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Simone Milani Brandão
ANÁLISE DA BIOCOMPATIBILIDADE DE CONES DE
BIOVIDRO E BIOVITROCERÂMICO EM CAVIDADE
EVISCERADA DE COELHO
Orientadora: Prof
a
. Dra Silvana A. Schellini
Botucatu
2010
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Simone Milani Brandão
ANÁLISE DA BIOCOMPATIBILIDADE DE CONES DE
BIOVIDRO E BIOVITROCERÂMICO EM CAVIDADE
EVISCERADA DE COELHO
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina, Universidade Estadual Paulista
“Julio de Mesquita Filho”, Campus de
Botucat, para obtenção do título de Mestre em
Bases Gerais da Cirurgia
Orientadora: Prof
a
. Dra Silvana A. Schellini
Botucatu
2010
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Brandão, Simone Milani.
Análise da biocompatibilidade de cones de biovidro e biovitrocerâmico em
cavidade eviscerada de coelho / Simone Milani Brandão. – Botucatu, 2010.
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universida-
de Estadual Paulista, 2010
Orientadora: Silvana A. Schellini
Assunto CAPES: 40101177
1. Olhos - Cirurgia - Estudos experimentais 2. Biocompatibilidade
3. Biovidro
Palavras-chave: Biomaterial; Biocompatibilidade; Biovitrocerâmico;
Cavidade oftálmica; Cone; Evisceração
Dedicatória
DEDICATÓRIA
Dedico aos meus pais Dorival e Jaciara Milani que sempre me apoiaram e acreditaram
em mim. Os dois sempre foram um exemplo de vida e inspiração para querer atuar na
área de ensino e pesquisa, por isso a conquista também é deles.
Ao Gustavo Brandão, amor da minha vida, que me levou ao mestrado em Botucatu e
sempre esteve ao meu lado, me apoiando, me incentivando e compreendendo todos os
momentos desta jornada.
Aos meus irmãos Maurício e Francine Milani pelo amor e carinho sempre dispensados.
Agradeço também a troca de experiências que tivemos nestes anos, mesmo a distância,
sempre ajudando no meu crescimento.
À minha Orientadora Dra Silvana Artioli Schellini que acreditou em mim e me ensinou
muito, mas não só medicina, mas sobre a vida - é um exemplo de mulher, professora e
médica.
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
A Deus por tudo que conquistei e o que sou hoje.
À minha mãe que me ajudou muito, me acompanhando muitas vezes nas longas viagens
a Botucatu e também trabalhando ativamente para tornar possível o experimento.
Agradeço muito por não ter medido esforços durante toda a vida e neste momento
também.
À Flávia por todo tempo dedicado a mim e a este experimento. Muito obrigada.
À FAPESP pela concessão de Auxílio à Pesquisa – Processo:2008/08058-0.
Ao Professor Dr. Carlos Roberto Padovani pelo auxílio na avaliação estatística do
experimento.
Ao Professor Dr. Edgar Zanoto que me atendeu e norteou para que esta pesquisa fosse
possível.
Ao Professor Oscar Peitl que tornou possível o experimento com a confecção das
próteses estudadas e a atenção dispendida durante todo este tempo.
Aos funcionários da Cirurgia experimental, Marta e Carlos, pelo tempo dedicado a
minha pesquisa e o cuidado no manejo do experimento.
Agradecimentos
Aos funcionários dos Laboratórios Experimentais Florian e Vitor que confeccionaram
as lâminas de histologia e me ajudaram a tomar decisões importantes para o estudo.
À funcionária Mara que me ajudou na preparação do sangue para análise dos exames
bioquímicos.
À Professora Regina Kiomi Takahira da Veterinária e seus funcionários que fizeram os
exames bioquímicos.
Ao Professor Dr. Luiz Carlos Vulcano, Diretor da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da UNESP que disponibilizou a Tomografia Computadorizada do seu serviço
e me ensinou sobre o exame.
Ao funcionário Heraldo da Tomografia pelo maravilhoso trabalho com as imagens e a
paciência comigo e os meus coelhos.
À Professora Vânia Mari de Vascncelos Machado da Veterinária pela atenção
disponibilizada nos dias dos exames.
Aos residentes da Patologia Veterinária pelo atendimento a um dos meus coelhos:
obrigada pela atenção e os cuidados.
Ao Silvinho que fez as maravilhosas fotografias, durante todo o experimento, que
constam nesta dissertação.
Agradecimentos
Às enfermeiras Márcia Tonin e Susy, responsáveis pela esterilização do material do
estudo.
Ao Professor José Carlos Georgete que confiou em mim e me deixou a vontade em seu
laboratório para análise das imagens.
À Professora Elenize Jamas Pereira e a Fernanda pela ajuda no exame morfométrico.
À Professora Noemi Sousa Rocha pelos ensinamentos sobre Patologia.
À Professora Claúdia Helen Pellizzon pela sua contribuição na parte histológica.
Ao Nivalde Basso, funcionário do Instituto de Biociências pelo auxílio na parte de
Microscopia Eletrônica de Varredura para uso neste trabalho.
À funcionária Claudete, funcionária do Instituto de Biociências, pela confecção do
material para análise na Microscopia Eletrônica Varredura.
Ao Pós Graduando Ronaldo pela paciência e os ensinamentos para a leitura do material
na Microscopia Eletrônica de Varredura.
À professora Daniela, chefe do Laboratório de Microscopia Eletrônica, pela ajuda na
leitura do material.
À Funcionária Niva do Serviço de Biblioteca do Campus de Botucatu, pela ajuda no
levantamento das bibliografias e a Selma, pela confecção da ficha catalográfica.
Agradecimentos
Aos funcionários da Pós Graduação: Regina, Natanael, Janete e Andrea pelo excelente
trabalho na orientação dos alunos.
À funcionária Simone, da Cirurgia e Ortopedia, pelas orientações recebidas.
Ao Residente de Oftalmologia Emerson Hashimoto que me ajudou prontamente toda
vez que o solicitei, sem medir esforços para ajudar.
À Amanda Dias Moraes, aluna de iniciação científica e bolsista da FAPESP neste
projeto.
À Maria Tereza Fiorindo, chefe de Benefício do INSS, que compreendeu a necessidade
do meu mestrado e não mediu esforços para possibilitar que isto fosse possível.
Aos meus colegas de trabalho, Peritos Médicos do INSS, pela compreensão na minha
ausência.
Aos meus chefes Dr. José Henrique Scabello e Dr. Nelson Gonçalves da Silva pelo
apoio durante estes anos de estudo.
À Blaramis, chefe do Centro Municipal de Especialidades, que possibilitou minha
ausência em alguns dias para poder realizar esta pesquisa.
À Poliana que, na minha ausência, cuidou da minha família com carinho e dedicação.
Resumo
RESUMO
Introdução: A reposição do volume perdido nas cavidades enucleadas e evisceradas é
feita há muitos anos. O vidro foi o primeiro material utilizado para este fim, seguido por
uma série de outros, sem que nenhum deles possa ser considerado como o material
ideal. Mais recentemente, o vidro ou melhor, o biovidro, voltou ao cenário das
reconstruções em outras áreas da Medicina, levantando-se a hipótese do uso destes em
cavidade anoftálmica. Objetivo: avaliar experimentalmente a biocompatibilidade de
cones de biovidro, biovitrocerâmico I e biovitrocerâmico II em cavidades evisceradas de
coelhos. Método: foram utilizados 51 coelhos albinos, espécie Orictolagus cuniculus,
submetidos a cirurgia de evisceração do olho direito, seguida da inclusão de cones na
cavidade escleral. Os animais foram divididos em três grupos (G) que diferiram pelo
tipo de biomaterial de que eram feitos os cones: cones de biovidro (GA), cones de
biovitrocerâmico I (GB) e cones de biovitrocerâmico II (GC). Os animais foram
sacrificados em três momentos (M) experimentais: sete (M1), 90 (M2) e 180 (M3) dias
após a colocação dos cones na cavidade eviscerada. Os parâmetros avaliados foram:
peso no início e ao final do período experimental; exame clínico diário; exames
bioquímicos (TGO, TGP, CPK, FA, LDH, Uréia e Creatinina) imediatamente antes do
procedimento cirúrgico e nos momentos de sacrifício; avaliação histológica do conteúdo
orbitário e exame morfométrico da pseudocápsula e celularidade formada ao redor dos
cones nos momentos de sacrifício; estudo tomográfico da órbita 45 dias após a
evisceração e colocação dos cones; e microscopia eletrônica de varredura, realizada em
seis coelhos no M3. Resultados: o exame clínico e os exames bioquímicos dos animais
mostraram que os animais mantiveram-se saudáveis durante o experimento. Houve boa
integração dos cones com os tecidos do hospedeiro em todos os grupos e em todos os
Resumo
momentos experimentais, não tendo ocorrido extrusão em nenhum dos animais.
Histologicamente observou-se a formação de pseudocápsula ao redor dos cones,
composta por reação fibrovascular, neovasos, poucas hemácias e células inflamatórias.
O exame morfométrico mostrou que a reação inflamatória foi mais intensa no M1,
diminuindo em direção ao M3, sendo menos intensa nos coelhos que receberam cones
de biovidro (GA) que nos demais grupos de estudo. O exame tomográfico mostrou que
os cones não migraram e não induziram alterações inflamatórias para a cavidade
orbitária. O exame de microscopia eletrônica de varredura confirmou que o biovidro
induz menor reação inflamatória tecidual. Conclusões: os cones de biovidro e
biovitrocerâmico I e II podem ser úteis para a reparação da cavidade anoftálmica. Os
cones de biovidro mostraram-se superiores aos compostos por biovitrocerâmico I e II,
devido ao fato de provocarem menor reação inflamatória tecidual.
Palavras-chave: coelho, cavidade anoftálmica, biovidro, biovitrocerâmico, cone,
biocompatibilidade, evisceração.
Abstract
ABSTRACT
Biocompatibility analisys of Bioglass and bioglassceramic cone in rabbit
eviscerated cavity
Purpose: Replacement of lost volume in eviscerated and enucleated cavities has been
performed for many years. Glass was the first material for this purpose, followed by a
number of others, although none of them could be considered an ideal one. Recently,
bioglass made its return at the reconstruction scenery, bringing up the hypothesis of its
use in anophthalmic cavity. Objective: to evaluate bioglass, bioglassceramic and
bioglassceramic II biocompatibility in rabbit’s eviscerated cavities. Methods: 51
rabbitis were used, species Orictolagus cuniculus, all submitted to right eye evisceration
surgery, followed by the inclusion of protheses in the escleral cavity. Those animals
were gathered in 3 groups (G), distinguished through the type of material used to
manufacture the cones: bioglass (GA), bioglassceramic (GB) and bioglassceramic II
(GC). The animals were sacrificed at three distinctive experimental moments (M): 7
(M1), 90 (M2) and 180 (M3) days after the placement of cones in eviscerated cavities.
The parameters evaluated were: daily clinical exam; biochemical exam (AST, ALT,
CK, AP, HDL, urea and creatinine) before surgery and sacrifice; histological analysis;
morphometric evaluation; ocular tomography 45 days after surgery; and scanning
electron microscopy evaluation in six rabbits in M3. Results: Clinical and biochemical
examination led to the conclusion that the animals stayed healthy during the experiment.
There was good cone integration with the host tissue in every group and throughout
every experimental moment, having occurred extrusion in none of the animals.
Histologically, it was observed pseudocapsule formation around the cones, composed of
fibrovascular reaction, neovases, low amount of erythrocyte and inflammatory cells.
Abstract
Morphometric evaluation showed that the inflammatory reaction was higher at M1,
getting progressively lower while getting at M3, being the lowest in rabbits which
received bioglass cones (GA) than at any other groups. Tomographic evaluation showed
that the cones did not migrate and did not induce inflammatory alterations at the ocular
cavity. Scanning electron microscopy evaluation confirmed that bioglass induce the
lowest inflammatory tissue reaction. Conclusion: bioglass and bioglassceramic I and II
cones can be useful to repair anophthalmic cavity. Bioglass cones showed itself superior
to those composed by bioglassceramic I and II due to the fact they cause lower
inflammatory tissue reaction.
Key words: rabbit, anophthalmic cavity, bioglass, bioglassceramic, cone,
biocompatibility, evisceration.
Conteúdo
CONTEÚDO
Página
RESUMO
9
ABSTRACT
11
01
INTRODUÇÃO
25
1. Volume orbitário e a reparação após enucleação ou evisceração 26
2. Definição de biomateriais e biocompatibilidade 33
3. Histórico do biovidro 33
4. O uso do biovidro em cavidade anoftálmica no Brasil 37
5. Justificativa do estudo 37
02
OBJETIVOS
38
03
MATERIAL E MÉTODO
39
1. Aprovação pelo Comitê de Ética 39
2. Animais utilizados 39
3. Delineamento experimental: grupos e momentos experimentais 39
4. Variáveis estudadas 41
5. Sequência dos tempos experimentais 43
6. Metodologia utilizada na produção dos cones 44
7. Técnica cirúrgica empregada para a colocação do cone na cavidade
eviscerada e detalhamento da sequência experimental
49
8. Método de coleta dos exames bioquímicos 54
9. Preparo para análise histológica e detalhamento do exame morfométrico 56
10. Metodologia utilizada para a realização dos exames de Tomografia
computadorizada
61
11. Microscopia Eletrônica de Varredura 63
12. Manutenção dos animais 67
Conteúdo
13. Sacrifício dos animais 68
14. Avaliação Estatística 69
04
RESULTADOS
71
1. Avaliação clínica dos animais dos diversos grupos experimentais: 71
1.1. Avaliação da região órbito-palpebral 71
1.2. Evolução clínica sistêmica 72
1.3. Peso dos animais 74
2. Exames Bioquímicos 75
4. Avaliação Histológica 81
4.1 - Observações Histológicas feitas em M1 82
4.1.1. Grupo A 82
4.1.2. Grupo B 82
4.1.3. Grupo C 83
4.2. Observações Histológicas feitas em M2 85
4.2.1. Grupo A 85
4.2.2. Grupo B 85
4.2.3. Grupo C 85
4.3. Observações Histológicas feitas em M3 87
4.3.1. Grupo A 87
4.3.2. Grupo B 87
4.3.3. Grupo C 87
Conteúdo
4.4. Resultados do exame morfométrico
88
4.4.1. Avaliação da espessura da pseudocápsula
88
4.4.2. Avaliação da celularidade existente na
pseudocápsula
90
4.4.3. Avaliação do colágeno
91
4.5. Avaliação Tomográfica 93
4.5.1. Observações Tomográficas feitas no Grupo A 94
4.5.2. Observações Tomográficas feitas no Grupo B 95
4.5.3. Observações Tomográficas feitas no Grupo C 96
4.6. Avaliação dos cones ao Microscópio Eletrônico de Varredura 97
4.6.1. Observações Ultra-estruturais com
Microscopia Eletrônica de Varredura, feitas no Grupo A
98
4.6.2. Observações Ultra-estruturais com
Microscopia Eletrônica de Varredura, feitas no Grupo B
100
4.6.3 Observações Ultra-estruturais com
Microscopia Eletrônica de Varredura, feitas no Grupo C
102
05
DISCUSSÃO
105
1. Escolha do tema e modelo experimental 105
2. Quanto ao desenvolvimento dos cones para o estudo 106
3. Avaliação clínica dos animais e a biocompatibilidade 109
Os exames bioquímicos 110
Avaliação da resposta cicatricial ao redor dos cones 111
Análise quantitativa da espessura da pseudocápsula e da
celularidade nos implantes de biovidro, biovitrocerâmico I e
biovitrocerâmico II
113
Análise do colágeno nos cones de biovidro, biovitrocerâmico I
e biovitrocerâmico II
115
4. Avaliação da Tomografia Computadorizada 115
Conteúdo
5. Avaliação da Microscopia Eletrônica de Varredura 116
06
CONCLUSÃO
119
07
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFIAS
120
08
APÊNDICE
126
1. Comitê de ética 126
Lista de Figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Imagem dos três tipos de cones, compostos pelos
biomateriais utilizados: A) biovidro; B) biovitrocerâmico I;
C) biovitrocerâmico II.
40
Figura 2 Vista lateral do cone de biovidro utilizado no presente
experimento.
45
Figura 3 Sequência do procedimento cirúrgico de evisceração
realizada nos coelhos, seguida da colocação dos cones dos
diferentes biomateriais. A) Posicionamento do coelho em
decúbito lateral esquerdo, de forma que o olho direito
permanecesse voltado para cima; B) Instilação de colírio
anestésico; C) Antissepsia usando PVPI; D) Paracentese
com bisturi lâmina 11; E) Abertura córneo-escleral com
tesoura tipo Westcott; F) Separação da córnea e esclera; G)
Retirada da córnea; H) Evisceração com remoção das
estruturas intraoculares; I) Limpeza da capa escleral usando
cureta; J) Apresentação da capa escleral após remoção das
estruturas intraoculares; K) Colocação do cone na
cavidade; L) Sutura escleral com mersilene 6-0; M)
Aspecto da sutura escleral completa; N) Sutura conjuntival
com mersilene 6-0; O) Aspecto da finalização do
procedimento P) Instilação de solução oftálmica de
Gatifloxacino colírio ao final do experimento.
54
Figura 4 Demonstração da coleta de sangue da veia auricular do
coelho para análises bioquímicas.
55
Figura 5 Figura contendo um cone esquemático, com a identificação
das regiões padronizadas para análise na lâmina
histológica.
58
Figura 6 Demonstração da região de análise da espessura da
pseudocápsula, realizada na coloração de HE, em três
locais (L1, L2 e L3) de cada uma das regiões apontas na
figura 5,, usando a lupa e no aumento de 40 X.
59
Figura 7 Fotografia da estação de comando do Tomógrafo da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade Estadual Paulista- UNESP Campus de
Botucatu.
61
Figura 8 Coelho posicionado para exame de Tomografia
Computadorizada, Faculdade de Medicina Veterinária e
62
Lista de Figuras
Zootecnia da Universidade Estadual Paulista- UNESP
Campus de Botucatu.
Figura 9 Animal anestesiado e posicionado ventralmente com o
crânio apoiado e elevado para a realização da Tomografia
Computadorizada.
63
Figura 10 Esclera envolvendo o cone removidos da cavidade orbitária
após o sacrifício do animal. Demonstração do método
utilizado na partida do material de estudo ao meio com
auxílio de uma lâmina diamantada ligada a um motor de
3.000 rotações por minuto, sob irrigação com soro
fisiológico a 0,9%.
65
Figura 11 Material de estudo partido ao meio, mostrando o cone
firmemente aderido a esclera, imediatamente antes da
fixação em glutaraldeído.
65
Figura 12 Imagens do exame de Microscopia de Varredura. A)
Material colocado nos “stubs” dentro do Microscópio
Eletrônico de Varredura sob vácuo. B) Imagem da
superfície do cone com aumento de 37X. C) Idem com
aumento de 120X. D) Idem com aumento de 450X.
67
Figura 13 Fotografia do Biotério de Manutenção dos animais
utilizados no experimento, com detalhe dos coelhos
acondicionados em gaiolas individuais.
68
Figura 14
Material retirado imediatamente após eutanásia,
identificando-se a esclera envolvendo o cone de biomaterial
estudado.
69
Figura 15 Aspecto da cavidade anoftálmica de coelho após sete dias
(M1) de evisceração do olho direito. Observar a ausência
de pelos na região adjacente a fenda palpebral e a escassez
de sinais inflamatórios.
72
Figura 16 Cortes histológicos referentes a reação de reparação
tecidual formada entre a esclera e os cones no M1 (seta). A)
Biovidro. B) Biovitrocerâmico I. C) Biovitrocerâmico II.
Em todos os cortes nota-se a pseudocápsula, formada por
fibroblastos, hemácias e células inflamatórias( HE 40X ).
84
Figura 17 Cortes histológicos referentes a reparação tecidual formada
entre a esclera e os cones no M2. A) Biovidro. B)
Biovitrocerâmico I. C) Biovitrocerâmico II. Nota-se a
pseudocápsula menos espessa, principalmente no grupo A
(HE 40X).
86
Lista de Figuras
Figura 18 Cortes histológicos referentes a reparação tecidual entre a
esclera dos coelhos e os cones no momento 3 (M3).. A)
Biovidro. B) Presença do biomaterial (seta) envolto por
tecido reparativo do hospedeiro C) Biovitrocerâmico. D)
Biovitrocerâmico II. Nota-se pseudocápsula formada por
fibroblastos, ausência de edema e pequena reação
inflamatória (HE 40X).
88
Figura 19 Corte histológico referente a reparação tecidual formada
entre a esclera e os cones no Grupo A, em M1. As fibras
colágenas coradas em vermelho; os miócitos em amarelo; e
os espaços em branco. Picrosirius Red (PR 40X).
91
Figura 20 Tomografia computadorizada realizada nos coelhos em
posição ventral com o crânio apoiado e elevado. Os cortes
foram feitos de 1x1mm (1mm de espessura por 1mm de
intervalo de reconstrução) e as imagens avaliadas em janela
óssea e de partes moles, com o FOV ( Field Of View-
Campo de Visão) de 11 cm. Observar imagem do cone na
cavidade orbitária (seta).
94
Figura 21 Cortes tomográficos do crânio do coelho na posição
transversal, onde se observa na órbita direita, o cone de
biovidro e, na esquerda, o bulbo ocular.
95
Figura 22 Cortes tomográficos do crânio do coelho na posição
transversal, onde se observa na órbita direita, o cone de
biovitrocerâmico I e, na esquerda, o bulbo ocular.
96
Figura 23
Cortes tomográficos do crânio do coelho na posição
transversal, onde se observa na órbita direita, o cone de
biovitrocerâmico II e, na esquerda, o bulbo ocular.
97
Figura 24
Imagem referente a animal do grupo A em M3. Fratura da
camada mais externa do cone, separando uma camada mais
densa do biomaterial. Na região mais interna o biovidro
apresenta microfraturas (MEV 450X).
99
Figura 25 Imagem referente a animal do grupo A em M3. Fratura
retilínea na superfície de contato do biovidro da esclera
(seta). Efeito de corte induzido para o preparo do material,
o biovidro forma pequenas placas que se desprendem.
Esclera (E)(MEV 37X).
100
Lista de Figuras
Figura 26 Imagem referente a animal do grupo B em M3. Presença da
linha de fratura na camada superficial do material,
separando o biomaterial em duas camadas distintas(MEV
38X).
101
Figura 27 Imagem referente a animal do grupo B em M3. Presença das
camadas superficial e profunda, com inúmeras
“rachaduras” de formato de figuras geométricas (seta)
(MEV 549X).
102
Figura 28 Imagem referente a animal do grupo C em M3. Superfície
entre o biomaterial e o hospedeiro com grande quantidade
de fibrose, não permitindo a observação do biomaterial,
com poucas células inflamatórias e poucas hemácias (MEV
120X).
103
Figura 29 Imagem referente a animal do grupo C em M3. Presença de
capa de fibrose é vista como uma superfície algodonosa
que envolve todo o cone e não permite visibilizá-lo (MEV
469X).
104
Figura 30 Primeiras próteses de vidro com formatos anteriores
diferentes devido a tensão de superfície.
107
Figura 31 Molde de grafite de alta precisão, considerados a melhor
opção para a obtenção de cones de mesmo padrão de
formato e tamanho.
107
Figura 32 Formato da prótese de biovidro antes e após a aplicação do
vácuo em sua confecção.
108
Figura 33 Prótese cônica de biovidro após o desbaste/lixamento.
108
Figura 34 Imagem da Microscopia Eletrônica de Varredura. A)
biomaterial. B) integração. C) material do hospedeiro.
118
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composição Química do Biovidro e do Biosilicato 45
Tabela 2 Tratamento térmico empregado no Laboratório de Materiais
Vítreos - LAMAV, pertencente a Universidade Federal de
São Carlos, para cristalizar o biovitrocerâmico nos processos
de nucleação e cristalização.
47
Tabela 3 Média e desvio padrão do peso inicial (em gramas) dos
coelhos, segundo grupo experimental.
74
Tabela 4
Média e desvio padrão do peso de coelhos segundo grupo e
momento de sacrifício.
75
Tabela 5 Média e desvio padrão das dosagens bioquímicas da Uréia e
Creatinina de coelhos submetidos a evisceração do olho
direito e colocação de cones na cavidade anoftálmica,
segundo grupo e momento de avaliação.
76
Tabela 6 Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens
bioquímicas da TGO de coelhos submetidos a evisceração do
olho direito e colocação de cones na cavidade anoftálmica,
segundo grupo e momento de avaliação.
77
Tabela 7
Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens
bioquímicas da TGP de coelhos submetidos a evisceração do
olho direito e colocação de cones na cavidade anoftálmica,
segundo grupo e momento de avaliação.
78
Tabela 8 Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens
bioquímicas da fosfatase alcalina de coelhos submetidos a
evisceração do olho direito e colocação de cones na cavidade
anoftálmica, segundo grupo e momento de avaliação.
79
Tabela 9 Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens
bioquímicas da LDH de coelhos submetidos a evisceração do
olho direito e colocação de cones na cavidade anoftálmica,
segundo grupo e momento de avaliação.
80
Lista de Tabelas
Tabela 10 Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens
bioquímicas da CPK de coelhos submetidos a evisceração do
olho direito e colocação de cones na cavidade anoftálmica,
segundo grupo e momento de avaliação.
81
Tabela 11 Mediana e valores máximo e mínimo referentes a espessura
da pseudocápsula formada entre a esclera e os cones, em
cavidades evisceradas de coelhos, segundo grupo, momento
de avaliação e região onde foi realizada a observação.
90
Tabela 12 Mediana e valores máximo e mínimo referentes a
celularidade observada nos tecidos regenerativos formados
entre a esclera e os cones, em cavidades evisceradas de
coelhos, segundo grupo e momento de avaliação.
91
Tabela 13 Porcentagem de colágeno avaliada no exame de lâminas
coradas por Picrosirius Red segundo implante e momento, e
seus valores máximo e mínimo
93
Lista de Gráficos
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Mediana, valores máximo e mínimo, da quantidade de
colágeno encontrado na interface entre a esclera e os cones,
segundo grupo e momentos de estudo.
92
Lista de Fluxograma
LISTA DE FLUXOGRAMA
Fluxograma 1 Apresentação do processo de obtenção dos implantes de
biovidro e biovitrocerâmico.
48
Introdução
25
1 - INTRODUÇÃO
Algumas doenças oculares, como o glaucoma, o trauma e a endoftalmite
podem cursar com perda da função visual, causando sofrimento, desfiguramento da
aparência, com reflexos psicológicos desfavoráveis para o portador. Muitas vezes há
necessidade de intervenção cirúrgica para minimizar a dor ou para restaurar a aparência
do indivíduo, possibilitando ao mesmo o retorno ao mercado de trabalho e a vida
normal.
Muitas vezes há necessidade de se remover o olho como um todo
(enucleação) ou o seu conteúdo (evisceração), a fim de reduzir a dor (decorrente de
edema de córnea, glaucoma absoluto), para conservar a saúde geral do indivíduo (no
caso dos tumores oculares), ou por razões estéticas (leucoma, phithisis bulbi).
A face é a “janela” para o mundo e, sendo assim, o olho é foco de atenção e
identificação do ser humano. Alterações oculares são marcantes e podem acarretar
graves prejuízos para a estética facial. Especial atenção deve ser dada para a perda do
volume orbitário, pois a contração e a de formação dos tecidos contidos na cavidade
orbitária são os maiores problemas estéticos enfrentados pelo indivíduo que apresenta
uma afecção que necessite de remoção do olho ou de seu conteúdo.
Tanto a enucleação, quanto a evisceração, reduzem o conteúdo da cavidade
orbitária, havendo necessidade de reposição de volume para que se tenha aspecto
estético aceitável (MULES, 1990; MIGLIORI, 2002; PERRY et al., 2009). A
enucleação provoca perda mais acentuada de volume para a órbita, uma vez que o
trauma para as estruturas orbitais é maior (MIGLIORI, 2002). Entretanto, também com
a evisceração há perda de volume, com reflexos negativos para a aparência da face
(SHIRATORI et al., 2005).
Introdução
26
A reparação após a perda de volume orbitário deve ser realizada, buscando-
se como resultado final a simetria com o lado contralateral. Ou seja, a devolução do
volume orbitário tem como objetivo principal evitar o prejuízo estético para o paciente
(SU; YEN, 2004).
A técnica cirúrgica escolhida, a experiência do cirurgião, as condições de
assepsia e o material adequado a ser implantado são muito importantes para prevenir a
complicação mais temida neste tipo de cirurgia: a extrusão do implante (RODRIGUES
et al., 1997).
Quando a devolução de volume é primária, ou seja, é feita no mesmo ato
cirúrgico realizado para a enucleação ou evisceração ocular, 90% das pessoas tratadas
apresentam bons resultados (HABAL, 1987).
1. Volume orbitário e a reparação após enucleação ou evisceração
O olho humano apresenta formato esferóide, com volume de 7 ±2 cm
3
e
diâmetro de 24 mm. Ele se encontra dentro da cavidade orbitária que possui volume
total de 32 ±2 cm
3
, composto pelo volume do bulbo ocular e pelos músculos
extrínsecos, vasos sanguíneos, nervos e gordura (HABAL, 1987).
Quando da necessidade de remoção do bulbo ocular ou de seu conteúdo, o
volume perdido pode ser devolvido para a cavidade orbitária de várias formas, tais
como usando materiais autólogos, heterólogos ou aloplásticos. Em linguagem corrente,
os materiais aloplásticos utilizados para devolver o volume orbitário, são conhecidos
como implantes, termo que segundo Pigossi e colaboradores (1971) não estaria correto,
devido ao fato de que implantes são transplantes de células que não possuem viabilidade
Introdução
27
vital; ou seja, o melhor termo para definir o objeto utilizado para a reposição de volume
em cavidade anoftálmica seria inclusão (PIGOSSI et al., 1971). De qualquer forma,
utilizar a reposição de volume no tratamento da cavidade anoftálmica, evita a contração
dos tecidos orbitários e possibilita que posteriormente sejam adaptadas próteses
externas, com melhoria da estética facial (KARESH, 1998).
Os tecidos autólogos que podem ser utilizados para reposição de volume na
cavidade orbitária seriam: cartilagem, osso, fáscia lata, gordura (GOUGELMAN, 1976).
Estes tecidos, por serem obtidos do próprio hospedeiro, não necessitam de triagem
especial; porém necessitam de um segundo sítio cirúrgico. Já os materiais heterólogos,
dispensam a necessidade de um segundo sítio operatório; entretanto, há que se prever a
utilização de métodos de triagem de doadores, meios de conservação ou preservação,
acondicionamento e transporte adequados (BEAVER et al., 1996).
Os materiais aloplásticos são os mais utilizados para a reparação da cavidade
anoftálmica, devido a sua fácil obtenção, ausência de risco de transmissão de doenças,
cirurgia que necessita de apenas um procedimento operatório, dispensando a
preservação ou a conservação dos implantes.
A necessidade de devolver volume para cavidades anoftálmicas é
reconhecida há séculos e a procura do melhor meio para se conseguir este intento é
estudada há muitos anos.
Os primeiros implantes utilizados datam do ano de 1885, quando Mules
desenvolveu esferas de vidro que foram implantadas após eviscerações e, em seguida,
após as enucleações (TONKELAAR et al., 1991). O vidro foi o principal material
utilizado até os anos 40 do Século passado (PERRY, 1990), época em que a fábrica de
esferas de vidro foi destruída na Grande Guerra. A falta desta fábrica fez com que os
Introdução
28
profissionais passassem a usar esferas confeccionadas usando materiais autólogos, como
as bolas de ossos e cartilagem (SU; YEN, 2004). Também novos materiais sintéticos
começaram a surgir, como o polimetilmetacrilato (PMMA) e o silicone, também
chamadas de esferas não integradas.
Até 1989, os implantes mais usados no mundo todo eram os implantes não
integrados, em especial os fabricados usando o PMMA ou o silicone. Foi nesta época
que Perry sugeriu o uso dos implantes porosos, confeccionados de hidroxiapatita
coralina ou hidroxiapatita natural (SIRES et al., 1998), cujo principal ponto de diferença
com os implantes não integrados é o fato de que os integrados possuem poros que
permitem o crescimento fibrovascular no seu interior, com forte apelo para a melhora da
mobilidade da prótese externa (LIN et al., 2002), já que o implante que recebe a
colonização dos tecidos do hospedeiro poderia ser perfurado, com acoplagem de
parafuso tipo macho/fêmea que fixa a inclusão presente na cavidade orbitária com a
prótese externa, permitindo a transmissão dos movimentos dos músculos extrínsecos do
olho para o implante (PERRY, 1990).
Vale à pena ressaltar que o implante de hidroxiapatita natural não foi o
primeiro implante integrado existente na literatura, já que por volta de 1940 haviam sido
sugeridos implantes feitos de um material metálico inerte (o ouro), com o formato de
esfera, com superfície do tipo de uma “peneira”, que permitia a “integração” com o
hospedeiro, na medida em que o tecido do receptor era capaz de crescer para o seu
interior, permeando os “poros” da esfera. Este implante não prosperou, em decorrência
das grandes complicações observadas, tais como as exposições e extrusões em
decorrência da abertura da tênue membrana conjuntival (TONKELAAR et al., 1991).
Introdução
29
Portanto, na década de 80 houve o retorno a este conceito, reiniciando-se o
uso de esferas integradas conforme proposto por Perry, usando a hidroxiapatita natural,
derivada do coral marinho, que passa por um processo de sinterização. As esferas
fabricadas por este processo possuem custo elevado, principalmente por serem
derivadas da natureza, justificando-se que estas são derivadas de fonte que pode se
exaurir (PERRY, 1990; PERRY et al., 2002).
Seguindo o mesmo raciocínio de que as esferas integradas teriam melhor
mobilidade, surgem, em seguida, várias outras hidroxiapatitas, agora fabricadas de
material sintético, todas elas tendo por base em sua fórmula química o carbonato de
cálcio (JORDAN et al., 2000a; SCHELLINI et al., 2003).
Muitas discussões aconteceram a respeito das hidroxiapatitas sintéticas,
relacionadas com o estado de pureza do material (JORDAN et al., 2000a), com a
possibilidade de se ter a absorção sistêmica do material implantado, com redução do
volume que se pretendia devolver para a cavidade orbitária (RANZANI et al., 1997),
ficando este último ponto como a principal de todas as queixas que existiram com
relação a este material.
A procura por novos materiais sintéticos para reposição do volume orbitário
continuou, chegando-se ao polietileno poroso, um material inerte e que permanece no
local de implantação (GOLDBERG et al., 1994; KARESH, 1998; HSU et al., 2000;
JORDAN et al., 2000a; PERRY et al., 2002; JORDAN et al., 2002; ANDERSON et al.,
2002; SCHELLINI et al., 2003; FERRAZ et al., 2006; CUSTER; TRINKAUS, 2007).
Outra vantagem é o custo, muitas vezes menor que o das hidroxiapatitas naturais
(SCHELLINI et al., 2003). Sua forma em gel foi pesquisada baseados na hipótese de
que o contato do implante rígido com a prótese externa favoreceria a isquemia tecidual,
Introdução
30
levando a deiscência que pode resultar, em última análise, nas extrusões (SCHELLINI
et al., 2008).
Os motivos que tem levado ao estudo de novos materiais são o risco de
complicações, como as deiscências de sutura, as extrusões do implante e os processos
inflamatórios exacerbados (KARESH, 1998; SU; YEN, 2004; FRANÇA et al., 2005;
BRITO, 2008).
O risco de haver complicações relacionadas com o material utilizado e a
técnica cirúrgica aplicada, como extrusão do implante, deiscência de suturas
(RODRIGUES et al., 1997; GUPTA et al., 2001; KLAPPER et al., 2003; SCHELLINI
et al., 2007), trauma mecânico da esclera e processos inflamatórios exacerbados
(KARESH, 1998; SU; YEN, 2004), também são motivos que tem levado ao estudo de
novos materiais (FRANÇA et al., 2005; BRITO, 2008).
Talvez o principal motivo para se continuar pesquisando novos materiais
para reconstrução da cavidade anoftálmica esteja relacionado ao fato de que ainda não
se encontrou o material considerado ideal para a reconstrução da cavidade anoftálmica.
Para os brasileiros, acresce-se a isso, a inexistência no mercado nacional das
inovações que surgem no mercado internacional, ficando a população composta de
indivíduos mais desassistidos, uma vez que os preços de importação são abusivos.
Nos Estados Unidos da América, entre os materiais aloplásticos, o mais
utilizado atualmente, referido como o de melhor resultado cirúrgico para preenchimento
de cavidades anoftálmicas e de boa integração tecidual, é o polietileno poroso de alta
densidade, registrado como Medpor
®
(Porex) (BLAYDON et al., 2003; SU; YEN,
2004).
Introdução
31
Apesar de se ter pesquisas brasileiras sobre a utilização de polietileno poroso
americano em cavidades anoftálmicas de humanos (MOURA et al., 2007), pode-se
afirmar que o alto custo das esferas da Porex limita o seu uso na prática clínica. Estes
biomateriais, inicialmente tidos como inertes quando implantados no organismo,
qualquer que seja o tipo de material utilizado, mesmo os biocompatíveis, desencadeiam
reação inflamatória no hospedeiro, representada pela formação de cápsula ou
pseudocápsula fibrosa envolvendo o implante (SCHELLINI et al., 2000).
Até o momento, nenhum estudo foi feito entre os oftalmologistas brasileiros
que possa apontar qual é o material mais empregado na reparação da cavidade
anoftálmica em território nacional. Entretanto, observações pessoais permitem dizer que
os cirurgiões brasileiros ainda empregam preferentemente para a reparação da cavidade
anoftálmica, o implante de polimetilmetacrilato.
Existem outros materiais que estão sendo explorados para uso em cavidade
anoftálmica, dentre eles está o biovidro. Este material começou a ser utilizado a partir
de 1969. Entretanto, somente após a criação da terceira geração deste biomaterial, o que
ocorreu no ano de 1985 com a patente do implante de Bioglass
®
- é que surgiram vários
estudos sobre a utilização do biovidro em diversas áreas da Medicina (OONISHI et al.,
1997; AMATO et al., 2003; HENCH, 2006).
No estudo realizado por Amato e colaboradores (2003), o Bioglass® foi
utilizado para aumentar o volume de órbitas enoftálmicas, recobrindo defeitos em
assoalho orbitário de coelhos, demonstrando-se haver biocompatibilidade, com pouca
reação inflamatória, sem infecção, sem exposição do implante, ausência de problemas
para o bulbo ocular, estimulação do crescimento ósseo e capacidade de aumento do
volume orbitário.
Introdução
32
Em se tratando de biomaterial, um novo conceito é a associação de
substâncias que possam ter, entre si, uma interação positiva. Assim, o Bioglass®
(biovidro) foi testado também em associação com o Medpor® (polietileno poroso),
mostrando ainda melhores resultados (AMATO et al., 2003).
Seguindo este mesmo conceito, surge o desenvolvimento de novos materiais
cerâmicos com diferentes tratamentos térmicos, demonstrando eficiência e melhora da
biointegração. Dentre eles, o biovitrocerâmico (Biossilicato
®
) (PEITL et al., 2001;
CHEN et al., 2006) que já foi usado em próteses para substituição dos ossículos do
ouvido (MASSUDA; OLIVEIRA, 2007) e para preenchimento dos alvéolos dentários
de cães (RORIZ; PANZERI, 2006; TIRAPELLI; PANZERI, 2007), com bons
resultados in vivo. O biovitrocerâmico também foi testado e aprovado para uso como
matriz polimérica para reconstrução do complexo zigomático orbitário de humanos
(TURREN et al., 2008).
Existe ainda, pesquisas com biocerâmicos em cavidades evisceradas,
enucleadas ou em implantes secundários, na forma de um óxido de alumínio (Al
2
O
3
),
mostrando-se uma alternativa aos implantes orbitais porosos, aprovado pelo FDA (Food
and Drug Administration) para uso nos Estados Unidos da América no ano 2000,
principalmente pelo menor custo, quando comparado ao Bioglass e Medpor (JORDAN
et al., 2000b).
Os estudos com biovitrocerâmico vem mostrando bons resultados em
animais e humanos (MOURA et al., 2007). A possibilidade de desenvolvimento de
implantes orbitários a partir deste material, comparados com próteses compostas por
biovidro, permitirá a avaliação da biocompatibilidade destes diferentes biomateriais,
com possível identificação de viabilidade de uso nas cavidades anoftálmicas.
Introdução
33
2. Definição de biomateriais e biocompatibilidade
Os chamados biomateriais são materiais usados para entrar em contato com
tecidos vivos com objetivo de recompor uma parte danificada ou auxiliar na
recuperação do tecido do organismo. Estes quando sintéticos, podem ser divididos em
cerâmicos (Biovidro, biovidrocerâmico), polímeros (substâncias compostas por cadeias
longas de Carbono: polietileno e polimetilmetacrilato) e metálicos (aço inoxidável,
titânio, ouro, prata) (FRATZL; BARTH, 2009).
A biocompatibilidade é a capacidade de um material de funcionar com
resposta apropriada ao hospedeiro em uma aplicação específica. Esta ação deve-se ser
contínua, ou seja, deve-se exercer ação para a qual foi programado por um período tão
longo quanto necessário. Esta biocompatibilidade é dependente diretamente da
composição e reações químicas do material e também do tipo de tecido e saúde do
hospedeiro em que for implantado (FRANÇA, 2003).
3. Histórico do biovidro
Dados históricos a respeito das próteses utilizadas na reparação da
cavidade anoftálmica podem ser obtidos da publicação de Tonkelaar e colaboradores,
segundo a qual os primeiros implantes utilizados em cavidades anoftálmicas eram de
vidro. A reposição de volume em cavidades anoftálmicas foi o principal assunto do
Congresso Europeu de Oftalmologia, ocorrido no ano de 1900; entretanto, a fábrica de
vidro utilizado na confecção dos implantes era situada na Alemanha, tendo sido
destruída nas Grandes Guerras (TONKELAAR et al., 1991).
Passando por todos os desafios descritos anteriormente neste capítulo
introdutório na procura do material ideal para reconstrução da cavidade anoftálmica,
Introdução
34
volta-se no meio do século XX novamente ao vidro como componente de biomateriais,
o que ocorreu na Ohio State University (OSU), nos anos de 1957/1958, quando se
estudou o material precursor do Bioglass®, com os primeiros resultados publicados na
American Ceramic Society, no ano de 1962 (TONKELAAR et al., 1991; HENCH,
2006).
A partir daí, vários estudos surgiram, visando encontrar a fórmula ideal do
biomaterial que não fosse “rejeitado” pelo organismo humano. A fórmula mais próxima
ao Bioglass® foi desenvolvida no ano de 1967, mas foi divulgada somente em 1969
(Na
2
O- CaO- SiO
2
), tendo sido testada como implante em fêmur de ratos pelo Dr. Ted
Greenlee (GREENLEE, Jr. et al., 1972).
Em 1976, o professor alemão Peter Gress usou o implante do Bioglass
recoberto com alumina (óxido de alumínio- Al
2
O
3
) em ovelhas e os resultados
mostraram que a superfície não era estável. Isso levou a busca de novas fórmulas que
utilizassem o Bioglass® 45S5 em associação com outras substâncias químicas, como
em 1977, quando se procedeu a adição de pequena quantidade de K
2
O e MgO aos
implantes, utilizando modelos animais. Seu uso clínico foi limitado devido à
instabilidade na fase de formação da cristalização do vitrocerâmico (TONKELAAR et
al., 1991).
A modificação mais importante do biomaterial de vidro foi realizada pelo
professor Yamamuro, da Universidade de Kuoto-Japão, que submeteu o biovidro a uma
sinterização (transformar pó em peça rígida através de tratamento térmico) e a
cristalização que, gerou a formação, na interface do Bioglass®, da apatita (fosfato de
cálcio) e do mineral wollastonita (CaSiO
3
) o que, em estudos experimentais em animais,
mostrou ser excelente para a aplicação ortopédica (3000 casos de prótese vertebral,
Introdução
35
1200 casos de laminectomia, 2000 de próteses da crista ilíaca) (YAMAMURO et al.,
1990; HENCH, 2006).
Uma nova modificação na fórmula realizada pelos Professores Orjan
Anderson e Kai Karlsson, foi testada e seu uso clínico para reparação cirúrgica de
coluna e crânio foi um sucesso por vários anos (HENCH, 2006).
Em 1981, o Dr. June Wilson e alguns colegas realizaram o primeiro estudo
in vitro e in vivo em tecidos conectivos, uma vez que, antes disso, o biovidro havia sido
testado apenas como prótese para reparação óssea. Após aprovação do comitê de ética,
deu-se a realização do primeiro trial clínico (HENCH, 2006).
Já com o nome de Bioglass®, no ano de 1985 foi publicado nos Estados
Unidos da América o primeiro trabalho realizado com esta fórmula registrada. O
material foi utilizado para tratar a perda auditiva de condução, na orelha média,
mostrando bons resultados na recuperação dos ossículos do ouvido e da membrana
timpânica. Este biomaterial ficou conhecido como o Bioglass de primeira geração
(HENCH, 2006).
A segunda geração do Bioglass® teve sua fórmula usada em Odontologia,
no ano de 1988 (HENCH, 2006).
Após vários estudos experimentais, chegou-se a terceira geração do
Bioglass®, a qual proporcionou regeneração e reparação dos tecidos no local em que foi
implantada, devido à ativação dos genes nos tecidos vivos. Os estudos foram realizados
com várias aplicações clínicas, como na pele, no sistema vascular, na cartilagem
auricular e também na reparação óssea. Nestes casos, o Bioglass® foi capaz de
“estimular” a produção do tecido ósseo por meio da reparação pela osteoprodução e
osteoestimulação, decorrente da ação direta nos osteoblastos (HENCH, 2006).
Introdução
36
O FDA liberou o uso do Bioglass® no ano de 1996, a ser utilizado na região
alveolar de dentes extraídos, após a publicação que descreveu o potencial do biomaterial
usado em periodontia, ocorrida no ano de 1987, que abordava estudo de Wilson e
colaboradores, da Universidade da Flórida. A partir deste trabalho e mais dois,
publicados em 1992 e 1994, este material recebeu o nome de PerioGlass®, material
este que já possui período longo de observação, com 10 anos de resultados sem reações
adversas (HENCH, 2006).
Diante do sucesso do PerioGlass®, em 1999 seu uso em ortopedia trouxe o
nome de NovaBone®, demonstrando regeneração efetiva do osso com o uso do 45S5
Bioglass®. Em 2005, foi publicado um estudo de bons resultados em humanos, com
dois anos de acompanhamento clínico (TONKELAAR et al., 1991).
Mais recentemente, este tipo de biomaterial vem sendo estudado para
tratamento de hipersensibilidade dentária (RORIZ; PANZERI, 2006; TIRAPELLI;
PANZERI, 2007), em substituição dos ossículos do ouvido (MASSUDA; OLIVEIRA,
2007) e em reconstrução do complexo zigomático orbitário (TURREN et al., 2008).
A partir daí, estudos brasileiros sugeriram o tratamento cerâmico do
biovidro, mostrando que a cristalização que sofre o material, gerando o
biovitrocerâmico, faz decrescer o nível de bioatividade, tornando o material mais inerte
ao organismo em que for implantado (PEITL et al., 2001; MOURA et al., 2007).
O presente estudo foi motivado pelo fato dos bons resultados obtidos por
estes materiais, aliado a necessidade de se desenvolver um material que possa ser
considerado ideal para o tratamento da cavidade anoftálmica.
Introdução
37
4. O uso do biovidro em cavidade anoftálmica no Brasil
O biovidro foi usado em coelhos, no campo da plástica ocular, na forma de
compósitos, que são materiais formados por dois ou mais constituintes, com distintas
composições, estruturas e propriedades, que estão separados por uma interface. Neste
primeiro estudo no Brasil, o Biovidro foi associado com polietileno e usado como
controle o Medpor® e Polipore em implantação do biomaterial em órbitas de coelhos.
Os resultados do estudo demonstraram uma ótima biocompatibilidade, com os
compósitos apresentando melhores resultados que os controles, o que foi deduzido a
partir da observação de menor reação inflamatória justamente no grupo que recebeu os
compósitos. Quanto à bioatividade, os compósitos de biovidro com polietileno
apresentaram alta angiogênese, formação de uma pseudocápsula mais espessa e
estrutura mais rica em colágeno (FRANÇA, 2003; FRANÇA et al., 2005).
5. Justificativa para a realização do estudo
Tendo em vista a aplicação do biovidro com bons resultados em estudos
experimentais e clínicos, inclusive com o uso em cavidade anoftálmica de coelhos, e
que materiais compostos de biovidro cristalizado podem ser úteis e necessitam de
maiores estudos para nos dar esta definição, levando-se em conta que nenhum dos
biomateriais existentes pode ser considerado ideal para uso em cavidade anoftálmica,
justifica-se a realização do presente estudo.
Objetivos
38
2 - OBJETIVOS
Objetivo geral: usando um modelo experimental, demonstrar se cones de
biovidro ou biovitrocerâmico podem ser úteis para a reparação de cavidades
anoftálmicas.
Objetivo específico: avaliar a biocompatibilidade de cones de biovidro e
outros dois tipos de cones compostos por biovitrocerâmico (biovitrocerâmico I e
biovitrocerâmico II), introduzidos em cavidades evisceradas de coelhos, estudando-se:
1. a resposta clínica dos animais após a colocação dos cones nas
cavidades anoftálmicas;
2. a possível toxicidade sistêmica dos cones, avaliada por meio de
exames bioquímicos que possam refletir o funcionamento de órgãos
vitais dos animais de estudo;
3. a avaliação da resposta dos tecidos orbitários após a colocação dos
cones na cavidade eviscerada, por meio de exame histológico e
morfométrico;
4. a avaliação do posicionamento dos cones e a situação dos mesmos em
relação aos tecidos vizinhos, por meio de exame tomográfico;
5. a avaliação da superfície de contato dos cones com o hospedeiro, por
meio de microscopia eletrônica de varredura.
Material e Método
39
3 - MATERIAL E MÉTODO
1. Aprovação pelo Comitê de Ética
Esse trabalho encontra-se de acordo com os princípios éticos utilizados na
experimentação animal, adotados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de
Botucatu UNESP - São Paulo, para o uso de animais de experimentação, tendo sido
aprovado para execução em 26 de junho de 2008 (protocolo número 682 - Apêndice 1).
2. Animais utilizados
O estudo foi cego, experimental e aleatorizado. Foram utilizados 51 coelhos
da espécie Oryctolagus cuniculus, raça Norfolk (albino), sexo masculino, com idade
entre três e seis meses. Os animais foram cedidos pelo Biotério Central da UNESP,
localizado no Campus de Botucatu.
3. Delineamento experimental: grupos e momentos experimentais
Os animais foram divididos em três grupos experimentais, cada um deles
composto por 17 coelhos. Os grupos diferiram entre si pelo tipo de biomaterial que foi
utilizado: grupo A (GA) que recebeu cones de biovidro, com composição semelhante ao
Bioglass
®
; grupo B (GB) que recebeu cones de biovitrocerâmico I ou Biossilicato
®
; e
grupo C (GC) que recebeu cones de biovitrocerâmico II, assim chamado por apresentar
Material e Método
40
a mesma composição do biovitrocerâmico I, porém submetido a processo maior de
cristalização. Oito animais foram desprezados e substituídos durante o experimento.
A pesquisadora não conhecia qual biomaterial estava empregando nos
diferentes grupos experimentais, tendo sido o cegamento feito pelo fornecedor dos
implantes, que os separou nos três grupos, identificados pelas letras A, B e C. As letras
só foram identificadas para a pesquisadora ao final do estudo.
Figura 1. Imagem dos três tipos de cones, compostos pelos biomateriais utilizados: A)
biovidro; B) biovitrocerâmico I; C) biovitrocerâmico II.
Depois de realizado o procedimento cirúrgico, foi feita nova aleatorização
como meio de decisão para composição dos momentos experimentais, considerados
momentos de sacrifício, como segue:
A B C
Material e Método
41
• Momento 0 (M0): momento de coleta de exames bioquímicos, imediatamente
antes da realização da cirurgia:
• Momento 1 (M1): 15 animais, cinco de cada grupo, permaneceram sete dias
com os cones na cavidade eviscerada após o que, foram sacrificados;
• Momento 2 (M2): 15 animais, cinco de cada grupo, permaneceram 90 dias com
os cones na cavidade eviscerada, após o que, foram sacrificados;
• Momento 3 (M3): 21 animais, sete de cada grupo, permaneceram 180 dias com
os cones na cavidade eviscerada, após o que, foram sacrificados. Dois animais
de cada grupo foram destinados para avaliação do material sob microscopia
eletrônica de varredura e os outros cinco, para as mesmas análises histológicas
propostas nos demais momentos do estudo.
4. Variáveis estudadas
Os biomateriais foram avaliados segundo as seguintes variáveis:
• Exame Clínico: os animais foram pesados no início do experimento e no
momento de sacrifício. Foram avaliados diariamente após a realização do ato cirúrgico,
por observação ectoscópica, feita sob luz ambiente. O exame visou sinais que
denotassem alterações da saúde geral do animal, estimada pela atividade, apetite e
atitude na gaiola, ou sinais que estivessem presentes no sítio operatório, com atenção
especial aos sinais locais na região orbitária direita, avaliando-se a presença de sinais
inflamatórios e/ou infecciosos, traduzidos por secreção, deiscência de sutura conjuntival
ou outros sinais possíveis e presentes na face, além da observação da presença do cone
Material e Método
42
implantado na cavidade orbitária. Também foi realizada a avaliação do peso dos
animais, com o intuito de estabelecer possíveis alterações clínicas sistêmicas
decorrentes do procedimento realizado.
• Exames Bioquímicos: foram realizados exames para verificação de possível
absorção e repercussão sistêmica, decorrente da presença do biomaterial na cavidade
orbitária. Foram colhidos exames para verificação da função hepática (TGO, TGP,
LDH, FA), cardíaca (CPK) e renal (Uréia, Creatinina). Os exames foram colhidos
imediatamente antes do procedimento cirúrgico (considerado padrão de normalidade
para os exames ou momento zero – M0), e no momento do sacrifício do animal. Todos
os exames foram realizados para todos os animais que receberam nas cavidades
evisceradas os cones de biovidro, biovitrocerâmicoI e biovitrocerâmico II (Grupos
A,B,C, respectivamente). Os valores observados foram transferidos para Tabela Excel
para posterior análise estatística.
Todos os exames citados foram realizados em todos os animais que
receberam nas cavidades evisceradas os cones de biovidro, biovitrocerâmico I e
biovitrocerâmico II (Grupos A, B, C).
• Tomografia computadorizada: foi realizada nos coelhos dos três grupos, aos
45 dias após os cones terem sido colocados na cavidade anoftálmica, ou seja, nos
animais do M2 e M3, já que os de M1 foram sacrificados após sete dias do
procedimento cirúrgico. Este exame foi realizado com o intuito de pesquisar o
posicionamento da prótese na órbita, verificando possível ocorrência de migração e a
presença de alterações nos tecidos vizinhos, como presença de coleções ou processos
inflamatórios ao redor dos cones implantados.
Material e Método
43
• Exame Morfológico: o exame morfológico seguiu com a realização de três
tipos de avaliação: histológica, morfometria e ultra-estrutural. O exame histológico foi
feito para a avaliação da reparação tecidual inflamatória (tipo, localização e intensidade
da reação) encontrada nos tecidos ao redor dos cones, com ênfase na celularidade
(neutrófilos e eosinófilos) e a vascularização local, em lâminas coradas por
Hematoxilina e Eosina (nos momentos M1, M2 e M3) e Picrosirius Red (nos momentos
M1 e M3). O exame morfométrico foi realizado para avaliação quantitativa da
pseudocápsula que se formou ao redor dos implantes, assim como da celularidade,
seguindo a metodologia descrita a seguir. Também foi realizado exame ultra-estrutural,
por meio de microscopia eletrônica de varredura, em dois coelhos de cada grupo, no
momento M3. A preparação para o exame histológico, assim como o exame
morfométrico foi feita no Laboratório Experimental da Faculdade de Medicina de
Botucatu. O exame ultra-estrutural foi realizado no Laboratório de Microscopia
eletrônica, pertencente ao Instituto de Biociências, da Universidade Estadual Paulista-
Campus Botucatu.
5. Sequência dos tempos experimentais
Os animais foram transferidos do Biotério Central para as dependências dos
Laboratórios Experimentais, local onde foram realizados os procedimentos operatórios e
mantidos os animais.
Após a ambientação, foi colhida uma amostra de sangue para realização de
exames bioquímicos e, em seguida, os animais foram anestesiados.
Material e Método
44
Os olhos direitos dos coelhos foram eviscerados, com reposição do volume
perdido usando cones, compostos por três tipos distintos de biomateriais: o biovidro; o
biovitrocerâmico I; e
o biovitrocerâmico II (Grupos A, B e C).
Desta forma, os grupos experimentais diferiram de acordo com o tipo de
biomaterial que foi utilizado para reposição de volume nas cavidades evisceradas.
Os coelhos permaneceram em observação segundo o tempo estipulado para o
experimento.
Nos animais de M2 e M3, após 45 dias do procedimento cirúrgico, foi
realizado exame tomográfico, feito sob anestesia geral.
Transcorridos os dias previstos, os animais foram anestesiados, coletando-se
novamente sangue para os exames bioquímicos, após o que, foram imediatamente
sacrificados, sendo o conteúdo da órbita removido e preparado para exame morfológico.
O preparo para exame morfológico está especificado a seguir.
6. Metodologia utilizada na produção dos cones
Todas os cones foram confeccionados por um mesmo profissional, Dr. Oscar
Peitl, pertencente à Universidade Federal de São Carlos, no Departamento de
Engenharia de Materiais, localizado no Laboratório de Materiais Vítreos - LAMAV.
Todos apresentavam diâmetro anterior de 10 mm, posterior de 3 mm e comprimento de
12 mm, tendo sido confeccionados a partir de um molde de grafite para moldes de alta
precisão, construído especificamente para este estudo. O peso das próteses foi de 1,19
(±0,02)g.
Material e Método
45
Figura 2. Vista lateral do cone de biovidro utilizado no presente experimento.
A obtenção destes cones iniciou-se com o preparo da matéria prima, que foi
pesada na proporção para se obter a formulação desejada, utilizando-se balança com
precisão mínima de 0,01g e colocada em um recipiente cilíndrico de polietileno de alta
densidade, hermeticamente vedado.
Para garantir a homogeneidade química da mistura dos pós, o recipiente com
a mistura foi colocado para girar na velocidade crítica de efeito “cascata” em um
moinho de jarros por 2 horas.
Tabela 1. Composição Química do Biovidro e do Biosilicato.
Componente
SiO
2
Na
2
O K
2
O CaO P
2
O
5
Faixa de composição (wt%)
45,0– 55,0 15,0-25,0 0-7,0 15,0-35,5 0-9,0
(AMATO et al., 2003)
Após a mistura ter sido homogeneizada, foi conduzida ao forno de fusão. O
forno empregado para a fusão foi o elétrico tipo botton load com resistência capaz de
atingir até 1800°C de temperatura. A opção pelo aquecimento elétrico se deu por ser o
sistema que anula toda contaminação proveniente da queima de combustível, como nos
Material e Método
46
fornos aquecidos por gás natural ou petróleo. O cadinho empregado para a fusão foi
confeccionado em platina pura (Pt 99,999%), por ser um metal que não sofre nenhum
ataque químico a elevadas temperaturas (até 1650°C), proveniente do contato com o
líquido do vidro fundido. Apesar de ser extremamente oneroso, o cadinho de platina é o
material mais inerte conhecido, ao contrário dos cadinhos cerâmicos (Al2O3, ZrO2,
Mulita, etc.), normalmente empregados pela indústria de vidros, os quais são fortemente
atacados pelos elementos alcalinos (sódio). O ataque químico do vidro em estado
líquido nos cadinhos cerâmicos leva a dissolução de parte dele que é incorporada à
composição do vidro e se torna uma fonte de contaminação para os vidros fundidos
nesses cadinhos. Por esse fato, fica inviável proceder à fusão em cadinhos cerâmicos.
O processo completo de fusão e eliminação das heterogeneidades (bolhas,
estrias, infundidos) e obtenção do vidro homogêneo para a composição escolhida é de
quatro horas, na faixa de 1250 a 1450°C. Com o vidro fundido se procede ao seu
vertimento em molde de grafite de alta densidade, já que este vidro possui uma estreita
faixa de temperatura na qual pode ser moldado, com tempo para moldagem dos cones
(com dimensões muito pequenas) extremamente curto (aproximadamente um segundo).
Para viabilizar o preenchimento completo do molde nesse curto espaço de tempo é
necessário se proceder ao vertimento em vácuo ou sob pressão, o que foi feito.
Após a moldagem, a temperatura decai rapidamente e em aproximadamente
15 segundos atinge 100°C. Esse rápido resfriamento leva ao aparecimento de tensões
internas no vidro que são indesejadas, pois podem conduzir à fratura completa da peça
recém formada. Para eliminar as tensões da moldagem se faz o recozimento, que
consiste em elevar a temperatura da peça acima da Temperatura de Transição Vítrea
(Tg) por 15 minutos e resfriar lentamente até a temperatura ambiente, a uma taxa
Material e Método
47
aproximada de 4°C/min. Este processamento é executado em forno mufla convencional
(capacidade até 1200°C) com aquecimento elétrico. Após o resfriamento, é possível
cortar o excesso de vidro acumulado devido à moldagem, assim obtendo a geometria
praticamente definitiva da prótese.
A peça de vidro é submetida a dois tratamentos térmicos para promover a
sua cristalização. Inicialmente faz-se o tratamento para surgir núcleos de cristais no
volume do vidro. Após esse processo de nucleação, faz-se o crescimento dos cristais
conduzindo a inclusão vítrea a uma vitrocerâmica. A Tabela 2 apresenta a faixa de
temperatura dos tratamentos térmicos de nucleação e crescimento utilizados na
produção de cones de biovidro e biovitrocerâmico.
Tabela 2. Tratamento térmico empregado no Laboratório de Materiais Vítreos -
LAMAV, pertencente à Universidade Federal de São Carlos, para cristalizar o
biovitrocerâmico nos processos de nucleação e cristalização.
TRATAMENTO TÉRMICO
Nucleação Crescimento
Temperatura Tempo Temperatura Tempo
°C Minutos °C Minutos
500-610 30-9000 650-850 1-100
No biovitrocerâmico II, o processo é igual ao biovitrocerâmico I, porém faz-
se um terceiro tratamento térmico para promover um segundo crescimento, aparecendo
assim, uma nova fase cristalina a base de fosfato.
O fluxograma apresentado abaixo demonstra resumidamente o processo
utilizado para a obtenção do biovitrocerâmico (Fluxograma 1).
Material e Método
48
Fluxograma 1. Apresentação do processo de obtenção dos implantes de biovidro e
biovitrocerâmico.
Matérias Primas
Grau PA
SiO
2
CaCO
3
Na
2
CO
K
2
CO
3
P
2
O
5
P
Mistura em Moinho de
Jarro
Descarte
Recozimento
Corte
Tratamento
Térmico
Nucleação
Crescimento
Desgaste
Polimento
Descarte
Limpeza
Armazenamento
Esterilização
Pesagem
Material e Método
49
Para concluir a prótese com sua dimensão final procedeu-se a um desbaste e
polimento do stem, assim garantindo que todos os cones possuíssem as mesmas
dimensões. Após o acerto dimensional do cone foi efetuada a limpeza, imergindo-os em
um banho de acetona (PA) dentro de um equipamento de ultrassom, por 10 minutos.
Após o banho em ultrassom os cones foram devidamente mantidos em recipientes
lacrados, contendo acetona, e encaminhados para esterilização individual, feita em
Óxido de Etileno, pela empresa Oximed (São José do Rio Preto- SP), permanecendo no
máximo dois dias embalados e esterilizados, tendo sido logo colocados na órbita.
7. Técnica cirúrgica empregada para a colocação do cone na cavidade
eviscerada e detalhamento da sequência experimental
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados, no Laboratório
Experimental do Departamento de Oftalmologia/Otorrinolaringologia/Cirurgia de
Cabeça e Pescoço, da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP.
1. Aleatorização dos animais experimentais para composição dos grupos:
A, B e C
2. Retirada e preparo do sangue para exames bioquímicos
3. Anestesia geral utilizando Zoletil® 50 (cloridrato de tiletamina e
cloridrato de zolazepam, Virbac, France), na dose de 15mg/kg
4. Posicionamento do coelho sobre a mesa cirúrgica, em decúbito lateral
esquerdo, de forma que o olho direito permanecesse voltado para cima
Material e Método
50
5. Instilação de 1 gota de colírio anestésico no olho a ser operado, para
complementação da analgesia
6. Antissepsia do olho direito com Polivinilpirrolidona-iodo (PVPI)
7. Colocação de campo oftalmológico estéril e blefarostato para abertura
palpebral
8. Abertura córneo-escleral com bisturi lâmina 11 (Two Arrows,
fabricação da RPC, Shanghai Med SN, China), aproximadamente à
1mm do limbo, sendo feita a paracentese, com complementação da
abertura de 360°, usando tesoura tipo Westcott, para separação da
córnea em relação à esclera, sendo desprezada a córnea
9. Evisceração do conteúdo do olho direito, sendo feita a remoção deste
com uma cureta pequena e pinça de conjuntiva e utilizando-se uma
espátula para separar a esclera do tecido uveal
10. Com o auxílio de compressas de gaze (Plascalp – Produtos Cirúrgicos
Ltda, BA) e cotonetes (Johnson & Johnson, SP), foi feita a remoção
dos restos uveais da esclera e a hemostasia dos vasos sangrantes da
cavidade escleral
11. Após a hemostasia, procedeu-se a colocação dos cones, conforme
grupo experimental
12. Fechamento da incisão cirúrgica foi realizado por meio de sutura
contínua, com fio inabsorvível trançado 6-0 (Mersilene 6-0 – Ethicon,
Johnson & Johnson, SP), nos planos da esclera e conjuntiva
13. Instilação de 0,1 ml de solução oftálmica Gatifloxacino colírio (Zymar,
Allergan Laboratórios do Brasil)
Material e Método
51
14. Novamente foram sorteados e divididos os animais em três subgrupos
experimentais, agora para determinação do tempo de acompanhamento,
denominados de momentos experimentais, escolhidos como momentos
para sacrifício dos animais
15. Após 45 dias do procedimento, os animais de M2 e M3 foram
anestesiados, sendo submetidos ao exame tomográfico
16. Transcorrido o tempo estipulado para o seguimento, os animais foram
anestesiados da mesma forma apresentado no item 2, sendo, em
seguida, colhido sangue para exames bioquímicos
17. Remoção do conteúdo orbitário e preparo para o exame histológico,
morfométrico e ultra-estrutural.
Material e Método
52
A
C
B
D
E
G
F
H
Material e Método
53
I
K L
M
J
O Q
N
Material e Método
54
Figura 3. Sequência do procedimento cirúrgico de evisceração realizada nos coelhos,
seguida da colocação dos cones dos diferentes biomateriais. A) Posicionamento do
coelho em decúbito lateral esquerdo, de forma que o olho direito permanecesse voltado
para cima; B) Instilação de colírio anestésico; C) Antissepsia usando PVPI; D)
Paracentese com bisturi lâmina 11; E) Abertura córneo-escleral com tesoura tipo
Westcott; F) Separação da córnea e esclera; G) Retirada da córnea; H) Evisceração com
remoção das estruturas intraoculares; I) Limpeza da capa escleral usando cureta; J)
Apresentação da capa escleral após remoção das estruturas intraoculares; K) Colocação
do cone na cavidade; L) Sutura escleral com mersilene 6-0; M) Aspecto da sutura
escleral completa; N) Sutura conjuntival com mersilene 6-0; O) Aspecto da finalização
do procedimento P) Instilação de solução oftálmica de Gatifloxacino colírio ao final do
experimento.
8. Método de coleta dos exames bioquímicos
A coleta de sangue dos animais para os exames bioquímicos foi realizada
antes do procedimento cirúrgico e uma segunda bateria de exames bioquímicos foi
colhida antes da eutanásia.
Os animais foram colocados em um suporte adequado para tal procedimento.
Foram coletados 5ml de sangue com seringa (BD precision glide
®
, PR) e agulha
descartáveis, por meio da veia auricular conforme apresentado na figura 4.
Material e Método
55
Figura 4. Demonstração da coleta de sangue da veia auricular do coelho para análises
bioquímicas.
O conteúdo da seringa foi imediatamente transferido de forma lenta, com o
jato dirigido para a parede do tubo de ensaio sem anticoagulante, para evitar lise das
células sanguíneas e deixado em repouso por 1 hora.
O tubo foi então, submetido à centrifugação com 3000 rotações/minuto, por
20 minutos, em temperatura ambiente, obtendo assim o sangue fracionado.
O soro foi separado usando uma pipeta e congelado em dois tubos Eppendorf
para cada amostra.
Os exames bioquímicos foram realizados no Laboratório Clínico,
pertencente ao Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
de Botucatu – UNESP, a partir do soro congelado.
Material e Método
56
9. Preparo para análise histológica e detalhamento do exame morfométrico
Após o sacrifício, os cones envoltos por esclera, removidos da cavidade
orbitária,, foram fixados no formol tamponado a 10%. Após três dias de fixação,
iniciou-se a preparação para o exame histológico.
A capa escleral que evolvia os cones foi seccionada, os cones foram
removidos do seu interior e apenas a capa escleral seguiu a preparação para exame
histológico e morfométrico.
O material foi desidratado em série crescente de seis cubas de álcoois (80-
100%), diafanizado em três cubas de xilol, e por fim, em três cubas de parafina
(temperatura entre 50 e 60°C), permanecendo por uma hora em cada uma dessas cubas,
e, em seguida, processado no auto-técnico (Leica TP 1020, Alemanha).
Em seguida, foi incluído em blocos de parafina no inclusor auto-técnico
(Leica EG 1160, Alemanha), cortado em espessura de quatro µm para coloração com
Hematoxilina-Eosina (HE) e de seis µm para Picrosirius Red (exame específico para
análise do colágeno) em micrótomo rotativo (Leica RM 2155, Alemanha).
Os melhores cortes foram selecionados e separados. Estes foram colocados
em álcool 30%, seguido de banho-maria em temperatura a 50°C para estirar, sendo
colocados de dois a quatro cortes em lâminas (Knittel, Alemanha), levadas a estufa a
60°C, por aproximadamente uma hora para desparafinizar.
As lâminas destinadas à avaliação de Hematoxilina-Eosina foram finalmente
colocadas no aparelho Auto-Stainer XL, para coloração pela técnica de Hematoxilina
Material e Método
57
(QEEL - Química especializada Erich Ltda, SP) e Eosina (Merck - Alemanha) (HE),
sendo montadas no aparelho (Leica CV 5000), cobertas com lamínulas (Knittel,
Alemanha).
As lâminas destinadas à avaliação de Picrosirius Red foram finalmente
colocadas no aparelho Auto-Stainer XL, para coloração pela técnica de Picrosirius Red
(Direct Red 80, Altrich Chemical Company.inc, EUA), sendo montadas no aparelho
(Leica CV 5000), cobertas com lamínulas (Knittel, Alemanha).
Durante toda a análise histológica e morfométrico, as lâminas permaneceram
identificadas com o número do preparo, sem revelação do grupo e nem momento do
estudo.
A avaliação das lâminas foi realizada empregando-se o microscópio LEICA
DM LS, acoplado à câmara de vídeo que envia imagens digitais ao computador dotado
de programa de análise de imagens Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Spring,
Maryland- USA).
As avaliações foram realizadas adotando-se a padronização de análise de
cortes em quatro posições: anterior, posterior, três horas e nove horas, conforme a
disposição do corte sobre a lâmina histológica (figura 5).
Material e Método
58
Figura 5. Figura contendo um cone esquemático, com a identificação das regiões
padronizadas para análise na lâmina histológica.
O exame morfométrico foi feito utilizando as lâminas coradas pelo método
de Hematoxilina-Eosina (HE), sendo quantificada a espessura da pseudocápsula
formada entre o tecido escleral e o cone, nos 4 locais referidos nas figuras 5 e 6,
efetuando-se a medição em três pontos diferentes e adjacentes, em cada uma das
posições, para cálculo dos valores médios.
Material e Método
59
Figura 6. Demonstração da região de análise da espessura da pseudocápsula, realizada
na coloração de HE, em três locais (L1, L2 e L3) de cada uma das regiões apontas na
figura 5,, usando a lupa e no aumento de 40 X.
L1
L2
L3
Material e Método
60
Também foi realizado exame morfométrico quantificando-se a reação
inflamatória que ocorreu após a colocação dos cones na cavidade anoftálmica, seguindo
a mesma sistemática utilizada para o exame da pseudocápsula, ou seja, nas regiões
anterior, posterior e três e nove horas, em três pontos distintos em cada uma das regiões.
A reação inflamatória foi analisada, de acordo com o tipo e quantidade de células
inflamatórias encontradas, utilizando o sistema de avaliação em cruzes (1+ a 4+), de
modo que quanto maior o número de cruzes, maior a inflamação.
As lâminas destinadas à coloração de Picrosirius Red foram utilizadas para a
quantificação da fração de colágeno intersticial (CVF), por meio de vídeodensitometria.
As imagens dos tecidos da cavidade anoftálmica foram capturadas por computador IBM
compatível e analisadas por software de análise de imagens Image Pro-plus (Media
Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). Os elementos do tecido avaliado foram
identificados de acordo com os níveis de cor: as fibras colágenas apareceram vermelhas;
os miócitos amarelos; e os espaços, brancos. O perfil digitalizado foi analisado pelo
computador que calcula o volume de fração do colágeno como a soma de toda área do
tecido conectivo, dividido pela soma da área de tecido conectivo e a área do miócito.
Em média foram analisados 10 campos, utilizando a objetiva de 40X. Esta contagem foi
realizada somente na região interna da capa escleral, ou seja, região que se encontrava
em contato com o cone utilizado excluindo-se o colágeno que se encontrava na porção
externa da esclera e do tecido que não apresentava contato com a prótese empregada.
A fração de colágeno existente na pseudocápsula foi analisada
quantitativamente, comparando-se os momentos M1 e M3, por meio de análise de
pontos. Para isto, cortes histológicos com espessura de 6 µm, corados por Picrosirius
Red, foram examinados com objetiva de 40X e ocular dotada de retículo 10 colunas por
10 linhas. A percentagem do volume de fração de colágeno foi calculada de acordo com
a equação (PEREIRA, 2001):
Material e Método
61
Onde:
Cvf: Volume de fração de colágeno
Pc: número de intersecções da grade quadriculada com o colágeno
Pf: número total de intersecções dentro da área de referência
10. Metodologia utilizada para a realização dos exames de Tomografia
Computadorizada
O Tomógrafo utilizado para a realização dos exames dos coelhos foi o
pertencente à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual
Paulista- UNESP Campus de Botucatu. O aparelho é da marca Shimadzu, modelo SCT-
7800TC (figura 7).
Figura 7. Fotografia da estação de comando do Tomógrafo da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista- UNESP Campus de
Botucatu.
Cvf(%) = (Pc/Pf) x 100
Material e Método
62
Os animais foram previamente anestesiados com Zoletil®, na dosagem de 15
mg/kg, posicionados ventralmente, com o crânio apoiado e elevado. (Figuras 8 e 9).
Foram realizados cortes transversais no sentido rostro-caudal da cabeça, angulados
paralelamente à topografia da órbita, com área total de corte de 26 mm de extensão,
com os seguintes parâmetros: 120kVp e 160mA. Os cortes foram feitos de 1x1mm (um
mm de espessura por um mm de intervalo de reconstrução) e as imagens avaliadas em
janela óssea e de partes moles, com o FOV ( Field Of View- Campo de Visão) de 11 cm.
Figura 8. Coelho posicionado para exame de Tomografia Computadorizada, Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista- UNESP
Campus de Botucatu.
Material e Método
63
Figura 9. Animal anestesiado e posicionado ventralmente com o crânio apoiado e
elevado para a realização da Tomografia Computadorizada.
11. Microscopia Eletrônica de Varredura
Conforme descrito nos momentos experimentais, dois animais de M3 de
cada um dos grupos experimentais foram submetidos ao exame ultra-estrutural.
Os cones envoltos por esclera foram extraídos das cavidades orbitárias dos
coelhos em M3, logo após a retirada, foram cortados com bisturi lâmina 15 (Two
Arrows, fabricação da RPC, Shanghai Med SN, China) de modo a se produzir um sulco
na esclera que revestia o cone e, em seguida, foram partidos ao meio, com auxílio de
uma lâmina diamantada (KG Discos Flexíveis diamantados, Brasil), ligada a um motor
de 3.000 rotações por minuto. Todo o procedimento foi feito sob irrigação com soro
fisiológico a 0,9%, com uso de seringa e agulha (figura 10). Após ser partido (figura
11), o material foi fixado em glutaraldeído 2,5% em tampão fostato com pH 7,3
(cacodilato de sódio 0,1M) por um tempo longo (até 24 h), já que a duração prolongada
da fixação aumenta a penetração do fixador e a resistência física da amostra. Em
Material e Método
64
seguida a amostra foi lavada por três vezes com duração de 10 minutos cada vez, com
água destilada, com a finalidade de remover resíduos. Em seguida, foi realizada a pós-
fixação em tetróxido de ósmio 0,5% em água destilada por 30 minutos para prevenir a
extração de lipídios na fase de desidratação. A desidratação foi então iniciada em série
crescente de etanóis (7,5% a 100%), ficando o material sempre submerso durante três
horas. Então, as amostras foram transferidas para o aparelho de ponto crítico Balzers
CPD-020, onde foram feitas várias substituições com dióxido de carbono líquido (CO
2
)
para promover a secagem em condições mais favoráveis. As amostras secas foram,
então, montadas em “stubs” (porta amostra para Microscópio de Varredura) e, em
seguida, cobertas com 10 nm de ouro em metalizador MED-010 da Balzers (para
promover e aumentar a condutividade). Neste momento as peças estavam prontas para
serem analisadas no Microscópio Eletrônico de Varredura SEM 515 - Philips, sob
tensão de 20KV, pertencente ao Instituto de Biociências de Botucatu, da Universidade
Estadual Paulista (SILVEIRA, 1998). Todos estes procedimentos seguem o protocolo
daquele Laboratório e consta de material apostilado produzido pelos responsáveis pelo
serviço. O exame ultra-estrutural foi realizado com o intuito de avaliar a superfície de
contato entre o cone e a esclera, em diversos aumentos e observando-se a superfície nos
quatro pontos avaliados também no exame histológico (anterior, posterior, três e nove
horas).
Material e Método
65
Figura 10. Esclera envolvendo o cone removidos da cavidade orbitária após o sacrifício
do animal. Demonstração do método utilizado na partida do material de estudo ao meio
com auxílio de uma lâmina diamantada ligada a um motor de 3.000 rotações por
minuto, sob irrigação com soro fisiológico a 0,9%.
Figura 11. Material de estudo partido ao meio, mostrando o cone firmemente aderido à
esclera, imediatamente antes da fixação em glutaraldeído.
Material e Método
66
A descrição apresentada a seguir mostra a técnica para a preparação das amostras para
avaliação em Microscopia Eletrônica de Varredura passo-a-passo:
1. Fixação: o material removido da cavidade orbitária foi fixado em
glutaraldeído 2,5%, em tampão fostato, com pH 7.3.
2. Lavagem: em água destilada (três vezes por 10 minutos cada uma).
3. Pós-fixação: em tetróxido de ósmio 0,5%, em água destilada, por 30
minutos.
6. Desidratação em série crescente de etanol (7,5% a 100%).
7. Secagem: aparelho de ponto crítico Balzers CPD-020 utilizando o
dióxido de carbono líquido (CO
2
).
8. Montagem: amostras secas montadas em “stubs”.
9. Cobertura: amostras cobertas com 10 nm de ouro em metalizador
MED-010 da Balzers.
10. Análise: após o preparo, o material foi analisado no Microscópio
Eletrônico de Varredura SEM 515 - Philips, sob tensão de 20KV
(figura 12).
Material e Método
67
Figura 12. Imagens do exame de Microscopia de Varredura. A) Material colocado nos
“stubs” dentro do Microscópio Eletrônico de Varredura sob vácuo. B) Imagem da
superfície do cone com aumento de 37X. C) Idem com aumento de 120X. D) Idem com
aumento de 450X.
12. Manutenção dos animais
Os animais foram acondicionados em gaiolas individuais, em ambiente com
temperatura e iluminação controladas, recebendo alimentação a base de ração para a
espécie e água ad libitum. Todos os dias, pela manhã, os coelhos foram observados,
sendo feita a higiene das suas pálpebras e conjuntiva, utilizando soro fisiológico 0,9% e
algodão. Primeiramente removia-se as secreções que se encontravam acoladas aos
pêlos, seguida da remoção da secreção do saco conjuntival e das crostas aderidas às
margens palpebrais usando cotonetes. Os animais não foram anestesiados para tal tarefa,
A
B
D
C
Material e Método
68
não demonstrando dor a manipulação. Esta tarefa foi realizado por um residente de
Oftalmologia (Emerson Hashimoto) e por uma bolsista de Iniciação Científica (Amanda
Dias de Morais).
Figura 13. Fotografia do Biotério de Manutenção dos animais utilizados no
experimento, com detalhe dos coelhos acondicionados em gaiolas individuais.
13. Sacrifício dos animais
Os animais foram sacrificados usando-se sobre dose de Cloridrato de
Ketamina (Dopalen- Vetbrands-SP) pela via intramuscular, nos tempos idealizados para
a pesquisa.
Após o sacrifício, foi removido o cone juntamente com a esclera e o tecido
orbitário adjacente (figura 14), usando tesoura de argola e pinça de conjuntiva. Em
seguida, o material foi colocado em Formol tamponado 10% (Rioquímica, SP) para
fixação.
Material e Método
69
Figura 14. Material retirado imediatamente após eutanásia, identificando-se a esclera
envolvendo o cone de biomaterial estudado.
14. Avaliação Estatística
Todos os valores encontrados nos exames bioquímicos (CPK, LDH, FA,
TGO, TGP, Uréia e Creatinina) foram transferidos para planilhas Excel e submetidos à
análise estatística, utilizando-se a técnica de Análise de Variância para o modelo com
dois fatores complementada com o teste de comparações múltiplas de Tukey, usando
média e desvio padrão para o estudo da Uréia e Creatinina. Para o estudo do restante
dos exames laboratoriais (CK, LDH, FA, TGO, TGP), a técnica empregada foi a de
Análise de Variância não paramétrica para o modelo com dois fatores, complementada
com o teste de Dunn, usando a Mediana e os valores mínimos e máximos. O contraste
pesquisado foi entre grupos e dentro dos momentos experimentais estudados,
considerando-se P < 0,05.
Material e Método
70
Os valores obtidos no exame morfométrico também foram transferidos para
a Tabela Excel e avaliados estatisticamente.
Para o estudo da pseudocápsula, utilizou-se a técnica de Análise de
Variância não paramétrica para o modelo com três fatores, complementada com o teste
de Dunn, usando a Mediana e os valores mínimos e máximos. O contraste foi entre
grupos, o local de medida da pseudocápsula e dentro dos momentos experimentais
estudados, considerando-se P < 0,05.
Para o estudo da inflamação e do colágeno (Picrosirius Red), utilizou-se a
técnica de Análise de Variância não paramétrica para o modelo com dois fatores,
complementada com o teste de Dunn, usando a Mediana e os valores mínimos e
máximos. O contraste foi entre grupos e dentro dos momentos experimentais estudados,
considerando-se P < 0,05.
Resultados
71
4 - RESULTADOS
1. Avaliação clínica dos animais dos diversos grupos experimentais
1.1. Avaliação da região órbito-palpebral
• Todos os dias, pela manhã, os coelhos foram observados, sendo feita a higiene das
suas pálpebras e conjuntiva, utilizando soro fisiológico 0,9% e algodão.
Primeiramente removia-se as secreções que se encontravam acoladas aos pêlos,
seguida da remoção da secreção do saco conjuntival e das crostas aderidas às
margens palpebrais. Os animais não foram anestesiados para tal tarefa, não
demonstrando dor a manipulação.
• Alguns coelhos apresentaram maior quantidade de secreção que os demais, sendo
nos mesmos repetida à limpeza no período da tarde. Esta secreção era
esbranquiçada e não tinha aspecto infeccioso e esteve presente em 7 coelhos,
todos pertencentes ao momento M3 e distribuídos segundo os grupos:
o Grupo A: dois coelhos (n° 09 e 23)
o Grupo B: três coelhos (n° 24, 37 e 43)
o Grupo C: dois coelhos (n° 16 e 21)
Resultados
72
Figura 15: Aspecto da cavidade anoftálmica de coelho após sete dias (M1) de
evisceração do olho direito. Observar a ausência de pelos na região adjacente à fenda
palpebral e a escassez de sinais inflamatórios.
• Nenhum animal apresentou hiperemia conjuntival, deiscência ou extrusão do
implante durante todo o seguimento do estudo.
1.2. Evolução clínica sistêmica
• A maioria dos animais evolui bem, alimentando-se normalmente e com atividade
normal na gaiola;
• Foram a óbito oito animais: a) dois coelhos pareciam estar bem durante o
acompanhamento; porém, vieram a morrer de forma súbita (coelhos n° 24
pertencente ao grupo B e n° 26 pertencente ao grupo C, com 4 meses de
acompanhamento). Ambos apresentavam evidências de queimadura na face, o que
interpretamos ser possível ter ocorrido quando da limpeza das gaiolas, já que as
Resultados
73
mesmas são suspensas, sendo a limpeza feita usando fogo que queima os pelos que
caíram dos animais. Portanto, o cuidado inadequado com a limpeza da gaiola pode
ter causado queimaduras na face e até quadros respiratórios, provocando a morte
destes dois animais. Esta rotina passou a ser revista pelos bioteristas depois do
ocorrido; b) dois outros animais vieram a morrer por diarréia (coelhos n° 42
pertencente ao grupo C aos 3 meses de acompanhamento e n° 5 pertencente ao
grupo A, com 5 meses de acompanhamento); c) um coelho (Grupo B) apresentou
uma lesão retro-orbital que não comprometeu o estado geral do coelho e apareceu
ao 30° dia de acompanhamento. Este coelho evoluiu bem, sem apresentar
prostração e com deslocamento superior do posicionamento do implante, mas sem
deiscência ou extrusão. Ao 60° dia de acompanhamento esta lesão drenou uma
secreção esbranquiçada da qual foi realizado exame histológico que demonstrou
grande quantidade de células inflamatórias e atípicas. A partir deste momento este
coelho não apresentou mais nenhuma alteração, a prótese retornou a posição
normal e a cavidade não apresentava nenhuma alteração ao exame clínico. Ao 107°
dia de acompanhamento este coelho amanheceu morto, sem causa aparente. d) três
outros animais foram encontrados mortos na gaiola, sem que tivesse algum fator
que levantasse suspeita sobre a saúde geral dos mesmos (coelho n° 21 do grupo C
com 5 meses e 24 dias de acompanhamento; coelho n° 06 do grupo C com 5 meses
de acompanhamento; coelho n° 32 do grupo A com 5 meses e 26 dias de
acompanhamento). Estes últimos animais faleceram em dias muito frios,
juntamente com outros que se encontravam em seguimento na mesma sala e que
pertenciam a outros estudos, levantando a hipótese de alterações atmosféricas,
levando a doenças comuns e provocando o óbito.
Resultados
74
• Desta forma, segundo a observação clínica, pode-se dizer que nenhum animal
apresentou alterações sistêmicas que fossem decorrentes da cirurgia ou dos cones.
• Alguns animais apresentaram perda de pelos na região periorbital, sem sinais
inflamatórios e sem comprometimento da cavidade eviscerada, que mantinha-se
sem hiperemia e excelente cicatrização (coelho n° 11- Grupo A, M2; coelho n° 03-
Grupo B, M3; coelho n° 36- Grupo C, M2).
• Todos os animais que evoluíram para óbito foram substituídos, permanecendo o
estudo com o mesmo número de coelhos idealizados no projeto de pesquisa inicial.
1.3. Peso dos animais
O peso inicial dos animais dos diferentes grupos experimentais era
semelhante, não tendo sido observada diferença estatística entre os grupos (Tabela 3).
Tabela 3. Média e desvio padrão do peso inicial (em gramas) dos coelhos, segundo
grupo experimental.
Grupo A Grupo B Grupo C Valor P
2064,5 ± 447,9 2314,4 ± 293,0 2008,1 ± 298,1 P>0,005
Os animais do estudo apresentaram ganho de peso em todos os grupos com o
passar do tempo, sendo este aumento significativo estatisticamente. Entre os grupos
houve uma diferença estatística entre o grupo B e C no momento 1 (M1), porém sem
significado clínico (tabela 4).
Resultados
75
Tabela 4. Média e desvio padrão do peso de coelhos segundo grupo e momento de
sacrifício.
Momento Grupo
M1 M2 M3
A 2566,8 ± 434,6 3974,8 ± 131,3
∆
5115,4 ± 129,7
#
B 2902,0 ± 339,5* 3974,4 ± 416,9
∆
5106,7 ± 201,0
#
C 2179,6 ± 359,5 3685,6 ± 285,1
∆
4988,0 ± 194,9
#
* (p<0,05) B x C
#
(p<0,05) M3 x (M2 e M1)
∆
(p<0,05) M2 x M1
2. Exames Bioquímicos
Os exames bioquímicos, colhidos antes do procedimento cirúrgico e antes da
eutanásia, possibilitaram comparação dos valores obtidos no início do estudo e no seu
final, mostrando que todos os animais apresentavam-se com saúde equivalente ao seu
estado de antes das manipulações experimentais.
Os valores obtidos antes do procedimento cirúrgico constam da primeira
coluna (M0). Os resultados referentes aos exames colhidos imediatamente antes do
sacrifício estão apresentados segundo grupo de animais (A, B, C), dentro dos
respectivos momentos experimentais (M1, M2, M3). Alguns resultados estão
apresentados segundo Média e desvio-padrão (Creatinina e Uréia) e outros pela
Mediana e semi-amplitude total, devido ao padrão de resposta ocorrido com a variável
de estudo e necessidade de aplicação do tipo de teste estatístico.
Resultados
76
Ressalte-se que, para todos os parâmetros bioquímicos estudados, embora
tenham sido observadas algumas diferenças estatísticas, os valores observados
estiveram sempre dentro dos limites de normalidade considerados para a espécie.
Os resultados que refletem a função renal, representados pelos exames de
Uréia e Creatinina passam a ser relatados. A Uréia não apresentou diferença entre os
grupos e nem entre os momentos do estudo. Já o estudo da Creatinina, mostrou que
houve alteração significativa entre os grupos B e C, sendo observado valor menor no
momento inicial (M0). Ainda nos resultados da Creatinina houve aumento dos seus
valores nos momentos M1, M2 e M3 em relação ao momento inicial (M0) nos grupos A
e B, e entre os momentos M2 e M3 com os momentos M0 e M1 no grupo C (tabela 5).
Tabela 5. Média e desvio padrão das dosagens bioquímicas da Uréia e Creatinina de
coelhos submetidos à evisceração do olho direito e colocação de cones na cavidade
anoftálmica, segundo grupo e momento de avaliação.
Momento de Avaliação
Grupo M0 M1 M2 M3
A
35,465 ± 9,782 37,260 ± 8,124 42,260 ± 6,042 36,342 ± 8,171
B
41,433 ± 12,757 31,100 ± 3,486 43,060 ± 8,525 36,225 ± 5,314
Uréia
C
38,773 ± 12,641 28,700 ± 6,195 37,900 ± 4,721 36,140 ± 9,693
A 1,006 ± 0,244
#
1,340 ± 0,305 1,500 ± 0,367 1,586 ± 0,267
B 1,039 ± 0,289*
#
1,320 ± 0,164 1,520 ± 0,228 1,587 ± 0,173
Creatinina
C
0,827 ± 0,194
∆
1,000 ± 0,100
∆
1,500 ± 0,200 1.500 ± 0,235
* (P<0,05) B xC
#
(P<0,05) M0 x (M1,M2, M3)
∆
(P<0,05) (M0, M1) x (M2, M3)
Resultados
77
Para a pesquisa da função hepática dos coelhos, no momnento inicial (M0)
em todos os momentos de sacrifício (M1, M2, M3), foram feitas dosagens de TGO,
TGP, FA e LDH.
A TGO (aspartato aminotransferase) não apresentou diferenças estatísticas
entre os grupos e momentos do estudo (tabela 6).
Tabela 6. Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens bioquímicas da TGO de
coelhos submetidos à evisceração do olho direito e colocação de cones na cavidade
anoftálmica, segundo grupo e momento de avaliação.
Momento de Avaliação
Grupo
M0 M1 M2 M3
A
18,0 (14,0; 47,0) 17,3 (16,2; 27,7) 14,1 (12,0; 28,3) 20,4 (15,0; 43,0)
B
20,5 (14,0; 47,0) 22,0 (7,9; 50,3) 24,6 (13,6; 38,7) 25,1 (14,1; 38,0)
TGO
C
18,0 (8,0; 39,0) 18,3 (2,6; 33,5) 18,3 (11,0; 27,7) 18,0 (3,1; 25,2)
TGO= aspartato aminotransferase
Nos exames de TGP (alanina aminotransferase) houve diferença estatística
no grupo A, entre o momento M3 e o momento M0 e M2, e no grupo B entre o
Momento 3 e Momento 2, sendo que os valores encontrados foram menores no M3 em
relação aos outros momentos. No grupo C não houve diferença estatística (tabela 7).
Resultados
78
Tabela 7. Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens bioquímicas da TGP de
coelhos submetidos à evisceração do olho direito e colocação de cones na cavidade
anoftálmica, segundo grupo e momento de avaliação.
Momento de Avaliação
Grupo
M0 M1 M2 M3
A
16,0 (5,0; 34,0) 12,0 (5,0; 15,0) 20,0 (17,0; 85,0) 5,0 (4,0; 7,0)*
B
17,5 (5,0; 30,0) 15,0 (7,0; 19,0) 24,0 (21,0;36,0) 7,0 (3,0; 28,0) #
TGP
C
13,0 (3,0; 26,0) 17,0 (4,0; 50,0) 19,0 (2,0; 36,0) 8,0 (3,5; 40,0)
TGP= alanina aminotransferase
* (P<0,05) M3 x (M0, M1)
#
(P<0, 05) M3 x M2
Nas dosagens da FA (Fosfatase Alcalina),, os resultados encontrados entre
os grupos, só foi estatisticamente significativo entre o grupo A e C no momento M1,
sendo o valor da fosfatase alcalina maior em A. Em relação aos momentos de análise:
no grupo A, o valor da FA diminui em M3 em relação aos momentos M0 e M1; no
grupo B, o valor diminui em M3 em relação aos momentos M0, M1 e M2; no grupo C,
o valor é maior no M0 em relação aos outros três momentos (tabela 8).
Resultados
79
Tabela 8. Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens bioquímicas da fosfatase
alcalina de coelhos submetidos à evisceração do olho direito e colocação de cones na
cavidade anoftálmica, segundo grupo e momento de avaliação.
Momento de Avaliação
Grupo
M0 M1 M2 M3
A
131,2 (64,8; 198,8) 172,5 (127,2; 273,3)* 85,9 (54,3; 196,0) 26,7 (17,0; 58,3)#
B
105,3 (72,1; 222,8) 147,4 (122,3; 165,2) 115,0 (52,6; 118,3) 25,9 (20,3; 43,7)∆
FA
C
112,6 (74,5; 194,4)α 98,8 (90,7; 119,9) 67,2 (55,9; 97,2) 30,8 (27,5; 99,6)
FA= fosfatase alcalina
* (P<0,05) A x C
#
(P<0,05) M3 x (M0, M1)
∆ (P<0,05) M3 x (M0, M1, M2)
α (P<0,05) M0 x (M1, M2 , M3)
Nos resultados do exame de LDH não houve diferença estatística entre os
valores ao avaliar os diferentes grupos experimentais. No grupo A, no M1 houve uma
redução do valor encontrado em relação ao outros momentos (M0, M2 e M3) (tabela 9).
Resultados
80
Tabela 9. Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens bioquímicas da LDH de
coelhos submetidos à evisceração do olho direito e colocação de cones na cavidade
anoftálmica, segundo grupo e momento de avaliação.
Momento de Avaliação
Grupo
M0 M1 M2 M3
A
72,8 ( ) 12,1 (10,0; 58,2)* 70,0 (39,0; 502,0) 72,8 (10,0; 349,5)
B
98,3 (9,7; 267,6) 17,4 (9,0; 385,9) 148,0 (21,8; 446,6) 142,0 (70,4; 216,0)
LDH
C
106,8 (9,7; 300,9) 58,2 (12,1; 148,0) 194,2 (24,3; 497,5) 114,1 (63,1; 325,2)
LDH: desidrogenase láctea
* (P<0,05) M1 x (M0, M1, M3)
Na pesquisa do exame de função cardíaca foi realizado baseando-se nos valores
observados para a creatinofosfoquinase (CPK), tendo ocorrido redução do valor
estatisticamente significativo, no Grupo A no M3 em relação ao M2. Entre os grupos A,
B e C e no restante dos momentos, não houve diferença estatística (tabela 10).
Resultados
81
Tabela 10. Mediana e valores máximo e mínimo das dosagens bioquímicas da CPK de
coelhos submetidos à evisceração do olho direito e colocação de cones na cavidade
anoftálmica, segundo grupo e momento de avaliação.
Momento de Avaliação
Grupo
M0 M1 M2 M3
A
786,0 (307,9; 1501,0) 460,8 (278,5; 648,2) 790,0 (351,4; 1745,0) 448,7 (234,0; 768,7)*
B
573,0 (205,6; 1336,0) 460,8 (278,5; 648,2) 548,9 (342,3; 1629,0) 389,4 (261,3; 1239,0)
CPK
C
666,4 (380,0; 2020,0) 647,2 (372,7/ 713,0) 781,0 (371,7; 1050,0) 544,9 (298,8; 1077,0)
CPK= creatinoquinase
* (p<0,05) M3 x M2
4. Avaliação Histológica
O cone não estava presente em todas as lâminas estudadas, uma vez que este
foi removido para a confecção das mesmas, devido à impossibilidade de partir o
biomaterial. Sendo assim, as lâminas foram avaliadas na porção interna, local em que
havia a relação direta da esclera com o cone, porém sem a presença deste.
Ao exame macroscópico das lâminas observou-se que mesmo com a retirada
do cone da capa escleral, o material permaneceu com a forma cônica.
As observações foram feitas em todos os animais que compuseram a amostra
e estão descritas separadas por momento do estudo.
Resultados
82
4.1 - Observações Histológicas feitas em M1
4.1.1. Grupo A
Após sete dias do procedimento de evisceração com a colocação dos cones
na cavidade anoftálmica (M1), na interface entre a parte interna da esclera e a externa
do material estudado, observou-se tecido necrótico e a formação de tecido regenerativo,
composto por uma rede de fibrina contendo células de formato fusiforme e de núcleo
arredondado, compatível com morfologia de fibroblastos jovens, além de hemácias,
células inflamatórias (principalmente neutrófilos) em meio à rede de fibrina e edema,
quadro correspondente a inflamação do tipo aguda (figura 16A). Pequenos fragmentos
do biomaterial, assim como alguns neovasos, foram observados em meio à reação
tecidual. A esclera apresentava-se edemaciada, principalmente na porção anterior, nos
locais coincidentes com a sutura esclero-escleral. O fio de sutura estava presente e ao
redor do mesmo a reação inflamatória era mais acentuada.
Neste momento já era possível observar a formação da pseudocápsula,
composta por acúmulo de fibroblastos e células inflamatórias, dispostos de maneira
circular e a envolver a maior parte da porção interna da capa escleral.
4.1.2. Grupo B
A resposta regenerativa tecidual presente neste momento foi semelhante ao
que se observou no Grupo A no momento 1, ou seja, revestindo a face interna da capa
escleral havia aglomerado de células inflamatórias e hemácias em meio à rede de
Resultados
83
fibrina. O processo inflamatório em alguns lugares foi mais intenso, observando-se na
coloração de HE, grumos de intensa coloração roxa, correspondendo ao acúmulo de
células necróticas (Figura 16B). Em alguns lugares, notou-se a presença de
birrefringência, localizada na superfície interna da esclera e permeando a resposta
reparativa.
4.1.3. Grupo C
A análise histológica deste grupo mostra que o processo reparativo foi
semelhante ao que o ocorreu nos demais grupos, em especial ao grupo B (Figura 16C).
Resultados
84
Figura 16. Cortes histológicos referentes à reação de reparação tecidual formada entre a
esclera e os cones no M1 (seta). A) Biovidro. B) Biovitrocerâmico I. C) Biovitrocerâmico II.
Em todos os cortes nota-se a pseudocápsula, formada por fibroblastos, hemácias e células
inflamatórias( HE 40X ).
A
B
C
Resultados
85
4.2. Observações Histológicas feitas em M2
4.2.1. Grupo A
Após 90 dias do procedimento de evisceração com a colocação dos cones na
cavidade anoftálmica (M2), na interface entre a parte interna da esclera e a externa do
material estudado havia menor quantidade de células inflamatórias. A pseudocápsula
apresentava-se mais densa, composta por fibroblastos contendo núcleos menores que os
observados em M1, estando aparentemente menos espessa e com menor quantidade de
hemácias e de edema tecidual (figura 17A). Presença de neovasos contendo hemácias.
4.2.2. Grupo B
As características descritas para o grupo A se repetiram no grupo B (figura
17B).
4.2.3. Grupo C
As características descritas para o grupo A e B se repetiram no grupo C
(figura 17C).
Resultados
86
Figura 17. Cortes histológicos referentes à reparação tecidual formada entre a esclera e os
cones no M2. A) Biovidro. B) Biovitrocerâmico I. C) Biovitrocerâmico II. Nota-se a
pseudocápsula menos espessa, principalmente no grupo A (HE 40X).
A
C
B
Resultados
87
4.3. Observações Histológicas feitas em M3
4.3.1. Grupo A
Após 180 dias do procedimento de evisceração com a colocação dos cones
na cavidade anoftálmica (M3), na interface entre a parte interna da esclera e a externa
do material estudado, não se observava mais o edema; presença de neovasos contendo
hemácias. Reação inflamatória escassa (Figura 18A). Os fragmentos do biovidro
encontravam-se envoltos pelo tecido conjuntivo reparativo, com ausência de reação
inflamatória, identificados como áreas de birrefringência.
4.3.2. Grupo B
As características descritas para o Grupo A se repetiram no Grupo B (figura
18B).
4.3.3. Grupo C
As características descritas para o Grupo A e B se repetiram no Grupo
C(figura 18C).
Resultados
88
Figura 18: Cortes histológicos referentes à reparação tecidual entre a esclera dos coelhos e os
cones no momento 3 (M3).. A) Biovidro. B) Presença do biomaterial (seta) envolto por tecido
reparativo do hospedeiro C) Biovitrocerâmico. D) Biovitrocerâmico II. Nota-se pseudocápsula
formada por fibroblastos, ausência de edema e pequena reação inflamatória (HE 40X).
4.4. Resultados do exame morfométrico
4.4.1. Avaliação da espessura da pseudocápsula
A avaliação da espessura da pseudocápsula que se formou ao redor dos
cones está apresentada na tabela 11.
No grupo A, a avaliação da espessura da pseudocápsula mostrou-se maior
em M1 em relação aos momentos M2 e M3, na posição chamada de 9 horas. O mesmo
ocorreu no grupo B, na posição anterior e posterior, e no grupo C, na posição posterior.
A
B
C
D
Resultados
89
Na região anterior, a pseudocápsula encontrou-se mais espessa no grupo B
em M1 e no grupo C, em M3.
Ao comparar os biomateriais, o grupo C apresentou a pseudocápsula mais
espessa em M1 na região denominada posterior e em M3, na anterior e às 9h, quando
comparado aos grupos A e B.
No M1, nas posições posterior e 3 horas, a espessura da pseudocápsula foi
maior nos Grupos B e C, quando comparados com o Grupo A.
Apesar de não se ter observado diferença estatística significativa para a
maioria das comparações entre os grupos A, B e C, houve uma tendência de valores
menores para a espessura da pseudocápsula nos animais do Grupo A, os que receberam
o biovidro, em todos os locais de medição (anterior, posterior, 3horas e 9horas).
Resultados
90
Tabela 11. Mediana e valores máximo e mínimo referentes à espessura da
pseudocápsula formada entre a esclera e os cones, em cavidades evisceradas de coelhos,
segundo grupo, momento de avaliação e região onde foi realizada a observação.
Momento Grupo Região
M1 M2 M3
Anterior
21,945 (12,397; 37,596) 10,833 (4,714; 25,710) 18,828 (11,209; 35,136)
Posterior
20,230 (10,292; 23,320) 12,730 (7,004; 19,503) 15,652 (8,522; 19,007)
A
3 horas
18,282 (13,444; 23,797) 10,222 (6,451; 20,041) 12,451 (10,735; 32,262)
9 horas
25,206 (20,693; 51,633)* 14,481 (5,358; 19,485) 13,792 (10,537; 30,120)
Anterior
93,854 (23,634; 108,932)*
# α
12,746 (5,533; 30,881) 14,948 (10,419; 21,911)
Posterior
49,759 (18,125; 59,581)* 12,836 (7,036; 60,532) 17,456 (9,993; 44,070)
3 horas
15,094 (11,974; 65,345)
α
22,132 (10,312; 28,586) 19,446 (12,899; 73,155)
B
9 horas
30,894 (18,155; 47,194)* 12,235 (9,134; 27,000) 16,236 (14,223; 31,315)
Anterior
47,138 (24,291; 128,852) 20,341 (10.090; 67,763) 73,796 (20,112; 126,212)
#∆
Posterior
51,970 (34,444; 137,236)*
∆
19,397 (6,833; 47,915) 17,075 (12,158; 48,799)
3 horas
35,644 (13,905; 51,501) 16,371 (5,147; 43,442) 23,530 (17,135; 37,503)
C
9 horas
37, 538 (13,861; 235,228) 17,343 (5,593; 40,870) 33,352 (10,059; 40,795)
∆
* (P<0,05) M1 x (M2,M3)
#
(P<0,05)
Anterior x (Posterior, 3h, 9h)
∆
(P<0,05) C x (A, B)
α
(P<0,05) Bx A
4.4.2. Avaliação da celularidade existente na pseudocápsula
A avaliação da celularidade observada na pseudocápsula que se formou ao
redor dos cones está apresentada na Tabela 12.
Quanto à celularidade, quando se compara os momentos dentro de cada
grupo, observa-se redução significativa da quantidade de células inflamatórias de M1
para M2 e M3. Observou-se, ainda, a inflamação mais importante nos implantes do
Grupo C (biovitrocerâmico II) no M1 em relação aos Grupos A e B.
Resultados
91
Tabela 12. Mediana e valores máximo e mínimo referentes à celularidade observada
nos tecidos regenerativos formados entre a esclera e os cones, em cavidades evisceradas
de coelhos, segundo grupo e momento de avaliação.
Momento
Grupo
M1 M2 M3
A
2+ (1; 2) 1+ (1; 3) 1+ (1; 2)
B
2+ (2; 2) 2+ (1; 3) 1,5+ (1; 2)
C
3+ (3;3)*
#
2+ (1; 2) 2+ (1; 2)
* (P<0,05) C x (A,B)
# (P<0,05) M1 x (M2, M3)
4.4.3. Avaliação do colágeno
Para análise da quantidade de colágeno existente nas pseudocápsulas, com os
valores encontrados em cada lâmina foi calculada a média e o desvio padrão, nos
momentos M1 e M3, analisadas e calculadas automaticamente pelo software de análise de
imagens Image Pro-plus (figura 19).
Figura 19. Corte histológico referente à reparação tecidual formada entre a esclera e os
cones no Grupo A, em M1. As fibras colágenas coradas em vermelho; os miócitos em
amarelo; e os espaços em branco. Picrosirius Red (PR 40X).
Resultados
92
A M1
B
M
1
C M1
A M3
B
M3
C M3
0.000
0.005
0.010
0.015
Grupos e Momentos de avaliação
Colágeno
Gráfico 1. Mediana, valores máximo e mínimo, da quantidade de colágeno encontrado na
interface entre a esclera e os cones, segundo grupo e momentos de estudo.
A M1= grupo A e momento 1
B M1= grupo B e momento 1
C M1= grupo C e momento 1
A M3= grupo A e momento 3
B M3= grupo B e momento 3
C M3= grupo C e momento 3
* (P<0,05) M1 > M3
A avaliação dos valores médios observados nas medidas da quantidade de
colágeno existente na pseudocápsula foi semelhante para os três grupos experimentais,
tanto no momento M1, como no M3. Comparando-se os valores de cada grupo nos
momentos M1 e M3, houve diferença estatística apenas no grupo B, quando a quantidade
de colágeno foi maior no momento M1, tanto para a média quanto para o desvio padrão
(Gráfico 1).
*
Resultados
93
A avaliação dos percentuais de colágeno encontrado na pseudocápsula dos três
grupos estudados nos dois momentos de avaliação, mostrou que não havia diferença entre
os grupos, tanto no momento M1, como no M3. Comparando-se os momentos fixando-se o
grupo, a análise estatística mostrou que no grupo B os valores observados, foram maiores
no M1 (Tabela 13).
Tabela 13. Porcentagem de colágeno avaliada no exame de lâminas coradas por
Picrosirius Red segundo implante e momento, e seus valores máximo e mínimo.
Momento de avaliação Grupo
M1 M3
A
0,0618 (0,0068; 0,3190) 0,0101 (0,0095; 0,812)
B
0,1670 (0,0725; 0,4210)* 0,0283 (0,0088; 0,7820)
Porcentagem
C
0,0869 (0,0298; 0,2690) 0,0143 (0,0033; 0,2100)
*((P<0,05) M1>M3
4.5. Avaliação Tomográfica
A Tomografia Computadorizada, realizada nos coelhos com 45 dias pós
cirurgia de evisceração e colocação dos cones, incluiu todos os animais dos momentos M2
e M3. Não houve nenhuma perda de animal em decorrência do ato anestésico ou por outro
motivo durante este procedimento.
As imagens tomográficas foram avaliadas individualmente, em três dimensões,
não tendo sido encontradas imagens sugestivas de coleção purulenta, de deslocamento ou
ausência dos cones nas cavidades orbitárias (figura 20).
Resultados
94
Figura 20. Tomografia computadorizada realizada nos coelhos em posição ventral com o crânio
apoiado e elevado. Os cortes foram feitos de 1x1mm (1mm de espessura por 1mm de intervalo
de reconstrução) e as imagens avaliadas em janela óssea e de partes moles, com o FOV ( Field
Of View- Campo de Visão) de 11 cm. Observar imagem do cone na cavidade orbitária (seta).
4.5.1. Observações Tomográficas feitas no Grupo A
Cortes tomográficos transversais da cavidade orbitária dos coelhos
mostraram que a simetria da órbita operada com a contralateral foi mantida em todos os
animais, não havendo alterações de estrutura óssea ou de partes moles. Nenhum animal
desenvolveu extrusão do cone implantado. Em alguns coelhos, o posicionamento dos
cones não foi mantido com o ápice na posição posterior, porém em todos, os cones
permaneceram dentro da cavidade orbitária, na posição central, sendo possível observar
as paredes ósseas da órbita e os músculos extra-oculares na posição anatômica.
Coleções, edema, sinais infecciosos ou outras alterações não foram detectadas (Figura
21).
Resultados
95
Figura 21. Cortes tomográficos do crânio do coelho na posição transversal, onde se
observa na órbita direita, o cone de biovidro e, na esquerda, o bulbo ocular.
4.5.2. Observações Tomográficas feitas no Grupo B
Cortes tomográficos transversais da cavidade orbitária dos coelhos
mostraram-se idênticos aos observados nos animais do Grupo A, com simetria das
órbitas e sem alterações de estrutura óssea ou de partes moles. Nenhum animal
desenvolveu extrusão do cone implantado e também neste grupo o posicionamento dos
cones não foi mantido com o ápice na posição posterior, embora tenham permanecido
na posição central. Coleções, edema, sinais infecciosos ou outras alterações não foram
detectadas (Figura 22).
Resultados
96
Figura 22. Cortes tomográficos do crânio do coelho na posição transversal, onde se observa na
órbita direita, o cone de biovitrocerâmico I e, na esquerda, o bulbo ocular.
4.5.3. Observações Tomográficas feitas no Grupo C
Cortes tomográficos transversais da cavidade orbitária dos coelhos
mostraram-se idênticos aos observados nos animais dos Grupo A e B, com todas as
características dos grupos anteriores mantidas nestes animais (Figura 23).
Resultados
97
Figura 23. Cortes tomográficos do crânio do coelho na posição transversal, onde se
observa na órbita direita, o cone de biovitrocerâmico II e, na esquerda, o bulbo ocular.
4.6. Avaliação dos cones ao Microscópio Eletrônico de Varredura
O exame ultra-estrutural foi realizado em animais do M3, avaliando-se a
superfície dos cones.
Foi possível observar que a superfície dos diferentes biomateriais
apresentava-se distinta na parte mais externa, local de contato com os tecidos do
hospedeiro.
Resultados
98
4.6.1. Observações Ultra-estruturais com Microscopia Eletrônica de
Varredura, feitas no Grupo A
Nos materiais preparados para exame de ultra-estrutural da superfície dos
cones, há nítida linha de fratura, separando uma estreita camada superficial de outra
mais profunda. A linha de fratura tem estrutura regular, retilínea, de espessura
homogênea, deixando espaço constante entre as duas camadas. Sobre o biomaterial há
“rachaduras” de formato irregular, de aspecto semelhante a figuras geométricas. Na
porção superficial destas duas camadas que se formaram, é possível observar maior
rugosidade A quantidade de fibrose e células inflamatórias sobre o material é pequena,
sendo possível observar o biovidro não revestido em várias localizações (Figura 24).
No efeito de corte induzido para o preparo do material, o biovidro forma pequenas
placas que se desprendem, expondo na porção mais profunda uma superfície muito lisa,
brilhante e mais escura (figura 25).
Resultados
99
Figura 24. Imagem referente a animal do grupo A em M3. Fratura da camada mais externa
do cone, separando uma camada mais densa do biomaterial. Na região mais interna o
biovidro apresenta microfraturas (MEV 450X).
Resultados
100
Figura 25. Imagem referente a animal do grupo A em M3. Fratura retilínea na superfície
de contato do biovidro da esclera (seta). Efeito de corte induzido para o preparo do
material, o biovidro forma pequenas placas que se desprendem. Esclera (E)(MEV 37X).
4.6.2. Observações Ultra-estruturais com Microscopia Eletrônica de
Varredura, feitas no Grupo B
Observa-se uma linha de fratura na camada superficial do material, irregular em
forma e espessura, que separa o biomaterial em duas camadas distintas (figura 26). A linha
é paralela a superfície, com porções retilíneas e segmentos angulares. Na porção superficial
destas duas camadas que se formaram, é possível observar maior rugosidade. Em detalhe, a
rugosidade, corresponde à fibrose formando uma verdadeira capa que reveste o material,
entremeada por poucas hemácias e células inflamatórias. Na camada mais profunda, a
superfície dos cones mostra-se mais lisa, com menor quantidade de células e com inúmeras
E
Resultados
101
“rachaduras” de formato de figuras geométricas, sem que exista separação da camada
subjacente (figura 27). No efeito de corte induzido para o preparo do material, a superfície
é lisa.
Figura 26. Imagem referente a animal do grupo B em M3. Presença da linha de fratura na
camada superficial do material, separando o biomaterial em duas camadas distintas (MEV
38X).
Resultados
102
Figura 27. Imagem referente a animal do grupo B em M3. Presença das camadas
superficial e profunda, com inúmeras “rachaduras” de formato de figuras geométricas
(seta) (MEV 549X).
4.6.3 Observações Ultra-estruturais com Microscopia Eletrônica de
Varredura, feitas no GrupoC
A camada superficial é separada da profunda por linha de fratura semelhante
a do Grupo B, ou seja, possui forma irregular, distância entre as duas partes que não é
homogênea e não retilínea, com segmentos angulares. A superfície entre o biomaterial e
o hospedeiro possui grande quantidade de fibrose que não permite a observação do
biomaterial, com poucas células inflamatórias e poucas hemácias (figura 28). Em maior
aumento, a capa de fibrose é vista como uma superfície algodonosa que envolve todo o
cone (figura 29). No efeito de corte induzido para o preparo do material, a superfície é
lisa.
Resultados
103
Figura 28. Imagem referente a animal do grupo C em M3. Superfície entre o
biomaterial e o hospedeiro com grande quantidade de fibrose, não permitindo a
observação do biomaterial, com poucas células inflamatórias e poucas hemácias (MEV
120X).
Resultados
104
Figura 29. Imagem referente a animal do grupo C em M3. Presença de capa de fibrose
é vista como uma superfície algodonosa que envolve todo o cone e não permite
visibilizá-lo (MEV 469X).
Discussão
105
5. DISCUSSÃO
1. Escolha do tema e modelo experimental
Este estudo foi desenvolvido com a intenção de avaliar a biocompatibilidade
do biovidro, do biovitrocerâmico I e do biovitrocerâmico II em cavidades evisceradas
de coelhos, com o intuito de decidir se estes materiais, produzidos no Laboratório
fornecedor, podem ser utilizados na reparação das cavidades enucleadas ou evisceradas,
e qual dentre eles seria a melhor opção.
Para isso, foi utilizado um modelo experimental já estabelecido, empregado
em outras pesquisas feitas nesta mesma Instituição, seguindo dentro da linha de
pesquisa da orientadora do estudo.
A escolha pelo coelho foi feita, por ser este animal de fácil manipulação e
manutenção, volume orbitário suficiente para a realização do procedimento de
evisceração e colocação de uma inclusão, ser de baixo custo e de estar disponível em
biotério especializado para criação e manutenção de nossa Instituição, além de se ter
amplo domínio deste modelo experimental para este tipo de pesquisa. Também os
procedimentos anestésicos, de administração de drogas e de manipulação para exames é
mais simples quando se usa animais de pequeno porte.
A comparação entre três materiais diferentes foi adotada no sentido de se
testar, em cavidade anoftálmica, os biomateriais fabricados a partir do vidro que já
estão sendo testados em outras áreas da Medicina e Odontologia.
O procedimento dos três materiais foram realizados simultaneamente a fim
de se avaliar a evolução temporal no tempo de estudo, excluindo-se variações
climáticas e outras possíveis variáveis que pudessem influenciar nos resultados obtidos.
Discussão
106
2. Quanto ao desenvolvimento dos cones para o estudo
Apesar de o material usado para a fabricação dos cones já ser conhecido, a
fabricação destes para o uso em cavidade anoftálmica não havia sido realizada. Para
isso, dados relativos ao tamanho necessário dos cones foram obtidos de estudos
prévios, alguns realizados nos nossos laboratórios, chegando-se a conclusão que seria
possível usar uma inclusão de 10 a 12 mm em cavidades orbitárias de coelhos em fase
de desmame (SEKUNDO; SEIFERT, 1998; SCHELLINI et al., 2003; FERRAZ et al.,
2006; BRITO, 2008).
Como a intenção do presente estudo era estudar inclusões com formato de
cones ao invés de esferas, foi necessário realizar estudos “piloto”, partindo-se da
dissecção do crânio do coelho, com avaliação do volume orbitário. A partir destas
avaliações, chegou-se no formato e tamanho da prótese a ser fabricada: diâmetro
anterior de 10 mm, posterior de 3 mm e comprimento de 12 mm.
Para a confecção do formato estabelecido, foi optado usar um molde de
grafite de alta precisão. Inicialmente este molde tinha o formato do cone posterior e a
parte anterior aberta. Porém, com os primeiros cones confeccionados, devido à tensão
de superfície do vidro, observou-se que a parte anterior terminava com formatos
diferentes (figura 30). Assim, optou-se por realizar um molde usando vácuo anterior
(figura 31) para que todos tivessem a mesma forma final, sendo a parte externa formada
pelo vácuo, retirada e polida (figura 32), mantenho a simetria de forma, de tamanho e
peso em todas as próteses produzidas, mesmo utilizando-se materiais diferentes no
processamento, como o biovidro ou o biovitrocerâmico (figura 33).
Discussão
107
Figura 30. Primeiras próteses de vidro com formatos anteriores diferentes devido à
tensão de superfície.
Figura 31. Molde de grafite de alta precisão, considerados a melhor opção para a
obtenção de cones de mesmo padrão de formato e tamanho.
Discussão
108
Figura 32. Formato da prótese de biovidro antes e após a aplicação do vácuo em sua
confecção.
Figura 33. Prótese cônica de biovidro após o desbaste/lixamento.
Discussão
109
Na própria confecção das próteses, há formação de substâncias químicas que
são capazes de apresentar interação com os tecidos do hospedeiro. Desta forma, optou-
se por testar estes cones de biovidro, biovitrocerâmico I e biovitrocerâmico II, partindo
de estudos anteriores sobre integração dos materiais com o hospedeiro (IORDANIDOU;
DE POTTER, 2004) , na tentativa de se obter menor resposta inflamatória e menor
chance de extrusão das próteses.
Assim, delineou-se este estudo, comparativo entre três diferentes tipos de
biomateriais. Entretanto, é importante ainda se conhecer características específicas
destes biomateriais.
Após os estudos “piloto”, conseguiu-se a confecção estável das próteses em
forma de cone para o estudo em questão. Porém, após a produção do biovidro e dos
biovitrocerâmicos I e II, não deve haver o contato dos biomateriais com o ar e nem com
a água, necessitando eles permanecer em vácuo ou conservados em banho de acetona
até que sejam esterilizados.
A esterilização deve ser feita em óxido de etileno, devendo ser feita a
utilização cirúrgica em curto período de tempo, devido ao risco de mudança da estrutura
do três biomateriais com o passar do tempo.
Ou seja, é necessário conhecer as características físico-químicas dos
biomateriais que estarão sendo empregados, a fim de que se trabalhe dentro do que se
considera como padrão dentro do assunto.
3. Avaliação clínica dos animais e a análise da biocompatibilidade
Para a análise da biocompatibilidade dos materiais utilizados, procedeu-se a
avaliações clínicas diárias quanto à saúde geral e alterações locais da área cirúrgica,
Discussão
110
exame do peso dos animais e avaliações bioquímicas no início e final do experimento,
exame de tomografia computadorizada no período de 45 dias após o início do
experimento e avaliações morfológicas, realizadas ao final do período experimental.
A evolução clínica e do peso dos animais demonstrou que não houve
interferência dos procedimentos realizados com a homeostase, havendo ganho de peso
ao longo do tempo, o que já demonstra um curso normal de crescimento dos animais.
Os exames bioquímicos
Os exames bioquímicos foram realizados para a análise de toxicidade, ou
seja, com o intuito de conhecer se o material de que foram confeccionados os cones
poderia ser absorvido sistemicamente e acarretar repercussões para a saúde geral dos
animais. Para isso foram avaliadas a função hepática (TGO, TGP, LDH, FA), cardíaca
(CPK) e renal (Uréia, Creatinina).
Tendo em vista que no laboratório veterinário utilizado para esta pesquisa
não há parâmetros de referência de normalidade para os exames realizados em coelhos
como existe para humanos, foram colhidos exames antes da colocação dos cones,
considerado o momento zero ou o padrão de normalidade para o estudo bioquímico,
comparando-se com o obtido no momento do sacrifício, conforme já descrito por outros
(BRITO, 2008; TURNER et al., 2009). (TURNER et al., 2009). Ou seja, com os valores
obtidos no M0 foram feitas as outras comparações. Além disso, a maioria dos exames
bioquímicos colhidos foi coincidente com os empregados por outros pesquisadores
(YAMADA et al., 2004), o que permitiu que fossem feitas comparações entre estudos,
tendo sido observados resultados semelhantes.
Discussão
111
Assim, com a análise dos exames laboratoriais, tentou-se detectar se a
colocação dos cones poderia produzir alguma alteração no organismo, através de
exames que refletem o funcionamento dos órgãos vitais (coração, fígado e rim).
Alterações que poderiam ser encontradas nas dosagens pesquisadas poderiam inferir que
o biomaterial pudesse ter sofrido absorção, atingido a circulação e assim, produzir
efeitos deletérios ao organismo, devido a possíveis componentes tóxicos, mesmo à
distância.
A avaliação dos parâmetros bioquímicos estudados mostrou que algumas
variações existiram. Entretanto, no geral, as variações foram discretas e, embora com
algumas diferenças estatísticas constadas, não houve motivo para acreditar que as
variações não fossem apenas fisiológicas, sem significado clínico, mesmo porque
muitas vezes os valores finais foram inferiores aos iniciais.
Desta forma, tais indicadores permitiram considerar que a presença dos
cones de biovidro e biovitrocerâmico I e II não foram prejudiciais ao rim, fígado e
coração, sendo possível considerar que os mesmos não interferiram na saúde geral dos
animais.
Avaliação da resposta cicatricial ao redor dos cones
Todo material estranho que é implantado em um organismo vivo gera uma
reação inflamatória que no presente estudo revelou-se desde o início (sete dias) com a
formação de uma pseudocápsula ao redor dos cones, composta inicialmente por fibrina,
que dará origem aos fibroblastos, além de células inflamatórias, hemácias e neovasos,
denotando o processo de reparação tecidual. Esta pseudocápsula formada era composta
por tecido conjuntivo frouxo no início e que foi se tornando mais denso, o que foi
Discussão
112
comprovado pelo exame morfométrico. A pseudocápsula é um tecido conjuntivo
formado ao redor de qualquer corpo estranho ou processo inflamatório que se forme no
sítio de lesão, dessa forma tentando deter a inflamação que ocorre no local.
Os animais do M1 apresentavam ainda bastante edema dos tecidos, presença
de fibrina e de muitas hemácias, demonstrando resposta recente ao ato cirúrgico.
As células inflamatórias se modificam no sítio de reparação com o passar
do tempo, passando de resposta inflamatória aguda para crônica. No início é comum o
encontro dos neutrófilos, às vezes em grande quantidade, células características da
resposta inflamatória aguda e neovasos. Com o passar do tempo, as características da
resposta inflamatória passam para a fase crônica, observando-se os fibroblastos com
sinais de células maduras. Estas mudanças caracterizam um processo de cicatrização
(COTRAN et al., 1994) , com substituição do tecido lesado, por tecido conjuntivo.
A resposta inflamatória no sítio de implantação dos cones diminuiu
gradativamente ao longo do período experimental. Esta mesma observação foi feita
usando-se outros materiais (ANDERSON et al., 2002; FERRAZ et al., 2006; BRITO,
2008), podendo ser esta uma característica que indica ser o biomaterial compatível.
Em casos de implante uma placa de proteína morfogenética no assoalho da
órbita de coelhos, foi verificada a existência de uma camada de tecido inflamatório
envolvendo o implante após sete dias e, passados 30 dias, houve redução da espessura
desse tecido, não havendo mais sinais de atividade inflamatória após 90 dias.(FERRAZ
et al., 2007)
Alguns materiais suscitam o aparecimento de “células gigantes”. Caso
surgissem estas células, poderia haver a fagocitose de partes do material implantado,
como já observado com esferas de hidroxiapatita sintética (RANZANI et al., 1997).
Discussão
113
Desta forma, outros fenômenos poderiam ser evidenciados, como a redução do volume
do cone, por exemplo, que não foi detectado nem pelo exame de tomografia realizada
aos 45 dias (animais dos três grupos pertencentes aos momentos M2 e M3) e nem na
avaliação do cone ao ser extraído do organismo e destinado a avaliação histológica.
Outro fenômeno possível seria que fragmentos do cone implantado poderiam ganhar a
circulação, chegando até outros locais distantes, podendo ocorrer deposição em órgãos e
sistemas, lesando-os. Devido a esta possibilidade, justificou-se o estudo dos exames
bioquímicos, já comentados.
Um fator considerado positivo foi a não observância de alterações locais, não
tendo ocorrido nenhuma extrusão dos cones implantados ou inflamação que fosse
importante. Além disso, a resposta tecidual pode ser considerada semelhante a que
ocorre quando se utilizam outros materiais em cavidades (RANZANI et al., 1997;
FERRAZ et al., 2006; BRITO, 2008).
Análise quantitativa da espessura da pseudocápsula e da
celularidade nos implantes de biovidro, biovitrocerâmico I e biovitrocerâmico II
A pseudocápsula, após a implantação de cones de biovidro, biovitrocerâmico
I e biovitrocerâmico II, foi mais espessa no início do período experimental, nos três
tipos de materiais utilizados. Isso porque logo após a implantação existem os fenômenos
inflamatórios da fase aguda, com grande exsudação de líquidos e afluxo de células para
o sítio cirúrgico (sete dias- M1). Com o passar do tempo, houve redução da espessura da
pseudocápsula, sendo a espessura menor nos momentos M2 (90 dias) e M3 (180 dias),
quando comparados ao momento M1 (sete dias). Os fenômenos que explicam esta
Discussão
114
redução podem ser: a redução do edema, das hemácias e a diminuição da quantidade de
células inflamatórias (o que também foi constatado em exame quantitativo).
A comparação da espessura da pseudocápsula entre os biomateriais
demonstrou que no grupo C ela era mais espessa aos sete e 180 dias, sinal de que o
biovitrocerâmico II causou maior reação inflamatória durante todo o experimento.
Esta pseudocápsula, em cada momento do estudo, apresentava-se com
diferença de espessura nos diferentes locais de medida, o que nos levou a estabelecer
locais fixos para a avaliação (anterior, posterior, 3 e 9 horas). A avaliação estatística
destas variações mostrou que a região denominada anterior, era a mais espessada em
relação à posterior, 3h e 9h, nos M1 e M3, devido possivelmente a resposta inflamatória
mais exacerbada, pois foi evidente que na região do sítio cirúrgico e local da sutura com
o uso de fio não absorvível, havia maior processo inflamatório. Além disso, esta região
fica mais exposta aos fatores ambientes que as demais, com maior risco de
contaminação. Esta diferença havia sido observada ao exame macroscópico da lâmina
de HE e foi confirmada pela avaliação morfométrica.
Os resultados encontrados na espessura da pseudocápsula são semelhantes
aos encontrados por França (2005) ao estudar um compósito bioativo de matriz
polimérica.
O exame morfométrico confirmou também a redução da espessura da
pseudocápsula, com valores estatisticamente significativos, ao longo do experimento,
fato considerado muito positivo, uma vez que os materiais testados mostraram não
suscitar grandes reflexos em termos de inflamação tecidual tardia.
Neste mesmo sentido, a reação inflamatória aferida nas lâminas foi
estatisticamente significativa no momento M1 (sete dias), sendo maior nos Grupos B e
Discussão
115
C (biovitrocerâmico I e II) em comparação com o Grupo A (biovidro). Esta diferença
também foi observada no Grupo C em relação aos momentos do estudo, ou seja, com
diminuição significativamente importante do M1 para o M2 e M3 (RANZANI et al.,
1997; FERRAZ et al., 2006; BRITO, 2008).
Análise do colágeno nos cones de biovidro, biovitrocerâmico I e
biovitrocerâmico II
A avaliação do colágeno não demonstrou diferença estatística entre os
grupos nos três momentos do estudo. Mesmo tendo sido encontrado diferença estatística
no Grupo B entre os momentos M1 e M2, estes valores não foram altos e nem muito
diferentes aos observados nos Grupos A e C. Com estas observações pode-se verificar
que os cones implantados não geraram resposta inflamatória exacerbada e assim não
produziram cicatrização anormal dos tecidos cicatriciais, não formando fibrose
importante no local de contato entre o cone e o tecido do hospedeiro, nem mesmo na
região anterior, local do sítio cirúrgico.
4. Avaliação da Tomografia Computadorizada
Às imagens obtidas no exame de Tomografia Computadorizada dos coelhos
observou-se bom posicionamento dos cones na órbita do coelho, sendo este exame um
excelente método diagnóstico para avaliação do material implantado na cavidade
anoftálmica. A desvantagem é a necessidade de anestesia do animal para a realização do
exame, uma vez que este não pode se mover durante a realização do procedimento.
Somente uma analgesia do animal foi tentada, mas impediu a realização da Tomografia
Discussão
116
por ser rápida a recuperação do coelho que acordava durante a tomada das imagens pelo
aparelho.
Com o exame foi possível avaliar a ausência de coleções e processos
infecciosos ao redor dos cones e observar a simetria existente entre o lado operado e o
contra-lateral. Também pode ser observado que os cones não receberam vascularização
em seu interior, o que seria de se esperar, já que os mesmos não possuem poros. Este
procedimento foi muito empregado para observar o tempo de colonização das inclusões
integráveis, tomado como parâmetro para a colocação dos pinos, o que não foi nosso
objetivo no presente estudo.
O posicionamento do cone intraorbital não mantido com o ápice posterior e
apresentando diferentes posições, observado no exame de Tomografia
Computadorizada, pode ter sido causado durante o ato cirúrgico e não ser ter sido
ocasionado pelo material ou resposta inflamatória, isso porquê, durante o procedimento
cirúrgico, após a colocação do biomaterial na cavidade escleral, observou-se que quanto
menor era esta cavidade, já durante a sutura esclero-escleral, o cone mudava de posição
em que era inicialmente colocado. Como o processo de integração entre material e
hospedeiro inicia-se sete horas após o contato com fluídos (PEITL et al., 2001), o
material deve ter ficado na posição do final da cirurgia.
5. Avaliação da Microscopia Eletrônica de Varredura
Os fenômenos observados no exame ultra-estrutural podem ser explicados
pelas alterações físico-químicas que ocorrem na superfície dos biomateriais quando
possuem contato com o tecido vivo.
Discussão
117
Os cones, logo após entrarem em contato com os fluídos dos tecidos vivos,
começam a sofrer alterações em sua composição físico-química, através da seqüência de
cinco etapas de reações:
1) Lixiviação seletiva: Rápida troca iônica entre a solução, doadora de
prótons H
+
, e a superfície do biovidro liberando sódio (Na), potássio
(K) e ou fósforo. Formando assim os grupos silanois, Si-OH, na
superfície da inclusão..
2) Dissolução química
: ruptura das ligações químicas -Si-O-Si-
formando na solução os grupos Si(OH)
4
. Na superfície atacada do
biovidro permanece os grupos silanois
.
3) Repolimerização ou condensação: formação da fase gel rica em
SiO
2
, com a formação de “grandes poros” pela reincorporarão á
superfície dos grupos Si(OH)
4
presentes na solução.
4) Fosfato cálcio amorfo: migração do Ca
2+
e PO
3-
4
, que aumenta
gradativamente devido à corrosão dos íons e também aqueles
lixiviados nas etapas anteriores. O acumulo destes íons sobre a
camada rica em sílica, forma a CaO-P
2
O
5
amorfa.
5) Cristalização
: formação do hidroxi-carbonato apatita (HCA) via
incorporação de grupos hidroxila e ânios CO
2-
3
da solução (PEITL
et al., 2001).
Estes processos levam a formação de uma dupla camada (item 3 e 5), uma de
gel e outra de apatita. Esta camada ao sofrer ressecamento pelo glutaraldeído para
preparação do material para análise ao Microscópio de Varredura, destacou-se por
trincamento, sendo visível a análise das peças.
Discussão
118
Além disso, devido à fase de repolimerização e conseqüente a formação de
poros na superfície, foi possível identificar a integração do material com o hospedeiro
(figura 34).
Figura 34. Imagem da Microscopia Eletrônica de Varredura. A) biomaterial. B)
integração. C) material do hospedeiro.
A análise das imagens ultra-estruturais mostrou que na parte externa do
cone em contato com o tecido do hospedeiro, houve a formação de uma capa de
resposta inflamatória menor nos cones de biovidro em relação aos de biovtitrocerâmico
I e II, observado pela possibilidade de se visualizar o material no grupo A e não no B e
C e pela quantidade de células encontradas. Estes achados confirmam os observados na
microscopia óptica e apontam para a superioridade do biovidro (Grupo A), em relação
aos demais.
A
B
C
Conclusão
119
6. CONCLUSÃO
Após as análises realizadas e frente às condições experimentais empregadas,
pode-se concluir que:
- a colocação dos cones nas cavidades evisceradas mostrou que não houve
interferência dos mesmos com parâmetros clínicos, permanecendo os animais com a
saúde geral inalterada, assim como com ausência de sinais desfavoráveis no local de
implantação;
- a análise morfológica apontou para a superioridade dos cones de biovidro,
os quais apresentaram menor reação inflamatória e menor formação da pseudocápsula
que os cones de biovitrocerâmico I e II;
- o exame tomográfico mostrou que os cones não migraram e que não houve
formação de coleções ou processo inflamatório ao redor dos mesmos nos três grupos
experimentais;
- a análise feita por Microscopia Eletrônica de Varredura confirmou que os
cones de biovidro apresentaram menor reação inflamatória que os demais.
Sendo assim, pode-se concluir que os cones de biovidro e os de
biovitrocerâmico I e II podem ser úteis para a reparação de cavidades anoftálmicas. Os
cones de biovidro mostraram-se superiores aos de biovitrocerâmico, devido ao fato de
provocarem menor reação inflamatória tecidual.
Referências Bibliográficas
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Apêndice
126
08. APÊNDICE
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