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LEIDIANE AMORIM SOARES GALVÃO
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MSP-1 DE PLASMODIUM VIVAX DE
PACIENTES ATENDIDOS NA FUNDAÇAO DE MEDICINA TROPICAL DA
CIDADE MANAUS – AM
Manaus
2010
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LEIDIANE AMORIM SOARES GALVÃO
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MSP-1 DE PLASMODIUM VIVAX DE
PACIENTES ATENDIDOS NA FUNDAÇAO DE MEDICINA TROPICAL DA
CIDADE MANAUS – AM
Manaus
2010
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Saúde, Sociedade e Endemias da
Amazônia, da Universidade Federal do
Amazonas, como requisito avaliativo para a
obtenção do título de Mestre em: Saúde,
Sociedade e Endemias da Amazônia em área de
concentração: Determinantes Bio-Sociais do
processo saúde-doença na Amazônia.
Linha de Pesquisa: Biologia de Agentes
infecciosos e parasitários
Orientador: Dr. Paulo Afonso Nogueira
Co-orientadora: Dra. Patrícia Puccinelli Orlandi
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LEDIANE AMORIM SOARES GALVÃO
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MSP-1 DE PLASMODIUM VIVAX DE
PACIENTES ATENDIDOS NA FUNDAÇAO DE MEDICINA TROPICAL DA
CIDADE MANAUS – AM
Banca Examinadora
Dr. Paulo Afonso Nogueira
Instituto de Pesquisas Leônidas e Maria Deane/FIOCRUZ - AM
Dr. Felipe Naveca
Instituto de Pesquisas Leônidas e Maria Deane/FIOCRUZ - AM
Dr. Danivaldo Vieira
Centro Universitário Uninilton-Lins – Manaus/AM
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Saúde, Sociedade e Endemias da
Amazônia, da Universidade Federal do
Amazonas, como requisito avaliativo para a
obtenção do título de Mestre em: Saúde,
Sociedade e Endemias da Amazônia em área de
concentração: Determinantes Bio-Sociais do
processo saúde-doença na Amazônia.
Linha de Pesquisa: Biologia de Agentes
infecciosos e parasitários
Orientador: Dr. Paulo Afonso Nogueira
Co-orientadora: Dra. Patrícia Puccinelli Orlandi
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AGRADECIMENTOS
• Ao Programa de Pós-Graduação em Saúde, Sociedade e Endemias da Amazônia –
UFAM, CpqLMD, UFPA, pela oportunidade de realização dessa dissertação;
• A pessoa que me concedeu a oportunidade de entrar em um Mestrado, a essa pessoa
que me estendeu a mão quando precisei lançando o convite para morar em Manaus e
recomeçar; minha orientadora de Monografia, Co-orientadora de mestrado e
futuramente orientadora de doutorado Dra. Patrícia Orlandi;
• Ao Dr. Paulo Nogueira, por ter me aceitado como orientanda, por ter intermediado
oportunidades em congressos que participei durante o mestrado, pela paciência e pela
confiança em minha competência profissional;
• Ao Mestre Luis André Mariúba, meu supervisor de mestrado, amigo, me ajudou
muitas vezes quando precisei obrigada pela paciência em ensinar, pela disposição e
boa vontade;
• A Universidade Federal do Amazonas pela oportunidade e concessão de bolsa de
estudos;
• A secretaria do Programa PPSSEA – SECA pela competência e disposição e
dedicação;
• Ao Instituto de Pesquisas Leônidas e Maria Deane pelo fornecimento de materiais e
infra-estrutura para o desenvolvimento desse estudo;
• Ao Dr. Marcus Vinícios Lacerda pela colaboração em relação às amostras de sangue
dos pacientes positivos para malária, atendidos na Fundação de Medicina Tropical;
• A Dra. Silvana Paz da Fiocruz BA, pelo Sequenciamento das amostras;
• Ao laboratório de biotecnologia da UFAM, na pessoa do Prof. Dr. Spartaco Astolfi e a
Mestranda Enedina Nogueira pela colaboração com equipamentos;
• Aos colegas de laboratório que muitas vezes me socorreram em alguns experimentos,
em especial a Luciana, Davi, Yuri e Fernanda que colaboraram grandemente em
momentos sufocantes com as purificações, géis e etc...;
• A meu marido Lenilson, por mais uma vez ter enfrentado e agüentado junto comigo os
desafios que é um curso de formação superior, a cada etapa cumprida o crescimento
pessoal e profissional com certeza é desfrutado não só por mim, mais por ele também
que vivenciou e vivencia todos os momentos de minha carreira profissional;
• A toda família Amorim, família de fibra, coragem e com certeza uma família de
vitórias; em especial aqueles que vivenciaram minha mudança à cidade de Manaus,
me apoiaram e acreditam que tudo é possível;
• A minha mãe, pai e irmãos que são pessoas especiais para mim;
• A família Galvão Rocha que torcem por mim e sempre acreditam em dias melhores;
• Aos amigos verdadeiros que conquistei em Manaus;
• Aos colegas de Porto Velho que em Manaus se tornaram meus amigos, dividindo
nossos rumores e nossos temores;
• Aos meus amigos queridos espalhados pelo Brasil;
A TODOS MUITO OBRIGADA!
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RESUMO
No Brasil a malária ao lado de leishmanioses está em processo de expansão. O seu controle
total pela intervenção no seu ciclo biológico é difícil, não só pelas condições sócio-
econômicas da população sob risco, mas porque envolvem elementos como insetos vetores
cujo controle ou eliminação são racionalmente irrealizáveis. A vacina, portanto, é uma
ferramenta que poderia contribuir efetivamente para esse controle. Um dos grandes problemas
para o desenvolvimento da vacina é a diversidade antigênica das proteínas candidatas. Dentre
as proteínas candidatas a vacina, a proteína 1 de superfície do Plasmodium vivax (pvMSP1) é
uma forte candidata, já que possui um papel protetor espécie – específico. Em nosso estudo,
realizamos a genotipagem de isolados de Plasmodium vivax através de Reação em Cadeia da
Polimerase e Sequenciamento dos blocos polimórficos 2, 6 e 10 da pvMSP1 com o objetivo
de analisar filogeneticamente através de análise computacional a estrutura gênica e a
diversidade alélica de isolados de P.vivax circulantes no entorno de Manaus. Os isolados do
bloco 2 mostraram ser blocos bastante polimórficos, porém, com características semelhantes ,
formando haplótipos diferentes. Em todos os blocos analisados, detectamos genótipos
semelhantes às cepas encontradas no Brasil, bem como a cepas encontradas em outras regiões
geográficas. O bloco 6 apresentou um perfil semelhante ao já descrito por estudos anteriores,
sendo um bloco rico em glutamina que é um determinante de recombinação gênica entre
cepas e pode ser determinante de cepas pertencentes ao genótipo Belém. O bloco 10 foi o
bloco mais conservado do nosso estudo. Percebemos que esse bloco tem seqüências que não
são conservadas apenas em nossa região, mas também em outras regiões geográficas, como é
o caso de regiões da Ásia, por exemplo.
Palavras Chaves: MSP1, Malária, Plasmodium vivax
ABSTRACT
Malaria in Brazil, beside leishmaniasis disease, is under an expansion process. Its
complete control through life cycle intervention is too difficult, not only by economic and
social conditions of population under risk, but because it involves elements like the
invertebral vector, which control or elimination are rationally unrealistic. A vaccine,
therefore, is a tool which could effectiveness contributes to malaria control. One of the
biggest problems on vaccine development is the antigenic diversity of candidates proteins.
Among these candidates, “merozoite surface protein 1” (pvMSP1) of Plasmodium vivax is a
strong one, since it has a protector role (specie-specific). In this study, we made a genotyping
of P. vivax isolates using polymerase chain reaction (PCR) and sequencing the polymorphic
blocks 2, 6 and 10 of pvMSP1, with the goal to analyze (using phylogenetic tools) the genetic
structure and allelic diversity of P. vivax from periphery Manaus-AM, Brazil. The isolates of
block 2 shown to be very polymorphic, although having similar characteristics, they formed
different haplotypes. On each block analyzed, we detected genotypes similar to others clones
found in Brazil, likewise clones found in other regions of the globe. The block 6 shown
results similar to previous studies, being a glutamine rich block. It’s a characteristic which
lead to genomic recombination between clones and could be a key region to determine clones
that belong to Belem genotype. The block 10 was the most conserved one of our study. We
realized that block 10 has sequences not only conserved in our region, but in other regions of
the globe too, like Asia, for example.
Key words: MSP1; Malaria; Plasmodium vivax.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURAS
Figura 1: Distribuição geográfica e endemicidade da malária no mundo.
Figura 2: Mapa esquemático, mostrando a distribuição da incidência parasitária de malária
anual no Brasil.
Figura 3: Ciclo de vida da malária.
Figura 4: Herança de genes cromossômicos em parasitas da malária.
Figura 5: Método para analisar os cruzamentos entre os clones de parasitas da malária.
Figura 6: Processamento MSP1.
Figura 7: Amostras positivas no PCR bloco 2 com fragmentos com tamanhos 473 a 515 PB.
Figura 8: Amostras positivas no PCR bloco 6 com fragmentos com tamanhos 470 a 515 PB.
Figura 9 e 10: Amostras positivas no PCR bloco 10 com fragmentos com tamanhos 500 a
615 PB.
Figura 11: Identidade das seqüências do bloco 2 dos isolados deste estudo com seqüência
disponibilizadas no genbank.
Figura 12a: Alinhamento dos isolados do bloco 2 com isolados oriundos do genbank.
Figura 12b: Alinhamento dos isolados do bloco 2 com isolados oriundos do genbank
Figura 13: Cladograma referente ao alinhamento entre bloco 2 e seqüências disponibilizadas
no genbank
Figura 14: Seqüência peptídica SDENAKRGGQSTN conservada em alguns isolados.
Figura 15: Recombinação na seqüência PAPAAPSSTNANYEAKKIIYQAIYNGI.
Figura 16: Recombinação ISDENAKRGSQ SPAPAAPSSTNANYE.
Figura 17: Repetições de SSX, onde X refere-se a qualquer aminoácido.
Figura 18: Identidade das seqüências do bloco 2 dos isolados deste estudo com seqüências
disponibilizadas no genbank.
Figura 19a: Alinhamento das seqüências do bloco 6 com seqüências do genbank
Figura 19 b: Alinhamento das seqüências do bloco 6 com seqüências do genbank
Figura 20: Cladograma entre seqüências do bloco 6 do gene MSP-1 com seqüências do
genbank.
Figura 21: Identidade das seqüências do bloco 10 dos isolados deste estudo com seqüências
disponibilizadas no genbank.
Figura 22: Alinhamento referente a seqüências dos isolados do bloco 10 do gene MSP1
associadas a seqüências do genbank.
Figura 23: Cladograma referente a seqüências do bloco 10 associadas com seqüências do
geenbank
Figura 24: Percentual de identidade e divergência entre os isolados do bloco 2 associados
com seqüências do genbank.
Figura 25: Percentual de identidade e divergência entre os isolados do bloco 6 associados
com seqüências do genbank.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
GRÁFICOS
Gráfico 1: Amplificação por PCR Real Time com alvo para P.vivax
Gráfico 2: Distribuição das repetições dos produtos de PCR do bloco 2, 6, 10 nos isolados.
TABELAS
Tabela 1: Variação no tamanho dos fragmentos de bandas do bloco 2 do gene MSP1
visualizados em gel de agarose
Tabela 2: Variação no tamanho dos fragmentos de bandas do bloco 6 do gene MSP1
visualizados em gel de agarose.
Tabela 3: Variação no tamanho dos fragmentos de bandas do bloco 10 do gene MSP1
visualizados em gel de agarose.
Tabela 4: Isolados positivos comparados a negativos de acordo com a amplificação de cada
bloco.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.............................................................................17
1.1 A Malária no Mundo......................................................................17
1.2Malária no Brasil...........................................................................18
1.3Aspectos Gerais da doença..............................................................20
1.4Genes Polimórficos em Plasmo dium................................................22
1.5Recombinação Genética..................................................................23
1.6 Vacina contra a malária.................................................................28
1.7Proteína de Superfície do Merozoíto................................................32
2.OBJETIVO.....................................................................................36
2.1 Objetivos Específicos....................................................................36
3.METODOLOGIA............................................................................38
3.1 População e Área de Estudo...........................................................38
3.2 Coleta e Considerações Éticas........................................................38
3.3 Processamentos das Amostras e Extração de
DNA.................................................................................................38
3.4 Primers e PCR..............................................................................38
3.5 Purificações de amostras de DNA genômico em gel de
agarose..............................................................................................39
3.6 Sequenciamento dos Produtos de
PCR..................................................................................................39
3.7 Análises das Seqüências................................................................39
4. RESULTADOS..............................................................................41
4.1 Amostras do gene MSP1 com PCR positivo......................................41
4.2 Variações no tamanho dos fragmentos de bandas visualizados em gel
de agarose..........................................................................................42
4.2.1 Bloco 2.....................................................................................42
4.2.2 Bloco 6.....................................................................................43
4.2.3 Bloco 10....................................................................................44
4.3 Isolados positivos comparados a negativos de acordo com a
amplificação de cada bloco..................................................................45
4.4 Análises das Seqüências................................................................47
4.4.1 Bloco 2.....................................................................................47
4.4.2 Alinhamento entre seqüências do bloco 2 com seqüências
disponibilizadas no genbank................................................................47
4.4.3 Cladograma referente ao alinhamento entre bloco 2 e seqüências
disponibilizadas no genbank................................................................50
4.5 Recombinações de seqüências encontradas no bloco 2......................51
4.5.1 Seqüência peptídica SDENAKRGGQSTN conservada em alguns
isolados......................................................................................................................51
4.5.2 Recombinação na seqüência
PAPAPPSSTNANYEAKKIIYQAIYNGI................................................52
4.5.3 Seqüência contendo evidência de processo recombinatório
LISDENAKRGSQ SPAPAAPSSTNANY...............................................53
4.5.4 Repetições de SSX.....................................................................54
4.6 Identidade das sequências do bloco 6 dos isolados deste estudo com
sequências disponibilizadas no genbank...............................................55
4.6.1 Alinhamento das sequências do bloco 6 com sequências do
genbank.............................................................................................55
4.6.2 Cladograma da seqüência obtida através do seqüenciamento entre os isolados do
bloco 6................................................................................................58
4.7 Análises das seqüências do bloco 10 do gene MSP1....................................................59
4.7.1 Identidade das seqüências do bloco 10 dos isolados deste estudo com seqüências
disponibilizadas no genbank...............................................................................................59
4.7.2 Alinhamento referente a seqüências do bloco 10 associadas com seqüências do
genbank...............................................................................................................................59
4.7.3 Cladograma referente a seqüências do bloco 10 associadas com seqüências do
genbank...............................................................................................................................61
5. DISCUSSÃO..................................................................................63
6. CONCLUSÃO................................................................................69
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................72
8. ANEXO.........................................................................................77
Introdução
___________________________________________________________Introdução
17
1. INTRODUÇÃO
1.1 A malária no mundo
A Malária é a doença parasitária com maior número de internações
e mortes por ano em todo o mundo, sendo um dos maiores problemas de
saúde pública na África, América do Sul e Ásia Oriental, segundo
estimativas da Organização Mundial de Saúde, 243 milhões de pessoas
ficaram doentes em 2008 (WHO, 2009). Em geral os países que
apresentam maior endemia são os países subdesenvolvidos.
A malária está distribuída em regiões tropicais e subtropicais do
mundo, onde epidemias podem ocorrer em populações com pouca ou
nenhuma imunidade, fatores naturais (tais como variações climáticas) ou
ações humanas que modificam o meio ambiente (abertura de campos para
agricultura, construção de barragens, mineração) aumentam a população
dos mosquitos vetores da malária (Guerra et al., 2006).
A transmissão da doença não ocorre de forma homogênea, havendo
regiões com menor risco de infecção (regiões hipo-mesoendêmicas) e
maior (hiper-holoendêmicas) (Figura 1). A grande divergência observada
no estabelecimento da malária entre as diferentes regiões do mundo é
resultado da variação da dinâmica de transmissão parasito-vetor-
hospedeiro, que favorece ou limita a transmissão dos riscos da doença e
morte(Brasil,2006).
Figura 1
: Distribuição geográfica e endemicidade da malária no Mundo.
___________________________________________________________Introdução
18
Em localidades onde as condições são favoráveis à transmissão predomina a
espécie mais virulenta, o Plasmodium falciparum (P. falciparum), esta espécie está
associada a mais de 95% dos casos de malária registrados anualmente em
todo o mundo, sendo capaz de causar a forma grave da doença (WHO,
2005). O P.falciparum se restringe a determinadas regiões do globo,
principalmente ao continente Africano. Nas áreas do continente
Americano e Asiático o número de casos de malária pelo Plasmodiu m
falciparum oscila entre 20 a 32% (WHO, 2005).
Com 35 milhões de casos anuais, o Pla smodium vi vax (P.viva x) é
o segundo maior patógeno responsável pela malária em humanos e a
espécie de maior distribuição geográfica. Na América Central e México,
quase 100% dos casos são causados por P.vivax (WHO., 2000), na região
das Andinas, que abrange os países da Venezuela, Colômbia, Peru,
Equador e Bolívia, quase 80% dos casos são causados por P.vivax.
Embora a “malária viva x” não apresente a mesma gravidade e
mortalidade comparada a “malária falciparum”, ela possui uma alta
morbidade e consequentemente um impacto econômico nas comunidades
onde é endêmica (Herrera & Arévalo-Herrera.,2007). Estima-se que cada
indivíduo residente em uma área mesoêndemica de P.vi vax possa ter de
10 a 30 episódios de malária, durante a infância e vida adulta produtiva
(Mendis et al., 2001).
1.2 Malária no Brasil
No Brasil são encontrados três espécies do protozoário causador da
malária, P.vivax, P.mala riae e P.f alciparum, noventa e nove por cento
dos casos de malária são registrados anualmente na região da Amazônia
legal, que é composta pelos estados do Acre, Amapá, Amazonas, Pará,
Rondônia, Roraima, Tocantins, Mato Grosso e Maranhão (DATASUS
2008).
De acordo com uma nova avaliação do Ministério da Saúde, os
casos da doença notificados em 2008 totalizaram 309.419 registros,
32,4% menos que o acumulado em 2007, que chegou a 457.569 casos na
___________________________________________________________Introdução
19
mesma região. Essa redução vem sendo resultado de um importante plano
de intensificação das ações de controle de malária (PIACM) para a
Amazônia legal, o qual foi implantado a partir do ano 2000, com o
objetivo de reduzir a incidência da doença, evitando o surgimento de
epidemias localizadas e reduzindo a gravidade das infecções com
diagnóstico e tratamento precoce. As medidas priorizaram municípios
com índice parasitário anual (IPA) maior que 49,9 (responsáveis por 80%
dos casos da doença na região), além daqueles com prevalência de
“malária falcipa rum” maior que 20% (DATASUS, 2008).
O risco de transmissão de malária na região da Amazônia legal
pode ser estimado pelo IPA, esse índice baseia-se na determinação do
número anual de casos por 1000 habitantes. A Figura 2 mostra as áreas
classificadas para malária como de alto risco (mais de 100 casos/ 1000
Hab), médio risco (entre 1 e 100 casos /1000 Hab) e baixo (menos que 1
caso/ 1000 Hab) (Martinez- Spinosa et al. ,2004).
Figura 2
: Mapa esquemático, mostrando a distribuição da incidência parasitária de malária anual no
Brasil.
Fonte: WHO, 2009
___________________________________________________________Introdução
20
471.894 637.474 615.247 389.762 349.896 409.960 465.880 607.
1.3 Aspectos Gerais da Doença
O ciclo eritrocítico do parasito é responsável pela patogenia e
manifestações da doença que se caracterizam por padrões clínicos
(paroxismo) tais como febre alta, calafrios, sudorese e cefaléia, como
conseqüência da ruptura das hemácias infectadas com esquizontes e do
processo inflamatório sistêmico decorrente do material oriundo desta
ruptura.
De um modo geral, as formas clínicas mais graves são causadas
por P.f alciparum, onde o quadro clínico pode evoluir para formas de
malária complicada, através de outros processos fisiopatológicos levando
a malária cerebral, anemia, edemas, malária gestacional, insuficiência
renal aguda dentre outras (Brasil, 2006).
O ciclo de vida da malária (Figura 3) é iniciado quando a fêmea de
mosquito do gênero Anopheles exerce hematofagia em um hospedeiro
humano, durante seu repasto sanguíneo, contendo formas sexuadas
maduras denominadas gametócitos femininos e masculinos. No estômago
do mosquito o gametócito masculino sobre exflagelação originando
gametas masculinos ou microgametas, e o gametócito feminino sofre
maturação formando gameta feminino ou macrogametas. O microgameta
fertiliza o macrogameta e a fusão desses dois forma zigoto, que após
tornar-se móvel é chamado oocineto. O oocineto fixa-se na parede do
estômago, entre as células epiteliais, sendo denominado oocisto dentro
deste formam-se muitos esporozoítos, que são as células elongadas e
móveis com um núcleo central, que, após a liberação na cavidade
corpórea do mosquito alcançam as glândulas salivares tornando-o
infectivo. Quando o mosquito novamente, realiza o repasto sanguíneo, os
esporozoítos são injetados na corrente circulatória. Após um tempo
máximo de 30 minutos, os esporozoítos entram nos hepatócitos e iniciam
o processo de divisão assexual conhecido como esquizogonia pré –
eritrocítica. Após 12 a 15 dias os esquizontes rompem as células e
liberam merozoítos na circulação (Perlmann & Troye Blomberg., 2002).
___________________________________________________________Introdução
21
Os merozoítos invadem células vermelhas no sangue e
transformam-se em trofozoítas jovens ou anéis. Quando começam a
crescer e seu citoplasma torna-se mais irregular, são denominados
trofozoítas maduros que após a esquizogonia contem vários merozoítas
em seu interior. Após o término de divisão o esquizonte rompe a hemácia
e os merozoítas liberados na corrente circulatória invadem novas
hemácias e fazem novo ciclo eritrocítico (Rey, 2002).
Esta liberação de parasitas na circulação é responsável pelo
aparecimento dos sintomas devido à liberação de fatores do parasito, tais
como hemozoína, âncoras glicosilfosfatidilinositol (GPI) e metabólitos
oriundos da clivagem celular que estimulam a reação inflamatória
sistêmica com a produção de citocinas pró-inflamatórias. A duração do
ciclo eritrocítico determina a periodicidade desses sintomas, variando
entre as espécies de Plasmodium (Amino et al., 2006).
Após algumas gerações de merozoítas alguns se diferenciam em
formas sexuadas (gametócitos) sofrem maturação e são ingeridos por
fêmeas de anofelinos durante o repasto sanguíneo, fechando o ciclo
(Amino et al., 2006).
___________________________________________________________Introdução
22
1.4 Genes Polimórficos em Plasmodium
A existência de cepas de P. vivax e P.f alciparum tem sido
documentada ao longo dos últimos 100 anos. A manifestação de cepas
resistentes ao tratamento com drogas antimaláricas é um exemplo
evidente do surgimento de novas formas do parasito em resposta à
seleção, e só em tempos relativamente recentes, entretanto, que a
verdadeira extensão dos polimorfismos genéticos em populações naturais
de parasitas tornou-se evidente. Formas eletroforéticas de enzimas
estavam entre os primeiros marcadores bioquímicos usados para
diferenciar isolados de Plasmodium (Carter, 1973), esse método fo i
complementado por eletroforese bidimensional para diferenciar formas
alélicas de proteínas, através do ponto isoelétrico e tamanho molecular,
cerca de 20 proteínas de P.falciparu m poderam ser diferenciadas
(Fenton, 1985). Métodos sorológicos, especialmente aqueles que utilizam
Figura 3
: Ciclo de vida da malária
Fonte: WHO, 2009.
___________________________________________________________Introdução
23
anticorpos monoclonais também foram extremamente valiosos para
diferenciar formas variantes de antígenos isolados de campos (McBride
et al., 1985). Em tempos mais recentes, a identificação de genes e
seqüências de Plasmodium levaram ao amplo uso de metodologias
baseadas no DNA, especialmente Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
para obter marcadores genéticos, e isso tornou-se o método de escolha
para estudos de campo sobre a diversidade genética. A principal
vantagem do método da PCR é que pode ser aplicado sobre parasitas em
pequenas amostras de sangue ou mesmo em mosquitos sem necessidade
de uma cultura parasitária. Através dessa técnica foi possível identificar
alguns genes constituintes da superfície do merozoíto em Plasmodium
falciparum, como a Proteína 1 de Superfície do Merozoíto , Proteína 2 de
Superfície do Merozoito (MSP1, MSP2) (Kimura et al., 1990), Proteína
rica em glutamato (GLURP) (Borre et al., 1991), a Proteína
circunsporozoito (CSP) (Arnort et al., 1993) e microssatélites de
seqüências de DNA repetidas, que variam em número de alelos diferentes
(Su & Wellems, 1996). Alelos desse tipo diferem em tamanho e podem
ser facilmente distinguidos pela eletroforese de seus produtos de PCR
amplificados em gel de agarose. Variação da seqüência entre os alelos de
MSP1 e MSP2 podem ser detectadas usando seqüência de primers
específicos em reações de PCR ou por hibridização de seqüências através
de sondas específicas para os produtos da PCR amplificados (Babiker et
al., 1994).
A extensão destes genes polimórficos nas populações de parasitas
aumenta a diversidade antigênica das cepas circulantes de modo que a
imunidade adaptativa é cepa específica. Este fenômeno representa o
grande entrave para desenvolvimento de uma vacina anti - malárica
efetiva (Su et al., 1997).
1.5 Recombinação genética
Toda a variação genética se origina ou por mutação genética ou
por recombinação. Este último é o principal mecanismo para a geração
de formas de um organismo com novos genótipos. Em eucariontes, a
___________________________________________________________Introdução
24
recombinação ocorre principalmente na meiose e muito mais raramente
na mitose. No Plasm odium, a meiose ocorre na formação do zigoto. Em
termos gerais, a meiose permite (I) uma variedade independente de genes
em cromossomos diferentes, (II) croosing - over entre genes ligados no
mesmo cromossomo, e (III) eventos de recombinação intragênica. Os
mecanismos I e II dão origem a formas com novas combinações de genes,
tais como duplicações e deleções enquanto (III) é um mecanismo de
geração de novos alelos dos genes. O parasito da malária é haplóide para
a maioria de seu ciclo (Walliker et al., 1975), com um único estágio
diplóide sendo o zigoto formado pela união de gametas no mosquito. No
caso de o mosquito exercer hematofagia contendo gametócitos de apenas
um único clone, somente a autofecundação poderá acontecer devido os
gametas serem geneticamente idênticos, produzindo zigotos
homozigóticos. Se ocorrer gametócitos de mais de um clone podem
ocorrer eventos de passagem, resultando em recombinação
heterozigóticas (Figura 4). A Recombinação meiótica não deverá ter
grandes efeitos genéticos nos homozigotos porque ambos os alelos de
todos os genes são idênticos, no entanto, processos como a replicação de
derrapagem e crossing-over desigual poderiam resultar em situações
como novos alelos que apresentam variações no número de unidades
repetidas, visto em alguns genes. Em heterozigotos, entretanto, a
recombinação meiótica inevitavelmente leva à produção de formas
haplóides recombinantes (Figura 4) (Sherman, 1998).
Estes eventos ocorrem dependentemente do índice de transmissão
de malária em áreas hipo ou hiperendêmicas. Em áreas de baixa
endemicidade é mais provável que a formação de novos alelos ocorra por
processos de autofecundação acontecendo preferencialmente através de
deleção ou duplicação de seqüências gênicas do que trocas entre
diferentes alelos. Este último deve ser mais encontrado, provavelmente,
em áreas de alta endemicidade onde vários estudos observaram
multiclonalidade de cepas em pacientes infectados por Plasmodiu m
falciparum ou Plasmodium vivax.
___________________________________________________________Introdução
25
A hipótese acima pode ser evidenciada por pesquisa de genótipos
em estudos de estrutura populacional. Exame de parasitas não clonados
em uma amostra de sangue fornece apenas informações limitadas sobre o
número de clones presentes. Se o único lócus polimórfico é examinado e,
por exemplo, três alelos são vistos, o número mínimo de clones presentes
deve ser de três. No entanto, se um segundo lócus examinado tiver na
mesma amostra, por exemplo, dois alelos, o número de clones sobe para
seis, desde que há seis combinações possíveis dos alelos em cada lócus.
O número preciso de clones só pode ser determinado através do
isolamento e caracterização de clones individuais de tais isolados. A
Figura 4
: Herança de genes cromossômicos em parasitas da malária. (1) Esporozoítos homozigotos derivados da
autofecundação de gâmetas do clone A, (2,3) esporozoítos heterozigotos derivados do cruzamento entre os clones
A e B, (4) esporozoítos homozigotos derivados da autofecundação de gametas do clone B.
Fonte: (Sherman, 1998)
___________________________________________________________Introdução
26
composição clonal em um determinado paciente pode mudar ao longo do
tempo, mesmo de dia para dia. Por exemplo, Farnert e colaboradores em
1997 estudaram amostras diárias de P. falcipa rum em crianças
assintomáticas residentes de uma aldeia em uma área da Tanzânia, onde a
malária é altamente endêmica, utilizou-se a técnica de PCR para
examinar alelos dos genes MSP1 e MSP2 e GLURP (Figura 5), na
maioria dos casos, os padrões complexos de infecções multiclonais fora m
encontrados. Uma descoberta particularmente surpreendente foi a de que
algumas crianças tiveram mudanças em genótipos de cada 24 h, por
exemplo, parasitas identificados nos dias 1 e 3 foram semelhantes entre
si mas diferiram daqueles observados nos dias 2 e 4. A explicação mais
provável para essa mudança foi que as diferentes cepas de parasitas
foram submetidas a seqüestro em dias alternados, ainda nesse estudo foi
observado quem em muitas pessoas até três genes alelos de novos
parasitas foram observados, durante o período de 2 semanas.
Figura 5
:
M
étodo para analisar os cruzamentos entre os clones de parasitas da malária
.
Fonte: (Sherman,1998).
___________________________________________________________Introdução
27
Outros estudos longitudinais foram feitos em pacientes com
intervalos de tempo mais longo, Daubersies e colaboradores 1996,
analisaram os alelos MSP1 e MSP2 de P.falcipa rum de pacientes em duas
aldeias no Senegal, que tinham diferentes taxas de transmissão de
malária durante os períodos de 3 meses onde, amostras de sangue foram
coletadas a cada 2 semanas e, pelo menos onde, cinco clones foram
presentes em alguns casos. Flutuações de alelos também foram
observadas em amostras colhidas em alguns pacientes a 2 a 4 intervalos
de dias. Em Pikine, um subúrbio de Dakar, onde a transmissão foi
sazonal, foram retiradas amostras de três pessoas, cinco vezes ao longo
de um período de 5 semanas durante a estação seca, nestas infecções, os
alelos de cada gene semelhantes foram observados em cada amostragem,
mostrando que os clones persistiram ao longo deste período (Sherman.,
1998).
Estudos sobre a estrutura populacional de P.viva x era até 2008
prejudicado pela falta de informação sobre o genoma do parasita. Porém
agora com o genoma do P.vivax completo, novos marcadores poderão ser
utilizados ao lado daqueles já conhecidos. Antes do genoma, pesquisas
têm sido realizadas a respeito da variação de alelos de dois genes,
Pv CSP e o homólogo PvMSP1. Análise de isolados de P.vi vax em Papua
Nova Guiné, Brasil, Sri Lanka, Tailândia, Filipinas e China revelou a
heterogeneidade ampla destes genes. A diversidade alélica de Pv CSP
geralmente não é tão grande como o observado no PvMSP1 (Del Portillo
et al., 1991). Outros estudos realizados na China e nas Filipinas,
revelaram idênticos alelos PvCSP em três dos seis isolados chineses e
seis de sete filipinos isolados, em cada caso, os parasitas presentes nos
isolados diferiram no lócus PvMSP1 e por isso não foram considerados
clones do mesmo parasita (Mann et al., 1994). A taxa de infecções
multiclonais por P.vivax parece à primeira vista, ser inferior ao P.
falciparum, no entanto, devido à diversidade limitada de alguns genes, o
número de lócus incluídos na análise precisa ser levado em conta. Por
exemplo, em Papua Nova Guiné, 38% das infecções por P.vivax foram
multiclonais usando PvMSP1, mas essa porcentagem sobe para 65% em
dois outros locais que foram incluídos na análise (Kolakovich et al.,
___________________________________________________________Introdução
28
1996). Um grande estudo realizado na Índia, utilizando três enzimas
polimórficas concluiu que 20% dos isolados foram P.vivax multiclonais
(Joshi et al., 1997). Parece haver nenhuma diferença significativa na taxa
de infecção multiclonal entre os tempos de transmissão de baixa e alta,
nem qualquer diferença nas freqüências alélicas ao longo dos 8 anos de
estudo (Sherman.,1998).
1.6 Vacina contra a malária
Várias protozooses constituem-se em grandes problemas de saúde
pública no mundo, e dentre elas a malária é a que traz maiores
preocupações pela prevalência e morbidade, sendo incluída pela
Organização Mundial da Saúde entre as seis endemias prioritárias para
investimento em pesquisa. No Brasil, a malária ao lado de leishmanioses
está em processo de expansão, porém o seu controle total pela
intervenção no seu ciclo biológico é difícil ou não realizável, não só
pelas condições sócio-econômicas da população sob risco, mas, porque
envolvem elementos como insetos vetores cujo controle ou eliminação
são racionalmente irrealizáveis. A vacina, portanto, é uma ferramenta
que poderia contribuir efetivamente para esse controle (Lindoso.,2000).
Há muitas pesquisas em desenvolvimento visando vacinas contra
malária, porém não há produtos liberados para uso na população geral.
Há vários fatores que resultam nesta situação atual, um dos fatores é
decorrente da complexidade do ciclo biológico onde o parasito toma
formas morfológicas diversas, este fato leva ao envolvimento de
antígenos diversos nas várias fases do ciclo. Além disso, os parasitos
têm a capacidade de modificar as moléculas de seus antígenos, variação
antigênica, diante de uma resposta imune protetora (Stoute et al., 1998).
Para o desenvolvimento de qualquer vacina o ponto de partida é a
constatação da possibilidade de induzir imunidade no hospedeiro contra
a infecção em questão. Na malária esta evidência foi verificada há mais
de 30 anos em animais experimentais e em homens imunizados com
esporozoítos atenuado (Nussensweig et al., 1967), porém, não sendo
___________________________________________________________Introdução
29
factível o uso destes como vacina, pela impossibilidade de produção em
grande escala de esporozoítos dentre outras questões práticas, iniciou-se
a busca de outros imunógenos obtidos utilizando tecnologias bioquímicas
e de biologia molecular avançadas. Vacinas voltadas para a fase pré-
eritrocítica que tem o esporozoíto como alvo ou que impeçam a invasão
do hepatócito pelo parasito, ou ainda que o eliminem durante a
esquizogonia dentro do hepatócito são interessantes por bloquear a
infecção no seu início, porém, a sua eficácia há de ser absoluta
considerando que escape de um único parasito pode levar à fase
eritrocítica da infecção com suas conseqüências patológicas. Ao lado de
estudos visando esta fase pré-eritrocítica, duas outras linhas de pesquisa
são desenvolvidas tendo como alvo a fase eritrocítica e o bloqueio da
transmissão, esta última visando impedir o desenvolvimento do parasito
dentro do inseto vetor com indução de anticorpo no hospedeiro que teria
efeito dentro do tubo digestivo do inseto, interferindo na reprodução do
parasito (Ling et al., 1994).
Na busca de imunógenos candidatos à vacina, principalmente
quando se buscam moléculas sintéticas, o conhecimento do mecanismo
imune protetor é essencial. A proteína que cobre o esporozoito é
conhecida como Proteína do Circunsporozoíto do inglês
“circunsporozoite protein” (CSP). O epítopo B imunodominante desta
proteína é a porção central repetitiva NANP encontrada no P.
falciparum, mas presente e conservada nas diversas espécies de
Plasmodium. Em um estudo, o gene da CSP foi clonado (Dame et al.,
1984) e, subseqüentemente, foram obtidos produtos recombinantes
(Ballou et al., 1987) e sintéticos (Herringnton et al., 1987) considerados
seguros para uso em seres humanos, porém, estudos clínicos não
mostraram proteção além de 20 – 30% (Ballou et al., 1987, Guiguemende
et al., 1990, Fries et al., 1992). Segundo Stoute e colaboradores (1997),
uma formulação que consiste de proteína de fusão de uma porção da CSP
e antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), denominada RTS.S, foi
testada em voluntários humanos com adjuvantes diversos e
imunoestimulantes. Resultados iniciais com RTS.S em emulsão água e
óleo acrescida de imunoestimulantes monofosforil lipídio A e QS21
___________________________________________________________Introdução
30
despertaram entusiasmo por conferir proteção em seis dos sete
indivíduos vacinados quando desafiados com mosquito infectado por P.
falciparum três semanas após a terceira dose da vacina. No entanto,
quando cinco destes indivíduos e outros dois que receberam outro tipo de
adjuvante e que mostraram proteção inicial foram desafiados novamente
após 6 meses, cinco desenvolveram infecção (Stoute et al., 1998),
abortando prosseguimento para a fase III da vacina.
Epítopos da fase eritrocítica também são objeto de intenso estudo e
há 25 anos foi observada proteção de macacos injetados com merozoitos
de P. knowlesi e P.falciparum utilizando adjuvante completo de Freund
(Mitchel & Cohen 1975, Sidiqqi 1977). A Proteína 1 da superfície de
merozoito (MSP-1) de P. yoelii foi purificada com anticorpo monoclonal
e esta induziu imunidade em camundongo contra a infecção com o
parasito homólogo (Holder & Freeman 1981); proteína homóloga de
MSP-1 também foi encontrada em outras espécies de Pla smodium
incluindo P. f alciparum (Holder et al., 1985). Utilizando proteína de
fusão MSP-1 - glutationa S transferase foi possível proteger camundongo
à infecção por P. yo elii (Ling et al., 1994) e MSP-1 recombinante de P.
falciparum induziu proteção em macacos Aotus (Kumar et al., 1995).
Proteína de fusão de MSP-1 e epítopo T do toxóide tetânico foi para
teste de fase I em seres humanos e observaram-se algumas reações
adversas, recomendando-se maior cautela no uso (Keitel et al., 1999).
Constatando-se que a imunidade dirigida exclusivamente a uma
fase do ciclo do parasito dificilmente levaria a uma proteção efetiva,
vários compostos combinando epítopos de diferentes fases do ciclo do
parasito foram elaborados para estudo. O mais estudado é o SPf66,
desenvolvido na Colômbia, que contém a seqüência PNAMP do CSP da
fase pré-eritrocítica e três antígenos da fase eritrocítica incluindo um
epítopo do MSP-1, que mostrou efeito protetor parcial quando testado no
macaco e em voluntários humanos (Patarroyo et al., 1987, Patarroyo et
al., 1988).
Numa abordagem diferente da obtenção simples de proteínas
recombinantes para uso como vacina, alguns compostos são resultantes
de inserção de segmentos de gene que codificam para proteínas do
___________________________________________________________Introdução
31
parasito de interesse em microrganismos que por si só suscitam resposta
imune que possam contribuir na imunização com o composto vacinal.
Uma destas preparações é o NYVAC-Pf7 que não só associa epítopos de
fases diferentes do ciclo do parasito, mas, estes são expressos pelo vírus
da vaccinia NYVAC. Foram inseridos neste vírus genes que codificam
para proteínas expressas por parasitos na fase de esporozoito (CSP e
PfSSP2), fases hepática (LSA1), eritrocítica (MSP1, SERA, AMA1) e
sexuada (Pfs25). Não tendo observado nenhum efeito colateral da
NYVAC-Pf7 em macaco Rhesu s, foi testado em voluntários humanos em
teste de fases I e II. Houve indução tanto da resposta humoral quanto
celular a diferentes componentes antigênicos, mas, somente retardou o
aparecimento da parasitemia, não induzindo proteção (Ockenhouse et al.,
1998).
Vacina de DNA é uma outra possibilidade explorada tendo como
vantagem a facilidade na sua obtenção e indução de resposta de células
T, principalmente CD8+ além da persistência no hospedeiro com
estimulação imune por período prolongado. DNA de CSP de P. yoelii
(PyCSP) foi testada em camundongos BALB/c conferindo proteção
parcial dependente de células T CD8+. DNA de CSP de P. f alciparu m
foi testada em voluntários humanos quanto à toxicidade e segurança.
Num estudo em que se combina o uso de DNA de PyCSP e um
recombinante constituído por vírus da vaccinia contendo segmento de
gene de PyCSP observa-se melhor proteção e produção maior de
anticorpos com o uso inicial de DNA seguido de recombinante como
reforço do que o uso de duas doses de vacina de DNA (Sedegah et al.,
1998).
Embora o P. viva x seja considerada uma espécie importante do
ponto de vista epidemiológico pela frequência, os estudos para o
desenvolvimento de vacina com esta espécie de Plasmodiu m ocorrem
numa escala mais modesta. Os estudos mais avançados são de testes em
várias espécies de primatas não humanos com diferentes compostos
vacinais. O primeiro teste em primata foi com esporozoito atenuado e
com o antígeno recombinante de CSP de P. vivax, observando-se
produção de anticorpos e proteção em alguns e prolongamento do
___________________________________________________________Introdução
32
período prepatente em outros (Collins et al., 1989). A imunogenicidade
de peptídeos da proteína da fase eritrocítica MSP-1 de P. viva x vem
sendo estudada (Damangel et al., 1996) e Perera e colaboradores 1998,
viram que no modelo de primata infectado com P. cynomolgi,
considerado similar à infecção humana por P. vivax, foi utilizado
antígeno recombinante de MSP-1 de P. cynomolgi em baculovírus
obtendo-se proteção grande que não se alterou após seis meses. O papel
protetor espécie-específico do antígeno MSP1, observado principalmente
em estudos envolvendo a espécie P. falciparum fortalecem a MSP1 como
forte candidata a vacina antimalárica (Mertens et al., 1993), já que sua
importância biológica na invasão do merozoíto in vitro e o efeito de
anticorpos inibitórios a penetração do parasita no eritrócito já são bem
conhecidos através de estudos (Holder et al., 1999).
1.7 Proteína de Superfície do Merozoíto
O antígeno MSP-1 é uma proteína de superfície do merozoíto
presente tanto em P. falciparu m quanto em P. viva x e apresenta um
padrão genômico e genético comum. Em relação ao genômico tem sido
demonstrado à estrutura gênica da MSP-1 a existência de regiões
conservadas, semiconservadas e polimórficas. Geneticamente os blocos
conservados do gene MSP-1 apresentam dimorfismo genético. Em
relação à MSP-1 de P. vivax, Del portillo e colaboradores mostraram
pela biologia molecular a presença de dois alelos MSP-1 presentes no
Brasil, em Belém e Salvador (Mertens et al., 1993). Essas glicoproteínas
são acopladas à superfície dos merozoítos através de âncoras GPI e
compreendem motivos repetitivos que variam em seqüência e número de
repetições.
A ocorrência de polimorfismos nesses motivos, os quais
apresentam epítopos imunodominantes para células T e B, ou a simples
variação no número de repetições, parece contribuir para o escape imune
do parasito (Anders et al., 1994). Realmente, anticorpos naturalmente
adquiridos são capazes de distinguir entre motivos repetitivos distintos
___________________________________________________________Introdução
33
de antígenos pertencentes à mesma família alélica (Ranford-Cartwright,
et al., 1996; Da Silveira et al., 1999; Tonhosolo et al., 2001), mesmo se
a diferença entre eles residir somente no número de vezes em que um
mesmo motivo se repete (Tonhosolo et al., 2001).
O gene que codifica esta proteína apresenta-se em cópia única e
possui um peptídeo de 1796 aminoácidos (Del Portillo et al., 1991). É
sintetizada com um precursor de 200-250 kDa (Undagama et al., 1989).
Sofre dois processos de proteólise (Figura 6) no primeiro dividindo-se
em dois fragmentos, um contendo 506 aminoácidos, denominada região
N-terminal. O outro fragmento contendo 111 aminoácidos que
corresponde a 42 kDa (Sakai et al., 2003). Na segunda proteólise uma
parte equivalente a 19 kDa não tem papel de ligante, porem a proteólise
é importante para a invasão, pois anticorpos que bloqueiam a proteólise
estão associados a inibição da invasão in vitro (Blackmam et al., 1990).
Dentre as proteínas de estágio sanguíneo de Pla smodiu m, a
proteína 1 de superfície do merozoíto tem sido estudada intensivamente
como um potencial alvo para proteção imunológica. Sua função está
relacionada ao processo de invasão do eritrócito, pois estudos de Holder
e colaboradores (1994) demonstraram que anticorpos denominados
inibitórios do processamento do precursor impediam a invasão das
hemácias pelo merozoíto do P.f alciparum. A invasão dos eritrócitos
pelos merozoítos é fundamental para o estabelecimento e manutenção da
infecção malárica em um indivíduo (Cowman et al.,2001), como esse
Figura
6
: Processamento MSP1
Fonte
: Sakai
et al
., 2003)
___________________________________________________________Introdução
34
estágio do parasita se encontra na circulação sanguínea ele se torna um
potencial alvo para ação de vacinas.
Em um estudo realizado com uma população ribeirinha da
Amazônia legal, Portuchuello (RO) onde se, identificaram pacientes
assintomáticos e sintomáticos, a aquisição natural de anticorpos avaliada
contra uma proteína recombinante correspondente a região N terminal do
MSP1 de P.vi vax passou a ser considerada uma importante candidata à
vacina anti - malárica (Nogueira et al, 2006). Nesse mesmo estudo,
dados mostraram que pacientes assintomáticos apresentavam anticorpos
IgG3 contra a região N-terminal da MSP1 de P. vivax, no entanto, soros
de alguns indivíduos assintomáticos não reconheceram a proteína
recombinante N-term MSP1 construída a partir de DNA da cepa Belém.
Assim, a variabilidade das regiões polimórficas poderia ser explicação
para o não reconhecimento por parte de alguns assintomáticos.
Considerando-se que a aquisição de imunidade contra os
plasmódios humanos em áreas altamente endêmicas tem sido fortemente
atribuída à contínua exposição ao parasito, é sabido que esta imunidade
esteja associada com aquisição de repertório de anticorpos contra
antígenos do parasito com o elevado polimorfismo (Day & Marsh, 1991,
Tetteh et al 2005; Nogueira et al 2006,). Embora alguns estudos venham
sendo conduzidos no Brasil com a finalidade de caracterizarem
geneticamente isolados de parasitos que circulam em regiões de
transmissão, não existe nenhum estudo no entorno de Manaus no estado
do Amazonas, havendo somente estudos de Del Portillo e Urbano em
isolados de Rondônia (Del Portillo et al., 1991; Mancilla et al., 1994; Da
Silveira et al., 1999;). Portanto, a análise genotípica dos isolados que
pretendemos realizar em zonas periféricas de Manaus deve fornecer
informações sobre os alelos e a dinâmica de transmissão dos mesmos.
Objetivos
_______________________________________________________________Objetivos 36
2. OBJETIVO
O presente projeto visa analisar a estrutura gênica e a diversidade alélica de
isolados de P.vivax circulantes no entorno de Manaus baseando-se em três seqüências
gênicas correspondentes aos blocos polimórficos 2, 6 e 10 do gene MSP1.
2.1 Objetivos Específicos
Determinar a seqüência gênica de três blocos polimórficos do gene PvMSP-1;
Avaliar as seqüências e compará-las com as já disponíveis em banco de dados;
Determinar a freqüência das seqüências do gene PvMSP-1 e agrupá-las na forma
de cladograma para determinar o repertório gênico dos isolados circulantes nas
regiões de coleta.
Metodologia
________________________________________________________________Metodologi
a
38
3. METODOLOGIA
3.1 População e Área de Estudo: O estudo foi realizado com amostras
sanguíneas positivas para malária, causada por P.vivax, de pacientes
atendidos na Fundação de Medicina Tropical de Manaus – AM,
residentes no entorno de Manaus, no qual diagnóstico por PCR “Real
Time” e lâmina de gota espessa foram utilizados para detecção e
constatação da parasitemia.
3.2 Coleta e Considerações Éticas: Dispondo das informações de
diagnóstico, foram convidados para participar indivíduos que tiverem
resultado de (Reação em Cadeia da Polimerase) PCR ou lâmina gota
espessa positivos para “malária vi vax”. Os mesmos ou seus
representantes responderam um questionário epidemiológico e assinaram
um termo de consentimento livre e esclarecido aprovado pelo Comitê de
Ética da Universidade Federal do Amazonas sob CAAE: 3640.0.000.115-
07.
3.3 Processamento das Amostras e Extração de DNA: A extração de
DNA foi feita através do Kit comercial Charge Switch gDNA 50-100ul
Blood kit (Invitrogen), conforme instruções do fabricante.
3.4 Primers e PCR: Para realizar análise do polimorfismo foram
utilizados os primers do estudo de Bastos e colaboradores (2007), Bloco
2 pvF1 (5’CTCTGACAAAGAGCTGGAC3’) pvR9
(5’GCTCCTTCAGCACTTTCACGCG 3’), Bloco 6 pvF4 ( 5’
TACTACTTGATGGTCCTCAAAAG 3’), pvR6 (5’GTGCTTGTGACATGCGTA 3’),
Bloco 10 pvF7 (5’CCTTAAGAATACCGAGATTTTGCTGAAG 3’) pvR3
(5’GCGATTACTTTGTCGTAG 3’) na concentração de 10 pM. Para o preparo da
reação foram utilizados: Tampão 10X, DNTP 100 µM, Mgcl 1,5 Mm e Taq Polimerase
1 U, nas seguintes condições: 95
o
5Min.
1X, 94º 1Min., 63
0
1Min., 72
o
1Min., 36X, 72º
1X 10Min. As amostras foram visualisadas em gel de agarose 1%.
________________________________________________________________Metodologi
a
39
3.5 Purificação de amostras de DNA genômico em gel de agarose: Os produtos de
PCR amplificados em gel de agarose, foram purificados utilizando o Kit comercial de
Purificação QIAquick Gel Extraction - QIAGEN, conforme instruções do fabricante.
3.6 Sequenciamento dos produtos de PCR: Os produtos foram analisados em
seqüenciador automático de DNA MegaBace 1000 da FIOCRUZ/BA, pelo método de
terminação da cadeia ou dideoxi Cada amostra foi seqüenciada pelo menos 3 vezes.
3.7 Análise das seqüências: Os eletroferogramas oriundos do seqüenciamento foram
visualizados e editados pelo SeqMan II do pacote Lasergene versão 4.05 (DNAStar). As
seqüências dos produtos da PCR foram comparadas com seqüências depositadas em
bancos de dados disponíveis no GenBank (National Center for Biotechnology
Information), através do Blast-p do inglês “Blast Protein” Alinhamentos foram
realizados entre as seqüências resultantes dos blocos 2, bloco 6 e bloco 10 do gene
MSP-1 com outras seqüências do mesmo gene depositadas no GenBank, utilizando os
programa EditSeq e MegAlign do pacote Lasergene versão 4.05 (DNAStar). A partir
destas seqüências foram construídas árvores filogenéticas, utilizando o programa Mega
line, também do pacote Lasergene. As árvores filogenéticas foram comparadas às
tabelas de percentual de similaridade e divergência entre seqüências alinhadas, através
do Megaline.
Resultados
____________________________________________________________________Resultados
41
4. RESULTADOS
4.1 Amostras do gene MSP1 com PCR positivo
Obtivemos 130 amostras diagnosticadas positivas por gota espessa para
P.vivax pela Fundação de Medicina Tropical da cidade de Manaus - AM, indivíduos
procedentes do entorno de Manaus.
Das 130 amostras oriundas da Fundação de Medicina Tropical, obtivemos 73
amostras positivas para o bloco 2 na PCR, onde foi possível verificar variações nos
tamanhos dos fragmentos amplificados. Utilizamos um plasmídio (ICB2-5) e (ICB-
10) contendo uma construção gênica correspondente à região N-terminal do gene
MSP-1 do isolado Belém, cedido gentilmente por Dr. Hernando Del Portillo para
ser usado como controle da reação da PCR. Para os blocos 6, foi feita PCR em 100
amostras sanguíneas e dessas 61 foram positivas, onde também fo i observado a
variação no tamanhos dos fragmentos. Já para o bloco 10 foi feita PCR em 70
amostras e 61 foram positivas, houve variação nos fragmentos.
Bloco 2 Bloco 6
Bloco 10
Bloco 10 Bloco 10
Figura
8
: Amostras positivas no PCR bloco 6
com fragmentos com tamanhos 470 a 515 PB.
Figura 9 e 10
: Amostras positivas no PCR bloco 10 com fragmentos com tamanhos
500 a 615 PB.
Figura
7
: Amostras positivas no PCR bloco 2
com fragmentos com tamanhos 473 a 515 PB
.
500 PB
500 PB
500 PB
500 PB
500 PB
500 PB
____________________________________________________________________Resultados
42
4.2 Variações no tamanho dos fragmentos de bandas visualizados em gel de agarose
4.2.1 Bloco 2
A tabela abaixo mostra a variação dos fragmentos amplificados da região 2
(bloco 2) e visualizados em gel de agarose os fragmentos variaram de tamanho
sendo < 500 pb (490 pb) a 500 pb (com variações de 500 a 600 pb), sugerindo
diferenças nos genótipos amplificados. As variações de tamanhos dos fragmentos
de PCR obtidas aqui também foram detectadas por estudos de Bastos e Urbano em
2007, na região do Acre.
Tabela 1
: Variação no tamanho dos fragmentos de bandas do bloco 2 do gene MSP1 visualizados em gel de
agarose.
____________________________________________________________________Resultados
43
Os diferentes tamanhos dos produtos obtidos na reação de PCR do Bloco 2 já
evidenciam a diversidade genética da população de parasitas (Tabela 1). Contudo
pôde-se verificar o predomínio de um dos produtos, de 500pb. Estes dados
funcionam como um marcador importante para a estrutura populacional dos
parasitos circulantes.
4.2.2 Blocos 6
Notamos duas variações nos tamanhos dos fragmentos no bloco 6 de 500 pb e > 500 pb (
530 pb) . Apesar da pequena variação do bloco 6, esses produtos de PCR são sugestivos de isolados
polimórficos.
Tabela
2
: Variação no tamanho dos fragmentos de bandas do bloco 6 do gene MSP1 visualizados em gel de
agarose.
____________________________________________________________________Resultados
44
4.2.3 Bloco 10
No bloco 10 verificamos variações entre 500 a > 500 pb ( 600 pb), sendo que a altura 500
pb foi mais encontrada (Tabela 3). Esses dados também indicam indícios de polimorfismos devido
aos diferentes tamanhos dos produtos amplificados.
Novamente os resultados obtidos com os produtos do bloco 10, onde os mesmos foram
únicos, corroboram os dados dos blocos 2 e 6 indicando infecções por populações monoclonais.
Tabela 3
:
Var
iação no tamanho dos fragmentos de bandas do bloco
10
do gene MSP1 visualizados em gel de agarose
.
____________________________________________________________________Resultados
45
4.3 Isolados positivos comparados a negativos de acordo com a amplificação de cada bloco
A Tabela 4 mostra resultados da amplificação dos produtos de PCR para os três blocos
estudados em todas as amostras, distinguindo-as daqueles que foram positivos ou negativos para um
bloco.
Dos 61 isolados, trinta e seis foram positivos para o bloco 2, trinta e cinco foram positivos
para o bloco 6 e quarenta e três foram positivos para o bloco 10. Pode-se perceber que o bloco 10 foi
o bloco mais amplificado já que quase todos os produtos de PCR puderam ser visualizados em gel
de agarose, corroborando os dados encontrados na literatura que apontam entre os blocos
polimórficos o bloco 10 é mais conservado.
Entre os resultados, houve doze que amplificaram na PCR em apenas 1 bloco (Tabela 4).
Esses resultados sugerem que a existência de polimorfismos na região alvo dos primers utilizados
nesta pesquisa, já que as reações positivas confirmam a estabilidade do DNA extraído e a reação do
especifico bloco amplificou vários outros isolados.
Apesar do polimorfismo destes poucos isolados a grande maioria das amostras foi
amplificada demonstrando que os pares de primers utilizados neste estudo (e desenhados por Bastos
e colaboradores, 2007) são aplicáveis nos estudos genéticos dos isolados no Brasil. Experimentos
preliminares realizados com primers desenhados Inwong e colaboradores (2005) não serviram para
amplificar os blocos 2, 6 e 10 dos isolados do Brasil (dados não mostrados). O estudo de Inwong e
colaboradores foram aplicados na Ásia e os primers foram desenhados para os isolados desta região.
Portanto, o polimorfismo nas seqüências alvos destes primers é responsável pela ineficácia das
nossas amplificações.
____________________________________________________________________Resultados
46
Tabela 4:
Isolados positivos comparados a negativos de acordo com a amplificação de cada bloco.
____________________________________________________________________Resultados
47
4.4 Análises das seqüências
4.4.1 Bloco 2
Selecionamos seqüências já depositadas em banco de dados (genbank) através do blast(p)
que se assemelhassem aos isolados encontrados no bloco 2, a figura 11 mostra os dados dessas
seqüências.
4.4.2 Alinhamento entre seqüências do bloco 2 com seqüências disponibilizadas no genbank
Foram selecionadas do genbank através do programa blast(p) cepas com perfil de similaridade de
58% a 100% referentes aos isolados desse estudo (Figura 11). Na formação do alinhamento
(Figura12a 12b), identificamos seqüências de aminoácidos que se repetem tanto nos isolados de
nosso estudo, como em cepas oriundas de outras regiões geográficas. A figura 24 no anexo indica o
percentual de similaridade entre as seqüências em questão.
Figura
11
: Identidade das seqüências do bloco 2 dos isolados deste estudo com seqüência disponibilizadas no
genbank
____________________________________________________________________Resultados
48
Figura 12a
: Alinhamento dos isolados do bloco 2 com isolados oriundos do genbank.
____________________________________________________________________Resultados
49
Figura 12b
: Alinhamento dos isolados do bloco 2 com isolados oriundos do genbank.
____________________________________________________________________Resultados
50
4.4.3 Cladograma referente ao alinhamento entre bloco 2 e seqüências disponibilizadas no genbank
Todos os isolados do bloco 2 foram agrupados e combinados em um cladograma (Figura 13) com seqüências provenientes de outras
regiões (seqüências do genbank), indicando uma aproximação dos isolados da região da Amazônia com isolados de outras regiões geográficas,
um dado interessante é que cepas de regiões distantes como é o caso da Tailândia, Bangladesh e Coréia foram similares a alguns isolados do
bloco 2, isso mostra que evolutivamente houve alterações em parasitas encontrados em nossa região, entretanto, o perfil de similaridade ainda é
importante. Cepas com registro inicial ABV, ficaram entre os grupos mais próximos dos isolados de nosso estudo, essas cepas são oriundas
também de uma região da Amazônia Legal e foram descritas nos estudos de Bastos em 2007. Em anexo, a figura (24) confirma o percentual de
similaridade e divergência em relação aos nossos isolados e aos encontrados em outras regiões geográficas.
Nucleotide Substitutions (x100)
Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
62.4
102030405060
Isolado 2 Bl 2.pro
ABV25923.1.pro
98.8
AF435037 MSP1.PRO
AF435037.1.pro
98.8
85.3
AAN86213.1.pro
97.3
AAN86232.1.pro
45.4
AAN86226.1.pro
AAN86226.1.pro
100.0
42.9
AAN86231.1.pro
NA
AAN86237.1.pro
39.6
Isolado 32 Bl 2.pro
ABV25925.1.pro
69.6
Isolado 16 Bl 2.pro
95.8
AAM22836.1.pro
94.8
AAN86235.1.pro
94.8
AAN86227.1.pro
85.2
AF435615-1 MSP1 .PRO
88.2
AF435632-1 MSP1.pro
88.8
97.8
AAN86243.1.pro
95.8
AAA63427.1.pro
AAA63427.1.pro
91.1
89.4
AAN86210.1.pro
70.2
AAN86238.1.pro
95.9
Isolado 8 Bl 2.pro
Isolado 18 Bl 2.pro
72.8
Isolado 13 Bl 2.pro
91.3
Isolado 80 Bl 2.pro
98.2
Figura 13
: Cladograma referente ao alinhamento entre bloco 2 e s
eqüências disponibilizadas no g
enbank
____________________________________________________________________Resultados
51
4.5 Recombinações de seqüências encontradas no Bloco 2
4.5.1 Seqüência peptídica SDENAKRGGQSTN conservada em alguns isolados
Através do alinhamento realizado entre algumas amostras que mostraram ser
mais semelhantes de acordo com suas seqüências de aminoácidos, podemos notar
que alguns isolados são mais similares do que outros de acordo com alguns fatores,
como por exemplo, uma repetição de um peptídeo. Os isolados 2 e 58 se
assemelham na repetição as seqüência peptídica SDENAKRGGQSTN (Figura 14),
enquanto que outros isolados 18, 13, 8 e 59 não possuem esta seqüência (figura
15).
Figura 14
:
Seqüência peptídica SDENAKRGGQSTN conservada em alguns isolados
____________________________________________________________________Resultados
52
4.5.2 Recombinação na seqüência PAPAAPSSTNANYEAKKIIYQAIYNGI
A seqüência majoritária que aparece para o grupo de isolados 18, 13, 8 e 59
seqüência PAPAAPSSTNANYEAKKIIYQAIYNGI, parece ser um peptídeo conservado para os
isolados do bloco 2, porém nos isolados 2 e 58 não encontramos esta seqüência.
Figura 15
: Recombinação na seqüên
cia PAPAAPSSTNANYEAKKIIYQAIYNGI
____________________________________________________________________Resultados
53
4.5.3 Seqüência contendo evidência de processo recombinatório LISDENAKRGSQ
SPAPAAPSSTNANY
Na análise do alinhamento, identificamos também dois outros grupos com perfis
semelhantes, nesses grupos identificamos o peptídio KLISDENAKR e o SPAPAAPSSTNANY,
onde os isolados 61 e 80 puderam ser classificados.
Figura
16
:
Recombinação ISDENAKRGSQ
SPAPAAPSSTNANYE
____________________________________________________________________Resultados
54
4.5.4 Repetições de SSX
Putaporntip e colaboradores (2002) identificaram oligômeros nas seqüências do bloco 2 para
diferenciação de vários haplótipos. Nos isolados de nosso estudo encontramos um trímero de
aminoácidos que se repetem, com um perfil semelhante ao do estudo de Putaporntip SSX (onde X é
definido como qualquer resíduo). Percebemos quatro tipos de combinações de trímero, com
isolados contendo 6 repetições, 5, 4 e duas repetições (Figura 17). O isolado 58 há seis repetições
desta seqüência, nos isolados 18, 13, 8 e 61 quatro repetições e no isolado 59 há cinco repetições.
Figura 17
: Repetições de SSX, onde X refere
-
se a qualquer aminoácido.
____________________________________________________________________Resultados
55
4.6 Identidade das seqüências do bloco 6 dos isolados deste estudo com seqüência
disponibilizadas no Genbank
Selecionamos seqüências já depositadas em banco de dados (genbank) através do blast(p)
que se assemelhassem aos isolados encontrados no bloco 6, a figura 18 mostra os dados dessas
seqüências.
4.6.1 Alinhamento das seqüências do bloco 6 com seqüências do Genbank
Foram selecionadas do genbank através do programa blast(p) cepas com perfil de
similaridade de 85% a 99% referentes aos isolados do bloco 6. Alinhamos os isolados do bloco 6
(Figura 19a 19b) com as seqüências encontradas no genbank, e a partir da análise podemos
encontrar perfis de seqüências de aminoácidos de cepas oriundas de outras regiões geográficas, bem
como de nossa região, como é o caso das seqüências com início de registro ABJ, semelhantes aos
perfis dos isolados encontrados em nosso estudo. Assim como no bloco 2 isolados do bloco 6,
também apresentaram um percentual alto de similaridade em relação a cepas procedentes de outras
regiões geográficas e ao alinharmos ambas as seqüências percebemos que existem porções de
aminoácidos conservadas tanto nas cepas oriundas de regiões diferentes da região de nosso estudo,
quanto dos isolados provenientes do nosso estudo.
Figura
18
:
Identidade das seqüências do bloco 6 dos isolados deste estudo com seqüência disponibilizadas no
genbank.
____________________________________________________________________Resultados
56
Figura 19 a
: Alinhamento das seqüências do bloco 6 com seqüências do
g
enbank
____________________________________________________________________Resultados
57
Figura 19 b
: Alinhamento das seqü
ências do bloco 6 com seqüências do
g
enbank
____________________________________________________________________Resultados
58
4.6.2 Cladograma da seqüência obtida através do seqüenciamento entre os isolados do bloco 6 com sequências do genbank
Todos os isolados do bloco 6 foram agrupados e combinados com seqüências provenientes de outras regiões (seqüências do genbank) na
árvore filogenética (Figura 20), indicando uma aproximação dos isolados da região da Amazônia com isolados de outras regiões geográficas.
Percebemos na figura que existem dois grandes grupos de isolados que estão conectados por um ramo maior na árvore filogenética, indicando
assim isolados que combinam mais com algumas seqüências do que com outras. O percentual de identidade e divergência de cada isolado
combinado encontra-se no anexo na figura 25.
Nucleotide Substitutions (x100)
Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
43.8
510152025303540
Isolado 71 Bl 6.pro
Isolado 9 Bl 6.pro
63.4
Isolado 3 Bl 6.pro
88.0
Isolado 8 Bl 6.pro
ABJ53048.1.pro
NA
ABJ53047.1.pro
11.4
15.6
ACU56867.1.pro
90.5
AAN86232.1.pro
50.8
Isolado 10 Bl 6.pro
Isolado 18 BL 6.pro
56.0
97.0
Isolado 13 Bl 6.pro
38.2
AAN86238.1.pro
69.5
Isolado 1 Bl 6.pro
Isolado 5 Bl 6.pro
56.1
Isolado 6 Bl 6.pro
61.7
AAR30530.1.pro
47.3
AAV41015.1.pro
81.9
ABJ53012.1.pro
89.5
CAB60129.1.pro
49.4
CAD41952.1.pro
44.9
sequencia Ira IS-5.pro
90.8
BAA18972.1.pro
100.0
Figura 20
:
cladograma entre seqüências do bloco 6 do gene MSP
-
1 com seqüências do genbank.
____________________________________________________________________Resultados
59
4.7 Análises das seqüências do bloco 10 do gene MSP1
4.7.1 Identidade das seqüências do bloco 10 dos isolados deste estudo com seqüências
disponibilizadas no Genbank
Selecionamos seqüências já depositadas em banco de dados (genbank) através do blast(p)
que se assemelhassem aos isolados encontrados no bloco 10, a figura 21 mostra os dados dessas
seqüências.
4.7.2 Alinhamento referente a seqüências do bloco 10 associadas com seqüências do genbank
O alinhamento entre isolados do bloco 10 (figura 22) mostra seqüências majoritárias entre o
grupo, seqüências fora da marcação representam aminoácidos diferentes do grupo majoritário de
aminoácidos. Pode-se perceber que houve significativas seqüências de aminoácidos em comum
entre o Bloco 10. Foram selecionadas do Genbank através do programa blast(p) cepas oriundas de
outras regiões geográficas com perfil de similaridade de 95% a 98% referentes aos isolados do bloco
10 percebemos no alinhamento que o perfil de isolados do bloco 10 é semelhante ao perfil de
isolados de outras regiões geográficas, inclusive foi possível perceber que esse bloco assim como os
outros também apresenta peptídeos conservados. A partir desse alinhamento podemos confirmar que
o bloco 10 realmente é o bloco mais conservado de nosso estudo, não apenas na região estudada
mais também em outras regiões geográficas
Figura 21
:
Identidade das seqüências do bloco 10 dos isolados deste estudo com seqüências disponibilizadas no
g
enbank
.
____________________________________________________________________Resultados
60
Figura 22
: Alinhamento referente a seqüências dos iso
lados do bloco 10 do gene MS
P1 associadas a seqüências do g
enbank.
____________________________________________________________________Resultados
61
4.7.3 Cladograma referente a seqüências do bloco 10 associadas com seqüências do genbank
Através dos cladograma (figura 23) percebemos que os genótipos com o registro AAM22864, AAN86240, AAF91164, XP 00161842 e o
AAN86217, são similares aos encontrados nesse estudo, o interessante disso é que somente o XP00161842 – Sal I - é um genótipo conservado
nas diversas regiões com potencial malarígeno, os outros genótipos encontrados são oriundos de regiões pertencentes à Ásia, apesar de
pertencerem a outro continente percebemos que os isolados da região do Amazonas, têm um perfil muito semelhante aos encontrados naquela
região.
Nucleotide Substitutions (x100)
Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
66.7
102030405060
ISOLADO 1 BL10.pro
AAF91164.1.pro
90.9
Isolado 94.pro
89.8
AAN86240.1.pro
89.1
XP-001614842.pro
AAM22864.1.pro
49.6
ISOLADO 10 BL10.pro
NA
AAN86217.1.pro
99.7
99.5
AAN86234.1.pro
100.0
Isolado 9 bl 10.pro
90.6
Isolado 4 Bl 10.pro
Isolado 20 Bl 10.pro
58.4
66.0
Isolado 16 Bl 10.pro
99.3
Isolado 3 Bl 10.pro
92.1
Isolado 03 Bl 10.pro
Figura
23
: Cladograma referente a seqüências do bloco 10 associadas com seqüências do geenbank
Discussão
_________________________________________________________________Discussão
63
5. DISCUSSÃO
A malária causada por Plasm odium vivax representa um grande
problema para saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais.
Um dos grandes problemas para o desenvolvimento da vacina contra a
essa doença é a diversidade antigênica das proteínas candidatas a vacina.
A crítica para o problema emergente é que a resposta do hospedeiro a um
alelo, não é muito eficaz contra parasitas que expressam diferentes
formas alélicas (Keittel et al., 1999). Portanto, estudos de variação
genética para os antígenos de vacinas contra Plasmodium vivax são muito
importantes.
O estudo do polimorfismo é importante não só para estabelecer o
repertório antigênico dos isolados de regiões onde a malária é endêmica,
mas também para elucidar os mecanismos que são gerados através da
diversidade antigênica. Dentre as proteínas candidatas a vacina, a
proteína 1 de superfície do Plasmodiu m vivax (Pv MSP1) é uma forte
candidata, já que possui um papel protetor espécie – específico e
segundo Holder e colaboradores (1999), sua importância biológica na
inibição da penetração de parasita no eritrócito através de anticorpos já é
bem conhecida.
Os genes que codificam a MSP-1 dos plasmódios encontram-se em
cópia única no genoma haplóide, cada clone expressa somente uma das
subseqüências-tipo encontradas na natureza. (Rich et al., 2000),
entretanto, novas variantes desses genes podem ser geradas,
predominantemente por meio de recombinação intragênica durante a
meiose que ocorre no inseto, nos casos em que os zigotos resultantes da
fusão de gametócitos carregam alelos geneticamente diferentes (Kemp,
1992). O polimorfismo de PvMSP-1 tem sido considerado como resultado
de recombinação interalélica na natureza (Putaporntip et al., 2002). Em
relação ao polimorfismo do gene MSP-1 de P. falciparum, pouco se sabe
sobre o polimorfismo de P. vivax MSP-1. Dessa forma, este estudo tende
a contribuir com novos dados a respeito dessa diversidade da PvMSP1 na
região do entorno de Manaus.
_________________________________________________________________Discussão
64
Em nosso estudo, identificamos diferentes seqüências de isolados
do gene MSP-1 nos blocos 2, 6 e 10 na região de Manaus, verificamos
que essas seqüências encontradas possuem características que
classificam o isolado como do Bloco 2, Bloco 6 e Bloco 10, apesar de
encontrarmos algumas características que são conservadas para um bloco
determinado, verificamos que em alguns isolados esses perfis diferem,
resultando em uma grande variabilidade genética. Em um estudo
realizado por Bastos e colaboradores na região do Acre (2007),
observou-se a grande variabilidade genética do gene MSP-1 nesses
mesmos blocos.
As seqüências destes antígenos provenientes de isolados
circulantes em uma região de Rondônia e outra do Pará foram
comparadas às encontradas nos parasitos da região do Acre, notou-se que
nenhum dos blocos pôde ser considerado dimórficos, ou seja, nenhuma
das seqüências pôde ser agrupada como do tipo Belém ou do tipo
Salvador, já que algumas delas divergiram de ambas, muitas delas sendo
geradas por recombinação entre as duas cepas. Estes dados reforçam a
versatilidade do polimorfismo do gene MSP1 na geração da diversidade
antigênica da proteína nos isolados de P. vivax circulantes nas regiões do
Brasil.
De acordo com os resultados da amplificação dos produtos de PCR
para os três blocos estudados (Tabela 4) de 61 isolados, trinta e seis
foram positivos para o bloco 2, trinta e cinco foram positivos para o
bloco 6 e quarenta e três foram positivos para o bloco 10. Pode-se
perceber que o bloco 10 foi o bloco mais amplificado já que quase todos
os produtos de PCR poderam ser visualizados em gel de agarose,
corroborando os dados encontrados na literatura que apontam entre os
blocos polimórficos o bloco 10 é mais conservado. Entre os resultados,
houve doze que amplificaram na PCR em apenas 1 bloco. Esses
resultados sugerem que há existência de polimorfismos na região alvo
dos primers utilizados nesta pesquisa. Apesar do polimorfismo nestes
isolados a grande maioria das amostras foi amplificada demonstrando
que os pares de primers utilizados neste estudo (e desenhados por Bastos
e colaboradores, 2007) são aplicáveis nos estudos genéticos dos isolados
_________________________________________________________________Discussão
65
no Brasil. Experimentos preliminares realizados com primers desenhados
Inwong e colaboradores (2005) não serviram para amplificar os blocos 2,
6 e 10 dos isolados do Brasil (dados não mostrados). O estudo de Inwong
e colaboradores foram aplicados na Ásia e os primers foram desenhados
para os isolados desta região. Portanto, o polimorfismo nas seqüências
alvos destes primers é responsável pela ineficácia das nossas
amplificações.
Os isolados do bloco 2 de nosso estudo, foram considerados blocos
mais susceptíveis a recombinações, percebemos durante a análise do
alinhamento entre as suas seqüências uma variação alélica, entre os
seguimentos de aminoácidos, o que pôde ser detectado através de perfis
de peptídeos que foram característicos em algumas seqüências de nossos
isolados, isso indica que há uma variedade de haplótipos do gene MSP1
na região do Amazonas. Em estudo feito na Ásia por Putaporntip e
colaboradores (2002), também foram encontrados isolados caracterizados
por variações alélicas. Esses isolados foram classificados como
haplótipos de acordo com cada perfil de variação. Nos eucariotos, a
recombinação genética homóloga esta geralmente associada à divisão
celular (garantindo a segregação ordenada dos cromossomos) e ao reparo
de DNA. A recombinação ocorre com maior freqüência durante a meiose,
processo no qual células diplóides da linhagem germinativa, com dois
conjuntos iguais de cromossomos, dividem-se para produzir gametas
haplóides, cada gameta possuindo apenas um membro de cada par de
cromossomos que em outro estágio serão referidos como cromátide
irmãs. É nessa etapa que ocorre recombinação genética homóloga que
aumentará a diversidade genética da população (Lehninger.,2002), de
modo que a imunidade adaptativa será cepa específica. Este fenômeno
representa o grande entrave para desenvolvimento de uma vacina anti -
malárica efetiva.
Outro dado muito importante em relação ao bloco 2 que pôde ser
detectado foi que esses isolados, foram semelhantes a cepas oriundas de
regiões geográficas bem distantes da Amazônia Brasileira, indicando
assim que apesar da evolução das espécies de parasitas, muitos ainda
_________________________________________________________________Discussão
66
carregam identidades genotípicas que assemelham-se a seus ancestrais.
Segundo historiadores e evolucionistas, antes da separação do novo e
velho mundo era possível haver a existência de parasitos causadores da
malária, a partir da separação houve migração de espécies diferentes para
diferentes regiões, influenciados por fatores climáticos. Porém, até hoje
ainda existem discussões a esse respeito, alguns historiadores acreditam,
que algumas espécies de parasitos possam ter sobrevivido em uma
viagem por mar ou mesmo uma sucessão de viagens do Sul da Ásia para
o leste da costa das Américas (Carter and Mendis., 2002).
As análises do seqüenciamento para o bloco 6 apresentaram um
interessante perfil a respeito dos isolados desse bloco, o alinhamento
entre as seqüências mostrou que existe uma grande quantidade do
aminoácido glutamina (Q) entre as seqüências. Putaporntip e
colaboradores (1997) falaram a respeito desse grupo de aminoácidos que
eles chamam de grupo polyglutamina (Poli-Q), segundo o autor esse
marcador é característico da cepa Belém e representa a principal fonte de
diversidade genética da cepa. Além disso, uma região Poli-Q é
considerada importante sítio de recombinação entre tipos de Belém e Sal
I, e como mostrado na literatura, recombinações interalélicas entre esses
tipos são muito freqüentes. Santos-Ciminera (2007) e Putaporntip e
colaboradores (2007) encontraram genótipos na região Amazônica que
foram semelhantes aos isolados encontrados em nosso estudo, isso
mostra que perfis do gene MSP1 de P.vivax para esse bloco já esta sendo
bem caracterizado.
Os isolados do bloco 10 foram caracterizados em nosso estudo
como isolados com genótipos mais conservados, visto que apresentaram
seqüências de aminoácidos conservadas tanto para região da Amazônia
quanto para regiões mais distantes. Isolados pertencentes a esse bloco
são geralmente caracterizados por muitos autores como dimórficos, isto
é, são considerados como genótipos Salvador ou genótipos Belém. Em
nosso estudo podemos perceber que as seqüências foram muito
semelhantes à cepa Salvador, mas também apresentaram similaridade
com outros genótipos, sendo similares inclusive com os encontrados na
_________________________________________________________________Discussão
67
Tailândia por Putaporntip e colaboradores (2002) e Han e Chai (2001) na
Coréia do Sul.
Nossos resultados mostraram que na região do estado do
Amazonas, assim como em outras regiões com potencial malarígeno,
também é possível encontrar diferentes genótipos da Proteína 1 de
Superfície de Merozoita de Plasmodium vivax. Essa proteína tem sido
estudada intensivamente como uma grande candidata a vacina. Nogueira
e colaboradores (2005), em estudos realizados em uma região também
incluída na Amazônia Legal, demonstraram que pacientes assintomáticos
com malária apresentaram anticorpos contra uma proteína recombinante
que foi construída a partir de uma cepa Belém. Em acordo com diversos
estudos referentes a essa proteína, o estudo do perfil de genótipos
encontrados em diferentes regiões geográficas é de extrema importância,
já que poderão dar suporte para novos conhecimentos em relação à
Pv MSP1, podendo contribuir, com o aceleramento da produção de uma
vacina eficaz contra o Plasmo dium vi vax.
Conclusão
___________________________________________________________Conclusão
69
6.CONCLUSÃO
1. Nossos resultados mostraram que na região do entorno de Manaus,
assim como em outras regiões com potencial malarígeno, também é
possível encontrar diferentes genótipos da Proteína 1 de Superfície de
Merozoita de Plasmodium vi vax.
2. Os isolados do bloco 2 de nosso estudo mostraram ser blocos
bastante polimórficos, porém, com características semelhantes, formando
haplótipos diferentes. Detectamos genótipos semelhantes a isolados no
Brasil, bem como genótipos isolados em outras regiões geográficas,
como, por exemplo, genótipos oriundos da Ásia.
3. O bloco 6 apresentou um perfil semelhante ao já descrito em
outros estudos, com por exemplo, o grupo Poli-Q que é um determinante
de recombinação gênica entre cepas e pode ser determinante de cepas
pertencentes ao genótipo Belém.
4. O bloco 10 foi o bloco mais conservado do nosso estudo,
percebemos que esse bloco tem seqüências que não são conservadas
apenas em nossa região, mais também em outras regiões geográficas,
como é o caso de regiões da Ásia, por exemplo.
5. A partir desses resultados serão construídas proteínas
recombinantes das seqüências mais encontradas nos isolados aqui
estudados. Com isso, em um futuro próximo, poderemos analisar o nível
de anticorpos de pacientes contra esses epítopos recombinantes.
___________________________________________________________Conclusão
70
Dispondo de resultados favoráveis, continuaremos nosso estudo para em
um futuro em longo prazo, realizarmos testes para avaliar o potencial de
anticorpos contra esses epítopos na inibição da invasão do merozoíto no
eritrócito.
Referências Bibliográficas
____________________________________________________Referências Bibliográficas
72
9. RERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Anders. R.F., Falk, M., Al-Yaman, F., Genton, B., Triglia, T., T., Lewis, D., HII, J.,
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Brasillian amazon region. Infect Immun. 67: 5906 – 5916, 1999.
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Day, K. P., Marsh, K. Naturally acquired immunity to Plasmodium falciparum.
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http://www.who.int/health-tropics/malaria.htmAcesso em 12 de Abril de 2009.
Anexos
____________________________________________________________ANEXO
77
10. Anexos
Figura 26: Percentual de identidade e divergência entre os isolados do bloco 2 associados com seqüências do genbank
.
____________________________________________________________ANEXO
78
Figura 27
: Percentual de identidade e divergência entre os isolados do bloco 6 associados com seqüências do genbank.
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