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RODRIGO OCTAVIO DE PAIVA QUEIROZ FILHO
ANÁLISE GENÉTICA EM PSITACÍDEOS DE CATIVEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação do Departamento de Biologia
Geral do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre
em Genética.
Orientador: Prof. Dr. Fabrício Rodrigues dos Santos
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Biologia Geral
Belo Horizonte, MG
Junho/2008
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AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer às seguintes pessoas que contribuíram direta ou indiretamente
para a realização deste trabalho:
- ao amigo Paulo Machado, da Fazenda Vale Verde, quem me forneceu as amostras de sangue
utilizadas no trabalho;
- ao Fabrício, meu orientador e, acima disso, meu amigo, por ter me aceitado como aluno, me
ensinado e me incentivado, principalmente durante as várias ocasiões em que achei que não ia
conseguir;
- a todos que me ajudaram, com ensinamentos e treinamento, na realização dos trabalhos
práticos (“bancada”): Dani, Ricardo, Letícia, Josimar, Sarah, Débora e, em especial, Sibelle e
Camila;
- ao Rodrigo Redondo, pela ajuda e ensinamentos na realização de análises e interpretação de
resultados;
- ao amigo Anderson, que me ajudou, ensinou e realizou grande parte dos trabalhos práticos.
Ajudou-me também com ensinamentos a respeito das análises e do uso de programas. Sem
sua ajuda eu não teria conseguido concluir esta dissertação;
- a todos os integrantes do LBEM, amigos que, mesmo sem saber, me ajudaram muito, já que
eu não tive tarefas diárias sob minha responsabilidade;
- aos seguintes professores: Bernadete e Cleusa, pelos ensinamentos, aulas, conselhos e pela
amizade demonstrada; Evanguedes, por ter me apoiado e ajudado a refletir melhor em um
momento em que eu dava como certa minha desistência; Mônica pela amizade e conselhos (e
por ouvir as infinitas “lamúrias” no corredor); Walderez, por ter me apresentado ao curso;
- à Professora Cristina Miyaki, da USP de São Paulo, SP, pelo apoio prestado e discussão de
dados sobre as duas espécies de Amazona estudadas;
- à Marina, pela amizade e boa-vontade demonstrada na solução dos infinitos “pepinos”
surgidos durante o curso;
- a todos colegas do SETEC, Polícia Federal, pelo apoio e, em especial às seguintes pessoas:
Arnaldo, pela ajuda no uso do computador; colegas do grupo de “Diversos/Meio Ambiente”,
Gomide, Marculino (que tanto me ajudou com o Photoshop), Cardoso, Mayrink, Gaspa,
Cerello e Joãozinho, por, tantas vezes, terem “segurado as pontas” enquanto eu me ausentava
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para me dedicar ao Mestrado; aos chefes que tive durante o curso: Magela, Sávio, Lúcio e
Gyovany, por terem autorizado minha ausência durante as inúmeras vezes em que precisei;
- aos meus pais, por terem me ensinado a importância do estudo.
5
À Karla e à Flávia, sem as quais nada faria sentido.
6
ÍNDICE
Agradecimentos ............................................................................................................... 3
Índice ................................................................................................................................ 6
RESUMO: ........................................................................................................................ 8
LISTA DE FIGURAS:......................................................................................................9
LISTA DE TABELAS:.....................................................................................................9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS: ................................................................... 10
INTRODUÇÃO: ............................................................................................................ 11
I – O tráfico de animais silvestres: ...................................................................................... 11
II – Os psitacídeos brasileiros: ............................................................................................. 15
III – O gênero Amazona: ...................................................................................................... 17
III.1 – Amazona aestiva: ................................................................................................................... 18
III.2 – Amazona ochrocephala .......................................................................................................... 19
IV – DNA mitocondrial: ....................................................................................................... 21
OBJETIVOS: ................................................................................................................. 23
MATERIAL E MÉTODOS: ........................................................................................ 233
Origem do material biológico: ............................................................................................. 23
Extração do DNA: ................................................................................................................. 24
Amplificação e seqüenciamento do DNA: ........................................................................... 24
Análise dos dados: ................................................................................................................. 24
RESULTADOS: ............................................................................................................. 25
Seqüências de ND2: .............................................................................................................. 25
Filogenia e filogeografia: ...................................................................................................... 26
AMOVA:................................................................................................................................ 28
DISCUSSÃO: ................................................................................................................. 32
Filogenia e filogeografia das espécies do gênero Amazona ............................................... 32
Diversidade de haplótipos de DNAmt e discriminação de linhagens ............................... 36
7
CONCLUSÃO: ............................................................................................................... 38
REFERÊNCIAS: ........................................................................................................... 40
ANEXO 1 ............................................................................................................................... 43
8
RESUMO:
A atividade de criação de espécies nativas brasileiras em cativeiro para fins de
comercialização foi legalizada há menos de uma década. Entre as espécies de aves mais
procuradas como mascotes destacam-se os psitacídeos do gênero Amazona, pela sua beleza,
inteligência e capacidade de imitação da fala humana e outros sons. Os papagaios Amazona
aestiva e Amazona ochrocephala são duas espécies neotropicais da família Psittacidae
proximamente relacionadas, amplamente criadas como mascotes em todo o Brasil. Enquanto a
primeira restringe-se à região central da América do Sul, em hábitats mais secos e abertos, a
segunda distribui-se do México à bacia amazônica, habitando áreas florestadas. Ambas as
espécies compartilham uma pequena área de distribuição, ao sul da Amazônia (oeste do Brasil
e nordeste da Bolívia, Ribas, 2007). Neste trabalho, foi seqüenciada parte do gene ND2 do
DNA mitocondrial (DNAmt) de 46 espécimes de Amazona aestiva, todos de cativeiro. As
seqüências obtidas foram analisadas conjuntamente com outras, do mesmo gene, obtidas na
literatura, de A. aestiva e A. ochrocephala para: i) avaliar as relações entre as populações das
duas espécies; ii) avaliar o potencial de informação deste gene como um marcador de
linhagem para detecção do local de origem dos indivíduos parentais (matrizes que
normalmente vieram da natureza) e iii) o potencial de discriminação entre indivíduos de
cativeiro (F1 ou >F1) e silvestres de A. aestiva/ochrocephala. Tal informação pode ser de
grande utilidade na fiscalização dos criatórios de aves silvestres e no combate ao tráfico ilegal
desses animais. Os resultados de comparação entre espécies apontam na direção de estudos
anteriores, em que os haplótipos ND2 de A. aestiva agrupam-se indiferenciados de haplótipos
de A. ochrocephala. Portanto, trata-se aparentemente de duas espécies muito próximas, entre
as quais possa haver alguma hibridização, ou, de forma alternativa, seriam duas variedades de
uma mesma espécie. Independente de qual seja a melhor explicação para o fenômeno
observado, o uso da informação do DNAmt ao complexo A. aestiva/ochrocephala possui uma
aplicação limitada, não permitindo, com o conhecimento disponível de suas populações
naturais, uma discriminação genética precisa da origem geográfica de determinado exemplar.
No entanto, a grande diversidade existente entre indivíduos A. aestiva/ochrocephala,
encontrada principalmente entre os animais cativos, permite uma discriminação suficiente
para caracterizar geneticamente, indivíduos procedentes de criatórios, como uma forma de
inibição do tráfico de animais silvestres.
9
LISTA DE FIGURAS:
Fig. 01: Distribuição geográfica das subespécies de A.ochrocephala sul e centro-americanas.
................................................................................................................................................. 20
Fig. 02: Distribuição sul-americana das subespécies de A.ochrocephala e A.aestiva.
................................................................................................................................................. 20
Fig. 03: “Network” construída com os 30 haplótipos analisados, com método Median Joining.
................................................................................................................................................. 27
Fig. 04: Árvore Neighbor-Joining, com método de distância K2p, mostrando os
agrupamentos entre os 35 haplótipos analisados. .................................................................. 29
LISTA DE TABELAS:
Tab. 01: Índices de diversidade de A.aestiva, A.ochrocephala e suas subespécies. .............. 26
Tab. 02: AMOVA entre A.aestiva e A.ochrocephala. ........................................................... 28
Tab. 03: AMOVA entre A.aestiva aestiva e A.aestiva xanthopteryx. ................................... 30
Tab. 04: AMOVA entre A.ochrocephala nattereri, A.ochrocephala ochrocephala e
A.ochrocephala xantholaema. ................................................................................................ 30
Tab. 05: AMOVA entre todas as subespécies agrupadas. ..................................................... 30
Tab. 06: AMOVA entre as subespécies agrupadas por espécie. .......................................... 31
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS:
AOU: The American Ornithologists’ Union
CBRO: Comitê Brasileiro de Registros Ornitológicos
CETAS: Centro de Triagem de Animais Silvestres
CGEN: Conselho de Gestão do Patrimônio Genético
CITES: Convention on International Trade of Endangered Species of Wild Flora and Fauna
IBAMA: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
IUCN: International Union for the Conservation of Nature and Natural Resources
ICB: Instituto de Ciências Biológicas da UFMG
LBEM: Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular
MMA: Ministério do Meio Ambiente
ND2: NADH desidrogenase subunidade 2
PCR: reação em cadeia da polimerase
RENCTAS: Rede Nacional de Combate ao Tráfico de Animais Silvestres
UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais
11
INTRODUÇÃO:
I – O tráfico de animais silvestres:
O Brasil encontra-se entre os países de maior riqueza faunística no mundo, ocupando o
primeiro lugar em número total de espécies (RENCTAS 2001). Em se tratando de aves, com
1801 espécies (CBRO 2007), ocupa a terceira posição no mundo, sendo o país mais rico do
mundo em espécies de psitacídeos (Sick 1997), com mais de 80 espécies (CBRO 2007).
No entanto, na região neotropical, o Brasil é o país com o maior número de espécies
de aves ameaçadas (Marini e Garcia 2005). Cerca de 10% das espécies de aves encontram-se
hoje ameaçadas no Brasil (RENCTAS 2001, Marini e Garcia 2005). A caça (para subsistência
e comércio ilegal) é a segunda maior ameaça à fauna silvestre brasileira, após a perda de
hábitat (RENCTAS 2001). O comércio ilegal de vida silvestre (incluindo a fauna e seus
produtos) movimenta, no mundo, de 10 a 20 bilhões de dólares por ano, sendo a terceira
maior atividade ilícita no mundo, atrás dos tráficos de armas e drogas, e da qual o Brasil
participa com, aproximadamente, 5 a 10% do total mundial (RENCTAS 2001). Cerca de 12
milhões de animais são traficados anualmente no Brasil (outras estimativas apontam para um
número em torno de 38 milhões de animais retirados anualmente da natureza – RENCTAS
2001), associando-se a este problema a soltura em condições inadequadas (p. ex.: locais
impróprios; condições sanitárias impróprias) dos animais apreendidos (Marini e Garcia 2005).
Em geral, os animais traficados sofrem maus tratos, com exceção dos mais raros, por serem
valiosos. Das aves capturadas, aproximadamente 80% morrem. Estima-se que apenas 0,45%
dos animais envolvidos no tráfico são objetos de apreensão. Obviamente, este número vai
depender, em parte, da intensidade da atividade de fiscalização nas diferentes regiões do país
(RENCTAS, 2001).
Segundo o Primeiro Relatório Nacional sobre o Tráfico de Fauna Silvestre (2001),
elaborado pela Rede Nacional de Combate ao Tráfico de Animais Silvestres (RENCTAS), o
comércio ilegal de fauna no Brasil apresenta-se em quatro modalidades básicas, quanto às
espécies traficadas e ao destino que elas têm quando chegam aos mercados internacionais:
a) animais para colecionadores: inclui, principalmente, espécies ameaçadas, devido ao
seu maior valor, tais como arara-azul-de-lear, papagaio-de-cara-roxa, mico-leão-dourado,
jaguatirica, etc.;
12
b) animais para fins científicos: principalmente espécies que produzem substâncias
químicas utilizadas em pesquisas. Por exemplo: serpentes peçonhentas, aranhas, etc. O
tráfico, nesta categoria, denomina-se também biopirataria;
c) animais para serem mantidos como mascotes: esta categoria, segundo o relatório, é
a que mais incentiva o tráfico no Brasil. Pode incluir praticamente qualquer espécie e os
valores alcançados dependem principalmente da espécie traficada e da quantidade. Por
exemplo: jibóia, arara-vermelha, tucano-toco, etc.
d) produtos de fauna: principalmente peles, couros, penas, presas, etc., que são
utilizados como artigos da moda ou souvenir.
Entre os principais países “exportadores” de vida silvestre encontram-se o Brasil,
Peru, Argentina, Guiana, Venezuela, Paraguai, Bolívia, Colômbia, África do Sul, Zaire,
Tanzânia, Quênia, Senegal, Camarões, Madagascar, Índia, Vietnã, Malásia, Indonésia, China
e Rússia. Entre os maiores “consumidores” estão Estados Unidos (o maior), Alemanha,
Holanda, Bélgica, França, Inglaterra, Suíça, Grécia, Bulgária, Arábia Saudita e Japão. No
Brasil, os animais são provenientes, em sua maior parte, das regiões Norte, Nordeste e
Centro-Oeste, sendo escoados para as regiões Sul e Sudeste, especialmente para os estados do
Rio de Janeiro e São Paulo, onde são vendidos em feiras ou exportados (RENCTAS 2001). Os
comerciantes utilizam quatro categorias principais de fraudes para dar vazão aos espécimes
capturados: 1) contrabando, no qual o transporte dá-se entre fronteiras de países. Os
contrabandistas podem atuar em áreas de difícil patrulhamento, fazer-se passar por viajantes e
levar os animais junto à bagagem ou à própria roupa do corpo, ou mesmo utilizar-se de envio
pelo correio; 2) uso de documentos legais para acobertar produtos ilegais. Através deste
expediente pode haver divergência entre o número de indivíduos transportados e o declarado
no documento, divergência entre as espécies declaradas e as transportadas ou divergência
entre a origem do animal (p. ex.: animal capturado na natureza, mas declarado como nascido
em cativeiro); 3) uso de documentos falsos, fraudados ou alterados; 4) outras atividades
fraudulentas (RENCTAS, 2001).
Dentre as classes de animais comercializadas ilegalmente, as aves constituem a grande
maioria, respondendo por 82% das apreensões entre 1999 e 2000 (RENCTAS 2001). Do total
de animais apreendidos em 2005 (incluindo ovos e animais mortos), as aves responderam por
48% (Ibama 2005). Fazem parte deste comércio as aves vivas, couros, penas e ovos. A maior
parte das aves silvestres comercializadas no mundo é originária dos trópicos, onde há maior
riqueza de espécies. Os passeriformes são as aves mais capturadas e comercializadas no
mundo. No entanto, a maioria é originária de países africanos. Também no Brasil, os pássaros
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canoros são as aves mais encontradas em cativeiro, em parte, devido à antiga tradição do povo
brasileiro em manter em gaiolas esse tipo de animal. Atualmente, há no Brasil, inclusive,
associações e clubes de criadores de espécies canoras (RENCTAS, 2001).
Os psitacídeos, em virtude de sua capacidade de imitar a voz humana, além de sua
beleza, docilidade e inteligência, estão entre as aves mais procuradas como animais de
estimação no mundo e, por isto, entre as mais comercializadas ilegalmente. Apenas cerca de
5% dos psitacídeos encontrados no comércio provêm de criação em cativeiro, sendo o restante
retirado da natureza. Das apreensões do IBAMA entre 1999 e 2000, os psitacídeos ocuparam
o 3º lugar em número de animais, ficando atrás apenas dos passeriformes e dos
columbiformes (RENCTAS 2001). A família Psittacidae ocupa o 3º lugar, entre as aves, em
número de espécies listadas na Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção (www.mma.gov.br).
Dezesseis espécies encontram-se atualmente na lista oficial do IBAMA (www.ibama.gov.br).
Pelo menos duas espécies, a arara-azul-pequena e a ararinha-azul (Cyanopsitta spixii) são
consideradas extintas, em grande parte devido ao tráfico ilegal (Marini e Garcia 2005). Sick
(1997) aponta os seguintes números para o comércio de psitacídeos brasileiros: entre abril e
junho centenas de papagaios são transportados clandestinamente da Bahia para os mercados
do sul; em 1982, estima-se que saíram ilegalmente do Brasil 1000 indivíduos de A.
hyacinthinus. Em 1979 foram encontradas, com um único comerciante na Alemanha
Ocidental, 200 A. hyacinthinus, todas procedentes do Brasil; na Alemanha Ocidental foram
importados 7.438 A.aestiva, em 1980; em um único transporte, da Argentina para Londres e
Singapura, foram encontrados 600 A. aestiva xanthopteryx, em 1986; na década de 1920,
entre 3.000 e 6.000 aves do gênero Amazona (principalmente A. aestiva) foram negociadas,
além de 20.000 a 30.000 psitacídeos de cauda longa (araras, jandaias, etc.).
Dentre as principais conseqüências do tráfico (RENCTAS 2001), podem-se citar as de
caráter: a) sanitário: uma vez que os animais são comercializados ilegalmente, não estão
sujeitos a qualquer tipo de controle sanitário, podendo, assim, disseminar doenças graves a
criações domésticas e, mesmo, ao homem; b) econômico/social: seja pela movimentação de
grandes quantias à margem da lei e, portanto, “livres” de tributação, seja pela redução dos
serviços prestados pela fauna, retirada da natureza, tais como controle de pragas, incentivo ao
turismo ecológico, etc; c) ecológico: são causadoras de impacto ambiental tanto a retirada de
espécimes da natureza quanto sua (re)introdução sem os devidos critérios científicos e
controles (por exemplo, reintrodução de espécimes sem controle sanitário; introdução em
áreas sem condições de abrigá-las ou fora de sua área natural de ocorrência).
14
Segundo Sick (1997), para se obterem os números encontrados no comércio
clandestino de psitacídeos (o que é aplicável a outros grupos de animais), um número muito
maior de aves é capturado, pois muitas perecem. Considere ainda que muitos ovos e filhotes
são perdidos com a retirada dos ninhos ou captura dos pais e, freqüentemente, uma árvore
deve ser derrubada, o que restringe ainda mais os locais favoráveis à reprodução.
O destino da maior parte dos animais silvestres apreendidos no Brasil é a soltura: 78%
em 1999 e 2000, segundo IBAMA (RENCTAS 2001) (o panorama é um tanto diferente,
segundo o “Diagnóstico do Tráfico de Animais Silvestres na Mata Atlântica – Corredores
Central e Serra do Mar”, produzido pela RENCTAS (2007). Segundo os dados informados,
nos estados de MG, SP, RJ, ES e BA, o principal destino das apreensões são os CETAS –
Centros de Triagem de Animais Silvestres, aparecendo a soltura em 2º lugar). A soltura é
prevista pela legislação brasileira. Porém, para que seja realizada de maneira criteriosa, é
necessário que se cumpram certas etapas, a seguir listadas (RENCTAS, 2001):
- conhecer o local de origem ou de ocorrência do animal;
- identificar o animal quanto à espécie;
- realizar marcação adequada;
- estabelecer a capacidade de suporte da área onde será realizada a soltura;
- liberar o animal em seu hábitat, respeitando suas condições ecológicas;
- acompanhar a evolução do animal e sua adaptação após a soltura;
- cumprir todas as etapas, respeitando a legislação vigente.
As solturas realizadas de forma não-criteriosa podem causar impacto ambiental. Além
do risco da introdução de animais portadores de doenças infecto-contagiosas que podem
disseminar-se para o restante da população, há o risco de introdução de espécies exóticas ao
local em questão ou o risco de depressão exogâmica (Frankham et al., 2002). Segundo
RENCTAS (2007), as solturas realizadas no âmbito dos estados de MG, SP, RJ, ES e BA
(estados compreendidos no levantamento) são realizadas com pouquíssimo ou nenhum
critério.
A Lei 5.197/67 foi a primeira norma oficial de proteção à fauna silvestre brasileira,
tornando a caça, o comércio e a manutenção de animais silvestres em cativeiro atividades
ilegais (ressalta-se, no entanto, que o art. 6º dispõe que o poder público estimulará a
construção de criadouros com finalidades econômicas e industriais). Desde então, o país conta
com diversas normatizações relativas à fauna, inclusive determinando alguns critérios para a
soltura de animais em ambiente natural (Lei 9605/98, Decreto 3179/99) e regulamentando a
criação de animais silvestres em cativeiro (por exemplo, as Portarias sobre a instalação de
15
criatórios comerciais, conservacionistas e científicos). Entre os objetivos de tal
regulamentação, pode-se citar o de diminuir o impacto da captura, abate e comercialização
ilegal de espécies da fauna silvestre nacional (tráfico de animais), bem como o de fomentar a
criação com objetivos conservacionistas e científicos (www.ibama.gov.br).
Segundo o Diagnóstico da RENCTAS (2007), apesar de ainda tímidos, os resultados
que o Brasil alcançou no combate ao tráfico de animais têm merecido grande destaque no País
e junto à comunidade internacional. Entre eles, podemos citar a Campanha Internacional de
Combate ao Tráfico de Animais Silvestres, lançada em 2006 pelo Ministério das Relações
Exteriores, em conjunto com o Ministério do Meio Ambiente, e o trabalho de repressão que o
Ministério da Justiça vem realizando, através de sua divisão de combate aos delitos
ambientais da Polícia Federal. No entanto, pelo menos para os estados de MG, SP, RJ, ES e
BA (aos quais se refere o estudo), constata-se que os mesmos (talvez com exceção de MG)
dispõem de poucas informações quanto aos locais de capturas, rotas de tráfico e locais de
venda de animais (até mesmo a identificação das espécies capturadas apresenta dificuldades).
Do mesmo modo, o Diagnóstico ainda aponta que os órgãos (IBAMA, polícias, etc.) de
combate ao tráfico quase não se utilizam do trabalho de inteligência (investigação) para
nortear seus trabalhos, valendo-se mais de denúncias.
II – Os psitacídeos brasileiros:
A ordem Psittaciformes, composta pelas famílias Cacatuidae e Psittacidae (Collar
1997) compreende cerca de 350 espécies distribuídas em 84 gêneros, dos quais,
aproximadamente, 27% encontram-se ameaçados em graus variados (Tavares, Yamashita e
Miyaki 2004). Segundo Wright et al. (2001), a família Psittacidae está entre as mais
ameaçadas, entre as aves do mundo. Possui mais espécies ameaçadas do que qualquer outra
família de aves. Dentre os psitacídeos neotropicais, cerca de 31% das espécies encontram-se
sob risco de extinção em nível global. Sua distribuição inclui o sul da América do Norte,
Américas Central e do Sul, Caribe, África, ilhas nos oceanos Índico e Pacífico, região
australásica e sul da Ásia. A filogenia do grupo é ainda mal compreendida em quase todos os
níveis taxonômicos, bem como sua relação filogenética com as demais ordens de aves (Sick
1997; Tavares, Yamashita e Miyaki 2004).
A ordem Psittaciformes possui membros de aparência muito característica, facilmente
reconhecida, embora apresentem grande variação de tamanho: entre as espécies brasileiras, o
peso pode variar entre os 25 g de um tuim e o 1,5 Kg de uma arara. Com o bico alto e
16
recurvado, são chamados de aves de “bico redondo”. Os psitacídeos brasileiros, apesar da
grande variação em tamanho, apresentam aparência mais homogênea do que os australianos.
Apresentam, normalmente, a cabeça pesada, em relação ao restante do corpo, em parte devido
ao tamanho do bico, que apresenta grande mobilidade e potência muscular. A língua é grossa,
sensível e muito rica em papilas gustativas (Sick 1997). As pernas são muito curtas (Souza
2004) e o pé é zigodáctilo, com o 4º dedo deslocado para trás, junto ao hálux; os dedos
apresentam grande habilidade e são, muitas vezes, utilizados para segurar o alimento e levá-lo
ao bico (Sick 1997). Asas compridas e fortes; plumagem curta, dura e rica em pó; glândula
uropigiana atrofiada ou ausente. Os representantes brasileiros apresentam o verde como
coloração predominante. Estes não desenvolveram um topete, como nas cacatuas, mas
Deroptyus apresenta um cocar. A região perioftálmica tende a apresentar-se nua em extensão
variável, podendo alcançar toda a face (araras). Apresentam, em geral, pouco ou nenhum
dimorfismo sexual (há algumas supostas diferenças relatadas quanto à cor da íris, porte físico,
tamanho da cauda, coloração, etc.) (Sick 1997).
São conhecidos como aves “inteligentes”, aprendendo truques, fazendo uso de
instrumentos e conseguindo solucionar problemas, principalmente quando em cativeiro. A
“cerebralização” (peso dos hemisférios cerebrais/peso do tronco cerebral) de uma arara atinge
o valor de 28,07, sendo o mais alto entre as aves (Sick 1997). Normalmente são aves sociais e
ruidosas (Souza 2004). Apresentam intensa vocalização, podendo esta ser útil na identificação
taxonômica. O repertório pode ser rico, com realização de duetos entre o casal e a muito
conhecida disposição a imitar sons (Sick 1997).
A alimentação, realizada em árvores que escalam utilizando o bico como um terceiro
pé, ou no solo, inclui sementes de frutas, castanhas, cocos, brotos, flores, folhas tenras e,
segundo relatos, até mesmo moluscos, vermes e larvas de insetos (o Kea neozelandês, Nestor
notabilis, é sabidamente carnívoro). Atacam também plantações de milho, arroz, etc (Sick
1997). Também é conhecido o hábito dessas aves de freqüentar barreiros cuja argila (rica em
sais minerais), quando ingerida, ajuda a neutralizar toxinas presentes na alimentação (Sigrist
2006).
Vivem aos casais, que, segundo se sabe, permanecem juntos por toda a vida. O
período do ano em que se iniciam as atividades reprodutivas varia segundo a espécie, assim
como varia também a idade em que a espécie começa a se reproduzir (as maiores tendem a
iniciar a vida reprodutiva mais tarde – por exemplo, Amazona aos 3 ou 4 anos de idade). O
modo de copular dos psitacídeos neotropicais é distinto dos restantes, já que, nos primeiros, o
macho não monta a fêmea, mas, ao contrário, permanece a seu lado, apoiado em um só pé e
17
passando o outro por cima da fêmea, enquanto friccionam as cloacas. A nidificação dá-se em
ocos de árvores, pelos quais competem com outras aves. O número de ocos utilizáveis pode
constituir fator limitante a sua reprodução. Cupinzeiros e paredões rochosos também são
utilizados por algumas espécies, assim como buracos em rochas, no solo e ninhos de joão-de-
barro, etc. A caturrita, Myopsitta monachus, como exceção aos outros psitacídeos, constrói
seu ninho de gravetos junto aos ninhos de outros casais da mesma espécie. Os ovos, que
variam em número e tamanho segundo a espécie, são chocados, na maior parte das vezes, pela
fêmea, que é visitada e alimentada pelo macho. A extensão dos períodos de incubação e o
desenvolvimento dos filhotes até a saída do ninho, que costumam ser longos (Sigrist 2006),
também variam segundo a espécie. Os pais alimentam os filhotes regurgitando-lhes o
alimento no bico (Sick 1997).
Adultos, ovos e filhotes podem ser predados por macacos, carnívoros (p.ex.: irara),
serpentes, tucanos, gaviões, etc (Sick 1997).
Alguns autores sugerem, com base em alguns caracteres morfológicos e
comportamentais (p.ex.: a cópula apoiada em um só pé, pelos machos), que os psitacídeos do
Novo Mundo constituem grupo diverso do Velho Mundo, sendo os primeiros pertencentes à
tribo Arini (subfamília Psittacinae, família Psittacidae). A tribo Arini possui o maior número
de espécies da ordem (148 das 353). O território brasileiro conta com cerca de 83 espécies
distribuídas em 23 gêneros (CBRO 2007): Anodorhyncus (araras azuis), Cyanopsitta (ararinha
azul), Ara (araras), Orthopsittaca, Primolius e Diopsittaca (maracanãs), Guarouba
(ararajuba), Aratinga (jandaias), Pyrrhura (tiribas), Myiopsitta (caturrita), Forpus (tuim),
Brotogeris e Nannopsittaca (periquitos), Touit (apuins), Pionites (marianinhas), Gypopsitta e
Graydidascalus (curicas), Pionopsitta (cuiú-cuiú), Pionus (maritacas), Alipiopsitta e Amazona
(papagaios), Deroptyus (anacã) e Triclaria (sabiá-cica). Distribuem-se em quase todos os
biomas brasileiros, especialmente em florestas (Sigrist 2006). Destaca-se a Amazônia como
região do país com maior número de indivíduos e espécies de psitacídeos. As áreas ricas em
buritizais da região de Minas Gerais e adjacências também apresentam grande número de
araras, papagaios e outros psitacídeos (Sick 1997).
III – O gênero Amazona:
Os psitacídeos do gênero Amazona são popularmente conhecidos como papagaios.
Souza (2004) caracteriza-os morfologicamente como “bojudos, cauda curta e quadrada”. Já
Russello e Amato (2004) descrevem-nos como aves de tamanho médio a grande; bico forte e
18
pesado; cauda curta, arredondada; ceroma proeminente e nu; mandíbula superior com uma
saliência distinta; dimorfismo sexual discreto ou ausente; plumagem verde, em geral (há
exceções), variando de escura a verde-amarelado. Colorações variáveis na cabeça, peito,
coberteiras alares e penas de vôo são utilizadas para a identificação das espécies.
Ainda segundo Russello e Amato (2004), os papagaios estão entre as mais facilmente
identificáveis e desejadas aves do mundo. Sua plumagem colorida, bem como a capacidade
para “falar”, têm exercido atração nas pessoas, como “animais de estimação” por séculos e,
como conseqüência, contribuído para o atual status de animais ameaçados da maior parte das
espécies. As espécies do gênero estão entre as mais ameaçadas da ordem Psittaciformes
(Lopes et al. 2007). Das 33 espécies do gênero, no mundo, 16 encontram-se nas categorias
vulnerável, ameaçada ou criticamente ameaçada e duas outras (A. martinicana e A. violacea)
encontram-se extintas, segundo a Lista Vermelha da IUCN (IUCN 2007). Todas as espécies
estão listadas no Apêndice I ou II da CITES e 4 espécies constam da Lista Nacional das
Espécies da Fauna Brasileira Ameaçadas de Extinção (www.mma.gov.br).
As espécies distribuem-se do México à Argentina e Caribe, havendo altos níveis de
endemismos nas Antilhas. O real número de espécies varia conforme a interpretação que se dá
a certos grupos (como, por exemplo, os de “cabeça amarela”: se formado por uma única
espécie, A. ochrocephala, ou esta e mais A. auropalliata e A. oratrix) ou o reconhecimento de
espécies distintas em táxons normalmente considerados subespécies, em alguns casos. O
número pode, inclusive, vir a aumentar, à medida que se aprofundam as investigações nesses
determinados grupos, compostos por muitas subespécies (Russello e Amato 2004).
O gênero Amazona constitui, ainda, um grupo mal compreendido em termos
filogenéticos, pouco se sabendo sobre sua história evolutiva. O trabalho de Russello e Amato
(2004) indicou que talvez nem se trate de um grupo monofilético. Estudos moleculares
recentes indicam que a disposição taxonômica atual freqüentemente não reflete as relações
filogenéticas, tanto para este grupo, quanto para outros psitacídeos neotropicais (Ribas et al.
2007). Alguns trabalhos, realizados na tentativa de melhor elucidar as relações filogenéticas
dentro do gênero, incluem os de Russello e Amato (2004), Eberhard e Bermingham (2004) e
Ribas et al. (2007).
III.1 – Amazona aestiva:
A espécie Amazona aestiva, objeto deste trabalho, é popularmente conhecida pelos
nomes de papagaio-verdadeiro, papagaio-de-fronte-azul, papagaio-curau, papagaio-grego,
19
papagaio-comum, louro, etc (Sick 1997). Cresce até aproximadamente 37 cm. Sigrist (2006)
assim descreve a espécie: “É freqüentemente considerado um dos papagaios mais comuns no
Brasil Centro-oriental. Prefere áreas semi-abertas, bordas de florestas, capoeiras, cerrados,
matas secas, caatingas, matas de galeria, buritizais, savanas de cupim e cerradão. Também é
encontrado do Chaco ao Pantanal de Mato Grosso, assim como em cidades, parques e jardins.
É facilmente reconhecido pela fronte azulada, píleo e face amareladas. Ocorre no Brasil
Central, no Nordeste e em parte do Sudeste (Figura 01). Localmente comum, alimenta-se de
frutos e, possivelmente, de larvas e ninfas de insetos que procura sob a casca das árvores.
Desloca-se em grupos de 10 ou mais aves, ou aos casais. Nidifica em cupinzeiros terrestres ou
em ocos de árvores.” Sick (1997) descreve sua distribuição como indo “do Nordeste (Piauí,
Pernambuco, Bahia), pelo Brasil central (Minas Gerais, Goiás e Mato Grosso), ao Rio Grande
do Sul, Paraguai, norte da Argentina e Bolívia; ausente nas áreas litorâneas...”.
Ainda segundo Sick (1997), A. aestiva é o papagaio mais procurado como mascote,
sendo conhecido como o melhor “falador”. O autor aponta duas raças geográficas: A.a.
aestiva, com encontro da asa vermelho, no Brasil oriental, e A.a. xanthopteryx, com encontro,
coberteiras pequenas superiores e cabeça amarelas (testa azul), na Bolívia, Argentina e Brasil
ocidental (Figuras. 01 e 02).
A espécie está incluída no Anexo II da CITES (espécies que não são, necessariamente,
ameaçadas de extinção atualmente, mas que podem assim se tornar, a menos que seu
comércio seja estritamente controlado). Segundo a IUCN, não se encontra ameaçada
(categoria “Least Concern”).
III.2 – Amazona ochrocephala
Segundo Eberhard e Bermingham (2004), o denominado “complexo” Amazona
ochrocephala representa um grupo de interesse biogeográfico devido a sua ampla distribuição
neotropical, além do que sua taxonomia, em bases morfológicas, tem representado um
problema. O complexo inclui 11 subespécies reconhecidas, distribuídas do México à bacia
amazônica (Figura 01). As subespécies são identificadas com base em caracteres
morfológicos, tais como a extensão e posição da cor amarela na cabeça e nas coxas, a
coloração nos “ombros”, pigmentação do bico e dos pés e tamanho do corpo. No entanto, tais
caracteres podem variar significativamente, até mesmo entre indivíduos de mesma localidade.
Assim, alguns taxonomistas consideram todo o complexo como uma única espécie, A.
ochrocephala, com nove ou dez subespécies (Ribas et al. 2007), enquanto outros reconhecem
20
a existência de três (Eberhard e Bermingham 2004): os papagaios de “coroa-amarela”
(“Yellow-crowned Amazon”, A. ochrocephala, composta por A. o. ochrocephala, A. o.
xantholaema, A. o. nattereri e A. o. panamensis), os de “nuca-amarela” (“Yellow-naped
Amazon”, A. auropalliata, com três subespécies) e os de “cabeça-amarela” (“Yellow-headed
Amazon”, A. oratrix, com quatro subespécies).
Ainda segundo Eberhard e Bermingham (2004), tais aves são geralmente encontradas
abaixo de 750 m, habitando principalmente áreas florestadas de vários tipos. Na América do
Sul (onde o grupo é representado por A. o. ochrocephala, A. o. nattereri e A. o. xantholaema),
nenhuma descontinuidade é conhecida entre as distribuições de A. o. ochrocephala (leste da
Colômbia, Venezuela, Trinidad, Guianas e norte do Brasil) e A. o. nattereri (sul da Colômbia,
leste do Ecuador e Peru, Brasil ocidental e Bolívia setentrional). A. o. xantholaema é
encontrado na Ilha de Marajó, no Pará.
Como apontam Eberhard e Bermingham (2004) e Ribas et al. (2007), a taxonomia de
A. aestiva e A. ochrocephala, bem como a distinção entre as duas espécies, é feita com base
principalmente nas cores das plumagens da cabeça (o principal carácter que distingue uma
espécie da outra é a presença, em A. aestiva, de penas azuis na fronte) e do bico. A. aestiva
(assim como A. amazonica) é consistentemente listada próximo a A. ochrocephala em
taxonomias lineares (Eberhard e Bermingham 2004). Nos estudos moleculares envolvendo as
duas espécies, realizados por Russello e Amato (2004), Eberhard e Bermingham (2004), e
Ribas et al. (2004), haplótipos de A. aestiva aparecem no interior de clados de A.
ochrocephala, indicando que as duas espécies são proximamente relacionadas ou que existe
alguma confusão taxonômica.
Fig.01: distribuição geográfica das subespécies de
A.ochrocephala sul e centro-americanas. A distribuição de
A.aestiva é mostrada pela linha pontilhada (Fonte: Eberhard
& Bermingham 2004).
Fig.02: Distribuição sul-americana das subespécies de
A.ochrocephala (linha cinza) e A.aestiva (linha preta),
adaptado de Ribas et al. 2007. IM: Ilha de Marajó
21
IV – DNA mitocondrial:
Amplificações por PCR de DNA mitocondrial, nuclear, ribossomal e de cloroplasto
podem ser utilizadas para se realizarem análises de estrutura metapopulacional, de eventos de
hibridização e delineação de espécies, subespécies e raças, os quais podem auxiliar na
determinação de prioridades em relação à conservação. Por exemplo, o esclarecimento de
determinada taxonomia pode chamar maior ou menor atenção para um referido táxon,
resultando na repriorização de esforços conservativos. De modo análogo, a compreensão de
níveis relativos de diferenciação intra e interpopulacionais pode ajudar na focalização de
esforços em populações específicas, necessitadas de recuperação (Haig 1998). Estudos
filogeográficos utilizam seqüências de DNA, realizando análise de suas variações entre
indivíduos através da área de distribuição de uma espécie. Isso permite a reconstrução de
genealogias moleculares, cujas relações espaciais podem ser dispostas geograficamente e
analisadas para se deduzir a história evolutiva de populações, subespécies e espécies
(Emerson e Hewitt 2005).
A filogeografia lida com a filogenia de linhagens ou haplótipos e sua distribuição
espacial e pode ser feita com base em análises de seqüências de DNA mitocondrial (DNAmt).
Tais estudos incorporam a análise da distribuição espacial de linhagens intraespecíficas para
reconstrução da história natural das espécies (Avise et al. 1987).
Emerson e Hewitt (2005) afirmam: “a filogeografia animal é dominada pelo DNAmt,
enquanto a filogeografia vegetal é denominada pelo DNA de cloroplastos”. O DNAmt de
vertebrados é uma molécula circular simples (16-20 Kb), que apresenta alta taxa evolutiva se
comparada ao DNA nuclear e herança materna, sem recombinação, favorecendo seu uso em
estudos microevolutivos (Avise et al. 1987). Tem sido satisfatoriamente utilizado para inferir
a filogeografia de muitas espécies de vertebrados, incluindo psitacídeos, possibilitando
correlacionar os achados com eventos históricos (Russello e Amato 2004; Eberhard e
Bermingham 2004 e 2005; Ribas et al. 2006, Ribas et al. 2007). Seqüências mitocondriais
podem ser usadas para estabelecer associação entre processos microevolutivos (ex.: mutação,
deriva genética) e filogenética e macroevolução. Além disso, o DNAmt apresenta algumas
características peculiares, tais como: tamanho reduzido, herança materna, com ausência ou
freqüência mínima de recombinações, tornando mais diretas as reconstruções filogenéticas;
taxa de evolução (1 a 10 vezes) superior à do DNA nuclear, apresentando extensa variação
22
intraespecífica; maior facilidade de estudo e fácil isolamento, por estar presente nas células
em múltiplas cópias. O DNA nuclear, além de apresentar uma taxa de evolução mais lenta que
o mitocondrial, associa-se a um maior tamanho efetivo populacional, significando um tempo
maior de coalescência para alelos de locos nucleares do que os de mitocondriais, o que faz do
DNAmt um melhor instrumento para captar a estrutura populacional, caso esta exista. Tais
características tornam o DNAmt não apenas uma ferramenta apropriada para estudos
genéticos, mas também uma importante ponte de ligação entre a genética de populações e a
filogenia (Avise et al. 1987).
Apesar das vantagens, o DNAmt apresenta algumas limitações (Avise et al. 1987) em
sua utilização como ferramenta molecular, que incluem, entre outras, a homoplasia e
problemas com a escala taxonômica abordada pela análise. A homoplasia do mtDNA é
atribuída à substituição recorrente de bases em alguns sítios, com maior freqüência de
mutação. A escala de abordagem pode apresentar-se problemática em dois aspectos: a)
dificuldade em comparar grupos mais distantes, já que substituições sempre irão ocorrer
rapidamente nos sítios mais sujeitos a elas, até um ponto a partir do qual as mudanças passam
a acumular-se mais lentamente, e b) dificuldade em comparar grupos com divergência
recente, já que boa parte das diferenças observadas hoje no DNAmt já devia estar presente
antes da separação das populações, sendo portanto um reflexo do polimorfismo ancestral.
Quando se trata de seqüenciar apenas um gene mitocondrial, como no presente
trabalho, Sorenson (2003) recomenda que se utilize o gene ND2 (NADH desidrogenase,
subunidade 2). Segundo o autor, este gene, em termos de seqüência de aminoácidos é o 3º
mais variável, atrás apenas de ATPase 8, que é muito curto (~165 – 168 pb) e assim fornece
relativamente pouca informação, e ND6, que também é relativamente curto (~519 – 522 pb) e
mais difícil de amplificar e seqüenciar. Em contraste, o gene ND2 completo pode ser
amplificado, seja em uma ou duas partes, com primers universais para aves. Em Amazona, o
ND2 apresenta 1041 pb (Eberhard e Bermingham 2004).
No presente trabalho, realizamos o seqüenciamento da região ND2 (NADH
desidrogenase 2) do DNAmt de 46 exemplares de Amazona aestiva mantidos em cativeiro,
em um criatório comercial localizado na região metropolitana de Belo Horizonte/MG
(Fazenda Vale-Verde, município de Betim/MG). As seqüências obtidas foram então
analisadas juntamente com outras, de A.aestiva e A.ochrocephala, encontradas na literatura e
depositadas no GenBank.
23
OBJETIVOS:
Avaliar o potencial de discriminação do gene ND2 como marcador das linhagens
maternas, como instrumento complementar para certificação de animais (F1 ou >F1
das mães de cativeiro) vendidos no mercado.
Avaliar o potencial do gene ND2 como ferramenta empregada na discriminação do
local de origem dos animais parentais mantidos em cativeiro.
Verificar a afinidade genética entre todos animais das das espécies Amazona aestiva e
A. ochrocephala, cuja taxonomia é complexa.
Auxiliar no futuro esclarecimento, mediante a realização de novos e mais abrangentes
estudos, das relações filogenéticas entre as populações dessas duas espécies.
Ajudar no planejamento de futuras ações de conservação ex-situ que venham a
envolver esse grupo de aves.
Subsidiar o desenvolvimento de ferramentas que facilitem a identificação de
indivíduos dessas espécies, que seria de grande utilidade em medidas de combate ao
tráfico bem como em planejamentos de solturas.
MATERIAL E MÉTODOS:
Origem do material biológico:
O material analisado constitui-se de amostras de sangue colhidas de 46 espécimes de
Amazona aestiva (papagaio-verdadeiro, sendo 2 indivíduos da subespécie A.aestiva
xanthopterix e o restante A.aestiva aestiva) mantidos em cativeiro no Parque Ecológico Vale
Verde – um criatório comercial registrado no IBAMA e localizado no município de Betim
(região metropolitana de Belo Horizonte/MG). O criatório possui representantes de várias
espécies de aves, principalmente psitacídeos, da fauna nacional e exótica. Todas as aves são
anilhadas, o que permite a manutenção de registros individuais das aves. Os animais
utilizados no estudo são matrizes que, por sua vez, são, na maior parte, oriundos da natureza,
produtos de apreensão da fiscalização ambiental. No entanto, a maior parte destes animais de
cativeiro não possui registro do local de origem geográfica. O laboratório na UFMG (LBEM)
24
é fiel depositário do patrimônio genético brasileiro credenciado pelo CGEN/MMA, onde as
amostras de DNA foram depositadas.
Extração do DNA:
O DNA genômico total foi extraído das respectivas amostras de sangue coletadas
utilizando-se o método fenol-clorofórmio (Sambrook et al.1989). As amostras de DNA
extraído ficaram depositadas/armazenadas no banco de DNA do LBEM (ICB/UFMG) em
congelador a –20°C.
Amplificação e seqüenciamento do DNA:
No presente estudo foram seqüenciadas as regiões ND2 (NADH desidrogenase 2) do
DNA mitocondrial das aves amostradas. Para isto foram feitas reações de PCR (reação em
cadeia da polimerase) utilizando-se iniciadores (primers) específicos para amplificação destas
regiões. O gene completo do ND2 foi amplificado (1041 pb) com os iniciadores específicos
(Sorenson 2003): H6313 (ACT CTT RTT TAA GGC TTT GAA GGC) e L5216 (GGC CCA
TAC CCC GRA AAT G).
A reação de PCR foi realizada nas seguintes condições: 94ºC 2 min, 35 ciclos de 94ºC
30s, 60ºC 40s, 72ºC 2 min e uma extensão final de 10 min a 72ºC. As reações tinham um
volume total de 12,5 μL contendo 1X de tampão com 1.5 mM MgCl2 (Phoneutria), 0,5 U de
Taq polimerase (Phoneutria), 200 μM de dNTPs, 0,5 μM de cada iniciador e 2 μL de DNA
genômico (~ 40 ng). Os amplicons foram purificados por precipitação em PEG (20%
polietilenoglicol 8000, 2,5 M NaCl) seguido de lavagens com etanol 80% e resuspensos em
água MILLI-Q. As reações de seqüenciamento consistiam de 35 ciclos de 95ºC 25s, 50ºC 15s,
60ºC 3 min e tinham um volume total de 10 μL que continha 4 μL do kit de seqüenciamento
(ET DYE Terminator Kit, Amersham Biosciences), 3 μL de água MILLI-Q, 2 μL de produto
de PCR e 1μL do iniciador a 5μM. Foi utilizado o iniciador L5216 (Sorenson 2003). As
reações de seqüenciamento foram purificadas usando acetato de amônio e etanol, dissolvidas
em tampão formaldeído-EDTA e analisadas no seqüenciador automático MegaBACE 1000
(Amersham Biosciences).
Análise dos dados:
As seqüências consenso foram obtidas a partir de 3 a 5 seqüências de alta qualidade
geradas com iniciadores diretos, provenientes de pelo menos duas reações de PCR diferentes,
25
utilizando os programas Phred v. 0.20425 (Ewing et al. 1998), Phrap v. 0.990319
(http//www.phrap.org) e Consed 14.0 (Gordon et al. 1998). As seqüências obtidas foram
alinhadas e analisadas juntamente com 13 seqüências de Amazona aestiva e 27 de Amazona
ochrocephala (22 de subespécies sul-americanas e 5 de subespécies centro-americanas,
utilizadas como grupos externos), obtidas no GenBank. Os alinhamentos foram construídos
usando Clustal W (Higgins & Sharp 1988), implementado no programa MEGA 4 (Tamura et
al. 2007), que também foi usado para estimar a divergência entre os diferentes haplótipos
através do modelo de distância nucleotídica Kimura 2 parâmetros – K2p (Kimura 1980) e
para construção de uma árvore com método Neighbor Joining (NJ) usando distâncias K2p e
medidas de suporte de ramos calculados com porcentagens de 1.000 replicações bootstrap.
Foi também construída uma “rede” haplotípica (network) intra e interespecífica usando-se o
algoritmo Median-joining (MJ) (Bandelt et al. 1999) com o programa Network
(www.fluxusengineering.com).
A distribuição hierárquica de diversidade genética foi verificada através de Análise de
Variância Molecular (AMOVA, Excoffier et al. 1992) com o programa Arlequin (Excoffier et
al. 2005). Foram feitas 5 comparações: entre A.aestiva e A.ochrocephala, entre as subespécies
de A.aestiva, entre as subespécies de A.ochrocephala, entre as subespécies como populações
de cada espécie, e entre populações geográficas considerando estas duas espécies como um
único táxon, no complexo A. aestiva/ochrocephala. No programa Arlequin foram também
calculadas estimativas de diversidade haplotípica (H), nucleotídica () e outros parâmetros de
diversidade intra e interpopulacional, para avaliação do potencial discriminatório do
marcador.
RESULTADOS:
Seqüências de ND2:
Foram obtidas 46 seqüências consenso de 430 pb do gene mitocondrial ND2, que
puderam ser comparadas entre todos os indivíduos e com dados de literatura (Eberhard e
Bermingham, 2004 e Ribas et al., 2007). Foram encontrados 30 haplótipos para as espécies
analisadas, divididos entre A.aestiva aestiva, A.aestiva xanthopterix, A.ochrocephala
nattereri, A.ochrocephala ochrocephala e A.ochrocephala xantholaema (todas sul-
americanas). Das amostras seqüenciadas neste estudo, provenientes da Fazenda Vale Verde,
foram encontrados 23 haplótipos (H_1 a H_23). Além destes, 5 haplótipos de outras
26
subespécies de A.ochrocephala (oratrix, belizensis, tresmariae, panamensis e auropalliata) da
América Central foram utilizados como grupos externos para comparações, tal como indicado
por estudos filogenéticos recentes (Eberhard e Bermingham, 2004 e Ribas et al., 2007). As
distribuições geográficas de A.aestiva e das subespécies de A.ochrocephala são mostradas na
Figura 01.
Nos 30 haplótipos analisados foram observadas 30 substituições, sendo 24 transições e
6 transversões, em 26 sítios polimórficos, dos quais 10 eram informativos. Não foi observado
nenhum “indel”. A diversidade nucleotídica foi estimada em 0,006346 +/- 0,003771. Um
resumo dos índices de diversidade encontrados encontra-se na Tabela 01, abaixo.
Tabela 01: Índices de diversidade de A.aestiva, A.ochrocephala e suas subespécies. N (nº de
indivíduos), h (nº de haplótipos), H (diversidade haplotípica), (diversidade nucleotídica).
----------------------------------------------------------------------
Taxon N h H
----------------------------------------------------------------------
Amazona 81 30 0,8799 0,006346
(aest + ochro)
A.aest 59 24 0,865 0,005858
A.a.aest 54 22 0,8498 0,005446
A.a.xanth 4 3 0,8333 0,007034
A.ochro 22 9 0,8874 0,006535
A.o.xanth 6 2 0,5333 0,001243
A.o.natt 10 4 0,7111 0,004371
A.o.ochro 6 4 0,8667 0,010865
----------------------------------------------------------------------
Filogenia e filogeografia:
Foi construída uma rede haplotípica (network) com o método Median-Joining (Bandelt
et al. 1999), apresentada na Figura 03. Observando-se a rede, nota-se que não há formação
evidente de agrupamentos haplotípicos. Os haplótipos de maior freqüência são H_1 (N=24),
H_11 (N=12), H_9 (N=7) e H_25 (N=7). Nota-se também que há vários haplótipos
compartilhados por mais de uma espécie e ou subespécie (haplótipos 1, 11 e 25). Observa-se
que, dentre as matrizes A. aestiva de cativeiro, apenas 2 haplótipos foram compartilhados com
aqueles de literatura (A.a aest – H_1 e H_11); os outros 21 haplótipos não possuem registro
nas populações naturais de literatura.
27
Fig.03: “Network” construída com os 30 haplótipos analisados, com método Median Joining. Os tamanhos
dos círculos são proporcionais ao nº de indivíduos representados por cada haplótipo e os números nos
ramos referem-se às posições com eventos de mutação conectando os haplótipos. Os animais de
cativeiro são os A. aest aest (cat), em vinho sólido, além de dois A.a.xanth (H_11 e H_12), em verde
sólido.
Foi gerada uma árvore Neighbor-Joining, com a distância Kimura 2 parâmetros (K2p),
apresentada na Figura 04. As subespécies de A.aestiva agrupam-se com as subespécies de
A.ochrocephala sul-americanas (à exceção de um indivíduo da subespécie A.ochrocephala
ochrocephala, H_29, de origem colombiana, que forma um grupo-irmão a todos os outros sul-
americanos), ficando as outras subespécies de A.ochrocephala, centro-americanas, como
grupos externos.
Dentro da linhagem sul-americana, podemos notar a formação de 3 agrupamentos. O
primeiro é formado por 10 haplótipos, todos de A.aestiva aestiva (todos são matrizes da
Fazenda Vale Verde). O segundo, grupo-irmão do primeiro e contendo 9 haplótipos, é
formado apenas pelas subespécies A.aestiva aestiva, A.ochrocephala xantholaema e
A.ochrocephala nattereri. As outras duas subespécies, A.aestiva xanthopterix e
A.ochrocephala ochrocephala, encontram-se no terceiro agrupamento, composto por 10
28
haplótipos e todas as subespécies, com exceção de A.ochrocephala xantholaema. Este
agrupamento constitui grupo-irmão dos dois anteriores. Quando confrontamos a árvore
apresentada na Figura 04 com a lista apresentada no ANEXO 1, podemos observar que
praticamente não há correspondência entre os agrupamentos encontrados na árvore e os locais
de origem dos exemplares mencionados na literatura. Observamos tanto o agrupamento, no
mesmo cluster, de animais de origens muito distintas (p.ex.: A.o.xanth, de Marajó, e A.a.aest,
de Miranda e Chapada Gaúcha, H_1), quanto a separação, em clusters distintos, de animais de
mesma origem geográfica (p.ex.: H_1 e H_11, nos clusters 2 e 3, respectivamente, contêm
espécimes de A.a.aest provenientes tanto de Miranda quanto de Chapada Gaúcha).
AMOVA:
Foram realizadas análises de variância molecular (AMOVA) entre A.aestiva e
A.ochrocephala (subespécies sul-americanas), entre as duas subespécies de A.aestiva, entre as
três subespécies sul-americanas de A.ochrocephala, entre todas as subespécies (das duas
espécies) agrupadas e entre as subespécies como populações das duas espécies (2 grupos). Os
resultados são apresentados nas tabelas 02, 03, 04 e 05, geradas pelo programa ARLEQUIN.
Tabela 02: AMOVA entre A.aestiva e A.ochrocephala
----------------------------------------------------------------------
Source of Sum of Variance Percentage
variation d.f. squares components of variation
----------------------------------------------------------------------
Among
species 1 6.595 0.16526 Va 11.29
Within
species 79 102.557 1.29818 Vb 88.71
----------------------------------------------------------------------
Total 80 109.151 1.46345
----------------------------------------------------------------------
Fixation Index FST : 0.11293
----------------------------------------------------------------------
29
Fig.04: Árvore Neighbor-Joining, com método de distância K2p, mostrando os agrupamentos entre os 35
haplótipos analisados.
30
Tabela 03: AMOVA entre A.aestiva aestiva e A.aestiva xanthopteryx
----------------------------------------------------------------------
Source of Sum of Variance Percentage
variation d.f. squares components of variation
----------------------------------------------------------------------
Among
subspecies 1 4.534 0.44902 Va 27.41
Within
subspecies 56 66.595 1.18920 Vb 72.59
----------------------------------------------------------------------
Total 57 71.129 1.63822
----------------------------------------------------------------------
Fixation Index FST : 0.27409
----------------------------------------------------------------------
Tabela 04: AMOVA entre A.ochrocephala nattereri, A.ochrocephala ochrocephala e
A.ochrocephala xantholaema
----------------------------------------------------------------------
Source of Sum of Variance Percentage
variation d.f. squares components of variation
----------------------------------------------------------------------
Among
subspecies 2 8.033 0.40703 Va 26.48
Within
subspecies 19 21.473 1.13018 Vb 73.52
----------------------------------------------------------------------
Total 21 29.506 1.53721
----------------------------------------------------------------------
Fixation Index FST : 0.26479
----------------------------------------------------------------------
Tabela 05: AMOVA entre todas as subespécies agrupadas
----------------------------------------------------------------------
Source of Sum of Variance Percentage
variation d.f. squares components of variation
----------------------------------------------------------------------
Among
subspecies 4 19.346 0.35556 Va 23.24
Within
subspecies 75 88.069 1.17425 Vb 76.76
----------------------------------------------------------------------
Total 79 107.414 1.52980
----------------------------------------------------------------------
Fixation Index FST : 0.23242
----------------------------------------------------------------------
31
Tabela 06: AMOVA entre as subespécies agrupadas por espécie
----------------------------------------------------------------------
Source of Sum of Variance Percentage
variation d.f. squares components of variation
----------------------------------------------------------------------
Among
species 1 6.779 -0.08079 Va -5.34
Among
subspecies
within
species 3 12.566 0.41811 Vb 27.66
Within
subspecies 75 88.069 1.17425 Vc 77.68
----------------------------------------------------------------------
Total 79 107.414 1.51157
----------------------------------------------------------------------
Fixation Indices
FSC : 0.26257
FST : 0.22316
FCT : -0.05345
----------------------------------------------------------------------
Em todos os casos, há maior variação, de forma significativa, dentro dos grupos
(“populações”) do que entre os grupos: F
ST
de 11,29% (p = 0,00098), 27,41% (p = 0,00587),
26,48% (p = 0,00098), 23,24% (p = 0,00000) e F
CT
de –5,34% (p = 0,52004),
respectivamente. Porém, tal diferença é mais acentuada nas análises entre as duas espécies de
Amazona: 11,29% de variação entre as espécies contra 88,71% de variação dentro das
espécies (Tabela 02), quando a análise foi feita entre os indivíduos de uma espécie e os
indivíduos de outra, e –5,34% de variação entre as espécies contra 27,66% entre as
subespécies dentro dos grupos (espécies) e 77,68% de variação dentro das subespécies
(Tabela 06), quando a análise foi feita entre as subespécies agrupadas por espécie. Os
resultados de AMOVA indicam a existência de alguma subestruturação populacional, com
F
ST
s variando entre 0,11 e 0,27, possibilitando alguma discriminação de localização
geográfica para algumas linhagens. No entanto, as análises apresentadas na rede
filogeográfica (Figura 03) e na árvore filogenética (Figura 04) indicam que a correlação
geográfica é bastante limitada e são necessários novos estudos e amostragens de populações
naturais em toda área de ocorrência das espécies e suas subespécies na América do Sul.
32
DISCUSSÃO:
Filogenia e filogeografia das espécies do gênero Amazona
Russello e Amato (2004), trabalhando com seqüências mitocondriais e nucleares,
encontraram um clado, por eles denominados “yellow-headed parrot complex”, formado por
A. ochrocephala, A. oratrix e A. auropalliata e que inclui A. aestiva e A. barbadensis. Dentro
deste clado, as duas subespécies de A. aestiva inserem-se em um grupo formado por A.
ochrocephala nattereri e A. ochrocephala xantholaema. Em virtude de tais resultados, os
autores crêem que a atual taxonomia do grupo (“complexo de cabeça amarela”) é incorreta,
necessitando de novos estudos, mais abrangentes, e de uma revisão.
Eberhard e Bermingham (2004), trabalhando com genes mitocondriais (ATPase 6,8,
COI e ND2) verificaram a existência de agrupamento entre as subespécies sul-americanas
(nattereri, xantholaema e ochrocephala) de A. ochrocephala, formando um clado distinto de
outros dois, que compreendem, um, as subespécies centro-americanas e, o outro, um grupo (A.
ochrocephala ochrocephala) do norte da América do Sul (Colômbia e Venezuela). O clado
sul-americano inclui A. aestiva (os autores exploraram a relação entre aestiva e ochrocephala
usando seqüências nucleares Gapdh: as análises produziram árvores em que aestiva encontra-
se fora do grupo ochrocephala, porém, o teste S-H – Shimodaira-Hasegawa – mostrou que
tais topologias não diferem significativamente de uma em que aestiva é inserido à força no
clado de ochrocephala). Este clado, formado pelas subespécies sul-americanas de A.
ochrocephala e por A. aestiva, forma, um grupo-irmão do clado do norte da América do Sul e
do clado que compreende todas as subespécies meso-americanas de A. ochrocephala. Os
autores concluem que o chamado “complexo” ochrocephala é composto por membros
proximamente relacionados e muito mais entre si do que com outras espécies do gênero
estudadas. Além disso, seus dados não suportam as subespécies sul-americanas como grupos
monofiléticos.
Ribas et al. (2007), também trabalhando com os mesmos genes mitocondriais,
recuperaram uma filogenia em que o clado sul-americano é irmão do centro-americano. Esses
dois, porém, formam um clado irmão do clado do norte da América do Sul. Novamente, o
clado sul-americano inclui Amazona aestiva (o estudo incluiu 13 exemplares dessa espécie, ao
contrário de apenas 1 exemplar no estudo de Eberhard e Bermingham). Esse clado divide-se
em outros dois, ambos contendo exemplares de A. aestiva provenientes das duas localidades
amostradas (Miranda/MS e Chapada Gaúcha/MG). As autoras concluem que o padrão
33
recuperado pode dever-se ao fato de que a taxonomia tradicional das duas espécies (A.
ochrocephala e A. aestiva), baseada na coloração da plumagem, pode não refletir a história
evolutiva do grupo. Isso poderia significar que a variação nas plumagens das duas espécies
pode decorrer de mudanças relativas a diferenças de habitat (A. ochrocephala ocorre na bacia
amazônica, enquanto que A. aestiva ocorre em áreas mais secas e abertas – cerrado, caatinga,
etc.) que não são refletidas entre as linhagens de DNAmt, ou que a interpretação usual das
características da plumagem precisa ser revista, já que tais características são muito variáveis
neste grupo de papagaios. Uma outra alternativa para explicar o padrão encontrado (árvore
genética distinta da árvore taxonômica usual), segundo as autoras, seria a existência de
fenômenos populacionais tais como introgressão ou a separação ainda incompleta das
linhagens. Tal possibilidade poderia ser abordada através do estudo de seqüências nucleares,
que são transmitidas de forma independente das mitocondriais. No entanto, as autoras
apontam o problema de que há um baixo nível de variação em genes nucleares entre estes
taxa tão próximos (problema encontrado no estudo de Eberhard e Bermingham) e apontam a
necessidade de uma revisão morfológica do grupo para melhor compreensão dos padrões de
variação da plumagem.
Nossos resultados, assim como os trabalhos citados, revelam a falta de estruturação
dentro da linhagem sul-americana, compreendendo Amazona ochrocephala e Amazona
aestiva, que se comportam como um complexo de espécies A. aestiva/ochrocephala.
Na rede (network) haplotípica construída (Figura 03) não há a formação clara de
agrupamentos (clusters), nem mesmo entre espécies ou subespécies distintas. Além disso,
observa-se o compartilhamento de haplótipos por subespécies ou mesmo por espécies
distintas: haplótipo 1 (A.aestiva aestiva, A.ochrocephala nattereri e A.ochrocephala
xantholaema), haplótipo 11 (A.aestiva aestiva, A.aestiva xanthopterix e A.ochrocephala
nattereri) e haplótipo 25 (A.aestiva xanthopterix e A.ochrocephala nattereri), que estão entre
os haplótipos de maior freqüência.
A árvore filogenética (Figura 04) apresenta-se também pouco estruturada. As
linhagens sul-americanas formam três clusters (além de um quarto, formado exclusivamente
pelo exemplar do norte da América do Sul, haplótipo 29, de origem colombiana) em que, à
exceção de um deles, formado apenas por A.aestiva aestiva (cluster 1 – composto
inteiramente por exemplares utilizados no presente trabalho), ocorrem tanto a presença de
mais de uma espécie e subespécie em um cluster, quanto a presença de uma espécie ou
subespécie em mais de um deles. Assim, o cluster 2 (irmão do cluster 1) contém todas as
subespécies, exceto A. aestiva xanthopteruix e A. ochrocephala ochrocephala, e o cluster 3
34
(irmão do cluster 1 + 2) também contém todas as subespécies, exceto A. ochrocephala
xantholaema. A. aestiva aestiva e A.ochrocephala nattereri estão presentes em ambos os
clusters (2 e 3). Apesar de que os clusters indicados possuem baixo suporte de bootstrap, os
mesmos foram identificados no trabalho de Ribas et al. (2007), com exceção do novo cluster
1 das matrizes de cativeiro que não se agrupa com nenhum dos dados já publicados.
De modo semelhante aos trabalhos de Eberhard e Bermingham (2004) e Ribas et al.
(2007), o exemplar do norte da América-do-Sul (aqui representado pelo haplótipo 29, A.
ochrocephala ochrocephala – instituição/voucher STRI-x-61) apresenta-se como um cluster
distinto do restante da linhagem sul-americana e basal em relação a esta. Para Ribas et al.
(2007), tal posição basal deste clado (haplótipo 29) é compatível com uma distribuição
ancestral, ao norte da América do Sul, de todo o grupo, a partir de onde teriam ocorrido as
posteriores irradiações para as Américas do Sul e Central. Eberhard e Bermingham (2004)
consideram, como possíveis explicações para a distinção entre esta linhagem do norte da
América do Sul e o restante da linhagem sul-americana, as hipóteses de o Rio Amazonas agir
como barreira genética entre as duas margens e, alternativamente, a existência passada de
descontinuidades de hábitat em virtude de variações da cobertura florestal decorrentes dos
ciclos glaciais pleistocênicos.
As análises de variância molecular (AMOVA) chamam a atenção para a pouca
distinção entre as duas espécies, A. aestiva e A. ochrocephala. Informações a esse respeito,
para psitacídeos, são escassas na literatura, mas Faria et al. (2008), trabalhando com
seqüências nucleares e mitocondriais de Anodorhynchus hyacinthinus (arara-azul) de três
populações distintas, sendo duas do Pantanal e uma do estado do Piauí, encontrararam F
ST
’s
de até 0,33 (P < 0,001) entre populações de localizações geográficas distantes (Pantanal e
Piauí). Melo e O’Ryan (2007), trabalhando com seqüências mitocondriais de papagaios
africanos (Psittacus erithacus) encontraram Φ
ST
’s de até 0,74 (P < 0,0001) entre três
populações (uma das quais é insular), pertencentes a duas subespécies diferentes (P. erithacus
erithacus e P. erithacus timneh).
No presente caso, enquanto as fontes de variação entre populações (F
ST
’s) apontam
valores de 27,41% (entre A. aestiva aestiva e A. aestiva xanthopteryx, Tabela 3) e 26,48%
(entre as subespécies de A. ochrocephala, Tabela 4) das respectivas variações totais quando
são analisadas as duas espécies separadamente, a parcela de variação entre as duas espécies,
quando analisadas em conjunto é de apenas 11,29% (F
ST
= 0,11293, p = 0,00098, Tabela 2).
Em outras palavras, os resultados indicam que a fonte de variabilidade dentro de cada espécie
é mais importante do que entre as duas espécies (Hartl e Clark, 2007). O resultado encontrado
35
fica ainda mais evidente quando se observa a análise entre as 5 subespécies, separadas por
espécie (2 de aestiva e 3 de ochrocephala). Neste caso, o índice de fixação (FCT, na Tabela
06) encontrado é de – 0,05345. A parcela da variação total atribuída a diferenças entre as duas
espécies (denominadas “grupos”, na Tabela 06) é de – 5,34%, considerada não significativa (p
= 0,52004).
Analisando o conjunto de resultados aqui apresentados, percebemos que a relação
entre as duas espécies abordadas é complexa (ou mesmo confusa). Segundo Ribas et al.
(2007), casos de polifilia ao nível de espécie podem ter como causa diferentes fatores, mas
estes podem ser divididos em dois grupos principais: erro na interpretação da variação
morfológica que deu origem à delimitação das espécies, ou fenômenos de nível populacional
tais como separação incompleta de linhagens ou introgressão (conforme já exposto). Eberhard
e Bermingham (2004) assinalam que as duas espécies apresentam distribuição separada uma
da outra na maior parte, mas a pequena região de simpatria (Figura 01) poderia permitir a
ocorrência de hibridização entre ambas, possibilitando introgressão do DNAmt. Os autores
citam trabalhos que reportam o fenômeno de introgressão em um vasto conjunto de taxa
animais. Enfatizam também que, apesar de não serem conhecidos casos de hibridização entre
as duas espécies na natureza, as espécies do gênero Amazona são conhecidas por
hibridizarem-se em cativeiro. Lopes et al. (2007) citam Grant e Grant (1992) ao afirmar que a
hibridização é um fenômeno largamente disseminado entre as aves, sendo conhecido em
aproximadamente uma em cada dez espécies.
Entendemos que a hipótese de hibridização/introgressão recente é fragilizada, ou, pelo
menos, não seria suficiente para explicar os resultados aqui encontrados, pelo fato de a região
de simpatria entre as duas espécies ser aparentemente pequena (Figura 01). Enquanto que A.
ochrocephala encontra-se predominantemente na bacia amazônica, A. aestiva ocorre em áreas
mais abertas, como Cerrado, Caatinga e Chaco (Ribas et al., 2007), limitando-se, a área de
sobreposição das duas espécies, a uma pequena região ao sul da Amazônia. Se levarmos em
consideração a origem geográfica dos exemplares utilizados neste estudo, veremos que há
casos de compartilhamento de haplótipos entre indivíduos de origens muito distantes. Por
exemplo, o haplótipo 1 é compartilhado por espécimes, entre outros, de origens tão diversas
quanto a Ilha de Marajó (A. ochrocephala xantholaema) e os municípios de Miranda/MS e
Chapada Gaúcha/MG (A. aestiva aestiva). Porém, não se pode descartar a hipótese de
hibridização prévia (histórica) entre as espécies.
Por outro lado, a taxonomia de A. aestiva e A. ochrocephala é baseada principalmente
nos padrões de cor da cabeça. Enquanto que em A. ochrocephala, a extensão da coloração
36
amarela na cabeça é de suma importância na caracterização das subespécies, a principal
característica que distingue A. ochrocephala de A. aestiva é a presença da coloração azul na
fronte do último, apesar de a extensão da coloração azul variar entre indivíduos até de mesma
origem geográfica (Ribas et al., 2007).
Os resultados alcançados no presente estudo, a nosso entender, apontam na direção das
proposições de Ribas et al. (2007), segundo as quais a taxonomia tradicional pode não refletir
a evolução do grupo, sendo necessária uma revisão a fim de se compreender melhor a
variação nos padrões de plumagem que diagnosticam os dois taxa, e de Russello e Amato
(2004), para quem os próprios resultados sugerem “fortemente que a atual taxonomia
reconhecida pela AOU está incorreta” (referindo-se a todo o “Yellow-headed parrot
complex”), sendo claramente justificável uma detalhada análise do grupo a fim de corrigir as
inadequações da atual taxonomia. Caso esta interpretação esteja correta, nossos resultados não
apóiam o posicionamento de A. aestiva e A. ochrocephala como duas espécies distintas.
Nesse caso, poderíamos estar diante de um caso de diferenciação incipiente que ainda não é
detectável no DNA mitocondrial, conforme postularam Ribas et al. (2007), o que poderia ser,
segundo as autoras, “um interessante exemplo de progressiva divergência-com-fluxo-gênico
relacionada ao ecótone floresta/área aberta na Amazônia meridional” (Ribas et al., 2007,
citando Rice e Hostert, 1993, Smith et al., 1997 e Ogden e Thorpe, 2002).
Obviamente, o presente estudo apresenta limitações, tais como a utilização de apenas
um gene mitocondrial (ND2) em suas análises, além da relativa falta de informações (por
exemplo, origem geográfica) a respeito dos exemplares amostrados, todos eles de cativeiro.
Para que as relações entre as duas espécies e suas subespécies aqui abordadas sejam
esclarecidas, novos estudos, analisando um maior número de seqüências mitocondriais e
nucleares serão necessários. Também deverão ser utilizadas, conforme Russello e Amato
(2004), amostras de maior tamanho e que compreendam toda a área de abrangência do grupo.
Diversidade de haplótipos de DNAmt e discriminação de linhagens
Por causa da falta de estruturação geográfica marcante apresentada acima com análises
de AMOVA, rede filogeográfica e árvore filogenética, a possibilidade de determinação do
local de origem das matrizes de cativeiro é limitada. Quase não se observam agrupamentos ou
associações geográficas específicas com relação aos haplótipos (algumas poucas exceções
são, por exemplo, A.o. xanth, de Marajó, e A.o. ochr – H_28 – de Macapá). Por outro lado, o
que se vêem são compartilhamentos de haplótipos entre exemplares muitas vezes de origens
37
muito distintas (por exemplo, A.a.aest provenientes de Miranda e Chapada Gaúcha
compartilhando o haplótipo 1 junto com A.o.xanth, de Marajó, e A.o.natt, da Bolívia, e o
haplótipo 11 junto com A.o.natt, do Acre, da Bolívia e do Pará – vide lista no anexo 1), além,
como exposto, do compartilhamento por subespécies e espécies distintas. Os agrupamentos
encontrados na árvore (Figura 04) também não exibem boa correspondência com as origens
geográficas das aves. Observamos tanto o agrupamento de haplótipos de origens muito
diversas (p.ex.: H_11, contendo A.a.aest de Miranda e Chapada Gaúcha, com H30, com aves
de Altamira/PA), quanto a separação, em clusters distintos, de haplótipos de mesma origem
geográfica (p.ex.: H_1 e H_11, ambos contendo A.a.aest tanto de Miranda quanto de Chapada
Gaúcha). Isto mostra que, com base nos dados até agora encontrados, o gene mitocondrial
ND2 não constitui boa ferramenta para discriminação dos locais de origem de papagaios dos
grupos aqui abordados. Provavelmente, o futuro uso de uma maior amostragem, com um
número significativo de indivíduos de todas populações naturais das diferentes áreas de
distribuição de A. aestiva e A. ochrocephala permitirá um melhor detalhamento da filogenia e
filogeografia dos haplótipos, melhorando a resolução dos mesmos e possibilitando a
estimativa da origem geográfica das matrizes de cativeiro.
A escassez de conhecimento a respeito do grupo, bem como a necessidade de se
utilizar um número maior de exemplares oriundos de regiões mais diversificadas de sua
distribuição torna-se patente ao observarmos as figuras 03 e 04, nas quais podemos ver que as
seqüências de A. aestiva obtidas na literatura compreendem apenas 3 haplótipos (2 haplótipos
– H_1 e H_11 – de A.a.aest e 1 haplótipo – H_25 – de A.a.xanth), enquanto que as obtidas em
um único criatório (Vale Verde) compreendem 23 haplótipos diferentes, sendo 21 exclusivos.
Por outro lado, se compararmos a árvore aqui obtida (Figura 04) com a apresentada no
trabalho de Ribas et al. (2007), poderemos notar que, com a utilização de animais de um
único criatório (no presente estudo) foi gerado um agrupamento a mais (Cluster 1, Figura 04)
do que os dois obtidos no citado trabalho. O cluster “extra”, aqui obtido, é composto
inteiramente por matrizes de A.a aest do criatório Vale Verde.
Caso se consiga, futuramente, estimar a origem geográfica de matrizes de cativeiro,
esta informação será importante para aconselhar a formação de casais reprodutores. Por
exemplo, se para alguma subespécie for observada um certo isolamento na natureza, seria
indicado manter os casais entre membros de mesma subespécie. Caso se constate um enorme
fluxo gênico, inclusive entre espécies em determinada localidade, casais poderão ser formados
também entre indivíduos de localidades muito diferentes. Futuramente, estes estudos também
deverão ser acoplados à análise de outros marcadores biparentais como microssatélites, para
38
estimativa de coeficientes de consagüinidade, já que endogamia é inevitável em cativeiro em
médio e longo prazos, e deverá ser necessário estimá-la nos indivíduos e entre os casais
formados.
A alta diversidade haplotípica (H) observada na espécie A. aestiva (Tabela 01) indica
um alto poder discriminatório de linhagens do DNAmt para a espécie, entre 83 e 87%. Isto
indica que, em média, um indivíduo (ou linhagem) pode ser discriminado pela sequência de
seu DNAmt com uma probabilidade acima de 80%, mas valores mais altos ou mais baixos
podem estar relacionados a haplótipos mais raros ou mais comuns na população de A. aestiva.
No caso dos criatórios autorizados, os quais recebem matrizes oriundas de apreensões de
animais de populações naturais, somente a prole F1 e >F1 pode ser comercializada no caso
das espécies A. aestiva e A. ochrocephala. Portanto, o DNAmt poderia ser utilizado como um
marcador de linhagem materna das matrizes fêmeas, que terão seu DNAmt transmitido à prole
F1 que é comercializada. Este tipo de marcador genético de linhagem das matrizes de cada
criatório poderá ser utilizado para fins de combate ao tráfico ilegal, já que existe a
possibilidade de “esquentamento” de animais ilegais oriundos da natureza, pela implantação
dos chips ou anilhas de controle. Com o gene ND2 e outros do DNAmt, poderia ser verificada
a origem do cativeiro do indivíduo comercializado, com um poder de discriminação maior
que 80% em relação à diversidade das populações naturais. Neste caso, para que fosse feito o
“esquentamento” de um papagaio apreendido na natureza, seria necessário adicionar o chip ou
anilha que identifica o animal a ser comercializado e sua origem (criatório), neste caso ilegal,
e a linhagem mitocondrial da matriz específica do criatório. A utilização conjunta de
ferramentas tão diversas quanto o DNA mitocondrial (no caso, ND2) e dispositivos como o
chip ou anilha (devidamente controlados pelo IBAMA) reduziria bastante a possibilidade de
tráfico ilegal, ou, pelo menos, facilitaria bastante a detecção de espécimes sendo
comercializados ou adquiridos de maneira irregular.
CONCLUSÃO:
O presente estudo é o primeiro a compreender 46 exemplares de Amazona aestiva,
além de outros 13 A. aestiva e 22 A. ochrocephala presentes na literatura. Apesar de algumas
limitações, tais como a análise de apenas um gene mitocondrial (ND2) e a escassez de
informações a respeito das aves amostradas (todas de cativeiro e, portanto, sem informações a
39
respeito de suas origens geográficas na natureza), os resultados apontam na mesma direção de
estudos anteriores, uma relação muito próxima entre as duas espécies. Na verdade, os
presentes resultados não apóiam a existência de duas espécies distintas. Conforme
preconizado em trabalhos anteriores, acreditamos que novos estudos devam ser realizados,
compreendendo um maior número de seqüências mitocondriais e nucleares, além da
utilização de amostras maiores de indivíduos de populações naturais, compreendendo maiores
extensões geográficas de ocorrência das espécies em questão e todas suas subespécies.
Quanto à filogeografia de A. aestiva e à possibilidade de se identificar a origem
geográfica de determinado exemplar, o gene ND2 mostrou-se uma ferramenta de pouca
utilidade, uma vez que os haplótipos encontrados não possuem correspondências geográficas
claras.
No entanto, o gene ND2 (e o DNAmt) se mostrou bastante útil como ferramenta
forense, já que apresenta alta diversidade haplotípica (> 80%), permitindo assim, com
razoável precisão, a identificação da procedência legal (de criatório autorizado) ou não, do
exemplar analisado, através da comparação de sua seqüência com a seqüência da suposta
matriz (materna) de cativeiro. O emprego de tal ferramenta poderia tornar ainda mais efetivo
o combate ao tráfico ilegal, se combinado ao uso de chips ou anilhas individuais devidamente
controlados pelo IBAMA.
40
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Neotropical parrot biogeography, taxonomy, and conservation. Molecular Phylogenetics
and Evolution 30: 421-37.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.
2.ed., Cold Spring Harbor Press, New York.
Sick, H., 1997. Ornitologia Brasileira. Nova Fronteira, Rio de Janeiro.
Sigrist, T. Aves do Brasil, uma visão artística. 2.ed. Avis Brasilis, São Paulo, 2006.
Sorenson, M.D. Avian mtDNA primers. Boston, 2003. Disponível online em
http://people.bu.edu/msoren/Bird.mt.Primers.pdf (acessado em 07/11/2007).
Souza, D., 2004. Todas as aves do Brasil – guia de campo para identificação.2.ed. Dall, Feira
de Santana.
Tamura K., Dudley J., Nei M. & Kumar S., 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599.
42
Tavares, E.S., Yamashita, C. & Miyaki, C.Y., 2004. Phylogenetic relationships among some
neotropical parrot genera (Psittacidae, Aves) base don mitochondrial sequences. The Auk
121(1): 230-242.
Wright, T.F., Toft, C.A., Enkerlin-Hoeflich, E., Gonzalez-Elizondo, J., Albornoz, M.,
Rodríguez-Ferraro, A., Rojas-Suárez, F, Sanz, V., Trujillo, A., Beissinger, S.R., Berovides,
V., Gálvez, X., Brice, A.T., Joyner, K., Eberhard, J., Gilardi, J., Koenig, S.E., Stoleson, S.,
Martuscelli, P., Meyers, J.M., Renton, K., Rodríguez, A.M., Sosa-Asanza, A.C., Vilella, F.J.
& Wiley, A.J.W, 2001. Nest poaching in Neotropical parrots. Conservation Biology 15 (3):
710-720.
43
ANEXO 1
Lista de indivíduos por haplótipo, com espécie, subespécie e localidade de origem ou procedência.
Vale
Verde
Haplótipo
Subespécie
Indivíduo
Localidade
Voucher
Gen Bank
Hap 1
A.aest aest
4045
Zoo Brasília
x
A.aest aest
CONSER004
Rodrigo Luiz Rocha (BH)
x
A.aest aest
fvv MG 074
Criad. Bico Torto
x
A.aest aest
fvv MG 95192
IBAMA
x
A.aest aest
fvv265
Zoo Americana
x
A.aest aest
fvv276
Zoo Americana
x
A.aest aest
fvv279
Nilsea L.Santos
x
A.aest aest
fvv320
Zoo Americana
x
A.aest aest
fvv557
Zoo Americana
x
A.aest aest
fvv558
Zoo Americana
x
A.aest aest
fvv573
IBAMA
x
A.aest aest
fvv588b
IBAMA
x
A.aest aest
fvvmg032
IBAMA
x
A.aest aest
fvvmg95153
Criad. Bico Torto
x
A.o.xanth
gi91694475
Marajó
USP 1042
DQ453654
A.o.xanth
gi91694469
Marajó
USP 1031
DQ453651
A.o.xanth
gi91694477
Marajó
USP 1589
DQ453655
A.o.xanth
gi37780924
Cativo
STRI-LP1
AY194445
A.o.natt
gi37780908
St.Cruz Dpt. BOLIVIA
LSU B12973
AY194437
A.aest aest
gi91694445
Miranda
USP 2180
DQ453639
A.aest aest
gi91694459
Chapada Gaúcha MG
USP 4057
DQ453646
A.aest aest
gi91694467
Chapada Gaúcha MG
USP 4056
DQ453650
A.aest aest
gi91694481
Chapada Gaúcha MG
USP 4053
DQ453657
A.aest aest
gi91694463
Chapada Gaúcha MG
USP 4055
DQ453648
Hap 2
A.aest aest
4162
Zoo Curitiba
x
Hap 3
A.aest aest
4056
Zoo Brasília
x
Hap 4
A.aest aest
CBT31100002
Criad. Bico Torto
x
Hap 5
A.aest aest
CONMG172
Rodrigo Luiz Rocha (BH)
x
Hap 6
A.aest aest
CONMG427
Rodrigo Luiz Rocha (BH)
x
Hap 7
A.aest aest
CONSER005
Rodrigo Luiz Rocha (BH)
x
Hap 8
A.aest aest
fvv049
IBAMA
x
A.aest aest
fvv066
Criad. Bico Torto
x
Hap 9
A.aest aest
fvv078
Criad. Bico Torto
x
A.aest aest
fvv267
IBAMA
x
A.aest aest
fvv583
IBAMA
x
A.aest aest
fvv597
IBAMA
x
A.aest aest
fvvmg95154
Criad. Bico Torto
x
A.aest aest
fvvmg95168
IBAMA
x
A.aest aest
fvvmg95198
IBAMA
x
Hap 10
A.aest aest
fvvmg95161
Criad. Bico Torto
x
Hap 11
A.aest aest
fvv266
Zoo Americana
x
A.aest aest
fvv326b
Foz do Iguaçu IBAMA
x
A.aest xanth
fvv343
Foz do Iguaçu IBAMA
x
A.o.natt
gi91694435
Assis ACRE
USP 2076
DQ453634
A.o.natt
gi91694451
Jacareacanga PARÁ
USP 2951
DQ453642
A.o.natt
gi37780910
Beni BOLIVIA
LSU B-25220
AY194438
44
A.aest aest
gi91694439
Miranda MS
USP 2183
DQ453636
A.aest aest
gi91694443
Miranda MS
USP 2186
DQ453638
A.aest aest
gi91694457
Miranda MS
USP 2189
DQ453645
A.aest aest
gi91694461
Chapada Gaúcha MG
USP 4052
DQ453647
A.aest aest
gi91694479
Miranda MS
USP 2192
DQ453656
A.aest
gi37780902
Cativo
STRI-x-97
AY194434
Hap 12
A.aest xanth
fvv310
Foz do Iguaçu IBAMA
x
Hap 13
A.aest aest
fvv326
Foz do Iguaçu IBAMA
x
Hap 14
A.aest aest
fvv332
Zoo Americana
x
Hap 15
A.aest aest
fvv339
Zoo Americana
x
Hap 16
A.aest aest
fvv385
Criad. Bico Torto
x
A.aest aest
fvv589
IBAMA
x
Hap 17
A.aest aest
fvv553
Zoo Americana
x
Hap 18
A.aest aest
fvv576
Zoo Americana
x
Hap 19
A.aest aest
fvvmg059
IBAMA
x
Hap 20
A.aest aest
fvvmg95169
IBAMA
x
Hap 21
A.aest aest
fvvmg95189
IBAMA
x
Hap 22
A.aest aest
fvv597
IBAMA
x
Hap 23
A.aest aest
fvvmg039
IBAMA
x
Hap 24
A.o.xanth
gi91694431
Marajó
USP 1590
DQ453632
A.o.xanth
gi91694447
Marajó
USP 1587
DQ453640
Hap 25
A.o.natt
gi37780912
Pando Dpt. BOLIVIA
LSU B9409
AY194439
A.o.natt
gi91694455
Rio Iaco ACRE
USP 2068
DQ453644
A.o.natt
gi91694433
Rio Itimari ACRE
USP 2084
DQ453633
A.o.natt
gi91694441
Rio Acre, Xapuri, ACRE
USP 2078
DQ453637
A.o.natt
gi91694449
Rio Acre, Basiléia, ACRE
USP 2074
DQ453641
A.aest xanth
gi91694453
Vila Bela da Stsma.Trindade, MT
USP 1320
DQ453643
A.aest xanth
gi91694471
Vila Bela da Stsma.Trindade, MT
USP 1319
DQ453652
Hap 26
A.o.natt
gi91694483
Pando Dpt. BOLIVIA
USP 2075
DQ453658
Hap 27
A.o. ochr
gi91694437
Macapá AP
USP 1572
DQ453635
Hap 28
A.o. ochr
gi91694465
Macapá AP
USP 1563
DQ453649
A.o. ochr
gi91694473
Macapá AP
USP 1565
DQ453653
Hap 29
A.o. ochr
gi37780954
Carimaguá, COLOMBIA
STRI-x-61
AY194460
Hap 30
A.o. ochr
gi37780906
Rio Xingu, Altamira, PA
NMNH B07034
AY194436
A.o. ochr
gi37780904
Rio Xingu, Altamira, PA
NMNH B06867
AY194435
Obs.: 1) a coluna “Vale Verde” indica as amostras seqüenciadas no presente estudo;
2) as cores utilizadas na segunda coluna não correspondem às das Figuras 03 e 04.
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