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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA
ANÁLISE DE Arabidopsis thaliana Heyhn COMO MODELO
EXPERIMENTAL PARA ESTUDO DA RIZOGÊNESE ADVENTÍCIA
Por Luciano da Rocha Corrêa
Orientador: Prof. Dr. Arthur Germano Fett-Neto
Tese submetida ao Programa de
Pós- Graduação em Botânica da UFRGS
como quesito parcial para a obtenção do
título de Doutor em Botânica
Porto Alegre
Fevereiro, 2009
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Arthur Germano Fett-Neto, pela valiosa orientação e pelo convívio durante
esses anos de trabalho, que se constituiu em grande impulso para meu aprimoramento profissional
e pessoal.
Ao CNPq, pelo suporte financeiro.
Ao Programa de Pós-Graduação em Botânica e à Universidade Federal do Rio Grande do
Sul, por me permitirem a realização do presente trabalho.
À Prof. Dra. Janette Palma Fett, aos colegas do PPG-Botânica, aos colegas do Laboratório
de Fisiologia Vegetal e Laboratório de Anatomia Vegetal.
À minha família, sempre. Aos meus amigos, sempre. Por tudo.
Finalmente, a Deus, ponto inicial e destino final do objeto de estudo da Ciência da Vida.
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SUMÁRIO
SUMÁRIO..........................................................................................................................................1
LISTA DE ABREVIATURAS...........................................................................................................3
LISTA DE FIGURAS.........................................................................................................................4
LISTA DE TABELAS........................................................................................................................5
RESUMO............................................................................................................................................6
ABSTRACT........................................................................................................................................8
INTRODUÇÃO GERAL..................................................................................................................10
Enraizamento adventício de plantas.................................................................................10
Arabidopsis thaliana Heyhn.............................................................................................11
Algumas classes de mutantes e ecotipos disponíveis..................................................12
Considerações sobre arabidopsis como modelo de rizogênese adventícia.................13
Motivação e escopo do trabalho......................................................................................14
OBJETIVOS.....................................................................................................................................16
CAPÍTULO 1 - Biochemical changes associated with adventitious rooting in leaf petioles of
Arabidopsis thaliana Heyhn with and without exogenous auxin....................................................17
Abstract.............................................................................................................................19
Introduction.......................................................................................................................20
Material and methods.........................................................................................................21
Results................................................................................................................................23
Discussion..........................................................................................................................26
References..........................................................................................................................30
CAPÍTULO 2 - Comparison among experimental systems of adventitious rooting in Arabidopsis
thaliana uncovers distinct developmental responses related to the same process………………....44
Abstract..............................................................................................................................46
Introduction........................................................................................................................47
Material and methods.........................................................................................................49
Results................................................................................................................................53
Discussion..........................................................................................................................55
References..........................................................................................................................60
DISCUSSÃO GERAL......................................................................................................................82
POSSÍVEIS PERSPECTIVAS DE CONTINUAÇÃO....................................................................90
4
REFERÊNCIAS GERAIS................................................................................................................91
ANEXO 1 (Óxido Nítrico e Enraizamento Adventício de arabidopsis)..........................................96
ANEXO 2 (Outras atividades acadêmicas durante o período do doutorado)...................................98
ANEXO 3 (Comprovantes de publicações extra-tese de trabalhos realizados concomitantemente
com o doutorado).....................................................................................................................100
5
LISTA DE ABREVIATURAS
WRCs: Compostos relacionados ao dano
AIA/IAA: Ácido Indol Acético
AIB/IBA: Ácido Indol Butírico
ANA/NAA: Ácido Naftaleno Acético
MS: Murashige e Skoog
ANOVA: Análise de Variância
v/v: volume por volume
w/v: peso por volume
Col: Columbia
An: Antwerpeen
NO: óxido nítrico
SNP: nitroprussiato de sódio
SNAP: S-nitroso N-acetil penicilamina
cPTIO: carboxy-2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazolinone-3-oxide-1-oxyl
GMPc: guanosil monofosfato cíclico
MAPKs: quinases ativadas por mitógenos
CO: monóxido de carbono
DNA: ácido desoxirribonucléico
EMS: etilmetanossulfato
rty: rooty
chs: chalcona sintase
sur: superroot
atr: altered tryptophan regulation
6
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1: Efeitos de tipo de auxina, dose e tempo de exposição, e temperatura ambiente no
enraizamento de folhas de A. thaliana..............................................................................................36
Figura 2: Conteúdo de clorofilas e antocianinas em folhas de A. thaliana após diferentes
tempos de tratamento rizogênico......................................................................................................38
Figura 3: Conteúdo de açúcares solúveis e amido em folhas de A. thaliana após diferentes
tempos de tratamento rizogênico......................................................................................................40
Figura 4: Atividades enzimáticas (peroxidases totais e AIA oxidase) e conteúdo protéico
em folhas de A. thaliana após diferentes tempos de tratamento rizogênico.....................................41
Figura 5: Conteúdo de fenólicos totais e flavonóides em folhas de A. thaliana após
diferentes tempos de tratamento rizogênico.....................................................................................43
CAPÍTULO 2
Figura 1: Aspecto morfológico do enraizamento nos 3 sistemas.......................................67
Figura 2: Cortes anatômicos transversais de plântulas e explantes enraizados pelos 3
sistemas.............................................................................................................................................68
Figura 3: Desempenho rizogênico de plântulas e explantes de A. thaliana (ecotipos
Antwerpeen e Columbia) nos 3 sistemas, com e sem auxina...........................................................70
Figura 4: Enraizamento do mutante rty (superprodutor de auxina)....................................76
Figura 5: Influência da maturidade fisiológica no desempenho rizogênico de A.
thaliana.............................................................................................................................................77
Figura 6: Desempenho rizogênico (quanto ao tempo médio de enraizamento) de mutantes
de florescimento dos ecotipos Antwerpeen e Columbia...................................................................78
Figura 7: Influência de quercitina e auxina no enraizamento do mutante chs (defectivo na
síntese de flavonóides)......................................................................................................................79
Figura 8: Influência de diferentes flavonóides no enraizamento do mutante chs (defectivo
na síntese de flavonóides).................................................................................................................80
7
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1:
Tabela 1: Comparação entre os 3 sistemas de enraizamento..............................................66
8
RESUMO
Arabidopsis thaliana Heyhn é uma espécie largamente utilizada em estudos fisiológicos
por ser um modelo genético bem conhecido, visto que estão disponíveis muitos mutantes
caracterizados, além de diversos ecotipos distintos. A espécie também apresenta outras
características desejáveis, como autofecundação, cruzamento artificial simples, fácil transformação
genética e genoma completamente sequenciado.
A rizogênese adventícia é uma importante parte do processo de propagação clonal de
plantas, muitas delas de grande importância econômica. É interessante o domínio da base teórica
desse processo para maximizar a eficiência da sua aplicação. Apesar de conhecido há muito tempo,
ainda há perguntas não respondidas acerca de seus mecanismos, e a utilização mais intensa e
padronizada de arabidopsis pode vir a contribuir na elucidação dessas questões.
Para tanto, buscou-se o estabelecimento de protocolos visando o uso dessa ferramenta no
estudo da rizogênese. Devido a peculiaridades nos diferentes mutantes e tentando antecipar os
diferentes propósitos de estudos futuros, trabalhou-se com 3 sistemas diferentes de enraizamento: o
uso de um sistema hidropônico com folhas de plantas maduras, plântulas de 1 mês crescidas in
vitro e com o sistema radicular excisado, e com o alagamento parcial de hipocótilos de plântulas de
aproximadamente uma semana, crescidas in vitro e pré-estioladas. Foram realizados cortes
histológicos dos explantes e plântulas para tentar identificar os tecidos de origem das raízes
adventícias nas diferentes situações.
Foram também realizados testes com mutantes, para estudar a influência de fatores como
auxinas e flavonóides no enraizamento. O mutante rty, referido pela literatura como superprodutor
de auxina, teve desempenho rizogênico inferior a outros mutantes de mesmo fenótipo (atr4 e
sur1), e sua rápida senescência prejudicou seu uso em alguns ensaios. O mutante chs, defectivo em
flavonóides, mostrou um desempenho um pouco superior ao tipo selvagem, e o tipo de flavonóide
(quercitina, rutina ou naringenina) não pareceu influir no enraizamento.
O enraizamento adventício é um processo que consiste em diferentes fases, sendo
consensual, entre os autores da área, identificar duas fases principais: a indução e a formação, nas
quais o efeito de auxinas é inverso (promotor na primeira e inibitório na segunda). Outros fatores
podem agir diferencialmente, dependendo da fase em que estão presentes ou são modificados.
Sendo assim, buscou-se estabelecer grupos de substâncias como marcadores do processo,
utilizando-se o sistema hidropônico de folhas. Dentre os diferentes grupos testados (açúcares,
compostos fenólicos, pigmentos e enzimas), a atividade de peroxidases totais e a quantidade de
fenólicos totais e de carboidratos solúveis apresentaram os maiores perfis de variação associados
9
com a rizogênese, mostrando-se mais propícios à utilização como marcadores do processo nesse
sistema.
Os sistemas de enraizamento de arabidopsis estabelecidos e descritos nesse estudo, apesar
de apresentarem particularidades que impedem uma comparação direta entre resultados advindos
de cada um deles, podem cobrir uma grande gama de situações experimentais, constituindo-se em
ferramentas de grande utilidade para a realização de estudos de base sobre o tema.
Palavras-chave: mutantes, marcadores, carboidratos, peroxidases, fenólicos.
10
ABSTRACT
Arabidopsis thaliana Heyhn is a species largely used in physiological studies because it
is a well known genetic model, for which there is a plethora of characterized mutants and several
different ecotypes. The species also has other useful features, such as self-fertilization, simple
artificial crossing, easy genetic transformation, and a fully sequenced genome.
Adventitious rooting is an important step of the clonal propagation process of plants,
many of which of significant economic relevance. The expansion of basic knowledge on this
process is desirable to maximize efficiency in its application. In spite of being a developmental
process known for a long time, there are still several unaswered questions about the adventitious
rooting mechanisms, and a more intense and standardized use of Arabidopsis may contribute to the
elucidation of these questions.
To that end, protocols for Arabidopsis adventitious rooting were developed and
compared. Due to specific features of different mutants and in an attempt to anticipate possible
purposes of future investigations on rooting, three rooting systems were examined: detached
expanded leaves in hydroponic medium, in vitro germinated one month-old seedlings with the
embryonic roots excised, and partial hypocotyl flooding of about one week old etiolated plantlets
grown in vitro. Histological sections were done on explants and seedlings in the root forming zone
to identify the tissues involved in the development of adventitious roots in each one of the systems.
Tests with mutants were also carried out to study the influence of factors such as auxins
and flavonoids in rooting. The mutant rty, known as an auxin superaccumulator, had poorer
rooting performance compared to other mutants with similar biochemical phenotype (atr4 and
sur1), and its fast senescence hindered its use in some tests. The flavonoid defective mutant chs
showed slightly better rooting response compared to wild type and the kind of flavonoid
(quercetin, rutin or naringenin) exogenously supplied to wild type or chs did not affect rooting
significantly.
Adventitious rooting is a process that comprises different phases, and most authors
identify two main steps: induction and formation of roots; in these phases, the effect of auxins is
the opposite (promoter in the first and inhibitor in the second). Other factors can also act
differentially, depending on the phase in which they are present or modified. Therefore, potential
biochemical markers of the rooting process were examined using the leaf hydroponic system.
Among the various parameters evaluated (carbohydrates, phenolics, pigments and auxin
catabolizing enzymes), total soluble peroxidase activity and the concentration of total phenolics
11
and soluble carbohydrates showed the largest variation profiles associated with root development,
being more appropriate as markers of the process in this system.
The Arabidopsis rooting systems established and described in this investigation, in spite
of having specific features that limit a direct comparison between results derived from each one of
them, can cover a wide range of experimental situations, constituting highly useful tools to study
basic aspects on the subject.
Key words: mutants, markers, carbohydrates, peroxidases, phenolics.
12
INTRODUÇÃO GERAL
Enraizamento Adventício de Plantas
A propagação clonal de plantas é um processo biotecnológico baseado na multiplicação
de genótipos de interesse, o qual movimenta milhões de dólares anualmente em todo o mundo nas
áreas de silvicultura, fruticultura, floricultura e afins (Kumar et al., 1999; Turnbull, 1999).
O processo de enraizamento é crucial para o sucesso da propagação clonal (De Klerk et
al., 1997). Falhando em desenvolver um sistema radicial eficiente, as chances de sobrevivência de
uma planta são nulas, excetuando-se aquelas que não possuem raízes, como as pteridófitas
aquáticas Salvinia sp, Marsillea sp e algumas outras poucas espécies (Raven et al., 1999).
As raízes têm como funções principais a absorção de água e nutrientes e a fixação da
planta ao substrato. É estimado que, aproximadamente, 30% do genoma de um vegetal está
relacionado com a formação radicial (Zobel, 1986). Existem três tipos de raízes, de acordo com a
origem: a radícula, de origem embrionária; raízes laterais, originadas a partir do periciclo da
radícula ou de outras raízes; e raízes adventícias ou aéreas, que se formam a partir de outros
tecidos que não o periciclo radicial, ou seja, onde normalmente não ocorreriam raízes (tecidos
parenquimáticos desdiferenciados, células cambiais, epidérmicas, hipocótilos, caules, folhas)
(Raven et al., 1999; Lund et al., 2008).
Nos ambientes naturais, certos vegetais desenvolvem raízes adventícias em resposta a
estímulos do meio, como forma de adaptação morfofisiológica. O milho (Zea mays) desenvolve
raízes aéreas para melhorar sua fixação ao substrato (Raven et al., 1999). Plantas de ambiente
pantanoso desenvolvem raízes adventícias em resposta à baixa concentração de oxigênio no
substrato como parte de uma adaptação a estresse por alagamento, processo esse desencadeado pelo
aumento da concentração endógena de etileno, com conseqüente formação de aerênquima (Bray,
2000). Também os pneumatóforos (raízes respiratórias) de plantas de pântanos e mangues são
exemplos de raízes adventícias (Raven et al., 1999).
Raízes adventícias podem ser emitidas por vários órgãos ou tecidos, como folhas (limbo
ou pecíolo), segmentos de caule ou inflorescências. Seu modo de emissão pode ser direto (sem a
formação de um calo) ou indireto (a partir de um calo) (Geneve, 1991).
Segundo De Klerk et al. (1999), o processo de rizogênese adventícia é composto de três
fases. Em modelo baseado em estudos com macieira, nas primeiras 24 horas ocorre a
13
desdiferenciação celular, na qual as células retomam uma condição meristemática, preparando-se
para a formação de um novo órgão; há o acúmulo de grãos de amido nos sítios de iniciação de
raízes. Entre 24 até, aproximadamente, 96 horas após o início da rizogênese, ocorre a fase de
indução, durante a qual as células passam por mudanças bioquímicas e de expressão gênica
acionadas, em grande parte, por auxina e por outras substâncias; também se dá a formação do
primórdio radicial. Depois de decorridas 96 horas, ocorre a fase de formação, na qual se dá a
expansão das raízes. Para fins práticos e de generalização, a rizogênese pode também ser dividida
em duas fases: indução, etapa de processos moleculares e bioquímicos, sem alterações visíveis, e
formação, correspondendo a divisões celulares e crescimento das novas raízes (Fett-Neto et al.,
1992).
Diversos são os fatores envolvidos na produção e emissão de raízes adventícias.
Primeiramente, características morfoanatômicas das diversas espécies, em nível celular e tecidual,
são relevantes ao andamento do processo rizogênico. Essas são reflexos de interações do genoma
com respostas fisiológicas a variáveis endógenas e ambientais. Por exemplo, plantas jovens
tendem a enraizar mais facilmente, visto que são menos lignificadas e têm maior responsividade a
fitormônios (Fett-Neto et al., 2001), os sinalizadores por excelência do processo. Visto que o
processo é mediado por sinalizadores e constituintes essenciais (fitormônios, metabólitos
secundários, carboidratos, minerais) (De Klerk et al., 1999); o nível endógeno dessas substâncias é
importante, e é variável de acordo com o genótipo e status fisiológico. Fatores abióticos, como luz
e temperatura, influenciando no metabolismo em geral, também desempenham papel relevante no
enraizamento (Correa e Fett-Neto, 2004, Correa et al., 2005).
Arabidopsis thaliana Heyhn
Trata-se de uma planta originária do Hemisfério Norte, de ampla distribuição. Possui
vários ecotipos, alguns apresentando diferenças marcantes entre si. Morfologicamente é uma
pequena roseta, que emite um ramo floral na época de reprodução, a qual geralmente leva entre 2 a
5 meses para ocorrer dependendo do ecotipo e das condições ambientais. O número e morfologia
das folhas, comprimento do pecíolo, número de flores, tempo de floração e outros aspectos
também variam conforme o arcabouço genético.
Ao contrário de muitas outras espécies vegetais, as quais possuem grande valor em termos
econômicos, A. thaliana ocupa posição de destaque principalmente no meio acadêmico, como
espécie-modelo para estudos genéticos e fisiológicos. Logo, é usada caracteristicamente para
estudos de base, constituindo-se em valiosa ferramenta. Sua grande variedade de mutantes
14
caracterizados (www.arabidopsis.org) propicia aos pesquisadores desenvolver estudos acerca de
fenômenos fisiológicos em um cenário genético bem definido, como o efeito da ausência de
determinada enzima na resposta à administração de determinado fitormônio, por exemplo. A
caracterização desses mutantes segue uma série de passos, que podem ter uma pequena variação
caso a caso: a mutagênese de um banco de sementes, uma busca por uma determinada
característica fenotípica, o isolamento desses mutantes e sua caracterização através de técnicas
moleculares usando, por exemplo, amplificação, clonagem e sequenciamento dos genes afetados.
Uma mutação pode induzir tanto a redução de algum metabólito, por exemplo, por
diminuição ou total obliteração da produção de dada enzima (“nocaute”), como a superprodução,
por inibição de um repressor gênico protéico (Lewin, 2001). Tendo em vista as questões
supracitadas, torna-se imediata a dedução do valor desses mutantes para a pesquisa de diferentes
processos fisiológicos: usando-se mutantes caracterizados que contém concentrações de
determinado(s) composto(s) alteradas com relação ao seu equivalente selvagem, pode ser feito um
desenho experimental comparativo entre ambos para verificar em que aspectos as condições
modificadas provocaram efeitos diferenciais sobre ambos.
Algumas classes de mutantes e ecotipos disponíveis
Mutantes de arabidopsis podem ser gerados através de diversas técnicas. O EMS (etil-
metano-sulfonato), agente químico mais utilizado, é um agente alquilante de DNA, modificando
timinas, fazendo com que formem pontes de hidrogênio com outras timinas. São também
utilizados outros agentes químicos, como: 5-bromo-uracil, diepoxibutano, etil-nitrosuréia,
nitroguanidina, nitrosometilbiureto e nitrosometiluréia. Agentes físicos também são comumente
usados: raios X, raios gama e bombardeamento com nêutrons. Todas essas técnicas são aplicadas
sobre um grupo de sementes; pode-se também visar células ou tecidos individuais e multiplicá-los
posteriormente por cultura de tecidos, ou transformá-los por meio de infecção com Agrobacterium
sp. ou por inserção de transposons (Brasileiro, 1998).
O uso dos mutantes está condicionado à observação do ecotipo selvagem que lhe deu
origem. Esses diferentes ecotipos apresentam variações fenotípicas notáveis. Por definição,
ecotipos são variantes de um organismo adaptadas a determinados locais, diferindo geneticamente
de seus outros ecotipos (Raven, 1999). Ecotipos de A. thaliana são provenientes de diferentes
regiões, principalmente do continente americano, europeu e asiático. Os mais utilizados em
pesquisa científica em geral são o Columbia (Col) e o Landsberg (Ler), porém muitos outros estão
15
disponíveis. Grande parte desses ecotipos se distribui em regiões temperadas do planeta, havendo
poucas exceções, como a Cape Verdi (Cvi), originária do Cabo Verde.
Os mutantes de arabidopsis têm os níveis de certas substâncias diminuídos ou aumentados
drasticamente, dependendo da proteína codificada pelo gene afetado pela mutação. Esses genes são
conhecidos, no caso dos mutantes caracterizados; também há mutantes cujo fenótipo é conhecido,
mas não se descobriu ainda qual o gene afetado.
O presente trabalho utilizou os ecotipos Columbia, Landsberg e Antwerpeen (An), os
quais têm tempos de florescimento semelhantes (com emissão do ramo floral em aproximadamente
3 meses nas condições experimentais usadas) e possuem vários mutantes desejáveis ao trabalho, a
saber (os códigos correspondem ao banco de mutantes do site da TAIR – The Arabidopsis
Information Resource - http://www.arabidopsis.org/):
rty: rooty. Ecotipo Columbia. Superenraizador. Alterado no metabolismo de
glucosinolatos, acumula precursores de auxina.
sur1: superroot 1. Ecotipo Columbia. Superenraizador. Superprodutor de auxina.
atr4: altered tryptophan response 4. Ecotipo Columbia. Similar ao superroot 2 (ecotipo
Wassilewskija). Superprodutor de auxina.
chs: chalcone synthase. Ecotipo Landsberg. Defectivo na produção de flavonóides.
CS 506 e N 505: mutantes de florescimento precoce – ecotipo Antwerpeen.
CS509 e CS 304: mutantes de florescimento tardio – ecotipo Antwerpeen.
CS 3125 e CS 3239: mutantes de florescimento precoce – ecotipo Columbia.
CS 3732 e CS 3071: mutantes de florescimento tardio – ecotipo Columbia.
Considerações sobre arabidopsis como modelo de rizogênese adventícia
Arabidopsis thaliana oferece muitas vantagens para estudos básicos de processos
complexos de desenvolvimento em função de seu genoma pouco repetitivo e relativamente
pequeno, ciclo de vida curto, suscetibilidade para transformação genética, abundante produção de
sementes e disponibilidade de inúmeros mutantes (Bressan et al., 2001). No entanto,
especificamente para rizogênese adventícia este modelo apresenta algumas limitações importantes.
A primeira limitação é o fato de plantas adultas crescerem na forma de rosetas, ou seja,
possuem caule formado por entrenós muito curtos. Embora o ramo formado durante a floração
possa ser comparado a um caule, sua principal função relaciona-se à reprodução e resulta de
alterações fitormonais relevantes fortemente controladas pelo foto e termoperíodo (Zeevaart,
16
2008). Outro aspecto importante é o curto ciclo de vida e as variações relativamente abruptas no
desenvolvimento de arabidopsis, gerando contextos fisiológicos de difícil comparação entre si.
A formação de raízes ao longo de hipocótilos de plântulas jovens estioladas colocadas
sobre a superfície de meio semi-sólido em placas de petri orientadas verticalmente, por exemplo,
são comumente empregadas em ensaios de enraizamento com essa espécie. Em geral essa
formação segue o padrão de raízes laterais, pois o diminuto caule mantém em boa parte a estrutura
anatômica da raiz, inclusive com a existência de periciclo caulinar. Em plantas lenhosas e
hortícolas, nas quais a rizogênese adventícia é fundamental para a clonagem comercial, raras vezes
essa condição existe, e as raízes adventícias geralmente originam-se da região cambial. Outro
ponto a considerar em experimentos de rizogênese adventícia com arabidopsis é a grande
diversidade de ecotipos, bem como a aplicabilidade de mutantes nesse tipo de ensaio. Por fim, do
ponto de vista do metabolismo de auxinas, arabidopsis apresenta um fator importante, ou seja, o
intenso metabolismo de indol glucosinolatos, o qual pode afetar de modo marcante a produção de
auxinas (Grubb e Abel, 2006).
Motivação e Escopo de Trabalho
Experimentos de morfogênese vegetal envolvendo tratamentos semelhantes usando uma
mesma espécie, ou até mesmo espécies diferentes, são muitas vezes diretamente comparados na
literatura cientifica, visando a construção de modelos gerais de crescimento e desenvolvimento. No
entanto, nem sempre as premissas básicas para tais generalizações são satisfeitas, podendo
conduzir a conclusões incorretas. Para que espécies modelo, como arabidopsis, possam contribuir
com máxima eficiência na análise da rizogênese adventícia, métodos experimentais devem ser
caracterizados e padronizados, e suas limitações e peculiaridades avaliadas. Na presente Tese,
buscou-se responder às seguintes perguntas: 1) É A. thaliana um modelo adequado para rizogênese
adventícia? 2) quais são as fases do processo rizogênico nessa planta? 3) existe relação entre tempo
de floração, mudança de fase vegetativa-reprodutiva e rizogênese nesse modelo? 4) resultados
obtidos com sistemas experimentais para estudo do enraizamento adventício usando folhas
destacas, plântulas com raiz extirpada ou plântulas estioladas são comparáveis entre si? 5) os
diferentes sistemas são adaptáveis a testes com mutantes e distintos ecotipos?
17
18
OBJETIVOS
• Estabelecer e caracterizar sistemas experimentais para auxiliar no estudo do processo
de rizogênese adventícia utilizando Arabidopsis thaliana, uma espécie que propicia a
obtenção de dados com a confiabilidade de um arcabouço genético estabelecido.
• Estudar a possibilidade de uso de alguns grupos bioquímicos como marcadores
temporais desse processo.
19
CAPÍTULO 1
Artigo a ser submetido à revista “Plant Growth Regulation”
20
Biochemical changes associated with adventitious rooting in leaf petioles of Arabidopsis
thaliana Heyhn with and without exogenous auxin
Luciano da Rocha Correa ¹, Ricardo José Stein
2
, and Arthur Germano Fett-Neto
1,2
(1) Departamento de Botânica, Laboratório de Fisiologia Vegetal, Programa de Pós-Graduação em
Botânica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (2) Centro de Biotecnologia
(Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular), UFRGS, CP 15005, CEP 91501-
970, Porto Alegre, RS, Brazil.
21
Abstract
Adventitious root formation (ARF) is a key step of the clonal propagation process, which
allows the fast multiplication of individuals showing economically relevant phenotypes. The
rooting of fully expanded leaves is a practical and fast method to evaluate many genotypes under
different abiotic conditions, in which both mother-plant and explant effects can be tested, as well
as the influence of various exogenous factors. Arabidopsis thaliana Heyhn is a model species in
biochemical, physiological and molecular studies for which a plethora of at least partially
characterized mutants is available. This work aimed at developing a liquid medium leaf rooting
system, and evaluating time course changes in several potentially relevant biochemical parameters
during rooting assays with and without auxins, in order to characterize the adventitious rooting
phases in this genetically amenable system. The rooting protocol developed for detached leaves
provided a useful system to study adventitious rooting. The rooting profiles with and without
exogenous auxins of distinct metabolic stability for two ecotypes of A. thaliana were similar,
suggesting its potential applicability to distinct genetic backgrounds, including various mutants.
Considering the different parameters examined, peroxidase activity, total phenolic content and
total soluble carbohydrates appeared as the most distinct biochemical markers of the rooting
process in this system.
Key words: peroxidases, phenolics, leaves
22
Introduction
Adventitious root formation (ARF) is a key step of the clonal propagation process, which
allows the fast multiplication of individuals with economically relevant phenotypes. ARF has
three distinct physiological phases, which have been well established in a model of apple
microcuttings that determined the time course of the process in hours after culture media
inoculation: dedifferentiation (0-24 hours), induction (24-96 hours) and formation (96 hours
onwards) (De Klerk et al., 1999). The biochemical events and requirements change with the
progress of rooting. Many studies on this subject are limited to a few phytohormonal tests – often
restricted to auxin (phytohormone class which is the key regulator of ARF) application - and
morphometrical measurements to adapt or validate established protocols for new target species
(Kaliamoorthy et al., 2008; Matu et al., 2006).
Arabidopsis thaliana Heyhn is a model species for biochemical, physiological and molecular
studies due to characteristics such as short life cycle, ease of genetic transformation, completely
sequenced genome, production of large numbers of seeds and the availability of a plethora of at
least partially characterized mutants. Although, it has been shown to be a useful species for
adventitious rooting studies (Boerjan et al., 1995; Ludwig-Müller et al., 2005), work focusing on
the biochemical changes during the process, particularly of potential rooting markers (Fett-Neto et
al., 1992), has been lacking in this species. The rooting of fully expanded leaves is a practical and
fast method to evaluate many genotypes under different abiotic conditions, in which both mother-
plant and explant effects can be tested, as well as the influence of various exogenous factors.
This work aimed at developing a liquid medium leaf rooting system, evaluating time course
changes in several potentially relevant biochemical parameters during rooting assays with and
without auxins, in order to characterize the adventitious rooting phases in this genetically
amenable system. The parameters analyzed included: peroxidases and IAA oxidases, enzymes
presumably involved in auxin catabolism; total phenolics, may be substrates or co-factors for
23
peroxidases; total flavonoids, a class of phenolics involved in auxin transport; chlorophylls and
anthocyanins, as indicators of senescence and stress; soluble sugars, important sources of energy
and carbon, with a possible regulatory role in rooting (Correa et al., 2005), and starch, the main
form of carbohydrate storage.
Material and methods
Plant material
Arabidopsis thaliana seeds were obtained from TAIR - The Arabidopsis Information Resource
(2005). When necessary, surface sterilization was done by soaking seeds for 1 minute in ethanol
70% and 15 min in sodium hipochloride (NaClO) 1.5% (v/v) with a few drops of commercial
neutral detergent, followed by four washes in autoclaved distilled water. Prior to all cultivations,
seeds were imbibed for 30 minutes and stored for two days at 4°C.
Seeds were germinated in pots with commercial top soil and vermiculite (1:1) and irrigated
with MS 0.1x (Murashige and Skoog, 1962). After the stratification period, the pots were
transferred to chambers at 20 ± 2°C. Plants were alternately irrigated with distilled water and
fertilized with MS 0.1x once a week. Up to seven days after emission (DAE) of the first flower
bud, leaves were harvested and put to root in 200 mL capacity plastic boxes with 50 mL liquid MS
salts 0.1x plus phytohormones when appropriate, for the induction step. After four days, leaves
were transferred to similar boxes without phytohormones and with 0.1% (w/v) activated charcoal
(formation medium); pH of media was adjusted to 5.8 at the start of the experiments.
24
Three or four leaves were harvested at the following times after the start of the rooting
treatment: 0, 1, 2, 4, 8 and 16 days. Samples were frozen with liquid nitrogen and stored in freezer
at - 20°C.
Auxin influence on Arabidopsis ARF and protocol establishment
Leaves of A. thaliana were put to root in continuous media with different concentrations of
indole-3-acetic, indole-3-butyric or naphthaleneacetic acid. To achieve more general conclusions,
two ecotypes Columbia (Col) and Antwerpeen (An) were used. The concentration and kind of
auxin in which the best rooting response was observed were used for all subsequent assays,
including an auxin time pulse test (2, 4 and 6 days, or a continuous auxin exposure treatment).
Leaves of Columbia wild-type were also rooted at four different temperatures (15, 20, 25 and
30°C) to find out which was the best rooting temperature. Rooting parameters evaluated included:
percent rooting, roots per rooted leaf, length of the longest root and mean rooting time (Fett-Neto
et al., 2001).
Biochemical analyses
Biochemical analyses were carried out spectrophotometrically, following published
protocols for each class of compound examined: total chlorophylls (Ross, 1974), anthocyanins
(Chatterjee et al., 2006), soluble carbohydrates (Nelson, 1944; Somogyi, 1945; glucose
equivalents), starch (McCready, 1950), peroxidase (Pox) activity (Ranjit et al., 1988), total
proteins (Bradford, 1976; bovine serum albumin equivalents), IAA oxidase (IAAox) activity
(Rout, 2006), total phenolic compounds (Folin, 1927; pyrogallic acid equivalents) and flavonoids
25
(Zhishen et al., 1999; quercitin equivalents). For all compounds, three replicates of about 100 mg
fresh weight each were used, and each experiment was independently carried out at least three
times, with similar results. All results are expressed on a dry weight basis, except for peroxidases
and IAA oxidases, which are expressed on a protein basis.
Results
Protocol establishment
Different auxins and concentrations were used to run ex vitro rooting tests with leaves of Col
WT and An WT. Apparently, both ecotypes have the same rooting requirements. Overall, leaves
incubated in IAA at the highest concentration (10 mg/L, or 57 µmol/L) yielded higher root
numbers and longer roots, whereas the use of NAA in the same concentration resulted in higher
percentage of rooted leaves (Fig 1A, 1B, 1C). IBA treated-leaves displayed intermediate percent
rooting (Fig. 1A), whereas for other parameters, responses to this auxin where equivalent to those
of NAA treated leaves (Fig. 1B to D). Preliminary tests showed that 570 µmol/L IAA (which is the
less stable auxin among them) was less efficient in leaf rooting, causing symptoms of toxicity (data
not shown). A concentration of 57 µmol/L IAA was chosen to be used in further assays due to the
quality of the adventitious root system developed rather than merely quantity of rooted leaves;
besides, an intermediate efficiency in terms of percent rooting could make easier the identification
of mutants or treatments that differed from the control in terms of promoting or inhibiting rooting.
There was no difference for any of the rooting parameters when auxin was maintained for 2 or
4 days in the medium (Fig. 1E). Beyond this limit, however, rooting efficiency started to drop.
Considering the overall rooting response, 20°C was the best temperature for leaf rooting (Fig. 1F).
The highest temperature (30°C) was deleterious to rooting.
26
Pigments
A similar pattern of change in content was observed for the two chlorophylls (Fig 2A-B).
There was a progressive but steady and significant fall in chlorophyll content, and the relationship
between Chl a/b was maintained. Auxin treatment caused a faster drop in chlorophyll in the
beginning (this difference was significant only in day 2), but after 16 days the contents of these
pigments became indistinct. In all cases, the final content of chlorophylls was about 60% of the
initial values.
Anthocyanins content showed a slow decrease up to day 8; however, an increase was observed
after that time. Difference in content within days was not significant. In IAA treated leaves,
anthocyanins raised about 40%, whereas it almost doubled in the control leaves.
Carbohydrate content
Both in presence and absence of exogenous auxin a similar pattern of change in soluble
carbohydrate content was observed (Fig 3A). An initial drop, with gradual recovery after day 2
was apparent. After 16 days, the content of carbohydrates had almost doubled compared to the
initial concentration. The only detected difference within time points was on day 8, when IAA
exposed leaves had a higher increase in soluble carbohydrates content.
At 24h of the start of leaf incubation, starch had an opposite behaviour compared to soluble
sugars, showing an increase, albeit small, in concentration. In day 8, starch content decreased,
whereas that of soluble sugars increased. No major differences were observed in starch content
27
between control and IAA treatments, except for a trend toward higher starch content in IAA-
treated leaves after day 1 (Fig. 3B).
Enzyme activities and protein levels
During the first days of the rooting process, peroxidase activity levels (Fig 4A) were low in all
treatments (auxins and control), increasing considerably after day 2 (auxins) or 4 (control),
stabilizing towards the end of the experiments. In general, IAA treatment promoted earlier increase
and greater Pox activity levels. No significant alterations were detected in IAAox activities (Fig
4B) within or among sampling days; however, the activity of these enzymes increased and
decreased in IAA-treated leaves before those of the control leaves (decrease from day 2 and day 4,
respectively, Fig. 4B). Slightly lower contents of protein were detected in IAA-treated leaves
compared to controls at day 4 (Fig. 4C).
Phenolic compounds and flavonoids
An initial drop in phenolic levels followed by a significant increase up to day 4, and a gradual
decrease back to levels similar to those of the start of the assay were observed. This profile was
more evident in the control treatment (Fig. 5A). In this treatment, total phenolics increased above
the concentration of the starting day content in day 4, a response not observed in auxin-treated
leaves. Flavonoids followed a similar pattern; however only subtle differences were detected (Fig.
5B). Slightly higher contents of flavonoids were seen in control leaves compared to IAA-treated
ones up to day 2, the opposite being observed from day 4 toward the end of the assay.
28
Discussion
The present work aimed at studying time course changes in several biochemical parameters
to verify their potential as markers of the adventitious rooting process. Among many kinds of
established protocols, a hydroponic method for rooting excised leaves was chosen (modified from
Ludwig-Müller et al., 2005). Some key time points were selected, based on the phases suggested
for the rooting of apple explants, in which dediferentiation ends at approximately 24h, induction at
96h and formation follows (De Klerk et al., 1999).
Both Columbia and Antwerpeen ecotypes showed similar rooting responses to the different
types of auxin tested, suggesting a wider applicability of the protocol to study different genetic
backgrounds. Auxin stability seemed to affect the rooting outcome, with better responses being
observed with the labile auxin IAA, particularly in terms of root length and mean rooting time.
This is likely a consequence of the capacity to reduce active auxin pools for the root formation
step, which may be difficult with more stable auxins, particularly NAA (Fogaça and Fett-Neto,
2004). Time of exposure to auxin was excessive in continuous exposure, causing a depression in
rooting percentage, possibly due to excessive amounts of auxin, leading to difficulties in regulating
auxin content similar to the one just described. Temperature of rooting was best at 20 degrees,
whereas root development diminished at 30 degrees. This response may reflect the geographical
origin of these ecotypes, native of temperate regions. Similar differences in optimal rooting
temperature have been observed for species of Eucalyptus of distinct origins (Correa and Fett-
Neto, 2004). Temperature effects on rooting may be related to auxin metabolism and transport,
uptake of exogenous sources or differences in carbohydrates consumption.
Once the leaf is detached from the plant, a senescence process is expected to be triggered
within the following days. As leaves are incubated in liquid media (with or without auxin), a
chance of longer survival becomes possible, ideally leading to the appearance of roots.
29
Chlorophylls (Leu and Hsu, 2005) and anthocyanins (Ougham et al., 2005) are groups of
substances which have their concentrations altered during senescence. Chlorophyll concentrations
reduced, whereas the content of anthocyanins slowly dropped up to the appearance of the first
roots, increasing when the rooting process was finished. The initial faster drop in chlorophyll
content in IAA-treated leaves could be a consequence of ethylene-driven chlorophyll breakdown
induced by auxin exposure (De Klerk et al., 1999). Anthocyanins increase may be linked to plant
defense metabolites in many species (Lev-Yadun and Gould, 2007), acting as an indirect parameter
related to senescence. Anthocyanin accumulation may also be related to a relatively lower
phosphate level, a nutrient which affects lateral root architecture; this reduction could be due to
phosphate use for adventitious root formation (Devaiah et al., 2007). In addition, the increase in
anthocyanins after day 8 may be a response to the accumulation of soluble carbohydrates, which
peak at about this time (Fig. 3A); the synthesis of these pigments in abscising leaves often occurs
after the content of soluble carbohydrates increases (Lev-Yadun and Gould, 2007). It seems that
the presence of auxin did not alter significantly the natural course of senescence in detached
leaves, except for the lower content of anthocyanin compared to that of control leaves at the end of
the experiments.
The formation of roots demands energy and structural carbon. Soluble carbohydrates and
starch contents were evaluated to verify if their consumption rates could be used as rooting
markers. In contrast to data reported by Husen (2008), in which starch and soluble sugars
decreased with time in Dalbergia sissoo rooting, soluble sugars increased with time, whereas
starch levels did not change significantly during the process, showing a trend toward a decrease
during the course of root development. In the first 24h, starch content increased and that of soluble
sugars decreased. The subsequent increase in soluble sugars was particularly evident in IAA-
treated leaves, suggesting higher biosynthesis in these leaves. This profile points to the importance
of availability of soluble sugars in the process of root development. In Petunia hybrida cuttings, a
30
detailed study of metabolic events culminating with adventitious rooting showed that the
establishment of the cutting base as a sink organ for carbohydrates is an essential early step in the
rooting process (Ahkami et al., 2009).
Peroxidase activity and phenolic compounds content are classical markers of adventitious
rooting. As previously reported (Fett-Neto et al., 1992), peroxidase activity increases dramatically
when the induction phase is over. Formation phase is characterized by a fall of endogenous auxin
levels after their action in signaling for reprogramming differentiated cells into meristematic and,
later, root cells (De Klerk et al., 1999). Changes in IAAox activity were less pronounced and did
not reflect the overall peroxidase variation; however, IAAox activity reduced earlier in IAA-
treated leaves, remaining high for longer time in control leaves. This probably reflects the need for
a prompt control of auxin content in the presence of exogenous phytohormone and indicates the
importance of this fine tuning of auxin content in the outcome of the rooting process. Some
studies have reported a very good correlation between IAAox and Pox activity (Qaddoury and
Amssa, 2004). This was not observed in our study possibly due to species-specific differences or
type of rooting system under investigation. Peroxidases could be acting on phenolics, but this is
not likely, since their levels did not fall when peroxidases were most active. However, the role of
Pox in lignification asociated with xylem differentiation could explain this difference in activity
(Fett-Neto et al., 1992). Changes in total soluble proteins were similar in both treatments,
indicating a comparable degree of senescence between leaves.
Flavonoids, which are known as inhibitors of auxin transport and may affect rooting (Muday
and DeLong, 2001), showed subtle, but distinct profiles in control and IAA-treated leaves, with
slightly higher contents of flavonoids in the former up to day 2, and the opposite being observed
from day 4 toward the end of the assay. These profliles may result in different rates of auxin
transport to the basal petioles along the incubation time, affecting the root induction and formation
outcome. In some conditions and species, flavonoids can have a positive effect on rooting (Tarrago
31
et al., 2005). During in vitro rhizogenesis of Nothofagus nervosa, exogenous flavonoids
(naringenin, quercitin and rutin) diminished rooting time and anticipated Pox action peak
(Martínez Pastur et al., 2003). On the other hand, walnut hybrids (Juglans nigra x Juglans regia)
transformed with an antisense gene of chalcone synthase (a key enzyme in flavonoid biosynthesis)
showed decreased contents of flavonoids and increased rooting performance (El Euch et al., 1998).
The hydroponic rooting protocol herein described for detached leaves provided a useful
system to study adventitious rooting. The rooting profiles with and without exogenous auxins of
distinct metabolic stability for two ecotypes of A. thaliana were similar, suggesting its potential
applicability to distinct genetic backgrounds, including various mutants. Considering the various
parameters examined, peroxidase activity, total phenolic content and total soluble carbohydrates
were the ones that appeared as the most indicated as biochemical markers of the rooting process.
This developmental response was associated with earlier and higher increases in peroxidase
activity and soluble carbohydrate content, as well as lower phenolic concentration. It must be
considered that there are many systems used to root plant species, such as whole plantlets, stem
explants, leaf discs and so on, and any parameter must be tested for each system before its
usefulness as a marker is established.
32
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37
38
Figures
A
A
BC
A
B
A
BC
BC
BC
CD
D
aa
ab
b
bc
bc
cd
d
d
a
0
20
40
60
80
100
C
on
t
r
ol
I
AA1
I
AA5
IAA10
I
BA1
I
BA5
I
BA10
NAA1
N
A
A5
N
A
A1
0
Auxin type and dose (mg/L)
Percent rootin g (%)
Columbia
Antwerpeen
B
ABC
AB
BC
C
BC
ABC
A
BC
BC
C
a
ab
ab
abc
bcd
cd
d
d
d
d
0
5
10
15
20
25
30
Contro
l
IAA1
I
AA5
I
AA
10
IB
A1
I
BA5
IBA
1
0
NAA1
N
AA5
NAA10
Auxin type and dose (mg/L)
M ean number of roots
per rooted cutting
Columbia
Antwerpeen
C
BC
BC
ABC
BC
ABC
AB
A
ABC
C
BC
cd
bcd
ab
cdcd
bcd
ab
a
abc
d
0
10
20
30
40
50
60
70
Cont
ro
l
IAA
1
IAA5
IA
A1 0
IB
A1
IB
A5
IB
A1 0
NAA1
NA
A5
NAA10
Auxin type and dose (mg/L)
M e a n len g th o f lo n g e s t
r o o t (m m )
Columbia
Antwerpeen
D
AB
A
A
B
AB
A
A
A
AB
C
c
bc
bc
bc
bc
bc
ab
ab
a
a
0
2
4
6
8
10
12
Control IAA1 IAA5 IAA10 IBA1 IBA5 IBA10 NAA1 NAA5 NAA10
Auxin type and dose (mg/L)
M e a n r o o ting tim e ( d a y s )
Col
An
E
a
a
a
a
a
a
a
ab
a
b
a
b
a
b
a
b
0
10
20
30
40
50
60
% rooting numroots root length mean rooting
time
Parameters
2 d
4 d
6 d
continuous
F
c
b
b
a
a
a
a
a
b
a
a
a
b
0
20
40
60
80
100
%rooting mean rooting
time
numroots root length
Parameters
15°C
20°C
25°C
30°C
Figure 1: Effect of type and amount of auxin in Arabidopsis thaliana leaf rooting parameters for
both ecotypes Columbia and Antwerpeen (A-D); auxin exposure time (E) and rooting temperature
(F) for Columbia only. Upper and lower case letters are not to be compared, since they are used to
compare treatments within the same ecotype (Col – Columbia upper case; An – Antwerpeen lower
39
case). Bars sharing a letter indicate no statistical difference among treatments (Anova/Duncan test,
p≤ 0.05).
40
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
Chlorophyll a
MS
IAA
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
Chlorophyll b
MS
IAA
C
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
Total chlorophylls
MS
IAA
41
D
0
5
10
15
20
25
30
35
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
abs 530nm/dry weight
MS
IAA
Figure 2: Chlorophyll (mg/g dry weight) and anthocyanin (absorbance at 530 nm/mg dry
weight) content in a time-course analysis of leaf rooting of Arabidopsis thaliana ecotype Columbia
in control and 57 µmol/L IAA-treated leaves. Chlorophyll a (A), chlorophyll b (B), total
chlorophylls (C) were measured at start and 2, 4 and 16 days after leaf excision; anthocyanins (D)
were measured after 1, 2, 4, 8 and 16 days. Arrows indicate mean time of emergence of the first
roots. Bars indicate standard deviation.
42
A
0
10
20
30
40
50
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
mg carbohydrates/ g dry
weight
MS
IAA
B
0
10
20
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
mg starch/ g dry weight
MS
IAA
Figure 3: Soluble carbohydrates (A) and starch (B) in a time-course analysis of leaf rooting
of Arabidopsis thaliana ecotype Columbia in control and 57 µmol/L IAA-treated leaves. Both
parameters were measured at start and 1, 2, 4, 8 and 16 days after leaf excision. Arrow indicates
mean time of emergence of first roots. Bars indicate standard deviation.
43
A
0
20
40
60
80
100
120
140
0 2 4 6 8 10 12
Days
Pox specific activity/ mg
protein
MS
IAA
B
0
1
2
3
4
0 2 4 6 8 10 12
Days
IAAox activity/ mg of protein
MS
IAA
44
C
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0 2 4 6 8 10 12
Days
mg proteins/ g dry weight
MS
IAA
Figure 4: Enzymatic activities and protein content during leaf rooting of Arabidopsis thaliana
ecotype Columbia with or without 57 µmol/L IAA treatment. Total peroxidases (A), IAA oxidase
(B) and total protein (C) were evaluated in a time course analysis at start, 1, 2, 4, 8 and 16 days
after leaf excision. Arrows indicate mean time of emergence of first roots. Bars indicate standard
deviation.
45
A
6
11
16
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
mg phenolic compunds / g
dry weight
MS
IAA
B
250
300
350
400
450
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
micrograms of flavonoids / g
dry weight
MS
IAA
Figure 5: Total phenolic compounds and flavonoids during rooting of detached leaves of
Arabidopsis thaliana ecotype Columbia with or without 57 µmol/L IAA treatment. Total phenolics
(A) and flavonoids (B) were evaluated in a time course analysis at start, 1, 2, 4, 8 and 16 days after
leaf excision. Arrows indicate mean time of emergence of first roots. Bars indicate standard
deviation.
46
CAPÍTULO 2
Artigo a ser submetido à revista “Journal of Experimental Botany”
47
Comparison among experimental systems of adventitious rooting in Arabidopsis thaliana uncovers
distinct developmental responses related to the same process
Luciano da Rocha Correa ¹, Juliana Troleis
2
, Alexandra Antunes Mastroberti
2
, Jorge Ernesto de
Araújo Mariath
2
, Arthur Germano Fett-Neto
1,3
(1) Departamento de Botânica, Laboratório de Fisiologia Vegetal, Programa de Pós-Graduação em
Botânica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (2) Departamento de Botânica,
Laboratório de Anatomia Vegetal, Programa de Pós-Graduação em Botânica, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (3) Centro de Biotecnologia (Programa de Pós-Graduação
em Biologia Celular e Molecular), UFRGS, CP 15005, CEP 91501-970, Porto Alegre, RS, Brazil.
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Abstract
The detailed understanding of the cytological and genetic bases of adventitious root
development is a major concern for plant germplasm improvement. The literature describes
different rooting protocols to use with A. thaliana as a model to study adventitious rooting;
however, there is a lack of objective comparisons of advantages and limitations of each method in
the study of adventitious rooting with wild type ecotypes and their respective mutants. This
investigation was undertaken to evaluate the adventitious rooting process in three different
experimental systems, all using A. thaliana, analyzing the same rooting parameters after transient
exposure to auxin and control conditions: the use of excised leaves of adult plants, in vitro plants
with excised root systems and in vitro etiolated plantlets. The site of origin of roots differed
depending on the system used. Roots appeared along the entire length of etiolated stems, whereas
their emergence in the other systems was restricted to the proximities of the cut surface.
Adventitious roots seemed to originate from different tissues: vascular cambium in the petioles, the
pericycle in etiolated hypocotyls, and a region of early differentiating cambium, close to the
pericycle, in de-rooted seedlings. None of the systems had an absolute requirement of exogenous
auxin, although rooting was enhanced by this phytohormone, with the exception of de-rooted
plantlets, which had rooting inhibited by exogenous auxin. No callus formation preceded rooting in
the three systems evaluated. Root elongation was much favored in isolated leaves. Auxin-
overproducing mutants could not be used in the detached leaf system due to precocious
senescence. Because the physiological responses can differ significantly, caution must be
exercised when attempting to generalize responses based on comparisons of data derived from
different experimental systems to study rooting in this model species.
Key words: mutant, petiole, etiolated plantlet, de-rooted plantlet
49
Introduction
Clonal propagation is an important technique on which depend several economic activities
such as agroforestry, pharmaceutical industry and horticulture (Chaturvedi et al., 2007; Rout et al.,
2006; Kumar et al., 2006). Multiplying desirable genotypes – selected from natural variability,
generated by conventional breeding or genetic transformation procedures – requires the formation
of an efficient root system, often based on adventitious roots. Therefore, the detailed understanding
of the cytological and genetic bases of adventitious root development is a major concern for plant
germplasm improvement.
Efficient rooting protocols are related to high rooting percentages coupled to large numbers of
long roots developed in the shortest time possible; such root systems improve the survival rate of
the explants when transferred to a definitive site (da Rocha et al., 2008). The process of
adventitious root formation (ARF) in apple stem explants was divided in three phases, established
after culture media inoculation: dedifferentiation (0-24 hours), induction (24-96 hours) and
formation (96 hours onwards) (De Klerk et al., 1995). The biochemical events and requirements
change with the progress of root development.
Auxins play a central role on ARF (Kevers et al., 1997 and references therein); their action is
often based on gene derepression by selective proteolysis, mediated by a soluble receptor protein
of the F-box family (Dharmasiri e al., 2005). Auxins are transported from their endogenous (shoot
apex) and exogenous (culture media) sources and their local pools are regulated by
synthesis/degradation, importation/exportation and conjugation/deconjugation; the overall effect of
these regulatory mechanisms determines auxin activity in a given tissue or area of the plant (Fett-
Neto et al., 2001). However, other factors are involved in ARF, including: a) flavonoids (Hand,
1994) which regulate auxin transport, b) carbohydrates (Correa et al., 2005), acting as structural
50
carbon and energy sources, perhaps with a role mediating the cell cycle, c) mineral elements
(Schwambach et al., 2005) as enzyme cofactors and signaling molecules, d) temperature (Correa
and Fett-Neto, 2004) and e) light (Fett-Neto et al., 2001), both relevant factors in global
metabolism, growth, and development. Peroxidases (Gaspar et al., 1982) seem to be involved in
auxin catabolism and are classical markers for rooting (Fett-Neto et al., 1992). It has been
hypothesized that there is a role for peroxidases in the processes of adventitious rooting and
flowering, since these enzymes display an antagonic pattern of variation in each of these
developmental events (Gaspar et al. 1982).
Arabidopsis thaliana Heyhn is a model plant which is largely used for physiological,
developmental and biochemical studies because of the extense knowledge available up to date
about this species, including the complete sequence of its genome (AGI, 2000) and the
characterization of a great quantity of mutants and several ecotypes. The use of this species as
experimental model can shed light over various questions concerning adventitious root formation.
Some approaches have been classically used for this kind of study: pharmacological application of
exogenous factors (Schwambach et al., 2005), comparisons between easy and difficult-to-root
species (Correa and Fett-Neto, 2004; Fogaça and Fett-Neto, 2005), mutants or selected clones of
the same species (Lund et al., 1997), evaluation of biochemical markers in treatments leading to
rooting versus control conditions (Gaspar et al., 1982, Fett-Neto et al., 1992). The literature
describes different rooting protocols to use with A. thaliana as a model to study adventitious
rooting (Ludwig-Müller et al., 2005; Sorin et al., 2005). However, there is a lack of information on
how interchangeable the findings made with one experimental rooting system are with another, as
well as an objective comparison of advantages and limitations of each method in the study of
adventititious rooting with wild type ecotypes and their respective mutants.
The present investigation was undertaken to evaluate the adventitious rooting process in three
different experimental systems, all using A. thaliana as a genetic model and analyzing the same
51
rooting parameters: the use of excised leaves of adult plants, in vitro plants with excised root
systems and in vitro etiolated plantlets.
Material and Methods
Plant Material
Arabidopsis thaliana seeds were obtained from TAIR - The Arabidopsis Information Resource.
When necessary, sterilization was carried out by soaking seeds for 1 minute in ethanol 70% and 15
min in NaClO 1.5% (w/v) with a few drops of commercial detergent, followed by four washes in
autoclaved distilled water. For all cultivations, seeds were imbibed for 30 minutes and stored for
two days at 4°C (stratification) in order to improve germination.
For ex vitro rooting assays with detached leaves, seeds were put to germinate in pots with soil
and vermiculite (1:1) and irrigated with MS 0.1x (Murashige and Skoog, 1962). After the
stratification period, the pots were transferred to chambers at 20°C and about 45 µmol.m
-2
.s
-1
of
photosynthetically active radiation (PAR). Plants were irrigated with distilled water and fertilized
with MS 0.1x once a week. Up to seven days after emission (DAE) of the first flower bud, leaves
were collected and put to root in polyethylene boxes with 200 mL capacity containing 50 mL
liquid MS 0.1x plus phytohormones, if that was the case (induction medium). After four days
leaves were transferred to similar boxes without phytohormones and with 0.1% (w/v) activated
charcoal (formation medium). Rooted leaves were counted every two days. After 12 days in
formation media, roots per rooted leaf were counted and measured, considering as a root every
polarized white structure of at least 1 mm in length. Root branches (lateral roots formed from
adventitious roots) were also considered in the total root count.
52
For in vitro assays with embryonic root removal, the germination was carried out in 250 mL
glass flasks with 40 mL medium MS 0.1x supplemented with 2% sucrose and solidified with agar
(0.6% w/v). Stratification and growth were as described above. One month after germination,
plantlets had their root system excised and were transferred to similar flasks with rooting medium
(described above, with or without 57 µmol/L IAA (indoleacetic acid) supplementation). Rooting
criterium was as described for the detached leaf system.
In vitro assays with entire etiolated plantlets were carried out in plastic microplates with 24
wells of 2 mL each. Plates were previously sterilized in ethanol 70% for at least 24 hours, washed
four times with sterile distilled water, and 1 mL of agar medium (with composition as above) was
poured in each cell just after leaving the autoclave. Plates were then closed and involved with
parafilm. After cooling, surface sterilized seeds were placed on the medium (1 per cell). After
stratification, plates were covered with aluminum foil for 5 days to allow germination and
etiolation; then, 0.5 mL of liquid 0.3% agar medium with 57 µmol/L IAA was aseptically added
into each cell, covering part of the hypocotyl. Seedlings remained in this medium until the end of
the experiments. Rooting criterium was also as described for the detached leaf system, except that
lateral roots (rarely formed) were not included in the root counting.
Superroot rooting
In a first assay, leaves of auxin superproducer Columbia mutant CS8156 (classified as rty in
the TAIR catalog, and hereby so called) were set in the leaf hydroponic system to root, with and
without auxin supplementation.
In another experiment, the rooting responses of CS8156 were confronted with other known
auxin superproducers: sur1-3 and atr4 (kindly provided by Dr. Catherine Bellini, Umea Plant
Research Center, Sweden), in the etiolated plantlet system, without auxin supplementation.
53
Reproductive phase shift and flowering time influence on rooting
To evaluate the influence of flowering on leaf rooting, expanded leaf explants were taken
before the inflorescence emission (days after emission-DAE, i.e. visible bolting), up to seven DAE
and between 14 and 21 DAE of the first flower bud. Moreover, ex vitro rooting tests were carried
out using two early and two late flowering mutants of both Columbia and Antwerpeen ecotypes to
find out if there was a correlation between flowering acceleration or delay with mean rooting time.
In all of the experiments involving flowering time or phase shift, expanded and non-senescent
leaves pooled from rosettes of several plants from each harvest time or genetic make up were
inoculated to root ex vitro.
Flavonoids and rooting
To test the validity of the etiolated plant system to verify the influence of flavonoids on
rooting, the mutant CS85 - chs (deficient in chalcone synthetase, the first enzyme on flavonoids
biochemical pathway) and its WT control ecotype, Landsberg. First we evaluated the effect of
presence/absence of exogenous quercetin (dehydrated, 95%, Sigma-Aldrich) and auxin on
plantlets; next, to find out if there were differences in activity regarding the flavonoid type,
quercetin was compared to rutin (hydrated, Sigma-Aldrich) and naringenin (+/- isomers, Sigma-
Aldrich), with no exogenous auxin supply. Stock solutions were made with ethanol 96%, and the
solvent alone was used in the controls. Flavonoids were used in a concentration of 20 µmol/L, as in
Martinez Pastur et al. (2003).
54
Rooting parameters and statistical analysis
Rooting was evaluated based on the following parameters: percentage of rooted explants, mean
number of roots per rooted explant, mean length of longest root (in mm) and, for ex vitro assays
only, mean rooting time, with measurements every two days. Analysis of Variance followed by
Duncan test were applied in factorial experimental design. When necessary, values were
transformed to square root or log 10; if variance heterogeneity persisted, Welch Anova and
Dunnett-C test were applied. For two treatment comparisons, t-test was applied. For all tests,
probability was p≤ 0.05. Mean rooting time was calculated as described in Fett-Neto et al. (2001).
Root emission and histological studies
To find out which were the tissues involved in originating adventitious roots in the three
rooting systems (three-month petioles, two-weeks etiolated hypocotyls and one-month plantlet
stems), initially the pattern of root emergence was examined with a stereomicroscope. After that,
based on root site and timing of emergence, transversal sections were made at the time of
appearance of the first roots and also two days before, in an attempt to observe the origin of root
formation. This procedure was done for at least three different samples from each treatment.
All materials were harvested at 0, 4 and 6 days after rhizogenic treatment application (IAA 10
mg/L, which is equivalent to 57 µmol/L). Petioles and stems sections were placed in 4%
paraformaldehyde and 1% glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer (pH 7.2) fixation
solution (McDowell and Trump, 1976) for at least 2 days, triple-washed with 0.1M sodium
phosphate buffer (Gabriel, 1982), dehydrated in a crescent ethanolic concentration series and
embedded in hidroxyethylmethacrylate resin (Gerritz and Smid, 1983). Sections of 0.5 µm were
made in a Leitz model 1400 microtome, stained with toluidine blue (O’Brien and McCully, 1981)
55
and photographed in a Leitz light microscope, model Dialux 20 EB, coupled with a Leica model
MD-2 photographic system.
Results
Comparison among three rooting systems
Although the same species and genetic background were used in several experiments, rooting
recalcitrance varied according to the experimental system applied. Morphological aspects of plants
are shown in Fig 1A-C; adventitious roots appeared in the basal part of leaf petioles and de-rooted
plant hypocotyls, whereas they were homogeneously distributed along the axis of etiolated
hypocotyls.
As it can be seen in the section pictures (Fig 2A-J), adventitious roots seemed to originate from
different tissues: vascular cambium in the petioles (Fig 2B and 2I), the pericycle in etiolated
hypocotyls (Fig 2E and 2J), and a region of early differentiating cambium, close to the pericycle,
in de-rooted seedlings (Fig 2H). Tissue organization of Arabidopsis hypocotyls is similar to
angiosperm roots (Fig 2D and 2G). In addition, hypocotyls of both etiolated and de-rooted
plantlets are also similar; the main difference is that one-month hypocotyls reflect a greater
histological maturity compared to younger etiolated ones. Sections of etiolated Col WT and Col rty
samples were also made, indicating similar tissue organization and root origin between them (data
not shown).
Whereas exogenous auxin promoted rooting in leaves (Fig 3A) and etiolated plantlets (Fig 3B),
it was inhibitory for regeneration of roots in de-rooted plantlets (Fig 3C). Considering the lower
56
and higher mean values of root length, adventitious roots developed in petioles were about five
times longer than those formed in seedlings (Fig. 3A and B)
A semi-quantitative comparison of practical aspects of the three systems is shown in Table 1.
Superroot rooting
De rooted plantlets of Col WT in MS and in IAA originated longer roots than superroot
mutant, and plantlets without auxin had a better overall rooting performance (Fig 4A). In etiolated
system, however, rty showed better rooting responses than WT (Fig 4B). Leaves of Col rty could
not be used in ex vitro assay due to fast senescence (Fig 4C).
In the etiolated plant system, rty showed a rooting performance that was similar to sur1-3, that
is, significantly better than the WT control. The atr4 mutant showed the best response among all
auxin superproducers mutants for the evaluated parameters (Fig 4D).
Juvenility and flowering time
No differences were observed between leaves taken before or a few days after the first flower
bud emission; however, leaves in the both referred conditions rooted more efficiently than leaves
from older plants (Fig 5). Mutants in two ecotype backgrounds that took different times to flower
were tested, but no consistent relationship between their flowering time and rooting time was
found (Fig 6).
Flavonoids and rooting
57
Overall results with the etiolated plantlet system indicated that the mutant chs had a lower
percent rooting than wild type (Fig 7A). In wild type plants, quercetin diminished root length
whereas no effect was observed in chs (Fig 7B); no significant effects on chs rooting parameters
were observed. Quercetin had an inhibitory effect on WT rooting (number of roots and root length)
that was epistatic on the positive effects of auxin. There seems to be no difference among distinct
flavonoid types in terms of effect on adventitious rooting (Fig 8A and 8B).
Discussion
Arabidopsis thaliana is a model plant which provides a valuable genetic system for many
physiological studies. In the case of adventitious rooting, some protocols have been reported;
however, since this is a complex process, it is important to establish how comparable are the
results generated by different experimental systems and which kind of protocol works best for
specific purposes.
The site of origin of roots differs depending on the system used. Roots appeared along the
entire length of etiolated stems, whereas their emergence in the other systems was restricted to the
proximities of the cut surface. Such wound zone localized site of root development has been
previously observed for the rooting of leaves and inflorescence segments in Arabidopsis treated
with indole-3-butyric acid (Ludwig-Müller et al., 2005). Hypoxia is an unlikely explanation for
this difference in site of differentiation because petioles and one-month hypocotyls had both a
much greater flooded area than just the extreme bottom part, which was the case of de-rooted
seedlings. The same reasoning applies to potential differences in ethylene production and
accumulation, which have been reported as regulating root development in apple stems and leaf
disks (De Klerk et al., 1999). A factor affecting this response could be the local influence of
wound-related compounds (WRCs) such as some phenolics and jasmonic acid, which are known to
58
promote rooting (De Klerk et al., 1999). It has recently been proposed that wound induced
jasmonates could trigger sink activity in Petunia hybrida cutting bases by mediating apoplastic
sucrose unloading and the activity of cell wall invertase (Ahkami et al., 2009). Unlike what was
observed for adventitious rooting in inflorescence segments of Arabidopsis (Ludwig-Müller et al.,
2005), root development in the systems herein described was not preceded by callus formation;
cell divisions leading to root development occurred within the hypocotyl or petiole tissues.
Internal organization of stem tissues from where adventitious roots arise is similar to plant
roots; this can be due to the proximity of the sites of root emergence to the limit point between
hypocotyl and main root system; only higher zones of well differentiated portions of Arabidopsis
hypocotyls (nearby leaves) show typical stem vascular organization.
Tissues involved in root origin were, apparently, the cambium of petioles, the pericycle or
early cambium of etiolated young hypocotyls, and a region of early differentiating cambium, in
older hypocotyls of de-rooted seedlings. However, it was previously shown in etiolated plantlets
that adventitious roots can also originated from surrounding tissues when exogenous auxin is used
(Falasca and Altamura, 2003). Lateral roots of Arabidopsis also have their origin in the pericycle
(Casimiro et al., 2003), and asymmetrically-dividing pericycle cells whose derivatives give origin
to lateral roots recently served as targets to identify a new receptor-like kinase ACR4, which acts
in the control of cell divisions in newly-developing Arabidopsis roots (De Smet et al., 2008). At
early stages of development, adventitious roots started to form a vascular cylinder, as reported by
Baum et al. (2002). Root origin and morphology can vary depending on the protocol and system
used, since adventitious root formation is one of the plant developmental responses that is most
affected by environmental factors, such as carbohydrate availability, carbon dioxide concentration
(Lee-Ho et al., 2007) and local sources of nitrogen (Schwambach et al., 2005).
Potential differences in auxin requirements were noted among the three systems tested.
Whereas exogenous IAA was favorable to leaf and etiolated plantlet rooting, it was inhibitory for
59
de-rooted plants. This is presumably a result of overaccumulation of shoot derived auxin in the
case of de-rooted plants (Bhalerao et al., 2002), which may become excessively concentrated with
additional exogenous supply. All of the systems studied allowed the development of at least some
adventitious rooting even in the absence of exogenous auxin, a situation often found in commercial
scale propagation of trees in minihedges (Schwambach et al., 2008). This contrasts with what was
observed for inflorescence segments, which only rooted in the presence of exogenous auxin
(Ludwig-Müller et al., 2005).
Based on our results, rooting leaves in hydroponic system is effective under clean but non-
aseptic conditions, and is a potentially good way to mimic physiological responses of cuttings,
since roots derive from the cambial region. Moreover, because of the excelent root elongation in
this system, petioles appear adequate for studies on adventitious root growth (root formation step).
Petiole rooting has the problem of involving only a leaf, and not an entire plant, which can lead to
different responses. One of these differences is that the hydroponic system does need the
application of exogenous auxin for leaves to reach higher rooting percentages, which is not
necessary when in vitro plants are grown after the primary root system is excised. Both petiole
rooting and de-rooted seedlings (mainly the former, when using ecotypes or genotypes that reach a
reasonable size) can yield a good quantity of biomass for biochemical and molecular studies. The
potential problem of leaf senescence was not significant within the time frame of the experiments
for most of the genetic backgrounds tested. In Col WT, it was previously determined that the
decrease in total chlorophyll in detached leaves both with and without auxin supplementation after
16 days was approximately 37%, and leaves remained viable, particularly as rooting progressed
(Corrêa and Fett-Neto, unpublished results). Because it is carried out ex vitro, the leaf system has
the additional advantage of facilitating sample harvesting and medium changes in order to evaluate
the influence of chemicals during the different rooting phases (De Klerk et al., 1999). On the other
hand, the use of special chemicals in the hydroponic leaf system may demand larger amounts
60
compared to the etiolated plantlet system. The latter, however, provides much less biomass for
biochemical and molecular analyses. In terms of time required to data collection, etiolated plantlets
yield faster responses and assay assembly involves one step only. Compared to de-rooted plantlets,
etiolated plants have the disadvantage of modifying the normal photomorphogenic condition of
plants and, due to their young seedling age, limiting the capacity of inferring rooting responses in
stem cuttings. In addition, etiolated plantlets were not able to reach the high adventitious rooting
rates of de-rooted plants in the absence of auxin.
Some of the systems herein described were used to test the rooting response of mutants related
to important aspects of adventitious root physiology. Superroot (sur1 and sur2) are mutants which
overproduce auxin, developing much more adventitious roots than their corresponding wild types
(Columbia and Wassilewskija, respectively) (Boerjan et al., 1995). TAIR germplasm lists a mutant
(rty) which was reported to be similar to sur1. However, in the leaf system this mutant has not
rooted at all, becoming chlorotic very fast. This could be due to high accumulation of auxin in the
detached leaf triggering auxin-induced ethylene production and leading to precocious senescence
(Fogaça and Fett-Neto et al, 2005). In fact a similar response was observed for de-rooted seedlings
of rty (data not shown). Therefore, this genotype was tested in the etiolated plantlet system,
together with the sur1 (sur1-3) and atr4, a Col mutant, similar to Ws sur2, which displays an even
stronger phenotype. In this system, the comparison was feasible and results were clear.
The leaf system was used to find out if there was a correlation between flowering time and
rooting time. For this, flowering time mutants were cultivated and their leaves used about one
week after flower bud emission, which was considered a stage of mature plants. As was formerly
proposed, based on inverse variations in peroxidase activity during these two developmental events
(Gaspar, 1981), one could expect that the quicker a mutant flowered, the slower it would root.
However, no consistent trend was detected, suggesting that, at least for the rooting of Arabidopsis
detached leaves, these processes are relatively independent. Although an abrupt phase-change
61
associated difference in rooting capacity was not observed, a significant reduction in rooting
capacity occurred in leaves from plants at 14-21 DAF. However, in monocarpic oilseed species
such as Arabidopsis, these changes in leaf rooting capacity may also be related to reduced
carbohydrate accumulation in vegetative tissues due to a significant shift of photoassimilates to
support early stages of seed development and later conversion to lipids (Fallahi et al., 2008).
Flavonoids are considered natural inhibitors of auxin transport (Peer and Murphy, 2007).
Auxin transport may be incremented in chs and exogenous quercetin could be not enough to cause
any inhibitory effect, compared to the extra quercetin supplied to wild type plants, which contain
endogenous amounts. In fact, a trend towards improved root development was seen in chs plants
treated with flavonoids. This could be due to antioxidant activity preserving the basal auxin
content (De Klerk et al., 1999). There seems to be no difference among distinct flavonoid types in
terms of effect on adventitious rooting (Fig 2), which is not in agreement with the findings
reported for Nothofagus nervosa (Martínez Pastur et al., 2003), which points to a greater positive
effect of naringenin, comparing to rutin and quercetin. These results may reflect species-specific
features or differences in the experimental set up. The action of flavonoids in auxin transport,
although not essential for the process to take place, depends on several factors, such as their
location and interaction with P-glycoptoteins involved in auxin transport, as well as regulatory
kinases and phosphatases (Peer and Murphy, 2007).
To sum up, it is clear that A. thaliana constitutes an interesting model for studying adventitious
root development. However, the input of endogenous hormonal responses, the requirement for
exogenous auxin, and the need of pre-treatments such as etiolation must be taken into account
before choosing an experimental system to investigate particular aspects of adventitious rooting in
Arabidopsis. Because the physiological responses can differ significantly, even including
variations in auxin sensitivity, root founding tissues and sites of root differentiation, caution must
62
be exercised when attempting to generalize responses based on comparisons of data derived from
different rooting experimental systems using this model species.
Acknowledgements
The authors are grateful to Dr. Catherine Bellini (Umea Plant Science Centre) for the gift of
superrot mutant seeds. Financial support for this research was provided by the Brazilian agency
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
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68
Table 1: Comparison of practical aspects of three methods of rooting based on leaf petioles, de-
rooted plantlets and etiolated plantlets; the number of “+” reflects the intensity of the parameter,
and “N/A” indicates not applicable due to physical space limitations.
Parameter Leaf petioles Plants with
excised roots
Etiolated plantlets
Contamination
chance
+++ + ++
Phase-change tests
+++ + N/A
Exogenous auxin
effect
+ - +
Time required
3-4 months
2 months 3 weeks
Assemblage
difficulty
+ ++ ++
Biomass yield for
other assays
+++ ++ +
Mutant assay
feasibility
+ ++ +++
Adequacy for
assays with
addition of
substances
+++
++
+
Difficulty of mean
rooting time
evaluation
+
+++ +++
69
Figure 1: Morphological aspects of rooted Arabidopsis thaliana (ecotype Col) plants from the
three experimental systems: (A) rooted leaves, (B) rooted one-month plantlets and (C) etiolated
plantlet. White arrows indicate roots emergence sites and black arrow in C indicates the limit
between the hypocotyl and radicle. White bars = 5 mm.
B A
C
70
Figure 2: Transversal sections of Arabidopsis thaliana (ecotype Col) petioles (A-C), etiolated
plantlets (D-F) and one-month plants hypocotyls (G-H), at 0d (A, D and G), 4d (B, E) and 6d (C, F
and H). (I) and (J) show vascular regions of (B) and (E) in detail. vc: vascular cylinder; cp: cortical
E F
I J
H
A
B C
D
G
c x
ph
cp
vc
vc vc
vc
vc
vc
vc vc
cp
cp cp cp
cp
cp
cp
cp
pc
cp
G
71
parenchyma; pc: pre-cambium; x: xylem; c: cambium; ph: phloem. Black arrows in (B), (E), (I)
and (J) show the sites of initiation of roots. Bars = 20 µm (A – H) and 2 µm (I and J).
72
A
b
a
B
A
a
a
A
A
0
20
40
60
80
100
MS IAA MS IAA
AnWT ColWT
Treatments
%
0
2
4
6
8
days
% rooting
rooting time
B
b
a
A
A
A
A
a
b
0
20
40
60
80
MS IAA MS IAA
AnWT ColWT
Treatments
mm
0
5
10
15
20
25
number of roots
root length
numroots
73
C
A
B
a
b
0
20
40
60
80
100
MS IAA MS IAA
AnWT ColWT
Treatments
%
% rooting
D
A
A
a
a
A
B
a
b
0
4
8
12
16
20
MS IAA MS IAA
AnWT ColWT
Treatments
mm
0
2
4
6
8
10
12
Number of roots
root length
numroots
E
B
A
b
a
0
20
40
60
80
100
MS IAA MS IAA
AnWT ColWT
Treatments
%
% rooting
74
F
B
A
a
a
B
A
b
a
0
4
8
12
16
MS IAA MS IAA
AnWT ColWT
Treatments
mm
0
2
4
6
8
10
number of roots
root length
numroots
Figure 3: Auxin requirements for A. thaliana adventitious rooting varies according to the rooting
system. 57 µmol/L IAA was applied in rooting media in explants of ecotypes Columbia (Col) and
Antwerpeen (An), comparing against controls without auxin. (A) and (B) Rooting of leaves of
adult plants. (C) and (D) Rooting of etiolated plantlets. (E) and (F) Rooting of de-rooted plantlets.
Comparisons were made by t-test (p≤ 0.05) between treatments in the same background.
75
A
b
b
a
a
0
20
40
60
80
100
MS IAA MS IAA
Col WT Col rty
Treatment
%
% rooting
76
B
D
B
C
A
b
a
b
a
0
4
8
12
16
MS IAA MS IAA
Col WT Col rty
Treatment
mm
0
2
4
6
8
Number of roots
root length
numroots
C
a
ab
b
c
0
20
40
60
80
100
MS IAA MS IAA
Col WT Col rty
Treatment
%
% rooting
D
A
A
A
A
a
ab
ab
b
0
2
4
6
8
10
MS IAA MS IAA
Col WT Col rty
Treatments
mm
0
2
4
6
8
Number of roots
root length
numroots
77
E
78
F
a
b
b
c
0
20
40
60
80
100
WT rty sur1-3 atr4
background
%
% rooting
G
A
AB
B
B
b
b
a
b
0
2
4
6
8
10
12
14
WT rty sur1-3 atr4
background
mm
0
2
4
6
8
10
Number of roots
root length
numroots
Figure 4: (A) and (B) de-rooted and (C) and (D) etiolated plantlets rooting parameters – capital
letters: root length; (E) aspect of Col WT (top) and rty (bottom) leaves after ex vitro rooting
treatment – Bar = 1cm; (F) and (G) adventitious rooting mutants rty, sur1-3 and atr4, in etiolated
plantlets system – capital letters: root length; same letters show no statistical difference among
treatments (Dunnett-C for percent rooting, Anova/Duncan test for the others, p≤ 0.05).
79
a
a
b
0
10
20
30
40
50
60
Pre flower 1-7 DAE 14-21 DAE
% rooting
Figure 5: Percent rooting of leaves from plants of Arabidopsis thaliana (ecotype Col) in distinct
juvenility states, related to inflorescence emission time (visible bolting). Pre flower: about 11
weeks after germination, with no bud emission yet. DAE: days after bolting. Analyses were made
by Anova and Duncan test (p≤ 0.05).
80
A
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
% ro o te d ex p l an ts
AnWT
CS509
CS304
CS506
N505
B
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Days
% roo ted exp lan ts
ColWT
CS3732
CS3071
CS3125
CS3239
C
0
2
4
6
8
10
12
14
AnWT
C
S
5
06
N
50
5
CS509
CS304
ColWT
CS3125
CS3239
CS3732
C
S
3
0
7
1
Background codes
Days
Figure 6: Flowering time (days until bolting) of mutant plants does not influence rooting time of
leaves derived therefrom. Leaves of flowering mutants of Antwerpeen (A) and Columbia (B)
ecotypes were put to root and evaluated for 16 days (early flowering: dotted lines; late flowering:
broken lines; wild type: continuous line). (C) Mean rooting time: analyses were made by Anova
and Duncan test (p≤ 0.05), with bars indicating standard deviation; full colored: wild type; white:
mutants early; light grey: mutants late.
81
A
b
a
ab
ab
b
ab
a
a
0
20
40
60
80
100
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
Treatments
%
% rooting
B
A
A
AB
AB
AB
AB
B
B
a
b
ab
ab
ab
ab
b
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
Treatment
m m
0
2
4
6
8
10
Num ber of
roots
root length
numroots
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
Genot
WT
WT WT WT chs chs chs chs
IAA - + - + - + - +
Qct - - + + - - + -
Figure 7: Quercetin and auxin in non-flavonoid chs mutant Arabidopsis thaliana
(ecotype Ler), in etiolated plantlets system. (A) percent rooting and (B) number of
roots and root length (capital letters). IAA: indole acetic acid; Qct: quercetin.
Analyses were made by Anova and Duncan test (p≤ 0.05)
82
A
a
a
a
a
a
a
a
a
0
20
40
60
80
100
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
Treatments
%
% rooting
B
A
B
AB
B
AB
AB
AB
AB
a
a
a
a
a
a
a
a
0
2
4
6
8
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
Treatments
mm
0
1
2
3
4
5
6
Number of
roots
root length
numroots
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
Genot
WT
chs WT chs WT chs WT chs
Flv none
none querc
querc
naring
naring
rutin rutin
Figure 8: Flavonoids in non-flavonoid chs mutant and WT Arabidopsis thaliana
(ecotype Ler), in etiolated plantlets system. Flv: flavonoid; Querc: quercetin;
naring: naringenin. (A) percent rooting and (B) number of roots and root length
(capital letters). Analyses were made by Anova and Duncan test (p≤ 0.05)
83
84
DISCUSSÃO GERAL
O propósito inicial do trabalho era o estabelecimento de um sistema de enraizamento de
folhas de plantas maduras (pós-emissão de ramo) de arabidopsis, já em desenvolvimento e até
então inédito, com vistas à sua subseqüente utilização como ferramenta para estudos bioquímicos
das fases do processo, já estabelecidas para outras espécies em outros sistemas, como microestacas
de Eucalyptus spp (Fett-Neto et al., 2001 e posteriores trabalhos do grupo), discos caulinares de
Malus sp (De Klerk et al., 1999) e outros. Havia um interesse especial no estudo da cascata de
ativação da rizogênese por óxido nítrico (trabalhos de Pagnussat et al., em 2002, 2003 e 2004).
Pretendia-se utilizar arabidopsis para estabelecer um sistema com arcabouço genético confiável e
pela possibilidade de avaliar o desempenho de mutantes caracterizados no desenvolvimento de um
sistema radicial adventício.
No início do período de desenvolvimento da tese, em 2005, foi publicado um sistema de
enraizamento em segmentos de ramos e folhas de arabidopsis por Ludwig-Müller e colaboradores,
com ênfase nos primeiros. Por outro lado, vários testes que realizamos com a aplicação
farmacológica de elementos efetores da rota do óxido nítrico, ao contrário dos trabalhos originais
(em que se usaram plântulas de pepino com raízes excisadas), resultaram em efetividade quase
nula. A possibilidade de utilizar diferentes protocolos de enraizamento adventício em arabidopsis,
acoplado ao grande número de fatores capazes de influenciar a resposta rizogênica, levou-nos a
realizar um estudo comparativo para verificar a universalidade e as restrições de resultados obtidos
em diferentes sistemas experimentais de enraizamento usando arabidopsis. Foram avaliados três
sistemas teoricamente passíveis de aplicação para o estudo da rizogênese em arabidopsis, com
enfoque no oferecimento de diferentes opções, dependendo das peculiaridades de cada tipo de
estudo. A atenção foi concentrada nos parâmetros da tabela 1 do 1° artigo, todos com enfoque em
aspectos fundamentais e práticos dos ensaios de rizogênese adventícia:
* Risco de contaminação: o desenvolvimento de fungos e bactérias no meio de cultivo é
um evento indesejável em cultura de tecidos (Watt et al., 2003), prejudicando especialmente os
estudos de base acerca do enraizamento, pois as conclusões relativas aos fatores-teste do estudo
podem ser questionadas como sendo produtos da ação dos microorganismos. No caso da produção
comercial de mudas, a competição provocada pelos contaminantes fitopatogênicos ou sapróbios
pode levar ao enfraquecimento e/ou morte do material vegetal.
* Ensaios de fases da rizogênese: foi estabelecido, por vários sistemas de enraizamento
adventício, com várias espécies-alvo, que a rizogênese adventícia é composta de diferentes fases,
com eventos moleculares, bioquímicos e anatômicos próprios de cada uma. O exemplo mais
85
marcante dessas diferenças é com relação à necessidade de auxina (conhecida desde o início do
século XX como hormônio central do processo): nos primeiros dias do processo, desempenha
papel fortemente indutor, e em um segundo momento, fortemente inibitório (Kevers et al., 1997;
De Klerk et al., 1999). A praticidade na aplicação farmacológica de elementos pode contribuir
grandemente para a elucidação do processo. Quanto mais fácil for para acrescentar uma substância
exógena ao meio no decorrer do experimento, ou quanto mais fácil for trocar o meio de incubação
do material, mais propício é o sistema para ensaios dessa natureza. Logo, um meio hidropônico se
presta melhor do que um meio ágar sólido nesse caso.
* Necessidade de auxina exógena: costuma-se classificar as diferentes espécies vegetais,
relativamente ao enraizamento adventício, em: recalcitrantes (necessitam de auxina extra,
geralmente aplicada de forma exógena) ou não-recalcitrantes (enraízam sem auxina exógena)
(Fogaça e Fett-Neto, 2005). Todavia, a recalcitrância, nesse sentido, pode variar dentro de uma
mesma espécie, dependendo do sistema utilizado. Por exemplo, plântulas de arabidopsis de 1 mês
em ágar podem produzir auxina endógena suficiente para garantir um nível de enraizamento muito
superior ao de folhas excisadas de plantas maduras e colocadas em solução hidropônica sem
fitormônios.
* Tempo requerido: é obviamente desejável que a maior quantidade de dados (de boa
qualidade) seja gerada no menor tempo possível; e isso depende do que deve ser avaliado. A
avaliação da participação de determinado transportador de membrana ou do desempenho de algum
mutante pode ser realizada utilizando plântulas jovens, mas a realização de ensaios com o objetivo
de inferir resultados para indivíduos adultos de outras espécies requer o uso de órgãos lignificados
e/ou tecidos de plantas maduras, o que pode tornar o processo mais lento, desde o plantio até a
coleta do material.
* Dificuldade de montagem: sistemas que necessitem de um controle maior sobre a
invasão de microorganismos devem ser montados assepticamente, processo esse mais complexo e
dispendioso do que utilizar ensaios mais voltados a ambientes de estufa ou campo.
* Biomassa para ensaios bioquímicos (ou moleculares): ao fazer um estudo de base sobre
determinado fator, é desejável ter à disposição a maior quantidade de material vegetal possível,
pois muitas substâncias estão presentes em baixas concentrações. Sabendo-se que sempre há
perdas de material na extração e processamento, a adoção de um sistema em que a quantidade de
tecido vegetal seja escassa pode se tornar um fator limitante.
* Ensaios com mutantes: o nocaute ou a transcrição de determinado(s) gene(s) leva à
depleção (ou superprodução) de proteínas e subseqüentes produtos. Por sua vez, haverá reflexos
em nível fisiológico e morfológico, que podem se mostrar em termos de necessidades especiais
86
para o cultivo, crescimento e/ou fertilidade alterados ou outras características; é esperado que essas
alterações metabólicas se mostrem mais drásticas com o passar do tempo, sendo de esperar que um
sistema mais rápido dê menor margem para o surgimento de algum fator inviabilizante para a
planta ou para a obtenção de material experimental.
* Ensaios com substâncias exógenas: certas substâncias, como alguns inibidores
enzimáticos, podem ter alto custo. Logo, um sistema que não necessite de grandes quantidades
dessa substância pode ser preferido, em detrimento de outro que utilize grandes quantidades de
meio. Da mesma forma, alguns grupos químicos são termossensíveis, não podendo ser submetidos
a altas temperaturas, que vêm a ser a principal forma de esterilização de meios em cultura de
tecidos, fazendo-se necessária a esterilização por filtração. Sendo assim, esses elementos devem
necessariamente estar incluídos na avaliação de qual sistema será utilizado.
* Avaliação do tempo médio de enraizamento: quanto mais rapidamente uma planta
enraíza, mais tempo há para o crescimento das raízes, mais cedo ocorre a captação eficiente de
água e nutrientes do solo e maiores são as chances de sobrevivência. Por isso o tempo médio de
enraizamento é um dos parâmetros de avaliação de enraizamento classicamente utilizados (Correa
e Fett-Neto, 2004). Para tanto, é interessante a utilização de um sistema que permita ver se um
explante enraizou (ou até mesmo contar as raízes) sem que tenha de ser desmontado; caso
contrário, aumenta em muito a necessidade de material e, geralmente, de tempo de trabalho e
custos.
O sistema de folhas já estava sendo desenvolvido anteriormente à tese, primeiramente
com o uso de placas transparentes de 24 poços de 2 mL, em que as folhas eram colocadas
individualmente. Havia, porém, o problema da rápida evaporação do meio, o que exigia reposição
constante de meio. Apesar de apresentar a vantagem da possibilidade de um monitoramento
individual das unidades amostrais e do meio, o sistema hidropônico passou a ser montado em
placas germbox com 200 mL de meio, com 24 folhas sobre uma placa fina de material sintético
leve flutuante (isopor), com 24 orifícios por onde passam os pecíolos.
Partindo-se desse formato, foram realizados experimentos com vários fatores, visando
estabelecer um protocolo que posteriormente baseou a montagem dos outros 2 sistemas do
presente trabalho. Estabeleceu-se o tipo e dose ideal de auxina (AIA 10 mg/L, que equivale a 57
µmol/L), a duração ideal do pulso (4 dias), a temperatura ideal (20°C), o regime ideal de luz
(fotoperíodo de 14 horas-luz diárias – ensaios não publicados) e concentração ideal de sais (MS
0,1 x – Murashige e Skoog, 1962). Esses resultados indicaram que as condições de cultivo são
87
também as ideais para experimentos de enraizamento, e que uma auxina de fácil degradação (AIA)
é preferível para essa espécie, sob essas condições.
O sistema de plântulas estioladas foi adaptado da literatura. A forma mais comum de
enraizamento adventício de arabidopsis hoje utilizada consiste em germinar sementes em placas
sobre uma camada de ágar e submetê-las a escuro contínuo (para estiolá-las), virando a placa para
que o caule cresça em contato com o meio. Esse procedimento é simples e prático, porém havendo
a limitação de dificultar a administração de substâncias no decorrer do experimento. Sendo assim,
sementes eram plantadas em placas de 24 poços (citadas anteriormente), previamente desinfestadas
com etanol 70% e UV. Colocava-se 1 mL de meio ágar autoclavado (em capela de fluxo laminar)
e, após a solidificação, as sementes eram plantadas no ágar. No final do processo, as placas eram
tampadas e envolvidas em filme plástico transparente (Magipack®) para evitar contaminação por
esporos de fungos. Seguia-se então a manutenção sob luz contínua durante 12 horas, 5 dias de
estiolamento e os fatores rizogênicos (p. ex. auxinas) eram administrados dissolvidos em ágar
semi-sólido (3 g/L) autoclavado (0,8 mL por poço), alagando-se uma porção do caule. Após 2
semanas os resultados eram avaliados. Portanto, outra diferença desse sistema para o divulgado na
literatura era a criação de um ambiente hipóxico na região da porção alagada do caule.
O enraizamento de plantas de 1 mês de idade crescidas em ambiente asséptico foi
concebido para mimetizar o uso de estacas, forma essa comumente utilizada em indústrias e em
muitos estudos de base (Fett-Neto et al., 2001). Essas plantas, apesar de ter seu tamanho reduzido
e sua maturidade acelerada (reações da espécie ao ambiente in vitro), mantinham um meristema
apical caulinar (produtor de auxina) e apresentavam maior lignificação na região do curto caule,
aproximando-se mais de um sistema tradicional de estacas. Sementes eram germinadas em vidros
de 250 mL com tampa plástica com 40 mL de ágar sólido, e mantidas nas condições expostas
acima, por um mês. Tinham, então, seu sistema radicular excisado e eram transferidas (em capela
de fluxo) para outros vidros com ágar, para reconstituição das raízes. O resultado final era avaliado
em 2 semanas.
Foram realizados cortes transversais próximos dos sítios de emissão de raízes em
amostras de plantas submetidas aos 3 sistemas de cultivo. Os resultados apontam na direção de
padrões já estabelecidos na literatura (Casimiro et al., 2003), que é a origem das raízes a partir de
tecidos indiferenciados (periciclo, câmbio ou "pré-câmbio" vascular), porém variando entre os
sistemas experimentais.
De uma maneira geral, as vantagens e desvantagens levantadas em cada um dos sistemas
estão na tabela 1 do 1° artigo. E cada um desses sistemas possui vantagens interessantes para os
propósitos das investigações dessa tese. Enquanto o uso de plântulas estioladas representa uma
88
grande economia em reagentes e em tempo de obtenção de resultados, o sistema de folhas
possibilita obter várias unidades amostrais (folhas) por semente em menor tempo, visto que é
pequena a quantidade de sementes enviada pelos bancos como o TAIR (www.arabidopsis.org),
além de propiciar maior quantidade de biomassa para os testes bioquímicos.
Portanto, esse foi o sistema escolhido para os estudos de bioquímica, que visava avaliar
mudanças na concentração de grupos químicos (pigmentos, carboidratos) e atividade enzimática
(peroxidases, AIA oxidase) no decorrer do processo do enraizamento. O cruzamento de
informações desses testes com as informações dos ensaios morfométricos, em especial daqueles
em que a auxina era o enfoque principal, mostrariam quais desses grupos químicos seriam
potencialmente melhores marcadores da progressão do processo rizogênico. Esses grupos foram:
• Pigmentos
* Clorofilas: a degradação das clorofilas é um indicativo de senescência e conseqüente
morte de tecidos vegetais. A manutenção de níveis razoáveis ou mesmo a sua
reconstituição poderiam indicar padrões no processo de enraizamento.
* Antocianinas: o aumento no conteúdo de antocianinas também costuma denotar
senescência, logo poderiam indicar tendências no enraizamento, como as clorofilas,
porém seguindo padrão inverso de modificação. Também têm papel indicativo de estresse
oxidativo, o que pode ser provocado pelo sistema de enraizamento a ser utilizado (com
imersão de tecidos em ambientes hipóxicos); todavia, como os controles se encontram em
meio semelhante, seu aumento ou diminuição por esse tipo de estresse não justificaria
diferenças entre os tratamentos.
• Carboidratos
* Solúveis: é necessário carbono estrutural e para biossíntese, além de energia para
formar raízes. Carboidratos como glicose e sacarose também tem papel regulatório no
enraizamento (Corrêa et al., 2005). Logo, sua demanda poderia diferir conforme a fase do
processo, e modificações na sua quantidade poderiam indicá-los como eficientes
marcadores.
* Amido: espera-se que o açúcar solúvel disponível como material de construção da
estrutura celular venha de duas fontes: da fotossíntese e do consumo de estoques, na
forma de amido. Ainda que certas espécies o estoquem em órgãos especiais aclorofilados
(tubérculos, raízes, etc.), órgãos fotossintetizantes também têm suas reservas, localizadas
nos cloroplastos.
• Enzimas
89
* Peroxidases: são enzimas que estão envolvidas em muitos processos fisiológicos nas
plantas, como metabolismo de ligninas, fenólicos em geral e auxinas. Estas enzimas
são conhecidas por apresentarem perfis de atividade distintos em processos de
floração e enraizamento, com variações antagônicas em cada processo (Gaspar, 1982).
Figura retirada de Gaspar et al. (1982) mostrando alterações antagônicas na atividade de peroxidases
(linha contínua) no enraizamento (A, B) e floração (C, D).
* AIA oxidase: são as isoformas de peroxidase que reconhecem o AIA como
substrato, porém ocorrem em concentração menor, em comparação à gama completa
de peroxidases presentes na planta.
De uma forma geral, as folhas eram coletadas em vários pontos no tempo, após a
colocação no sistema hidropônico; eram congeladas com nitrogênio líquido e estocadas em freezer
a -20°C, até o momento da análise. As quantificações eram feitas em espectrofotômetro e geravam
curvas que refletiam a alteração de concentrações no tempo. Os principais pontos a serem
observados são os relativos a 4 dias (fim do pulso de auxina, em princípio marcando a passagem
da fase de indução para a fase de formação) e 8 dias (tempo em que, em média, as raízes emergiam
dos pecíolos). Considerando-se a variabilidade amostral, os grupos que mostraram maior inflexão
90
nas curvas – logo, mais propensos a serem considerados marcadores – foram a atividade de
peroxidases, conteúdo de fenólicos totais e conteúdo de carboidratos solúveis.
Outra vantagem propiciada pelo uso de diferentes sistemas relaciona-se ao trabalho com
mutantes. Uma das várias vantagens de se usar A. thaliana é a disponibilidade de uma gama de
mutantes caracterizados para genes específicos ou para pelo menos alguma característica
fisiológica. E o trabalho com 3 sistemas de montagem diferenciada aumenta as chances de sucesso
com alguns mutantes, pois enquanto o uso de plantas estioladas não seria possível com alguns
mutante com problemas nos fotorreceptores, o uso de plantas de 1 mês ficaria dificultado com
mutantes de crescimento muito reduzido in vitro, mesmo problema com relação ao sistema
hidropônico no caso de plantas que não desenvolvem folhas grandes.
Sendo assim, o primeiro teste foi no sistema hidropônico, com mutantes de florescimento
precoce e florescimento tardio, com o objetivo de verificar uma possível relação (direta ou inversa)
do tempo médio de florescimento (já estabelecido) com o tempo médio de enraizamento, avaliando
a proposição de Gaspar et al.(1982) quanto à ação de peroxidases no florescimento e no
enraizamento. O experimento, no entanto, não mostrou correlação conspícua. Também foi
realizado um ensaio com mutantes rty do ecotipo Columbia, que produzem grande quantidade de
raízes adventícias; todavia, o mutante não se prestou ao sistema hidropônico pelo pequeno
crescimento e rápida senescência das folhas após excisão. Esse mesmo mutante foi utilizado no
sistema de plântulas estioladas em uma comparação com outros conhecidos superprodutores de
raízes adventícias (sur1-3 e atr4), obtendo um desempenho intermediário, entre o tipo selvagem
(Col WT) e os citados mutantes. Outro mutante testado foi o chs, defectivo em chalcona sintase,
enzima chave da rota de síntese dos flavonóides. Visto que esse grupo de compostos fenólicos atua
como moduladores do metabolismo e transporte de auxinas, acaba tendo um papel regulatório na
rizogênese adventícia (De Klerk et al., 1999). No presente trabalho, esses mutantes obtiveram um
desempenho mais pobre no desenvolvimento de raízes do que o tipo selvagem (no sistema de
plântulas estioladas), e, contrariando dados já publicados com outra espécie (Martínez Pastur et al.,
2003), não houve diferença relevante nos resultados da aplicação de diferentes flavonóides
(quercitina, rutina e naringenina).
O trabalho desta tese vem a contribuir para o conhecimento fisiológico do enraizamento
adventício e mostrar a ocorrência de respostas distintas entre os sistemas experimentais
examinados, apontando para a necessidade de comparar de forma cuidadosa resultados obtidos
com esta espécie modelo mesmo sob tratamentos similares. Espera-se que o estabelecimento e
análise comparativa de estratégias experimentais para o estudo da rizogênese adventícia aqui
descritos, utilizando esse modelo genético, contribuam para a formação de uma matriz comum
91
consolidada para nortear futuros trabalhos investigando esse importante processo de
desenvolvimento vegetal.
92
POSSÍVEIS PERSPECTIVAS DE CONTINUAÇÃO
A presente tese teve um enfoque generalista, com o objetivo de realizar um trabalho
essencialmente metodológico, ou seja, cuja natureza foi o desenvolvimento de ferramentas para o
uso de trabalhos futuros. Sendo assim, as perspectivas de continuação são inúmeras. Diversos
aspectos do enraizamento adventício pode ser estudados com o auxílio dos sistemas e marcadores
aqui vistos. Todavia podem ser citadas algumas possibilidades:
• A investigação do efeito de flavonóides de diferentes naturezas químicas no
enraizamento.
• O uso de mutantes na sinalização ou percepção de diferentes grupos fenólicos.
• A real participação do etileno no sistema de enraizamento de plântulas estioladas,
usando-se capturadores ou inibidores de ação.
• O isolamento e caracterização das peroxidases com atividade aumentada durante os
vários pontos da rizogênese.
93
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959, 1986.
98
ANEXO 1
Óxido Nítrico e Enraizamento Adventício de arabidopsis
O Óxido Nítrico (NO) é uma pequena molécula volátil cuja função como hormônio
animal foi recentemente descoberta e uma grande quantidade de trabalhos foi publicada desde
então, como, por exemplo, Seilicovich et al. (1995). Estudos foram realizados para tentar
correlacionar a presença do NO e sua função em rotas evolutivamente similares entre animais e
vegetais. Chegou-se a descobrir várias funções desse gás em plantas: atuação em conjunto com
ácido abscísico no controle de abertura estomática e outras interações com fitormônios, respostas a
patógenos, morte celular programada, produção de fitoalexinas (Lamattina et al., 2003); de-
estiolamento e aumento no conteúdo de clorofila (Neill et al., 2003 e referências); proteção contra
estresse por metais pesados (Hsu and Kao, 2004).
Uma série de 3 artigos publicados entre 2002 e 2004 (Pagnussat et al. 2002; Pagnussat et
al., 2003; Pagnussat et al., 2004) apontam para um papel fundamental do NO como sinalizador do
processo de enraizamento adventício, atuando à jusante das auxinas. Utilizou-se como modelo
plântulas de pepino com as raízes excisadas, expostas a soluções aquosas com os fatores teste, em
placas de petri. Usando-se vários elementos da cascata de sinalização, como doadores de NO (SNP
– nitroprussiato de sódio; e SNAP - S-nitroso N-acetil penicilamina) e inibidor de ação de NO
(cPTIO - carboxy-2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazolinone-3-oxide-1-oxyl), levantou-se a
essencialidade do NO no modelo estudado; em um segundo momento, inibidores alcaloídicos de
enzimas levaram à percepção de que a ação do NO se dava via GMPc (guanosil monofosfato
cíclico) e MAPKs (quinases ativadas por mitógenos), tipicamente presentes na sinalização de
eventos intracelulares.
Contudo, pouco se publicou a esse respeito depois disso. Coulsson (2004) reafirmou a
mediação por GMPc e trouxe à luz a importância dos níveis de cálcio citosólico, no enraizamento
de Commelina communis. Xu et al. (2006) relataram ter obtido, em Phaseolus radiatus L. cv.
Mingguang, com a aplicação de monóxido de carbono (CO) via doador (hematina), efeito
semelhante ao obtido com NO nos trabalhos de Pagnussat et al., e foi proposta uma via alternativa
de rizogênese adventícia que também incluiria o NO (Xuan et al., 2008). Campos-Cuevas et al.
(2008) demonstraram uma melhora no enraizamento de plântulas de arabidopsis através da
aplicação de alcamidas (uma nova classe de compostos lipídicos relacionados com os
99
endocanabinóides de animais), e essas substâncias também induziam o aumento da concentração
local de óxido nítrico.
Para verificar o efeito do óxido nítrico sobre o enraizamento adventício, inúmeros
experimentos foram realizados, utilizando-se a aplicação de doadores (SNP e SNAP) e inibidor
(cPTIO), em uma abordagem farmacológica (semelhante aos trabalhos realizados). Foram
utilizadas concentrações similares aos trabalhos de Pagnussat et al.
Primeiramente, folhas de A. thaliana ecotipo Columbia foram colocadas em sistema
hidropônico, em presença de SNP ou AIA, havendo ainda um controle negativo. Esperava-se que o
resultado das folhas em SNP fosse semelhante ao das folhas em auxina, porém não houve
enraizamento (as folhas em auxina enraizaram). A seguir, usou-se um sistema em placas de petri e
folha de papel filtro, e o resultado foi idêntico ao anterior. Foi realizado o mesmo experimento,
sem o papel, mas o resultado foi o mesmo. Experimentos de dose-dependência com SNP com
folhas em hidroponia mostrou efeito tóxico do doador, que aumentava com a elevação da
concentração (0, 1, 10, 100 e 1000 µM); sabendo-se que o SNP é um cianeto inorgânico, repetiu-se
o experimento em placas de petri, com outro doador (SNAP), porém os resultados foram
novamente negativos.
Foram feitos testes com imersão do caule de plântulas estioladas, usando-se combinações
dos doadores, AIA e inibidor (cPTIO), com várias repetições. Novamente, houve resultados
notáveis apenas com a aplicação de AIA, e não houve inibição com o uso de cPTIO, o que deveria
ocorrer se for considerado que o NO age à jusante das auxinas na sinalização do enraizamento.
Esse conjunto de resultados negativos suscita dúvidas quanto à universalidade das vias de
sinalização propostas pelos referidos trabalhos, ao menos com relação aos sistemas utilizados em
A. thaliana.
100
ANEXO 2
Outras atividades acadêmicas durante o período do doutorado
O produto principal da realização de um doutorado configura-se na tese, a qual tem sido
realizada nos PPGs em forma de artigos, para facilitar a publicação posterior ou, no caso da
publicação anterior à defesa, para facilitar a confecção do manuscrito final.
No entanto, outras atividades de interesse científico foram realizadas no decorrer do
período de tese, concomitantemente, sendo relevante aqui sua inclusão como uma contraprestação
adicional ao financiamento (bolsa de doutorado – CNPq) condicionado à dedicação exclusiva (em
especial de alguns trabalhos iniciados anteriormente ao período de validade da bolsa).
2006: Publicação do artigo: CORREA, L. da R. Relação entre o critério socioeconômico
e parâmetros ecológicos relativos à arborização viária de Canoas, Brasil. Pesquisas. Botânica, São
Leopoldo, v. 57, p. 303-318, 2006.
2006 e 2007: Docência em ensino superior, nas disciplinas de Introdução à Fisiologia
Vegetal (Biologia) e Fisiologia Vegetal (Agronomia), por contrato temporário, como professor
substituto. Nesse caso foi percebida remuneração extra à bolsa, hipótese essa prevista pelo CNPq.
2006 e 2007: Atuação como consultor ad hoc na revisão de 2 artigos da revista Ciência
Florestal.
2007 e 2008: Participação em 3 bancas de avaliação no XIX Salão de Iniciação Científica
– UFRGS.
2008: Publicação do artigo: CORREA, L. da R.; SOARES, G. L. G.; FETT NETO, A. G.
Allelopathic potential of Psychotria leiocarpa, a dominant understorey species of subtropical
forests. South African Journal of Botany.
2005-2008: Publicação de 9 resumos em congressos
2008: Elaboração de capítulo de livro: RUEDELL, CM ; SCHWAMBACH, J ,
CORREA, L da R, FETT-NETO AG. STRATEGIES FOR ADVENTITIOUS ROOTING IN
CLONAL PROPAGATION OF EUCALYPTUS (In Press). In: Niemi, K; Scagel, C.. (Org.).
Adventitious root formation in forest trees and woody horticultural crops-from genes to
applications. New Delhi: Research SignPost, 2008, v. , p. -.
2009: Elaboração e submissão de artigo ao South African Journal of Botany:
101
RODRIGUES, K. C. da S.; CORREA, L. da R. Allelopathic activity of Myrciaria cuspidata Berg.
102
ANEXO 3
Comprovantes de publicações extra-tese de trabalhos realizados concomitantemente com o
doutorado
103
104
Data: Fri, 12 Dec 2008 15:14:37 +0530
De: admin <admi[email protected]om>
Reponder para: admin <admin@rsflash.com>
Assunto: Rs/Niemi/17
Para: fettneto@cbiot.ufrgs.br
RESEARCH SIGNPOST
December 12, 2008
Ref. No: RS/Niemi/17
Dear Dr. Arthur G. Fett-Neto,
Enclosed please find the page proof of your manuscript entitled
"Strategies for adventitious rooting in clonal propagation of Eucalyptus".
Please go through the same very carefully and point out the corrections if any,
quoting the page, paragraph and line numbers on a separate page.
Kindly note that corrections if any are to be intimated us within seven
days on receipt of the galley proof. This is to avoid delay in printing and
publication of the book.
Thanking you and looking forward to receiving the corrected proof here
soon. Please do acknowledge the receipt of this mail.
Thanking you and awaiting your response,
Sincerely Yours,
A. Gayathri
Publication Manager.
105
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