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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
GUSTAVO BERTOL
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA
CONTROLE DE QUALIDADE DE MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO CONTENDO
Uncaria tomentosa (Willd.) DC. - Rubiaceae
CURITIBA
2010
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GUSTAVO BERTOL
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA
CONTROLE DE QUALIDADE DE MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO CONTENDO
Uncaria tomentosa (Willd.) DC. - Rubiaceae
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de
Concentração Insumos, Medicamentos e
Correlatos, Departamento de Farmácia, Setor de
Ciências da Saúde, Universidade Federal do
Paraná, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Brás Heleno de Oliveira
CURITIBA
2010
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Para minha esposa, pelo seu amor incondicional.
Aos meus pais, por me propiciarem vida e amor.
AGRADECIMENTOS
À minha esposa, Merilin pela compreensão nos momentos de solidão, pelo
carinho quando eu estava cansado, pela alegria quando eu desanimava.
Aos meus pais, Vera e Oromar, meu esteio, orientação e segurança para a
vida.
Ao Eduardo e Henrique, meus queridos irmãos, pela amizade, carinho e
respeito que nutrimos em nossa família.
A Deli e Lauri, meus sogros e grandes incentivadores.
Ao professor Dr. Brás Heleno de Oliveira pela orientação segura durante o
andamento do trabalho.
Aos amigos de Desenvolvimento Analítico do Herbarium Laboratório
Botânico: Cláudio S. de Souza Filho, Cristiane Mara Kopke, Luzia Franco, Melissa
Ariadne e Marina Maciel Braz, pela compreensão e auxílio quando as tarefas se
acumulavam.
Aos demais amigos do Herbarium pelo apoio e paciência durante a
execução deste trabalho, em especial a Laerte Dall’Agnol, aos colegas do Controle
de Qualidade físico-químico e Desenvolvimento de produtos.
À professora Dra. Tomoe Nakashima por ter permitido meu ingresso no
laboratório de fitoquímica da UFPR e iniciação dos meus estudos com produtos
naturais.
Aos colegas de mestrado Karina Bora e João Gasparetto pelo auxílio na
realização das análises e amizade.
Ao Daniel Altino de Jesus do LACEN-PR por sua disposição e execução das
análises de espectrometria de massas.
Ao Valdomiro Catani e João Alencar de Sousa, pesquisadores da
EMBRAPA, pelas valiosas informações e fotos disponibilizadas sobre e planta objeto
do estudo.
Enfim, obrigado Deus pela atual existência, pelas oportunidades, pelas
dificuldades e principalmente pelo amor.
“O sacrifício pessoal é o preço do acesso
aos caminhos da Grande Luz”.
Bezerra de Menezes
RESUMO
Cascas do caule e raiz de Uncaria tomentosa, popularmente conhecida como unha-
de-gato, são utilizadas no tratamento de diversos casos de inflamações, câncer e
processos virais. Planta nativa da América do Sul possui várias de suas
propriedades farmacológicas associadas aos alcalóides oxindólicos (AO). Os AO
presentes na espécie são classificados em pentacíclicos (AOP) e tetracíclicos (AOT).
Os AOT (rincofilina e isorincofilina) possuem acentuada ação no sistema nervoso
central e são considerados antagonistas dos AOP (especiofilina, uncarina F,
mitrafilina, isomitrafilina, pteropodina e isopteropodina), portanto devem ter seu teor
controlado. O presente trabalho apresenta o desenvolvimento e validação de
métodos para o controle de qualidade de U. tomentosa e seus derivados
farmacêuticos tintura e gel, por CLAE. Entre os diferentes alcalóides constituintes da
espécie, o alcalóide mitrafilina foi indicado após avaliações como o mais adequado
para padronização do material utilizado. O método CLAE para casca e tintura e o
preparo da amostra casca foram otimizados com planejamento fatorial de
experimentos. A análise por espectrometria de massas de amostras da planta
indicou presença de AOP ainda não descritos na espécie, provavelmente uncarinas
A e B, e o oxindólico rauniticina allo A ou B. Para análise do gel foi desenvolvido
método de preparo da amostra pela aplicação da técnica de dispersão de matriz em
fase sólida (MSPD) e quantificação por CLAE. A seletividade / especificidade dos
métodos foram avaliadas através da determinação da pureza dos picos, comparação
dos perfis espectrais entre padrão e amostra, análise do placebo do gel, verificação
do paralelismo das curvas de padrão e amostra adicionada de padrão para cascas e
tintura e análise por espectrometria de massas para cada um dos alcalóides no
método para casca. Linearidade com coeficiente de correlação (r) igual a 0,9998 e
0,9997 foi obtida com o padrão analítico para os métodos da casca e gel
respectivamente. Limites de 0,80 e 1,41 µg.mL
-1
(detecção) e 2,40 e 4,27 µg.mL
-1
(quantificação) foram obtidos para método CLAE da casca e gel respectivamente.
Precisão com desvio padrão relativo (DRP) inferior a 2,30%, recuperação superior a
98,37% para exatidão e r de 0,9979 foram obtidos para o método da casca. Para o
método de análise da tintura valores de precisão com DPR inferior a 0,93%,
linearidade com r de 0,9989 e recuperação superior a 98,37% para exatidão foram
encontrados. Para o gel a validação apresentou valores de DPR inferior a 1,96% nos
ensaios de precisão, r de 0,9927 para linearidade e mínimo de 98,78% de
recuperação para a exatidão. Finalmente o trabalho demonstrou que os métodos
permitem análises confiáveis da droga U. tomentosa, sua tintura e gel contendo
como ativo a tintura da planta.
Palavras chave: Uncaria tomentosa DC. Mitrafilina. Validação analítica. CLAE.
Alcalóides oxindólicos.
ABSTRACT
Stem and root barks of Uncaria tomentosa, popularly known as cat’s claw, are used
in the treatment of several cases of inflammations, cancer and viral processes. The
plant is native from South America and possesses several of its pharmacological
properties associated with the oxindole alkaloids (OA). The OA found in the specie
are classified in pentacyclic (POA) and tetracyclic (TOA). TOA (rhynchophylline and
isorhynchophylline) possess accentuated action in the central nervous system and
are considered antagonists of POA (speciophylline, uncarine F, mitraphylline,
isomitraphylline, pteropodine and isopteropodine), therefore their amount should be
controlled. This work presents the development and validation of methods for quality
control of U. tomentosa plant material and a gel formulation containing its tincture, by
HPLC. Among the different alkaloids present in the specie, the alkaloid mitraphylline
was indicated as the most suitable for standardization of the used samples. Both the
bark sample preparation and the HPLC method for bark and tincture preparation
were optimized with statistical experimental design. The mass spectrometry analysis
of species sample indicated the presence of POA still not described in the specie,
probably uncarines A and B, and the oxindolic rauniticine allo A or B. Sample
preparation method for gel analysis was developed with the application of the
technique of matrix solid-phase dispersion (MSPD) and HPLC quantification. The
selectivity and specificity of the methods were evaluated through the determination of
the peak purity, comparison of the spectral profiles between standard and sample,
analysis of the placebo of the gel, verification of the parallelism of analytical curves
and sample spiked with standard for bark and tincture and mass spectrometry
analysis for each one of the alkaloids in the bark method. Correlation coefficients (r)
equal to 0,9998 and 0,9997 were obtained with the analytical standard in the
linearity test respectively for the methods of bark and tincture. Limits of 0,80 and 1,41
µg.mL
-1
(detection) and 2,40 and 4,27 µg.mL
-1
(quantification) were obtained
respectively for HPLC method of bark and gel. Precision with relative standard
deviation (RSD) lower than 2,30%, recovery higher than 98,37% for accuracy and r
of 0,9979 were obtained for bark method. For tincture method of analysis values of
precision with RSD lower than 0,93%, linearity with r value of 0,9989 and recovery
higher than 98,37% for accuracy were found. For gel validation RSD values lower
than 1,96% for precision tests, r value of 0,9927 for linearity and recovery higher than
98,78% for accuracy were found. Finally the present work demonstrated that the
methods allowed reliable analyses of the drug U. tomentosa, its tincture and gel
containing the plant tincture as active principle.
Key words: Uncaria tomentosa DC. Mitraphylline. Analytical validation. HPLC.
Oxindole alkaloids.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – ASPECTO DOS ESPINHOS DE U. tomentosa DC., RUBIACEAE.......21
FIGURA 2 – ASPECTO DO CAULE DE U. tomentosa DC., RUBIACEAE. ..............21
FIGURA 3 – FLORES DE U. tomentosa DC., RUBIACEAE......................................22
FIGURA 4 – ASPECTO DA TREPADEIRA U. tomentosa DC., RUBIACEAE...........22
FIGURA 5 – ROTA BIOSSINTÉTICA DO l-TRIPTOFANO .......................................29
FIGURA 6 – INTERCONVERSÃO DE ALCALÓIDE OXINDOLICO DO TIPO
PSEUDO PARA O TIPO NORMAL......................................................32
FIGURA 7 – MÉTODO DE DISPERÇÃO DE MATRIZ EM FASE SÓLIDA ...............36
FIGURA 8 – DESIGN COMPOSTO CENTRAL PARA TRÊS FATORES AVALIADOS
.............................................................................................................39
FIGURA 9 – DETERMINAÇÃO DA EXATIDÃO PELA ADIÇÃO DE PADRÃO À
AMOSTRA ...........................................................................................46
FIGURA 10 – FLUXOGRAMA DAS ETAPAS SEGUIDAS NA PESQUISA...............50
FIGURA 11 – FLUXOGRAMA DO PREPARO DA AMOSTRA GEL .........................60
FIGURA 12 – CROMATOGRAMA DO ALCALÓIDE ISOLADO ................................68
FIGURA 13 – ESTRUTURA DA MITRAFILINA.........................................................69
FIGURA 14 – ESPECTRO DE RMN -
1
H (200 MHz) EM CDCl
3
DA MITRAFILINA
ISOLADA .............................................................................................70
FIGURA 15 – ESPECTRO DE RMN –
13
C (200 MHz) EM CDCl
3
DA MITRAFILINA
ISOLADA .............................................................................................71
FIGURA 16 – ESPECTRO DEPT (200 MHz) EM CDCl
3
DA MITRAFILINA ISOLADA
.............................................................................................................72
FIGURA 17 – ESPECTRO DE MASSAS DA MITRAFILINA ISOLADA - [M+H]
+
......73
FIGURA 18 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DA MITRAFILINA NO ULTRAVIOLETA
(190 – 330nm)......................................................................................74
FIGURA 19 – ESPECTRO EM 3D DA MITRAFILINA ISOLADA OBTIDO EM CLAE-
DAD .....................................................................................................74
FIGURA 20 – ANÁLISE DE DSC DA MITRAFILINA ISOLADA.................................76
FIGURA 21 – EFEITOS PADRONIZADOS – PAR UNCARINA F - MITRAFILINA ...78
FIGURA 22 – EFEITOS PRINCIPAIS – PAR UNCARINA F – MITRAFILINA...........79
FIGURA 23 – SUPERFÍCIE DE RESPOSTA DAS CONDIÇÕES CLAE PARA
CASCAS E TINTURA ..........................................................................80
FIGURA 24 – PERFIL CROMATOGRÁFICO DAS CONDIÇÕES OTIMIZADAS PARA
CASCAS E TINTURA – PLANTA BRASILEIRA ..................................81
FIGURA 25 – PERFIL CROMATOGRÁFICO DAS CONDIÇÕES OTIMIZADAS PARA
CASCAS E TINTURA – PLANTA PERUANA ......................................81
FIGURA 26 – EM – MS1 DA PLANTA BRASILEIRA ................................................83
FIGURA 27 – EM – MS1 DA PLANTA PERUANA....................................................84
FIGURA 28 – MS2 DOS ALCALÓIDES OXINDÓLICOS ..........................................86
FIGURA 29 – PROPOSTA DE FRAGMENTAÇÃO PARA AOP................................90
FIGURA 30 – PROPOSTA DE FRAGMENTAÇÃO PARA AOT................................91
FIGURA 31 – ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES PADRÃO.....................................94
FIGURA 32 – PERFIL DE ELUIÇÃO DO PROPIL PARABENO NO METODO CLAE
PARA CASCAS E TINTURA................................................................96
FIGURA 33 – PERFIL CROMATOGRÁFICO DOS AO DO GEL APÓS
OTIMIZAÇÕES ....................................................................................97
FIGURA 34 – GRÁFICO DE PARETO PARA AS CONDIÇÕES EXTRATIVAS DAS
CASCAS ..............................................................................................99
FIGURA 35 – EFEITOS PRINCIPAIS PARA AS CONDIÇÕES EXTRATIVAS DAS
CASCAS ............................................................................................100
FIGURA 36 – SUPERFÍCIE DE RESPOSTA PARA OTMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO
DAS CASCAS....................................................................................101
FIGURA 37 – PERFIL CROMATOGRÁFICO DA TINTURA DE U. tomentosa .......102
FIGURA 38 – DEMONSTRAÇÃO DAS ETAPAS DO PROCESSO DE PREPARO DA
AMOSTRA GEL.................................................................................105
FIGURA 39 – PERFIS ESPECTRAIS DOS PICOS DE AOP ANALISADOS ..........107
FIGURA 40 – LINEARIDADE COM PADRÃO MITRAFILINA, MÉTODO CLAE
CASCAS E TINTURA ........................................................................109
FIGURA 41 – CURVA ANALÍTICA PARA CÁLCULO DO LD PARA CASCAS E
TINTURA ...........................................................................................110
FIGURA 42 – LINEARIDADE – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE U. tomentosa .....113
FIGURA 43 – DISPERSÃO DOS RESÍDUOS – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE U.
tomentosa ..........................................................................................114
FIGURA 44 – AVALIAÇÃO DO EFEITO MATRIZ – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE
U. tomentosa......................................................................................116
FIGURA 45 – LINEARIDADE – VALIDAÇÃO DA TINTURA ...................................119
FIGURA 46 – DISPERSÃO DOS RESÍDUOS – VALIDAÇÃO DA TINTURA..........120
FIGURA 47 – AVALIAÇÃO DO EFEITO MATRIZ – VALIDAÇÃO DA TINTURA ....122
FIGURA 48 – SOBREPOSIÇÃO DOS CROMATOGRAMAS DO PLACEBO E
AMOSTRA GEL.................................................................................124
FIGURA 49 – FAIXA LINEAR DE TRABALHO OBTIDA PARA O MÉTODO GEL..124
FIGURA 50 – LINEARIDADE – VALIDAÇÃO DO GEL...........................................125
FIGURA 51 – DISPERSÃO DOS RESÍDUOS – VALIDAÇÃO DO GEL..................125
FIGURA 52 – CURVA ANALÍTICA PARA CÁLCULO DO LD DO GEL...................127
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 – ENQUADRAMENTO TAXONÔMICO SEGUNDO APG II (2003). ......20
QUADRO 2 – CORRELAÇÃO ENTRE OS PRINCIPAIS METABÓLITOS DE U.
tomentosa E SUAS PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS..............24
QUADRO 3 – PRINCIPAIS ALCALOIDES ENCONTRADOS EM U. tomentosa.......25
QUADRO 4 – ISÔMEROS POSSÍVEIS PARA ESTRUTURA GERAL DOS AOP ....33
QUADRO 5 – CATEGORIAS DOS TESTES SUBMETIDOS À VALIDAÇÃO ...........40
QUADRO 6 – ENSAIOS NECESSÁRIOS PARA VALIDAÇÃO SEGUNDO
CATEGORIA........................................................................................40
QUADRO 7 – MODIFICAÇÕES POSSÍVEIS PARA AVALIAÇÃO DA ROBUSTEZ..48
QUADRO 8 – PARÂMETROS DE CONFORMIDADE DO SISTEMA PARA CLAE ..49
QUADRO 9 – COLUNAS TESTADAS NA VALIDAÇÃO DA ROBUSTEZ DOS
MÉTODOS...........................................................................................65
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – LIMITES DE ACEITAÇÃO PARA AVALIAÇÃO DA EXATIDÃO ...........47
TABELA 2 – CONDIÇÕES UTILIZADAS NO ESPECTRÔMETRO DE MASSAS.....54
TABELA 3 – GRADIENTE UTILIZADO NAS ANÁLISES POR CLAE DAS CASCAS E
TINTURA .............................................................................................56
TABELA 4 – GRADIENTE UTILIZADO NAS ANÁLISES POR CLAE DO GEL.........58
TABELA 5 – RESULTADOS OBTIDOS PARA RMN-
1
H DA MITRAFILINA ISOLADA
.............................................................................................................69
TABELA 6 – DADOS OBTIDOS PARA RMN-
13
C DA MITRAFILINA ISOLADA........70
TABELA 7 – CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS PROPOSTAS POR GANZERA,
(2004) ..................................................................................................77
TABELA 8 – ETAPA DE TRIAGEM – PLANEJAMENTO FATORIAL PARA CLAE
DAS CASCAS E TINTURA..................................................................77
TABELA 9 – ETAPA DE OTIMIZAÇÃO – PLANEJAMENTO FATORIAL CLAE DAS
CASCAS E TINTURA ..........................................................................80
TABELA 10 – ÍONS MOLECULARES OBTIDOS EM CLAE-MS PARA A PLANTA
BRASILEIRA E PERUANA ..................................................................85
TABELA 11 – IONS PRODUTO DOS PRINCIPAIS ALCALÓIDES DE U. tomentosa
.............................................................................................................88
TABELA 12 – COMPARAÇÃO DAS CURVAS ANALÍTICAS AVALIADAS...............92
TABELA 13 – COMPARAÇÃO DOS DIFERENTES TEORES ALCALÓIDICOS
OBTIDOS FRENTE ÀS DIFERENTES CURVAS ANALITICAS
TESTADAS..........................................................................................92
TABELA 14 – ETAPA DE TRIAGEM – PLANEJAMENTO FATORIAL PARA
EXTRAÇÃO DAS CASCAS .................................................................98
TABELA 15 – ETAPA DE OTIMIZAÇÃO – PLANEJAMENTO FATORIAL PARA
EXTRAÇÃO DAS CASCAS ...............................................................101
TABELA 16 – PUREZA DE PICO DOS ALCALÓIDES PARA AVALIAÇÃO DA
SELETIVIDADE .................................................................................108
TABELA 17 – AVALIAÇÃO DO LQ PARA CASCAS E TINTURA...........................111
TABELA 18 – RESULTADOS OBTIDOS COM AS DIFERENTES COLUNAS
TESTADAS NA AVALIAÇÃO DA ROBUSTEZ PARA CLAE DAS
CASCAS E TINTURA ........................................................................112
TABELA 19 – REPETIBILIDADE – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE U. tomentosa114
TABELA 20 – PRECISÃO INTERMEDIÁRIA – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE U.
tomentosa ..........................................................................................115
TABELA 21 – DADOS PARA O TESTE DA ADIÇÃO DE PADRÃO À AMOSTRA
CASCAS DE U. tomentosa................................................................116
TABELA 22 – EXATIDÃO – VALORES DE RECUPERAÇÃO PARA OS AO DAS
CASCAS DE U. tomentosa................................................................117
TABELA 23 – REPETIBILIDADE – VALIDAÇÃO DA TINTURA..............................120
TABELA 24 – PRECISÃO INTERMEDIÁRIA – VALIDAÇÃO DA TINTURA ...........121
TABELA 25 – DADOS PARA O TESTE DA ADIÇÃO DE PADRÃO À AMOSTRA
TINTURA ...........................................................................................122
TABELA 26 – EXATIDÃO – VALORES DE RECUPERAÇÃO PARA OS AO DA
TINTURA ...........................................................................................123
TABELA 27 – REPETIBILIDADE – VALIDAÇÃO DO GEL .....................................126
TABELA 28 – PRECISÃO INTERMEDIÁRIA – VALIDAÇÃO DO GEL ...................127
TABELA 29 – EXATIDÃO – VALORES DE RECUPERAÇÃO PARA OS AO DO GEL
...........................................................................................................128
TABELA 30 – RESULTADOS OBTIDOS COM AS DIFERENTES COLUNAS
TESTADAS NA AVALIAÇÃO DA ROBUSTEZ PARA CLAE DO GEL
...........................................................................................................129
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ANOVA - Análise de variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AO - Alcalóides oxindólicos
AOP - Alcalóides oxindólicos pentacíclicos
AOT - Alcalóides oxindólicos tetracíclicos
o
C - Graus Celsius
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
DAD - Detector de arranjo de diodos
DEPT - Distortion enhancement by polarization transfer
DP - Desvio padrão
DPR - Desvio padrão relativo
DSC - Differential scanning calorimetry (calorimetria exploratória diferencial)
EM - Espectrometria de massas
ICH - International Conference of Harmonization
INMETRO
- Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
IUPAC - International Union of Pure and Applied Chemistry
LD - Limite de Detecção
LQ - Limite de Quantificação
mAU - Milli absorbance units (mili unidades de absorbância)
MeCN - Acetonitrila
min - Minutos
MSPD - Matrix solid phase dispersion (dispersão de matriz em fase sólida)
MtBE
- Éter metil tert-butílico
m/z
- Relação massa-carga
OALB
- Óxido de alumínio básico
OALN
- Óxido de alumínio neutro
ppm
- Partes por milhão
r
- Coeficiente de correlação de Pearson
RMN-
13
C
- Ressonância Magnética Nuclear de carbono 13
RMN-
1
H
- Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio
rpm
- Rotações por minuto
s
- Segundos
TMS
- Tetrametilsilano
USP
- United States Pharmacopeia
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................17
2 OBJETIVOS ...........................................................................................................19
2.1 OBJETIVO GERAL ..............................................................................................19
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................19
3 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................20
3.1 DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE .................................................................................20
3.1.1 Propriedades farmacológicas e constituintes químicos ..................................23
3.2 ALCALÓIDES OXINDÓLICOS.............................................................................27
3.3 DISPERSÃO DE MATRIZ EM FASE SÓLIDA.....................................................35
3.4 PLANEJAMENTO FATORIAL DE EXPERIMENTOS ..........................................37
3.5 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS .........................................................39
3.5.1 Seletividade / Especificidade..........................................................................41
3.5.2 Linearidade e intervalo ...................................................................................42
3.5.3 Precisão..........................................................................................................42
3.5.3.1 Repetitividade ou repetibilidade...................................................................43
3.5.3.2 Precisão intermediária .................................................................................43
3.5.3.3 Reprodutibilidade.........................................................................................43
3.5.4 Limite de Detecção e Limite de Quantificação................................................44
3.5.5 Exatidão..........................................................................................................45
3.5.6 Robustez ........................................................................................................47
3.5.7 Estabilidade das soluções ..............................................................................48
3.5.8 Conformidade do Sistema ..............................................................................49
4 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................50
4.1 DESENHO EXPERIMENTAL...............................................................................50
4.2 REAGENTES, SOLVENTES E SOLUÇÕES .......................................................51
4.3 PADRÕES ANALÍTICOS .....................................................................................51
4.4 EQUIPAMENTOS ................................................................................................52
4.5 AMOSTRAS.........................................................................................................52
4.6 ISOLAMENTO DO PADRÃO ANALÍTICO DE ALCALÓIDE OXINDÓLICO.........53
4.6.1 Identificação e confirmação da pureza do padrão isolado..............................54
4.7 DESENVOLVIMENTO DO TAMPÃO ORGÂNICO E OTIMIZAÇÃO DOS
MÉTODOS EM CLAE ..........................................................................................55
4.7.1 Desenvolvimento do Tampão orgânico e Otimização do método em CLAE
para cascas e tintura ......................................................................................55
4.7.2 Verificação da capacidade de distinção entre AOT e AOP.............................56
4.7.3 Escolha do padrão externo para quantificação dos AO..................................56
4.7.4 Estabilidade das soluções padrão ..................................................................57
4.7.5 Otimização do método CLAE para análise do gel ..........................................57
4.7.6 Avaliação da conformidade do sistema ..........................................................58
4.8 DESENVOLVIMENTO E OTIMIZAÇÃO DOS MÉTODOS DE PREPARO DAS
AMOSTRAS CASCAS, TINTURA E GEL ............................................................58
4.8.1 Otimização do preparo da amostra cascas de U. tomentosa .........................58
4.8.2 Otimização do preparo da amostra tintura de U. tomentosa ..........................59
4.8.3 Otimização do preparo da amostra gel...........................................................59
4.9 VALIDAÇÃO DOS METODOS ANALÍTICOS ......................................................60
4.9.1 Seletividade / especificidade ..........................................................................60
4.9.1.1 Método da adição de padrão .......................................................................60
4.9.1.2 Comparação dos perfis espectrais...............................................................61
4.9.1.3 Avaliação da pureza de pico........................................................................61
4.9.1.4 Monitoramento dos íons produtos originários de [M+H]
+
= 369 e 385 Da....61
4.9.1.5 Análise do placebo.......................................................................................61
4.9.2 Linearidade e intervalo ...................................................................................62
4.9.3 Precisão..........................................................................................................62
4.9.3.1 Repetitividade ou repetibilidade...................................................................62
4.9.3.2 Precisão intermediária .................................................................................63
4.9.4 Limite de detecção..........................................................................................63
4.9.5 Limite de quantificação...................................................................................63
4.9.6 Exatidão..........................................................................................................64
4.9.7 Robustez ........................................................................................................64
4.10 CÁLCULO DO TEOR DE ALCALÓIDES NAS AMOSTRAS...........................65
4.10.1 Amostra cascas ..............................................................................................66
4.10.2 Amostra tintura ...............................................................................................66
4.10.3 Amostra gel ....................................................................................................66
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................67
5.1 ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E CONFIRMAÇÃO DA PUREZA DO
PADRÃO ANALÍTICO..........................................................................................67
5.1.1 RMN de
1
H e
13
C ............................................................................................68
5.1.2 Espectrometria de massas .............................................................................72
5.1.3 Perfil espectral em UV....................................................................................73
5.1.4 Análise da Pureza em CLAE-DAD .................................................................74
5.1.5 Confirmação da pureza por DSC....................................................................75
5.2 DESENVOLVIMENTO DO TAMPÃO ORGÂNICO E OTIMIZAÇÃO DOS
MÉTODOS EM CLAE ..........................................................................................76
5.2.1 Desenvolvimento do Tampão orgânico e Otimização do método em CLAE
para pó e tintura .............................................................................................76
5.2.2 Verificação da capacidade de distinção entre AOT e AOP.............................82
5.2.3 Escolha do padrão externo.............................................................................91
5.2.4 Estabilidade das soluções padrão ..................................................................93
5.2.5 Conformidade do sistema método CLAE para cascas e tintura .....................94
5.2.6 Otimização do método CLAE análise do gel ..................................................95
5.2.7 Conformidade do sistema método CLAE para gel..........................................97
5.3 MÉTODOS DE PREPARO DAS AMOSTRAS.....................................................98
5.3.1 Preparo da amostra cascas............................................................................98
5.3.2 Preparo da amostra tintura...........................................................................102
5.3.3 Preparo da amostra gel ................................................................................103
5.4 VALIDAÇÃO DOS METODOS ANALÍTICOS ....................................................106
5.4.1 Comparação dos perfis espectrais ...............................................................106
5.4.2 Avaliação da pureza de pico.........................................................................108
5.4.3 Condições cromatográficas das cascas e tintura .........................................109
5.4.3.1 Linearidade com padrão ............................................................................109
5.4.3.2 Limite de detecção.....................................................................................110
5.4.3.3 Limite de quantificação ..............................................................................110
5.4.3.4 Robustez das condições cromatográficas CLAE para cascas e tintura.....111
5.4.4 Validação do método para cascas de U. tomentosa ....................................112
5.4.4.1 Seletividade / especificidade......................................................................112
5.4.4.2 Linearidade e intervalo...............................................................................113
5.4.4.3 Repetibilidade ............................................................................................114
5.4.4.4 Precisão intermediária ...............................................................................115
5.4.4.5 Exatidão.....................................................................................................116
5.4.4.6 Robustez....................................................................................................118
5.4.5 Validação do método para tintura.................................................................118
5.4.5.1 Seletividade / especificidade......................................................................118
5.4.5.2 Linearidade e intervalo...............................................................................119
5.4.5.3 Repetibilidade ............................................................................................120
5.4.5.4 Precisão intermediária ...............................................................................121
5.4.5.5 Exatidão.....................................................................................................121
5.4.6 Validação do método para o gel ...................................................................123
5.4.6.1 Seletividade / especificidade......................................................................123
5.4.6.2 Linearidade e intervalo...............................................................................124
5.4.6.3 Repetibilidade ............................................................................................126
5.4.6.4 Precisão intermediária ...............................................................................126
5.4.6.5 Limite de detecção.....................................................................................127
5.4.6.6 Limite de quantificação ..............................................................................128
5.4.6.7 Exatidão.....................................................................................................128
5.4.6.8 Robustez....................................................................................................129
6 CONCLUSÃO.......................................................................................................130
REFERÊNCIAS.......................................................................................................132
ANEXOS...... ...........................................................................................................140
17
1 INTRODUÇÃO
Produtos naturais são uma fonte atrativa de diferentes moléculas que
possuem possíveis atividades biológicas, o que historicamente conduz esses
produtos a serem uma fonte de novos medicamentos (BOLDI, 2004). Para se ter
uma idéia do que isto representa Newman; Cragg e Snader (2003) citam que para
as terapias de câncer e doenças infecciosas, entre 60 e 75% das drogas utilizadas
tem origem em produtos naturais ao que Calixto (2005) corrobora, demonstrando
que entre 25 a 30% de todas as drogas disponíveis para terapêutica possuem
origem em produtos naturais, sejam eles plantas, micróbios ou animais.
De acordo com a organização mundial da saúde (OMS), aproximadamente
65 a 80% da população dos países em desenvolvimento dependem essencialmente
de plantas medicinais, fato ocasionado pela pobreza e falta de acesso à moderna
medicina. Todavia existe pouco estudo científico dessas plantas para se confirmar, a
qualidade, segurança e eficácia (CALIXTO, 2005).
Uma exceção à regra Uncaria tomentosa (Willdenow ex Roemer and
Shultes) DC., Rubiaceae, popularmente conhecida como unha-de-gato, é uma
planta extensamente estudada por diversos pesquisadores e com suas propriedades
terapêuticas já bastante divulgadas. Entre os diversos constituintes químicos já
caracterizados, os alcalóides oxindólicos (SANDOVAL et al.) são reconhecidos como
os marcadores fitoquímicos desta espécie por estarem associados a várias de suas
ações farmacológicas (KEPLINGER et al., 1999; HEITZMAN et al., 2005; USP,
2008). Entretanto, existe nesta espécie variação sazonal na produção e
armazenamento de diferentes tipos de alcalóides oxindólicos. A mesma planta pode
em alguns momentos de sua vida produzir e armazenar alcalóides oxindólicos do
tipo pentacíclico (AOP) em maior quantidade e em outros momentos movimentar sua
rota metabólica em direção aos alcalóides oxindólicos do tipo tetracíclico (AOT). Aos
AOP são atribuídas atividades imunomoduladoras, antitumoral e antinociceptiva, já
para os AOT são atribuídas ações no sistema nervoso central e antagonismo em
relação aos AOP na indução de células humanas a liberarem fatores reguladores da
proliferação de linfócitos (LAUS; KEPLINGER, 1994; LAUS; BROSSNER;
KEPLINGER, 1997; WURM et al., 1998; JING-SHAN et al., 2003; ZHANG; CHEN;
SIM, 2004). Desta maneira pesquisadores e agências regulatórias passaram a
18
preocupar-se no sentido de identificar e utilizar para fins terapêuticos apenas plantas
da espécie que apresentem majoritariamente o perfil pentacíclico de alcalóides
oxindólicos.
A distinção entre planta contendo AOP e AOT é facilmente realizada pela
análise do material vegetal por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com o
emprego de tampões fosfato (potássio e sódio) como fase móvel em vários métodos
descritos. (STUPPNER; STURM; KONWALINKA, 1992; LAUS; KEPLINGER, 1994;
GANZERA et al., 2001; VALENTE et al., 2006; PEREIRA et al., 2008; USP, 2008). O
emprego destas fases móveis requer longo tempo de lavagem com água ao final da
análise para garantir que não ocorra precipitação de sal na coluna, isso conduz a um
tempo excessivamente longo de análise e redução da vida útil da coluna, tornando o
controle de qualidade demorado e caro para laboratórios analíticos.
Além disso, a RDC-48 de 16 de março de 2004, legislação atual para
registro de medicamentos fitoterápicos no Brasil, exige para deferimento do registro
que sua solicitação seja acompanhada, entre outros documentos, por validação da
metodologia analítica para quantificação dos princípios ativos e/ou marcadores de
acordo com a Resolução-RE 899 de 29 de maio de 2003 (Guia para validação de
métodos analíticos e bioanalíticos). Esta validação deve ser apresentada quando a
metodologia analítica utilizada não estiver descrita em farmacopéias ou formulários
oficiais, devidamente reconhecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) (BRASIL, 2003; BRASIL, 2004).
Essas exigências constituem desafio para controle de qualidade de
medicamentos fitoterápicos, pois, quando formulados em matrizes complexas, como
no caso de gel, proporcionam um agravante ao desenvolvimento e validação destas
metodologias analíticas para quantificação dos marcadores. Por si a planta e seus
derivados, tinturas e extratos, já são considerados uma matriz complexa e quando
associados à outra matriz, tão complexa quanto a sua, conduz o analista à
necessidade de desenvolver técnicas analíticas que permitam solucionar o problema
de Controle de Qualidade de maneira seletiva, reprodutível, robusta, exata e linear.
Assim o desafio de alcançar metodologias analíticas mais rápidas e
eficientes para a análise de AO em Uncaria tomentosa e seus derivados
farmacêuticos, bem como a necessidade de obtenção da renovação do registro de
gel contendo tintura de U. tomentosa produzido pela empresa Herbarium Laboratório
Botânico S.A., motivaram o desenvolvimento desta pesquisa.
19
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver e validar metodologia analítica para extração e quantificação de
alcalóides oxindólicos presentes em gel, para tratamento de Herpes zoster tipo 1,
contendo tintura de Uncaria tomentosa (Willdenow ex Roemer and Shultes) DC.,
Rubiaceae, de forma a atender ao controle de qualidade do referido produto.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Isolar, caracterizar e determinar pureza de padrão analítico de AOP;
Desenvolver tampão orgânico e otimizar método em CLAE capaz de
separar e distinguir entre AOP e AOT na casca e tintura de U. tomentosa;
Desenvolver e otimizar método do preparo das amostras casca, tintura e
gel de U. tomentosa;
Validar as metodologias analíticas desenvolvidas, conforme Resolução-RE
899 de 29 de maio de 2003 (Guia para validação de métodos analíticos e
bioanalíticos).
20
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE
Uncaria tomentosa (Willdenow ex Roemer e Shultes) DC., Rubiaceae, é um
grande cipó ou arbusto que chega a atingir de 20 a 30 m e seu ramo principal pode
ter mais de 30 cm de diâmetro. É uma trepadeira com espinhos característicos
semelhantes a ganchos recurvados nas margens dos ramos, o que levou os
espanhóis a chamar essa espécie “uña de gato”, em português unha-de-gato. Esses
espinhos quando florescem dão lugar a florescências que podem ser de coloração
branca e amarela, e estão assentadas em formações circulares, possuindo odor
semelhante ao de canela (REINHARD, 1997; KEPLINGER et al., 1999;
FALKIEWICZ; LUKASIAK, 2001; GATTUSO; DI
SAPIO; LI
PEREYRA, 2004).
A espécie em questão segue a classificação taxonômica apresentada no
QUADRO 1.
TÁXON NOMENCLATURA
Divisão Magnoliophyta
Classe Magnoliopsida
Subclasse Asteridae
Ordem Rubiales
Família Rubiaceae
Gênero
Uncaria
Espécie
Uncaria tomentosa DC.
QUADRO 1 – ENQUADRAMENTO TAXONÔMICO SEGUNDO APG II (2003).
FONTE: CASTAÑEDA et al. (1998)
Nas regiões em que é encontrada e demais partes do mundo é conhecida
por diversos nomes comuns, entre eles destacam-se: no Brasil unha-de-gato; nos
demais países latino americanos uña de gato, garabato, vilcacora, samento,
garabato amarillo; nos Estados Unidos da América e países da Europa Ocidental
cat’s claw, cat’s crew, hawk’s claw, saventaro; na Alemanha e Áustria katzenkralle
(VILCHES, 1995; FALKIEWICZ; LUKASIAK, 2001; HEITZMAN et al., 2005).
As espécies que compõe o gênero Uncaria, em um total de 34, possuem
como habitat natural as regiões tropicais do globo e destas apenas duas são
encontradas na América latina (Uncaria tomentosa e Uncaria guianensis), três na
21
África e as demais na Ásia (PHILLIPSON; HEMINGWAY; RIDSDALE, 1978;
KEPLINGER et al., 1999; HEITZMAN et al., 2005).
As espécies latino americanas são encontradas naturalmente nas florestas
tropicais da América Central (Guatemala, Belize, Honduras, El Salvador, Nicarágua,
Costa Rica e Panamá) e América do Sul (Brasil, Colômbia, Peru, Equador, Guianas
e Bolívia), sendo que ambas possuem ligeira diferença nas características
fenotípicas (VILCHES, 1995; POLLITO; TOMAZELLO, 2006).
FIGURA 1 – ASPECTO DOS ESPINHOS DE U. tomentosa DC., RUBIACEAE.
FONTE: João Alencar de Sousa
FIGURA 2 – ASPECTO DO CAULE DE U. tomentosa DC., RUBIACEAE.
FONTE: João Alencar de Sousa
22
FIGURA 3 – FLORES DE U. tomentosa DC., RUBIACEAE.
FONTE: João Alencar de Sousa
FIGURA 4 – ASPECTO DA TREPADEIRA U. tomentosa DC., RUBIACEAE.
FONTE: João Alencar de Sousa
Os autores Gattuso; Di Sapio e Li Pereyra (2004) apresentam a espécie
Uncaria tomentosa como encontrada principalmente nas regiões de selva alta, entre
300 e 800 m em relação ao nível do mar, enquanto a espécie Uncaria guianensis é
encontrada nas regiões de selva baixa, entre 100 e 500 m de altitude.
As duas espécies são utilizadas na medicina popular de maneira
intercambiável, no entanto, seus constituintes químicos, mais notadamente o perfil
alcalóidico e as características anatômicas, como já citado, são bastante diferentes.
U. tomentosa apresenta concentração significativamente maior de alcalóides em
23
relação à U. guianensis (VILCHES, 1995; SANDOVAL et al., 2002; GATTUSO; DI
SAPIO; LI
PEREYRA, 2004; POLLITO; TOMAZELLO, 2006)
Segundo Falkiewicz e Lukasiak (2001), uma característica de bastante
relevância e que distingue a espécie em questão das demais espécies do gênero
Uncaria é a grande variação no conteúdo individual de alcalóides entre as diferentes
partes da planta, sendo as maiores concentrações encontradas nas cascas do caule
e raiz.
Os pesquisadores Laus e Keplinger (1994) acompanharam o
desenvolvimento de algumas plantas da espécie mencionada por um período de até
sete anos e encontraram variação sazonal no conteúdo alcaloídico bastante
significativa. Foi percebido que a mesma planta com o decorrer do tempo alternava
entre diferentes alcalóides majoritários. Os mesmos autores estabeleceram após
conversas com habitantes nativos da selva peruana, existir três variedades de U.
tomentosa, que quando tem suas raízes vivas cortadas, exibem colorações
diferentes: cinza claro, amarelo amarronzado e vermelho escuro.
3.1.1 Propriedades farmacológicas e constituintes químicos
A utilização da planta com fins medicinais pelos povos nativos da região
Amazônica (Asháninka - Peru) data em mais de 2.000 anos. É cultuada por este
povo como planta sagrada que possui grandes propriedades terapêuticas
(KEPLINGER et al., 1999; WILLIAMS, 2001).
Preparada na medicina tradicional como um decocto das cascas dos ramos
e da raiz, o extrato aquoso é utilizado em casos de doenças inflamatórias (artrite,
gastrite, inflamações do trato geniturinário e inflamações dérmicas), asma, úlceras
gástricas, diabetes, tumores, câncer, processos virais, irregularidades no ciclo
menstrual, sensação de fraqueza e gonorréia (VILCHES, 1995; HEITZMAN et al.,
2005).
As diferentes propriedades terapêuticas desta planta são atribuídas a uma
diversidade de metabólitos secundários já identificados e estudados nesta espécie,
que até hoje passam de cinqüenta, entre eles alcalóides oxindólicos e indólicos,
polifenóis (flavonóides, proantocianidinas, taninos), glicosídeos triterpenos derivados
24
do ácido quinico e quinóvico e saponinas (AGUILAR et al., 2002; PILARSKI et al.,
2007).
AÇÃO METABÓLITO
COMPROVAÇÃO DA
ATIVIDADE
REFERÊNCIA
Estimulação da
atividade fagocítica de
macrófagos
Alcalóides
In vitro / In vivo
WAGNER, et al.
(1985)
Atividade antiviral
Glicosideos do ácido
quinovico / alcalóides
In vitro
AQUINO, et al. (1989);
REIS, et al. (2008)
Atividade
antiinflamatória
Glicosideo do ácido
quinovico
In vivo
AQUINO, et al. (1991)
Atividade
antimutagênica
Diferentes frações
In vitro
RIZZI, et al. (1993)
Antinociceptiva
Fração enriquecida de
alcalóides
In vitro / In vivo
JURGENSEN, et al.
(2005)
Antioxidante
Proantocianidinas,
ácidos fenólicos e
alcalóides
In vitro
GONÇALVES; DINIS;
BATISTA (2005);
PILARSKI (2006)
Atividade
antileucêmica
Alcalóides
In vitro
STUPPNER, et
al.(1993); PILARSKI
(2007)
Atividade pró-
apoptótica em células
leucêmicas
Alcalóides
In vitro
BACHER (2005)
QUADRO 2 – CORRELAÇÃO ENTRE OS PRINCIPAIS METABÓLITOS DE U. tomentosa E SUAS
PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS.
Notadamente os AO são os constituintes mais extensamente estudados na
planta. Esses alcalóides não são característicos da espécie, uma vez que são
encontrados em espécies do gênero Mitragyna (Ex. Mitragyna hirsuta), além de
outras espécies do gênero Uncaria como U. canescens, U. glabatra, U. attenuata, U.
orientalis entre outras e já possuem suas estruturas bem caracterizadas.
(JOLLIFFE; SHELLARD, 1973; PHILLIPSON; HEMINGWAY, 1975b; PHILLIPSON;
HEMINGWAY, 1975a; PHILLIPSON; HEMINGWAY; RIDSDALE, 1978;
PHILLIPSON; SUPAVITA; ANDERSON, 1982; WAGNER; KREUTZKAMP; JURCIC,
1985; LAUS; KEPLINGER, 1994; WAGNER; BLADT, 1996; LAUS; BROSSNER;
KEPLINGER, 1997; LAUS; KEPLINGER, 1997).
25
CLASSE ALCALÓIDES PENTACÍCLICOS ALCALÓIDES TETRACÍCLICOS
Pteropodina (Uncarina C) Rincofilina
Isopteropodina (Uncarina E) Isorincofilina
Especiofilina (Uncarina D) Corinoxeina
Uncarina F Isocorinoxeina
Mitrafilina
Alcalóides oxindólicos
Isomitrafilina
Akuammigina Hirsutina
Tetrahidroalstonina Dihidrocorinantheina
Isoajmacilina Hirsuteina
Alcalóides indólicos
Corinantheina
QUADRO 3 – PRINCIPAIS ALCALOIDES ENCONTRADOS EM U. tomentosa
FONTE: KEPLINGER et al. (1999)
O estudo exaustivo desses alcalóides levou recentemente alguns autores a
inferirem sobre a existência de dois quimiotipos de Uncaria tomentosa ocorrendo
naturalmente na natureza, os quais podem ser diferenciados pelo seu conteúdo
alcaloídico. Um dos quimiotipos conteria principalmente alcalóides oxindólicos
pentacíclicos (especiofilina, uncarina F, mitrafilina, isomitrafilina, pteropodina e
isopteropodina) e o outro conteria grande quantidade de alcalóides oxindólicos
tetracíclios (rincofilina e isorincofilina) (LAUS; BROSSNER; KEPLINGER, 1997;
WURM et al., 1998).
No entanto, alguns pesquisadores questionam a classificação adotada de
dois quimiotipos diferentes para a mesma espécie, sustentam que esses perfis
alcaloídicos podem ser intercambiáveis sob condições sazonais (PILARSKI et al.,
2007). Conforme já mencionado, o trabalho publicado por Laus e Keplinger (1994)
descreve que a mesma planta pode alterar seu conteúdo alcaloídico, apresentando
em determinado ano majoritariamente alcalóides tetracíclicos e, em outro ano,
majoritariamente alcalóides pentacíclicos.
Estes dados são importantes, pois ainda segundo Laus e Keplinger (1997),
as principais formas de adulterações/falsificações da planta contendo
majoritariamente AOP são exatamente a mistura de partes da planta com o perfil
tetracíclico e partes de Uncaria guianensis, assim como partes de madeira, lenho e
cascas de plantas indeterminadas. Reinhard (1997) fortalece a preocupação na
distinção entre plantas contendo diferentes perfis alcaloídicos, descrevendo que
somente a planta com o perfil pentacíclico, possui valor terapêutico, ao que
corroboram as informações de Keplinger e colaboradores (1999), citando os autores
que os curandeiros da tribo Asháninka na selva peruana utilizam apenas plantas que
apresentam o perfil pentacíclico de alcalóides no tratamento dos diferentes males.
26
Após os estudos de Wagner; Kreutzkamp e Jurcic (1985) foram atribuídas
importantes propriedades imunomoduladoras aos AOP por sua capacidade de
estimular a fagocitose em macrófagos. Além disso, é conhecido que os AOT
possuem atividade acentuada no Sistema Nervoso Central – SNC (redução da
pressão sanguínea, inibição de arritmia cardíaca, inibição da condução do estímulo
nervoso) (WAGNER; KREUTZKAMP; JURCIC, 1985; WURM et al., 1998; JING-
SHAN et al., 2003).
Já em 1998, pesquisadores austríacos encontraram antagonismo na ação
dos AOT em relação aos AOP na ação de estímulo para liberação de fator regulador
da proliferação de linfócitos por células endoteliais humanas, in vitro. Como
conseqüência, misturas do material dessa planta não controladas em seu conteúdo
alcaloídico poderiam ser colocadas em dúvida quanto ao seu efeito terapêutico, caso
os resultados in vitro repitam-se in vivo (WURM et al., 1998).
Considerando todas essas informações, recentemente a farmacopéia dos
Estados Unidos XXXI (USP) publicou monografia para esta droga definindo como
limite máximo para AOT 0,05% e limite mínimo para os AOP de 0,3% (USP, 2008).
Devido a esses estudos iniciais, pensou-se que as principais atividades
farmacológicas da unha-de-gato estivessem associadas a estes componentes
alcaloídicos, com o que corrobora o estudo de alguns autores que encontraram
correlação entre a atividade antiinflamatória e antiviral, por exemplo, e a quantidade
de alcalóides pentacíclicos presente no extrato da planta (AGUILAR et al., 2002;
REIS et al., 2008).
Contrariando os dados citados anteriormente, vários estudos posteriores aos
de Wagner e colaboradores relataram a existência de associação entre a
concentração de glicosídeos triterpênicos derivados do ácido quinóvico e a atividade
antiinflamatória da unha-de-gato. Os autores, no entanto, não descartaram que esta
atividade fosse em decorrência da ação sinérgica entre diferentes constituintes
químicos da planta (AQUINO; SIMONE; PIZZA, 1989; AQUINO et al., 1991).
Outros estudos com extratos aquosos da planta isentos de alcalóides,
comprovaram a atividade antiinflamatória do extrato mesmo na ausência destes
componentes assim colocou-se em dúvida a correlação entre a atividade
antiinflamatória da planta e os AOP (SANDOVAL et al., 2002; AKESSON et al.,
2003; SHENG et al., 2005).
27
Entretanto ainda hoje esta planta é marcada e seu controle de qualidade é
realizado em função da sua composição e concentração de AO. Existem várias
razões que explicam o fato, desde a grande concentração destas moléculas na
espécie, a quantidade de métodos descritos para análise via CLAE, até a já citada e
comprovada correlação entre algumas atividades farmacológicas, como
imunomodulação, atividade antileucêmica e antinociceptiva e estes alcalóides
(AGUILAR et al., 2002; PILARSKI et al., 2006; PILARSKI et al., 2007; REIS et al.,
2008).
3.2 ALCALÓIDES OXINDÓLICOS
Os alcalóides são bases nitrogenadas encontradas principalmente em
plantas, mas também podem ser encontrados em menores proporções em
microorganismos e animais. Podem apresentar um ou mais átomos de nitrogênio,
geralmente como aminas primárias, secundárias ou terciárias, o que geralmente
confere características básicas aos alcalóides, facilitando seu isolamento e
purificação, uma vez que sais hidrossolúveis podem ser formados na presença de
ácidos minerais. O nome alcalóide deriva consequentemente de álcali (DEWICK,
1997).
Ainda segundo Dewick (1997), os átomos de nitrogênio constituintes dos
diversos alcalóides existentes, são provenientes de suas moléculas precursoras na
rota biossintética, os aminoácidos. Geralmente os esqueletos carbônicos destes
aminoácidos precursores são bastante conservados na estrutura final do alcalóide,
apesar do carbono relativo ao ácido carboxílico ser geralmente perdido via
descarboxilação. Os principais aminoácidos precursores dos alcalóides são ornitina,
lisina, ácido nicotínico, tirosina, triptofano, ácido antranílico e histidina, estes podem
receber a incorporação de blocos derivados das vias do acetato, chiquimato ou
mevalonato para originarem as diversas classes de alcalóides. Todavia existe
exceção a esta regra, pois alguns alcalóides incorporam seus átomos de nitrogênio
por transaminação, assimilando apenas o átomo de nitrogênio do aminoácido, o
restante da molécula é derivado do acetato, chiquimato ou tem origem nos
terpenoides, esteroides.
28
No gênero Uncaria todos os alcalóides encontrados possuem um núcleo
indólico ou oxindólico, com exceção do harmana e são derivados da condensação
da triptamina (grupamento indólico derivado do triptofano) com o monoterpeno
ciclopentanoide secologanina. A resultante estrictosidina dá origem aos
heterohiohimbinicos pentacíclicos e tetracíclicos e aos correspondentes oxindólicos
(PHILLIPSON; HEMINGWAY; RIDSDALE, 1978).
Portanto, os alcalóides oxindólicos tem sua gênese na via do ácido
chiquímico (1), que por sucessivas reações com o fosfoenol piruvato (PEP / 2)
origina o intermediário ácido chorísmico (3), posteriormente tornando-se ácido
antranílico (4) e por sucessivos rearranjos, após condensação com fosforibosil PP
(5), dá origem ao grupamento indólico (6) desta classe de alcalóides. Finalmente o
grupamento indólico condensado à l-serina (7) origina o l-triptofano (8), intermediário
chave na via dos alcalóides indólicos terpenoides, FIGURA 5 (DEWICK, 1997).
29
CO
2
H
OH
OH
OH
ácido chiquímico (1)
ATP
CO
2
H
PO
OH
OH
H
+
CO
2
H
PO
CO
2
H
PO
OH
O
H
H
H
- HOP
CO
2
H
CO
2
H
PO
OH
O
- HOP
CO
2
H
CO
2
H
OH
O
ácido chorísmico (3)
PEP (2)
CO
2
H
PO
ácido chorísmico (3)
l-Gln
OH
2
H
+
NH
2
CO
2
H
CO
2
H
OH
O
NH
2
CO
2
H
ácido antranílico (4)
CO
2
H
O
CO
2
H
OH
NH
2
CO
2
H
ácido antranílico (4)
PPO
CH
2
OP
OH
OH
O
fosforibosil PP (5)
H
+
PPO
CH
2
OP
OH
OH
O
NH
CO
2
H
OP
OH
OH
OH
NH
+
HO
2
C
H
OP
OH
OH
OH
NH
HO
2
C
H
OP
OH
OH
O
NH
OO
indol (6)
CO
2
H
NH
2
OH
l-Triptofano (8)
l-Serina (7)
- CO
2
- H
2
O
H
CO
2
H
NH
2
N
H
N
H
OP
OH
OH
N
FIGURA 5 – ROTA BIOSSINTÉTICA DO l-TRIPTOFANO
Cabe ressaltar que segundo Dewick (1997), os alcalóides indólicos
terpenoides são um dos maiores grupos dessa classe química no reino Plantae.
Majoritariamente são encontrados em oito famílias de plantas, das quais os
principais exemplos são Apocynaceae, Loganiaceae e Rubiaceae. Praticamente
todas as estruturas são compostas de uma porção triptamina e outro fragmento
geralmente C
9
ou C
10
dos quais três tipos principais são distinguidos: 1) Corynanthe
30
como ajmalicina e akuammicina; 2) Aspidosperma como a tabersonina; 3) Iboga
como a catarantina. A porção C
9
ou C
10
tem origem nos terpenoides e o secoiridoide
secologanina (9) é o que geralmente se liga ao triptofano, via reação de Mannich,
para originar esta classe em especial.
Os AOP e AOT são alcalóides do tipo heterohiohimbina, muito próximos ao
tipo Corynanthe, sendo variantes oxidadas dos alcalóides iohimbinicos (10), como a
ajmalicina (11). As partes em negrito das estruturas apresentadas a seguir
evidenciam relação precursor-produto na rota biossintética.
ajmalicina (11)
N
N
MeO
2
C
OH
H
H
iohimbina (10)
secologanina (9)
H
H
N
N
O
MeO
2
C
H
H
OHC O
MeO
2
C
OGlc
Os alcalóides oxindólicos pentacíclicos (12) e tetracíclicos (13), derivados
das estruturas apresentadas anteriormente, possuem as estruturas gerais
representadas abaixo.
A
1
C
D
E
B
3
6
7
8
9
10
11
H
N
O
MeO
2
C
H
H
N
2
O
Me
H
13
14
5
15
16
17
18
19
20
21
Estrutura geral para AOP (12)
12
A
1
C
D
B
3
6
7
8
9
10
11
12
13
14
5
15
16
17
18
19
20
21
Me
Me
H
N
O
MeO
2
C
H
H
N
2
O
H
Estrutura geral para AOT (13)
Como citado, esses alcalóides são encontrados em várias plantas do gênero
Mitragyna e Uncaria, utilizadas com freqüência na medicina popular. Teoricamente
trinta e dois esteroisômeros da fórmula geral apresentada para AOP são possíveis,
pois sua estrutura possui cinco centros assimétricos ou estereogênicos. No entanto,
31
biogeneticamente a configuração do centro assimétrico na posição C-15 é fixo na
forma (S) devido ao precursor comum strictosidina, assim o número de possíveis
isômeros pode ser restrito a dezesseis (LAUS; WURST, 2003). A classificação
diasteroisomérica dos alcalóides oxindólicos do tipo heterohiohimbina foi
estabelecida em oito grupos: normal S (C-3 Hα, C-20 Hβ), normal R (C-3 Hα, C-20
Hβ), pseudo S (C-3 Hβ, C-20 Hβ), pseudo R (C-3 Hβ, C-20 Hβ), allo S (C-3 Hα, C-20
Hα), allo R (C-3 Hα, C-20 Hα), epiallo S (C-3 Hβ, C-20 Hα) e epiallo R (C-3 Hβ, C-20
Hα). Os diferentes tipos S ou R são relativos à conformação em C-7, sendo que R é
referente à carbonila lactâmica acima do plano dos anéis C-D e S o oposto.
(SHAMMA et al., 1967; PHILLIPSON; HEMINGWAY, 1975a; SEKI et al., 1993).
NH
N
O
O
O
O
allo S
NH
N
O
O
O
O
allo R
epiallo S
N
O
O
O
N
H
O
epiallo R
NH
N
O
O
O
O
normal S
NH
N
O
O
O
O
normal R
pseudo R
O
N
O
O
O
NH
H
pseudo S
O
N
O
O
O
N
H
H
N
O
O
O
NH
O
32
As estruturas anteriores demonstram que os alcalóides do tipo normal, são
caracterizados pela relação do tipo E (trans) nas junções dos anéis C/D e D/E, já os
representantes do tipo epiallo são caracterizados por relação do tipo Z (cis) na
junção dos anéis D/E, enquanto que os alcalóides do tipo allo são caracterizados por
relação do tipo E (trans) e Z (cis) nas junções dos anéis C/D e D/E respectivamente
(SEKI et al., 1993).
Importante observar que todas as estruturas relacionadas ocorrem como par
de epímeros em C(7) ou mesmo em C(3), esses pares em C(7) podem por
diferentes rearranjos se interconverterem (SHAMMA et al., 1967; PHILLIPSON;
HEMINGWAY; RIDSDALE, 1978; LAUS et al., 1996; LAUS; WURST, 2003).
Epímeros segundo Solomons e Fryhle (2006), são diasteroisômeros que diferem na
configuração em apenas um centro estereogênico como por exemplo d-Glucose e d-
Manose.
Dessas estruturas a de tipo pseudo ainda não foi encontrada na natureza,
provavelmente devido à séria interferência estérica existente entre a parte oxindólica
e a parte inferior do anel D da molécula, logo, esta estrutura pode epimerizar
facilmente para compostos do tipo normal, FIGURA 6 (SEKI et al., 1993).
pseudo
O
N
O
O
O
NH
O
N
O
O
O
N
H
O
N
H
N
+
N
O
O
O
normal
FIGURA 6 – INTERCONVERSÃO DE ALCALÓIDE OXINDOLICO DO TIPO PSEUDO PARA O TIPO
NORMAL
Deriva do citado anteriormente que o número de isômeros considerados
viáveis da estrutura geral apresentada para AOP, pode ser limitado a doze,
QUADRO 4.
33
TIPO
CONFIG.
DO C
3
-H
CONFIG.
DO C
20
-H
RELAÇÃO
DOS
ANÉIS
D/E
CONFIG.
DO C
19
-H
CONFIG.
DO C
7
EXEMPLO
S
Isomitrafilina
S (β)
R
Mitrafilina
S
Uncarina A
(isoformosanina)
Normal
S (α) R (β)
E
R (α)
R
Uncarina B
(formosanina)
S
Uncarina D
(especiofilina)
S (β)
R
Uncarina F
S
Rauniticina-
epiallo-oxindol A
Epiallo
R (β) S (α)
Z
R (α)
R
Rauniticina-
epiallo-oxindol B
S
Uncarina E
(isopteropodina)
S (β)
R
Uncarina C
(pteropodina)
S
Rauniticina-allo-
oxindol A
Allo
S (
α
) S (α)
Z
R (α)
R
Rauniticina-allo-
oxindol B
S
----
S (β)
R
----
S
----
Pseudo
R (β) R (β)
E
R (α)
R
----
QUADRO 4 – ISÔMEROS POSSÍVEIS PARA ESTRUTURA GERAL DOS AOP
FONTE: SEKI et al. (1993)
NOTA: Config.: Configuração
Os dados apresentados no quadro foram posteriormente confirmados por
análises cristalográfica por Laus e Wurst (2003) e Muhammad e colaboradores
(2001).
Da análise do quadro pode ser depreendido que para todas as estruturas a
diferença entre uma substância e outra é alteração espacial do esqueleto oxindólico
do tipo heterohiohimbina, o que torna distinguível os isômeros apenas com a
associação de diferentes técnicas analíticas, principalmente com a utilização de
ressonância magnética nuclear (RMN) e perfis de fragmentação por espectrometria
de massas (EM).
Na Uncaria tomentosa, os pares epiméricos em C(7), que ocorrem
naturalmente são: especiofilina (14) / uncarina F (15), mitrafilina (16) / isomitrafilina
(17), pteropodina (18) / isopteropodina (19) e rincofilina (20) / isorincofilina (21).
34
NH
N
O
O
O
Me
H
H
H
H
O
isopteropodina (19)
NH
N
O
O
O
Me
H
H
H
H
O
pteropodina (18)
especiofilina (14)
N
O
O
O
H
H
H
H
N
H
O
Me
N
O
O
O Me
H
H
H
H
NH
O
uncarina F (15)
NH
N
O
O
O
Me
H
H
H
H
O
isomitrafilina (17)
NH
N
H
O
O
O
O
Me
H
H
H
mitrafilina (16)
isorincofilina (21)
rincofilina (20)
NH
N
O
O
Me
H
H
H
O
O
Et
NH
N
H
O
O
O
O
Me
H
H
Et
Esses alcalóides, como já citado, são associados a algumas das ações
farmacológicas da Uncaria tomentosa e tradicionalmente analisados com o emprego
de CLAE em fase reversa e fase móvel composta de tampão fosfato (JOLLIFFE;
SHELLARD, 1973; PHILLIPSON; SUPAVITA; ANDERSON, 1982; STUPPNER;
STURM; KONWALINKA, 1992; LAUS; KEPLINGER, 1994; TIRILLINI, 1996; LAUS;
BROSSNER; KEPLINGER, 1997; GANZERA et al., 2001; PEREIRA et al., 2008).
O emprego de CLAE em fase reversa para análise desses alcalóides pode
ser explicado pela capacidade das estruturas apresentadas realizarem interações
hidrofóbicas e do tipo dipolo-dipolo com os grupamentos C-18 das colunas. Além
disso, possuem excelentes grupos cromóforos como anel aromático do grupamento
indólico e duplas ligações conjugadas que facilitam a detecção em ultravioleta no
comprimento de onda próximo aos 245 nm.
35
3.3 DISPERSÃO DE MATRIZ EM FASE SÓLIDA
A preparo de amostras tem sido o grande limitador de procedimentos
analíticos, principalmente aqueles voltados à análise de traços de componentes,
concentrações na ordem de partes por milhão (ppm) (GARCIA-LOPEZ; CANOSA;
RODRIGUEZ, 2008).
Ainda segundo o mesmo autor, o sucesso de um determinado método de
análise, para compostos orgânicos presentes em matrizes complexas, depende de
um adequado balaço entre o rendimento e a seletividade do processo de extração.
Todavia métodos clássicos para determinação de traços de compostos são
geralmente constituídos de várias etapas, tipicamente baseados em extração
exaustiva da matriz e subseqüente remoção do material co-extraído por sucessivas
etapas de limpeza (KRISTENSON; RAMOS; BRINKMAN, 2006).
Cabe enfatizar que tais métodos empregam grande quantidade de amostra,
sorbentes e solventes orgânicos de alta qualidade, requerem muito manuseamento
da amostra, são caros em termos de tempo e consumo de material e a sua
velocidade no preparo de amostras é muito baixa, não sendo condizente com os
desafios das análises modernas nos laboratórios de controle de qualidade das
indústrias (KRISTENSON; RAMOS; BRINKMAN, 2006).
Desta forma, Dispersão de Matriz em Fase Sólida (MSPD) tem encontrado
grande aplicação como processo analítico para a preparação, extração e
fracionamento de amostras biológicas sólidas, semi-sólidas e altamente viscosas
(BARKER, 2007).
Segundo Garcia-Lopez; Canosa e Rodriguez (2008), MSPD possui
características únicas como uma técnica de preparação de amostra. O uso de
condições brandas na análise como temperatura ambiente e pressão atmosférica
com uma combinação adequada do sorbente dispersante e do solvente de eluição,
geralmente fornece recuperações adequadas e média seletividade.
Outras vantagens em relação às formas clássicas de preparo da amostra
seriam (BOGIALLI; DI
CORCIA, 2007):
1) Baixo custo por extração
2) Procedimento analítico é drasticamente simplificado e reduzido
3) A possibilidade de formação de emulsão é eliminada
4) Não necessidade de instrumentação
36
5) Moderado consumo de solventes orgânicos
Estes pontos levantados corroboram com os dados de que desde sua
introdução em 1989 por Steven A. Barker, MSPD foi citada até o momento como o
método de extração empregado em mais de 250 publicações (BARKER, 2007).
A técnica consiste em basicamente triturar uma amostra viscosa, sólida ou
semi-sólida com um suporte sólido, geralmente sílica derivatizada com uma fase
orgânica (C
18
) em sua superfície, em um graal de vidro. O suporte sólido serve como
abrasivo para romper a arquitetura celular da amostra, quebrando o material em
pequenos pedaços. A presença da fase orgânica ligada à sílica confere uma
propriedade especial ao sorbente, a de dissolver e dispersar de acordo com seus
coeficientes de distribuição. Após esta etapa a amostra já dispersa no suporte sólido
é introduzida em uma seringa de polipropileno contendo um filtro em sua
extremidade inferior para evitar perda de amostra. Finalmente a amostra é
compactada com o êmbolo de uma seringa e sobre a mesma, colocada outro filtro. A
coluna finalizada está pronta para eluição conforme o solvente, ou solventes,
selecionados (BARKER, 2000; BARKER, 2007; GARCIA-LOPEZ; CANOSA;
RODRIGUEZ, 2008).
FIGURA 7 – MÉTODO DE DISPERÇÃO DE MATRIZ EM FASE SÓLIDA
37
O equilíbrio de partição e adsorção, similares àqueles que ocorrem na
coluna cromatográfica, são responsáveis pela distribuição do analito entre a amostra
e o solvente de eluição (GARCIA-LOPEZ; CANOSA; RODRIGUEZ, 2008).
Atualmente diferentes tipos de suportes sólidos são utilizados no
desenvolvimento de métodos para MSPD, entre eles podem ser citados amino-propil
sílica, florisil, aluminas, sílica e terra diatomácea (BARKER, 2000; KRISTENSON;
RAMOS; BRINKMAN, 2006; BARKER, 2007; GARCIA-LOPEZ; CANOSA;
RODRIGUEZ, 2008). Entretanto, é preciso lembrar que para fases normais a
interação com os componentes da amostra é realizada apenas pela adsorção e
estas não são capazes de dissolver a matriz da amostra. Ligações de hidrogênio
entre amino grupos na estrutura dos analitos e os silanóis da sílica, contribuem para
a retenção de espécies alvo na MSPD (GARCIA-LOPEZ; CANOSA; RODRIGUEZ,
2008).
Como é um método extrativo muito versátil, rápido e de fácil execução,
possui um grande atrativo para aplicação no controle de qualidade de medicamentos
fitoterápicos, de maneira a se eliminar a matriz complexa que caracteriza esses
produtos e alcançar uma extração seletiva das moléculas de interesse.
3.4 PLANEJAMENTO FATORIAL DE EXPERIMENTOS
A análise cromatográfica usualmente envolve três etapas: preparo da
amostra, separação e quantificação dos componentes (FERREIRA et al., 2007).
Destas, as etapas de preparo da amostra e separação dos componentes
podem sofrer duas abordagens para estabelecimento das melhores condições de
análise. A primeira seria avaliar o efeito da alteração de uma variável por vez,
mantendo todas as demais constantes durante o experimento, modelo univariado
(GARRIDO-LOPEZ; TENA, 2005).
O modelo univariado apresenta como inconvenientes não permitir a predição
do que ocorreria se as outras variáveis também fossem alteradas, não fornece
informação sobre os valores ótimos para cada parâmetro, apresenta um conjunto de
dados desconectados, não faz um mapeamento do espaço experimental, exige
muitas análises e é pouco eficiente (PELLATI et al., 2005).
38
A segunda abordagem seria a utilização da ferramenta estatística
planejamento fatorial de experimentos, modelo multivariado. Esta metodologia
permite configurar os testes de maneira a estudar todas as variáveis ao mesmo
tempo. As principais vantagens deste tipo de experimento seriam a redução do
número de análises necessárias e uma completa exploração do domínio
experimental (GARRIDO-LOPEZ; TENA, 2005).
Basicamente a análise multivariada é realizada em dois momentos. Na etapa
de triagem modelos lineares indicam quais fatores, dentro de valores máximos e
mínimos estabelecidos pelo pesquisador, influenciam a análise e são importantes
investigar. Para uma triagem de n variáveis e avaliação de dois níveis para cada
uma delas (valores máximos e mínimos), são necessários 2 x 2 x ... x 2 = 2
n
.
Em seguida a etapa de otimização emprega modelos quadráticos para criar
um mapa válido do domínio experimental, ou seja, indicar o valor ótimo para cada
parâmetro apontado como estatisticamente significativo na etapa de triagem.
Idealmente os testes em cada uma das etapas devem ser randomicamente
executados para assegurar boa estimativa do erro experimental. (FERREIRA et al.,
2007).
A criação de um mapa válido do domínio experimental é obtida
eficientemente por gráficos de superfície de resposta, que permitem a sinalização do
valor ótimo para cada parâmetro avaliado. Para tratamento e desenho dos mapas os
resultados são processados por diferentes modelos quadráticos, entre eles os mais
comuns são design composto central, Box-Behnken e Doehlert.
Design composto central é um tipo de design composto completo de três
níveis nos quais os fatores são avaliados em níveis que formam um cubo, com pelo
menos um valor constituindo o ponto central (o), outros formando os vértices (-1 ou
+1) e os demais os pontos axiais ou estrela (α ou -α) (FERREIRA et al., 2007).
39
FIGURA 8 – DESIGN COMPOSTO CENTRAL PARA TRÊS FATORES AVALIADOS
FONTE: FERREIRA et al. (2007)
NOTA: Pontos negros – pontos axiais; pontos cinzas – pontos cúbicos; ponto branco – ponto central
O número total de ensaios neste modelo é dado por n = 2
k
+ 2k + m, em que
2
k
representa o número de pontos fatoriais, 2k o número de pontos axiais e m o
numero de replicatas centrais (NETO; SCARMINO; BRUNS, 2003).
Já Box-Behnken não é frequentemente utilizado para otimização de etapas
em análises cromatográficas, embora constitua uma alternativa para o design
composto central. Para este modelo são cruzadas as informações dos fatores
(variáveis) em níveis extremos com os valores em níveis médios dos demais fatores.
Finalmente o Doehlert constitui outra classe de planejamento fatorial na qual
é possível estudar fatores diversos com diferentes números de níveis para cada um.
É útil em situações onde alguns fatores merecem maior atenção do que outros
(FERREIRA et al., 2007).
3.5 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Para se garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis
e interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominada
validação (RIBANI et al., 2004).
Com a Resolução RE n
o
899 de 29 de maio de 2003 – Guia para validação
de métodos analíticos e bioanalíticos – a ANVISA passou a exigir para os produtos
farmacêuticos a serem registrados no Brasil, estudos de validação das suas
metodologias analíticas de controle de qualidade dos princípios ativos. As
metodologias precisam ser avaliadas segundo critérios previamente definidos nos
parâmetros de Seletividade, Linearidade, Intervalo, Precisão, Limite de detecção,
40
Limite de quantificação, Exatidão e Robustez de acordo com a finalidade da
metodologia avaliada, QUADRO 5.
CATEGORIA FINALIDADE DO TESTE
I Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos
farmacêuticos ou matérias-primas
II Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e
produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas
III Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo)
IV Testes de identificação
QUADRO 5 – CATEGORIAS DOS TESTES SUBMETIDOS À VALIDAÇÃO
FONTE: BRASIL (2003)
Assim para cada categoria são exigidos que se avaliem determinados
parâmetros de maneira a comprovar a capacidade do método em fornecer
resultados confiáveis, QUADRO 6.
CATEGORIA II
PARÂMETRO
CATEGORIA
I
QUANTITATIVO
ENSAIO
LIMITE
CATEGORIA
III
CATEGORIA
IV
Especificidade/
Seletividade
Sim Sim Sim * Sim
Linearidade Sim Sim Não * Não
Intervalo Sim Sim * * Não
Precisão -
Repetibilidade
Sim Sim Não Sim Não
Precisão -
Intermediária
** ** Não ** Não
Limite de
detecção
Não Não Sim * Não
Limite de
quantificação
Não Sim Não * Não
Exatidão Sim Sim * * Não
Robustez Sim Sim Sim Não Não
QUADRO 6 – ENSAIOS NECESSÁRIOS PARA VALIDAÇÃO SEGUNDO CATEGORIA
FONTE: BRASIL (2003)
NOTA: Destaque à categoria em que se enquadram as amostras avaliadas neste trabalho. * Pode ser
necessário, dependendo da natureza do teste específico; **Se houver comprovação da
reprodutibilidade não é necessária a comprovação da Precisão.
Basicamente os critérios adotados pela ANVISA seguem parâmetros
internacionais estabelecidos pela conferência internacional de harmonização (ICH) e
hoje seguidos pelos Estados Unidos da América, União Européia e Japão (ICH,
2005).
41
3.5.1 Seletividade / Especificidade
Por definição um método analítico é dito específico quando ele apenas
mensura o analito desejado sem nenhuma forma de interferência, o que é muito
raro. A União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC) considera que a
especificidade seria a seletividade em seu grau máximo. Entretanto, é muito comum
que métodos analíticos sofram interferências de uma diversidade de componentes
externos presentes nas diversas matrizes que compõem as amostras. Essas
interferências podem ser estimadas e, por isso, é utilizado o termo seletividade
(PERSON; VESSMAN, 1998).
A seletividade de um método instrumental refere-se à capacidade que ele
possui em determinar o analito de interesse com exatidão mesmo em presença dos
demais componentes da amostra conhecidos como matriz da amostra. A matriz,
reconhecidamente uma mistura complexa de componentes, pode incluir o placebo
da formulação, intermediários de síntese, excipientes, impurezas e produtos de
degradação (RIBANI et al., 2004; ICH, 2005; CHANDRAN; SINGH, 2007).
Esse parâmetro pode ser atestado de diferentes maneiras conforme o guia
de validação seguido.
Para métodos desenvolvidos em CLAE, a primeira forma de se avaliar a
seletividade é analisando a matriz isenta da substância de interesse e a matriz
adicionada com a substância padrão. Nesse caso não deve ser observada co-
eluição de substâncias no tempo de retenção do analito.
Quando a matriz isenta do analito não é possível de ser obtida, como no
caso da análise de drogas vegetais e seus extratos, o método da adição de padrão
pode ser utilizado. Esse método consiste em preparar uma curva analítica e outra
com a adição do padrão analítico à amostra e verificação do paralelismo entre as
curvas obtidas. Se forem paralelas, pode-se considerar que não existe interferência
da matriz na determinação do analito. Além disso, testes de pureza espectral através
do detector de arranjo de diodos (DAD) auxiliam a comprovar que os picos obtidos
em CLAE são puros e não apresentam substâncias co-eluindo (RIBANI et al., 2004).
A analise das amostras após terem sido submetidas a diversas condições de
estresse, como aquecimento entre 50 – 60
o
C, luminosidade intensa, ácidos (HCl
0,1M) ou bases (NaOH 0,1M) e oxidantes (H
2
O
2
3%) também podem ser utilizadas
42
de maneira a demonstrar que o método é capaz de seletivamente discriminar entre o
analito de interesse e sustâncias de degradação (SHABIR, 2003).
3.5.2 Linearidade e intervalo
A linearidade de um método analítico é definida como a capacidade do
método em fornecer resultados que são diretamente, ou por transformações
matemáticas bem definidas, proporcionais à concentração do analito na amostra ao
longo de uma faixa de interesse (CHANDRAN; SINGH, 2007). Segundo a ANVISA
para determinações quantitativas do analito em matérias-primas ou em formas
farmacêuticas o alcance da faixa deve abranger de 80 a 120% da concentração
teórica da amostra e deve ser avaliada com no mínimo cinco concentrações
diferentes (BRASIL, 2003).
Já intervalo é definido como a faixa de concentração da molécula alvo na
amostra, incluindo os extremos, para o qual o método gera resultados precisos,
exatos e lineares (USP, 2008).
A linearidade pode ser avaliada pela verificação do coeficiente angular e
pelo coeficiente de correlação (r) da reta obtida para as cinco concentrações do
analito. Um r maior que 0,99 é recomendado pela ANVISA e considerado como
evidência de ajuste ideal dos dados para a linha de regressão (RIBANI et al., 2004).
A homocedasticidade, ou variância constante dos resíduos, deve ser
analisada através do gráfico de resíduos de maneira a garantir que os erros obtidos
nas análises são aleatórios e não provenientes de tendências do método
(CHANDRAN; SINGH, 2007).
3.5.3 Precisão
O termo precisão deve ser compreendido como a dispersão de resultados
entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras
semelhantes ou padrões sob condições definidas (INMETRO, 2007).
Pode ser atestada em três níveis distintos: repetitividade ou repetibilidade,
precisão intermediária e reprodutibilidade.
43
Para a ANVISA a precisão pode ser avaliada pelo desvio padrão relativo
(DPR), também conhecido como coeficiente de variação (CV) através da equação 1.
Não são admitidos valores superiores a 5% (BRASIL, 2003).
DPR = DP / CMD x 100 (Equação 1)
CMD representa a concentração média calculada.
3.5.3.1 Repetitividade ou repetibilidade
Conhecida como precisão intra-corrida pode ser definida como a
concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo, efetuadas
sob as mesmas condições, mesmo local, mesmo analista e mesmo instrumento. A
ANVISA e ICH recomendam que a repetibilidade seja avaliada em um mínimo de
nove determinações cobrindo o intervalo do método ou em seis determinações com
uma concentração similar ao valor esperado (RIBANI et al., 2004).
3.5.3.2 Precisão intermediária
Também chamada de precisão inter-corridas, é a concordância entre os
resultados do mesmo laboratório, obtidos em dias diferentes, com analistas
diferentes e/ou equipamentos diferentes (BRASIL, 2003). É reconhecido como o
teste de maior valor para estabelecer a variabilidade dos resultados dentro de um
mesmo laboratório e pode ser avaliada conforme condições descritas para
repetibilidade (RIBANI et al., 2004).
3.5.3.3 Reprodutibilidade
Parâmetro a ser testado quando do interesse em tornar o método oficial
como, por exemplo, em farmacopéias. Avalia o grau de concordância entre os
resultados obtidos por diferentes laboratórios. Para este fim é utilizada a mesma
amostra em todos os laboratórios que visam à padronização. A IUPAC, recomenda
que os resultados de oito laboratórios sejam avaliados para se tirar conclusões
confiáveis sobre a reprodutibilidade do método (RIBANI et al., 2004).
44
3.5.4 Limite de Detecção e Limite de Quantificação
Limite de detecção (LD) é a menor concentração do analito presente na
amostra que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificado. Já limite
de quantificação (LQ) é a menor concentração do analito presente na amostra que
pode ser determinado com precisão e exatidão aceitáveis. Em ambos os casos o
resultado é usualmente expresso como a concentração do analito na amostra
(BRASIL, 2003; ICH, 2005).
Usualmente são utilizados três procedimentos distintos para atestar os
parâmetros acima descritos: método visual, método da relação sinal ruído e método
baseado em parâmetros da curva analítica.
O método visual consiste em adicionar concentrações conhecidas da
substância de interesse à matriz e verificar em qual concentração é possível a
distinção entre o sinal analítico e o ruído naturalmente gerado pelo equipamento
(RIBANI et al., 2004).
A relação sinal ruído somente pode ser utilizada em métodos que
apresentem o ruído da linha de base, a concentração do analito que gere uma
reposta do método três vezes superior ao ruído é considerada o LD. Já o LQ é
considerado a concentração do analito que gere resposta dez vezes superior ao
ruído do método (SHABIR, 2003).
Finalmente o método baseado em parâmetros da curva analítica utiliza as
relações descritas nas equações 2 e 3.
LD = 3,3 x DP / IC (Equação 2)
LQ = 10 x DP / IC (Equação 3)
O desvio padrão (DP) da resposta pode ser originário da estimativa do
desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear
da equação, já IC é o coeficiente angular da curva analítica (RIBANI et al., 2004).
Como por definição LQ representa a menor concentração do analito em que
o método responde com precisão e exatidão é necessário que, os limites calculados
por estes métodos citados sejam validados através da análise de amostras em
45
concentrações próximas ao valor encontrado e assim seja estabelecida a dispersão
e assertividade dos resultados no LQ (ERMER, 2001).
3.5.5 Exatidão
Exatidão de um método analítico expressa a proximidade da concordância
entre um valor tido como verdadeiro e o valor encontrado na análise. O ICH e a
ANVISA determinam que este parâmetro seja avaliado com um mínimo de nove
determinações, envolvendo um mínimo de três diferentes níveis de concentração
(BRASIL, 2003; ICH, 2005).
Este parâmetro é calculado pela porcentagem de recuperação de uma
quantidade conhecida do analito adicionado à amostra, conforme Equação 4, ou
como a diferença entre a média e o valor aceito como verdadeiro (USP, 2008).
% de recuperação = Concentração experimental média x 100 (Equação 4)
Concentração teórica
Entre os métodos utilizados para avaliação da exatidão são descritos
basicamente quatro procedimentos, a serem utilizados de acordo com a finalidade
da metodologia, características da amostra e disponibilidade dos padrões analíticos.
O primeiro deles seria determinação da exatidão pela utilização de um único
material de referência certificado, neste método o valor obtido na análise é
comparado com aquele tido como referência (CHANDRAN; SINGH, 2007).
O segundo procedimento é a comparação entre resultados obtidos
empregando-se o método em desenvolvimento e os resultados conseguidos através
de um método de referência, com incerteza e precisão conhecidas, e avaliação do
grau de proximidade entre os resultados obtidos pelos dois métodos (RIBANI et al.,
2004).
Os dois procedimentos anteriormente descritos não são aplicáveis se
materiais de referência certificados ou método de referência não existirem. Nesta
situação pode ser executado um ensaio de recuperação, no qual quantidades
conhecidas do analito são inseridas “spiked” na matriz cobrindo toda a faixa da
linearidade, seguida pela quantificação empregando-se o método extrativo e técnica
46
de medida propostos. O resultado então é expresso como porcentagem de
recuperação (CHANDRAN; SINGH, 2007).
A adição de padrão é o quarto método utilizado para determinação da
exatidão. Este procedimento é adotado quando não existe possibilidade de se
preparar um branco da matriz, como no caso da análise de drogas vegetais e suas
formas extrativas. Neste método, quantidades conhecidas da substância de
interesse são adicionadas em diferentes concentrações na amostra que já contenha
o analito em concentração desconhecida. A análise é realizada e são construídas
duas curvas analíticas, FIGURA 9. Uma curva do padrão e outra com o padrão
adicionado à amostra em que se relaciona as quantidades adicionadas do analito à
amostra versus as respostas obtidas. O ponto da reta de padrão mais amostra que
corta o eixo das ordenadas, corresponde à resposta da substância que está sendo
determinada sem qualquer adição do padrão e a extrapolação da reta no eixo das
abscissas a concentração da substância na amostra analisada. Este resultado pode
então ser utilizado para avaliar a recuperação do método (RIBANI et al., 2004).
100
1100
2100
3100
4100
5100
6100
0 5 10 15 20 25
FIGURA 9 – DETERMINAÇÃO DA EXATIDÃO PELA ADIÇÃO DE PADRÃO À AMOSTRA
Importante ressaltar que as normas nacionais e internacionais não
estabelecem parâmetros de aceitação para os valores de recuperação obtidos na
avaliação da exatidão (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002; BRASIL, 2003; ICH,
2005; INMETRO, 2007; USP, 2008). Já o autor Huber (2001) cita que a recuperação
esperada depende da matriz da amostra, do preparo de amostra e da concentração
Área do cromatograma
Concentração do analito
Padrão + amostra
Padrão
Área da amostra
47
do analito. O referido autor apresenta tabela estabelecendo critérios de aceitação
em função da concentração do analito na amostra, TABELA 1.
TABELA 1 – LIMITES DE ACEITAÇÃO PARA AVALIAÇÃO DA EXATIDÃO
CONCENTRAÇÃO
DO ANALITO (%)
FAIXA DO ANALITO UNIDADE
RECUPERAÇÃO
MÉDIA (%)
100 1 100% 98-102
≥10 10
-1
10% 98-102
≥1 10
-2
1% 97-103
≥0,1 10
-3
0,1% 95-105
0,01 10
-4
100 ppm 90-107
0,001 10
-5
10 ppm 80-110
0,0001 10
-6
1 ppm 80-110
0,00001 10
-7
100 ppb 80-110
0,000001 10
-8
10 ppb 60-115
0,0000001 10
-9
1 ppb 40-120
FONTE: HUBER (2001)
NOTA: ppb – partes por bilhão
Consequentemente, os limites para as amostras utilizadas no presente
trabalho seriam:
Cascas – 95 – 105%, concentração de mitrafilina entre 0,2 e 0,6%;
Tintura – 90 – 107%, concentração de mitrafilina entre 115 e 180 µg.mL
-1
(115 e 180 ppm);
Gel – 80 – 110%, concentração de alcalóides entre 28 e 45 µg.g
-1
(28 e 45
ppm).
3.5.6 Robustez
Este parâmetro avalia a capacidade do método analítico em resistir a
pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos, indica sua confiança
durante o uso normal. A robustez deve ser testada geralmente durante o
desenvolvimento do método e quando constatada a susceptibilidade do método à
variações nas condições analíticas, estas deverão ser controladas e precauções
incluídas no procedimento (BRASIL, 2003).
As mudanças deliberadas devem refletir as alterações que podem ocorrer
quando um método é transferido para outros laboratórios, analistas ou equipamentos
e o método é dito ser robusto quando não é afetado por estas pequenas
modificações (RIBANI et al., 2004).
48
TIPO DE MÉTODO CONDIÇÕES PASSÍVEIS DE SEREM ALTERADAS
Estabilidade das soluções analíticas
Preparo das amostras
Tempo de extração
Variação do pH da solução
Temperatura
Espectrofotometria
Diferentes fabricantes de solventes
Variação do pH da fase móvel
Variação na composição da fase móvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Cromatografia líquida
Fluxo da fase móvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Cromatografia gasosa
Velocidade do gás de arraste
QUADRO 7 – MODIFICAÇÕES POSSÍVEIS PARA AVALIAÇÃO DA ROBUSTEZ
FONTE: BRASIL (2003)
O Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
(INMETRO) é a única agência reguladora que determina como executar esse teste
através do teste de Youden. O teste de Youden permite avaliar a robustez do
método bem como ordenar a influência que cada variação em suas condições
analíticas causa nos resultados finais, indicando o tipo de influência de cada uma
das variações (RIBANI et al., 2004).
3.5.7 Estabilidade das soluções
Este item não é contemplado pela RE 899 da ANVISA e pelo ICH, no
entanto para gerar resultados confiáveis e reprodutíveis, as amostras , os padrões e
reagentes usados devem ser estáveis por um período razoável que depende da
necessidade, um dia, uma semana, um mês ou mais. Este parâmetro deve ser
avaliado durante as etapas iniciais dos estudos de validação para orientação das
demais etapas (RIBANI et al., 2004; CHANDRAN; SINGH, 2007).
As amostras e padrões devem ser testadas ao menos por um período 24
horas e a quantificação dos componentes deve ser realizada frente a padrões
recentemente preparados. Uma estabilidade aceitável é uma mudança de 2% na
resposta do padrão ou amostra. A fase móvel deve ter estabilidade aceitável,
avaliada pela obtenção de cromatogramas equivalentes e resultados dentro de 2%
de variação quando comparada a fase móvel velha em relação à fase móvel recém
preparada (SHABIR, 2003).
49
3.5.8 Conformidade do Sistema
Segundo Ribani e colaboradores (2004), antes de iniciar a validação ou
mesmo a análise de amostras, deve-se avaliar se o sistema utilizado é capaz de
fornecer dados de qualidade aceitável. Esta avaliação é chamada conformidade do
sistema (system suitability), que pode ser definida como um conjunto de testes para
garantir que o equipamento utilizado está apto a gerar resultados de precisão e
exatidão aceitáveis. Existem duas abordagens para comprovação da conformidade
do sistema.
A primeira abordagem contempla critérios selecionados do desempenho do
método determinados durante a validação. Segundo a USP (2008) os critérios
estabelecidos devem ser atingidos durante as análises de rotina de maneira a ser
garantida a confiabilidade dos resultados gerados, QUADRO 8.
PARÂMETRO CRITÉRIO
Fator de retenção (k)
O pico deve estar bem separado de outros picos e do
pico correspondente ao tempo de retenção de um
composto não retido, k > 2
Repetitividade DPR < 1% para n > 5
Resolução (Rs)
Rs > 2 entre o pico de interesse e o interferente
potencial mais próximo (impureza, produto de
degradação)
Fator de alargamento (TF)
TF ≤ 2
Número de pratos teóricos da coluna (N) N > 2000 para CLAE
QUADRO 8 – PARÂMETROS DE CONFORMIDADE DO SISTEMA PARA CLAE
FONTE: USP (2008)
A outra abordagem considera o sistema cromatográfico como um todo e
inclui, além do sistema cromatográfico, a calibração e manutenção dos
equipamentos e instrumentos utilizados em todo o procedimento analítico (RIBANI et
al., 2004).
50
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 DESENHO EXPERIMENTAL
A pesquisa seguiu cinco etapas principais: 1) isolamento e caracterização do
padrão analítico; 2) desenvolvimento do método em CLAE para cascas e tintura de
U. tomentosa; 3) otimização do preparo de amostra cascas; 4) desenvolvimento de
método CLAE para o gel e 5) desenvolvimento do preparo de amostra do gel.
FIGURA 10 – FLUXOGRAMA DAS ETAPAS SEGUIDAS NA PESQUISA
51
4.2 REAGENTES, SOLVENTES E SOLUÇÕES
Os reagentes utilizados foram todos grau analítico (PA): acetato de etila,
acetato de amônio, ácido clorídrico, ácido fórmico, ácido sulfúrico, éter metil tert-
butílico (MtBE), clorofórmio, etanol, éter etílico, fosfato de potássio monobásico,
fosfato de sódio dibásico, hexano, hidróxido de amônio, hidróxido de sódio, metanol
e peróxido de hidrogênio.
Quando utilizados como fase móvel nas análises cromatográficas os
solventes atenderam aos requisitos de grau CLAE: acetonitrila (MeCN), ácido
acético, água ultra pura, metanol e trietilamina.
Para análise de RMN foi utilizado clorofórmio deuterado 99,96% D, contendo
tetrametilsilano (TMS).
A poliamida utilizada na purificação das amostras para análise em CLAE foi
grau cromatográfico.
Os suportes testados no desenvolvimento da metodologia para o gel
possuíam as seguintes especificações:
Óxido de alumínio 90 neutro (OALN) para cromatografia, partículas de 0,05 a
0,2 mm (70 a 270 mesh).
Óxido de alumínio 90 básico (OALB) para cromatografia, partículas de 0,05
a 0,2 mm (70 a 270 mesh).
4.3 PADRÕES ANALÍTICOS
A Mitrafilina utilizada como padrão analítico de referência foi obtida através
de isolamento a partir do material vegetal.
Os padrões de Isomitrafilina, Pteropodina e Isopteropodina foram adquiridos
da empresa Chromadex.
Isomitrafilina, lote: 09417-101; pureza: 80,5%.
Pteropodina, lote: 21220-101; pureza: 99,9%.
Isopteropodina, lote: 21225-101; pureza: 98,6%.
52
4.4 EQUIPAMENTOS
•
Balança analítica Mettler Toledo
modelo AB204-S (0,1 mg).
•
Balança analítica AND
modelo HR-202 (0,01 mg).
•
Rota evaporador Fisatom
modelo 803.
•
Manta de aquecimento Fisatom
modelo 102.
•
Dessecador Arsec
modelo DCV 040.
•
Aparelho de ultrassom
Unique
modelo USC 5000A, 40 Khz.
•
Potenciômetro Tecnal
modelo TEC-3MP.
•
Centrífuga Eppendorf
modelo 5416.
•
Espectrofotômetro UV-VIS Shimadzu
modelo UV-1601.
•
Cromatógrafo líquido de alta eficiência Agilent
1100, degasser
(G1379A), bomba quaternária (G1311A), injetor automático (G1313A),
compartimento de coluna termostatizado (G1316), detector de
comprimento de onda variável UV-VIS (G1314A), detector de arranjo de
diodos (G1315B) (G1315B). O equipamento foi controlado pelo software
Chemistation (Rev. A. 06.0x).
•
Ultra-purificador de água Milli-Q
, modelo BOKN32002.C.
•
Espectrômetro de massas Applied Biosystems
/MSD SCIEX, modelo
API 3000 equipado com fonte de ionização do tipo “eletrospray”.
•
Espectrômetro de RMN Bruker
modelo AC 200, 4,7 Tesla (200 MHz),
equipado com sonda dual (
1
H e
13
C) de observação direta de 5 mm.
•
Sistema de Calorimetria Exploratória Diferencial Shimadzu
modelo DSC
60.
4.5 AMOSTRAS
Para todos os ensaios apresentados nesta dissertação foram utilizados pó
das cascas do caule de Uncaria tomentosa (Willdenow ex Roemer and Shultes) DC.,
família Rubiaceae. As amostras foram coletadas na região de Porto Walter, estado
do Acre (Brasil) e adquiridas da empresa Centroflora com concentração de 1,0% de
53
AOP. O material foi identificado pelo Instituto de Botânica de São Paulo onde está
depositada exsicata sob número SP373337 (ANEXO 1).
Para o ensaio de verificação da capacidade do método analítico em
distinguir entre AOP e AOT foi utilizado, além do material anterior, o pó das cascas
do caule de Uncaria tomentosa (Willdenow ex Roemer and Shultes) DC., família
Rubiaceae coletada no Peru e adquirida da empresa Peruvian Heritage. O material
foi identificado pelo Museu de Historia Natural da Universidade Nacional Maior de
San Marcos onde está depositada exsicata sob número 047-USM-2008 (ANEXO 2).
Foi utilizada tintura 10% em etanol 60% (v/v), produzida pelo Herbarium
Laboratório Botânico, com concentração alcaloídica de 700 µg.mL
-1
.
O gel utilizado foi produzido pelo Herbarium Laboratório Botânico com
concentração alcaloídica de 30 µg.g
-1
.
4.6 ISOLAMENTO DO PADRÃO ANALÍTICO DE ALCALÓIDE
OXINDÓLICO
As cascas reduzidas a pó foram extraídas conforme metodologia
previamente descrita por Phillipson (1973) e Herath (1979), com adaptações.
O pó (300 g) foi previamente umedecido com hidróxido de amônio 10% (300
mL) e posteriormente macerado em sonicação (30 min) com acetato de etila (1500
mL).
Após o tempo de sonicação, o acetato de etila foi filtrado, concentrado e
submetido à extração líquido-líquido com ácido sulfúrico 2%. O líquido extrator foi
tornado alcalino com hidróxido de amônio (pH 9 a 10) e extraído com clorofórmio.
O clorofórmio foi levado à secura originando 4,3669 g da fração alcaloídica
bruta (Ab).
A fração Ab foi re-suspendida em MtBE e levada a refluxo (10 min),
conforme Mazzei (2004). A solução foi resfriada à temperatura ambiente e
posteriormente em freezer (-18
o
C). O precipitado formado foi filtrado em papel de
filtro, lavado com MtBE frio e repetida a etapa de refluxo e posterior filtração.
Finalmente o material retido no filtro (1,0125 g) foi solubilizado em
clorofórmio (30 mL) e cristalizado com a adição lenta de hexano (10 mL) e etapas de
54
aquecimento e resfriamento. O alcalóide assim obtido foi seco em dessecador com
corrente de ar por 24 horas.
4.6.1 Identificação e confirmação da pureza do padrão isolado
A identificação da molécula isolada foi realizada por RMN, EM e perfil de
absorção em espectrofotômetro. Para RMN a molécula alvo (30 mg) foi dissolvida
em clorofórmio deuterado (2 mL) e realizadas as técnicas de
1
H,
13
C desacoplado e
“distortion enhancement by polarization transfer” (DEPT).
Para EM foi realizada a injeção por bomba seringa da amostra (5 mg)
dissolvida em etanol (10 mL), adicionada dos aditivos acetato de amônio 5 mM e
ácido fórmico 1% e testadas as condições de fragmentação positiva e negativa.
Primeiramente foi monitorado o íon molecular da amostra injeta e após confirmação
da massa foram monitorados os íons produto do íon molecular encontrado.
TABELA 2 – CONDIÇÕES UTILIZADAS NO ESPECTRÔMETRO DE MASSAS
PARÂMETROS MS1 – Q1 – 367,2 [M-H]
+
MS1 + Q1 – 369,3 [M+H]
+
MS2
Fonte de ions
electrospray electrospray electrospray
Temperatura da
interface (
o
C)
500 500 500
Gás nebulizador (Ar
sintético)
6 6 6
Cortina de gás (N
2
-
6.0)
6 6 6
Voltagem do spray
-3000 5500 5500
Potencial de
declustering
-50 50 50
Potencial de
focalização
-200 200 200
Gás de colisão
N.A. N.A. 4
Energia de colisão
N.A. N.A. 35
Produto
N.A. N.A. 369,4
O perfil espectral foi obtido com a amostra (2 mg) diluída no solvente etanol
(100 mL) para varredura de 190 a 330 nm.
55
A pureza da molécula foi avaliada por calorimetria diferencial exploratória
(DSC) e pureza espectral em CLAE equipado com DAD. Para DSC a amostra (2,70
mg) foi submetida à atmosfera de nitrogênio com fluxo de 100 mL/min e
programação de temperatura com início em 40
o
C e aumento de 20
o
C/min até 350
o
C.
A análise de pureza espectral em CLAE equipado com DAD foi realizada
com a amostra (5 mg) dissolvida em etanol (10 mL) e 10 µL injetados no
cromatógrafo conforme condições otimizadas. Todos os espectros dentro da área do
pico foram obtidos pelo software entre os comprimentos de onda de 200 e 400 nm.
4.7 DESENVOLVIMENTO DO TAMPÃO ORGÂNICO E OTIMIZAÇÃO
DOS MÉTODOS EM CLAE
4.7.1 Desenvolvimento do Tampão orgânico e Otimização do método em
CLAE para cascas e tintura
O método CLAE descrito por Ganzera e colaboradores (2001) foi otimizado
através de planejamento fatorial de experimentos realizado em pacote estatístico
Minitab 15 (Minitab Inc. 2006). A avaliação dos resultados quimiométricos obtidos foi
feita no mesmo programa.
Na etapa de triagem foi utilizado um delineamento fatorial 2
3
, com repetições
completamente randomizadas realizadas em duplicata, resultando em um total de
dezesseis experimentos. Os parâmetros analisados foram: natureza do tampão, pH
do tampão e temperatura de coluna.
Os parâmetros indicados como estatisticamente significativos pela análise
de variância (ANOVA), intervalo de confiança 95%, foram otimizados com aplicação
de design composto central. Os resultados obtidos foram utilizados na construção
dos gráficos de superfície de resposta.
O método definido segue abaixo.
•
Eluição: gradiente, TABELA 3
•
Fase aquosa: ácido acético 0,2% em água ajustada a pH 6,90 com
trietilamina (Tampão acetato)
56
•
Fase orgânica: MeCN
•
Coluna: Zorbax Eclipse XDB C-18 (150 x 4,6 mm; 3,5 µm), Agilent
•
Temperatura da coluna: 15
o
C
•
Volume de injeção: 10 µL
•
Detecção: 245 nm
TABELA 3 – GRADIENTE UTILIZADO NAS ANÁLISES POR CLAE DAS CASCAS E TINTURA
TEMPO (min) FASE AQUOSA (%) FASE ORGÂNICA (%) FLUXO (mL/min)
0 65 35 0,80
18 65 35 0,80
29 50 50 0,80
31 50 50 0,80
32 65 35 0,80
38 65 35 0,80
4.7.2 Verificação da capacidade de distinção entre AOT e AOP
Para verificar a capacidade do método em distinguir entre AOT e AOP, o
método cromatográfico definido foi transposto para cromatógrafo líquido de alta
eficiência acoplado a detector de espectrometria de massas.
Para este teste foram utilizadas amostras das cascas da planta adquirida no
Peru e no Brasil, preparadas conforme condições definidas após otimização do
método extrativo.
Em ambas as amostras foi realizada análise preliminar em MS1 pela
detecção de todos os íons presentes na amostra com relação m/z entre 150 e 400
Da. As amostras foram posteriormente submetidas à análise MS2 pelo
monitoramento dos íons produto originários de [M+H]
+
369,00 para AOP e [M+H]
+
385,00 para AOT. As condições do equipamento foram as mesmas do modo MS2 já
descrito (item 4.6.1).
4.7.3 Escolha do padrão externo para quantificação dos AO
Foram avaliados os padrões: mitrafilina, isomitrafilina, pteropodina e
isopteropodina.
57
Para cada padrão em separado foi construída uma curva analítica com
diluição em etanol nas concentrações 8,0; 20,0; 40,0; 83,0 e 210,0 µg.mL
-1
.
Primeiramente, amostras das cascas (três) foram analisadas e todos os AO
obtidos nos cromatogramas foram integrados e calculados considerando uma única
curva analítica, esse procedimento foi realizado de maneira que cada amostra
apresentasse quatro resultados, um para cada curva. Posteriormente foi obtido o
valor considerado verdadeiro para cada amostra, calculando cada alcalóide das
amostras frente à curva analítica obtida de seu respectivo padrão analítico. Como
não existiam padrões de especiofilina e uncarina F, esses alcalóides foram
calculados com referência nas curvas de isopteropodina e mitrafilina
respectivamente.
As médias dos resultados obtidos para cada curva em separado e para cada
alcalóide com sua curva (valor verdadeiro) foram comparadas por ANOVA com
execução do teste de Tukey, limite confiança de 95%.
4.7.4 Estabilidade das soluções padrão
As soluções utilizadas para construção da curva analítica da mitrafilina, nas
concentrações apresentadas no item anterior, foram armazenadas em freezer a -20
o
C. Cada uma das soluções foi analisada em triplicata nos tempos 0, 15, 30, 60, 90 e
120 dias.
As curvas obtidas nos tempos 15, 30, 60, 90 e 120 dias foram comparadas à
curva obtida no tempo zero através da execução do teste t para amostras pareadas.
4.7.5 Otimização do método CLAE para análise do gel
O método CLAE foi definido após adequação do solvente orgânico e
composição do gradiente, TABELA 4. Foi escolhida a mistura MeCN : metanol (2:1)
em gradiente com o tampão orgânico desenvolvido. As demais condições
cromatográficas foram as mesmas do método para casca e tintura (item 4.7.1).
58
TABELA 4 – GRADIENTE UTILIZADO NAS ANÁLISES POR CLAE DO GEL
TEMPO (min) FASE AQUOSA (%) FASE ORGÂNICA (%) FLUXO (mL/min)
0 90 10 0,80
2 90 10 0,80
3 70 30 0,80
12 60 40 0,80
35 50 50 0,80
42 40 60 0,80
44 30 70 0,80
47 30 70 0,80
49 90 10 0,80
55 90 10 0,80
4.7.6 Avaliação da conformidade do sistema
A conformidade dos sistemas CLAE desenvolvidos foi avaliada por cinco
injeções da mesma amostra casca e gel nos seus respectivos métodos
cromatográficos. A avaliação foi realizada pela obtenção de resolução maior que 2,0
entre o par problema pteropodina – isomitrafilina em ambos os métodos. Além disso,
desvio padrão relativo inferior a 1% para as áreas de cada um dos alcalóides e
simetria de pico inferior a dois foram considerados para confirmação de
conformidade do sistema (USP, 2008).
4.8 DESENVOLVIMENTO E OTIMIZAÇÃO DOS MÉTODOS DE
PREPARO DAS AMOSTRAS CASCAS, TINTURA E GEL
4.8.1 Otimização do preparo da amostra cascas de U. tomentosa
A otimização da extração das cascas de U. tomentosa foi realizada a partir
do método proposto por Ganzera e colaboradores (2001).
Para o desenvolvimento diferentes parâmetros considerados críticos na
etapa: tempo de extração, tipo de solvente extrator, tamanho da partícula da
amostra, temperatura do banho de extração e massa da amostra submetida à
extração, foram avaliados através do pacote estatístico Minitab 15 (Minitab Inc.
2006).
59
Os parâmetros descritos foram avaliados em etapa de triagem através da
execução de delineamento fatorial 2
5
, com repetições completamente randomizadas
realizadas em duplicata, resultando em um total de 64 experimentos.
Os parâmetros críticos indicados por ANOVA, intervalo de confiança 95%,
foram otimizados pela aplicação de design composto central. Abaixo segue o
método otimizado.
Amostra (200 mg) em balão volumétrico de 10 mL, diluição com solvente
etanol 60% (v/v). Extração em banho de ultrassom (20 min) a 30
o
C. Após a extração
o sobrenadante (2 mL) foi passado por coluna contendo poliamida (200 mg) e o
eluato analisado em CLAE.
4.8.2 Otimização do preparo da amostra tintura de U. tomentosa
O preparo de amostra foi definido pela transferência da tintura (2 mL) para
balão volumétrico de 5 mL e adição de etanol 60% (v/v) ao volume. A diluição (2 mL)
transferida para coluna com poliamida (200 mg) e o eluato levado ao cromatógrafo.
4.8.3 Otimização do preparo da amostra gel
Para otimização do método foram testados diferentes sorbentes, proporções
entre o sorbente e amostra, recipientes para mistura da amostra com sorbente,
solventes de limpeza e remoção dos alcalóides. O método foi definido conforme
FIGURA 11.
60
FIGURA 11 – FLUXOGRAMA DO PREPARO DA AMOSTRA GEL
4.9 VALIDAÇÃO DOS METODOS ANALÍTICOS
Conforme descrito no item 3.5, os métodos analíticos do presente trabalho
podem ser classificados na categoria 1 da RE 899 da ANVISA (2003). Além dos
parâmetros exigidos os limites de detecção e quantificação foram avaliados como
complementação.
4.9.1 Seletividade / especificidade
4.9.1.1 Método da adição de padrão
Este procedimento foi utilizado para as cascas e tintura. O preparo das
amostras e padrão está descrito na exatidão do método. Foi verificado o paralelismo
entre as curvas obtidas com padrão e amostra + padrão, através da comparação dos
respectivos coeficientes angulares.
61
4.9.1.2 Comparação dos perfis espectrais
Os picos referentes aos AO tiveram seus perfis espectrais (200 a 400 nm)
comparados aos perfis dos padrões de mitrafilina, isomitrafilina, pteropodina e
isopteropodina, através de DAD.
4.9.1.3 Avaliação da pureza de pico
Os picos dos alcalóides foram submetidos à análise de pureza espectral em
DAD. As purezas dos espectros analisados ao longo de todo o pico foram
comparadas às obtidas com os padrões de mitrafilina, isomitrafilina, pteropodina e
isopteropodina. Além disso, foram testadas amostras submetidas à degradação
(SHABIR, 2003):
Ácida – amostras foram adicionadas de quantidades de HCl para perfazer a
concentração de 0,1 M na solução final de leitura;
Alcalina – amostras foram adicionadas de quantidades de NaOH 1,0 M para
perfazer a concentração de 0,1 M na solução final de leitura;
Peróxido – foi utilizado peróxido de hidrogênio 3% (2 mL) no preparo das
amostras.
4.9.1.4 Monitoramento dos íons produtos originários de [M+H]
+
= 369 e
385 Da
Realizado apenas para as cascas da planta. As condições foram as mesmas
das descritas na TABELA 2 (item 4.6.1), a amostra teve monitorados os íons produto
de [M+H]
+
= 369,00 e 385,00 Da.
4.9.1.5 Análise do placebo
Teste realizado apenas para o gel. A formulação contendo todos os
componentes da amostra à exceção da tintura de U. tomentosa (placebo), foi
submetida à análise conforme procedimento descrito (item 4.8.3) e submetido à
análise cromatográfica (item 4.7.5).
62
4.9.2 Linearidade e intervalo
Para determinação da linearidade com o padrão analítico foram avaliadas
três curvas analíticas, cinco pontos cada em um total de 15 injeções, com
concentrações entre 8,0 e 210,0 µg.mL
-1
para os dois métodos cromatográficos
desenvolvidos.
A linearidade com amostra das cascas da planta foi testada com pesagens
de 100, 150, 200, 250 e 300 mg de amostra abrangendo a faixa de 50 a 150% do
teor da casca.
Volumes de amostra de 1,6; 1,8; 2,0; 2,2 e 2,4 mL foram tomados de
maneira a abranger a faixa de 80 a 120% do teor da tintura.
Para o gel foram utilizadas amostras preparadas com quantidades
proporcionais de tintura de maneira a perfazer as concentrações 80 a 120% do teor
médio especificado para o produto. Em todos os testes de linearidade com amostra
cada concentração foi analisada com uma triplicata. Todas as curvas foram plotadas
no programa Microsoft Excel
, através da correlação da concentração final de AO
presente no volume de injeção (µg.mL
-1
) versus a área somada dos alcalóides
(mAU.s
-1
). Pelo software foram obtidos os coeficientes angular e linear, além do
coeficiente de correlação, coeficiente de determinação e gráfico de resíduos.
O intervalo de aplicação foi avaliado pelas faixas testadas na linearidade,
exatidão e precisão para cada uma das metodologias.
4.9.3 Precisão
4.9.3.1 Repetitividade ou repetibilidade
Foi avaliada em cada um dos métodos pela análise de seis amostras
diferentes representando a concentração 100%, executadas por um mesmo analista,
com o mesmo equipamento em um curto período de tempo. Além disso, foram
utilizadas as triplicatas de cada concentração mínima e máxima do teste de
linearidade com amostra para confirmar a repetibilidade nos teores 50 e 150% para
cascas e 80 e 120% para tintura e gel. Os resultados foram avaliados em função do
DP e DPR.
63
4.9.3.2 Precisão intermediária
Atestada pela comparação dos resultados das seis amostras a 100%
ensaiadas na repetibilidade, com outras seis amostras analisadas por outro analista,
no mesmo equipamento e em dia diferente. Os resultados foram avaliados em
função do DP e DPR.
4.9.4 Limite de detecção
Os dados de inclinação e desvio obtidos com a curva analítica dos dois
métodos cromatográficos foram utilizados na Equação 2, item 3.5.4, para se obter o
valor de LD para análise em CLAE das cascas, tintura e gel. Posteriormente foram
realizadas diluições do padrão até alcançar o limite indicado, a análise em CLAE
desta concentração foi utilizada como confirmação do resultado.
4.9.5 Limite de quantificação
Os dados de inclinação e desvio obtidos com a curva analítica dos dois
métodos cromatográficos foram inseridos na Equação 3, item 3.5.4, de maneira a
ser gerado o LQ para cada um dos métodos. Posteriormente foram realizadas
diluições do padrão até alcançar o limite indicado, a análise em CLAE desta solução
foi utilizada como um indicativo da confiabilidade do resultado. A confirmação da
precisão e exatidão no limite encontrado foi realizada pela análise de seis replicatas
com tomadas de amostra que fornecessem concentrações próximas às calculadas
como LQ com o padrão.
cascas: 90 mg foram analisados conforme o procedimento do item 4.8.1;
tintura: 0,10 mL da tintura foi analisada conforme procedimento do item
4.8.2;
gel: 1,1 g de gel foram analisados conforme procedimento do item 4.8.3.
64
4.9.6 Exatidão
Para as amostras de casca e tintura foi utilizado o método de adição de
padrão à amostra, devido à impossibilidade de se obter branco da matriz da amostra
(SHABIR, 2003; RIBANI et al., 2004).
A curva analítica foi construída nas concentrações 8,0; 20,0; 40,0; 83,0 e
210,0 µg.mL
-1
, a equação da reta dessa curva foi utilizada para inserção do valor do
coeficiente linear obtido da curva da amostra adicionada de quantidades crescentes
de padrão, isso permitiu encontrar o valor real do analito na amostra.
As curvas de amostra adicionada de padrão foram construídas com 5 pontos
cada, pela contraposição da concentração final do analito adicionado (µg.mL
-1
)
versus área do pico (mAU x s).
Casca de U. tomentosa: à tomada de amostra inicial (200 mg) foram adicionados 1,
2, 3 e 4 mL de solução 210,0 µg.mL
-1
do padrão mitrafilina,
Tintura de U. tomentosa: à tomada de amostra inicial (2 mL) foram adicionados 0,5,
1, 2 e 3 mL de solução padrão mitrafilina com a mesma concentração anterior.
O valor verdadeiro do analito presente na amostra foi utilizado para calcular
a recuperação (Equação 4, item 3.5.5) de amostras preparadas conforme indicado
no teste de linearidade (item 4.9.2) nas concentrações 50, 100 e 150% para o pó e
80, 100 e 120% para a tintura.
O teste do gel foi executado com placebo (5 g) contaminado por quantidades
de mitrafilina de maneira a perfazer as concentrações 80, 100 e 120% de AO na
amostra. A avaliação da recuperação da mitrafilina foi utilizada para indicar a
exatidão do método.
4.9.7 Robustez
Para as cascas foram considerados os dados obtidos durante o
planejamento fatorial de experimentos realizado para otimização do método
cromatográfico e preparo de amostra. Foram avaliados ainda os parâmetros
estabilidade da amostra preparada após um e dois dias armazenada em freezer (-20
o
C), além de colunas diferentes, QUADRO 9.
65
COLUNA DIMENSÕES CARACTERÍSTICAS
END
CAPPING
FABRICANTE
Luna C-18 (2) 150 x 4,6 mm
100 Å de poro, 17,5% de
Carbono, 5 µm partícula
Sim Phenomenex
Hipersil 150 x 4,6 mm
120 Å de poro, 10% de
Carbono, 5 µm partícula
Sim Agilent
Zorbax Eclipse XDB 150 x 4,6 mm
80 Å de poro, 10% de
Carbono, 5 µm partícula
Duplo Agilent
Zorbax Eclipse XDB
(controle)
150 x 4;6 mm
80 Å de poro, 10% de
Carbono, 3,5 µm partícula
Duplo Agilent
QUADRO 9 – COLUNAS TESTADAS NA VALIDAÇÃO DA ROBUSTEZ DOS MÉTODOS
A Robustez da tintura considerou os resultados obtidos em planejamento
fatorial de experimentos para otimização do método CLAE e diferentes colunas
avaliadas para as cascas, por se tratar de matriz semelhante à obtida após o
preparo das cascas.
Estabilidade das amostras após um dia de preparo, 2,5 g de OALN na base
da coluna, dispersão do gel em OALN e eluição após um dia e as colunas
apresentadas no QUADRO 9 foram os parâmetros alterados na avaliação da
robustez do gel.
À exceção dos parâmetros avaliados por planejamento fatorial de
experimentos, os demais foram avaliados em triplicata e as médias dos resultados
para os teores de AO comparados às médias de uma triplicata controle, condições
normais da análise, através de ANOVA, execução do teste de Tukey com 95% de
limite de confiança.
4.10 CÁLCULO DO TEOR DE ALCALÓIDES NAS AMOSTRAS
Para todas as amostras utilizadas no presente trabalho, os picos referentes
aos AOP foram integrados e calculados frente à curva analítica de mitrafilina
expressa em µg.mL
-1
. Desta forma para gerar os teores finais de alcalóides para
cada uma das amostras (cascas, tintura e gel) nas unidades apresentadas (%,
µg.mL
-1
e µg.g
-1
) foi necessário considerar as diluições efetuadas, o peso realizado
para o preparo da amostra e fatores para a conversão de unidades conforme
apresentado a seguir.
66
4.10.1 Amostra cascas
Conforme apresentado no item 4.8.1, as cascas foram diluídas a 10 mL e
analisadas em CLAE, logo o resultado do cromatograma (µg.mL
-1
)
foi multiplicado
por 10 para encontrar a quantidade de alcalóides no volume final de amostra.
Posteriormente o resultado foi multiplicado por 100, dividido pelo peso da amostra
(mg) e finalmente dividido por 1000 para apresentar o resultado em %.
4.10.2 Amostra tintura
Conforme apresentado no item 4.8.2, a amostra tintura (2 mL) foi diluída a 5
mL e analisada em CLAE. Portanto, o resultado do cromatograma (µg.mL
-1
)
foi
multiplicado por 5 para encontrar a quantidade de alcalóides no volume final de
amostra e finalmente dividido pela quantidade de tintura utilizada na análise (2 mL)
para apresentar o resultado em µg.mL
-1
.
4.10.3 Amostra gel
Para o preparo da amostra o item 4.8.3 apresenta o uso de 5 g de gel e
após a extração a obtenção de 2 mL para análise em CLAE. Esse volume final é
acrescido de 0,2 mL provenientes de componentes hidrossolúveis do gel,
remanescentes do processo de limpeza do preparo da amostra, o que eleva o
volume final de análise para 2,2 mL.
Assim o resultado do cromatograma (µg.mL
-1
) foi multiplicado por 2,2 para
encontrar a quantidade de alcalóides no volume final de amostra e finalmente
dividido pela quantidade de gel utilizada na análise (g) para apresentar o resultado
em µg.g
-1
.
67
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A revisão de literatura permitiu demonstrar que os métodos para análise de
AO nas cascas de U. tomentosa são bastante difundidos na literatura científica, no
entanto, em sua quase totalidade são descritas fases móveis compostas por tampão
inorgânico o que exige limpeza da coluna e sistema cromatográfico após as
análises, o que não realizado adequadamente reduz muito o tempo de vida da
coluna. Além disso, a complexidade da matriz de análise do gel exige abordagem
mais elaborada para a extração seletiva e posterior quantificação dos analitos. Estes
desafios permitiram a realização do trabalho para desenvolvimento de métodos de
análise para casca, tintura e produto contendo tintura de Uncaria tomentosa.
Para evitar repetições desnecessárias em algumas tabelas foi utilizada a
seguinte numeração para designar os nomes dos alcalóides:
1 – especiofilina; 2 – uncarina F; 3 – mitrafilina; 4 – isomitrafilina; 5 –
pteropodina; 6 – isopteropodina; 7 – rincofilina; 8 – isorincofilina.
5.1 ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E CONFIRMAÇÃO DA PUREZA
DO PADRÃO ANALÍTICO
Os 300 g de planta utilizados no isolamento forneceram 4,3669 g de fração
Ab o que, se considerado o teor médio obtido na validação das cascas de 1,05% de
alcalóides oxindólicos totais (precisão intermediária, item 5.4.4.4), reflete em
rendimento de 138,63%. O valor pode ser atribuído ao grande residual de
clorofórmio, solvente muito denso, que não foi possível de ser totalmente eliminado
da fração.
A fração Ab após sucessivas cristalizações originou 0,6128 g de material
cristalino branco. Este material analisado em CLAE apresentou pureza
cromatográfica de 99,0% e tempo de retenção 15,789 min tempo atribuído à
mitrafilina, FIGURA 12.
68
FIGURA 12 – CROMATOGRAMA DO ALCALÓIDE ISOLADO
Se for considerado que o valor médio de mitrafilina encontrado no pó
durante a validação das cascas foi de 0,38% (exatidão, item 5.4.4.5), o isolamento
apresenta rendimento de 53,75%.
Posteriormente o alcalóide isolado foi identificado e teve sua pureza
atestada por RMN
1
H e
13
C, CLAE/DAD, EM e DSC.
5.1.1 RMN de
1
H e
13
C
Os dados obtidos nestes testes foram todos comparados aos previamente
apresentados pelos grupos de pesquisa representados por Seki (1993), Toure
(1992) e Carbonezi (2004). Todos os dados foram obtidos com zero em TMS.
Pela observação da estrutura da mitrafilina, FIGURA 13, pode ser
depreendida a complexidade das interações H-H no espectro de
1
H, o que levou
Seki e colaboradores (1993) com equipamento de 500 MHz e diferentes técnicas bi-
dimensionais a classificar alguns sinais obtidos apenas como m (multipletos), sem
tentar apresentar suas correlações.
0
5 10
15
20 25 30 35
mAU
0
100
200
300
400
500
600
DAD1 A, Sig=245 nm
15.789 - Mitrafilina
min
69
FIGURA 13 – ESTRUTURA DA MITRAFILINA
Em equipamento de 200 MHz foram observados sinais para os hidrogênios
próximos aos obtidos pelo referido autor, FIGURA 14, não sendo possível
comparação com os dados do trabalho de Toure e colaboradores (1992), pois os
autores utilizaram como solvente DMSO-d
6
. Na TABELA 5 são apresentados os
deslocamentos e constantes de acoplamento dos principais H que diferenciam a
mitrafilina de seu epímero em C-7, isomitrafilina. As discrepâncias observadas entre
as constantes de acoplamento e deslocamentos podem ser atribuídas à dificuldade
em se integrar corretamente os sinais observados em um equipamento de menor
resolução.
TABELA 5 – RESULTADOS OBTIDOS PARA RMN-
1
H DA MITRAFILINA ISOLADA
SEKI, et al. (1993)
MITRAFILINA
H
δ
CONSTANTE DE
ACOPLAMENTO
δ
CONSTANTE DE
ACOPLAMENTO
3 2,41
dd J
3-14β
= 11,1; J
3-14α
= 2,4
2,40
dd J
3-14β
= 11,4; J
3-14α
= 2,5
5 β
3,39 m 3,40 m
9 7,19
d J
9-10
= 7,8
7,20
d J
9-10
= 7,6
10 7,00
ddd J
10-9
= 7,8; J
10-11
= 7,8;
J
10-12
= 0,9
ddd J
10-9
= 8,0; J
10-11
= 8,0;
J
10-12
= 0,9
12 6,89
d J
12-11
= 7,6
6,90
d J
12-11
= 7,2
14 β
1,21
ddd J
14β-14α
= 11,1; J
14α-15
= 11,1;
J
14β-3
= 11,1
1,22
d J
= 11,1
17 7,43
d J
17-15
= 1,3
7,43 Sinal alargado
18 (Me) 1,11
d J
18-19
= 6,6
1,11
d J
18-19
= 6,6
19 4,37
qd J
19-18Me
= 6,6; J
19-20
= 3,2
4,37
J
19-18Me
= 6,6; J
19-20
= 2,9
21 α
1,85
dd J
21α-21β
= 10,5; J
21α-20
= 10,4
1,88
dd J
21α-21β
= 10,4; J
21α-20
= 10,3
21 β
3,22
dd J
21β-21α
= 10,5; J
21β-20
= 2,2
3,23
dd J
21β-21α
= 8,7; J
21β-20
= 1,0
23
(PEREIRA
et al.)
3,57 s 3,59 s
NH 8,40 Sinal alargado 8,54 Sinal alargado
NOTA: m: multipleto
70
FIGURA 14 – ESPECTRO DE RMN -
1
H (200 MHz) EM CDCl
3
DA MITRAFILINA ISOLADA
Os dados obtidos para RMN-
13
C, TABELA 6, confirmam de maneira
inequívoca a identidade da molécula, todos os deslocamentos são condizentes com
aqueles apresentados pelos três autores já citados.
TABELA 6 – DADOS OBTIDOS PARA RMN-
13
C DA MITRAFILINA ISOLADA
C
SEKI, et al. (1993) TOURE, et al. (1992) CARBONEZI, et al.. (2004)
MITRAFILINA
2 181,33 179,44 180,90 181,39
3 74,58 73,62 74,60 74,60
5 54,28 52,79 54,30 54,31
6 35,16 34,35 35,10 35,18
7 55,56 54,85 55,50 55,60
8 133,35 133,65 133,30 133,35
9 122,89 122,85 123,00 122,93
10 122,54 121,40 122,60 122,59
11 128,00 127,50 128,00 128,05
12 109,74 108,69 109,50 109,80
13 140,87 141,80 140,60 140,91
14 28,37 28,01 28,30 28,39
15 30,44 29,73 30,40 30,47
16 106,92 106,74 106,90 106,93
17 154,05 153,29 154,00 154,10
18 14,84 14,53 14,80 14,88
19 73,81 73,22 73,80 73,85
20 40,48 40,23 40,50 40,50
21 54,33 53,31 54,20 54,36
22 167,10 165,94 167,10 167,14
23 50,71 50,30 50,70 50,77
CDCl
3
71
As pequenas divergências entre os valores encontrados por Toure e
colaboradores (1992) daqueles obtidos no presente trabalho podem ser atribuídas
ao já citado emprego de DMSO-d
6
pelo referido autor.
FIGURA 15 – ESPECTRO DE RMN –
13
C (200 MHz) EM CDCl
3
DA MITRAFILINA ISOLADA
O espectro obtido em DEPT, FIGURA 16, confirma a atribuição de cada
carbono, uma vez que não são observados no espectro os carbonos quaternários 2,
7, 8, 13, 16 e 22. Além disso, são encontrados na fase inferior do espectro os
carbonos CH
2
5, 6, 14 e 21, todos os sinais estão com seus deslocamentos em
regiões muito semelhantes às já apresentadas no espectro de RMN de
13
C, FIGURA
15.
72
FIGURA 16 – ESPECTRO DEPT (200 MHz) EM CDCl
3
DA MITRAFILINA ISOLADA
5.1.2 Espectrometria de massas
A fórmula molecular da mitrafilina C
21
H
24
N
2
O
4
apresenta massa de 368,4263
Da, conforme apresentado por diversos autores (PHILLIPSON; HEMINGWAY,
1975b; WAGNER; KREUTZKAMP; JURCIC, 1985; LOPEZ-AVILA; BENEDICTO,
1997; CARBONEZI et al., 2004). A análise em MS1 modo positivo [M+H]
+
com
aditivo acetato 5 mM apresentou melhores resultados em relação ao modo negativo
e aditivo ácido fórmico.
73
FIGURA 17 – ESPECTRO DE MASSAS DA MITRAFILINA ISOLADA - [M+H]
+
A elevada abundância do sinal m/z 369,3 Da em relação aos demais sinais
indica a pureza do material isolado e confirma a massa do alcalóide investigado.
A análise em MS2 apresentou íons produto característicos de AOP e serão
discutidos posteriormente (item 5.2.2).
5.1.3 Perfil espectral em UV
A Varredura realizada entre 190 e 330 nm apresentou máximos de absorção
em 213,2; 242,6 e 282,8 nm com valores de absorvância 1,265; 0,903 e 0,080
respectivamente. Os resultados estão em acordo com aqueles relatados por Herath
e colaboradores (1979) utilizando o mesmo solvente e por Wagner; Kreutzkamp e
Jurcic (1985) utilizando metanol como solvente, FIGURA 18.
74
FIGURA 18 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DA MITRAFILINA NO ULTRAVIOLETA (190 – 330nm)
5.1.4 Análise da Pureza em CLAE-DAD
A análise da substância em CLAE-DAD apresentou o perfil da FIGURA 19.
O pico (15,789 min) referente à substância em análise apresentou área que
corresponde a 99,4% da área total do cromatograma e pureza de pico indicado pelo
software de 99,25%. Além deste pico o cromatograma apresentou outro sinal em
23,838 min (0,6% da área total), identificado como pteropodina após injeção de
padrão autêntico dessa molécula e comparação dos tempos de retenção.
FIGURA 19 – ESPECTRO EM 3D DA MITRAFILINA ISOLADA OBTIDO EM CLAE-DAD
A presença do alcalóide pteropodina não foi possível de ser eliminada
mesmo após as sucessivas etapas de cristalização. A similaridade da conformação
dos anéis C,D e E da classe allo e normal associada à mesma conformação em C-7
75
(R) para mitrafilina e pteropodina, podem explicar o comportamento relativamente
semelhante nos solventes utilizados para o isolamento.
É importante destacar que a pequena quantidade observada de pteropodina
não inviabiliza o uso como padrão analítico da mitrafilina isolada, pois a pureza da
última é bastante elevada e a possível interconversão entre esses alcalóides em
solução foi acompanhada pela avaliação da estabilidade da solução analítica
executada no item 5.2.4.
5.1.5 Confirmação da pureza por DSC
A DSC pode ser um método simples e rápido para estimar a pureza de
materiais (FAROONGSARNG; KADEJINDA; SUNTHORNPIT, 2000). A técnica
fornece informações sobre as propriedades físicas e energéticas da substância em
análise como ponto de fusão, pureza e polimorfismo (CLAS; DALTON; HANCOCK,
1999).
O gráfico obtido da análise indica evento endotérmico, referente à fusão,
ocorrido em 276,47
o
C. O resultado é semelhante aos valores 275 e 272
o
C
publicados respectivamente por Herath et al. (1979) e Carbonezi et al. (2004), porém
diverso de 265
o
C publicado por Shellard, Tantivatana e Becket (1967) e 264 - 268
o
C por Wagner; Kreutzkamp e Jurcic (1985). Os menores valores apresentados por
último podem indicar que as amostras continham impurezas, pois a presença destas
conduz o processo de fusão a menores temperaturas.
Além do citado, a alta pureza indicada pelo gráfico (98,25%) e o sinal
bastante fino do evento de fusão, FIGURA 20, auxiliam na comprovação da pequena
presença de impurezas na amostra, uma vez que conteúdos elevados destas
causam alargamento do sinal do pico. A pureza apresentada é coerente com 99,4%
obtido pela análise cromatográfica, uma vez que a DSC detectada a presença de
interferentes como água, solventes residuais, metais e outras impurezas com pontos
de fusão diferentes à substância em análise, enquanto por CLAE as mesmas não
são consideradas.
76
FIGURA 20 – ANÁLISE DE DSC DA MITRAFILINA ISOLADA
5.2 DESENVOLVIMENTO DO TAMPÃO ORGÂNICO E OTIMIZAÇÃO
DOS MÉTODOS EM CLAE
A semelhança da matriz da tintura em relação à da casca após preparada e
pronta para inserção no sistema cromatográfico, permitiu o desenvolvimento de um
mesmo método CLAE para ambas. Isso foi possível, pois a tintura foi obtida após
extração da planta com etanol 60% (v/v), mesmo solvente utilizado no método do
preparo da amostra cascas (item 5.3.1).
A complexidade que caracteriza a matriz do gel impossibilitou a utilização do
mesmo método cromatográfico empregado nas amostras já citadas e, assim, exigiu
a elaboração de outro procedimento para CLAE (item 5.2.6).
5.2.1 Desenvolvimento do Tampão orgânico e Otimização do método em
CLAE para pó e tintura
Inicialmente as condições de gradiente e fluxo propostas por Ganzera e
colaboradores (2001), TABELA 7, foram otimizadas para as colunas disponíveis no
laboratório, Luna C-18 (150 x 4,6 mm; 5 µm tamanho de partícula, 100 Å de poro e
77
17,5% de Carbono) Marca Phenomenex e Zorbax XDB C-18 (150 x 4,6mm; 3,5 µm
tamanho de partícula, 80 Å de poro e 10% de Carbono) Marca Agilent.
TABELA 7 – CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS PROPOSTAS POR GANZERA, (2004)
TEMPO
(min)
TAMPÃO FOSFATO 10 mM
pH 7,0 (%)
ACETONITRILA (%)
ÁCIDO ACÉTICO 1% EM
METANOL (%)
0 65 35 0
17 65 35 0
25 50 50 0
30 50 50 0
31 0 0 100
36 0 0 100
37 65 35 0
47 65 35 0
NOTA: Coluna utilizada pelo autor: Luna C-18 (100 x 4,6 mm, 3 µm tamanho de partícula) Marca
Phenomenex. Temperatura da coluna: ambiente. Fluxo: 0,75 mL/min. Injeção: 10 µL. Detecção: 245
nm.
As condições otimizadas (item 4.7.1) apresentaram melhor resolução entre
os picos dos alcalóides com a coluna Zorbax fato explicado pelos menores
diâmetros de partícula e poro desta em relação à Luna.
A necessidade de aumentar o tempo de vida da coluna e reduzir o tempo de
análise conduziu ao desenvolvimento de tampão orgânico, acetato, em substituição
ao tampão inorgânico, fosfato. Esse fator associado às condições consideradas
críticas para a análise por Stuppner; Sturm e Konwalinka (1992) foram avaliadas em
planejamento fatorial de experimentos, TABELA 8.
TABELA 8 – ETAPA DE TRIAGEM – PLANEJAMENTO FATORIAL PARA CLAE DAS CASCAS E
TINTURA
FATOR MÍNIMO MÁXIMO
Natureza Tampão (A) Acetato Fosfato
pH do tampão (B) 6 7
Temperatura da coluna (C) 15
o
C 35
o
C
Os resultados foram avaliados em função da resolução entre os pares de
picos críticos: uncarina F – mitrafilina e isomitrafilina – pteropodina.
O gráfico dos efeitos padronizados, FIGURA 21, demonstra a avaliação dos
resultados para os picos uncarina F – mitrafilina e apresenta como fatores mais
significativos o pH e temperatura da coluna. No gráfico os pontos afastados da reta
descrita pelos valores pertencentes a uma mesma população, são considerados
significativamente diferentes dos demais. Os resultados para o segundo par de picos
críticos avaliados seguiu a mesma tendência do anterior.
78
FIGURA 21 – EFEITOS PADRONIZADOS – PAR UNCARINA F - MITRAFILINA
LEGENDA: A: Natureza do tampão, B: pH, C: Temperatura da coluna. Vermelho – Significativo, Preto
– Não significativo
Já o gráfico dos efeitos principais, FIGURA 22, caracteriza pela inclinação da
linha a magnitude do efeito e pela direção da linha especifica se o efeito exerce
influência positiva ou negativa na resolução dos pares de picos avaliados
(GFRERER; LANKMAYR, 2005).
É possível evidenciar melhores valores de resolução em valores mais
elevados de pH dos tampões e menores temperaturas da coluna para o par uncarina
F - mitrafilina. Os resultados para o par isomitrafilina – pteropodina seguiram o
mesmo padrão de resposta do par citado.
O comportamento frente ao pH do tampão pode ser explicado pelo pKa
desses alcalóides. O valor de 5,7 a 6,7 citado por Laus (1996) para o pKa dos AO,
indica que valores de pH do tampão acima de 6,7 mantêm o nitrogênio heterocíclico
das moléculas em sua forma alcalina, diminuindo a afinidade pelos resíduos de
silanóis da coluna. Isso conduz a um favorecimento nas interações do tipo
hidrofóbicas e dipolo-dipolo entre os alcalóides e as cadeias C-18 da sílica,
aumentando a eficiência da separação.
Já para o parâmetro temperatura da coluna, segundo Jardim, Collins e
Guimarães (2006), não é possível estabelecer uma regra a respeito da influência da
temperatura em separações por CLAE. O aumento da temperatura freqüentemente
aumenta o desempenho da coluna por diminuir a viscosidade da fase móvel, o que
melhora a transferência de massas entre essa fase e a fase estacionária, resultando
em um melhor processo de separação. Entretanto, segundo Skoog e colaboradores
79
(2009), seu aumento também pode levar à redução dos estados de equilíbrio entre o
analito e a fase estacionária, ocorrendo aumento do coeficiente de difusão das
moléculas de interesse na fase móvel o que aumenta a altura equivalente dos pratos
teóricos da coluna reduzindo assim a eficiência da separação, como no método
avaliado.
O tampão acetato desenvolvido além de sua capacidade tamponante,
realiza, pela presença da trietilamina, competição pelos resíduos de silanóis da
coluna, evitando interações secundárias destes com porções mais polares dos
alcalóides, aumentando assim a eficiência cromatográfica.
Como a natureza do tampão utilizado não resultou em melhoras para a
resolução dos pares de picos estudados, o tampão acetato foi escolhido para a
análise em substituição ao tampão inorgânico. A substituição por tampão acetato
permitiu a eliminação da etapa final de limpeza da coluna com 1% de ácido acético
em metanol, reduzindo o tempo total de análise.
FIGURA 22 – EFEITOS PRINCIPAIS – PAR UNCARINA F – MITRAFILINA
Conforme discutido, os parâmetros pH do tampão e temperatura da coluna
foram otimizados em design composto central através de design fatorial (2
2
)
com
quatro pontos axiais e cinco replicatas no centro do delineamento, TABELA 9.
80
TABELA 9 – ETAPA DE OTIMIZAÇÃO – PLANEJAMENTO FATORIAL CLAE DAS CASCAS E
TINTURA
DOMÍNIO EXPERIMENTAL
FATOR
-α
a
-1 0 1
α
a
pH do Tampão 6.5 6.8 7.5 8.2 8.5
Temperatura da coluna (
o
C) 10 12.2 17.5 22.8 25
Os gráficos de superfície de resposta obtidos permitem visualizar as
melhores resoluções para os picos estudados nas zonas de tonalidades verdes mais
escuras, FIGURA 23. Segundo Ciola (1998), para análises quantitativas é
necessário um mínimo de resolução do pico de 1,5 e para a USP XXXI (2008) maior
que 2,0, assim para se atender ao último critério, mais restritivo, foram selecionados
valores de pH 6,9 e temperatura da coluna 15
o
C com base no par de picos mais
crítico isomitrafilina – pteropodina.
FIGURA 23 – SUPERFÍCIE DE RESPOSTA DAS CONDIÇÕES CLAE PARA CASCAS E TINTURA
Os resultados alcançados são semelhantes aos previamente apresentados
por Stuppner e colaboradores (1992) obtidos em experimento univariado, no entanto
a eficiência cromatográfica do trabalho citado está bem aquém daquelas
apresentadas nas FIGURAS 24 e 25.
81
A escolha do pH 6,9 em detrimento dos demais valores é explicada pelo fato
de em pH maior que 7,0 a rincofilina co-eluir com isomitraflina, já menores valores de
pH não foram escolhidos para se garantir boa resolução entre os picos.
FIGURA 24 – PERFIL CROMATOGRÁFICO DAS CONDIÇÕES OTIMIZADAS PARA CASCAS E
TINTURA – PLANTA BRASILEIRA
NOTA: especiofilina (10,02 min), uncarina F (14,33 min), mitrafilina (15,52 min), isomitrafilina (23,05
min), pteropodina (24,15 min) e isopteropodina (31,59 min).
FIGURA 25 – PERFIL CROMATOGRÁFICO DAS CONDIÇÕES OTIMIZADAS PARA CASCAS E
TINTURA – PLANTA PERUANA
NOTA: especiofilina (10,19 min), uncarina F (14,15 min), mitrafilina (15,54 min), rincofilina (19,67 min),
isomitrafilina (22,77 min), pteropodina (23,93 min), isorincofilina (25, 82 min) e isopteropodina (31,37
min).
A identificação dos picos obtidos nos cromatogramas acima foi estabelecida
por similaridade dos tempos de retenção e perfis espectrais em relação a padrões
analíticos autênticos de mitrafilina, isomitrafilina, pteropodina e isopteropodina. Os
demais alcalóides foram identificados por comparação com trabalhos previamente
publicados por Ganzera e colaboradores (2001) e por Laus e Keplinger (1994) que
utilizaram condições cromatográficas semelhantes às otimizadas no presente
trabalho. Os testes de robustez indicaram não haver alteração na ordem de eluição
min
10
15 20 25
30
mAU
0
10
20
30
40
50
60
70
DAD1 A, Sig=245 nm
10.185
14.148
15.540
19.670
22.768
23.930
25.825
31.372
min
10 15
20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
DAD1 A, Sig=245 nm
10.024
14.331
15.526
23.049
24.152
31.586
82
em função da fase estacionária utilizada. Além disso, a análise por espectrometria
de massas, detalhada a seguir, auxiliou na identificação dos picos obtidos.
A planta peruana, FIGURA 25, apresentou teor de 0,88% para AOP e 0,31%
para AOT. O resultado encontrado para AOT foi superior ao limite de 0,05%
estabelecido pela USP XXXI. Dessa forma essa planta, como citado no item 4.5, foi
utilizada apenas nos testes de verificação da capacidade do sistema CLAE em
distinguir entre AOP e AOT, não sendo utilizada nas análises de validação.
5.2.2 Verificação da capacidade de distinção entre AOT e AOP
Vários estudos nas décadas de 1960, 1970 e mais recentemente 2004,
relatam análise por EM para AOT e AOP, com utilização como fonte de íons impacto
eletrônico (BECKETT; DWUMA-BADU; HADDOCK, 1969; PHILLIPSON;
HEMINGWAY, 1975a; PHILLIPSON; HEMINGWAY, 1975b; HERATH et al., 1979;
CARBONEZI et al., 2004). Embora o modo de ionização empregado pelos autores
seja, provavelmente, o mais utilizado ainda hoje, frequentemente é desejável reduzir
a fragmentação na fonte de íons de modo a simplificar a interpretação de moléculas
de peso molecular elevado (MENDHAM et al., 2002).
Ainda segundo Mendham e colaboradores (2002), ionizações mais brandas
podem ser alcançadas com o emprego de outras fontes de íons entre elas a
ionização por nebulização elétrica (electrospray), que operam à pressão atmosférica.
Os processos de ionização à pressão atmosférica são mais eficientes por um fator
de até 10
4
em relação aos processos que ocorrem sob vácuo, como o impacto
eletrônico, e como conseqüência resultam em maior sensibilidade.
O trabalho publicado por Lopez-Avila e Bendicto (1997) fornece informações
sobre o espectro de fragmentação dos AO em condições de ionização mais brandas
(APCI). Informações sobre fragmentação com electrospray ainda não são
disponíveis em literatura, embora esta seja hoje a fonte de ionização mais versátil
existente para acoplamento com sistemas CLAE.
Conforme já discutido para a massa molecular da mitrafilina, 368,4263 Da, a
relação m/z esperada para o seu íon molecular em modo positivo de fragmentação
seria 361,4 Da. Essa relação esperada pode ser estendida aos demais AOP tendo
em vista serem todos isômeros conformacionais. Já para os AOT como a massa
83
molecular é de 384,4687 Da, a relação m/z esperada para o íon molecular em modo
positivo de fragmentação é de 385,4 Da.
O monitoramento em MS1 das razões m/z efetuado entre 150 e 400 Da,
FIGURAS 26 e 27, para as injeções em CLAE-EM das amostras de cascas da planta
brasileira e peruana, exigiu a substituição da trietilamina por hidróxido de amônio
para o ajuste do pH do tampão.
FIGURA 26 – EM – MS1 DA PLANTA BRASILEIRA
NOTA: especiofilina (10,02 min), uncarina F (14,83 min), mitrafilina (15,61 min), rincofilina (17,73 min),
pico desconhecido (18,86), isomitrafilina (23,50 min), pteropodina (24,20 min), isorincofilina (26,19
min), pico desconhecido (27,70 min) e isopteropodina (31,48 min).
84
FIGURA 27 – EM – MS1 DA PLANTA PERUANA
NOTA: especiofilina (10,00 min), uncarina F (14,82 min), mitrafilina (15,53 min), rincofilina (17,74 min),
isomitrafilina (23,45 min), pteropodina (24,18 min), isorincofilina (26,18 min), isopteropodina (31,48
min) e pico desconhecido (31,99 min).
As figuras acima apresentam os mesmos perfis e ordem de eluição dos
cromatogramas obtidos com detecção UV, FIGURAS 24 e 25 (item 5.2.1).
Na TABELA 10 são apresentadas apenas as relações m/z observadas para
sinais de AO, [M+H]
+
369 e 385 Da. Pelos dados apresentados evidencia-se que a
planta brasileira, embora não tenha apresentado AOT em análise CLAE-UV, não é
destituída desses alcalóides. A análise confirma os sinais em tempos de retenção
17,7 e 26,3 como AOT, bem como demonstra boa separação e confiável distinção
entre AOT e AOP pelo método cromatográfico desenvolvido.
85
TABELA 10 – ÍONS MOLECULARES OBTIDOS EM CLAE-MS PARA A PLANTA BRASILEIRA E
PERUANA
Uncaria tomentosa – PLANTA BRASILEIRA Uncaria tomentosa – PLANTA PERUANA
TR (min)
RELAÇÃO
m/z
% ÁREA TR (min)
RELAÇÃO
m/z
% ÁREA
10,02 369,4 16,68 10,00 369,4 11,00
14,83 369,0 5,40 14,82 369,1 3,44
15,61 369,4 23,98 15,53 368,8 13,80
17,73* 385,2 1,08 17,74 385,5 15,69
18,86* 368,9 0,82 23,45 369,0 6,84
23,50 369,1 13,71 24,18 369,1 15,89
24,20 368,7 23,81 26,18 385,5 12,68
26,19* 385,2 0,41 31,48 368,9 5,52
27,70* 368,9 0,33 31,99* 369,0 1,01
31,48 369,0 9,03
NOTA: *Sinais não observados por CLAE-UV; Destacado os dados relativos aos AOT
Não foi encontrada na literatura descrição da possível identidade dos picos
observados em 18,86; 27,70 e 31,99 min, mas fica evidente pelos dados obtidos se
tratarem de AOP.
Embora na planta brasileira, FIGURA 26, tenha sido evidenciado pico em
32,12 min, este não apresentou m/z característico de AOP ou AOT, não podendo ser
o AOP com tempo de retenção 31,99 min observado na planta peruana, FIGURA 27.
Além disso, o pico de grande intensidade em 20,94 min presente na planta peruana
não apresentou relação m/z característica de AOP ou AOT.
O monitoramento em MS2 dos íons produto de 369 e 385 Da forneceu os
perfis de fragmentação para todos AOP e AOT presentes nos cromatogramas,
conforme modelos da FIGURA 28.
86
FIGURA 28 – MS2 DOS ALCALÓIDES OXINDÓLICOS
LEGENDA: A - MS2 mitrafilina; B – MS2 rincofilina
A
B
87
Os demais perfis de fragmentação para cada alcalóide seguiram o mesmo
padrão apresentado em A e B, respeitando-se a classe AOT ou AOP. Os seis
principais íons obtidos em cada caso encontram-se na TABELA 11.
88
TABELA 11 – IONS PRODUTO DOS PRINCIPAIS ALCALÓIDES DE U. tomentosa
AOP AOT
especiofilina
(10,02 min)
uncarina D
(14,83 min)
mitrafilina
(15,61 min)
18,86
min
isomitrafilina
(23,50 min)
pteropodina
(24,20 min)
27,70
min
isopteropodina
(31,48 min)
31,99
min
rincofilina
(17,74 min)
isorincofilina
(26,18 min)
160,2
1
(65,25)
2
160,3
(69,83)
160,2
(100,00)
160,3
(100,00)
160,2
(100,00)
160,3
(80,27)
160,1
(100,00)
160,2
(81,59)
160,2
(87,96)
160,2
(54,22)
160,2
(35,28)
201,3
(14,85)
178,2
(7,88)
178,2
(16,65)
178,1
(16,05)
178,2
(17,82)
178,1
(9,08)
178,0
(15,29)
178,2
(8,10)
201,2
(24,07)
215,2
(16,22)
215,3
(9,61)
213,1
(8,38)
201,3
(12,31)
201,1
(11,63)
201,3
(18,72)
201,2
(10,90)
201,2
(16,75)
201,3
(18,24)
201,3
(20,54)
226,3
(30,56)
226,3
(13,75)
241,3
(18,03)
239,3
(7,54)
213,1
(7,52)
309,4
(26,99)
309,3
(21,40)
309,3
(28,31)
213,3
(9,73)
309,5
(20,00)
213,3
(8,49)
238,5
(26,85)
269,4
(24,08)
269,4
(17,68)
337,4
(100,00)
337,2
(79,11)
337,4
(22,89)
337,1
(36,83)
337,4
(24,54)
337,4
(100,00)
337,3
(53,53)
337,3
(100,00)
337,2
(100,00)
353,4
(29,31)
353,4
(47,48)
369,1
(46,76)
369,3
(100,00)
369,1
(42,72)
369,2
(43,21)
369,1
(67,08)
369,2
(56,19)
369,3
(65,59)
369,3
(54,18)
369,4
(81,48)
385,4
(100,00)
385,4
(100,00)
LEGENDA:
1
razão m/z;
2
(intensidade %)
89
Pela análise dos dados fica claro que os alcalóides seguem um perfil de
fragmentação conforme a classe representada (AOP ou AOT) e o tipo (normal, allo
ou epiallo) em que são classificados (item 3.2). Pelo padrão de fragmentação
apresentado os alcalóides em 18,86 e 27,70 min são provavelmente do tipo normal,
pois apresentam os mesmos fragmentos, em intensidades semelhantes, aos
alcalóides do mesmo tipo mitrafilina e isomitrafilina. Esses alcalóides podem ser as
uncarinas A ou B descritas no gênero Uncaria, contudo não descritas na espécie em
estudo (HEITZMAN et al., 2005).
Já o alcalóide em 31,99 min, presente na planta peruana, apresentou perfil
de fragmentação muito semelhante aos alcalóides do tipo allo (pteropodina e
isopteropodina), com pico base de m/z 337,2. Esse alcalóide pode ser tanto o
oxindólico rauniticina-allo A quanto o B, já descritos no gênero (U. elliptica), mas
ainda não na unha-de-gato (HEITZMAN et al., 2005).
A não descrição desses alcalóides por outros autores pode ser resultado do
uso do modo de ionização impacto eletrônico na análise das amostras estudadas de
U. tomentosa, modo esse que como já citado é menos sensível que electrospray.
Os novos alcalóides encontrados na espécie U. tomentosa foram detectados
com pequena intensidade de sinal, o que pode explicar a diferença de fragmentação
do alcalóide em 31,99 min em relação aos estruturalmente relacionados do tipo allo.
A pequena intensidade dos sinais obtidos para esses novos alcalóides não
altera de maneira significativa o teor calculado para AO por CLAE – UV na espécie
U. tomentosa.
Na FIGURA 29 segue proposta dos fragmentos formulada com base na
abundância obtida para os íons produto de m/z 369.
90
H
+
N
O
H
NH
+
N
O
H
H
NH
+
N
O
H
H
N
+
N
O
H
H
O
O
H
N
+
O
H
H
N
O
Me
H
O
O
N
O
H
H
+
Me
H
m/z = 213,2
m/z = 201,2
m/z = 160,2
m/z = 239,3
O
+
N
-
+
O
H
H
Me
H
N
O
+
H
H
N
O
Me
H
m/z = 309,4
m/z
= 178,2
O
+
H
N
O
H
H
N
O
Me
H
m/z = 337,4
m/z = 238,3
m/z = 369,4
O
O
N
H
H
+
Me
H
m/z = 226,3
FIGURA 29 – PROPOSTA DE FRAGMENTAÇÃO PARA AOP
Em todos os tipos de AOP foram evidenciados fragmentos de m/z 160,2 Da
correspondente à porção indólica do alcalóide, decorrente da ruptura no anel de
cinco membros mais tencionado da porção terpênica. Os sinais de m/z 178,2 e
238,3 Da decorrem da fragmentação em porção distinta do mesmo anel de cinco
membros. Todos esses fragmentos além do m/z 201,2 e 213,2 Da são quebras
adjacentes ao nitrogênio básico da molécula. Os demais sinais de m/z 309,4 e 337,4
Da são perdas da porção éster e metila respectivamente, próximas à região bastante
eletrofílica das moléculas.
Os fragmentos de m/z 226,3 e 239,3 Da são resultantes da fragmentação da
porção do éter cíclico derivado da secologanina.
Para AOT foi observado o mesmo fragmento de m/z 160,2 Da derivado da
porção indólica. Os demais fragmentos estão relacionados à fragmentação dos
91
grupamentos éster e éter da porção terpênica da molécula (m/z = 215,3; 241,3;
269,4 e 353,4 Da).
Já o fragmento de m/z 226,3 Da é originado pela fragmentação das porções
indólica e terpênica (éter) da molécula, FIGURA 30.
O
H
N
O
H
H
N
O
H
+
O
O
N
H
H
+
H
N
+
H
N
O
H
H
O
O
H
N
+
O
H
H
N
O
H
m/z = 385,5
m/z = 353,4
m/z = 269,4
m/z = 226,3
H
N
+
N
O
H
m/z
= 241,3
H
NH
+
N
O
H
m/z = 215,3
H
N
+
O
m/z = 160,2
FIGURA 30 – PROPOSTA DE FRAGMENTAÇÃO PARA AOT
5.2.3 Escolha do padrão externo
A maior parte dos trabalhos que descrevem métodos de análise para U.
tomentosa utilizam como padronização externa o alcalóide pteropodina, culminando
com a recente monografia da USP XXXI estabelecendo esse mesmo alcalóide para
padronização da planta (STUPPNER; STURM, 1992; LAUS; KEPLINGER, 1994;
GANZERA et al., 2001; VALENTE et al., 2006; USP, 2008).
Tendo em vista a complexidade da composição alcalóidica da espécie, seis
AOP e dois AOT, foi analisada qual a melhor alternativa para padronização das
cascas, ou seja, qual dos alcalóides isolados disponíveis forneceria resultados mais
confiáveis para expressar o teor alcaloídico.
92
Os dados obtidos para cada curva analítica preparada, conforme item 4.7.3,
estão compilados na TABELA 12. Pelos resultados pode ser inferido absortividades
semelhantes para alcalóides com mesma conformação em C-7. Mitrafilina e
pteropodina, conformação R em C-7, apresentam valores menores para a razão
concentração/área em relação aos alcalóides de conformação S em C-7,
isomitrafilina e isopteropodina. Esta evidência suporta a afirmação de que a porção
indólica influi de maneira significativa no comportamento da absorção da molécula
no ultra-violeta.
TABELA 12 – COMPARAÇÃO DAS CURVAS ANALÍTICAS AVALIADAS
ALCALÓIDE
CONCENTRAÇÃO (µg.mL
-1
)
ÁREA (mAU.s)
CONCENTRAÇÃO /
ÁREA
8,10 240,15 3,37 x10
-2
20,30 604,56 3,36 x10
-2
40,60 1.221,78 3,32 x10
-2
81,20 2.447,29 3,32 x10
-2
Mitrafilina (3)
203,00 6.089,92 3,33 x10
-2
6,50 178,66 3,64 x10
-2
16,30 452,16 3,60 x10
-2
32,60 908,34 3,59 x10
-2
65,20 1.830,99 3,56 x10
-2
Isomitrafilina (4)
163,0 4.565,42 3,57 x10
-2
8,60 264,26 3,25 x10
-2
21,40 655,95 3,26 x10
-2
42,80 1.323,82 3,23 x10
-2
85,60 2.651,68 3,23 x10
-2
Pteropodina (5)
214,00 6.787,08 3,15 x10
-2
8,10 221,82 3,65 x10
-2
20,30 564,16 3,60 x10
-2
40,60 1.138,01 3,57 x10
-2
81,20 2.267,92 3,58 x10
-2
Isopteropodina (6)
203,00 5.716,02 3,55 x10
-2
Os valores da TABELA 13 apresentam os resultados obtidos de amostras
calculadas frente a cada uma das curvas.
TABELA 13 – COMPARAÇÃO DOS DIFERENTES TEORES ALCALÓIDICOS OBTIDOS FRENTE ÀS
DIFERENTES CURVAS ANALITICAS TESTADAS
TEOR DE ALCALÓIDES (%)
AMOSTRA CURVA 3 CURVA 4 CURVA 5 CURVA 6
VALOR
VERDADEIRO*
1 1,09 1,17 1,05 1,17 1,11
2 1,06 1,14 1,03 1,14 1,08
3 1,07 1,15 1,04 1,15 1,09
Média 1,07 1,15 1,04 1,15 1,09
NOTA: *Cada alcalóide calculado em função da sua respectiva curva analítica, especiofilina calculada
com curva da isopteropodina e uncarina F com curva da mitrafilina.
93
Os resultados da última coluna são considerados como os valores
verdadeiros, pois cada alcalóide da amostra foi calculado frente ao seu padrão
analítico, ou seja, o pico da mitrafilina com a curva analítica da mitrafilina, o pico da
isomitrafilina com a curva da isomitrafilina e assim sucessivamente. Especiofilina e
uncarina F, alcalóides sem padrão analítico disponível, foram calculadas frente a
padrão de alcalóide com mesma conformação em C-7, nesse caso isopteropodina e
mitrafilina respectivamente.
A análise de variância, execução do teste de Tukey com 95% de confiança
apresenta valores semelhantes para resultados obtidos entre curvas analíticas de
alcalóides com mesma conformação em C-7, mitrafilina e pteropodina (conformação
R) e isomitrafilina e isopteropodina (conformação S).
Além disso, o teste acusa diferença significativa quando comparados entre si
resultados obtidos com curvas analíticas provenientes de alcalóides com diferentes
conformações em C-7.
Finalmente a análise estatística aponta como semelhante aos valores
considerados verdadeiros, apenas os valores obtidos com a curva da mitrafilina,
assim para a amostra utilizada foi estabelecida padronização externa em mitrafilina
como a mais adequada.
5.2.4 Estabilidade das soluções padrão
A mitrafilina isolada e selecionada como padrão externo ideal para
quantificação dos AOP, foi preparada, estocada e analisada conforme item 4.7.4.
Para os tempos analisados, 15, 30, 60, 90 e 120 dias, os valores de t
calculados foram inferiores ao t tabelado (n=4), confirmando a estabilidade da curva
analítica por até 120 dias quando armazenada nas condições descritas. Além disso,
os coeficientes de correlação superiores a 0,9999 obtidos para todas as curvas
confirmam a estabilidade da solução analítica de mitrafilina por esse período,
FIGURA 31.
94
FIGURA 31 – ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES PADRÃO
Esses resultados permitem afirmar que não existe interconversão entre
mitrafilina e a pteropodina residual presente no padrão isolado dentro do intervalo de
tempo avaliado.
5.2.5 Conformidade do sistema método CLAE para cascas e tintura
Segundo Ermer (2001), durante o desenvolvimento e validação do método
analítico, parâmetros de performance devem ser identificados para orientar limites
de conformidade do sistema.
A USP (2008) recomenda que os parâmetros acompanhados sejam
resolução entre picos, precisão de pelo menos 5 replicatas e o fator cauda ou
simetria do pico. Dos três parâmetros citados a farmacopéia afirma que a resolução
é uma função da eficiência da coluna e assim a forma mais confiável de se realizar a
avaliação da conformidade do sistema. Estabelece ainda que os testes devam ser
executados com injeções do padrão analítico.
A realização deste procedimento com a amostra tentou garantir a
adequabilidade do sistema mesmo em presença da matriz responsável pela
dificuldade nos procedimentos cromatográficos associados a drogas vegetais.
Conforme orientado pelo ICH (2005), devido à sua natureza complexa,
procedimentos analíticos para produtos biológicos e biotecnológicos podem, em
0,0
1000,0
2000,0
3000,0
4000,0
5000,0
6000,0
7000,0
0
50 100 150 200 250
Concentração de mitrafilina (µg.mL
-
1
)
Area (mAU.s)
Tempo zero
15 dias
30 dias
60 dias
90 dias
120 dias
95
alguns casos, sofrer abordagens diferentes do descrito pelo documento para
comprovação da confiabilidade do método.
As injeções realizadas apresentaram simetrias entre 0,91 e 0,98 para todos
os picos relativos aos AO, resolução mínima de 2,25 entre os picos pteropodina –
isomitrafilina e DPR inferior a 0,96% entre as áreas dos picos.
As simetrias de pico encontradas permitem correta integração dos picos
analisados e contribuem para a eficiência cromatográfica. Como o resultado
encontrado para resolução entre os pares de picos críticos foi superior ao limite
estabelecido pela USP XXXI, mínimo 2,0, pode ser atestada a conformidade do
sistema cromatográfico.
A avaliação não foi realizada com a amostra tintura por se tratar de matriz
idêntica à obtida com o preparo de amostra das cascas.
5.2.6 Otimização do método CLAE análise do gel
O método CLAE desenvolvido para pó e tintura não foi possível de ser
utilizado no gel. O parahidroxibenzoato de metila (metil parabeno) e
parahidroxibenzoato de propila (propil parabeno) utilizados como conservantes na
formulação, apresentaram característica de absorção no ultravioleta muito próxima,
λ
máx
= 260 nm em etanol, em relação aos AO. Além disso, o comportamento do
propil parabeno no método CLAE desenvolvido foi muito semelhante à mitrafilina,
comprovado pela contaminação de 0,5 mL de tintura com 0,5 mL de propil parabeno
em etanol (5 mg/mL), FIGURA 32. O incremento da área da mitrafilina comprova a
co-eluição.
96
FIGURA 32 – PERFIL DE ELUIÇÃO DO PROPIL PARABENO NO METODO CLAE PARA CASCAS E
TINTURA
LEGENDA: A – Perfil da tintura não contaminada; B – Perfil da tintura contaminada
NOTA: Destacada co-eluição do propil parabeno sobre a mitrafilina
As tentativas de otimização foram realizadas no sentido de manter o tampão
orgânico e alterar apenas o gradiente, de maneira a se obter separação do
conservante. Os testes iniciais primaram pela redução da força da fase móvel
reduzindo a quantidade inicial de MeCN no gradiente. Estes testes conduziram a
tempos de análise de até 53 min sem, contudo, separar o conservante dos
alcalóides, ora parabeno co-eluia com mitrafilina ora com uncarina F.
A alternativa encontrada foi, além de reduzir a força da fase móvel, alterar a
sua seletividade pela utilização de outro solvente. Segundo Jardim, Colins e
Guimarães (2006), quando em uma separação cromatográfica, após o ajuste da
força cromatográfica, existirem picos sobrepostos no cromatograma, a solução é
alterar a seletividade da fase móvel até se obter fator de separação suficiente. Ciola
(1998) cita resultados muito interessantes com misturas de metanol em MeCN para
a melhora da seletividade da fase móvel na separação de multicomponentes.
Desta maneira, a MeCN utilizada no gradiente foi substituída primeiramente
por mistura 1:1 desse solvente em metanol e posteriormente, após sucessivas
min
10 15
20
25
30 35
mAU
0
100
150
200
250
300
350
VWD1 A, Wavelength=245 nm
10.889
14.650
16.115
-
23.391
24.498
31.716
50
min
10 15
20 25
30
35
mAU
0
100
150
200
250
300
350
VWD1 A, Wavelength=245 nm
10.881
14.629
16.356
23.374
24.493
31.717
50
A
B
97
otimizações, relação 2:1 da mistura apresentada, conforme item 4.7.5, sendo obtido
o perfil cromatográfico apresentado na FIGURA 33.
Separação cromatográfica completa foi obtida em 47 min de análise. O metil
e propil parabenos eluiram em 12,6 e 25,3 min respectivamente.
FIGURA 33 – PERFIL CROMATOGRÁFICO DOS AO DO GEL APÓS OTIMIZAÇÕES
NOTA: especiofilina (27,50 min), uncarina F (28,46 min), mitrafilina (32,37 min), isomitrafilina (36,70
min), pteropodina (37,92 min) e isopteropodina (46,08 min).
5.2.7 Conformidade do sistema método CLAE para gel
A resolução encontrada para o par pteropodina – isomitrafilina foi superior a
2,34 e os valores de simetrias de todos os picos entre 0,92 e 1,00. Como os valores
de simetrias e resolução dos picos foram satisfatórios, o método pode ser dito
eficiente e seletivo na separação dos AOP (JARDIM; COLLINS; GUIMARÃES,
2006).
O DPR entre as áreas dos picos referentes à especiofilina, uncarina F,
mitrafilina, isomitrafilina e pteropodina foi inferior a 0,97%, apenas para o alcalóide
isopteropodina as áreas variaram com DPR de 1,05%. No entanto, esse valor é
muito próximo ao limite de 1,0% estabelecido pela USP XXXI e face à complexidade
da matriz analisada pode ser aceito como comprovação da conformidade do sistema
cromatográfico.
min
27.5 30
32.5
35
37.5
40
42.5 45
mAU
0
5
10
15
20
25
30
DAD1 A, Sig=245 nm
27.500
28.457
36.703
46.085
37.924
32.368
98
5.3 MÉTODOS DE PREPARO DAS AMOSTRAS
5.3.1 Preparo da amostra cascas
Para a extração dos AO das cascas foi selecionado o método de ultrassom
por ser mais prático e rápido em relação ao tradicionalmente usado extração por
refluxo. A extração por ultrassom é atribuída ao fenômeno de cavitação do solvente,
causado pela passagem de uma onda ultrassonica.
Bolhas de cavitação são produzidas e comprimidas no processo e com o
aumento da pressão e temperatura ocorre rompimento das mesmas, uma onda de
choque passa então pelo solvente aumentando a mistura e penetração do solvente
na matriz. Este efeito aumenta a área superficial de contato do líquido com a
amostra, aumentando a transferência de massas pela desruptura das células. Nesse
processo, maiores temperaturas aumentam o número de bolhas de cavitação
formadas (LIAZID et al., 2007).
Diferentemente dos métodos descritos em literatura que aplicam múltiplas
etapas no processo de extração da planta, com o ultrassom foi testado o
esgotamento dos AO presentes na amostra em uma única etapa extrativa
(STUPPNER; STURM; KONWALINKA, 1992; LAUS; KEPLINGER, 1994; GANZERA
et al., 2001).
Devido a todo preparo de amostra ser afetado pelo tempo, tamanho da
partícula, massa de amostra submetida à extração e ao solvente extrator utilizado,
esses fatores foram testados na etapa de triagem, TABELA 14. Além disso, como o
método de ultrassom é afetado pela temperatura, esse fator também foi incluído
para teste na mesma etapa. Os resultados foram avaliados em termos do teor obtido
de AO (%).
TABELA 14 – ETAPA DE TRIAGEM – PLANEJAMENTO FATORIAL PARA EXTRAÇÃO DAS
CASCAS
FATOR MÍNIMO MÁXIMO
Tempo de extração (A) 10 min. 30 min.
% de etanol em água (B) 50 90
Tamanho de partícula do pó - mesh (C) > 60 < 80
Temperatura de extração (D) 25
o
C 45
o
C
Massa da amostra (E) 100 mg 200 mg
99
Os resultados plotados no gráfico de Pareto, FIGURA 34, permitem inferir
forte influência dos fatores tamanho de partícula, % de etanol em água, temperatura
e tempo de extração, com p < 0,05. A influência muito grande do tamanho da
partícula na extração está associada à característica do material fibroso lignificado
constituinte das cascas da planta, o que impede a entrada do solvente nas células e
a conseqüente extração do seu conteúdo. Logo menores tamanhos de partículas
aumentam a superfície de contato da amostra, permitindo maior possibilidade de
penetração do solvente nas células.
FIGURA 34 – GRÁFICO DE PARETO PARA AS CONDIÇÕES EXTRATIVAS DAS CASCAS
LEGENDA: A: Tempo de extração, B: % de Etanol em água, C: Tamanho de partícula do pó, D:
Temperatura de extração, E: Massa da amostra.
O gráfico dos efeitos principais, FIGURA 35, torna evidente melhores valores
de extração dos AO para tempos próximos a 30 min, menores quantidades de etanol
em água como solvente extrator, partículas com granulometria < 80 mesh e
temperatura de extração próxima a 45
o
C.
100
FIGURA 35 – EFEITOS PRINCIPAIS PARA AS CONDIÇÕES EXTRATIVAS DAS CASCAS
Conforme observado em ambos os gráficos a massa de amostra utilizada
não interfere de maneira estatisticamente significativa no teor final obtido de AO,
assim foi estabelecida a massa de 200 mg para análise em função de 100 mg de
amostra ter apresentado áreas muito pequenas, próximas ao LQ, para os alcalóides
minoritários especiofilina e uncarina F.
Para o fator tamanho da partícula foi estabelecido como valor ótimo para
extração dos AO, partículas das cascas inferiores a 80 mesh. Isso pôde ser
estabelecido uma vez que, após todas as condições otimizadas, testes em triplicata
de amostras em partículas inferiores a 120 mesh não terem apresentado resultados
estatisticamente diferentes no teor de AO quando comparadas a amostras com
partículas inferiores a 80 mesh.
Os demais fatores foram otimizados pela aplicação de design composto
central com design fatorial (2
3
)
composto por doze pontos axiais e dezesseis
replicatas no centro do delineamento, TABELA 15.
101
TABELA 15 – ETAPA DE OTIMIZAÇÃO – PLANEJAMENTO FATORIAL PARA EXTRAÇÃO DAS
CASCAS
DOMÍNIO EXPERIMENTAL
FATOR
-α
a
-1 0 1
α
a
Tempo de extração (A) 20 22 25 28 30
% de Etanol em água (B) 30 38 50 62 70
Temperatura de extração (D) 30 33 38 42 45
Os gráficos de superfície de resposta apresentados suportam como
melhores regiões para as condições extrativas os valores próximos às tonalidades
de verde mais intenso.
FIGURA 36 – SUPERFÍCIE DE RESPOSTA PARA OTMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DAS CASCAS
O perfil atípico do gráfico de interação Temperatura Vs Tempo pode ser
justificado pelo erro experimental, pois pequena diferença entre os valores mínimos
(<0,98) e máximos (>1,04) é observada.
Fica evidente pela análise dos gráficos que dentro dos valores explorados
para o domínio experimental o fator que rege predominantemente a extração é a
102
porcentagem de etanol utilizada como solvente extrator. Com esse fator
devidamente otimizado, não existe diferença significativa na aplicação de 30 e 20
min no tempo ou 30 e 45
o
C na temperatura de extração do método. Dessa forma os
menores valores de temperatura e tempo foram selecionados como condições
ótimas para remoção dos AO das cascas de U. tomentosa, já como solvente extrator
foi estabelecido etanol 60% para evitar a extração de outros componentes menos
polares da planta e melhor simular a força da fase móvel.
Finalmente os fatores otimizados foram confrontados com o solvente extrator
metanol e três etapas extrativas, condições citadas por Ganzera e colaboradores
(2004) e utilizadas pela USP XXXI (2008), no intuito de se verificar se essas
condições resultavam em maiores teores de AO extraídos da planta. Os resultados
demonstraram que com os parâmetros otimizados, os teores de AO são
estatisticamente semelhantes aos obtidos com os fatores descritos em literatura,
quando avaliados pelo teste de Tukey com 95% de confiança.
5.3.2 Preparo da amostra tintura
Como os alcalóides encontravam-se solúveis e disponíveis para análise
nessa matriz, foi necessária apenas a adequação da concentração da amostra para
que as áreas dos alcalóides ficassem contidas entre os pontos mínimo e máximo da
curva analítica. Foi estabelecida diluição de 2 mL de tintura ao volume final de 5 mL
com o solvente previamente utilizado na análise do pó, etanol 60% (v/v).
FIGURA 37 – PERFIL CROMATOGRÁFICO DA TINTURA DE U. tomentosa
NOTA: especiofilina (10,31 min), uncarina F (14,06 min), mitrafilina (15,48 min), isomitrafilina (22,53
min), pteropodina (23,68 min) e isopteropodina (31,25 min)
min
10 15 20 25 30 35
mAU
0
20
40
60
80
100
120
140
VWD1 A, Wavelength=245 nm
1
0.312
14.056
15.477
22.532
23.683
31.254
103
5.3.3 Preparo da amostra gel
As principais etapas críticas para o desenvolvimento de um método por
MSPD foram avaliadas na seguinte seqüência: 1) natureza do sorbente para mistura
com amostra; 2) solvente para limpeza da amostra; 3) relação sorbente : amostra; 4)
solvente para eluição final das moléculas alvo.
O objetivo principal no desenvolvimento da metodologia extrativa foi remover
os interferentes oleosos e os conservantes utilizados na formulação do gel.
Conforme descrito por Rowe, Sheskey e Weller (2003) os conservantes metil
e propil parabeno possuem pKa = 8,4, valor significativamente diferente dos
relatados para AOP por Laus e colaboradores (1996) como 5,7 a 6,7 e 4,7 por Chan,
Morsingh e Yeoh (1966). Tendo em vista essa diferença de pKa e sabendo-se que o
nitrogênio heterocíclico dos alcalóides possui grande afinidade de interação com
óxido de alumínio, foram testados como sorbentes OALB e OALN. Outra
característica muito importante neste caso é capacidade do óxido de alumínio
adsorver água, pois 85% da matriz do gel é composta por esse solvente.
Como o OALB em presença de água confere pH 9,5 à solução, o uso deste
foi descartado logo após os primeiros testes, pois causou efeito nivelador na eluição
das moléculas dos conservantes e AOP, não permitindo seletividade na extração. Já
o OALN confere pH 7,0 à solução em presença de água, desta maneira os AOP em
sua forma molecular poderiam ser removidos da coluna com solvente orgânico
apropriado.
A escolha do solvente de limpeza foi efetuada tendo-se em vista que metil e
propil parabeno são consideravelmente solúveis em éter etílico e que os demais
componentes oleosos da amostra tem grande afinidade pelo solvente hexano. Desta
maneira foram avaliadas as proporções de hexano : éter etílico (5:5; 7:3 e 8:2) em
diferentes volumes (20, 30, 40, 50 e 80 mL). As quantidades mais elevadas de éter
na mistura de limpeza foram capazes de remover também os alcalóides, assim foi
escolhida e menor proporção de éter na mistura em um volume de 40 mL para
limpeza da amostra.
Para fixar a melhor proporção OALN : gel, partiu-se da relação 1:4 citada por
Barker (2007) como a mais frequentemente utilizada na relação amostra : suporte
sólido e testadas as proporções 1:4, 1:5 e 1:6. O ajuste foi realizado pela obtenção
das misturas visualmente mais homogêneas e das melhores recuperações de AOP
104
obtidas. Foi verificada a necessidade do uso de OALN na base da coluna como
mecanismo de evitar perda de alcalóides durante a etapa de limpeza, as
quantidades de 1, 2, 3 e 4 g do óxido foram avaliadas para esse propósito. Para
evitar respostas em CLAE muito baixas para os AOP, não foram utilizadas
quantidades de gel inferiores a 5 g.
A mistura sorbente e gel foi executada em béquer com bastão de vidro, pois
a mistura em gral e pistilo não resultou em maior homogeneidade da amostra.
Finalmente o solvente de eluição dos alcalóides foi definido com base na
afinidade que os AOP possuem com acetato de etila e boa compatibilidade deste
com OALN. O volume de 35 mL encontrado como ótimo condiz com os dados
citados por Barker (2007) que descreve a eluição dos analitos de 0,5 g de amostra
misturada com 2 g de sorbente nos primeiros 4 mL do solvente passado pela coluna,
aproximadamente um volume de coluna.
Todas as etapas acima descritas não foram capazes de eliminar por
completo os conservantes e o óleo da amostra, embora os tenham reduzido
significativamente. Isso pode ser atribuído à maior concentração de propil parabeno
e componentes oleosos em relação aos AOP no gel, 38 e 1625 vezes superior
respectivamente. Dessa forma quando se tentava a eliminação desses
componentes, acabavam por carrear os AOP presentes na ordem de ppm.
Assim separação completa dos AOP e parabenos foi obtida em CLAE
conforme descrito no item 5.2.6.
A eliminação do óleo residual proveniente da amostra foi obtida pelo
emprego de etanol 60% (v/v) como solvente para retomada da amostra após
secagem do acetato de etila, em virtude de possuir baixa miscibilidade com o óleo. A
centrifugação final permitiu melhor separação das fases e injeção da amostra
límpida no cromatógrafo.
105
A
B
C
D
E
F
FIGURA 38 – DEMONSTRAÇÃO DAS ETAPAS DO PROCESSO DE PREPARO DA AMOSTRA GEL
LEGENDA : A) aspecto do sorbente e gel; B) etapa inicial da mistura; C) mistura finalizada; D) 3 g de
OALN na base da coluna; E) introdução da amostra na coluna; F) coluna empacotada.
Embora não tenha sido conseguida completa limpeza da amostra em
relação aos conservantes, os volumes de solvente utilizados foram bastante
reduzidos, além do tempo de preparo da amostra em comparação às técnicas
usualmente empregadas para amostras semi-sólidas, geralmente múltiplas etapas
de agitação com solvente de extração.
106
5.4 VALIDAÇÃO DOS METODOS ANALÍTICOS
Os resultados para os ensaios de validação estão reunidos para cada
amostra avaliada: cascas, tintura e gel. Os ensaios de perfil e pureza espectral estão
reunidos para todas as amostras para permitir melhor comparação dos resultados.
Como o método cromatográfico utilizado foi o mesmo nas cascas e tintura, os testes
referentes às condições CLAE para linearidade com padrão, limites de detecção e
quantificação e robustez para as duas amostras são apresentados em conjunto.
5.4.1 Comparação dos perfis espectrais
Em cada método cromatográfico os perfis espectrais dos picos de alcalóides
foram comparados aos picos obtidos pela injeção de soluções dos padrões
analíticos disponíveis de AOP, FIGURA 39.
107
especiofilina
uncarina F
mitrafilina
isomitrafilina
pteropodina
isopteropodina
FIGURA 39 – PERFIS ESPECTRAIS DOS PICOS DE AOP ANALISADOS
LEGENDA: Azul – cascas; Vermelho – tintura; Preto – padrão; Verde - gel
Os perfis espectrais semelhantes das amostras em relação aos padrões
constituem forte indicativo da identidade dos picos analisados.
Embora não tenham sido comparados a padrões analíticos, os perfis da
especiofilina e uncarina F são muito semelhantes aos demais alcalóides oxindólicos,
indicando pertencerem à mesma classe química.
108
5.4.2 Avaliação da pureza de pico
A pureza de pico determinada com utilização de DAD, avalia a sobreposição
de vários espectros adquiridos no pico de interesse. Um alto fator de similaridade,
em uma escala de 0 a 1000, indica inexistência de interferentes co-eluindo ao
analito.
TABELA 16 – PUREZA DE PICO DOS ALCALÓIDES PARA AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE
PUREZAS DOS PICOS
AMOSTRA
TRATAMENTO 1 2 3 4 5 6
Não degradado 998,816 996,850 994,050 972,122 881,842 999,677
Ácido 877,516 857,812 990,656 845,093 952,382 939,268
Base 974,111 938,312 858,237 997,397 900,657 852,041
Cascas
Peróxido 884,491 792,516 995,856 979,799 998,688 999,714
Tintura* Não degradado 996,742 996,991 998,817 937,581 995,791 933,649
Não degradado 999,821 999,859 998,107 999,576 998,681 999,571
Ácido 999,800 999,898 998,084 999,615 998,776 999,645
Base 999,911 999,891 998,607 999,479 998,699 999,291
Gel
Peróxido 999,847 999,893 998,257 999,626 998,873 999,655
Padrões
(CLAE pó)
Não degradado N.A. N.A. 985,863 995,789 998,739 999,841
Padrões
(CLAE gel)
Não degradado N.A. N.A. 940,909 997,222 993,903 992,518
NOTA: 1 – especiofilina; 2 – uncarina F; 3 – mitrafilina; 4 – isomitrafilina; 5 – pteropodina; 6 –
isopteropodina; N.A. – não aplicável;
*Os tratamentos de degradação para a tintura não foram realizados devido à semelhança da amostra
em relação às cascas.
Os valores apresentam bons resultados para pureza de pico em todas as
condições analisadas. As condições de degradação testadas conforme Shabir
(2003) reduziram os teores de pureza apenas para a amostra pó, no entanto os
teores podem ser considerados elevados, semelhantes até aos padrões analíticos.
As resoluções entre todos os picos ficaram acima de 1,5, critério utilizado pelo
mesmo autor para manter a confiabilidade analítica.
Nenhuma das condições de degradação realizada conduziu ao surgimento
de picos estranhos à amostra, indicando não terem sido formados compostos de
degradação. O fato pode apresentar duas explicações plausíveis: a capacidade dos
alcalóides permanecerem estáveis mesmo frente aos parâmetros utilizados ou as
condições testadas terem sido muito brandas para as amostras analisadas.
109
5.4.3 Condições cromatográficas das cascas e tintura
5.4.3.1 Linearidade com padrão
O teste de linearidade com padrão permite avaliar a concordância da
resposta do sistema cromatográfico frente a diferentes concentrações do analito de
interesse. O INMETRO (2007) denomina este ensaio como “escolha da faixa linear
de trabalho”, e estabelece que a concentração mais esperada da amostra deva,
sempre que possível, se situar no centro da faixa de trabalho.
Três curvas analíticas com concentrações semelhantes foram analisadas em
dias diferentes, total de 15 pontos. O coeficiente de correlação (r) apresentado na
FIGURA 40 é superior ao exigido pela ANVISA (0,99) (BRASIL, 2003).
FIGURA 40 – LINEARIDADE COM PADRÃO MITRAFILINA, MÉTODO CLAE CASCAS E TINTURA
Além disso, segundo Ribani e colaboradores (2004) um coeficiente de
correlação maior que 0,999 é considerado como evidência de um ajuste ideal dos
dados para a linha de regressão. Para esta análise o método apresentou resposta
linear na faixa de 8,32 a 208,00
µ
g.mL
-1
de mitrafilina.
y = 31,108x - 2,5938
R
2
= 0,9996
r = 0,9998
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
4000,00
5000,00
6000,00
7000,00
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
Concentração de mitrafilina (
µ
µµ
µ
g/mL)
Area (mAU.s)
110
5.4.3.2 Limite de detecção
Conforme descrito pelo ICH (2005) e Brasil (2003), a inclinação e o desvio
encontrado para uma curva analítica injetada foram utilizados na Equação 2, item
3.5.4, e encontrado o valor de 1,00
µ
g.mL
-1
de mitrafilina para LD.
Para confirmação desse valor a solução do padrão analítico foi diluída até a
concentração calculada e analisada. Esse ponto inserido na curva analítica anterior
forneceu novos valores de inclinação e desvio que inseridos na Equação 2 geraram
limite de 0,80
µ
g.mL
-1
de mitrafilina confirmando este valor como LD, FIGURA 41.
FIGURA 41 – CURVA ANALÍTICA PARA CÁLCULO DO LD PARA CASCAS E TINTURA
5.4.3.3 Limite de quantificação
Os resultados do desvio e inclinação da mesma curva analítica do item
anterior inseridos na Equação 3 geraram o valor de 2,90
µ
g.mL
-1
de mitrafilina para
LQ. A diluição do padrão até a concentração encontrada e posterior inclusão na
curva analítica confirmou o valor de 2,40
µ
g.mL
-1
de mitrafilina para LQ.
As sextuplicatas utilizadas na avaliação da precisão e exatidão no LQ para a
mitrafilina, apresentaram valores de DPR de 4,28 e 3,24% respectivamente para
cascas e tintura, resultados adequados comparados ao limite de 11% publicado para
a concentração testada (TAVERNIERS; LOOSE; BOCKSTELE, 2004).
y = 31,6547x + 1,0328
R
2
= 1,0000
r = 1,0000
0,0000
1000,0000
2000,0000
3000,0000
4000,0000
5000,0000
6000,0000
7000,0000
0,00 50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
Concentração de mitrafilina (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Area (mAU.s)
111
TABELA 17 – AVALIAÇÃO DO LQ PARA CASCAS E TINTURA
AMOSTRA ÁREA (mAU.s)
RESULTADO (µg.mL
-1
)
DPR (%)
RECUPERAÇÃO*
(%)
Cascas (n=6)
136,790 ± 5,915 4,07 ± 0,19
4,28 104,13
Tintura (n=6)
79,990 ± 2,510 2,81 ± 0,09
3,24 101,91
NOTA: *Calculada considerando o valor médio de 3,91 e 2,75 µg.mL
-1
para a mitrafilina, obtido na
avaliação da repetibilidade das cascas e tintura respectivamente.
As recuperações entre 101,91 e 104,13% estão contidas dentro do limite de
80 a 110% descrito por Huber (2001) como aceitável para as concentrações
avaliadas.
5.4.3.4 Robustez das condições cromatográficas CLAE para cascas e
tintura
Para este teste foram considerados os valores obtidos na planejamento
fatorial de experimentos do método CLAE. Segundo Chandran e Singh (2007) os
parâmetros avaliados na robustez podem ser analisados um fator por vez ou
simultaneamente como parte de um experimento fatorial.
Os gráficos de superfície de resposta já apresentados no item 5.2.1
permitem afirmar a robustez do método cromatográfico em manter resolução > 1,5,
entre os pares de picos problema isomitrafilina – pteropodina e uncarina F –
mitrafilina para pH de tampão entre 6,6 e 8,4 e temperatura da coluna entre 10 e 20
o
C. Além disso, é possível considerar o método robusto para o tipo de tampão
empregado, fosfato ou acetato.
O limite de 1,5 foi escolhido para atestar a robustez do método frente à
resolução dos picos, pois Ciola (1998) e Collins (2006) citam que resoluções acima
deste valor garantem separação completa entre os picos, boa integração e eficiência
na quantificação.
Amostras preparadas em triplicata foram analisadas em diferentes colunas
(item 4.9.7) para avaliar a interferência desse fator na análise.
Embora a coluna Hypersil tenha apresentado os piores valores de simetria
para os picos avaliados, a resolução entre os sinais não foi prejudicada
significativamente, logo foi possível a adequada integração de todos os picos. Todos
os resultados de teor não são significativamente diferentes quando avaliados pelo
112
teste-t com 95% de confiança. Na TABELA 18 são apresentados apenas os
resultados para os picos críticos mitrafilina e pteropodina.
TABELA 18 – RESULTADOS OBTIDOS COM AS DIFERENTES COLUNAS TESTADAS NA
AVALIAÇÃO DA ROBUSTEZ PARA CLAE DAS CASCAS E TINTURA
MITRAFILINA
1
PTEROPODINA
1
COLUNAS
(n=3)
TEOR DE
ALCALÓIDES (%)
1
RESOLUÇÃO
2
SIMETRIA
RESOLUÇÃO
3
SIMETRIA
Luna C-18 (2)
1,06 ± 0,01
3,04 0,87 3,04 0,87
Hipersil
1,06 ± 0,01
2,84 0,78 2,84 0,78
Zorbax Eclipse
XDB
1,05 ± 0,01
2,51 0,90 2,51 0,90
Zorbax Eclipse
XDB (controle)
1,05 ± 0,02
3,25 0,91 2,17 0,94
Nota:
1
Valores médios;
2
em relação ao pico da uncarina F;
3
em relação ao pico da isomitrafilina.
Os piores resultados encontrados para a coluna Hypersil para simetria são
explicados pela pior tecnologia na obtenção das partículas de sílica, demonstrado
pelo maior diâmetro médio de poro (120 Å), em relação às demais, item 4.9.7. Os
valores acima permitem atestar que a eficiência e seletividade do método foram
mantidas mesmo quando utilizadas as diferentes colunas, consequentemente o
método permaneceu robusto frente às colunas avaliadas.
5.4.4 Validação do método para cascas de U. tomentosa
5.4.4.1 Seletividade / especificidade
O gráfico obtido no método da adição de padrão para avaliação do efeito
matriz é apresentado na avaliação da exatidão da metodologia (item 5.4.4.5). O
valor de 30,44, obtido para o coeficiente angular da curva adicionada de padrão
apresenta pouco desvio, 1,08%, em relação ao coeficiente angular de 30,77, obtido
para a curva analítica. Segundo Ribani e colaboradores (2004) a similaridade dos
coeficientes angulares indica ausência de interferência da matriz na análise.
Os perfis de fragmentação e espectros de massa já apresentados (item
5.2.2) constituem evidência de que os sinais obtidos no cromatograma são
resultados de AO e não possuem interferentes co-eluindo.
113
5.4.4.2 Linearidade e intervalo
Embora não seja descrito em literatura, a avaliação da linearidade com a
amostra melhor representa o analito em seu ambiente químico. Em produtos de
origem vegetal os diferentes componentes da matriz podem causar interferências
que não são detectadas quando a avaliação se faz com o padrão analítico. Desta
forma, a linearidade acaba avaliando o método como um todo, processo de preparo
de amostra e cromatográfico.
Como se trata de material vegetal, portanto sem padronização, a escolha da
faixa de 50 a 150% da concentração visou abranger a maior variabilidade possível
do teor de alcalóides na planta, 105 a 315
µ
g de alcalóides em 1 mL de solução
injetada (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002). O gráfico plota o somatório da área
dos alcalóides (mAU.s) Vs concentração (
µ
g.mL
-1
), FIGURA 42.
O valor apresentado para o coeficiente de correlação é superior ao exigido
pela ANVISA (0,99), embora seja inferior ao citado como ideal pelo FDA (0,999).
(FDA, 2001; BRASIL, 2003). No entanto, segundo Pimentel e Neto (1996) a
linearidade não deve ser avaliada apenas pelo coeficiente de correlação, a análise
do gráfico de resíduos segundo esses autores é de suma importância para predizer
tendências no método.
FIGURA 42 – LINEARIDADE – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE U. tomentosa
O teste de resíduos conforme descrito por Taverniers, Loose e Bockstaele
(2004), representa a diferença entre os valores de y encontrados e os preditos pela
y = 30,333x + 297,97
R
2
= 0,9959
r = 0,9979
0,000
2000,000
4000,000
6000,000
8000,000
10000,000
12000,000
80,00
130,00
180,00
230,00 280,00
330,00
Concentração de alcalóides injetada (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Area (mAU.s)
114
equação de regressão gerada. Se os valores de resíduos são randomicamente
distribuídos, a linearidade é confirmada.
O gráfico de resíduos gerado com os dados da linearidade demonstrou
valores randomicamente dispersos ao longo do eixo y, comprovando assim a
linearidade do método, FIGURA 43.
É preciso considerar que todas as concentrações de cada alcalóide
separadamente estão contidas na faixa apresentada no item 5.4.3.1. Apenas pelo
somatório dessas concentrações, FIGURA 42, é observada a extrapolação da faixa
da curva analítica.
FIGURA 43 – DISPERSÃO DOS RESÍDUOS – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE U. tomentosa
5.4.4.3 Repetibilidade
O teste de precisão intra-dia, avaliado com seis amostras na mesma
concentração apresentou os resultados da TABELA 19.
TABELA 19 – REPETIBILIDADE – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE U. tomentosa
REPLICATA
ÁREA (mAU.s)
RESULTADO CROMATOGRAMA
(µg.mL
-1
)
TEOR DE AOP NAS
CASCAS (%)
1 6705,031 211,62 1,05
2 6843,541 215,99 1,07
3 6664,292 210,33 1,04
4 6790,553 214,32 1,07
5 6808,684 214,89 1,07
6 6891,933 217,52 1,09
Média N.A. N.A. 1,07
DP N.A. N.A. 0,02
DPR (%) N.A. N.A. 1,45
NOTA: DP – desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo; N.A. – não aplicável
-500
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
0
50 100
150
200
250
300
350
Concentração de alcalóides injetada (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Resíduos
115
Além da confirmação da repetibilidade com amostras a 100% da
concentração teórica do teste, a avaliação em triplicata para cada concentração no
teste de linearidade, item 5.4.4.2, permitiu a confirmação da repetibilidade também
nas concentrações 50 e 150%. Para a concentração 50% o valor de DPR para a
triplicata analisada foi de 0,68%, já a triplicata da concentração 150% apresentou
DPR de 2,56% em relação à somatória das áreas dos alcalóides.
Os resultados confirmam o valor de DPR abaixo do limite estabelecido pela
ANVISA como 5% (BRASIL, 2003). Os valores encontrados também são inferiores
ao limite mais restritivo de 2,7% citado por Huber (2001).
5.4.4.4 Precisão intermediária
A precisão intermediária foi avaliada com os resultados das análises de dois
analistas diferentes em dias diferentes e utilização do mesmo equipamento.
A TABELA 20 contém valor de DPR inferior a 5%, limite estabelecido pela
ANVISA para o teste.
TABELA 20 – PRECISÃO INTERMEDIÁRIA – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE U. tomentosa
REPLICATA ÁREA (mAU.s)
RESULTADO CROMATOGRAMA
(µg.mL
-1
)
TEOR DE AOP NAS
CASCAS (%)
1 6705,031 211,62 1,05
2 6843,541 215,99 1,07
3 6664,292 210,33 1,04
4 6790,553 214,32 1,07
5 6808,684 214,89 1,07
6 6891,933 217,52 1,09
7 6736,296 210,33 1,05
8 6490,829 209,17 1,05
9 6587,630 204,57 1,02
10 6537,390 203,01 1,02
11 6506,613 202,03 1,01
12 6678,289 207,46 1,04
Média N.A. N.A. 1,05
DP N.A. N.A. 0,02
DPR (%) N.A. N.A. 2,29
NOTA: DP – desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo; N.A. – não aplicável
116
5.4.4.5 Exatidão
A indisponibilidade de obtenção da matriz, cascas de U. tomentosa, sem os
analitos de interesse, AO, levou à necessidade de executar o teste de exatidão pelo
procedimento da adição de padrão à amostra.
Conforme já explicado, item 4.9.6, as amostras sofreram adições de padrão
segundo TABELA 21.
TABELA 21 – DADOS PARA O TESTE DA ADIÇÃO DE PADRÃO À AMOSTRA CASCAS DE U.
tomentosa
PADRÃO AMOSTRA + PADRÃO
PONTO
CONCENTRAÇÃO DE
MITRAFILINA (µg.mL
-1
)
ÁREA (mAU.s)
CONCENTRAÇÃO DE
MITRAFILINA
ADICIONADA (µg.mL
-1
)
ÁREA (mAU.s)
1 7,92 238,338 0,00 2371,237
2 19,80 598,632 19,20 2975,555
3 39,60 1204,806 38,50 3576,248
4 79,20 2433,933 57,80 4153,534
5 198,10 6085,422 77,00 4713,653
Com os dados acima foram construídas as curvas pela correlação da
Concentração de mitrafilina (
µ
g.mL
-1
) Vs Área (mAU.s).
FIGURA 44 – AVALIAÇÃO DO EFEITO MATRIZ – VALIDAÇÃO DAS CASCAS DE U. tomentosa
LEGENDA: Azul – curva amostra + padrão; Verde – curva analítica
Como para a curva da amostra + padrão foram computadas apenas as
concentrações adicionadas de mitrafilina, pode-se considerar que o ponto onde a
y = 30,440x + 2386,1
R
2
= 0,9997
r = 0,9998
y = 30,766x - 8,3097
R
2
= 1,0000
r = 1,0000
100,00
2100,00
4100,00
6100,00
0,00
50,00
150,00
200,00
250,00
Concentração de mitrafilina (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Área (mAu.s)
2386,10
77,83
100,00
117
reta corta o eixo das ordenadas (ponto 1) corresponde à área do pico da mitrafilina
que está sendo determinada, sem qualquer adição de padrão (indicada em
vermelho). Assim, a extrapolação desse valor para a reta da curva analítica define,
no eixo das abscissas, a concentração da substância na amostra analisada, como
indicado na FIGURA 44.
Em termos matemáticos a inserção de 2386,1 mAU.s de área na equação da
reta da curva analítica e posterior considerações das diluições efetuadas e tomada
de amostra (200 mg), fornece o valor real da concentração de mitrafilina na amostra.
Equação da reta da curva padrão: y = 30,766x – 8,3097
2386,1 = 30,766x – 8,3097
X = 77,83
µ
g.mL
-1
∴
77,83
µ
g / 200 mg = 0,39% de mitrafilina nas cascas
O valor de 0,39% foi considerado o valor verdadeiro para a concentração de
mitrafilina na amostra. A tomada de amostra das cascas como explicado no item
4.9.6, permitiu avaliar a recuperação nas concentrações 50, 100 e 150%, TABELA
22.
TABELA 22 – EXATIDÃO – VALORES DE RECUPERAÇÃO PARA OS AO DAS CASCAS DE U.
tomentosa
NÍVEL (%)
CONCENTRAÇÃO
ESPERADA DE
MITRAFILINA (%)
ÁREA (mAU.s)
CONCENTRAÇÃO
OBTIDA DE
MITRAFILINA (%)
RECUPERAÇÃO
MÉDIA ± DP (%)
1241,828 0,197
1243,515 0,197
50 0,20
1253,912 0,197
98,43 ± 0,07
2421,887 0,381
2430,098 0,383 100 0,39
2458,874 0,387
98,37 ± 0,87
3621,649 0,569
3492,593 0,549 150 0,58
3605,964 0,567
98,89 ± 1,90
Os valores de recuperação apresentados estão dentro da faixa de 95 –
105% citada por Huber (2001) como aceitável para as concentrações analisadas.
Como a mitrafilina é um alcalóide de polaridade intermediária em relação
aos demais AO, os valores obtidos de recuperação para essa molécula podem ser
melhor extrapolados para os demais alcalóides. Além disso, a USP XXXI (2008) e o
118
ICH (2005) estabelecem que a exatidão possa ser inferida uma vez que a precisão,
linearidade e especificidade tenham sido demonstradas.
5.4.4.6 Robustez
Além dos testes já apresentados para avaliação do método CLAE, foi
verificada a estabilidade das soluções da amostra após um e dois dias de preparo. A
comparação foi efetuada em relação aos valores dos teores de AO (%) obtidos da
análise realizada no dia do preparo das amostras, a execução do teste-t com 95%
de confiança não apresentou diferenças significativas entre as médias dos
resultados.
Os resultados do planejamento fatorial de experimentos, item 5.3.1,
permitem apresentar a robustez do preparo de amostra, considerando teores >
1,00% de AO, para tempos de extração de 20 a 30 min, concentrações de etanol de
55 a 70% em água, temperatura de extração ente 30 e 45
o
C e granulometria das
cascas menores que 80 mesh.
5.4.5 Validação do método para tintura
5.4.5.1 Seletividade / especificidade
As curvas obtidas para padrão e amostra + padrão estão apresentadas no
teste da exatidão, item 5.4.5.5.
Foi encontrado coeficiente angular de 30,89 para a curva analítica e 31,12
para a curva da amostra adicionada de padrão, correspondendo a um desvio de
0,72% de uma em relação à outra. Esse resultado permite confirmar a relação
paralela entre as duas curvas, e admitir como inexistente a interferência da matriz na
análise.
119
5.4.5.2 Linearidade e intervalo
A avaliação foi realizada com tomadas de amostra proporcionais da tintura
de maneira a perfazer as concentrações 80, 90, 100, 110 e 120% de AO presentes
na amostra, conforme descrito no item 4.9.2.
Os resultados da análise em triplicata de cada concentração foram plotados
em gráfico Concentração de alcalóides injetada (
µ
g.mL
-1
) Vs Área dos picos
(mAU.s), FIGURA 45.
O coeficiente de correlação obtido, r = 0,9989, é superior ao exigido pela
ANVISA (0,99) e inferior ao exigido pelo FDA (0,999), embora esteja muito próximo a
esse último. É de se considerar que o valor de r foi obtido com a análise de uma
forma extrativa de planta, matriz muito mais complexa do que as soluções de
padrões analíticos geralmente empregadas para execução destes testes (FDA,
2001; BRASIL, 2003).
Como a análise dos resíduos apresentou pontos aleatoriamente dispersos,
FIGURA 46, é possível confirmar a capacidade do método em apresentar resultados
lineares na faixa de 220 a 332
µ
g de AO / mL da solução injetada.
FIGURA 45 – LINEARIDADE – VALIDAÇÃO DA TINTURA
y = 31,823x - 241,3
R
2
= 0,9979
r = 0,9989
5000,000
7000,000
9000,000
11000,000
200,00
250,00 300,00
350,00
Concentração de alcalóides injetada (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Area (mAU.s)
120
FIGURA 46 – DISPERSÃO DOS RESÍDUOS – VALIDAÇÃO DA TINTURA
5.4.5.3 Repetibilidade
O DPR de 0,66%, obtido do ensaio de seis amostras a 100% da
concentração para teste da repetibilidade, permite afirmar que o resultado é inferior
ao limite estabelecido de 5% para a concentração avaliada segundo os documentos
consultados, TABELA 23 (HUBER, 2001, BRASIL, 2003).
TABELA 23 – REPETIBILIDADE – VALIDAÇÃO DA TINTURA
REPLICATA ÁREA (mAU.s)
RESULTADO
CROMATOGRAMA (µg.mL
-1
)
TEOR DE AOP NA
TINTURA (µg.mL
-1
)
1 8585,211 279,30 698,25
2 8499,722 276,49 691,23
3 8604,825 279,89 699,74
4 8538,940 277,76 694,40
5 8471,737 275,58 688,96
6 8476,873 275,75 689,38
Média N.A. N.A.
693,66
DP N.A. N.A.
4,58
DPR (%) N.A. N.A.
0,66
NOTA: DP – desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo; N.A. – não aplicável
Mais uma vez, o teste de linearidade, item 5.4.5.2, permitiu comprovar a
precisão nos níveis extremos de concentração 80 e 120%. Para a concentração 80%
o valor de DPR na triplicata analisada foi de 0,71%, já a triplicata da concentração
120% apresentou DPR de 1,07% em relação à somatória das áreas dos alcalóides.
-100
-50
0
50
100
150
200
150,00 200,00
250,00
300,00
350,00
Concentração de alcalóides injetada (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Res
íduos
121
5.4.5.4 Precisão intermediária
O teste realizado em dias e por analistas diferentes, forneceu DPR de 0,93%
confirmando a precisão da metodologia.
TABELA 24 – PRECISÃO INTERMEDIÁRIA – VALIDAÇÃO DA TINTURA
REPLICATA ÁREA (mAU.s)
RESULTADO
CROMATOGRAMA (µg.mL
-1
)
TEOR DE AOP NA
TINTURA (µg.mL
-1
)
1 8585,211 279,30 698,25
2 8499,722 276,49 691,23
3 8604,825 279,89 699,74
4 8538,940 277,76 694,40
5 8471,737 275,58 688,96
6 8476,873 275,75 689,38
7 8305,273 270,19 675,48
8 8473,685 275,65 689,12
9 8526,349 277,35 693,38
10 8443,292 274,66 686,66
11 8459,513 275,19 687,97
12 8412,295 273,66 684,15
Média N.A. N.A. 689,88
DP N.A. N.A. 6,44
DPR (%) N.A. N.A. 0,93
NOTA: DP – desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo; N.A. – não aplicável
5.4.5.5 Exatidão
Assim como para as cascas, é impossível se obter a matriz isenta de AO
para a tintura de U. tomentosa. Portanto, foi utilizado o método de adição de padrão
à amostra para teste da exatidão.
Como a mitrafilina é um alcalóide de média polaridade em relação aos
demais AO, seu comportamento no método CLAE pode, com maior segurança, ser
estendido para confirmação da recuperação dos AO presentes na amostra.
Os dados para construção das curvas, conforme apresentado no item 4.9.6,
encontram-se na TABELA 25.
122
TABELA 25 – DADOS PARA O TESTE DA ADIÇÃO DE PADRÃO À AMOSTRA TINTURA
PADRÃO AMOSTRA + PADRÃO
PONTO
CONCENTRAÇÃO DE
MITRAFILINA (µg.mL
-1
)
ÁREA (mAU.s)
CONCENTRAÇÃO DE
MITRAFILINA
ADICIONADA (µg.mL
-1
)
ÁREA (mAU.s)
1 8,16 238,293 0 1817,501
2 20,40 610,505 20,40 2491,867
3 40,80 1251,640 40,80 3101,458
4 81,60 2537,048 81,60 4406,845
5 204,00 6285,140 122,40 5626,736
Com os resultados das análises cromatográficas, apresentados acima, foram
construídas as curvas analítica e da amostra + padrão através da correlação da
Concentração de mitrafilina (
µ
g.mL
-1
) Vs Área (mAU.s), FIGURA 47.
FIGURA 47 – AVALIAÇÃO DO EFEITO MATRIZ – VALIDAÇÃO DA TINTURA
LEGENDA: Azul – curva amostra + padrão; Verde – curva analítica
Conforme já exposto, item 5.4.4.5, o ponto da reta da amostra + padrão que
corta o eixo das ordenadas (ponto 1) corresponde à área do pico da Mitrafilina que
está sendo determinada, sem qualquer adição de padrão (indicada em vermelho).
Pela extrapolação desse valor para a reta da curva analítica foi encontrado, no eixo
das abscissas, o valor de 59,11
µ
g.mL
-1
para a concentração de mitrafilina injetada.
Considerando as diluições efetuadas a quantidade de mitrafilina presente na tintura
é de 148,00
µ
g.mL
-1
.
O valor de 148,00
µ
g.mL
-1
foi considerado o valor esperado para o nível
100% no cálculo da recuperação. A tomada de amostra da tintura como explicado no
item 4.9.6, permitiu avaliar a recuperação nas concentrações 80, 100 e 120%. A
y = 31,117x + 1838,4
R
2
= 0,9998
r = 0,9999
y = 30,8944x - 8,7314
R
2
= 1,0000
r = 1,0000
0,00
1500,00
3000,00
4500,00
6000,00
7500,00
0
50
100
150
200
250
Concentração de mitrafilina (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Area (mAU.s)
59,11
1817,50
123
faixa de 80 a 120% foi escolhida em conformidade com ANVISA, ICH e USP XXXI,
por se tratar de amostra possível de ser padronizada. (BRASIL, 2003; ICH, 2005;
USP, 2008).
TABELA 26 – EXATIDÃO – VALORES DE RECUPERAÇÃO PARA OS AO DA TINTURA
NÍVEL (%)
CONCENTRAÇÃO
ESPERADA DE
MITRAFILINA
(µg.mL
-1
)
ÁREA (mAU.s)
CONCENTRAÇÃO
OBTIDA DE
MITRAFILINA
(µg.mL
-1
)
RECUPERAÇÃO
MÉDIA ± DP (%)
1456,319 118,419
1447,860 117,734
80 118,00
1465,766 119,184
100,38 ± 0,61
1890,359 153,561
1889,761 153,513
100 148,00
1819,261 147,805
102,45 ± 2,24
2194,707 178,204
2189,088 177,749 120 177,00
2227,544 180,862
101,09 ± 0,95
Os valores de recuperação apresentados, TABELA 26, estão dentro da faixa
de 90 – 107% apresentada por Huber (2001) como aceitável para as concentrações
analisadas.
5.4.6 Validação do método para o gel
5.4.6.1 Seletividade / especificidade
Frente à possibilidade de se obter a matriz na ausência dos analitos de
interesse, foi avaliada a possível existência de interferentes provenientes desta na
detecção e quantificação dos alcalóides. Assim, a análise do placebo foi confrontada
a uma amostra, FIGURA 48, para observar co-eluição nos tempos de retenção dos
alcalóides.
124
FIGURA 48 – SOBREPOSIÇÃO DOS CROMATOGRAMAS DO PLACEBO E AMOSTRA GEL
LEGENDA: Pontilhado – amostra; Vermelho – placebo
A inexistência de interferentes no cromatograma do placebo em tempos de
retenção dos AOP, associado aos testes já descritos de comparação dos perfis
espectrais e avaliação de pureza de pico, itens 5.4.1 e 5.4.2, comprova a
especificidade/seletividade do método.
5.4.6.2 Linearidade e intervalo
Para verificar a possibilidade de empregar a mesma faixa linear de trabalho
utilizada no método CLAE das cascas e tintura, foram avaliadas as respostas de três
curvas analíticas de mitrafilina na faixa de 8,0 a 210,0
µ
g.mL
-1
. O resultado obtido
apresentou coeficiente de correlação de 0,9997, superior ao exigido pela ANVISA
(0,99), FIGURA 49 (BRASIL, 2003). O método apresentou linearidade na faixa de
concentração da mitrafilina de 8,29 a 207,31
µ
g.mL
-1
.
FIGURA 49 – FAIXA LINEAR DE TRABALHO OBTIDA PARA O MÉTODO GEL
min
27.5 30
32.5
35
37.5 40 42.5 45
mAU
0
5
10
15
20
25
30
DAD1 A, Sig=245,16
27.500
28.457
36.703
37.924
37.924
32.368
y = 30,938x + 3,1031
R
2
= 0,9995
r = 0,9997
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
4000,00
5000,00
6000,00
7000,00
0 50
100
150
200
250
Concentração de mitrafilina (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Área (mAU.s)
125
Já a linearidade foi obtida com amostras preparadas de maneira a simular as
concentrações contidas no intervalo de 80 a 120% para o teor de AOP no gel. O
gráfico obtido pela correlação da Concentração de alcalóides injetada (
µ
g.mL
-1
) Vs
Área dos picos (mAU.s), apresentou r = 0,9927, FIGURA 50.
FIGURA 50 – LINEARIDADE – VALIDAÇÃO DO GEL
Mais uma vez, o coeficiente de correlação é superior ao exigido pela
ANVISA (0,99) e inferior ao exigido pelo FDA (0,999) (FDA, 2001; BRASIL, 2003).
No entanto, conforme Pimentel e Neto (1996), a avaliação do coeficiente de
correlação deve ser sucedida pela elaboração e avaliação do gráfico de resíduos, se
este apresentar pontos aleatoriamente dispersos, existe forte evidência da
adequabilidade do modelo proposto.
FIGURA 51 – DISPERSÃO DOS RESÍDUOS – VALIDAÇÃO DO GEL
y = 31,561x - 198,7
R
2
= 0,9855
r = 0,9927
1500,0000
2000,0000
2500,0000
3000,0000
3500,0000
65 75
85
95 105
115
125
Concentração de alcalóides injetada (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Área (mAU. s)
-100
-50
0
50
100
150
50
60
70 80
90
100 110
120
Concentração de alcalóides injetada (
µ
µµ
µ
g.mL
-
1
)
Resíduos
126
O gráfico de resíduos, FIGURA 51, apresentou pontos aleatoriamente
dispersos, portanto é possível confirmar a capacidade do método em fornecer
resultados lineares na faixa de 68,87 a 105,00
µ
g de AOP / mL de solução injetada,
o que corresponde a 30,21 a 45,43
µ
g de AOP / g de amostra.
5.4.6.3 Repetibilidade
A avaliação da repetibilidade a 100% da concentração esperada para AOP
na amostra apresentou os resultados da TABELA 27.
TABELA 27 – REPETIBILIDADE – VALIDAÇÃO DO GEL
REPLICATA ÁREA (mAU.s)
RESULTADO
CROMATOGRAMA (µg.mL
-1
)
TEOR DE AOP NO
GEL (µg.g
-1
)
1 2334,756 77,39 33,94
2 2328,678 77,20 33,71
3 2327,195 77,15 33,82
4 2345,546 77,74 33,96
5 2397,314 79,40 34,90
6 2380,448 78,86 34,63
Média N.A. N.A. 34,16
DP N.A. N.A. 0,48
DPR (%) N.A. N.A. 1,42
NOTA: DP – desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo; N.A. – não aplicável
O valor encontrado para o DPR (1,42%) é inferior aos valores aceitos pela
ANVISA (5%) e Huber (7,3%) nas concentrações analisadas (HUBER, 2001;
BRASIL, 2003).
As triplicatas analisadas para as concentrações 80 e 120% do teste de
linearidade, item 5.4.6.2, permitiram comprovar a repetibilidade do método também
em presença de maiores ou menores quantidades de alcalóides. Para a
concentração 80% o DPR entre a somatória das áreas dos alcalóides na triplicata foi
de 0,45%, já para a concentração 120% o DPR foi de 1,64% (BRASIL, 2004; ICH,
2005; USP, 2008).
5.4.6.4 Precisão intermediária
Os dados obtidos para a precisão intermediária, avaliada em dias diferentes
por analistas diferentes, apresentaram DPR de 1,96%, confirmando a precisão da
metodologia analítica desenvolvida.
127
TABELA 28 – PRECISÃO INTERMEDIÁRIA – VALIDAÇÃO DO GEL
REPLICATA ÁREA (mAU.s)
RESULTADO
CROMATOGRAMA (µg.mL
-1
)
TEOR DE AOP NO
GEL (µg.g
-1
)
1 2334,756 77,39 33,94
2 2328,678 77,20 33,71
3 2327,195 77,15 33,82
4 2345,546 77,74 33,96
5 2397,314 79,40 34,90
6 2380,448 78,86 34,63
7 2407,591 75,92 33,30
8 2394,363 75,50 33,13
9 2533,330 79,90 34,89
10 2539,747 80,12 35,08
11 2516,014 79,40 34,66
12 2511,963 79,24 34,80
Média N.A. N.A. 34,24
DP N.A. N.A. 0,67
DPR (%) N.A. N.A. 1,96
NOTA: DP – desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo; N.A. – não aplicável
5.4.6.5 Limite de detecção
A inserção do desvio padrão e coeficiente de angular da curva analítica na
Equação 2, item 3.5.4, forneceu o valor de 1,68
µ
g.mL
-1
como LD para mitrafilina. A
confirmação foi realizada pela diluição da solução padrão até esta concentração,
análise e inclusão na curva analítica, FIGURA 52, os novos valores de coeficiente
angular e desvio padrão forneceram valor de 1,41
µ
g.mL
-1
para LD do alcalóide.
FIGURA 52 – CURVA ANALÍTICA PARA CÁLCULO DO LD DO GEL
y = 30,6633x + 5,0001
R
2
= 1,0000
0,000
1000,000
2000,000
3000,000
4000,000
5000,000
6000,000
7000,000
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
Concentração de mitrafilina (µg.mL
-
1
)
Area (mAU.s)
128
5.4.6.6 Limite de quantificação
Os mesmos resultados do item anterior, quando inseridos na Equação 3,
item 3.5.4, geraram o valor de 5,10
µ
g.mL
-1
de mitrafilina para LQ. A diluição do
padrão até a concentração encontrada e posterior inclusão na curva analítica
confirmou o valor de 4,27
µ
g.mL
-1
de mitrafilina para LQ.
As sextuplicatas utilizadas para avaliação da precisão e exatidão no nível do
LQ, apresentaram 2,13% de DPR e 82,35% de recuperação para área média de
141,404
±
3,118 mAU.s com resultado médio de 4,36
±
0,09
µ
g.mL
-1
. A recuperação
foi calculada considerando o valor de médio 5,30
µ
g.mL
-1
para a mitrafilina obtido na
avaliação da repetibilidade.
Os valores acima estão dentro dos limites previamente descritos por Huber
(2001) como 11% para precisão e 80 a 110% para exatidão na concentração
avaliada.
5.4.6.7 Exatidão
Foi utilizada solução de mitrafilina na concentração de 393,00
µ
g.mL
-1
para
contaminar o placebo, perfazendo as concentrações 80, 100 e 120% de AOP
esperadas na amostra, TABELA 29.
A mitrafilina foi escolhida por ser o alcalóide de média polaridade em relação
aos AO presentes em U. tomentosa e assim a observação de seu comportamento
no preparo de amostra pode ser mais fidedignamente extrapolado para os demais
alcalóides.
TABELA 29 – EXATIDÃO – VALORES DE RECUPERAÇÃO PARA OS AO DO GEL
NÍVEL
(%)
MITRAFILINA
ADICIONADA (µg)
TEOR
ESPERADO
(µg.g
-1
)
ÁREA
(mAU.s)
TEOR OBTIDO
(µg.g
-1
)
RECUPERAÇÃO
MÉDIA ± DP (%)
2071,781 28,82
2150,958 29,92
80 149,34 29,87
2140,462 29,77
98,78 ± 2,01
2637,948 36,70
2660,995 37,02
100 184,71 36,94
2685,428 37,36
100,23 ± 0,89
3228,392 44,91
3211,007 44,67 120 220,08 44,02
3225,362 44,87
101,82 ± 0,29
129
Os resultados obtidos estão contidos dentro da faixa de recuperação de 80 a
110%, estabelecida como aceitável por Huber (2001) para as concentrações
testadas.
5.4.6.8 Robustez
A análise de variância, limite de aceitação de 0,05%, não indicou diferença
significativa dos resultados obtidos para o teor de alcalóides (
µ
g.g
-1
) das amostras
em condições alteradas em relação as amostras controle.
Assim, são atestadas as possibilidades de eluição da amostra após um dia
do seu empacotamento na coluna, o uso de 2,5 g de OALN na base da coluna, a
estabilidade da amostra após um dia de preparo e emprego de colunas de outros
fabricantes ou tamanhos de partículas diferentes para análise cromatográfica
(QUADRO 9, item 4.9.7). Na TABELA 30 são apresentados apenas os resultados
para os picos críticos uncarina F e pteropodina para as diferentes colunas avaliadas.
TABELA 30 – RESULTADOS OBTIDOS COM AS DIFERENTES COLUNAS TESTADAS NA
AVALIAÇÃO DA ROBUSTEZ PARA CLAE DO GEL
UNCARINA F
1
PTEROPODINA
1
COLUNAS
(n=3)
TEOR DE
ALCALÓIDES
(µg.g
-1
)
1
RESOLUÇÃO
2
SIMETRIA
RESOLUÇÃO
2
SIMETRIA
Luna C-18 (2)
34,31 ± 0,56
1,56 0,79 1,76 0,91
Hipersil
34,99 ± 1,03
1,43 0,80 1,74 0,83
Zorbax Eclipse
XDB
35,41 ± 0,84
1,63 0,96 2,16 0,99
Zorbax Eclipse
XDB (controle)
35,17 ± 1,35
1,99 1,04 2,09 1,07
Nota:
1
Valores médios;
2
em relação ao pico da especiofilina;
3
em relação ao pico da isomitrafilina.
130
6
CONCLUSÃO
O padrão analítico mitrafilina foi caracterizado com resultados semelhantes
aos previamente descritos em literatura. A pureza determinada de 98,25% permite
sua utilização como padrão externo em análises quantitativas de Uncaria tomentosa.
O método CLAE otimizado mostrou ser adequado para a quantificação de
alcalóides oxindólicos em amostras de U. tomentosa. Os valores encontrados na
validação demonstram adequabilidade do método com boa especificidade /
seletividade, linearidade com r >0,998, exatidão próxima a 99%, precisão com DPR
inferior a 5%. O tampão orgânico desenvolvido permite separação cromatográfica
semelhante ao comumente empregado tampão fosfato, com a vantagem de
aumentar o tempo de vida da coluna e reduzir o tempo da análise cromatográfica.
Os resultados obtidos com a curva analítica da mitrafilina demonstraram
serem mais próximos ao valor real para alcalóides oxindólicos na planta. A
padronização em isopteropodina, amplamente utilizada na Europa e Estados Unidos
da América, apresentou resultados superiores aos considerados verdadeiros,
superestimando a resposta. O presente trabalho sugere a adoção da padronização
da planta frente ao alcalóide mitrafilina ou pelo menos sua inclusão junto à
isopteropodina para construção da curva analítica. Dessa forma, os alcalóides da
série R (mitrafilina, uncarina F, pteropodina e rincofilina) podem ser calculados em
função da curva analítica da mitrafilina, e os alcalóides da série S (especiofilina,
isomitrafilina, isopteropodina e isorincofilina) calculados frente à curva analítica da
isopteropodina.
O planejamento fatorial de experimentos executado para otimização do
método cromatográfico das cascas e tintura e para o preparo de amostra cascas
permitiu construir mapas de todo o domínio experimental proposto e selecionar em
cada caso os melhores parâmetros para os métodos.
As análises de espectrometria de massas da planta brasileira e peruana
indicaram picos de alcalóides oxindólicos pentacíclicos não descritos em literatura
para a espécie Uncaria tomentosa. São necessários estudos posteriores para
confirmar a identidade das substâncias detectadas.
Finalmente o trabalho permitiu o desenvolvimento do método de dispersão
de matriz em fase sólida para o preparo de amostra de um produto farmacêutico
com concentração dos seus marcadores na ordem de ppm. Esse emprego para a
131
técnica ainda não é citado em literatura, constituindo grande campo de aplicação
para sanar dificuldades encontradas pelos laboratórios de controle de qualidade na
análise de analitos em baixa concentração inseridos em uma matriz complexa.
O método desenvolvido permite a análise dos AOP no gel de maneira
confiável, demonstrado pelos resultados da validação que comprovam sua
seletividade / especificidade, linearidade (r > 0,99), precisão (DPR < 2%), exatidão
(recuperação próxima a 100%) e robustez.
132
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140
ANEXOS
ANEXO 1 - IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DA PLANTA BRASILEIRA -
Uncaria tomentosa, DC.
141
ANEXO 2 - IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DA PLANTA PERUANA - Uncaria
tomentosa, DC.
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