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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Genética
Alterações Genéticas em Linfócitos de
Pacientes Idosos Portadores da Síndrome da
Fragilidade
Danillo Lucas Alves Espósito
Ribeirão Preto
2010
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Genética
Alterações Genéticas em Linfócitos de
Pacientes Idosos Portadores da Síndrome da
Fragilidade
Danillo Lucas Alves Espósito
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de mestre,
pelo curso de Pós-Graduação em Genética
Ribeirão Preto
2010
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Danillo Lucas Alves Espósito
Alterações Genéticas em Linfócitos de
Pacientes Idosos Portadores da Síndrome da
Fragilidade.
Genetic Alterations on Lymphocytes from
Elderly Frailty Syndrome Patients.
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de mestre,
pelo curso de Pós-Graduação em Genética
Orientadora: Profa. Dra. Elza Tiemi Sakamoto Hojo
Ribeirão Preto
2010
FICHA CATALOGRÁFICA
Espósito, Danillo Lucas Alves
Alterações genéticas em linfócitos de pacientes portadores da síndrome da
fragilidade. Ribeirão Preto, São Paulo. 2010.
p. 60: il ; 30 cm
Dissertação de mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/USP – Área de concentração: Genética.
Orientadora: Hojo, Elza Tiemi Sakamoto.
1. Síndrome da Fragilidade. 2. Estresse Oxidativo. 3. Dano no DNA. 4. Perfis de
Expressão
APOIO FINANCEIRO
Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro das seguintes entidades e
instituições:
- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Proc nº
06/1947-8 e 06/0588-9);
-Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
CNPq; (Edital
MCT – CNPq / MS-SCTIE-DECIT – Nº 17/2006)
-Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência – FAEPA –
FMRP/USP;
-Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP);
-Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP/USP);
Agradecimentos
Agradeço à Profª. Elza Tiemi Sakamoto Hojo por toda a confiança
depositada em mim neste período em que me orientou, ajudou a me transformar em
um cidadão crítico e mais responsável.
À Profª. Drª Catarina Satie Takahashi pelos momentos de descontração e
amizade e ao Prof. Dr. Geraldo Aleixo S. Passos Junior pela colaboração em
ceder prontamente seu laboratório e equipamentos.
Agradeço aos meus pais por tudo que me deram, desde pequeno e até hoje.
Sem vocês dois eu nunca conseguiria chegar aonde cheguei. Saiba que vocês dois
estão no meu coração.
Agradeço ao Prof. Dr. Eduardo Ferriolli, ao Dr. Paulo Formighieri e todos
os residentes que contribuíram para a caracterização da síndrome nos pacientes e
nas coletas de material. Agradeço ainda às enfermeiras do HC e em especial à
Luana, que me ajudou nas coletas externas.
À Profª Drª Nilce Maria Martinez Rossi, chefe do Departamento de Genética
da FMRP/USP, e ao Prof Dr Ademilson Espencer E. Soares, coordenador do
curso de Pós-graduação do departamento de Genética da FMRP-USP.
Aos diretores, enfermeiros e funcionários do asilo Casa do Vovô que
contribuíram bastante para a finalização deste trabalho, ajudando na coleta dos
pacientes. Agradeço ainda a todos os funcionários do posto de saúde CSE, Monte
Alegre por toda paciência e ajuda nas coletas.
Às funcionárias do departamento, Susie A. Nalon, Maria Aparecida Elias,
Cleusa Mazzucatto e Silvia H. Costa por toda colaboração com a parte burocrática
do processo.
Agradeço à FAPESP pela bolsa de estudos concedida para a realização
deste trabalho (processo nº06/05288-9).
Às alunas do laboratório de Imunogenética Molecular por toda a ajuda que
deram na realização da técnica de microarrays e no processamento dos dados.
Agradeço ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, pela infra-estrutura e apoio na realização deste trabalho. Agradeço
também a todos os professores e funcionários que participaram dessa minha
caminhada.
Aos meus colegas de laboratório: Aline, Ana Cláudia, Ana Paula, Cristiano,
Daily, Danilo, Flávia, Giovana, Gustavo, Igor, Juliana, Leonardo, Mônica, Paulo,
Patrícia, Raquel, Stephano, Vinicius, Carmem, Cássia, Cleide, Douglas, Marcelo
e Maria Sol, todos que participaram desse momento importante. Um agradecimento
especial para Flávia, Danilo, Douglas, Giovana e Paulo, pela ajuda nas coletas,
experimentos, análise dos dados e amizade.
Aos técnicos do laboratório, Junior e Sueli, por organizarem o local de
trabalho e prepararem o material, muito obrigado.
Aos meus amigos por toda amizade e carinho nesse período: Angélica, Rico,
Eduardo, Artur, Sheila, Hugo, Michelle, Vicente, Débora, Rafael e tantos outros
que sempre estiveram comigo.
E como não poderia faltar, agradeço também todos os idosos que literalmente
doaram o sangue por esse trabalho, muito obrigado por todo esforço e
compreensão, pois sem vocês esta pesquisa não existiria.
ÍNDICE
Resumo i
Abstract iii
1. Introdução 1
1.1 Síndrome da Fragilidade 1
1.2 Dano Oxidativo e Reparo do DNA 3
1.3 Dano Oxidativo e Envelhecimento 6
2. Objetivos 8
3. Material e Métodos 9
3.1 Grupo de pacientes e indivíduos controles 9
3.2 Cultivo de linfócitos 10
3.3 Ensaio do cometa 10
3.4 Forma de análise dos danos no DNA pelo ensaio do Cometa 11
3.5 Extração de RNA total 12
3.6 Preparação das lâminas de cDNA microarrays 12
3.7 Preparação das sondas de cDNA e hibridação na lâmina
13
3.8 Forma de análise de expressão gênica por microarrays
14
3.9 Avaliação da expressão gênica por RT-PCR quantitativa em tempo real
15
4. Resultados
16
4.1 Análise de danos no DNA pelo ensaio do cometa
16
4.2 Análise de genes relacionados com o reparo BER por qRT-PCR
23
4.3 Análise de expressão gênica por microarrays 25
5. Discussão
33
5.1 Análise de danos no DNA pelo ensaio do cometa e cinética de reparo
34
5.2 Análise de genes relacionados com a remoção de lesões oxidativas
36
5.3 Modulação da expressão gênica analisada por microarrays
40
6. Conclusões 50
7. Referências Bibliográficas 51
8. Anexos 51
RESUMO
A síndrome da fragilidade é geralmente definida como um quadro clínico de fraqueza
e vulnerabilidade que atinge pessoas de idade acima de 65 anos, sendo que os principais
sintomas são relacionados com a atividade motora, afetando tanto o sistema muscular
quanto nervoso. Pouco se sabe acerca dos mecanismos fisiológicos e moleculares
relacionados com a fragilidade em idosos, sendo que a hipótese mais provável é que o
acúmulo de dano oxidativo nas células dos pacientes pode constituir um fator importante
capaz de contribuir para o desenvolvimento da síndrome.
Neste trabalho foram avaliadas as respostas celulares frente a um agente indutor de
danos oxidativos, o peróxido de hidrogênio, em linfócitos de idosos frágeis e sadios, por
meio do ensaio do cometa, abordando aspectos da dinâmica de reparo dessas lesões. Além
disso, os danos no DNA foram também avaliados pelo ensaio do cometa na presença da
enzima hOGG1, responsável pelo reparo de 8-oxo-Guanina. Para tanto, foram analisados os
linfócitos provenientes de um total de 16 indivíduos, sendo oito controles e oito pacientes.
Não foi encontrada nenhuma diferença significativa para o montante de danos basais entre
os dois grupos estudados, mas sob tratamento com hOGG1, os indivíduos caracterizados
frágeis apresentaram um valor significativamente maior do que os controles em relação aos
danos acumulados, sugerindo uma possível ineficácia dos processos moleculares
responsáveis pela remoção dessas lesões ou um retardo no reparo das mesmas.
Para avaliar a cinética de reparo das lesões oxidativas pelo ensaio do cometa, os
linfócitos dos grupos estudados foram tratados com um agente genotóxico, o peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
). As culturas foram analisadas em três tempos diferentes, logo após a
indução (T0), duas e quatro horas após a remoção da H
2
O
2
(T1 e T2, respectivamente). Os
indivíduos frágeis demonstraram uma maior sensibilidade ao peróxido de hidrogênio no
parâmetro momento da cauda do cometa, mostrando uma diferença significativa
comparativamente ao grupo controle. Em contrapartida, a eficiência de reparo dos linfócitos
desses pacientes encontrou-se diminuída quando verificada a quantidade total de danos
remanescentes no DNA após duas horas da remoção do agente genotóxico. Não houve
diferença significativa entre os tempos de 2 e 4 horas.
Os níveis de expressão gênica transcricional foram estudados para alguns genes
participantes do mecanismo de defesa anti-oxidante e reparo de danos oxidativos no DNA,
sendo que estes mostraram expressão diferencial na comparação pacientes frágeis versus
sadios. SOD1(0,5) e FEN1 (0,18) foram encontrados induzidos, enquanto XRCC1 (-0,39),
APEX1 (-0,65) e OGG1 (-0,95), reprimidos. Estes resultados refletem alterações na via de
reparo BER que podem provavelmente ter contribuído para o quadro de fragilidade dos
pacientes.
Os resultados obtidos na análise de expressão gênica por microarrays revelaram
uma lista de 571 genes diferencialmente expressos (análise pelo método SAM: Significance
Analysis of Microarray), sendo 300 genes reprimidos e 271 induzidos, para valores de False
Discovery Rate (FDR) ≤ 1%. O agrupamento hierárquico mostrou uma separação distinta
entre os pacientes e controles. Os genes modulados participam de diversos processos
celulares que podem contribuir para o fenótipo dos pacientes, como reparo do DNA (BTG2,
RAD51L3, ERCC5, ERCC1, SMC1L1, MHL3, XRCC3 PCBP4, RAD52, TRRAP, PRKDC,
H2AFX, POL4, RFC5, REVL3 e MLH1), genes de resposta ao estresse (SESN1, POLH,
RFC5, CDH13, REV3L, WRNIP1, H2AFX, RAD52, GSTM3, MLH1, PRKDC, CAV1, HTRA2,
CAT) e do sistema Ubiquitina-Proteassoma (HSPs, NEDD4L, WDSUB1, UBE3A, UBE2E1,
TRAP1, RNF2, PSMA5, FBXO4, ANAPC7 RNF128, PSMD10, RNF138, RNF144, PIAS1,
HERC1, FBXL11, FBXL3, RNF149 e FBXL5). Assim, uma lista de genes candidatos a
marcadores biológicos foi obtida no presente trabalho, sendo que esses genes merecem
uma investigação mais detalhada, visto que a elucidação dos papéis de cada um poderá
contribuir para a compreensão dos mecanismos que desencadeiam a síndrome da
fragilidade em indivíduos idosos.
ABSTRACT
The frailty syndrome is generally defined as a group of clinical conditions that affects
elderly people, over 65 years, that is related with weakness and vulnerability, mainly related
to motor activity, affecting both the nervous and muscular system. The literature is still scarce
regarding the physiological and molecular mechanisms that lead to weakness in the elderly,
and probably the accumulation of oxidative damage in cells of these patients may be an
important factor that can contribute to the development of the syndrome.
In this study, we evaluated the cellular responses displayed by lymphocytes of
healthy and frail elderly individuals to hydrogen peroxide, a genotoxic agent capable of
inducing oxidative damage, by means of the comet assay, which allow the analysis of the
kinetics of DNA break repair. In addition, the amount of basal oxidative damage could be
evaluated under treatment with the enzyme hOGG1 that play a role in the removal of 8-oxo-
Guanine. Thus, we analyzed the lymphocytes from a total of 16 subjects, eight controls and
eight patients. No significant difference in the amount of basal damage was found between
the groups, but under treatment with hOGG1, individuals characterized as frail showed a
significant increase in the amount of these lesions, demonstrating a possible inefficiency of
the removal of DNA lesions, or a delay in repair processes.
The repair kinetics of oxidative lesions was studied in lymphocytes treated with
hydrogen peroxide (H
2
O
2
) at three different times after damage induction (0, 2 and 4 hours
after the removal of H
2
O
2
, as analyzed by the comet assay. The frail patients showed a
greater sensitivity to hydrogen peroxide, showing a significant difference in the tail moments,
compared with control individuals. Moreover, the analysis or repair kinetics demonstrated
that the lymphocytes of patients presented a reduced repair capacity, as shown at 4h
collection time. However, a significant difference between zero and 1 h (early time point) was
not found.
The transcript expression of genes related to oxidative damage repair was
significantly different between both group of individuals, frail versus healthy elderly people.
Two genes were induced, SOD1 (0.5) and FEN1 (0.18), while XRCC1 (-0.39), APEX1 (-0.65)
and OGG1 (-0.95), were found down-regulated. These results reflect changes in BER repair
pathways and might contribute to the development of the frail symptoms.
The analysis of gene expression obtained by the microarray technique revealed a list
of 571 differentially expressed genes, as analyzed by the method of SAM (Significance
Analysis of Microarray), 300 down-regulated and 271 up-regulated, for values of False
Discovery Rates (FDR) ≤ 1%. The hierarchical clustering showed a distinct separation
between the groups of patients and controls. The differentially expressed genes are involved
in several cellular processes, and most probably, they might contribute to the frailty
phenotype. The main processes were DNA repair (BTG2, RAD51L3, ERCC5, ERCC1,
SMC1L1, MHL3, XRCC3 PCBP4, RAD52, TRRAP, PRKDC, H2AFX, POL4, RFC5, REVL3
and MLH1), stress response (SESN1, POLH, RFC5, CDH13, REV3L, WRNIP1, H2AFX,
RAD52, GSTM3, MLH1, PRKDC, CAV1, HTRA2, CAT) and Ubiquitin-Proteasome (HSPs,
NEDD4L, WDSUB1 , UBE3A, UBE2E1, TRAP1, RNF2, PSMA5, FBXO4, ANAPC7 RNF128,
PSMD10, RNF138, RNF144, PIAS1, HERC1, FBXL11, FBXL3, FBXL5 and RNF149). Thus,
a list of candidate genes to biological markers was obtained in this work, which deserves
further investigation, since the elucidation of the roles of each gene can contribute to
understanding the mechanisms responsible for triggering the frailty syndrome in elderly
individuals.
Introdução
___________________________________________________________________________
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Sindrome da fragilidade
O envelhecimento é um processo natural de declínio gradual e progressivo das
funções fisiológicas do organismo (Fraser et al., 2005), comum entre organismos eucariotos.
Apesar do crescente número de publicações sobre o assunto, os mecanismos moleculares
que levam a este processo ainda não estão completamente elucidados (Lombard et al.,
2005). Durante as últimas décadas, o número de pessoas com mais de 65 anos de idade
aumentou consideravelmente e, com isso, aumentou também o número de pesquisas para
determinar os padrões fisiológicos, genéticos e ambientais que levam ao envelhecimento, e
por conseqüências, as doenças decorrentes desse processo (Harper & Crews, 2000; Crews
& Zavotka, 2006).
O termo “idosos frágeis” tem sido utilizado desde a década de 70, embora haja muita
controvérsia sobre quais os critérios para a caracterização da fragilidade e os parâmetros
para seu diagnóstico. Vários estudos foram e ainda estão sendo realizados para uma melhor
caracterização da síndrome, mas existe um consenso no qual ela pode ser definida como
um quadro clínico de fraqueza e vulnerabilidade em pessoas de idade avançada,
normalmente acima de 65 anos. Uma grande variedade de fenótipos é associada à
síndrome, incluindo fraqueza muscular, fragilidade óssea, fadiga, grande risco de delírio,
pressão sangüínea instável, dentre outras (Walston & Fried, 1999; Ferrucci et al., 2003;
Walston et al., 2006).
Apesar de apresentar várias características, as mais típicas residem nas alterações
quanto à organização motora, principalmente aquelas relacionadas aos sistemas muscular e
nervoso (Fried, 1992). Segundo Fried e Walston (2003), o desenvolvimento da fragilidade
pode ter sustentação em uma tríade de eventos composta por sarcopenia, desregulação
neuro-endócrina e disfunção imune.
O decréscimo na composição muscular (sarcopenia) é um componente importante
no processo da fragilidade, sendo um fator determinante para a dependência do indivíduo
(van der Beld & Lamberts, 2000). O idoso apresenta em sua musculatura tanto uma perda
de quantidade quanto de qualidade de fibras, o que pode ocasionar uma disfunção do
sistema músculo-esquelético com perda de mobilidade, força, equilíbrio e de massa óssea
(Suh e Lyles, 2003; Kinney, 2004). Fatores hormonais, inflamatórios, neurológicos e
relacionados à atividade física podem contribuir para a diminuição da atividade muscular
associada ao envelhecimento (Evans & Campbell, 1993; Vanltallie, 2003; Volpi et al. 2004).
Introdução
___________________________________________________________________________
2
Além da sarcopenia, as alterações do sistema nervoso também podem levar à
manifestação do quadro de fragilidade. De acordo com Walston et al. (2006), as interações
entre os sistemas fisiológicos e a composição corpórea são dependentes do sistema
nervoso central e periférico. Disfunções neurológicas podem afetar essa interação, o que
pode contribuir para o quadro clínico da síndrome.
Ainda, a presença de disfunção imune acarreta maior vulnerabilidade a infecções e
processos malignos (Veiga, 2006). Com o envelhecimento ocorre uma diminuição da
ativação, proliferação e desempenho dos linfócitos T, além de uma reação diminuída dos
linfócitos B a antígenos externos e um aumento em relação aos antígenos do próprio
organismo, com desenvolvimento de auto-imunidade (Hodkinson et al., 2006). A perda da
atividade ou proliferação dos linfócitos com a idade está relacionada à diminuição na
produção de interleucina-2 (IL-2) e ao aumento na quantidade de interleucina 1B e 6 (IL-1B
e IL-6) (Ershler & Keller, 2000; Hodkinson et al., 2006).
Esta tríade de alterações (Figura 1) é decorrente de modificações moleculares, tais
como alterações no nível de expressão gênica, danos oxidativos no DNA genômico e
mitocondrial, alterações oxidativas ou glicação de proteínas, encurtamentos de telômeros,
dentre outros (Linnane et al., 1989; Finch e Tanzi, 1997; Fried & Walston, 2003). Além de
eventos moleculares, outros fatores também podem contribuir para a manifestação dos
sintomas clínicos da fragilidade, como uma nutrição inadequada, baixa coordenação
cognitiva e falta de suporte social (Fried et al. 1998).
Figura 1 – Eventos moleculares, fisiológicos e clínicos no desenvolvimento da síndrome da
fragilidade (Adaptado de Walston et al. 2006).
Introdução
___________________________________________________________________________
3
Diante dos eventos desencadeadores da fragilidade, complexas vias fisiológicas
permitem uma variedade de respostas ao estresse sofrido pelo organismo. Essas respostas
irão determinar se o organismo entra em um estado de estabilidade ou vulnerabilidade, o
que ativa, neste último caso, um processo de desequilíbrio em múltiplos sistemas,
característico da fragilidade (Walston et al., 2006).
De acordo com um estudo da American Medical Association, estima-se que cerca de
10 a 25% da população idosa podem ser caracterizados como frágeis, sendo que essa
porcentagem aumenta proporcionalmente com a idade (Fried & Walston, 2003).
Devido à dificuldade de definição do que é fragilidade, vários parâmetros são
utilizados para o diagnóstico da síndrome, alguns até conflitantes. Um estudo realizado por
Fried et al., em 2001, determinou cinco critérios para avaliação da fragilidade, todos
baseados nos sintomas desses idosos. São eles: 1) Perda involuntária de peso; 2)
Exaustão ou cansaço auto-relatado; 3) Fraqueza; 4) Velocidade de marcha reduzida e
5) Baixo nível de atividade física.
Alguns trabalhos na literatura buscam a utilização de marcadores biológicos na
identificação da síndrome. Ferrucci et al. (2002) rotulam como principais marcadores os
mediadores solúveis de resposta inflamatória, hormônios, radicais livres, antioxidantes,
macro e micronutrientes. Ershler & Keller (2000) e Leng et al. (2002) relataram o aumento
da citocina inflamatória Interleucina-6 nos estágios terminais do envelhecimento,
correlacionando com a síndrome da fragilidade.
Entretanto, o estudo sobre os marcadores para identificação da fragilidade em
idosos ainda se encontra em um estágio inicial, sendo necessário um melhor entendimento
acerca dos mecanismos moleculares envolvidos e a busca de marcadores sensíveis para o
diagnóstico da síndrome.
1.2 Dano oxidativo e reparo do DNA
O dano oxidativo, que pode ser definido como lesões em componentes intracelulares
resultantes de um desequilíbrio entre a formação e a remoção de espécies reativas de
oxigênio (Reactive Oxygen Species - ROS), tem sido relacionado a inúmeras doenças
neurodegenerativas (Zana et al., 2006). Em organismos sadios ele é controlado por um
complexo e eficiente sistema antioxidante (Aguirre et al., 1997), que intercepta os radicais
livres, tornando-os menos reativos. Entre as enzimas envolvidas nesse processo podemos
citar a superóxido desmutase e a catalase (Evans et al., 2004).
Introdução
___________________________________________________________________________
4
As ROS são moléculas instáveis de oxigênio com elétrons não pareados (Rahman,
2003), que são formadas continuamente pelo metabolismo celular e por ação de fatores
exógenos, como exposição à radiação ultravioleta, drogas terapêuticas e radiações
ionizantes (Bohr, 2002). Estas moléculas podem ser radicais, como por exemplo, o ânion
superóxido (O
2
-
) e a hidroxila (•OH), ou não-radicais, como o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
(Cooke et al., 2006).
Os agentes oxidantes podem acarretar vários danos para a célula, como a oxidação
dos componentes celulares, a ativação de vias de transdução de sinais (tanto no citoplasma
quanto no núcleo), a modulação da expressão gênica e alteração na atividade da DNA
polimerase (Wiseman et al., 1995). Os alvos principais dos danos oxidativos incluem o DNA,
os lipídeos e as proteínas, sendo que vários fatores podem direcionar a oxidação para estes
componentes, como o local de produção das ROS, o potencial da célula em termos de alvo
para oxidação e a presença de íons metálicos (Evans et al., 2004).
O radical hidroxila (•OH) é considerado a ROS que mais causa danos ao DNA,
podendo atingir as bases, incorporando-se na fita dupla de DNA e liberando um átomo de
hidrogênio (von Sonntag, 1987). Um importante produto gerado pelo dano oxidativo no DNA
é a 8-oxoguanina (8-oxoG), que sofre modificações e se pareia com a adenina, causando
mutações por transversão (Shibutani et al., 1991). Adicionalmente, a glicoltimina (TG)
também pode ser formada (Maki & Sekiguchi, 1992), sendo que esta bloqueia a duplicação
do DNA (Ide et al., 1985; Clark & Beardsley, 1987) e a transcrição (Htun & Johnston, 1992;
Hatahet et al., 1994).
Um aumento no nível de 8-oxoG nas células está associado à formação de tumores,
devido a mutações por transversão G para T que, se não reparadas no DNA, podem levar
ao desenvolvimento do câncer. A hidroxilação de outras bases também ocorre, mas com um
menor potencial carcinogênico (Remmen et al., 2003).
O reparo por excisão de base (Base Excision Repair - BER) é o sistema de reparo
mais importante na remoção da 8-oxoG e TG (Bohr, 2002), embora outros tipos de reparo
possam ocorrer, como o NER (Nucleotide Excision Repair – NER), MMR (Mismatch Repair),
HR (Homologous Repair) e NHEJ (Non Homologous End-Joining) (Slupphaug et al., 2003;
Bassi et al., 2004).
O BER (Figura 2) é considerado o processo mais importante no reparo da maioria
dos danos ao nível das bases do DNA, sendo que cerca de 90% das bases oxidadas são
removidas por esse processo (Valko et al., 2006), que envolve a ação de uma glicosilase,
deixando um sítio apurínico-apirimidinico (AP) (Cooke et al., 2003). Subseqüentemente à
remoção da base, o reparo pode ser completado por duas vias: uma curta, com a remoção
Introdução
___________________________________________________________________________
5
de apenas um nucleotídeo, ou uma via longa, com dois a dez nucleotídeos sendo
removidos. A ocorrência de uma ou outra via depende de vários processos, incluindo o tipo
de glicosilase envolvida, a natureza do sítio AP resultante, dentre outros (Slupphaug et al.,
2003). A principal glicosilase responsável por remover a 8-oxoG em humanos é a OGG1,
que atua no BER de via curta (Cooke et al., 2006).
Após a liberação do sítio AP, uma endonuclease (APE1) produz uma quebra na
ligação fosfodiéster nesse local, onde uma DNA polimerase β (Pol β) complementa o
nucleotídeo que está faltando e a DNA ligase III-XRCC1 sela o processo (Bohr, 2002). Em
um mecanismo alternativo, a via longa de BER, a APE1 cliva o sítio AP, e várias proteínas
de DNA Pol δ / ε, PCNA e FEN1 atuam para realizar o reparo. A FEN1 é uma endonuclease
que corta a fita de DNA a partir da região 3’ da quebra, liberando os nucleotídeos, sendo
que as Pol δ e Pol ε atuam para preencher a falha remanescentes das bases excisadas. A
DNA ligase I completa a via ligando os fragmentos (Sancar et al., 2004).
Figura 2 – Principais vias do reparo por excisão de bases (BER). A e B – vias curtas e C –
longa. Modificado de Bohr (2002).
A maquinaria do NER é ativada quando o DNA sofre um dano que distorce a sua
estrutura helicoidal (Fuss & Cooper, 2006). Essa via de reparo consiste nas seguintes
etapas: (1) reconhecimento do dano (proteínas XPC, XPA e RPA); (2) dupla incisão (antes e
após a lesão) e remoção de 24-32 nucleotídeos no caso de eucariotos; (3) liberação do
oligonucleotídeo; (4) síntese de DNA; (5) ligação (Sancar et al., 2004). Esta via de reparo
ocorre principalmente quando os danos são causados pela exposição à luz UV e por
Introdução
___________________________________________________________________________
6
agentes que induzem aductos no DNA, mas foi demonstrada em pacientes com Xeroderma
Pigmentosum que ela também atua em resposta a danos oxidativos (Evans et al., 2004).
Uma outra via complementar também é capaz de auxiliar na remoção de danos
causados por ROS, conhecida como via de reparo de bases mal-pareadas (Mismatch
Repair – MMR), que consiste na remoção do pareamento errôneo 8-oxoG:A pelas proteínas
do MMR (Russo et al., 2007). Nesse processo, a glicosilase hMYH remove a adenina oposta
ao 8-oxoG, auxiliando a OGG1 no reparo da lesão (Cooke et al., 2006).
A ação das ROS (tanto no DNA quanto na própria célula) tem sido associada à
várias doenças neurodegenerativas e ao câncer. Alguns casos de grande acúmulo de danos
oxidativos foram relatados para pacientes com Síndrome de Down (Zana et al., 2006) e
Alzheimer (Mecocci et al., 1994; Gabbita et al., 1998), além de pacientes com diabetes,
Parkinson e demência, entre outros. Adicionalmente, os mecanismos ligados ao dano
oxidativo possuem grande potencial na iniciação, promoção e progressão de tumores. O
risco de desenvolvimento do câncer está associado ao acúmulo de dano oxidativo,
principalmente em idosos. Lesões do tipo 8-oxoG possuem um grande potencial
mutagênico, sendo utilizadas como biomarcadores de dano oxidativo.
1.3 Dano oxidativo e envelhecimento
ROS e muitos outros agentes que causam danos no DNA, tais como radiações,
quimioterápicos, dentre outros, podem levar a célula a um estado irreversível de bloqueio no
ciclo celular, além de alterações nas características morfológicas e funcionais, estado
denominado senescência. Segundo Bem-Porath & Weinberg (2004), a indução da
senescência depende de vias envolvendo principalmente as proteínas TP53 e RB;
entretanto, atualmente, muitas outras proteínas têm sido descritas como atuantes nesse
processo.
Harman (1956) propôs a teoria dos radicais livres, na qual o envelhecimento
ocorreria pelo do acúmulo gradual de danos em biomoléculas causados por radicais livres.
Posteriormente, com a descoberta de outros tipos de ROS (como por exemplo, os
peróxidos) diferentemente dos radicais livres, que também causam algum tipo de estresse
oxidativo para as células, este postulado passou a ser chamado de teoria do dano oxidativo
(Bokov et al., 2004).
Com o envelhecimento, vários mecanismos relacionados ao dano oxidativo sofrem
modificações, sendo que as alterações mais importantes são a diminuição da defesa
antioxidante e do sistema de reparo, aumento da produção de ROS e o acúmulo dos
produtos finais do dano oxidativo (Beckman & Ames, 1998).
Introdução
___________________________________________________________________________
7
Apesar de vários estudos demonstrarem a existência de uma relação entre os danos
causados por ROS e o envelhecimento, os resultados ainda são controversos. Segundo Van
Remmen et al. (2003) as discrepâncias observadas podem resultar de problemas
metodológicos na mensuração do dano, como a oxidação por artefatos durante a extração
do DNA.
Assim, o metabolismo anaeróbico e a geração de ROS têm sido considerados
fatores importantes implicados no envelhecimento, sendo relevante a investigação dos
mecanismos que desencadeiam ou aceleram o envelhecimento, bem como o papel dos
danos oxidativos e do sistema de defesa antioxidante nesse processo.
Além disso, poucos trabalhos na literatura correlacionam a ação dos agentes
genotóxicos com o envelhecimento e doenças relacionadas à idade, não sendo conhecido
se os pacientes idosos com a síndrome da fragilidade possuem susceptibilidade maior à
ação de agentes físicos e químicos, ou mesmo se esta pode ser correlacionada à eficiência
dos mecanismos de reparo do DNA. Sendo assim, um estudo sobre os efeitos da exposição
a agentes genotóxicos em tais pacientes, comparados aos indivíduos sadios, torna-se
imprescindível.
O peróxido de hidrogênio é um agente genotóxico que é transformado em radicais
hidroxil por um processo não-enzimático, na presença de metais como ferro (Fe
2
) ou cobre
(Cu
2
), chamado de reação de Fenton. O radical hidroxil é extremamente mutagênico e induz
danos no material genético como quebras de fita simples e dupla, sítios álcali-lábeis e a
oxidação, tanto de purinas como pirimidinas (Joenje, 1989).
.
Objetivos
___________________________________________________________________________
8
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
O objetivo geral deste trabalho foi detectar alterações genéticas em linfócitos de
pacientes idosos que apresentam a síndrome da fragilidade, através da associação de
diversas técnicas moleculares, visando testar a hipótese de que os portadores dessa
doença possuem material genético mais sensível a modificações endógenas (danos
oxidativos) e exógenas (induzidas por um agente genotóxico), além de apresentarem perfis
de expressão gênica diferenciada para determinadas classes de genes, com um enfoque
adicional direcionado a alguns genes de reparo do DNA (via BER).
2.2 Objetivos Específicos
a)
Determinar os padrões de expressão gênica diferencial em linfócitos de pacientes idosos
apresentando a síndrome da fragilidade (pelo método de microarranjos de cDNA), visando
detectar grupos ou classes de genes relacionados ao envelhecimento e respostas ao dano
oxidativo induzido no DNA;
b)
Analisar a expressão gênica transcricional (por qPCR em tempo real) para alguns genes
de interesse, como SOD1, e genes participantes dos processos de reparo do DNA pela via
BER (XRCC1, APEX1, FEN1 e OGG1), bem como alguns genes que se apresentarem
modulados, indicados pela análise de expressão gênica diferencial;
c)
Detectar e quantificar, por meio do ensaio do cometa, danos oxidativos (ao nível basal e
induzido por enzima hOGG1) no DNA de linfócitos de pacientes com a síndrome,
comparativamente ao grupo controle;
d)
Avaliar as respostas celulares (por meio da técnica do cometa) dos linfócitos de pacientes
submetidos a tratamento in vitro com o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), em comparação ao
grupo controle, observando a dinâmica de reparo dessas células em tempos subseqüentes
ao tratamento.
Material e Métodos
___________________________________________________________________________
9
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Grupo de pacientes
A seleção dos pacientes foi realizada no Ambulatório de Geriatria (AGER) do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo (HC-FMRP / USP), na Unidade Básica de Saúde (Centro Saúde Escola) do Monte
Alegre – Ribeirão Preto e no Asilo “Casa do Vovô”, sob a supervisão do Prof. Dr. Eduardo
Ferrioli e sua equipe médica. Os pacientes incluídos no grupo, com idade acima de 70 anos,
de ambos os sexos, foram recrutados no ambulatório com base na avaliação de 5
parâmetros descritos por Fried et al. (Walston et al., 2006; Fried e Walston, 2003 e Ferrucci
et al., 2004), que possam caracterizar os fenótipos da síndrome: 1) Perda de peso não
intencional (≥ 4,5kg ou ≥ 5% do peso corporal no ano anterior); 2) Exaustão avaliada por
auto-relato de fadiga, indicado por duas questões da Center for Epidemiological Studies –
Depression (CES-D); 3) Diminuição da força de preensão medida com dinamômetro na mão
dominante e ajustada ao sexo e ao índice de massa corporal (IMC); 4) Baixo nível de
atividade física medido pelo dispêndio semanal de energia em quilocalorias, ajustado
segundo o sexo (com base no auto-relato das atividades e exercícios físicos realizados,
avaliados pelo Minnesota Leisure Time Activities Questionnaire); 5) Lentidão medida pela
velocidade da marcha indicada em segundos (distância de 4,6 m, ajustada segundo sexo e
altura). Pessoas com três ou mais dessas características seriam classificadas como frágeis
e as com uma ou duas características como pré-frágeis.
Foram excluídos os pacientes que apresentaram co-morbidades, tais como câncer
de qualquer tipo e diabetes, algum tipo de déficit cognitivo ou demência, bem como
infecções e outras doenças de natureza aguda, que estavam sob tratamento.
Uma amostra de 20 ml de sangue foi coletada de cada paciente, por punção venosa,
na ocasião em que estes foram atendidos no ambulatório, sendo imprescindível a
autorização voluntária para participar da pesquisa, perante a assinatura do termo de
consentimento.
Para a seleção do grupo controle, composto por indivíduos que não apresentaram a
síndrome estudada, foram realizados os mesmos procedimentos descritos acima para os
pacientes. O presente trabalho foi submetido e aprovado pelo comitê de Ética em pesquisa
do HC-FMRP-USP (Proc. HCRP nº 13126/2006).
Material e Métodos
___________________________________________________________________________
10
3.2 Cultivo de células
As amostras de sangue de cada paciente e do grupo controle foram coletadas por
meio uma seringa e posteriormente divididas entre tubos Vacutainer (Beckton & Dickson,
EUA) com heparina sódica e EDTA, sendo subdividido para as diversas metodologias que
foram utilizadas no presente trabalho.
O material conservado em heparina sódica foi utilizado para as análises de danos e
reparo no material genético. Uma alíquota de sangue total (aproximadamente 5 ml) foi
separada para cultivo e estudo de indução de danos por agente genotóxico (H
2
O
2
). As
células foram cultivadas durante 24 horas em meio RPMI 1640 (10,4g RPMI -Sigma
Chemical Co., St. Louis, USA - contendo 0,005 g de penicilina (Sigma), 0,01g de
estreptomicina (Inlab) e água q.s.p. 1000ml) suplementado com soro fetal bovino a 20%
(Cultilab). A proliferação dos linfócitos foi estimulada por fitohemaglutinina a 2%. Além disso,
cerca de 300 µl sangue em heparina foi utilizada para as análise de danos basais e
induzidos pela enzima hOGG1, por meio da metodologia do cometa.
A enzima hOGG1 é específica para danos oxidativos, em particular, aqueles que
ocorrem na guanina formando a 8-oxoG, que é extremamente mutagênica (Bouteux &
Radicella, 2000). Quando associada ao ensaio do cometa, um aumento na quantidade de
danos no material genético, comparativamente ao basal, será decorrente de danos
oxidativos, sendo esta enzima uma importante ferramenta para a avaliação destas lesões.
3.3 Ensaio do Cometa
Para a análise de danos basais e tratados com enzima hOGG1 foram realizados 16
experimentos por meio do ensaio do cometa, em amostras de sangue de 8 pacientes e 8
indivíduos controles. O método foi realizado de acordo com o proposto por Singh et al.
(1998), com algumas modificações. Foram adicionados 50 µL da cultura de linfócitos a um
volume de 200 µL de agarose de baixo ponto de fusão (37°C) 0,5%. Essa suspensão celular
foi distribuída em uma lâmina recém preparada com uma camada de agarose de ponto de
fusão normal (1,5%) e coberta com uma lamínula, sendo, em seguida, incubada a 4ºC por 5
minutos. A lamínula foi retirada e a lâmina então mergulhada em uma solução de lise a 4ºC
(NaCl 2,5 M, Na
2
EDTA 100 mM, Tris 10 mM, Triton X-100 1% e DMSO 10%, pH=10,0) por
pelo menos duas horas.
Posteriormente à lise, as lâminas foram imersas, 2 vezes, em tampão F [(HEPES 40
mM; KCl 0,1 M; EDTA 0,5 mM e 0,2 mg/mL (pH= 8.0)] por 5 minutos cada e à temperatura
ambiente. A enzima hOGG1 foi diluída em 50 µL de tampão F, em diluições estabelecidas
para a aquisição da maior percentagem de quebras possíveis, resultado do reconhecimento
Material e Métodos
___________________________________________________________________________
11
do dano oxidativo por parte da enzima. Esta diluição foi equivalente à cerca de 0,08 U por
lâmina. Em seguida, as lâminas foram cobertas por lamínulas e incubadas em uma câmara
úmida por 20 minutos a 37°C.
As lâminas foram, então, colocadas numa cuba para eletroforese contendo um
tampão de pH alcalino (NaOH 0,3 M e Na
2
EDTA 1 mM, pH > 13) durante 20 minutos, após
os quais teve início uma eletroforese a 25 V (1 V/cm, 300 mA) por mais 20 minutos a 4ºC.
Após este tempo, as lâminas foram imersas em solução tampão de neutralização (Tris-HCl
0,4 M, pH=7,5) durante 15 minutos, secas e fixadas em etanol absoluto por alguns
segundos. A coloração utilizada foi 50 µL de iodeto de propídeo (10 mg/mL) e a análise foi
realizada em microscópio de fluorescência, sendo analisadas 50 células por
indivíduo/tratamento.
Para a análise de sensibilidade à indução de dano oxidativo e capacidade de reparo
de danos, outros 16 experimentos foram conduzidos para a avaliação de quebras no
material genético de linfócitos, em amostras de sangue de 8 pacientes e 8 indivíduos
controles, por meio da metodologia do cometa.
O tratamento com H
2
O
2
(agente indutor de dano oxidativo) ocorreu 24 horas após o
inicio da cultura, tendo duração de uma hora, onde uma amostra foi retirada, caracterizando
o tempo 0 (T0), logo após a exposição ao químico. As culturas restantes foram lavadas com
meio RPMI puro por duas vezes, sendo novamente re-incubadas em meio completo. Duas
outras alíquotas foram amostradas, duas e quatro horas após a retirada da droga (T1 e T2,
respectivamente), para a avaliação de danos no DNA. O ensaio do cometa foi realizado
como descrito acima, sem a adição da enzima hOGG1.
A concentração utilizada de H
2
O
2
nesses experimentos foi de 30 µM, sendo definida
após uma série de testes, mostrando ser suficiente para causar dano sem levar os linfócitos
à morte celular.
3.4 Forma de análise dos danos no DNA pelo ensaio do Cometa
Foram analisadas 50 células/cultura/indivíduo, sendo contadas as células que
apresentaram um contorno circular (núcleos sem danos de DNA) ou em forma de “cometa”
(núcleos com danos no DNA), no qual a extensão da cauda reflete a distância de migração
da fita de DNA danificada. Para tal, foi utilizado um microscópio de fluorescência (ZEISS,
filtro 516-560nm e barreira de filtro de 590 nm), em aumento de 40x.
A quantificação do dano foi realizada por meio de um software gratuito
CometScore
TM
versão 1.5 (TriTrek Corp./USA), sendo que dois parâmetros foram
Material e Métodos
___________________________________________________________________________
12
selecionados para estudo estatístico, a porcentagem de DNA na cauda do cometa e o
momento da cauda (Tail moment).
Os dados foram submetidos a testes estatísticos de acordo com o tamanho da
amostra e a abordagem pretendida. Dois testes foram utilizados no presente trabalho, o
teste t pareado, que compara o nível de semelhança ou diferença entre duas amostras e o
teste two way ANOVA, que avalia a interação entre dois fatores que envolvam diversas
categorias.
3.5 Extração de RNA total
Uma alíquota do sangue coletado foi utilizada para extração do RNA total. Os
linfócitos foram separados através de centrifugação com Ficoll e lavados com solução salina
0,9% estéril. Após a separação, foi adicionado 1ml de Trizol
®
Reagent (Invitrogen) para cada
5ml de sangue coletado. O material foi homogeneizado e em seguida adicionado 200 µl de
clorofórmio para cada 1ml de Trizol
®
, sendo esta mistura agitada vigorosamente por 15
segundos e mantida em repouso a temperatura ambiente por 3 minutos. As amostras foram
submetidas à centrifugação a 12000g durante 15 minutos a 4ºC, sendo a fase aquosa
resultante do processo transferida para um novo tubo. O RNA foi precipitado com
isopropanol, coletado através de centrifugação 12000g por 10 minutos e lavado 3 vezes com
etanol 70%. As amostras foram eluídas em 16 µl de água DEPC (Dietil Pirocarbonato – livre
de RNAse).
As amostras foram quantificadas no espectrofotômetro NanoDrop ND1000
(NanoDrop Tecnologies) nos comprimentos de onda 230nm, 260nm e 280nm. A pureza do
RNA foi avaliada pelas razões A
260
/A
280
, onde o ideal são valores próximos a 2.0,
demonstrando ausência de contaminação por proteínas e DNA, e A
260
/A
230
, onde valores
inferiores a 1.7 ou superiores a 2.2 demonstram contaminação por compostos orgânicos,
tais como o fenol. A integridade do RNA foi avaliada através de eletroforese em gel de
agarose com formaldeído, corados com brometo de etídeo (0,2mg/ml) e visualizadas por um
transluminador UV.
3.6 Preparação das lâminas de cDNA microarrays
Para avaliação da expressão gênica em larga escala, foram utilizadas lâminas de
vidro onde foram depositadas, através de um robô Array Spotter Generation III (Amersham
Biosciences), 4500 seqüências gênicas em duplicata, provenientes do “IMAGE Consortium”
(http://image.llnl.gov), gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Geraldo A.S. Passos (FORP-USP
Material e Métodos
___________________________________________________________________________
13
Ribeirão Preto) e pela Dra. Catherine Nguyen do Centr d’Immunologie Marseille – Luminy,
Marseille, França.
3.7 Preparação das sondas de cDNA e hibridação na lâmina
As sondas complexas de cDNA forma preparadas a partir de leucócitos de 10
pacientes portadores da síndrome da fragilidade e de 12 indivíduos sadios, sendo que
nestes últimos foi realizado três pools com quantidades equivalentes de RNA, cada um com
amostras de 4 pacientes (Figura 3). A concentração final de cada amostra, tanto para os
pacientes quanto para o pool de controles foi de 10 g de RNA total.
Figura 3 – “Pooling” de amostras de RNA controles para análise em lâminas de microarrays.
Para garantir que não ocorreram diferenças na incorporação do corante, um pool de
referência composto de RNA extraído de 4 linhagens diferentes (U343 MG-a, linhagem de
glioma humano; HeLA, carcinoma cervical; Jurkat, célula T-leucêmicas e Hep-2, tumoral de
faringe) foi adicionado e marcado de coloração diferente aos indivíduos estudados. Este
pool se torna importante para a normalização dos dados, uma vez que possui a totalidade
dos transcritos inseridos na lâmina de microarray.
Na preparação das sondas, foi utilizado o kit Amersham CyScribe Post-Labelling (GE
Healthcare), marcando a amostra com o corante Cy3 e o pool de referência com Cy5. Dois
processos estão envolvidos na confecção das sondas: o primeiro envolve a síntese de
Material e Métodos
___________________________________________________________________________
14
cDNA, adição de um nucleotídeo modificado (aminoalil-dUTP ou AA-dUTP), purificação do
cDNA para remoção de nucleotídeos livres através de colunas CyScribe GFX (GE
Healthcare). O segundo processo envolve a incorporação do corante no grupamento AA-
dUTP (Cy3 para os grupos de estudo e Cy5 pool de referência).
A hibridação das sondas nas lâminas de microarrays foi realizada de forma
automática, durante quinze horas a 42ºC num processador Lucidea Automated Slide
Processor – ASP (Amersham Biosciences). Após a hibridação, as lâminas foram lavadas,
secadas e analisadas em um escâner GenePix 4000b (Axon) para aquisição das imagens.
Todos os processos foram realizados de acordo com o protocolo que acompanha os
reagentes.
3.8 Forma de análise de expressão gênica por microarrays
As imagens obtidas foram processadas pelo software Spotfinder da TIGR
(www.tm4.org/spotfinder), que quantificou o sinal obtido em cada ponto, gerando arquivos
de texto na extensão .tav. Estes foram submetidos ao ambiente estatístico R (www.r-
project.org), que normalizou os dados, removendo diferenças de incorporação dos
fluorocromos (Ihaka & Gentleman, 1996).
Após normalização, os dados foram exportados na extensão .mev e analisados pelo
pacote estatístico MEV – MultiExperiment Viewer, da TIGR (www.tm4.org/mev). Os dados
foram submetidos à análise SAM (Significance Analysis of Microarray), que avalia os grupos
de estudo e agrupa os genes diferencialmente expressos. Foi utilizada uma forma análoga
ao teste t, com duas classes não pareadas, e os genes foram agrupados com um FDR
(False Discovery Rate) menor que 1%. O FDR é utilizado para quantificar o erro da amostra
como um todo e posteriormente aplicado para ajustar os valores p estatísticos para
expressão do erro (Smyth, 2004).
As informações sobre a localização dos genes e suas funções biológicas foram
obtidas a partir de S.O.U.R.C.E. (http://smd.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch) e
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Os genes modulados foram funcionalmente agrupados por meio da ferramenta
DAVID-NIH (Dennis et al. 2003) (http://david.abcc.ncifcrf.gov), que gera uma matriz de
similaridade gene-a-gene baseado em um banco de dados com cerca de 75.00 termos de
14 fontes funcionais.
Material e Métodos
___________________________________________________________________________
15
3.9 Avaliação da expressão gênica por RT-PCR quantitativa (qPCR) em tempo real
A expressão gênica dos genes realizadas por qPCR em tempo real foi realizada com
os genes relacionados com o reparo das lesões oxidativas (FEN1, APEX1, SOD, XRCC1 e
OGG1).
O RNA anteriormente extraído foi convertido para cDNA por meio de reações de
transcriptase reversa de acordo com protocolo padrão. Para a qPCR real time, foi utilizado o
kit SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) e as reações foram realizadas
com um mix de volume final 15 µl, sendo 7,5 µl de PCR Master Mix, 0,75 µl do primer
forward e 0,75 µl do primer reverse (ambos com solução estoque 10 µM), 5,4 µl de água
livre de RNAse e 0,6 µl do cDNA da amostra.
As reações foram montadas e seladas em placas de 96 poços, sendo em seguida
utilizado um programa de 40 ciclos, com um período de incubação (2 min a 50ºC), ativação
da Taq (10 min a 95ºC), denaturação do cDNA (15 segundos a 95ºC), anelamento dos
primers (1 min a 60ºC) e resfriamento (10 min a 4ºC).
Tabela 1: Sequência de primers utilizados nas reações de qPCR em tempo real
Gene Primer Forward Primer Reverse
FEN1
5’-CCAGCTCTTCTTGGAACCTG-3’ 5’-CGCTCCTCAGAGAACTGCTT-3’
APEX1
5’-ATATTGCTTCGGTGGGTGAC-3’ 5’-GCTCTGTCCTGAGCTCATCC-3’
XRCC1
5’-CCCTGAAGAGACCAAAGCAG-3’ 5’-TCCTCTGTCTCCCCAGAATC-3’
SOD
5’-GGCAAAGGTGGAAATGAAGA-3’ 5’-GGGCCTCAGACTACATCCAA-3’
OGG1
5’-AAGAAATTCCCCAAGCACCT-3’ 5’-CCTGGCCTTTGAGGTAGTCA-3’
3.9 Avaliação da expressão gênica por RT-PCR quantitativa (qPCR) em tempo real
Os valores de C
T
(Cycle Threshold) obtidos pela análise comparativa do grupo de
pacientes com o controle foram utilizados para avaliar a expressão gênica. Os valores
numéricos de C
T
são inversamente proporcionais à quantidade de RNA na amostra. Os
resultados de todos os genes testados foi subtraído daqueles obtidos para o gene
constitutivo, gerando um delta ∆C
T
, utilizado para a formação do ∆∆C
T
. Este último nos
fornece o valor RQ como mostra o esquema abaixo:
∆C
T
= C
T(gene)
– C
T(constitutivo)
∆∆C
T
= ∆C
T
– ∆C
T(calibrador)
RQ = 2
-∆∆Ct
Resultados
___________________________________________________________________________
16
4. RESULTADOS
4.1 Análise de danos no DNA pelo ensaio do cometa
O estudo foi realizado com 16 indivíduos, sendo 8 caracterizados como portadores
da síndrome da fragilidade, com média de idade de 78 anos, e 8 controles, com média de 76
anos. Foi utilizado o ensaio do cometa em duas situações: a) para avaliar a quantidade
basal de danos em linfócitos dos indivíduos com utilização da enzima hOGG1, específica
para danos oxidativos; b) para avaliação da sensibilidade dos linfócitos frente ao tratamento
com um agente genotóxico (peróxido de hidrogênio), bem como a capacidade de reparo
deduzida a partir de dados obtidos em diferentes tempos.
4.1.1 Análise de danos no DNA basais e tratados com a enzima hOGG1
Os resultados obtidos na análise dos danos basais e sob tratamento com a enzima
hOOG1 nos linfócitos dos indivíduos envolvidos na pesquisa. Quando submetidos ao teste
estatístico two way ANOVA e procedimento de comparação múltipla Holm-Sidak, foi
encontrada uma diferença significativa (p < 0,05) entre a quantidade de danos basais e
danos avaliados sob tratamento com a enzima hOGG1 nos indivíduos controle e nos
pacientes, nos três parâmetros analisados (porcentagem de DNA na cauda, Tail Moment e
Olive Moment) (Tabela 2, Figura 4).
Não houve diferença entre os grupos controle e paciente quando comparados em
relação ao dano basal, mas nos ensaios realizados com a hOGG1, ambos os grupos
apresentaram níveis de danos significativamente maiores (p<0,05) que os do controle
(Tabela 2; Figura 4). Nenhuma das variáveis apresentadas pela metodologia do cometa
passou pelo teste de normalidade e igualdade de variâncias.
Os resultados obtidos para o controle positivo (lâmina diretamente tratada com
H
2
O
2
), mostraram uma quantidade maior de danos em relação aos outros grupos,
demonstrando a eficiência do método para a detecção de danos no DNA (Tabela 2; Figura
4).
Resultados
___________________________________________________________________________
17
Tabela 2 – Valores de médias de danos obtidos no DNA de linfócitos dos grupos estudados
para as diversas variáveis: Porcentagem de DNA na cauda, Tail Moment e Olive Moment.
CP = controle positivo; DP = desvio padrão e EP = erro padrão.
Grupos Tratamento
Danos no DNA
Média DP± EP
% DNA 2,98
0,72
0,18
Basal Tail Moment 0,92
0,74
0,19
Olive Moment 1,92
0,52
0,13
% DNA 5,41
1,13
0,28
Controles Enzima Tail Moment 5,02
2,23
0,56
Olive Moment 5,51
1,85
0,46
% DNA 6,98
0,64
0,44
H2O2 CP Tail Moment 7,65
1,98
1,22
Olive Moment 7,02
1,62
0,74
% DNA 2,72
0,77
0,19
Basal Tail Moment 1,11
0,73
0,18
Olive Moment 2,06
0,55
0,14
% DNA 7,44
2,85
0,71
Pacientes Enzima Tail Moment 9,55
5,85
1,46
Olive Moment 8,08
4,18
1,04
% DNA 7,95
0,84
0,33
H2O2 CP Tail Moment 10,16
2,52
0,89
Olive Moment 8,35
1,24
0,68
Resultados
___________________________________________________________________________
18
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Basal Enzima H2O2 CP
% de DNA na cauda
Controles
Pacientes
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
Basal Enzima H2O2 CP
Tail Moment
Controles
Pacientes
Figura 4 – Porcentagem de DNA (A) e Momento da cauda (Tail Moment) (B) obtidos no
ensaio do cometa nos grupos controle e pacientes em três condições: basal, tratados com
enzima hOGG1 e no controle positivo com H
2
O
2.
Os dados estão representados como média
± desvio padrão. * Diferença significativa (p<0,05).
4.1.2 Análise de sensibilidade e reparo de danos no material genético
Nos experimentos realizados in vitro para a avaliação de sensibilidade a um agente
genotóxico e capacidade de reparo do DNA, observou-se que os linfócitos dos pacientes e
controles responderam de maneira diferenciada para os três parâmetros estudados
aplicando-se a metodologia do cometa (% de DNA, Tail moment). Esses valores foram
observados 1 hora após a exposição ao peróxido de hidrogênio na ausência de um período
de recuperação (T0). Tanto no parâmetro momento da cauda quanto na porcentagem de
DNA na cauda, os linfócitos dos pacientes apresentaram uma diferença significativa (p <
0,05) logo após o tratamento com H
2
O
2
(T0, na ausência de um período de recuperação)
*
*
*
*
A
B
Resultados
___________________________________________________________________________
19
comparados com os indivíduos do controle, quando os dados foram analisados pelo teste
two way ANOVA e procedimento de comparação múltipla Holm-Sidak (Tabelas 3 e 4,
Figura 5 e 6).
Tabela 3 – Médias de danos no DNA (Tail Moment) resultantes da avaliação in vitro de
sensibilidade a um agente genotóxico e reparo do DNA. C = controle, DP = desvio padrão,
EP = erro padrão, T0 = 1 hora de exposição ao peróxido de hidrogênio e T1 e T2 duas e
quatro horas de recuperação, respectivamente.
Grupos Tratamento
Média DP EP
C T0 2,6226
1,7085
0,4271
C T1 2,6141
1,5453
0,3863
Controle
C T2 3,1202
1,6584
0,4146
H
2
O
2
T0 8,6402
1,9951
0,4988
H
2
O
2
T1 5,7593
1,5109
0,3777
Controles
H
2
O
2
H
2
O
2
T2 2,0515
0,8236
0,2059
C T0 1,8614
0,6154
0,1539
C T1 2,1847
1,6204
0,4051
Controle
C T2 1,8217
0,9523
0,2381
H
2
O
2
T0 12,7799
3,0377
0,7594
H
2
O
2
T1 9,4186
2,1052
0,5263
Pacientes
H
2
O
2
H
2
O
2
T2 6,9402
2,6843
0,6711
Figura 5 – Momento da cauda (Tail Moment) obtido no ensaio do cometa nos diversos
grupos controle e tratados. C = controle, T0 = logo após exposição ao peróxido de
hidrogênio e T1 e T2 duas e quatro horas de recuperação, respectivamente. Os dados estão
representados como média ± desvio padrão. * Diferença significativa (p<0,05).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
C T0 C T1 C T2 H2O2 T0 H2O2 T1 H2O2 T2
Tail Moment
Controles
Pacientes
*
*
Resultados
___________________________________________________________________________
20
Em contrapartida, embora haja diferenças entre os tratamentos, estas não foram
significativas quanto ao reparo dos danos causados no DNA pelo hidróxido de oxigênio
entre os intervalos de tempo (T0xT1; T1xT2), sendo o teste t pareado utilizado para esta
análise (Tabela 3 e 4; Figura 5 e 6).
Tabela 4 – Médias de danos no DNA (Porcentagem de DNA na cauda) resultantes da
avaliação in vitro de sensibilidade a um agente genotóxico e reparo do DNA. C = controle,
DP = desvio padrão, EP = erro padrão, T0 = 1 hora de exposição ao peróxido de hidrogênio
e T1 e T2 duas e quatro horas de recuperação, respectivamente.
Grupos Tratamento
Média DP± EP
C T0 4,4443
1,3761
0,344
C T1 3,7068
0,9905
0,2476
Controle
C T2 3,9933
1,2465
0,3116
H
2
O
2
T0 7,6015
1,6009
0,4002
H
2
O
2
T1 5,3782
1,0104
0,2526
Controles
H
2
O
2
H
2
O
2
T2 3,9662
1,2034
0,3009
C T0 4,2399
1,3977
0,3494
C T1 3,6126
0,6173
0,1543
Controle
C T2 3,2661
0,8281
0,207
H
2
O
2
T0 9,9578
2,0089
0,5022
H
2
O
2
T1 6,7071
0,6655
0,1664
Pacientes
H
2
O
2
H
2
O
2
T2 5,8614
0,9883
0,2471
Figura 6 – Porcentagem de DNA na cauda do cometa nos diversos grupos controle e
tratados. C = controle, T0 = logo após exposição ao peróxido de hidrogênio e T1 e T2 duas
e quatro horas de recuperação, respectivamente. Os dados estão representados como
média ± desvio padrão. * Diferença significativa (p<0,05).
0
2
4
6
8
10
12
14
C T0 C T1 C T2 H2O2 T0 H2O2 T1 H2O2 T2
% DNA na cauda
Controles
Pacientes
*
*
Resultados
___________________________________________________________________________
21
Quando avaliada a quantidade de danos quatro horas após a remoção do peróxido
de hidrogênio (T2), os dados apresentaram uma diferença significativa (p < 0,05) para os
dois parâmetros analisados no ensaio do cometa, avaliados pelo teste two way ANOVA e
procedimento de comparação múltipla Holm-Sidak. Assim, após duas horas, os resultados
mostram uma retomada à quantidade de dano próxima ao valor inicial (antes do tratamento)
nos indivíduos do grupo controle e uma menor capacidade de reparo apresentada pelos
pacientes com a síndrome estudada (Figuras 5, 6 e 7).
Resultados
___________________________________________________________________________
22
Figura 7 – Dinâmica de reparo – Porcentagem de DNA na cauda (A) e Tail Moment (B) do
ensaio do cometa nos diversos grupos controle e tratados. C = grupo controle, Co = controle
do experimento, P = grupo de pacientes; T0 = logo após exposição ao peróxido de
hidrogênio e T1 e T2 duas e quatro horas de recuperação, respectivamente. Os dados estão
representados como média ± desvio padrão.
0
2
4
6
8
10
12
14
T0 T1 T2
% de DNA na cauda
C Co
C H2O2
P Co
P H2O2
A
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
T0 T1 T2
Tail Moment
C Co
C H2O2
P Co
P H2O2
B
Resultados
___________________________________________________________________________
23
4.2 Análise de genes relacionados com o reparo de lesões oxidativas por qRT-PCR em
tempo real
Para os experimentos de expressão gênica por RT-qPCR, foram utilizados os RNAs
extraídos de linfócitos de 10 pacientes portadores da síndrome estudada e de 10 indivíduos
do grupo controle, com idades médias de 79 e 77 anos de idades respectivamente.
Foi avaliada a expressão de alguns genes relacionados ao reparo de danos
causados por agentes oxidativos, pertencentes à via BER (FEN1, XRCC1, APEX1 e OGG1),
e de um gene (SOD) relacionado ao catabolismo destes agentes. Os RNAs extraídos dos
linfócitos de pacientes e indivíduos controles foram submetidos a uma RT-PCR para
transformação em cDNAs, sendo a eficiência desta reação testada com um gene
constitutivo, o 18S.
Entre os genes relacionados ao reparo do DNA, apenas FEN1 apresentou um certo
nível de expressão em relação aos indivíduos controle (Fold Change = 0,18). Os outros
genes avaliados para a via de reparo BER, XRCC1, APEX1 e OGG1, demonstraram uma
expressão gênica reprimida (FC = -0,39; -0,65 e -0,95, respectivamente) (Figura 8).
Adicionalmente, foi avaliada a expressão do gene SOD, responsável pela produção
de uma proteína que catalisa algumas espécies reativas de oxigênio (em particular o
superóxido) em oxigênio e hidróxido de oxigênio. O gene SOD apresentou-se induzido na
comparação de pacientes com indivíduos sadios, com um FC aproximado de 0,5 (Figura 8).
Figura 8 – Perfis de expressão gênica (valores relativos de Fold-Change) de pacientes
portadores da síndrome da fragilidade em comparação com o grupo controle avaliados por
RT-qPCR em tempo real. O controle endógeno utilizado foi o 18S.
-1.2
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
SOD FEN1 XRCC1 APEX1 OGG1
Fold Change
Resultados
___________________________________________________________________________
24
Quando comparada a expressão relativa destes mesmos genes em idosos frágeis
com relação aos indivíduos controle, apenas APEX1 e OGG1 apresentaram diferença
significativa pelo teste estatístico t pareado (P = 0,026 e 0,004, respectivamente) (Figura 9).
Figura 9 – Valores relativos de expressão gênica em linfócitos de pacientes portadores da
síndrome da fragilidade em comparação com o grupo controle avaliados por RT-qPCR em
tempo real. O controle endógeno utilizado foi o 18S. * diferença significativa. Os dados estão
representados como média ± erro padrão.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
SOD FEN1 XRCC1 APEX1 OGG1
Expressão gênica
Controles
Pacientes
*
*
Resultados
___________________________________________________________________________
25
4.3 Análise de expressão gênica por microarrays
Para os experimentos de expressão gênica por microarrays, foram utilizados os
RNAs extraídos de linfócitos de 10 pacientes portadores da síndrome estudada e “pools” de
RNA dos linfócitos do grupo controle, sendo formados três pools, cada um contendo
amostras provenientes de quatro indivíduos.
As imagens das lâminas hibridadas com as sondas de cDNA foram analisadas em
scanner apropriado (GenePix 4000b), sendo geradas duas imagens, uma obtida por meio de
leitura em comprimento de onda 532nm, de cor verde (Cy3) para os grupos de estudo e
outra em comprimento 635nm, de cor vermelha (Cy5) para o pool de referência de RNA.
Essas imagens foram sobrepostas resultando em uma imagem final na qual os níveis de
expressão dos genes podem ser visualizados.
Os pontos fluorescentes foram quantificados e normalizados, sendo posteriormente
submetidos à análise estatística pelo método SAM, comparando o grupo de pacientes com o
controle, de forma a evidenciar os genes que foram modulados significativamente. Para
valores de FDR ≤ 1%, foram selecionados 571 genes diferencialmente expressos, sendo
300 reprimidos (representados em verde) e 271 induzidos (representados em vermelho). O
método de agrupamento hierárquico foi aplicado para o conjunto de genes selecionados
pelo SAM (Figura 10). Alguns clusters foram selecionados por inspeção visual, nos quais
foram agrupados pelo SAM com uma diferença marcante entre pacientes e controles.
O algoritmo de agrupamento hierárquico aplicado aos resultados obtidos pelo SAM
separou as amostras em dois grupos distintos: um contendo todas as amostras referentes
aos pacientes, e outro, as amostras dos controles. Isso evidencia a diferença de expressão
gênica entre os portadores da síndrome e os indivíduos sadios. Três grupos de genes
(clusters) foram selecionados por inspeção visual, notando-se uma nítida diferença nos
níveis de expressão dos genes entre os grupos “pacientes” e “controles” (Figuras 11, 12 e
13).
Além disso, a lista de genes diferencialmente expressos foi submetida à análise de
funções biológicas pelo DAVID-NIH (Dennis et al. 2003). Esse programa agrupou os genes
de acordo com suas funções, sendo utilizado o parâmetro de dados do Gene Ontology –
Biological Process All (Figura 14).
Dentre os 571 genes apontados como diferencialmente expressos pelo SAM, 100
genes (41 reprimidos e 59 induzidos) foram selecionados de acordo com suas funções
(processos biológicos) atribuídas pelo DAVID-NIH (Tabelas 5 e 6; Figura 14). As funções
destacadas foram aquelas consideradas mais relevantes para o presente trabalho, como
Resultados
___________________________________________________________________________
26
reparo do DNA, resposta ao estresse e via ubiquitina-proteassomo, bem como os genes
diferencialmente expressos com nível maior de significância.
Figura 10 – Comparação dos perfis de expressão gênica entre pacientes idosos portadores
de Fragilidade e idosos sadios. Matriz de expressão de 571 sequências gênicas
selecionadas pela análise pelo SAM. As áreas em vermelho indicam indução da expressão
transcricional, verde indica repressão, preto ausência de modulação e cinza indica pontos
perdidos. Os clusters em detalhe foram selecionados por inspeção visual.
Resultados
___________________________________________________________________________
27
Figura 11 – Agrupamento de genes diferencialmente expressos, selecionados pelo método
SAM (FDR ≤ 1%). As áreas em vermelho indicam indução da expressão transcricional,
verde indica repressão, preto ausência de modulação e cinza indica pontos perdidos.
Figura 12 – Agrupamento de genes significativamente expressos, selecionados pelo método
SAM (FDR ≤ 1%). As áreas em vermelho indicam indução da expressão transcricional,
verde indica repressão, preto ausência de modulação e cinza indica pontos perdidos.
Resultados
___________________________________________________________________________
28
Figura 13 – Agrupamento de genes significativamente expressos, selecionados pelo método
SAM (FDR ≤ 1%). As áreas em vermelho indicam indução da expressão transcricional,
verde indica repressão, preto ausência de modulação e cinza indica pontos perdidos.
Resultados
___________________________________________________________________________
29
0
10
20
30
40
50
60
P
r
o
c
e
s
s
o
s
m
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a
b
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C
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p
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s
s
o
s
c
e
l
u
l
a
r
e
s
Porcentagem de genes modulados (%)
Figura 14 – Principais classes funcionais atribuídas aos 571 genes significativamente
expressos na comparação entre o grupo de pacientes frágeis com grupo controle. FDR ≤
1%. Dados obtidos por meio do DAVID-NIH.
A metodologia de PCR em tempo real foi utilizada para validar a expressão de quatro
genes encontrados modulados por microarrays (PRKDC, HTRA1, CAV1 e HSPE1),
utilizando-se a mesma amostra de RNA (Figura 15).
-7.5
-6.5
-5.5
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
PRKDC HSPE1 CAV1 HTRA1
Fold Change
Real time
Microarrays
Figura 15 – Níveis de expressão gênica apresentados por quatro genes (PRKDC, HSPE1,
CAV1 e HTRA1) comparados pela metodologia de PCR em tempo real e microarrays.
PRKDC e HTRA1 apresentaram diferença significativa pelo teste t nas duas metodologias,
quando comparado pacientes idosos e indivíduos sadios.
Resultados
___________________________________________________________________________
30
Tabela 5 – Lista de genes significativamente reprimidos obtidos na comparação entre os
pacientes com Síndrome da Fragilidade e indivíduos controles. A análise estatística foi
realizada pelo SAM (FDR ≤ 1%).
Símbolo do
gene Clone ID
Loc.
Cromossômica
Fold
Change
Valor Q
Função / Processos celulares
SLC19A3 137285 2q37 -8.118 0.000 Transporte
PRKDC 1613637
8q11 -7.700 0.000 Reparo e recombinação DNA, apoptose
CAV1 24651 7q31.1 -4.683 0.000 Proteína de ligação
TRRAP 21537 7q21.2-q22.1 -3.549 0.000 Regulação da transcrição, reparo do DNA
RAD52 1675900
12p13-p12.2 -3.074 0.000 Reparo do DNA
ARHGEF7 28736 13q34 -2.727 0.000 Sinalização celular
HTRA2 24797 2p12 -2.552 0.000 Resposta ao estresse, proteólise
HSPE1 133099 2q33.1 -2.520 0.000 Proteína Heat Shock
DDX23 30630 12q13.12 -2.153 0.000 Proteína de ligação, processamento do RNA
RFC5 49940 12q24.2-q24.3 -1.951 0.000 Reparo e replicação do DNA
NEDD4L 24477 18q21 -1.939 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
RCHY1 142689 4q21.1 -1.790 0.000 Proteína de ligação
OXCT1 28469 5p13.1 -1.713 0.000 Sintese e degradação de corpos cetônicos
MORF4L1 135875 15q24 -1.654 0.000 Regulação da transcrição
SMAD7 148968 18q21.1 -1.624 0.000 Resposta ao estresse, proteína de ligação
ALDH18A1 26406 10q24.3 -1.595 0.000 Metabolismo
GSTP1 136235 11q13 -1.592 0.000 Proteína de ligação, anti-apoptótica
WDSUB1 133759 2q24.2 -1.512 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
UBE3A 39799 15q11-q13 -1.490 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
GSTM3 137940 1p13.3 -1.486 0.000 Metabolismo
ADAMTS19
34014 5q31 -1.460 0.852 Proteólise
ADAMTS1 34684 21q21.2 -1.459 0.000 Proteólise
RASSF5 40988 1q32.1 -1.453 0.053 Regulação do ciclo celular
REV3L 131517 6q21 -1.429 0.000 Reparo do DNA
CDH13 31093 16q24.2-q24.3 -1.421 0.000 Resposta ao estresse, proteína de ligação
UBE2E1 133916 3p24.2 -1.392 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
ATP1B1 25433 1q24 -1.369 0.000 Transporte de íons
WRNIP1 32537 6p25.2 -1.359 0.000 Reparo do DNA
TRAP1 143480 16p13.3 -1.336 0.218 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
PPP2R1B 263846 11q23.2 -1.316 0.000 Regulação de processos celulares, apoptose
POLH 250434 6p21.1 -1.297 0.000 Reparo do DNA
H2AFX 1130993
11q23.2-q23.3 -1.297 0.000 Reparo do DNA
MARK1 21522 1q41 -1.293 0.000 Sinalização celular
ATP1B3 139611 3q23 -1.277 0.000 Transporte de íons
SESN1 135889 6q21 -1.256 0.000 Resposta a danos no DNA
RNF2 141298 1q25.3 -1.195 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
PSMA5 141226 1p13 -1.189 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
ARHGAP26
22134 5q31 -1.168 0.000 Sinalização celular
FBXO4 23056 5p12 -1.165 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
PRKAA1 260234 5p12 -1.161 0.499 Sinalização celular
ANAPC7 131110 12q24.11 -1.160 0.055 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
MLH1 267569 3p21.3 -1.139 0.102 Reparo do DNA
TRAF3IP2 22279 6q21 -1.118 0.000 Sinalização celular
Resultados
___________________________________________________________________________
31
Tabela 6 – Lista de genes significativamente induzidos obtidos na comparação entre os
pacientes com Síndrome da Fragilidade e indivíduos controles. A análise estatística foi
realizada pelo SAM ( FDR ≤ 1%).
Símbolo do
gene Clone ID
Loc.
Cromossômica
Fold
Change
Valor Q
Função / Processos celulares
TGFB2 36472 1q41 1.150 0.000 Sinalização celular
PHLDA2 143558 11p15.5 1.162 0.102 Supressor de tumor, apoptose
CASP4 183194 11q22.2-q22.3 1.180 0.000 Sinalização celular, proteólise, apoptose
TP53I11 48285 11p11.2 1.187 0.052 Respsota ao estresse
RNF128 132015 Xq22.3 1.195 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
RQCD1 136893 2q35 1.195 0.000 Proteína de ligação
PSMD10 143997 Xq22.3 1.199 0.054 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
ARHGAP26
40744 5q31 1.207 0.441 Sinalização Celular
PCBP4 137374 3p21 1.217 0.000 Resposta a danos no DNA
GPR75 53042 2p16 1.221 0.000 Sinalização Celular
RNF138 139365 18q12.1 1.229 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
SOX1 35336 13q34 1.244 0.000 Regulação da transcrição
RAD51L3 259579 17q11 1.255 0.102 Reparo do DNA, apoptose
ARHGAP22
23762 10q11.22 1.259 0.000 Sinalização Celular
MARK2 25665 11q12-q13 1.262 0.000 Sinalização Celular
ERCC5 1308118
13q22|13q33 1.266 0.000 Reparo do DNA
CHD2 137211 15q26 1.267 0.000 Proteína de ligação, regulação da transcrição
SMC1L1 31914 Xp11.22-p11.21
1.267 0.000 Reparo do DNA
RNF144 32042 2p25.2-p25.1 1.282 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
DYRK1A 32712 21q22.13 1.283 0.000 Sinalização celular
MLH3 250771 14q24.3 1.285 0.000 Reparo do DNA
DNAJC13 260276 3q22.1 1.287 0.000 Proteína heat-shock
PPP2R5E 138116 14q23.1 1.291 0.000 Sinalização celular
ARHGAP12
24837 10pter-cen 1.305 0.000 Sinalização celular
PIAS1 32565 15q 1.368 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
INPP5E 53392 9q34.3 1.370 0.055 Sinalização celular
ARHGAP10
131817 4q31.23 1.370 0.000 Sinalização celular
CASP8 25467 2q33-q34 1.379 0.000 Sinalização celular, apoptose, proteólise
SOX6 31163 11p15.3 1.385 0.000 Regulação da transcrição
XRCC3 141821 14q32.3 1.409 0.000 Reparo do DNA
RASGRP1 25016 15q15 1.423 0.055 Sinalização celular
GPR108 25949 19p13.3 1.439 0.000 Sinalização celular
ERCC1 1585120
19q13.2-q13.3 1.466 0.000 Reparo do DNA
HSPB1 23827 7q11.23 1.469 0.000 Proteína heat-shock
ATP6AP2 131821 Xp11.4 1.470 0.000 Sinalização celular
HERC1 28896 15q22 1.488 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
FBXL11 134942 11q13.1 1.496 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
ATPAF2 24418 17p11.2 1.511 0.000 Sinalização celular
MAP2K1 33826 15q22.1-q22.33
1.572 0.000 Sinalização celular
FBXL3 25778 13q22 1.595 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
CAMK2B 50636 22q12 1.609 0.000 Sinalização celular
ROCK1 139031 18q11.1 1.701 0.000 Sinalização celular, apoptose
GPR126 142589 6q24.1 1.813 0.000 Sinalização celular
RNF149 139470 2q11.2 2.083 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
HSPA13 222025 21q11.1|21q11 2.101 0.000 Proteína heat-shock
BTG2 32510 1q32 2.181 0.000 Reparo do DNA
Resultados
___________________________________________________________________________
32
Tabela 6 – Lista de genes significativamente induzidos obtidos na comparação entre os
pacientes com Síndrome da Fragilidade e indivíduos controles. A análise estatística foi
realizada pelo SAM ( FDR ≤ 1%).Continuação.
Símbolo do
gene Clone ID
Loc.
Cromossômica
Fold
Change
Valor Q
Função / Processos celulares
PRKCH 138849 14q22-q23 2.275 0.000 Sinalização celular
CAPN5 186922 11q14 2.537 0.000 Sinalização celular, proteólise
RASSF2 24149 20pter-p12.1 2.627 0.000 Sinalização celular
PRKCD 47306 3p21.31 2.870 0.000 Sinalização celular
CASP8AP2
134682 6q15 3.213 0.000 Sinalização celular, apoptose
DDX5 162775 17q21 3.230 0.000 Regulação da transcrição, processamento do RNA
CAT 32662 11p13 3.406 0.000 Resposta ao estresse oxidativo, catalase
HLA-DRB1 186767 6p21.3 3.498 0.000 Resposta imune
FBXL5 33083 4p15.33 3.514 0.000 Complexo Ubiquitina-Proteassoma
CALM1 138538 14q24-q31 4.180 0.000 Sinalização celular
SERPINH1 142788 11q13.5 11.517 0.000 Proteína heat-shock
HBA2 142947 16p13.3 25.759 0.000 Formação da hemoglobina
HBA1 137542 16p13.3 55.679 0.000 Formação da hemoglobina
Discussão
___________________________________________________________________________
33
5. DISCUSSÃO
Diversos estudos buscam uma caracterização da Síndrome da Fragilidade, além dos
processos que culminariam neste quadro clínico de difícil determinação, devido ao grande
número de co-morbidades relacionadas ao próprio processo natural de envelhecimento. A
hipótese de que a fragilidade seria decorrente de diversas alterações nos processos
fisiológicos dos indivíduos tem sido apontada por diversos pesquisadores há tempos
(Buchner e Wagner, 1992; Fried et al., 2004; Walston, 2004), mas pouco foi elucidado.
Alguns marcadores moleculares são importantes ferramentas para o diagnóstico e
tratamento de diversas doenças, sendo que alguns podem ser relacionados com a
fragilidade em idosos, tais como mediadores solúveis de resposta inflamatória, hormônios,
radicais livres, antioxidantes, macro e micronutrientes (Ferrucci et al., 2002).
Muito se postula sobre o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS) e no aumento do estresse oxidativo durante o envelhecimento, sendo que muitos
mecanismos envolvidos no próprio processo são diretamente relacionados ao estresse
(Martin et al 1996; von Zglinicki et al 2001). Segundo Schrager et al. (2003), a capacidade
antioxidante de indivíduos idosos encontra-se diminuída, levando a um acúmulo de ROS
produzidas pelas mitocôndrias de fibras musculares, desencadeando as diversas
complicações da idade, entre elas a sarcopenia (diminuição da massa magra).
A compreensão dos mecanismos de ação das ROS sobre o material genético e sua
contribuição para a progressão das complicações relacionadas ao envelhecimento depende
da elucidação de uma complexa rede de processos envolvidos diretamente com os danos
oxidativos, tais como a maneira com que as ROS atuam no DNA genômico, mitocondrial e
telomérico, assim como a ação de sistemas de reparo do DNA (Kirkwood, 2002).
Um dos objetivos do presente trabalho foi avaliar e comparar a susceptibilidade
diferencial dos indivíduos portadores da síndrome da fragilidade ao acúmulo de danos
resultantes de processos oxidativos. Além disso, objetivou-se estudar a dinâmica de reparo
destes danos por meio do ensaio do cometa após o tratamento das células em cultura com
H
2
O
2
. Outra abordagem também foi conduzida com enfoque sobre os genes relacionados à
maquinaria de reparo de danos oxidativos, além de um “screening” de genes
diferencialmente expressos nos pacientes frágeis, quando comparados aos indivíduos
controles, na busca por possíveis marcadores biológicos para a fragilidade em idosos.
Discussão
___________________________________________________________________________
34
5.1 Análise de danos no DNA pelo ensaio do cometa e cinética de reparo das lesões
Os dados obtidos demonstraram que a média dos diferentes parâmetros avaliados
pelo ensaio do cometa (porcentagem de dano e momento da cauda) em relação à
quantidade de danos basais encontrada em linfócitos de pacientes e indivíduos controles,
não apresentou uma diferença significativa. Em contrapartida, quando tratados com a
enzima hOGG1, idosos frágeis apresentaram uma quantidade de danos significativamente
maior quando comparados aos indivíduos controles. A enzima hOGG1 é uma glicosilase
cujo papel principal é a remoção de lesões oxidativas, em particular a 8-oxoG, que produz
transversões GC para AT. A hOGG1 reconhece e catalisa a remoção da 8-oxoG da dupla
fita do DNA, deixando um sítio AP, substrato para a maquinaria do BER (Bouteux &
Radicella, 2000; Christmann et al., 2003).
A diferença estatística apresentada pelos pacientes na quantidade de danos gerados
sob a ação da enzima hOGG1 demonstra um acúmulo de danos oxidativos nesses
pacientes, comparativamente aos controles, que pode ter resultado de dois processos: a)
uma grande sensibilidade às ROS e um sistema anti-oxidante ineficaz, gerando um maior
número de danos não reparados; b) mutações em enzimas relacionadas com a remoção
das lesões oxidativas, em particular a hOGG1, levando a uma ineficiência nessa etapa do
processo de reparo do dano.
Estudos com camundongos nocauteados para o gene da OGG1 indicam que seu
produto está diretamente relacionado ao reparo das lesões oxidativas (Collins et al., 2001) e
o acúmulo de mutações provenientes dessas pode estar associado a diversas doenças
(Boiteuux & Radicella, 2000), particularmente aquelas mais comuns em idade avançada.
Diversos trabalhos demonstraram um aumento na incidência de câncer relacionado aos
polimorfismos no gene OGG1 (Sugimura et al., 1999; Le Marchand et al., 2002; Goode et
al., 2002). Além disso, alguns polimorfismos desse gene demonstram um fenótipo deficiente
para o reparo de bases oxidadas quando as células são submetidas a um estresse oxidativo
(Smart et al., 2006).
Além disso, no presente estudo, foram também realizados ensaios de sensibilidade
dos linfócitos de pacientes frente à indução de danos oxidativos pelo H
2
O
2
. O peróxido de
hidrogênio é uma molécula que atravessa facilmente a membrana celular, sendo
prontamente transformado em radicais hidroxil por um processo não-enzimático, na
presença de metais como ferro (Fe
2
) ou cobre (Cu
2
). Esse processo é chamado de reação
de Fenton e induz danos no material genético, como quebras de fita simples e dupla, sítios
álcali-lábeis e a oxidação, tanto de purinas como pirimidinas (Joenje, 1989). Neste trabalho
foi avaliada a sensibilidade dos pacientes portadores da síndrome da fragilidade sob
Discussão
___________________________________________________________________________
35
condições de tratamento com um agente causador de danos oxidativos (H
2
O
2
) e avaliação
da capacidade de reparo dos linfócitos desses pacientes.
Os dados obtidos mostraram uma maior sensibilidade (significativa) dos linfócitos de
pacientes (caracterizados como frágeis) ao peróxido de hidrogênio. A presença de radicais
livres nos organismos está diretamente ligada ao processo de envelhecimento. Essa
hipótese é compatível com a teoria dos radicais livres adotada por Hartman (1956), em que
há uma indução de danos em biomoléculas (sendo o DNA a de maior relevância) que se
acumulam com o tempo. Adicionalmente, vários processos que regulam a quantidade de
ROS ou reparam os danos causados por elas encontram-se deficientes ou mesmo ausentes
em algumas doenças humanas (Valko, 2007). Os dados obtidos são compatíveis com a
sugestão de que os linfócitos de indivíduos portadores da síndrome estudada, que
apresentaram um maior dano quando tratados com H
2
O
2
(quando comparados com idosos
na mesma faixa etária) e apresentaram uma deficiência no reparo dessas lesões,
possivelmente devem apresentar um sistema anti-oxidante deficiente.
Vários estudos têm relatado a influência da presença de danos oxidativos para o
desenvolvimento de doenças relacionadas ao envelhecimento. Semba et al. (2007a e
2007b) demonstraram que a oxidação de proteínas em mulheres idosas está relacionada
com uma diminuição na motricidade, podendo gerar problemas motores, além de um
aumento no risco de mortalidade dessas pacientes. Howard et al. (2007), estudando
mecanismos de oxidação protéica, identificaram uma relação direta destas lesões com a
diminuição da força muscular em idosos. Estes trabalhos ajudam a embasar a teoria de que
o aumento na quantidade de danos oxidativos, ou problemas relacionados com a remoção
dos mesmos pode ter relação direta com o desenvolvimento da fragilidade, já que a
motricidade e a força palmar são parâmetros clínicos para diagnóstico da síndrome.
O DNA está constantemente sujeito a danos, que são reparados por processos
específicos para cada tipo de lesão. As lesões oxidativas causadas pelo peróxido de
hidrogênio são reparadas principalmente por excisão de bases (BER) (Collins et al., 1995),
que ao contrário de outros tipos de lesões resultantes da ação de agentes genotóxicos,
ocorre rapidamente nas células (Gabelova et al. 1997).
Para avaliar a dinâmica de reparo das lesões oxidativas foi realizado o ensaio do
cometa em tempos de recuperação consecutivos à indução de danos por peróxido de
hidrogênio. Os resultados obtidos mostraram que não houve diferenças significativas entre
os tempos T0 x T1 e T1 x T2 quando comparados os dois grupos (pacientes e controles),
indicando uma resposta proporcionalmente semelhante entre os grupos. Apesar de não
Discussão
___________________________________________________________________________
36
haver diferença significativa detectada por teste estatístico, existe uma tendência para
diferenças entre os grupos nos outros parâmetros estudados pelo ensaio do cometa.
De acordo com Xu et al. (2008), o sistema de reparo BER possui uma tendência a
diminuir sua atividade com o envelhecimento natural. Estudos realizados por Chen et al..
(2002) demonstraram que em linfócitos de indivíduos de diversas faixas etárias, a atividade
da enzima hOGG1 diminuiu significativamente com a idade, comprometendo a remoção do
dano. Os resultados obtidos no presente estudo indicam que idosos frágeis apresentaram
uma alteração na cinética de reparo das lesões oxidativas. Quatro horas após a remoção da
droga, o grupo controle atingiu uma quantidade de danos basal próxima à quantificada no
início do experimento, antes da ação do peróxido de hidrogênio. Em contrapartida, os
linfócitos dos indivíduos caracterizados como frágeis continuaram com uma quantidade
muito superior de danos no material genético, provavelmente resultante de um atraso no
sistema de reparo, fato constatado nos três parâmetros analisados pelo ensaio do cometa.
O atraso na remoção das lesões oxidativas pode se relacionar ao desenvolvimento
de características compatíveis com as doenças. Vários trabalhos demonstraram uma
relação direta entre defeitos na maquinaria de reparo e a progressão do envelhecimento,
principalmente para a via NER (nucleotide excision repair) e no reparo de quebras duplas
(DSB) (Lombard et al., 2005). A principal via de reparo das lesões oxidativas é o BER, mas
poucos estudos correlacionaram problemas em seus processos e o envelhecimento.
Defeitos nas glicosilases e em outros genes participantes da via BER são conhecidos por
elevar a susceptibilidade ao câncer (Maynard et al., 2009).
Algumas evidencias experimentais demonstraram uma diminuição na remoção das
bases 8-oxoG e na expressão de β-OGG1 nas mitocôndrias de linhagens de câncer de
próstata (PC-3 e DU-145) (Trzeciak et al., 2004), além de relatos de deficiência no reparo de
8-oxoG em linhagens de câncer de mama (Mambo et al., 2002).
5.2 Análise de genes relacionados com a remoção de lesões oxidativas
De acordo com a teoria do envelhecimento por radicais livres, as espécies reativas
de oxigênio, tais como os radicais superóxidos e hidroxil, estão diretamente relacionados
com o desenvolvimento de doenças degenerativas (especialmente as neurológicas) e do
próprio envelhecimento (Hartman, 1956). O estresse oxidativo causado pelas ROS pode
desencadear vários processos celulares, dependendo da molécula afetada, tais como perda
da resposta a fatores de crescimento, diminuição da atividade de proteínas reguladoras do
ciclo celular, instabilidade genômica, dentre outros que conferem à célula um fenótipo
senescente (Chen & Ames 1994).
Discussão
___________________________________________________________________________
37
Particularmente o DNA, tanto nuclear quanto mitocondrial, sofre uma série de danos
causados pelos agentes indutores de estresse oxidativo, sendo que o mais comum a
oxidação de bases, tais como a 8oxoG (Shigenaga & Ames, 1991). As lesões 8oxoG
resultam em uma transversão GC → TA, pois a base oxidada leva a uma incorporação
errônea de um A no lugar de C. Com o envelhecimento, ocorre um acúmulo de lesões
oxidativas no material genético, especialmente de 8-oxoG (Valko et al., 2007).
As células são equipadas com diversos mecanismos para reverter os danos
causados por ROS, tanto direta como indiretamente. Dentre eles, um sistema de enzimas
antioxidante eficaz e diversas vias de reparo do DNA atuam para a remoção das lesões.
Uma enzima importante no combate aos radicais livres é a superóxido desmutase (SOD),
que neutraliza os radicais superóxido (O
2
-
), convertendo-os para peróxido de hidrogênio,
prevenindo a formação de espécies mais agressivas como o radical hidroxil (OH
-
) (Afonso et
al., 2007).
A ausência de expressão do gene SOD1 em células cultivadas in vitro demonstraram
uma diminuição dos processos de divisão celular, além de uma menor resistência ao
estresse oxidativo (Huang et al., 1997). Mutações neste gene são freqüentemente
relacionadas com doenças neurodegenerativas (Reiter, 1995). Em células proficientes para
a expressão deste gene, um aumento na transcrição de SOD1 é observado em resposta a
diversos estímulos internos ou externos, como choques térmicos, mecânicos, presença de
metais pesados e estresse oxidativo (Afonso et al., 2007).
No estudo da expressão gênica em linfócitos de pacientes idosos portadores da
síndrome da fragilidade, comparativamente com controles sadios, uma modulação positiva
do gene SOD1 foi verificada, demonstrando um aumento na transcrição deste gene. Este
quadro pode ser explicado pela maior sensibilidade desses indivíduos quando expostos a
agentes causadores de estresse, forçando as células a atuarem de uma maneira mais
intensa contra os mesmos. Apesar de apresentar uma expressão aumentada de SOD1,
estudos complementares da integridade desta proteína são necessários para verificar se o
balanço entre produção de ROS e sua eliminação é mantido.
Juntamente com a ação da SOD, um complexo de enzimas relacionadas com o
reparo de lesões é responsável pela integridade do material genético quando a célula é
exposta a agentes genotóxicos. Como o principal dano resultante dos radicais livres é a
oxidação de bases, a via de remoção destas lesões é principalmente a BER (Base Excision
Repair).
BER é um processo importante para a manutenção da instabilidade genômica, o que
pode ser demonstrado por diversos fenótipos de doenças resultantes da deficiência de
Discussão
___________________________________________________________________________
38
produtos desta via, tais como câncer, envelhecimento prematuro e defeitos metabólicos
(Maynard et al., 2009). Após a clivagem da base oxidada por uma glicosilase, resultando em
um sítio abásico (ponto apurínico/apiridínico –AP), as proteínas relacionadas com esta via
são responsáveis pela reposição da base excisada e correta ligação da molécula de DNA
(Sancar et al., 2004).
Devido à sua função no desenvolvimento embrionário, a ausência de expressão dos
genes da via BER é geralmente letal em camundongos. Mutações nestes genes levam a
célula a uma maior propensão ao câncer, mas é difícil relacionar defeitos nesta via com uma
aceleração no processo de envelhecimento, sendo menos comum a associação de doenças
com a deficiência de produtos do BER do que de outras vias de reparo (Maynard et al.,
2009). Estudos realizados em levedura demonstraram que defeitos em diversas proteínas
desta via de reparo diminuem o tempo de vida dos organismos (Maclean et al., 2003).
Rao (2009) encontrou uma relação entre o reparo de lesões por BER e o
desenvolvimento de desordens neurodegenerativas. Segundo o autor, células neuronais
possuem um comprometimento nesta via de reparo com o aumento da idade, sendo um dos
fatores responsáveis pela deterioração de funções mentais.
O gene OGG1 encontrou-se reprimido na comparação pacientes frágeis e sadios.
Esse resultado corrobora com os dados encontrados para os experimentos de remoção de
danos realizados pela metodologia do cometa, demonstrando um possível
comprometimento na excisão das lesões oxidativas, o que resultaria em um acúmulo das
mesmas.
A expressão de outros três principais genes relacionados ao reparo de lesões
oxidativas, pertencente à via BER, demonstraram uma modulação diferenciada
nospacientes portadores da síndrome da fragilidade comparativamente aos indivíduos
controle. Enquanto FEN1 foi induzido (FC = 0,18), dois genes foram reprimidos (XRCC1, FC
= -0,39 e APEX1, FC = -0,65).
O gene FEN1 é responsável pela transcrição da endonuclease responsável pela
remoção de fragmentos de DNA por meio da identificação de terminação 5’ não ligadas.
Esta enzima está presente nos processos de duplicação do DNA, com o início da
degradação de primers de RNA nos fragmentos de Okasaki (Liu et al., 2004) e na via longa
do processo de reparo BER (Sancar et al.,2004).
Estudos relacionados com a função de FEN1 demonstraram que a deleção das duas
cópias deste gene em camundongos leva à letalidade dos organismos. Uma insuficiência da
função deste gene pode ser crucial para o desenvolvimento de tumores (Kucherlapati et al.,
2002), bloqueio no ciclo celular e aumento de apoptose quando as células são expostas à
Discussão
___________________________________________________________________________
39
espécies reativas de oxigênio e radiação ionizante, levando a uma instabilidade genômica
(Larsen et al., 2003).
A modulação positiva encontrada para o gene FEN1 demonstra a sua indução nos
linfócitos de idosos frágeis, o que pode ser decorrente do acúmulo de danos oxidativos
nesses indivíduos. Alguns estudos relacionam uma expressão aumentada de FEN1 com o
desenvolvimento de diversas formas de câncer (Singh et al., 2008; Nikolova et al., 2009).
Estes dados, juntamente com o perfil encontrado para os pacientes frágeis, podem indicar
uma maior susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores, sendo que estudos específicos
são necessários para elucidar os mecanismos que levaram a esta indução.
Em contrapartida, XRCC1 e APEX1 se mostraram reprimidos nos linfócitos dos
pacientes frágeis. Os dois genes participam das duas vias de reparo BER, a curta e a longa.
A proteína Ape1 hidrolisa a quebra de ligações fosfodiéster logo após a ação das
glicosilases, formando um sítio AP, no qual outras enzimas do processo irão atuar. Diversas
funções além do reparo de lesões estão relacionadas com esta proteína, dentre elas o
controle de fatores de transcrição e a prevenção a estressores químicos (Fishel & Kelley,
2007). Uma redução na atividade de APEX1 está relacionada com diversos fatores que
induzem a uma instabilidade genética, tais como alquilação e oxidação do DNA (Evans et
al., 2000); sensibilidade a agentes como H
2
O
2
e quimioterápicos (Ono et al., 1994; Bobola et
al., 2001 e 2005), além de deixar as células mais propensas ao desenvolvimento de
cânceres devido à falta de reparo de lesões (Fishel & Kelley, 2007).
A proteína XRCC1 atua como uma âncora, recrutando e mantendo unidas diversas
outras proteínas para atuações em sítios específicos. Uma dessas interações é realizada
pela DNA ligase III e DNA polimerase para completar o reparo BER. Deficiências na
transcrição de XRCC1 estão associadas com falhas nas ligações do DNA, principalmente
nos processos de reparo BER e reparo de quebras de fitas simples (SSB) (Fam & Wilson,
2005). Além disso, Wong et al. (2005) demonstraram uma relação positiva entre a proteína
XRCC1 e as glicosilases, inferindo possíveis mecanismos desta proteína com o início do
reparo BER.
As três proteínas relacionadas à via BER, como já mencionado, devem possuir uma
função no desenvolvimento embrionário do organismo, visto que deleções nesses genes
são letais em camundongos. Alterações na função desses genes durante o envelhecimento
pode levar à instabilidade genômica, principalmente por falhas nos mecanismos de reparo,
particularmente a via BER. Os linfócitos dos idosos frágeis apresentaram, neste estudo, uma
diferença na expressão desses três genes, que podem contribuir para um aumento na
Discussão
___________________________________________________________________________
40
susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores, pela indução de FEN1 e repressão de
XRCC1 e APEX1.
5.3 Modulação da expressão gênica analisada por microarrays
A análise da expressão gênica tem sido largamente utilizada na busca por
mecanismos para elucidação de vários processos biológicos, especialmente os patogênicos.
A metodologia de microarrays é recente, e tem sido muito aplicada, devido à possibilidade
de analisar uma grande quantidade de genes simultaneamente, contribuindo especialmente
para a descoberta de novos tratamentos e hipóteses diagnosticas para doenças, graças à
comparação entre genes diferencialmente modulados.
Neste estudo, foi avaliada a expressão gênica de linfócitos de pacientes portadores
da síndrome da fragilidade comparativamente com idosos sadios na busca de marcadores
biológicos que facilitem seu diagnóstico. Foram utilizados RNA de 10 pacientes, comparado
com 3 “pools” de amostras de indivíduos sadios, cada um com o RNA de 4 indivíduos
(Figura 3). A opção pela forma do “pool” pode gerar resultados diferenciados de expressão
gênica. Vários trabalhos demonstraram a validade dos experimentos de microarrays quando
um “pool” de amostras é realizado com variações dentro do grupo, ou por replicata de
experimentos ou ainda por “poolings” diferenciados, como realizado neste trabalho,
preservando a variabilidade entre as amostras (Kendziorski et al., 2003; Peng et al., 2003).
Foram encontrados 571 genes diferencialmente modulados com um FDR ≤ 1%, 300
modulados negativamente e 271 positivamente. Por meio de suas funções, foram
selecionados 100 genes para discussão, de acordo com sua relevância para o trabalho. Em
uma visão geral, de acordo com os dados agrupados pelo DAVID-NIH (Dennis et al. 2003)
(Figura 16), a maioria dos genes diferencialmente modulados participa de várias vias de
processos metabólicos e de sinalização celular.
Muitos processos celulares dependem da integridade de seus componentes, que são
constantemente danificados por agentes químicos e físicos. A manutenção da homeostase
normal da célula requer uma rápida ação contra os danos causados pelos estressores,
principalmente no DNA, onde a ação das moléculas que compõem as vias de reparo das
lesões é importante para o reparo do dano (Daulny & Tansei, 2009). Com o
envelhecimento, os mecanismos de reparo das lesões no material genético apresentam
falhas ou diminuição da sua atividade, contribuindo para a instabilidade genética e aumento
de eventos apoptóticos nas células (Vijg, 2008).
Um conjunto de 16 genes relacionados com vias de reparo foram modulados
significativamente neste trabalho, 8 modulados positivamente (BTG2, RAD51L3, ERCC5,
Discussão
___________________________________________________________________________
41
ERCC1, SMC1L1, MHL3, XRCC3 e PCBP4) e 8 negativamente (RAD52, TRRAP, PRKDC,
H2AFX, POL4, RFC5, REVL3 e MLH1).
O gene BTG2 (B-cell translocation gene 2) codifica uma proteína envolvida no
controle do crescimento celular, e está relacionada com o processo de reparo de lesões no
DNA (Rouault et al., 2002; Lim et al., 2002). A expressão de BTG2 é regulada pela proteína
p53 após uma injúria no DNA causada por um agente genotóxico (Rouault et al., 1996).
Embora sua função exata nas células não seja bem conhecida, a proteína codificada pelo
gene BTG2 está relacionada como co-fator transcricional, como um supressor de tumor e
reguladora do ciclo celular, bloqueando o ciclo nas fases G1/S e G2/M (Lim, 2006). Estudos
demonstraram uma expressão aumentada de BTG2 durante a indução de apoptose por
quimioterápicos em várias células tumorais (Tirone, 2001; Chen et al.,2006).
Postula-se que a proteína codificada pelo gene BTG2 atue induzindo a senescência
celular, realizando papel de supressor tumoral, bloqueando a capacidade proliferativa da
célula, impedindo que se torne imortal. Células deficientes para BTG2 podem ser
suscetíveis ao desenvolvimento de tumores, além de ter alterado seu processo de
envelhecimento natural (Lim, 2006).
Lim et al. (2008) demonstraram uma relação direta da atividade da expressão do
gene BTG2 com o dano oxidativo. Por meio de desregulação de enzimas antioxidantes,
BTG2 aumenta a morte celular em células tumorais pelo aumento da suscetibilidade aos
danos oxidativos causados pela doxorrubicina.
Foi observado um aumento na expressão transcricional do gene BTG2 em pacientes
portadores da síndrome da fragilidade (FC = 2,1806) em comparação com o grupo controle.
A expressão positiva de BTG2 pode contribuir para um envelhecimento das células desses
indivíduos, além de deixá-las mais vulneráveis à ação de radicais livres.
A proteína codificada pelo gene RAD52 desempenha um papel nos primeiros passos
do reparo homólogo, contribuindo para a busca por regiões homólogas e invasão da fita de
DNA. Mutações neste gene podem levar à ineficiência do reparo de quebras duplas (DSB –
double strand breaks) no material genético (Krejci et al.,2003). Existem poucas evidências
indicando uma possível influência de RAD52 e a progressão do envelhecimento. Park et al.
(1999), analisaram células deficientes para este gene em Saccharomyces cerevisae e
verificaram que os organismos mutantes possuem um período de vida menor, uma vez que
o reparo das DSBs fica comprometido. Além disso, essas células ficam bloqueadas no ciclo
celular na fase G2/M devido ao acúmulo de danos.
Souza-Pinto et al. (2009) encontram uma relação do gene RAD52 com o reparo de
danos oxidativos, através de sua interação com a glicosilase hOGG1. Segundo este estudo,
Discussão
___________________________________________________________________________
42
a proteína RAD52 estimula a atividade da hOGG1 no reparo das lesões 8-oxoG. Após a
indução de danos na célula, a interação entre as proteínas aumenta significativamente.
Células que possuem uma baixa expressão de RAD52 possuem uma sensibilidade maior ao
estresse oxidativo, mesmo na ausência de indução química.
Em contrastre à expressão de RAD52, a RAD51L3 foi modulada positivamente. Esta
faz parte de uma família de proteínas relacionadas ao reparo homólogo (HR), atuando como
promotora da invasão da fita danificada para a correta complementação em cromossomos
homólogos (West, 2003). O gene XRCC3, também expresso positivamente, apresenta uma
similaridade com a família RAD51 e está envolvida com o reparo de quebras duplas no
DNA. Estes dois genes estão relacionados com diversos tipos de cânceres, especialmente
de mama (Thacker, 2005). A expressão positiva de XRCC3 e RAD51 em pacientes idosos
pode corroborar a hipótese de susceptibilidade desses indivíduos a danos no material
genético.
O gene TRRAP, negativamente modulado neste trabalho, codifica uma proteína
essencial nos estágios iniciais de desenvolvimento celular, importante para a progressão
natural do ciclo celular (Herceg et al.,2001). É possível que a TRRAP atue em vários
processos de reparo de danos no DNA, especialmente naqueles relacionados com as
quebras de fita dupla (DSBs), interagindo com outras proteínas para o remodelamento da
cromatina e reconhecimento das lesões no DNA (Robert et al., 2006). O acúmulo de danos
oxidativos ou a suscetibilidade aos mesmos podem contribuir de forma direta ou indireta
para a produção de DSBs. Regiões de quebra simples, lacunas produzidas pelo reparo das
lesões oxidativas podem ser convertidas em DSBs. Ainda, durante o processo de duplicação
do DNA, as bases oxidadas podem levar à produção das quebras duplas (Brennan &
Schiestl, 1998; Haber, 1999). A expressão reprimida de TRRAP nos idosos portadores da
síndrome da fragilidade pode indicar uma deficiência nos processos de reparo das DSBs,
contribuindo para um aumento de instabilidade genômica nesses pacientes.
Várias vias de reparo podem ser ativadas em resposta a danos oxidativos, embora a
principal delas seja o BER. Dois genes em particular foram expressos positivamente neste
trabalho e estão conectados à via NER (reparo por excisão de nucleotídeos), que podem
atuar quando a quantidade de ROS causa muitos danos no material genético (Sluppaugh et
al., 2003). Langie et al. (2009) demonstraram a expressão aumentada de diversos genes
envolvido na via NER após exposição a um agente oxidativo (no caso peróxido de
hidrogênio), incluindo ERCC1 e ERCC5.
Outro gene participante do reparo do DNA, reprimido nos pacientes frágeis, é o
PRKDC, que codifica uma proteína quinase dependente de DNA (DNA-PK), envolvida com
Discussão
___________________________________________________________________________
43
processos de transcrição do DNA e reparo de lesões. As DNA-PKs fazem parte de uma
classe de proteínas que respondem às condições de estresse através de transdutores de
cascata de sinalização (Shiloh, 2003). O papel da DNA-PK no reparo de danos no material
genético está relacionado à lesões do tipo DSBs, participando do reparo não homólogo
(NHEJ). Estudos demonstraram que a DNA-PK se conecta às extremidades das quebras
duplas, aproximando-as e mantendo-as juntas até a total ligação pela DNA ligase e fatores
de ligação (DeFazio et al., 2002; Lieber et al., 2003).
Além de participar do reparo NHEJ, a DNA-PK também atua nos telômeros,
impedindo a união de extremidades cromossômicas (d’Adda di Fagagna et al., 2001),
desempenhando um papel de protetores teloméricos. A ausência da proteína DNA-PK pode
levar a uma instabilidade genômica devido à quantidade de danos não reparados e à falta
de proteção das extremidades dos telômeros. Com o avanço da idade, defeitos na DNA-PK
levam a um encurtamento dos telômeros e aumento das junções cromossômicas nas
células (Espejel et al., 2004).
Todos os processos acima descritos relativos a alterações nos processos de reparo
do DNA em idosos portadores da fragilidade, podem gerar instabilidade genética ocasionada
pela ausência da função dos produtos gênicos responsáveis por estas vias e uma
aceleração da senescência celular, podendo assim contribuir para a produção do fenótipo
frágil nesses indivíduos.
Outros três genes que codificam proteínas quinases, PRKCD, PRKCH e PRKAA (ou
AMPK), apresentaram a sua expressão diferenciada nos idosos frágeis, os dois primeiros
com uma expressão aumentada em relação ao grupo controle e o segundo, diminuída. A
proteína quinase C (PKC) possui vários subgrupos relacionados com a transdução de sinais,
podendo atuar em diversificados mecanismos moleculares nas células (Dempsey et al.,
2000). Muitas funções são atribuídas às PKCs, tais como regulação do crescimento celular e
de controle da apoptose e resposta a agentes estressores (Stabel & Parker, 1991;Steinberg,
2004). A ação de agentes oxidantes modifica a atividade de uma grande variedade de
proteínas quinases (Fialkon et al., 1994; Liu et al., 1995), incluindo as PKCs.
Evidências mostram que as PKCs sofrem influência direta e indireta de agentes
oxidantes e antioxidantes. Os oxidantes atenuam a função inibitória do domínio regulatório
das PKCs. Sendo assim, a exposição prolongada dessas proteínas aos agentes oxidantes
pode levar a uma inativação das PKCs, resultando em uma iniciação de tumores. Por outro
lado, a ação de anti-oxidantes é exercida diretamente nas PKCs, mas podem atuar
confrontando os efeitos oxidantes, estimulando a atividade das quinases (Gopalakrishna &
Jaken, 2000).
Discussão
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44
Apesar de os linfócitos dos idosos frágeis demonstrarem uma indução dos genes
PRKCD e PRKCH, devido a uma maior sensibilidade aos danos oxidativos e acúmulo de
lesões apresentadas pelos pacientes portadores da síndrome estudada, a oxidação das
PKCs também pode contribuir para o desenvolvimento do quadro clínico de vulnerabilidade.
Um aprofundamento no estudo dessas proteínas se torna necessário para verificar sua
relação com o envelhecimento.
Vários outros genes que atuam em resposta aos agentes causadores de estresses
foram encontrados diferencialmente expressos nos linfócitos dos idosos frágeis em
comparação com os indivíduos sadios. Um deles, relacionado diretamente com o estresse
oxidativo, é o CAT, que teve sua expressão aumentada nos pacientes, que pode resultar de
uma resposta frente a uma grande quantidade de radicais livres na célula.. Este gene
codifica uma enzima que cataliza a degradação do peróxido de hidrogênio em água e
oxigênio, e encontra-se localizado nos peroxissomos, mas também aparece no plasma
celular (Rajaraman et al., 2008). Em camundongos, verificou-se que um aumento na
expressão de genes que codificam enzimas com atividade semelhante à da catalase está
associado tanto à resistência a danos oxidativos quanto a um aumento no período de vida
(Cutler, 2005). Experimentos realizados em linhagens astrogliais de camundongos
demonstraram um aumento na quantidade de mRNA de catalase após a tratamento com
peróxido de hidrogênio (Röhrdanz et al., 2001).
O gene CAV1, reprimido nos idosos frágeis, codifica a proteína caveolina e pode ter
uma relação direta com o envelhecimento do organismo e senescência celular. As
caveolinas são proteínas da membrana plasmática relacionadas com processos de
endocitose e regulação da eficiência da transdução de sinais (Park et al., 2004). Cho & Park
(2005) postularam uma teoria, por meio de estudos com esta proteína, sobre a influência da
mesma no processo de senescência celular. Segundo estes autores, um aumento na
expressão de caveolina gera uma supressão da capacidade proliferativa das células por
meio da inibição da atividade de receptores tirosina-quinase, induzindo a célula a um
fenótipo senescente.
Uma redução na expressão de caveolina parece reverter o quadro de senescência
celular e gerar alterações relacionadas ao envelhecimento. Cho et al. (2004) demonstraram
que a modulação da caveolina em células senescentes restaura a aparência morfológica e
sua eficiência funcional, o que indica um papel crucial desta proteína como determinante de
características morfológicas ligadas à senescência.
Várias doenças humanas foram relacionadas a mutações na classe de família de
genes que codificam caveolinas, tais como câncer de mama e distrofias musculares.
Discussão
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45
Estudos em ratos deficientes para esta proteína indicaram o desenvolvimento de vários
problemas com o avançar da idade, como anormalidades cardiovasculares, hipertensão
pulmonar e defeito no metabolismo de adipócitos, além de uma proliferação desregulada de
células epiteliais e endoteliais, reduzindo drasticamente o período de vida desses animais
(Park et al., 2004).
Com base no exposto, pode-se inferir uma hipótese que explicaria a baixa expressão
de CAV1 em idosos portadores da síndrome da fragilidade. O conjunto de características
senescentes levaria a uma diminuição na expressão deste gene, por meio de mecanismos
de feedback negativo. Consequentemente, a falta de caveolinas ocasionaria diversos
problemas fisiológicos, contribuindo para o fenótipo frágil do indivíduo. Entretanto, estudos
adicionais sobre a influência dessa proteína nos processos fisiológicos do envelhecimento
se tornam necessários para corroborar essa hipótese.
Outro gene que tem sua expressão modificada em respostas ao estresse e se
apresentou reprimido nesse trabalho foi o HTRA2. Este gene codifica uma protease
(também conhecida como Omi) localizada principalmente no espaço intermembranas das
mitocôndrias (Moisoi et al., 2009), A proteína atuaria como uma molécula pró-apoptótica e a
sua presença impediria o acúmulo de proteínas malformadas e agentes causadores de
estresses oxidativos (Ross et al., 2008).
Por meio de uma interação com uma proteína da membrana da mitocôndria
(Mpv17l), a proteína HTRA2 forma um complexo que identifica e regula o estresse oxidativo,
possibilitando a remoção dos danos causados pelo mesmo. Um aumento na geração de
espécies reativas de oxigênio (ROS) gera uma diminuição de Mpv17l, que induz uma
conformação alterada da proteína HTRA2, sendo esta liberada para o citosol, onde exerce
suas atividades pró-apoptóticas (Krick et al., 2008).
A perda da atividade de HTRA2 estaria relacionada com diversas desordens
neurodegenerativas, principalmente o mal de Parkinson, além de levar a um aumento de
danos oxidativos nas moléculas (Ross et al., 2008; Moisoi et al., 2009). Lindholm et al.
(2004), observaram que as células deficientes para o gene HTRA2 foram mais sensíveis à
morte induzida por estresse.
Outros genes que atuam nas respostas ao estresse foram encontrados
diferencialmente expressos, a maioria reprimidos nos pacientes, tais como SESN1, POLH,
RFC5, CDH13, REV3L, WRNIP1, H2AFX, RAD52, GSTM3, MLH1 e PRKDC, o que pode
indicar uma deficiência nos processos dependentes da atuação das proteínas
correspondentes codificadas por esses genes.
Discussão
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46
Além da expressão gênica alterada, outros fatores podem contribuir para o fenótipo
de doenças, como a má formação de proteínas ou mesmo a sua degradação, impedindo
que exerçam suas funções. A célula submetida a estresse agudo ou crônico pode sofrer
modificações em suas moléculas, como problemas no empacotamento de proteínas ou
mesmo agregação protéica. Diversas moléculas conhecidas como chaperonas são
responsáveis por restabelecer a correta conformação dessas proteínas (Garrido et al.,
2006).
As chaperonas são moléculas que auxiliam no empacotamento de proteínas recém
sintetizadas ou na identificação de proteínas danificadas para uma remodelagem ou
proteólise (Young et al. 2004; Kalmar & Greensmith, 2009). Quando proteínas danificadas
não podem ser reparadas pelas chaperonas, elas iniciam o ingresso em uma via proteolítica
pela adição de cadeias de ubiquitinas para posterior degradação, numa via complexa
mediada pelo sistema Ubiquitina-proteassoma (UBP) (Nakamura & Lipton, 2009).
Em resposta a diversos tipos de estresse cellular, tais como hipertermia, estresse
oxidativo, injúrias físicas/químicas, uma classe especial de chaperonas são expressas para
manutenção da homeostase celular, as “heat-shock protein” (HSP), que são classificadas de
acordo com seu tamanho molecular (Kalmar & Greensmith, 2009). Cada família de HSPs é
composta por membros que atuam em diferentes compartimentos celulares, algumas
exercendo funções na diferenciação celular (Garrido et al., 2006).
Em condições normais, as HSPs se ligam ao HSF1 (heat shock factor 1) formando
um monômero. Quando aumenta a quantidade de moléculas oxidantes no ambiente celular,
várias moléculas (DNA, lipídeos e proteínas) podem sofrem oxidação. As proteínas são
extremamente sensíveis a mudanças intracelulares e podem facilmente perder a sua
conformação e se tornarem danificadas. A presença dessas proteínas libera as HSPs do
HSF1, sendo que este último quando livre se dirige ao núcleo, promovendo a ativação da
transcrição das HSPs (Abravaya et al., 1992; Morimoto & Santoro 1998).
As HSPs atuam de diversas maneiras para proteção celular em resposta a danos
oxidativos. Algumas HSPs atuam como sensores do estresse oxidativo, enquanto outras
regulam moléculas de cascatas celulares diversificadas, como inflamações e processos
apoptóticos, inibindo alguns componentes e dessa forma, promovendo a sobrevivência da
célula (Kalmar e Greensmith, 2009).
Defeitos em mecanismos de reparo e degradação de proteínas são associados com
diversas doenças, especialmente as neurodegenerativas. De acordo com o envelhecimento
do organismo, danos nas proteínas se tornam cada vez mais freqüentes, liberando cada vez
mais o fator HSF, o que eleva a transcrição de HSPs na célula, contribuindo para uma
Discussão
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47
grande quantidade de chaperonas nesses organismos (Stadtman & Berlett, 1998; Soti &
Csemely, 2003). Sobrecargas de chaperonas, que ocorre na maioria dos indivíduos idosos,
pode causar defeitos na transdução de sinais, transporte de proteínas, reconhecimento
imune e organização celular. Sendo assim, as células de indivíduos idosos podem se tornar
mais desorganizadas, ou até mesmo comprometidas (Csermely, 2001; Nardai et al., 2006;
Soti & Sermerly, 2007). Além disso, a atividade das chaperonas pode tornar-se
comprometida com o envelhecimento, atuando como “moléculas suicidas” (Macário &
Conway de Macário, 2005).
Cinco genes para proteínas HSPs em particular foram diferencialmente expressos
em nosso trabalho, quatro deles foram induzidos (HSPA13 ou STCH; HSP47 ou SERPINH1;
HSPB1 e DNAJC13) e um reprimido (HSPE1 ou HSP10) nos pacientes frágeis realtivamente
aos controles.
A proteína HSPA13 parece ter uma relação com a regulação do ciclo celular e
eventos apoptóticos (Kaye et al., 2000). Em contrapartida, HSP47 está presente
principalmente em células produtoras de colágeno, sendo que alterações em sua expressão
pode afetar a biossíntese dessas moléculas. Miyaishi et al. (1995) verificaram uma
diminuição da expressão de HSP47 em fibroblastos em processo de envelhecimento,
resultando em um acúmulo de protocolágenos desnaturados dentro destas células.
O gene HSP10 codifica uma chaperona relacionada diretamente com o reparo de
proteínas modificadas pelo estresse oxidativo. A proteína HSP10 é encontrada
principalmente nas mitocôndrias, exercendo suas funções de transporte, remodelamento e
prevenção contra agregação das proteínas mitocondriais. Estudos verificaram um aumento
da quantidade de HSP10 em mitocôndrias de células jovens, mas não em antigas, após
indução de estresse. Enquanto em células jovens o aumento de HSP10 pode reparar os
danos causados por agentes genetóxicos, uma baixa quantidade dessas proteínas em
células velhas pode levar a um acúmulo de proteínas danificadas, levando a uma
instabilidade mitocondrial (Haak et al., 2009).
Além das chaperonas, diversos genes envolvidos na via Ubiquitina-Proteassoma
foram modulados neste trabalho, dentre eles NEDD4L, WDSUB1, UBE3A, UBE2E1, TRAP1,
RNF2, PSMA5, FBXO4, ANAPC7 (modulados negativamente) RNF128, PSMD10, RNF138,
RNF144, PIAS1, HERC1, FBXL11, FBXL3, RNF149 e FBXL5 (modulados positivamente). A
maioria desses codifica proteínas responsáveis pela ubiquitinação de proteínas degradadas
ou malformadas, sinalizando-as para posterior proteólise. Dois grupos gênicos se destacam
por possuírem um grande número de genes induzidos nos idosos frágeis: o grupo de
proteínas F-box e as ring fingers. Essas duas classes de proteínas pertencem a um grupo
Discussão
___________________________________________________________________________
48
especial de ubiquitina, as E3, que conferem uma especificidade à ubiquitinação, transferindo
a ubiquitina das enzimas E2 para os substratos (Deschaies & Joazeiro, 2009; Ho et al.,
2006).
Combinando os dados encontrados na literatura para os genes discutidos no
trabalho, podemos inferir que devido a uma deficiência encontrada em alguns genes
relacionados ao reparo do DNA e resposta ao estresse, juntamente com a expressão
induzida de vias relacionadas à degradação de proteínas, o estresse oxidativo sofrido pelas
células de pacientes idosos frágeis pode levar à instabilidade genética, contribuindo para o
desenvolvimento do quadro clínico observado nesses indivíduos. Estudos mais específicos
acerca desses processos são necessários para corroborar esta hipótese.
Outros genes que apresentaram a sua expressão diferencial entre pacientes e
controles podem servir como marcadores biológicos, apesar de não terem uma relação
direta com processos de envelhecimento. Os genes HBA1 e HBA2 tiveram sua expressão
induzida (FC = 55 e 25 respectivamente) e estão relacionados com a produção de cadeias α
da molécula de hemoglobina. Apesar de serem geralmente associados com indivíduos
diabéticos, alguns autores correlacionam diferenças na expressão de HBA com o
envelhecimento. Fachin et al. (2009) encontraram esses mesmos genes induzidos em
estudo realizado com profissionais expostos a baixos níveis de radiação ionizante.
Pani et al. (2008) demontraram que a quantidade de hemoglobina A aumenta com a
idade, sugerindo que fatores não-glicemicos possam contribuir para essa relação
hemoglobina A e envelhecimento. Esses autores inferem que este aumento pode ser devido
ao uso de medicamentos. Outro estudo com pacientes idosos não diabéticos não encontrou
nenhuma relação da variação da hemoglobina A com o envelhecimento (Duruk et al., 2005).
Dentre os genes reprimidos nos pacientes, estão o SLC19A3 e PRKDC (FC = -8 e -7
respectivamente). O gene SLC19A3 codifica uma proteína da família SLC19A, que possui
função de transporte de solutos, especialmente folato e tiamina, vitaminas do complexo B.
SLC19A3 transporta especificamente a tiamina e, em cérebro de ratos, foi encontrada uma
grande expressão dessa proteína. Vários autores sugerem que a atividade desses
transportadores garante a falta de complicações cardiovasculares e neurológicas, sendo que
a ausência de vitaminas do complexo B se relaciona com diversas doenças, especialmente
as neurodegenerativas (Eudy et al., 2000; Ganapathy et al., 2004).
A baixa expressão encontrada para o gene SLC19A3 sugere uma relação com o
desenvolvimento do quadro clínico de fragilidade, privando as células de receberem a
tiamina, mas permanece a ser investigado se realmente esse metabólito está deficiente nas
células e se a falta deste influencia a vulnerabilidade do indivíduo. Em caso positivo,
Discussão
___________________________________________________________________________
49
terapias de incorporação desta vitamina auxiliariam no combate dos sintomas da sua
ausência.
Consequentemente, apesar de existirem diversos fatores relacionados com o
desenvolvimento da fragilidade em idosos, as informações obtidas nesse trabalho fornecem
uma contribuição importante na elucidação de alguns mecanismos fisiológicos e
moleculares que podem ser correlacionados com a progressão da síndrome, além de
apontar genes candidatos a possíveis marcadores biológicos para a fragilidade.
Conclusões
___________________________________________________________________________
50
6. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos na avaliação de danos no material genético em linfócitos de
pacientes idosos com a síndrome da fragilidade, comparados com um grupo controle sadio,
demonstraram um aumento no acúmulo de lesões oxidativas em linfócitos desses indivíduos
quando submetidos ao tratamento com hOGG1, uma enzima específica para dano oxidativo
do tipo 8-oxoG. Em contrapartida, a quantidade de danos basais desses dois grupos não
apresentou diferenças significativas.
Adicionalmente, a cinética de reparo das lesões oxidativas analisada em
experimentos nos quais os linfócitos de idosos frágeis foram tratados com peróxido de
hidrogênio, mostrou um reparo deficiente, visto que houve um atraso na remoção das lesões
no DNA quatro horas após a remoção do peróxido, além de uma maior quantidade de danos
logo após o tratamento. Os resultados sugerem uma sensibilidade aumentada dos pacientes
frente a um agente causador de estresse, além de problemas na maquinaria de reparo.
A expressão dos genes FEN1 e SOD1 mostrou-se induzida, provavelmente em
resposta à quantidade de danos acumulados no DNA dos pacientes. Por outro lado,
observou-se uma repressão dos genes XRCC1, OGG1 e APEX1, o que pode corroborar os
dados obtidos nos experimentos de cinética de reparo.
A análise da expressão gênica em larga escala por “microarrays” apresentou uma
série de genes diferencialmente expressos, quando comparados os resultados obtidos entre
pacientes idosos frágeis e sadios. Diversas vias de processos biológicos foram
demonstradas comprometidas, em especial as de reparo de lesões no DNA, sistemas de
processamento e degradação de proteínas e as vias relacionadas às respostas ao estresse.
Apesar de ser uma síndrome dependente de fatores externos para o desenvolvimento do
fenótipo do indivíduo, a expressão diferencial de diversos genes estudados sugere um
comprometimento de vias metabólicas que podem contribuir, direta ou indiretamente, para o
quadro clínico de fragilidade do idoso, merecendo um estudo mais detalhado quanto a
vários genes biomarcadores em potencial.
Os resultados obtidos fornecem uma contribuição relevante para uma caracterização
mais apurada da síndrome da fragilidade, sugerindo possíveis genes candidatos a
marcadores biológicos, promovendo ferramentas que possam ser úteis no diagnóstico da
mesma e apontando mecanismos moleculares deficientes, o que também pode auxiliar na
busca de estratégias para o tratamento dos pacientes.
Referências Bibliográficas
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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Anexos
___________________________________________________________________________
58
HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO
PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Campus Universitário Monte Alegre - Fone: 3633-1000 - Fax: 3633-1144
CEP 14048-900 RIBEIRÃO PRETO - SÃO PAULO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – PACIENTES
NOME DA PESQUISA: ESTUDO DAS ALTERAÇÕES GENÉTICAS EM LINFÓCITOS
DE INDIVÍDUOS PORTADORES DA SÍNDROME DA FRAGILIDADE.
PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Danillo Lucas Alves Espósito
ENDEREÇO PARA CONTATO : Av. Bandeirantes, 3900; CEP: 14049-900
Laboratório de Citogenética e Mutagênese, Bloco G
Depeartamento de Genética - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo (FMRP/USP).
Telefone : (16) 3602-3082
Prezado (a) doador (a),
A síndrome da fragilidade é geralmente definida como um quadro clínico de fraqueza e
vulnerabilidade que atinge pessoas de idade avançada, acima de 65 anos, onde seus principais
sintomas são modificações relacionadas com as atividades motoras (como a dificuldade de andar)
afetando tanto o sistema muscular quanto nervoso. Neste trabalho queremos investigar quais os
possíveis fatores que podem levar ao desenvolvimento da doença, buscando informações que
possam ser importantes para melhorar a qualidade de vida dos pacientes, embora o presente
estudo não deva beneficiar diretamente os pacientes.
Este estudo nos ajudará a compreender melhor esta síndrome, já que pouco se sabe sobre ela,
além de contribuir para o diagnóstico, prevenção e tratamento. Para a realização desta pesquisa é
necessária a sua participação como paciente.
Caso concorde em participar da pesquisa, serão coletados 20ml do seu sangue (equivalente a
uma seringa de tamanho médio), sendo que você não sofrerá uma nova picada de agulha, além daquela
necessária para a coleta de sangue para os exames de rotina. Você não terá que realizar nenhum gasto
e também, não será remunerado(a) pela sua colaboração na pesquisa. A coleta será feita pelo técnico
responsável do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, de modo que você receberá assistência
adequada no ato da colheita de sangue.
Se aceitar participar da pesquisa, você poderá pedir esclarecimentos sobre como o material
está sendo utilizado sempre que achar necessário. Nós asseguramos que a sua participação será
considerada confidencial, ou seja, você não será identificado(a) em nenhuma ocasião.Você não é, de
Anexos
___________________________________________________________________________
59
modo algum, obrigado a colaborar com esta pesquisa e, mesmo que concordar agora, poderá retirar o
seu consentimento a qualquer momento que desejar.
Colaborando ou não com a pesquisa, você continuará recebendo a mesma atenção e
tratamento, o qual não será prejudicado sob hipótese alguma por causa da sua participação, ou não,
neste trabalho. Gostaríamos ainda de esclarecer que, caso seja de nosso interesse realizar outro tipo de
estudo com o seu sangue, você será informado(a) sobre esse novo trabalho e este só será realizado
após o seu consentimento.
PESQUISADOR RESPONSÁVEL
Eu,______________________________________________________________________, RG
n
o
____________________________, abaixo assinado, tendo recebido as informações acima e ciente
dos meus direitos, abaixo relacionados, concordo em participar da pesquisa.
Serão preservados os direitos do doador, conforme seguem:
1) A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida
acerca dos procedimentos, riscos e benefícios e outros relacionados com a pesquisa;
2) A liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo,
sem que isso traga prejuízo em relação ao seu tratamento no hospital;
3) A segurança de que o doador não será identificado e, que será mantido o caráter confidencial
da informação relacionada à sua privacidade;
4) O compromisso de proporcionar informação atualizada ao doador durante o estudo, ainda que
esta possa afetar a sua vontade de continuar participando;
5) Não ocorrerão prejuízos no tratamento clínico instituído neste ambulatório, pois não serão
substituídas ou modificadas quaisquer medicações por conta deste estudo;
6) Pelo fato desta pesquisa não impor risco à saúde dos pacientes, não haverá a necessidade de
conceder remuneração ou ressarcimento aos participantes, mas em casos excepcionais, caso o
paciente se sinta lesado com o procedimento da coleta de sangue, este poderá requerer os seus
direitos de acordo com as leis vigentes no país.
7) Caso haja algum gasto adicional, este ocorrerá por conta do pesquisador.
Tendo ciência do exposto acima, assino abaixo
Ribeirão Preto,____de____________________de________.
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