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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE
ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS
METALOPROTEINASES 2 E 9 EM CARCINOMAS UROTELIAIS DA
BEXIGA RESTRITOS À LÂMINA PRÓPRIA
Aluna: Helena Terezinha Hubert Silva
Orientador: Profa. Dra. Adriana Roehe
Co-orientador: Prof. Dr. Antonio Hartmann
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia
da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre
como requisito para a obtenção do grau de Doutor
2010
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE
ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS METALOPROTEINASES
2 E 9 EM CARCINOMAS UROTELIAIS DA BEXIGA
RESTRITOS À LÂMINA PRÓPRIA
Aluna: Helena Terezinha Hubert Silva
Orientador: Profa. Dra. Adriana Roehe
Co-orientador: Prof. Dr. Antonio Hartmann
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade
Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção
do grau de Doutor
2010
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Catalogação na Publicação
Bibliotecário Vladimir Luciano Pinto - CRB 10/1112
S586e Silva, Helena Terezinha Hubert
Estudo da expressão imunohistoquímica das metaloproteinases
2 e 9 em carcinomas uroteliais da bexiga restritos à lâmina
própria / Helena Terezinha Hubert Silva. – 2010.
84 f.: il., tabelas; 30 cm.
Tese (doutorado) -- Universidade Federal de Ciências da Saúde
de Porto Alegre. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-
Graduação em Anatomia Patológica, 2010.
“Orientadores: Profª Drª Adriana Vial Roehe; Prof. Dr. Antonio A.
Hartmann”.
1. Neoplasia da bexiga. 2. Metaloproteinases. 3. Carcinoma
I. Roehe, Adriana Vial. II. Hartmann, Antonio A. III. Título.
CDD 616.99462
CDU 616-006.6
“Vivendo a aventura de ser um eterno aprendiz...
...onde os sonhos, que você ousa sonhar,
se tornam realidade...”
II
AGRADECIMENTOS
À Comissão Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Patologia,
professores Drs. Antonio A. Hartmann (coordenador), Giorgio Adriano Paskulin (vice-
coordenador), Marilda da Cruz Fernandes, Paulo Ricardo Gazzola Zen e Renan
Rangel Bonamigo.
À professora Dra. Marilda da Cruz Fernandes, chefe do Laboratório de
Patologia do Programa de Pós-Graduação em Patologia.
Aos professores e funcionários do Laboratório de Micologia e Patologia do
Hospital Santa Rita – Complexo Hospitalar Santa Casa.
Aos funcionários do Centro de Documentação e Pesquisa (CEDOP) do
Complexo Hospitalar Santa Casa – núcleos do Hospital Santa Rita, Ambulatório e
Internação do Hospital Santa Clara, Hospital São Francisco e Hospital São José.
Ao coordenador do Núcleo de Informação em Saúde da Secretaria Estadual
da Saúde do RS, Dr. Paulo Recena Grassi.
Aos bibliotecários da UFCSPA, Ruth Borges Fortes de Oliveira, Solange
Padilha Ortiz, Vladimir Luciano Pinto.
A todos os professores, colegas, estagiários, monitores, amigos e alunos,
sem os quais este trabalho não poderia ter sido realizado, em especial:
Ana Maria Ponzio de Azevedo
Carolina Sturm Trindade
Débora Maria Vargas de Lima
Edi Carmen Pulrolnik
Fernando Marchioro Kasperifki
III
Jeanine Pereira
João Francisco Navarro Reolon
Jussara Ribeiro Duarte Bocaccio
Maria Isalete Neumann Pritsch
Maristela Pasin
Rosalva Thereza Meurer
IV
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Aos meus orientadores:
Profa. Dra. Adriana Vial Roehe, pelos ensinamentos, inestimável paciência,
sabedoria, incentivo e carinho na elaboração desta árdua tarefa.
Prof. Dr. Antônio Atalíbio Hartmann, pelo apoio e incentivo à conclusão desta
tese.
V
DEDICADA
Ao meu esposo, Luiz Carlos, com carinho e
minha admiração;
Aos meus filhos, Gabriel e Rafael, por serem
meus queridos filhos;
À minha mãe, Adelaide, pela perseverança e
compreensão;
À minha irmã, Susana, por ser a minha irmã;
Ao meu pai, Hugo.
VI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estadiamento do carcinoma de bexiga ......................................................18
VII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação das metaloproteinases ........................................................21
VIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AJCC American Joint Committee on Cancer
APTS Solução silano (3 – aminopropriltrietoxisilano)
BCG Bacilo de Calmet-Guérin
BSA Albumina de soro bovina
CB Carcinoma de bexiga
CISCMPA Complexo Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre
CUBRLP Carcinoma urotelial de bexiga restrito à lâmina própria
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EGFR Fator de crescimento epidérmico
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EMMPRIN Indutor da metaloproteinase da matriz extracelular
IMQ Imunohistoquímica
INCA Instituto Nacional do Câncer
ISUP International Society of Urological Pathology
Ki 67 Proteína nuclear marcadora da proliferação celular
MEC Matriz extracelular
MMP Metaloproteinase de matriz
MMP 2 Metaloproteinase matriz 2
MMP 9 Metaloproteinase matriz 9
MT-MMP Metaloproteinase transmembrana
NBPM Neoplasia de baixo potencial de malignidade
OMS Organização Mundial da Saúde
PBS Solução tampão fosfato
IX
PCR Reação em cadeia da polimerase
PDGF Fator de crescimento derivado das plaquetas
RS Rio Grande do Sul
RT-PCR Reação em cadeia da polimerase pela transcriptase reversa
SPSS 12 Statistical Package for the Social Sciences versão 12
Tis Tumor não papilar restrito ao urotélio
Ta Tumor papilar restrito ao urotélio
T1 Tumor presente na lâmina própria
T2 Invasão da camada muscular superficial
T3a Invasão da camada muscular própria profunda
T3b Invasão do tecido adiposo perivesical
T4 Invasão de estruturas adjacentes
TGF-β Fator transformador de crescimento β
TIMP 2 Inibidor da metaloproteinase 2
TIMPs Inibidores teciduais das metaloproteinases
TNM Classificação de tumores malignos: T - extensão do tumor primário;
M - metástase à distância; N - metástase em linfonodo regional
UFCSPA Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre
UICC União Internacional Contra o Câncer
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
X
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................................... 2
1.1 EPIDEMIOLOGIA ............................................................................................................................. 4
1.2 ETIOLOGIA....................................................................................................................................... 5
1.2.1 TABAGISMO ................................................................................................................................. 6
1.2.2 EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL...................................................................................................... 6
1.2.3 FATORES QUÍMICOS................................................................................................................... 7
1.2.4 FATORES DE IRRITAÇÃO CRÔNICA......................................................................................... 7
1.2.5 FATORES GENÉTICOS E MOLECULARES................................................................................ 8
1.3 SINTOMATOLOGIA ......................................................................................................................... 8
1.4 DIAGNÓSTICO................................................................................................................................. 9
1.5 TRATAMENTO ............................................................................................................................... 11
1.6 HISTOPATOLOGIA........................................................................................................................ 12
1.6.1 HISTOLOGIA NORMAL.............................................................................................................. 12
1.6.2 ASPECTOS PATOLÓGICOS......................................................................................................13
1.6.2.1 GRADUAÇÃO HISTOLÓGICA ................................................................................................ 13
1.6.2.2 ESTADIAMENTO...................................................................................................................... 16
1.7 PROGNÓSTICO ............................................................................................................................. 19
1.8 METALOPROTEINASES ............................................................................................................... 20
1.9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 25
2 ASPECTOS ÉTICOS......................................................................................................................... 29
3 OBJETIVOS....................................................................................................................................... 30
3.1 OBJETIVO GERAL......................................................................................................................... 30
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................................... 30
4 ARTIGO CIENTÍFICO REDIGIDO EM INGLÊS................................................................................ 31
5 ARTIGO CIENTÍFICO REDIGIDO EM PORTUGUÊS....................................................................... 51
6 CONCLUSÕES FINAIS............................................................................................................
......... 72
7 ANEXOS ............................................................................................................................................ 73
ANEXO A – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA DO CISCMPA......................................................... 73
ANEXO B – ADENDO AO PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA DO CISCMPA.................................. 75
ANEXO C – TÉCNICAS HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA................................................. 76
1
2
1 INTRODUÇÃO
O carcinoma de bexiga (CB) é o quinto tumor mais comum na espécie
humana e corresponde ao quarto tumor mais comum nos homens e o oitavo mais
comum nas mulheres (Cheng e cols. 1999; Jemal e cols., 2009; Madeb e cols.,
2004). Além disso, apresenta-se como uma neoplasia localmente agressiva e tem
como tipo histológico mais comum o carcinoma urotelial ou de células transicionais
(Black e cols., 2009).
Os principais fatores de risco documentados para o desenvolvimento do
carcinoma de bexiga são o tabagismo, a exposição a agentes químicos industriais
(aminas aromáticas) e algumas infecções do trato genito-urinário. A severidade e o
prognóstico dos casos de carcinoma de bexiga estão diretamente relacionados ao
estágio tumoral (superficial ou infiltrativo), ao grau histológico (I, II e III) e ao tamanho
do tumor, sendo considerados os de melhor prognóstico os tumores superficiais, de
grau I e com até três centímetros (Gogus e cols., 2002).
Por sua vez, as metaloproteinases da matriz (MMPs) estão envolvidas na
formação de diversos processos neoplásicos – incluindo surgimento de metástases,
uma vez que são capazes de degradar componentes da matriz extracelular (MEC),
uma importante barreira para o desenvolvimento de neoplasias, em geral
comprometendo sua estabilidade.
As MMPs são classificadas em subgrupos, conforme sua afinidade de
substratos, dentre elas, as colagenases, as gelatinases, as estromelisinas, as
matrilisinas e as MMPs ligadas à membrana. As MMPs 2 e 9, objetos desse estudo,
são as gelatinases e têm a propriedade de degradar principalmente colágeno
desnaturado (gelatinas) e colágeno tipo IV, componentes das membranas basais.
3
Além disso, as MMPs 2 e 9 têm sido consistentemente associadas com a
agressividade, o potencial metastático e o prognóstico desfavorável das neoplasias
malignas (Pereira e cols., 2006; Vasala,2009).
Os pacientes com carcinoma de bexiga em estágio inicial têm melhores
prognósticos – sobrevida de 5 anos de 80% (Vasala e cols., 2003) – do que os com
estágios mais avançados. Entretanto, alguns estudos encontram algumas diferenças
de sobrevida em pacientes com mesmo estadiamento e grau (Lipponen, 1991).
Estudos destacam os casos com elevados níveis de MMPs 2 e 9 como de
grande potencial para indicar invasão e metástase, não se restringindo apenas às
neoplasias de bexiga (Hong e cols., 2000). Devido à sua importância, atualmente, as
MMPs têm sido um dos focos de pesquisas das indústrias farmacêuticas para
tratamento de câncer.
Os estudos que utilizam inibidores teciduais das metaloproteinases (TIMPs)
têm forte impacto na definição de prognósticos clínicos, pois elas conseguem reduzir
a formação, a invasão e a metástase tumoral (Eissa e cols., 2007; Kanayama e cols.,
1998).
Os níveis de MMP 2 e de TIMP 2 são maiores em tumores de grau III do que
em tumores de grau I e contribuem para definir melhores índices de sobrevida em
pacientes de grau III (Kanayama e cols., 1998).
4
1.1 Epidemiologia
As neoplasias de bexiga constituem o quinto tumor mais comum na espécie
humana e correspondem ao quarto tumor mais comum nos homens e o oitavo mais
comum nas mulheres (Cheng e cols., 1999; Madeb e cols., 2004).
Nos Estados Unidos, estima-se, para o ano de 2009, a ocorrência de cerca
de 70.980 casos novos e 14.330 mortes para ambos os sexos. Quanto aos gêneros,
a incidência esperada é de 52.810 homens e 10.180 mulheres para novos casos e
18.170 homens e 4.150 mulheres para a letalidade, em 2009 (Jemal e cols., 2009).
Considerando-se as neoplasias malignas do trato genito-urinário, o carcinoma
de células transicionais da bexiga é o segundo tipo de tumor mais comum e a
terceira maior causa de morte na população com neoplasias genito-urinárias (Pasin
e cols., 2008).
No Brasil, as estimativas de novos casos de cânceres serão de 466.730 mil
para o ano de 2008 e válidas para o ano de 2009 (Inca, 2008). Neste período, teve-
se uma incidência de 14,73% de casos novos na população masculina mundial
contra 10,63% na população masculina brasileira. Quando se compara a taxa na
população feminina, observa-se cerca de 3% de casos novos na população mundial
contra 2,69% na população feminina brasileira. Conforme estatísticas extraídas do
INCA, na cidade de Porto Alegre, a incidência de casos novos de carcinoma de
bexiga, entre os anos de 1999 e 2003, foi de 474 casos em homens e 177 casos
novos em mulheres (Inca, 2008).
Aproximadamente 80% dos casos de carcinoma de bexiga são
diagnosticados na população com idade superior a 60 anos (Jemal e cols., 2009).
Apesar de ocorrer em qualquer idade o diagnóstico é mais frequente entre as 6ª e 7ª
5
décadas, sendo a média em torno dos 65 anos, aumentando diretamente com a
idade. O carcinoma de bexiga é mais comum em brancos que negros, sendo quatro
vezes mais frequente no homem que na mulher (Pompeu e cols., 2006; Kaufman e
cols., 2009; Jemal e cols., 2009).
Na cidade de Porto Alegre, entre os anos de 1999 a 2003, a faixa etária de
maior incidência entre os homens estava compreendida entre os 80-84 anos e em
relação às mulheres estava acima dos 85 anos (Inca, 2008). Embora esta incidência,
a taxa de mortalidade tem diminuído (Pompeo e cols., 2006; Grasso, 2008).
1.2 Etiologia
O urotélio vesical tem sido exposto a elementos potencialmente
carcinogênicos que podem ser excretados ou ativados na urina por hidrolases. Esta
exposição dispersa no urotélio é uma das hipóteses para a ocorrência multifocal dos
carcinomas uroteliais (Bochner e cols., 2008).
O câncer de bexiga tem sido associado a fatores de risco exógenos e
ambientais. Os dois fatores de risco mais conhecidos para o câncer de bexiga são o
tabagismo e a exposição ocupacional (Pasin e cols., 2008).
6
1.2.1 Tabagismo
O tabagismo é o fator de risco mais importante para o desenvolvimento do
carcinoma de bexiga, sendo o responsável por 50% dos cânceres em homens e
35% das mulheres (Costa e cols., 2008).
Na população em geral, os fumantes têm cerca de 2 a 4 vezes mais chances
de desenvolver o CB e os fumantes pesados possuem um risco 5 vezes maior com
um período de latência de 20 a 30 anos. O mecanismo exato pelo qual o tabagismo
provoca o CB não é conhecido, mas agentes cancerígenos uroteliais presentes na
fumaça como as aminas aromáticas primárias e radicais livres têm sido implicados
(Pasin e cols., 2008; Vasala, 2008).
1.2.2 Exposição ocupacional
A exposição ocupacional é o segundo fator de risco mais importante,
estimando-se que ela explica a etiologia de 20% de todos os casos de CB. O grau
de carcinogênese, devido à exposição ocupacional, varia de acordo com o grau de
industrialização, mas, em nações altamente industrializadas, a exposição
ocupacional pode ser responsável por até 1/4 de todos os tipos de câncer urotelial.
O período de latência entre a exposição e o desenvolvimento do tumor geralmente é
prolongada (Kirkali e cols., 2005; Pasin e cols., 2008; Vasala, 2008; Bochner e cols.,
2008; Kaufman e cols., 2009).
7
1.2.3 Fatores químicos
A exposição química a tratamento quimioterápico com ciclofosfamida; o abuso
de uso de analgésicos, particularmente a fenacetina; os adoçantes compostos por
sacarinas e ciclamatos (quando ingerido mais de 1680mg/dia) e o café, por possuir a
cafeína, substância mutagênica quando ingerido dez ou mais xícaras por dias,
também têm sido associados à gênese do CB. Embora a ingestão de cafeína tenha
sido implicada como um fator de risco para câncer de bexiga, estimativas de risco
para esta associação têm redução após a restrição de uso concomitante de tabaco
(Pompeo e cols., 2006; Pasin e cols., 2008).
A qualidade e a quantidade de água consumida, pela clorificação, compostos
halogenados e concentrações de arsênico utilizados no processo de higienização
foram descritos por Bochner e cols.(2008), também como possíveis fatores de risco.
1.2.4 Fatores de irritação crônica
Infecções do trato urinário, incluindo bactérias, fungos, infecções virais e
infestação pelo Schistossoma haematobium estão entre os fatores de risco de
irritação crônica da superfície vesical associados às neoplasias uroteliais. São
relacionadas, ainda, como fatores de irritação crônica a sondagem vesical e a
radiação ionizante pélvica terapêutica (Kaufamn e cols., 2009; Pompeo e cols.,
2006).
8
1.2.5 Fatores genéticos e moleculares
Entre os fatores genéticos e moleculares, estão incluídos oncogenes como
TP63, receptores para fator de crescimento epidérmico (EGFR) e a proteína Ras
p21. Genes supressores tumorais como TP53 e RB1 também estão relacionados.
Além disso, as proteínas reguladoras do ciclo celular como as CABLES, e a ciclina
D1 são fatores moleculares envolvidos na gênese tumoral (Kaufman, 2009).
Metabólitos ativadores da carcinogênese como enzimas citocromo P450
(CYP1A2, CTP2D6 e CTP3A4) envolvidas na ativação da arilamina são relacionados
como potenciais fatores de risco. Por sua vez, a Glutationa S transferase M1, das
famílias detoxificadoras dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, arilaminas e
nitrosaminas, também tem sido associada a risco de carcinoma de bexiga (Kirkali e
cols., 2005; Bochner e cols., 2008; Kaufman e cols., 2009).
1.3 Sintomatologia
A sintomatologia pode ser confundida com outras alterações urinárias comuns
como infecções do trato urinário, cistite intersticial, prostatites e passagem de
cálculos renais. A hematúria é o sintoma mais comum referido pelo paciente no
diagnóstico do câncer de bexiga, sendo tipicamente intermitente, macroscópica,
indolor e presente durante toda a micção (Donat e cols., 2008).
A hematúria pode ser assintomática, microscópica, quando três ou mais
hemácias forem vistas em campo de grande aumento, avaliadas no sedimento
urinário de duas ou três amostras apropriadamente coletadas (Passin e cols., 2008).
9
A dor, quando presente, é usualmente resultado de invasão tumoral
localizada ou metastática e sua distribuição está relacionada com a localização e
tamanho do tumor primário, suas metástases e envolvimento de tecidos adjacentes.
(Donat e cols., 2008).
Sintomas urinários irritativos são resultado de uma rápida diminuição da
capacidade vesical, hiperatividade do músculo detrusor da bexiga, invasão do
trígono ou obstrução da uretra. Entre os sintomas irritativos, observam-se polaciúria,
urgência, disúria ou incontinência. Podem ser ainda incluídos distensão vesical, fluxo
intermitente, noctúria, diminuição da força do jato urinário e sensação de
esvaziamento incompleto. Sistemicamente pode ser observado fadiga, perda de
peso, anorexia e sinais avançados de metastatização (Donat e cols., 2008).
1.4 Diagnóstico
O paciente com idade superior a 40 anos, tabagista, apresentando
especialmente hematúria macroscópica e/ou sintomas irritativos requer investigação
pela suspeita diagnóstica de neoplasia vesical. A cistoscopia com biópsia é o padrão
de diagnóstico e de acompanhamento do câncer de bexiga. A presença de lesão
compatível com câncer de bexiga à cistoscopia correlaciona-se com câncer ao
exame anatomopatológico, em mais de 90% dos casos (Pompeo e cols. 2006; Donat
e cols., 2008).
A avaliação consiste ainda da realização de citologia urinária, esta, porém,
apresenta desvantagem pela subjetividade do exame (experiência do
citopatologista) e baixa sensibilidade do método, ao redor de 35% para tumores de
10
baixo grau. Entretanto, quando avaliada a especificidade do método, esta se eleva
para 94% na presença de citologia positiva (Kaufman e cols., 2009).
A utilização de biomarcadores moleculares, detectados na urina, pode ser
alternativa aos métodos diagnósticos invasivos. O processo se dá pela identificação
de antígenos e outras proteínas associadas à neoplasia urotelial ou de alterações
genéticas relacionadas à proliferação neoplásica. Apesar de serem promissores,
ainda não há acurácia suficiente para sua adoção (Pompeo e cols., 2006; Kaufman,
e cols., 2009).
Exames de imagem têm contribuído para diagnóstico e acompanhamento das
neoplasias uroteliais. A radiologia tem sido utilizada como triagem inicial e
monitorização periódica para pacientes com risco de metástases pulmonares.
A tomografia computadorizada permite demonstrar a extensão extravesical da
neoplasia, o envolvimento de linfonodos, vísceras pélvicas e metástases
retroperitoniais, ósseas e pulmonares. A ultrassonografia também tem sido utilizada
por apresentar alta sensibilidade na detecção de tumores com mais de 0,5 cm e
possuir baixo custo (Donat e cols., 2008; Kaufman e cols., 2009).
A ressonância magnética é reservada aos casos especiais como alergia ao
contraste e insuficiência renal naqueles casos de envolvimento do trato urinário
superior, onde é necessário avaliar a excreção através da urografia excretora e os
pacientes apresentam contra-indicações (Pompeo e cols., 2006; Donat e cols., 2008;
Kaufman e cols., 2009).
A avaliação diagnóstica definitiva se dá pela realização de ressecção
transuretral da bexiga, sob anestesia, com a confirmação anatomopatológica dos
segmentos ressecados. Havendo insuficiência de tecido neoplásico para avaliar a
11
lesão inicial uma segunda ressecção deve ser realizada (Pompeo e cols., 2006;
Vasala, 2008).
1.5 Tratamento
O câncer de bexiga é uma doença com história natural variável. Num extremo
do espectro estão as neoplasias superficiais que têm uma baixa taxa de progressão
e requerem tratamento endoscópico inicial. No outro extremo estão as neoplasias de
elevado potencial maligno, associadas à significativa progressão local e
metastatização.
O tratamento padrão do câncer de bexiga superficial é a ressecção
transuretral devendo ser, se possível, completa e o material ressecado incluir tecido
muscular (Pompeo e cols., 2006; Kaufmann e cols., 2009).
Pacientes portadores de tumor superficial de bexiga apresentam risco de
recorrência e progressão, se tratados apenas pela ressecção transuretral. Alguns
parâmetros aumentam o risco de recorrência (60% a 90%) e progressão (30% a
50%): multiplicidade, tamanho > 3 cm, alto grau, T1, Tis e recorrência prévia. Em
qualquer dessas condições, a terapia intravesical deverá ser empregada utilizando-
se quimioterápicos (tiotepa, mitomicina C e adriamicina) ou bacilo de Calmet-Guérin
(BCG) em esquemas próprios (Pompeo e cols., 2006; Kaufmann e cols., 2009).
O carcinoma urotelial invasivo de bexiga é uma doença potencialmente letal
que requer tratamento agressivo, sendo que menos de 15% dos pacientes
sobrevivem dois anos, se não tratados. O objetivo do tratamento é a prevenção de
recorrência local ou distante e oferecer sobrevida longa, com boa qualidade de vida.
12
A cistectomia radical permanece como a opção de escolha para tumor de bexiga
com invasão da camada muscular. Confirmada a invasão muscular, após a
ressecção transuretral, a cistectomia deve ser realizada o mais breve possível
(Pompeo e cols., 2006).
Para o homem é indicada a cistoprostatectomia radical e para a mulher a
exenteração anterior, incluindo útero, tubas uterinas, ovários, bexiga, uretra e parede
vaginal anterior. As terapêuticas com quimioterapia ou radioterapia e/ou sua
associação devem ser estudadas caso a caso em virtude de idade avançada, função
renal inadequada ou status de mau desempenho (Pompeo e cols., 2006; Kaufmann
e cols., 2009).
A quimioterapia citotóxica é a única modalidade terapêutica capaz de
prolongar a sobrevida dos pacientes portadores de câncer de bexiga metastático.
(Pompeo e cols., 2006).
1.6 Histopatologia
1.6.1 Histologia normal
Uma secção transversal da parede da bexiga, quando vista pelo microscópio,
exibe as seguintes camadas celulares:
• Epitélio - chamado de urotélio ou epitélio de transição reveste o interior da
parede da bexiga constituído por três a sete camadas celulares. A maioria
dos cânceres da bexiga origina-se no epitélio urotelial;
13
• Lâmina própria - esta camada é constituída por tecido conjuntivo, vasos
sanguíneos e estruturas neuronais, localizados imediatamente abaixo do
epitélio de transição;
• Muscular própria - é a camada profunda e espessa de células musculares
que forma a parede da bexiga, o músculo detrusor;
• Adventícia ou serosa - a camada mais externa da parede da bexiga, que
consiste de gordura, tecido conjuntivo fibroso e vasos sanguíneos (Magi-
Galluzzi e Zhou, 2008).
1.6.2 Aspectos patológicos
Mais de 90% dos carcinomas de bexiga são originados das células
transicionais, 5% são carcinomas epidermóides e menos de 2% são
adenocarcinomas. Os demais compreendem tumores mesenquimais,
feocromocitoma, linfomas e outros (Magi-Galluzzi e Zhou, 2008).
1.6.2.1 Graduação histológica
Em conferência de consenso realizada em outubro de 1998 entre a
Organização Mundial da Saúde (OMS) e a Sociedade Internacional de Patologia
Urológica (ISUP) foi estabelecido um consenso para a classificação das neoplasias
uroteliais (Epstein e cols., 1998; Magi-Galluzzi e Zhou, 2008), a seguir demonstrada:
14
Normal
• Normal: epitélio normal, podendo incluir casos anteriormente
diagnosticados como displasia leve.
Hiperplasia
• Hiperplasia plana: aumento marcado da espessura, sem atipia citológica;
• Hiperplasia papilar: mucosa ondulada ou papilar, de espessura variável,
sem atipia. Não tem eixo fibrovascular, mas pode ter capilares dilatados na
base.
Lesões planas com atipia
• Atipia reacional (inflamatória): presença de núcleos uniformemente
aumentados, vesiculares, com nucléolo proeminente central, em mucosa
aguda ou cronicamente inflamada. Pode ter mitoses frequentes;
• Atipia de significado incerto: às vezes, lesões inflamadas apresentam
pleomorfismo e/ou hipercromasia demasiada para a extensão da
inflamação;
• Displasia (neoplasia intra-urotelial de baixo grau): tipicamente vista em
pacientes com neoplasia urotelial e são incomuns em pacientes sem
neoplasia. Quando vista na mucosa adjacente ao tumor, há maior risco de
recorrência e progressão;
• Carcinoma in situ (neoplasia intra-urotelial de alto grau): pode ter padrão
com células neoplásicas espalhadas, pagetóide, e descamativo (clinging).
15
Neoplasias papilares
• Papiloma: tumor exofítico, papilar, com estroma central fibrovascular e
urotélio citologicamente normal (não é necessário contar o número de
camadas);
• Papiloma invertido: quando completamente retirado, tem risco muito baixo
de recorrer. Numa minoria dos casos, pode estar associado a carcinoma
urotelial.
• Neoplasia papilar de baixo potencial de malignidade: lesão com arquitetura
delicada, leve fusão de papilas, polaridade normal, núcleo levemente
aumentado, ovalada, com cromatina fina, raras mitoses, geralmente
basais e ausência de nucléolo;
• Carcinoma papilar de baixo grau: presença de fusão de papilas, várias
camadas celulares, leve perda da polaridade celular, coesão celular
habitual, núcleo aumentado com contorno irregular, discreta variação da
cromatina nuclear entre as células, presença de algumas figuras de mitose
e alguns nucléolos evidentes. Pode invadir a lâmina própria e tem baixo
risco de progressão (< 5%), apesar de recorrer frequentemente;
• Carcinoma papilar de alto grau: tumor com maior fusão de papilas,
desorganização, espessamento e perda da polaridade e da coesão
celular, pleomorfismo nuclear, marcada hipercromasia, nucléolos
proeminentes e/ou múltiplos, presença de mitoses e ausência de células
superficiais. Ele apresenta risco de progressão muito maior que o
carcinoma papilar de baixo grau (15 a 40%), e há maior risco de
associação com doença invasiva no momento da apresentação.
16
Neoplasias invasoras
• Invasão da lâmina própria: apresenta ninhos, grupos ou células
neoplásicas isoladas na lâmina própria, às vezes com proeminente
artefato por retração. A retração proeminente do estroma muitas vezes é
sobrediagnosticada como invasão vascular – invasão vascular em casos
com invasão da lâmina própria é incomum.
• Invasão da muscular própria (músculo detrusor): a invasão da muscular
própria é diagnosticada quando o tumor infiltra feixes musculares
espessos.
1.6.2.2 Estadiamento
O objetivo do estadiamento é determinar se a doença é superficial ou
invasiva, se há o comprometimento da camada muscular, e se sua extensão é local,
regional ou metastática, seguindo o proposto pelo Sistema TNM, da União
Internacional Contra o Câncer (UICC) de 2002:
T - Tumor Primário
TX - O tumor primário não pode ser avaliado
T0 - Não há evidência de tumor primário
Ta - Carcinoma papilífero não invasivo
Tis - Carcinoma in situ, “tumor plano”
17
T1 - Tumor que invade o tecido conjuntivo sub-epitelial
T2 - Tumor que invade a camada muscular
T2a - Tumor que invade a musculatura superficial (metade interna)
T2b - Tumor que invade a musculatura profunda (metade externa)
T3 - Tumor que invade a gordura peri-vesical
T3a - microscopicamente
T3b - macroscopicamente
T4 - Invasão de órgãos adjacentes
T4a - Tumor que invade próstata, útero ou vagina
T4b - Tumor que invade parede pélvica ou parede abdominal
N - Linfonodos Regionais
NX - Os linfonodos regionais não podem ser avaliados
N0 - Ausência de metástase em linfonodos regionais
N1 - Metástase, em um único linfonodo, com 2 cm ou menos em sua maior
dimensão
N2 - Metástase, em um único linfonodo, com mais de 2 cm até 5 cm em
sua maior dimensão, ou em múltiplos linfonodos, nenhum com mais
de 5 cm em sua maior dimensão
N3 - Metástase em linfonodo com mais de 5 cm em sua maior dimensão
M - Metástase à Distância
MX - A presença de metástase à distância não pode ser avaliada
M0 - Ausência de metástase à distância
M1 - Metástase à distância
18
Com finalidade prática na elaboração da estratégia terapêutica, dividem-se os
tumores localizados em: superficiais e invasivos. Os tumores superficiais incluem o
Tis, Ta e T1. A penetração da camada muscular identifica os tumores invasivos da
bexiga (Pompeo e cols., 2006).
A Figura 1 apresenta graficamente a relação do tumor com as camadas da
parede vesical.
Figura 1. Representação gráfica do estadiamento do carcinoma de bexiga (Pompeo e cols., 2006)
O tratamento das neoplasias uroteliais da bexiga é baseado, principalmente,
no grau de invasão tumoral, conforme o seguinte estadiamento (AJCC/UICC):
• Tis – tumor não papilar restrito ao urotélio;
• Ta – tumor papilar restrito ao urotélio;
• T1 – tumor presente na lâmina própria;
• T2a– invasão da camada muscular superficial;
• T2b – invasão da camada muscular própria profunda;
• T3a – invasão do tecido adiposo perivesical superficial;
• T3b – invasão do tecido adiposo perivesical profundo;
• T4a – invasão de estruturas adjacentes - próstata, útero ou vagina
• T4b – tumor que invade parede pélvica ou parede abdominal
19
As neoplasias uroteliais papilares restritas à lâmina própria, em estágio T1,
são tratadas, na grande maioria dos casos, com ressecção transuretral sem
cistectomia, encaminhando-se o material ressecado para avaliação histopatológica.
Após o tratamento, o paciente é acompanhado para observação de possível
recidiva e /ou progressão da lesão. Atualmente, não há marcadores prognósticos, de
uso rotineiro, capazes de apontar indícios de lesões com maior potencial de recidiva,
com progressão de graduação histológica, invasão tecidual e desenvolvimento de
metástases.
A possibilidade de estabelecer a análise imuno-histoquímica dessas lesões
como um marcador de prognóstico possibilitaria o emprego de medidas preventivas
e terapêuticas mais rigorosas nos pacientes de maior risco. Para tanto, a
possibilidade de detectar se realmente existe uma relação entre a expressão das
MMP2 e MMP 9 e os carcinomas uroteliais da bexiga restritos à lâmina própria, pode
evidenciar um provável marcador biológico.
1.7 Prognóstico
A maioria dos pacientes é diagnosticada com carcinoma de bexiga restrito à
lâmina própria. O prognóstico depende de fatores como tipo histológico do tumor,
grau histológico, estadiamento, multifocalidade, tamanho e tempo de recidiva.
O carcinoma papilar tem melhor prognóstico, em relação ao tipo não papilar,
ou infiltrativo, o qual será de pior prognóstico. A sobrevida, para o carcinoma papilar,
após o diagnóstico, em 5 anos, é de 70% para os homens e de 67% para as
20
mulheres (Grasso, 2008; Lyman e cols., 2009; Kaufman e cols. 2009; Lynch e cols.,
2007).
1.8 Metaloproteinases
As metaloproteinases (MMPs) constituem uma família de metaloenzimas
relacionadas ao remodelamento e degradação da matriz extracelular (MEC),
causando lise em seus componentes, contribuindo para a microinvasão e
metástases e, assim, à progressão do carcinoma de bexiga.
De acordo com sua estrutura e especificidade, classificam-se em:
colagenases, gelatinases, estromalisinas, matrilisinas, MMPs ativadas por furinas,
MMPs transmembrana (MT-MMP), MT-MMPs de tipo II, MT-MMPs, com domínio
GPI e outras MMPs (Tabela 1).
21
Tabela 1. Classificação das metaloproteinases
Colagenases
Colagenase 1 (MMP-1)
Colagenase 2 (MMP-8)
Colagenase 3 (MMP-13)
Gelatinases
Gelatinase A (MMP-2)
Gelatinase B (MMP-9)
Estromalisinas
Estromalisina 1 (MMP-3)
Estromalisina 2 (MMP- 10)
Matrilisinas
Matrilisina 1 (MMP-7)
Matrilisina 2 (MMP- 26)
MMPs ativadas por furinas
Estromalisina 3 (MMMP-11)
Epilisina (MMP-28)
MMP-21
MMPs transmembrana
MT 1-MMP (MMP-14)
MT 2-MMP (MMP-15)
MT 3-MMP (MMP-16)
MT 5-MMP (MMP-24)
MMPs transmembrana de tipo II
MMP-23 A
MMP-23 B
MMPs transmembranas com domínio GPI
MT 4-MMP (MMP-17)
MT 6-MMP (MMP-25)
Outras MMPs
Metaloelastase (MMMP-12)
MMMP-19
Enamelisina (MMP-20)
Estas são enzimas proteolíticas capazes de degradar componentes do tecido
conjuntivo e são secretadas em uma forma inativa, com domínio amino-terminal,
bloqueando o sítio de atividade. O mecanismo de ativação ainda não é bem
compreendido e sua ação é modulada por citoquinas, fatores de crescimento e
inibidores teciduais endógenos (Davies e cols., 1993; Liu, 1998; Giambernardi e
cols., 1998; Özdemir e cols., 1999; Thomas e cols., 1999; Borkakoti, 2000; Shiozawa
e cols., 2000; Kader e cols., 2006; Roehe, 2006; Wu e cols., 2006; Martin e col.,
2007).
As MMPs têm expressão dependente da necessidade de remodelamento
tecidual e participam das etapas de proliferação celular, diferenciação,
vascularização e migração celular através da MEC. Elas apresentam papel
22
importante em processos fisiológicos, como: implantação placentária, organogênese,
crescimento e cicatrização, e ainda, em processos patológicos. Estes últimos
incluem reações inflamatórias como a artrite reumatóide, doenças do tecido
conjuntivo (fibrose hepática) e aneurismáticas, ruptura de placas ateroscleróticas,
invasão neoplásica, angiogênese e metastatização. Estes últimos requerem uma
cascata de eventos que incluem mecanismos similares aos que as células normais
utilizam para a migração e quebra das barreiras teciduais, a membrana basal e o
estroma extracelular (Kader e cols., 2006).
Sua produção é rapidamente estimulada por agentes exógenos, que irão
atuar, na sua maioria, sobre a transcrição gênica, como citocinas (interleucinas,
interferons), fatores de crescimento (EGF, TGF-β, PDGF, VEGF), componentes da
MEC, organomercuriais, oxigênios reativos, estresse físico, radiação ultravioleta e
transformação celular oncogênica (Roehe, 2006).
A relação com a MEC, não somente por meio de fatores solúveis, mas
também através de interações célula-célula e célula-matriz é um ponto importante
quanto aos mecanismos de controle das MMPs. O antigo conceito de função da
MEC como um simples tecido de sustentação foi substituído pela ideia de uma
estrutura dinâmica, um reservatório de células e moléculas capazes de emitir sinais
ativadores de rotas intracelulares (Roehe, 2006).
Peptídeos provenientes da proteólise de macromoléculas da MEC, como a
elastina, a fibronectina e glicoproteínas do tecido conjuntivo, assim como derivados
de membrana basal (lamininas e colágeno tipo IV) podem agir como estimuladores
ou inibidores de MMPs, atuando sobre células tumorais, estromais e endoteliais
(Roehe, 2006).
23
Entre as moléculas de adesão célula-célula e célula-matriz, receptores para
caderinas e integrinas, apresentam expressão variável durante a evolução tumoral e
têm capacidade de transmitir sinais intracelulares, que poderão modular a expressão
de MMPs (Yamamura e cols., 2002; Yano e cols., 2002). Células malignas também
podem expressar moléculas reguladoras de MMPs. Um exemplo é a produção de
MMPs 1, 2 e 3 por fibroblastos, via indutor extracelular de MMPs (EMMPRIN) que é
uma glicoproteína transmembra expressa na superfície de células neoplásicas.
A degradação da matriz extracelular é complexa e envolve três classes de
proteases: as serinas, as cisterinas e as metaloproteinases sendo estas
responsáveis pela maior parte da degradação da matriz. Alterações na expressão de
enzimas, resultando em aumento das suas atividades, estão presentes em
neoplasias invasivas e metastáticas. Ao que parece, as células malignas são
capazes de produzir MMPs e utilizar as MMPs produzidas pelas células estromais e
inflamatórias vizinhas (Liu, 1998; Shiozawa e cols., 2000; Chang e cols., 2001).
O aumento da atividade dessas enzimas tem sido estudado em diversos tipos
de neoplasias. Algumas pesquisas apontam para uma maior expressão das MMPs,
enquanto outras mostram alterações nos seus inibidores teciduais.
As MMPs 2, 3, 7 e 9 e o inibidor da MMP 2 (TIMP 2) já foram relacionados às
neoplasias da cavidade oral, gástricas, do sistema nervoso central, no
adenocarcinoma colorretal, neoplasias da mama, carcinomas pulmonares não-de
pequenas células e carcinomas de bexiga (Konishi e cols., 1997; Kitagawa e cols.,
1998; Liu, 1998; Fujise e cols., 2000; Kabashima e cols., 2000; Chang e col., 2001;
Yamamura e cols., 2002;).
24
As gelatinases A e B (MMP 2 e MMP 9) estão associadas à degradação pela
hidrólise do colágeno tipo IV, componente da membrana basal, que é considerada a
primeira barreira para a invasão tumoral (Liu, 1998; Shiozawa e cols., 2000).
Pesquisas demonstram associação entre o aumento da atividade das MMPs
2, 9 em carcinomas uroteliais invasores e de maior graduação histológica. A
expressão das MMPs tem sido avaliada nas células tumorais e na urina desses
pacientes (Kitagawa e cols., 1998; Monier e cols., 2000; Gerhards e cols., 2001; Roy
e cols., 2009). A maior parte dos estudos mostra elevação na expressão das MMPs
proporcional à progressão do estadiamento, o que parece lógico, pois para obter
maior capacidade de invasão tecidual, com aumento do estágio, é necessária maior
atividade proteolítica sobre a matriz extracelular.
Entretanto, sabe-se que as lesões com o mesmo estágio podem ter
propriedades biológicas distintas. Da mesma forma, as MMPs podem se expressar
diversamente em carcinomas de igual estágio, mas com diferentes graduações
histopatológicas; ou, ainda, com graduação histopatológica semelhante, porém, com
características moleculares individuais. Estuda-se a possibilidade de que a
expressão alterada dessas MMPs em certos carcinomas uroteliais possa representar
um indício de maior potencial de malignidade e pior prognóstico, auxiliando na
detecção da parcela das neoplasias em estágio inicial com maior propensão à
invasão.
25
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29
2 ASPECTOS ÉTICOS
Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de
Ciências da Saúde de Porto Alegre (protocolos: 476/02 e 014/09). Comprometem-se
os autores a manter confidencialidade quanto aos dados obtidos na revisão de
prontuários e a fazer uso das informações relevantes a esta pesquisa somente neste
estudo. O estudo em questão não oferece risco aos pacientes, uma vez que é
retrospectivo e que se tratam materiais emblocados em parafina, de casos de
arquivo.
Pesquisar a expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 2 e 9 em
pacientes portadores de neoplasias uroteliais com estadiamento até T1 (tumor
restrito à lâmina própria).
30
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Pesquisar a expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 2 e 9 em
pacientes portadores de neoplasias papilares uroteliais vesicais com estadiamento
até T1 (tumor restrito à lâmina própria).
3.2 Objetivos Específicos
• Avaliar a expressão das metaloproteinases 2 e 9 pela técnica de imuno-
histoquímica em amostras de carcinoma urotelial de bexiga restrito à
lâmina própria incluídas em parafina;
• Identificar possível associação entre a expressão das metaloproteinases 2
e 9 com a graduação histológica dos carcinomas uroteliais da bexiga;
• Observar a relação da expressão das MMPs 2 e 9 com o tempo de
sobrevida total dos pacientes e com a sobrevida livre de doença;
•
•
Comparar a expressão das MMPs 2 e 9 com a graduação histológica e o
estadiamento dos pacientes que apresentarem recidiva da doença.
31
4 ARTIGO CIENTÍFICO REDIGIDO EM INGLÊS
Study of the immunohistochemical expression of metalloproteinase 2
and 9 in urothelial carcinoma of the bladder restricted to the lamina propria
Helena Terezinha Hubert Silva, Adriana Vial Roehe, Antonio Atalibio Hartmann
Post-Graduate Program in Pathology from Universidade Federal de Ciências
da Saúde de Porto Alegre (UFSCPA)
ABSTRACT
Introduction: Bladder carcinoma is aggressive locally, while treatment of urothelial
neoplasias of the bladder is based on the level of tumor invasion, according to the
staging. In turn, metalloproteinase 2 (MMP 2) and 9 (MMP 9) are related to
microinvasion, appearance of metastases and progression of bladder carcinoma.
Purposes: To research the immunohistochemical expression (IHC) of MMP 2 and 9
in patients with urothelial neoplasias with staging up to T1 (tumor restricted to the
lamina propria), comparing to the histological graduation, staging, free survival of the
disease and overall survival of the patients.
Methods: A retrospective study was conducted evaluating the IHC expression of
metalloproteinase 2 and 9 in 59 paraffin-embedded of urothelial bladder carcinoma
restricted to the lamina propria, obtained by transurethral resection, between 1997
and 2001, at the Pathology Service of Hospital Santa Rita-CISCMPA. The IHC
expression was related to parameters like histological graduation, staging, free
survival of the disease and overall survival of the patients. The medical charts and
record of deaths were evaluated to obtain data on the overall survival of patients and
disease free time.
Results: In the analysis of overall survival related to the MMP 2 expression, we
observed 23 deaths with weak and 1 death with strong expression, while for the MMP
9 expression, 22 deaths were observed with strong and 2 deaths with weak
expression, not showing statistical significance between the data evaluated. The data
on free survival of disease related to the MMP 2 expression showed 21 recurrences
with weak expression and 2 with strong expression. When the MMP 9 expression
was analyzed, there were 23 recurrences, of which 20 are with strong and 3 with
weak expression, there being no statistical significance in the data analyzed. There
were no significant correlations between MMPs expressions with graduation and with
staging.
Conclusion: There was no association of the immunohistochemical expression of
MMP 2 and 9 with histological graduation, staging, overall survival and disease free
32
survival suggesting that MMPs are not good markers of prognosis for superficial
urothelial carcinoma of the bladder.
Keywords: urothelial carcinoma, metalloproteinase of matrix 2 and 9, survival,
recurrence.
Introduction: Bladder carcinoma (BC) is the fifth most common tumor in the
human species and corresponds to the fourth most common tumor in men and eighth
most common in women
4,16,21,25
, presenting as a locally aggressive neoplasia and
whose most common histological type is urothelial carcinoma or carcinoma of
transitional cells
1
.
The main risk factors for development of bladder carcinoma are: age, smoking,
occupational exposure to industrial agents (aromatic amines), genetic and molecular
factors, cyclophosphamide, schistossomosis and irritant agents of the reproductive-
urinary tract
2, 33, 31,19,21
. The risk of developing bladder carcinoma before age of 75
years is of 2 – 4% in men and 0.5 – 1% in women
16,21
.
The severity and prognosis of bladder carcinoma cases are directly related to
the tumor stage (superficial or infiltrative), to histological level (I, II and III) and to the
tumor size, being the superficial, of level I and with up to three centimeters, the tumor
considered of better prognosis
12
.
Treatment of urothelial neoplasias of the bladder is based mainly on the level of
tumor invasion according to the following staging recommended by the American
Joint Committee on Cancer (AJCC) and by the International Union Against Cancer
(UICC):
• Tis – non-papillary tumor restricted to the urothelium;
• Ta – papillary tumor restricted to the urothelium;
• T1 – tumor present in the lamina propria;
• T2 – invasion of muscular layer;
33
• T3 – invasion of perivesical adipose tissue;
• T4 – invasion of adjacent structures.
Papillary urothelial neoplasias restricted to the lamina propria, in T1 stage, are
treated in the majority of cases with transurethral resection, sending the resected
material for histopathological evaluation. After treatment, the patient is followed up for
observation of possible relapse and/or progression of the disease.
The prognosis depends on factors like histological type of the tumor, histological
level, staging, multifocality, size and time of relapse, however, most patients are
diagnosed with bladder cancer restricted to the lamina propria
19,23
. Tumor
progression occurs by local aggressiveness with invasion of the lamina propria
28
.
An European study, between 1990 and 1994, showed 5 years survival after
diagnosis of 70% for men and of 67% for women
13, 23
. The matrix metalloproteinase
(MMPs) are a group of enzymes related to extracellular matrix (EM) breakdown,
being involved notonly in all stages of reorganization and physiological repairs, but
also in pathological situations, such as arthritis, arteriosclerosis, hepatitis and
neoplasias, causing lyses of the basal membrane and conjunctive tissue. According
to their structure and specificity, they are classified in: collagenases, gelatinases,
membrane type and other MMPs. These are zinc proteolytic and calcium-dependent
enzymes, able to breakdown components of the tissue
3,8,10,11, 18,17,22,36,37,38
.
EM breakdown is a critical part for growth, invasion, angiogenesis and
promotion of metastatization of malignant neoplasias. The basal membrane and EM
represent two physical barriers to neoplastic invasion and their breakdown by MMPs
play a fundamental role in the tumor progression and metastatic dissemination. A
component of the basal membrane and of EM, collagen type IV, is broken down by
34
gelatinases A (MMP 2) and B (MMP 9). MMPs 2 and 9 have been recognized as
mediators of tumor progression and metastatization in various cancer types
14,15,17,29,36
.
In neoplasias of the breast, prostate, esophagus, skin, larynx, mouth mucosa,
stomach and rectal colon, in addition to carcinoma of transitional cells of the bladder,
the MMPs are associated with progression, level, type and stage of the tumor,
recurrence and survival of patients
5,7,8,10,15,26,27,30,32,34,35,36,39,43
. In the urothelial
carcinomas, the MMPs 2 and 9 expressions are directly proportional to the
classification and staging
10,42
.
Purposes
This study proposes to a) evaluate the expressions of MMPs 2 and 9 by the
immunohistochemistry (IHC) technique in paraffin-embedded samples of urothelial
carcinoma of the bladder restricted to lamina propria; b) identify possible association
between the expressions of MMP2 and 9 with the histological graduation of urothelial
carcinomas of the bladder, with overall survival time of patients and with disease free
survival and, also, c) compare the expressions of MMP2 and 9 with histological
graduation and staging of patients with relapse of the disease.
Methods
Material: A total of 83 cases were identified from the file of the Pathology
Service of Hospital Santa Rita do Complexo Irmandade Santa Casa de Misericórdia
de Porto Alegre, RS, Brazil, diagnosed, between 1997 and 2000, as urothelial
35
carcinoma of the bladder, according to graduation based on the consensus between
the World Health Organization (WHO) and the International Society of Urological
Pathology (ISUP).
The clinical information related to the survival was determined through
systematic reviewing of the medical charts of patients under oncological follow-up at
Complexo Hospitalar da Santa Casa. The information related to death was obtained
by consulting the Health Information of the State Health Secretariat of RS.
The inclusion criteria were: a) have a diagnosis of urothelial carcinoma of the
bladder, restricted to the epithelium, or to lamina propria, diagnosed in the Pathology
Service of Hospital Santa Rita-CISCMPA, between 1997 and 2001; b) have
existence and preservation of paraffin blocks regarding to each case in the study
period; and c) have existence of hospital records.
The exclusion criteria were: lack of paraffin blocks or medical records and
insufficient material in the paraffin blocks.
The variables studied were: gender, color, age, histological graduation and
staging of the initial lesion of the disease, and also of the lesion of the patients that
presented relapse, time of overall survival of patients and free survival of the disease.
Furthermore, in reviewing the medical records, we verified information on
conduction of cystoscopy and its result, as well as of cystectomy, immunotherapy
with intravesical instillation of the Bacille Calmette-Guérin (BCG), chemotherapy and
radiotherapy, presence and location of metastases and cause of death.
Histological processing: for histological analysis of the samples, including IHC
preparations, the fragments were formalin-fixed (10%), included in paraffin and
histological sections with 3-µm thickness were obtained. With the aim of diagnostic
36
analysis, the sections were set up in glass slides and subjected to dyeing by the
hematoxylin and eosin technique.
Histopathological review, in all cases, was conducted by an experienced
pathologist, where the graduation followed the WHO/ISUP consensus and the
staging was conducted according to TNM classification (AJCC/UIC).
Immunohistochemical analysis: for IHC evaluation, by the streptavidin-biotin-
peroxidase technique, the sections were set up in previously silanized, deparaffined,
hydrated slides and were then subjected to antigenic recovery with Tris-EDTA buffer
solution (1mM, pH 9.0) in double at the temperature of 92°C - 95°C for 40 min. The
endogenous peroxidase activity was blocked, using two boilers of 10 min in hydrogen
peroxidase (H
2
O
2
) 30V, 5%, in methanol.
The blocking of the unspecified proteins was done with bovine albumin fraction
V (BSA) 1%. Incubation with primary antibody was conducted overnight, at
temperature of 4°C. The primary antibodies used consisted of the following: MMP 2
clone 17B11 (Novocastra® Newcastle, UK) dilution 1:40 and MMP 9, polyclonal
(Neomarkers – Fremont –CA), dilution 1:300.
Incubation with secondary antibody (biotinylated) and tertiary antibody
(streptavidin-biotin-peroxidase complex) was conducted for 30 min at room
temperature. As positive control, human placenta was used. For negative control of
the technique, we used the same tissues incubated with the same antibodies, except
for the primary, which was replaced by BSA 1%. The antigen-antibody bond was
viewed with the chromogen DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride). The
counter-staining was done with Harris hematoxylin; the slides were dehydrated and
set up with Entelan.
37
Determination of the immuno-reactivity of MMP2 and 9 was verified through
simple histological observation. The reaction’s intensity was observed in the cellular
cytoplasm and considered weak or strong, according to the positivity observed,
taking as internal control the coloring of the leukocytary cells.
Statistical analysis: A descriptive analysis of the data was initially conducted by
calculating the frequency and percentage for the categorical variables, while the
quantitative variables were expressed as mean and standard deviation (or median
and interquartile interval in case of non-normality). The relationship between
clinicopathological variables and expression of metalloproteinases was analyzed by
the Fisher exact test. To evaluate total survival of patients and time until relapse
(disease-free time), we used the Log-rank test. The data was analyzed in the SPSS
12.0 program for Windows and the level of significance adopted was 0.05.
Ethical aspect: the study was approved by the Institutional Review Board of
Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre (protocol: 476/02 and 14/09).
Results
Initially, 83 cases were identified, excluding 24 cases, 8 due to lack of paraffin
blocks; 6 due to error in the coding record; 3 due to diagnosis before 1997; 3 due to
insufficient material in the blocks and 4 due to non-localization of the medical
records. The sample actually studied was of 59 cases of urothelial carcinomas of the
bladder restricted to lamina propria, being 51 (86.4%) in men and 8 (13.6%) in
women; 55 (93.2%) in white patients, 1 (1.7%) in black and 3 (5.1%) afro-americans,
with median age of 68 (40-84) years at the time of initial diagnosis.
38
The MMP 2 expression was weak in 51(86.4%) and strong in 8 (13.6%) cases
in the initial diagnosis. In 53 (89.8%) cases, the MMP 9 expression was strong and in
66 (10.2%) cases, it was considered weak, at the time of the first diagnosis (Figure 1).
Figure 1. Immunohistochemical expression of matrix metalloproteinase 2 & 9: (A) MMP 2 weak;
(B) MMP 2 strong;(C) MMP 9 weak; (D) MMP 9 strong (IMQ-400x).
Upon initial diagnosis of the disease, the staging showed that 56 (94.9%) cases
corresponded to T1 and 3 (5.1%) to Ta; and with regard to histological classification,
40 (67.8%) cases corresponded to urothelial carcinoma of low grade, 16 (27.1%)
cases to urothelial carcinoma of high grade and 3 (5.1%) to urothelial neoplasia of
low potential for malignancy, with neoplasia recurrence in 23 patients (39%).
In the first recurrence of the cases, the staging observed was T1 in 16 (72,8%),
Ta in 3 (12%) cases and T2 in 3 (12%) cases, while the histological graduation
observed was of urothelial carcinoma of low grade in 14 (63.6%) cases, with
urothelial carcinoma of high grade in 7 (31.8%) cases and urothelial neoplasia of low
malignancy potential in 1 (4.5%) case.
39
Tables 1 and 2 show respectively, the relation of the metalloproteinase 2 (MMP
2) expression with the histological classification and with the staging, at the time of
initial diagnosis.
Table 1. Association between MMP 2 and histological classification in the initial diagnosis
Histological classification in the
initial diagnosis
nlpm low grade high grade
Total
n 3 35 13 51
weak
% 5.9 68.6 25.5 100.0
n 0 5 3 8
MMP 2
Expression
strong
% 0.0 62.5 37.5 100.0
n 3 40 16 59 Total
% 5.1 67.8 27.1 100.0
nlpm: neoplalsia of low potential malignancy
Table 2. Association between MMP 2 and staging in the initial diagnosis
Staging in the initial
diagnosis
Ta T1
Total
weak
N 3 48 51
% 5.9 94.1 100.0
strong
N 0 8 8
MMP 2
Expression
% 0.0 100.0 100.0
Total
N 3 56 59
% 5.1 94.9 100.0
Ta – papillary tumor restricted to the urothelium
T1 – tumor present in the lamina propria
There was no significant association between the expression of MMP 2 and
histological classification (Fisher's exact test, p = 0.536) and staging at the time of
initial diagnosis (Fisher's exact test, p = 0.343).
40
Tables 3 and 4 show respectively, the relation of the metalloproteinase 9 (MMP
9) expression with the histological classification and with the staging, at the initial
diagnosis:
Table 3. Association between MMP 9 and histological classification in the initial diagnosis
Histological classification in the
initial diagnosis
nlpm low grade high grade
Total
n 0 5 1 6
weak
% 0.0 83.3 16.7 100.0
n 3 35 15 53
MMP 9
Expression
strong
% 5.7 66.0 28.3 100.0
n 3 40 16 59 Total
% 5.1 67.8 27.1 100.0
nlpm: neoplalsia of low potential malignancy
Table 4. Association between MMP 9 and staging in the initial diagnosis
Staging in the initial
diagnosis
Ta T1
Total
weak
n 1 5 6
% 16.7 83.3 100.0
strong
n 2 51 53
MMP 9
Expression
% 3.8 96.2 100.0
Total
n 3 56 59
% 5.1 94.9 100.0
Ta – papillary tumor restricted to the urothelium
T1 – tumor present in the lamina propria
There was no significant association between the expression of MMP 9 and
histological classification (Fisher's exact test, p = 0.556) and staging at the time of
initial diagnosis (Fisher's exact test, p = 0.702).
Regarding to the number of relapses, these occurred in 23 patients; 13 (22%)
presented 1 relapse; 6 (10.2%), 2 relapses; 3 (5.1%), 3 relapses; 2 (3.4%), 7
relapses and 1 (1.7%) 8 relapses. The median disease-free time was 232.5 days and
41
the follow-up of 1396 days (3.8 years). The number of deaths during the period was
24 (40.7%) with a median age of 71 (44-88) years.
In the analysis of overall survival related to the MMP 2 expression (Figure 2),
we observed 23 deaths with weak expression and 1 death with strong expression.
Regarding the MMP 9 expression (Figure 3), we observed 21 deaths with weak
expression and 22 deaths with strong expression. The Log-rank test did not show
any statistic difference between the overall survivals of the groups, for both the MMP
2 expression (p = 0.2380) and the MMP 9 expression (p = 0.8670).
Figure 2. Analysis of total survival and expression of MMP 2
Figure 3. Analysis of total survival and expression of MMP 9
42
In the analysis of disease-free survival related to the MMP 2 expression (Figure
4), there were 21 recurrences with weak expression and 2 strong. When the MMP 9
expression was analyzed (Figure 5), there were 23 recurrences where 3 cases are of
weak expression and 20 strong.
The Log-rank test did not show statistic difference between the distributions of
disease-free survival for the groups with strong or weak MMP 2 expression (p =
0.3110) and MMP 9 expression (p = 0.7450).
Figure 4. Analysis of disease-free survival and expression of MMP 2
Figure 5. Analysis of disease-free survival and expression of MMP 9
43
In the post-diagnostic follow of the 59 subjects examined, 45 (76.3%) patients
underwent cystoscopies where the result of the last record informed that 23 (51.1%)
were normal and 22 (48.9%) showed lesion; 9 (15.3%) underwent cystectomy with
the detection of metastases in 8 (13.6%) patiens. The information on metastases was
obtained through histopathological test in 5 cases (62.5%); 1 (12.5%) was identified
only by computer tomography; 1 (12.5%) by both histopathological test and computer
tomography and 1 (12.5%) by medical record in the patient chart only. The
metastases were located in the liver (3 – 37.5%), bone (2 – 25%), skin (1 – 12.5%),
retroperitonium (1 – 12.5%) and inguinal lymph nodes (1 – 12.5%). Out of the total
patients, 9 (15.3%) underwent chemotherapy and 5 (8.5%) radiotherapy. Out of the
24 deaths recorded, 21 were men and 3 were women.
The cause of death, obtained through records from the Health Information
Center of the State Health Secretariat and through research of the hospital medical
charts, showed that out of the 24 deaths, 6 were due to bladder neoplasia; 3 due to
prostate neoplasia; 2 due to gastric neoplasia; 1 due to cilliary body neoplasia; 1 due
to bronchial and lung neoplasia; 1 due to chronic kidney failure; 1 due to vascular
alterations in the intestine; 2 due to heart failure; 4 due to arterial hypertension and 1
due to cardiac arrest.
Discussion
Patients with urothelial carcinoma of the bladder present, in their majority, good
prognostics. However, about 10 to 25%
41
, of the patients will present progression of
the disease. Biological markers that could be used as predictors of progression of
invasive or metastatic disease are currently searched. MMP 2 and 9 seem to be,
44
according to studies conducted by Bianco et al. (1998)
1,
Choi et al ( 2007)
6
, Eissa et
al. (2007)
10
and Gerhards et al. (2001)
11
, potential markers of bladder cancer
prognosis, because they are associated with increased expression in carcinomas of
high grade and advanced stage.
This study analyzed the role of the IHC expression of MMP 2 and 9 in
superficial urothelial carcinoma (restricted up to the lamina propria) and its possible
relation to clinicopathological parameters, including overall survival and disease-free
survival of the patients.
In our study, bladder carcinoma was more frequent in white men, with median
age of 68 years in the initial diagnosis, agreeing with the observations of Black et al.
(2009)
2
, Davies et al. (1993)
8
, Gerhards et al. (2001)
11
and Murta et al. (2008)
30
.
Considering the graduation and staging, no statistically significant association
was found with the markers examined. The same was observed by Vasala
42
in
relation to MMP 9, using the IHC technique and by Grignon et al. (1996)
15
, on
studying the IHC expression of MMP 2 in 42 patients with BC diagnosis.
Bianco et al. (1998)
1
and Gerhards et al. (2001)
11
observed correlation
between high levels of urinary excretion of MMP 9 and carcinomas of high grade with
advanced staging (T2). Davies et al. (1993)
8
Gerhards et al. (2001)
11
detected the
same results for excretion of MMP 2. However, in these studies the IHC technique
was not used. The authors obtained their results using studies by zymography in
washed vesicle
1
, in urine
11
and in cryopreserved tissue
8
and hybridization in situ
8
.
Likewise, Kanayama et al. (1998)
21
, in a study with 41 patients, using the reverse
transcriptase-polimerase chain reaction, correlated high levels of MMP 2 with tumors
of higher histological graduation.
45
In relation to the overall survival and disease-free survival, we also did not find
statistically significant results. The same was observed by Bianco et al. (1998)
1
,
studying the relation between urinary excretion of MMP 9 and disease-free survival.
Vasala et al. (2003)
41
,
analyzing tissue samples from 54 patients with
vesical urothelial carcinomas, for 6 consecutive years, subjected to IHC technique,
showed that the positive IHC expression of MMP 9, in vesical urothelial carcinomas,
was associated with a better prognosis. This data contradicts the initial hypothesis
that the high IHC expression of MMP 9 was associated with an unfavorable
prognosis.
In the same study, the positive IHC expression of MMP 2 was significantly
associated with a shorter disease-free survival time in 5 and 10 years
41
. However,
when the total survival was evaluated, the results observed did not show statistical
significance. The author justifies these findings by the advanced age of the patients,
66 years (43-85), and by the fact that many died during the 10 years of follow-up due
to various non-neoplastic causes.
Even though, the authors suggest that MMP 2 could be an independent marker
of prognosis in cases of BC. The data gathered herein are similar to those already
reported, with 24 deaths in 59 cases, in which the patients had a median age of 68
years (40-84), in a follow-up period of 12 years. In our study, out of 24 deaths, only 6
resulted from vesical neoplasia. This fact supports the characteristic of the biological
behavior of BC: low mortality rate, despite high percentage of recurrences.
Our study did not show statistical significance among the variables studied.
These findings can be explained by methodological differences, including the
techniques used to measure the MMPs, sample sizes, follow-up time of patients, and
also by loss of information, or absence of medical charts.
46
However, the possibility that the IHC expressions of MMP 2 and 9 may not
represent a contributive factor in view of the biological behavior of the urothelial
neoplasias of the bladder, as suggested in our study, must be considered.
Conclusion
In this study, there was no association of the immunohistochemical expression
of MMPs 2 and 9 with clinicopathological parameters, histological graduation staging,
overall survival and disease-free survival. MMP 2 and 9 did not prove to be
prognostic markers for urothelial carcinoma of the bladder restricted up to the lamina
propria.
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51
5 ARTIGO CIENTÍFICO REDIGIDO EM PORTUGUÊS
Estudo da expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 2 e 9
em carcinomas uroteliais da bexiga restritos à lâmina própria
Helena Terezinha Hubert Silva, Adriana Vial Roehe, Antonio Atalibio Hartmann
Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal de Ciências da
Saúde de Porto Alegre (UFSCPA)
RESUMO
Introdução: O carcinoma de bexiga é agressivo localmente, enquanto que o
tratamento das neoplasias uroteliais da bexiga baseia-se no grau de invasão
tumoral, conforme o estadiamento. Por sua vez as metaloproteinases 2 (MMP 2) e 9
(MMP 9) estão relacionadas à microinvasão, ao aparecimento de metástases e à
progressão do carcinoma de bexiga.
Objetivos: Pesquisar a expressão imuno-histoquímica (IMQ) das MMP 2 e 9 em
pacientes portadores de neoplasias uroteliais com estadiamento até T1 (tumor
restrito à lâmina própria), comparando à graduação histológica, ao estadiamento, à
sobrevida livre de doença e à sobrevida total dos pacientes.
Métodos: Foi realizado um estudo retrospectivo avaliando a expressão IMQ das
metaloproteinases 2 e 9 em 59 amostras parafinadas de carcinoma urotelial de
bexiga restrito à lâmina própria, obtidas por ressecção transuretral, entre os anos de
1997 e 2001, no Serviço de Patologia do Hospital Santa Rita-CISCMPA. A
expressão IMQ foi relacionada a parâmetros como a graduação histológica, o
estadiamento, a sobrevida livre de doença e a sobrevida total dos pacientes. Foram
avaliados os prontuários hospitalares e o registro de óbitos para a obtenção de
dados sobre a sobrevida total dos pacientes e tempo livre de doença.
Resultados: Na análise de sobrevida total relacionada à expressão de MMP 2
observamos 23 óbitos com expressão fraca e 1 óbito, forte; quanto à expressão de
MMP 9 foram observados 22 óbitos com expressão forte e 2 óbitos, fraca, não
evidenciando significância estatística entre os dados avaliados. Os dados de
sobrevida livre de doenças relacionadas à expressão de MMP 2 demonstraram 21
recorrências com expressão fraca e 2 fortes. Quando analisada a expressão de
MMP 9 houve 23 recorrências onde 20 casos são de expressão forte e 3 fracas, não
havendo significância estatística nos dados analisados. A correlação entre
graduação, estadiamento e expressão das MMPs não foi significativa.
Conclusão: Não houve associação da expressão imuno-histoquímica das MMP 2 e
9 com graduação histológica, estadiamento, sobrevida total e sobrevida livre de
52
doença, indicando que as MMPs não se mostram como marcadores de prognóstico
para o carcinoma urotelial superficial de bexiga.
Palavras-chave: carcinoma urotelial, metaloproteinase de matriz 2 e 9; sobrevida;
recorrência.
Introdução: O carcinoma de bexiga (CB) é o quinto tumor mais comum na
espécie humana e corresponde ao quarto tumor mais comum nos homens e o oitavo
mais comum nas mulheres
4,16,21,25
, apresentando-se como uma neoplasia agressiva
localmente e que tem como tipo histológico mais comum o carcinoma urotelial ou de
células transicionais
1
.
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento do carcinoma de bexiga
são: idade, tabagismo, exposição ocupacional a agentes químicos industriais
(aminas aromáticas), fatores genéticos e moleculares, ciclofosfamida,
esquistossomose e agentes irritativos do trato genito-urinário
2, 33, 31,19,21
. O risco de
desenvolvimento de carcinoma de bexiga antes dos 75 anos é de 2-4% nos homens
e 0,5-1% nas mulheres
16,21
.
A severidade e o prognóstico dos casos de carcinoma de bexiga estão
diretamente relacionados ao estágio tumoral (superficial ou infiltrativo), ao grau
histológico (I, II e III) e ao tamanho do tumor, sendo considerados tumores de melhor
prognóstico os superficiais, de grau I e com até três centímetros
12
.
O tratamento das neoplasias uroteliais da bexiga é baseado, principalmente,
no grau de invasão tumoral conforme o seguinte estadiamento recomendado pelo
American Joint Committee on Cancer (AJCC) e pela União Internacional Contra o
Câncer (UICC):
• Tis – tumor não papilar restrito ao urotélio;
• Ta – tumor papilar restrito ao urotélio;
53
• T1 – tumor presente na lâmina própria;
• T2 – invasão da camada muscular;
• T3 – invasão do tecido adiposo perivesical;
• T4 – invasão de estruturas adjacentes.
As neoplasias uroteliais papilares restritas à lâmina própria, em estágio T1,
são tratadas, na grande maioria dos casos, com ressecção transuretral,
encaminhando-se o material ressecado para avaliação histopatológica. Após o
tratamento, o paciente é acompanhado para observação de possível recidiva e /ou
progressão da doença.
O prognóstico depende de fatores como tipo histológico do tumor, grau
histológico, estadiamento, multifocalidade, tamanho e tempo de recidiva, entretanto,
a maioria dos pacientes é diagnosticada com carcinoma de bexiga restritos à lâmina
própria
19,23
. A progressão tumoral se dá pela agressividade local através da invasão
da lâmina própria
28
.
Um estudo europeu, entre os anos de 1990 e 1994, mostrou sobrevida de 5
anos após o diagnóstico de 70% para os homens e de 67% para as mulheres
13, 23
.
As metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de enzimas
relacionadas
à
degradação da matriz extracelular (MEC), estando envolvidas em
todas as etapas de reorganização e reparação fisiológicas também em situações
patológicas tais como artrites, arterioesclerose, hepatites e neoplasias, causando lise
da membrana basal e do tecido conjuntivo. De acordo com sua estrutura e
especificidade, classificam-se em: colagenases, gelatinases, de tipo membrana e
54
outras MMP. Estas são enzimas proteolíticas zinco e cálcio dependentes, capazes
de degradar componentes do tecido
3,8,10,11, 18,17,22,36,37,38
.
A degradação da MEC é uma parte crítica para crescimento, invasão,
angiogênese e promoção da metastatização de neoplasias malignas. A membrana
basal e a MEC representam duas barreiras físicas à invasão neoplásica e suas
degradações pelas MMPs têm papel fundamental na progressão tumoral e
disseminação metastática. Um componente da membrana basal e da MEC, o
colágeno tipo IV, é degradado pelas gelatinases A (MMP 2) e B (MMP 9). As MMPs
2 e 9 têm sido reconhecidas como mediadoras da progressão e da metastatização
tumoral em vários tipos de cânceres
14,15,17,29,36
.
Em neoplasias de mama, próstata, esôfago, pele, laringe, mucosa oral,
estômago e de cólon reto, além do carcinoma de células transicionais de bexiga, as
MMPs estão associadas à progressão, grau, tipo e estágio tumoral, recorrência e
sobrevida dos pacientes
5,7,8,10,15,26,27,30,32,34,35,36,39,43
. Nos carcinomas uroteliais, as
expressões das MMPs 2 e 9 são diretamente proporcional à classificação e
estadiamento
10,42
.
Objetivos
Este estudo, propõe-se a: a) avaliar a expressão das MMPs 2 e 9 pela técnica
de IMQ em amostras de carcinoma urotelial de bexiga restrito à lâmina própria
incluídas em parafina ; b) identificar possível associação entre a expressão das
MMPs 2 e 9 com a graduação histológica dos carcinomas uroteliais da bexiga, com o
tempo de sobrevida total dos pacientes e com a sobrevida livre de doença e,
55
também, c) comparar a expressão das MMPs 2 e 9 com a graduação histológica e o
estadiamento dos pacientes que apresentaram recidiva da doença.
Métodos
Material: Foram identificados 83 casos provenientes do arquivo do Serviço de
Patologia do Hospital Santa Rita do Complexo Irmandade Santa Casa de
Misericórdia de Porto Alegre, RS, Brasil, diagnosticados como carcinoma urotelial da
bexiga, conforme graduação baseada no consenso entre a Organização Mundial da
Saúde (OMS) e a International Society of Urological Pathology (ISUP), no período
entre 1997 e 2001.
As informações clínicas, relativas à sobrevida, foram aferidas através da
revisão sistemática de prontuários dos pacientes que mantêm acompanhamento
oncológico no Complexo Hospitalar da Santa Casa. As informações relativas ao
óbito foram obtidas através de consulta ao Núcleo de Informações em Saúde da
Secretaria Estadual de Saúde do RS.
Como critérios de inclusão, foram considerados: a) ter diagnóstico de
carcinoma urotelial da bexiga, restrito ao epitélio, ou à lâmina própria, diagnosticado
no Serviço de Patologia do Hospital Santa Rita-CISCMPA, entre 1997 e 2001; b)
haver existência e conservação dos blocos de parafina referentes a cada caso no
período de estudo; e c) haver existência dos prontuários hospitalares.
Os critérios de exclusão foram: a ausência de blocos de parafina, ou de
prontuários médicos e material insuficiente nos blocos de parafina.
As variáveis estudadas foram: sexo, cor, idade, graduação histológica e
estadiamento da lesão inicial da doença e também da lesão dos pacientes que
56
apresentaram recidiva da doença, tempo de sobrevida total dos pacientes e
sobrevida livre de doença.
Adicionalmente, na revisão dos prontuários foram verificadas informações
quanto à realização de cistoscopia e seu resultado, bem como de cistectomia,
imunoterapia com instilação intravesical do bacilo de Calmette-Guérin (BCG),
quimioterapia e radioterapia, presença e localização de metástases e causa de
óbito.
Processamento histológico: para a análise histológica das amostras, incluindo
as preparações IMQs, os fragmentos foram fixados em formalina (10 %), incluídos
em parafina e obtendo-se cortes histológicos de 3 µm de espessura. Com o fim de
análise diagnóstica, as secções foram montadas em lâminas de vidro e submetidas
à coloração pela técnica de hematoxilina e eosina.
A revisão histopatológica, em todos os casos, foi realizada por dois
patologistas experientes, onde a graduação seguiu o consenso OMS/ISUP e o
estadiamento foi realizado conforme a classificação TNM (AJCC/UIC).
Análise imuno-histoquímica: para a avaliação IMQ, pela técnica de
estreptavidina-biotina-peroxidade, os cortes foram montados em lâminas
previamente silanizadas, desparafinados, hidratados e então submetidos à
recuperação antigênica com solução de tampão Tris-EDTA (1mM, pH 9,0) em
banho-maria na temperatura de 92°C - 95°C por 40 min. A atividade da peroxidase
endógena foi bloqueada, utilizando-se dois banhos de 10 min em peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) 30V, a 5%, em metanol.
O bloqueio das proteínas inespecíficas foi realizado com albumina bovina
fração V (BSA) 1%. A incubação com anticorpo primário foi realizada durante a noite,
à temperatura de 4°C. Os anticorpos primários utilizados consistiam dos seguintes:
57
MMP 2 clone 17B11 (Novocastra® Newcastle,UK) diluição 1:40 e MMP 9, policlonal
(Neomarkers – Fremont – CA), diluição 1:300.
A incubação com anticorpo secundário (biotinilado) e anticorpo terciário
(complexo estreptoavidina-biotina-peroxidase) foi realizada durante 30 min à
temperatura ambiente. Como controle positivo, foi utilizada placenta humana. Para
controle negativo da técnica, foram utilizados os mesmos tecidos, incubados com os
mesmos anticorpos, exceto o primário, que foi substituído por BSA 1%. A ligação
antígeno-anticorpo foi visualizada com o cromógeno DAB (3,3-diaminobenzidina
tetrahidrocloreto). A contracoloração foi feita com hematoxilina de Harris; as lâminas
foram desidratadas e montadas com Entelan.
A aferição da imunoreatividade das MMPs 2 e 9 foi verificada através de
observação histológica simples. A intensidade da reação foi observada no
citoplasma celular e considerada fraca ou forte, de acordo com a positividade
observada, tomando-se como controle interno a coloração das células leucocitárias.
Análise estatística: Inicialmente, foi realizada uma análise descritiva dos
dados através do cálculo de freqüência e percentual para as variáveis categóricas,
enquanto que as variáveis quantitativas foram expressas em média e desvio-padrão
(ou mediana e intervalo interquartílico no caso de não normalidade). A relação entre
as variáveis clinicopatológicas e a expressão das metaloproteinases foi avaliada
através do teste exato de Fisher. Para avaliar a sobrevida total dos pacientes e do
tempo até uma recidiva (tempo livre de doença), utilizou-se o teste de Log-rank. Os
dados foram analisados no programa SPSS 12.0 para Windows e o nível de
significância adotado foi de 0,05.
Aspecto ético: o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre (protocolos: 476/02 e 14/09).
58
Resultados
Foram identificados inicialmente 83 casos, sendo excluídos 24 casos, sendo 8
por ausência dos blocos de parafina; 6 por erro no registro de codificação; 3 por
terem sido diagnosticados anteriormente a 1997; 3 por material insuficiente nos
blocos e 4 pela não localização dos prontuários médicos. A amostra efetivamente
estudada foi de 59 casos de carcinomas uroteliais da bexiga restritos à lâmina
própria, sendo 51 (86,4%) em homens e 8 (13,6%) em mulheres; 55 (93,2%)
pacientes de cor branca, 1 (1,7%) de cor negra e 3 (5,1%) afro-americanos, com
idade mediana de 68 (40-84) anos no momento do diagnóstico inicial.
A expressão da MMP 2 foi fraca em 51(86,4%) e forte em 8 (13,6%) casos no
diagnóstico inicial. Em 53 (89,8%) casos, a expressão da MMP 9 foi considerada
forte e em 6 (10,2%) casos foi considerada fraca, quando do primeiro diagnóstico
(Figura 1).
Figura 1. Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases de matriz 2 e 9: (A) MMP 2 fraca;
(B) MMP 2 forte; (C) MMP 9 fraca; (D) MMP 9 forte (IMQ-400x).
59
Quando do diagnóstico inicial da doença, o estadiamento demonstrou que 56
(94,9%) casos correspondiam a T1 e 3 (5,1%) a Ta; e quanto à classificação
histológica, 40 (67,8%) casos correspondiam à carcinoma urotelial de baixo grau, 16
(27,1%) casos a carcinoma urotelial de alto grau e 3 (5,1%) a neoplasia urotelial de
baixo potencial para malignidade, tendo havido recorrência da neoplasia em 23
pacientes (39%).
Na primeira recorrência dos casos, o estadiamento observado foi T1 em 17
(72,8%), Ta em 3 (12%) casos e T2 em 3 (12%) casos, enquanto a graduação
histológica observada foi de carcinoma urotelial de baixo grau em 15 (63,6%) casos,
com carcinoma urotelial de alto grau em 7 (31,8%) casos e neoplasia urotelial de
baixo potencial de malignidade em 1 (4,5%) caso.
As tabelas 1 e 2 apresentam, respectivamente, a relação da expressão da
metaloproteinase 2 (MMP 2) com a classificação histológica e com o estadiamento,
no momento do diagnóstico inicial.
Tabela 1. Associação entre MMP 2 e classificação histológica no diagnóstico inicial
Classificação histológica no
diagnóstico inicial
nbpm baixo grau alto grau
Total
n 3 35 13 51
fraca
% 5,9 68,6 25,5 100,0
n 0 5 3 8
Expressão
MMP2
forte
% 0,0 62,5 37,5 100,0
n 3 40 16 59 Total
% 5,1 67,8 27,1 100,0
nbpm: neoplasia de baixo potencial de malignidade
60
Tabela 2. Associação entre MMP 2 e estadiamento no diagnóstico inicial
Estadiamento no
diagnóstico inicial
Ta T1
Total
fraca
n 3 48 51
% 5,9 94,1 100,0
forte
n 0 8 8
Expressão
MMP2
% 0,0 100,0 100,0
Total
n 3 56 59
% 5,1 94,9 100,0
Ta - Tumor papilar restrito ao urotélio
T1 - Tumor presente na lâmina própria
Não foi observada associação significativa entre a expressão da MMP 2 e a
classificação histológica (teste exato de Fisher, p = 0,536) e o estadiamento no
momento do diagnóstico inicial (teste exato de Fisher, p = 0,343).
As tabelas 3 e 4 apresentam a relação entre a expressão da metaloproteinase
9 (MMP 9) e a classificação histológica e o estadiamento, no diagnóstico inicial:
Tabela 3. Associação entre MMP 9 e classificação histológica no diagnóstico inicial
Classificação histológica no
diagnóstico inicial
nbpm baixo grau alto grau
Total
n 0 5 1 6
fraca
% 0,0 83,3 16,7 100,0
n 3 35 15 53
Expressão
MMP9
forte
% 5,7 66,0 28,3 100,0
n 3 40 16 59 Total
% 5,1 67,8 27,1 100,0
nbpm: neoplasia de baixo potencial de malignidade
61
Tabela 4. Associação entre MMP 9 e estadiamento no diagnóstico inicial
Estadiamento no
diagnóstico inicial
Ta T1
Total
fraca
n 1 5 6
% 16,7 83,3 100,0
forte
n 2 51 53
Expressão
MMP9
% 3,8 96,2 100,0
Total
n 3 56 59
% 5,1 94,9 100,0
Ta - Tumor papilar restrito ao urotélio
T1 - Tumor presente na lâmina própria
Não foi observada associação significativa entre a expressão da MMP 9 e a
classificação histológica (teste exato de Fisher, p = 0,556) e o estadiamento no
momento do diagnóstico inicial (teste exato de Fisher, p = 0,702).
Em relação ao número de recidivas, estas ocorreram em 23 pacientes; 13
(22%) apresentaram 1 recidiva; 6 (10,2%), 2 recidivas; 3 (5,1%), 3 recidivas; 2
(3,4%), 7 recidivas e 1 (1,7%), 8 recidivas. O tempo mediano livre de doença foi de
232,5 dias e o de seguimento de 1396 dias (3,8 anos). O número de óbitos ocorridos
no período foi 24 (40,7%) com uma idade mediana de 71 (44-88) anos.
Na análise de sobrevida total relacionada à expressão de MMP 2 (Figura 2),
observaram-se 23 óbitos com expressão fraca e 1 óbito com expressão forte. Com
relação à expressão de MMP 9 (Figura 3) foram observados 2 óbitos com expressão
fraca e 22 óbitos com expressão forte. O teste Log-rank não mostrou diferença
estatística entre as sobrevidas totais dos grupos com expressão forte e fraca, tanto
para a expressão de MMP 2 (p = 0,238) quanto para a expressão de MMP 9 (p =
0,867).
62
Figura 2. Análise de sobrevida total e expressão de MMP 2
Figura 3. Análise de sobrevida total e expressão de MMP 9
Na análise de sobrevida livre de doença relacionada à expressão de MMP 2
(Figura 4), ocorreram 21 recorrências em pacientes com expressão fraca e 2 com
expressão forte. Quando analisada a expressão de MMP 9 (Figura 5), houve 23
recorrências, onde 3 casos apresentaram expressão fraca e 20 expressão forte.
63
O teste Log-rank não mostrou diferença estatística entre as distribuições de
sobrevida livre de doença dos grupos de pacientes com expressão fraca e forte de
MMP 2 (p = 0,311). O mesmo ocorrendo para a expressão de MMP 9 (p = 0,745)
Figura 4. Análise de sobrevida livre da doença e expressão de MMP 2
Figura 5. Análise de sobrevida livre da doença e expressão de MMP 9
64
No acompanhamento pós-diagnóstico dos 59 casos examinados, 45
pacientes (76,3%) realizaram cistoscopias onde o resultado do último registro
informou que 23 (51,1%) estavam normais e 22 (48,9%) apresentaram lesão; 9
(15,3%) foram submetidos a cistectomia e houve detecção de metástases em 8
(13,6%) casos. O informe sobre as metástases foi obtido através de exame
histopatológico em 5 casos (62,5%); 1 (12,5%) foi identificado somente pela
tomografia computadorizada; 1 (12,5%) tanto pelo exame histopatológico quanto
pela tomografia computadorizada e 1 (12,5%) somente pelo registro médico no
prontuário do paciente. As metástases foram localizadas no fígado (3 – 37,5%), osso
(2 – 25%), pele (1 – 12,5%), retroperitônio (1 – 12,5%), e linfonodos inguinais (1 –
12,5%). Do total de pacientes, 9 (15,3%) foram submetidos à quimioterapia e 5
(8,5%) submetidos à radioterapia. Dos 24 óbitos registrados 21 ocorreram em
homens e 3 em mulheres.
A causa de óbito, obtida através dos registros do Núcleo de Informações em
Saúde da Secretaria Estadual da Saúde e pela pesquisa nos prontuários
hospitalares, evidenciou que, dos 24 óbitos constatados, 6 ocorreram por neoplasia
de bexiga; 3 por neoplasia de próstata; 2 por neoplasia gástrica; 1 por neoplasia de
corpo ciliar; 1 por neoplasia de brônquios e pulmão; 1 por neoplasia de cólon; 1 por
diabetes; 1 por insuficiência renal crônica; 1 por alterações vasculares em intestino;
2 por infarto cardíaco; 4 por hipertensão arterial e 1 por parada cardíaca.
Discussão
Pacientes com carcinoma urotelial de bexiga apresentam, na sua maioria,
bom prognóstico. No entanto, uma parcela destes doentes, cerca de 10 a 25%
41
, irá
65
apresentar progressão da doença. Procura-se, atualmente, identificar marcadores
biológicos que possam ser utilizados como preditores de progressão para doença
invasora ou metastática. As MMPs 2 e 9 têm se mostrado, em estudos realizados
por Bianco et al. (1998)
1,
Choi et al. (2007)
6
, Eissa et al. (2007)
10
e Gerhards et al.
(2001)
11
, como potenciais marcadores de prognóstico em câncer de bexiga, por
estarem associadas à expressão aumentada em carcinomas de alto grau e
estadiamento avançado.
Este estudo analisou o papel da expressão IMQ das MMPs 2 e 9 em
carcinoma uroteliais superficiais (restritos até a lâmina própria) e sua relação com
parâmetros clinicopatológicos, incluindo a sobrevida total e sobrevida livre de doença
dos pacientes.
Neste estudo, o carcinoma de bexiga foi mais frequente em homens brancos,
com idade mediana de 68 anos no diagnóstico inicial, concordante com o observado
por Black et al. (2009)
2
, Davies et al. (1993)
8
, Gerhards et al. (2001)
11
e Murta et al.
(2008)
30
.
Considerando a graduação e o estadiamento, não se encontrou associação
estatisticamente significativa entre os marcadores examinados. O mesmo foi
observado por Vasala (2008)
42
em relação à MMP 9, utilizando a técnica de IMQ e
por Grignon et al. (1996)
15
, ao estudar a expressão IMQ de MMP 2 em 42 pacientes
com diagnóstico de CB.
Já Bianco et al. (1998)
1
e Gerhards et al. (2001)
11
observaram correlação
entre altos níveis de excreção urinária da MMP 9 e carcinomas de alto grau com
estadiamento avançado (T2). Davies et al. (1993)
8
Gerhards et al. (2001)
11
detectaram, ainda, os mesmos resultados para excreção de MMP 2. No entanto,
nestes estudos relatados não foi utilizada a técnica de IMQ. Os autores obtiveram
66
seus resultados utilizando estudos por zimografia em lavado vesical
1
, na urina
11
e
em tecido
8
criopreservado com hibridização in situ
8
. Do mesmo modo, Kanayama
et al. (1998)
21
, num estudo com 41 pacientes, utilizando a reação da transcriptase
reversa seguida de reação em cadeia da polimerase, correlacionaram altos níveis de
MMP 2 com tumores de maior graduação histológica.
Em relação à sobrevida total e sobrevida livre de doença, também não se
encontraram resultados estatisticamente significativos. O mesmo aconteceu com
estudo de Bianco et al. (1998)
1
, pesquisando a relação entre a excreção urinária de
MMP 9 e sobrevida livre de doença.
Vasala et al. (2003)
41
,
analisando amostras de tecido de 54 pacientes com
carcinomas uroteliais vesicais, durante 6 anos consecutivos, e submetidos à técnica
de IMQ, evidenciaram que a expressão IMQ positiva de MMP 9, em carcinomas
uroteliais vesicais, está associada a um melhor prognóstico. Este dado contraria a
hipótese inicial de que a alta expressão IMQ de MMP 9 teria associação a um
prognóstico desfavorável.
No mesmo estudo a expressão IMQ positiva de MMP 2 foi significativamente
associada a menor tempo de sobrevida livre de doença em 5 e 10 anos
41
. No
entanto, quando avaliada a sobrevida total, os resultados observados não
mostraram significância estatística. O autor justifica o achado relacionando com a
idade avançada dos pacientes, 66 anos (43-85), e com o fato de que muitos
morreram durante os 10 anos do seguimento por causas não neoplásicas diversas.
Ainda assim, os autores sugerem que MMP 2 pode ser um marcador
independente de prognóstico nos casos de CB. Os dados aqui coletados se
assemelham ao relatado, havendo 24 óbitos em 59 casos, onde os pacientes
possuíam uma idade mediana de 68 anos (40-84), num período de seguimento de
67
12 anos. Em nosso estudo, de 24 óbitos, apenas 6 foram decorrentes da neoplasia
vesical. Este fato corrobora a característica do comportamento biológico do CB:
baixa taxa de mortalidade, apesar de um alto percentual de recorrências.
Este estudo não mostrou significância estatística entre as variáveis
estudadas. Resultados conflitantes, em relação ao papel das MMPs 2 e 9 nestas
neoplasias, ainda são encontrados na literatura. Tais achados podem encontrar
explicação em diferenças metodológicas, incluindo as técnicas empregadas para
medida das MMPs, os tamanhos amostrais, o tempo de seguimento dos pacientes e
perda de informações, ou a ausência de prontuários médicos.
Entretanto, a possibilidade de que as expressões IMQ das MMPs 2 e 9
possam não representar um fator contributivo frente ao comportamento biológico das
neoplasias uroteliais da bexiga, conforme sugere nosso estudo, deve ser
considerada.
Conclusão
Neste estudo, não houve associação da expressão imunohistoquímica das
MMPs 2 e 9 com parâmetros clinicopatológicos, com a graduação histológica, com o
estadiamento, com a sobrevida total e com a sobrevida livre de doença. As MMP 2 e
9 não se mostraram marcadores de prognóstico para o carcinoma urotelial de bexiga
restrito até a lâmina própria.
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72
6 CONCLUSÕES FINAIS
Neste estudo não houve associação da expressão imunohistoquímica das
MMPs 2 e 9 com parâmetros clinicopatológicos, graduação histológica,
estadiamento, sobrevida total e sobrevida livre de doença.
As MMPs 2 e 9 não se mostraram marcadores de prognóstico para o
carcinoma urotelial de bexiga restrito até a lâmina própria.
Resultados conflitantes, em relação ao papel das MMPs 2 e 9 nestas
neoplasias, ainda são encontrados na literatura. Tais achados podem encontrar
explicação em diferenças metodológicas, incluindo as técnicas empregadas para
medida das MMPs, os tamanhos amostrais, o tempo de seguimento dos pacientes e
a perda de informações, ou ausência de prontuários médicos.
Entretanto, a possibilidade de que a expressão IMQ das MMPs 2 e 9 possa
não representar um fator contributivo frente ao comportamento biológico das
neoplasias uroteliais da bexiga, conforme sugere nosso estudo, deve ser
considerada.
73
7 ANEXOS
Anexo A – Parecer do Comitê de Ética do CISCMPA
74
75
Anexo B – Adendo ao parecer do Comitê de Ética do CISCMPA
76
Anexo C – Técnicas Histológica e Imuno-histoquímica
1. Análise histológica:
Para a análise histológica das amostras, incluindo as preparações imuno-
histoquímicas, os fragmentos foram fixados em formalina (10%) tamponada,
incluídos em parafina e obtidos cortes histológicos de 3 micra.
Com o fim de análise diagnóstica, as secções foram montadas em lâminas de
vidro e submetidas à coloração pela técnica de hematoxilina e eosina.
2. Análise imuno-histoquímica:
Para a avaliação imuno-histoquímica, pela técnica de streptavidina-biotina-
peroxidade os cortes foram montados em lâminas previamente silanizadas,
desparafinados, hidratados e então submetidos à recuperação antigênica com
solução de tampão Tris-EDTA pH 9,0 em banho-maria na temperatura de 92°C -
95°C por 40 min. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizada com água
oxigenada (30V), 95 ml de metanol e 5 ml de água oxigenada, dois banhos de 10
min cada. O bloqueio das proteínas inespecíficas foi realizado com albumina bovina
fração V (BSA) 1%, por 30 min.
As amostras foram então incubadas com os anticorpos primários: anti-MMP-2-
clone 17B11 diluição = 1:40 (Novocastra, Newcastle – UK) e anti-MMP-9, policlonal
diluição = 1:300 (Neomarkers – Fremont – CA) a 4°C na geladeira. A amplificação da
reação foi obtida com o sistema avidina-biotina-peroxidase, segundo as orientações
do fabricante (Dako, Co Carpenteria, CA, USA.).
77
A revelação da reação foi feita utilizando-se 3’,3’-tetrahidrocloreto de
diaminobenzidina (Sigma Chemical Co . MO, USA.).
Os fragmentos teciduais foram então contra-corados em hematoxilina de
Harris. Como controle negativo, substituiu-se o anticorpo primário por solução de
BSA a 1%, diluída em PBS (pH 7,4), e como controles positivos foram usados
amostras de placenta.
3. Preparação Técnica
3.1 Coloração de hematoxilina-eosina (HE):
É a coloração combinada mais simples e universalmente usada. Utiliza uma
coloração nuclear pela hematoxilina, seguida pelo corante ácido eosina.
3.1.2 Solução de hematoxilina de Harris:
Hematoxilina (cristais) 5 g.
1. Álcool absoluto ____________________50 ml.
2. Alúmen de potássio ou amônia _______ 100 g.
3. Água destilada ____________________ 1000 ml.
4. Óxido amarelo de mercúrio __________ 2,5 g.
Dissolver a hematoxilina no álcool, dissolver o alúmen na água aquecendo
(sem ferver). Retirar do fogo e misturar as duas soluções. Levar ao fogo até
ebulição, o tempo não deve ultrapassar um minuto. Colocar o óxido lentamente (com
a solução fora do fogo). Agitar bem, retomar ao fogo até a solução adquirir cor
púrpura. Levar o recipiente imediatamente
à
água fria. Na hora de usar, adicionar
0,5 ml de ácido acético glacial para 200 ml de solução.
78
3.1.3 Solução de eosina:
A eosina normalmente usada é a Y (hidrossolúvel, derivada do tetrabromato de
fluoresceína). Prepara-se uma solução estoque a 1%, seja aquosa ou alcoólica, a
partir da qual, dilui-se uma parte da solução de estoque em três partes de álcool.
Para conseguir uma tonalidade mais avermelhada, adicionar 0,5 ml de ácido acético
glacial para cada 100 ml de corante. No laboratório de patologia da Pós-Graduação
da UFCSPA usa-se a solução alcoólica.
Solução alcoólica de eosina:
Solução de estoque:
1. eosina Y _________________1 g.
2. água destilada ____________ 20 ml.
3. álcool etílico a 95% ______________80 ml.
Solução de uso
Dissolver e adicionar:
1. solução estoque de eosina ___________1 parte.
2. álcool etílico a 80% __________________________ 3 partes.
3.1.4 Coloração HE- procedimento técnico:
1. Desparafinar, hidratar.
2. Água destilada, lavar.
3. Solução de hematoxilina – 3 min.
4. Água corrente, lavar 10 min em água corrente.
5. Solução de eosina – 4 min.
6. Álcool etílico 100% – 4 passagens.
79
7. Xilol, clarificar com 3 passagens.
8. Montar a lâmina.
3.2 Imuno-histoquímica
MMP 2 Æ MMP-2/72 KDa Collagenase IV Gelatinase A Ab-1 (clone CA 4001)
Neomarkers (monoclonal).
MMP 9 Æ MMP 9/92 a 86 KDa Gelatinase B Ab-4 (clone IAS) Neomarkers
(monoclonal).
3.2.1 Silanização das lâminas:
O APTS (3 - aminopropriltrietoxisilano - Sigma A3648) pode causar queimaduras
na pele, por isso deve ser manipulado com luvas e com cuidado. Os líquidos devem
ser colocados em cubas de vidro com tampa e manipulados na capela.
1. Imersão das lâminas em acetona p.a. (1
a
- cuba) por 2 min; esgotar muito bem
o excesso de acetona para não diluir a solução de APTS.
2. Imersão em APTS a 4% em acetona p.a. (2
a
- cuba) por 2 min; esgotar bem o
excesso.
3. Imersão em acetona p.a. (3
a
- cuba) por 4 vezes, esgotar bem o excesso.
4. Secagem em estufa; deixar esfriar e guardá-Ias em caixas.
3.2.2 Técnica de imuno-histoquímica:
1. Desparafinar as lâminas na estufa a 60°C por 30 min.
2. Imersão das lâminas em xilol (duas vezes por 5 min), álcool absoluto
(passagem por três cubas), álcool absoluto (uma vez por 5 min) e água
destilada.
80
3. Recuperação antigênica com Tris – EDTA em banho – maria a 92-95°C por
40 min. O resfriamento é feito
à
temperatura ambiente durante 20 min
aproximadamente.
4. Lavar as lâminas em água destilada.
5. Lavar com solução tampão fosfato (PBS) duas vezes durante 5 min.
6. Bloqueio da peroxidase endógena: imersão das lâminas em (metanol 95
ml e H
2
O
2
, 30 V - 5ml), duas vezes por 10 min.
7. Lavar em água corrente e em água destilada por 5 min.
8. Lavar com solução tampão fosfato (PBS) duas vezes durante 5 min.
9. Escorrer o excesso de tampão e secar nas bordas do corte histológico.
10. Demarcar o corte com caneta DAKOPEN (S2002, DAKO).
11. Aplicar os anti-corpos primários anti-MMPs diluídos em solução de albumina
bovina; incubar em câmara úmida tampada durante 1 h.
12. Lavar com solução tampão fosfato (PBS) duas vezes durante 5 min.
13. Escorrer o excesso de tampão e secar nas bordas do corte histológico.
14. Aplicar o anticorpo secundário biotinilado; incubar em câmera úmida
durante 30 min.
15. Lavar com solução tampão fosfato (PBS) duas vêzes durante 5 min.
16. Escorrer o excesso de tampão e secar nas bordas do corte histológico.
17. Aplicar o complexo estrepto-avidina-biotina-peroxidase (KIT LSAB+),
incubar em câmara úmida durante 30 min.
18. Lavar com solução tampão fosfato (PBS) duas vezes durante 5 min.
19. Escorrer o excesso de tampão e secar nas bordas do corte histológico.
20. Aplicar o cromógeno DAB, deixando-o atuar no mínimo por 5 min.
21. Lavar em água destilada por 5 min.
81
22. Mergulhar em hematoxilina de Harris pura durante 30 seg para contra - corar.
23. Passar as lâminas em álcool absoluto (quatro vezes por 5 min) e em xilol
(duas vezes por 5 min).
24. Montar as lâminas com lamínula e cola especial Entellan (1079610100
Merck).
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