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AMBIENTE DE CULTIVO NA PROPAGAÇÃO
IN VITRO DE CRISÂNTEMO (Dendranthema
grandiflora TZVELEV CV. RAGE):
CARACTERÍSTICAS ANATÔMICAS E
FISIOLÓGICAS
FRANCYANE TAVARES BRAGA
2006
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FRANCYANE TAVARES BRAGA
AMBIENTE DE CULTIVO NA PROPAGAÇÃO IN VITRO DE
CRISÂNTEMO (Dendranthema grandiflora TZVELEV cv. Rage):
CARACTERÍSTICAS ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Lavras
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Agronomia, área de concentração
em Fisiologia Vegetal, para a
obtenção do título de “Mestre”.
Orientador
Prof. Dr. Moacir Pasqual
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2006
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos
Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Braga, Francyane Tavares
Ambiente de cultivo na propagação in vitro de crisântemo
(Dendranthema grandiflora Tzvelev cv. Rage): características anatômicas e
fisiológicas / Francyane Tavares Braga. – Lavras: UFLA, 2006.
119 p. : il.
Orientador: Moacir Pasqual
Dissertação (Mestrado) – UFLA
Bibliografia.
1. Dendranthema grandiflora. 2. Luz Natural. 3. Propagação. 4.
Ventilação natural. 5. Qualidade espectral. 6. Aclimatização. I.
Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD-635.93355
FRANCYANE TAVARES BRAGA
AMBIENTE DE CULTIVO NA PROPAGAÇÃO IN VITRO DE
CRISÂNTEMO (Dendranthema grandiflora TZVELEV cv. Rage):
CARACTERÍSTICAS ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Lavras
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Agronomia, área de
concentração em Fisiologia
Vegetal, para a obtenção do
título de "Mestre".
APROVADA em 21 de julho de 2006.
Prof. Dr. Evaristo Mauro de Castro UFLA
Dr. Leonardo Ferreira Dutra Embrapa Florestas
Prof. Dr. Moacir Pasqual
UFLA
(Orientador)
A Deus e aos meus pais, Francisco e Maria Auxiliadora (In
memoriam),
OFEREÇO.
A minha irmã, Pollyana.
A minha família.
Aos meus amigos e pais, Sr. Jorge e Toninha.
Aos meus amigos e irmãos, Marcelo, Thiago e Anderson.
DEDICO.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por fazer tudo na minha vida possível.
À Universidade Federal de Lavras (UFLA), em especial ao Setor de
Fisiologia Vegetal, pela oportunidade de realização da pós-graduação.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudos.
Ao meu orientador, professor Moacir Pasqual, por toda atenção, apoio,
amizade e ensinamentos durante estes anos.
Ao professor Evaristo Mauro de Castro, pela co-orientação, mas,
principalmente, pela amizade e confiança.
Aos membros da banca examinadora: Dr. Leonardo Ferreira Dutra e Prof
a
.
Dra. Patrícia Duarte de Oliveira Paiva, por se disponibilizarem e lerem este
trabalho e por todas as sugestões para a melhoria do mesmo.
Aos professores do setor de Fisiologia Vegetal.
A Patrícia, pela amizade e apoio durante todo o período do curso e
principalmente, pelo convívio familiar em nossa casa. Obrigada por todos os
momentos.
A Larissa e Mayara, também pela amizade e convívio familiar.
A Samantha e Espeto, por terem tornado possível este trabalho, por toda
ajuda e amizade.
Mais uma vez, aos meus irmãos: Marcelo, Thaigo, Anderson e Rosi, por
estarem sempre presentes em minha vida, compartilhando de bons e maus
momentos.
Às grandes companheiras: Fernanda Soares e Fernanda Nery, pelas
inúmeras horas de alegria e pelo apoio em todos os momentos.
Aos colegas técnicos e funcionários: Lena, Izonel, Tanhan, Joel,
Odorêncio e Tina, por reunirem o trabalho com a oportunidade de diversão, pelo
auxílio e por serem tão prestativos.
Aos amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de
Agricultura: Vantuil, Claret e Antônio Carlos, pelo apoio e momentos de
descontração.
Aos alunos de doutorado, mestrado e iniciação científica do Laboratório
de Cultura de Tecidos do Departamento de Agricultura.
A todos os amigos do Setor de Fisiologia Vegetal, em especial aos alunos
que partilharam todos os momentos durante o curso: Raírys, Sidney, Paulo Cairo
eVanessa Stain.
A todos os colegas e amigos do laboratório de Anatomia Vegetal, Gabriel
Biagiotti, Cynthia, Girlene Santos, Walter, Gabriel Buiu e Mirian, pelo trabalho
em conjunto, por todo tempo que se dispuseram no auxílio desta dissertação e
pelo agradável convívio.
A todos que, de uma forma ou de outra, colaboraram para o encerramento
desta etapa importante da minha vida e que, embora não citados aqui, não
deixam de merecer meu profundo agradecimento.
BIOGRAFIA
FRANCYANE TAVARES BRAGA, filha de Francisco dos Santos Braga
e Maria Auxiliadora Pedra Tavares Braga (ambos falecidos), nasceu em 10 de
agosto de 1981, em Conselheiro Lafaiete, MG, onde estudou na Escola Estadual
Narciso de Queiróz. Em 2000, transferiu-se para Lavras, iniciando o curso de
graduação em Ciências Biológicas, no Centro Universitário de Lavras,
concluindo-o em dezembro de 2003. Durante este período, foi estagiária do
Centro de Pesquisas, sob orientação do Prof. João Antônio Argenta e
desenvolveu projetos de pesquisa com Plantas Medicinais. Em agosto de 2004,
iniciou o curso de Mestrado em Agronomia – Fisiologia Vegetal na UFLA,
concluindo-o em agosto de 2006.
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................................ i
ABSTRACT ................................................................................................... ii
CAPÍTULO I: Introdução geral..................................................................
1
1 Introdução.................................................................................................... 2
2 Referencial teórico....................................................................................... 5
2.1 Floricultura.............................................................................................. 5
2.2 Crisântemo............................................................................................... 6
2.3 Propagação de crisântemos in vivo e in vitro........................................... 10
2.4 Ambiente de cultivo................................................................................. 13
2.4.1 A luz no cultivo in vitro....................................................................... 14
2.4.2 Qualidade de luz……………………………………………………... 16
2.4.3 Sacarose na propagação in vitro.......................................................... 18
2.5 Morfofisiologia e anatomia de plantas micropropagadas....................... 20
2.6 Aclimatização…………………………………………………………. 22
3 Referências bibliográficas............................................................................ 24
CAPÍTULO II: Luz natural e concentração de sacarose na
propagação in vitro de Dendranthema grandiflora cv. Rage: alterações
anatômicas e fisiológicas...............................................................................
36
1 Resumo ....................................................................................................... 37
2 Abstract........................................................................................................ 38
3 Introdução.................................................................................................... 39
4 Material e métodos....................................................................................... 41
4.1 Meio de cultura......................................................................................... 41
4.2 Ambiente de cultivo.................................................................................. 41
4.3 Variáveis avaliadas.................................................................................. 43
4.4 Delineamento experimental e análise estatística....................................... 44
5 Resultados e discussão ................................................................................ 44
5.1 Características fitotécnicas..................................................................... 44
5.2 Características anatômicas.................................................................... 53
6 Conclusões.................................................................................................. 57
7 Referências bibliográficas............................................................................ 57
CAPÍTULO III: Propagação in vitro de Dendranthema grandiflora cv.
Rage submetida a alterações espectrais: características anatômicas e
fisiológicas......................................................................................................
62
1 Resumo........................................................................................................ 63
2 Abstract........................................................................................................ 64
3 Introdução.................................................................................................... 65
4 Material e métodos....................................................................................... 67
4.1 Meio de cultura......................................................................................... 67
4.2 Ambiente de cultivo................................................................................ 67
4.3 Variáveis avaliadas................................................................................. 68
4.4 Delineamento experimental e análise estatística…...………………….. 70
5 Resultados e discussão................................................................................. 70
5.1 Características fitotécnicas..................................................................... 70
5.2 Teores de clorofila.................................................................................. 74
5.3 Características anatômicas...................................................................... 76
5.4 Aclimatização......................................................................................... 78
6 Conclusões .................................................................................................. 83
7 Referências bibliográficas............................................................................ 83
CAPÍTULO IV: Luz natural e sistemas de vedação na propagação in
vitro de Dendranthema grandiflora cv. Rage: alterações anatômicas e
fisiológicas......................................................................................................
87
1 Resumo........................................................................................................ 88
2 Abstract........................................................................................................ 89
3 Introdução.................................................................................................... 90
4 Material e métodos....................................................................................... 92
4.1 Meio de cultura....................................................................................... 92
4.2 Ambiente de cultivo................................................................................ 92
4.3 Variáveis avaliadas……………………………………………………. 94
4.4 Delineamento experimental e análise estatística……………………... 95
5 Resultados e discussão................................................................................. 96
5.1 Características ritotécnicas..................................................................... 96
5.2 Teores de clorofila.................................................................................. 99
5.3 Características anatômicas……………………………………………. 101
5.3.1 Características paradérmicas................................................................ 101
5.3.2 Características do limbo foliar............................................................ 104
5.4 Aclimatização......................................................................................... 108
6 Conclusões................................................................................................... 115
7 Referências bibliográficas............................................................................ 116
i
RESUMO
BRAGA, Francyane Tavares. Ambiente de cultivo na propagação in vitro de
crisântemo (Dendranthema grandiflora TZVELEV cv. Rage):
características anatômicas e fisiológicas. 2006. 119p. Dissertação (Mestrado
em Agronomia. Fisiologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, MG.
1
Planta cultivada pela beleza de suas inflorescências, o crisântemo tem grande
valor comercial por ser uma das culturas ornamentais de maior aceitação no
mercado. A cultura de tecidos tem sido utilizada para a sua propagação
comercial. Devido aos altos custos de produção por meio da micropropagação
convencional, relacionados à perda durante a aclimatização e ao alto consumo de
energia elétrica em salas de crescimento, objetivou-se, com este trabalho, o
cultivo in vitro de crisântemo de forma alternativa. O material constitui-se de
segmento nodais cultivados in vitro durante 60 dias. Num primeiro experimento,
foram testados dois diferentes fatores: luz (sala de crescimento - SC e casa de
vegetação sem - CVSS e com proteção de sombrite 50% - CVSP) e
concentrações de sacarose (0, 15, 30g.L
-1
). Para número de folhas, brotos e
raízes e comprimento da maior raiz, o melhor resultado foi observado 30g.L
-1
de
sacarose e casa de vegetação com sombrite
de 50%. Densidades estomáticas e
diâmetros polar e equatorial em casa de vegetação sem sombrite com adição de
30g.L
-1
de sacarose ao meio. Num segundo experimento, testou-se o efeito de
sombrites coloridos (vermelho e azul) sobre os frascos cultivados em casa de
vegetação (CV) e SC. Para as variáveis fitotécnicas SC mostrou-se mais eficaz
que os demais tratamentos, porém, quanto às telas coloridas, melhores resultados
foram obtidos em CV-vermelho. Quanto aos aspectos anatômicos melhores
resultados foram obtidos em CVSS. Num terceiro experimento, avaliaram-se
dois ambientes de cultivo: CVSP e SC e dois sistemas de vedação: convencional
e ventilada. Para número de folhas, brotos e raízes e comprimento de parte aérea
e raízes, os melhores resultados foram obtidos em CVSP e sistema de vedação
ventilado, porém, os fatores não interagem entre si. Densidades estomáticas e
diâmetro polar e equatorial, CV com sistema de vedação ventilada foram os
melhores resultados. Quanto ao mesofilo, também CV e sistema de vedação
convencional mostraram maiores espessuras. Com os resultados obtidos é
possível recomendar o uso da luz natural na propagação in vitro dessa espécie,
bem como o uso de sistemas de vedação que permitam ventilação natural,
proporcionam uma diminuição nos custos de produção.
_______________________________________
1
Comitê Orientador: Dr. Moacir Pasqual – UFLA. (Orientador), Dr. Evaristo
Mauro de Castro – UFLA. (Co-orientador).
ii
ABSTRACT
BRAGA, Francyane Tavares. Environment of culture in the propagation in
vitro of Dendranthema grandiflora cv. Rage: anatomical and physiological
alterations. 2006. 119p. Dissertation (Master in Agronomy. Major in
Physiology)-Federal University of Lavras, Lavras, MG.
1
Plant cultivated for the beauty of its flowers, chrysanthemum has great
commercial value for being one of the most important ornamental cultures for
plants market . Tissue culture has been used for that plant in commercial
propagation. Becouse of high costs in traditional micropropagation tecnics, to
the loss during the acclimatizing process and high eletric energy consumption in
growth rooms, the objective of this work was to cultivate crisântemo in vitro
trought an alternative way. The material consists of nodal segment cultivated in
vitro, during 60 days. In a first experiment, two different factors had been tested:
light (usual growth room - GR, greenhouse with 50% of – GHS and greenhouse
without shade - GHWS) and different sucrose concentrations (0, 15 e 30 g.L
-1
).
Number of leafs, sprouts and roots and length of the biggest resulted root the
best one was observed 30g.L
-1
of sucrose and greenhouse 50% of shadow –
GHS. Stomatal density, polar and equatorial diameter in greenhouse without
shadow - GHWS and medium aditionated with30g.L
-1
of sucrose. In an second
experiment it was tested the effect of colorful shading (red and blue) for bottles
cultivated in greenhouse without shade - GHWS and growth room - GR. For
fitotecnics variables, GR showed more efficience than the too other treatments,
however, to the colored screens, better results were obteined GH-red. Best
anatomical aspects were gotten in GHWS. The third experiment, there were
avaluated two kinds of environment: GHS and GR and two systems of
prohibition: ventilated and traditional. For leaf number, sprouts and roots and
length of aerial part and roots, the better results had been gotten in GHS and
ventilated system of prohibition, however the factors do not interact between
itself. Stomatal densities and polar and equatorial diameter, GH with system of
ventilated prohibition had the best results. However to mesofilo, GH and the
traditional prohibition system showed hight thicknesses. Acording to the
results, it is possible to recommend the use of the natural light for in vitro
propagation , as well as the use of prohibition systems that allow natural
ventilation, providing a reduction in the production costs.
___________________________
1
Guidance Committee: Dr. Moacir Pasqual – UFLA (Adviser), Dr.
Evaristo Mauro de Castro – UFLA (Co-Adviser).
1
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO GERAL
2
1 INTRODUÇÃO
Planta cultivada pela beleza de suas inflorescências, o crisântemo tem
grande valor comercial por ser uma das culturas ornamentais de maior aceitação
no mercado. Hoje, no Brasil, é a segunda maior flor de corte, em volume de
produção, sendo superada apenas pelo cultivo de rosas.
Existem, atualmente, mais de mil variedades, sendo que
aproximadamente duzentas são cultivadas comercialmente. O crisântemo pode
ser propagado por sementes, porém, esta técnica exige tratos culturais e
fitossanitários trabalhosos e de alto risco, uma vez que a variabilidade genética
existente mostra-se incompatível com o grau de padronização exigido pelo
mercado. Atualmente, o crisântemo é propagado convencionalmente por meio
de estacas. Entretanto, as plantas assim produzidas têm apresentado sérios
problemas relacionados à infecção por viroses, ocasionando prejuízos aos
viveiristas e produtores.
O uso das técnicas de cultivo in vitro tem sido aceito em numerosas
áreas da agricultura comercial, especialmente com ornamentais, para a obtenção
de plantas matrizes.
A cultura de tecidos é uma forma de multiplicação assexuada, que visa
propagar rapidamente plantas sadias e em maior quantidade, a partir de pouco
material vegetativo, independente da época do ano. Além disso, requer pequeno
espaço físico, permitindo também a obtenção de plantas livres de bactérias,
fungos e vírus, que podem afetar o seu desenvolvimento e prejudicar a produção.
Uma das principais formas de cultivo in vitro do crisântemo é a
utilização de segmentos nodais como explante. A propagação, no entanto, exige
um meio individual e otimizado e condições adequadas de incubação.
Em escala comercial, a micropropagação já é realidade em diversas
áreas no mundo. No Brasil, a principal limitação para o maior acesso dos
3
produtores a essas mudas é o elevado custo deste tipo de material propagativo,
que é muito superior ao das mudas convencionais.
Sabe-se que um dos fatores que elevam os custos de produção de mudas
micropropagadas é o gasto com energia elétrica em salas de crescimento. Uma
alternativa para esse fator seria o cultivo de plântulas in vitro em ambiente de luz
natural. Essa tecnologia não é muito adotada, por não estarem esclarecidos seus
efeitos sobre as culturas que, convencionalmente, são condicionadas em luz
artificial, com intensidades luminosas inferiores e com fotoperíodo e
temperatura controlados.
O fator luz é fundamental para o desenvolvimento de plântulas
cultivadas in vitro. A luz influencia em aspectos anatômicos e fisiológicos,
interferindo na qualidade das plântulas durante o processo de aclimatização.
Além de reguladores de crescimento, a luz também pode influenciar na taxa de
multiplicação. Os componentes comprimento de onda e densidade de fluxo
luminoso podem ter efeitos positivos ou negativos no cultivo in vitro. Sendo
assim, é possível manipular o ambiente de luz em busca de melhores formas de
cultivo. A qualidade espectral da luz também pode ser manipulada para a
obtenção de melhores resultados. Algumas características na morfogênese de
plantas em diferentes espectros poderiam ser potencializadas, podendo até
substituir algumas fontes externas de reguladores adicionadas ao meio.
A principal fonte de carbono utilizada nos meios de cultura é a sacarose,
porém, o acréscimo desse carboidrato desenvolve, na plântula, características
mixo ou heterotróficas, o que ocasiona diminuição na taxa de sobrevivência
durante o período de aclimatização, levando à perda de produção e elevando
seus custos. Diante disso, trabalhos têm sido realizados a fim de reduzir a
concentração de sacarose nos meios, induzindo a um maior grau de autrotofia
desses tecidos.
4
Percebe-se, portanto, a crescente necessidade de estudos relacionados ao
ambiente de cultivo in vitro, procurando otimizar o uso da técnica e reduzir os
custos de produção. Objetivou-se melhorar a qualidade das mudas de crisântemo
(Dendranthema grandiflora da cultivar Rage) produzidas in vitro e reduzir os
custos de produção, por meio do uso de luz natural, alteração espectral com telas
de náilon coloridas, redução na concentração de sacarose do meio e sistemas de
vedação de frascos.
5
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Floricultura
A floricultura abrange o cultivo de flores e plantas ornamentais com
variados fins, desde as culturas de flores para corte à produção de mudas
arbóreas (Marques, 2002).
Segundo o Instituto Brasileiro de Floricultura – Ibraflor (2006), o Brasil
possui uma área total de 4850 hectares de produção de plantas ornamentais,
dados esses correspondentes ao ano de 1999. Essa produção ocorre em grande
expansão econômica, destacando-se os estados de São Paulo, Minas Gerais e
Rio de Janeiro, respondendo por cerca de 75% de toda a produção nacional.
Vale destacar que o Brasil possui vantagens para especializar-se na
produção de flores, como clima, disponibilidade de solo e água, além de energia
e mão-de-obra. A rentabilidade dos negócios da floricultura reforça a capacidade
de crescimento do setor. A floricultura nacional é atividade agrícola que requer
pequena área de cultivo, permitindo o aproveitamento de áreas marginais da
agricultura tradicional (Kämpf et al., 1990), possibilitando alto rendimento por
área cultivada e constituindo uma fonte alternativa para pequenos proprietários.
Motos (2000) cita que a produção mundial de flores e plantas
ornamentais ocupa uma área em torno de 190.000 ha, movimentando valores
próximos a US$ 16 bilhões por ano no setor de produção. Do ponto de vista do
faturamento no varejo, somam-se, aproximadamente, US$ 44 bilhões por ano.
A Holanda é altamente competitiva, em termos de custos. Segundo
Groot (1999), este país não depende de baixos custos de mão-de-obra, solo,
matéria-prima e capital, e sim da sua capacidade de inovar rapidamente. Isso
resulta, claramente, em produtividade, qualidade, mão-de-obra profissionalizada
e alta tecnologia.
6
O estado de Minas Gerais vem se destacando no cenário da floricultura
nacional. Em levantamento realizado em 1993, São José (2006) cita que, no
estado, a produção de flores estava localizada em aproximadamente 27 cidades.
As principais regiões produtoras de flores são as de Barbacena, Dona Eusébia,
Andradas, Teófilo Otoni, Munhoz e Senador Amaral, totalizando 342
produtores.
A localização da produção e dos centros de comercialização é um fator a
ser considerado nesta atividade agrícola. Conforme Kras (1999), cerca de 90%
da produção e do consumo de flores e plantas ornamentais se dá em um raio de
500 km entre eles, dado que o custo de transporte e de distribuição de produtos
altamente perecíveis limita a distância para a comercialização. Sendo assim, tais
atividades acontecem por meio das centrais de comercialização.
No fim dos anos 40 foi criada por holandeses, a Cooperativa
Agropecuária de Holambra e, nos anos 80 foi instalado o Veiling, principal
centro de comercialização de flores e plantas ornamentais do Brasil. Hoje, o
Veiling Holambra é responsável por cerca de 35% da comercialização desse
produto no mercado nacional, atendendo a 260 fornecedores da macrorregião de
Holambra e demais regiões produtoras, que os distribuem para todo território
nacional e países do Mercosul (Landgraf & Paiva, 2005). Em Minas Gerais foi
criado em Belo Horizonte no ano de 2001, dentro do Ceasa-BH, o Mercaflor,
destinado exclusivamente para o comércio de plantas ornamentais e flores
(Landgraf & Paiva, 2005).
2.2 Crisântemo
Planta cultivada pela beleza de suas inflorescências, o crisântemo tem
grande valor comercial por ser uma das culturas ornamentais de maior aceitação
no mercado. É uma espécie da família Asteraceae que compreende cerca de
1.100 gêneros e 25.000 espécies, ocorrendo em regiões tropicais, subtropicais e
7
temperadas. No Brasil, essa família compreende cerca de 180 gênero e o
crisântemo destaca-se como espécie cultivada de alto valor econômico (Imenes
& Alexandre, 1996).
Anderson (1987) reclassificou a espécie botanicamente como
pertencendo à tribo Anthemideae, subtribo Chrysantheminae, gênero
Dendranthema e espécie Dendranthema grandiflora Tzvelev.
Das espécies conhecidas na Europa, em 1800, hoje, têm-se inúmeras
variedades de crisântemos, e todos os anos aparecem no mercado outras novas e
diferentes, o que indica a importância comercial da planta cuja flor possui várias
aplicações (Arbós Lavila, 1992). A cultura dessa espécie no Brasil foi
introduzida a partir de cultivares importadas da Europa, Estados Unidos e Japão
e vem sendo desenvolvida desde os anos 70 (Arruda et al., 1996).
Os crisântemos eram denominados de Chrysanthemum morifolium
Ramat, nome originário do grego: chrysos (ouro) e anthemon (flor), ou seja,
significa flor-de-ouro (Arbós Lavila, 1992).
A flor é, na realidade, uma inflorescência composta, com flores nascidas
em capítulos. Nestas encontra-se, ainda, mais de um tipo de flor, que é
classificada de acordo com a forma de suas inflorescências (Figura 1) (Kofranek,
1980).
8
FIGURA 1: Classificação segundo a inflorescência: (A)
simples ou margarida; (B) anêmona ou
girassol; (C) pompons; (D) decorativas; (E)
spider ou fuji; (F) bola ou standard. UFLA.
Lavras, MG, 2006.
O crisântemo é uma planta de dias curtos, florescendo naturalmente no
inverno (Arruda et al., 1996). A ação da luz na floração em plantas sensíveis ao
comprimento do dia é explicada pelo fitocromo. Segundo Taiz & Zeiger (2003),
fitocromo é um complexo pigmento/proteína que absorve a luz na faixa
vermelho e vermelho distante. Embora o florescimento do crisântemo seja
controlado pelo fotoperíodo, a temperatura também é importante à floração,
A B
D
E
F
C
9
havendo um comportamento diferenciado entre as cultivares quanto à resposta a
esse fator (Barbosa, 2003). A temperatura explica a ineficiência e a baixa
qualidade do florescimento, mesmo sob controle fotoperiódico. De acordo com a
temperatura para indução floral, Larson (1997) classificou as cultivares de
crisântemo em três categorias: termozero, na qual o florescimento se processa a
15,5ºC, ocorrendo pouca inibição entre 10ºC e 27ºC, e pode ser cultivada o ano
todo; termopositivo, em que ocorre a inibição do florescimento em temperaturas
abaixo de 15,5ºC, havendo desenvolvimento do botão floral, porém sem abertura
do mesmo: também pode ser cultivado o ano todo, mas com temperatura
controlada, e termonegativo, na qual a inibição do florescimento ocorre com
temperaturas acima de 15,5ºC, sem inibição à iniciação floral.
A cultivar Rage possui inflorescência do tipo margarida, coloração
vermelha (Figura 2) e tem um período indutivo de nove semanas, do início da
aplicação do dia curto ao florescimento (Van Zanten, 2006).
FIGURA 2. Dendranthema grandliflora
cv. Rage Tzvelev. UFLA,
Lavras, MG, 2006.
São grandes a diversidade e a rotatividade de cultivares de crisântemo.
Sendo assim, é importante o conhecimento da adaptação dos mesmos à
10
sensibilidade ao controle fotoperiódico, às exigências do mercado, bem como sua
resistência às doenças e pragas.
2.3 Propagação de crisântemos in vivo e in vitro
A propagação de crisântemos pode ser feita por sementes, rebentos ou
estacas. Segundo Bezerra (1997), a propagação assexuada ou vegetativa é feita
utilizando-se partes vegetativas da planta. As vantagens deste método são
plantas mais uniformes, facilidade de trabalho, baixos custos e redução no tempo
de formação e produção das plantas.
A propagação por sementes exige tratos culturais e fitossanitários
trabalhosos e de alto risco, uma vez que a variabilidade genética existente
mostra-se incompatível com o grau de padronização exigido pelo mercado.
Normalmente, esse método é utilizado apenas no processo de melhoramento
genético (Cuquel et al., 1992). O crisântemo, sendo um complexo híbrido,
segrega facilmente quando propagado por sementes (Kofranek, 1980).
A multiplicação por rebentos é mais demorada e, pela tendência ao
acúmulo de patógenos no material de propagação, formam-se plantas propícias à
"degeneração" e com redução da produtividade (Almeida, 2001).
Hartmann et al. (1997) citam que a estaquia é uma importante técnica de
propagação de plantas ornamentais por se obter, em pouco tempo, grande
quantidade de estacas a partir de poucas matrizes. Esta é a principal técnica
adotada na propagação in vivo de crisântemo.
Segundo Lemaire (1964), a propagação por estacas é a mais indicada,
desde que se tenham boas matrizes. As estacas são separadas da planta-matriz
por meio de um corte, preferencialmente próximo e abaixo de uma gema.
Alguns produtores de estacas ligados à cooperativa Holambra I, Jaguariúna-SP,
as agrupam em lotes com peso homogêneo. Estacas herbáceas, como as do
11
crisântemo, são, principalmente, cultivadas em estufas, evitando-se extremos de
temperatura, mantendo-se a umidade relativa do ar em níveis elevados
(Hartmann & Kester, 1976), favorecendo ainda a hidratação do substrato,
essencial para induzir a formação de raízes (Cutter, 1986).
Outro fator a ser considerado é a utilização de reguladores de
crescimento na propagação in vivo dessa espécie. Diversos autores citam que o
crisântemo responde a reguladores de crescimento para indução do enraizamento
Weaver (1972); Kofranek(1980); Shin & Lee (1979) e Sanderson et al. (1988),
embora outros, considerem que o crisântemo não responda bem ao tratamento
com esses reguladores. As diferenças nas respostas a aplicação de reguladores de
crescimento em crisântemo podem ser explicadas, segundo Samananda et al.
(1972), pelas diferenças genéticas entre cultivares. Hare (1981) e Jerzy &
Stepczynska (1982), trabalhando com diversas cultivares de crisântemo, citaram
significativas diferenças quanto ao enraizamento de estacas em função da
cultivar. O sucesso na utilização de reguladores de crescimento, com a função de
enraizar estacas, depende da interação entre fatores endógenos e ambientais
(Laurie & Ríes, 1942; Riehl, 1957; Odom & Carpenter, 1965; Weigel et al.,
1984). O uso de reguladores não dispensa a necessidade de outras práticas, tais
como seleção de material de propagação e um bom substrato, manutenção de
suficientes níveis de umidade, escolha de luz, aeração e temperatura, as quais
são pré-requisitos para uma ótima iniciação de raízes (Weaver, 1972).
No cultivo de crisântemo, várias técnicas in vitro têm sido utilizadas
com os mais diferentes objetivos. A micropropagação é uma técnica da
biotecnologia que vem se destacando dentro da cultura de tecidos de plantas,
sendo uma forma de propagação assexuada em que se cultivam in vitro,
diferentes tipos de explantes, desde meristemas, sementes ou embriões zigóticos,
até folhas, segmentos caulinares e raízes (Ito, 2004).
12
Convencionalmente, o crisântemo é propagado por meio de estacas,
porém, as plantas têm apresentado sérios problemas ocasionados por viroses,
afetando a produção, o que resulta em prejuízos comerciais.
O potencial uso da cultura de tecidos na propagação e melhoramento do
crisântemo foi relatado por Murashige (1974). Outros autores, como Earle &
Langhans (1974), Jones (1987) e Bhojwani (1990), apresentaram justificativas
para a utilização propagação in vitro do crisântemo, sendo elas: rápida
propagação de plantas e introdução de novas cultivares, indexação de plantas
para viroses, plantas livres de vírus e livres de patógenos. Outros autores como
Sagawa & Kunisaki (1990), citam também a facilidade no manuseio e no
transporte, a independência da sazonalidade, o espaço físico reduzido para
cultivo e utilização de pequenas porções da planta para a produção em larga
escala comercial.
A produção de crisântemo via cultura de tecidos é ainda bastante
onerosa, porém, há interesse na produção de matrizes sadias para otimizar a
produção in vivo. Há a necessidade de se estabelecer um protocolo para otimizar
a multiplicação da espécie, assim como seu enraizamento e aclimatação (Jones,
1987; Bhojwani, 1990).
A utilização de segmentos nodais como explantes é uma das maneiras
de viabilizar a produção in vitro. Prasad & Chaturvedi (1988) testaram vários
explantes para a propagação de crisântemo e obtiveram melhores brotações em
ápices de segmentos nodais. Pierik (1987) e Bhojwani (1990) recomendam a
utilização de segmentos nodais simples, ou seja, aqueles que contenham apenas
uma gema para a propagação de crisântemo.
Libanio & Witmer (1987), estudando as diferenças entre plantas de
crisântemo propagadas in vivo e in vitro, observaram que o material propagado
in vitro era mais precoce e homogêneo, justificando a expressiva superioridade
na produção e na qualidade das flores comercializadas.
13
2.4 Ambiente de cultivo
O ambiente de cultivo é um fator relevante na propagação in vitro, uma
vez que os métodos tradicionais requerem a utilização de recipientes selados.
Nessas condições, os explantes cultivados crescem em taxas de umidade relativa
elevadas, assim como alta disponibilidade de água no meio de cultura, induzindo
a um desenvolvimento anatômico ineficaz, tornando o processo de aclimatização
difícil e demorado.
Quando cultivadas em ambiente in vitro as plântulas apresentam
características de fotossíntese, transpiração e absorção baixas.
Tais características são observadas na formação dos órgãos,
principalmente as folhas. Estas, quando formadas durante a cultura de tecidos,
apresentam diferenças anatômicas se comparadas a folhas formadas pelo
processo ex vitro, afetando, principalmente, a fotossíntese. Nas diferenças
anatômicas são observadas: composição e espessura de camadas de ceras,
pigmentação e comportamento estomático (Lee et al., 1985; Preece & Sutter,
1991). Plantas desenvolvidas in vitro possuem menos cera epicuticular e
cuticular que plantas cultivadas ex vitro, levando a planta a uma transpiração
excessiva (Brainerd & Fuchigami, 1981). Quando aliada a uma ineficiência do
mecanismo de abertura e fechamento dos estômatos, ocorre perda de água pela
planta, sendo este um fator que causa baixas taxas de sobrevivência durante o
processo de transplantio e aclimatização.
Diversas técnicas e metodologias têm sido aplicadas com o objetivo de
fornecer condições ambientais que promovam o aumento na capacidade
fotossintética do explante microprapagado, principalmente com a utilização de
filtros de membranas com microporos permeáveis a gases, os quais promovem o
aumento na troca de gases entre o recipiente de cultivo e o ambiente externo
(sistema de ventilação natural) (Cui et al., 2000; Zobayed et al., 2002).
14
2.4.1 A luz no cultivo in vitro
A realização de alguns processos vitais nas plantas é dependente de luz,
tais como fotossíntese, fotomorfogênese e fototropismo. A intensidade, a
qualidade e a duração afetam particularmente o processo fotossintético e
processos mediados por fitocromos, tendo o fototropismo pouca influência no
cultivo in vitro (George, 1993; Handro & Floh, 1990; Kozai et al., 1991; Kodyn
& Zapata-Arias, 1998).
A intensidade luminosa necessária para o cultivo de tecidos vegetais
depende do estágio da micropropagação, do explante utilizado e, principalmente,
da espécie propagada (Economou & Read, 1987).
Uma das formas de facilitar o processo de aclimatização de plântulas
cultivadas in vitro seria aumentar a intensidade luminosa, promovendo a
fotossíntese e melhorando as relações hídricas (Zhou et al., 2005). Ibaraki &
Nozaki (2005) afirmam, ainda, que, se houver necessidade de desenvolver
capacidade fotossintética nos tecidos, um dos fatores mais importantes que
devem ser considerados é o ambiente de luz, especialmente a intensidade.
A intensidade luminosa pode ter um efeito pronunciado no
desenvolvimento foliar e pode modificar características, tais como espessura
foliar, diferenciação do mesofilo, divisão celular e desenvolvimento dos
estômatos (Lee et al., 1988).
Sabe-se que o fator luz é capaz de influenciar intensamente a fotossíntese,
a concentração de clorofila e a ultra-estrutura de cloroplastos. Em avaliações de
cultivos de Liquidambar styraciflua, a baixa capacidade fotossintética não
representa um fator limitante para a aclimatização de plântulas e para o
crescimento dos materiais transplantados (Lee et al., 1985). Sendo assim, as
dificuldades de sobrevivência das plântulas transplantadas são, provavelmente,
relacionadas com as adaptações relacionadas às relações hídricas, uma vez que
essas plântulas apresentam um desenvolvimento cuticular reduzido e mesofilo
15
com grandes espaços intercelulares (Wetzstein & Sommer, 1982) e também
divergentes configurações de estômatos, com reduzida funcionalidade
(Wetzstein & Sommer, 1983).
Alguns autores vêm estudando as vantagens da utilização da luz natural
no lugar da luz artificial. Kodyn e Zapata-Arias (1999) estudaram a utilização
potencial da luz solar sobre o cultivo in vitro de bananeiras Grande Naine e os
efeitos de temperaturas flutuantes, do fotoperíodo e da intensidade luminosa nas
taxas de multiplicação e na qualidade das plântulas. Testando três diferentes
ambientes de cultivo in vitro - câmara de crescimento com luz artificial e
temperatura controladas, sala de crescimento com luz natural sem controle de
temperatura e casa de vegetação com luz natural, também sem controle de
temperatura, observaram que as maiores taxas de multiplicação foram obtidas
sob condições de luz natural, em casa de vegetação. Nessa condição, as plântulas
apresentaram-se mais verdes claras e com desenvolvimento de uma área foliar
maior do que na luz artificial. Entretanto foi observada queima de folhas e perda
de turgor.
Seko & Nishimura (1996) verificaram crescimento fotoautotrófico in
vitro, em meio de cultura sem sacarose, enriquecido com CO
2
, com explantes
regenerantes de cultura de calos de arroz, sob condições de iluminação contínua
(24 h) e sob alta intensidade (densidade de fluxo de fotons fotossintéticos de 125
µmol m
-2
s
-1
), durante a fase de alongamento e enraizamento de brotações.
Lee et al. (1988), trabalhando com Liquidambar styraciflua L., obtiveram
resultados mostrando que diferenças no fluxo quântico podem modificar o
desenvolvimento in vitro. A elevação nos níveis de luz produziu folhas mais
espessadas in vitro, com diferenciação do tecido paliçádico no mesofilo das
folhas. A anatomia foliar destas plântulas apresentou-se mais próxima de folhas
de mudas em aclimatização do que o material in vitro crescendo sob baixa
irradiância.
16
A partir dos estudos apresentados, constata-se que a luz natural
apresenta vantagens sobre o sistema de iluminação artificial, principalmente no
que se refere a alterações anatômicas e fisiológicas, destacando-se o crescimento
das plântulas micropropagadas, a melhoria das características fisiológicas,
devido às condições do ambiente de cultivo serem mais semelhantes àquelas
naturais, adaptando melhor essas plantas quando transplantas para ambiente ex
vitro.
2.4.2 Qualidade de luz
Os vegetais utilizam sinalizadores para promovere determinados
padrões de crescimento e esses sinalizadores respondem à qualidade de luz
(Almeida & Mundstock, 2001), crescendo sob uma região limitada no espectro
visível e exibindo morfologia e fisiologia determinadas pelas variações ocorridas
neste espectro (Eskins & Beremand, 1990).
Assim como todos os fatores que influenciam o desenvolvimento e o
crescimento de uma planta, a resposta à qualidade de luz também depende da
espécie em estudo (Schuerger et al., 1997; Antonopolou et al., 2004).
A qualidade espectral afeta estruturalmente a anatomia das folhas,
parecendo exercer maiores efeitos durante a expansão foliar, exibindo alto grau
de plasticidade tanto anatômico como fisiológico para mudanças na qualidade
espectral da luz (Saebo et al., 1995; Schubeger et al., 1997; Sims & Pearcy,
1992).
Já são bem estudados os efeitos das alterações espectrais sobre
processos, como germinação, inibição de alongamento do hipocótilo, expansão
dos cotilédones e das folhas, enverdecimento e biossíntese de pigmentos,
alongamento do caule e indução ao florescimento (Saitou et al., 2004; Taiz &
Zeiger, 2003; Tsegay et al., 2005).
17
A dependência das plantas à luz é um processo complexo que envolve a
ação combinada de fotorreceptores que controlam estágios variados no
desenvolvimento (Shahak, 2005; Shamir et al., 2001). São conhecidas três
classes de fotorreceptores consideradas principais: criptocromos e fototropinas,
que absorvem luz nas regiões do azul e ultravioleta e os fitocromos, que
absorvem luz nas regiões do vermelho e vermelho distante (Frankhauser &
Chori, 1997; Kagawua et al., 1992; Niemi et al., 2005; Saitou et al., 2004). Os
mecanismos pelos quais tais fotorreceptores regulam as respostas são, ainda,
desconhecidos na sua maioria.
A luz vermelha tem influência no desenvolvimento das plantas, pelas
alterações nas razões vermelho/vermelho distante (V:VD) absorvidas por formas
interconversíveis do fitocromo. Variações nas razões V:VD estimulam respostas
ao alongamento do caule, florescimento e alterações na condutância estomática
(Schuerger et al., 1997; Smith, 1992) e promovem, também, redução da
espessura foliar sob condições de sombreamento (Barreiro et al., 1997;
Kasperbauer & Peasler, 1973; Schuerger et al., 1997). Porém, essa redução pode
ser resultado de redução na radiação azul (Pushnick et al., 1987).
Alguns autores têm sugerido que o fitocromo regula o transporte de
reguladores de crescimento, entre eles as auxinas (Niemi et al., 2005; Tian &
Reed, 2001). Outros autores afirmam que o alongamento da parte aérea e
dominância apical, respostas comuns à luz vermelha, seja processo mediado pelo
fitocromo por meio do controle de enzimas, tal que a auxina pode ser conservada
em culturas iluminadas com luz vermelha, mas pode também ser degradada em
culturas mantidas sob luz azul (Marks & Simpson, 1999).
Dale (1988) cita que o fitocromo pode estar envolvido no controle de
genes ligados à fotossíntese, codificando a síntese de clorofilas a e b, pequenas
subunidades da rubisco, entre outros aparatos fotossintéticos.
18
Outro importante grupo de fotorreceptores para o desenvolvimento das
plantas são os que absorvem na região do azul. Inúmeras respostas têm sido
descritas em plantas, sendo elas: taxa de inibição no crescimento do hipocótilo,
fototropismo e indução de expressão gênica (Frankhauser & Chory, 1997;
Motersen & Stromme, 1987; Silva & Debergh, 1997). Além dessas respostas, a
luz azul é importante em processos de síntese de pigmentos, enzimas,
desenvolvimento de cloroplastídeos, abertura e fechamento estomático, ativação
do ritmo circadiano da fotossíntese e de muitos outros processos
fotomorfogênicos (Eckert & Koldenhoff, 2001; Pushnick et al., 1987; Schuerger
et al., 1997).
Plantas cultivadas sob luz azul podem resultar em altas taxas de
brotações laterais, devido à quebra da dominância apical causada pela
degradação de auxinas nessa faixa do espectro (Chee & Pool, 1989; Silva &
Debergh, 1997).
2.4.3 Sacarose na propagação in vitro
Células, tecidos e órgãos cultivados in vitro são heterotróficos e
dependem de uma fonte externa de carbono. Os carboidratos fornecem energia e
esqueleto de carbono necessários à síntese de polissacarídeos, aminoácidos e
proteínas. Na cultura de tecidos, a fonte mais comum de carboidrato utilizada é a
sacarose, que pode ser total ou parcialmente hidrolisado em glicose e frutose,
essenciais aos processos metabólicos dos vegetais. Dentre as características que
conferem importância à utilização da sacarose como principal fonte de carbono,
destacam-se: sua alta solubilidade e a rápida metabolização, uma vez que, os
produtos de sua hidrólise serão utilizados na via glicolítica ou na rota das
pentose-fosfato ou, ainda, serão armazenadas nos vacúolos como amido
(Pasqual, 2001).
19
A concentração de sacarose no meio tem efeito sobre a multiplicação e o
crescimento da espécie micropropagada, utilizando-se comercialmente 2% a 4%
(peso por volume). Abaixo dessa faixa, as plântulas podem apresentar clorose;
acima dela, pode-se acarretar problemas, devido ao excessivo potencial
osmótico do meio (Grattapaglia & Machado, 1998a). George (1993) observa que
a presença de sacarose no meio de cultura inibe a formação de clorofila e
conseqüentemente, a fotossíntese, prejudicando o crescimento autotrófico.
Alguns autores demonstraram que o cultivo de plantas com concentrações de
sacarose entre 20 a 30 g.L
-1
propiciaram acúmulo de açúcares solúveis na folha,
sob a forma de grãos de amido no cloroplastídeo, o que pode levar à inibição da
síntese de rubisco e clorofila, o que impediria regeneração do substrato RuBP
pela deficiência em fosfato inorgânico no estroma do cloroplastídeo,
conseqüentemente, reduzindo as taxas fotossintéticas (Capellades et al., 1991;
Chenevard et. al., 1997; Kanechi et al., 1998; Jackson, 1999).
Em trabalho realizado com regenerantes de arroz, a partir de cultura de
calos, cultivados em meio desprovidos de sacarose, com enriquecimento de CO
2
,
foi observada hiper-hidricidade, de forma que suas brotações, provavelmente,
continham anormalidades anatômicas, incluindo estômatos pouco desenvolvidos
(Seko & Nishimura, 1996). A hiper-hidricidade, ou vitrificação, pode ter sido
verificada em função do baixo potencial hídrico do meio de cultura,
disponibilizando, mais facilmente, água para os explantes. Nas plantas
micropropagadas, o pobre desenvolvimento das folhas durante o cultivo in vitro
tem sido considerado a principal causa da baixa taxa de sobrevivência destas,
após a transferência para o ambiente natural (Lee et al., 1985; Nguyen et al.,
1999). A perda de vigor observada após a transferência para casa de vegetação,
de acordo com Marin & Gella (1988), deve-se à inanição causada pela baixa
eficiência na troca do metabolismo heterotrófico (com dependência total de uma
fonte externa de carbono) para o metabolismo fotoautotrófico (com dependência
20
total de fotossíntese). Dessa forma, a eliminação total da sacarose do meio de
cultura deve ser questionada, para algumas situações. Debergh (1988) afirma
que a redução, ou até mesmo, a eliminação da sacarose do meio de enraizamento
devem ser utilizadas com a finalidade de facilitar a passagem das plantas para o
estágio autotrófico no transplantio para a fase de aclimatização.
2.5 Morfofisiologia de plantas micropropagadas
O desenvolvimento normal de uma planta pode ser afetado,
principalmente quanto a aspectos anatômicos, quando estas são cultivadas fora
do seu ambiente natural (Castro, 2003). Há, portanto, necessidade da realização
de pesquisas com anatomia foliar que possam conduzir a soluções para
problemas referentes à multiplicação dessas plantas (Gavilanes, 1981). A
avaliação decorrente das condições de cultura in vitro é uma base para a
compreensão do processo de adaptação da espécie, assim como fator importante
para o estabelecimento de um manejo eficiente para a condução de sistemas de
produção comercialmente viáveis (Santiago et al., 2001).
Fatores como alta umidade relativa no interior do recipiente e baixa
irradiância podem provocar alterações significativas estruturais e funcionais nos
tecidos, levando à incapacidade, principalmente no controle de perda de água,
quando submetidas às condições adversas do ambiente natural (Sciutti & Morini,
1995).
A excessiva perda de água, que contribui para a dessecação das plantas,
tem sido atribuída a anormalidades induzidas in vitro, como pobre formação de
cera epicuticular, alteração na composição química das ceras, com o aumento na
proporção de componentes hidrofóbicos, deficiência no mecanismo de
fechamento estomático (Shackel et al., 1990), aumento na freqüência de
estômatos (Lee et al., 1988), localização mais superficial dos estômatos na
epiderme da folha, presença de hidatódios (Capellades et al., 1990) e reduzida
21
diferenciação do mesofilo das folhas, com alta proporção de espaços
intercelulares (Dimassi-Theriou & Bosabalidis, 1997).
A desordem estrutural nas plantas in vitro é resultado de complexos e
múltiplos fatores no meio de cultura. A conseqüência é baixa taxa de
sobrevivência das plantas, quando transferidas para condições ex vitro.
Em trabalhos realizados comparando o desenvolvimento de espécies in
vitro e ex vitro, Wetzstein & Sommer (1982) observaram que folhas de
Liquidambar styraciflua apresentaram menor conteúdo citoplasmático e um
menor desenvolvimento de cloroplastídeos, quando comparadas com folhas
dessa espécie crescida a campo.
A formação de apenas uma camada de células paliçádicas em plantas
micropropagadas, em comparação com plantas desenvolvidas em casa de
vegetação, as quais normalmente apresentam de duas a três camadas de células
paliçádicas, além de maiores espaços intercelulares no mesofilo, vem sendo
relatada para algumas espécies (Soares, 2005).
Folhas persistentes de morangos tornaram-se mais espessas devido à
camada de células paliçádicas (Fabbri et al., 1986), porém, não houve mudanças
no número ou na quantidade dos espaços intercelulares no mesofilo. O
desenvolvimento de novas folhas, depois da remoção do meio de cultivo, foi
considerado como sendo importante para o crescimento vigoroso das plantas.
Durante a aclimatização, folhas presentes, como folhas primordiais in vitro,
assumiram características intermediárias entre folhas crescidas in vitro e aquelas
crescidas em casa de vegetação.
As novas folhas produzidas durante a aclimatização possuem
características de transição que podem conferir maior capacidade fotossintética,
conseqüentemente aquisição de fotoautotrofia e de regulação hídrica às plantas
(Sutter & Langhans, 1979; Smith et al., 1986; Wardle et al., 1983). Capellades et
al. (1990) citam que o período de aclimatização ex vitro permite redução na
22
densidade estomática, altera o formato e a topografia dos mesmos e, no geral,
favorece os diversos parâmetros foliares.
Por tais motivos, faz-se necessária uma gradual aclimatização, a fim de
que as plântulas sobrevivam, quando transferidas para diferentes condições
ambientais.
2.6 Aclimatização
A aclimatização de plantas micropropagadas consiste num processo em
que se transfere a planta cultivada in vitro para ex vitro, em geral, casa de
vegetação. O objetivo desse processo é superar possíveis dificuldades
decorrentes da mudança de ambiente, sendo, portanto, um fator limitante na
cultura de tecidos. O sucesso desta técnica requer que as plantas que se
desenvolveram heterotroficamente, sob condições de alta umidade,
posteriormente se desenvolvam autotroficamente, em condições de moderada ou
baixa umidade, temperaturas e luminosidades elevadas (Zimmerman, 1988).
Para muitas espécies, a aclimatização é considerada uma fase crítica da
micropropagação, sendo um dos maiores obstáculos à aplicação prática dos
métodos de cultura de tecidos na propagação de plantas devido à grande
diferença entre as duas condições ambientais (Read & Fellman, 1985). A perda
de vigor e a subseqüente morte devido ao dessecamento são dois sérios
problemas que ocorrem com plantas que são transferidas das condições in vitro
para casa de vegetação (Sutter & Hutzell, 1984).
Uma das causas mais relevantes da baixa taxa de sobrevivência de
plantas aclimatizadas é a excessiva perda de água pelas plantas (Brainerd &
Fuchigami, 1992; Sutter & Langhans, 1982). A quantidade reduzida de cera
epicuticular está relacionada com o aumento da perda de água. Foi observada
uma taxa de transpiração mais elevada em folhas de plantas com baixa
quantidade de cera epicuticular, quando comparadas com plantas que cresceram
23
em casa de vegetação ou que já estavam aclimatizadas (Wardle et al., 1983;
Sutter & Langhans, 1982). O mecanismo de abertura e fechamento estomático
de plantas cultivada in vitro em processo de aclimatização é mais lento do que
em plantas cultivadas ou mantidas em casa de vegetação, ocasionando rápida
perda de água, levando a um colapso nas folhas, resultando em clorose.
Grattapaglia & Machado (1998b) citam que vários fatores são limitantes
durante o processo de aclimatização: 1) passagem de baixo fluxo respiratório (in
vitro) para um ambiente que demanda aumento na taxa respiratória; 2) a plantas
passam de um meio heterotrófico, com grande suprimento de carbono, para um
autotrófico, sendo necessária a realização de fotossíntese para sobreviver; 3) o
aumento na absorção de sais rapidamente e 4) a planta passa de um ambiente
asséptico para outro, sujeito ao ataque de microrganismos e pragas.
Existem vários métodos que podem ser empregados para a
aclimatização de plantas micropropagadas, sendo estes agrupados em três
classes: a) métodos que aproximam as condições in vitro das condições naturais;
b) métodos que aproximam as condições naturais daquelas in vitro e c) métodos
que favorecem o crescimento das mudas após a aclimatização.
A primeira classe inclui técnicas de redução da umidade relativa do ar
dentro dos recipientes de cultura (Wardle et al., 1983), uso de substratos
alternativos ao ágar de modo que proporcione raízes mais ramificadas e de
melhor qualidade para tolerar a aclimatização (Leite, 1995). Facilitar as trocas
gasosas por meio do selamento permeável dos recipientes (Serret et al., 1997,
citados por Hoffmann et al., 1996), aumento de CO
2
associado ao aumento da
intensidade luminosa e a redução de sacarose, são outras técnicas incluídas nessa
classe (Fujiwara et al., 1988).
A segunda classe inclui o uso de ambientes com elevada umidade
relativa do ar (acima de 90%), que favoreça a aclimatização, sendo necessária a
redução gradativa da mesma após o período crítico inicial (Marin & Gella, 1988;
24
Corsato, 1993). O sombreamento do local onde as plantas estão sendo
aclimatizadas e a manutenção da sanidade do local e das mudas são técnicas
simples incluídas nessa classe.
Nos métodos que favorecem o crescimento de mudas, após a
aclimatização, estão incluídas técnicas, como enraizamento ex vitro ou in vitro
(Pasqual & Lopes, 1991; Biasi, 1996), escolha do substrato adequado (Normah
et al., 1995), uso de micorrizas (Corsato, 1993) e uso de inoculantes de bactérias
fixadoras de nitrogênio, no caso de espécies leguminosas.
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36
CAPÍTULO II
LUZ NATURAL E CONCENTRAÇÃO DE SACAROSE NA
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE Dendranthema grandiflora cv. Rage:
ALTERAÇÕES ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS
37
1 RESUMO
BRAGA, Francyane Tavares. Luz natural e concentração de sacarose na
propagação in vitro de Dendranthema grandiflora cv. Rage: alterações
anatômicas e fisiológicas. In: ______. Environment of culture in the
propagation in vitro of Dendranthema grandiflora cv. Rage: anatomical and
physiological alterations. 2006. Cap. 2, p.36-61. Dissertação (Mestrado em
Agronomia.Fisiologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
1
O uso de lâmpadas em salas de crescimento constitui um dos componentes que
mais elevam o custo total de produção in vitro, tornando-se necessário estudar as
vantagens potenciais da utilização de luz solar sobre a luz artificial para o
cultivo in vitro. O trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito do ambiente de
cultivo in vitro de Dendranthema grandiflora cv. Rage, sob diferentes
concentrações de sacarose. Os explantes constituíram-se de segmentos nodais
contendo uma gema, já estabelecidos in vitro. O meio de cultura utilizado foi o
MS combinando às concentrações de sacarose (0; 15 e 30g.L
-1
), sob três
ambientes de cultivo (sala de crescimento, casa de vegetação sem proteção de
sombrite e casa de vegetação com proteção de sombrite 50%). A avaliação foi
efetuada 60 dias após a instalação do experimento. Para o número de folhas,
brotos e raízes, e comprimento da maior raiz, o melhor resultado foi observado
nos tratamentos 30g.L
-1
de sacarose e condições de incubação em casa de
vegetação com sombrite
de 50%. Quanto ao comprimento médio de parte aérea,
o melhor resultado foi 15g.L
-1
em sala de crescimento. Maiores densidades
estomáticas e diâmetros polar e equatorial foram observados nos tratamentos em
casa de vegetação sem sombrite com adição de 30g.L
-1
de sacarose ao meio. O
ambiente de cultivo altera as respostas de plântulas cultivadas in vitro sendo
possível recomendar o uso da luz natural e a redução das concentrações de
sacarose do meio de cultura, na fase de micropropagação de crisântemo, com
possível melhoria da qualidade das mudas e redução dos custos de produção.
_______________________________________
1
Comitê Orientador: Dr. Moacir Pasqual – UFLA. (Orientador), Dr. Evaristo
Mauro de Castro – UFLA. (Co-orientador).
38
2 ABSTRACT
BRAGA, Francyane Tavares. Light natural and sucrose concentration in the
propagation in vitro of Dendranthema grandiflora cv. Rage. In: ______.
Environment of culture in the propagation in vitro of Dendranthema
grandiflora cv. Rage: anatomical and physiological alterations. 2006. Cap.2,
p.36-61. Dissertation (Master in Agronomy.Major in Physiology)-Federal
University of Lavras, Lavras, MG.
1
The use of light bulbs in growth rooms is a component that most raise total cost
for in vitro production plants , making necessary to study the potential
advantages of solar light with artificial light for the in vitro culture. The
objective of this work was to evaluate the effect of the in vitro culture
environment of Dendranthema grandiflora cv. Rage under different sucrose
concentration. The explantes were composed of nodal segments contending one
shut, already established in vitro. The MS medium with different sucrose
concentrations (0; 15 and 30g.L
-1
), under three different environments (usual
growth room - GR, greenhouse with 50% of shadow – GHS and greenhouse
without shadow - GHWS). The evaluation was done 60 days after the
experiment installation. For the number of leafs, sprouts and roots and length,
the best treatment was obtained with 30g.L
-1
of sucrose and conditions of
incubation in greenhouse with 50% of shadow – GHS. For the average number
of leaf, the best result for the aerial part was obtained with 15g.L
-1
in growth
room. Bigger stomatal density and diameter, were observed in the treatments in
greenhouse without shadow - GHWS with 30g.L
-1
of sucrose. The culture
environment modified plants cultivated in vitro, being possible to recommend
the use of natural light and the reduction of the sucrose concentration in the
medium for micropropagation of chrysanthemum. This alternative would
improve the quality of changes and reduction of production costs.
________________________________
1
Guidance Committee: Dr. Moacir Pasqual – UFLA (Adviser), Dr.
Evaristo Mauro de Castro – UFLA (Co-Adviser).
39
3 INTRODUÇÃO
A necessidade de aumentar a eficiência das técnicas de propagação in
vitro impulsionou a condução de estudos envolvendo a manipulação e o controle
das condições de cultivo para otimizar o crescimento in vitro, aumentar a
sobrevivência após a transferência no processo de aclimatização, garantir a
qualidade das plantas produzidas por essas técnicas e obter redução de custos.
Considera-se que explantes e plantas cultivadas in vitro não possuem
capacidade fotossintética para promover um balanço positivo de carbono e
requerem a suplementação deste ao meio. A fonte mais utilizada para o seu
crescimento heterotrófico ou mixotrófico pe a sacarose. Porém, inúmeros
estudos têm provado que as plantas cultivadas in vitro possuem capacidade
fotossintética e a realizam de maneira satisfatória, podendo, assim, reduzir ou
eliminar o requerimento de uma fonte externa de carbono ao meio de cultura.
No processo de cultivo in vitro, o que torna a técnica onerosa é a
manutenção das salas de crescimento, principalmente nos gastos com energia
elétrica e a perda de plântulas durante a aclimatização, isso porque a intensidade
luminosa pode ter efeito pronunciado no desenvolvimento foliar e pode
modificar características, tais como espessura, diferenciação do mesofilo,
divisão celular e desenvolvimento dos estômatos. A alta umidade relativa dentro
dos frascos e as baixas concentrações de CO
2
são fatores que afetam as taxas
fotossintéticas e, principalmente, reduzem a funcionalidade dos estômatos.
A redução dos custos de produção, bem como a aproximação do
ambiente de cultivo in vitro com o ex vitro, pode ser obtido por meio do uso de
luz natural e da redução da concentração de sacarose no meio, melhorando as
características fisiológicas das plântulas cultivadas e levando a um melhor
desenvolvimento na fase de aclimatização.
40
Nesse contexto, o presente trabalho teve por objetivo melhorar a
qualidade de plântulas na propagação in vitro de Dendranthema grandliflora cv.
Rage, utilizando-se a luz natural como ambiente de cultivo e redução na
concentração de sacarose, visando à redução dos custos de produção.
41
4 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido na Universidade Federal de Lavras (UFLA) no
Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de Agricultura durante o
período de fevereiro a abril de 2005.
O material vegetal utilizado constituim-se de plântulas da espécie
Dendrathema glandifloria cv. Rage, já estabelecidas in vitro. Foram retirados
dessas plântulas segmentos nodais contendo uma gema e inoculados em meio
MS (Murashige & Skoog, 1962), com adição de 30g L
-1
de sacarose e 5g L
-1
de
ágar. Os segmentos foram mantidos em sala de crescimento a 25±2ºC, com
radiação de 52,5W m
-2
e 16 horas de fotoperíodo, até atingirem o tamanho
adequado para utilização no experimento.
4.1 Meio de cultura
Segmentos contendo uma gema foram cultivados em meio MS, com a
concentração convencional dos sais, acrescido de ágar na concentração de
5g.L
-1
. Testaram-se três diferentes concentrações de sacarose (0; 15 e 30g L
-1
).
Foram utilizados tubos com 15mL
-1
de meio em cada tubo. O pH do meio foi
ajustado para 5,8, antes da autoclavagem a 121ºC e 1,2 atm durante 20 minutos.
4.2 Ambiente de cultivo
O experimento foi conduzido em casa de vegetação, sendo os tubos
fechados com tampas de polipropileno e vedados com plástico do tipo parafilme
e cobertos adicionalmente com saquinhos plásticos (Figura 3). Para o cultivo sob
luz natural, o material foi colocado diretamente sobre as bancadas, ou sob
proteção adicional de sombrite com 50% de retenção da radiação (Figura 3).
Foram cultivadas também plântulas em tubos mantidos em sala de crescimento
42
convencional, com fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25±2ºC, com
intensidade de 52,5W.m
-2s-1
(LI-200SA; Li-cor, Lincoln, Nevasca, USA),
fornecida por lâmpadas brancas fluorescentes, para servir como tratamento
controle.
FIGURA 3: Visão geral das plântulas mantidas em casa de vegetação.
UFLA, Lavras - MG. 2006.
A caracterização do comportamento diurno da radiação solar e da
temperatura do ar foi feita por meio de medidas em dias típicos, durante o
período de cultivo. As avaliações foram feitas utilizando-se sensores de radiação
(LI-200SA, Li-cor, Lincoln, Nevasca, USA) acoplados a um sistema de registro
(LI 1400; Li-cor. Neb), sendo os dados registrados a cada meia hora, durante 11
horas (das 7:00 às 18:00) As médias obtidas em cada microambiente para
radiação durante o período avaliado estão apresentadas na Tabela 1.
43
TABELA 1. Radiação solar e temperatura média do ar observadas nos
microambientes em casa de vegetação.
Ambiente com sombrite Ambiente sem sombrite
Radiação
(MJ.m
-2
.dia
-1
)
1,15
Temperatura
(ºC)
28
Radiação
(MJ.m
-2
.dia
-1
)
2,66
Temperatura
(ºC)
26
4.3 Variáveis avaliadas
Após 60 dias de cultivo, foram avaliadas as seguintes variáveis:
yCaracterísticas fitotécnicas: número de brotos, folhas e raízes por
plântula, comprimento da parte aérea e comprimento da maior raiz.
yCaracterísticas anatômicas: após a coleta de dados fitotécnicos,
plântulas foram selecionadas e fixadas em álcool etílico 70%, até a realização
das análises, para as quais foi coletada a segunda folha, contando-se a partir do
ápice.
Os cortes paradérmicos foram efetuados manualmente no terço médio
foliar, na superfície abaxial das folhas. Para os cortes transversais, utilizou-se
um micrótomo de mesa; também foram realizados cortes na região do terço
mediano das folhas. As lâminas das seções paradérmicas foram preparadas com
corante safranina em glicerina 1% (v/v). Dessas seções, as variáveis analisadas
foram: densidade estomática (nº de estômatos por mm
-2
) e diâmetros polar e
equatorial dos estômatos. A freqüência estomática foi avaliada com auxílio de
uma câmara clara, em microscópio Olympus CBB, seguindo a técnica descrita
por Laboriau et al. (1961).
Para cada tratamento foram avaliadas cinco folhas, tendo, para cada
folha, sido efetuadas cinco avaliações em campos diferentes. A freqüência
estomática foi avaliada com auxílio de uma câmara clara, em microscópio
44
Olympus CBB, seguindo a técnica descrita por Laboriau et al. (1961). As
fotomicrografias foram feitas no Laboratório de Citogenética do Departamento
de Biologia da UFLA, utilizando-se máquina fotográfica acoplada a um
microscópio Olympus modelo BX 60 em objetiva de 40x.
4.4 Delineamento experimental e análise estatística
O experimento foi montado em delineamento inteiramente casualizado,
em esquema fatorial 3X3, sendo três ambientes: sala de crescimento
convencional, casa de vegetação sem proteção e casa de vegetação com sombrite
50% e três diferentes concentrações de sacarose, 0; 15 e 30g L
-1
, totalizando
nove tratamentos, com dezesseis repetições. Cada repetição foi composta por um
tubo de ensaio contendo um segmento nodal cada.
Aos 60 dias de cultivo, as plântulas foram removidas dos recipientes
para proceder-se à coleta de dados. Os dados foram submetidos ao programa
SISVAR 4.3 (Ferreira, 1999), para a realização das análises de variância. As
médias foram comparadas pelo Teste de Scott & Knott a 5% de probabilidade.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Características fitotécnicas
Não houve significância para as interações entre os fatores de ambiente
de cultivo e concentração de sacarose no meio de cultura para todas as variáveis
avaliadas.
Os resultados obtidos em diferentes concentrações de sacarose no meio
de cultura, para número de folhas, raízes e brotos, e comprimento de parte aérea
e raízes, estão apresentados na Tabela 1.
45
TABELA 1. Número de folhas (NF), comprimento de parte aérea (CPA),
número de raízes (NR), comprimento da maior raiz (CR) e número
de brotações (NB), de plântulas de crisâtemo cv. Rage, cultivadas
em meios MS acrescido de diferentes concentrações de sacarose.
SACAROSE (g L
-1
) NF CPA (cm) NR CR (cm) NB
0
6,02c 1,85b 0,02c 0,02c 0,85b
15
17,10b 3,88a 5,91b 4,41b 1,52a
30
23,37a 3,80a 8,00a 6,30a 1,80a
* Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si, pelo teste
de Scott & Knott, a 5%.
O melhor resultado para todas a variáveis analisadas foram 15 e 30g L
-1
de sacarose. Maior número de folhas foi obtido com a concentração de 30gL
-1
de
sacarose, com média de 23,37 folhas e a menor média foi observada para o meio
sem adição de sacarose.
Resultados similares foram obtidos por Oliveira (1994), testando
diferentes concentrações de sacarose, relacionadas a diferentes concentrações do
meio MS no cultivo in vitro de crisântemo cv. Orange Reagen, quando observou
maior número de folhas na maior concentração de sacarose (6%). Dignart
(2006), trabalhando com Cattleya walkeriana, observou que as concentrações de
30g L
-1
e 15g L
-1
não resultaram em diferenças estatísticas na propagação in
vitro da espécie. Chu & Ribeiro (2002) observaram que, para o número de folhas
produzidas por gemas de diferentes espécies de Dioscorea cultivadas in vitro,
houve correlação positiva com a concentração de sacarose no meio, tendo os
melhores resultados sido obtidos com as concentrações de 3% a 5%.
46
Para comprimento de parte aérea, foi observada uma média de 3,88cm,
na concentração de 15g L
-1
(Tabela 1). De modo similar, Oliveira (1994)
observou que concentrações elevadas de sacarose afetaram negativamente o
comprimento da parte aérea, quando trabalhou com crisântemo cv. Orange
Reagen. Dignart (2006) obteve o mesmo resultado trabalhando com orquídea
Cattleya, constatando que 15g L
-1
foi a que resultou no maior comprimento de
parte aérea.
Skrebsky et al. (2004), avaliando diferentes concentrações de sacarose e
período de cultivo in vitro de ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata), obtiveram
resultados contrários. Altas concentrações de sacarose (30 e 45g L
-1
)
proporcionaram maior comprimento de parte aérea e estas concentrações estão
relacionados ao período de cultivo entre 10 e 25 dias após instalação do
experimento. As diferentes respostas observadas por estes autores e neste
trabalho podem ser atribuídas a diferenças intrínsecas às espécies estudadas.
Kozai et al. (1991) mencionam que, na presença de fontes externas de
carbono, plântulas não desenvolvem autotrofismo, causando redução no
crescimento das mesmas, podendo resultar em morte durante o período de
aclimatização. Uma explicação para isso seria que o acúmulo de açúcares nas
folhas inibiria o processo fotossintético. Os carboidratos acumulados podem
prejudicar a produção ou consumo de ATP/NADPH no processo de fotossíntese
(Neales & Incoll, 1968). Langford & Wainwright (1987) citam, ainda, que,
aumentando-se os níveis de sacarose no meio, obteria-se diminuição de CO
2
fixado, o que proporcionaria um efeito prejudicial na regeneração de RuBP,
principal substrato para a carboxilação no ciclo de Krebs. Dimassi-Theriou &
Bosabalidis (1996), trabalhando com kiwi (Actinia deliciosa) cultivado em meio
WPM, com ou sem sacarose, não observaram diferenças nas taxas fotossintéticas
47
e afirmaram que a redução deste carboidrato no meio de cultivo pode ser
aplicado neste caso.
Diversos autores, no entanto, são contrários à idéia de redução de
carboidratos no meio de cultura durante o processo de cultivo in vitro. Eles
afirmam que os mecanismos pelos quais a concentração de açúcares influencia
na aclimatização não são muito claros. Assim, manter os níveis de sacarose em
torno de 3% na fase que antecede a aclimatização é recomendável, pois, desse
modo, a planta armazenaria reservas de energia suficientes para sobreviver às
mudanças de ambiente (Capellades et al., 1990; Wainwright & Scrace 1989).
Foram obtidas médias de oito raízes por plântula, com comprimento da
maior raíz de 6,3 cm (Tabela 1). Oliveira (1994) observou que o nível de
sacarose no meio influencia a formação de raízes em crisântemos cv. Orange
Reagen, obtendo maior enraizamento em meios com nível de sacarose acima de
3%. Estes resultados também estão de acordo com os encontrados por Welander
(1976), Chong & Pua (1985), Pierik (1987) e Shibli et al. (1992), que
observaram a necessidade de fornecimento de alta concentração de sacarose para
a emissão de raízes em várias espécies, inclusive em crisântemo.
Dignart (2006) também observou que o número de raízes foi menor para
as menores concentrações de sacarose no meio para o cultivo in vitro de
orquídeas (Cattleya), porém, a sacarose não influenciou no comprimento médio
das raízes. Leite et al. (2000), trabalhando com pereira, observaram que a
concentração de sacarose teve efeito significativo nas variáveis porcentagens de
enraizamento, comprimento médio de raízes e formação de raízes secundárias,
tendo, a porcentagem de enraizamento apresentado comportamento quadrático
significativo, com o aumento da concentração de sacarose. O mesmo
comportamento foi observado para a formação de raízes secundárias. Com
relação ao comprimento médio de raízes, os autores observaram regressão linear
48
crescente com a concentração de sacarose variando de 1,05cm na ausência de
sacarose no meio e 1,70cm na concentração de 30g L
-1
.
Os dados obtidos são concordantes com a afirmação de vários autores,
segundo os quais a presença de açúcares é essencial ao processo de rizogênese in
vitro de muitas espécies (Grattapaglia & Machado, 1998; George & Sherrington,
1984; Sriskandarajah & Mullins, 1981).
Já em outros trabalhos, na fase de enraizamento, a redução da
concentração de sacarose no meio de cultura vem sendo citada como benéfica na
melhoria da qualidade do sistema radicular, bem como na sobrevivência das
plântulas transplantadas (Andrade, 1998).
Não houve diferença significativa para número de brotações nas
concentrações 15 e 30g L
-1
, porém, quando a sacarose foi omitida do meio, a
brotação por explante foi prejudicada (Tabela 1).
Dignart (2006) não observou diferenças quanto ao número de brotos de
Cattlleya em qualquer concentração de sacarose adicionada ao meio. O mesmo
foi observado por Oliveira (1994) com crisântemo, não tendo havido diferença
quanto ao número de brotos formados devido às diferentes concentrações de
sacarose, ocorrendo a formação de brotos em meios sem adição de sacarose.
Em trabalho de Serret et al. (1997) as brotações de gardênia a partir de
cultivo autotrófico ou mixotrófico foram similares, apesar das brotações
autotróficas apresentarem folhas maiores nos internos mais longos.
Foi observado, neste estudo, que a eliminação total de sacarose do meio
não foi apropriada, devido à inviabilidade de se fornecer outras fontes de
carbono dentro dos frascos durante o processo de cultivo. Achou-se conveniente
recomendar a utilização de menores concentrações de sacarose ao meio na fase
de crescimento das plântulas, uma vez que essas não apresentaram diferenças
que causassem prejuízos ao desenvolvimento das mesmas em nenhum dos
49
ambientes em que foram mantidas. Essas novas técnicas de cultivo in vitro
visam facilitar o processo de aclimatização da planta micropropagada,
desenvolvendo, nas plântulas, características próximas àquelas em condições de
ambientes ex vitro, com o intuito de promover a fotossíntese e habituando-a a
condição autotrófica.
Os resultados obtidos em diferentes condições de luz (ambiente de
cultivo) para número de folhas, raízes e brotos, e comprimento de raízes e parte
aérea, estão apresentados na Tabela 2.
TABELA 2. Número de folhas (NF), comprimento de parte aérea (CPA),
número de raízes (NR), comprimento da maior raiz (CR) e
número de brotações (NB), de plântulas de crisâtemo cv. Rage,
cultivados em diferentes ambientes, sala de crescimento (SC),
casa de vegetação com proteção de sombrite 50% (CV) e casa de
vegetação sem proteção de sombrite (CV).
LUZ NF CPA (cm) NR CR (cm) NB
CV sem sombrite
16,00a 2,36b 4,70a 3,85a 1,50a
CV com sombrite 50%
17,12a 3,51a 4,79a 3,48a 1,40a
Sala de crescimento
13,37a 3,66a 4,43a 3,39a 1,27a
* Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si, pelo teste
de Scott & Knott, a 5%.
Não foram observadas diferenças significativas para as variáveis
números de folhas, raízes e brotos e comprimento de raízes. Dignart (2006)
obteve melhores resultados com Cattleya em sala de crescimento e casa de
vegetação sem proteção de sombrite, tendo esses resultados diferenças
significativas em relação ao tratamento casa de vegetação com proteção de
sombrite 50%. Rocha (2005), trabalhando com banana-prata cv. Anã, verificou
que o maior número de brotações foi obtido com a utilização de meio de
multiplicação adicionado de (BAP) com o material vegetal mantido sob
50
condições de luz artificial (sala de crescimento, obtendo 2,35 brotações por
explante. Além dos reguladores de crescimento, a luz influencia muito a taxa de
multiplicação e o crescimento de explantes cultivados in vitro. Kodyn & Zapata-
Arias (1998) obtiveram maior número de brotações de bananeira em casa de
vegetação sob luz natural e em sala de crescimento recebendo luz natural através
de uma janela, do que sob o cultivo convencional em sala de crescimento com
iluminação artificial.
Uma possível explicação para elevadas taxas de multiplicação em luz
natural seria que o aumento da intensidade luminosa reduziria as concentrações
de auxinas endógenas das gemas, uma vez que esses fitoormônios são
fotoxidativos, levando a um desbalanceamento hormonal em direção às
citocininas (Radmann et al., 2001; Scontounchainaksaeng et al., 2001).
Trabalhando com pereira, Leite et al (2000) observaram que o fator luz
só teve efeito significativo na variável número de raízes. O aumento da
intensidade luminosa de 2.000 para 3.000 lux levou a um incremento de 25% no
número de raízes primárias. Kodym & Zapata-Arias (1998), trabalhando com
bananeira, observam que as raízes formadas em ambiente de luz natural eram
mais fortes e vigorosas do que as formadas em sala de crescimento, sob
condições de luz artificial.
Dignart (2006), porém, não observou diferenças significativas entre os
tratamentos de luz tanto para número de raízes quanto para comprimento médio
das mesmas. Similarmente, Magalhães Junior & Peters (1991), trabalhando com
ameixeira, forneceram diferentes intensidades luminosas, oriundas de diferentes
tipos de lâmpadas e obtiveram uma média geral de enraizamento em torno de
85%. Esta porcentagem foi independente da intensidade luminosa e do tipo de
lâmpadas e o mesmo foi observado para comprimento médio das raízes.
Radmann et al. (2001) também observaram que as intensidades luminosas
utilizadas durante o processo de multiplicação de Gypsophila paniculata não
51
afetaram o posterior enraizamento dos brotos. Rocha (2005), trabalhando com
banana-prata cv. Anã, observou que, em explantes cultivados sob luz natural, as
raízes foram maiores do que nos cultivados sob luz artificial.
O enraizamento no cultivo in vitro é dependente de alguns fatores. A
intensidade luminosa pode aumentar a taxa de enraizamento e a qualidade das
raízes, porém, há casos em que esse fator não afeta. Em alguns casos, é
necessário manter os explantes por algum tempo no escuro, para promover a
indução de raízes. Portanto, a resposta ao fator luz depende da espécie em estudo
e o genótipo é primordial nesse processo.
Para número de folhas também não foram observadas diferenças
significativas entre os tratamentos. O mesmo foi observado por Dignart (2006),
com Cattleya e Scontounchainaksaeng et al. (2001) com duas orquidáceas
Phaius e Vanda, não tendo a maior intensidade de luz influenciado no número
de folhas.
A iluminação natural utilizada por meio de clarabóias instaladas no
telhado, também não promoveu diferenças nas variáveis analisadas por Kodym
& Zapata Arias (2001). Esses autores consideram seus resultados vantajosos,
uma vez que os custos nas instalações puderam ser reduzidos. Estes resultados
possibilitam a recomendação do uso de luz natural na propagação in vitro da
espécie em questão.
Os melhores resultados para comprimento de parte aérea foram
observados em sala de crescimento e casa de vegetação com sombrite 50% e não
diferiram estatisticamante entre si. Resultados similares foram observados com
Cattleya, por Dignart (2006) e por Radman et al. (2001) Gypsophila, os quais
constataram taxa de crescimento maior no tratamento com menor intensidade.
Rocha (2005) observou que comprimentos superiores da parte aérea dos
explantes de banana-prata cv. Anã foram obtidos sob luz natural, com média de
11,80cm. Esses autores explicam que o maior crescimento dos brotos pode ser
52
resultado do processo de estiolamento induzido pela luminosidade deficiente nas
salas de crescimento, ocasionando maior crescimento dos entrenós com caules
mais finos.
Soontounchainaksaeng et al. (2001) citam também os hormônios como
fatores controladores no crescimento das plantas, tais como as auxinas, que são
fotoxidativas em intensidade de luz elevadas, as citocininas, que atuam
juntamente às auxinas na divisão celular no cultivo in vitro e as giberelinas, que
atuam no alongamento dos brotos, sendo que, essas, bem como a altura das
plantas, aumentam à medida que a intensidade de luz diminui. Sendo assim, o
balanço hormonal pode influenciar diretamente no comprimento dos brotos, não
havendo, necessariamente, uma relação positiva entre os maiores comprimentos
de parte aérea e a qualidade das plântulas.
Mesmo a luz sendo um fator importante na propagação de plantas em
geral, são escassos os trabalhos sobre o efeito da intensidade de luz natural no
crescimento in vitro de plantas. A intensidade e a duração da luz em quantidades
satisfatórias podem fornecer melhores resultados no cultivo in vivo e in vitro de
crisântemos.
Os resultados obtidos neste estudo são considerados importantes, uma
vez que as plântulas micropropagadas responderam bem aos tratamentos com
luz natural, sendo possível aplicar essas técnicas a fim de reduzir os custos de
produção in vitro, levando ao mercado mudas micropropagadas de qualidade e
acessíveis ao consumidor.
53
5.2 Características anatômicas
Observou-se que as folhas de Dendranthema grandliflora cv. Rage são
do tipo hipoestomática, apresentando estômatos do tipo anomocíticos, as células
guardas de formato elíptico e grande quantidade de tricomas multicelulares
tectores não ramificados em a toda região do limbo foliar (Figura 9).
Figura 9. Secções paradérmicas na superfície abaxial de folhas
de D. grandiflora. SC = sala de crescimento; CVSS =
casa de vegetação sem sombrite; CVCS = casa de
vegetação com sombrite; 0,0; 15 e 30g.L
-1
=
concentrações de sacarose no meio de cultura. Barra
= 35µm. UFLA, Lavras, MG, 2006.
CVSS-0
g
.L
-1
CVSS-15
g
.L
-1
CVSS-30
g
.L
-
CVCS-0
g
.L
-1
CVCS-15
g
.L
-1
CVCS-30
g
.L
-1
SC-0g.L
-1
SC-15g.L
-1
SC-30g.L
-1
54
Houve interações significativas entre os fatores luz e sacarose, para as
variáveis diâmetros polar e equatorial dos estômatos. Para a variável densidade
estomática, não houve interação entre os fatores, porém, os fatores luz e
sacarose, separadamente, influenciam significativamente na densidade de
estômatos/mm
2
, tendo sido as maiores densidades encontradas para os
tratamentos em casa de vegetação sem sombrite e 30g.L
-1
de sacarose (Tabela 3
e 4).
TABELA 3. Densidade estomática, diâmetros polar e equatorial em folhas de
crisântemo observados para cultivo em diferentes concentrações de
sacarose.
Concentração de
sacarose (g L
-1
)
Densidade
(mm
2
)
Diâmetro polar
(µm)
Diâmetro
equatorial (µm)
0
15
30
88,55b*
84,60b
102,86a
48,30a
50,47a
49,05a
35,32a
34,87a
35,02a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Skott &
Knott, a 5% de significância.
TABELA 4. Densidade estomática, diâmetros polar e equatorial em folhas de
crisântemo observados para cultivo em diferentes ambientes de
cultivo: sala de crescimento (SC), casa de vegetação com sombrite
(CVSP) e casa de vegetação sem sombrite (CVSS).
Ambiente de
cultivo
Densidade
(mm
2
)
Diâmetro polar
(µm)
Diâmetro
equatorial (µm)
SC
CVSP
CVSS
84,11b
95,17a
97,12a
42,15c
51,68b
54,56a
28,95c
36,43b
40,68a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Skott &
Knott, a 5% de significância.
55
Dignart (2006) observou maiores densidades em folhas de Cattleya,
também quando cultivadas em casa de vegetação, porém, quando a sacarose foi
omitida do meio. Alguns autores verificaram aumento na densidade de
estômatos em folhas oriundas do cultivo in vitro sobre aquelas observadas em
ambiente natural. Geralmente, esses fatores estão associados à grande umidade
relativa no interior do recipiente (Brainerd & Fuchigami, 1981; Khan et al.,
2002; Lee et al., 1988; Sciutti & Morini, 1995).
A variabilidade estomática está relacionada, principalmente, à umidade
relativa nos frascos, porém, a intensidade luminosa também pode implicar nesse
processo (Cutter, 1971). Portanto, é possível observar, com os resultados
apresentados, que as maiores densidades estão diretamente relacionadas com a
alta irradiância, demonstrando que plântulas cultivadas in vitro têm a mesma
característica de plantas em ambiente natural, possuindo mais estômatos quando
cultivadas em ambientes com maiores intensidades luminosas.
Rocha (2005) afirma que a análise da densidade estomática não é um
parâmetro confiável para a verificação da adaptabilidade anatômica durante o
processo de aclimatização. Uma forma segura de indicar a funcionalidade
estomática seria o formato das células guarda e a relação entre o diâmetro polar
e equatorial dos estômatos. Wetzstein & Sommer (1988) observaram que
estômatos de folhas de Liquidambar styraciflua L. desenvolvidas in vivo
apresentaram-se deprimidas e com células guarda elípitcas, ao passo que folhas
das plantas cultivadas in vitro apresentaram estômatos mais elevados,
arredondados e com células subsidiárias elevadas e a densidade estomática foi
afetada pela intensidade de luz, observando-se maiores densidades em plântulas
cultivadas em altas intensidades luminosas.
Conforme citam Khan et al. (2002), a forma elíptica é característica de
estômatos funcionais e a forma arredondada está associada a estômatos que não
apresentam funcionalidade normal. Rocha (2005) afirma que quanto maior a
56
relação diâmetro polar/equatorial, mais elipsóide será o formato do estômato,
portanto, maior será sua funcionalidade.
A interação ambiente de cultivo com diferentes intensidades luminosas e
concentrações de sacarose no meio interferem significativamente no diâmetro
polar dos estômatos de plântulas de crisântemo cultivar Rage cultivadas in vitro.
A diferentes concentrações de sacarose 15 e 30g L
-1
não resultaram em
diferenças estatísticas para os ambiente de luz, mostrando os melhores
resultados para diâmetro polar. Porém, quando a sacarose foi omitida do meio,
foi observado maior diâmetro polar no ambiente sala de crescimento em relação
às demais concentrações.
Quanto ao diâmetro equatorial dos estômatos, também houve interação
entre os fatores, mostrando que o ambiente casa de vegetação sem proteção de
sombrite mostraou melhores resultados para diâmetro equatorial, aliados às
concentrações 15 e 30g L
-1
que não diferiram entre si (Tabela 4). Dignart (2006)
também observou maior funcionalidade dos estômatos em casa de vegetação,
porém, quando a sacarose foi omitida do meio.
Esses resultados mostram a tendência em se obter maior funcionalidade
estomática sem alteração da concentração usual de sacarose do meio MS, porém
utilizando-se a casa de vegetação com aumento do nível de radiação como
ambiente de cultivo in vitro dessa espécie.
57
6 CONCLUSÕES
O ambiente de cultivo e a concentração de sacarose promovem
alterações anatômicas e fisiológicas em Dendranthema grandliflora cv. Rage,
durante o cultivo in vitro.
É possível utilizar luz natural em casa de vegetação e reduzir a
concentração de sacarose do meio MS pela metade, ou seja, 15g.L
-1
, sem
promover prejuízos no cultivo in vitro.
A omissão total da sacarose no meio não é recomendada, pois não há
fornecimento de outra fonte de carboidrato para os explantes.
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62
CAPÍTULO III
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE Dendranthema grandiflora cv. Rage
SUBMETIDA A ALTERAÇÕES ESPECTRAIS: CARACTERÍSTICAS
ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS
63
1 RESUMO
BRAGA, Francyane Tavares. Propagação in vitro de Dendranthema
grandiflora cv. Rage submetida a alterações espectrais: características
anatômicas e fisiológicas.
In: ______. Environment of culture in the
propagation in vitro of Dendranthema grandiflora cv. Rage: anatomical and
physiological alterations. 2006. Cap. 3, p.62-86. Dissertação (Mestrado em
Agronomia. Fisiologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
1
A qualidade de luz pode alterar a morfogênese das plantas por meio de uma série
de processos mediados por receptores, na região do vermelho e azul no espectro.
Objetivou-se avaliar o efeito da alteração espectral na anatomia e na fisiologia
de crisântemo. Os explantes constituíram-se de segmentos nodais cultivados in
vitro contendo uma gema. Foi utilizado o meio MS (Murashige e Skoog, 1962)
acrescido de 15g.L
-1
de sacarose e as condições de incubação foram: (SC) sala
de crescimento; (CV) casa de vegetação sem proteção de sombrite e com
sombrite 50%: preto, vermelho e azul. A avaliação foi efetuada 60 dias. Para
número de folhas o melhor resultado foi SC. O mesmo ocorreu com número de
raízes e brotações e comprimento médio de raízes. Para comprimento de parte
aérea o melhores resultados foram SC e CV com proteção de sombrite: azul
preto e vermelho. Quanto aos aspectos anatômicos, para densidade estomática o
maior número de estômatos/mm
2
foi CV sem sombrite e CV sombrite vermelho.
Para diâmetros polar e equatorial o melhor resultado foi CV sem sombrite,
seguidos de CV azul, vermelho. Quanto à porcentagem de sobrevivência, SC foi
a que obteve melhor resultado com 100%, seguido de CV sem sombrite (90%),
CV com sombrite 50% (80), vermelho (70%) e azul (60%), a menor
sobrevivência foi CV sem sombrite com apenas 10% de sobrevivência. Para os
dados anatômicos de plantas aclimatizadas, não houve diferenças entre os
tratamentos para densidade estomática, tendo o melhor resultado sido CV azul.
No diâmetro polar, foi observado um melhor resultado no tratamento CV preto
e, para diâmetro equatorial, foi CV sem sombrite e CV preto não havendo
diferença entre eles.Com os resultados apresentados, é possível recomendar a
utilização de luz natural no cultivo in vitro de crisântemo, bem como a
manipulação espectral da radiação, promovendo redução de custos e qualidade
das plântulas micropropagadas.
__________________________________
1
Comitê Orientador: Dr. Moacir Pasqual – UFLA. (Orientador), Dr.
Evaristo Mauro de Castro – UFLA. (Co-orientador).
64
2 ABSTRACT
BRAGA, Francyane Tavares. Propagation in vitro of Dendranthema
grandiflora cv. Rage submitted to the spectral alterations: anatomical and
physiological characteristics. In: ______. Environment of culture in the
propagation in vitro of Dendranthema grandiflora cv. Rage: anatomical and
physiological alterations. 2006. Cap. 3, p.62-86. Dissertation (Master in
Agronomy. Major in Physiology)_Federal University of Lavras, Lavras, MG.
1
The quality of light can modify plants morphogeneses through a series of
processes mediated from receivers, in the region of blue and red in the light
specter. This paper had the object to evaluate the effect of spectral alteration
throw the anatomy and physiology of chrysanthemum. The explantes were made
of nodal segments with one shut cultivated in vitro . The medium was composed
by half MS (Murashige and Skoog, 1962) complemented with 15g.L
-1
of sucrose
and the incubation conditions had been:
color shadow was tested (red and
blue) above the flasks grown in greenhouse (GH) and Growth room (GR).
The evaluation was made after 60 days. For leaf number the best result was GR,
the same occurred with number of roots and shot and average length of roots.
For length of aerial part, the best results were for GR and GH with shande
protection: blue, black and red color. For the anatomical aspects, for stomatal
density the biggest number of stomatal/mm
2
was GH - without shadow and GH
- red
shading. For stomatal diameter the best result was greenhouse (GH),
followed by GH – blue and red. For the survival percentage, GR was the best
result was with 100%, followed of GHSS (90%), GHS 50% (80), red (70%) and
blue (60%), the less survival was GH, with only 10% of sirving. For the
anatomical data of aclimatized plants, it was not different between the treatments
for stomatal density, the best result was GH - blue. For stomatal diameter the
best one was GH treatment - black and for equatorial diameter he was GH -
without
shadow and GH was observed – black, did not show difference between
them. As the presented results, it is possible to prescript the use of natural light
in vitro culture for chrysanthemum, as well as the spectral manipulation of the
radiation, promoting reduction of costs and quality to the plants.
_______________________
1
Guidance Committee: Dr. Moacir Pasqual – UFLA (Adviser), Dr.
Evaristo Mauro de Castro – UFLA (Co-Adviser).
65
3 INTRODUÇÃO
As plantas utilizam sinalizadores para promover determinados padrões
de crescimento e esses sinalizadores respondem à qualidade de luz crescendo
sob uma região limitada no espectro visível e exibindo morfologia e fisiologia
determinadas pelas variações ocorridas neste espectro. A dependência das
plantas à luz é um processo complexo que envolve a ação combinada de
fotorreceptores que controlam estágios variados no desenvolvimento.
Salas de crescimento, geralmente, são equipadas com lâmpadas
fluorescentes que emitem luz branca de similaridade espectral entre as bandas. A
irradiância fornecida primariamente na sala de crescimento afeta o
desenvolvimento das plantas, principalmente por meio de alterações
fotomorfogênicas.
Estudos da qualidade de luz na micropropagação ainda são escassos e
também não são claros os efeitos do espectro e de níveis de irradiância no
crescimento de plântulas durante o cultivo in vitro. Alguns estudos revelam que,
com a variação na qualidade, pode-se manipular o crescimento in vitro de
diversas espécies, de maneira alternativa à adição de reguladores de crescimento
ao meio de cultura.
Por outro lado, a complexidade e a variabilidade da radiação natural, e
as reações de múltiplas respostas das plantas ao ambiente de cultivo, tornam
difícil dizer como determinada manipulação na radiação natural afetará uma
resposta da planta.
A manipulação espectral da radiação natural tem sido realizada em casas
de vegetação por meio de filtros líquidos coloridos e de coberturas de náilon
também coloridas, a fim de se obter respostas fotomorfogênicas das plantas.
66
Poucos são os estudos do uso de alteração na qualidade espectral na
propagação in vitro. Porém, existem inúmeros estudos com o uso de coberturas
coloridas na propagação vegetativa convencional de ornamentais.
Diante do exposto, objetivou-se, com o presente trabalho, alterar a
qualidade espectral da luz em ambiente natural na propagação in vitro de
Dendranthema grandliflora cv. Rage, visando promover respostas
morfofisiológicas de interesse para melhorar a qualidade dessas plântulas,
principalmente durante o processo de aclimatização.
67
4 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido na Universidade Federal de Lavras (UFLA) no
Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de Agricultura durante o
período de fevereiro a abril de 2005.
O material vegetal utilizado constituiu-se de plântulas da espécie
Dendrathema glandifloria cv. Rage, já estabelecidas in vitro. Foram retirados
dessas plântulas segmentos nodais contendo uma gema e inoculados em meio
MS com adição de 30g L
-1
de sacarose e 5g L
-1
de ágar. Os segmentos foram
mantidos em sala de crescimento a 25±2ºC, com radiação de 52,5W m
-2
e 16
horas de fotoperíodo, até atingirem o tamanho adequado para utilização no
experimento.
4.1 Meio de cultura
Segmentos contendo uma gema foram cultivados em meio MS, com a
concentração convencional dos sais, acrescidos de ágar na concentração de 5g.L
-
1
e 15g L
-1
de sacarose, utilizando-se tudos com 15mL
-1
de meio em cada tubo.
O pH do meio foi ajustado para 5,8, antes da autoclavagem a 121ºC e 1,2 atm
durante 20 minutos.
4.2 Ambiente de cultivo
O experimento foi conduzido em casa de vegetação, sendo os tubos
fechados com tampas de polipropileno e vedados com plástico do tipo parafilme.
O material foi colocado diretamente sobre as bancadas ou sob malhas especiais
que, segundo o fabricante, alteram o espectro de luz solar ou, ainda, sob
proteção adicional de tela preta, que retém 50% da radiação solar. As malhas
coloridas utilizadas foram fornecidas pela empresa Polysac Plastic Industries®.
Utilizou-se a malha ChromatiNet Vermelha 50%, produzida com a finalidade de
68
alterar espectro da luz, reduzindo as ondas azuis, verdes e amarelas e
acrescentando as ondas na faixa espectral do vermelho e vermelho-distante.
Outro tratamento foi feito com a malha ChromatiNet Azul 50% que, segundo o
fabricante, muda o espectro da luz, reduzindo as ondas na faixa do vermelho e
vermelho distante e acrescentando as ondas azuis.
Foram cultivadas também plântulas em tubos mantidos em sala de
crescimento, com fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25+2ºC, com
radiação de 5,52W.m
-2
s
-1
(LI-200SA; Li-cor, Lincoln, Nevasca, USA), fornecida
por lâmpadas brancas fluorescentes, para servirem como tratamento controle.
A intensidade da radiação foi mensurada por meio de sensores de
radiação acoplados a um sistema de registro (LI 1400; Licor. Neb). Três
sensores foram acoplados ao sistema de registro em cada dia avaliado. No mês
de setembro, os sensores foram colocados nos três ambientes (Tabela 1).
TABELA 1. Radiações observadas nos microambientes em casa de vegetação.
CVSS: casa de vegetação sem sombrite; CVSV: casa de vegetação
com sombrite vermelho; CVSA: casa de vegetação com sombrite
azul e CVSP: casa de vegetação com sombrite preto.
Ambiente Radiação (MJ.m
-2
.dia
-1
)
CVSS 2,56
CVSV 2,53
CVSA 2,45
CVSP 1,98
4.3 Variáveis avaliadas
Após 60 dias de cultivo, foram avaliadas:
yCaracterísticas fitotécnicas: número de folhas e raízes por plântula,
comprimento da parte aérea e comprimento de raízes.
69
yQuantificação dos teores de clorofila: foram utilizadas três amostras de
0,5 g cada, de tecido foliar fresco, que foram maceradas em 30mL de acetona
80%. As concentrações de clorofila a, b e total foram determinadas de acordo
com o método de Arnon (1949), após a obtenção dos dados com base em leituras
realizadas no espectrofotômetro de luz a comprimentos de onda definidos em
663 e 645 nm.
yCaracterísticas anatômicas: ao término do experimento, seguindo-se à
coleta de dados fitotécnicos, as plântulas selecionadas foram fixadas em álcool
etílico 70% até a realização das análises, para as quais foram coletadas folhas na
posição dois, contando-se a partir do ápice.
Os cortes paradérmicos foram efetuados manualmente no terço médio
foliar, na superfície abaxial das folhas. Para os cortes transversais, utilizou-se
um micrótomo de mesa; também foram realizados cortes na região do terço
mediano das folhas. As lâminas das seções paradérmicas foram preparadas com
corante safranina em glicerina 1% (v/v). Dessas seções, as variáveis analisadas
foram: densidade estomática (nº de estômatos por mm
-2
) e diâmetros polar e
equatorial dos estômatos. A freqüência estomática foi avaliada com auxílio de
uma câmara clara, em microscópio Olympus CBB, seguindo a técnica descrita
por Laboriau et al. (1961).
Para cada tratamento foram avaliadas cinco folhas, sendo que para cada
folha, foram efetuadas cinco avaliações em campos diferentes. A freqüência
estomática foi avaliada com auxílio de uma câmara clara, em microscópio
Olympus CBB, seguindo a técnica descrita por Laboriau et al. (1961).
As fotomicrografias foram feitas no Laboratório de Citogenética do
Departamento de Biologia da UFLA, utilizando-se máquina fotográfica acoplada
a um microscópio Olympus modelo BX 60 em objetiva de 40x.
70
yAclimatização
Após 60 dias de cultivo 10 plântulas por tratamento foram testadas
quanto à capacidade de aclimatização. As plântulas foram colocadas em
bandejas contendo Plantmax
®
como substrato e foram mantidas na mesma casa
de vegetação onde foram previamente conduzidos os experimentos. A
capacidade de aclimatização foi avaliada pela porcentagem de sobrevivência em
cada tratamento, ao término de um mês.
Nas plantas sobreviventes, foram realizados cortes anatômicos das
folhas para que se pudesse comparar com o mesmo material na fase in vitro.
4.4 Delineamento experimental e análise estatística
O experimento foi montado em delineamento inteiramente casualizado,
totalizando cinco tratamentos, com vinte repetições. Cada repetição foi
composta por um tubo contendo um segmento nodal.
O fator a ser analisado foi o ambiente de incubação, definido por “luz”,
representado por sala de crescimento convencional, casa de vegetação sem
proteção e casa de vegetação com sombrite 50%, azul, vermelho e preto.
Aos 60 dias de cultivo, as plântulas foram coletadas para proceder-se à
coleta de dados. Para a realização das análises de variância, foi utilizado o
programa SISVAR 4.3 (Ferreira, 1999); as médias foram comparadas pelo Teste
de Scott & Knott, a 5% de probabilidade.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Características fitotécnicas
O ambiente de cultivo sala de crescimento apresentou melhores
resultados para todas as variáveis observadas (Tabela 2). Silva & Deberg (1997)
não observaram diferença quando trabalharam com alteração de qualidade
71
espectral em ambiente de cultivo in vitro de Azorina vidalli (Wats). Trabalhando
com Cattleya walkeriana, Dignart (2006) observou resultados semelhantes para
número de folhas, tendo sala de crescimento proporcionando maiores valores do
que casa de vegetação, observou-se também que as coberturas coloridas para
ambiente de casa de vegetação não resultaram em diferenças significativas.
TABELA 2. Número de folhas (NF), comprimento de parte aérea (CPA),
número de raízes (NR), comprimento da maior raiz (CR) e
número de brotações (NB) de plântulas de crisâtemo cv. Rage,
cultivadas em diferentes ambientes com coberturas coloridas (CV
= casa de vegetação).
LUZ NF CPA (cm) NR CR (cm) NB
Casa de vegetação
22,8b 3,5b 4,4b 5,3b 1,2a
CV azul
24,5b 5,4a 4,5b 5,5b 1,4a
CV preto
25,4b 5,5a 4,9b 5,9b 1,5a
CV vermelho
25,9b 5,8a 4,9b 6,2b 1,5a
Sala de crescimento
36,6a 6,5a 10,7a 9,8a 1,8a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Skott &
Knott, a 5%.
No comprimento de parte aérea, os valores obtidos foram maiores para
sala de crescimento e casa de vegetação com cobertura vermelho, azul e preto,
sem diferença significativa entre si. Porém, o ambiente casa de vegetação sem
proteção de sombrite foi o que apresentou menor resultado. Resultados
semelhantes foram obtidos por Radmann et al. (2001), quando, trabalhando no
cultivo, sob diferentes intensidades luminosas, de Gypsophila paniculata,
observaram que todas as plântulas mantidas em casa de vegetação
desenvolveram menor comprimento de parte aérea, comparadas a plântulas
mantidas em sala de crescimento. O mesmo foi observado por Dignart (2006)
72
que obteve melhor resultado no ambiente de cultivo sala de crescimento.
Segundo alguns autores esses resultados podem ser induzidos pela luminosidade
deficiente da sala de crescimento, caracterizando um crescimento estiolado
dessas plântulas. Quanto aos resultados obtidos neste trabalho, pôde-se observar
que, em casa de vegetação em plena luz, houve menor crescimento de parte
aérea, uma vez que em ambientes protegidos com sombrites coloridos e sala de
crescimento, cuja intensidade luminosa foi reduzida, ocorreu maior crescimento
dessas plântulas.
Poucos trabalhos têm sido realizados com o objetivo de verificar os
efeitos da qualidade de luz ou, mesmo, de diferentes níveis de irradiância no
crescimento e no desenvolvimento de espécies cultivadas in vitro. A maioria das
pesquisas é realizada com o objetivo de obter protocolos para meios nutritivos,
principalmente com o foco direcionado a alterações nas concentrações desses
meios, bem como as concentrações dos reguladores de crescimento adicionados
ao meio (Marks & Simpson, 1999).
De modo geral, como já observado em alguns estudos com qualidade
espectral, a radiação vermelha promove alongamento da parte aérea (Appelgren,
1991; Marks & Simpson, 1999; Silva & Deberg, 1997). Porém, essa
característica não é geral e muitos autores citam que a influência da qualidade
espectral sobre o crescimento e o desenvolvimento de plantas está associada à
espécie vegetal (Antonopolou et al., 2004; Hunter & Burrit, 2001; Schuerger et
al., 1997).
No presente estudo, verificou-se que o comprimento de parte aérea foi
influenciado tanto pela intensidade luminosa deficiente na sala de crescimento
quanto pela qualidade espectral e intensidade luminosa maior na casa de
vegetação, principalmente com sombrites preto e vermelho. Lee (2000)
observaram, quando trabalharam com duas espécies de Hopea, que a intensidade
73
de luz foi mais significativa no desenvolvimento do que a variação da qualidade
espectral.
Maior número e comprimento das raízes ocorreu em ambiente de
cultivo sala de crescimento, ao contrário do ambiente casa de vegetação, com
média de 10,7 raízes e 9,8 cm de comprimento da maior raiz. Dignart (2006), em
seu trabalho com Cattleya, não observou diferença entre os tratamentos com
qualidade espectral para comprimento médio de raízes, porém quanto ao número
de raízes, foi verificado que sala de crescimento com sombrite azul,
proporcionou média inferior à dos demais tratamentos. O mesmo foi observado
em trabalho realizado com Pinus propagados in vitro, onde não houve diferença
significativa no enraizamento desta espécie sob diferentes espectros de luz
(Niemi et al., 2005). Em trabalho realizado com ameixeira, Magalhães Júnior &
Peters (1991) observaram que intensidade luminosa mais baixa aumentou o
número de raízes por broto, no entanto, a percentagem de brotos com raízes
secundárias e o comprimento das raízes foram beneficiados pelo aumento da
intensidade luminosa na sala de crescimento. Segundo Tricoli et al. (1985), o
estímulo dado ao enraizamento in vitro é resultado da soma do AIA endógeno
dos brotos, com possíveis adições de auxinas ao meio. Sendo assim, pode-se
supor os resultados obtidos por meio de uma possível degradação das auxinas
pelas altas intensidades luminosas, uma vez que esse fitormônio ou regulador é
fotoxidativo (Hess, 1975).
Não houve diferença estatística para número de broto entre os ambientes
de cultivo, tanto sala de crescimento como casa de vegetação com variação da
qualidade espectral. A liberação da dominância apical resulta na formação de
brotos axilares, tanto pela fotoxidação de auxinas em altas intensidades
luminosas como pela degradação desse regulador pela luz azul (Chee & Pool,
1989).
74
5.2 Teores de clorofila
O maior teor de clorofila a foi observado em sala de crescimento
(Tabela 3), seguida de casa de vegetação com cobertura vermelho e preto. Os
demais tratamentos não resultaram em diferenças significativas, apresentando
também os menores teores de clorofila.
Resultado interessante foi obtido no tratamento casa de vegetação com
sombrite vermelho, que apresentou maior teor de clorofila que os demais
tratamentos com telas coloridas. Esses resultados são contrários aos obtidos por
Dignart (2006) e Silva & Debergh (1997) que, trabalhando com Cattleya e
Arizona vidalli, respectivamente, não observaram diferenças nos teores de
clorofila a para tratamentos enriquecidos com luz azul e, em radiação
enriquecida com luz vermelha, ocorreu diminuição deste pigmento.
TABELA 3. Teores de clorofila observados para plântulas cultivadas em
diferentes ambiente natural com coberturas coloridas. CV=casa
de vegetação e SC = sala de crescimento.
LUZ Clorofila a
(µg.mL
-1
)
Clorofila b
(µg.mL
-1
)
Clorofila total
(µg.mL
-1
)
a:b
(µg.mL
-1
)
CV
0,052c 0,023b 0,075c 1,821a
CV azul
0,060c 0,028b 0,089c 2,214a
CV preto
0,078b 0,033b 0,112b 2,342a
CV vermelho
0,090b 0,034b 0,125b 2,348a
SC
0,137a 0,082a 0,219a 2,629a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Skott &
Knott, a 5%.
75
Plântulas cultivadas em sala de crescimento apresentaram os maiores
teores clorofila b. Os demais tratamentos em casa de vegetação não deferiram
estatisticamente entre si.
Silva & Debergh (1997) também não observaram diferenças para os
teores de clorofila b de plântulas cultivadas sob enriquecimento de luz azul e
vermelha. Dignart (2006) verificou que os tratamentos com telas coloridas em
sala de crescimento apresentaram menores teores dessa clorofila e esses baixos
valores podem ser devido à baixa quantidade total de fluxo de fótons recebidos,
devido à retenção de luz pelas telas. Radmann et al. (2001) sugerem também que
as baixas irradiâncias não permitem um desenvolvimento adequado do aparato
fotossintético. Os efeitos da luz azul e vermelha na planta são função direta dos
níveis de irradiância nesses comprimentos de onda (Milivojevié & Eskins,
1990).
Observaram-se maiores teores de clorofila a b e total em sala de
crescimento e, em casa de vegetação, os maiores resultados foram obtidos em
sombrite vermelho e preto. Os menores teores foram observados em casa de
vegetação sem proteção de sombrite e com sombrite azul (Tabela 3).
Contrariamente aos resultados obtidos neste trabalho, Dignart (2006) verificou
maiores teores em plântulas cultivadas em casa de vegetação com sombrite de
cor azul. Milivojevié & Eskins (1990) também observaram aumento na síntese
de clorofila a e b em Pinus nigra em luz azul quando comparada à luz vermelha.
Schuerger et al. (1997) explicam que isso ocorre porque a luz azul é importante
na síntese deste pigmento.
Assim como obtido neste trabalho, Dignart (2006) também observou
maiores teores de clorofila total em sala de crescimento. Esses resultados podem
ser explicados uma vez qu, em intensidades mais baixas de luz, ocorre aumento
76
na concentração total de clorofilas, garantindo, assim, absorção mais eficiente da
radiação (Atroch et al., 2001; Engel & Poggiani, 1991).
Quanto à relação clorofila a:b, não houve diferença significativa entre
os tratamentos, porém, o que apresentou maior teor de clorofila foi sala de
crescimento. Dignart (2006) observou resultados semelhantes. Esses resultados
diferiram dos obtidos por Marks & Simpson (1999) que observaram aumento da
relação clorofila a:b em luz vermelha e diminuição em luz azul, quando
comparados ao controle de luz branca.
5.3 Características anatômicas
As folhas de Dendranthema grandliflora cv. Rage cultivadas sob
diferentes espectros de luz, apresentaram estômatos do tipo anomocíticos e as
células guardas de formato elíptico (Figura 4).
Para densidade de estômatos, houve diferenças significativas entre os
tratamentos aplicados, tendo as maiores densidades de estômatos sido
observadas em casa de vegetação sem proteção de sombrite, seguido de casa de
vegetação sombrite vermelho, que não diferiram entre si (Tabela 4).
Já as menores densidades foram observadas em sala de crescimento,
casa de vegetação sombrite azul e preto. Esses resultados corroboram os de
Dignart (2006) que, trabalhando com Cattleya, obteve maiores densidades em
casa de vegetação sem sombrite, e podem, ainda, ser comparados aos observados
por Rajapske & Kelly (1993), que obtiveram menor densidade estomática
trabalhando também com crisântemo cultivados sob filtros de CuSO
4
, que
produz os mesmos efeitos de filtros de luz azul.
77
FIGURA 4. Secções paradérmicas na superfície abaxial de folhas de
crisântemo. SC = sala de crescimento; CVSS = casa de
vegetação sem sombrite; CVSV = casa de vegetação
sombrite vermelho; CVSA = casa de vegetação sombrite
azul e CVSP = casa de vegetação sombrite preto. Barra
= 30µm. UFLA, Lavras, MG, 2006.
Quanto aos diâmetros polar e equatorial, foram observados melhores
resultados no tratamento casa de vegetação sem proteção de sombrite, seguido
dos tratamentos com proteção de telas coloridas, que não diferiram entre si
estatisticamente. Dignart (2006) observou que o tratamento casa de vegetação
com sombrite vermelho mostrou-se mais eficaz, quanto aos diâmetros polar e
equatorial, em estômatos de folhas de Cattleya cultivadas in vitro.
SC CVSS CVSV
CVSA CVSP
78
TABELA 4. Densidade estomática, diâmetro polar (DP), diâmetro equatorial
(DE) dos estômatos para folhas de plântulas cultivadas sob
diferentes ambientes de luz com telas coloridas. CV= casa de
vegetação.
LUZ Densidade (mm
2
) DP (µm) DE (µm)
Casa de vegetação
232,4a 58,6a 43a
CV azul
101,4b 52,9b 41,5b
CV preto
93.3b 53,6b 40,1b
CV Vermelho
165,1a 54,3b 40,5b
Sala de crescimento
87,2b 42,8c 28,7c
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Scott &
Knott, a 5%.
5.3 Aclimatização
As plântulas cultivadas em sala de crescimento tiveram 100% de
sobrevivência (Figura 5). Jás as plântulas provenientes de casa de vegetação sem
sombrite, casa de vegetação sombrite preto, vermelho e casa de vegetação
sombrite azul, apresentaram taxas de 90%, 80%, 70% e 60% de sobrevivência,
respectivamente. Todas as plântulas sobreviventes, porém, mostraram-se
vigorosas e, após 90 dias do processo de aclimatização, já apresentavam botões
florais (Figura 6).
79
Figura 5. Eficiência de aclimatização após cultivo em diferentes
ambientes de luz com telas coloridas. SC = sala de
crescimento; CVSS = casa de vegetação sem sombrite;
CVSV = casa de vegetação sombrite vermelho; CVSA =
casa de vegetação sombrite azul e CVSP = casa de
vegetação sombrite preto. UFLA, Lavras, MG, 2006.
Dignart (2006) observou que as plântulas de Cattleya cultivadas em sala
de crescimento tiveram porcentagem de aclimatização inferior àquelas mantidas
em casa de vegetação durante o cultivo in vitro, ressaltando as vantagens de se
trabalhar em casa de vegetação. Tais resultados foram contrários aos obtidos
neste trabalho em que a maior porcentagem de sobrevivência foi de plântulas
advindas de sala de crescimento. A mesma autora constatou 73,33% de
sobrevivência para plantas aclimatizadas em casa de vegetação com cobertura
vermelha, o mesmo observado no presente trabalho. A obtenção de plantas mais
vigorosas cultivadas sob cobertura vermelha já foi relatada por outros autores
(Gringberger et al., 2005; Reshef, 2005; Shamir et al., 2005).
0
20
40
60
80
100
SC CVSS CVSV CVSA CVSP
Ambiente de cultivo
Taxa de sobrevivência (%)
a
a
a
b
b
80
Dignart (2006) observou também menor taxa de sobrevivência em casa
de vegetação para sombrite preto, contrariando os resultados obtidos neste
trabalho, no qual a cobertura preta proporcionou alta taxa de sobrevivência.
Saebo et al. (1995), avaliando o desempenho em campo de Betula pendula após
cultivo in vitro em diferentes espectros de luz, observaram que as plântulas que
melhor aclimatizaram foram as cultivadas em luz azul e luz vermelha, em
comparação às cultivadas em lâmpadas brancas.
Figura 6. Aspecto das plântulas após cultivo em
diferentes ambientes de luz com telas
coloridas. Plântulas após transferência
para o substrato (A); plântulas
aclimatizadas (B); início do botão floral
(C) e florescimento das mudas (D).
UFLA, Lavras, MG, 2006.
As características estomáticas analisadas variaram muito após o período
de aclimatização, quando comparadas ao período in vitro (Tabela 4). Foram
observados estômatos do tipo amonocíticos e ciclocíticos, células-guarda com
formato elíptico e arrendondadas (Figura 7).
A B
C D
81
FIGURA 7. Seções paradérmicas na superfície abaxial de folhas aclimatizadas
de crisântemo. SC = sala de crescimento; CVSS = casa de
vegetação sem sombrite; CVSV = casa de vegetação sombrite
vermelho; CVSA = casa de vegetação sombrite azul e CVSP =
casa de vegetação sombrite preto. Barra = 25µm. UFLA, Lavras,
MG, 2006.
SC CVSS
CVSV
CVSP
CVSA
82
A densidade estomática em folhas de plantas aclimatizadas foi bem
maior do que durante o cultivo in vitro, em todos os tratamentos, com exceção
do ambiente casa de vegetação com sombrite preto, no qual a densidade foi
menor. Resultados contrários foram observados por Dignart (2006), segundo os
quais maiores densidades ocorreram em folhas durante o cultivo in vitro. A
redução na densidade de estômatos durante o período de aclimatização é um
processo bem característico desta fase e já foi reportado por outros autores
(Albarello et al., 2001; Donnelly & Vidaver, 1984; Lee et al., 1985; 1988). Uma
explicação para tais resultados está no fato de as células da epiderme, bem como
os demais tecidos foliares, apresentarem elevada taxa de crescimento e divisão
durante o período de aclimatização. Esse crescimento ocorre em ambiente com
umidade reduzida, o que promove adaptação, melhorando a funcionalidade dos
estômatos e reduzindo sua densidade (Dignart, 2006).
Das plantas aclimatizadas, aquelas que apresentaram maior densidade
estomática foram as cultivadas in vitro, em casa de vegetação com sombrite
azul, porém, não houve diferença significativa entre todos os tratamentos.
TABELA 4. Densidade estomática, diâmetros polar e equatorial (DP e DE) dos
estômatos para folhas de plântulas aclimatizadas. CV= casa de
vegetação.
LUZ Densidade (mm
2
) DP (µm) DE (µm)
Casa de vegetação
280,46a 44,66b 31,95a
CV azul
487,66a 37,35c 25,98c
CV preto
89,54b 48,03a 31,38a
CV vermelho
278,98a 39,03c 26,43c
Sala de crescimento
352,24a 39,82c 28,80b
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Scott &
Knott, a 5%.
83
6 CONCLUSÕES
Alterações espectrais não promovem alterações fisiológicas e
anatômicas significativas em plântulas de Dendranthema grandiflora cv. Rage
cultivadas in vitro.
Resultados satisfatórios são obtidos em casa de vegetação sem a
proteção de sombrite.
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87
CAPÍTULO IV
LUZ NATURAL E SISTEMAS DE VEDAÇÃO NA PROPAGAÇÃO
IN VITRO DE Dendranthema grandiflora cv. Rage: ALTERAÇÕES
ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS
88
1 RESUMO
BRAGA, Francyane Tavares. Luz natural e sistemas de vedação na propagação
in vitro de Dendranthema grandiflora cv. Rage: alterações anatômicas e
fisiológicas. In: ______. Environment of culture in the propagation in vitro
of Dendranthema grandiflora cv. Rage: anatomical and physiological
alterations. 2006. Cap. 4, p.87-119. Dissertação (Mestrado em
Agronomia.Fisiologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
1
O sistema de propagação in vitro fotoautotrófica representa um tipo de cultivo
caracterizado por fornecer condições ambientais, como um aumento na
disponibilidade de CO
2
e nos níveis de radiação, além de reduzir a concentração
de uma fonte de carboidrato ao meio de cultura. Considerando a influência do
ambiente de cultivo sobre a qualidade das mudas, quanto à capacidade de
crescimento e desenvolvimento após a transferência para ambiente natural, o
presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de dois ambientes de
cultivo: sala de crescimento e casa de vegetação com sombrite 50% e dois
sistemas de vedação de frascos, convencional e ventilado. Os explantes
constituíram-se de segmentos nodais cultivadas in vitro contendo uma gema. Foi
utilizado o meio MS, combinado a 15g.L
-1
de sacarose. Após 60 dias de cultivo,
para todas as variáveis fitotécnicas analisadas (número de folhas, brotos e raízes
e comprimento da parte aérea e comprimento da maior raiz), o melhor ambiente
de cultivo foi observado em casa de vegetação, sob sistema de vedação
ventilado. Quanto aos aspectos anatômicos, para densidade estomática, o melhor
resultado foi obtido em casa de vegetação com sistema de vedação ventilado;
para diâmetros polar e equatorial, casa de vegetação e vedação convencional
mostraram-se mais eficientes. Espessura do mesofilo mostrou-se maior em casa
de vegetação e vedação convencional. Observaram-se altas taxas de
sobrevivência das plântulas em todos os tratamentos. Não houve alteração na
anatomia foliar das plântulas aclimatizadas quando comparadas às cultivadas in
vitro, porém, maiores espessuras do mesofilo foram observadas em plantas cujo
cultivo in vitro realizou-se em sala de crescimento. Os resultados obtidos neste
trabalho indicam que o aumento na disponibilidade de luz com o uso da luz
natural e a utilização de ventilação natural podem aumentar as taxas de
crescimento in vitro e favorecem a sobrevivência das plântulas durante o
processo de aclimatização.
_____________________________
1
Comitê Orientador: Dr. Moacir Pasqual – UFLA. (Orientador), Dr. Evaristo
Mauro de Castro – UFLA. (Co-orientador).
89
2 ABSTRACT
BRAGA, Francyane Tavares. Natural light and systems of prohibition in the
propagation in vitro of Dendranthema grandiflora cv. Rage: anatomical and
physiological alterations.
In: ______. Environment of culture in the
propagation in vitro of Dendranthema grandiflora cv. Rage: anatomical and
physiological alterations. 2006. p.87-119. Dissertation (Master in Agronomy.
Major in Physiology)-Federal University of Lavras, Lavras, MG.
1
The in vitro fotoautotrophic propagation system represents a type of culture
characterized for supplying ambient conditions, as an increasing of the available
CO
2
and radiation levels, besides reducing the concentration of a source
carboidrato culture medium. Considering the influence of the environment to
culture on the quality of the changes, for the capacity of growth and
development after the transference for natural environment, the present work
objected to evaluate the effects of two environments: growth room - GR,
greenhouse with 50% of shadow – GHS and two systems of prohibition of
bottles and ventilated conventional. The explants were made of nodal segments
with one shut and were cultivated in vitro. The medium was made with half MS
and 15g.L
-1
of sucrose was used. After 60 days of culture, for all the analyzed
fitothecnics variable: number of leafs, sprouts and roots and length of the aerial
part and length of the biggest root, the best environment of culture was observed
in greenhouse, under ventilated system of prohibition. For the anatomical
aspects for stomatal density ,the best result was gotten in greenhouse with
ventilated system of prohibition, stomatal diameters greenhouse and
conventional prohibition had revealed more efficient. Thickness of leaf were
bigger in greenhouse and conventional prohibition. High taxes of survival were
observed in all treatments. There were no differences between plants cultivated
and aclimatized compared to in vitro, however, greaters thicknesses of
mesophylo had been observed in plants for in vitro culture in growth room. The
results gotten in this work indicate the increase in the use of light with the
natural light and the use of natural ventilation, so it can increase the growth
taxes in vitro and chance of surviving for the plants during the acclimatization
process.
_________________________
1
Guidance Committee: Dr. Moacir Pasqual – UFLA (Adviser), Dr. Evaristo
Mauro de Castro – UFLA (Co-Adviser).
90
3 INTRODUÇÃO
O sistema de propagação in vitro fotoautotrófica representa um tipo de
cultivo caracterizado por fornecer condições ambientais, com aumento na
disponibilidade de CO
2
e nos níveis de radiação, bem como redução na umidade
relativa dentro dos frascos, induzindo a fotossíntese e conferindo capacidade de
crescimento e multiplicação das plantas em meios sem ou com reduzida
suplementação orgânica.
Algumas técnicas e metodologias têm sido desenvolvidas com o
objetivo de fornecer condições ambientais que promovam a capacidade
fotossintética do material micropropagado e favoreçam a aquisição de
fotoautotrofia in vitro. As principais são: utilização de filtros de membranas com
microporos permeáveis a gases, os quais promovem aumento na transferência de
gases entre o recipiente de cultivo e o ambiente externo, sendo a atmosfera ao
redor do recipiente mantida sob concentrações normais de CO
2
(sistema de
ventilação natural) ou enriquecida com CO
2
(sistema de ventilação forçado) e a
utilização de maior densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativos
(DFFFA) por meio da iluminação natural.
Em diversas espécies tem sido demonstrado que a micropopagação
fotoautotrófica, ou seja, na ausência de sacarose, tem apresentado algumas
vantagens, quando comparada aos sistemas convencionais de micropropagação.
Isso porque, promove maior crescimento e desenvolvimento in vitro, diminuindo
o nível de contaminação; simplifica os meios de cultura, uma vez que permite a
retirada de certos reguladores de crescimento e compostos orgânicos e promove
rápido e vigoroso desenvolvimento das plantas durante a aclimatização.
Porém a eliminação total de uma fonte de carbono ao meio deve ser
questionada em algumas situações, uma vez que o processo de hiper-hidricidade
91
ou vitrificação pode ser provocado em função do baixo potencial hídrico do
meio de cultura, disponibilizando mais facilmente água para os explantes.
Diante dessas considerações, o presente estudo teve como objetivo
avaliar um sistema de vedação para frascos que permite troca de gases dentro do
recipiente de cultivo com o meio externo, bem como o uso de luz natural como
ambiente de cultivo na propagação in vitro de Dendranthema grandliflora cv.
Rage.
92
4 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido na Universidade Federal de Lavras (UFLA) no
Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de Agricultura durante o
período de fevereiro a abril de 2005.
O material vegetal utilizado constituiu-se de plântulas da espécie
Dendrathema glandifloria cv. Rage, já estabelecidas in vitro, foram retirados
dessas plântulas segmentos nodais contendo uma gema e inoculados em meio
MS com adição de 30g L
-1
de sacarose e 5g L
-1
de ágar. Os segmentos foram
mantidos em sala de crescimento a 25±2ºC, com radiação de 52,5W m
-2
e 16
horas de fotoperíodo, até atingirem o tamanho adequado para a utilização no
experimento.
4.1 Meio de cultura
Segmentos contendo uma gema foram cultivados em meio MS, com a
concentração convencional dos sais, acrescidos de ágar na concentração de 5g.L
-
1
e 15g L
-1
de sacarose, utilizando-se tubos com 15mL
-1
de meio cada. O pH do
meio foi ajustado para 5,8, antes da autoclavagem a 121ºC e 1,2 atm durante 20
minutos.
4.2 Ambiente de cultivo
O experimento foi conduzido em casa de vegetação, sendo os frascos
colocados diretamente sobre as bancadas sob proteção adicional de sombrite
com 50% de retenção da radiação (Figura 1) e em frascos mantidos em sala de
crescimento convencional, com fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25±2ºC,
com intensidade de 52,5 W.m
-2
fornecida por lâmpadas brancas fluorescentes.
Os frascos foram vedados com tampas convencionais de polipropileno e
tampas com sistema de vedação com ventilação natural, e protegidos com filtro
93
antifungo (Figura 2) que permite ventilação dentro dos recipientes, provenientes
do fabricante Samavidros
®
.
FIGURA 1. Ambientes de cultivo em: (A) casa de vegetação com proteção de
sombrite 50%; (B) sala de crescimento com vedação ventilada.
UFLA, Lavras - MG. 2006.
FIGURA 2. Sistema de vedação: (A) tampa com sistema de
vedação com ventilação natural; (B) tampa com
sistema de vedação convencional. UFLA,
Lavras - MG. 2006.
AB
A B
94
4.3 Variáveis avaliadas
Após 60 dias de cultivo, foram avaliadas:
yCaracterísticas fitotécnicas: número de folhas e raízes por plântula,
comprimento da parte aérea e comprimento das raízes.
yQuantificação dos teores de clorofila: foram utilizadas três amostras de
0,5g cada, de tecido foliar fresco, que foram maceradas em 30mL de acetona
80%. As concentrações de clorofila a, b e total foram determinadas de acordo
com o método de Arnon (1949), após a obtenção dos dados com base em leituras
realizadas no espectrofotômetro de luz a comprimentos de onda definidos em
663 e 645nm.
Características Anatômicas - Ao término do experimento, seguindo-se à
coleta de dados fitotécnicos, as plântulas selecionadas foram fixadas em álcool
etílico 70% até a realização das análises, para as quais foram coletadas folhas na
posição dois, contando-se a partir do ápice.
Os cortes paradérmicos foram efetuados manualmente no terço médio
foliar, na superfície abaxial das folhas. Para os cortes transversais, utilizou-se
um micrótomo de mesa, sendo também realizados cortes na região do terço
mediano das folhas. As lâminas das seções paradérmicas foram preparadas com
corante safranina em glicerina 1% (v/v). Dessas seções, as variáveis analisadas
foram: densidade estomática (nº de estômatos por mm
-2
) e diâmetros polar e
equatorial dos estômatos. A freqüência estomática foi avaliada com auxílio de
uma câmara clara, em microscópio Olympus CBB, seguindo a técnica descrita
por Laboriau et al. (1961).
As seções transversais foram clarificadas em hipoclorito de sódio 1%
durante um minuto, sendo enxaguadas em água destilada por cinco minutos.
Após a lavagem, as seções foram coradas com azul de astra e safranina,
seguindo a metodologia descrita por Kraus & Arduin (1997). As lâminas foram
montadas em água glicerinada a 50%.
95
Para cada tratamento foram avaliadas cinco folhas, e para cada folha,
foram efetuadas cinco avaliações em campos diferentes. Utilizou-se uma lente
ocular micrometrada acoplada a um microscópio de luz. As variáveis analisadas
para as seções transversais foram: espessura das epidermes das faces superior e
inferior, e espessura dos parênquimas paliçádico e esponjoso. As lâminas das
análises paradérmicas foram preparadas com corante safranina em glicerina 1%
(v/v). Dessas seções, as variáveis analisadas foram densidade estomática (nº de
estômatos por mm
-2
) e diâmetros polar e equatorial (µm) dos estômatos. A
freqüência estomática foi avaliada com auxílio de uma câmara clara, em
microscópio Olympus CBB, seguindo a técnica descrita por Laboriau et al.
(1961).
As fotomicrografias foram feitas no Laboratório de Citogenética do
Departamento de Biologia da UFLA, utilizando-se máquina fotográfica acoplada
a um microscópio Olympus modelo BX 60, em objetiva de 40x.
yAclimatização
Após 60 dias de cultivo, 10 plântulas por tratamento foram testadas
quanto à capacidade de aclimatização. Elas foram colocadas em bandejas
contendo Plantmax
®
como substrato e foram mantidas na mesma casa de
vegetação onde foram previamente conduzidos os experimentos. A capacidade
de aclimatização foi avaliada pela porcentagem de sobrevivência em cada
tratamento ao término de um mês.
Das plantas sobreviventes, foram realizados cortes anatômicos das
folhas para que se pudesse comparar com o mesmo material na fase in vitro.
4.4 Delineamento experimental e análise estatística
O experimento foi montado em delineamento inteiramente casualizado,
em esquema fatorial 2x2, totalizando quatro tratamentos, com 10 repetições.
Cada repetição foi composta por um frasco contendo cinco segmentos nodais.
96
O primeiro fator a ser analisado foi o ambiente de incubação, definido
por “luz”, representado por sala de crescimento convencional e casa de
vegetação com sombrite preto 50%. O outro fator a ser analisado foi o sistema
de vedação, constituindo-se de dois modelos de tampas, convencional e com
sistema de ventilação.
Aos 60 dias de cultivo, as plântulas foram removidas para proceder-se à
coleta de dados. Os dados foram submetidos ao programa SISVAR 4.3 (Ferreira,
1999), para a realização das análises de variância. As médias foram comparadas
pelo Teste de a 5% de probabilidade.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Características fitotécnicas
Não houve interação entre os fatores ambiente de cultivo e o sistema de
vedação para todas as variáveis fitotécnicas analisadas.
Em todas as variáveis, foram observadas diferenças significativas entre
os tratamentos do fator ambiente de cultivo, com exceção do número de
brotações. O melhor resultado foi apresentado pelo ambiente casa de vegetação
(Tabela 1).
97
TABELA 1. Número de folhas (NF), comprimento de parte aérea (CPA),
número de raízes (NR), comprimento da maior raiz (CR) e
número de brotações (NB), de plântulas de crisâtemo cv. Rage,
cultivado em diferentes ambientes casa de vegetação e sala de
crescimento.
LUZ NF CPA (cm) NR CR (cm) NB
Casa de vegetação
27,85a 7,36a 15,32a 13,57a 2,62a
Sala de crescimento
20,32b 6,21b 11,27b 10,11b 2,27a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a
5%.
Quanto ao sistema de vedação, houve diferenças significativas apenas
para as variáveis número de folhas e comprimento de raízes (Tabela 2). Melhor
resultado para número de folhas foi observado no sistema de vedação ventilado,
enquanto que para comprimento de raízes, o sistema de vedação convencional
mostrou-se mais eficaz.
TABELA 2. Número de folhas (NF), comprimento de parte aérea (CPA),
número de raízes (NR), comprimento da maior raiz (CR) e
número de brotações (NB), de plântulas de crisâtemo cv. Rage,
cultivado em diferentes sistemas de vedação com ventilação
natural e vedação convencional.
TAMPA NF CPA (cm) NR CR (cm) NB
Ventilação natural
26,55a 6,92a 13,95a 10,99b 2,57a
Convencional
21,62b 6,61a 12,65a 12,68a 2,32a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a
5%.
98
Trabalhando com Brassica oleracea, Kanechi & Ochi (1998) avaliaram
diferentes condições de cultivo in vitro, fotomixotrófica e fotoautotrófica. No
primeiro caso, foram utilizados diferentes níveis de irradiação, sistema de
vedação ventilado com filtro de membranas nas tampas e enriquecimento com
CO
2
nos frascos, tendo o meio de cultura sido suplementado com 2% de
sacarose. Já no segundo caso foram utilizadas as mesmas condições de cultivo,
porém, sem suplementação de sacarose ao meio. Observou-se que baixas
intensidades de irradiância e sistema de vedação ventilado promoveram maior
área foliar, bem como maiores massas de raízes e brotos nas plântulas em
condições fotomixotróficas. Em condições fotoautotróficas, os melhores
resultados também foram observados em condições de cultivo sob baixa
irradiância e sistema de vedação ventilado, porém, quando comparados os
resultados, verifou-se maior massa em brotos e raízes cultivadas em condições
fotomixotróficas, mostrando a necessidade de uma fonte extra de carboidrato.
A ventilação natural é importante durante o processo de enraizamento
in vitro, principalmente para subseqüente adaptação das plantas durante o
processo de aclimatização (Kubota & Kozai, 1992).
Para a realização da fotossíntese, é necessário obter energia por meio de
uma fonte de carbono para que ocorra crescimento fotoautrotrófico. O carbono
fixado pelas folhas desenvolvidas in vitro em meios sem adição extra de
sacarose é insuficiente para que ocorra um crescimento autotrófico,
principalmente após transferência para aclimatização, sendo necessária uma
adição desse carboidrato ao meio de cultura (Preece & Sutter, 1991).
Nguyen et al. (2001) avaliaram diferentes níveis de irradiância (baixo e
alto) e condições de ventilação no frasco (baixo e alto) em cultivo in vitro de
Coffea arabusta e verificaram que maior ventilação nos frascos, independente
99
dos níveis de irradiância, promoveu maiores pesos de matéria seca, maior área
foliar e comprimento de parte aérea.
O aumento dos níveis de irradiância durante o crescimento in vitro e a
concentração de CO
2
no interior dos frascos, é um fator crítico para promover
altas taxas fotossintéticas em plantas cultivadas em condições fotoautotróficas.
Da mesma forma que os demais trabalhos relatados e os resultados
apresentados neste trabalho, Arigita et al. (2002), trabalhando com Actinidia
deliciosa, obtiveram maior número de folhas e brotos e maior comprimento de
parte aérea, em condições de incubação com maiores concentrações de CO
2
no
interior do frasco e condições fotomixotróficas, ou seja, com adição de baixas
concentrações de sacarose ao meio.
5.2 Teores de clorofila
Foram observadas interações significativas nos teores de clorofila b e na
relação clorofila a/b, enquanto que para clorofila a e total, não foram observadas
diferenças (Tabela 3).
Em diversas espécies, a presença de sacarose no meio de cultura tem
sido considerada a principal causa na redução dos teores de clorofila,
conseqüentemente, prejudicando o processo fotossintético (Adelberg et al.,
1999; Kanechi et al., 1998; Chenevard et al., 1997; Deng & Donnelly, 1993).
Considerando-se as variações in vitro sob diferentes condições de
cultivo, observa-se tendência na redução do teor de clorofila quando se aumenta
o nível de irradiância (Deccetti, 2004).
Nos teores de clorofila a, foi observada uma diferença significativa
quando observado o fator luz separadamente, com tendência a menores teores
em folhas cultivas sob maiores níveis de irradiância, ou seja, em casa de
vegetação. Porém, não houve diferença nos níveis de clorofila, quando analisado
100
o sistema de vedação. O mesmo foi observado por Deccetti (2004), quando
avaliou os teores de clorofila a em folha de Annona glaba. A autora registrou
menores teores de clorofila quando utilizou ambiente de cultivo com maiores
níveis de irradiância, porém, maiores teores dessa clorofila foram verificados em
sistema de vedação com ventilação.
TABELA 3. Teores de clorofila a, b, total e a razão de clorofila a/b em folhas de
crisântemo D. grandiflora desenvolvidas durante o período de
cultivo in vitro sob sistema convencional de vedação e ventilação
natural e ambiente de cultivo em sala de crescimento (SC) e casa
de vegetação (CV).
Clorofila a (µg.mL
-1
)
CV SC
0,12b** 0,16a
Ventilação Convencional
0,14a 0,14a
Clorofila b (µg.mL
-1
)
Ventilação Convencional
CV
0,06bA* 0,05bA
SC
0,10aB 0,15aA
Clorofila total (µg.mL
-1
)
CV SC
0,18b 0,29a
Ventilação Convencional
0,23a 0,24a
Clorofila a/b (µg.mL
-1
)
Ventilação Convencional
CV
1,63aA 1,06bB
SC
2,08aA 2,38aA
* Letras minúsculas correspondem às colunas e letras maiúsculas às linhas.
**Letras iguais não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de significância.
Para clorofila b, observou-se que sala de crescimento e sistema de
vedação convencional resultaram nos maiores teores. Deccetti (2004) não
observou diferença entre os teores dessa clorofila, tanto no sistema de vedação
101
como nos níveis de irradiância, porém, os maiores teores foram obtidos em
menores níveis de irradiação, com sistema de ventilação natural.
Os ambientes de cultivo e o sistema de vedação não influenciam na
síntese de clorofila, tendo os maiores teores sido observados também em sala de
crescimento com sistema de vedação convencional. Os fatores analisados
interferem na relação clorofila a/b, evidenciando melhores resultados no sistema
de vedação convencional, mantidos em sala de crescimento. O efeito do nível de
irradiância foi menos evidente sobre a clorofila a e b.
Os teores de clorofila total foram maiores em folhas cultivadas em sala
de crescimento e com frascos vedados com tampas convencionais. Nas folhas
sob baixa irradiância, constitui-se em resposta que é observada com freqüência,
sendo que, sob essa condição, a planta investe mais assimilados no complexo
proteína-clorofila do aparelho fotossintético para otimizar a captação de luz
(Amâncio et al., 1999).
Quanto à razão clorofila a/b, foi observada interação entre os fatores
tendo sido sala de crescimento e sistema de vedação convencional os que
apresentaram maiores teores. Deccetti (2004) observou que as variações na
micropropagação de Annona foram menos evidentes em resposta às mudanças
no nível de irradiância ou no sistema de vedação do frasco.
De modo geral, a redução no teor de clorofila total, quanto ao nível de
irradiância é acompanhada pela redução nos teores de clorofila a e b. Dessa
maneira, a razão clorofila a/b é mantida.
5.3 Características anatômicas
5.3.1 Características paradérmicas
A análise da epiderme na face abaxial demonstrou que não houve
modificações no tipo de células epidérmicas. Ocorreu interação significativa
102
entre os fatores luz e sistema de vedação para as variáveis densidade e diâmetro
polar, porém, para diâmetro equatorial, não foi observada interação entre os
fatores (Tabela 4).
Verificou-se maior densidade estomática na interação casa de vegetação
com sistema de vedação ventilada. Similarmente aos resultados obtidos neste
trabalho, Deccetti (2004) observou que as maiores freqüências estão associadas
a altas irradiâncias.
TABELA 4. Densidade estomática, diâmetros polar e equatorial dos estômatos
de folhas de plântulas cultivadas sob diferentes ambientes de
cultivo sala de crescimento (SC) e casa de vegetação (CV) e
sistema de vedação com ventilação natural e convencional.
Densidade (mm
2
)
Ventilação Convencional
CV
163,54aB* 91,74bA
SC
150,96aA 141,34aA
Diâmetro polar (µm)
Ventilação Convencional
CV
49,45aB 56,81aA
SC
39,15bA 41,54bA
Diâmetro equatorial (µm)
CV SC
39,09ª** 29,13b
Ventilção Convencional
34,08a 34,14a
* Letras minúsculas correspondem às colunas e letras maiúsculas às linhas.
**Letras iguais não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de significância.
O aumento no número de estômatos sob maiores níveis de irradiância e
ventilação natural demonstra que plantas cultivadas in vitro têm tendência
semelhante à de plantas cultivadas em outros ambientes, que é de aumentar a
freqüência de estômatos sob maior disponibilidade de luz e CO
2
. O aumento no
número de estômatos em plantas cultivadas in vitro, quando comparadas a
103
plantas cultivadas em ambientes naturais, tem sido reportado em diversos
estudos que têm associado esse aumento, principalmente, à alta umidade relativa
dentro dos frascos (Khan et al., 2003; Scuitti & Morini, 1995; Lee et al., 1988;
Brainerd & Fuchigami, 1981).
FIGURA 3. Secções paradérmicas na superfície abaxial de folhas de D.
grandiflora. SC = sala de crescimento; CV = casa de vegetação;
V = sistema de vedação com ventilação e N = sistema de vedação
convencional. Barra = 25µm. UFLA, Lavras, MG, 2006.
Os estômatos das folhas que se desenvolveram em casa de vegetação
apresentam formato elíptico e são maiores em sistema de vedação convencional.
Os desenvolvidos em casa de vegetação com ventilação natural apresentam-se
menores e também em forma elíptica (Figura 3).
Maior diâmetro polar foi obtido em plântulas cultivadas em casa de
vegetação com vedação convencional. Quanto ao diâmetro equatorial, não houve
SC-V SC-N
CV-V CV-N
104
interação entre os fatores, tendo sido observada diferença significativa apenas no
fator luz, e os melhores resultados foram observados em casa de vegetação.
De acordo com Khan et al. (2003), a forma elíptica é característica de
estômatos funcionais, enquanto a forma arredondada está associada a estômatos
que não apresentam um funcionamento normal.
Alguns trabalhos demonstraram que a presença de uma fonte de
carboidrato no meio, bem como o acúmulo de etileno no interior do frasco e,
principalmente, a alta umidade relativa nos recipientes vedados
convencionalmente resultam no desenvolvimento anormal dos estômatos e na
reduzida capacidade de fechamento destes em resposta às condições severas do
ambiente natural, como, por exemplo, a demanda evaporativa das plantas em
ambientes ex vitro (Shackel et al., 1990; Sutter, 1988; Wardle et al., 1983;
Fuchigami et al., 1981; Brainerd & Fuchigami, 1981).
A funcionalidade dos estômatos sob diferentes condições de cultivo,
condições estas que se aproximem ao ambiente natural, podem impedir a
excessiva dessecação das plantas micropropagadas após o transplante,
aumentando as taxas de sobrevivência durante o processo de aclimatização.
5.3.2 Características do limbo foliar
Não houve interação entre os fatores para o espessamento das epidermes
abaxial e adaxial, bem como para os parênquimas paliçádico e esponjoso, não
(Tabela 5 e 6). Analisando-se os ambientes de cultivo separadamente,
observaram-se diferenças significativas entre estes.
Para as epidermes abaxial e adaxial, a maior espessura foi observada em
casa de vegetação. O mesmo foi observado para os parênquimas paliçádico e
esponjoso.
105
TABELA 5. Espessura dos tecidos epidérmicos, parênquimas paliçádico e
esponjoso de crisântemo desenvolvido durante cultivo in vitro sob
ambiente de casa de vegetação (CV) e sala de crescimento (SC).
Epiderme
abaxial (µm)
Epiderme
adaxial (µm)
Esponjoso
(µm)
Paliçádico
(µm)
CV
24,00a 31,95a 110,70a 55,80a
SC
20,40b 27,50b 89,10b 33,50b
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a
5%.
Para o sistema de vedação, foram observadas diferenças significativas
apenas nas variáveis epiderme abaxial e parênquima esponjoso. Os demais não
diferiram entre si. Porém, os maiores valores, em todas as variáveis, foram
obtidos em sistema de vedação convencional.
TABELA 6. Espessura dos tecidos epidérmicos, parênquimas paliçádico e
esponjoso de crisântemo desenvolvido durante cultivo in vitro sob
sistema de vedação com ventilação natural e convencional.
Epiderme
abaxial (µm)
Epiderme
adaxial (µm)
Esponjoso
(µm)
Paliçádico
(µm)
Ventilação
19,95b 29,10a 85,85b 44,45a
Convencional
24,45a 30,45a 112,95a 44,85a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a
5%.
Em todas as condições de cultivo, as epidermes apresentaram apenas
uma camada de células (epiderme uniestratificada); as células não apresentavam
um formato definido, revestidas por uma fina camada de cutícula.
O mesofilo, nas duas condições de cultivo, mostrou-se dorsiventral,
apresentando parênquima paliçádico na face superior da lâmina (adaxial) e
parênquima esponjoso na face inferior (abaxial). O parênquima paliçádico
apresentou apenas uma camada de células, com células de formato indefinido e
arranjadas desorganizadamente. Em espécies com mesofilo dorsiventral, a
106
grande maioria dos cloroplastos é encontrada nas células do parênquima
paliçádico. Devido à forma e ao arranjo dessas células, os cloroplastos podem se
dispor paralelamente às paredes celulares, aumentando a eficiência fotossintética
(Menezes et al., 2003; Soares, 2005).
O parênquima esponjoso mostrou células também desuniformes e com
espaços entre elas. Tais características são melhorvisualizadas na Figura 4.
FIGURA 4. Seções transversais de folhas de D. grandiflora desenvolvidas
durante o cultivo in vitro sob SC = sala de crescimento; CV =
casa de vegetação; V = ventilação natural e N = convencional.
Barra = 70µm UFLA, Lavras, MG, 2006.
107
Independente do local de cultivo, as células do parênquima paliçádico
são menores e mais desorganizadas em sistema de vedação com ventilação
natural. Já para o tecido do parênquima esponjoso, o sistema de vedação não tem
influência quando se observam espaços intercelulares que ocorrem em maior
abundância no mesofilo de folhas cultivadas em sala de crescimento com menor
irradiância.
Deccetti (2004), trabalhando com Annona glaba L. sob sistema de
vedação ventilada e convencional e vários níveis de irradiância, observou que o
aumento da irradiação interfere significativamente no desenvolvimento do tecido
foliar. Foi observado neste estudo que as epidermes adaxial e abaxial foram
maiores em níveis maiores de irradiância, porém, o sistema de vedação não
influenciou no desenvolvimento dessa epiderme. Já nos tecidos que compõem o
mesofilo, a espessura dos dois tecidos aumenta à medida que se aumentam os
níveis de radiação, independente do sistema de vedação do frasco.
Foi observado por Deccetti (2004) um maior grau de espaçamento entre
as células do parênquima esponjoso em tecidos cultivados sob baixa e média
irradiância, corroborando as características observadas neste trabalho.
Tais observações foram descritas por Dimassi-Theriou & Bosabalidis
(1997), durante o cultivo fotomixotrófico de Actinidea deliciosa, sob alta
irradiância.
O aumento na espessura da folha e células paliçádicas mais alongadas
constituem um padrão clássico de resposta e de adaptação das plantas à alta
intensidade de luz (Lee et al., 2000) e evidenciam a plasticidade adaptativa da
planta. A capacidade de alterar a estrutura da folha em resposta ao ambiente,
principalmente ao nível de irradiância, tem sido comumente observada em
diversas espécies cultivadas in vitro (Dimassi-Theriou & Bosabalidis, 1997;
Serret et al., 1996; Donnelly & Vidaver, 1984).
108
Os resultados deste trabalho demonstram que diferentes ambientes de
cultivo, principalmente sob diferentes níveis de irradiância, podem modificar o
desenvolvimento da folha in vitro, tornando a anatomia desta mais semelhante à
das plantas cultivadas em ambiente in vivo. Em adição, a estrutura da folha pode
determinar a capacidade fotossintética da planta (Araus et al., 1986). Dessa
maneira, o aumento na capacidade fotossintética de D. grandiflora em estágios
do desenvolvimento in vitro, principalmente sob alta irradiância, pode estar
associado ao maior desenvolvimento das características estruturais relacionadas
ao processo fotossintético, como a maior diferenciação do mesofilo,
principalmente do parênquima paliçádico.
5.4 Aclimatização
Após 30 dias do período de aclimatização, foi avaliada a taxa de
sobrevivência das plântulas; 100% das plântulas provenientes de cultivo in vitro
em casa de vegetação e sistema de vedação ventilada e convencional
sobreviveram. Por outro lado, apenas 70% das plântulas cultivadas em sala de
crescimento, também com os dois sistemas de vedação, sobreviveram (Figura 5).
Os resultados apresentados mostram a capacidade de adaptação das plântulas,
quando cultivadas em ambientes próximos ao natural, de sobreviverem durante o
processo de aclimatização (Figura 6). Tais resultados já eram esperados, devido
à adaptação anatômica das plântulas durante o cultivo in vitro; a funcionalidade
dos estômatos era mais evidente em plântulas cultivadas em casa de vegetação.
Mesmo com resultados superiores nesse ambiente de cultivo, a taxa de 70% para
plântulas cultivadas em sala de crescimento também é aceitável. São poucos os
trabalhos realizados com aclimatização de espécies cultivadas in vitro sob
diferentes ambientes de cultivo, principalmente quando se utiliza sistema de
vedação com ventilação natural. Portanto, torna-se difícil uma discussão a
respeito dos resultados obtidos.
109
FIGURA 5. Eficiência de aclimatização após cultivo em diferentes ambientes
de luz com diferentes sistemas de vedação. SC = sala de
crescimento; CV = casa de vegetação; V = sistema de vedação
ventilada e N = sistema de vedação convencional. UFLA, Lavras,
MG, 2006.
FIGURA 6. Aspecto das plantas floridas após cultivo em
diferentes ambientes de luz, com frascos com
sistema de vedação ventilado e convencional.
UFLA, Lavras, MG, 2006.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
SC - V SC - N CV - V CV - N
Ambiente de cultivo
Taxa de sobrevivência (%
)
aa
b b
110
Quanto às características anatômicas, observou-se que só houve
interação significativa entre os fatores nas variáveis diâmetros polar e equatorial.
Para a densidade estomática, somente o fator luz influenciou na anatomia de
estômatos (Figura7).
FIGURA 7. Secções paradérmicas na superfície abaxial de folhas de plântulas
aclimatizadas de D. grandiflora. SC = sala de crescimento; CV =
casa de vegetação; V = sistema de vedação com ventilação e N =
sistema de vedação convencional. Barra = 25µm. UFLA. Lavras,
MG, 2006.
Maiores densidades estomáticas foram observadas em sala de
crescimento, ao contrário dos resultados obtidos em folhas de plântulas
cultivadas in vitro que evidenciaram melhor resultado em casa de vegetação.
Observou-se também menor densidade de estômatos/mm
2
em folhas de plantas
aclimatizadas. Resultados semelhantes foram obtidos por outros autores, nos
SC-V SC-N
CV-V CV-N
111
quais a densidade estomática foi menor em folhas aclimatizadas do que aquelas
obtidas in vitro (Dignart, 2006; Soares, 2005). Redução na densidade de
estômatos durante o período de aclimatização é um processo bem característico
dessa fase e já foi reportado por outros autores (Donnelly & Vidaver, 1984; Lee
et al., 1985; 1988). Isso ocorre devido a células da epiderme, bem como dos
demais tecidos foliares, apresentarem elevada taxa de crescimento e divisão
durante o período de aclimatização. Esse crescimento ocorre em ambiente com
umidade reduzida, promovendo melhor adaptação, principalmente em termos de
funcionalidade dos estômatos e, conseqüentemente, diminuindo sua densidade.
TABELA 7. Densidade estomática, diâmetros polar e equatorial dos estômatos
de folhas de plântulas aclimatizadas cultivadas sob diferentes
ambientes de luz, sala de crescimento (SC) e casa de vegetação
(CV) e sistema de vedação com ventilação natural e convencional.
Densidade (mm
2
)
CV SC
120,62b** 134,68a
Ventilação Convencional
132,09a 123,21a
Diâmetro polar (µm)
Ventilação Convencional
CV
44,77aA* 41,06aB
SC
40,16bB 41,73aA
Diâmetro Equatorial (µm)
Ventilação Convencional
CV
27,45aA 27,22bA
SC
26,55aB 29,92aA
* Letras minúsculas correspondem às colunas e letras maiúsculas às linhas.
**Letras iguais não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de significância.
Para diâmetros polar e equatorial dos estômatos observados em folhas
de plântulas cultivadas in vitro, houve interação significativa entre os fatores
analisados.
112
Melhores resultados foram para diâmetro polar em casa de vegetação
com sistema de vedação ventilada. O mesmo não ocorreu para anatomia in vitro,
pois o sistema de vedação, para o qual ocorreu maior diâmetro polar foi o
convencional em casa de vegetação. Já para diâmetro equatorial, o melhor
resultado foi sala de crescimento com sistema de vedação convencional,
diferentemente da anatomia in vitro, em que o melhor resultado foi casa de
vegetação com sistema de vedação também convencional.
Com os resultados obtidos, pode-se afirmar que a funcionalidade dos
estômatos mostra a capacidade de adaptação de plântulas cultivadas in vitro a
ambientes naturais, sendo que quanto mais próximo é o ambiente de cultivo in
vitro do ambiente natural, maior é a taxa de sobrevivência das plantas.
Quanto às características de mesofilo, somente epiderme adaxial não
mostrou interação significativa entre os dois fatores. Por outro lado, os demais
tecidos, epiderme adaxial e parênquimas paliçádico e esponjoso, sofrem
influência significativa da interação entre os fatores luz e vedação do frasco
(Tabela 8).
Tanto a epiderme abaxial quanto a adaxial apresentavam células mais
uniformes O mesmo foi observado em células do parênquima paliçádico, que se
apresentavam mais justapostas e organizadas; o parênquima esponjoso
apresentou poucos espaços intercelulares, o que diferiu completamente dos
mesofilos de plantas aclimatizadas das plantas in vitro (Figura 8).
113
TABELA 8. Espessura dos tecidos epidérmicos, parênquimas paliçádico e
esponjoso de D. grandiflora desenvolvido durante cultivo in vitro
sob ambiente de cultivo em casa de vegetação (CV) e sala de
crescimento (SC) e sistema de vedação com ventilação natural e
convencional.
Epiderme abaxial (µm)
CV SC
30,15a** 31,57a
Ventilação Convencional
30,15a 31,57a
Epiderme adaxial (µm)
Ventilação Convencional
CV
34,20aA 30,30bB
SC
36,60aB 42,90aA
Parênquima esponjoso (µm)
Ventilação Convencional
CV
153,30aA 132,00bB
SC
146,70aB 164,70aA
Parênquima paliçádico (µm)
Ventilação Convencional
CV
64,20aA 57,77bA
SC
64,50aB 72,90aA
* Letras minúsculas correspondem às colunas e letras maiúsculas às linhas.
**Letras iguais não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de significância.
114
FIGURA 8. Seções transversais de folhas de
plântulas aclimatizadas de D.
grandiflora desenvolvidas durante o
cultivo in vitro sob SC = sala de
crescimento; CV = casa de
vegetação; V = ventilação natural e
N = convencional. Barra = 25µm.
UFLA, Lavras, MG, 2006.
A espessura da epiderme abaxial não diferiu estatisticamente entre os
tratamentos, tendo a maior espessura sido encontrada em sala de crescimento
sob frasco com vedação ventilada. Comparando-se a epiderme abaxial de
SC-V
SC-N
CV-V
CV-N
115
plântulas cultivadas in vitro, constata-se que as mesmas apresentaram maior
espessura quando cultivadas em maiores níveis de irradiância. Nas plantas
aclimatizadas houve aumento nessa espessura quando as plantas cultivadas em
menores níveis de irradiância foram colocadas em locais com maiores níveis de
irradiância. Isso mostra que há tendência de aumentar a espessura de tecidos
quando o nível de irradiação aumenta.
Resultados semelhantes foram encontrados para os demais tecidos,
epiderme adaxial e parênquimas paliçádico e esponjoso, ocorrendo maiores
espessuras nos tecidos cujas plântulas foram cultivadas durante
micropropagação em sala de crescimento e sistema convencional de vedação. A
anatomia dessas mesmas plantas analisadas, quando cultivadas in vitro, mostrou
melhores resultados em ambiente casa de vegetação, ou seja, com maiores níveis
de irradiação com o mesmo sistema de vedação convencional. Porém, quando
todos os tratamentos foram expostos à alta irradiância, observou-se que os
tratamentos em sala de crescimento aumentaram a espessura dos tecidos. A
capacidade de alterar a estrutura da folha em resposta ao ambiente,
principalmente ao nível de irradiância, tem sido comumente observada em
diversas espécies cultivadas in vitro (Dimassi-Theriou & Bosabalidis, 1997;
Serret et al., 1996; Donnelly & Vidaver, 1984).
6 CONCLUSÕES
O uso de luz natural e sistema de vedação com ventilação natural
aumenta as taxas de crescimento, alterando a morfoanatomia de folhas de
plântulas de crisântemo cultivadas sob esses ambientes.
Os teores de clorofilas diminuem com o aumento do nível de irradiação.
A alteração na anatomia das folhas indica uma adaptação da planta ao
ambiente de cultivo.
116
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