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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIA ANIMAL
Ana Janaina Jeanine Martins de Lemos
Respostas da interação blastocisto-endométrio, fertilidade, fígado,
rins e pulmões a doses subletais de formulações de inseticidas de
origem biológica e sintética
Recife
2010
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ANA JANAINA JEANINE MARTINS DE LEMOS
“Respostas da interação blastocisto-endométrio, fertilidade, fígado,
rins e pulmões a doses subletais de formulações de inseticidas de
origem biológica e sintética”
Dissertação apresentada ao Programa de
Biociência Animal da Universidade Federal
Rural de Pernambuco, como pré-requisito
para obtenção do grau de Mestre em
Biociência Animal. Área de Morfofisiologia.
Orientadora:
Profª. Drª. Valéria Wanderley Teixeira
Co-orientadores:
Prof. Dr. Álvaro Aguiar Coelho Teixeira
Prof. Dr. José Vargas de Oliveira
RECIFE
2010
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Ficha catalográfica
L557r Lemos, Ana Janaina Jeanine Martins de
Respostas da interação blastocísto-endométrio, fertilidade,
fígado, rins e pulmões a dose subletais de formulações de
inseticidas de origem biológica e sintética / Ana Janaina Jeanine
Martins de Lemos. -- 2010.
93 f. : il.
Orientadora: Valéria Warderley-Teixeira.
Dissertação (Mestrado em Biociência Animal) –
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de
Morfologia e Fisiologia, Recife, 2010.
Inclui referências e anexo.
1. Inseticida sintético 2. Bacillus thuringiensis
3. Reprodução 4. Histologia 5. Fertilidade 6. Rata I. Warderley-
Teixeira, Valéria, orientadora II. Título
CDD 591.824
ANA JANAINA JEANINE MARTINS DE LEMOS
“
Respostas da interação blastocisto-endométrio, fertilidade, fígado,
rins e pulmões a doses subletais de formulações de inseticidas de
origem biológica e sintética’’
Dissertação apresentada ao Programa de
Biociência Animal da Universidade Federal
Rural de Pernambuco, como pré-requisito para
obtenção do grau de Mestre em Biociência
Animal. Área de Morfofisiologia.
Aprovada em 25 de fevereiro de 2010.
BANCA EXAMINADORA:
___________________________________
Profª. Drª. Valéria Wanderley Teixeira (Orientadora) - UFRPE
___________________________________
Prof. Dr. Álvaro Aguiar Coelho Teixeira - UFRPE
___________________________________
Prof. Dr. Herbert Álvaro Abreu de Siqueira- UFRPE
___________________________________
Prof. Dr. Frederico Celso Lyra Maia - UFRPE
AGRADECIMENTOS
Agradeço, sobretudo, a Deus que sempre olhou por mim, por ter concedido
saúde e boa educação familiar, possibilitando a minha constante formação pessoal,
tendo desafios, decepções e alegrias, e reconhecendo todo meu esforço, me
abençoando, colocando em meu caminho as barreiras necessárias para que eu
buscasse pessoas maravilhosas que não hesitaram em me ajudar. Assim
construíram-se boas amizades as quais cultivarei sempre, com muita alegria;
Agradeço a minha família, em especial minha mãe Ana Cristina, por ter sido
sempre muito incentivadora de meus estudos e por ter me dado apoio e estímulo
nos momentos de maior dificuldade, ao meu namorado por ter me alegrado e
abdicado de finais de semana de festas, viagens, sempre muito compreensivo e à
Dona Anita e demais familiares por terem sempre acreditado em meu potencial;
À minha segunda mãe, “que a primeira não tenha ciúmes”, professora Valéria,
e ao professor Álvaro, meus orientadores, por terem sido sempre preocupados e
acolhedores, tendo firmeza e segurança na condução do meu caminho acadêmico, e
às vezes pessoal, fazendo com que eu produzisse com qualidade e estivesse
sempre me superando, melhorando e crescendo. Graças a vocês estou atingindo
meus objetivos e alcançando meus sonhos, serei eternamente grata por tudo,
principalmente pelo carinho, consideração e amizade;
À Universidade Federal Rural de Pernambuco, por ser uma extensão de
minha casa, ao Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal e todos os seus
professores componentes, por terem sido sempre atenciosos com seus alunos,
carinhosos, dispostos e prestativos, ao Departamento de Controle e Registro
Acadêmico (DRCA) por estar sempre com suas portas abertas;
Ao Programa Conexões de Saberes e à Pró-reitoria de Atividades de
Extensão por ter concedido bolsa acadêmica e por ter sido sempre compreensiva às
minhas prioridades, e por ter proporcionado experiências de trabalho fundamentais
ao meu crescimento pessoal quanto a valores e princípios morais, além de ter dado
a mim, convívio a pessoas maravilhosas, como os professores Alexandro Tenório e
João Moraes, e aos queridos Jacineide Arcanjo, Joseane Dourado, Thiago Sousa,
Cláudio Castro, João Gonçalves, Aldenise Curvelo, José Brito entre outros
integrantes do Programa;
Agradeço com muito respeito, carinho e admiração aos professores Gabriel
Rivas de Melo, (Departamento de Estatística e Informática), Frederico C. Lyra Maia
(Dep. de medicina Veterinária) e Herbert Álvaro A. de Siqueira (Dep. de Agronomia)
por terem sido sempre muito atenciosos e dispostos em vários momentos não
medindo esforços em ajudar;
Aos meus amigos do Laboratório da Área de Histologia pelo carinho e por
terem sempre proporcionado muita descontração, além de palavras de torcida, como
as ditas por Fernanda Silva, Franklin Magliano, Hilda Michelle, Thiago, Lílian, Ana
Cláudia, Paulo Estevão, dentre outros, as inesquecíveis, Andresa Oliveira, Raiana
Cabral, vocês são pessoas incríveis. Agradecimentos também a Marcos André pelo
auxilio com os animais do Biotério do DMFA e a todos do meu convívio que
interferiram direta ou indiretamente para o bom desenvolvimento de minhas
atividades acadêmicas.
RESUMO
A utilização de inseticidas microbianos, como uma alternativa ao uso de
inseticidas sintéticos vem sendo ampliada, devido à baixa persistência no ambiente
e a segurança aos organismos não-alvos, como mamíferos, pássaros, anfíbios e
répteis. Porém, experimentos revelaram que as toxinas protéicas da bactéria
Bacillus thuringiensis podem causar hipersensibilidade em alguns órgãos, como rins,
fígado e pulmões, além de interferirem de maneira diferente em ratos machos e
fêmeas. No entanto, são poucos os trabalhos que mostram os efeitos de doses
subletais de inseticidas sintéticos sobre o aparelho reprodutor feminino e
praticamente não há relatos sobre os efeitos dos inseticidas biológicos em
mamíferos, principalmente em relação à histofisiologia reprodutiva. Assim, resolveu-
se testar a hipótese se a administração dos inseticidas XenTari
®
WG (B.
thuringiensis subsp. Aizawai) e deltametrina (Decis
®
25CE), em concentrações que
não apresentem sinais clínicos de intoxicação materna, pode interferir na interação
blastocisto-endométrio e afetar órgãos maternos em ratas albinas. Foram utilizadas
70 ratas albinas, Rattus norvegicus albinus divididas aleatoriamente em 14 grupos
cada um constituído por cinco animais. Os animais foram submetidos a
concentrações subletais do inseticida sintético, nas doses de 1, 2 e 4mg/Kg de
deltametrina-(Decis
®
25CE) e do inseticida biológico nas doses de 18,5, 185 e
370mg/100g do XenTari
®
WG. Os resultados revelaram que as ratas submetidas às
maiores dosagens de ambos os inseticidas mostraram redução significativa do
número de sítios implantados, alterações histopatológicas nesses sítios,
caracterizadas pela presença de células trofoblásticas vacuolizadas, raros
citotrofoblastos, acentuado infiltrado leucocitário, degeneração da região da decídua,
além da presença de sangue no lúmen uterino. Histoquimicamente as decíduas
dessas ratas apresentaram-se mais fibrosas, principalmente nas ratas tratadas com
a maior dosagem do inseticida biológico. Nos órgãos maternos, observaram-se
alterações histopatológicas nos rins, principalmente deposição de hemossiderina,
necrose e degeneração vacuolar dos túbulos contorcidos e ductos coletores, além
de glomerulonefrite; no fígado, reação de células de Kupffer e degeneração vacuolar
dos hepatócitos; nos pulmões, peribronquiolite, perivasculite e pneumonia multifocal.
Dessa forma, conclui-se que doses subletais do inseticida XenTari
®
produz
alterações qualitativas e quantitativas na interação endométrio-blastocisto, e nos
órgãos maternos em ratas albinas, semelhantemente a doses subletais do inseticida
deltametrina, geralmente envolvendo processos inflamatórios, comprometendo
inclusive, o processo de implantação.
PALAVRAS-CHAVE: inseticida sintético; Bacillus thuringiensis; reprodução;
histopatologia; fertilidade, rata.
ABSTRACT
The use of microbial insecticides as an alternative to the use of synthetic
insecticides has been increased due to the low environmental persistence and
security to non-target organisms such as mammals, birds, amphibians and reptiles.
However, experiments showed that the protein toxins of the bacterium Bacillus
thuringiensis cause hypersensitivity in some organs such as kidneys, liver and lungs
and differently interfere in male and female rats. However, few studies have shown
the effects of sublethal doses of synthetic insecticides about female reproductive
system and almost no reports on the effects of biological insecticides in humans,
mainly related to reproductive histophysiologies. So, decided to test hypothesis
whether the administration of pesticides XenTari
®
WG (Bacillus thuringiensis subsp.
Aizawai) and deltamethrin (Decis
®
25CE), at concentrations that do not show clinical
signs of maternal intoxication, possibly interfere with blastocyst-endometrial
interaction and organs maternal albino rats. We used 70 albino rats, Rattus
norvegicus albinos randomly divided into 14 groups each consisting of five animals.
The animals were subjected to sublethal concentrations of synthetic insecticide, in
doses of 1, 2 and 4 mg/kg of deltamethrin-(Decis
®
25CE) and biological insecticide in
doses of 18.5, 185 and the 370mg/100g XenTari
®
WG. The results showed that the
rats undergone highest doses of both insecticides showed significant reduction in the
number and histopathological changes of sites deployed, characterized by the
presence of vacuolated trophoblast cells, cytotrophoblasts rare, leukocyte infiltration,
degeneration in the region decidua, and presence of blood in the uterine lumen.
Histochemically the uterus’ decidua rats showed more fibrous, especially in rats
treated with highest dosage of the biological insecticide. In the mother's organs were
observed histopathological changes in kidneys showing mainly hemosiderin
deposition, necrosis and vacuolar degeneration of convoluted tubules and collecting
ducts, and glomerulonephritis; liver, reaction of Kupffer cells and vacuolar
degeneration of hepatocytes; lung, peribronquiolite, perivasculitis and multifocal
pneumonia. Thus, it is concluded that sublethal doses of insecticide XenTari
®
produces qualitative and quantitative changes in endometrial-blastocyst interaction,
and maternal organs similarly to sublethal doses of deltamethrin, usually involving
inflammatory processes, including undermining the process of deployment albino
rats.
KEYWORDS: synthetic insecticide, Bacillus thuringiensis; reproduction;
histopathology; fertility; rat.
SUMÁRIO
Capítulos Pág.
INTRODUÇÃO........................................................................
11 1
REFERÊNCIAS.......................................................................
16
Resposta da interação blastocisto-endométrio em ratas
albinas frente a doses subletais de inseticidas biológico e
sintético ..................................................................................
20
RESUMO............................................................................... 20
INTRODUÇÃO........................................................................
21
MATERIAL E MÉTODOS........................................................
23
RESULTADOS........................................................................
26
DISCUSSÃO...........................................................................
28
2
REFERÊNCIAS.......................................................................
32
Toxicidade de doses subletais do Bacillus thuringiensis
subsp. Aizawai e do inseticida deltametrina sobre a
fertilidade e órgãos de ratas albinas prenhas......................... 43
RESUMO................................................................................ 43
INTRODUÇÃO........................................................................
44
MATERIAIS E MÉTODOS...................................................... 46
RESULTADOS........................................................................
48
DISCUSSÃO...........................................................................
50
REFERÊNCIAS.......................................................................
56
ANEXOS................................................................................. 67
3
(Norma da Placenta, ISSN:
0143-4004)
(Norma da Clinica Chimica Acta, ISSN:0009-8981)
11
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
Dentre os vários inseticidas sintéticos atualmente utilizados, podem-se
citar os piretróides, os organofosforados e os carbamatos. São compostos
lipofílicos amplamente utilizados no controle de pragas agrícolas e de interesse
médico-veterinário. A exposição a esses produtos se dá pelos alimentos
contaminados com resíduos tóxicos e, ainda, pela absorção dérmica e
respiratória (CANTARUTTI, 2005).
Por serem considerados menos tóxicos para o homem que os inseticidas
organoclorados e organofosforados, os piretróides têm múltiplas funções de
uso na agricultura, na medicina veterinária, no controle de pragas domésticas e
na saúde pública, principalmente para controle de vetores (BARLOW et al.,
2001). Os piretróides pertencem a um grupo de inseticidas considerado
moderno, pouco tóxico ao homem e muito eficiente no controle dos insetos.
Tem notável efeito repelente o que inviabiliza, de certo modo, o seu uso na
forma de isca (BOTTON, 2000).
Baseado na estrutura química e nos sinais e sintomas de intoxicação em
animais, os piretróides sintéticos podem ser divididos em duas classes:
piretróides do tipo I e do tipo II (WHO, 1990; RAY; FRY 2006). Em ratos, os
compostos do tipo I provocam um quadro de agressividade, prostração,
incoordenação e tremores, conhecido como “Síndrome T”. Os piretróides do
tipo II provocam movimentos irregulares dos membros, contorções, salivações
profusas e convulsões, que caracterizam a “Síndrome CS” (ECOBICHON,
1996; BURR; RAY 2004; ANADÓN et al., 2006).
Reys (2001) detalhou os efeitos de alguns inseticidas e mencionou que a
deltametrina (piretróide do tipo II) teve efeito na função placentária e
desregulou os anti-androgênicos. Braguini (2005) administrando doses de 0;
1,0; 2,0; e 4,0mg/kg de deltametrina em ratos verificaram uma diminuição do
consumo de oxigênio nas mitocôndrias hepáticas e interferência no potencial
elétrico da membrana desta organela. Já Andrade et al. (2002) observaram que
12
doses de 4,0mg/kg de deltametrina em ratos causa em machos adultos
redução do peso do testículo, epidídimo e da produção espermática.
Existem também vários trabalhos de avaliação de risco tóxico de alguns
inseticidas ao homem e toxicidade (hepatotoxicidade, carcinogênese, mutação)
em ratos e outros animais (CALDAS; SOUZA 2000; CASTILLO et al., 2002;
ANDERSEN et al., 2002); também foram mencionadas anormalidades ligadas
ao sistema reprodutivo, em seres humanos, como aumento do número de
casos de abortos, redução da libido, prejuízos na produção espermática,
impotência, assim como maior incidência de tumores de testículo, próstata e
mama (BAKER, 2001; SULTAN et al., 2001; GARRY et al., 2002).
Além dos inseticidas químicos empregados, o controle biológico tem
assumido importância cada vez maior, devido à ênfase que vem sendo dada
para a redução do uso de agrotóxico. Isto tem sido motivado por fatores
econômicos que pressionam as indústrias, e pela preocupação do público em
geral quanto aos efeitos danosos que alguns agrotóxicos têm apresentado
(CAPALBO, 1998).
Dentre os microorganismos utilizados no controle biológico estão os
fungos, bactérias e vírus, que podem ser cultivados em laboratório ou em
escala industrial, já havendo disponibilidade de algumas formulações
comerciais (BARRETO, 2005), como as à base da bactéria Bacillus
thuringiensis (Bt), a qual é obtida através de processos fermentativos
controlados em grande escala (MOINO JUNIOR, 2003).
B. thuringiensis é uma bactéria gram-positiva, aeróbia e formadora de
esporos (ARONSON, 1994). Durante a fase de esporulação, sintetiza δ-
endotoxinas que são depositadas como inclusões intracelulares de geometria
diversa e que são potencialmente tóxicas para mais de 18 espécies de insetos
de importância agrícola (AUDTHO et al., 1999). Seu uso como bioinseticida
tem várias vantagens, como a possibilidade de mesclar cepas com δ-
endotoxinas que reconhecem receptores diferentes, e desta forma, a
probabilidade de seleção de populações resistentes em curto prazo diminui,
consideravelmente (SIVASUPRAMANIAM et al., 2000). Além disso, essa
bactéria vem sendo utilizada para controle de larvas de insetos vetores em
13
áreas de mananciais (BOISVERT; BOISVERT, 2000; ÖSTMAN; LUNDSTRÖM;
PERSSON VINNERSTEN, 2008; TILQUIN et al., 2008)
O Bt tem como principal característica a produção de cristais inseticidas
durante sua esporulação. Estes cristais são compostos por uma ou várias
proteínas Cry ou Insecticidal Crystal Proteins (ICPs), codificadas por diferentes
genes, os quais conferem ação tóxica de Bt (δ-endotoxinas) a insetos de
diversas ordens, principalmente Lepidoptera, há mais de 40 anos, e mais
recentemente no controle de Diptera e Coleoptera. Tais proteínas são
altamente tóxicas e específicas e por isso, inócuas para a maioria de outros
organismos, incluindo insetos benéficos (HERRERO; OPPERT; FERRÉ 2001;
SIEGEL, 2001; RAMOS et al., 2006).
Estudos realizados por vários autores utilizando essa bactéria resultaram
em efeitos negativos em relação à toxicidade a ratos, coelhos e ovelhas
(SIEGEL, 2001; MEHER et al., 2002; WILCKS et al., 2006), além de não
provocar alterações na mucosa vaginal durante o ciclo estral (FIERROS;
ORDÓNEZ; MORALES 2002). Porém, quando analisado mais especificamente,
em outros experimentos, foram observadas alterações dos níveis antigênicos
no sistema imune, através do método de estudo imunoenzimático, Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) (VÁZQUEZ-PADRÓN et al., 2000;
CALDERÓN et al., 2007). Além disso, segundo Jung et al. (2006), a toxina Bt
também possui atividade citocida sobre algumas células cancerígenas
humanas.
Dados recentes mostraram que o Brasil ultrapassou a Argentina como o
segundo maior produtor mundial de culturas transgênicas. Um impressionante
crescimento de 5,6 milhões de hectares para 21,4 milhões de hectares, um
aumento de 35% em relação a 2008 (PARR, 2010).
A principal forma de contaminação por agrotóxicos é a ocupacional, que
se caracteriza pela contaminação dos trabalhadores que manipulam essas
substâncias. Esta contaminação é observada tanto no processo de formulação
(mistura e/ou diluição dos agrotóxicos para uso), quanto no processo de
utilização (pulverização, auxílio na condução das mangueiras dos
14
Dipel® WG-ABBOTT LABORATORIES North Chicago/U.S.A., Empresa Sumitomo
chemical do Brasil representações LTDA. Bacillus thuringiensis Kurstaki.
Decis
®
25 CE- BAYER S.A. São Paulo/SP - 18.459.628/0001-15- IUPAC: (S)-alpha-cyano-3-
phenoxybenzyl (1R,3R)-3-(2,2-dibromovinyl)-2,2- dimethylcyclopropanecarboxylate.
XenTari
®
WG- ABBOTT LABORATORIES North Chicago/U.S.A., Empresa Sumitomo
chemical do Brasil representações LTDA. Bacillus thuringiensis Aizawai.
pulverizadores e descarte de resíduos e embalagens contaminadas (MOREIRA
et al. 2002).
No Brasil o número de trabalhadores rurais que estão potencialmente
expostos aos inseticidas sintéticos e biológicos é bastante expressivo
(GARCIA; ALMEIDA 1991). Destes, a maioria pode se contaminar diretamente
com alimentos contendo resíduos desses inseticidas. Além disso, pode haver
intoxicações agudas e crônicas, através de contaminação de abastecimentos
de água potável para consumo humano e animal, de rios, lagos e açudes, do
leite materno e de vaca, de frutas, legumes e grãos (ARÃO, 2009). Além disso,
durante a gravidez, a comunicação materno-fetal placentária pode levar
resíduos de agrotóxicos aos tecidos fetais, pois a mesma possui células
endócrinas que secretam hormônios esteróides e peptídicos, os quais são
responsáveis pela sustentação e desenvolvimento fetal, além de manter a
comunicação de nutrientes e dejetos entre a mãe e o feto (BAISDEN et al.,
2007). A mão-de-obra feminina constitui, aproximadamente, 60% do total da
mão-de-obra utilizada na produção de diversas culturas (BRANCO;
VAINSENCHER 2001), o que leva ao aumento da exposição aos agrotóxicos.
Atualmente existem nove produtos formulados à base de Bt. Destes, as
formulações comerciais Dipel
®
WG e XenTari
®
WG pertencem à classe
toxicológica II (altamente tóxico), enquanto que a formulação comercial
Deltametrina (Decis
®
25 CE) pertence à classe toxicológica III (AGROFIT,
2007). As características de solubilidade dos piretróides facilitam a excreção de
substâncias pelo leite e a passagem pela barreira placentária, favorecendo a
exposição desses produtos no período perinatal. Assim, a exposição do
neonato ao inseticida em concentrações que não apresentem sinais clínicos de
intoxicação sistêmica materna, pode causar danos no indivíduo em
desenvolvimento (CANTARUTTI, 2005). No entanto, são poucos os trabalhos
que mostram os efeitos de doses subletais de inseticidas sintéticos sobre o
aparelho reprodutor feminino e praticamente não há relatos sobre os efeitos
dos inseticidas biológicos em humanos, principalmente em relação à
15
histofisiologia reprodutiva. Assim resolvemos testar a hipótese se a
administração dos inseticidas XenTari
®
WG (B. thuringiensis subsp. Aizawai) e
deltametrina (Decis
®
25CE), em concentrações que não apresentem sinais
clínicos de intoxicação materna, pode interferir na interação blastocisto-
endométrio e afetar órgãos maternos em ratas albinas.
16
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20
CAPÍTULO II
Resposta da interação blastocisto-endométrio em ratas albinas frente a doses subletais
de inseticidas biológico e sintético
A.J.J.M. Lemos
a
; V. Wanderley-Teixeira
a
*; Á.A.C. Teixeira
a
; F.C.A. Silva
a
; J.V.
Oliveira
b
; H.Á.A. Siqueira
b
a
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal,Universidade Federal Rural de
Pernambuco – Recife, Brasil
b
Departmento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco – Recife,
Brasil
*Autor para correspondência. UFRPE-DMFA. Av. Dom Manoel de Medeiros s/n Dois
Irmãos-Recife-PE-Brazil. CEP 52171-900. Tel. +55 81 33206389
E-mail: [email protected] (V. Wanderey-Teixeira)
RESUMO
Visando elucidar os efeitos de doses subletais de inseticidas biológico e químico
sobre a histofisiologia reprodutiva em mamíferos, testou-se a hipótese dos inseticidas
XenTari
®
e deltametrina (Decis
®
25CE), administrados em concentrações que não
apresentem sinais clínicos de intoxicação materna, poderem interferir na interação
blastocisto-endométrio em ratas albinas, utilizando-se parâmetros morfológicos,
histoquímicos e morfométricos. Utilizaram-se 35 ratas albinas, submetidas a doses
21
subletais dos inseticidas XenTari
®
(18,5; 185 e 370mg/100g) e deltametrina (1, 2 e
4mg/Kg). Os inseticidas foram administrados por gavagem, em doses diárias, e as ratas
sacrificadas no sétimo dia de prenhez. As ratas submetidas às maiores dosagens dos
inseticidas mostraram redução significativa do número de sítios implantados e
alterações histopatológicas nos sítios, caracterizadas por células trofoblásticas
vacuolizadas, raros citotrofoblastos, acentuado infiltrado leucocitário e sangue no lúmen
uterino. As decíduas apresentaram-se mais fibrosas, principalmente nas ratas tratadas
com a maior dosagem do inseticida XenTari
®
. Verificou-se aumento da vascularização
nos sítios das ratas submetidas à maior dosagem de deltametrina. Assim, conclui-se que
dose de 370mg/100g do inseticida XenTari
®
produz alterações qualitativas e
quantitativas na interação endométrio-blastocisto em ratas, semelhantemente a dose de
4mg/Kg do inseticida deltametrina, comprometendo o processo de implantação.
Palavras-chave: inseticidas, sítio de implantação, prenhez, rata, histoquímica,
morfometria.
1. Introdução
A deltametrina, composto pertencente aos piretróides do tipo II, é amplamente
utilizada tanto no controle de pragas agrícolas quanto de interesse médico-veterinário e
na saúde pública. Porém, em casos de intoxicação ocasiona sintomas como contorções,
salivações e convulsões, sintomas estes conhecidos como “Síndrome CS” [1-3].
Devido à crescente preocupação com a contaminação ambiental e deposição de
substâncias prejudiciais aos seres vivos destes produtos, atualmente várias pesquisas
têm enfatizado a utilização de substâncias sintéticas com o emprego de produtos de
22
origem biológica. Dentre os microorganismos utilizados no controle biológico estão os
fungos, bactérias e vírus, que podem ser cultivados em laboratório ou em escala
industrial, já havendo disponibilidade de algumas formulações comerciais [4], como o
Bacillus thuringiensis (Bt) (Berliner, 1909), o qual é obtido através de processos
fermentativos controlados em grande escala [5,6].
No Brasil o número de trabalhadores rurais que estão potencialmente expostos aos
inseticidas é bastante expressivo [7]. Destes, a maioria pode se contaminar diretamente
com alimentos contendo resíduos de inseticidas. Além disso, pode haver intoxicações
agudas e crônicas, através de contaminação de abastecimentos de água potável para
consumo humano e animal, de rios, lagos e açudes, do leite materno e de vaca, de frutas,
legumes, grãos e carnes.
A mão-de-obra feminina constitui, aproximadamente, 60% do total de
trabalhadores utilizados na produção de diversas culturas, entre as quais, a uva, a
acerola e o tomate [8], o que leva ao aumento da exposição aos agrotóxicos. Durante a
gravidez, a comunicação materno-fetal placentária pode levar resíduos de agrotóxicos
aos tecidos fetais. Assim, a exposição do feto aos inseticidas em concentrações que não
apresentem sinais clínicos de intoxicação sistêmica materna, pode causar danos no seu
desenvolvimento [9-11].
Estudos mostraram uma relação entre alterações do nível de hormônios sexuais e
a quantidade de substâncias piretróides eliminadas pela urina de homens com algum
tipo de infertilidade [12,13]. Já Andrade et al.[14] observaram que doses de 4,0mg/kg
de deltametrina em ratos machos adultos causa redução do peso do testículo, epidídimo
e da produção espermática. Quanto ao produto de origem biológica, Vázquez-Padrón et
al. [15] e Calderón et al. [16] relataram alterações dos níveis antigênicos no sistema
23
imune em ratos, após administração da toxina Bt Cry1Ac, na dosagem de 100µg/Kg,
por via intragástrica, e da toxina Bt p 130, nas dosagens de 0,1 a 2,5 mg/Kg, por via
intraperitoneal. Porém, poucos trabalhos tratam da avaliação dos efeitos desses produtos
sobre o sistema reprodutor feminino.
Visando elucidar os possíveis efeitos de doses subletais de inseticidas biológico
e químico sobre a histofisiologia reprodutiva em mamíferos, a presente pesquisa testou
a hipótese se a administração dos inseticidas XenTari
®
WG (B. thuringiensis subsp.
Aizawai) e deltametrina (Decis
®
25CE), em concentrações que não apresentem sinais
clínicos de intoxicação materna, pode interferir na interação blastocisto-endométrio em
ratas albinas, utilizando-se parâmetros morfológicos, histoquímicos e morfométricos.
2. Material e métodos
O experimento foi realizado no Laboratório de Histologia do Departamento de
Morfologia e Fisiologia Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco.
2.1 Animais
Foram utilizadas 35 ratas albinas Rattus norvegicus albinus com 90 dias de
idade, virgens, pesando aproximadamente 200g, da linhagem Wistar, procedentes do
Biotério do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da UFRPE.
Os animais foram mantidos em gaiolas com alimentação e água “ad libitum”, na
temperatura de 22°C e iluminação artificial que estabeleceram o fotoperíodo de 12
horas claro e 12 horas escuro, considerando o período de luz das 06:00 às 18:00 horas.
Após um período de adaptação, foram colhidos esfregaços vaginais para a determinação
24
do ciclo estral. Os animais que apresentaram três ciclos estrais regulares foram
acasalados e divididos nos seguintes grupos:
Grupo I - ratas prenhas que receberam placebo e sacrificadas no 7º dia de
prenhez, para análise dos sítios de implantação. (controle).
Grupo II - ratas prenhas que receberam 18,5mg de XenTari
®
WG(1mg de toxina
protéica)/100g e sacrificadas no 7º dia de prenhez, para análise dos sítios de
implantação.
Grupo III - ratas prenhas que receberam 185mg de XenTari
®
WG (10mg de
toxina protéica)/100g e sacrificadas no 7º dia de prenhez, para análise dos sítios de
implantação.
Grupo IV - ratas prenhas que receberam 370mg de XenTari
®
WG (20mg de
toxina protéica)/100g e sacrificadas no 7º dia de prenhez, para análise dos sítios de
implantação.
Grupo V - ratas prenhas que receberam 1,0mg de deltametrina (0,4ml de Decis
®
25CE)/kg e sacrificadas no 7º dia de prenhez, para análise dos sítios de implantação.
Grupo VI - ratas prenhas que receberam 2,0mg de deltametrina (0,8ml de Decis
®
25CE)/kg e sacrificadas no 7º dia de prenhez, para análise dos sítios de implantação.
Grupo VII - ratas prenhas que receberam 4,0mg de deltametrina (1,6ml de
Decis
®
25CE)/kg e sacrificadas no 7º dia de prenhez, para análise dos sítios de
implantação.
2.2 Administração dos inseticidas
Os inseticidas XenTari
®
WG e deltametrina (Decis
®
25CE) foram administrados
por via oral (gavagem), a partir da confirmação do acasalamento, em doses diárias, de
25
T-61
®
- Intervet Internacional – Schering-Plough Animal Health GmbH Wiesbaden/ Germany
acordo com a metodologia modificada de Shaban et al. [17] para o inseticida biológico,
e de Andrade et al. [14] para o inseticida sintético. As ratas foram pesadas diariamente
através do uso de uma balança digital, desde o primeiro dia de confirmação de
acasalamento até o sétimo dia gestacional, para observação do ganho de peso e para
conversão da medida proporcional da dosagem dos inseticidas.
2.3 Coleta dos sítios de implantação e histoquímica
Ao final do experimento as fêmeas de todos os grupos foram anestesiadas com
hidrocloridrato de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (6 mg/kg), por via intramuscular no
sétimo dia de prenhez. Após a coleta do material, os animais sofreram eutanásia
utilizando-se o T-61
®
, sendo administrado 0,2 mL/Kg, por via intravenosa. Os cornos
uterinos contendo os sítios de implantação foram coletados e mergulhados
imediatamente em líquido de Boüin, permanecendo no mesmo por 48 horas.
Posteriormente os cornos uterinos foram observados em uma lupa para contagem dos
sítios de implantação, utilizando-se como referência às áreas dilatadas apresentadas
pelos mesmos. Após esses procedimentos, os sítios de implantação foram processados
para inclusão em parafina e os cortes submetidos à técnica de coloração pela
Hematoxilina - Eosina (H. E.) e pelo Tricrômico de Mallory.
2.4 Análise morfométrica
Para quantificação da vascularização na região do sítio de implantação, utilizou-se
um retículo de 121 pontos de intersecção (Marca Olympus, modelo U-OCMSQ10/10)
acoplado a uma ocular de 10X e analisado com objetiva de 40X. Utilizaram-se cinco
lâminas de cada grupo, onde foram escolhidos dez campos aleatórios, perfazendo um
26
total de 1.210 pontos por sítio de implantação, sendo contados os pontos que incidiram
sobre o lúmen e parede dos vasos.
2.5 Análises estatísticas
Os dados obtidos do peso materno, número de sítios de implantação e da
morfometria da vascularização foram submetidos ao teste não paramétrico de Kruskal-
Wallis, onde as médias foram comparadas pelo teste de Wilcoxon-Mann-Whitney, a
95% de significância.
3. Resultados
3.1 Contagem dos sítios de implantação
A análise estatística do número de sítios de implantação dos grupos
experimentais revelou que tanto o inseticida biológico como o sintético diferiu
significativamente do grupo controle nas maiores dosagens administradas. Verificou-se
ainda uma diferença significativa entre a menor (grupo V) e a maior dosagem (grupo
VII) do inseticida sintético (Tabela 1).
3.2 Histopatologia e histoquímica
Os sítios de implantação nas ratas do grupo controle apresentaram-se totalmente
inseridos na parede do útero. Histologicamente esses sítios mostraram-se constituídos
por trofoblastos, alguns com atividade mitótica, citotrofoblastos poliplóides e rica
vascularização. O epitélio luminal apresentou-se característico do tipo simples colunar e
na decídua foram visualizadas várias glândulas endometriais (Figuras 1A, 1B, 1C, 1D e
27
1E). As doses de 18,5 e 185mg/100g do inseticida biológico, bem como a dosagem de
1mg/Kg do inseticida sintético não ocasionaram alterações histológicas nos sítios e
decídua (Figuras 1F, 2A e 2B). No entanto na dosagem 2mg/Kg do inseticida sintético
verificou-se a presença de infiltrado leucocitário na região do sítio de implantação
(Figura 2C). Alterações histológicas significativas foram visualizadas nas dosagens de
370mg/100g do inseticida biológico (Figuras 2D, 2E e 2F) e 4mg/Kg do inseticida
sintético (Figuras 3A, 3B e 3C), caracterizadas pela presença de células trofoblásticas
vacuolizadas, raros citotrofoblastos, grande quantidade de vasos sanguíneos, alguns
com acentuado infiltrado leucocitário, degeneração da região da decídua, além da
presença de sangue no lúmen uterino. A coloração pelo tricrômico de Mallory produziu
reação variada na decídua dos grupos experimentais, sendo caracterizadas como pouco,
moderada e muito fibrosa nos grupos I, VII e IV, respectivamente (Figuras 3D, 3E e
3F).
3.3 Aferição do peso dos animais
Estatisticamente não houve diferenças significativas no peso das ratas dos
grupos experimentais (Tabela 2).
3.4 Análise morfométrica
As doses subletais dos inseticidas biológico e sintético não interferiram no
número de vasos sanguíneos dos sítios de implantação dos grupos experimentais
(P>0,05) (Tabela 3).
28
4. Discussão
Embora seja conhecido que os piretróides apresentem características de
solubilidade que facilitam a excreção de substâncias pelo leite e a passagem pela
barreira placentária, favorecendo a exposição desses produtos no período perinatal,
verificou-se na presente pesquisa que dose sub-letal de 2mg/Kg de deltametrina, uma
concentração que não apresenta sinais clínicos de intoxicação sistêmica materna, já
ocasionou o surgimento de áreas com infiltrados leucocitários na região dos sítios, o que
corrobora com relatos de Righi et al. [19] que administrando doses de 1 a 3 mg/Kg do
piretróide cialotrina, por gavagem, em ratos, observaram alterações das células do
sistema imunológico nos níveis plasmáticos. No entanto, alterações histopatológicas
drásticas nos sítios de implantação e redução do número desses sítios foram observadas
com a dose sub-letal de 4mg/Kg.
Resultado ainda mais expressivo foi o observado para o inseticida biológico, pois
várias pesquisas têm revelado efeitos negativos de B. thuringiensis em relação à
toxicidade a ratos, coelhos e ovelhas [20-22], e que essa bactéria não provoca alterações
na mucosa vaginal durante o ciclo estral [23]. Porém, os resultados revelaram que dose
subletal de 370mg/100g do inseticida biológico XenTari
®
, ocasionou alterações
histopatológicas também significativas nos sítios de implantação, bem como reduziu o
seu número semelhantemente ao ocorrido com o inseticida sintético.
Na região dos sítios bem como na luz dos vasos sanguíneos foram visualizados
infiltrados leucocitários, além de vacuolizações citoplasmáticas e degeneração.
Histoquimicamente verificou-se que a região da decídua nas ratas que receberam as
maiores dosagens dos inseticidas biológico e sintético apresentou-se mais fibrosa,
principalmente nas ratas que receberam administração do inseticida biológico o que
29
pode ter reduzido a comunicação célula-célula, alterando a distribuição de nutrientes e
fatores de desenvolvimento, além de interferirem na mobilidade celular, pela interação e
resistência das fibras levando a uma rigidez do tecido, sugerindo que estas alterações
impossibilitou a aderência e fixação do embrião, reduzindo assim, a capacidade de
implantação nestas ratas pela redução da receptividade do endométrio, pois não foram
observados locais de reabsorções. Outras duas hipóteses que poderiam justificar a
redução do número dos sítios seriam: 1. Redução da ingestão de alimento em
decorrência da administração diária dos inseticidas, porém não houve alterações
significativas no peso ponderal das ratas durante o período da administração e 2. A
capacidade, no caso dos inseticidas piretróides do tipo II, de agirem sobre o sistema
reprodutor feminino, alterando o eixo hipotalâmico-hipófise-adrenal (H-H-A) e
hormônios corticosteróides e sexuais, que estão envolvidos diretamente com a
morfofisiologia do sistema reprodutor [24-26]. Sabe-se também, que o inseticida
biológico age na fisiologia de animais machos e fêmeas, e que estas toxinas causam
alterações nos níveis dos hormônios sexuais, tanto com organismos geneticamente
modificados, quanto com aplicação direta da pró-toxina Bt [23,27].
As alterações histopatológicas mostram claramente que o inseticida biológico se
comporta semelhantemente a administração da toxina Cry1Ac, pois de acordo com
Vázquez-Padrón et al. [28] and Calderón et al. [16] alterações dos níveis antigênicos no
sistema imune em ratos, foram visualizados após administração da dosagem de
100µg/Kg, por via intragástrica da toxina Bt Cry1Ac, e da toxina Bt p 130, nas dosagens
de 0,1 a 2,5 mg/Kg, por via intraperitoneal. Também foi relatado estresse oxidativo, que
caracteriza-se pelo acúmulo de radicais livres, os quais danificam a célula, levando a
alterações do sistema imunológico e degeneração, quando administrado via
30
intraperitoneal ou oral, do inseticida biológico Dipel
®
, a base de B. thuringiensis, ou
proteínas tóxicas de Bt [17,29], que produziu alterações semelhantes às da presente
pesquisa.
No caso dos piretróides do tipo II, existem relatos quanto à capacidade de
alterarem o funcionamento do transporte e permeabilidade de membranas, levando a
uma ação imediata das células de defesa, tanto nos tecidos quanto a níveis plasmáticos
[19,30]. Interferem também nos canais protéicos de sódio, magnésio e cálcio, além de
induzirem a ativação de algumas subfamílias do citocromo P
450
, que têm função de
defesa contra toxinas, principalmente nas mitocôndrias e retículo endoplasmático liso
das células de órgãos de defesa, além de interferirem no funcionamento das esterases e
oxidases, e estarem envolvidos na síntese de esteróides, alterando a fisiologia hormonal
do desenvolvimento reprodutivo [31-34]. Estas alterações na fisiologia da membrana
podem levar a formação de vacúolos citoplasmáticos e conseqüente degeneração como
foi percebido na presente pesquisa, pois, o aumento da vacuolização é uma
manifestação comum de degeneração celular [35,36]. Além disso, procedimentos
experimentais mostraram que estes inseticidas sintéticos levam a alteração da expressão
da proteína P53, a qual está diretamente relacionada a apoptose [37,38]. Alterações
semelhantes também foram observadas por Khan et al. [39], que após imergirem cabras
diariamente em piretróide cipermetrina, nas concentrações de 0,0% a 1,6% por 1 a 2
minutos durante 75 dias, observaram diferenças altamente significativas nos hepatócitos
quando comparadas ao grupo controle.
A capacidade do B. thuringiensis de interferir na matriz extracelular foi
mencionada por Tsai et al. [29] e Tsai et al. [40] que administraram a bactéria Bt HD-
199 subespécie Darmstadiensis, na dose de 3,2 mg/Kg via intratraqueal em ratos,
31
verificando estresse oxidativo, depósito de colágeno, além do aumento da reação de
interleucinas 1-β (IL-1β), dos níveis do fator de necrose tumoral α (TNF-α) e aumento
da fibronectina. Estas reações induzidas pela proteína Bt levaram ao aumento da
presença de colágeno na região antimesometrial, a qual é constituída por células que
mantém características estruturais e ultra-estruturais de um fibroblasto comum, sendo
estimuladas pelo TNF-α e interleucinas IL1-α e IL1-β, que são elevadas pela bactéria
em questão, resultando em diferenças nos volumes nucleares e compartimentos
citoplasmáticos, e conseqüente aumento da sua principal função, a síntese de colágeno
[41]. Erdogan et al. [42] evidenciaram aumento de fibras colágenas no estroma de
pulmão de ratos, utilizando spray em aerossol de deltametrina diluída nas doses de 6 e
12mg/m³ por 30 minutos diários durante 45 dias, além de outros efeitos, como
acumulação de macrófagos espumosos e focos de hemorragia.
Apenas nas ratas que receberam a maior dosagem de deltametrina, grupo VII, foi
observado presença de sangue no lúmen uterino, indicando um processo hemorrágico.
Porém, quando analisado morfometricamente, o número de vasos sanguíneos, não
diferiu estatisticamente entre os grupos experimentais. Em experimentos com ratos
tratados com cipermetrina na dosagem de 14,5mg/Kg e deltametrina na dosagem
15mg/Kg mostraram inchaço gastrointestinal acompanhado de hemorragia e congestão
de vasos sanguíneos em vários órgãos [43,44]. Isto mostra um agravante quanto ao uso
de doses subletais de inseticidas piretróides, os quais além de levarem a uma reação
tóxico-inflamatória, levam a processos hemorrágicos, sendo então, mais um fator que
pode levar à redução de implantações embrionárias durante a concepção.
Em conclusão, o inseticida biológico na dose subletal de 370mg/100g (XenTari
®
WG, B. thuringiensis subsp. Aizawai) produz alterações qualitativas e quantitativas na
32
interação endométrio-blastocisto em ratas albinas, semelhantemente a dose subletal de
4mg/Kg do inseticida sintético deltametrina (Decis
®
25CE), comprometendo assim, o
processo de implantação.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os participantes, sem os quais este trabalho não seria
possível.
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38
Tabela 1
Média (± desvio padrão) do número de sítios de implantação dos grupos experimentais.
Grupos GL N *Média F
P
6 4,004
0,0051
G I- 5
14,0 ± 1,58a
G II 5
11,2 ± 0,83abc
G III 5
11,2 ± 2,28abc
G IV 5
9,4 ± 1,14bc
G V 5
13,0 ± 1,23ab
G VI 5
11,6 ± 1,14abc
G VII 5
8,20 ± 4,71c
*Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
Wilcoxon-Mann-Whitney (P>0,05). Número de repetições por tratamento (N); Grau de
liberdade (GL).
Tabela 2
Média (± desvio padrão) do peso das ratas (g) dos grupos experimentais.
Grupos GL N *Média F
P
6 9,804
0,1331
G I- 5
258,70 ± 3,80a
G II 5
256,30 ± 5,49a
G III 5
257,10 ± 6,27a
G IV 5
261,90 ± 6,12a
G V 5
259,50 ± 6,79a
G VI 5
258,90 ± 7,23a
G VII 5
261,40 ± 8,78a
*Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
Wilcoxon-Mann-Whitney (P>0,05). Número de repetições por tratamento (N); Grau de
liberdade (GL).
39
Tabela 3
*Médias (± desvio padrão) do número de vasos sanguíneos nos sítios de implantação
dos grupos experimentais.
Grupos GL N *Média F
P
6 9,361
0,1543
G I- 5
58,16 ± 1,59a
G II 5
55,82 ± 2,47a
G III 5
57,22 ± 4,10a
G IV 5
61,60 ± 2,10a
G V 5
59,46 ± 2,50a
G VI 5
57,70 ± 1,88a
G VII 5
59,04 ± 5,28a
*Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
Wilcoxon-Mann-Whitney (P>0,05). Número de repetições por tratamento (N); Grau de
liberdade (GL).
40
Figura 1: A) Sítio de implantação (*) de ratas do grupo controle totalmente inserido na
parede do útero. H.E. ± 42X. B) Trofoblasto em mitose (ponta de seta) e citotrofoblasto
poliplóide (seta). H.E ± 428X. C) Vasos sanguíneos (setas). H.E. ± 107X. D) Epitélio
luminal (seta). H.E ± 428X. E) Glândulas endometriais (setas). H.E ± 428X. F) Sítio de
implantação (*) de ratas tratadas com 18,5mg/100g do inseticida biológico XenTari
®
.
H.E. ± 42X.
*
A
B
C
D
E F
*
41
A
*
*
B
C
*
*
D
E F
Figura 2: A) Sítio de implantação (*) de ratas tratadas com 185mg/100g de XenTari.
H.E. ± 42X. B) Sítio de implantação (*) de ratas tratadas com 1mg/Kg de deltametrina.
H.E. ± 42X. C) Infiltrado leucocitário em vaso do sítio em rata tratada com 2mg/Kg de
deltametrina. H.E. ± 428X. D) Trofoblastos vacuolizados (*) e citotrofoblasto (seta) em
rata tratada com 370mg/100g de XenTari. H.E. ± 428X. E) Vasos sanguíneos com
discreto infiltrado leucocitário, tratamento com 370mg/100g de XenTari. H.E. ± 107X.
F) Degeneração decidual em rata tratada com 370mg/100g de XenTari. H.E. ± 107X.
42
Figura 3: A) Infiltrado leucocitário (setas), B) Degeneração decidual (*) e C) Lúmen
uterino com sangue (seta) em rata tratada 4mg/Kg de deltametrina. H.E. ± 107, 428 e
428X respectivamente. D) decídua (DE) pouco fibrosa grupo controle. Tricrômico de
Mallory. ± 42X. E) decídua (DE) muito fibrosa em rata tratada com 370mg/100g de
XenTari. Tricrômico de Mallory. ± 42X. F) decídua (DE) moderadamente fibrosa em
rata tratada com 4mg/Kg de deltametrina.Tricrômico de Mallory. ± 42X.
A
C
B
*
*
*
D
D
E
E
D
E
F
D
E
43
CAPÍTULO III
Toxicidade de doses subletais do Bacillus thuringiensis subsp. Aizawai e do inseticida
deltametrina sobre a fertilidade e órgãos de ratas albinas prenhas
Ana J. J. M. Lemos
a
; Herbert A. A. Siqueira
b
; Valéria Wanderley-Teixeira
c
*; Frederico
C.L.Maia
d
; Álvaro A. C. Teixeira
c
; Edson J. Silva
c
; José V. Oliveira
b
a
Mestranda do Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, Departamento de
Morfologia e Fisiologia Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco -
UFRPE- Brasil.
b
Professores do Departamento de Agronomia - UFRPE- Brasil.
c
Professores do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal - UFRPE- Brasil.
d
Professor do Departamento de Medicina Veterinária - UFRPE- Brasil.
Palavras-chave: Inseticidas, histopatologia, fígado, rins, pulmão, ratas.
* Autor para correspondência. Tel.: +55 81 3320.6389. Rua Dom Manoel de Medeiros,
s/n, Recife, PE, CEP 52171-900.
E-mail: [email protected] (Wanderley-Teixeira, V.)
RESUMO
Contexto: Produtos à base de Bacillus thuringiensis (Bt) assim como inseticidas
sintéticos têm sido amplamente utilizados contra importantes vetores de doenças
humanas, porém poucos trabalhos estudam a aplicação dessas substâncias em doses que
não apresentam sintomas clínicos de intoxicação, sobre o aparelho reprodutor feminino
durante a prenhez.
44
Métodos: Foram utilizadas 70 ratas albinas prenhas para análise da fertilidade e
histopatologia dos rins, fígado e pulmões, além de morfologia dos neonatos. As ratas
foram submetidas a três doses subletais dos inseticidas biológico, XenTari
®
WG -(B.
thuringiensis subsp. Aizawai) e sintético, deltametrina (Decis
®
25CE). Os inseticidas
foram administrados por via oral, a partir da confirmação do acasalamento, por sete dias
ou durante toda a prenhez.
Resultados: A análise ao microscópio de luz revelou alterações histopatológicas em
todos os órgãos em ambos os tratamentos. Não foram observados abortos e os neonatos
não apresentaram indícios de malformação na cabeça, membros, tórax e abdome, porém
houve redução do número de filhotes nos grupos que receberam as maiores dosagens
dos inseticidas em relação ao controle.
Conclusão: Ambos inseticidas atuaram de maneira semelhante nos rins, fígado e
pulmões produzindo lesões semelhantes, além de reduzirem a fertilidade em ratas
quando administrados em doses subletais sem sintomas clínicos de intoxicação materna.
1. Introdução
Formulações à base de Bacillus thuringiensis (Bt) têm sido amplamente utilizadas
como agentes controladores de insetos praga por mais de 40 anos sem evidências de
danos a seres humanos [1,2]. Seus cristais protéicos (Cry) são uma excelente alternativa
tanto contra insetos praga na agricultura quanto contra importantes vetores de doenças
humanas [3,4]. Porém, existem relatos de casos sobre efeitos alergênicos, além de asma,
náuseas e dores abdominais nos aplicadores e moradores das proximidades das áreas de
cultivo após a aplicação aérea de inseticida biológico a base das subespécies B.
thuringiensis kurstaki (B.t.k.) e israelensis (B.t.i.) [5,6].
45
Os testes realizados para liberação dos produtos Bt e protocolos de
desenvolvimento de toxicidade são muito superficiais, além de não serem realizados
estudos distintos entre fêmeas prenhas e não prenhas [7,8].
Em relação aos inseticidas químicos, a deltametrina, um dos mais utilizados da
classe dos piretróides do tipo II, muito importante por ser considerado de baixa
persistência, é aplicado nos cultivos agrícolas, na medicina veterinária e na saúde
pública [9]. Pesquisas desenvolvidas em mamíferos abordam principalmente o efeito no
sistema nervoso, e a toxicidade destes produtos [10-12]. Além disso, utilizam doses
baseadas na DL
-50
, sendo poucos os trabalhos que estudam a aplicação dessas
substâncias em doses que não apresentam sintomas clínicos sobre o aparelho reprodutor
feminino e durante a prenhez [8].
Sabe-se que a deltametrina aplicada via oral pode inibir o citocromo P
-450
, enzima
envolvida no metabolismo de drogas e substâncias tóxicas a qual, além de poder alterar
a fisiologia hormonal do desenvolvimento reprodutivo, também está envolvida no
funcionamento dos tecidos do fígado, rins, pulmão, intestino e endométrio uterino de
mamíferos [13-16].
No Brasil o número de trabalhadores rurais que estão potencialmente expostos aos
inseticidas é bastante expressivo [17]. Destes, a mão-de-obra feminina constitui,
aproximadamente, 60% do total de trabalhadores utilizados na produção de diversas
culturas, entre as quais, a uva, a acerola e o tomate [18], o que concorre para o aumento
da exposição aos agrotóxicos. Desta forma, objetivou-se testar a hipótese de que a
administração de inseticidas XenTari
®
WG (B. thuringiensis subsp. Aizawai) e
deltametrina (Decis
®
25CE), em concentrações que não apresentem sinais clínicos de
46
intoxicação materna, possam interferir na histologia dos rins, fígado e pulmões de ratas
no início da prenhez, bem como na fertilidade.
2. Materiais e métodos
O experimento foi realizado no Laboratório de Histologia do Departamento de
Morfologia e Fisiologia Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Foram
utilizadas 70 ratas albinas Rattus norvegicus albinus da linhagem Wistar com 90 dias de
idade, pesando aproximadamente 200g, procedentes do Biotério do mesmo
Departamento.
2.1 Instalação do bioensaio
Os animais foram mantidos em gaiolas com alimentação e água “ad libitum”, na
temperatura de 22°C e iluminação artificial que estabeleceram o fotoperíodo de 12
horas claro e 12 horas escuro, considerando o período de luz das 06:00 às 18:00 horas.
Após um período de adaptação, foram colhidos esfregaços vaginais para a
determinação do ciclo estral. As ratas que apresentaram três ciclos estrais regulares
foram divididas, ao acaso, em 7 grupos, cada um constituído por 10 fêmeas, sendo 5
tratadas até o sétimo dia de prenhez para análise dos rins, fígado e pulmões e as
restantes durante toda a gestação para análise da fertilidade. Os animais constituíram os
seguintes grupos:
Grupo I - ratas prenhas que receberam placebo;
Grupo II - ratas prenhas que receberam 18,5mg de XenTari
®
WG(1mg de toxina
protéica –B. thuringiensis subsp. Aizawai-)/100g.
Grupo III - ratas prenhas que receberam 185mg de XenTari
®
WG (10mg de
toxina protéica)/100g.
47
Grupo IV - ratas prenhas que receberam 370mg de XenTari
®
WG (20mg de
toxina protéica)/100g.
Grupo V - ratas prenhas que receberam 1,0mg de deltametrina (0,4ml de Decis
®
25CE)/kg.
Grupo VI - ratas prenhas que receberam 2,0mg de deltametrina (0,8ml de Decis
®
25CE)/kg.
Grupo VII - ratas prenhas que receberam 4,0mg de deltametrina (1,6ml de
Decis
®
25CE)/kg.
Após análise da ciclicidade estral de todos os grupos, as fêmeas que estavam
ciclando foram acasaladas na proporção de um macho para duas fêmeas, sempre no
início da noite (18:00h). Na manhã (06:00h) do dia seguinte, foram realizados exames
colpocitológicos para a confirmação do acasalamento, tomando-se como parâmetro a
presença de espermatozóides nos esfregaços corados pelo método Shorr-Harris.
2.2 Administração dos inseticidas
Os inseticidas XenTari
®
WG e deltametrina (Decis
®
25CE) foram administrados
por via oral (gavagem), a partir da confirmação do acasalamento, em doses diárias, de
acordo com a metodologia modificada de Shaban et al. [19] para o inseticida biológico,
e de Andrade et al. [20] para o inseticida sintético. As ratas foram pesadas diariamente
através de uma balança digital, a partir da confirmação do acasalamento, para
observação do ganho de peso e conversão da medida proporcional da dosagem dos
inseticidas. As doses de deltametrina utilizadas foram estabelecidas a partir da dose
NOEL (No Observed Effect Level) para toxicidade materna, ou seja, a maior dose de
deltametrina que não causa nenhum efeito adverso (não provoca toxicidade). Segundo a
48
Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA), a NOEL dose para
deltametrina em ratos é de 3.3 mg/kg [21].
2.3 Análise histopatológica e macroscópica
Para análise dos órgãos das fêmeas, cinco ratas de cada grupo foram anestesiadas
com hidrocloridrato de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (6 mg/kg), por via intramuscular
para eutanásia ao sétimo dia de prenhez. A seguir, foi realizada a abertura da cavidade
abdominal até as costelas, com abertura da caixa torácica para serem retirados os rins,
fígado e pulmões, estes foram mergulhados imediatamente em líquido de Boüin,
permanecendo no mesmo por 48 horas. Após esses procedimentos, os órgãos foram
clivados, desidratados em álcool etílico (concentrações crescentes), diafanizados pelo
xilol, impregnados e incluídos pela parafina. A seguir, os blocos foram cortados em
micrótomo do tipo Minot (Leica RM 2035) ajustado para 5 µm e submetidos à técnica
de coloração pela Hematoxilina - Eosina (H. E.) para análise em microscópio de luz e
fotomicrografia.
Para análise morfológica dos neonatos, as demais ratas foram acompanhadas por
um período de 21 dias, ou seja, até o nascimento dos filhotes, os quais foram contados,
pesados em balança analítica, medidos desde a cabeça a ponta da cauda, analisados
macroscopicamente quanto a presença de malformação visível na cabeça, tronco ou
membros, dados estes, que foram submetidos ao teste não paramétrico de Kruskal-
Wallis, onde as médias foram comparadas pelo teste de Wilcoxon-Mann-Whitney, a
95% de significância.
3. Resultados
3.1 Histopatologia
49
O presente estudo investigou os efeitos tóxicos de doses subletais de inseticidas
biológico e sintético sobre os rins, fígado e pulmões de ratas no início da prenhez e
sobre a fertilidade. Os resultados indicaram que ambos os inseticidas interferiram na
histofisiologia dos órgãos e que as alterações mostraram ser dose-dependente.
Nos rins, foi observada deposição de hemossiderina, necrose e degeneração
vacuolar dos túbulos contorcidos e ductos coletores, glomerulonefrite membranosa e
proliferativa, além da redução significativa do espaço de Bowman (Figs. 1B-1F) nos
rins das ratas que receberam 4,0mg de deltametrina (1,6ml de Decis
®
25CE)/kg de peso
animal, grupo VII, e nas ratas tratadas com XenTari
®
, 370mg/100g, que corresponde à
dosagem de 20mg/100g de animal, da prótoxina (Cry subespécie Aizawai), grupo IV,
neste grupo observou-se ainda acentuada hipertrofia e hiperplasia com estratificação do
epitélio dos túbulos coletores (Fig. 2A), os quais normalmente apresentam-se do tipo
simples cúbico.
No fígado foi observado discreto aumento dos espaços sinusóides devido à
congestão, necrose focal nodular do tipo coagulativa com intensa reação de células de
Kupffer e escassas células mononucleres nas ratas tratadas com doses de 185 e 370
mg/100g de XenTari
®
WG, correspondendo a 10 e 20 mg de toxina protéica,
respectivamente (Fig. 2C), já nas ratas tratadas com 2,0 e 4,0 mg de deltametrina/Kg
correspondendo 0,8 e 1,6 ml de Decis
®
25CE, respectivamente, além de congestão,
havia degeneração vacuolar dos hepatócitos, hiperplasia das células de Kupffer com
focos nos espaços porta, os quais apresentam colangite (Fig. 2D-2F).
Nos pulmões foi observada reação inflamatória com presença de macrófagos e
predomínio de polimorfonucleados, caracterizando bronquiolite purulenta com exudato
no interior, peribronquiolite e perivasculite com processo inflamatório por macrófagos e
50
linfócitos nas ratas tratadas com doses de 185 e 370mg/100g de XenTari
®
WG (Fig. 3B
e 3C). Já nas ratas tratadas com 2,0 e 4,0mg de deltametrina/kg foi observado
espessamento dos septos caracterizando moderada pneumonia intersticial, com reação
inflamatória ao redor dos bronquíolos e vasos, apresentando infiltrado peribronquiolar
bem característico; além disso, também foi diagnosticada pneumonia multifocal por
macrófagos, distribuída em várias áreas do lóbulo (Fig. 3D, 3E e 3F) quando
comparadas ao grupo controle (Fig. 3A).
3.2 Morfologia dos neonatos e fertilidade
A análise macroscópica dos neonatos não mostrou nenhum indício de
malformação na cabeça, membros, tórax e abdome. Também não foram observados
abortos. Na tabela 1 constam os dados referentes às médias do número, comprimento e
peso dos neonatos. Não houve diferença estatística significante para os parâmetros
comprimento e peso dos neonatos, porém verificaram-se diferenças com relação ao
número de neonatos, onde as maiores dosagens dos dois inseticidas analisados
ocasionaram redução significativas em relação ao controle e ao grupo tratado com dose
de 18,5mg de XenTari
®
.
4. Discussão
Dados contraditórios foram observados na presente pesquisa, pois foi evidenciado
que doses subletais do inseticida biológico produziram alterações histopatológicas
expressivas nos rins, fígado e pulmões de ratas tratadas no início da prenhez,
semelhantemente às doses subletais do inseticida sintético, caracterizadas por processos
inflamatórios. Também houve redução no número de filhotes justamente nos grupos que
receberam as maiores dosagens experimentais.
51
As alterações produzidas pelo inseticida biológico nos rins refletem os efeitos das
toxinas sobre o sistema imunológico pela proliferação das células mesangiais e
infiltração destas no tecido o que levaram a diminuição ou ausência dos espaços de
Bowman caracterizando a glomerulonefrite membranoproliferativa reduzindo assim, a
capacidade funcional dos néfrons. A atuação da toxina do Bt sobre o sistema imune é
reportada por Hayakawa et al. [22], que verificaram em culturas de células renais
humanas submetidas a cepas da bactéria Bt, estímulo para a ativação de células
linfocitárias. Além disso, outras pesquisas relataram também alterações histológicas na
cápsula de Bowman e diâmetro dos glomérulos, levando a diminuição das funções
renais da prole da terceira geração de ratas alimentadas durante a prenhez e lactação,
com milho transgênico e toxinas Bt [23,24].
Pesquisas têm revelado também que as toxinas Bt atuam em cultura de
hepatócitos de mamíferos aumentando a produção de lactato dehidrogenase (LDH), que
danifica as células endoteliais dos sinusóides levando à dilatação do lúmen sinusoidal
em doses de aproximadamente 2,0ng/ml após 24 e 48h de incubação [25,26]. Este fato
pode justificar o discreto aumento dos espaços sinusóides observado no presente estudo,
ocasionado por ingestão de doses subletais de 185 e 370 mg/100g de XenTari
®
. Outras
pesquisas têm mostrado que o inseticida Dipel
®
(B. thuringiensis var. kurstaki) tem a
capacidade de alterar o comportamento de defesa das células do fígado, induzir o
estresse oxidativo, estimular a peroxidação lipídica, devido à formação de radicais
livres, e danificar as membranas celulares dos hepatócitos em ratos, levando
conseqüentemente à reação inflamatória e atividade das células de Kupffer após
aplicação na mesma dosagem experimental utilizada no presente estudo [19,27].
52
A necrose focal nodular do tipo coagulativa com intensa reação e hiperplasia
difusa das células de Kupffer, resultou da ação inflamatória das toxinas do Bt, pois essas
células são macrófagos residentes que têm como funções metabolizar eritrócitos velhos,
digerir hemoglobina, secretar proteínas relacionadas com o sistema imunológico, ou
seja, atuam como células de defesa no fígado [28].
Com relação ao inseticida sintético a literatura reporta testes toxicológicos para
doses bem acima das utilizadas no presente estudo, dando ênfase aos aspectos
fisiopatológicos sem levarem em consideração as alterações morfológicas, como por
exemplo, Manna et al. [29], que citaram aumento do número de neutrófilos, linfócitos e
monócitos nos rins levando posteriormente a glomerulonefrite e hemorragia em ratos
quando submetidos ao piretróide da mesma classe que a deltametrina, a cipermetrina, na
dose de 14,5mg/Kg (1/10 da DL
50
) durante 30 dias. Doses orais de deltametrina de
5,6mg/Kg e 18mg/Kg durante 15 dias, também levaram a diminuição da glutationa
(GSH), que é extremamente importante para desintoxicação nos rins, fígado e pulmões.
Esta diminuição da GSH reflete em aumento da peroxidação lipídica e vulnerabilidade
do organismo quanto ao funcionamento do sistema imunológico, levando
consequentemente a doenças oportunistas, além de estresse oxidativo [30]. Devemos
mencionar ainda que além da diminuição desta substância, foi identificado por Eraslan
et al. [31], o aumento dos níveis de creatinina e fósforo no sangue de ratos que
receberam de 7,5mg/Kg a 30mg/Kg de deltametrina no alimento. O aumento na
concentração sanguínea da creatinina corresponde a diminuição da taxa de filtração
glomerular e disfunção dos néfrons. A deltametrina também tem como característica
causar alteração da diferença de potencial dos canais de sódio das membranas celulares,
causando disfunção renal [32,33].
53
Fetoui et al. [34] quando utilizaram deltametrina na dosagem de 668ppm (1/10 da
DL50) via intraperitoneal evidenciaram além da dilatação do lúmen dos sinusóides,
infiltração de células inflamatórias, degeneração dos hepatócitos e aumento da enzima
LDH. O efeito causado pela deltametrina observado por estes pesquisadores justifica a
colangite dos espaços porta, que são agregações de células inflamatórias, especialmente
ao redor de ductos biliares e presença de fibrose, a qual ocorre no fígado como resposta
à necrose e à inflamação, que pode ser seguida por uma fibrose como consequencia de
uma agressão tóxica ou inflamatória [35]. Outra hipótese para justificar essas lesões no
fígado em decorrência da deltametrina são alterações das hidrolases e biotransformação
das vesículas microssomais, além de aumento dos níveis de aspartato transmitase
(AST), alanina transmitase (ALT), Lactato dehidrogenase, que são substancias que
indicam sintomas de intoxicação, dano ou disfunção no tecido hepático ou pneumócitos.
Estas substâncias foram observadas quando ratos foram submetidos a doses orais de
12mg/Kg 4 vezes por semana por três semanas ou quando cabras foram banhadas em
soluções de 0,8 a 1,6% uma vez ao dia durante 75 dias [36,37]. Além disso, doses
baixas de deltametrina, de 1,28mg/Kg via oral em ratos durante 30 dias ocasionaram
insuficiência hepática levando à diminuição da albumina e globulina, as quais atuam
como transportadoras de hormônios e outras substancias fundamentais para o
funcionamento normal do organismo [38].
Nas ratas tratadas com doses de 185 e 370 mg/100g de XenTari
®
WG, e nas ratas
tratadas com 2,0 e 4,0mg de deltametrina/kg, observou-se alterações histopatológicas
nos pulmões bastante expressivas, caracterizadas por bronquiolite purulenta,
peribronquiolite e perivasculite, pneumonia intersticial, infiltrado peribronquiolar e
pneumonia multifocal por macrófagos.
54
Alterações semelhantes também foram percebidas nos pulmões de ratos que
receberam intratraquealmente unidades formadoras de colônias de 3,9x10
5
a 1,2x10
7
de
proteína Bt purificada nas doses de 0,4mg/Kg a 9,6mg/Kg em única dose, resultando em
alterações histológicas dose dependentes e alterações como inflamação nos bronquíolos
e alvéolos com infiltrado celular e aglomerados de neutrófilos [39,40]. Sabe-se também
que as toxinas desta bactéria levam ao aumento sérico das substâncias pró-inflamatórias,
podendo levar até a morte dos animais, se as doses de esporos forem dadas acima de 10
8
esporos intranasalmente, induzindo a hemorragia e infiltração inflamatória pulmonar
[41,42].
Já o inseticida sintético é relatado em pesquisas por possuir, além de atividade
pró-inflamatória, alteração sobre os pneumócitos do tipo II levando a hiperplasia destas
células, as quais são responsáveis pela produção do surfactante pulmonar e estão
envolvidas na limpeza do tecido. A aplicação de deltametrina spray aerossol por 30
minutos diários durante 45 dias nas doses de 06 e 12mg/m
3
promoveram além de
pneumonia intersticial, bronquíolos respiratórios com substância vascular e edema
perivascular e hiperplasia peribronquiolar do tecido linfóide [43], danos semelhantes
observados na atual pesquisa com as doses de 2,0 e 4,0mg/Kg administradas por apenas
7 dias via oral. Já outras pesquisas revelaram além da alteração sobre os pneumócitos,
sintomas pró-inflamatórios, quando foram aplicadas doses próximas à aguda, de 125 a
225mg/kg, levando à conclusão pelos autores, após 30 dias de pesquisa, que a
deltametrina causa enfisema pulmonar e é capaz de elevar os níveis de AST, LDH, ALT
etc, substâncias que indicam intoxicação [44], justificando desta maneira a presença de
infiltrado peribronquiolar e pneumonia multifocal por macrófagos nos lóbulos
pulmonares.
55
Interessante mencionar que pesquisa recente aplicando-se deltametrina mostrou
diferença quanto à deposição nos tecidos, sendo dose dependente quanto à distribuição
pelos tecidos, mas não proporcional à dose, assim justificando, de certa maneira,
reações semelhantes entre os diferentes tratamentos quando se observou o tecido
adiposo, muscular esquelético, epitelial e gastrintestinal em ratos nas doses entre 0,4; 2
e 10mg/Kg intravenoso [45].
Pôde ser observado que houve processo inflamatório nos animais submetidos tanto
ao inseticida sintético quanto ao biológico, nos rins, fígado e pulmões. Também houve
redução no número de filhotes justamente nos grupos que receberam as maiores
dosagens experimentais, quando foram aplicados os inseticidas durante toda a prenhez.
Esta redução pode ser justificada pelo fato de os inseticidas terem causado processo pró-
inflamatório nas ratas, pois, segundo Fierros et al. [46], toxinas protéicas Bt Cry1Ac
podem provocar respostas do sistema imunológico a nível sistêmico em diversos locais,
como no aparelho reprodutor, após aplicação de 100µg via intraperitoneal e
intravaginal. Também foi observado que esta mesma toxina é um potente indutor
específico da resposta imune em tecidos mucosos [47].
Assim, da mesma maneira que os inseticidas biológicos a base de Bt, inseticidas
piretróides do tipo II são também considerados pró-inflamatórios, pesquisadores
comprovaram que estes inseticidas podem levar a alteração dos níveis de hormônios
corticosteróides no plasma em doses de 3mg/Kg de cialotrina por 7 dias em ratos [48], e
alterar os níveis de hormônios sexuais, como FSH e LH, sendo estes de maneira
proporcional em relação a quantidade de substâncias piretróides eliminadas pela urina e
a nível sérico de homens adultos [12], mostrando a capacidade destes inseticidas
atuarem sobre o sistema reprodutor.
56
Como se sabe, o sucesso da implantação depende de diversos fatores, entre eles a
expressão temporariamente definida de moléculas específicas. A implantação do
blastocisto é sempre precedida por um aumento da permeabilidade vascular para
formação dos sítios de implantação, o que aumenta o contato do útero com todas as
substâncias presentes a nível vascular. Além da importância da atuação hormonal, como
a progesterona na manutenção da decidualização e desenvolvimento do processo de
implantação, pois todos estes fatores são primordiais ao bom estabelecimento gravídico
do animal [49].
Em conclusão, percebeu-se que tanto o inseticida biológico, quanto o químico
ocasionaram lesões caracterizadas por reações inflamatórias, inclusive levando a
redução do número da prole, indicando assim que ambos os inseticidas atuam de
maneira semelhante nos rins, fígado e pulmões, bem como na fertilidade quando
aplicadas doses que não ocasionam sintomas clínicos de intoxicação em ratas albinas.
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63
Figura1: Rins das ratas dos grupos experimentais. A) Região cortical (c) e medular (m)
do rim bem preservadas (grupo controle). H.E. ± 42X. B) Deposição de hemossiderina
nos túbulos coletores nos rins de ratas tratadas com 185mg/100g de XenTari
®
. H.E. ±
428X. C) Necrose dos túbulos contorcidos (*) caracterizados por ausência dos núcleos e
coloração pálida das células, ratas tratadas com 370mg/100g de XenTari
®
). H.E. ±
428X. D) Degeneração vacuolar dos túbulos contorcidos (seta), ratas tratadas com
370mg/100g de XenTari
®
. H.E. ± 428X. E) Glomerulonefrite membranoproliferativa
com redução dos espaços de Bowman (18,5 e 185mg/100g XenTari
®
e 1 e 2mg/Kg
deltametrina). H.E. ± 428X. F) Glomerulonefrite membranoproliferativa com ausência
dos espaços de Bowman (370mg/100g XenTari
®
e 4mg/Kg deltametrina). H.E. ± 428X.
A
B
C
D
E
F
m
c
*
*
*
64
Figura 2: Rins e fígado das ratas dos grupos experimentais. A) Hipertrofia e hiperplasia
com estratificação das células dos túbulos coletores nos rins das ratas tratadas com
370mg/100g de XenTari
®
. Aspecto normal de túbulos coletores, epitélio simples cúbico
[A1]. H.E. ± 428X. B) Fígado do grupo controle bem preservado. H.E. ± 428X. C)
Necrose focal nodular do tipo coagulativa com intensa reação de células de kupffer e
escassas células mononucleres (185 e 370mg/100g XenTari
®
). H.E. ± 107X. D)
Discreto aumento dos espaços sinusóides característica de congestão(*) e hiperplasia
difusa das células de Kupffer [seta] (370mg/100g XenTari
®
). H.E. ± 428X. E)
Degeneração vacuolar dos hepatócitos (2 e 4mg/Kg deltametrina). H.E. ± 428X. F)
Colangite dos espaços porta [setas] (2 e 4mg/Kg deltametrina) característico de reação
inflamatória. H.E. ± 107X
.
*
A
B
C
D
E
F
A1
65
Figura 3: Pulmões das ratas dos grupos experimentais. A) Região vascular e alvéolos
normais do grupo controle. H.E. ± 107X. B) Bronquiolite purulenta, mostrando
exsudato com células polimorfonucleares (seta) e peribronquiolite (*) (185 e
370mg/100g XenTari
®
). H.E. ± 428X. C) Peribronquiolite (*) e perivasculite [seta] (185
e 370mg/100g XenTari
®
). H.E. ± 107X. D) Espessamento dos septos caracterizando
pneumonia intersticial (2,0 e 4,0mg/Kg deltametrina). H.E. ± 107X. E) Pneumonia
multifocal [setas longas] (2,0 e 4,0mg/Kg deltametrina). H.E. ± 107X. F) Detalhe do
foco de pneumonia constituído por macrófagos [seta larga] (2,0 e 4,0mg/Kg
deltametrina). H.E. ± 107 e 428X.
F
A
B
C
D
E
*
*
66
Tabela 1
Média (± desvio padrão) do número, comprimento e peso dos neonatos nos grupos
experimentais.
Grupos Número Comprimento Peso
G I- 12,00 ± 1,58a 6,17 ± 0,28a
6,14 ± 0,41a
G II 11,60 ± 0,89a 5,92 ± 0,37a
5,57 ± 0,34a
G III 8,60 ± 1,67ab 6,30 ± 0,05a
5,80 ± 0,31a
G IV 6,20 ± 1,09b 6,16 ± 0,69a
5,97 ± 0,96a
G V 8,20 ± 2,20ab 6,15 ± 0,95a
6,19 ± 0,56a
G VI 7,80 ± 1,48ab 6,32 ± 0,26a
6,10 ± 0,30a
G VII 4,80 ± 2,58b 6,52 ± 0,35a
6,31 ± 0,84a
Estatística
1
F
P
24,489
0,0004
9,489
0,1479
6,606
0,3589
1
Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
Wilcoxon-Mann-Whitney (P>0,05).
67
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68
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• Australia and New Zealand Placenta Research Association
• European Placenta Group
• Japanese Placenta Association
• the Placenta Association of the Americas
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Guide for Authors
The Official Journal of the International Federation of Placenta Associations
incorporating the following:
• Australia and New Zealand Placenta Research Association
• European Placenta Group
• Japanese Placenta Association
• the Placenta Association of the Americas
INCLUDES TROPHOBLAST RESEARCH, the Annual Supplement that is available
for free online.
INTRODUCTION
• Types of papers
• Contact details for
submission
BEFORE YOU BEGIN
• Ethics in Publishing
• Policy and ethics
• Conflict of interest
• Submission declaration
• Contributors
• Copyright
• Retained author rights
• Role of the funding source
• Funding body agreements
and policies
• Language and language
services
• Patient details
• Submission
• Referees
PREPARATION
• Use of wordprocessing
software
• LaTeX
• Article structure
• Essential title page
information
• Abstract
• Keywords
• Abbreviations
• Acknowledgements
• Nomenclature and units
• Accession numbers
• Footnotes
• Artwork
• Tables
• References
• Supplementary and
multimedia data
• Submission checklist
AFTER
ACCEPTANCE
• Use of the Digital
Object Identifier
• Proofs
• Offprints
AUTHOR INQUIRIES
PLACENTA invites submission of full-
length papers and short communications of high
quality research that provide novel insight into any aspect of placental biology.
Technical notes are welcome if a new technique or methodology is described that
71
clarifies or expands experimental studies. Case reports are acceptable if they illustrate a
key point about placental biology, yet should not include an extensive literature review.
Book reviews and letters to the Editors are selectively published. Letters to the Editors
may comment on any issue important to placentology, including comments about
articles published in PLACENTA or may communicate isolated findings that do not
justify publication as a short communication. Reviews (Current Topics) and topic
overviews (Current Opinion) are usually solicited by the Editors.
PLACENTA covers all aspects of the human and animal placenta including evolution,
development, histology, physiology, metabolism, endocrinology, microbiology,
pathology, immunology, pharmacology, cell biology, biochemistry, and molecular
mechanisms underlying placental function. We welcome articles describing clinical
aspects of placental structure or function and studies of implantation, comparative
placentation, fetoplacental interactions, trophoblastic neoplasia and placental vascular
biology. Authors should justify use of cell lines as models for trophoblast function.
All manuscripts should be written in English and each will be evaluated in a similar
manner, irrespective of country of origin. Neither the journal, nor the publisher will
assume any responsibility for statements in the articles, which are t
he sole responsibility
of the authors.
Unless requested otherwise, manuscripts from Africa and Europe will be handled by
Graham Burton (Cambridge, UK) and those from the Americas, Asia and Australia by
D. Michael Nelson (St. Louis, USA)
Types of papers
Original articles: a full-length report of original basic or clinical investigation that
provides novel insight and places the findings in a mechanistic, functional, or
evolutionary context (2000-3000 words, up to 45 references, and up to 6 tables and/or
figures). A structured abstract of no more than 250 words with the following sections
(objectives, study design, main outcome measures, results, conclusions) is required. The
rest of the paper should be structured as follows: Introduction, Methods, Results,
Discussion, References.
Short communications/Technical notes: descriptive studies or methodological advances
must not exceed 1,000 words with no more than two (2) tables or illustrations and
twenty-five (25) references. An unstructured abstract of no more than 100 words is
required. The text should also be structured in four parts: Introduction, Methods,
Results and Discussion, but the Results and Discussion sections may be combined.
Review articles: a comprehensive review of prior publications relating to an important
clinical subject (2000-3000 words and 30-
50 references). An unstructured abstract of no
more than 250 words is required. The Introduction should indicate why the topic is
important and should state the specific objective(s) of the review. The Conclusion
should include the clinical implications and observations regarding the need for
additional research. Systematic reviews should follow the QUOROM guidelines. Meta-
analysis of observational studies should follow the MOOSE guidelines.
72
Case reports: must not exceed 1,000 words and ten (10) references and two (2) tables
and/or figures.
Letters to the Editor: a question or challenge to an article published recently in the
journal. Letters must be received within 6 weeks of publication of th
e article to which
they refer and should be no longer than 250 words with up to 7 references and 1 figure
and/or table.
Contact details for submission
Submission of manuscripts proceeds entirely online at http://ees.elsevier.com/plac
Ethics in Publishing
For information on Ethics in Publishing and Ethical guidelines for journal publication
see http://www.elsevier.com/publishingethics and
http://www.elsevier.com/ethicalguidelines.
Policy and ethics
The work described in your article must have been carried out in accordance with The
Code of Ethics of the World Medical Association (Declaration of Helsinki) for
experiments involving humans http://www.wma.net/e/policy/b3.htm; EC Directive
86/609/EEC for animal experiments
http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm; Uniform
Requirements for manuscripts submitted to Biomedical journals
http://www.icmje.org. This must be stated at an appropriate point in the article.
Conflict of interest
All authors are requested to disclose any actual or potential conflict of interest including
any financial, personal or other relationships with other people or organizations within
three years of beginning the submitted work that could inappropriately influence, or be
perceived to influence, their work. See also
http://www.elsevier.com/conflictsofinterest.
Submission declaration
Submission of an article implies that the work described has not been published
previously (except in the form of an abstract or as part of a published lecture or
academic thesis), that it is not under consideration for publication elsewhere, that its
publication is approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsible
authorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be published
elsewhere including electronically in the same form, in English or in any other
73
language, without the written consent of the copyright-holder.
Contributors
Submission of multi-authored manuscripts to this journal requires the consent of each
author and all have to sign the covering letter. All authors of, and all contributors
(including medical writers and editors) must specify their individual contributions at the
end of the text. The following format is suggested: 'I declare that I participated in the
(here list contributions made to the study) and that I have seen and approved the final
version. I have the following conflicts of interest' (list here all relevant conflicts and
source of funding). This should be listed in the 'Comments' field in EES.
Copyright
Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing
Agreement' (for more information on this and copyright see
http://www.elsevier.com/copyright). Acceptance of the agreement will ensure the
widest possible dissemination of information. An e-mail will be sent to the
corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal
Publishing Agreement' form or a link to the online version of this agreement.
Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles including
abstracts for internal circulation within their institutions. Permission of the Publisher is
required for resale or distribution outside the institution and for all other derivative
works, including compilations and translations (please consult
http://www.elsevier.com/permissions). If excerpts from other copyrighted works are
included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and
credit the source(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in
these cases: please consult http://www.elsevier.com/permissions.
Retained author rights
As an author you (or your employer or institution) retain certain rights; for details you
are referred to: http://www.elsevier.com/authorsrights.
Role of the funding source
You are requested to identify who provided financial support for the conduct of the
research and/or preparation of the article and to briefly describe the role of the
sponsor(s), if any, in study design; in the collection, analysis and interpretation of data;
in the writing of the report; and in the decision to submit the paper for publication. If
the funding source(s) had no such involvement then this should be stated. Please see
http://www.elsevier.com/funding.
Funding body agreements and policies
Elsevier has established agreements and developed policies to allow authors whose
articles appear in journals published by Elsevier, to comply with potential manuscript
archiving requirements as specified as conditions of their grant awards. To learn more
74
about existing agreements and policies please visit
http://www.elsevier.com/fundingbodies.
Language and language services
Please write your text in good English (American or British usage is accepted, but not a
mixture of these). Authors who require information about language editing and
copyediting services pre- and post-submission please visit
http://www.elsevier.com/languageediting or our customer support site at
http://epsupport.elsevier.com for more information.
Patient details
Unless you have written permission from the patient (or, where applicable, the next of
kin), the personal details of any patient included in any part of the article and in any
supplementary materials (including all illustrations and videos
) must be removed before
submission. For further information see http://www.elsevier.com/patientphotographs.
Submission
Submission to this journal proceeds totally online. Use the following guidelines to
prepare your article. Via the homepage of this journal, http://ees.elsevier.com/plac,
you will be guided stepwise through the creation and uploading of the various files. The
system automatically converts source files to a single PDF file of the article, which is
used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files
are converted to PDF files at submission for the review process, these source files are
needed for further processing after acceptance. All correspondence, including
notification of the Editors' decision and requests for revision, takes place by e-mail
removing the need for a paper trail.
Referees
To expedite the review process Authors are required to provide the editorial office with
the names and email addresses of up to 5 potential Referees that are able to competently
review the article submitted for possible publication. The Referees are not to be
associated with or involved with the article in any way or be from the same institution
as the Author(s) involved with the article.
Use of wordprocessing software
It is important that the file be saved in the native format of the wordprocessor used. The
text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as
possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the article.
In particular, do not use the wordprocessor's options to justify text or to hyphenate
words. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc. Do not embed
75
"graphically designed" equations or tables, but prepare these using the wordprocessor's
facility. When preparing tables, if you are using a table grid, use only one grid for each
individual table and not a grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces, to
align columns. The electronic text should be prepared in a way very similar to that of
conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier:
http://www.elsevier.com/guidepublication). Do not import the figures into the text
file but, instead, indicate their approximate locations directly in the electronic text and
on the manuscript. See also the section on Electronic illustrations.
To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the "spell-check" and
"grammar-check" functions of your wordprocessor.
LaTeX
If the LaTeX file is suitable, proofs will be produced without rekeying the text. The
article should preferably be written using Elsevier's document class "elsarticle", or
alternatively the standard document class "article".
The Elsevier LaTeX style file package (including detailed instructions for LaTeX
preparation) can be obtained from the Quickguide: http://www.elsevier.com/latex. It
consists of the file: elsarticle.cls, complete user documentation for the class file,
bibliographic style files in various styles, and template files for a quick start.
Article structure
Introduction
The Introduction should describe the question addressed by the report, the relevant
background and must state the objective of the research. The literature review should be
relevant but not detailed.
Materials and methods
The Methods section should describe the research methodology in sufficient detail that
others could reasonably be expected to be able to duplicate the work. However, if the
methodology has been previously published, the appropriate reference should be cited,
and a full description is not required. The sequences of oligonucleotides, if not
previously published, should be provided. Novel DNA or protein sequences should be
deposited in an appropriate database (eg, Genbank, EMBL, SWISS-PROT), with the
accession numbers included in the manuscript (see below). Provide suppliers' names for
all antibodies used. Methods of statistical analysis should be identified and, when
appropriate, the basis for their selection stated. Statistical software programs used
should be cited in the text. P values should be expressed to no more than three decimal
places. Reports in which statistical difference is lacking must provide some indication
of the study's power to detect such differences, and this
information must be included in
the abstract.
Results
The Results section should present the findings in appropriate detail. Tables and figures
may be used, but duplication between text and tables or figures is to be avoided.
Discussion
76
The Discussion section should be used to critically appraise the implications of the
findings and to compare them with those of other studies. Repetition of the results
section should be avoided.
Conclusions
The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section,
which may stand alone or form a subsection of a Discussion or Results and Discussion
section.
Essential title page information
• Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems.
Avoid abbreviations and formulae where possible.
• Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a
double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation addresses
(where the actual work was done) below the names. Indicate all affiliations with a
lower-case superscript letter immediately after the author's name and in front of the
appropriate address. Provide the full postal address of each affiliation, including the
country name, and, if available, the e-mail address of each author.
• Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all stages
of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that telephone and fax
numbers (with country and area code) are provided in addition to the e-mail
address and the complete postal address.
• Present/permanent address. If an author has moved since the work described in the
article was done, or was visiting at the time, a "Present address" (or "Permanent
address") may be indicated as a footnote t
o that author's name. The address at which the
author actually did the work must be retained as the main, affiliation address.
Superscript Arabic numerals are used for such footnotes.
Abstract
A concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the purpose
of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is often
presented separately from the article, so it must be able to stand alone. For this reason,
References should be avoided, but if essential, then cite the author(s) and year(s). Also,
non-standard or uncommon abbreviations should be avoided, but if essential they must
be defined at their first mention in the abstract itself.
Keywords
Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using American
spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for
example, "and", "of"). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly
established in the field may be eligible. These keywords will be used for indexing
purposes.
Abbreviations
77
Define abbreviations that are not standard in this field in a footnote to be placed on the
first page of the article. Such abbreviations that are unavoidable in the abstract must be
defined at their first mention there, as well as in the footnote. Ensure consistency of
abbreviations throughout the article.
Acknowledgements
Collate acknowledgements in a separate section at the end of the article before the
references and do not, therefore, include them on the title page, as a footnote to the title
or otherwise. List here those individuals who provided help during the research (e.g.,
providing language help, writing assistance or proof reading the article, etc.).
Nomenclature and units
Follow internationally accepted rules and conventions: use the international system of
units (SI). If other quantities are mentioned, give their equivalent in SI. You are urged
to consult IUB: Biochemical Nomenclature and Related Documents:
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/ for further information.
Accession numbers
Accession numbers are unique identifiers in bioinformatics allocated to nucleotide and
protein sequences to allow tracking of different versions of that sequence reco
rd and the
associated sequence in a data repository [e.g., databases at the National Center for
Biotechnical Information (NCBI) at the National Library of Medicine ('GenBank') and
the Worldwide Protein Data Bank]. There are different types of accession numbers in
use based on the type of sequence cited, each of which uses a different coding. Authors
should explicitly mention the type of accession number together with the actual
number, bearing in mind that an error in a letter or number can result in a dead link in
the online version of the article. Please use the following format: accession number type
ID: xxxx (e.g., MMDB ID: 12345; PDB ID: 1TUP). Note that in the final version of the
electronic copy, accession numbers will be linked to the appropriate database, enabling
readers to go directly to that source from the article.
Footnotes
Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively throughout the article,
using superscript Arabic numbers. Many wordprocessors build footnotes into the text,
and this feature may be used. Should this not be the case, indicate the position of
footnotes in the text and present the footnotes themselves separately at the end of the
article. Do not include footnotes in the Reference list.
Table footnotes
Indicate each footnote in a table with a superscript lowercase letter.
Artwork
Electronic artwork
General points
78
• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.
• Save text in illustrations as "graphics" or enclose the font.
• Only use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times, Symbol.
• Number the illustrations according to their sequence in the text.
• Use a logical naming convention for your artwork files.
• Provide captions to illustrations separately.
• Produce images near to the desired size of the printed version.
• Submit each figure as a separate file.
A detailed guide on electronic artwork is available on our website:
http://www.elsevier.com/artworkinstructions
You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are
given here.
Formats
Regardless of the application used, when your electronic artwork is finalised, please
"save as" or convert the images to one of the following formats (note the resolution
requirements for line drawings, halftones, and line/halftone combinations given below):
EPS: Vector drawings. Embed the font or save the text as "graphics".
TIFF: color or grayscale photographs (halftones): always use a minimum of 300 dpi.
TIFF: Bitmapped line drawings: use a minimum of 1000 dpi.
TIFF: Combinations bitmapped line/half-tone (color or grayscale): a minimum of 500
dpi is required.
DOC, XLS or PPT: If your electronic artwork is created in any of these Microsoft
Office applications please supply "as is".
Please do not:
• Supply embedded graphics in your wordprocessor (spreadsheet, presentation)
document;
• Supply files that are optimised for screen use (like GIF, BMP, PICT, WPG); the
resolution is too low;
• Supply files that are too low in resolution;
• Submit graphics that are disproportionately large for the content.
Color artwork
Please make sure that artwork files are in an acceptable format (TIFF, EPS or MS
Office files) and with the correct resolution. If, together with your accepted article, you
submit usable color figures then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these
figures will appear in color on the Web (e.g., ScienceDirect and other sites) regardless
of whether or not these illustrations are reproduced in color in the printed version. For
color reproduction in print, you will receive information regarding the costs from
Elsevier after receipt of your accepted article. Please indicate your preference for
color in print or on the Web only. For further information on the preparation of
electronic artwork, please see http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Please note: Because of technical complications which can arise by converting color
figures to "gray scale" (for the printed version should you not opt for color in print)
please submit in addition usable black and white versions of all the color illustrations.
Figure captions
Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to
79
the figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a
description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum
but explain all symbols and abbreviations used.
Tables
Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place
footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase
letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that the data
presented in tables do not duplicate results described elsewhere in the article.
References
Authors are responsible for the accuracy of references. The 'Vancouver' style is used.
References appearing for the first time in a table or figure should be cited in the text
where the table or figure is mentioned. References cited must have been published in
peer-reviewed publications.
Citation in text
Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list
(and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full. Unpublished
results and personal communications are not recommended in the reference list, but
may be mentioned in the text. If these references are included in the reference list they
should follow the standard reference style of the journal and should include a
substitution of the publication date with either "Unpublished results" or "Personal
communication" Citation of a reference as "in press" implies that the item has been
accepted for publication.
Web references
As a minimum, the full URL should be given and the date when the reference was last
accessed. Any further information, if known (DOI, author names, dates, reference to a
source publication, etc.), should also be given. Web references can be listed separately
(e.g., after the reference list) under a different heading if desired, or can be included in
the reference list.
Reference style
Text: Indicate references by number(s) in square brackets in line with the text. The
actual authors can be referred to, but the reference number(s) must always be given.
List: Number the references (numbers in square brackets) in the list in the order in
which they appear in the text.
Examples:
Reference to a journal publication:
[1] Van der Geer J, Hanraads JAJ, Lupton RA. The art of writing a scientific article. J
Sci Commun 2000;163:51-9.
Reference to a book:
[2] Strunk Jr W, White EB. The elements of style. 3rd ed. New York:
Macmillan; 1979.
Reference to a chapter in an edited book:
[3] Mettam GR, Adams LB. How to prepare an electronic version of your article. In:
80
Jones BS, Smith RZ, editors. Introduction to the electronic age, New York: E-
Publishing Inc; 1999, p. 281-304.
Note shortened form for last page number. e.g., 51-9, and that for more than 6 authors
the first 6 should be listed followed by "et al." For further details you are referred to
"Uniform Requirements for Manuscripts submitted to Biomedical Journals" (J Am M
ed
Assoc 1997;277:927-934) (see also
http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html).
Journal abbreviations source
Journal names should be abbreviated according to
Index Medicus journal abbreviations: http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html;
List of serial title word abbreviations: http://www.issn.org/2-22661-LTWA-
online.php;
CAS (Chemical Abstracts Service): http://www.cas.org/sent.html.
Supplementary and multimedia data
Elsevier accepts electronic supplementary and multimedia data to support and enhance
your scientific research. Supplementary files offer the author additional possibilities to
publish supporting applications, movies, animation sequences, high-resolution images,
background datasets, sound clips and more. Supplementary files supplied will be
published online alongside the electronic version of your article in Elsevier Web
products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. In order to ensure
that your submitted material is directly usable, please ensure that data are provided in
one of our recommended file formats. Authors should submit the material in electronic
format together with the article and supply a concise and descriptive caption for each
file. Video files: please supply 'stills' with your files: you can choose any frame from
the video or make a separate image. These will be used instead of standard icons and
will personalize the link to your supplementary information. For more detailed
instructions please visit our artwork instruction pages at
http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Submission checklist
It is hoped that this list will be useful during the final checking of an article prior to
sending it to the journal's Editor for review. Please consult this Guide for Authors for
further details of any item.
Ensure that the following items are present:
One Author designated as corresponding Author:
• E-mail address
• Full postal address
• Telephone and fax numbers
All necessary files have been uploaded
• Keywords
• All figure captions
• All tables (including title, description, footnotes)
Further considerations
• Manuscript has been "spellchecked" and "grammar-checked"
81
• References are in the correct format for this journal
• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa
• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources
(including the Web)
• Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on the Web
(free of charge) and in print or to be reproduced in color on the Web (free of charge)
and in black-and-white in print
• If only color on the Web is required, black and white versions of the figures are also
supplied for printing purposes
For any further information please visit our customer support site at
http://epsupport.elsevier.com.
Use of the Digital Object Identifier
The Digital Object Identifier (DOI) may be used to cite and link to electronic
documents. The DOI consists of a unique alpha-numeric character string which is
assigned to a document by the publisher upon the initial electronic publication. The
assigned DOI never changes. Therefore, it is an ideal medium for citing a document,
particularly 'Articles in press' because they have not yet received their full bibliographic
information. The correct format for citing a DOI is shown as follows (example taken
from a document in the journal Physics Letters B):
doi:10.1016/j.physletb.2003.10.071
When you use the DOI to create URL hyperlinks to documents on the web, they are
guaranteed never to change.
Proofs
One set of page proofs (as PDF files) will be sent by e-mail to the corresponding author
(if we do not have an e-mail address then paper proofs will be sent by post) or, a link
will be provided in the e-mail so that authors can download the files themselves.
Elsevier now provides authors with PDF proofs which can be annotated; for this you
will need to download Adobe Reader version 7 (or higher) available free from
http://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html. Instructions on how to
annotate PDF files will accompany the proofs (also given online). The exact system
requirements are given at the Adobe site:
http://www.adobe.com/products/acrobat/acrrsystemreqs.html#70win.
If you do not wish to use the PDF annotations function, you may list the corrections
(including replies to the Query Form) and return them to Elsevier in an e-mail. Please
list your corrections quoting line number. If, for any reason, this is not possible, then
mark the corrections and any other comments (including replies to the Query Form) on
a printout of your proof and return by fax, or scan the pages and e-mail, or by post.
Please use this proof only for checking the typesetting, editing, completeness and
correctness of the text, tables and figures. Significant changes to the article as accepted
for publication will only be considered at this stage with permission from the Editor.
We will do everything possible to get your article published quickly and accurately.
82
Therefore, it is important to ensure that all of your corrections are sent back to us in one
communication: please check carefully before replying, as inclusion of any subsequent
corrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely your responsibility. Note that
Elsevier may proceed with the publication of your article if no response is received.
Offprints
The corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of the article via
e-mail. For an extra charge, paper offprints can be ordered via the offprint order form
which is sent once the article is accepted for publication. The PDF file is a watermarked
version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image
and a disclaimer outlining the terms and conditions of use.
For inquiries relating to the submission of articles (including electronic submission
where available) please visit this journal's homepage. You can track accepted articles at
http://www.elsevier.com/trackarticle and set up e-mail alerts to inform you of when
an article's status has changed. Also accessible from here is information on copyright,
frequently asked questions and more. Contact details for questions arising after
acceptance of an article, especially those relating to proofs, will be provided by the
publisher.
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83
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Clinica Chimica Acta
International Journal of Clinical Chemistry and Diagnostic Laboratory
Medicine
ISSN: 0009-8981
Imprint: ELSEVIER
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Clinica Chimica Acta
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International Journal of Clinical Chemistry and Diagnostic Laboratory Medicine
Clinica Chimica Acta publishes original Research Communications in the field of
clinical chemistry and laboratory medicine, defined as the application of chemistry,
biochemistry, immunochemistry, biochemical aspects of hematology, toxicology, and
molecular biology to the study of human disease in body fluids, cells or tissues. The
objective of the journal is to publish novel information leading to a better understanding
of biological mechanisms of human diseases, their prevention, diagnosis, and patient
management. Reports of an applied clinical character are also welcome. Papers
concerned with normal metabolic processes or with constituents of normal cells or body
fluids, such as reports of experimental or clinical studies in animals, are considered
when they are clearly and directly relevant to human disease. Development and
evaluation of novel analytical methodologies where applicable to clinical chemistry and
laboratory medicine, including point-of-care testing, and topics on laboratory
management and informatics will also be considered.
PUBLICATIONS
Original Research Communications: Peer-reviewed, high-quality, concise research
investigations that represent new and significant contributions to science.
Letters to the Editor: commenting on papers published in Clinica Chimica Acta - these
should be less than 400 words and may include 1 illustration or 1 table.
Invited Critical Reviews of recent central developments in medical biochemistry and
laboratory medicine.
Case reports involving interesting or novel clinical laboratory data.
Meeting announcements.
Consensus recommendations or guidelines on the use of laboratory test for clinical
practice will be considered if they are compiled by a recognized organization or expert
panel (e.g. IFCC, IUPAC, AACC, etc). Please contact the appropriate Editor-in-Chief
for consideration. The responsibility for such material remains with the originating
body.
Manuscript submission
Manuscripts should be submitted to the CCA web site at http://ees.elsevier.com/cca
Submission is only possible online through this web site. Authors are required to
transmit the text and art of the manuscript in electronic form to this address. A
manuscript is accepted for consideration for publication in Clinica Chimica Acta with
the understanding that it has not been published previously (except in abstract form or
as part of a public lecture or academic thesis), that it is not under consideration for
publication elsewhere, that its publication has been approved by all the authors and
tacitly or explicitly by the responsible authorities in the laboratories where the work
was carried out and that, if accepted, it will not be published elsewhere in the same
form, in either the same or another language, without the consent of the Editors-in-
Chief and the Publisher. Reference should be made to previously published abstracts,
etc. in the introductory section.
Responsibility for the accuracy of the material in the
manuscript, including bibliographic citations, lies entirely with the authors.
Relevant ethical approval must be noted for investigations involving human or animal
subjects. Authors are invited to consult any member of the Editorial Board, if in doubt
about any aspect of scope, format or content of a proposed paper.
86
A submission letter should always accompany the submitted paper, providing the
following information:
(a) The full name and address of the corresponding author (including telephone and fax
numbers and E-mail address).
(b) Any kn
own changes of address within a period of six months after submission of the
paper.
(c) The type of paper (Original Research communication, Short communication, Letter
to the Editor, Critical Review etc).
(d) The full title of the submitted paper.
(e) The names, addresses and telephone, fax and e-
mail details (where possible) of three
suitable, potential reviewers. If there are compelling reasons for excluding some
individuals as potential reviewers, these may be mentioned. However, the ultimate
reviewer selection is at the Editors-in-Chief's discretion.
We assume that all of the authors have approved the submitted manuscript. If this
assumption turns out to be incorrect, the manuscript will be withdrawn and will not be
published.
Closely related papers that are in press or that have been submitted elsewhere must be
included with the manuscript.
Submitted manuscripts will generally be published within a week of acceptance and
thus be made public.
For the Americas, Japan and Asia:
Alan H. Wu
San Francisco General Hospital
For Europe, Australia and all other territories:
Joris Delanghe University Hospital Gent
Reviews from all areas:
Greg S. Makowski
Hartford Hospital
The Editors-in-Chief are responsible for the professional review of the manuscripts.
Receipt of manuscripts by the Editors-in-Chief will be acknowledged. All materials
submitted becomes the property of CCA.
Language Editing : Authors who are unsure of correct English usage should have their
manuscript checked by someone proficient in the language. Manuscripts in which the
English is difficult to understand may be returned to the author for revision before
scientific review. The external services offered on our website are for your
consideration only:
www.elsevier.com/locate/languagepolishing
With Asia Science Editing, Elsevier has negotiated a rate of EUR 0.024 per word (ca
87
EUR 6 per page). A EUR 10 handling fee per manuscript is added, if payment is by
credit card. Different rates apply for mathematic-
based manuscripts. Turnaround time is
typically 5 days.
For all third party language editing recommendations, all interaction and responsibility
is between the Author and the Language Editor. Language editing should not be
confused with the copy-editing that takes place during the production process after a
manuscript has been accepted.
Ethics of Experimentation: Scientific investigations involving humans or animals
must have approval of the appropriate ethics committee. When conducting scientific
research using human tissue and which is intended for publication in CCA, authors
should follow procedures that are in accordance with the ethical standards a
s formulated
in the Helsinki Declaration of 1975 (revised 1983). When conducting experiments on
animals, these be carried out in accordance with the EU (86./609/EEC), NIH guidelines,
or local or national requirements for the care and use of laboratory anim
als. A statement
that informed consent was obtained from all subjects must accompany investigations
involving humans.
Revision and publication dates
Manuscripts requiring revision and/or condensation will be returned to the authors by
the Editors-in-Chief, specifying the requested alterations and including the
(anonymous) referee reports. Authors are requested to resubmit the revised manuscript
within three months. Papers not resubmitted within three months will be treated as new
submissions.
Proofreading
Authors of Original Research Communications, Review articles and Case Reports will
receive proofs as a PDF file by e-mail. As acceptance is based upon the submitted
version of the paper, it is essential that no new material be inserted in the text at the
time of proofreading; furthermore, no alterations to style or meaning will be permitted
at this stage. Any new material that the authors may wish to introduce, for reasons of
scientific accuracy, will be checked by the Editors-in-Chief and a charge may be made
for corrections. Elsevier will do everything possible to get your article corrected and
published as quickly and accurate as possible. Therefore, it is important to ensure that
all of your corrections are sent back to us in one communication. Subsequent
corrections will not be possible, so please ensure your first sending is complete.
Page charges: There are no submission fees or page charges
Offprints
The corresponding author will be provided with a free electronic offprint, as a PDF, or
alternatively twenty five printed offprints. An offprint order form, price list and
copyright transfer form are sent upon receipt of the manuscript at the Publisher so that
(extra) offprints may be ordered if required. It is essential that copyright be transfered
at
this stage.
Publication
88
For enquiries relating to the submission of articles please visit the journal's homepage at
http://www.elsevier.com/locate/cca or http://ees.elsevier.com/cca/. From there you can
also track accepted articles (http://www.elsevier.com/trackarticle) and set up e-mail
alerts to inform you of when an article's status has changed, as well as detailed artwork
guidelines, copyright information, frequently asked questions and more.
Contact details for questions arising after acceptance of an article, especially those
relating to proofs, are provided after registration of an article for publication.
PREPARATION OF PAPERS
Authors should consult a recent issue of the journal to make themselves familiar with
the conventions and layout of articles.
The entire text, including figure and table legends and the reference list, should be
double-spaced, leaving margins of approximately 3 cm (1 inch). All pages should be
numbered consecutively and carry a running title, in the upper right corner, starting
with the title page of the manuscript. Every new paragraph should be clearly indented.
Do not use right-hand justification.
Title page. Page 1 should be concise, descriptive and informative. It should include:
(1) The title of the article;
(2) The authors' full names (first name, middle initial(s),and surname); (3) Affiliations
(the name of department (if any), institution, city and state or country where the work
was done), indicating which authors are associated with which affiliation;
(4) Ac
knowledgement of grant support and of individuals who were of direct help in the
preparation of the study;
(5) Disclaimers, (if any);
(6) The name, address, telephone and fax numbers and E-mail address of the
corresponding author Authors are requested to select a maximum of six key words and
to present them on the title page of the typescript. They should cover precisely the
contents of the submitted paper and should give readers sufficient information as to the
relevance of the paper to his/her particular field.
Abstract.
Page 2 of the typescript should be reserved for the Abstract which should
have no more than 200 words. This should follow a structured format, sub-divided into
subsections entitled "Background"; "Methods"; "Results"; and "Conclusions". Each
subsection should be brief and informative, emphasizing those points that are unique to
the paper. Since summaries are increasingly used by abstracting services which will cut
off after a fixed number of words, it is important not to exceed the maximum
number of
words and to avoid bibliographic references and non-standard abbreviations.
Text.
After the Abstract, Original Research Communications should be organized in the
following format: Introduction, Materials and methods, Results, Discussion,
Acknowledgements, List of abbreviations, References.
Introduction This is a short section in which the authors should clearly state the reasons
for and aims of the investigation. Summarise the rationale for the study and hypothesis
89
tested by it, with brief reference to relevant previous work.
Materials and methods The section Materials and methods should be detailed enough
for readers to reproduce the experiments. Authors should always refer to other work on
the same subject, indicating whether or not their experimental results are in agreement
with previous work. Conclusions drawn from experiments described in the tables or
figures can often appear most conveniently in the Results section.
Result and Discussion The overall conclusions based on the work reported should be
given in the Discussion. In some cases, Results and Discussion sections may more
appropriately be combined than separated (at the author's discretion). Every effort
should be made to avoid jargon, to spell out all non-standard abbreviations the fir
st time
they are mentioned and to present the contents of the study as clearly and concisely as
possible.
Reports of new or improved methods should be as brief as is consistent with clarity (up
to about 1000 words). They should unequivocally identify the element of novelty
claimed and the advantages over existing technology. Performance characteristics,
including effects of interfering substances, comparisons with results of accepted
methods and reference values based on appropriate population samples should be
documented by adequate data. Citing of earlier publications is preferred to repetition of
details for reagents, procedures, etc., which are always in print. Nevertheless, the
information provided must suffice to allow readers to duplicate the work or to compare
the technique with current practice. Instrument and kit evaluations usually will not be
accepted unless a new principle is involved.
Acknowledgements
Only persons who have made substantial contributions to the work should be
acknowledged. Authors are responsible for obtaining written permission from everyone
acknowledged by name because readers may infer their endorsement of the data and
conclusions.
The source(s) of support in the form of grants, equipment, drugs, or all of these should
be acknowledged here.
References
Type references double-spaced and number them consecutively in the order in which
they are first quoted in the text. Identify references in text, tables and legends by arabic
numerals [square brackets]. References cited only in tables or in legends to figures
should be numbered in accordance with a sequence established by the first
identification in the text of the particular table or illustrations. Please note that all
authors should be listed when six or less; when seven or more, list only the first three
and add et al. The names of journals should be abbreviated according to the list of serial
title word abbreviations (ISDS, Paris, l985, ISBN 2-904938-02-8). Do not include
references to personal communications, unpublished data or manuscripts either 'in
preparation' or 'submitted for publication'. Reference to a paper as 'in press' implies that
it has been accepted for publication. Recheck references in the text against the
reference list after your manuscript has been revised and renumber accordingly.
Incomplete references can result in publication delay.
Examples of correct forms of references are as follows:
90
[1] Lott JA,Curtis LW, Thompson A, Gechlik GA, Rund DA. Reported alcohol
consumption and the serum carbohydrate-deficient transferrin test in third-year medical
students. Clin Chim Acta 1998; 276:121-128
[2] Strunk W, White EB, The elements of style, third ed. New York: Macmillan, 1979.
[3] Kennedy L. Glycation of haemoglobin and serum proteins. In: Alberti KGMM,
DeFronzo RA, Keen H, Zimmet P, editors. International textbook of Diabetes Mellitus.
Chichester: John Wiley, 1992: 985-1007.
Tables
Tables should be used sparingly; they should be used only when the data cannot be
presented clearly in the text. Each table, and every column should be provided with an
explanatory heading, with units of measure clearly indicated. The heading of the table
should make its general meaning understandable without reference to the text. Authors
are requested to consult recent issues of
CCA for the proper table layout. Cite each table
in the text in consecutive order. The Editor-in-Chief, on accepting a manuscript, may
recommend that additional tables containing important backup data, too extensive to be
published in the article, may be published as supplementary material (see below) or
deposited with the National Auxiliary Publications Service or made available by the
author(s). In that event, an appropriate statement will be added to the text. Submit such
tables for consideration with the manuscript.
Figures
Figures should be used to illustrate experimental results clearly. Illustrations for
reproduction should normally be about twice the final size required as figures are often
reduced to a one-column width. Symbols, lettering and li
nes should be sufficiently large
and clear to be legible after reduction. Photographs of tissues, cells, or subcellular
components should be included only when they are essential. For more detailed
instructions please visit our artwork instruction pages at
http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Colour Figures
Colour figures may be included in the article in the printed issue, but generally this
expense must be borne by the authors. However, if, together with your accepted article,
you submit usable colour figures, then Elsevier will ensure, at no additional charge, that
these figures will appear in colour on the Web (e.g., ScienceDirect and other sites)
regardless of whether these illustrations are reproduced in colour in the printed version.
For colour reproduction in print, you will receive information regarding the costs from
Elsevier after receipt of your accepted article. For more detailed instructions please visit
our artwork instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions
. [Please
note: Because of technical complications that can arise in converting colour figures to
"grey scale" (for the printed version should you not opt for colour in print), please
submit in addition usable black-and-white files corresponding to all the colour
illustrations.] As only one figure caption may be used for both colour and black and
white versions of figures, please ensure that figure captions are meaningful for both
91
versions, if applicable.
Figure Legends. Legends should be collated, typed double-spaced, numbered with
Arabic numerals corresponding to the illustrations, and submitted on a separate page.
When symbols, arrows, numbers, or letters are used to identify parts of the illustrations,
each should be explained clearly in the legend. For photomicrographs, the internal scale
markers should be defined and the method of staining should be given. The legends
should permit the figures to be understood without reference to the text. If the figure has
been previously published, a credit line should be included and a permission letter
supplied by the author.
Figures. Figure legends should be provided as text, placed after the reference section in
the main manuscript file. Number figures consecutively with Arabic numerals. When
creating your figures, use font sizes and line weights that will reproduce clearly and
accurately when figures are sized to the appropriate column width. The minimum line
weight is 0.5 point. Thinner lines will not reproduce well. Eliminate all excess white
space from the borders of each figure. Do not include figure legends or other extraneous
text in a graphic file. For more detailed instructions please visit our artwork instruction
pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Quantities and units
These should be in conformity with international practice relating to the use of SI units:
thus concentrations of solutes of known molecular mass should normally be stated in
mol/l or recognized submultiples thereof (nmol/l, etc.). Other solutes should be
expressed in g/l, mg/l, etc. Reagent composition may be specified either in molar terms
or in mass or volume of each solute per liter of final solution (% or w% should not be
used). Enzyme activities should be reported in katals or U/l whenever possible and
should be accompanied by a reference to, or a description of, the procedure used for the
measurements.
PREPARATION OF SUPPLEMENTARY MATERIAL
Elsevier now accepts electronic supplementary material to support and enhance your
scientific research. Supplementary files offer additional possibilities for publishing
supporting applications, movies, animation sequences, high-resolution images,
background datasets, sound clips, and more. Supplementary files supplied will be
published online alongside the electronic version of your article in Elsevier Web
products, including ScienceDirect ( http://www.sciencedirect.com
). For more detailed
instructions please visit our artwork instruction pages at
http://www.elsevier.com/artworkinstructions
PUBLICATION
Copyright Transfer: Upon acceptance of an article, authors will be asked to sign a
"Journal Publishing Agreement" (for more information on this and copyright see
http://www.elsevier.com/copyright). Acceptance of the agreement will ensure the
widest possible dissemination of information. An e-mail (or letter) will be sent to the
corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a "Journal
Publishing Agreement" form or a link to the online version of this agreement.
92
US National Institutes of Health (NIH) voluntary posting ("Public Access") policy.
Elsevier facilitates author posting in connection with the voluntary posting request of
the NIH (referred to as the NIH "Public Access Policy", see
http://publicaccess.nih.gov) by submitting the peer-reviewed author's manuscript
directly to PubMed Central on request from the author, immediately after final
publication. Please e-mail us at [email protected] that your work has
received NIH funding (with the NIH grant/project number(s), as well as name and e-
mail address of the Principal Investigator(s)) and that you intend to respond to the NIH
request. Upon such confirmation, Elsevier will submit to PubMed Central on your
behalf a version of your manuscript that will include peer-review comments, for public
access posting 12 months after the final publication date. This will ensure that you will
have responded fully to the NIH request policy. There will be no need for you to post
your manuscript directly to PubMed Central, and any such posting is prohibited
(although Elsevier will not request that manuscripts authored and posted by US
government employees should be taken down from PubMed Central). Individual
modifications to this general policy may apply to some Elsevier journals and its society
publishing partners.
Proofs will be sent to the correspond
ing author of an article by email in a PDF file. The
proof should be checked carefully and corrections (including replies to a Query Form)
should be returned in an e-mail to Elsevier using the "reply" button within 2 days of
receipt. Only printer's errors may be corrected: no changes in or additions to the edited
manuscript will be allowed at this stage.
E-Offprints. The corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of
the article via e-mail or, alternatively, 25 free paper offprints. The PDF file is a
watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal
cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use.
Author's rights
As an author you (or your employer or institution) may do the following:
•
make copies (print or electronic) of the article for your own personal use,
including for your own classroom teaching use
•
make copies and distribute such copies (including through e-mail) of the article
to research colleagues, for the personal use by such colleagues (but not
commercially or systematically, e.g., via an e-mail list or list server)
•
post a pre-print version of the article on Internet websites including electronic
pre-print servers, and to retain indefinitely such version on such servers or sites
•
post a revised personal version of the final text of the article (to reflect changes
made in the peer review and editing process) on your personal or institutional
website or server, with a link to the journal homepage (on elsevier.com)
•
present the article at a meeting or conference and to distribute copies of the
article to the delegates attending such a meeting
•
for your employer, if the article is a 'work for hire', made within the scope of
your employment, you employer may use all or part of the information in the
article for other intra-company use(e.g., training)
93
•
retain patent and trademark rights and rights to any processes or procedure
described in the article
•
include the article in full or in part in a thesis or dissertation (provided that this
is not to be published commercially)
•
use the article or any part thereof in a printed compilation of your works, such
as
collected writings or lecture notes (subsequent to publication of your article in
the journal)
•
prepare other derivative works, to extend the article into book-length form, or to
otherwise re-use portions or excerpts in other works, with full acknowled
gement
of its original publication in the journal
Updated April 2006 - for the latest version please check the journal's web site:
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