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LIA MARA ROSSI
IMUNOEXPRESSÃO DA AROMATASE,
CICLOXIGENASE-2 E RECEPTORES DE ESTRÓGENO EM
LIGAMENTOS UTEROSACRAIS DE MULHERES
PORTADORAS DE ENDOMETRIOSE
PÉLVICA PROFUNDA
Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de
Doutor em Ciências.
São Paulo
2010
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
LIA MARA ROSSI
IMUNOEXPRESSÃO DA AROMATASE,
CICLOXIGENASE-2 E RECEPTORES DE ESTRÓGENO EM
LIGAMENTOS UTEROSACRAIS DE MULHERES
PORTADORAS DE ENDOMETRIOSE
PÉLVICA PROFUNDA
Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de
Doutor em Ciências.
Área de concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Tsutomu Aoki
Co-orientador: Prof. Dr. Paulo A. Ayroza Galvão Ribeiro
Co-Orientadora: Profa. Dra. Carmen Lucia Penteado Lancellotti
São Paulo
2010
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Rossi, Lia Mara
Imunoespressão da aromatase, cicloxigenase-2 e receptores de
estrógeno em ligamentos uterosacrais de mulheres portadores de
endometriose pélvica profunda./ Lia Mara Rossi. São Paulo, 2010.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Tsutomu Aoki
Co-Orientador: Paulo Augusto Ayroza Galvão Ribeiro
Co-Orientador: Carmen Lucia Penteado Lancelotti
1. Endometriose/diagnóstico 2. Endometriose/terapia 3. Análise
serial de tecidos 4. Aromatase 5. Ciclooxigenase-2 6. Estrógenos 7.
Imunoistoquímica
BC-FCMSCSP/13-10
DEDICATÓRIA
“Quem planta flores, planta beleza e perfumes para alguns dias. Quem
planta árvores, planta sombra e frutos por anos, talvez séculos. Mas quem
planta idéias verdadeiras, planta para a eternidade.”
Jesus Cristo
Aos meus pais, Ferrante e Joanna, com o mais puro e verdadeiro amor!
Vocês que plantaram as mais belas flores e as árvores mais frondosas da
minha vida! Que são os responsáveis pelas minhas mais verdadeiras
idéias, meus valores e meus princípios sobre o que é certo e justo na vida!
Vocês, que são tudo para mim... o meu porto seguro...o melhor exemplo de
vida...toda a minha força....meu amparo....
Obrigada por, apesar de tudo, estarem sempre ao meu lado! AMO MUITO
VOCÊS!
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
“Não devemos moldar os filhos de acordo com os nossos sentimentos;
devemos tê-los e amá-los do modo como nos foram dados por Deus.”
Goethe
Aos meus filhos - Giovanna, Matheus, Rafaella e Fernanda.
Vocês são a razão da minha vida e por quem sou capaz de tudo! Agradeço
pelo brilho de seus olhos, pela pureza de seus corações, pela sensibilidade,
pelo companheirismo e pelo amor... incondicional! Obrigada por
compreenderem a minha ausência durante a confecção deste trabalho.
Obrigada por existirem e por fazerem parte da minha vida!
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho
original.”
Albert Einstein
Ao Prof. Dr. Tsutomu Aoki, Diretor do Departamento de Obstetrícia e
Ginecologia da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo,
meu orientador e mestre, pela confiança incondicional e por todo o carinho
destes últimos anos. Pelo apoio em todos os momentos da minha vida
pessoal e profissional, por toda a paciência e compreensão. Sobremaneira
por ter compartilhado comigo esta CASA SANTA que agora é parte
integrante da minha vida também!
À Profa. Dra. Carmen Lucia Penteado Lancellotti, Coordenadora da Pós-
Graduação Stricto Sensu da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo e minha co-orientadora, por todos os conselhos e
sugestões que, sem dúvida, já fazem parte da minha vida pessoal e
profissional. Pela dedicação, disponibilidade e paciência... atitudes tão
presentes durante o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Paulo Augusto Ayroza Galvão Ribeiro, Chefe da Clínica de
Endoscopia Ginecológica e Endometriose do Departamento de Obstetrícia
e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo e meu co-orientador, pela
sensatez e sabedoria. Obrigada pelo apoio e pela confiança e por dividir
comigo suas idéias imprescindíveis para a realização deste trabalho, que
com certeza, foi o primeiro de muitos em conjunto.
Ao Prof. Dr. Henrique Olavo de Olival Costa, coordenador da Pesquisa
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e meu
amigo, pela convivência tão intensa e rica de informações. Obrigada pelas
dicas, pelos desafios e pelas oportunidades.
AGRADECIMENTOS
“A gente não faz amigos, reconhece-os.”
Vinícius de Moraes
Aos meus irmãos Amaury, Célia e Sandra e respectivos familiares pela
presença e apoio constantes na minha formação acadêmica e pessoal.
Ao amigo Sergio Luiz Moreira Barboza pela compreensão e por cuidar
das minhas pequenas Rafaella e Fernanda enquanto me ausentava
trabalhando na confecção desta tese.
À Paola Gasparine, minha amiga e parceira, pela cumplicidade em todos
os momentos e conquistas profissionais e com quem espero poder
compartilhar todos os momentos da minha vida.
Às colegas da Secretaria de Apoio a Pesquisa da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP) Fernanda Lima,
Josélia Macedo e Suely Orlandeli, cuja contribuição foi imprescindível na
realização deste trabalho.
Aos colegas e dirigentes da Fundação Arnaldo Vieira de Carvalho ora
representados pelo Sr. Antonio Augusto Brant de Carvalho, e aos
colegas e dirigentes da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de
São Paulo representados pelos Professores Dr. Ernani Geraldo Rolim,
Diretor da FCMSCSP, e Dr. Luiz Arnaldo Szultan, Diretor do Curso de
Medicina da FCMSCSP, pela confiança depositada em meu trabalho.
À Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, a minha querida
CASA SANTA, pela possibilidade de realização deste estudo.
Aos acadêmicos do 5º. Ano do curso de Medicina da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, Bruno L. do Carmo e
Felipe A. Ribeiro Batista por estarem presentes, desde a idéia inicial até a
finalização deste estudo e com quem espero contar durante minha carreira
acadêmica.
Aos colegas do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Irmandade
da Santa Casa de São Paulo em especial aos Professores Dr. Antonio
Pedro Flores Auge, Dra. Lilian de Paiva Rodrigues, Dra Silvia Regina
Pizza Ferreira Jorge, Dr. Noel Aquino Marques, Dr. José Francisco
Rinaldi, Dra Adriana B. Campaner e às queridas Amanda Vieira, Marta
Regina N. Zaghi e Ana Bracht, aos quais ofereço toda a minha gratidão
pela acolhida e amizade.
Aos pesquisadores do INCT-HPV em especial à Profa. Dra. Luisa Lina
Villa pelas palavras de estímulo e coragem.
Aos dirigentes, colegas e indistintamente a todos os meus alunos ora
representados pelas acadêmicas Lara Lobianco Souza, Ana Lucia Mattar
e Ana Luyza Domingues da S. Faria da Faculdade de Medicina de Jundiaí
por acreditarem no meu trabalho e pelo carinho destes 18 anos.
Ao Prof. Dr. Dino Martini pela colaboração e auxílio para levantamento de
dados e materiais imprescindíveis para a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Hudson Souza Buck pelo auxílio na avaliação quantitativa
das amostras deste estudo.
À Profa. Dra. Maria Antonieta Longo Galvão pelas sugestões durante o
exame de qualificação e também aos técnicos do Serviço de Patologia da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo pela
realização das reações imunohistoquímicas deste estudo.
Ao Prof. Dr. Caio Parente Barbosa e colegas da Faculdade de Medicina
do ABC pela contribuição na coleta de casos para este estudo e também
pela valiosa contribuição durante exame de qualificação.
Ao Prof. Dr. Vilmar Marques de Oliveira pela presença constante nestes
últimos anos e pelas considerações feitas durante exame de qualificação.
Ao Curso de Pós-graduação em Ciências da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo pela concessão da bolsa de
doutorado e às Sras. Mirtes Souza e Priscile V. Foster pelo suporte
incondicional, dedicação e amizade durante o meu doutorado.
À Sabia Hussein Mustafa e Sonia Regina Fernandes Arevalo da
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
pelo auxílio na elaboração da ficha catalográfica.
Aos técnicos do Laboratório CDB do Instituto do Sono – AFIP, Maria
Aparecida da Silva, Carla Dias Coelho, Eliezio Ferreira de Araujo e
José Ribeiro Neto pela acolhida e auxílio na confecção das lâminas.
A todos os demais amigos que, direta ou indiretamente, me auxiliaram
durante a elaboração deste estudo.
Às pacientes, sem as quais este trabalho não seria possível.
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ............................................................................. 1
1.1 Endometriose Pélvica Profunda (EPP) ...............................
4
1.2 Susceptibilidade à ação hormonal ......................................
6
2.
OBJETIVOS ................................................................................. 18
2.1 Objetivo geral ..................................................................... 19
2.2 Objetivos específicos ..........................................................
19
3.
CASUÍSTICA E MÉTODOS ......................................................... 20
3.1 Casuística ...........................................................................
21
3.1.1 – Critérios de inclusão ............................................... 22
3.2 Método para coleta de amostras ........................................ 23
3.3 Método de processamento histológico das amostras......... 24
3.4 Preparação das lâminas e confecção do bloco de TMA .... 26
3.5 Processamento para imunohistoquímica ........................... 29
3.6 Critérios para primeira avaliação da Expressão da
imunomarcação ..................................................................
31
3.6.1 – Aromatase p450 ..................................................... 32
3.6.2 – COX-2 .....................................................................
33
3.6.3 – Receptores de estrógeno ....................................... 33
3.7 Avaliação complementar da Expressão da
imunomarcação ..................................................................
34
3.8 Método estatístico .............................................................. 37
4.
RESULTADOS ............................................................................ 38
4.1 Avaliação semiquantitativa da aromatase .......................... 39
4.2 Avaliação semiquantitativa da COX-2 ................................ 43
4.3 Avaliação semiquantitativa dos receptores de estrógeno .. 46
4.4 Avaliação quantitativa por ROD da imunomarcação ..........
50
4.5 Correção entre imunoexpressão da aromatase, COX-2 e
estrógeno ............................................................................
54
5.
DISCUSSÃO ............................................................................... 55
6.
CONCLUSÕES ........................................................................... 67
7.
ANEXOS ..................................................................................... 69
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................... 75
FONTES CONSULTADAS ......................................................... 84
RESUMO ..................................................................................... 87
ABSTRACT ................................................................................. 89
APÊNDICE .................................................................................. 91
LISTAS
Abreviaturas e Siglas
EPP – Endometriose Pélvica Profunda
ASRM – American Society for Reproductive Medicine
E1 – Estrona
E2 – Estradiol
17β-HSD1 – 17β Hydroxysteroid Dehydrogenase Reductase
PCR – Reação em Cadeia de Polimerase
PGD
2
– Prostaglandina D
2
PGE
2
– Prostaglandina E
2
PGG
2
– Prostaglandina G
2
PGH
2
– Prostaglandina H
2
PGI
2
– Prostaciclina
TXA – Tromboxano
TNFα – Fator de Necrose Tumoral α
Th1 – Linfócito T helper 1
Th2 – Linfócito T helper 2
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TMA – Tissue Microarray
HE – Hematoxilina-Eosina
RE – Receptor de estrógeno
ROD – Relative Optical Density (Densidade Óptica Relativa)
GnRH – Gonadotrophin Release Hormone
COX-1 – Cicloxigenase 1
COX-2 – Cicloxigenase 2
AA – Ácido Aracdônico
Figuras
N
o
Titulo da Figura Pág
1 Formação de Estrogênios a partir do colesterol
11
2 Formação de estrogênios a partir da androstenediona sob a
ação da aromatase.
13
3 Biossíntese local de E2 na endometriose a partir da
androstenediona sob a ação da aromatase. A produção de
PGE2 se dá pela ação da COX-2 sob o ácido aracdônico
(AA) e é mediada por citocinas e fatores de crescimento
produzidos pelas células endometriais
15
4 Síntese de prostaglandinas pela via da cicloxigenase. PGE
2
= prostaglandina E
2
; PGD
2
= prostaglandina D
2
; PGI
2
=
prostaciclina; TXA
2
= tromboxano
16
5 (a) Área com revestimento glandular de endometriose em
ligamento uterosacral. HE X 400. (b) Foco de endometriose
com componentes glandular e estromal em ligamento
uterosacral. HE X 200
25
6 (a) Equipamento para a construção do bloco do TMA
arrayer de tecido biológico; (b) Blocos de TMA
28
7 Mapa de TMA. Esse mapa orienta a inclusão dos casos no
bloco de TMA e, posteriormente, a identificação dos casos
para a interpretação dos resultados obtidos, por exemplo,
com a imunoistoquímica
29
8 (a) Equipamento para avaliação da Densidade Óptica
Relativa (ROD). (b) Sistema MCID de análise
densitométrica digital (InterFocus Imaging Ltd., Linton,
England)
35
9 Endometriose em ligamento uterosacral apresentando
imunomarcação positiva para a aromatase no componente
glandular e no estroma. (a) Escore 2 em glândulas (*) e
Escore 1 (↓) no citoplasma. (b) Escore 2 em glândulas e
estroma (↓). Imunohistoquímica X 400.
41
10 Endometriose em ligamento uterosacral apresentando
glândula com imunomarcação positiva para a aromatase.
(a) Escore 2 com granulação citoplasmática característica
(*) Escore 1 no estroma com marcação mais fraca (↓),
Imunohistoquímica X 400. (b) Expressão positiva (*) para
aromatase em glândulas e estroma (escore 2),
Imunohistoquímica X 200. (c) Escore 2 (*) com
imunomarcação positiva para a aromatase,
Imunohistoquímica X400. (d) Escore 3 com imunomarcação
positiva para aromatase no epitélio glandular (*) e escore 2
no estroma (↓), Imunohistoquímica X 400.
42
11 Endometriose em ligamento uterosacral apresentando
imunomarcação positiva para a COX-2. (a), (c), (d) Escore
3 com marcação positiva para COX-2 em tecido glandular
(*) e estroma (↓). (b) Escore 3 com marcação positiva para
COX-2 no estroma (↓).Imunohistoquímica X 400.
45
12 Endometriose em ligamento uterosacral com
imunomarcação positiva para a COX-2 em glândulas (*) e
estroma (↓). (a) Escore 3; (b) Escore 2. Imunohistoquímica
X 400.
46
13 (a) Estroma normal de ligamento uterosacral de
paciente sem endometriose com imunomarcação positiva
para receptores de estrógeno. (b) Estroma de ligamento
uterosacral acometido por EPP com imunomarcação
positiva para receptores de estrógeno. Imunohistoquímica
X 400.
48
14 (a, b, c, d) - Endometriose em ligamento uterosacral
apresentando glândula e estroma com imunomarcação
nuclear positiva para receptores de estrógeno.
Imunohistoquímica X 400.
49
15 (a) Imagem obtida para a análise de densidade óptica
relativa (ROD) e em (b) Fotomicrografia da mesma amostra
mostrando imunomarcação positiva para aromatase em
amostras de ligamento uterosacral com EPP.
50
16 (a) Imagem obtida para a análise de densidade óptica
relativa (ROD) e em (b) Fotomicrografia da mesma amostra
mostrando imunomarcação positiva para COX-2 em
amostras de ligamento uterosacral com EPP.
51
17 (a) Imagem obtida para a análise de densidade óptica
relativa (ROD) e em (b) Fotomicrografia da mesma amostra
mostrando imunomarcação positiva para receptores de
estrógeno em amostras de ligamento uterosacral com
EPP.
51
Tabelas
N
o
Titulo da Tabela Pág
1 Escore utilizado para a avaliação da imunoexpressão da
aromatase p450
32
2 Escore utilizado para a avaliação da imunoexpressão da
COX-2
33
3 Escore com base na porcentagem de núcleos marcados para
estrógeno
34
4 Valores de ROD obtidos nas amostras controle do TMA
36
5 Dados para interpretação das medidas de correlação
37
6 Expressão da proteína aromatase p-450 por
imunohistoquímica nas amostras de ligamento uterosacrais
de mulheres livres de doença (Grupo CONTROLE) e
pacientes com EPP (Grupo ENDOMETRIOSE).
41
7 Expressão da COX-2 por imunohistoquímica nas
amostras de ligamento uterosacrais de mulheres livres de
doença (Grupo CONTROLE) e pacientes com EPP (Grupo
ENDOMETRIOSE
44
8 Análise descritiva da Expressão do Estrógeno por
imunohistoquímica nas amostras de ligamento uterosacrais
de mulheres livres de doença (Grupo CONTROLE) e
pacientes com EPP (Grupo ENDOMETRIOSE
49
9 Avaliação quantitativa da Densidade Óptica Relativa
(ROD) nos Grupos Controle e Endometriose para os três
marcadores analisados.
52
10 Correlação de Spearman entre os dados semi-
quantitativos da imunoexpressão de aromatase, COX-2 e
estrógeno no grupo ENDOMETRIOSE, onde (A) é a
correlação entre aromatase p450 e COX-2; (B) Correlação
entre aromatase p450 e E2; (C) Correlação entre COX-2 e
E2
54
11 Correlação de Pearson entre os dados semi-
quantitativos da imunoexpressão de aromatase, COX-2 e
estrógeno no grupo ENDOMETRIOSE, onde (A) é a
correlação entre aromatase p450 e COX-2; (B) Correlação
entre aromatase p450 e E2; (C) Correlação entre COX-2 e
E2
54
Gráficos
N
o
Titulo do Gráfico Pág
1 Boxplot com valores individuais de escores obtidos após
avaliação da imunoexpressão de aromatase p450 nos
grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE.
40
2 Boxplot com valores individuais de escores obtidos após
avaliação da imunoexpressão de COX-2 nos grupos
CONTROLE e ENDOMETRIOSE.
44
3 Boxplot com valores individuais de escores obtidos após
avaliação da imunoexpressão de Estrógeno (E2) nos
grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE
47
4 Boxplot com valores individuais por ROD (densidade óptica
relativa) após avaliação da imunoexpressão de Aromatase
nos grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE.
52
5 Boxplot com valores individuais por ROD (densidade óptica
relativa) após avaliação da imunoexpressão de COX-2
nos grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE.
53
6 Boxplot com valores individuais por ROD (densidade óptica
relativa) após avaliação da imunoexpressão de receptores
para estrógeno nos grupos CONTROLE e
ENDOMETRIOSE.
53
Doutorado 2010
1. INTRODUÇÃO
ROSSI LM
Doutorado 2010
2
Nosso conhecimento acerca da patogênese da endometriose baseia-se
fortemente, ainda nos dias de hoje, nos estudos do Dr. John Albertson Sampson
(1873 a 1946), o “Pai da Endometriose”. Desde então, esta doença é vista como
uma enfermidade de origem poligênica, multifatorial complexa e ainda não
completamente elucidada (Sampson, 1927; Czernobilsky, 1995; Kennedy et al,
2005)
Definida como sendo uma afecção ginecológica benigna e estrógeno-
dependente, a endometriose caracteriza-se pela presença de tecido com aspectos
histológicos e funcionais semelhantes aos do endométrio tópico (células
endometriais, estromais ou epiteliais), fora de seu sítio habitual (Olive, Schwartz,
1993). Mais recentemente, seguindo a orientação da European Society of Human
Reproduction and Embriology, conceitua-se a enfermidade como a presença, fora do
útero e em diversos sítios anatômicos, de tecido semelhante ao endométrio e que
induz a inflamação crônica (Kennedy et al, 2005).
Apesar da prevalência da endometriose variar consideravelmente de estudo
para estudo, estima-se que aproximadamente 10% a 15% das mulheres na
menacma e 2% a 5% das mulheres na pós-menopausa são afetadas, chegando a
40% em mulheres com infertilidade. Na população geral, sua prevalência oscila de
1% a 50% das mulheres submetidas a cirurgias ginecológicas em doenças com
diferentes quadros sintomatológicos (Nisolle, Donnez, 1997; Donnez et al, 2002).
ROSSI LM
Doutorado 2010
3
Tradicionalmente, é vista como uma afecção estrógeno-dependente e não
responsiva à ação da progesterona (Osteen et al, 2005). Clinicamente, a paciente
pode apresentar queixas como dismenorréia, dor pélvica acíclica, alterações
intestinais cíclicas como tenesmo, proctorragia, diarréia na menstruação,
infertilidade, alterações do padrão menstrual, dispareunia profunda e algia pélvica
contínua, independentemente da localização do foco de endometriose (Wheeler,
1992; Ford et al, 2004).
Constitui-se um agravo de saúde pública com impacto na qualidade de vida
das mulheres, podendo levar a longos períodos de internação e afastamento social e
profissional, além de gastos excessivamente altos com medicamentos, tendo,
portanto um impacto econômico mundial (Olive, Schwartz, 1993; Barbosa, 2001;
Stenchever et al, 2001; Hompes, Mijatovic, 2007; Simoens et al, 2007).
Apesar de a endometriose ocorrer mais freqüentemente nos órgãos
pélvicos, muitos casos de endometriose extrapélvica, nos mais diversos sítios
anatômicos, são descritos. Desde as primeiras citações sobre a doença (Sampson,
1927), ocorrência de focos endometrióides tem sido descrita não somente em
tecidos intrapélvicos como o recesso reto uterino (fundo de saco de Douglas),
peritôneo da pelve, ligamentos uterosacrais, cólon, reto-sigmóide, ovário, peritôneo e
tubas uterinas, assim como também em tecidos extraperitoneais como cérebro
(Thibodeau et al, 1987), pulmão (Hong et al, 1999), fígado (Huang et al, 2002) e
nervos periféricos (Vercellini et al, 2003).
Os implantes de endometrioses também podem acometer várias outras
localizações causando endometriose da genitália externa, adenomiose uterina,
endometriose extragenital ou endometriose pélvica profunda (Anaf et al, 2000;
ROSSI LM
Doutorado 2010
4
Giudice, Kao, 2004).
Neste estudo, uma entidade que merecerá nossa atenção refere-se à
endometriose pélvica profunda (EPP), uma doença com intensa atividade
proliferativa semelhante ao endométrio tópico (Koninckx et al, 1991) definida como a
existência de lesões com penetração em profundidade igual ou superior a cinco
milímetros a partir da superfície do peritôneo e identificada em 30% a 40% das
pacientes com endometriose (Cornillie et al, 1990).
As características típicas das células endometrióticas incluem: potencial de
esteroidogênese, proliferação contínua e resistência à apoptose, capacidade de
promover a neoangiogênese, migração e invasão e modulação de sistema
imunológico local (Banu et al, 2008).
O desenvolvimento da doença dependerá, entretanto, da qualidade e da
quantidade das células endometriais regurgitadas e de um aumento da atividade
inflamatória no fluído peritoneal, com conseqüente formação de aderências
endométrio-peritoneais, neo-angiogênese, redução da resposta imunológica,
diminuição na taxa de remoção das células endometriais, seguido de um aumento
na produção de auto-anticorpos contra estas células (Siristatidis et al, 2006).
1.1. Endometriose pélvica profunda (EPP)
Atualmente, a classificação de endometriose se faz pelo sistema proposto
pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva em sua versão revisada (R-
RAFS). Por esta normativa (ASRM, 1997) a doença é descrita com base no sistema
de escores unificados em quatro estádios, associada à avaliação percentual das
ROSSI LM
Doutorado 2010
5
lesões peritoneais, após criteriosa observação do peritôneo, ovários, fundo de saco
posterior e tubas, a extensão de comprometimento. Cada uma das estruturas é
avaliada segundo dados assinalados em uma tabela padrão na qual cada
característica corresponde a pontos. A soma de tais pontos permite o estadiamento
da endometriose em quatro categorias: I (Mínima: 1-5), II (Leve: 6-15), III (Moderada:
16-40), IV (Grave maior que 40).
Os implantes de endometriose superficiais caracterizam o estágio inicial da
doença, cujo crescimento e infiltração superficial podem ser regulados por fatores
locais. Os implantes que apresentam infiltração intermediária, por sua vez, poderão
seguir dois caminhos: tornarem-se inativos e ou aprofundar-se (Siristatidis et al,
2006).
A morfologia macroscópica destas lesões, entretanto, é bastante variável.
Múltiplas formas e colorações caracterizam o espectro da endometriose (Jansen,
Russell, 1986). Histologicamente podemos descrevê-la como tecido extra-uterino
com características semelhantes às do endométrio tópico (Wheeler, 1992) com
elementos epiteliais do tipo mülleriano, com ou sem estroma, associados com sinais
de hemorragia e fibrose. Os implantes podem ser polipóides, com invasão do tecido
conjuntivo subperitoneal, císticos ou ainda apresentar lesões fibróticas e
inflamatórias (Vercellini et al, 2003).
A EPP tem peculiaridades como o sincronismo com o endométrio tópico e
grande capacidade de proliferação e crescimento com o passar do tempo. As lesões
infiltram-se rapidamente e mais freqüentemente nos ligamentos uterosacrais (Ribeiro
et al, 2006; Chapron et al, 2006) mas também invadem o recesso reto uterino, septo
reto-vaginal e tecido retrocervical (Koninckx et al, 1991), vagina e retosigmóide, em
ROSSI LM
Doutorado 2010
6
mais de 50% das pacientes com estágios avançados da doença (Paulson et al,
1977; Cornillie et al, 1990; Koninckx et al, 1991; Ribeiro et al,2001).
Em 1995, foram propostos dois diferentes tipos de endometriose profunda
(Donnez et al, 1995). A primeira seria a endometriose profunda infiltrativa, causada
por invasão de lesão peritonial profunda ativa no espaço retroperitonial. Em casos
de invasão peritonial lateral, os ligamentos uterosacrais e a parede anterior do reto
poderiam estar envolvidos, resultando em processo de retração, adesão e
obliteração secundária do recesso reto uterino. O segundo tipo seria decorrente de
pseudo-infiltração, também denominada adenomiose do septo retovaginal, onde as
lesões seriam originadas do tecido do próprio septo retovaginal e consistiriam de
musculatura lisa com epitélio glandular ativo ou estroma sendo, portanto, menos
invasivas.
Em relação à EPP infiltrativa, estudos relatam que a invasão de estruturas e
órgãos por focos de endometriose afetam cerca de 20% a 35% das mulheres
portadoras de endometriose (Chapron et al, 2001; Ford et al, 2004).
Apesar da vasta literatura relacionada à gênese desta doença, há ainda
muitas lacunas sobre a patogênese da endometriose reforçando o conceito de que
estamos frente a um processo complexo, mediado por diversos fatores.
1.2. Suscetibilidade à ação hormonal
O implante de células endometriais tópicas na superfície peritoneal pela
menstruação retrógrada – teoria defendida por Sampson em 1927 – é uma das
ROSSI LM
Doutorado 2010
7
explicações mais aceitas para o desenvolvimento da endometriose pélvica peritoneal
(Sampson, 1927).
De acordo com esta teoria, a endometriose parece ser causada pelo refluxo
e implantação de células endometriais regurgitadas pelas tubas uterinas para a
cavidade abdominal durante a menstruação (TEORIA DA REGURGITAÇÃO
TRANSTUBÁRICA DO SANGUE MENSTRUAL).
No entanto, este evento é comum entre mulheres em idade reprodutiva
(76% a 90% das mulheres com células endometriais viáveis detectadas no fluido
peritoneal) (Koninckx et al, 1980; Kruitwagen et al, 1991) e somente uma pequena
parcela destas mulheres desenvolve a doença. Entretanto, entre as várias teorias
para explicar a gênese da endometriose, acredita-se na ocorrência de metaplasia
nos tecidos derivados dos ductos de Muller naquelas mulheres portadoras de
anomalias genitais e que não apresentam menstruação retrógrada ou na
endometriose masculina (Meyer, 1919; Doty et al, 1980; El-Mahgoub, Yaseen, 1980;
Acien, 1986; Koninckx et al, 1999).
A TEORIA DA METAPLASIA é suportada também pela observação
experimental de que restos menstruais ou fragmentos de endométrio autólogo
transplantados podem induzir metaplasia endometrial ou endometriose em
diferentes tecidos (Merrill, 1966). De qualquer maneira, ainda permanece o enigma
sobre o mecanismo que permite a implantação de algumas células endometriais na
cavidade pélvica enquanto a grande maioria não o faz.
Recentemente, a hipótese da participação do sistema imunológico na
etiopatogenia da endometriose tem contribuído para preencher as lacunas
existentes nas demais teorias vigentes (TEORIA IMUNOLÓGICA).
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Doutorado 2010
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Supõe-se fortemente na atualidade que um distúrbio da resposta
imunológica seja um fator facilitador para o desenvolvimento da endometriose,
sugerindo a existência de um perfil imunológico específico (Siristatidis et al, 2006)
associado a fatores angiogênicos e genéticos (Seli et al, 2003).
Atualmente, grande parte das pesquisas em endometriose fundamenta-se
na capacidade exibida pelo peritônio para reagir ao endométrio ectópico por meio de
sua destruição e remoção com ativa participação das células do sistema
mononuclear fagocitário. Estas células agem associadas à produção de várias
citocinas, com função imuno-reguladora, ativadora ou supressora. Entre as
principais citocinas envolvidas na patogênese da endometriose e que apresentam
concentração elevada no soro ou no líquido peritoneal de portadoras da doença,
podemos citar: o fator de necrose tumoral, as interleucinas, o fator de crescimento
endotelial vascular, as metaloproteases de matriz extracelular, a proteína
quimiotáxica dos monócitos, o fator inibidor de migração de macrófagos, o peptídeo
epitelial ativador de neutrófilos e a leptina (Ihlenfeld et al, 2005).
Entretanto, é consenso afirmar que a endometriose é uma doença
inflamatória que provavelmente envolve um complexo comportamento imunológico
com a participação das citocinas produzidas por linfócitos T helper (Th) de ambos
os tipos (Th1 e Th2). Em estudo publicado por Podgaec et al (2007) este fato fica
explícito tendo em vista os achados em relação às concentrações mais elevadas da
IL-4 e da IL-10 nas pacientes com endometriose sugerindo um predomínio da
resposta por Th2 sobre a Th1.
O principal raciocínio da teoria imunológica atualiza a proposição do refluxo
menstrual. Acredita-se que as células endometriais, ao penetrarem na cavidade
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peritoneal além de estarem programadas para a morte celular (apoptose) por conta
da exposição à progesterona desencadeiam uma intensa reação inflamatória e
atraem grande numero de células do sistema imunológico para a região pélvica.
Assim, principalmente os macrófagos são ativados e iniciam uma extensa destruição
destas células, fazendo com que a totalidade delas desapareça nos primeiros dias
após a menstruação.
Na endometriose, entretanto, os macrófagos parecem exibir uma
capacidade diminuída para a fagocitose das células endometriais e isto seria um dos
principais facilitadores para o processo de implantação e desenvolvimento dessas
células na cavidade peritoneal, dando origem ao foco endometriótico inicial (Harada
et al, 2001).
A secreção dos fatores de crescimento e dos fatores angiogênicos pelas
células endometriais ectópicas é intensificada pela ação endócrina do estrógeno, ou
seja, da ação do hormônio sintetizado no ovário ou no tecido adiposo adjacente
(Noble et al, 1996; Mihalyi et al, 2006). Os fatores de crescimento e as citocinas, por
sua vez, favorecem o crescimento e a implantação ectópica destas células (Bulun et
al, 2004).
No entanto, na última década, estudos têm demonstrado que a produção e
a secreção de estrógeno in situ parece também ser de fundamental importância para
o desenvolvimento e progressão da doença, à semelhança do que ocorre no câncer
de mama e na miomatose uterina (Bulun et al, 1993)
Em células endometriais tópicas, a estrona circulante é convertida em
estradiol (E2) pela 17
β-HSD-1 (17β hydroxysteroid dehydrogenase reductase type 1)
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por um processo NADPH-dependente e a conversão reversa do estradiol para
estrona se dá pela ação da 17β-HSD-2 (17β hydroxysteroid dehydrogenase
reductase type 2) (Ebert et al, 2005).
O E2, assim como os outros esteróides sexuais, originam-se a partir da
molécula do colesterol, principalmente o LDL-colesterol, advindos de depósitos
intracelulares, cuja transferência é mediada por várias proteínas carreadoras que
são responsivas ao estímulo do AMPc (adenosina monofosfato cíclico), entre outras.
O LDL-colesterol sofre uma conversão para pregnenolona, molécula precursora da
17-hidroxiprogesterona e da progesterona. Sob a mediação da 17-α hidroxilase, na
via cascata delta 5, a pregnenolona converte-se em 17-hidroxipregnenolona e a
partir da enzima desmolase ocorre sua passagem para deidroepiandrosterona
(DHEA). Com a ação das enzimas 3-β-oldesidrogenase e delta-4-isomerase, a
deidroepiandrosterona converte-se em androstenediona (Zeitoun, Bulun, 1999;
Bulun et al, 2002). Em outra via de ação enzimática, via delta 4, ocorre a ação da 3-
β-ol-desidrogenase para a conversão da pregnenolona em progesterona que se
transforma em 17-11 hidroxiprogesterona sob mediação da 17-α-hidroxilase. Neste
momento, age a desmolase para a formação da androstenediona e posteriormente a
aromatase p450, responsável pela conversão da androstenediona em E1 e da
testosterona em E2 (Kase et al, 1995) (Fig. 1).
A ação do estrógeno nas células endometriais e musculares lisas do
miométrio até recentemente, era classificada como um mecanismo meramente
endócrino onde somente o estradiol circulante, se secretado pelo ovário ou formado
no tecido adiposo, pudesse exercer um efeito estrogênico depois de atingir os
tecidos alvo via corrente sangüínea (Bulun et al, 2004).
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Por ser um mitógeno para os tecidos müllerianos (Bulun et al, 2002) há
evidências de que haja uma possível ação autócrina do E2 sobre o endométrio de
mulheres com endometriose facilitando a implantação e o desenvolvimento de
implantes na cavidade peritoneal (Noble et al, 1996).
FIGURA 1 – Formação de Estrogênios a partir do colesterol.
O E2 inibe os níveis de interleucina-6 nos macrófagos bloqueando deste
modo, seletivamente a fagocitose, sem interferir na produção dos fatores de
crescimento celular e dos relacionados com a angiogênese. Desta maneira os
macrófagos chegam até as células endometriais sem, contudo destruí-las, pois a
sua função de fagocitose está inibida pelos estrogênios produzidos nestas pela
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ativação da enzima aromatase. Paradoxalmente o macrófago passa a ser um agente
facilitador da progressão das lesões de endometriose, pois os fatores de
crescimento celular e inflamatórios produzidos por estes vão ativar ainda mais a
enzima aromatase e o processo de angiogênese nos focos de endometriose (Bulun
et al,2002; Bulun et al, 2004).
Corroborando com esta informação, outros estudos também demonstram
concentrações de estrógeno significativamente aumentadas no sangue menstrual
de mulheres com endometriose (Luisi et al, 2006) associadas a concentrações muito
elevadas da aromatase em implantes endometrióticos e endometriomas (Noble et
al, 1996; Kitawaki et al, 2002), assim como também tem sido encontrado o RNAm da
aromatase em endométrio tópico de mulheres com endometriose, cuja expressão
não é detectada em mulheres livres da doença em estudo apresentado por Bulun et
al (1993).
Especula-se que as células endometriais de pacientes que desenvolverão a
endometriose já chegam à cavidade pélvica expressando a enzima aromatase que
aumenta exponencialmente na medida em que as células são expostas aos fatores
inflamatórios produzidos pelos macrófagos e pelas outras células do sistema
imunológico contribuindo para uma expressão cada vez maior de estrógeno (Colette
et al, 2009).
Desta maneira, há evidências de que a expressão de aromatase nas células
endometriais parece ser, portanto, o elemento chave para o implante destas células
na cavidade pélvica e o conseqüente desenvolvimento das lesões de endometriose.
A aromatase é codificada em humanos e camundongos por um único gene, o
CYP19 (Colette et al, 2009) e em humanos, à semelhança de outras espécies, sua
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expressão é ampla entre os tecidos adiposos, ósseo, nervoso, gonadal e placenta. A
proteína pertence a uma família de enzimas que tem a terminologia 450 em sua
nomenclatura - citocromo P450 - e pode metabolizar uma série de substratos. No
processo de esteroidogênese, são identificadas as P450scc que fazem a quebra do
colesterol; as P450c11 mediadoras da 11-hidroxilase e a 18-hidroxilase; as
P450c17 mediadoras da 17-hidroxilase; as P450c21 mediadoras da 21- hidroxilase;
e a P450arom responsável pela aromatização de androgênios em
estrogênios (Simpson et al, 1994).
Em mulheres ovulatórias, o principal substrato para a atividade
extraglandular da aromatase é a Androstenediona (A) produzida na adrenal e no
ovário, que é convertida pela aromatase em estrona (E1) no tecido adiposo ou nos
fibroblastos da pele. A E1 é, mais tarde, convertida em estradiol (E2) pela atividade
da 17β-HSD1 (17β hydroxysteroid dehydrogenase reductase) nos tecidos periféricos
(Bulun et al, 2004) (Fig. 2).
FIGURA 2 – Formação de estrogênios a partir da androstenediona sob a ação da
aromatase. (Adaptado de Bulun et al, 2004)
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Nos implantes peritoneais e ovarianos de endometriose, bem como no
endométrio tópico de mulheres com endometriose moderada e grave, acredita-se
que o aumento na concentração local do E2 deve-se ao aumento da expressão da
aromatase (Kitawaki et al, 2002; Kyama et al, 2008) justificando uma provável
produção local de E2 para sustentar a permanência do foco da lesão (Kitawaki et al,
1999).
Concomitante ao aumento da expressão da aromatase, há um aumento da
17β-HSD1 que catalisa a redução da E1 em E2 ativo e acarreta na diminuição da
17β-HSD2. Estas células não respondem à ação da progesterona para impedir a
proliferação do tecido endometriótico estrógeno-dependente uma vez que não há
atividade da 17β-HSD2 (Zeitoun, Bulun, 1999).
A expressão da aromatase na endometriose tem sido confirmada por
estudos transcricionais (Kyama et al, 2008; Attar et al, 2009), de atividade (Murakami
et al, 2006; Purohit et al, 2007) e expressão protéica (Velasco et al, 2006; Acien et
al, 2007). No entanto, não há consenso sobre sua localização, uma vez que alguns
autores encontram-na nas células do estroma (Velasco et al, 2006; Acien et al,
2007) enquanto outros demonstraram sua localização glandular (Matsuzaki et al,
2006; Hudelist et al, 2007).
Dois estudos, entretanto, contestam estes achados. No estudo de Colette e
colaboradores (2009) uma quantidade ínfima de RNAm para aromatase foi
detectada por reação em cadeia de polimerase (PCR) sem nenhuma positividade
para a expressão desta enzima por imunohistoquímica em espécimes com
endometriose a semelhança dos achados obtidos por Delvoux et al em 2008. Estes
estudos sugerem que o desenvolvimento da endometriose parece não ser
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desencadeado por esta enzima em focos endometrióides peritoneais, ovarianos e
retovaginais por imunohistoquímica.
Por outro lado, a prostaglandina E
2
(PGE
2
) parece ser a mais potente
molécula estimuladora da aromatase na endometriose (Ebert et al, 2005; Attar et al,
2009). Esta atividade da aromatase por aumentar a síntese local de estrogênios
estimula a expressão da COX-2 com conseqüente aumento na produção de
prostaglandina (PGH
2
e PGE
2
) estabelecendo assim um feedback positivo a favor da
formação contínua de estrógenos na endometriose, conforme mostra a Figura 3. As
concentrações de PGE2 no fluido peritoneal são maiores nas mulheres que sofrem
da doença e estes níveis elevados são os responsáveis pelas intensas dores
pélvicas reportadas por estas mulheres (Bulun et al, 2004; Acien et al, 2007).
FIGURA 3 – Biossíntese local de E2 na endometriose a partir da androstenediona sob
a ação da aromatase. A produção de PGE2 se dá pela ação da COX-2
sob o ácido aracdônico (AA) e é mediada por citocinas e fatores de
crescimento produzidos pelas células endometriais. (Adaptado de
Bulun et al, 2004)
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A enzima ciclooxigenase (COX) está envolvida na síntese de prostanóides,
catalisando a conversão do ácido aracdônico (AA) em prostaglandina G
2
(PGG
2
).
Por ação de uma enzima peroxidase, a PGG
2
é convertida em prostaglandina
H
2
(PGH
2
), que é a precursora direta das várias formas de prostaglandinas e
tromboxano (Funk et al, 1991). O passo seguinte ocorre nos diferentes tecidos e,
dependendo do tipo de célula envolvida, a PGH
2
pode originar PGE
2
, PGD
2
,
PGI
2
(ou prostaciclina) e tromboxano (TXA
2
). A PGF
2
, sintetizada a partir da PGE
2
,
aumenta a vasoconstrição, a broncoconstrição e a contração da musculatura lisa,
enquanto que as prostaglandinas PGD
2
e PGE
2
induzem a vasodilatação e
estimulam os nociceptores. A prostaciclina é produzida pelas células endoteliais e
sua função é inibir a agregação plaquetária e causar vasodilatação arterial. (Warner,
Mitchell, 2004; Bulun et al, 2004) (Fig. 4).
FIGURA 4 - Síntese de prostaglandinas pela via da cicloxigenase. PGE
2
=
prostaglandina E
2
; PGD
2
= prostaglandina D
2
; PGI
2
= prostaciclina;
TXA
2
= tromboxano
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A expressão da isoforma COX-2 está elevada em uma grande variedade de
tumores malignos e em lesões pré-malignas (Van Rees, Ristimäki, 2001; Ristimäki et
al, 2002). Funcionalmente, a COX-2 derivada dos prostanóides é a que promove a
angiogênese, a invasão e o aumento de metástase (Ristimäki et al, 2002 ).
Sua expressão está mediada pela presença de citocinas (IL-1 β, interferon
γ), fatores de crescimento e estimulantes tumorais (fator de necrose tumoral α -
TNF-α) sugerindo sua relevância no câncer e em processos inflamatórios. Na
endometriose, a COX-2 está expressa tanto nas glândulas quanto no estroma dos
focos endometrióticos (Ota et al, 2001). Além do ácido aracdônico, a COX-2 também
é capaz de agir no metabolismo de outras substâncias como o ácido linolênico, por
exemplo (Banu et al, 2008). Deste modo, esta retroalimentação positiva cria um
ciclo vicioso, com contínua produção local de PGE2 e estrógeno, favorecendo as
características inflamatórias e intensa atividade celular da endometriose (Bulun et al,
2002).
Neste sentido, entendemos que estudos para a detecção da expressão da
aromatase, COX-2 e a presença de receptores para E2 nos tecidos característicos
na EPP parecem ser de relevante importância para a definição de alvos moleculares
para abordagens terapêuticas para esta afecção.
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2. OBJETIVOS
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2.1 Objetivo Geral
⋅ Avaliar a imunoexpressão das AROMATASE P450, da
CICLOOXIGENASE-2 e dos RECEPTORES DE ESTRÓGENO pela técnica de
imunohistoquímica em espécimes cirúrgicos de ligamentos uterosacrais de mulheres
portadoras de endometriose profunda e em ligamentos uterosacrais de pacientes
sem endometriose através de critérios semiquantitativos (escores) e densidade
óptica relativa (ROD).
2.2 Objetivos Específicos
⋅ Comparar os achados semiquantitativos e quantitativos da
imunoexpressão da AROMATASE P450, da CICLOOXIGENASE-2 e dos
RECEPTORES DE ESTRÓGENO em espécimes cirúrgicos de ligamentos
uterosacrais de mulheres portadoras de endometriose profunda com aqueles
coletados de mulheres livres da doença.
⋅ Correlacionar a expressão da AROMATASE P450 com a quantidade de
RECEPTORES DE ESTRÓGENO e com a expressão de CICLOOXIGENASE-2.
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3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
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3.1 Casuística
Este estudo foi realizado no setor de Endoscopia Ginecológica e
Endometriose do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia (DOGI) da Irmandade
da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo em conjunto com o Serviço de
Anatomia Patológica do Departamento de Ciências Patológicas, e no Departamento
de Ciências Fisiológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo, após a aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa desta instituição (ANEXO
1).
As amostras utilizadas neste estudo foram coletadas de pacientes
submetidas a cirurgia por videolaparoscopia no DOGi-ISCMSP durante o período de
Maio de 2004 a Janeiro de 2007, para estudo da presença de fibras nervosas em
ligamentos uterosacrais em mulheres com EPP e sem endometriose realizado por
nosso grupo (Kelm Jr et al, 2008).
Naquela oportunidade, a todas as pacientes foi oferecido o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE) (ANEXO 2) no qual também foi solicitada a
permissão para utilização de dados e informações nos estudos inseridos na área
temática deste grupo de pesquisa. Somente as amostras de mulheres que
concordaram em participar do estudo após a assinatura do TCLE foram incluídas
neste estudo.
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Dois grupos de estudo foram constituídos, a saber: GRUPO
ENDOMETRIOSE composto por pacientes com diagnóstico de EPP e, GRUPO
CONTROLE composto por mulheres sem endometriose.
Após cálculo para tamanho amostral, os grupos poderiam ser formados com
22 a 30 amostras para cada braço contando com um Power de 84,4% e uma
diferença média entre as proporções de 40%, independentemente do marcador
analisado.
3.1.1 Critérios de Inclusão
Para o grupo ENDOMETRIOSE foram considerados blocos de parafina
oriundos das pacientes com quadro clínico, laboratorial e radiológico sugestivo de
endometriose profunda, sem tratamentos cirúrgico ou clínico prévios, nos últimos
seis meses, com idade variando de 20 a 52 anos (idade média ± desvio padrão =
33,8 ± 8,5), portadoras de ciclos eumenorreicos e sem terapia hormonal há pelo
menos três meses antes da cirurgia. Todos estes dados foram buscados nos
prontuários de maneira retrospectiva.
As pacientes, submetidas a tratamento cirúrgico para endometriose foram
consideradas para o estudo, quando apresentaram no intraoperatorio, acometimento
dos ligamentos uterosacrais e de tecidos adjacentes. Naquela oportunidade, os
tecidos acometidos foram removidos completa ou parcialmente e a amostra
submetida a processamento anatomopatológico para confirmação do diagnóstico de
endometriose.
Durante ato cirúrgico, a avaliação do acometimento septal (parcial ou total)
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foi feita com um probe retal e uma pinça com duas gazes dobradas, inserida no
fórnice vaginal posterior. Pacientes com fundo de saco normal apresentam uma
porção de parede vaginal distinta do colo uterino e do reto e os ligamentos
uterosacrais foram claramente individualizados. Nos casos com obliteração parcial
ou total, o reto estava aderido aos ligamentos uterosacrais ou ao útero,
respectivamente.
Para constituirmos o grupo CONTROLE (ligamentos uterosacrais livres de
doença em pacientes sem endometriose), foram selecionadas mulheres no
Ambulatório de Endometriose da Clínica de Endoscopia Ginecológica do
Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo portadoras
de outras afecções ginecológicas que envolvessem a abordagem dos ligamentos
uterosacrais (mio-hipertrofia uterina), sem quadro clínico, laboratorial e radiológico
sugestivo de endometriose profunda, que não tenham realizado tratamento cirúrgico
ou clínico prévios nos últimos seis meses, com idade variando de 20 a 52 anos
(idade média ± desvio padrão = 43,4 ± 6,1) e apresentando ciclos eumenorreicos,
submetidas à histerectomia total.
3.2 Método para Coleta das Amostras
Em ambos os grupos, fragmentos de ligamentos uterosacrais foram obtidos,
de acordo com critérios mínimos previamente estabelecidos por (Fujii et al, 2002),
para ablação do ligamento útero-sacro. Ligamentos uterosacrais foram obtidos
destas pacientes durante ato cirúrgico. Para a remoção dos fragmentos, nós usamos
cautério cirúrgico monopolar associado à tesoura de Metzembaum (Karl Storz,
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Tutlingen ®, Germany) e gerador de eletrocautério cirúrgico (Force Fx, Valleylab,
Bolder ®, USA) com modo de corte puro a 100 W - LUNA (16,5 mm a 33 mm da
cérvice e 3mm a 15 mm de profundidade).
Após fixação em solução de formaldeído a 10% tamponado, dos espécimes
cirúrgicos foram coletadas amostras para análise histológica, processadas de acordo
com protocolo rotineiro utilizado em anatomia patológica. Destas amostras foram
obtidos cortes histológicos de 4µm embebidos em parafina e posteriormente
submetidos à coloração com hematoxilina-eosina para estudo histopatológico.
Para nosso estudo, solicitamos ao Serviço de Anatomia Patológica da
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, após levantamento dos
respectivos números de registro geral da paciente e biopsia correspondente, os
blocos de parafina contendo as amostras de ligamentos uterosacrais cujas pacientes
perfizessem os critérios de inclusão.
Amostras teciduais de mulheres que não satisfizeram os critérios acima;
portadoras de doenças infecto-contagiosas crônicas ou imunológicas;
menopausadas ou em uso contínuo de medicamentos antiinflamatórios ou
hormonais não foram incluídas.
3.3 Métodos de processamento histológico das amostras
Quando da recuperação dos blocos de parafina, realizamos cortes de 4 µm
de espessura e desidratação em álcool etílico, seguida de diafanização por xilol para
posterior coloração pelo método de hematoxilina-eosina (HE), com o intuito
diagnóstico. A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico binocular de
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duas cabeças, em campos de 200 e 400 aumentos, de maneira simultânea com
anatomopatologista experiente.
Do total de 30 amostras do GRUPO ENDOMETRIOSE, EPP em ligamento
útero-sacro foi confirmada em 27 casos (Fig. 5a e 5b). Nas amostras do GRUPO
CONTROLE, somente 24 casos foram incluídos por estarem totalmente livres de
qualquer doença.
FIGURA 5 – (a) Área com revestimento glandular de endometriose em ligamento
uterosacral. HE X 400. (b) Foco de endometriose com componentes
glandular e estromal em ligamento uterosacral. HE X 200.
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3.4 Preparação das Lâminas e Confecção do Bloco de TMA
Neste estudo foi empregada a técnica de imunohistoquímica em lâminas
obtidas de blocos de microarranjo tecidual ou “tissue microarray” (TMA).
Previamente à confecção do bloco de TMA, realizamos o procedimento para
silanização das lâminas com intuito de diminuir perda de material.
As lâminas foram deixadas em solução detergente neutra por duas horas e,
após a lavagem em água corrente até a retirada completa do detergente, foram
imersas seqüencialmente em três cubas contendo respectivamente acetona, silano a
4% e acetona. A seguir, passaram por mais três cubas de acetona e foram deixadas
em estufa de secagem a 58°C até sua utilização.
Na sequência, escolhemos os sítios de interesse de cada amostra que
continha a área mais característica e representativa da EPP e, marcamos com
caneta permanente a lâmina assim como também foram marcados os blocos de
parafina correspondentes à lâmina.
A construção do bloco de TMA seguiu a técnica preconizada por Kononen
et al (1998), utilizando-se dispositivo de base fixa com agulhas de 2 mm de
diâmetro. O bloco foi confeccionado com 51 cilindros em espelho com espaçamento
de 2,2, mm entre os centros dos cilindros, na unidade situada em Botucatu do
Laboratório de Consultoria em Patologia.
Através de um modelo semi-automatizado, foram construídas as caselas no
bloco receptor e imediatamente depois foi feita a extração de cilindros teciduais de 2
mm de diâmetro da respectiva área de interesse previamente selecionada do bloco
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doador. Em seguida, procedeu-se a transferência do cilindro tecidual obtido do bloco
doador para a casela previamente criada no bloco receptor.
Foram construídos blocos de parafina do tipo “array” de tecido (TMA)
utilizando-se um “arrayer” de tecido biológico produzido pela Beecher Instruments,
Sun Prairie, EUA (Fig. 6a). Essa técnica permite a inclusão de grande número de
casos em um mesmo bloco de parafina, que ficam representados por cilindros de
tecidos, cujo diâmetro pode variar de 0,6 a 2,0 mm, colocados a uma distância de
1,0 mm entre si, tanto na horizontal quanto na vertical.
No presente trabalho, cada caso estava representado por 3 cilindros de
tecido consecutivos obtidos a partir dos blocos de parafina “doadores” (blocos
originais contendo endometriose ou tecido normal), com diâmetro de 2 mm. A
retirada dos cilindros do bloco de parafina “doador” e sua inclusão no bloco de
parafina “receptor” (bloco de TMA) foi realizada com a ajuda de agulhas especiais.
Os cilindros ou amostras de todos os casos incluídos no estudo foram
distribuídos num total de 3 blocos “receptores”, obedecendo-se ao mapa de TMA,
que registra a disposição e identificação dos casos (Fig. 6b).
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Mapa 1 Mapa 2
Mapa 3
FIGURA 6 - (a) Equipamento para a construção do bloco do TMA
arrayer de tecido biológico; (b) Blocos de TMA.
Para direcionamento da leitura, cada bloco de TMA era representado por
seu respectivo mapa (Fig. 7), explicitando o posicionamento de cada amostra. Além
dos casos em estudo, cada bloco de TMA também apresentava tecidos-controle
positivos adequados (amígdala, fígado, controle-normal, HER-2+ em câncer de
mama, mama normal e carcinoma) para a avaliação de todos os anticorpos
empregados no estudo imunoistoquímico. Os mapas para a análise dos blocos deste
estudo estão no ANEXO 3.
a
b
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FIGURA 7 - Mapa de TMA. Esse mapa orienta a inclusão dos casos no bloco de
TMA e, posteriormente, a identificação dos casos para a interpretação
dos resultados obtidos, por exemplo, com a imunoistoquímica.
3.5 Processamento para imunohistoquímica
A técnica de imunoistoquimica utilizada neste estudo para avaliar a
expressão protéica de aromatase p450, ciclooxigenase-2 (COX-2) e de receptores
de estrógeno (RE) foi realizada pelo Serviço de Anatomia Patológica da Faculdade
de Ciências Médicas da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo.
Em todos os casos, foram feitos cortes histológicos de 3µm de espessura,
desparafinizados com xilol (xilol a 60º C, durante 30 minutos, seguida por mais dois
banhos em xilol à temperatura ambiente, durando quinze minutos cada) e em
seguida re-hidratação com etanol absoluto (etanol absoluto I, etanol absoluto II,
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Doutorado 2010
30
etanol absoluto III, etanol 95º GL e etanol 80º GL [GayLussac], dois minutos cada
banho) e finalização em passagem por água destilada.
Depois desta primeira etapa, 1.600 mL do tampão citrato de sódio 0,1 M (pH
6,0) foram adicionados com exposição ao vapor durante 30 minutos, com a
finalidade de recuperar o epítopo antigênico e restituição da antigenicidade à
proteína afetada pelos tecidos fixados em formalina. As lâminas foram então
mantidas em vapor por 30 minutos e depois disso, conservadas em solução
tamponada, à temperatura ambiente, durante 20 minutos. Realizamos em seguida a
Reação de inibição da peroxidase endógena, por meio da lavagem das lâminas em
peróxido de hidrogênio a 3%, por quatro vezes, por dez minutos cada, e lavagem em
água parada, por cinco minutos. O processo foi finalizado pela lavagem das lâminas
no tampão salino PBS (pH 7.4), por duas vezes por 15 minutos.
As lâminas foram incubadas com anticorpo policlonal anti-aromatase,
obtido a partir do soro de camundongos (MCA2077, Serotec Inc.) na diluição
especificada pelo fabricante (aromatase: 1/70), anticorpos monoclonais primários
obtidos a partir de soro de camundongo para expressão da COX-2 (Novocastra Inc.,
Clone 4H12) na diluição especificada pelo fabricante (COX-2: 1/80) e receptores de
estrógeno Humano (DAKO Inc., Clone 1D-5) na diluição especificada pelo
fabricante (RE: 1/2300), pelas técnicas Steamer e Advance + DAB líquido Dako.
Transcorridas 18 horas em geladeira, realizamos a lavagem das lâminas,
por duas vezes, em tampão PBS (pH = 7,4), por dez minutos e incubação dos cortes
teciduais com anticorpos secundários (anticorpos de ligação), por 30 minutos em
estufa a 37ºC.
ROSSI LM
Doutorado 2010
31
Utilizamos também o anticorpo secundário biotinilado universal [Kit DAKO
LSAB Systems Peroxidase (DakoCorp., Carpinteria, CA, USA)] e para tal, as lâminas
foram novamente lavadas em tampão PBS, duas vezes, por dez minutos. Este
processo foi seguido pela incubação das lâminas em anticorpo terciário,
estreptavidina-biotinaperoxidase (Kit DAKO LSAB Systems, Peroxidase-universal),
em câmara úmida, por 30 minutos, em estufa a 37ºC. Após nova lavagem das
lâminas em solução tampão, duas vezes, por dez minutos, estas foram submetidas à
reação cromógena em 3,3´,5,5´ tetrahidrocloreto de diaminobenzidina (DAB), por
três a cinco minutos. Esta reação culmina no aparecimento da cor sépia,
característica do anticorpo fixado à proteína. As lâminas foram novamente
submetidas a duas lavagens com água corrente (dez minutos cada banho).
Com intuito de melhor visualizar a marcação citoplasmática granular da
aromatase, realizamos a contra-coloração rotineira com hematoxilina de Mayer, por
três minutos, em temperatura ambiente, que fornece a coloração azulada ao
citoplasma e ao núcleo. As lâminas foram desidratadas em concentrações
decrescentes de etanol (50-70-100º. GL) e embebidas em xilol. Realizamos a
montagem das lâminas por meio de fixação sobre Entellan Marck, a fim de que a
preparação passasse a ter conservação permanente.
3.6 Critérios para a primeira avaliação da Expressão da Imunomarcação
Independentemente do marcador estudado, regiões patognomônicas da
EPP e áreas representativas da lesão ou zonas características do tecido normal que
constituem o ligamento uterosacral foram localizadas em baixa magnificação. Diante
ROSSI LM
Doutorado 2010
32
da impossibilidade de reconhecimento destas áreas, a amostra foi excluída da
avaliação.
3.6.1 Aromatase p450
Neste estudo, inicialmente optamos por uma avaliação semiquantitativa da
expressão da aromatase p450 que foi realizada de forma cega, por dois
examinadores (LMR e CLPL). A aferição foi feita no microscópio binocular E600 da
Nikon, no mesmo campo óptico, com aumento de 400 vezes.
Os critérios para esta avaliação basearam-se no estudo de Ristimäki et al
(2002) e das adaptações realizadas por Riachi et al (2008) e estão demonstrados na
Tabela 1. Consideramos a expressão positiva quando a coloração sépia presente no
citoplasma sob a forma de grânulos estivesse presente de forma moderada ou forte
em mais de 10% das células. A expressão foi classificada como positiva (escores
um, dois ou três), ou negativa (escore zero).
TABELA 1 - Escore utilizado para a avaliação da imunoexpressão da aromatase p450
Escore Critérios utilizados para a determinação do escore
Escore 0 Não se observam células coradas
Escore 1
Citoplasma e membrana celular corados de maneira difusa e fraca +
até 10% de células fortemente coradas
Escore 2
Coloração citoplasmática granular e da membrana celular de moderada
a forte em 10%-30% das células
Escore 3 Mais de 30% das células coradas com intensidade forte
ROSSI LM
Doutorado 2010
33
3.6.2 COX-2
O escore empregado para a expressão de COX-2 em amostras de
ligamento uterosacral oriundas de pacientes com ou sem endometriose foi o
sugerido por (Ristimäki et al, 2002) onde são classificadas como “negativas” as
amostras com escores zero ou um, e positivas aquelas com escores dois ou três,
conforme mostra a Tabela 2.
TABELA 2 – Escore utilizado para a avaliação da imunoexpressão da COX-2
Escore Critérios avaliados para a determinação do escore
Escore 0 Não se observam células coradas
Escore 1
Citoplasma e membrana celular corados de maneira difusa e fraca +
até 10% de células fortemente coradas
Escore 2
Coloração citoplasmática granular e da membrana celular de
moderada a forte em 10%-90% das células
Escore 3 Mais de 90% das células coradas fortemente
A semelhança da avaliação da aromatase, a avaliação da expressão de
COX-2 foi inicialmente semiquantitativa, realizada de forma cega, pelos mesmos
examinadores e no mesmo microscópio.
3.6.3 Receptores de Estrógeno
A presença de receptores para estrógeno (RE) foi realizada de forma cega e
por dois examinadores. No entanto, neste caso, foi realizada uma avaliação
quantitativa relativa ao número de núcleos marcados. Optamos pela realização de
ROSSI LM
Doutorado 2010
34
contagem em três diferentes campos, com avaliação final dada pela média das três
contagens. Os campos de interesse foram escolhidos em baixa magnificação. Com a
objetiva de 40X, a expressão do marcador foi tomada em núcleos corados, após a
avaliação de 100 células em cada campo escolhido.
Para que fosse possível a análise de correlação dos achados semi-
quantitativos entre os diferentes marcadores, criamos um escore para a expressão do
estrógeno com base no número de núcleos marcados conforme demonstra a Tabela 3.
TABELA 3 - Escore com base na porcentagem de núcleos marcados para estrógeno
Escore Critérios avaliados para a determinação do escore
Escore 0 Nenhum núcleo marcado
Escore 1 Coloração nuclear presente em até 10% das células
Escore 2 Coloração nuclear presente de 10%-30% das células
Escore 3 Mais de 30% dos núcleos coradas
3.7 Avaliação complementar da Expressão da Imunomarcação
Após a avaliação anteriormente apresentada, optamos pela realização de
uma avaliação quantitativa da imunoexpressão de aromatase, COX-2 e receptores
para estrógeno.
Para tal, escolhemos a quantificacão por densidade óptica relativa (ROD)
através do sistema MCID de análise densitométrica digital (InterFocus Imaging Ltd.,
Linton, England) (Fig. 8a e 8b).
ROSSI LM
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35
Os cortes histológicos obtidos pelo TMA foram submetidos à avaliação e
para estes foi estabelecida uma curva de calibração a partir de uma escala de
densidades ópticas com valores conhecidos e os valores obtidos a partir dos cortes
serão interpolados na curva. O equipamento foi calibrado com base nas nossas
amostras em porções da lâmina que não continham tecidos, com abertura da lente
de 8 cm; altura da lente de 32,9 cm e flat field corretion de 871.
FIGURA 8 – (a) Equipamento para avaliação da Densidade Óptica Relativa (ROD).
(b) Sistema MCID de análise densitométrica digital (InterFocus Imaging
Ltd., Linton, England)
Antes de avaliarmos as amostras de ligamento uterosacral, fizemos a
medição de amostras-controle que estavam presentes nos mapas do TMA e os
valores estão demonstrados na Tabela 4. Lacunas sem tecido de cada lâmina de
TMA para cada um dos marcadores foram utilizadas para a calibragem do aparelho
e exibiram valor igual a zero.
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36
TABELA 4 - Valores de ROD obtidos nas amostras controle do TMA.
COX-2 Aromatase RE
MAPA 1
HER-2+ 0,4228 0,3538 0,2701
Amígdala 0,5526 0,4496 0,3729
COX-2 + 0,4561 0,3286 0,3144
Fígado 0,4313 0,2948 0,2838
Controle Normal 0,2499 0,2110 0,2164
Mama RE + 0,4140 0,2632 0,2924
MAPA 2
HER-2+ 0,3550 0,2861 0,2587
Amígdala 0,3918 0,2828 0,2904
COX-2 + 0,5302 0,2791 0,3057
Fígado 0,3372 0,2661 0,2594
Controle Normal 0,3803 0,2148 0,2050
Mama RE + 0,44479 0,2980 0,3111
MAPA 3
HER-2+ 0,4788 0,2792 0,2731
Amígdala 0,5109 0,3460 0,3299
COX-2 + 0,4173 0,2316 0,2584
Fígado 0,3494 0,2627 0,2479
Controle Normal 0,2986 0,2319 0,2469
Mama RE + 0,4077 0,2431 0,2577
Para cada uma das amostras do estudo foram obtidas medidas nas áreas
representativas da endometriose (Grupo ENDOMETRIOSE) e em áreas
características dos ligamentos uterosacrais (Grupo CONTROLE). Os valores
obtidos foram comparados entre os grupos de estudo.
ROSSI LM
Doutorado 2010
37
3.8 Método Estatístico
O programa Microsoft Excel 2007 foi utilizado para compilação e
arquivamento dos dados. Utilizamos o programa MINITAB 15 para a análise
descritiva e estatística dos resultados.
O número médio da expressão de estrógeno (variáveis quantitativas) e as
medidas obtidas após a avaliação quantitativa por ROD foram tratados pelo Teste t
de Student e as variáveis qualitativas (escores) foram analisadas pelos testes Qui-
Quadrado, Exato de Fisher e Kruskal-Wallis.
Para correlacionar os resultados obtidos após a avaliação da expressão da
aromatase, COX-2 e receptores para estrógeno, utilizamos a correlação de Pearson
(paramétricos) e Spearman (não-paramétricos) quando pertinente e a interpretação
dos dados seguiu-se com base na Tabela 5. Para este estudo, consideramos
valores de alfa ≤ 0,05 estatisticamente significantes.
TABELA 5 – Dados para interpretação das medidas de correlação.
Coeficiente de Correlação Correlação
r = 1 Perfeita positiva
0,8 ≤ r < 1 Forte positiva
0,5 ≤ r < 0,8 Moderada positiva
0,1 ≤ r < 0,5 Fraca positiva
0 < r < 0,1 Ínfima positiva
0 Nula
- 0,1 < r < 0 Ínfima negativa
-0,5 < r ≤ -0,1 Fraca negativa
-0,8 < r ≤ -0,5 Moderada negativa
-1 < r ≤ -0,8 Forte negativa
r= -1 Perfeita negativa
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4. RESULTADOS
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Um total de 51 amostras de ligamentos uterosacrais foi incluído neste
estudo. Deste total, 23 (45,1%) eram provenientes de mulheres livres de doença
(Grupo CONTROLE) e 28 amostras (54,9%) pertenciam à pacientes com EPP.
4.1 Avaliação semi-quantitativa da aromatase
Do total de casos alocados no grupo CONTROLE, houve perda do material
após processamento do TMA em uma amostra e ausência de área histológica
representativa da estrutura em outro caso, restando-nos para análise 21 casos
(91,3%). Dos 28 casos incluídos no grupo ENDOMETRIOSE, não foram encontradas
áreas representativas da doença em quatro casos e, portanto a análise da
imunoexpressão foi feita em 24 casos (85,7%). Os resultados encontrados após
imunomarcação para avaliação da expressão protéica de aromatase p450 estão
demonstrados no Gráfico 1.
Dezessete casos (81,0%) mostraram-se negativos do grupo CONTROLE
com expressão nula da aromatase (escore zero). Expressão positiva foi considerada
em quatro casos (19,0%) sendo dois casos com imunoexpressão em menos de 10%
das células (escore 1 – 9,5%), um caso com escore 2 (4,8%) e um caso com escore
3 (4,8%).
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40
endometriosecontrole
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
GRÁFICO 1 – Boxplot com valores individuais de escores obtidos após avaliação da
imunoexpressão de aromatase p450 nos grupos CONTROLE e
ENDOMETRIOSE.
No Grupo ENDOMETRIOSE foram encontrados seis casos (25,0%) com
escore zero, oito casos (33,3%) com escore 1, nove casos com escore 2 (37,5%)
(Fig. 9a, 9b, 10a, 10b, 10c) em 4,2% o escore 3 foi atribuído (Fig. 10d). A expressão
de aromatase foi positiva em 75,0% das amostras do grupo ENDOMETRIOSE e
mostrou diferença significante quando comparada ao Grupo CONTROLE cuja taxa
de posivitividade foi de 19% (x
2
= 15,742 e P<0,001) (TAB. 6).
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Doutorado 2010
41
TABELA 6 - Expressão da proteína aromatase p-450 por imunohistoquímica nas
amostras de ligamento uterosacrais de mulheres livres de doença
(Grupo CONTROLE) e pacientes com EPP (Grupo
ENDOMETRIOSE).
Grupo CONTROLE Grupo ENDOMETRIOSE Valor de P
Casos analisados
21 24
Mediana do escore 0 1 0,002*
Positivos (%) 4 (19,0) 18 (75,0) <0,001 **
* Kruskal-Wallis Test, H = 10.00 DF = 1 ; ** Chi-Sq = 15,742, DF = 1
FIGURA 9 - Endometriose em ligamento uterosacral apresentando imunomarcação
positiva para a aromatase no componente glandular e no estroma. (a)
Escore 2 em glândulas (*) e Escore 1 (↓) no citoplasma. (b) Escore 2
em glândulas e estroma (↓). Imunohistoquímica X 400.
a
*
*
*
↓
↓↓
↓
↓
↓↓
↓
↓
↓↓
↓
b
↓
↓↓
↓
↓
↓↓
↓
↓
↓↓
↓
ROSSI LM
Doutorado 2010
42
FIGURA 10 – Endometriose em ligamento uterosacral apresentando glândula com
imunomarcação positiva para a aromatase. (a) Escore 2 com
granulação citoplasmática característica (*) Escore 1 no estroma com
marcação mais fraca (↓), Imunohistoquímica X 400. (b) Expressão
positiva (*) para aromatase em glândulas e estroma (escore 2),
Imunohistoquímica X 200. (c) Escore 2 (*) com imunomarcação
positiva para a aromatase, Imunohistoquímica X400. (d) Escore 3
com imunomarcação positiva para aromatase no epitélio glandular (*)
e escore 2 no estroma (↓), Imunohistoquímica X 400.
a
b
c
d
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
↓
↓
↓
ROSSI LM
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43
4.2 Avaliação semi-quantitativa da COX-2
Em relação à expressão da enzima COX-2, houve perda de material
decorrente do TMA em dois casos sendo um de amostra oriunda de paciente com
EPP e outro alocado no grupo CONTROLE. Ainda no grupo CONTROLE, não foi
possível a leitura de uma amostra que demonstrou artefatos técnicos do
processamento histológico culminando na análise de 21 casos neste grupo.
Em três casos alocados no Grupo ENDOMETRIOSE, não foi possível
localizar áreas com representação histológica da EPP e, portanto, foram excluídos
desta análise. Assim, a avaliação da imunoexpressão da COX-2 no grupo
ENDOMETRIOSE foi realizada em 24 casos.
Vinte casos do grupo CONTROLE foram considerados negativos (95,2%). O
único caso positivo recebeu escore 3. Dos 10 casos positivos do Grupo
ENDOMETRIOSE, nove (90%) receberam escore 3 (Fig. 11a, 11b, 11c, 11d, 12a) e
um caso recebeu escore 2 (Fig. 12b). O gráfico 2 mostra a distribuição destes
escores em cada grupo de estudo.
A imunoexpressão de COX-2 foi negativa em 20 amostras do grupo
CONTROLE (95,2%) e em 14 casos do Grupo ENDOMETRIOSE (58,3%).
Positividade foi notada em 41,7% (n=10) dos fragmentos de ligamento uterosacral
acometidos por EPP e esta taxa foi significativamente maior do que aquela obtida
nas amostras do grupo CONTROLE (4,8%; p=0,004) (Tab. 7).
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Escore
endometriosecontrole
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
GRÁFICO 2 - Boxplot com valores individuais de escores obtidos após avaliação da
imunoexpressão de COX-2 nos grupos CONTROLE e
ENDOMETRIOSE.
TABELA 7 - Expressão da COX-2 por imunohistoquímica nas amostras de
ligamento uterosacrais de mulheres livres de doença (Grupo
CONTROLE) e pacientes com EPP (Grupo ENDOMETRIOSE).
Grupo CONTROLE Grupo ENDOMETRIOSE Valor de P
Casos analisados 21 24
Mediana do Escore 0 0 0,035*
Positivos (%) 1 (4,8) 10 (41,7)** 0,004**
*Kruskal-Wallis Test, H = 4,43, DF=1 ; **Chi-Sq = 8.259, DF = 1
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FIGURA 11 - Endometriose em ligamento uterosacral apresentando imunomarcação
positiva para a COX-2. (a), (c), (d) Escore 3 com marcação positiva
para COX-2 em tecido glandular (*) e estroma (↓). (b) Escore 3 com
marcação positiva para COX-2 no estroma (↓).Imunohistoquímica X
400.
a
b
c d
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FIGURA 12 - Endometriose em ligamento uterosacral com imunomarcação
positiva para a COX-2 em glândulas (*) e estroma (↓). (a) Escore 3;
(b) Escore 2. Imunohistoquímica X 400.
4.3 Avaliação quantitativa dos receptores de estrógeno
Em relação aos receptores para estrógeno, houve perda de material
decorrente do TMA em uma amostra do Grupo CONTROLE e a análise foi possível
em 22 amostras. No Grupo ENDOMETRIOSE, a avaliação foi feita em 20 casos,
pois do total, cinco casos foram excluídos por não exibirem área representativa da
lesão, dois casos foram não-conclusivos pois a imunomarcação mostrou-se no
citoplasma e um caso foi perdido no TMA.
Do total de amostras avaliadas, sete foram consideradas negativas, sendo
três casos no grupo CONTROLE e 4 casos no Grupo ENDOMETRIOSE. As
porcentagens obtidas em cada Grupo estão demonstradas no Gráfico 3.
Imunomarcação positiva foi encontrada em 86,4% e 80,0% das amostras,
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Doutorado 2010
47
respectivamente, nos Grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE, sem significância
estatística após a comparação dos dados (chi-square = 0,3055; Teste Exato de
Fisher = 0, 4409 e p=0,5805).
A Figura 13a nos mostra um caso do grupo CONTROLE com marcação
positiva abundante, porém mais fraca quando comparada às amostras de ligamento
uterosacral acometidas por EPP (Fig 13b). Amostras positivas alocadas no Grupo
ENDOMETRIOSE estão demonstradas nas Figs. 14a, 14b, 14c e 14d. Três casos
ficaram alocados no escore zero, 2 casos no escore 1, 6 casos no escore 2 e 11
casos no escore 3 no Grupo CONTROLE. No grupo ENDOMETRIOSE, foram 4
casos com escore zero, 3 casos com escore 1, 4 casos no escore 2 e 9 casos no
escore 3, demonstradas no Gráfico 3.
%
EndometrioseControle
100
80
60
40
20
0
GRÁFICO 3 - Boxplot com valores individuais de escores obtidos após avaliação
da imunoexpressão de Estrógeno (E2) nos grupos CONTROLE e
ENDOMETRIOSE
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FIGURA 13 – (a) Estroma normal de ligamento uterosacral de paciente sem
endometriose com imunomarcação positiva para receptores de
estrógeno. (b) Estroma de ligamento uterosacral acometido por
EPP com imunomarcação positiva para receptores de estrógeno.
Imunohistoquímica X 400.
Quando a média das porcentagens obtidas em cada grupo, incluindo os
casos negativos, foi comparada entre os grupos, não foi notada diferença
significante (38,4% versus 41,3%; respectivamente, Grupos CONTROLE e
ENDOMETRIOSE; p=0,779; 95% de intervalo de confiança, teste t de Student). A
análise descritiva da expressão do estrógeno por imunohistoquímica em nossas
amostras está demonstrada na Tabela 8.
a
b
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FIGURA 14 - (a, b, c, d) - Endometriose em ligamento uterosacral apresentando
glândula e estroma com imunomarcação nuclear positiva para
receptores de estrógeno. Imunohistoquímica X 400.
TABELA 8 - Análise descritiva da Expressão do Estrógeno por imunohistoquímica
nas amostras de ligamento uterosacrais de mulheres livres de doença
(Grupo CONTROLE) e pacientes com EPP (Grupo ENDOMETRIOSE).
Grupo CONTROLE Grupo ENDOMETRIOSE
Casos analisados 22 20
Média ± erro padrão (%) 38,4 ± 6,1 41,2 ± 8,0
Mínimo - Máximo (%) 0 – 80 0 – 95
Mediana 35 30
ROSSI LM
Doutorado 2010
50
4.4 Avaliação quantitativa por ROD da imunomarcação
Nossa avaliação complementar demonstrou um aumento na densidade
óptica relativa estatisticamente significante nas amostras oriundas de pacientes
portadoras de EPP para os três marcadores estudados. As Figuras 15 a 17 nos
mostram amostras de ligamento uterosacral cuja imagem fora obtida pelo sistema
que avalia a ROD com áreas representativas da lesão. Os resultados estão
demonstrados na Tabela 9 e nos Gráficos 4, 5, 6).
FIGURA 15 – (a) Imagem obtida para a análise de densidade óptica relativa (ROD)
e em (b) Fotomicrografia da mesma amostra mostrando
imunomarcação positiva para aromatase em amostras de ligamento
uterosacral com EPP.
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FIGURA 16 – (a) Imagem obtida para a análise de densidade óptica relativa (ROD) e
em (b) Fotomicrografia da mesma amostra mostrando imunomarcação
positiva para COX-2 em amostras de ligamento uterosacral com EPP.
FIGURA 17 – (a) Imagem obtida para a análise de densidade óptica relativa (ROD)
e em (b) Fotomicrografia da mesma amostra mostrando
imunomarcação positiva para receptores de estrógeno em amostras
de ligamento uterosacral com EPP.
ROSSI LM
Doutorado 2010
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TABELA 9 – Avaliação quantitativa da Densidade Óptica Relativa (ROD) nos
Grupos Controle e Endometriose para os três marcadores
analisados.
CONTROLE
(média ± erro padrão)
ENDOMETRIOSE
(média ± erro padrão)
Valor de P
Aromatase* 0,249 ± 0,005 0,351 ± 0,023 <0,001
COX-2 ** 0,385 ± 0,013 0,457 ± 0,020 0,004
RE *** 0,253 ± 0,009 0,322 ± 0,016 0,001
* 95 % de IC (-0,1519; -0,0525) ; ** 95 % de IC (0,1206; -0,0242); *** 95 % de IC (-0,1070; -0,0315)
ENDOMETRIOSECONTROLE
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
Aromatase
Gráfico 4 - Boxplot com valores individuais por ROD (densidade óptica relativa)
após avaliação da imunoexpressão de Aromatase nos grupos
CONTROLE e ENDOMETRIOSE,
ROSSI LM
Doutorado 2010
53
ENDOMETRIOSECONTROLE
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
COX-2
Gráfico 5 - Boxplot com valores individuais por ROD (densidade óptica relativa)
após avaliação da imunoexpressão de COX-2 nos grupos CONTROLE e
ENDOMETRIOSE.
endometriosecontrole
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
RE
Gráfico 6 - Boxplot com valores individuais por ROD (densidade óptica relativa)
após avaliação da imunoexpressão de receptores para estrógeno nos
grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE
ROSSI LM
Doutorado 2010
54
4.5 Correlação entre a imunoexpressão de aromatase, COX-2 e estrógeno
Quando submetemos os dados obtidos pelos escores de aromatase, Cox-2
e receptores para estrógeno à correlação de Pearson, não encontramos correlação
entre a expressão de aromatase p450 e COX-2 (r = 0,068) assim como também
entre a expressão da COX-2 e de receptores de estrógeno (r = 0,385) no Grupo
ENDOMETRIOSE (Tab. 10). Entretanto, quando os dados obtidos por ROD foram
avaliados, foi possível notar uma correlação positiva entre aromatase, COX-2 e
receptores para estrógeno, com significância estatística em todas as comparações
(Tab. 11).
TABELA 10 - Correlação de Spearman entre os dados semi-quantitativos da
imunoexpressão de aromatase, COX-2 e estrógeno no grupo
ENDOMETRIOSE, onde (A) é a correlação entre aromatase p450 e
COX-2; (B) Correlação entre aromatase p450 e E2; (C) Correlação
entre COX-2 e E2
Grupo ENDOMETRIOSE (A) (B) (C)
Correlação de Spearman 0,093 0,145 0,344
Valor de P 0,246 0,322 0,053
TABELA 11 - Correlação de Pearson entre os dados semi-quantitativos da
imunoexpressão de aromatase, COX-2 e estrógeno no grupo
ENDOMETRIOSE, onde (A) é a correlação entre aromatase p450 e
COX-2; (B) Correlação entre aromatase p450 e E2; (C) Correlação
entre COX-2 e E2
Grupo ENDOMETRIOSE (A) (B) (C)
Coeficiente de correlação de Spearman 0,607 0,735 0,648
Correlação de Pearson (r) 0,582 0,561 0,721
Valor de P 0,003 0,001 0,004
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5. DISCUSSÃO
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A endometriose é uma afecção estrógeno-dependente que acomete
preferencialmente mulheres em idade reprodutiva e regride após ooforectomia ou
menopausa (Luisi et al, 2006). A fonte primária do estradiol é oriunda do ovário e
por causa disto, as condutas terapêuticas para a endometriose primam pelos
medicamentos que suprimem a função ovariana ou por drogas antagonistas às
ações do estrógeno (Dassen et al, 2007).
A origem e o estabelecimento desta doença na cavidade peritoneal é
explicada pela habilidade exibida pelas células endometriais em sobreviver, aderir e
invadir tecidos e, proliferar em sítios ectópicos de acordo com a teoria proposta por
(Sampson, 1927). Devido às evidências experimentais e à observação de que quase
todas as mulheres eumenorreicas apresentam refluxo menstrual através de suas
tubas uterinas, os mecanismos pelos quais só algumas mulheres desenvolvem a
doença não estão bem elucidados.
Em decorrência de estudos que objetivam a investigação das características
exibidas pelas células endometriais tais como invasividade, neoangiogênese,
produção de citocinas, fatores de crescimento e moduladores de esteróides (Gaetje
et al, 1995; Taylor et al, 2002; Matsuzaki et al, 2004) vários novas alternativas de
tratamento são indicadas às mulheres com endometriose (Ebert et al, 2005) que
incluem o uso de antagonistas do GnRH (Gonadotrophin release hormone),
moduladores seletivos dos receptores de progesterona, agonistas dos receptores do
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estrógeno, inibidores da angiogênese, inibidores das metaloproteinases,
imunomoduladores e inibidores do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), inibidores
da aromatase e da COX-2 (Nothnick, D´Hooghe, 2003; Matsuzaki et al, 2004; Ebert
et al, 2005).
Assim, algumas moléculas como a aromatase e a COX-2 são consideradas,
na atualidade, potentes alvos terapêuticos e o estudo de sua expressão nos tecidos
acometidos pela endometriose apresenta grande relevância clínica. Neste contexto,
idealizamos este estudo para avaliar e comparar a imunoexpressão da
AROMATASE P450, da CICLOOXIGENASE-2 e dos receptores para ESTRÓGENO
pela técnica de imunohistoquímica em espécimes cirúrgicos de ligamentos
uterosacrais de mulheres com e sem endometriose profunda.
Pudemos notar, neste estudo, uma super expressão da aromatase
associada a um aumento na expressão de COX-2 e de receptores para estrógeno
em amostras de ligamentos uterosacrais acometidos por EPP.
A técnica escolhida para a avaliação da imunoexpressão da aromatase,
COX-2 e receptores de estrógeno foi a imunohistoquímica em TMA. O TMA tem
ampla aceitação pela literatura mundial (Kononen et al, 1998) e um conceito
extremamente simples: trata-se de agrupar um grande número de amostras
teciduais obtidos de dezenas ou centenas de blocos de parafina em um bloco único
de parafina e permite o estudo da expressão de marcadores moleculares com
uniformização das reações, facilidade na interpretação comparativa dos casos de
uma pesquisa, economia de reagentes e de tempo para a realização das reações
(Andrade et al, 2007).
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Um dos grandes problemas do TMA, entretanto, refere-se à perda de
material por descolamento dos cortes que varia de 3,1% a 8,1% (Almeida et al,
2008). Para minimizarmos este artefato, empregamos a técnica de silanização das
lâminas e a taxa de perda de material variou de 1,9% a 3,9%, sem prejuízo das
análises. Outro fato relevante é o tamanho da amostra coletada para esta técnica
que pode não representar a área característica da lesão (Kononen et al, 1998). Na
tentativa de minimizar este problema, escolhemos “punchs” de 2 mm para a
confecção do TMA mas mesmo assim perdemos cinco casos para estudo da
aromatase (um do Grupo CONTROLE e 4 do Grupo ENDOMETRIOSE), quatro
casos para estudo da COX-2 (um no Grupo CONTROLE e três no Grupo
ENDOMETRIOSE) e sete casos para o estudo dos receptores para estrógeno, todos
no Grupo ENDOMETRIOSE. Acreditamos também que este fato possa ser explicado
pela diminuição considerável de amostras no bloco de parafina decorrente da feitura
anterior de lâminas histológicas.
Na endometriose, há evidências de que a aromatase esteja envolvida em
um ciclo de retroalimentação a favor da expressão de genes-chave da
esteroidogênese (Bulun et al, 2005).
Conforme já fora mencionado, a atividade da aromatase causa a
biossíntese local de E2, que estimula a produção da COX-2, resultando em níveis
elevados de PGE2, a qual é um potente estimulante da atividade da aromatase,
levando a uma produção contínua de estrógeno e PGE2 no tecido endometrióide.
Em muitas linhagens celulares humanas, as concentrações de estrógeno e PGE2
estão diretamente relacionadas à proliferação, migração, angiogênese, resistência a
apoptose e invasividade (Ebert et al, 2005).
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Na presença de estrógeno, aumenta o crescimento e a invasão do tecido
endometrióide enquanto que o aumento de PGE2 causa dor, inflamação e
infertilidade (Bulun et al, 2005; Colette et al, 2009) que estimula a produção de
PGE2 regulada pela COX-2.
Em condições patológicas, é a aromatase p450 a responsável por catalisar
a aromatização dos androgênios circulantes em estrogênios com conseqüente
expressão no endométrio, processo induzido pelas prostaglandinas e outros
mediadores ligados à inflamação. Desta forma, a super expressão da proteína
aromatase associada à deficiência na expressão da 17β HSD-2, se estabelece um
ciclo vicioso de produção de estradiol e prostaglandinas que facilita a formação dos
implantes endometrióticos e perpetua este mecanismo fisiopatológico que favorece
as características proliferativas e inflamatórias da endometriose (Zeitoun, Bulun,
1999; Bulun et al, 2002).
O primeiro relato da literatura acerca da expressão da aromatase P450 em
implantes endometrióticos foi o estudo de Noble et al, em 1996. Neste estudo os
autores coletaram, durante laparotomia ou videolaparoscopia realizadas em de 21
mulheres, 17 fragmentos de implantes peritoneais de endometriose, 11 fragmentos
de endométrio proveniente de curetagem uterina de mulheres com endometriose,
sete biópsias de peritôneo normal de mulheres com a moléstia e sete fragmentos de
endométrio de mulheres que se submeteram à histerectomia por prolapso uterino,
miomatose ou doenças cervicais. De acordo com o estudo, foi demonstrada
transcrição da aromatase P450 por PCR nos 17 implantes peritoneais de
endometriose e em todas as 11 biópsias endometriais de pacientes portadoras da
doença. Já nos fragmentos coletados de mulheres sadias (peritôneo e endométrio),
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não houve detecção da aromatase P450.
Neste estudo, analisamos a imunoexpressão de aromatase, COX-2 e
receptores para estrógenos através de escores semiquantitativos e também fizemos
avaliação quantitativa desta expressão por densidade óptica relativa (ROD). A
avaliação por escores após reações imunohistoquímicas já é sedimentada na
literatura científica (Ristimäki et al, 2002; Oliveira et al., 2007, Riachi et al, 2008, Zhu
et al, 2008) assim como também há estudos que mostram a utilização da ROD para
a avaliar a expressão de marcadores na endometriose (Nisolle et al, 1997,
Tabibzadeh et al, 2003) e em outros tecidos (Kothapalli et al, 1997, Chen et al, 2001,
Viel et al, 2008).
Após avaliação semiquantitativa, notamos uma expressão 3,9 vezes maior
da aromatase nos tecidos acometidos por EPP quando comparado ao controle
(9,5% versus 75,0%, respectivamente, grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE)
cujos achados foram confirmados pela avaliação quantitativa pela ROD (0,25 versus
0,35; respectivamente, Grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE; p<0,001).
Os resultados de nosso estudo corrobora com estudos já publicados (Noble
et al, 1996; Bulun et al, 2004; Ebert et al, 2005; Ferrandina et al, 2005; Wölfler et al,
2005; Buchwritz et al, 2006; Velasco et al, 2006; Acien et al, 2007; Banu et al,
2008) e leva-nos a especular que estas proteínas e, possivelmente a produção local
de estrógeno em ligamentos uterosacrais com EPP, possam de fato contribuir para a
capacidade de implantação das células endometriais.
Em relação à aromatase, os estudos de Colette et al (2009) e Delvoux et al
(2008) são os únicos que contradizem a literatura existente acerca da sua
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expressão, por mostrarem total ausência da atividade desta proteína em espécimes
com endometriose.
No estudo de Colette et al foi detectada uma quantidade sutil de RNAm para
aromatase por reação em cadeia de polimerase (PCR) sugerindo que o
desenvolvimento da endometriose parece não ser desencadeado por esta enzima
em focos endometrióides peritoneais, ovarianos e retovaginais por
imunohistoquímica.
Outra controvérsia refere-se à sua localização uma vez que alguns autores
encontram-na nas células do estroma (Wölfler et al, 2005; Velasco et al, 2006; Acien
et al, 2007) enquanto outros demonstraram sua localização em glândulas (Ishihara
et al, 2003; Wölfler et al, 2005; Hudelist et al, 2007). Em nosso estudo, analisamos
áreas representativas da endometriose no estroma e também nas glândulas e
pudemos notar sua expressão em ambos os compartimentos.
Collete et al (2009) acreditam que a marcação glandular positiva para
endometriose deve-se à presença de biotina endógena, pois em um primeiro
momento também encontraram positividade para a aromatase em espécimes com e
sem endometriose. Realizaram então, novas reações imunohistoquímicas
associadas a um procedimento para bloqueio da expressão endógena de biotina
antes da incubação com o anticorpo primário. O resultado foi uma ausência total da
marcação em todas as amostras estudadas.
Este estudo também contesta a marcação estromal da aromatase em
amostras de tecido com endometriose. Ressaltam que, em seus estudos iniciais tal
marcação também foi localizada, mas após a realização da coloração de Perls,
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detectou-se a presença de siderófagos ou depósitos de ferro no citoplasma destas
células (Colette et al, 2009).
No entanto, comprovação de que a aromatase realmente está presente nos
tecidos acometidos pela endometriose e a relevância clínica de sua expressão local
nos focos da doença é representada pelo sucesso do uso de inibidores desta
enzima nos casos graves de EPP em pacientes na pré ou pós-menopausa. Estudos
como os de Takayama et al (1998), Bulun et al (1999), Ebert et al (2005), Mousa et
al (2007), Remorgida al (2007) entre outros, têm exaustivamente discutido os efeitos
benéficos destas drogas elencadas como promissoras para o tratamento da EPP e
nos deixam fortes indícios de que o bloqueio na expressão da aromatase possa, de
fato, inibir a produção de estrógeno local e explicar a eliminação da dor e dos focos
remanescentes de endometriose não responsiva a outras terapias. Apesar disto, a
literatura científica ainda carece de estudos randomizados a respeito da real
eficiência, dosagem ideal, tipo de inibidor e indicação pra estas drogas.
Em relação à expressão da COX-2, nossos achados nos mostram um
aumento de 8,7 vezes nas amostras com EPP quando comparados àquelas livres de
doença (4,8% versus 41,7%, respectivamente grupos CONTROLE e
ENDOMETRIOSE), dados estes também confirmados após a análise de ROD (0,38
versus 0,46; respectivamente grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE, p=0,004)
sem controvérsias quando comparados à literatura científica.
Em estudo publicado por Banu et al (2008), após avaliação
imunohistoquímica, há evidências de que a COX-2 é expressa de forma abundante
em focos endometrióticos assim como também em tecidos normais de mulheres com
a doença. Os autores concluem que os conceitos emergentes relacionados à via
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COX-2/PGE2 suportam a compreensão da patofisiologia e patogenia da
endometriose.
Em 2005, Ferrandina et al foram os primeiros a documentar que a super
expressão de COX-2 em tumores endometriais não tem associação com a
expressão de receptores para estrógeno e progesterona e, neste estudo, sugerem
outras rotas bioquímicas mediadas pela COX-2 que não o aumento da exposição de
receptores para hormônios esteróides. Todavia, em tumores reconhecidos como
hormônio-dependentes, como os carcinomas de mama, muitos estudos referem uma
relação inversa entre a COX-2 e os receptores para hormônios esteróides. Isto
significa que quanto maior é a concentração de COX-2 associada a uma menor
exposição de receptores para estrógeno, maior é a agressividade do tumor e pior
seu prognóstico. Em outras palavras, a expressão elevada de COX-2 está
diretamente associada a casos mais graves conforme também ressalta o estudo de
Ristimäki e colaboradores (2002).
A COX-2 é induzida por citocinas, fatores de crescimento, oncogênese e
promotores tumorais e não é detectável na maior parte dos tecidos normais.
Associa-se a quadros inflamatórios e contribui para a síntese de PGE2, como já fora
exaustivamente elucidado (Hwang et al, 1998; Oliveira et al, 2007) o que poderia
facilmente explicar o achado de um escore 3 para um dos pacientes do Grupo
CONTROLE. Neste caso, acreditamos que a presença de COX-2 nesta amostra de
ligamento uterosacral possa refletir um quadro inflamatório importante inerente à
miomatose uterina, por exemplo.
À semelhança do que tem sido reportado para os inibidores de aromatase,
estudos reportam sucesso após o uso inibidores de COX-2 em pacientes com
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endometriose e suportam o conceito do surgimento de uma nova modalidade de
tratamento (Hull et al, 2005; Ebert et al, 2005; Olivares et al, 2008).
Em nosso estudo, a avaliação quantitativa dos receptores para estrógeno
(contagem de 100 células em três campos de grande aumento), demonstrou pouca
ou nenhuma correlação o aumento da expressão de aromatase e COX-2.
Detectamos, por este critério, 80% de núcleos marcados para receptores de
estrógeno em ambos os grupos (86,4% no Grupo CONTROLE e 80% no Grupo
ENDOMETRIOSE).
O ligamento uterosacral, do ponto de vista embriológico, origina-se a partir
do ducto de Müller e é composto por colágeno, elastina, músculo liso, feixes
nervosos, fibroblastos e estruturas vasculares (Norton, 1993). Juntamente com o
ligamento cardinal e o músculo elevador do ânus atua na sustentação do assoalho
pélvico por fixar a porção superior da vagina, cérvice e útero na posição
retroperitoneal sobre o diafragma pélvico. Sabidamente, expõe receptores para
estrógeno e progesterona mesmo em mulheres livres de qualquer doença
(Mokrzycki et al, 1997; Blakeman et al, 2000; Zhu et al, 2008). Este achado também
esteve presente em 81,2% das nossas amostras do grupo CONTROLE e em 80,0%
das amostras do Grupo ENDOMETRIOSE.
Quando mensuramos a quantidade de receptores para estrógeno em
ligamentos uterosacrais com EPP e comparamos com os valores obtidos em
ligamentos saudáveis, pudemos perceber que a marcação esteve presente em 5% a
80% dos núcleos de ligamentos uterosacrais sem doença e de 5% a 95% naqueles
acometidos pela EPP com taxa média de 38,4% a 41,2%, respectivamente,
CONTROLE e ENDOMETRIOSE, sem diferença significante, mas, mostrando uma
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tênue diferença na intensidade da marcação com amostras de ligamento uterosacral
mais fortemente coradas do que as amostras livres de doença. Em média, nas
nossas amostras, três a cada dez células tiveram seus núcleos marcados
independentemente da presença da EPP.
Explicamos a ausência de significância estatística na avaliação
convencional dos receptores para estrógeno pois acreditamos que este método
apresenta pouca sensibilidade para detectar diferenças em amostras com grandes
quantidades de núcleos marcados (>80%). Todavia, após a avaliação da ROD a
tênue diferença tanto na intensidade da marcação como na quantidade de células
marcadas, pôde ser notada e o método mostrou-se eficaz para isto. Encontramos
valores de ROD significativamente mais altos nos ligamentos oriundos de pacientes
com endometriose (0,25 versus 0,32; respectivamente, Grupos CONTROLE e
ENDOMETRIOSE, p=0,001) sugerindo uma expressão quantitativamente maior de
receptores para estrógeno na presença da endometriose.
Nossos achados corroboram com os encontrados por Noel et al (2009) após
estudo com 14 ligamentos uterosacrais de pacientes com EPP confirmaram a
presença de receptores para estrógeno e progesterona tanto nas glândulas
endometriais, estroma e também no músculo liso, independentemente da fase do
ciclo menstrual, à semelhança do que foi notado em nosso estudo. No entanto,
notaram subjetivamente que parece haver maior abundância destes receptores na
musculatura lisa que permeia os focos de endometriose do que na musculatura lisa
distante da lesão. Os dados não apresentaram diferenças significantes.
Muito embora a ROD tenha se mostrado eficiente para detectar um aumento
significativo na quantidade de receptores para estrógeno nos ligamentos
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uterosacrais com EPP principalmente nas proximidades da lesão em decorrência do
aumento da biossíntese local do E2, este não foi um estudo funcional nem
tampouco prestou-se para avaliar a biodisponibilidade destes receptores.
Aparentemente, há uma maior quantidade de receptores para estrógeno e isto por si
só pode ser considerado um importante pré-requisito para a determinação de
órgãos-alvo responsivos ao estrógeno.
Com os dados obtidos pela ROD nos três marcadores estudados, pudemos
estabelecer uma correlação estatística de modo a acreditar que na medida em que
aumenta a expressão de aromatase, elevam-se também os níveis de COX-2 com
conseqüente aumento no número de receptores para estrógeno em tecidos
acometidos pela EPP e isto nos possibilita acreditar na ação das drogas inibidoras
da COX-2 e da aromatase para o tratamento desta doença.
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6. CONCLUSÕES
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1. Amostras de ligamento uterosacrais acometidas por EPP apresentam
imunoexpressão positiva para aromatase p450, COX-2 e receptores para estrógeno
após avaliação semi-quantitativa (escores) e quantitativa (ROD).
2. Notamos uma expressão 3,9 vezes maior da aromatase nos tecidos
acometidos por EPP quando comparados ao controle e imunoexpressão da COX-2
aumentada em 8,7 vezes na endometriose quando comparada às amostras livres de
doença.
3. A expressão dos receptores para estrógeno após avaliação convencional
parece ser semelhante nas amostras de ligamento uterosacral com e sem EPP; no
entanto, foi possível notar ROD aumentada nos espécimes acometidos por EPP.
4. Valores da imunoexpressão dos três marcadores estudados, obtidos
após avaliação semi-quantitativa, não mostraram correlação nas amostras de
ligamento uterosacral com EPP.
5. Notamos correlação moderada positiva entre os marcadores quando os
valores de ROD foram analisados.
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7. ANEXOS
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Anexo 1 – Aprovação do Comitê de Ética da ISCMSP
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Anexo 2 - Termo de consentimento livre e esclarecido
Informações às pacientes
Este estudo tem por objetivo analisar a expressão de substâncias (proteínas) no
ligamento útero-sacro de pacientes com e sem endometriose pélvica profunda. Para
isso, precisamos coletar fragmentos do ligamento útero-sacro durante o ato
cirúrgico. As biópsias de ligamento útero-sacro das pacientes sem endometriose
serão obtidas de pacientes com outras afecções ginecológicas de indicação cirúrgica
e que envolvam a abordagem do ligamento útero-sacro durante o tratamento
cirúrgico. Dessa maneira, as pacientes que participarem do estudo não terão
nenhum procedimento e/ou risco acrescidos ao seu tratamento, além daqueles já
existentes em seu tratamento habitual. As pacientes não terão sua identidade
revelada e terão suas informações mantidas em caráter sigiloso. Os dados obtidos
serão arquivados para posterior uso em fins didáticos e científicos. As pacientes
poderão, a qualquer momento, desistir de participar da pesquisa, sem que isto
implique em qualquer prejuízo às mesmas.
São Paulo, ___ de _________ de 200_.
Dr Paulo A. Ayroza Galvão Ribeiro
CRM 60560
Consentimento Pós-Informação
Eu, ________________________________________________________, portadora
do RG ______________________abaixo assinada, declaro estar ciente da natureza
deste estudo e ter pleno conhecimento de todos os procedimentos necessários para
realização do mesmo. Declaro ter lido o exposto no documento anexo, “Informação
às pacientes”, e concedo meu acordo de participação de livre e espontânea vontade.
Confirmo ainda que me foi assegurado o direito de abandonar a qualquer momento
o estudo, se assim eu o desejar.
São Paulo, ___ de _____________ de 200__.
___________________________________
Assinatura da Paciente
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Anexo 3 - Mapas 1, 2 e 3 do TMA
Mapa 1 do TMA
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Mapa 2 do TMA
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Mapa 3 do TMA
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ROSSI LM
Doutorado 2010
87
RESUMO
ROSSI LM
Doutorado 2010
88
Rossi LM. Imunoexpressão da aromatase, cicloxigenase-2 e receptores de
estrógeno em ligamentos uterosacrais de mulheres portadoras de endometriose
pélvica profunda. Tese. Doutorado. 2010.
Introdução: A Endometriose Pélvica profunda (EPP) apresenta lesões que se
infiltram rapidamente e acometem com freqüência os ligamentos uterosacrais, entre
outros sítios anatômicos. Há evidências de que a expressão de aromatase nas
células endometriais parece ser o elemento chave para o implante destas células na
cavidade pélvica e o conseqüente desenvolvimento das lesões de endometriose. A
atividade da aromatase, por aumentar a síntese local de estrogênios, estimula a
produção da prostaglandina E2
e esta por sua vez, induz o aumento da
cicloxigenase-2 (COX-2) estabelecendo assim um feedback positivo a favor da
formação contínua de estrógenos. Objetivos: Este estudo teve por objetivo avaliar,
comparar e correlacionar a imunoexpressão das aromatase p450, da COX-2 e dos
receptores para estrógeno em espécimes cirúrgicos de ligamentos uterosacrais de
mulheres portadoras de endometriose profunda e em ligamentos uterosacrais de
pacientes sem endometriose. Casuística e Métodos: Cinquenta e um espécimes
cirúrgicos de ligamento uterosacral oriundos de pacientes com EPP (n=28) e livres
de doença (n=23) foram incluídos neste estudo. As amostras foram processadas
para análise imunohistoquímica após confecção de bloco de tissue microarray (TMA)
e avaliadas por critérios semiquantitativos e quantitativos. Resultados: Neste
estudo, notamos uma expressão 3,9 vezes maior da aromatase nos tecidos
acometidos por EPP quando comparado ao controle (19,0% versus 75,0%,
respectivamente, grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE) e expressão da COX-2
aumentada em 8,7 vezes na endometriose quando comparada ao grupo controle
(4,8% versus 41,7%, respectivamente, grupos CONTROLE e ENDOMETRIOSE)
após critério semiquantitativo. Valores de densidade óptica relativa (ROD)
mostraram-se estatisticamente maiores para os três marcadores analisados nas
amostras com EPP, com correlação positiva entre eles. Conclusões: Amostras de
ligamento uterosacrais acometidas por EPP apresentam imunoexpressão positiva
significativamente maiores para aromatase p450, COX-2 e receptores para
estrógeno do que aquelas livres de doença, com correlação positiva entre os
marcadores.
ROSSI LM
Doutorado 2010
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ABSTRACT
ROSSI LM
Doutorado 2010
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ROSSI LM. Immunoexpression of aromatase, cyclooxygenase-2 and estrogen
receptors in uterosacral ligaments from women affected with Deep Infiltrating
Endometriosis. Tese. Doutorado, 2010.
Introduction: Deeply Infiltrating Endometriosis (DIE) presents rapidly infiltrating
lesions which frequently affect the uterosacral ligaments and other anatomic sites.
Evidence suggests that aromatase expression in endometriotic cells is a key factor
contributing to implantation of these cells in the pelvic cavity and subsequent
development of endometriotic lesions. Aromatase activity, by increasing local
estrogen synthesis, stimulates the production of prostaglandin E2 which in turn
induces increased cyclooxygenase-2 (COX-2) expression thereby establishing a
positive feedback loop conducive to the continuous formation of estrogens.
Objectives: The aim of this study was to assess, compare and correlate the
immunoexpression of aromatase, COX-2 and estrogen receptors in surgical
specimens of uterosacral ligaments from women with DIE versus patients without
endometriosis. Casuistic and Methods: Forty-five surgical specimens of
uterosacral ligament from patients with DIE (n=24) and without DIE (n=21) were
included in this study. The samples underwent immunohistochemical analysis after
being set into a tissue microarray (TMA) block, and were assessed using semi-
quantitative and quantitative criteria. Results: The present study revealed a 3.9-fold
higher expression of aromatase in tissues affected by DIE compared to control
samples (75.0% versus 19.0% in Endometriosis and Control Groups, respectively),
and 8.7 times greater elevation in COX-2 expression in endometriotic tissues
compared to control samples (41.7% versus 4.8% in Endometriosis and Control
Groups, respectively) according to semi-quantitative criteria. Relative optical density
values (ROD) were found to be statistically greater for all three markers analyzed in
samples with DIE, and positively correlated among the markers. Conclusions:
Uterosacral ligament samples affected by DIE present significantly higher
immunoexpression for aromatase P450, COX-2 and estrogen receptors than
disease-free samples, and show positive correlation among the markers.
ROSSI LM
Doutorado 2010
91
APÊNDICE
ROSSI LM
Doutorado 2010
92
Apêndice 1 - Listagem de pacientes
Iniciais
Número da Biópsia
TMA
Região e/ou Órgão
Grupo
ABD
10319619
1
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
AT
10616011
2
ÚTERO SACRO
CONTROLE
AGC
10517178
3
ÚTERO SACRO
CONTROLE
AMND
10417211
4
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
BFS
10400530
5
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
bloco controle
6
CRMC
10208213
7
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
DPL
10616570
8
ÚTERO SACRO
CONTROLE
EJ
10520168
9
ÚTERO SACRO
CONTROLE
SEM
10322986
10
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
bloco controle
11
ECMA
10613454
12
ÚTERO SACRO
CONTROLE
FCMS
10321996
13
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
FRS
10611454
14
ÚTERO SACRO
CONTROLE
FMO
10404279
15
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
bloco controle
16
GAC
10602876
17
ÚTERO SACRO
CONTROLE
GAC
10200442
18
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
HLM
10404939
19
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
IJB
10607972
20
ÚTERO SACRO
CONTROLE
bloco controle
21
IRG
10613962
22
ÚTERO SACRO
CONTROLE
IRS
10418647
23
ÚTERO SACRO
CONTROLE
LK
10316076
24
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
LPS
10616285
25
ÚTERO SACRO
CONTROLE
bloco controle
26
MLG
10407806
27
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
MJG
10607825
28
ÚTERO SACRO
CONTROLE
MCP
10402277
29
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
MDG
10610993
30
ÚTERO SACRO
CONTROLE
bloco controle
31
MFO
10612442
32
ÚTERO SACRO
CONTROLE
MFRG
10403313
33
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
MFS
10613228
34
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
MIR
10208092
35
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
bloco controle
36
MLVDV
10205202
37
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
MRO
10520126
38
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
MBS
10607156
39
ÚTERO SACRO
CONTROLE
MRS
10320763
40
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
bloco controle
41
NSS
10607826
42
ÚTERO SACRO
CONTROLE
OMS
10510593
43
ÚTERO SACRO
CONTROLE
RNC
10608343
44
ÚTERO SACRO
CONTROLE
RPA
10211542
45
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
bloco controle
46
RCC
10320229
47
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
RRF
10400331
48
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
SMHF
10308027
49
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
SIS
10504254
50
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
bloco controle
51
SO
10608348
52
ÚTERO SACRO
CONTROLE
VAAS
10321767
53
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
YMS
10313849
54
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
ZMF
10413948
55
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
bloco controle
56
IGT
10615470
56
ÚTERO SACRO
ENDOMETRIOSE
CLRP
10601835
57
ÚTERO SACRO
CONTROLE
OMS
10511035
58
ÚTERO SACRO
CONTROLE
DF
COLETA DE FORA
59
ÚTERO SACRO
CONTROLE
MAM
COLETA DE FORA
60
ÚTERO SACRO
CONTROLE
bloco controle
61
LFD
COLETA DE FORA
62
ÚTERO SACRO
CONTROLE
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