceiros de interação fusionados ao domínio BD.
As proteínas utilizadas nos testes de duplo-híbrido foram selecionadas mediante dados
presentes no trabalho de De Paoli et al. (submetido). Foram testadas as seguintes proteínas:
ciclinaD3;2, CDKA (Cyclin Dependent Kinase A), MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase),
Agamous, ciclinaA1;1, ciclinaA2;2 e ciclinaA2;2 com sítio destruction box (Vandepoele et al.,
2002) deletado.
Material e Métodos 31
3.16.1 Obtenção das sequências codificadoras e clonagem em vetores
específicos
Buscas foram realizadas em bancos de dados específicos, como o GenBank do NCBI e
o TOBEST (Quiapin et al, 2009) a fim de se encontrar a sequência codificadora das proteínas
mencionadas anteriormente.
3.16.1.1 Clonagem da sequência codificadora de MAPK nos vetores
pDEST22 e pDEST32
A busca pelo cDNA referente à MAPK na biblioteca TOBEST resultou em 2 clones
distintos, TOBEST063E05 e TOBEST077E11. Entretanto, devido ao fato da sequência
codificante da proteína não estar completa em nenhum dos clones (anexo - Figura 03), um passo
adicional foi necessário para complementação da sequência.
Para obter a CDS completa da MAPK, pronta para uso no sistema gateway, foi utilizada
uma estratégia de amplificação composta de 3 PCRs sequenciais. A Figura 09 apresenta um
esquema ilustrativo da estratégia utilizada.
No primeiro ciclo de amplificação, o cDNA do clone TOBEST63E05 foi utilizado
como molde, juntamente com os primers TH-MAPH-Fw e Nt-MAPK-Rv1 (Figura 10). Neste
caso, o primer forward seria responsável pela amplificação do cDNA a partir da região
correspondente à metionina inicial da proteína e pela inserção de parte do sítio attB1 na
extremidade 5´da sequência. Já o primer reverse, foi estrategicamente desenhado, com base na
sequência presente no clone TOBEST077E11, a fim de complementar o trecho do final da
sequência codificadora de MAPK que se encontrava ausente no clone TOBEST063E05.
Material e Métodos 32
Figura 09: Esquema ilustrando a estratégia utilizada para amplificação da sequência codificadora da enzima MAPK
através do clone TOBEST063E05. A sequência do clone TOBEST077E11 foi utilizada para desenho do primer NT-
MAPK-Rv1 responsável pela reconstrução da região 3´, inexistente no clone TOBES063E05 durante o primeiro de
ciclo de amplificação. Na segunda PCR, parte do sítio attB2 foi inserida na extremidade 3´ através do primer TH-
MAPK-Rv. Finalmente, na PCR número 3, os primers BP1 e BP2 complementaram a sequência dos adaptadores
attB1 e attB2, respectivamente, para possibilitar a posterior inserção da sequência no vetor pDONR221 (Sistema
Gateway-Invitrogen).
Material e Métodos 33
Figura 10: Esquema mostrando as sequências dos primers utilizados na amplificação da CDS da MAPK. O esquema
evidencia a localização do primer na sequência, a presença de um codon correspondente à sequência de Kozak
(importante para a expressão em eucariotos) no primer TH-MAPK-Fw e parte dos sítios attB1 e attB2.
A montagem da reação e as condições utilizadas foram:
Montagem da primeira reação:
- 2µl de DNA molde (cDNA E/E estágio 1 (10ηg/µl)
- 1µl de primer TH-MAPH-Fw (10ρmoles/µl)
- 1µl de primer Nt-MAPK-Rv1 (10ρmoles/µl)
- 1µl dNTP (10mM)
- 0,7µl enzima TripleMaster (5U/µl - Eppendorf)
- 5µl Buffer high fidelity (10X)
- 39,3µl de água destilada autoclavada (para completar 50µl)
Condições da reação 1:
Desnaturação (94ºC) 45 segundos
Pareamento (60ºC) 45 segundos
Extensão (72ºC) 90 segundos
Número de ciclos - 39 ciclos
Extensão após os ciclos (72ºC) 5 minutos
Material e Métodos 34
Num segundo ciclo de amplificação, o produto da PCR1 foi novamente amplificado
com o primer TH-MAPH-Fw, porém fazendo uso de um novo primer, denominado TH-MAPK-
Rv (Figura 10), que além de finalizar a sequência correspondente ao stop codon, adiciona parte
da sequência attB2 necessária para inserção da sequência em vetores específicos via
recombinação (Sistema Gateway). A montagem desta segunda reação de amplificação é
correspondente à montagem da PCR1 descrita no item 3.14.1.
Condições da reação 2:
Desnaturação (94ºC) 45 segundos
Pareamento (58ºC) 45 segundos
Extensão (72ºC) 90 segundos
Número de ciclos - 39 ciclos
Extensão após os ciclos (72ºC) 5 minutos
Finalmente, uma terceira PCR foi realizada a fim de complementar as sequências
referentes aos sítios attB1 e attB2, utilizando-se os primers BP1 e BP2. A montagem e
condições da reação deste terceiro ciclo de amplificação são correspondentes às da PCR2
descrita no item 3.14.1.
O produto da PCR3 foi inserido no vetor pDONR201 mediante recombinação, dos sítios
attB1 e attB2 presentes no inserto, com os sítios attP1 e attP2 presentes no vetor,
respectivamente. Para este tipo de recombinação foi utilizado o Kit BP Clonase (Invitrogen),
como descrito no item 3.14.2. Oito microlitros do volume da recombinação foram utilizados
para transformação de células de E. coli DH5α competentes pelo método descrito no item 3.3.2.
Para checar a identidade dos transformantes, utilizou-se digestão enzimática com SacI e PstI,
como descrito em 3.5 e 3.6.
Após a escolha de um clone que apresentou correspondência com o padrão de digestão
esperado, o DNA correspondente foi purificado como descrito no item 3.7 e quantificado (item
3.11). Uma amostra deste DNA foi seqüenciada através do método descrito em 3.9.4 e após
confirmação da sequência, uma alíquota deste DNA foi utilizada para transferir a CDS da
MAPK para o vetor de expressão pDEST22, através de uma reação LR com condições idênticas
às descritas em 3.14.3. Uma amostra do produto desta recombinação foi utilizado para
transformação de células de E. coli DH5α competentes. Novamente o método de digestão
enzimática foi usado para checar a identidade dos transformantes. Neste caso foi utilizada a
enzima SacI. Após comparação com o padrão de digestão esperado e escolha do clone, o DNA
correspondente foi purificado e quantificado como descrito na etapa anterior.
Material e Métodos 35
3.16.1.2 Clonagem da sequência codificadora da proteína AGAMOUS no
vetor pDEST22
A busca pela sequência do gene agamous na biblioteca TOBEST resultou no clone
TOBEST025G07. Após o sequenciamento, observou-se que o mesmo apresentava a sequência
codificadora da proteína AGAMOUS completa. Dessa forma, primers foram especificamente
desenhados para permitir a amplificação da CDS do gene: Nt-AGAMOUS-Fw e Nt-
AGAMOUS-Rv (Figura 11).
Figura 11: Desenho ilustrativo das sequências dos primers utilizados na amplificação da CDS de AGAMOUS. O
esquema evidencia a localização do primer na sequência e parte dos sítios attB1 e attB2.
A metodologia para amplificação da CDS de AGAMOUS foi bastante semelhante ao
descrito no item 3.14.1. Apenas o DNA utilizado como molde na PCR1 diferiu, sendo utilizado
o DNA extraído e purificado do clone TOBEST025G07. As condições utilizadas na PCR1
foram:
Condições da reação 1:
Desnaturação (94ºC) 45 segundos
Pareamento (62ºC) 45 segundos
Extensão (72ºC) 90 segundos
Número de ciclos - 29 ciclos
Extensão após os ciclos (72ºC) 5 minutos
Material e Métodos 36
O produto da PCR2 foi inserido no vetor pDONR221 mediante recombinação. Para este
tipo de recombinação foi utilizado o Kit BP Clonase (Invitrogen), como descrito no item 3.14.2.
Um microlitro do volume da recombinação foi utilizado para transformação de células de E. coli
DH10B eletrocompetentes pelo método descrito no item 3.3.1. Para checar a identidade dos
transformantes, utilizou-se digestão enzimática com EcoRV e PstI, como descrito em 3.5 e 3.6.
Após a escolha de um clone com correspondência positiva para o padrão de digestão
esperado, o DNA correspondente foi purificado como descrito no item 3.7 e quantificado (item
3.11. Uma amostra deste DNA foi seqüenciada através do método descrito em 3.9.4 e após
confirmação da sequência, uma alíquota deste DNA foi utilizado para transferir a CDS da
AGAMOUS para os vetores de expressão pDEST22 e pDEST32, através de duas reações LRs
com condições idênticas às descritas em 3.14.3. Um volume de 8µl do produto de cada
recombinação foi utilizado para transformação de células de E. coli DH5α competentes.
Novamente o método de digestão enzimática foi usado para checar a identidade dos
transformantes. Neste caso foram utilizadas as enzimas PstI e XhoI para a construção
pDEST22-AGAMOUS e PstI e HindIII para a construção pDEST32-AGAMOUS. Após
comparação com o padrão de digestão esperado e escolha dos clones, o DNA correspondente de
cada clone foi purificado e quantificado como descrito anteriormente.
3.16.1.3 Clonagem da sequência codificadora de ciclinaD3;2 nos vetores
pDEST22 e pDEST32
Uma vez que o cDNA correspondente à proteína ciclinaD3;2, não foi encontrado na
biblioteca TOBEST, a busca foi realizada no banco de dados GenBank do NCBI. A sequência
do cDNA da ciclinaD3;2 de N. tabacum (CAA09854) serviu de base para a construção de
primers específicos. Para facilitar o desenho destes primers e diminuir as chances de
amplificação de outras ciclinas da mesma família, as sequências codificadoras de diversas
ciclinas de N. tabacum foram alinhadas. Dentro da família de ciclinas D, foram encontradas:
ciclinaD3;1 (CAA09853), ciclinaD3;5 (AB243208) e ciclinaD2;1 (CAA09852). Além destas,
também foram consideradas no alinhamento, as sequências parciais de ciclinaB (AF518251) e
ciclinaA (D50735). O alinhamento das sequências foi realizado na região da metionina inicial
da CDS e na região do stop codon.
Como resultado, foram desenhados dois primers específicos: TH-CYCD3;2-Fw e TH-
CYCD3;2-Rv (Figura12). Utilizando a mesma lógica descrita nos itens anteriores, estes primers
são constituídos de uma região específica da sequência a ser amplificada (da metionina inicial
da CDS até o stop codon) e de parte dos sítios attB1 e attB2. No primer forward também foi
Material e Métodos 37
adicionado um codon extra, correspondente à sequência de Kozak (Kozak, 1987) para expressão
em organismos eucariotos.
Figura 12: Esquema ilustrativo das sequências dos primers utilizados na amplificação da CDS da ciclinaD3;2 de N.
tabacum. O esquema evidencia a localização do primer na sequência, a presença de um codon correspondente à
sequência de Kozak (importante para a expressão em eucariotos) e parte dos sítios attB1 e attB2.
A metodologia para amplificação da CDS da ciclinaD3;2 foi idêntica ao
descrito no item 3.14.1. O cDNA de E/E estágio 1 foi utilizado como molde na PCR1 e as
condições utilizadas na PCR1 foram:
Condições da reação 1:
Desnaturação (94ºC) 45 segundos
Pareamento (60ºC) 45 segundos
Extensão (72ºC) 120 segundos
Número de ciclos - 35 ciclos
Extensão após os ciclos (72ºC) 5 minutos
Devido ao fato da ciclinaD3;2 ser membro de uma família de proteínas bastante
semelhantes, antes de prosseguir para o segundo ciclo de amplificação (PCR2), o produto da
PCR1 foi inserido no vetor PCR-BluntII-TOPO (Invitrogen) para que fosse possível o
sequenciamento do mesmo. O procedimento para este tipo de clonagem encontra-se descrito no
item 3.13. Alguns transformantes foram analisados por digestão enzimática com EcoRI e em
seguida, uma amostra do DNA extraído e purificado de um dos clones com correspondência ao
Material e Métodos 38
padrão esperado de digestão foi seqüenciado. Após a confirmação da identidade do DNA, uma
alíquota foi utilizada no segundo ciclo de amplificação, como descrito em 3.14.1.
O produto da PCR2 foi inserido no vetor pDONR201 mediante recombinação em uma
reação BP, como descrito no item 3.14.2. Um microlitro do volume da recombinação foi
utilizado para transformação de células de E. coli DH10B eletrocompetentes pelo método
descrito no item 3.3.1. Para checar a identidade dos transformantes, utilizou-se digestão
enzimática com NcoI e PstI, como detalhado em 3.5 e 3.6.
Após a purificação e quantificação do DNA selecionado na etapa anterior, uma alíquota
foi utilizada para transferência da CDS da ciclinaD3;2 para os vetores de expressão, via
recombinação. Foram realizadas duas reações LRs conforme o procedimento presente no item
3.14.3, utilizando-se os vetores pDEST22 e pDEST32. Uma alíquota de cada ligação foi
utilizada para transformação de células E. coli DH10B. A identidade do DNA dos
transformantes foi testada por digestão enzimática. Para a construção pDEST22-CYCD3;2
foram usadas as enzimas XhoI e PstI, enquanto que as digestões dos clones resultantes da
construção pDEST32-CYCD3;2 foram feitas com as enzimas XhoI e XbaI. Dois clones que
apresentaram correspondência com o padrão de digestão esperado, um de cada construção,
foram selecionados para as etapas posteriores do teste. O DNA destes clones passou então pelos
processos de limpeza e quantificação, detalhados nos itens 3.7 e 3.11, respectivamente.
3.16.1.4 Clonagem da sequência codificadora de CDKA nos vetores
pDEST22 e pDEST32
A sequência do cDNA de CDKA:4 de N. tabacum (AF289467.1) foi obtida no GenBank.
A estratégia de amplificação e clonagem da sequência codificadora desta proteína consistiu no
desenho se primers específicos. Como realizado no item anterior, para facilitar o desenho destes
primers e diminuir as chances de amplificação de CDKs de outras famílias, a sequência
codificadora de: CDKB1-1 (AF289465), CDKB1-2 (AF289466), NtPITSLREalpha (AB195174)
e cdc2-homolog (D50738), de N. tabacum, foram alinhadas nas regiões da metionina inicial e
stop codon. Como resultado, foram estrategicamente construídos os primers TH-CDKA-Fw e
TH-CDKA-Rv (Figura 13).
Estes primers foram utilizados em conjunto, no primeiro ciclo de amplificação (PCR1-
item 3.14.1). O cDNA de E/E estágio 1 foi utilizado como molde e as condições utilizadas na
PCR1 foram:
Condições da reação 1:
Desnaturação (94ºC) 45 segundos
Material e Métodos 39
Pareamento (56ºC) 45 segundos
Extensão (72ºC) 60 segundos
Número de ciclos - 39 ciclos
Extensão após os ciclos (72ºC) 5 minutos
Figura 13: Esquema ilustrativo das sequências dos primers TH-CDKA-Fw e TH-CDKA-Rv, utilizados na
amplificação da CDS da CDKA de N. tabacum. O esquema evidencia a localização do primer na sequência, a
presença de um codon correspondente à sequência de Kozak (importante para a expressão em eucariotos) e parte dos
sítios attB1 e attB2.
Após a confirmação do funcionamento do primeiro ciclo de amplificação, uma segunda
reação foi montada (PCR2) como mencionado anteriormente. O produto da PCR2 foi inserido
no vetor pDONR201 mediante recombinação, em uma reação BP. Um microlitro do volume da
recombinação foi utilizado para transformação de células de E. coli DH10B eletrocompetentes
pelo método descrito no item 3.3.1. Para checar a identidade dos transformantes, utilizou-se
digestão enzimática com AvaI e EcoRI, como descrito em 3.5 e 3.6.
Um dos clones positivos para o teste de digestão enzimática foi escolhido e seu DNA
passou pelos processos de limpeza e quantificação. Seguindo o protocolo descrito no item
3.14.3, a CDS presente na construção pDONR221-CDKA foi transferida para os vetores de
expressão pDEST22 e pDEST32. Uma alíquota de cada ligação foi utilizada para transformação
de células E. coli DH10B. A identidade do DNA dos transformantes foi testada por digestão
enzimática. Para a construção pDEST22-CDKA foram usadas as enzimas XhoI e EcoRI,
enquanto que as digestões dos clones resultantes da construção pDEST32-CYCD3;2 foram
Material e Métodos 40
feitas com a enzima HindIII. Dois clones que apresentaram correspondência com o padrão de
digestão esperado, um de cada construção, foram selecionados para as etapas posteriores do
teste. O DNA extraído destes clones passou então pelos processos de limpeza e quantificação,
detalhados nos itens 3.7 e 3.11, respectivamente.
3.16.1.5 Clonagem das sequências codificadoras de ciclinaA1;1 e
ciclinaA2;2 nos vetores pDEST22
As sequências codificadoras de ciclinaA1;1 (X92966) e ciclinaA2;2 (D50736)
de N.
tabacum foram obtidas no GenBank. A estratégia de amplificação e clonagem da CDS destas
proteínas consistiu no desenho de primers específicos: Nt-CYCA1;1-Fw e Nt-CYCA1;1-Rv
(Figura 14), para ciclinaA1;1 e Nt-CYCA2;2-Fw e Nt-CYCA2;2-Rv (Figura 15) para ciclina
A2;2. Na sequência dos primers forward foi adicionada a sequência de Shine-Dalgarno
(Shine&Dalgarno, 1975) para expressão em organismos procariotos, além da sequência de
Kozak para expressão em organismos eucariotos.
Figura 14: Esquema ilustrativo das sequências dos primers Nt-CYCA1;1-Fw e Nt-CYCA1;1-Rv, utilizados na
amplificação da CDS da ciclinaA1;1 de N. tabacum. O esquema evidencia a localização do primer na sequência, a
presença de um codon correspondente à sequência de Kozak (importante para a expressão em eucariotos), a presença
da sequência de Shine-Dalgarno para expressão em procariotos. e parte dos sítios attB1 e attB2.
Material e Métodos 41
Figura 15: Esquema ilustrativo das sequências dos primers Nt-CYCA2;2-Fw e Nt-CYCA2;2-Rv, utilizados na
amplificação da CDS da ciclinaA2;2 de N. tabacum. O esquema evidencia a localização do primer na sequência, a
presença de um codon correspondente à sequência de Kozak (importante para a expressão em eucariotos) e da
sequência de Shine-Dalgarno para expressão em procariotos (Nt-CYCA2;2-Fw), além de parte dos sítios attB1 e
attB2.
A amplificação da CDS das duas ciclinas foi realizada de forma idêntica à descrita no
item 3.14.1, com exceção apenas para o uso da enzima Platinum® Taq DNA Polymerase High
Fidelity (Invitrogen). O cDNA de E/E estágio 1 foi utilizado como molde e as condições
utilizadas na PCR1, para as duas reações foram:
Condições da reação 1:
Desnaturação (94ºC) 45 segundos
Pareamento (58ºC) 45 segundos
Extensão (72ºC) 105 segundos
Número de ciclos - 35 ciclos
Extensão após os ciclos (72ºC) 5 minutos
Após a confirmação da correta amplificação dos fragmentos desejados nas PCR1, uma
segunda reação foi montada (PCR2) para cada PCR1, como descrito no item 3.14.1. Os
produtos das PCR2 foram inseridos no vetor pDONR221 mediante duas recombinações
independentes (reações BP). Um microlitro do volume de cada recombinação foi utilizado para
transformação de células de E. coli DH10B eletrocompetentes pelo método descrito no item
3.3.1. Para checar a identidade dos transformantes, utilizou-se digestão enzimática com PvuII,
como descrito em 3.5 e 3.6.
Material e Métodos 42
Para cada construção, um dos clones positivos para o teste de digestão enzimática foi
escolhido e seu DNA passou pelos processos de limpeza e quantificação. Seguindo o protocolo
descrito no item 3.14.3, as CDSs presentes nas construções pDONR221-CYCA1;1 e
pDONR221-CYCA2;2 foram transferidas para o vetor de expressão pDEST22, através de duas
reações LR independentes. Uma alíquota de cada ligação foi utilizada para transformação de
células E. coli DH10B. A identidade do DNA dos transformantes foi testada por digestão
enzimática. Tanto para a construção pDEST22-CYCA1;1 como pDEST22-CYCA2;2 foi usada
a enzima PvuII.
Um clone oriundo de cada construção e que tenha apresentado correspondência com o
padrão de digestão esperado foi selecionado para as etapas posteriores do teste. O DNA extraído
destes clones passou então pelos processos de limpeza e quantificação, detalhados nos itens 3.7
e 3.11, respectivamente.
3.16.1.6 Clonagem da sequência codificadora de ciclinaA2;2, com o sítio
destruction box deletado, nos vetores pDEST22
A progressão do ciclo celular é catalisada por kinases dependentes de ciclinas – CDKs
(cyclin-dependent kinases). Estas, como o próprio nome sugere, são ativadas por proteínas
especiais chamadas ciclinas. Durante todo o ciclo celular, ciclinas são sintetizadas e devem ser
degradadas, antes que a célula ingresse num novo ciclo mitótico. Assim, a degradação de
ciclinas é o passo principal que governa a saída da mitose e o progresso para o próximo ciclo
celular (Glotzer et al, 1991).
Proteólise através do sistema proteossomo-ubiquitina é o fundamental mecanismo para
reciclagem de proteínas, controle do ciclo celular e transdução de sinal (Ciechanover, 1994;
Yamano et al., 1998). Análises da região N-terminal definem a sequência essencial para a
proteólise de ciclinas, a então chamada “destruction box” ou D-box (Glotzer et al., 1991) e
mostraram que construções contendo D-boxes eram rapidamente poliubiquitinadas quando o
destruction box da ciclina estava presente (Yamano et al., 1998).
Com base nos dados acima mencionados, optou-se pela deleção do D-Box (DDB) da
ciclinaA2;2. Vanderpoele et al., (2002) relacionaram a sequência D-Box de uma série de
ciclinas de A. thaliana, dentre elas, da ciclinaA2;2. O sítio correspondente foi encontrado na
sequência da ciclinaA2;2 de N. tabacum e a deleção foi realizada através da construção de um
primer específico (Figura 15), que daria início à amplificação da CDS após o sítio D-box (Nt-
CYCA2;2-Del-Fw). Este, foi utilizado juntamente com o primer Nt-CYCA2;2-Rv em um
primeiro ciclo de amplificação (PCR1) utilizando cDNA de estigma e estile de N. tabacum
como molde.
Material e Métodos 43
Condições da reação 1:
Desnaturação (94ºC) 45 segundos
Pareamento (58ºC) 45 segundos
Extensão (72ºC) 105 segundos
Número de ciclos - 35 ciclos
Extensão após os ciclos (72ºC) 5 minutos
Figura 16: Esquema ilustrativo da sequência do primer Nt-CYCA2;2DDB-Fw construído para iniciar a CDS da
ciclinaA2;2 de N. tabacum após o sítio D-Box. O esquema evidencia a localização do primer na sequência, a
presença de um codon correspondente à sequência de Kozak (importante para a expressão em eucariotos) e da
sequência de Shine-Dalgarno para expressão em procariotos (Nt-CYCA2;2-Fw), além de parte dos sítios attB1 e
attB2.
A complementação dos sítios attB1 e attB2 foi feita mediante PCR2, como
anteriormente mencionado. O produto da PCR2 foi inserido no vetor pDONR221 mediante
recombinação, em uma reação BP. Um microlitro do volume da recombinação foi utilizado para
transformação de células de E. coli DH10B eletrocompetentes pelo método descrito no item
3.3.1. Para checar a identidade dos transformantes, utilizou-se digestão enzimática com PvuII,
como descrito em 3.5 e 3.6.
Um dos clones positivos para o teste de digestão enzimática foi escolhido e seu DNA
passou pelos processos de limpeza e quantificação. Seguindo o protocolo descrito no item
3.14.3, a CDS presente na construção pDONR221-CYCA2;2DDB foi transferida para o vetor
de expressão pDEST22. Uma alíquota da recombinação foi utilizada para transformação de
células E. coli DH10B. A identidade do DNA dos transformantes foi testada por digestão
enzimática com PvuII. O DNA extraído de um dos clones que mostraram correspondência com
o padrão de digestão esperado passou então pelos processos de limpeza e quantificação,
detalhados nos itens 3.7 e 3.11, respectivamente.
Material e Métodos 44
3.16.1.7 Clonagem da sequência codificante de SCI nos vetores pDEST22 e
pDEST32
A amplificação da CDS de SCI1 foi feita por De Paoli et al. (submetido), que cederam a
construção pENTRY-SCI1 para utilização no presente trabalho. Dessa forma, seguindo o
protocolo descrito no item 3.14.3, a CDS presente na construção pDONR201-SCI1 (pENTRY-
SCI1) foi transferida para os vetores de expressão pDEST22 e pDEST32, através de duas
reações LRs independentes. Uma alíquota de cada recombinação foi utilizada para
transformação de células E. coli DH10B. A identidade do DNA dos transformantes foi testada
por digestão enzimática. A enzima HindIII foi utilizada para testar os transformantes oriundos
das duas construções. Dois clones que apresentaram correspondência com o padrão de digestão
esperado, um de cada construção, foram selecionados para as etapas posteriores do teste. O
DNA extraído destes clones passou então pelos processos de limpeza e quantificação,
detalhados nos itens 3.7 e 3.11, respectivamente.
3.16.2 Ensaio de Duplo-híbrido
3.16.2.1 Células de leveduras competentes
Inicialmente, a cepa de Saccharomyces cerevisiae Mav203 (MATα, leu2-3,112, trp1-
901, his3∆200, ade2-101, gal4∆, gal80∆,SPAL10::URA3, GAL1::lacZ, HIS3UAS
GAL1::HIS3@LYS2, can1R, cyh2R, Invitrogen) foi recuperada do estoque em glicerol,
estriando-se uma pequena porção da suspensão de células em meio YPAD. Após 3 dias de
incubação a 30ºC, colônias podiam ser observadas. Uma colônia foi raspada da placa com
auxílio de uma alça de platina e ressuspendida em 50µl de água milli-Q autoclavada. Essa
suspensão de células foi espalhada no centro de uma placa contendo meio YPAD, com a ajuda
de uma alça de Drigalski e incubada a 30ºC durante a noite. No dia seguinte, as células
presentes no centro da placa foram coletadas com uma alça de platina e ressuspendidas em 5 ml
de água milli-Q autoclavada. A suspensão de células obtida foi adicionada em um Erlenmeyer
de 500 ml contendo 100 ml de meio YPAD líquido, até que a OD da cultura alcançar valor ~0,1.
O frasco contendo a cultura foi mantido em incubadora refrigerada (Tecnal TE-422)
com agitação de 250rpm, a 30ºC até a cultura atingir a OD~0,4. A suspensão de células foi
dividida em dois tubos Falcon de 50 ml e centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos a temperatura
ambiente. O sobrenadante foi descartado e cada precipitado de células ressuspendido lentamente
em 20 ml de água destilada e autoclavada, a temperatura ambiente. Novamente os tubos foram
Material e Métodos 45
centrifugados a 3000 rpm, durante 5 minutos a temperatura ambiente. A porção sobrenadante
foi descartada e cada precipitado de células ressuspendido em 10 ml de TE/LiAc 1X. Outra
etapa de centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente foi realizada e o
sobrenadante descartado. Cada precipitado de células foi então ressuspendido em 175 µl de
TE/LiAc 1X e juntados em um único tubo. A suspensão de células competentes foi aliquotada
em tubos de 1,5 ml contendo 50 µl cada, para uso imediato.
3.16.2.2 Co-transformação em células de S. cerevisiae
Para cada co-transformação realizada, foram utilizados:
- 50 µl de células competentes Mav203
- 5 µl de carreador de DNA fresco (esperma de salmão sonicado – Invitrogen)
- 200 ηg de cada construção, seguindo a tabela 01
Tabela 01: Relação de todas as combinações isca-presa (construções) co-transformadas em S. cerevisiae para teste de
duplo-híbrido. Para cada combinação, a tabela apresenta o objetivo de sua realização. BD: Binding Domain;
AD:Activation Domain.
Construção BD
(ISCA)
Construção AD
(PRESA)
Objetivo
pDEST32-SCI1 pDEST22-MAPK Interação BD-SCI e AD-MAPK
pDEST32-SCI1 pDEST22-CDKA Interação BD-SCI e AD-CDKA
pDEST32-SCI1 pDEST22-CYCD3;2 Interação BD-SCI e AD-CYCD3;2
pDEST32-SCI1 pDEST22-SCI1 Interação BD-SCI e AD-SCI1
pDEST32-CYCD3;2 pDEST22-SCI1 Interação BD-CYCD3;2 e AD-SCI1
pDEST32-CYCD3;2 pDEST22-CDKA Interação BD-CYCD3;2 e AD-CDKA
pDEST32-CDKA pDEST22-CYCD3;2
Interação BD-CDKA e AD-CYCD3;2
(controle positivo de interação)
pDEST32-CDKA pDEST22-SCI1 Interação BD-CDKA e AD-SCI1
pDEST32-SCI1 pDEST22-CYCA1;1 Interação BD-SCI e AD-CYCA1;1
pDEST32-SCI1 pDEST22-CYCA2;2 Interação BD-SCI e AD-CYCA2;2
pDEST32-SCI1 pDEST22-CYCA2;2DDB Interação BD-SCI e AD-CYCA2;2DDB
pDEST32-SCI1 pEXPAD-502 Interação BD-SCI e AD (controle)
pDBLeu pDEST22-SCI1 Interação BD e AD-SCI1 (controle)
pDEST32-CYCD3;2 pEXPAD-502 Interação BD-CYCD3;2 e AD (controle)
pDBLeu pDEST22-CDKA Interação BD e AD-CDKA (controle)
Material e Métodos 46
pDBLeu pDEST22-MAPK Interação BD e AD-MAPK (controle)
pDBLeu pDEST22-CYCA1;1 Interação BD e AD-CYCA1;1 (controle)
pDBLeu pDEST22-CYCA2;2 Interação BD e AD-CYCA2;2 (controle)
pDBLeu pDEST22-CYCA2;2DDB Interação BD e AD-CYCA2;2DDB (controle)
pDEST32-CDKA pEXPAD-502 Interação BD-CDKA e AD (controle)
pDBLeu pEXPAD-502
Interação BD e AD
(controle negativo de interação)
- - Controle negativo da transformação
As combinações foram gentilmente misturadas através de pipetagem. Em cada tubo
foram adicionados 300 µl de PEG/LiAc e novamente o conteúdo foi misturado. A suspensão de
células foi incubada a 30ºC por 30 minutos em banho-maria e imediatamente transferida para
outro banho a 42ºC, onde permaneceu por 15 minutos, caracterizando-se o choque térmico. Em
seguida, os tubos foram centrifugados a 7000g por 30 segundos à temperatura ambiente. O
sobrenadante foi cuidadosamente removido e o precipitado de células ressuspendido em 200 µl
de água destilada autoclavada. Cada suspensão de células foi totalmente espalhada com o
auxílio de uma alça de Drigalski em placas contendo meio SC (Synthetic Complete Medium)
sólido e previamente identificadas. O meio SC apresenta como característica a ausência de todos
os aminoácidos. Estes podem ser complementados de acordo com a seleção desejada. Neste
caso, o meio foi suplementado com todos os aminoácidos, exceto leucina, triptofano e histidina,
além de uracila. Para a seleção dos transformantes da co-transformação, o meio foi
suplementado com uracila (160µM) e histidina (800µM), de tal forma que permaneceu –Leu –
Trp. Assim, espera-se que apenas as células que receberam as duas construções desejadas sejam
capazes de produzir tais aminoácidos e desenvolver colônias na placa.
3.16.2.3 Transformação de células de S. cerevisiae por acasalamento
Para transformação de leveduras pelo método de acasalamento, foram utilizadas
leveduras haplóides tipo A e α. Alíquotas de células competentes destas duas variedades foram
preparadas de acordo com o procedimento descrito no item 3.16.2.1. Em seguida, células
competentes tipo A foram transformadas de acordo com o item 3.16.2.2, utilizando-se a
construção pDEST32-SCI1 e o vetor pDBLeu. Já as construções pDEST22-CYCA1;1,
pDEST22-CYCA2;2, pDEST22-CYCA2;2DDB e o vetor pEXPAD-502 foram transformadas
nas células competentes tipo α. Após a obtenção de colônias de células transformantes, uma
colônia portadora de cada construção foi inoculada em frasco Erlenmeyer contendo 50 ml de
Material e Métodos 47
meio SC estéril. Para as colônias portadoras da construção pDEST32-SCI1 e do vetor pDBLeu,
o meio permaneceu –Leu. As colônias portadoras das construções realizadas no vetor pDEST22
e o vetor pEXPAD-502 foram inoculadas em meio SC –Trp. Os inóculos permaneceram em
incubação (Tecnal TE-422) sob agitação de 250 rpm a 30ºC durante 24 horas. Após este período,
cada cultura de células foi utilizada para o acasalamento que ocorreu em meio YPAD. Para o
acasalamento, foram utilizados:
- 20 µl cultura levedura A contendo isca (pDEST32-isca)
- 20 µl cultura levedura α contendo presa (pDEST22-presa)
- 125 µl meio YPAD
As combinações isca-presa utilizadas estão descritas na tabela 02. Após os inóculos das
duas culturas em tubos previamente identificados, estes foram mantidos em agitação de 200 rpm,
a 30ºC por 24 horas. Após este período, as culturas em acasalamento foram centrifugadas a
3000 rpm por 1 minuto e o sobrenadante descartado. As células foram ressuspendidas em meio
SC –Leu -Trp para lavagem do restante de meio YPAD. Este procedimento foi repetido
novamente e as células ressuspendidas em 100 µl de meio SC –Leu –Trp. Cada tubo foi
complementado com 1,4 ml de meio SC -Leu -Trp e mantido sob agitação de 200 rpm a 30ºC
por 48 horas.
Após os 2 dias de crescimento, a OD
600
correspondente de cada cultura foi mensurada
através do aparelho Ultrospec 2100 Pro (Amersham Biosciences). Utilizando-se três placas de
96 poços (Costar-Corning), uma para cada teste de interação, as culturas foram diluídas para
OD
600
~0,2 (volume de 250 µl) na primeira linha, a fim de uniformizar o número de células. Para
a diluição foi utilizado meio SC –Leu –Trp -His. Na vertical, foram realizadas novas diluições
da cultura: 1/5, 1/25, 1/125 e 1/625 (Figura 17). Utilizando-se um replicador para placas de 96
poços (Boekel), o conteúdo de cada placa foi aplicado em placa de Petri contendo meio SC não
suprido com os aminoácidos de seleção dos genes repórteres HIS3, de acordo com a
metodologia presente no item 3.16.2.4.
Material e Métodos 48
Tabela 02: Relação de todas as combinações isca-presa (construções) transformadas em S. cerevisiae pelo método de
acasalamento. Para cada combinação, a tabela apresenta o objetivo de sua realização. BD: Binding Domain;
AD:Activation Domain.
Construção BD
(ISCA)
Levedura A
Construção AD
(PRESA)
Levedura α
Objetivo
pDEST32-SCI1 pDEST22-CYCA1;1 Interação BD-SCI e AD-CYCA1;1
pDEST32-SCI1 pDEST22-CYCA2;2 Interação BD-SCI e AD-CYCA2;2
pDEST32-SCI1 pDEST22-CYCA2;2DDB Interação BD-SCI e AD-CYCA2;2DDB
pDBLeu pDEST22-CYCA1;1 Interação BD e AD-CYCA1;1 (controle)
pDBLeu pDEST22-CYCA2;2 Interação BD e AD-CYCA2;2 (controle)
pDBLeu pDEST22-CYCA2;2DDB Interação BD e AD-CYCA2;2DDB (controle)
pDEST32-SCI1 pEXPAD-502 Interação BD-SCI e AD (controle)
pDBLeu pEXPAD-502
Interação BD e AD
(controle negativo de interação)
- - Controle negativo da transformação
3.16.2.4 Análise do fenótipo dos transformantes para o gene repórter
HIS3
Uma colônia de cada co-transformação presente na tabela 01 e 02 foi inoculada em 5 ml
de meio SC –Leu-Trp e mantida sob agitação de 200 rpm durante 48 horas a 30ºC. Após os 2
dias de crescimento, a OD
600
correspondente de cada cultura foi mensurada através do aparelho
Ultrospec 2100 Pro (Amersham Biosciences). Utilizando-se placas de 96 poços (Costar-
Corning), uma para cada teste de interação, as culturas foram diluídas para OD
600
~0,2 (volume
de 250 µl) com meio SC –Leu-Trp-His-Ura, a fim de uniformizar o número de células. As
culturas foram dispostas na horizontal (primeira linha), onde foram agrupados controle de
interação, controles do teste e testes de interação, de acordo com a Figura 17. Na vertical, foram
realizadas novas diluições das culturas: 1/5, 1/25, 1/125 e 1/625. Utilizando-se um replicador
para placas de 96 poços (Boekel), o conteúdo de cada placa foi aplicado em placas de Petri
contendo meio SC –Leu –Trp contendo as seguintes molaridades de 3AT: 0mM, 10mM, 25mM,
50mM, 75mM e 100mM.
Material e Métodos 49
Figura 17: Esquema ilustrando o mapeamento das culturas em placa de 96 poços para realização dos testes dos genes
repórteres HIS3 e lacZ.
O uso do composto 3AT se baseia no fato de que a cepa de S. cerevisiae Mav203 pode
apresentar um nível basal de expressão do gene repórter HIS3. Além disso, segundo o fabricante
do Kit, algumas proteínas quando fusionadas ao domínio BD podem auto-ativar o sistema
resultando em falsos positivos. A expressão do gene repórter HIS3 leva a produção da enzima
imidazol glicerol fosfato dehidratase, envolvida na biossíntese de histidina. Esta enzima pode
ser inibida de maneira dose-dependente pelo composto 3AT. Dessa forma, testes de titulação de
3AT para avaliar a concentração ideal deste composto capaz de mascarar o nível basal de
expressão da cepa ou de auto-ativação do sistema são necessários. Estes testes são realizados
através da comparação do crescimento das células em meio SC –Leu – Trp – His suplementado
com várias concentrações de 3AT.
Resultados positivos de interação são determinados pelo crescimento das colônias de
interação em meio seletivo para histidina e com molaridade de 3AT suficiente para inibir o
crescimento dos controles de interação.
3.16.2.5 Análise do fenótipo dos transformantes para o gene repórter
lacZ
O procedimento para análise do fenótipo dos transformantes para o gene reporte lacZ é
bastante semelhante ao descrito no item 3.16.2.4. A diferença ocorre no momento da aplicação
Material e Métodos 50
das culturas em meio específico, utilizando replicador. Neste caso, o replicador é levemente
apoiado sobre uma membrana Hybond-N
+
(Amersham Biosciences) disposta sobre placas
contendo meio YPAD. As placas foram mantidas em estufa a 30ºC por 48 horas. Após este
período, cada membrana foi delicadamente retirada da placa com auxílio de uma pinça e imersa
em nitrogênio líquido durante 30 segundos para rompimento das células.
Cada membrana foi posicionada sobre duas folhas de papel filtro (125-mm Whatman
541) presentes dentro de uma placa de 15 cm, e saturadas em uma solução obtida a partir da
mistura de 100 µL de X-gal em DMF, 60 µL de 2-mercaptoethanol e 10 ml de Buffer Z (item
3.18). Bolhas de ar devem ser cuidadosamente removidas e as placas incubadas a 37ºC, em
ângulo inclinado. O acompanhamento do processo de coloração azul deve ocorrer no período de
24 horas. A coloração se deve ao fato da ativação do gene repórter lacZ conduzir a expressão da
enzima β-galactosidase, capaz de converter X-gal em galactose e 5-bromo-4-chloro-3-
hydroxyindole 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo, sendo este último de coloração azul. Dessa
forma, colônias que apresentarem coloração azul após este teste são indicativas de ativação do
gene repórter lacZ.
3.17 Estudo de possíveis parceiros de SCI1 através de ensaios de Pull-down
3.17.1 Expressão da proteína heteróloga SCI1
Após a inserção da sequência codificadora (cDNA) de SCI1 no vetor de expressão em E.
coli pDEST17 (Invitrogen, Gateway Technology), conforme descrito no item 3.14.4, foram
utilizadas 20ηg da construção para transformar bactérias E. coli BL-21 (DE) Rosetta
eletrocompetentes. O produto da transformação foi plaqueado em meio LB contendo 34mg/ml de
cloramfenicol e 100mg/ml de ampicilina. Da placa contendo células de E. coli transformadas
com a construção pDEST17-SCI1, uma colônia isolada foi recuperada e inoculada em 5 ml de
meio LB suplementado com os antibióticos adequados, na concentração citada anteriormente.
Após crescimento “overnight” (16-20 horas), a 37ºC, sob agitação (200 rpm), foi realizada a
diluição na proporção de 1:100, adicionando-se 250µl do pré-inóculo em Erlenmeyer de 1L
contendo 250ml de meio LB, suplementado com os antibióticos apropriados. A seguir, essa nova
cultura foi incubada a 37ºC, sob agitação (200 rpm) por 2 horas, ou até atingir a DO
600
~ 0,4 –
0,6. Ao se atingir tal densidade, foi retirada uma alíquota de 2ml, que foi utilizada como tempo
zero (pré-indução) e adicionou-se IPTG 0,1mM, para início de indução da expressão. As culturas
foram mantidas sob as condições especificadas anteriormente durante o período de 3 horas. Ao
término da indução, as culturas foram centrifugadas a 4ºC, por 10 minutos, a 5.000 rpm, para a
Material e Métodos 51
obtenção dos precipitados celulares. A fração sobrenadante foi descartada, e o precipitado
bacteriano foi ressuspenso em 10ml de tampão de lise [Tampão L - (Tris-HCl 50mM pH 7,4,
NaCl 150 mM)], acrescido do inibidor de proteases [Protease Inhibitor Cocktail for General Use
- 1mM (Sigma)], e lisozima (10mg/ml). Após a suspensão ser incubada em gelo por 30 minutos,
deu-se início ao processo de sonicação, para a lise celular. A amostra foi sonicada, empregando-
se 6 a 8 pulsos de 1 minuto cada, a 60W de potência, com intervalos de 60 segundos, em um
aparelho Vibracell
TM
(Sonic & Materials Inc, Dunbury, CT, USA). Ao final, a suspensão celular
resultante foi centrifugada por 30 minutos, a 10.000 rpm, a 4ºC, em centrífuga Eppendorf
(modelo 5810R). A fração sobrenadante foi transferida para um novo tubo, e o precipitado foi,
então, ressuspenso em 10ml do mesmo tampão de lise. Após o preparo, os extratos protéicos
foram quantificados de acordo com o método de Bradford (1976).
3.17.2 Extração de proteínas de estigma e estilete de plantas RNAi-SCI1
Estigmas e estiletes de plantas transgênicas com SCI1 silenciado (RNAi) foram
coletados e imediatamente transferidos para nitrogênio líquido. O armazenamento foi feito a -
70ºC. Foram utilizados 2,5 g de material coletado de flores nos estágios 1 a 6 (Koltunow et al.,
1990) e 2,5g dos demais estágios (exceto 12). O material foi macerado em graal, na presença de
nitrogênio líquido, até apresentar-se como um pó fino. Imediatamente, o material macerado foi
transferido para um tubo Falcon contendo 10ml de tampão de extração (50mM NaH
2
PO
4
pH8.0,
0.3M NaCl, 10mM imidazol e 0,1% Triton-100) e homogenizado em vortex durante 10 minutos
com intervalos de 30 segundos no gelo. Em seguida, o material foi sonicado, aplicando 6 pulsos
de 30 segundos cada, a 60W de potência, com intervalos de 30 segundos, em um aparelho
Vibracell
TM
(Sonic & Materials Inc, Dunbury, CT, USA).
A amostra foi então foi centrifugada por 30 minutos, a 10.000 rpm, a 4ºC, em centrífuga
Eppendorf (modelo 5810R). A fração sobrenadante foi filtrada em papel filtro e transferida para
um novo tubo.
3.17.3 Ensaio de Pull-down
Antes da ligação da proteína recombinante à resina, o etanol presente na resina foi
totalmente lavado aplicando-se 15 ml de tampão de lavagem/equilíbrio, pH7.2 (50mM NaH
2
PO
4
pH8.0, 300mM NaCl, 10mM imidazol). Em seguida, a fração sobrenadante do lisado celular de
E. coli contendo a proteína SCI com His-tag fusionada em sua porção C-terminal foi aplicada na
coluna, com fluxo de 200µl/min, coletando-se o material após a passagem pela coluna (flow-
Material e Métodos 52
through1). Em seguida, a resina foi novamente lavada com 20 ml de tampão de
lavagem/equilíbrio (lavagem 1) e o extrato protéico de E/E, contendo os possíveis parceiros de
interação com SCI1 foi aplicado na coluna, com fluxo de 200µl/min, coletando-se o material
após a passagem pela coluna (flow-through2). Novamente a coluna foi lavada com 20 ml de
tampão de lavagem/equilíbrio (lavagem 2).
Após a lavagem, aplicou-se 10 ml de tampão de eluição (50mM NaH
2
PO
4
pH8.0,
300mM NaCl, 125mM imidazol) e o material eluido foi coletado em 20 tubos eppendorf 1,5 ml
numerados, com 500µl cada. Para encontrar a alíquota onde o material foi eluído, as amostras
foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE) e o gel corado
com Comassie-BrilliantBlue.
3.17.4 Identificação por Espectrometria de Massa das proteínas obtidas no
ensaio de Pull-down
O material resultante do ensaio de pull-down descrito anteriormente foi submetido à
eletroforese em gel de poliacrilamida tipo gradiente 4-12% Bis-Tris (Nu PAGE-Invitrogen), a
fim de obter uma melhor separação das bandas, facilitando a identificação das mesmas e
evitando contaminação com queratina durante o preparo e manipulação do material, visto que
este tipo de contaminação constitui o principal problema em amostras analisadas por
espectrometria de massa.
A fim de obter quantidade suficiente de proteína para análise, as amostras foram
aplicadas no gel em triplicatas, com 45µl de amostra sendo aplicada em cada poço. A amostra
foi preparada misturando-se 33,75µl do material eluído e 11,25µl de tampão de amostra 4x
fornecido no Kit. O gel foi completamente imerso em tampão 1X SDS Running Buffere e, após a
aplicação das amostras e do marcador de peso molecular Prestained SDS-PAGE Standards
(Bio-Rad), o conjunto foi submetido a uma tensão elétrica de 200 Volts. Após a corrida, o gel
foi cuidadosamente retirado do invólucro e corado com Comassie-BrilhantBlue-G (0,2%
Comassie diluído em solução 50%metanol) durante 1 hora. Em seguida, o gel foi descorado por
3 horas em solução descorante (50% metanol, 10% ácido acético e 40% água destilada
autoclavada).
Todo cuidado foi tomado para evitar a contaminação do material com queratina. As
bandas existentes no gel foram cuidadosamente excisadas com auxílio de um bisturi e colocadas
em tubos eppendorf autoclavados e previamente identificados. Após a coleta, o material foi
encaminhado para análise por Espectrometria de Massa para o Instituto Pasteur de Montevideo
(Unidade Pasteur de Analises Proteomica - Uruguai).
Material e Métodos 53
O Espectro de Massa das amostras enviadas foi gerado através da digestão in situ das
proteínas com tripsina e posterior aplicação em um analisador 4800 MALDI Tof/Tof, modo
refletor positivo e usando matriz CHCA. Como resultado, para cada amostra é gerado um
espectro de massa de um ou mais peptídeos ionizados, os quais são convertidos em sequências
de aminoácidos para a realização de buscas em bancos de dados a procura de proteínas que
possuam tais peptídeos em suas sequências. Para isso, foi utilizado o programa Mascot
(http://www.matrixscience.com/) e os bancos de dados EST-viridiplantae e DFCI Tobacco, do
Gene Index Project (Harvard School of Public Health), adotando um pvalue < 0,05.
3.18 Tampões e Soluções
Meio de Cultura para Leveduras – YPAD - 1L
10g extrato de levedura (Bacto- DIFCO)
20g peptona (Bacto-DIFCO)
100mg sulfato de adenina (Amresco)
20g dextrose (Malllinckrodt)
1L água destilada
Ajustar pH 6,0 com HCl.
Autoclavar
Meio de Cultura de bactérias – Luria Bertani - 1L
10g triptona (Acumedia)
5g extrato de levedura (BBL)
10g NaCl (JTBaker)
1L água destilada
Autoclavar
Meio sintético para cultura de leveduras (Synthetic Complete Medium
)
– SC – 0,5L
3,35g Yeast Nitrogen Base without amimoacids (YNB) (SIGMA)
0,675g de mistura de aminoácidos*
0,5L de água destilada
Acertar pH 5,9 com NaOH.
Autoclavar e adicionar 25ml de glicose 40%.
Material e Métodos 54
Para meio sólido, adicionar 10g de ágar (Bacto Agar - DIFCO).
Autoclavar e adicionar 25ml de glicose 40%.
* Mistura de Aminoácidos (9g): 500mg de cada aminoácido: adenina, alanina, arginina, ácido
aspártico, asparagina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, isoleucina, glicina, valina, tirosina,
treonina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina.
Solução Uracila 20mM – 100ml
0,224g uracila (SIGMA)
100ml água destilada
Esterilizar por filtragem. Manter em tubo Falcon protegido por papel alumínio.
Solução Histidina 100mM – 100ml
1,55g histidina (SIGMA)
100ml água destilada
Esterilizar por filtragem. Manter em tubo Falcon protegido por papel alumínio.
Solução Leucina 100mM – 100ml
1,31g leucina (SIGMA)
100ml água destilada
Esterilizar por filtragem. Manter em tubo Falcon protegido por papel alumínio.
Solução Triptofano 40mM – 100ml
0,817g triptofano (SIGMA)
100ml água destilada
Esterilizar por filtragem. Manter em tubo Falcon protegido por papel alumínio.
Glicose 40% - 200ml
80g de dextrose (Mallinckrodt)
200ml água destilada
Autoclavar
Glicerol 50% - 50ml
50ml glicerol 100% (JTBaker)
50ml água destilada
Material e Métodos 55
Solução de Gentamicina 5mg/ml – 1ml
5mg sulfato de gentamicina (SIGMA)
1ml água milliQ autoclavada
Esterelizar por filtragem.
Água DEPC 0,1% - 800ml
800ml água destilada
800µl DEPC
Adicionar o DEPC à água e chacoalhar bem. Deixar overnight e autoclavar. Agitar bem para
retirar o excesso de DEPC. Deixar a tampa semi-aberta.
Solução X-gal em DMF
- 10 mg X-gal (5-bromo-5-chloro-3-indolyl-β-Dgalactoside)
- 100 µl N,N-dimethyl formamide (DMF)
Buffer Z (1L)
- 16.1 g Na2HPO4•7H2O
- 5.5 g NaH2PO4•H2O
- 0.75 g KCl
- 0.246 g MgSO4•7H2O
Completar volume para 1L com água destilada. Ajustar pH=7,0 e esterilizar filtrando.
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão 57
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análise da sequência genômica de SCI1 de Nicotiana tabacum
A sequência de nucleotídeos codificante de SCI1 foi obtida por De Paoli et al.
(submetido), a partir da montagem das sequências de dois clones de cDNA: HS1-002E06 e
TOB068F10, que continham partes diferentes, porém complementares de SCI1. Com a
utilização de primers específicos, baseados nas sequências destes clones, a sequência
codificante completa de SCI1 foi amplificada por RT-PCR, seqüenciada e nomeada ORF-SCI1.
Utilizando como molde a sequência ORF-SCI1, a busca pela sequência genômica
correspondente foi feita no banco de dados do SOL (International Solanaceae Genomics
Project - Sol Genomic Networks - http://solgenomics.net). Dentre as sequências que mostraram
maior similaridade, o contig processed_tobacco_genome_sequences_c32287 revelou cobrir
grande parte da sequência genômica de SCI1, com exceção de parte das regiões 5´UTR e
promotora do gene. Visando totalizar a sequência, uma nova busca foi realizada no banco de
dados do SOL, utilizando parte da região 5´ do contig
processed_tobacco_genome_sequences_c32287 como “query”. Além de mostrar uma
sobreposição satisfatória com a sequência molde, o clone AGN_OF3786xo09f1.ab1 continha
uma sequência adicional, com o restante da sequência do 5´UTR e, possivelmente, parte da
região promotora do gene (anexo – Figura 01). Dessa forma, foi possível a montagem da
sequência genômica putativa de SCI1, composta por 4204 pares de bases (Figura 18).
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Resultados e Discussão 58
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Figura 18: Esquema ilustrativo da sequência genômica putativa de SCI1, obtida na base de dados do SOL. Em realce
amarelo encontra-se a sequência de aminoácidos codificada pelo éxon1, em azul, do éxon 2, em rosa, do éxon 3 e em
verde, do éxon 4. Trechos com realce em cinza indicam diferenças entre as sequências genômica e de cDNA. A
sequência de 16 nucleotídeos da região 5´UTR, que encontra-se presente no clone HSI-002E06, aparece destacada em
negrito e itálico. Acima deste trecho, outros 149 nucleotídeos foram encontrados na sequência genômica disponível,
correspondentes, provavelmente, ao restante da região 5´UTR e uma pequena parte da região promotora do gene.
Sequências destacadas em negrito e sublinhadas correspondem a região 3`UTR do gene, sendo comum entre a
sequência genômica e os cDNAs. O símbolo barra (/) representa nucleotídeos inseridos ou deletados (indel).
Nucleotídeos destacados em marrom representam bases ainda não confirmadas no sequenciamento. O trecho
tracejado, no final da sequência, corresponde a possível região promotora do gene vizinho de SCI1 no genoma,
encontrada através de análise computacional utilizando o programa PromoterScan. Sequências em negrito,
sublinhadas e coloridas representam elementos cis regulatórios (ver Tabela 03).
Através da comparação da sequência genômica de SCI1, com a sequência do cDNA
correspondente, ambas traduzidas com o auxílio da ferramenta translate do ExPASy Proteomic
Server (http://www.expasy.ch/tools/dna.html), foi possível constatar que a sequência genômica
de SCI1 é composta de 4 éxons e 3 íntrons (Figuras 19 e 20). O éxon 4 mostrou ser o maior,
codificando 48,7% da proteína (77 aminoácidos + códon de terminação), seguido pelo éxon 2
Resultados e Discussão 59
codificando 24,7% da proteína (39/35 aminoácidos), éxon 1 codificando 14,6% da proteína (23
aminoácidos) e o éxon 3 codificando 12% da proteína (19 aminoácidos), totalizando uma
proteína de 158/154 aminoácidos.
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Figura 19: Sequência de nucleotídeos do cDNA codificante de SCI1 de N. tabacum, correspondente a montagem das
sequências dos clones ORF-SCI1 e TOB68F10 (De Paoli et al, submetido). As sequências de aminoácidos
codificadas por cada éxon aparecem realçadas com diferentes cores. Em azul e negrito aparecem destacados dois
trechos da região 3´UTR que são encontrados na sequência genômica atualmente disponível e, em realce cinza, um
trecho inexistente na mesma, sugerindo a existência de duas sequências genômicas para SCI1 em N. tabacum.
A análise conjunta de todas as sequências genômicas e de cDNAs (anexo- Figura 02),
disponíveis para SCI1, demonstram a existência de dois grupos de sequências, muito
semelhantes entre si, mas não idênticas, no genoma de N. tabacum. O primeiro grupo de
sequências é composto pelos clones HS1-002E06, HS1-003D09 e HS1-004F03, todos da
biblioteca de SSH (DePaoli et al., em preparação), e pelas sequências genômicas
OF3786xo09f1, OF435xh24f1 e c32287, todas obtidas no site do SOL. O segundo grupo de
sequências é representado pelos clones SCI1-ORF, TOB068F10 e TOB048C05, os dois últimos
oriundos da biblioteca do TOBEST. Como as sequências dos clones genômicos não está
finalizada, ainda apresentando erros, diferenças pontuais de nucleotídeos não foram
consideradas nesta análise global. Entretanto, é possível afirmar a existência dos dois grupos de
sequências distintas. O primeiro grupo difere do segundo na ausência de um códon (AAG), para
um aminoácido lisina (Lis), e a presença de 5 códons adicionais, para o pentapeptídeo Lis-Ser-
Resultados e Discussão 60
Lis-Cis-Hi (sequência com realce cinza, Figura 18), ambas as diferenças localizadas no éxon 2.
Portanto, o éxon 2 codifica um total de 39 aminoácidos no primeiro grupo e 35 aminoácidos no
segundo grupo de sequências. Adicionalmente, o segundo grupo de sequências possui uma
sequência de 187 nucleotídeos a mais (inserida) no 3’UTR, que não está presente no primeiro
grupo de sequências (sequência com realce cinza, Figura 19). Considerando o fato de que a
cultivar Petit Havana SR1 de N. tabacum, usada neste trabalho, é mantida a muitas gerações por
autofecundação, praticamente eliminando as diferenças alélicas, e o fato da espécie N. tabacum
ser considerada alotetraplóide, originada da hibridação interespecífica das espécies diplóides, N.
sylvestris e N. tomentosiformis, é possível propor que os dois grupos de sequências de SCI1
representam genes homeólogos, ou seja, correspondem aos genes das espécies ancestrais.
Com relação à região 5´UTR, apenas um pequeno segmento de 16 pares de bases era
conhecido, referente ao clone HS1-002E06, o qual também está presente na sequência genômica.
Outros 149 nucleotídeos foram encontrados na sequência genômica, possivelmente
complementando a região 5´UTR do gene e parte da região promotora.
4.1.1 Busca in silico por elementos cis regulatórios
Para uma melhor análise da sequência genômica de SCI1, foi realizada uma busca por
elementos cis regulatórios idênticos ou similares aos domínios registrados em dois bancos de
dados de elementos regulatórios da expressão em plantas PLACE e PLANTCARE. Vários
elementos em cis foram encontrados. A Tabela 03 corresponde a uma lista de alguns destes
elementos, mostrando a relação dos mesmos com vários processos regulatórios de resposta a
hormônios vegetais, controle do ritmo circadiano, enhancers de transcrição, sítios para proteína
AGL15, uma sequência alvo de WUSCHEL, um sítio de ativação de genes fase-dependente do
ciclo celular, além de elementos CATBOX e TATABOX, tipicamente encontradas em regiões
promotoras e sinais de poliadenilação, que sinalizam o término da transcrição. Na Figura 20 é
possível observar a localização de cada elemento na sequência genômica.
Resultados e Discussão 61
Tabela 03: Principais elementos cis regulatórios encontrados na sequência genômica putativa de SCI1, de acordo
com as análises feitas nas bases de dados PLACE (P) e PLANTCARE (PC). Para cada elemento, encontra-se
disponível sua sequência (em cores diferentes para melhor visualização na Figura 18), o número de cópias, sua
função esperada e o código da sequência no banco de dados onde está presente.* Elementos encontrados na cadeia
complementar (-).
Elemento em cis Sequência
Número de
cópias
Função esperada
Banco de
Dados
P: PLACE;
PC: PlantCare
10PEHVPSBD
TATTCT
3
Ritmo circadiano P (S000392)
CIRCADIANLELHC
CAANNNNATC
1
Ritmo circadiano P (S000252)
CARGCW8GAT
CWWWWWWWWG
3
Sítio para proteína AGL15 P (S000431)
WUSATAg
TTAATGG
1
Sequência alvo de WUS no
íntron do AGAMOUS
P (S000433)
CATATGGMSAUR
CATATG
1
Resposta à auxina P (S000370)
NTBBF1ARROLB
ACTTTA
3
Expressão tecido-específica e
indução por auxina
P(S000273)
MYCATRD22
CACATG *
1
Resposta a ABA P (S000174)
ABRE
GACACGTGGC
1
Resposta ao Ácido Abcísico PC
GARE-Motif
AAACAGA *
1
Resposta à giberelina PC
GARE1OSREP1
TAACAGA *
2
Resposta à giberelina P (S000419)
P-BOX
CCTTTTG
1
Resposta à giberelina PC
MYBCOREATCYCB1
AACGG
1
Ativação de genes fase-
dependente do ciclo celular
P (S000502)
5UTR Py-rich stretch
TTTCTTCTCT
1
Altos níveis de transcrição PC
MBSI
TTTTTACGGTTA *
1
Sítio de ligação MYB PC
TA-rich region
TATATATATATATATATATATA
1
Enhancer PC
TATA-BOX
TTTTAT
1
Elemento promotor PC
CAATBOX1
CAAT
1
Elemento promotor P (S000028)
POLASIG1
AATAAA
6
Sinal de poliadenilação P (S000080)
POLASIG3
AATAAT
5
Sinal de poliadenilação P (S000088)
Logo no início da sequência 5´ regulatória de SCI1 aparece um domínio TATA-BOX,
precedido por um domínio do tipo CAATBOX, reforçando a hipótese de ser esta a região
promotora do gene. O sítio TATA-BOX está distante 129 nucleotídeos do ATG inicial, e sua
distância ao local do início da transcrição não pode ser avaliada, por não terem sido realizados
experimentos para determinar a extremidade 5’do mRNA.
Programas computacionais treinados para realizar a busca por elementos regulatórios
comuns em regiões promotoras, como o PROMOTER SCAN (http://www-
bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan) (Prestridge, 1995) não foram capazes de encontrar uma
região promotora na sequência genômica de SCI1. Isto provavelmente ocorreu devido ao trecho
pequeno de sequência conhecido nesta região. Entretanto, o programa obteve êxito em delimitar
uma possível região promotora (3925-4175) no final da sequência (Figura 18). O programa foi
desenvolvido para encontrar sítios putativos para a RNA polII de eucariotos, em sequências
genômicas. O score encontrado foi de 57,45, que comparado com o score limite (53,0)
fornecido pelo programa, indica que a chance do programa ter encontrado uma região incorreta
é de 1 em 14000 bases (Prestridge, 1995). A presença de três sinais de poliadenilação antes da
região promotora encontrada e de um domínio TATA-BOX presente na posição 4160, distante
exatamente 30 nucleotídeos da região de início de transcrição (4190), aumentam as chances de
Resultados e Discussão 62
se tratar realmente de uma região de término da sequência de SCI1 e início da sequência do
gene vizinho.
Figura 20: Desenho esquemático ilustrando a constituição da sequência genômica de SCI1 de N. tabacum e a
localização de alguns elementos cis regulatórios encontrados na sequência, durante análise in silico. A região 5´
regulatória compreende a região 5´UTR e parte da região promotora.
Resultados do trabalho de DePaoli et al. (submetido) mostram uma grande semelhança
nas alterações do desenvolvimento do pistilo de plantas transgênicas com o gene SCI1
silenciado (RNAi) em N. tabacum com o desenvolvimento do gineceu em mutantes
ARF3/ETTIN (Auxin Response Factor) em A. thaliana (Sessions et al., 1997) e plantas tratadas
com NPA (N-1-naphthylphthalamic acid), um inibidor do transporte polar de auxina
(Nemhauser et al., 2000). Neste último trabalho, os autores propõem um modelo de gradiente
apical-basal de auxina durante o desenvolvimento do gineceu, responsável por regular a
Resultados e Discussão 63
transcrição de ETTIN, estabelecendo o padrão de desenvolvimento do gineceu. Na sequência
genômica de SCI1 foram encontrados quatro sítios putativos de resposta à auxina: um sítio
CATATGGMSAUR (CATATG) localizado na região do terceiro íntron e três sítios
NTBBF1ARROLB (ACTTTA), um deles localizado possivelmente na região promotora do
gene, outro localizado na região 3´UTR e o terceiro, no final da sequência, 89 nucleotídeos
antes de três sítios de poliadenilação POLSIG1 (AATAAA). A presença de elementos de
resposta à auxina na sequência genômica de SCI1 reforça a idéia de que este gene seja regulado
por auxina e, possivelmente, também esteja envolvido em uma via de sinalização mediada por
auxina, importante para o desenvolvimento do gineceu.
Localizado 105 nucleotídeos antes do ATG inicial da sequência codificadora de SC1,
foi encontrado um sítio de elemento cis regulatório, denominado MYBCOREATCYCB1
(AACGG). Segundo Planchais et al. (2002), trata-se de um elemento regulatório descrito
originalmente na região promotora do gene da ciclina B1;1 de A. thaliana, e faz parte de uma
sequência específica de 18 pares de bases da região promotora, localizada 120 bases upstream
do ATG inicial, necessária para a regulação da expressão deste gene. Complexos protéicos,
incluindo o fator de transcrição MYB, e HYP (proteína hipotética) foram identificados ligados à
sequência de 18 pares de bases e a presença do domínio AACGG mostrou-se essencial para que
isso ocorra. A proximidade entre os domínios de resposta à auxina (ACTTTA) e da proteína
MYB (AACGG), encontrados na sequência genômica de SCI1, é indicativa de que fatores de
transcrição MYB e fatores de resposta à auxina atuem juntos no controle da transcrição de SCI1,
possivelmente formando complexos protéicos. Dessa forma, a expressão deste gene estaria
sendo regulada não somente pela sinalização por auxina, mas também por eventos relacionados
ao controle do ciclo celular. Estas hipóteses são coerentes com a função proposta para SCI1, de
um inibidor de ciclo celular específico do estigma/estilete de N. tabacum (DePaoli et al.,
submetido).
Outro elemento cis regulatório, denominado 10PEHVPSBD (banco de dados
PLACE), aparece na sequência genômica de SCI1 em três regiões distintas: duas cópias no
íntron número 2 e uma cópia no éxon 4. A presença deste domínio aponta para uma possível
participação deste gene no controle do ritmo circadiano. Sistemas circadianos são redes de
sinalização complexas, as quais permitem aos organismos ajustar as atividades fisiológicas e
celulares, em antecipação às mudanças periódicas no ambiente (Johnson, 2001). Ao nível
molecular, os ritmos biológicos são comandados por oscilações circadianas endógenas da
expressão de diversos genes, como o CCR2 (Cold, Circadian Rhythm and RNA-binding 2) que
codifica uma pequena proteína de ligação ao RNA, rica em glicina. Segundo Streitner et al.
(2008), além de outras funções, esta proteína pode estar envolvida na transição da fase
vegetativa para a reprodutiva (floração) em A. thaliana.
Resultados e Discussão 64
Quando o processo de transição do desenvolvimento vegetativo para o reprodutivo é
iniciado nas plantas, múltiplos sinais ambientais e endógenos convergem para a ativação de
genes chaves da identidade floral que orquestram a formação de 4 verticilos, onde segundo o
modelo ABC, ocorrerá a diferenciação dos órgãos florais. Neste caso, o gene AGAMOUS, além
de atuar como um repressor do gene WUSCHEL (que mantém o meristema indiferenciado),
comanda a diferenciação do verticilo central em carpelo (Yanofsky, 1990; Bowman et al. 1991;
Coen & Meyerowitz, 1991). A presença dos domínios, WUSATAg e CARGCW8GAT na
sequência genômica de SCI1 reforça a hipótese de o gene SCI1 ser alvo destes fatores de
transcrição, e pertencer a complexa rede de genes a serem expressos para o desenvolvimento
adequado do órgão floral feminino. O domínio WUSATAg (TTAATGG) foi descrito por
Lohmann et al. (2001) como um sítio de ligação da proteína WUSCHEL, localizado no segundo
íntron da sequência genômica de AGAMOUS. Sabe-se que a expressão do gene AGAMOUS é
ativada pelo gene WUSCHEL, assim, o fato deste domínio também ser encontrado em uma
região intrônica de SCI1 (íntron 3), sugere que SCI1 também possa ser regulado por
WUSCHEL. O domínio CARGCW8GAT consiste em um sítio de ligação da proteína AGL15
(AGAMOUS like protein 15), único membro da família de proteínas de domínio MADS de
ligação ao DNA, cujo acúmulo ocorre durante o desenvolvimento do embrião de plantas (Tang
& Perry, 2003).
Ainda considerando a participação de SCI1 na diferenciação do gineceu, há uma
significativa aceleração do desenvolvimento do pistilo de plantas com SCI1 silenciado. Além
disso, há também o início precoce das divisões celulares na região de fusão dos carpelos, que
resultam na formação do estigma (DePaoli et al., submetido). Este evento marca o término do
meristema floral, o que é iniciado pelo gene AGAMOUS e reprimido por WUSCHEL.
Em suma, os resultados citados acima sugerem que a expressão do gene SCI1 é
regulada pelas vias de controle do ciclo celular, resposta à auxina e desenvolvimento de órgãos
florais, particularmente do órgão sexual feminino. A confirmação da existência e papel destes
elementos cis regulatórios precisará ser realizada experimentalmente no futuro.
4.1.2 Comparação das sequências genômicas de SCI1 de Nicotiana tabacum
e Arabidopsis thaliana
A sequência genômica de SCI1 de A. thaliana foi obtida no banco de dados TAIR (The
Arabidopsis Information Resource), correspondente ao locus At1g79200, gene 2207334,
cromossomo 1.
Resultados e Discussão 65
aagctagtaaaaagggattataattgtattggggtaaataaaaacattgggggcgagatg
caaaatataaaagagtaaggggtttaagtgtaatttcgacatcgagacccgacccgaccc
gggattatgaatcctgatcgccgcggggtccaaataaatatatgtcagctcctccgttct
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M V S E R S S K E K K R
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S R A R S E D S S S S D
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tttcgattagattttgtagttggcgttgagagtgtgacttattgttgtgaatgacataat
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K E G I P E L S M E D Y F S K
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N N E F A T W L K E E K R T Y F N D L T
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agaactatctgatgaatccttatgtaacattgagaatttgatatccggttaagggagaaa
tagaccgttttgattgaaagttggtcttgtacagtatgtaa
Figura 21: Sequência genômica de SCI1 de A. thaliana com anotações de exons, introns, regiões 5´e 3´UTRs e
elementos cis regulatórios
.
Sequências com realce colorido correspondem à sequência de aminoácidos codificada
pelos exons (destacados em itálico) e a região sublinhada corresponde ao 5´UTR. Elementos cis regulatórios
encontram-se destacados: NTBBF1ARROLB (resposta à auxina), WUSATAg (sequência alvo de WUS) e
MYBCOREATCYCB1 (ligação proteína MYB). Informações obtidas a partir do banco de dados do TAIR.
Resultados e Discussão 66
De maneira geral, as sequências genômica de SCI1 de N. tabacum e A. thaliana
apresentaram muitas características em comum. Com relação aos exons e introns, o padrão e
número são mantidos. Como pode ser visualizada nas Figuras 21 e 22, a sequência é
caracterizada pela presença de 4 exons, sendo o exon 1 composto por 24 aminoácidos (15,19%
da proteína), exon 2 composto por 36 aminoácidos (22,78% da proteína), exon 3 composto por
21 aminoácidos (13,29% da proteína) e exon 4 composto por 77 aminoácidos (48,73% da
proteína). Assim como observado em N. tabacum, SCI1 em Arabidopsis é composto por 4
exons, sendo o maior deles o exon 4 e o menor o exon 3.
DePaoli et al. (submetido) analisaram a sequência de aminoácidos de SCI1 de 8
espécies de plantas, a fim de encontrar motivos conservados. Três domínios foram propostos
baseados na similaridade entre as sequências. O domínio I, região parcialmente conservada
entre as espécies consideradas pelos autores, corresponde ao exon 1 e parte do exon 2 da
sequência genômica de SCI1 em N. tabacum e A. thaliana. Já o domínio II foi proposto como a
região com maior grau de divergência entre as sequências, correspondendo a parte do exon 2 e
ao exon 3, enquanto o domínio III, a região mais conservada da proteína, foi encontrada
principalmente no exon 4. Estes fatos sugerem que domínios importantes para a correta
atividade funcional de SCI1 devem estar localizados principalmente nos exons 1 e 4, uma vez
que mostraram-se bastante conservados durante a evolução.
Figura 22: Esquema ilustrativo da sequência genômica de SCI1 de A. thaliana. Elementos em formato de caixas
correspondem aos exons. Em azul escuro estão representados os exons da região codificadora da proteína SCI1 e, em
cor azul claro, as regiões 5´e 3´UTRs. Linhas azuis representam os introns. Fonte: TAIR.
Três introns (199, 416 e 241 nucleotídeos), uma região 3´UTR de 329 nucleotídeos e
uma região 5´regulatória particularmente pequena, composta por um 5´UTR de 17 nucleotídeos
e uma região promotora de aproximadamente 200 bases, também compõem a sequência
genômica de SCI1 em A. thaliana. Como descrito anteriormente, somente uma pequena região
5´regulatória foi encontrada na sequência genômica parcial de SCI1 em N. tabacum. Por outro
lado, o fato desta sequência ser bastante curta em A. thaliana, uma espécie cujo genoma está
totalmente seqüenciado, é um fato curioso. Saber se a região 5´regulatória também é bastante
pequena em N. tabacum, ainda dependerá da obtenção de sequências genômicas adicionais na
Resultados e Discussão 67
região do gene SCI1. Considerando regiões 5’regulatórias pequenas para ambas as espécies,
seria esperado que elementos regulatórios adicionais fossem encontrados fora da região
5´regulatória, complementando a regulação da expressão de SCI1. De fato, a análise in silico da
sequência genômica de SCI1 em N. tabacum (Tabela 03 e Figura 18) revelou a presença de
diversos elementos cis regulatórios localizados em regiões de éxons, introns e 3’UTR.
A sequência genômica de SCI1 de A. thaliana, também foi submetida a uma análise in
silico em busca de elementos cis regulatórios. Assim como em N. tabacum, a maioria dos
elementos foi encontrada fora da região 5´regulatória, e três domínios importantes,
NTBBF1ARROLB (resposta à auxina) e MYBCOREATCYCB1 (ligação proteína MYB) e
WUSATAg (sítio alvo da proteína WUSCHEL), encontrados em N. tabacum e descritos acima,
também foram encontrados na sequência genômica de SCI de A. thaliana (Figura 21), sugerindo
que as espécies compartilhem mecanismos de regulação semelhantes para expressão do gene
SCI1.
4.2 Busca de possíveis parceiros de SCI1 através de ensaios de duplo híbrido
A fim de encontrar parceiros de interação com SCI1 e, na inexistência de uma biblioteca
de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum em vetor de duplo-híbrido, foi feita uma busca
na literatura para encontrar possíveis candidatos a parceiros de SCI1, proteína que atua como
inibidor de CDK, regulando o ciclo celular (DePaoli et al., submetido). Buscas foram realizadas
em bancos de dados como o GenBank do NCBI e o TOBEST (TOBacco ESTs) (Quiapim et al.,
2009), a fim de se encontrar as sequências codificadoras das proteínas candidatas: ciclinaD3;2,
CDKA (Cyclin Dependent Kinase A), MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), AGAMOUS,
ciclinaA1;1, ciclinaA2;2 e ciclinaA2;2 com o sítio destruction box (Vandepoele et al., 2002)
deletado.
4.2.1 Obtenção das sequências codificadoras e clonagem em vetores
específicos
4.2.1.1 Sequências presentes no banco de dados TOBEST
A primeira tentativa de busca foi realizada no banco de dados TOBEST (Quiapim et al.,
2009). Este banco apresenta clones de cDNAs de estigmas e estiletes de N. tabacum e a
presença do cDNA codificante de algumas das proteínas citadas anteriormente não só facilitaria
a amplificação e clonagem de sua sequência codificadora (CDS – “coding sequence”), como
Resultados e Discussão 68
também comprovaria que a proteína em questão encontra-se expressa no pistilo, juntamente
com SCI1.
De todas as proteínas citadas anteriormente, apenas duas apresentavam o cDNA
correspondente na biblioteca TOBEST: MAPK e Agamous.
4.2.1.1.1 Clonagem da sequência codificadora de MAPK nos vetores
pDEST22 e pDEST32
A busca pelo cDNA referente à MAPK na biblioteca TOBEST resultou em 2 clones
distintos, TOBEST063E05 e TOBEST077E11. As sequências correspondentes a estes clones
apresentavam uma sobreposição de cerca de 600 pares de bases (anexo - Figura 03), indicando
que representavam um mesmo cDNA. Análises das sequências revelaram que o clone
TOBEST067E05 possuía a região 5´UTR do cDNA e grande parte da CDS da MAPK, com
exceção da região codificadora dos 11 últimos aminoácidos da proteína (33 pares de bases). Já o
clone TOBEST077E11 era portador de toda região 3´UTR do cDNA, porém toda região 5´UTR
e parte do início da região codificadora da MAPK estavam ausentes.
Com base na sequência destes clones foram sintetizados 3 primers que, utilizados em
combinações específicas descritas na metodologia deste trabalho, resultaram na amplificação da
CDS da MAPK flanqueada pelos sítios attB1 e attB2 para inserção em vetores do sistema
Gateway (Invitrogen).
A Figura 23 apresenta o resultado das três reações de amplificação, quando aplicados
em gel de agarose 1% e marcados com brometo de etídeo.
Resultados e Discussão 69
Figura 23: Amplificação da sequência codificadora da enzima MAPK, analisada por eletroforese em gel de agarose
1%, corado com brometo de etídeo. O gel A mostra o resultado da primeira PCR, onde o tamanho esperado da banda
era de 1120 pares de bases. No gel B, o produto da primeira PCR pode ser comparado com o resultado da segunda
reação de amplificação. Notar o ligeiro aumento no tamanho da banda (tamanho esperado de 1140 pares de bases).
Em C, o produto da PCR2 pode ser comparado com o resultado da terceira PCR, onde o fragmento gerado (1180pb)
encontra-se pronto para ser inserido no vetor pDONR201. M: marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder
(Invitrogen)
O produto da PCR3 foi inserido no vetor pDONR201 mediante recombinação. A
clonagem foi feita em células de E. coli DH10B eletrocompetentes. Na Figura 24 pode-se
observar a digestão, pelas enzimas de restrição SacI e PstI, do DNA extraído de 12 colônias
isoladas, obtidas a partir da transformação. O padrão esperado da digestão era composto de 3
bandas: 211, 345 e 2827pb. Apenas a colônia número 9 não mostrou o padrão desejado.
Resultados e Discussão 70
Figura 24: Análise por eletroforese em gel de agarose 1% das amostras de DNA de 12 colônias isoladas (1 a 12),
resultantes da transformação de células E. coli DH10B, com a CDS da MAPK inserida no vetor pDONR201,
digeridas com as enzimas SacI e PstI. M: marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Onze
colônias apresentaram o padrão de digestão esperado
.
O DNA extraído e purificado da colônia número 3 (pENTRY_MAPK-3) foi utilizado na
reação de recombinação LR (Sistema Gateway - Invitrogen) para inserção do inserto no vetor de
expressão pDEST22 (ProQuest Two-Hybrid System – Invitrogen). Quatro colônias isoladas,
resultantes da transformação, tiveram seu DNA extraído. Para confirmar a identidade das
amostras de DNA, as mesmas foram submetidas à digestão enzimática com a enzima SacI. O
padrão esperado era de 2 bandas, sendo a menor de 498 pares de bases e a maior, 7762pb. Como
pode ser observado na Figura 25, o resultado da eletroforese das amostras de DNA das 4
colônias, após a digestão enzimática, mostrou o padrão de bandas esperado para todas as
colônias analisadas.
Resultados e Discussão 71
Figura 25: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1%, de amostras de DNA extraídas de 4 colônias isoladas
contendo a construção pDEST22_MAPK, digeridas com a enzima SacI. O gel foi corado com brometo de etídeo e o
padrão esperado da digestão era de 2 bandas, sendo a menor de 498 pares de bases e a maior, 7762pb. M: marcador
de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
4.2.1.1.2 Clonagem da sequência codificadora da proteína
AGAMOUS no vetor pDEST22
O sequênciamento do clone TOBEST025G07 mostrou que o mesmo apresentava a
sequência codificadora da proteína AGAMOUS completa. Dessa forma, primers específicos
foram desenhados para permitir a amplificação da CDS do gene (Nt-AGAMOUS-Fw e Nt-
AGAMOUS-Rv). A Figura 26 mostra os resultados obtidos em cada reação de amplificação,
através da eletroforese de uma alíquota do produto de cada PCR em gel de agarose 1%. corado
com brometo de etídeo. Em ambas as amplificações observa-se a presença de uma banda única,
bem definida, no tamanho e padrão esperados.
Resultados e Discussão 72
Figura 26: Gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo, onde foram aplicadas alíquotas da PCR1 e PCR2
utilizadas para amplificação da CDS de AGAMOUS, a partir do clone TOBEST025G07. O nítido aumento no
tamanho do fragmento é devido à adição dos sítios attB1 e attB2, durante a PCR2, utilizando-se os primers BP1 e
BP2. M: marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
O fragmento da PCR2 foi inserido no vetor pDORN221 mediante recombinação. Uma
alíquota foi utilizada para transformação de células de E. coli DH10B eletrocompetentes. Oito
colônias resultantes da transformação tiveram sua identidade testada através de digestão
enzimática com as enzimas PstI e EcoRV. A Figura 27 mostra que o padrão de digestão
esperado (336 e 3305pb) foi encontrado em todos os transformantes.
O DNA resultante da colônia número 1, agora denominado pENTRY-AGAMOUS1, foi
escolhido para dar continuidade às construções desejadas. O inserto presente nesta construção
foi inserido nos vetores pDEST22 e pDEST32, via recombinação. Foram obtidas 5 colônias
possivelmente portadoras da construção pDEST22-AGAMOUS e 4 colônias pDEST32-
AGAMOUS.
Para confirmar se o DNA extraído de cada colônia correspondia à construção desejada,
este foi digerido com enzimas de restrição específicas. Para a construção pDEST22-
AGAMOUS, foram usadas as enzimas PstI e XhoI, que resultariam em um padrão de bandas
esperado de 930, 1493 e 4800 pb (Figura 28 A). Já o DNA resultante da construção pDEST32-
AGAMOUS foi digerido com as enzimas PstI e HindIII, esperando-se um padrão de bandas de
1047, 4732 e 5606 pb (Figura 28 B). Conforme pode ser observado, todas as 9 colônias
mostraram o padrão de digestão esperado.
Resultados e Discussão 73
Figura 27: Eletroforese em gel de agarose 1% de alíquotas do DNA extraído de 8 colônias transformantes, contendo
a construção pENTRY-AGAMOUS, digeridas com as enzimas PstI e EcoRV. Todas as alíquotas mostram um padrão
de bandas coincidente com o padrão de digestão esperado (336 e 2969 pb) M: marcador de peso molecular 1 kb Plus
DNA Ladder (Invitrogen).
Figura 28: Gel de agarose 1% contendo amostras de digestões de DNA submetidas à eletroforese. Em A aparecem o
marcador, e o padrão de digestão do DNA extraído de 5 colônias, possivelmente portadoras da construção pDEST22-
AGAMOUS, quando digerido pelas enzimas PstI e XhoI. O padrão esperado era de 930, 1493 e 4800pb. Em B é
possível observar o marcador de peso molecular (M) e o padrão de digestão do DNA extraído de 4 colônias
transformantes para a construção pDEST32-AGAMOUS, quando digeridos com as enzimas PstI e HindIII. O padrão
de bandas esperado era de 1047, 4732 e 5606pb. Todas as colônias mostraram o padrão de digestão esperado.
Resultados e Discussão 74
Com relação à construção pDEST22-AGAMOUS, o DNA referente à colônia número 2
foi utilizado nas etapas seguintes do ensaio de duplo-híbrido e a construção foi denominada
pDEST22-AGAMOUS-2. Já para a construção pDEST32-AGAMOUS, utilizou-se o DNA
extraído da colônia 1, denominando-a pDEST32-AGAMOUS-1.
4.2.1.2 Sequências presentes no banco de dados GenBank (NCBI)
Uma vez que os cDNAs correspondentes às proteínas: ciclinaD3;2, CDKA (Cyclin
Dependent Kinase A), ciclinaA1;1, e ciclinaA2;2 não foram encontrados na biblioteca TOBEST,
a busca foi realizada no banco de dados GenBank do NCBI.
4.2.1.2.1 Clonagem da sequência codificadora de ciclinaD3;2 nos vetores
pDEST22 e pDEST32
A sequência do cDNA da ciclinaD3;2 de N. tabacum (CAA09854) foi obtida no
GenBank. A estratégia de amplificação e clonagem da sequência codificadora desta proteína
consistiu no desenho de primers específicos. Para facilitar o desenho destes primers e diminuir
as chances de amplificação de outras ciclinas da mesma família, a sequência codificadora de
diversas ciclinas de N. tabacum foram alinhadas. Dentro da família de ciclinas D foram
encontradas: ciclinaD3;1 (CAA09853), ciclinaD3;5 (AB243208) e ciclinaD2;1 (CAA09852).
Além destas, também foram consideradas no alinhamento, as sequências parciais de ciclinaB
(AF518251) e ciclinaA (D50735). A Figura 29 apresenta o alinhamento das sequências na
região da metionina inicial da CDS e na região do stop codon.
Resultados e Discussão 75
Figura 29: Alinhamento das sequências dos cDNAs de 4 ciclinas da família D, uma ciclinaA e uma ciclinaB de N.
tabacum, realizado através da ferramenta ClustalW. O alinhamento foi realizado na região da metionina inicial da
CDS e na região do stop códon, a fim de facilitar o desenho de primers específicos para amplificação exclusiva da
CDS da ciclina3;2 (negrito). Destacadas em vermelho estão as sequências 5´ 3´ dos primers elaborados (TH-
CYCD3;2-Fw e TH-CYCD3;2-Rv). Além da sequência destacada também foram incluídos alguns nucleotídeos
referentes aos sítios attB1 e attB2.
A amplificação da CDS da ciclinaD3;2 de N. tabacum foi feita a partir da técnica de
PCR utilizando-se uma alíquota de cDNAs de estigmas e estiletes como molde e os primers TH-
CYCD3;2-Fw e TH-CYCD3;2-Rv. Como pode ser observado na Figura 30 A, a eletroforese em
gel de agarose de uma alíquota do produto da PCR1 revelou a presença de uma banda única de
cerca de 1100pb, que corresponde ao padrão esperado de 1126pb da CDS. Como a ciclinaD3;2
é membro de uma família de ciclinas, antes de prosseguir com o segundo ciclo de amplificação,
o fragmento gerado na PCR1 foi inserido no vetor PCR-BluntII-TOPO (Invitrogen) para que o
mesmo pudesse ser seqüenciado. O produto da ligação foi utilizado para transformação de
células de E. coli DH10B eletrocompetentes. Dez colônias resultantes da transformação tiveram
seu DNA extraído. Estes foram pré-selecionados através de digestão enzimática (EcoRI).
Apenas a colônia número 9 mostrou o padrão de digestão esperado e o sequenciamento
confirmou que o inserto correspondia à sequência codificadora da ciclinaD3;2 de N. tabacum.
O DNA extraído da colônia número 9 foi utilizado como molde para a segunda reação
de amplificação (PCR2). Na Figura 30 B é possível observar o resultado da PCR2, que
apresenta uma banda única com cerca de 1150pb, de tamanho próximo ao esperado (1166pb).
Resultados e Discussão 76
Figura 30: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1% de uma alíquota da primeira reação de amplificação da
CDS da ciclinaD3;2 de N. tabacum (A) e após a complementação dos sítios attB1 e attB2 através da PCR2 (B). M:
marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
O material resultante da PCR2 foi purificado e utilizado para inserção no vetor
pDONR201 (Invitrogen) mediante reação BP. A análise do DNA de 6 transformantes foi feita
por digestão enzimática, utilizando-se as enzimas NcoI e PstI. O padrão de bandas esperado era:
488, 729 e 2150pb. A Figura 31 apresenta o resultado das digestões, onde é possível observar
que todos os transformantes mostram o padrão de bandas esperado. O DNA oriundo da colônia
2 foi escolhido e a construção denominada pENTRY-CYCD3.2-2.
Resultados e Discussão 77
Figura 31: Mini-preparações de DNA das colônias oriundas da recombinação de ciclinaD3;2 com o vetor
pDONR201. As amostras foram digeridas com as enzimas NcoI e PstI e submetidas à eletroforese em gel de agarose
1%, tampão TBE 0,5x. Todos os transformantes apresentam padrão de digestão coerente com o esperado. M:
marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
O inserto presente na construção pENTRY-CYCD3.2-2 foi inserido nos vetores
pDEST22 e pDEST32, via recombinação. Foram analisadas 8 colônias possivelmente
portadoras da construção pDEST22-CYCD3;2 e 12 colônias da construção pDEST32-CYCD3;2.
A Figura 32 mostra o resultado das digestões enzimáticas realizadas para confirmar a identidade
dos DNAs extraídos dos transformantes. Em A, observa-se que as 8 alíquotas dos DNAs
referentes aos clones obtidos com a construção pDEST22-CYCD3;2, quando digeridas com as
enzimas XhoI e PstI, mostram um padrão de digestão compatível com o esperado (1125, 1493 e
5633pb). Da mesma forma, a análise do padrão de digestão do DNA extraído das 12 colônias
oriundas da construção pDEST32-CYCD3;2 (Figura 32 B), utilizando-se as enzimas XhoI e
XbaI, também revelou a correspondência de todas com o padrão esperado: 1118, 1706, e
8763pb. Para dar continuidade ao ensaio de duplo-híbrido, foram utilizados os DNAs referentes
aos clones: pDEST22-CYCD3;2-4 e pDEST32-CYCD3;2-12.
Resultados e Discussão 78
Figura 32: Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. Em A observa-se o padrão de digestão
enzimática de alíquotas de DNA extraído de 8 clones independentes, portadores da construção pDEST22-CYCD3;2.
A digestão foi realizada com as enzimas XhoI e PstI e todas as amostras mostraram correspondência com o padrão
esperado. Em B, o mesmo procedimento foi realizado com amostras de DNA dos 12 clones referentes à construção
pDEST32-CYCD3;2. A digestão foi realizada com as enzimas XhoI e XbaI e todos os clones correspondem ao
padrão esperado. M: marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
4.2.1.2.2 Clonagem da sequência codificadora de CDKA nos vetores
pDEST22 e pDEST32
A sequência do cDNA de CDKA:4 de N. tabacum (AF289467.1) foi obtida no GenBank.
A estratégia de amplificação e clonagem da sequência codificadora (CDS) desta proteína
consistiu no desenho de primers específicos. Para facilitar o desenho destes primers e diminuir
as chances de amplificação de CDKs de outras famílias, as sequências codificadoras das
seguintes CDKs de N. tabacum foram obtidas no GenBank e alinhadas: CDKB1-1 (AF289465),
CDKB1-2 (AF289466), NtPITSLREalpha (AB195174) e cdc2-homolog (D50738). A Figura 33
mostra o alinhamento das sequências na região da metionina inicial da CDS e na região do stop
codon. A região destacada em vermelho corresponde à sequência utilizada para desenho dos
primers TH-CDKA-Fw e TH-CDKS-Rv.
Resultados e Discussão 79
Figura 33: Alinhamento realizado pela ferramenta ClustalW da região codificadora das seguintes CDKs de N.
tabacum encontradas no GenBank: CDKA:4 (AF289467.1), CDKB1-1 (AF289465), CDKB1-2 (AF289466),
NtPITSLREalpha (AB195174) e cdc2-homolog (D50738). Regiões destacadas em vermelho correspondem à
sequência utilizada para desenho dos primers TH-CDKA-Fw e TH-CDKS-Rv.
A amplificação da CDS da CDKA de N. tabacum foi feita de forma semelhante à
descrita para ciclinaD3;2. A Figura 34 A apresenta o resultado da primeira reação de
amplificação. Como pode ser observado, uma banda única de cerca de 900pb, que corresponde
ao padrão esperado de 907pb, foi obtida. A Figura 34 B apresenta o resultado da PCR2, onde é
possível observar a presença de uma banda de maior intensidade, cujo tamanho aproximado
corresponde ao esperado (947pb).
O material resultante da segunda reação de amplificação foi inserido no vetor
pDONR201 como descrito anteriormente. Foram analisados 10 clones resultantes da
transformação por digestão enzimática com AvaI e EcoRI. A Figura 35 mostra que 9 dos 10
transformantes apresentam o padrão de digestão esperado. O DNA referente ao clone 1 foi
selecionado para utilização nas próximas etapas de construção, sendo denominado pENTRY-
CDKA-1.
Resultados e Discussão 80
Figura 34: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1% de uma alíquota da primeira reação de amplificação da
CDS da CDKA de N. tabacum (A) e após a complementação dos sítios attB1 e attB2 via PCR2 (B). M: marcador de
peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
Figura 35: Eletroforese em gel de agarose 1% do DNA extraído de 10 clones advindos da construção pDONR201 +
CDKA e digerido com as enzimas AvaI e EcoRI. Nove dos dez clones analisados apresentaram o padrão de digestão
coerente com o esperado. M: marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
Resultados e Discussão 81
O inserto presente na construção pENTRY-CDKA-1 foi transferido para os vetores
pDEST22 e pDEST32, via recombinação. Oito colônias foram analisadas como candidatas a
portadoras da construção pDEST22-CDKA e 5 colônias da construção pDEST32-CDKA. A
Figura 36 mostra o resultado das digestões enzimáticas realizadas para confirmar a identidade
dos DNAs extraídos dos transformantes. Em A, observa-se que das 8 alíquotas dos DNAs
referentes aos clones obtidos com a construção pDEST22-CDKA, digeridas com as enzimas
XhoI e EcoRI, todas mostram um padrão de digestão compatível com o esperado (683, 1493 e
5857pb). Da mesma forma, a análise do padrão de digestão do DNA extraído dos 5
transformantes resultantes da construção pDEST32-CDKA (Figura 36 B), utilizando-se a
enzima HindIII, também revelou a correspondência de todas com o padrão esperado: 938 e
10431pb. Para dar continuidade ao ensaio de duplo-híbrido, foram utilizados os DNAs
referentes aos clones: pDEST22-CDKA-1 e pDEST32-CDKA-2.
Figura 36: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1%, das amostras de DNA extraído dos clones resultantes das
construções pDEST22-CDKA (A) e pDEST32-CDKA (B). Em A, é possível observar que todas as amostras
apresentam padrão de digestão enzimática coerente com o esperado, após tratamento com a enzima HindIII. Apenas 3
clones resultantes da construção pDEST32-CDKA mostram o padrão de digestão compatível com o esperado, como
pode ser visto em B. M: M: marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
Resultados e Discussão 82
4.2.1.2.3 Clonagem das sequências codificadoras de ciclinaA1;1 e
ciclinaA2;2 nos vetores pDEST22
As sequências codificadoras de ciclinaA1;1 (número de acesso X92966) e
ciclinaA2;2 (D50736)
de N. tabacum foram obtidas no GenBank. A estratégia de amplificação
e clonagem da CDS destas proteínas consistiu novamente no desenho de primers específicos:
Nt-CYCA1;1-Fw e Nt-CYCA1;1-Rv, para ciclinaA1;1 e Nt-CYCA2;2-Fw e Nt-CYCA2;2-Rv
para ciclina A2;2. As amplificações das CDSs, resultantes da primeira PCR podem ser
observadas na Figura 37 A. É possível verificar a presença de uma banda mais intensa, na altura
esperada, em ambos os casos. O sucesso da segunda reação de amplificação é mostrado na
Figura 37 B, onde novamente observa-se a presença de uma banda de maior intensidade,
coerente com o esperado para as duas construções.
Figura 37: Eletroforese em gel de agarose 1% do material resultante das amplificações das CDS de ciclinaA1;1 e
ciclinaA2;2 após PCR1 (A) e após PCR2 (B). M: marcador de peso molecular 1kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
Os fragmentos gerados na PCR2 foram inseridos no vetor pDONR221, via
recombinação. Foram analisados por digestão enzimática 5 clones da construção pDONR221 +
CYCA1;1 e 9 clones oriundos da construção pDONR221 + CYCA2;2. O DNA extraído de
todos os transformantes foi digerido com a enzima PvuII e o resultado pode ser visto na Figura
38. Na Figura 38 A é possível observar que apenas os clones1 e 2, referentes à construção
Resultados e Discussão 83
pDONR221 + CYCA1;1, mostraram identidade com o padrão esperado (987, 1086 e 1942pb).
Quanto aos clones referentes à construção pDONR221 + CYCA2;2 (Figura 38 B), o padrão
esperado (348, 475, 1280 e 1942pb) também só foi confirmado em 2 clones (7 e 9). Os clones
pENTRY-CYCA1;1-1 e pENTRY-CYCA2;2-7 foram selecionados para doar seus insertos para
o vetor de expressão pDEST22, através de 2 reações LRs (Invitrogen) realizadas separadamente.
Figura 38: Eletroforese em gel de agarose 1%, marcado com brometo de etídeo, resultante da aplicação de amostras
da digestão enzimática do DNA extraído dos clones oriundos das construções pDONR221 + CYCA1;1 (A) e
pDONR221 + CYCA2;2 (B). Em A pode-se observar que apenas os clones 1 e 2 mostram um padrão de bandas
compatível com o esperado. Em B, somente os clones 7 e 9 apresentam o padrão esperado. M: M: marcador de peso
molecular 1kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
Foram analisados 8 clones referentes à construção pDEST22-CYCA1;1 mediante
digestão enzimática com a enzima EcoRV. Como pode ser observado na Figura 39 A, todos os
transformantes mostraram o padrão esperado. Quanto à construção pDEST22-CYCA2;2, a
digestão foi realizada utilizando-se a enzima PvuII. Na Figura 39 B é possível comprovar que
todos os 7 clones analisados corresponderam ao padrão de digestão esperado. O DNA dos
clones pDEST22-CYCA1;1-2 e pDEST22-CYCA2;2-7 foram selecionados para utilização nos
ensaios de duplo-híbrido.
Resultados e Discussão 84
Figura 39: Eletroforese em gel de agarose 1% das mini-preparações de DNA das colônias oriundas das
transformações pDEST22-CYCA1;1 e pDEST22-CYCA2;2 submetidas à digestão enzimática. (A) mostra o padrão
de bandas obtido após a digestão do DNA extraído dos clones pDEST22-CYCA1;1 com a enzima EcoRV. Como
pode ser observado, todas as amostram apresentam o padrão esperado. Em (B) está mostrado o resultado da digestão
enzimática (PvuII) do DNA oriundo dos clones pDEST22-CYCA2;2. Novamente todos os clones conferem com o
padrão esperado. M: marcador de peso molecular 1kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
4.2.1.2.4 Clonagem da sequência codificadora de ciclinaA2;2, sem a região
destruction box, no vetor pDEST22
A região correspondente ao D-box foi encontrada na sequência da ciclinaA2;2 de N.
tabacum e a deleção desta região foi realizada através da construção de um primer específico
(Nt-CYCA2;2-Del-Fw), que daria início à amplificação da CDS após o sítio D-box. Este foi
utilizado juntamente com o primer Nt-CYCA2;2-Rv, como descrito na metodologia deste
trabalho (item 3.16.1.6). A Figura 40 apresenta o resultado dos dois ciclos de amplificação.
Como pode ser observado, o fragmento gerado pela PCR1 é coerente com a deleção de um
trecho de 285 nucleotídeos da CDS da ciclinaA2;2 amplificada (Figura 40 A).
O fragmento gerado na PCR2 foi inserido no vetor pDONR221, via recombinação. Sete
possíveis transformantes foram analisados por digestão enzimática (PvuII). Na Figura 41 é
possível observar que 6 clones mostraram o padrão esperado: 348, 477, 995 e 1940pb.
A
B
Resultados e Discussão 85
Figura 40: Eletroforese em gel de agarose 1% do produto da PCR1 (A) e PCR2 (B) utilizadas para amplificação do
CDS da ciclinaA2;2 de Nicotiana tabacum, com a região D-box deletada (DDB). M: marcador de peso molecular 1kb
DNA Ladder (Invitrogen).
Figura 41: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1% de amostras de DNA dos sete transformantes,
possivelmente portadores da construção pDONR221-CYCA2;2DDB (CDS da ciclinaA2;2, sem a região D-box,
inserida no vetor pDONR221), após a digestão com a enzima PvuII. Cinco dos sete transformantes mostraram o
padrão esperado. M: marcador de peso molecular 1kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
Resultados e Discussão 86
Finalmente, o fragmento presente na construção pENTRY-CYCA2;2DDB-7 foi
inserido no vetor de expressão pDEST22 permitindo, então, sua utilização nos ensaios de duplo-
híbrido. Oito clones foram analisados por digestão enzimática, utilizando-se as enzimas BamHI
e EcoRI. A Figura 42 mostra que o padrão esperado foi observado em todos os clones
analisados.
Figura 42: Análise do padrão de digestão enzimática apresentado pelas amostras de DNA extraídas de 8 clones,
resultantes da transformação de células de E. coli DH10B eletrocompetentes com a construção PDEST22-
CYCA2;2DDB, quando submetidas a eletroforese me gel de agarose 1% e coradas com brometo de etideo. M:
marcador de peso molecular 1kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
4.2.1.3 Clonagem da sequência codificante de SCI nos vetores do sistema de
duplo-híbrido
A clonagem da CDS de SCI1 foi feita por De Paoli et al. (submetido), que cederam a
construção pENTRY-SCI1 para utilização no presente trabalho. Assim, mediante recombinação,
a CDS de SCI1 foi inserida nos vetores pDEST22 e pDEST32. A Figura 43 A mostra a análise
por digestão enzimática, com HindIII, de 10 clones resultantes da construção pDEST22-SCI1.
Pode-se observar a correspondência do padrão de digestão de todas as amostras com o esperado.
Na Figura 43 B é mostrado o padrão de digestão do DNA extraído de 10 clones resultantes da
construção pDEST32-SCI1, fazendo uso da enzima HindIII. Novamente, observa-se a
Resultados e Discussão 87
correspondência do padrão de digestão de todas as amostras com o esperado. Foram
selecionadas para utilização nos ensaios de duplo-híbrido as construções: pDEST22-SCI1-3 e
pDEST32-SCI1-1.
Figura 43: Resultado da eletroforese em gel de agarose 1% do DNA extraído de 10 clones da construção pDEST22-
SCI1 e submetido à digestão enzimática com HindIII (A). Algumas amostras apresentam uma banda extra de
aproximadamente 2,5kb, possivelmente resultante de digestão parcial do DNA. Em B é mostrado o padrão de
digestão do DNA de 8 clones da construção pDEST32-SCI1, quando digeridos com HindIII. M: marcador de peso
molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
4.2.2 Ensaios de duplo-híbrido
Após a confirmação por digestão enzimática, todas as construções foram seqüenciadas a
fim de analisar a integridade e a identidade das sequências, além de investigar a correta inserção
das CDSs, visto que devem seguir a mesma fase de leitura do domínio a que estão fusionadas.
Todos os clones foram corretamente identificados e mostraram estar em fase de leitura correta
com os domínios BD e AD presentes nos vetores de expressão.
4.2.2.1 Análise do fenótipo dos transformantes para os genes HIS3 e lacZ
Após a co-transformação de células de leveduras com as construções citadas
anteriormente e utilizando as combinações presentes na Tabela 01, os transformantes foram
Resultados e Discussão 88
submetidos à análise de seus fenótipos (Figura 44). Com relação ao teste de interação dos
híbridos BD-SCI1 + AD-CYCD3;2 (Figura 44 A), não foi observada ativação dos genes
marcadores HIS3, URA3 (dados não mostrados) e do gene repórter lacZ. O mesmo foi
observado para os híbridos BD-SCI1 + AD-CDKA, mostrados na Figura 44 B.
Já o teste de interação entre as construções BD-SCI1 + AD-MAPK mostrou uma
pequena ativação do gene marcador de seleção HIS3, o que foi determinado visualmente pelo
ligeiro crescimento das colônias portadoras das duas proteínas híbridas, enquanto nenhum
crescimento celular foi evidenciado nos controles, quando estes foram crescidos em meio
seletivo sem histidina (–His) e na presença de 25mM de 3AT (3-Amino-1,2,4-triazole ) e
diluição 1/5 (Figura 44 C). Assim como o controle B (Invitrogen), o teste de expressão do gene
repórter lacZ pode não ser visualmente e quantitativamente observado em casos de interações
fracas. Dessa forma, estes resultados indicam haver uma interação fraca entre SCI1 e MAPK.
Com o intuito de confirmar os resultados de interação mencionados acima, os testes
foram repetidos, porém invertendo-se as construções. Na Figura 44 D, é possível observar que
os testes utilizando as construções BD-CYCD3;2 + AD-SCI1 não foram conclusivos, pois a
análise do fenótipo dos transformantes mostrou um significativo crescimento das colônias de
interação e dos controles em meio seletivo –His, mesmo na titulação máxima de 3AT (100mM)
e diluição de células 1/25. A análise de expressão do gene repórter lacZ também foi positivo
para as colônias de interação e controles. O fato dos genes marcadores de seleção e repórteres
serem ativados nos controles é indicativo de que o sistema tenha sido auto-ativado, neste caso,
pela construção BD-CYCD3;2. Segundo o fabricante (Invitrogen), algumas proteínas, quando
fusionadas ao domínio BD, podem ocasionar certo nível de ativação do sistema, na presença do
domínio AD, sem que isto represente interação entre as proteínas testadas. Para mascarar a
expressão do gene repórter HIS3, causada pela auto-ativação do sistema, o fabricante sugere o
uso de 3AT. No caso da construção BD-CYCD3;2, nem mesmo a titulação máxima deste
composto foi suficiente para “apagar” o efeito da auto-ativação causada pela mesma. Como
titulações de 3AT superiores a 100mM não são recomendadas, os resultados foram
inconclusivos. Na Figura 44 E são mostrados os testes com as construções BD-CDKA + AD-
SCI1, que foram negativos, indicando não haver interação entre SCI1 e CDKA.
Também foi testada a possibilidade de SCI1 interagir com ele mesmo, formando
homodímeros, utilizando as construções BD-SCI1 e AD-SCI1. Novamente o resultado foi
negativo (Figura 44 G), indicando que SCI1 não interage com si próprio.
Diante de vários resultados negativos, cogitou-se a hipótese de que o sistema utilizado
não estivesse funcionando corretamente. Assim, o teste referente à construção BD-MAPK e
AD-SCI1 não foram realizados. Para testar a veracidade da hipótese levantada, um controle
positivo era necessário. Diante do fato de CDKA ser descrita na literatura como um parceiro de
interação com diversas ciclinas, inclusive ciclinaD3;2, testes foram conduzidos com as
Resultados e Discussão 89
construções BD-CYCD3;2 e AD-CDKA (Figura 44 F). Entretanto, novamente a construção
BD-CYCD3;2 auto-ativou o sistema e os resultados não foram conclusivos. Invertendo-se as
construções, testes com BD-CDKA e AD-CYCD3;2 mostraram não haver interação entre estas
proteínas (dados não mostrados), no sistema em uso no laboratório.
Devido aos resultados obtidos e relatados em DePaoli et al. (submetido), demonstrando
que SCI1 inibe o ciclo celular, devido à necessidade de identificar os parceiros de interação
protéica para que esta proteína possa exercer a sua função e, devido à limitação de ter que clonar
cada um dos possíveis candidatos em N. tabacum, foi estabelecida uma colaboração com o Prof.
Dr. Lieven DeVeylder (Universidade de Gent – Bélgica), que possui um array com todos os
genes de Arabidopsis thaliana, envolvidos com o ciclo celular conhecidos, clonados em vetores
de expressão do sistema duplo-híbrido. O doutorando Henrique C. DePaoli clonou o homológo
de SCI1 em A. thaliana (AtSCI1) e os experimentos de duplo-híbrido como as sequências de A.
thaliana foram realizados pelo Prof. Dr. DeVeylder, demonstrando que a proteína AtSCI1
interage com ciclinaA1;1 e ciclinaA2;2 com D-box deletado. Para confirmar estes resultados em
N. tabacum, as CDSs destas proteínas foram clonadas como descrito acima e testes de duplo-
híbrido foram conduzidos. Os resultados obtidos foram negativos para todos os testes (dados
não mostrados). Nenhuma ativação significativa do gene repórter HIS3 foi observada nos testes
BD-SCI1 e AD-CYCA1;1, BD-SCI1 e AD-CYCA2;2, e BD-SCI1 e AD-CYCA2;2DDB. Em
paralelo, estas mesmas sequências de N. tabacum foram clonadas, pelo doutorando Henrique C.
DePaoli, em vetores de expressão para experimentos de BiFC (Bimolecular Fluorescence
Complementation), para expressão transitória em folhas de N. tabacum. Os resultados obtidos
por BiFC confirmaram a interação entre SCI1 e a ciclinaA1;1 de N. tabacum, reforçando a
desconfiança de que os vetores e/ou o sistema de duplo-híbrido, disponível em nosso laboratório,
apresentam algum tipo de problema.
Baseado na suspeita de que a cepa de levedura utilizada (Mav203) fosse a fonte dos
problemas observados, e também devido ao fato desta apresentar um nível basal de expressão
do gene marcador HIS3, os três últimos testes relatados foram repetidos em uma nova cepa
(PJ69-4), mediante acasalamento de leveduras PJ69-4a e PJ69-4α haplóides (mating type),
simulando as condições dos experimentos de De Paoli et al. (submetido) realizados em A.
thaliana. Apesar de não ter sido observado um nível basal de expressão do gene HIS3 nesta
cepa, todos os resultados foram novamente negativos, como apresentado na Figura 45.
Como todos os vetores construídos foram seqüenciados no local das inserções,
confirmando a ausência de mutações e a clonagem na fase de leitura correta, é plausível supor
que os vetores do sistema de duplo-híbrido, disponíveis no laboratório, não estão funcionando
adequadamente. Para testar esta possibilidade, no futuro serão realizados experimentos de
western blot, com anticorpos contra as sequências AD e BD, para verificar se as proteínas de
fusão estão sendo sintetizadas ou não, nos vetores e cepas em uso.
Resultados e Discussão 90
Portanto, a realização dos ensaios de duplo-híbrido para testar possíveis parceiros de
interação com SCI1 ainda constituem uma meta a ser alcançada. Esforços serão dispensados no
intuito de descobrir a origem dos problemas observados, talvez com a aquisição de um novo
sistema duplo-híbrido, a fim de possibilitar a obtenção de dados importantes sobre o papel de
SCI1 no desenvolvimento do pistilo e consequentemente no sucesso reprodutivo das plantas.
Figura 44: Ensaios de duplo-híbrido. 1 e 2 apresentam o fenótipo das células transformantes quanto ao
gene marcador HIS3 com 0mM e titulação ótima de 3AT, respectivamente. A última coluna (3) indica o
resultado do teste do gene repórter lacZ.. (A) representa spots de colônias de leveduras portadoras das
construções BD-SCI1 + AD-CYCD3;2 e controles (+ presença da proteína / - ausência da proteína). A
primeira coluna (1) indica que as células foram capazes de crescer em meio SC-Leu-Trip-His sem 3AT e
Resultados e Discussão 91
diluição 1 (30.000 células/µl). A segunda coluna (2) mostra que as células representativas de interação
mostraram-se incapazes de crescer na presença de 25mM de 3AT, mesmo na diluição 1. A terceira coluna
(3) mostra que não houve expressão significativa do gene repórter lacZ nos spots de células
representativas de interação. (B) spots de colônias de leveduras da construção BD-SCI1 + AD-CDKA e
controles. A segunda coluna mostra que não houve crescimento de spots de células representativas de
interação na presença de 10mM de 3AT e diluição 1. Nenhum sinal de interação foi também observado
no teste de expressão do gene repórter lacZ. (C) spots de colônias de leveduras da construção BD-SCI1 +
AD-MAPK e controles. Um discreto crescimento foi observado nos spots de células representantes de
interação, na presença de 25mM de 3AT e diluição 1/5. Nesta titulação de 3AT e diluição celular, nenhum
crescimento de controles foi observado, o que sugere uma interação fraca entre SCI1 e MAPK. Assim
como o controle B (Invitrogen), o teste de expressão do gene repórter lacZ pode não ser visualmente e
quantitativamente observado. (D) spots de colônias de leveduras da construção BD-CYCD3;2 + AD-SCI1
e controles. A segunda coluna mostra crescimento de spots de células representativas de interação e
controle da construção BD-CYCD3;2, mesmo na presença de 100mM de 3AT e diluição de células 1/25,
o que é indicativo de auto-ativação do sistema por BD-CYCD3;2. A terceira coluna confirma a auto-
ativação de BD-CYCD3;2 pela expressão do gene repórter lacZ. (E) spots de colônias da construção BD-
CDKA + AD-SCI1 e controles. Em 2 é possível que nenhum crescimento ocorra na titulação de 25mM de
3AT, como em (B), indicando que CDKA e SCI1 aparentemente não são parceiros de interação. (F) spots
de colônias da construção BD-CYCD3;2 + AD-CDKA e controles. Na segunda coluna é possível
observar crescimento celular na titulação máxima de 3AT (100mM), o que confirma a auto-ativação de
BD-CYCD3;2, como evidenciado em (D). (G) spots de colônias da construção BD-SCI1 + AD-SCI1 e
controles. Nenhum crescimento distintivo entre células de interação e controles foi observado, mesmo na
presença de 50mM de 3AT e diluição 1/5. Nenhuma evidência de expressão do gene repórter lacZ foi
observada.
Figura 45: Investigação da interação de SCI1 com ciclinaA1;1, ciclinaA2;2 e ciclinaA2;2DDB (com D-box deletado)
através de ensaios de duplo-híbrido, utilizando o método de acasalamento de leveduras haplóides a e α (yeast mating-
type). Os spots presentes nas figuras representam colônias de leveduras transformantes, portadoras de duas
construções e crescidas em meios seletivos sem histidina (–His), 0mM e 10mM de 3AT (3-amino-1,2,4-triazole). A
legenda ao lado de cada figura especifica a dupla de proteínas híbridas sendo produzidas em cada caso. BD: somente
domínio binding DNA; AD: somente domínio Activation Domain; BD-SCI1: proteína SCI1 com domínio BD
fusionado em sua extremidade N-terminal; AD-CYCA1;1: ciclina A1;1 com domínio AD fusionado no seu N-
terminal; AD-CYCA2;2: ciclina A2;2 com domínio AD fusionado no seu N-terminal; AD-CYCA2;2DDB: ciclina
A2;2 com sítio D-box deletado e domínio AD fusionado no N-terminal. É possível observar que os testes de duplo-
híbrido não evidenciam a interação de SCI1 com nenhuma das proteínas testadas. Além disso, a ausência de
crescimento nos controles indica que apenas os domínios AD e BD não são suficientes para ativar o sistema.
Resultados e Discussão 92
4.3 Busca de possíveis parceiros de SCI1 através de ensaios de pull-down
4.3.1 Expressão da proteína heteróloga SCI1
O primeiro passo para a realização de ensaios de pull-down consiste na obtenção da
proteína heteróloga em fusão a uma sequência de aminoácidos conhecida (tag), utilizando uma
linhagem de células de expressão apropriada. Para isso, a sequência codificante de SCI1 de N.
tabacum foi clonada por De Paoli et al. (submetido) no vetor pDEST17 (Invitrogen). Este vetor
de expressão foi utilizado em testes preliminares de expressão, que indicaram que uma
quantidade significante da proteína heteróloga estava presente na fração solúvel do lisado de
células crescidas sob as seguintes condições: 250 ml de meio de cultura, 3 horas de indução
utilizando 0,05mM de IPTG. A Figura 46 apresenta o padrão protéico obtido após eletroforese
de 15µl do lisado celular (fração insolúvel e fração solúvel) em gel de poliacrilamida 12,5%
(SDS-PAGE). Como pode ser observado, a proteína heteróloga de aproximadamente 25kDa
mostrou-se presente na fração solúvel do lisado celular, após 3 horas de indução com IPTG.
Figura 46: Análise da expressão da proteína His-SCI1 em E. coli, por SDS-PAGE (gel a 12,5%). Na primeira
posição do gel aparece o marcador de peso molecular LMW Calibration Kit for SDS Eletrophoresis (GE Helthcare),
seguido pela fração insolúvel do lisado celular de E. coli expressando His-SCI1 e, por último, a fração solúvel do
mesmo lisado, onde é possível visualizar a presença da proteína desejada.
His-SCI1
25kDa
fração
insolúvel
fração
solúvel
M
His-SCI1 His-SCI1
94
66
45
30
20,1
14,4
kDa
Resultados e Discussão 93
4.3.2 Extração de proteínas de estigma e estilete
Foram utilizados 4,5g de tecido de estigmas e estiletes (E/E) de flores de N. tabacum
Ri14.1 (DePaoli et al., submetido), para extração de proteínas. A escolha de plantas
transgênicas, com o gene SCI1 silenciado, para utilização nos ensaios de pull-down, foi feita
devido a relatos da literatura (Bauer&Kuster, 2003) que dizem haver, neste caso, uma maior
probabilidade das proteínas que interagem com SCI1 estarem livres, uma vez que a proteína
apresenta-se escassa devido ao silenciamento. O procedimento de extração foi realizado no
mesmo tampão utilizado para equilibrar a coluna contendo resina de níquel, como descrito em
Material e Métodos, na tentativa de manter constantes as condições do ensaio e evitar a perda de
material. Após a extração, 15 µl do extrato protéico foram submetidos à eletroforese em gel de
poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE) para avaliação do perfil protéico obtido (Figura 47).
4.3.3 Ensaio de pull-down
A Figura 47 apresenta o gel resultante da eletroforese corado com Comassie Brillhant
Blue G (Sigma), onde é possível observar que a proteína recombinante, presente na fração
solúvel do lisado celular, antes da passagem pela coluna, ficou retida na mesma e, portanto, não
aparece no material coletado depois (flow-through 1). A ausência de proteínas na lavagem 2
indica que já não existiam mais proteínas livres na coluna, em outras palavras, que todas as
proteínas que permaneciam na coluna estavam efetivamente formando complexos com SCI1 ou,
eventualmente, seriam portadoras de trechos ricos em histidina em sua sequência protéica e,
dessa forma, apresentariam algum tipo de afinidade à coluna.
A Figura 47 também mostra o perfil de desprendimento dos complexos protéicos (SCI1
+ proteínas de interação putativas, do extrato protéico de E/E) da resina de níquel entre as
amostras eluídas 5, 7 e 9. É possível notar que a banda mais intensa, correspondente à proteína
recombinante His-SCI1, ocorre na amostra número 5 e a intensidade diminui em seguida. Esta
amostra também revelou a presença de algumas bandas de menor intensidade, que
correspondem às proteínas que formam complexos com SCI1. Para uma melhor distinção destas
proteínas, a amostra foi submetida a SDS-PAGE gradiente (item abaixo).
Resultados e Discussão 94
Figura 47: Gel de poliacrilamida 12,5% obtido após eletroforese de alíquotas de 15 µl do material utilizado e obtido
no ensaio de pull-down. Nos poços pode-se observar: M Marcador de peso molecular LMW Calibration Kit for SDS
Eletrophoresis (GE Helthcare), His-SCI1 fração solúvel do lisado de células de E. coli BL21(DE3)-Rosetta
expressando His-SCI1, antes de ser aplicado na coluna. E/E extrato representativo do perfil protéico dos estigmas e
estiletes de plantas transgênicas Ri14.2 (N. tabacum). FT1 Flow- through 1 - fração solúvel do lisado de células de E.
coli BL21(DE3)-Rosetta expressando His-SCI1, após passagem pela coluna. FT2 Flow- through 2 - extrato protéico
dos estigmas e estiletes de plantas transgênicas Ri14.2, após passagem pela coluna. 5, 7 e 9 - amostras no. 5, no.7 e
no.9 eluídas da coluna, respectivamente. Setas apontam para a banda correspondente à proteína heteróloga His-SCI1.
4.3.4 Identificação por espectrometria de massa das proteínas obtidas no
ensaio de pull-down
O material resultante do ensaio de pull-down, descrito no item anterior, foi submetido à
eletroforese em gel de poliacrilamida tipo gradiente 4-12% Bis-Tris (Nu PAGE-Invitrogen).
Com a finalidade. de obter quantidade suficiente de proteína para análise, as amostras foram
aplicadas no gel em triplicatas. A Figura 48 apresenta o resultado obtido, onde pode-se observar
uma melhor distinção de bandas quando comparada à Figura 47. As setas apontam para a
localização de 16 bandas distintas que foram evidenciadas no gel mediante coloração com
Comassie Brilhant Blue G. Cada banda foi devidamente cortada do gel, identificada, e colocada
junto com suas duas bandas correspondentes (triplicatas).
Resultados e Discussão 95
Após a coleta das bandas, estas foram enviadas para análise por espectrometria de
massa (MS e MS/MS por MALDI Tof/Tof) no Instituto Pasteur de Montevideo (Unidade
Pasteur de Analises Proteomica - Uruguai).
Figura 48: Gel gradiente 4-12% Bis-Tris (Nu PAGE -Invitrogen) obtido após eletroforese da amostra eluída do
ensaio de pull-down, realizado com a proteína heteróloga His-SCI1, expressa em células de E. coli BL21(DE3)-
Rosetta, e extrato protéico de estigmas e estiletes de plantas transgênicas Ri14.2 de N. tabacum. Na primeira posição
aparece o marcador de peso molecular e nos poços 3, 4 e 5 aparece a amostra número 5 eluída do ensaio, em triplicata.
Setas indicam a localização das bandas que foram identificadas e numeradas. M: marcador de peso molecular
Prestained SDS-PAGE Standards (BioRad).
A Tabela 04 resume os resultados obtidos na análise das proteínas submetidas à
espectrometria de massa. Das 16 bandas processadas, as análises sugerem que 5 (bandas 1, 2, 3,
12 e 16) correspondem a proteínas de E. coli, e muito provavelmente devem ser artefatos do
ensaio. Já os espectros de massa das bandas número 7 e 15 não mostraram identidade com
nenhuma sequência dos bancos de dados utilizados e permanecem sem identificação. A não
identificação destas proteínas pode estar associada ao fato de N. tabacum não possuir seu
Resultados e Discussão 96
genoma seqüenciado e, portanto, nem todas as informações genéticas e proteômicas dessa
espécie estão presentes em bancos de dados.
SCI1 foi identificado na amostra número 8, como era esperado, confirmando a acurácia
da identificação de proteínas pela espectrometria de massa realizada. Além disso, as amostras 4
e 5 também foram identificadas como SCI1. A grande quantidade desta proteína, em relação às
demais, e a elevada sensibilidade da técnica podem ter sido responsáveis por estes resultados,
fazendo com que esta proteína majoritária, dificulte a identificação das proteínas minoritárias,
efetivamente resultantes da interação.
Tabela 04: Relação de proteínas obtidas no ensaio de pull-down utilizando His-SCI1 como isca e identificadas por
espectrometria de massa.
A análise do espectro de massa, resultante da banda 6, mostrou uma homologia
estatisticamente significante com uma lectina de N. tabacum, descrita por Chen et al. (2002).
Trata-se de uma proteína induzida por metiljasmonato, presente nos compartimentos
citoplasmático e nuclear das células. Segundo os autores, acredita-se que esteja envolvida em
algum processo regulatório específico do núcleo, possivelmente através de interações com
proteínas regulatórias glicosiladas (fatores de transcrição e tradução).
Resultados interessantes também foram encontrados na análise do espectro de massa
das bandas 9 e 10. A Figura 49 apresenta o resultado da busca, utilizando tBlastn, por proteínas
portadoras dos peptídeos gerados pelo espectro de massa da banda 9. O resultado das análises da
banda 10 é bastante semelhante. Ambas mostraram grande similaridade com fosfatases ácidas.
Nesta mesma figura é possível observar que quatro peptídeos gerados pelo espectro de massa da
Amostra Proteína identificada Organismo
1
Proteína ribossomal 15S Escherichia coli
2
Chaperona Hfq Escherichia coli
3
Proteína ribossomal 50S Escherichia coli
4
Clone TOBESTR068F10 - SCI1 Nicotiana tabacum
5
Clone TOBEST 48C05 – SCI1 Nicotiana tabacum
6
Clone TOBESTR037D05 - Lectina Nicotiana tabacum
7
Cloramfenicol acetil transferase Escherichia coli
8
Clone TOBEST068F10 – SCI1 Nicotiana tabacum
9
Clone TOBEST104H03 - Fosfatase ácida (VSP1) Nicotiana tabacum
10
Clone TOBEST104H03 - Fosfatase ácida (VSP1) Nicotiana tabacum
11
Clone TOBEST61C05 - Glyceraldeído-3-fosfato dehidrogenase Nicotiana tabacum
12
Sequência genômica traduzida Escherichia coli
13
Heparanase Nicotiana tabacum
14
Clone TOBESTR021D12 - tts-1(transmition tissue specific protein-1) Nicotiana tabacum
15
Sem identificação
--
16
Sequência genômica traduzida Escherichia coli
Resultados e Discussão 97
proteína presente na banda 9 são encontrados na sequência protéica de uma fosfatase ácida
(APS-1) de tomate (Solanum lycopersicum), descrita por Williams & Colwell em 1991. A
atividade de APS-1 é regulada durante o desenvolvimento e mostrou ser relativamente alta em
meristemas apicais desta planta.
Dois dos peptídeos encontrados na fosfatase ácida de tomate também são encontrados
na sequência de aminoácidos de uma proteína de estocagem específica do carpelo de
Arabidopsis thaliana (VSP1), e descrita por Utsugi et al. (1998), a qual posteriormente foi
caracterizada como portadora de atividades de fosfatase ácida e fator de transcrição (Gamboa et
al, 2001). Segundo Utsugi et al. (1998), VSP1 interage com uma proteína rica em leucina
(FLOR1), formando um complexo protéico VSP1-FLOR1, com o qual AGAMOUS interage. A
proteína AGAMOUS é codificada pelo gene do modelo ABC responsável pela determinação da
identidade do pistilo (Yanofsky, 1990, Bowman et al. 1991; Coen & Meyerowitz 1991). Dessa
forma, FLOR1 constitui um fator acessório da proteína AGAMOUS, mediando a interação desta
proteína com VSP1, em um estágio específico do desenvolvimento do órgão reprodutivo
feminino.
A análise do espectro de massa gerado pela proteína número 11 revelou que esta
apresentava uma grande similaridade com uma enzima GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase) de N. tabacum. A Figura 50 apresenta o resultado da busca por proteínas
portadoras dos peptídeos previstos pelo programa Mascot, realizada contra o banco de dados do
NCBI, utilizando-se o programa tBlastn. É possível notar que 4 peptídeos oriundos da
espectrometria de massa são encontrados na sequência de aminoácidos de GAPDH e que a
mesma compartilha 94% de similaridade com a sequência encontrada pelo programa Mascot.
Resultados e Discussão 98
Figura 49: Resultado do alinhamento da sequência de aminoácidos encontrada pelo programa Mascot, ao analisar o
espectro de massa da banda 09, com proteínas do banco de dados do SOL através do programa tBlastn. Destacadas na
cor vermelha estão as sequências de aminoácidos correspondentes aos peptídeos gerados por espectrometria de
massa.
A proteína GAPDH é tradicionalmente conhecida como uma das enzimas participantes
da quebra da glicose (glicólise), catalizando a conversão de gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-
bifosfoglicerato (Spamer & Pette, 1977). Entretanto, com o avanço das técnicas de biologia
molecular, outras atividades vêm sendo associadas à GAPDH ao longo do tempo. Zheng et al.
(2003) descobriram que GAPDH pode estar associada à ativação da transcrição de histonas 2B
(H2B) durante a fase S do ciclo celular, atuando como co-fator em um complexo transcricional
denominado OCA-S. Além disso, Singh et al. (2008) relataram a expressão de genes da família
Resultados e Discussão 99
CP12 (chloroplast protein) em tecidos florais, incluindo estigmas e estiletes. As proteínas CP12
interagem com GAPDH formando complexos que, inicialmente, foram relacionados à regulação
do ciclo dia/noite, porém, recentemente, vêm sendo relacionados a processos metabólicos em
tecidos florais. Considerando GAPDH como um fator de transcrição ou elemento participante
de processos metabólicos em tecidos florais, é possível que SCI1 seja parceiro de interação com
esta proteína, ou mesmo interaja com algum complexo protéico do qual GAPDH faça parte.
Figura 50: Alinhamento das sequências encontradas pelo programa Mascot, durante análise do espectro de massa
referente à banda número 11, com a sequência de maior similaridade presente no banco de dados do NCBI,
utilizando-se a ferramenta tBlastn para realizar a busca.Com 94% de identidade, a proteína correspondente à banda
número 11 foi identificada como a enzima gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase de N. tabacum. Destacadas em cor
vermelha estão as sequências dos quatro peptídeos gerados pelo espectro de massa.
Dando continuidade à análise do espectro de massa das proteínas obtidas durante o
ensaio de pull-down, a proteína referente à banda número 13 foi identificada, com 71% de
homologia, como uma β-glucoronidase, também conhecida como heparanase (HPSE). Os
únicos relatos na literatura sobre heparanases de plantas mencionam um possível envolvimento
desta enzima na via de degradação de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) (Morimoto et al., 1998,
Eckey et al., 2004). A Figura 51 mostra o alinhamento da sequência encontrada pelo programa
Mascot com a sequência de uma heparanase de Ricinus communis, encontrada através do
programa tBlastn. Dois peptídeos gerados pelo espectro de massa desta proteína 13 são
encontrados na sequência (sequências em vermelho). Devido à escassez de dados literários
Resultados e Discussão 100
sobre a funcionalidade desta proteína em plantas, é difícil inferir sobre sua possível relação com
SCI1.
Figura 51: Resultado da pesquisa realizada pelo programa tBlastn, utilizando como referência as sequências
protéicas obtidas pelo programa Mascot, ao analisar o espectro de massa resultante da banda 13. É possível notar o
alinhamento destas com a sequência de aminoácidos da heparanase de Ricinus communis. As sequências dos
peptídeos constituintes do espectro de massa encontram-se destacados em vermelho.
Completando a identificação das proteínas obtidas durante o ensaio de pull-down,
utilizando SCI1 como proteína alvo, a banda número 14 mostrou uma similaridade significativa
com a sequência traduzida do clone TOBEST109G12 e também de vários outros clones
presentes no banco de dados TOBEST (ESTs de estigmas e estiletes de N. tabacum). Foi
verificado que estes clones independentes formam um único contig com o clone
TOBEST091B07, o qual dá nome ao contig e indica que estes cDNAs correspondem a mRNAs
de um mesmo gene.
Na sequência traduzida do contig TOBC091B07 foram encontrados 2 peptídeos gerados
pela análise do espectro de massa da proteína em questão pelo programa Mascot (sequências
destacadas em vermelho na Figura 52). Com o auxílio do programa tBlastn, foi realizada uma
busca no banco de dados do NCBI por proteínas similares à sequência traduzida do clone. A
Figura 52 apresenta o resultado da busca, que mostrou haver uma grande similaridade entre
sequência traduzida do contig TOBC091B07 e a sequência protéica de uma proteína rica em
Resultados e Discussão 101
prolina, específica do tecido transmissor de N. tabacum, denominada TTS-2 (Transmitting
Tissue-Specific-2).
Figura 52: Alinhamento da sequência traduzida do
contig TOBC091B07
com a sequência de aminoácidos da
proteína TTS-2 (transmitting tissue-specific-2) de N. tabacum, encontrada durante busca utilizando a ferramenta
tBlastn. Sequências destacadas na cor vermelha correspondem aos peptídeos gerados pela análise do espectro de
massa da proteína número 14 pelo programa Mascot.
O RNA mensageiro codificante da proteína TTS-2 foi isolado pela primeira vez por
Cheung et al. em 1993, juntamente com o RNA mensageiro de TTS-1, outra proteína da família
TTS, muito semelhante à TTS-2. Segundo os autores, a expressão destes genes em N. tabacum
tem início em botões florais jovens e os RNAs mensageiros resultantes são acumulados até os
estádios tardios de desenvolvimento floral, quando a elongação do estilete é mais rápida,
permanecendo até a antese. Wu et al. (2001) observaram que proteínas TTS, presentes no tecido
transmissor do estilete de N. tabacum, atuavam promovendo o crescimento dos tubos polínicos,
e servindo de atrativo para os mesmos. Além disso, Cheung et al.(1996) e Wu et al. (2001)
observaram que plantas de N.tabacum expressando AGAMOUS ectopicamente apresentavam
sépalas transformadas em estruturas semelhantes a pistilos, que suportavam a germinação do
grão de pólen e crescimento do tubo polínico. Cheung et al. (1996) mostraram que a expressão
de agamous nas sépalas destas plantas levava à expressão de uma bateria de genes envolvidos
no desenvolvimento floral, incluindo tts. Dessa forma, Cheung et al. (1996) e Wu et al. (2001)
concluíram que o gene tts-1 está sob o controle de uma rota de desenvolvimento regulada pelo
gene agamous.
De Paoli et al. (submetido) descrevem algumas características de SCI1, bastante
pertinentes no contexto da necessidade de interações proteína-proteína, para a atuação desta
proteína. A presença de dois domínios putativos de interação com ciclinas e de 15 sítios
Resultados e Discussão 102
putativos de fosforilação em sua sequência protéica, os fenótipos dos pistilos de plantas
transgênicas de silenciamento e superexpressão de SCI1, associados ao conjunto dos resultados
obtidos (DePaoli et al., submetido), sugerem que SCI1 faça parte de vias de sinalização
relacionadas ao desenvolvimento do órgão reprodutivo feminino, regulando a
proliferação/diferenciação do estigma/estilete, sob controle do hormônio auxina. Na tentativa de
investigar a hipótese da atuação de SCI1 nesta(s) via(s) de sinalização, os experimentos de pull-
down foram conduzidos para encontrar parceiros de interação, revelando algumas proteínas
inesperadas.
A identificação da proteína GAPDH, uma enzima conhecida por participar da glicólise,
no experimento de pull-down mostrou-se um fato bastante curioso. Apenas recentemente
surgiram evidências de que uma forma nuclear de GAPDH está envolvida na regulação de genes
do ciclo celular (Zheng et al., 2003). Também foram identificadas outras proteínas, como TTS,
heparanase e lectina, que não são proteínas localizadas no núcleo e podem representar apenas
artefatos do experimento de pull-down. O fato da atividade de proteínas como heparanases e
lectinas ainda não ser muito conhecida, dificulta o estabelecimento de hipóteses sobre a
associação das mesmas ao complexo conjunto de vias metabólicas das quais SCI1 poderia fazer
parte.
A possível interação entre SCI1 e VSP1 é coerente com o fato de ambas apresentarem
localização nuclear. Uma vez que 15 sítios de fosforilação estão presentes em SCI1, é bastante
lógico inferir que a atividade de SCI1 seja regulada, de alguma forma, por fosfatases, como
VSP1, e quinases, mediante a adição e a retirada de grupamentos fosfato em sítios específicos
da proteína. Por outro lado, é de se esperar que outras fosfatases, assim como várias quinases,
também interajam com SCI1. Experimentos adicionais serão necessários para encontrar novos
parceiros de SCI1.
Conforme o esperado para uma proteína que possui dois sítios putativos de interação
com ciclina, os resultados obtidos no array de Arabidopsis e nos experimentos de BiFC
(Biomolecular Fluorescent Complementation) demonstraram a interação entre SCI1 e ciclinas A
(DePaoli et al., submetido). Assim, era de se esperar que ciclinas A também tivessem sido
encontradas nos experimentos de pull-down. A ausência de ciclinas, entre os candidatos a
proteínas de interação de SCI1, pode ter ocorrido pelo fato do experimento ter sido realizado
com extrato total de proteínas de estigmas/estiletes, coletados em vários estádios de
desenvolvimento floral. As ciclinas são proteínas nucleares, altamente reguladas, que não estão
presentes em grandes quantidades nas células. Estas características podem explicar o fato destas
proteínas não terem sido encontradas nos experimentos de pull-down. Para aumentar a chance
de encontrar ciclinas, estes experimentos serão repetidos, no futuro, com proteínas nucleares, de
estigmas/estiletes coletados apenas nos estádios iniciais do desenvolvimento floral.
Resultados e Discussão 103
Em suma, os resultados aqui descritos revelaram alguns possíveis parceiros de SCI1,
que precisarão ser confirmados em experimentos distintos (duplo-híbrido, co-
imunoprecipitação, e/ou BiFC), a serem realizados no futuro.
Conclusões
Conclusões 105
5. CONCLUSÕES
Durante a realização do presente trabalho, o gene SCI1 de N. tabacum foi estudado sob
dois aspectos: sua estrutura gênica e a identificação de candidatos a parceiros de interação
proteína-proteína. As seguintes conclusões finais podem ser apresentadas:
1) A análise da sequência genômica de SCI1 revelou que o mesmo é composto de 4
exons e 3 introns, assim como seu homólogo em A. thaliana.
2) A comparação das sequências dos cDNAs disponíveis no TOBEST e SSH, com as
sequências genômicas de N. tabacum existentes no SOL, permite concluir que existem 2
sequências muito similares, mas distintas, para o gene SCI1. Considerando o fato de que este
gene está presente em cópia única em A. thaliana, cujo genoma já está seqüenciado, e o fato de
que a cultivar de N. tabacum usada neste trabalho (Petit Havana SR1) é mantida a muitas
gerações por autofecundação, praticamente eliminando as diferenças alélicas, é possível propor
que as duas sequências de SCI1 são homeólogos, correspondendo aos genes das espécies
ancestrais N. sylvestris e N. tomentosiformis.
3) Na sequência genômica de SCI1 foram encontrados elementos cis regulatórios para
indução por auxina, para ativação de expressão fase-dependente do ciclo celular e a sequência
alvo de WUSCHEL, uma proteína reguladora da atividade proliferativa do meristema floral.
Todos estes elementos regulatórios são coerentes com a função proposta para SCI1, como
integrante de vias de sinalização relacionadas ao desenvolvimento do órgão reprodutivo
feminino, regulando a proliferação/diferenciação do estigma/estilete, sob controle do hormônio
auxina (DePaoli et al., submetido).
4) Apesar de pouco conclusivos, os testes de duplo-híbrido, utilizando SCI1 como isca,
indicam uma interação fraca desta proteína com MAPK, sugerindo que SCI1 possa ser
fosforilado por esta quinase.
5) Dados do ensaio de pull-down identificaram um número significativo de proteínas
candidatas a parceiros de interação com SCI1. Entre estas, a identificação de uma fosfatase
ácida, capaz de regular a atividade da proteína SCI1, que possui 15 sítios putativos de
fosforilação, deve ser ressaltada.
Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas 107
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J.
(1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search
programs. Nucleic Acids Research, 25(17):3389-402.
Bauer, A. & Kuster, B. (2003). Affinity purification-mass spectrometry, powerful tools for the
characterization of protein complexes. European Journal of Biochemistry, 270:570–578.
Bland, M. M.; Matzinger, D. F.; Levings, C. S. (1985). Comparison of the mitochondrial
genome of Nicotiana tabacum with its progenitors species. Theoretical and Applied
Genetics, 69: 535-541.
Bowman, J.L., Smyth, D.R., and Meyerowitz, E.M. (1991. ). Genetic interactions among floral
homeotic genes of Arabidopsis. Development, 112: 1–20.
Bruckner, A.; Polge, C.; Lentze, N.; Auerbach, D. & Schlattner, U. (2009) Yeast two-hybrid, a
powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences, 10:
2763-2788.
Chen,Y., Peumans,W.J., Hause,B., Bras,J., Kumar,M., Proost,P.,Barre,A., Rouge,P. and Van
Damme,E.J. (2002). Jasmonic acid methyl ester induces the synthesis of a
cytoplasmic/nuclear chito-oligosaccharide binding lectin in tobacco leaves. FASEB
Journal, 16(8):905-7.
Cheung, A. Y., May, B., Kawataf, E.E., Gu, Q., Wu, H. (1993). Characterization of cDNAs for
stylar transmitting tissue specific proline-rich proteins in tobacco. The Plant Journal,
3(1):151-160.
Cheung, A. Y.; Wang, H.; Wu, H. (1995). A floral transmitting tissue-specific glycoprotein
attracts pollen tubes and stimulates their growth. Cell. 82: 383-393.
Cheung, A.Y., Zhant, X.Y., Wang, H.,Wu, H.M. (1996). Organ-specific and Agamous-
regulated expression and glycosylation of a pollen tube growth-promoting protein (pistil-
specific gene expression/posttranslational modifications/proline-rich proteins).
Referências Bibliográficas 108
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
93:3853-3858.
Chevray, P. M. & Nathans, D. (1992) Protein Interaction Cloning in Yeast: Identification of
Mammalian Proteins that React with the Leucine Zipper of Jun. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 89: 5789-5793.
Churchman, M.L., Brown, M.L., Kato, N., Kirik, V., Hülskamp, M., Inzé, D., De Veylder, L.,
Walker, J.D., Zheng, Z., Oppenheimer, D.G., Gwin, T., Churchman, J., Larkin, J.C. (2006)
SIAMESE, a plant-specific cell cycle regulator, controls endoreplication onset in
Arabidopsis thaliana. The Plant Cell 18: 3145-3157.
Ciechanover, A. (1994). The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell, 79:13–21.
Coen, E.S. & Meyerowitz, E.M. (1991). The war of the whorls: genetic interactions controlling
flower development. Nature, 353:31–37.
Dean, C.; Van-Del-Elzen, P.; S. Tamaki, S.; Dunsmuir, P.; Bedbrook, J. (1985). Differential
expression of eight genes of the petunia ribulose biphosphate carboxilase small subunit multi-
gene family. The EMBO Journal, 4: 3055-3061.
DePaoli, H.C. (2006). Análise da expressão gênica no pistilo de Nicotiana tabacum:
identificação de genes específicos por hibridização subtrativa e caracterização temporal e
celular. 104 páginas. Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação
em Genética da FMRP/USP, 104p.
DePaoli, H.C., Brito, M.S., Quiapim, A.C., Strini, E. J., Teixeira, S. P., DeVeylder, L., Goldman,
G.H., Dornelas, M.C., Goldman, M.H.S. (2010). A novel tobacco stigma/style gene, SCI1,
encoding a lysine-rich protein that controls cell divisions and differentiation. The Plant
Cell, submetido.
De Veylder, L., Beeckman, T., Inzé, D. (2007). The ins and outs of the plant cell cycle. Nature
reviews. Molecular cell biology, 8: 655-665.
Ding, X.; Richter, T.; Chen, M.; Su Seo, H. F.; Xie, M.; Zheng, X.; Kanrar, S.; Stevenson, R.;
Dardick, C.; Zhang, Y. L. Y.; Yu, F.; Bartley, L. E.; Chern, M.; Bart, R.; Chen, X.; Zhu, L.;
Referências Bibliográficas 109
Farmerie, W. G.; Gribskov, M.; Zhu, J.; Fromm, M. E.; Ronald, P. C. & Song, W. (2009).
A Rice Kinase-Protein Interaction Map1. Plant Physiology, 149: 1478–1492.
Eckey, C., Korell, M., Leib, K., Biedenkopf, D., Jansen, C., Langen, G., Kogel, K. (2004).
Identification of powdery mildew-induced barley genes by cDNA-AFLP: functional
assessment of an early expressed MAP kinase. Plant Molecular Biology 55: 1–15.
Esau, K. (1989). Anatomia das plantas com sementes. 3ª ed. São Paulo, Edgard Blücher. 293p.
Fields, S. & Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions.
Nature, 340: 245-246.
Gamboa, A., Paéz-Valencia, J., Acevedo, G.F., Vázquez-Moreno, L., Alvarez-Buylla, R.E.
(2001). Floral transcription factor AGAMOUS interacts in vitro with a leucine-rich repeat
and an acid phosphatase protein complex. Biochemical and Biophysical Research
Communications, 288(4):1018-26.
Gavin, A.C., Aloy, P., Grandi, P., Krause, R., Boesche, M., Marzioch, M., Rau, C. Jensen, L.J.,
Bastuck, S., Dumpelfeld, B., Edelmann, A., Heurtier, M. Hoffman, V., Hoefert, C. Klein, K.,
Hudak, M., Michon, A., Schelder, M., Schirle, M., Remor, M., Rudi, T., Hooper, S., Bauer,
A., Bouwmeester, T., Casari, G., Drewes, G., Neubauer, G., Rick, J.M., Kuster, B., Bork, P.,
Russell, R.B., Superti-Furga, G. (2006) . Proteome survey reveals modularity ofthe yeast
cell machinery. Nature 415:180–183.
Gietz, R.D., Triggs-Raine, B., Robbins, A., Graham, K.C., Woods, R.A. (1997). Identification
of proteins that interact with a protein of interest: Applications of the yeast two-hybrid
system. Molecular and Cellular Biochemistry, 172: 67-79.
Glotzer,M., Murray,A.W. and Kirschner,M.W. (1991). Cyclin is degraded by the ubiquitin
pathway. Nature, 349:132–138.
Goldman, M. H. S, Golderg, R. B., Mariani, C. (1994). Female sterile tobacco plants are
produced by stigma-specific cell ablation. The EMBO Journal 13: 2976–2984.
Golemis, E. A.; Serebriiskii, I.; Finley Jr, R. L.; Kolonin, M. G.; Gyuris, J. & Brent, R. (2009).
Interaction Trap/Two-Hybrid System to Identify Interacting Proteins. Current Protocols
in Protein Science, 57: 19.2.1-19.2.35.
Referências Bibliográficas 110
Goodspeed, T. H. 1954. The genus Nicotiana. University of California, Bekerley, California.
Gray. J. F.; Kung, S. D.; Wildman, S. G. (1974). Origin of Nicotiana tabacum L. detected by
polypeptide composition of fraction I protein. Nature. 252: 226-227.
Hunt, A.; Xu, R.; Addepalli, B.; Rao, S.; Forbes, K. P.; Meeks, L. R.; Xing, D.; Mo, M.; Zhao,
H.; Bandyopadhyay, A.; Dampanaboina, L.; Marion, A.; Von Lanken, C. & Li, Q. Q.
(2008). Arabidopsis Mrna polyadenylation machinery: comprehensive analysis of protein-
protein interactions and gene expression profiling. BMC Genomics, 9:220.
Ikeda, M., Mitsuda, N., Ohme-Takagi, M.(2009). Arabidopsis WUSCHEL Is a Bifunctional
Transcription Factor That Acts as a Repressor in Stem Cell Regulation and as an Activator
in Floral Patterning. The Plant Cell, 21:3493-3505.
Johnson, C. H. (2001). Endogenous timekeepers in photosynthetic organisms. Annual Review
of Physiology, 63: 695-728.
Klahre, U. & Kost, B. (2006). Tobacco RhoGTPase activating protein1 spatially restricts
signaling of RAC/Rop to the Apex of pollen tubes. The Plant Cell, 18: 3033-3046.
Kenton, A.; Parakonny, A. S.; Gleba, Y. Y.; Bennett, M. D. (1993). Characterization of the
Nicotiana tabacum L. genome by molecular cytogenetics. Molecular & General Genetics,
240: 159-169.
Koltunow, A.M., Truettner J., Cox, K.H., Wallroth M., Goldberg, R.B. (1990). Different
Temporal and Spatial Gene Expression Patterns Occur during Anther Development. The
Plant Cell, l 2: 12 1201-1224.
Koyama, T., Okada, T., Kitajima, S., Takagi, M. O., Shinshi, H., Sato, F. (2003). Isolation of
tobacco ubiquitin-conjugating enzyme cDNA in a yeast two-hybrid system with tobacco
ERFE3 as bait and its characterization of specific interation. Journal of Experimental
Botany, 54: 1175-1181.
Kozak, M. (1987). An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.
Nucleic Acids Research, 15 (20): 8125–8148.
Referências Bibliográficas 111
Lohmann, J. U., Hong, R. L., Hobe, M., Busch, M. A., Parcy, F., Simon, R., Weigel, D. (2001).
A molecular link between stem cell regulation and floral patterning in Arabidopsis. Cell,
105: 793 -803.
Lord, E. M. (2003). Adhesion and guidance in compatible pollination. Journal of
Experimental Botany, 54: 47–54.
Ming, F. & Ma, H. (2009). A terminator of floral stem cells. Genes & Development,23: 1705-
1708.
Mohameda, M. R.; Rahmana, M. M.; Lanchburyb, J. S.; Shattuckb, D.; Neffb, C.; Dufford, M.;
Buurenc, N. V., Faganc, K., Barryc, M.; Smith, S., Damond, I. & Mcfaddena, G. (2009).
Proteomic screening of variola virus reveals a unique NF-_B inhibitor that is highly
conserved among pathogenic orthopoxviruses. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 106(22):9045-9050.
Morimoto, S., Tateishi, N., Matsuda, T., Tanaka, H., Taura, F., Furuya, N., Matsuyama, N.,
Shoyama, Y. (1998). Novel Hydrogen Peroxide Metabolism in Suspension Cells of
Scutellaria baicalensis Georgi. The Journal of Biological Chemistry, 273: 12606–12611.
Nemhauser, J.L., Feldman, L.J., Zambryski, P.C. (2000). Auxin and ETTIN in Arabdopsis
gynoecium morphogenesis. Development, 127: 3877-3888.
Otsu, T. C., Silva, I., Molfetta, J. B., Silva, L. R., Engler, J. A., Engler, G., Torraca, P. C.,
Goldman, G. H., Goldman, M. H. S. (2004). NtWBC1, an ABC transporter gene
specifically expressed in tobacco reproductive organs. Journal of Experimental Botany,
55: 1643-1654.
Parrish, J.R.; Gulyas, K.D. & Finley, R.L. (2006). Yeast two-hybrid contributions to
interactome mapping. Current Opinion in Biotechnology, 17, 387-393.
Phizicky, E.M. & Fields S. (1995) Protein-Protein Interactions: Methods for Detection and
Analysis. Microbiological Reviews, 59: 94–123.
Planchais, S., Perennes C., Glab N., Mironov V., Inzé D., Bergounioux C. (2002).
Characterization of cis-acting element involved in cell cycle phase-independent activation
Referências Bibliográficas 112
of Arath;CycB1;1 transcription and identification of putative regulatory proteins. Plant
Molecular Biology, 50(1):111-27.
Prestridge, D.S. (1995). Predicting Pol II Promoter Sequences Using Transcription Factor
Binding Sites. Journal of Molecular Biology, 249: 923-32.
Preuss, D. (2002). Sexual signaling on a cellular level: lessons from plant reproduction.
Cellular and Molecular Biology, 13: 1803-1805.
Quiapim, A.C. (2005). Estudo comparativo de expressão gênica nos órgãos vegetativos e
reprodutivos de Nicotiana tabacum. Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de
Pós-Graduação em Biologia Comparada da FFCLRP/USP, 106p.
Quiapim A.C., Brito M.S., Bernardes L.A., Dasilva I., Malavazi I., DePaoli H.C., Molfetta-
Machado J.B., Giuliatti S., Goldman G.H., Goldman M.H. (2009). Analysis of the
Nicotiana tabacum stigma/style transcriptome reveals gene expression differences between
wet and dry stigma species. Plant Physiology, 149: 1211-1230.
Sablowski, R. (2007). Flowering and determinacy in Arabidopsis. Journal of Experimental
Botany, 58: 899–907.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Schoonheim, P. J.; Veiga, H.; Pereira, D.C.; Friso, G.; Van Wijk, K.J. & Boer, A.H. (2007). A
Comprehensive Analysis of the 14-3-3 Interactome in Barley Leaves Using a
Complementary Proteomics and Two-Hybrid Approach1[C][OA]. Plant Physiology, 143:
670–683.
Scebba, F., DeBastiani, M., Bernacchia, G., Andeucci, A. Galli, A. Pitto, L. (2007). PRMT11: a
new Arabdopsis MBD7 protein partner with arginine methyltransferase activity. The Plant
Journal, 52: 210-222.
Sessions, A., Nemhauser, J.L., McColl, A., Roe, J.L., Feldmann, K.A., Zambryski, P.C. (1997)
ETTIN patterns the Arabidopsis floral meristem and reproductive organs. Development,
124(22):4481-91.
Referências Bibliográficas 113
Shine, J., Dalgarno, L. (1975). Determinant of cistron specificity in bacterial ribosomes. Nature,
254(5495): 34–8.
Silva, I. (2004). Estudo de Transportadores ABC expressos em estigmas/estiletes de Nicotiana
tabacum. Dissertação de Doutorado apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias.e
Veterinárias, UNESP campus Jaboticabal, 114p.
Singh, P., Kaloudas, D., Raines, C.A. (2008). Expression analysis of the Arabidopsis CP12 gene
family suggests novel roles for these proteins in roots and floral tissues. Journal of
Experimental Botany, 59(14): 3975–3985.
Spamer, C., Pette, D. (1977). Activity patterns of phosphofructokinase,
glyceraldehydephosphate dehydrogenase, lactate dehydrogenase and malate dehydrogenase
in microdissected fast and slow fibres from rabbit psoas and soleus muscle.
Histochemistry, 52(3):201-16.
Streitner C, Danisman S, Wehrle F, Schöning JC, Alfano JR, Staiger D.(2008) The small
glycine-rich RNA binding protein AtGRP7 promotes floral transition in Arabidopsis
thaliana. The Plant Journal : for Cell and Molecular Biology, 56(2):239-50.
Sun, B., Xu, Y., Ng, K.H., Ito, T. (2009). A timing mechanism for stem cell maintenance and
differentiation in the Arabidopsis floral meristem. Genes & Development, 23: 1791-1804.
Tang, W., Perry, S.E. (2003). Binding Site Selection for the Plant MADS Domain Protein
AGL15 an in vitro and in vivo study. The Journal of Biological Chemistry, 278: 28154-
28159.
Thompson, J.D., Higgins. D.G., Gibson, T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of
progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap
penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research., 22(22):4673-80.
Utsugi, S., Sakamoto, W., Murata, M., and Motoyoshi, F. (1998) Arabidopsis thaliana
vegetative storage protein (VSP) genes: Gene organization and tissue-specific expression.
Plant Molecular Biology, 38: 565–57.
Vandepoele K., Raes J., Veylder, L., Rouzé, P., Rombauts, S., Inzé, D. (2002). Genome-Wide
Analysis of Core Cell Cycle Genes in Arabidopsis. The Plant Cell, 14: 903–916.
Referências Bibliográficas 114
Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E. (1996). Reverse two-hybrid and one-
hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93:
10321-10326.
Volkov, R. A.; Borisjuk, N. V.; Panchuk I. I.; Sshweizer, D.; Hemleben, V. (1999). Elimination
and rearrangement of parental rDNA in the allotetraploid Nicotiana tabacum. Molecular
biology and evolution, 16: 311-320.
Walhout, A.J.M.; Sordella, R.; Lu, X.; Hartley, J.L.; Temple, G.F.; Brasch, M.A.; Thierry-Mieg,
N. & Vidal, M. (2000). Protein Interaction Mapping in C. elegans Using Proteins Involved
in Vulval Development. Science, 287: 116–122.
Walhout, A.J.& Vidal, M. (2001). High-throughput yeast two-hybrid assays for largescale
protein interaction mapping. Methods 24: 297–306.
Wang, H., Fowke, L.C. & Crosby, W.L. (1997) A plant cyclin-dependent kinase inhibitor gene.
Nature 386, 451–452.
Williamson, V.M. & Colwell, G. (1991). Acid Phosphatase-1 from Nematode Resistant
Tomato: Isolation and Characterization of its Gene. Plant Physiology., 97(1):139-46.
Wu, H., Graaf, B., Marianid, C., Cheung, A.Y. (2001). Hydroxyproline-rich glycoproteins in
plant reproductive tissues: structure, functions and regulation. Cellular and Molecular Life
Sciences, 58: 1418–1429.
Yamano, H., Tsurumi, C., Gannon, J. Hunt, T. (1998). The role of the destruction box and its
neighbouring lysine residues in cyclin B for anaphase biquitin dependent proteolysis in
fission yeast: defining the D-box receptor. The EMBO Journal, 17:5670–5678.
Yanofsky M.F., Ma, H., Bowman, J.L., Drews, G.N., Feldmann, K., Meyerowitz, E.M.
(1990). The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles
transcription factors. Nature 346: 35–39.
Referências Bibliográficas 115
Zheng, L., Roeder, R.G., Luo, Y. (2003). S Phase Activation of the Histone H2B Promoter by
OCA-S, a Coactivator Complex that Contains GAPDH as a Key Component. Cell, 114:
255–266.
Zheng, Y., Ren, N., Wang, H, Stromberg, A.J., Perry, S.E. (2009). Global Identification of
Targets of the Arabidopsis MADS Domain Protein AGAMOUS-Like15. Plant Cell
Advance Online Publication.
Anexo
OF37
86 GCTAAAGAATTCAGTGCAATAATTCTATTTTTATAACTAAAAAACTACATCAAACTTTAG 60
c32287 ------------------------------------------------------------
OF3786 AACGGTATATGAGCCCGTGCTGCGGCTATCATACTAGTAAATAAATAAAAGGAAGACACA 120
c32287 ------------------------------------------------------------
OF3786 TTTCAAGAATATTTTTCTGCGAAATAGAATCAGAGGTGCGAGTAAATGGGGAGCGATAAG 180
c32287 ------------------------------------------------------------
OF3786 AAGACGACGGAGGAGAAGAGGAAGCATAAGAGAAATTCGCGTTCTTCTCCACGAGGTTTT 240
c32287 -----------------------GCATAAGAGAAATTCGCCTTCTTCTCCACGAGGTTTT 37
***************** *******************
OF3786 TTCCTTTCTTGTGTCTTCCAAATGGGGAGCGATAAATAATTTTTGAATATATATGGGCTT 300
c32287 TTCCTTTCTTGTGTCTTCCAAAATCTGCA-AAGAGATAATTTTTGAATATATATGGGCTT 96
********************** * * * *************************
OF3786 ATACGTCTTTGTGTCTGCTTAAACAGATGAAGTGAAAAGCAAACGCCAGAATATCAAAGG 360
c32287 ATACGTCTTTGTGTCTGCTTAAACAGATGAAGTGAAAAGCAAACGCCAGAATATCAAAGG 156
************************************************************
OF3786 GGATGAAGAGCGAAGGAAAGAAAAGGACAAATCCAAGAAGGAGAAGCACAAATCCCATAA 420
c32287 GGATGAAGAGCGAAGGAAAGAAAAGGACAAATCCAAGAAGGAGAAGCACAAATCCCATAA 216
************************************************************
OF3786 ATCCAAATGTCATTCTAGTGAAGGTACTTGCACAATTTTTGTTTTTGTTTTAAATTTTGT 480
c32287 ATCCAAATGTCATTCTAGTGAAGGTACTTGCACAATTTTTGTTTTTGTTTTAAATTTTGT 276
************************************************************
OF3786 ATATGAGTTCTGTTCAGTATTAAGCTGAGAATTTACTGATTTTATTATGAAAATTTAGGG 540
c32287 ATATGAGTTCTGTTCAGTATTAAGCTGAGAATTTACTGATTTTATTATGAAAATTTAGGG 336
************************************************************
OF3786 ATTTTGTTCTTTACTTGGGCCTCAGAAGGGTTCGTTTAGTTCCGTAAAACGTTTGCGATT 600
c32287 ATTTTGTTCTTTACTTGGGCCTCAGAAGGGTTCGTTTAGTTCCGTAAAACGTTTGCGATT 396
************************************************************
OF3786 TAGAATTTGATGTTGTTGCTGTTAGGGTTTGCTGCACTGATTAGTATAATGAGTTTGAAA 660
c32287 TAGAATTTGATGTTGTTGCTGTTAGGGTTTGCTGCACTGATTAGTATAATGAGTTTGAAA 456
************************************************************
OF3786 AGGGAAAGCAAGTATTATGCCGCTCAGCAATCCTTTTGCTTTGTTTTCCAATTCAATTGA 720
c32287 AGGGAAAGCAAGTATTATGCCGCTCAGCAATCCTTTTGCTTTGTTTTCCAATTCAATTGA 516
************************************************************
OF3786 TAGTTATGTGTAGGTTATGTGATCTGCCATTTATTAAGCAACT----------------- 763
c32287 TAGTTATGTGTAGGTTATGTGATCTGCCATTTATTAAGCAACTAAACNATAAATTAGGNC 576
*******************************************
OF3786 ------------------------------------------------------------
c32287 TGCACACAAACACATATAAAAAAGAAAAAGAAGAAAAATGATGGGTACGTATGTGGAAAT 636
OF3786 ------------------------------------------------------------
c32287 AGTTAGAACACCATTTNCAACAACAACAACCCACTATAATCCCACTAGTGGGGTCTGGGG 696
Figura 01: Alinhamento dos clones genômicos de SCI de N. tabacum, AGN_OF3786xo09f1.ab1 e c32287 obtidas no
site SOL e alinhadas utilizando-se o programa ClustalW.
HS1002E06 TCCAGCGGCCGCCCGGGCAGGTTCAGAGGTGCGAGTAAATGGGGAGCGATAAGAAGACGA 60
SCI1-ORF --------------------------------------ATGGGGAGCGATAAGAAGACGC 22
TobEST068F10 ------------------------------------------------------------
TobEST048C05 ------------------------------------------------------------
HS1002E06 CGGAGGAGAAGAGGAAGCATAAGAGAAATTCGCCTTCTTCTCCACGAGATGAAGTGAAAA 120
SCI1-ORF CGGAGGAGAAGAGGAAGCATAAGAGAAGTTCGCCTTCTTCTCCACGAGATGAAGTGAAAA 82
TobEST068F10 ------------------------------------------------------------
TobEST048C05 ------------------------------------------------------------
HS1002E06 GCAAACGCCAGAATATCAAAGGGGATGAAGAGCGAAGGAAAGAAAAG---GACAAATCCA 177
SCI1-ORF GCAAACGCCAGAATATCAAAGGGGATGAAGAGCGAAGGAAAGAAAAGAAGGACAAATCCA 142
TobEST068F10 ------------------------------------------------------------
TobEST048C05 ------------------------------------------------------------
HS1002E06 AGAAGGAGAAGCACAAATCCCATAAATCCAAATGTCATTCTAGTGAAGAGAAGAAGTCAG 237
SCI1-ORF AGAAGGAGAAGCACAAATCCCAT---------------TCTAGTGAAGAGAAGAAGTCAG 187
TobEST068F10 ------------------------------------------------------------
TobEST048C05 ------------------------------------------------------------
HS1002E06 GGGAAAAGCACAAAACCAAGAGCCACAAACATAAGGATAAATCGAAAAACAAGTTTGAAG 297
SCI1-ORF GGGAAAAGCACAAAACCAAGAGCCACAAACATAAGGATAAATCGAAAAACAAGTTTGAAG 247
TobEST068F10 ------------------------------------------CGAAAAACAAGTTTGAAG 18
TobEST048C05 ------------------------------------------CGAAAAACAATTTTGAAG 18
********** *******
HS1002E06 AGTTATCAAAAGATGATTATTTCTCTAAGAACAATGAATTTGCTTCTTGGCTGAAAGATA 357
SCI1-ORF AGTTATCAAAAGATGATTATTTCTCTAAGAACAATGAATTTGCTACTTGGCTGAAAGATA 307
TobEST068F10 AGTTATCAAAAGATGATTATTTCTCTAAGAACAATGAATTTGCTACTTGGCTGAAAGATA 78
TobEST048C05 AGTTATCAAAAGATGATTATTTCTCTAAGAACAATGAATTTGCTACTTGGCTGAAAGATA 78
******************************************** ***************
HS1002E06 AGAAGAATTTGTTCTTCTCAGATCTTTCGTCTGAGACTGCACGCAATTTATTCTCTGACT 417
SCI1-ORF AGAAGAATTTGTTCTTCTCAGATCTTTCGTCTGAGACTGCACGCGATTTATTCTCTGACT 367
TobEST068F10 AGAAGAATTTGTTCTTCTCAGATCTTTCGTCTGAGACTGCACGCGATTTATTCTCTGACT 138
TobEST048C05 AGAAGAATTTGTTCTTCTCAGATCTTTCGTCTGAGACTGCACGCGATTTATTCTCTGACT 138
******************************************** ***************
HS1002E06 TTGTCATACAATGGAACAAGGGAAAGCTTGACAGCCAATACTATGAGGGAATTGCAACCG 477
SCI1-ORF TTGTCATACAATGGAACAAAGGAAAGCTTGACAGCCAATACTATGAGGGAATTGCAACCG 427
TobEST068F10 TTGTCATACAATGGAACAAAGGAAAGCTTGACAGCCAATACTATGAGGGAATTGCAACCG 198
TobEST048C05 TTGCCATACAATGGAACAAAGGAAAGCTTGACAGCCAATACTATGAGGGAATTGCAACCG 198
*** *************** ****************************************
HS1002E06 GACCTCGGCCGCGACCACGCTAAGGGCGAATT---------------------------- 509
SCI1-ORF GGCCTCGGTCATC-CCACGCTTGGAATATCAAAAAGTAA--------------------- 465
TobEST068F10 GGCCTCGGTCATC-CCACGCTTGGAATATCAAAAAGTAATAGAATTCCATGTTTCTTCTC 257
TobEST048C05 GGCCTGGGTCATC-CCACGCTTGGAATATCAAAAAGTAATAGAATTCCATGTTTCTTCTC 257
* *** ** * ******* *
HS1002E06 ------------------------------------------------------------
SCI1-ORF ------------------------------------------------------------
TobEST068F10 TTTAAGGAGCAGTTGTATTGTCTTTTTTCCAGTTGTCCGATGGTTATGTCTTAGGCTTCT 317
TobEST048C05 TTTAAGGAGCAGTTGTATTGTCTTTTTTCCAGTTGTCCGATGGTTATGTCTTAGGCTTCT 317
HS1002E06 ------------------------------------------------------------
SCI1-ORF ------------------------------------------------------------
TobEST068F10 GTATTTTTGTGTTTTCTTTTTTCAGCAGAACATGCTTAGTCTTATGAAGTTACTTTCTTG 377
TobEST048C05 GGATTTTTGGGTTTTCTTTTTTCAGCAAAACATGCTTAGTCTTATGAAGTTACTTTCTTG 377
HS1002E06 ------------------------------------------------------------
SCI1-ORF ------------------------------------------------------------
TobEST068F10 GATAATGGTAAAATCACCATCTCTGTTGTAAGCTATGTTGTCCGGACTCTCCAAAATCCT 437
TobEST048C05 GATAATGGTAAAATCACCATCTCTGTTGTAAGCTATGTTGTCCGGACTCTCCAAA----- 432
HS1002E06 ------------------------------------------------------------
SCI1-ORF ------------------------------------------------------------
TobEST068F10 GCCGCATCCCCGTCGGACCCTCCAAAAATGCACATACTTTTAGAGGATCCGACACGCACC 497
TobEST048C05 ------------------------------------------------------------
HS1002E06 ------------------------------------------------------------
SCI1-ORF ------------------------------------------------------------
TobEST068F10 TGGTAACATTTTTAGTGAGTCTGGGCAACATAGGTTGTAAGAGTTCTATGCTAGTCCTAC 557
TobEST048C05 ------------------------------------------------------------
HS1002E06 ------------------------------------------------------------
SCI1-ORF ------------------------------------------------------------
TobEST068F10 CACGTGACTGCATTTATCATGGCCTTTGGCTGCAGAGACGGACAATACTTCTTATGATTC 617
TobEST048C05 ------------------------------------------------------------
HS1002E06 ------------------------------------------------------------
SCI1-ORF ------------------------------------------------------------
TobEST068F10 ACGTAAACTCAATAGTTTTTATTCATACTTTCTATATGTATTAAAAATTTATTGAATATT 677
TobEST048C05 ------------------------------------------------------------
HS1002E06 ----------------------------------------------
SCI1-ORF ----------------------------------------------
TobEST068F10 TATAAATGTTAAAACTATAAATTCCAATAAAAAAAAAAAAAAAAAA 723
TobEST048C05 ----------------------------------------------
Figura 02: Alinhamento das sequências de cDNA dos clones de SCI1 de N. tabacum: HS1-002E06, TobEST048C05,
TobEST068F10 e SCI1-ORF. Sequência destacada em cinza corresponde ao stop codon.
TOBEST063e05 ------------------------------------------------------------
TOBEST077e11 ATTTGGTACGCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCCGGGTCGACCCACGCGTCCGGTATT 60
TOBEST063e05 ------------------------------------------------------------
TOBEST077e11 GATGCTCTGAGAACTTTGCGTGAGCTAAAGCTCCTTCGCCACCTTAGACACGAAAATGTG 120
TOBEST063e05 ------------------------------------------------------------
TOBEST077e11 ATTGCTCTGAAAGATGTGATGATGCCAATCCACAGGCGAAGTTTCAAAGATGTTTACTTG 180
TOBEST063e05 ------------------------------------------------------------
TOBEST077e11 GTTTACGAACTAATGGATACTGATTTACATCAGATAATCAAATCCTCTCAAACACTTTCA 240
TOBEST063e05 ----------------ATTTCTATTTCCAGT-GCTTCGAGGTCTGAAATATCTCCATTCT 43
TOBEST077e11 AATGATCATTGCCAGTATTTCCTATTCCAGTTGCTTCGAGGTCTGAAATATCTCCATTCT 300
***** ******* ****************************
TOBEST063e05 GCAAATATTCTTCATCGTGATTGAAACTGGGGGAACTTGCTTATCAATGCTAACTGCGAT 103
TOBEST077e11 GCAAATATTCTTCATCGTGACTTGAAACCTGGGAACTTGCTTATCAATGCTAACTGCGAT 360
******************** * ** ******************************
TOBEST063e05 CTGAAGATATGTGACTTCGGGCTGGCACGCACGAGCAGTGGCAAGGACCAGTTTATGACT 163
TOBEST077e11 CTGAAGATATGTGACTTCGGTCTGGCACGCACGAGCAGTGGCAAGGACCAGTTTATGACT 420
******************** ***************************************
TOBEST063e05 GAATACGTTGTTACACGCTGGTATAGGGCTCCGGAACTTCTCCTTTGCTGTGACAACTAT 223
TOBEST077e11 GAATACGTTGTTACACGCTGGTATAGGGCTCCGGAACTCCTCCTTTGCTGTGACAACTAT 480
************************************** *********************
TOBEST063e05 GGAACATCTATTGACGTATGGTCTGTTGGTTGCATTTTCGCGGAGCTCTTAGGGAGGAAA 283
TOBEST077e11 GGAACATCGATTGACGTATGGTCTGTTGGTTGCATTTTCGCGGAGCTCTTAGGGAGGAAA 540
******** ***************************************************
TOBEST063e05 CCCGTCTTTCCAGGTACTGAATGCCTTAACCAACTTAAACTGATTATCAACATCCTTGGC 343
TOBEST077e11 CCCGTCTTTCCAGGTACTGAATGCCTTAACCAACTTAAACTGATTATCAACATCCTTGGC 600
************************************************************
TOBEST063e05 AGTCAGCGAGAAGAAGATATTGAATTTATCGATAACCCAAAGG-CGAGAAAGTACATCAA 402
TOBEST077e11 AGTCAGCGAGAAGAAGATATTGAATTTATCGATAACCCAAAGGGCGAGGAAGTACATCAA 660
******************************************* **** ***********
TOBEST063e05 ATCACTTCCATACTCTCCCGGAACACCCTTTTCCCGTCTCTATCCCCATGCTCATCCTTT 462
TOBEST077e11 ATCACTACCATACTCTCCCGGAACACCCTTTTCCCGTCTCTATCCCCATGCTCATCCTTT 720
****** *****************************************************
TOBEST063e05 AGCCATCGATCTCCTGCAGAGGATGCTTGTGTTTGACCCTTCAAAAAGAATTAGTGTTAT 522
TOBEST077e11 GGCCATCGATCTCCTGCAGAGAATGCTCGTGTTTGACCCTTCGAAAAGAATTAGTGTTAT 780
******************** ***** ************** *****************
TOBEST063e05 CGAAGCACTTCAACATCCATACATGTCTCCCTTGTATGATCCAAACACTGACCCCCCAGC 582
TOBEST077e11 CGAAGCACTTCAGCATCCATACATGTCCCCCTTGTATGATCCAAACACTGACCCCCCAGC 840
************ ************** ********************************
TOBEST063e05 GCAGGTTCCTATCAATCTTGACATAGATGAGGACTTAGGGGAAGAGACGATAAGGGAAAT 642
TOBEST077e11 GCAGGTTCCTATCAATCTTGACATAGATGAGGACTTAGGGGAAGAGACCATAAGGGAAAT 900
************************************************ ***********
TOBEST063e05 GATGTGGAAGGAAATACTTGAATACCATCCTGAAGCGGCCGC------------------ 684
TOBEST077e11 GATGTGGAACGAAATACTCGAATACCATCCTGAAGCGGCCTCAGCTGCTATGGAAGTTGT 960
********* ******** ********************* *
TOBEST063e05 ------------------------------------------------------------
TOBEST077e11 TCTATGAGCTGCTTCTTGAAAAGTTGTTGAGGTAATGTTAGAGCTTTTTGTAACTTATCT 1020
Figura 03: Alinhamento das sequências de nucleotídeos dos clones TOBEST063E05 e TOBEST077E11,
referentes ao cDNA da MAPK de Nicotiana tabacum. Stop codon destacado em cor cinza.
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