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ANDRÉA LUIZA CUNHA LAURA
EFEITOS DA INGESTÃO DE EXTRATO
HIDROACETÔNICO DE Maytenus ilicifolia
E HIDROETANÓLICO DE Achyrocline alata
EM RATAS PRENHES E SEUS FETOS
CAMPO GRANDE
MATO GROSSO DO SUL - BRASIL
DEZEMBRO / 2009
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i
ANDRÉA LUIZA CUNHA LAURA
EFEITOS DA INGESTÃO DE EXTRATO
HIDROACETÔNICO DE Maytenus ilicifolia
E HIDROETANÓLICO DE Achyrocline alata
EM RATAS PRENHES E SEUS FETOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Saúde e Desenvolvimento na
Região Centro-Oeste da Universidade Federal
de Mato Grosso do Sul, como requisito parcial
para a obtenção do título de Doutor.
Orientador: Prof. Dr. João Máximo de Siqueira.
CAMPO GRANDE
MATO GROSSO DO SUL - BRASIL
DEZEMBRO / 2009
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ii
iii
Este trabalho é dedicado:
À minha mãe Laudelina Rocha Cunha, pelo exemplo de amor, renúncia e dedicação,
cujo apoio e incentivo sempre foram fundamentais na minha vida.
A meus filhos Pedro Enrico e Lívia Elena que transformaram minha existência, meus
eternos amores..., desculpem-me pelas ausências por causa do trabalho...
Ao meu esposo amado e amigo Valdemir, cúmplice de jornada de aprendizado,
obrigada pelo carinho...
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus pai e criador...
A Jesus, irmão maior, exemplo de amor incondicional...
À Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Faculdade de Medicina
“Doutor Hélio Mandetta” e ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e
Desenvolvimento na Região Centro-Oeste, pela oportunidade de realização deste
Curso.
À Coordenação do Curso de Pós-Graduação e seus funcionários pela
dedicação prestada ao crescimento do Curso.
Aos Docentes das disciplinas cursadas na Pós-Graduação, pelos
conhecimentos adquiridos e aos Pós-Graduandos pelo prazeroso convívio.
À FUNDECT/MS (Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência
e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul) pelo auxílio financeiro (Edital
Chamada FUNDECT N° 06/2005 – Doutorado no MS – Processo: 41/100.230/2005).
A meus pais, Antônio Liberato da Cunha (in memória) e Laudelina Rocha
Cunha, que me deram a vida e me ensinaram a vivê-la com coragem e dignidade,
pelo amor e exemplo de vida.
A meus irmãos e irmãs, pelo apoio e incentivo em minha vida.
A Valdemir Antônio Laura e aos nossos amados filhos, Pedro Enrico e Lívia
Elena, por serem indispensáveis ao meu equilíbrio, por me fazer querer ser uma
pessoa melhor.
A Maria Sudária Garcia (Sogrinha), Iraceles Aparecida Laura e Idarlete Garcia
Laura (Cunhadas) pelo apoio e auxílio com os filhos em inúmeras ocasiões.
À minha amiga Gisele de Almeida, que jamais desiste de si mesma e das
pessoas que ama, jamais desiste de ser feliz, que mesmo estando longe, sinto
sempre presente a meu lado.
À Adriana da Silva Cabanha de Matos pelo apoio e valiosa colaboração com
os filhos e o lar.
Ao Professor Dr. João Máximo de Siqueira pela confiança em mim
depositada, apoio, orientação, sugestões, paciência e amizade demonstrados
durante e execução deste trabalho e no transcorrer de todo o curso.
v
À Maria Rita Stringhetti de Toledo por ter possibilitado e incentivado nossos
trabalhos iniciais na área de toxicologia da reprodução e plantas medicinais.
À Profa. Dra. Maria do Carmo Vieira pela confiança, oportunidade de parceria
e recurso financeiro (Chamada Fundect Nº 04/2005 - Rede de Pesquisa - Processo:
23/200.040/2007 - Termo de Outorga n° 002/07) disponibilizado para aquisição de
equipamentos imprescindíveis e fundamentais para a execução dos experimentos
em condições controladas e seguras.
À Profa. Dra. Luciane Candeloro pela confiança e recurso financeiro
(Chamada Fundect Nº 04/2006 UNIVERSAL - Processo: 23/200.197/2007 - Termo
de Outorga n° 0026/2008) disponibilizado para aquisição do material de consumo
dos experimentos.
À Profa Dra. Ezilda Jacomassi (UNIPAR, Umuarama, PR, Brasil) pela
identificação botânica das exsicatas de número 902 e 2.191 (Maytenus ilicifolia),
oriundas do Herbário DDMS de Dourados/MS.
À Andréa Lantieri Correa de Barros e Roseana Silveira Leite, pela dedicação,
responsabilidade, valioso apoio e consideração em todas as etapas de condução
dos experimentos.
Aos acadêmicos: João Marcos Souza Gualberto, Plínio Turine Neto, Ana
Cláudia de Oliveira Fernandes e Juliana Libman Luft, pela ajuda na condução de
algumas etapas dos experimentos.
Ao Dr. Rodrigo J. Oliveira e Véssia da Silva Leite pela dedicação,
responsabilidade e valiosa ajuda na análise esquelética e visceral dos experimentos.
Ao Cláudio Gonçalves Oliveira, Simone Bertozi de Souza Vasconcelos e
Luciane Candeloro pelo apoio valioso e fundamental na confecção e análise do
material histológico.
A todos os funcionários do Biotério da UFMS pela atenção e boa vontade em
colaborar disponibilizando os animais.
Ao amigo Paulo Robson de Souza por seu valioso e fundamental apoio no
registro do material fotográfico. Aos Técnicos e Profs. do Departamento de Biologia
da UFMS, em especial Teresa C. Stocco Pagotto, Édna Scremin-Dias, Maria
Rosângela Sigrist, Ângela L. Bagnatori Sartori, Danielle S. de Lima Moraes, Aline P.
Lorenz Lemke, Marina de L. Xavier Corrêa, Sandra dos Santos Cereali e Simone R.
Mendes Grance, pela torcida, apoio, e consideração.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
vi
SUMÁRIO
Maytenus ilicifolia
ix
LISTA DE FOTOS
ix
LISTA DE FIGURAS
xi
LISTA DE TABELAS
xv
Achyrocline alata
xvi
LISTA DE FOTOS
xvi
LISTA DE FIGURAS
xvii
LISTA DE TABELAS
xx
RESUMO
xxi
ABSTRACTS
xxiv
1. INTRODUÇÃO GERAL
1
2.A REVISÃO DE LITERATURA
4
2.A.1 Maytenus ilicifolia (Espinheira-Santa)
4
2.A.2 Substâncias Químicas
6
2.A.2.1 Triterpenos
7
2.A.2.2 Substâncias Fenólicas
9
2.A.2.2.1 Taninos
10
2.A.2.2.2 Flavonóides
12
2.A.3 Propriedades farmacológicas
13
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
17
EXPERIMENTO I - Maytenus ilicifolia
27
1. INTRODUÇÃO
27
2. OBJETIVOS
29
2.1 Objetivo Geral
29
2.2 Objetivos Específicos
29
3. MATERIAL E MÉTODOS
30
3.1 Procedência e Coleta do Material Botânico
30
3.2 Obtenção do Extrato Vegetal
30
3.3 Animais de Experimentação
31
vii
3.4 Acasalamento e Diagnóstico de Prenhez
31
3.5 Determinação da Dosagem
32
3.6 Grupos e Delineamento Experimental
32
3.7 Avaliação da Toxicidade Materna
33
3.8 Avaliação do Desempenho Reprodutivo Materno e do
Desenvolvimento Embrionário
34
3.9 Avaliação do Desenvolvimento das Ninhadas
36
3.9.1 Fixação e Análise Visceral
36
3.9.2 Diafanização e Análise Esquelética
42
3.9.3 Fixação e Análise Histológica
45
3.10 Análise Estatística e Registro do Material Fotográfico
46
4. RESULTADOS
47
4.1 Toxicidade Materna
47
4.2 Desempenho Reprodutivo Materno e Desenvolvimento Embrionário
51
4.3 Desenvolvimento das Ninhadas
53
4.3.1 Análise Visceral
53
4.3.2 Análise Esquelética
57
4.3.3 Análise Histológica
60
5. DISCUSSÃO
73
5.1 Toxicidade Materna
73
5.2 Desempenho Reprodutivo Materno e Desenvolvimento Embrionário
74
5.3 Desenvolvimento das Ninhadas
76
5.3.1 Análises Esquelética e Visceral
76
5.3.2 Análise Histológica
78
6. CONCLUSÕES
85
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
86
2.B REVISÃO DE LITERATURA
100
2.B.1 Achyrocline alata (Jateí-kaá ou Jataí-kaá)
100
2.B.2 Substâncias Químicas
101
2.B.3 Propriedades farmacológicas
103
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
107
viii
EXPERIMENTO II- Achyrocline alata
113
1. INTRODUÇÃO
113
2. OBJETIVOS
116
2.1 Objetivo Geral
116
2.2 Objetivos Específicos
116
3. MATERIAL E MÉTODOS
117
3.1 Procedência e Coleta do Material Botânico
117
3.2 Obtenção do Extrato Vegetal
117
3.3 Animais de Experimentação
117
3.4 Determinação da Dosagem
118
3.5 Grupos e Delineamento Experimental
118
4. RESULTADOS
120
4.1 Toxicidade Materna
120
4.2 Desempenho Reprodutivo Materno e Desenvolvimento Embrionário
124
4.3 Desenvolvimento das Ninhadas
127
4.3.1 Análise Visceral
127
4.3.2 Análise Esquelética
131
4.3.3 Análise Histológica
134
5. DISCUSSÃO
142
5.1 Toxicidade Materna
142
5.2 Desempenho Reprodutivo Materno e Desenvolvimento Embrionário
143
5.3 Desenvolvimento das Ninhadas
145
5.3.1 Análises Esquelética e Visceral
145
5.3.2 Análise Histológica
147
6. CONCLUSÕES
153
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
154
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
166
9. ANEXOS
167
ix
LISTA DE FOTOS
EXPERIMENTO I - Maytenus ilicifolia
Foto 1 – Relação e localização de cortes utilizados durante o estudo de
malformações viscerais: (1) Corte transversal na altura da cavidade oral; (2)
Corte frontal na região pré-gabelar; (3) Corte frontal na região orbital; (4) Corte
frontal na região do vértex; (5) Corte transversal na região de pescoço; (6)
Corte transversal na região do terço médio toráxico; (7) Corte transversal na
região abdominal inferior; (8) Corte transversal na região pélvica. Fonte:
Oliveira, 2001.
Foto 2 – Sequência de cortes para estudo visceral em feto normal. (A) Corte
transversal na altura da cavidade oral: 1 – Palato, 2 – Cérebro; (B) Corte
frontal na região pré-gabelar: 1 – Septo nasal; 2 – Coana; (C) Corte frontal na
região orbital: 1 – Bulbo olfatório, 2 – Cristalino, 3 – Coana, 4 – Retina; (D)
Corte frontal na região do vértex: 1 – Ventrículo Lateral, 2 – Terceiro
ventrículo; (E) Corte transversal na região de pescoço: 1 – Traquéia, 2 –
Esôfago, 3 – Medula espinhal; (F) Corte transversal na região do terço médio
toráxico: 1 – Traquéia, 2 – Timo, 3 – Coração, 4 – Aurícula direita; 5 – Fígado.
Fonte: Oliveira, 2001
Foto 3 – Sequência de cortes para estudo visceral em feto normal. (A) Corte
transversal na região do terço inferior do tórax: 1 – Medula, 2 – Diafragma; (B)
Corte transversal na região do terço superior do tórax: 1 – Medula espinal, 2 –
Artéria Aorta, 3 – Fígado, 4 – Veia Cava Inferior, 5 – Veia hepática; (C) Corte
transversal na região do terço médio abdominal: 1 – Estômago, 2 – Rins, 3 –
Fígado, 4 – Alças intestinais, 5 – Medula espinal; (D) Corte transversal na
região do terço inferior abdominal: 1 – Rins, 2 – Medula espinhal, 3 – Fígado,
4 – Alças intestinais. Fonte: Oliveira, 2001.
Foto 4 – Sequência de cortes para estudo visceral em feto normal. (A) Corte
transversal na região pélvica: 1 – Rins, 2 – Medula espinhal, 3 – Fígado, 4 –
Alças intestinais, 5 – Pelve renal; (B) Cortes transversal na região pélvica: 1 –
Ovários, 2 – Cornos uterinos (útero bicórneo), 3 – Bexiga, 4 – Alças
Intestinais; (C) Corte transversal na região pélvica: 1 – Testículos, 2 – Bexiga,
3 – Intestino grosso. Fonte: Oliveira, 2001.
Foto 5 – Corte transversal de rins, (A) Aspecto normal: 1 – Papila renal, 2 –
Pelve renal, 3 – Medula espinhal. Fonte: Oliveira, 2001.
Foto 6 – Corte transversal de rins. (A) Aspecto dismórfico: 1 – Hidronefrose;
(B) Aspecto dismórfico: 1 – Hidronefrose e hipoplasia de papila renal; (C)
Aspecto dismórfico: 1 – Hidronefrose, 2 – Hidronefrose e hipoplasia de papila
renal. Fonte: Oliveira, 2001.
Foto 7 – Vista superior da ossificação craniana normal: (A) Nasal; (B) Frontal;
(C) Parietal; (D) Interparietal; (E) Supraoccipital. Fonte: Damasceno et al.,
2008.
x
Foto 8 – Vista lateral da ossificação craniana normal: (F) Pré-maxilar; (G)
Maxilar; (H) Zigomático; (I) Escamoso; (J) Exoccipital. Fonte: Damasceno et
al., 2008.
Foto 9 – Vista ventral da ossificação craniana normal: (L) Volmer; (M) Palato;
(N) Présfenóide; (O) Basisfenóide; (P) Hamulo; (Q) Basoccipital, (R)
Orbtosfenóide; (S) Tímpânico. Fonte: Damasceno et al., 2008.
Foto 10 – Pontos de ossificação do esterno adulto anormal: (A) Esternébrio
anormal; (B) Agenesia de esternébrio; (C) Esternébrio com ossificação
incompleta. Fonte: Damasceno et al., 2008.
Foto 11 – Corte transversal na região pélvica normal em feto do grupo Tratado
1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP. Aspecto Normal do Sistema Urogenital. (A) Maculino: 1 – Testículos, 2 –
Bexiga, 3 – Alças Intestinais, 4 – Rins, 5 – Ureteres, 6 - Intestino grosso; (B):
Feminino:1 – Ovários, 2 – Cornos uterinos (útero bicórneo), 3 – Bexiga.
Campo Grande (UFMS), 2009.
Foto 12 – Corte frontal na região do vértex em feto do grupo Controle 2 (C2)
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP. (A)
Aspecto Normal: 1 – Ventrículo Lateral, 2 – Terceiro Ventrículo, 3 – Quarto
Ventrículo, 4 – Hemisfério cerebral; (B) Aspecto Alterado (Dismórfico): 1
Hidrocefalia à custa de dilatação do terceiro e quarto ventrículos; (C) 1 -
Hidrocefalia à custa de dilatação dos ventrículos laterais, 2 – terceiro e quarto
ventrículos. Campo Grande (UFMS), 2009.
Foto 13 – Corte transversal de rins em feto do grupo Controle 2 (C2):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP. (A)
Aspecto Normal do Rim, 1 – Papila renal, 2 – Pelve renal, 3 – Medula
espinhal; (B) Hidronefrose. Campo Grande (UFMS), 2009.
Foto 14 – Vista superior da ossificação craniana com fontanela normal (*) em
feto do grupo Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia
(15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP; (a) nasal; (b) frontal; (c) parietal; (d) interparietal; (e)
supraoccipital. Campo Grande (UFMS), 2009.
Foto 15 – Pontos de ossificação do esterno normal em feto do grupo Tratado
2 (T2): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º
DP; (a) Manúbrio; (b) 4 Centros Esternais; (c) Processo Xifóide. Campo
Grande (UFMS), 2009.
Foto 16 – Pontos de ossificação do esterno anormal em feto do grupo
Controle (C2) receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º
DP. Ossificação Reduzida e Agenesia de Esternébrios. Campo Grande
(UFMS), 2009.
xi
LISTA DE FIGURAS
EXPERIMENTO I - Maytenus ilicifolia
Figura 1 - Peso corpóreo (média erro padrão da média) das ratas prenhes
no 1º, 6º, 15º e 20º dia(s) de prenhez (DP) nos grupos experimentais:
controle 1 (C1) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de
prenhez (DP); tratado 1 (T1) - receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia
(15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada
do 6º ao 15º DP e tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Maytenus
ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP. Teste Estatístico: ANOVA/Tukey,
p 0,05. Campo Grande (UFMS), 2009.
47
Figura 2 - Ganho de peso e ganho de peso líquido (média erro padrão da
média) das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) -
receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado
1 (T1) - receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP e
tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º
ao 15º DP. Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05. Campo Grande
(UFMS), 2009.
48
Figura 3 - Estimativa do consumo de água filtrada (média erro padrão da
média) das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) -
receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1
(T1) - receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP;
tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP; média de consumo do 2º ao 6º DP (M2-6); média de consumo do 7º
ao 15º DP (M7-15); média de consumo do 16º ao 20º DP (M16-20) e média de
consumo do 2º ao 20º DP (M2-20). Letras diferentes no mesmo intervalo
gestacional indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais
(Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05). Campo Grande (UFMS), 2009.
49
xii
Figura 4 - Estimativa do consumo de ração comercial (média erro padrão da
média) das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) -
receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1
(T1) - receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP;
tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP; média de consumo do 2º ao 6º DP (M2-6); média de consumo do 7º
ao 15º DP (M7-15); média de consumo do 16º ao 20º DP (M16-20) e média de
consumo do 2º ao 20º DP (M2-20). Letras diferentes no mesmo intervalo
gestacional indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais
(Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05). Campo Grande (UFMS), 2009.
50
Figura 5 – Fotomicrografia de baço de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP.
Congestão vascular (→) e deposição de hemossiderina (* grânulos de cor
marrom escura). HE, 400X.
60
Figura 6 – Fotomicrografia de baço de rata do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem
alteração. HE, 400X.
61
Figura 7 – Fotomicrografia de fígado de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem
alteração. HE, 400X.
62
Figura 8 – Fotomicrografia de rim de rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam
extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido
em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Congestão
vascular (→). HE, 200X.
63
Figura 9 – Fotomicrografia de rim de rata do grupo Controle 1 (C1): receberam
0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração. HE,
400X.
64
Figura 10 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia
(15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Congestão vascular (*) e hemorragia hepática (→).
HE, 200X.
65
xiii
Figura 11– Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de rata
do grupo Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1
mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage
do 1º ao 20º DP. Hemoperitônio (→). HE, 100X.
66
Figura 12 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração hepática. HE, 200X.
67
Figura 13 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração no peritônio. HE, 200X.
67
Figura 14 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia
(15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Vasos da derme congestos (→). HE, 200X.
68
Figura 15 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração na derme. HE, 200X.
69
Figura 16 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Observe
que o côrio viloloso (CV) e as áreas, decídua basal (DB), zona juncional (ZJ) e
zona labiríntica (ZL), estão bem organizadas. Sem alteração na placenta. HE,
100X.
70
Figura 17 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Maior
aumento das áreas de decídua basal (DB) e zona juncional (ZJ). HE, 200X.
70
Figura 18 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Maior
aumento da zona labiríntica. Os vasos fetais (→) e as lacunas vasculares
maternas estão bem definidos (*). HE, 200X.
71
xiv
Figura 19 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Observe
a zona labiríntica com os vasos fetais (→) e as lacunas vasculares maternas
(*) bem definidos. HE, 200X.
71
Figura 20 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Maior
aumento da zona labiríntica (ZL) próxima a placa coriônica. Observe o tronco
viloso (TV) ramificado entre os vasos fetais (→) e as lacunas vasculares
maternas (*). HE, 200X.
72
Figura 21 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Observe
o tronco viloso (TV) ramificado entre os vasos fetais (→) e as lacunas
vasculares maternas (*). HE, 200X.
72
xv
LISTA DE TABELAS
EXPERIMENTO I - Maytenus ilicifolia
Tabela 1. Pesos (média erro padrão da média) absoluto (PA) e relativo
(PRel) dos órgãos maternos nos grupos experimentais. Campo Grande
(UFMS), 2009.
51
Tabela 2. Desempenho (média erro padrão da média) reprodutivo das ratas
e análise dos fetos nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
52
Tabela 3. Anomalias viscerais fetais (médias ± erro padrão da média)
observadas nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
56
Tabela 4. Anomalias esqueléticas fetais (média erro padrão da média)
observadas nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
59
xvi
LISTA DE FOTOS
EXPERIMENTO II - Achyrocline alata
Foto 17 – Corte transversal na região pélvica normal em feto do grupo
Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º
ao 20º DP. Aspecto Normal do Sistema Urogenital: (A) Maculino 1 –
Testículos, 2 – Bexiga, 3 – Rins, 4 – Medula espinhal; (B) Feminino:1 –
Ovários, 2 – Cornos uterinos (útero bicórneo), 3 – Bexiga, 4 - Rins. Campo
Grande (UFMS),
127
Foto 18 – Corte frontal na região do vértex em feto do grupo Controle 1 (C1)
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. (A)
Aspecto Alterado (Dismórfico): 1 - Hidrocefalia à custa de dilatação do
terceiro e quarto ventrículos; (B) 1 - Hidrocefalia à custa de dilatação dos:
ventrículos laterais, 2 - terceiro e quarto ventrículos. Campo Grande (UFMS),
2009.
128
Foto 19 – Corte transversal de rim em feto do grupo Controle 2 (C2):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP. (A)
Aspecto Normal do Rim, 1 – Papila renal, 2 – Pelve renal, 3 – Medula
espinhal; (B) Aspecto dismórfico do rim - Hidronefrose. Campo Grande
(UFMS), 2009.
129
Foto 20 – Foto 20 – Vista da ossificação craniana em feto do grupo Tratado 2
(T2): receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º
DP. (A) Fontanela Normal (*), 1 - nasal, 2 - frontal, 3 - parietal, 4 -
interparietal, 5 - supraoccipital. (B) Fontanela um pouco aumentada (*).
Campo Grande (UFMS), 2009.
131
Foto 21 – Pontos de ossificação do esterno adulto em feto do grupo Controle
(C2) receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP: (A)
Manúbio, (B) Centros Esternais (Esternébrios Assimétricos), (C) Processo
Xifóide. Campo Grande (UFMS), 2009.
132
xvii
LISTA DE FIGURAS
EXPERIMENTO II- Achyrocline alata
Figura 22 - Peso corpóreo (média erro padrão da média) das ratas prenhes
no 1º, 6º, 15º e 20º dia(s) de prenhez (DP) nos grupos experimentais: controle
1 (C1) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP);
tratado 1 (T1) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao
20º DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP e
tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP. Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05. Campo Grande (UFMS),
2009.
120
Figura 23 - Ganho de peso e ganho de peso líquido (média erro padrão da
média) das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) -
receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1
(T1) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP e
tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP. Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05. Campo Grande (UFMS),
2009.
121
Figura 24 - Estimativa do consumo de água filtrada (média erro padrão da
média) das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) -
receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1
(T1) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP;
tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP; média de consumo do 2º ao 6º DP (M2-6); média de consumo do 7º
ao 15º DP (M7-15); média de consumo do 16º ao 20º DP (M16-20) e média de
consumo do 2º ao 20º DP (M2-20). Letras diferentes no mesmo intervalo
gestacional indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais
(Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05). Campo Grande (UFMS), 2009.
122
xviii
Figura 25 - Estimativa do consumo de ração comercial (média erro padrão
da média) das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) -
receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP), tratado 1
(T1) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP, controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP,
tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP, média de consumo do 2º ao 6º DP (M2-6), média de consumo do 7º
ao 15º DP (M7-15), média de consumo do 16º ao 20º DP (M16-20) e média de
consumo do 2º ao 20º DP (M2-20). Letras diferentes no mesmo intervalo
gestacional indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais
(Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05). Campo Grande (UFMS), 2009.
123
Figura 26 – Fotomicrografia de baço de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP.
Congestão vascular (→). HE, 200X.
135
Figura 27– Fotomicrografia de baço de rata do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem
alteração. HE, 200X.
135
Figura 28 – Fotomicrografia de fígado de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5
ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração. HE,
400X.
136
Figura 29 – Fotomicrografia de rim de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5
ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração. HE, 400X.
137
Figura 30 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP. Sem alteração hepática. HE, 200X.
138
Figura 31 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam: Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao
20º DP. Sem alteração no perotôneo. HE, 200X.
138
Figura 32 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração na derme. HE, 200X.
139
xix
Figura 33 – Fotomicrografia da placenta de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP.
Concentração de infiltrados de neutrófilos ao redor e na decídua basal (DB).
HE, 200X.
140
Figura 34 – Fotomicrografia da placenta de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP.
Concentração de infiltrados de neutrófilos ao redor e na decídua basal (DB).
HE, 400X.
141
xx
LISTA DE TABELAS
EXPERIMENTO II- Achyrocline alata
Tabela 5. Peso (média erro padrão da média) absoluto (PA) e relativo (PRel)
dos órgãos maternos nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS),
2009.
124
Tabela 6. Desempenho reprodutivo (média erro padrão da média) das ratas
e análise dos fetos nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
125
Tabela 7. Anomalias viscerais fetais (médias erro padrão da média)
observadas nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
130
Tabela 8. Anomalias esqueléticas fetais (média erro padrão da média)
observadas nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
133
xxi
RESUMO
No Brasil, as plantas medicinais têm assumido crescente importância como um
recurso terapêutico alternativo muito útil nos programas de atenção primária de
saúde. Entre as plantas mais solicitadas pela população de Campo Grande (MS) aos
raizeiros e/ou por eles indicadas, têm-se Maytenus ilicifolia (Espinheira-santa) e
Achyrocline alata (Jataí-kaá). Apesar de serem amplamente utilizadas, não há
trabalhos que atestem a sua seguridade em relação às gestantes. Dessa forma,
objetivou-se avaliar o risco toxicológico da exposição aos extratos hidroacetônico de
M. ilicifolia e hidroetanólico de A. alata no sistema reprodutivo de ratas Wistar e em
seus fetos, a fim de verificar a segurança das doses preconizadas e utilizadas na
medicina popular. Para tanto, foram realizados dois experimentos. No experimento
com M. ilicifolia (EMI), ratas prenhes foram distribuídas em quatro grupos
experimentais (dois grupos controles e dois grupos tratados). Os grupos foram
submetidos ao seguinte esquema de tratamento: Grupo Controle 1 (C1): receberam,
via gavage, 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); Grupo Tratado
1 (T1): receberam, via gavage, extrato seco de M. ilicifolia (15,1 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada do 1º ao 20º DP; grupos
Controle 2 (C2) e Tratado 2 (T2) receberam, respectivamente, as mesmas
substâncias administradas aos dois primeiros grupos, alterando-se apenas o tempo
de exposição, que foi do 6º ao 15º DP. O experimento com A. alata (EAA) foi
executado de forma idêntica ao de M. ilicifolia (EMI), alterando-se apenas a
dosagem administrada aos animais que foi de 3,9 mg/kg de peso corpóreo. O
protocolo para uso de animais em experimentação (nº 115/2006) foi aprovado pelo
Comitê de Ética da UFMS. No 20º DP, as ratas (EMI e EAA) foram submetidas à
eutanásia e laparotomia, os ovários, útero, órgãos maternos (baço, fígado e rins),
fetos e placentas foram retirados, pesados e avaliados externamente para verificar
possíveis distúrbios referentes à cor, ao tamanho, à textura e à presença de cistos.
Contou-se o número de corpos lúteos, fetos vivos e/ou mortos e reabsorções
embrionárias. A partir desses dados foram calculados os parâmetros relativos à
fertilidade (razão sexual, índice placentário, viabilidade fetal e as taxa de eficiência
de implantação, reabsorção e perdas pré e pós-implantação). Os fetos foram
divididos em grupos para as análises esquelética, visceral e histológica. Para a
xxii
comparação dos resultados quantitativos foram utilizados testes paramétricos e não
paramétricos (ANOVA e Kruskal-Wallis), conforme a natureza de distribuição dos
dados. Após a detecção de diferenças pela ANOVA e pelo Teste de Kruskal-Wallis
foi utilizado o teste de comparação múltipla de Tukey e Dunn, respectivamente. Os
dados qualitativos e as freqüências obtidas tiveram a ninhada utilizada como
unidade-base. Em todos os casos, quando p 0,05, a diferença foi considerada
estatisticamente significativa. No EMI e EAA, quando os grupos experimentais foram
comparados quanto: 1) aos sinais clínicos de toxicidade - não foram registradas
mortes maternas, eriçamento dos pêlos corporais, alteração da deambulação e
diarréia; 2) alterações de peso corpóreo - o acompanhamento diário da evolução
gestacional demonstrou que não houve diferenças significativas quanto ao peso
corpóreo (PC), ganho de peso (GP) e ganho de peso líquido (GPL), indicando
gestação normal sem efeito dos tratamentos; 3) alterações no consumo de alimento
e água – os indícios de toxicidade de M. ilicifolia e A. alata no período de
organogênese (consumo de água e ração) e durante todo período gestacional
(consumo de ração) parecem ter sido transitórios, uma vez que não foi constatada
diferenças quanto a PC, GP e GPL; 4) peso absoluto (PA) e relativo (PR) de fígado,
ovários, rins e útero materno com fetos e sem fetos – os resultados foram similares;
5) desempenho reprodutivo materno e desenvolvimento embrionário - os resultados
para tamanho dos fetos, assim como seu peso corpóreo e de suas placentas, índice
placentário e taxas (implantação, perdas pré e pós-implantação, reabsorção e
viabilidade fetal) encontravam-se semelhantes entre os grupos, sendo assim, os
tratamentos não alteraram as condições fisiológicas e intra-uterinas relacionadas
com a reprodução e desenvolvimento embrio-fetal; 6) análise macroscópica dos
órgãos maternos (baço, fígado e rins) - não revelou nenhuma alteração; 7) variações
esqueléticas e viscerais nos fetos – foram variantes do normal e possivelmente
regrediriam caso a gestação chegasse a termo e/ou no período pós-natal; 8) análise
microscópica dos fetos – não apresentou efeitos teratogênicos. Considerando o EMI:
1) 6º ao 15º DP e 1º ao 20º DP - não provocou alterações anátomo-histológicas no
fígado materno; não causou efeitos tóxicos ou alterações morfológicas na placenta
das ratas; 2) 1º ao 20º DP – apresentou efeitos citotóxicos maternos no baço e rins;
alterações fetais no fígado, hemoperitônio e vasos da derme. Considerando o EAA:
1) 6º ao 15º DP e 1º ao 20º DP - não provocou alterações anátomo-histológicas no
fígado e rins maternos; não provocou alterações nas células fetais do fígado, região
xxiii
peritoneal e derme; 2) 1º ao 20º DP - apresentou efeitos citotóxicos maternos no
baço e processo inflamatório agudo com concentração de infiltrados de neutrófilos
ao redor e na decídua basal das placentas (face materna) do grupo T1 (mais
intenso) e C2. No EMI e EAA não foram registradas mortes maternas e fetais, assim
como desvio da proporção esperada de 1:1 para razão sexual. Sendo assim, M.
ilicifolia e A. alata não afetaram os processos de organogênese e diferenciação
sexual dos fetos, ou seja, não são teratogênicas. Os resultados obtidos não excluem
a possibilidade de toxicidade humana durante a gestação. O uso como medicamento
deve ser previamente validado cientificamente na espécie humana, como qualquer
outro medicamento. A utilidade medicamentosa na gestação deve ser fundamentada
em evidências experimentais comprobatórias. Portanto, é preciso cautela, os efeitos
da exposição nos organismos materno e fetal, devem ser considerados, respeitando-
se a complexidade farmacológica e as possíveis transformações que se impõe a
unidade materno/placentária/fetal.
Palavras-Chave: Espinheira-santa/toxicidade, Marcela/toxicidade, Rattus
norvegicus, preparação de uso popular, desempenho reprodutivo, teratogênese,
histopatologia.
xxiv
ABSTRACT
In Brazil, the medicinal plants have assumed increasing importance as a resource
very useful therapeutic alternative in the programs of primary health care. Among the
plants most requested by the population of Campo Grande to salespeople and / or
indicated by them, have Maytenus ilicifolia and Achyrocline alata. Despite being
widely used, there are no papers attesting its safety in relation to pregnant women.
Thus, in this work the aim was to evaluate the toxicological risk of exposure to
hydroacetonic dry extract of M. ilicifolia and hydroethanolic of A. alata in the
reproductive system of rats (Rattus norvegicus) and their fetuses in order to verify the
safety of in the dose recommended and used in folk medicine. To this purpose, two
experiments were carried out. In the experiment with M. ilicifolia (EMI), pregnant rats
were distributed into four experimental groups (two control groups and two treated
groups). Both groups underwent the following treatment schedule: Group Control 1
(C1) received, by gavage, 0.5 mL of filtered water from the 1
st
to 20
th
day of
pregnancy (DP), the Group 1 (T1) received by gavage, dry extract of M. ilicifolia (15.1
mg / kg body weight) dissolved in 0.5 mL / day of filtered water from the 1
st
to the 20
th
DP, the control group 2 (C2) and the treated 2 (T2) received, respectively, the same
as those given to first two groups, changing only the exposure time, which was the 6
th
to the 15
th
DP. The experiment with A. alata (EAA) was performed identically to that
of M. ilicifolia (EMI) changing only the dosage administered to animals was 3.9 mg /
kg of body weight. The protocol for animal use in experimentation (No 115/2006) was
approved by the Ethics Committee of UFMS. In the 20
th
DP, the rats (EMI and EAA)
were subjected to euthanasia and laparotomy, the ovaries, uterus, maternal organs
(spleen, liver and kidneys), fetuses and placentas were removed, weighed and
assessed externally to investigate possible disturbances related to color, size, texture
and the presence of cysts. We counted the number of: lutea, live fetuses and / or
resorptions and dead cells. From these data we calculated the parameters for fertility
(sex ratio, placental index, fetal viability and the rate of: implantation efficiency,
turnover and loss pre-and post-deployment). The fetuses were divided into groups for
the analysis of skeletal, visceral and histology. For comparison of the quantitative
tests were used parametric and non parametric (ANOVA and Kruskal-Wallis),
depending on the type of data distribution. After the detection of differences by
ANOVA and the Kruskal-Wallis test was used for multiple comparisons and Dunn's
xxv
test, respectively. Qualitative data obtained and the frequencies have the litter used
as base unit. In all cases, when p 0.05, the difference was considered statistically
significant. In EMI and EAA, when the experimental groups were compared for: 1)
clinical signs of toxicity - no maternal deaths were recorded, erection of body hair,
abnormal walking and diarrhea; 2) changes in body weight - the daily monitoring of
gestational development showed no significant differences in body weight (BW),
weight gain (WG) and net weight gain (NPG), indicating normal pregnancy without
treatment effect; 3) changes in food consumption and water - the evidence of toxicity
of M. ilicifolia and A. alata during organogenesis (water consumption and diet) and
throughout the gestational period (intake) appear to be transient, since we found no
differences in BW, WG and NPG; 4) absolute weight (BP) and relative (RP) of liver,
ovaries, kidneys and uterus with fetuses and fetuses without - the results were
similar; 5) maternal reproductive performance and embryo development - the results
for size of the fetus, as well as their body weight and their placentas, and placental
index rates (implantation losses before and after implantation, fetal resorption and
viability) were similar between groups, so the treatments did not alter the
physiological conditions and intrauterine related with reproduction and embryo-fetal
development; 6) macroscopic analysis of maternal organs (spleen, liver and kidneys)
- revealed no changes; 7) visceral and skeletal variations in fetuses - were variants of
normal and possibly regress if the pregnancy came to term and/or the postnatal
period; 8) microscopic analysis of the fetus – did not show teratogenic effects.
Whereas EMI: 1) 6
th
to 15
th
DP and 1
s
t to 20
th
DP - did not alter anatomic lesions in
maternal liver, does not cause toxic effects or alterations in the placenta of rats, 2) 1
st
to 20
th
DP - showed cytotoxic effects on maternal spleen and kidneys, fetal liver,
hemoperitoneum and vessels of the dermis. Considering the EAA: 1) 6
th
to 15
th
DP
and 1
st
to 20
th
DP - do not alter anatomic lesions in maternal kidneys and livers, no
change in fetal liver cells, peritoneal region and dermis, 2) 1
st
to 20
th
DP - showed
cytotoxic effects on maternal spleen and acute inflammatory process with a
concentration of neutrophil infiltration around and in the placentas basal decidua
(maternal side) in group T1 (most intense) and C2. In the EMI and EAA were not
recorded maternal deaths and stillbirths, as well as deviation from expected ratio of
1:1 for sex ratio. Thus, M. ilicifolia and A. alata did not affect the processes of
organogenesis and sexual differentiations of the fetus, i.e., are not teratogenic. The
results do not exclude the possibility of human toxicity during pregnancy. The use as
xxvi
a medicine must first be scientifically validated in humans, like any other medicine.
The drug use during pregnancy should be based on experimental evidence showing
this evidence. Therefore, caution is needed, the effects of exposure in maternal and
fetal bodies, should be considered, respecting the complexity and possible
pharmacological changes which requires a mother/placenta/fetal development.
Keywords: Espinheira-santa/toxicity, Marcela/toxicity, Rattus norvegicus,
preparation of popular use, reproductive performance, teratogenesis, histopathology.
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
As plantas medicinais desempenham um importante papel na medicina
moderna. Primeiramente, porque podem fornecer fármacos extremamente
importantes, os quais dificilmente seriam obtidos via síntese química. Em segundo
lugar, as fontes naturais fornecem compostos que podem ser levemente
modificados, tornando-os mais eficazes ou menos tóxicos. Em terceiro lugar, os
produtos naturais podem ser utilizados como protótipos para obtenção de fármacos
com atividades terapêuticas semelhantes a dos compostos originais (ROBBERS,
SPEEDIE e TYLER, 1996).
Plantas Medicinais são aquelas que possuem tradição de uso em uma
população ou comunidade e são capazes de prevenir, aliviar ou curar enfermidades.
Ao serem processadas para a obtenção de um medicamento, tem-se como resultado
o medicamento fitoterápico (CARVALHO et al., 2007).
Segundo a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 48/2004 (Legislação
Atual que regulamenta o registro de Fitoterápicos – BRASIL, 2004a), da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), fitoterápico é o medicamento cujo
princípio ativo é um derivado de droga vegetal (extrato, tintura, óleo, cera, exsudato,
suco e outros), obtido empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas
vegetais, caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso,
assim como pela reprodução e constância de sua qualidade. Não se considera como
medicamento fitoterápico aquele que inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer
origem, nem as associações destas com extratos vegetais (CARVALHO et al.,
2007).
De acordo com a WHO (World Health Organization), devido à pobreza e
pouco acesso à medicina moderna, cerca de 65 a 80% da população mundial
dependem essencialmente das plantas como forma primária de cuidar da saúde
(SUZUKI, 2002; CALIXTO, 2005).
O produto natural é mais barato e, muitas vezes, de fácil acesso, o que
contribui para melhoria da saúde de pessoas de baixo poder aquisitivo (ANDRADE
et al., 2005).
Aproximadamente, 48% dos medicamentos empregados na terapêutica
advêm, direta ou indiretamente, de produtos naturais, especialmente de plantas
medicinais (BALUNAS e KINGHORN, 2005).
2
Segundo Aschwanden (2001) o mercado mundial de medicamentos
fitoterápicos é de US$ 43 bilhões por ano. Somente nos Estados Unidos da América,
este mercado representa US$ 5 bilhões por ano, sendo o setor de mais rápido
crescimento no mercado farmacêutico norte-americano.
Diante da grande importância dos medicamentos fitoterápicos, vários países
da Europa estão intensificando esforços para unificar a legislação referente aos
medicamentos fitoterápicos, amplamente comercializados nestes países (em
especial na Alemanha e França). No entanto, nos Estados Unidos, as preparações à
base de plantas são classificadas como suplementos nutricionais, não sendo
necessário submeter dados de segurança e eficácia ao Food and Drug
Administration (FDA) para a comercialização destes produtos (TUROLLA e
NASCIMENTO, 2006).
De acordo com Calixto e Yunes (2001), aproximadamente 75% dos
compostos puros naturais utilizados pelas indústrias farmacêuticas foram isoladas,
seguindo recomendações da população. Portanto, é mais provável encontrar
atividade biológica em plantas orientadas pelo uso popular do que em plantas
escolhidas ao acaso.
Nos últimos anos a legislação brasileira vem passando por modificações e
duas importantes políticas foram estabelecidas em 2006. A primeira foi a Política
Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde
(SUS), aprovada por meio da Portaria Ministerial MS/GM nº 971 de 03 de maio de
2006 (BRASIL, 2006a). A segunda foi a Política Nacional de Plantas Medicinais e
Fitoterápicos publicada por meio do Decreto nº 5.813 de 22 de junho de 2006
(BRASIL, 2006b). Ambas as políticas apresentam em suas diretrizes o incentivo à
pesquisa e ao desenvolvimento com relação ao uso de plantas medicinais e
fitoterápicos que possam ser disponibilizados com qualidade, segurança e eficácia à
população, priorizando a biodiversidade do país.
No Brasil, as espécies utilizadas como medicinais são principalmente nativas
e geralmente obtidas de forma extrativista. Muitas plantas, freqüentemente utilizadas
por populações locais, ainda não foram estudadas e nem seus princípios ativos
foram identificados para validá-las como medicamentos ou para aproveitá-las
economicamente. Mesmo assim, podem apresentar atividade medicinal satisfatória e
serem utilizadas desde que não apresentem efeito tóxico aparente (BALBACH,
1986; BERG, 1993).
3
De acordo com Simões et al. (2001), o uso popular e mesmo o tradicional,
não são suficientes para validar eticamente as plantas medicinais como
medicamentos eficazes e seguros. Nesse sentido, as plantas medicinais não se
diferenciam de qualquer outro xenobiótico sintético e a preconização ou autorização
oficial do seu uso medicamentoso, deve ser fundamentada em evidências
experimentais comprobatórias.
Além disto, sabe-se que muitas plantas medicinais apresentam substâncias
que podem desencadear reações adversas, seja por seus próprios componentes,
seja pela presença de contaminantes ou adulterantes presentes nas preparações
fitoterápicas exigindo um rigoroso controle de qualidade desde o cultivo, coleta da
planta, extração de seus constituintes, até a elaboração do medicamento final
(SILVA et al., 2001; TUROLLA e NASCIMENTO, 2006).
A baixa qualidade e padronização dos produtos comercializados, além do uso
de espécies erradas, da adulteração, superdosagens, uso indevido e interação com
medicamentos levou as autoridades sanitárias a preocuparem-se com a segurança,
eficácia e qualidade das drogas vegetais (SILVA et al., 2001).
As espécies medicinais apresentam metabolismo secundário produzindo
substâncias químicas com função de proteção ao ataque de pragas e doenças.
Estas substâncias que são nocivas a alguns organismos podem apresentar
atividades terapêuticas a outros e às vezes a relação tóxico/terapêutica depende
apenas da dose (MAGALHÃES, 1997).
No decorrer da gestação, vários agentes podem interferir no desenvolvimento
normal do embrião, levando a alterações funcionais e/ou morfológicas que podem
acarretar na inviabilidade do concepto. A intensidade de tais efeitos teratogênicos
depende de vários fatores, como: a etapa do desenvolvimento embrionário, o tempo
de exposição à substância, a relação dose-efeito, o genótipo materno-fetal e o
mecanismo patogênico específico de cada agente (SPRITZER, SANSEVERINO e
SCHULER, 2001).
Considerando que gestantes e lactantes constituem um grupo populacional
que culturalmente recorre ao uso de plantas medicinais, objetivou-se avaliar o risco
toxicológico da exposição ao extrato seco de Maytenus ilicifolia e de Achyrocline
alata sobre o sistema reprodutivo de ratas Wistar e em seus fetos, durante o período
de organogênese e durante todo o período de gestação (prenhez), a fim de
comprovar sua segurança na dose preconizada pela medicina popular.
4
2.A REVISÃO DE LITERATURA
2.A.1 Maytenus ilicifolia (Espinheira-santa)
Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss., família Celastraceae, é conhecida
popularmente como espinheira-santa pela aparência das folhas que possuem as
bordas com espinhos e pelas propriedades medicinais (MAGALHÃES, 2002).
A família Celastraceae engloba cerca de 50 gêneros compreendendo entre
800 e 850 espécies distribuídas nos trópicos e subtrópicos e apenas alguns gêneros
alcançam regiões temperadas (HEYWOOD, 1978; CRONQUIST, 1981).
O gênero Maytenus conta com 200 espécies tropicais, sendo que a América
do Sul dispõe do maior número delas. Destas, 40% ou aproximadamente 76
espécies e 14 variedades ocorrem no Brasil, destacando na flora nacional M.
ilicifolia. O nome do gênero Maytenus vem de Maytén, nome de uma planta utilizada
pelos Mapuches, no Chile. A denominação ilicifolia significa o que tem folhas iguais
ao Ilex, que é um azevinho usado como enfeite de Natal, do mesmo gênero no qual
se encontra a erva-mate (REIS e SILVA, 2004).
Os nomes populares são: cancerosa, cancoroso, cancrosa, congora,
coromilho-do-campo, erva-cancerosa, espinheira-santa, espinheira-divina, espinho-
de-Deus, limãozinho, maiteno, pau-josé, salva-vidas e sombra-de-touro (CORRÊA
JUNIOR, MING e SCHEFFER, 1994). Segundo Nunes et al. (2003), em Campo
Grande-MS, as raízes de M. ilicifolia são conhecidas popularmente como cancorosa
e as folhas como espinheira-santa.
M. ilicifolia, espécie autóctone (nativa) do Brasil (MARIOT e BARBIERI, 2007),
é encontrada principalmente na região sul do Brasil e nos países vizinhos, Paraguai,
Uruguai e Leste da Argentina. Ainda no Brasil registra-se a ocorrência no estado de
Mato Grosso do Sul e São Paulo, no interior de mata nativa e mata ciliar, onde o solo
é rico em matéria orgânica e bem drenada, em altitude de até 1.200 m. É uma planta
de clima temperado e subtropical com umidade relativa variando de média a alta
(RADOMSKI, 1998; CORRÊA JUNIOR, MING e SCHEFFER, 1994). O cultivo da
planta no estado do Paraná concentra-se nas regiões de Curitiba, Guarapuava e Irati
(REIS e SILVA, 2004).
M. ilicifolia é uma espécie arbórea-arbustiva, geralmente com 5 m de altura.
Apresenta caule liso e inserção das folhas helicoidal, o que a distingue de M.
aquifolium que apresenta caule e ramos com estrias longitudinais e inserção das
5
folhas pareada (MAGALHÃES, 1997). As folhas são simples, alternadas e
lanceoladas com cristais de oxalato de cálcio nas células epidermais e camada de
cutícula espessa (DUARTE e DEBUR, 2005).
Jacomassi e Machado (2003) também descreveram características
anatômicas importantes de M. ilicifolia, tanto para distinção entre esta espécie e M.
aquifolium bem como de outras espécies que podem ser erroneamente identificadas
como espinheira-santa.
Segundo Scheffer (2001), M ilicifolia apresenta uma taxa de fecundação
cruzada de 99,6%, sendo classificada como uma espécie alógama.
Estima-se que cerca de 40% das plantas comercializadas como M. ilicifolia
sejam na verdade de outras espécies (SCHEFFER, CORRÊA JUNIOR e GRAÇA,
2004), mas a maior demanda hoje é por folhas de M. ilicifolia, considerada a
verdadeira. Devido à similaridade morfológica das folhas, outras espécies são
adicionadas como adulterantes, por exemplo, a Sorocea bomplandii (Baill.) Burger,
Zollernia ilicifolia Vog. e M. aquifolium (REIS e SILVA, 2004; NEGRI, 2007).
Em oito amostras de fitoterápicos à base de espinheira-santa submetida à
CCD (cromatografia em camada delgada) apenas três amostras revelaram a
presença de marcadores químicos de M. ilicifolia e somente uma das amostras
revelou ausência de marcadores químicos considerados adulterantes (ALBERTON,
FALKENBERG e FALKENBERG, 2002).
Acredita-se que 95% da coleta de espinheira-santa ainda sejam obtidas por
extrativismo, atividade ilegal e sem controle sanitário, e por isso, o produto que
chega ao consumidor normalmente não atende às especificações exigidas. Na
reunião técnica Estratégias para Conservação e Manejo de Recursos Genéticos de
Plantas Medicinais, promovida pelo IBAMA e CENARGEN (atual Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia) em Brasília, no ano de 2001, a espinheira-santa foi
considerada prioritária para o desenvolvimento de trabalhos de manejo e
conservação por causa da crescente demanda de utilização e pelo extrativismo. Em
função do extrativismo é considerada espécie ameaçada de extinção, tornando-se
necessário sair do sistema de extrativismo e solidificar o sistema de domesticação e
cultivo (REIS e SILVA, 2004 apud MARIOT e BARBIERI, 2006).
Em 1988, no Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais da Central de
Medicamentos do Ministério da Saúde, foi publicada uma série de trabalhos
relatando as propriedades terapêuticas da M. ilicifolia em relação a sua ação
6
atividade antiúlcera gástrica (CARLINI, 1988). Os resultados obtidos comprovaram
cientificamente a eficácia terapêutica da planta.
Na década de 90, M. ilicifolia foi alvo de biopirataria, tendo seu extrato
patenteado por uma empresa japonesa, logo após as primeiras publicações que
comprovaram a eficiência da planta contra gastrite e úlcera gástrica em pesquisa
realizada no Brasil (CARVALHO, 2005 apud RIBEIRO, 2008).
M. ilicifolia faz parte de uma lista de 34 plantas (BRASIL, 2004b) que não
necessitam de validação das indicações terapêuticas e da segurança de uso para o
registro, como medicamentos fitoterápicos, no Ministério da Saúde. Para o registro
devem ser respeitadas as seguintes especificações para a planta: parte usada,
padronização (marcador químico para o extrato), forma de uso, indicação
terapêutica, dosagem, via de administração, posologia e restrição de uso. No caso
da M. ilicifolia as especificações são: - Parte usada: folhas; - Padronização
(marcador químico): taninos totais; - Formas de uso: extratos e tintura; - Indicações
terapêuticas: dispepsias, coadjuvante no tratamento de úlcera gástrica; - Dose diária:
60 a 90 mg de taninos/dia; - Via de administração: oral; - Restrição de uso: não
apresenta (venda sem prescrição médica).
Atualmente a Farmacopéia Brasileira (FARMACOPÉIA, 2003) apresenta
aspectos morfoanatômicos e o controle de qualidade da droga vegetal. As dosagens
dos fitoterápicos de M. ilicifolia são padronizadas de acordo com o conteúdo de
taninos totais presentes.
Segundo Mariot e Baebieri (2006) a tecnologia para a produção de
fitofármacos a partir da espinheira-santa já está em fase de estudos no País, com
boas perspectivas de lançamento de medicamentos em um futuro próximo. Em
conjunto com os laboratórios Aché e Biossintética, a Universidade Federal de São
Paulo (UNIFESP) registrou recentemente as patentes de duas substâncias retiradas
de plantas. Uma delas deve dar origem ao primeiro medicamento desenvolvido
integralmente no Brasil. Um estudo está sendo feito com a espinheira-santa (M.
ilicifolia) e o outro com o nó-de-cachorro (Heteropteris aphrodisíaca).
2.A.2 Substâncias químicas
As plantas, ao contrário dos animais, conseguem sintetizar substâncias
químicas para o próprio sustento. Algumas destas substâncias sofrem sucessivas
transformações produzindo os metabólitos secundários. Destes, a maioria apresenta
7
atividade farmacológica e são denominados de princípios ativos. Os metabólitos
secundários podem ser armazenados em diferentes locais e órgãos na planta e, a
sua ação biológica pode acontecer com a substância química isolada ou em
associação (FONTE, 2004).
Na espinheira-santa foram isoladas várias substâncias químicas bioativas
(metabólitos), onde as mais citadas são os taninos, os flavonóides e os terpenos,
grupo em que estão inseridos os triterpenos (CORDEIRO, VILEGAS e LANÇAS,
1999).
Di Stasi (2004) em uma revisão sobre compostos bioativos em espécies de
Maytenus, relata a presença de pristimerina, um triterpeno do tipo friedelano com
ação antimalárica e compostos fenólicos com atividade inibitória sobre a replicação
do vírus HIV-1 em M. senegalensis. Em M. canariensis foram isoladas nortriterpenos
com atividade antibiótica e sesquiterpenos, com atividade inseticida. M. macrocarpa
apresenta nortriterpenos, denominados macrocarpinas, os quais são citotóxicos,
sesquiterpenos com atividade leishmanicida e triterpenos do tipo friedelano.
Triterpenóides do tipo friedelano também foram isolados desta espécie por Chávez
et al. (1998). Foi evidenciado por Kennedy et al. (2001), a ação leishmanicida de
sesquiterpenos isolados de M. magellanica e M. chubutensis.
Entre os compostos bioativos em M. ilicifolia e M. aquifolium, que podem ter
ação antiulcerogênica e antigástrica, destacam-se os triterpenos. Os triterpenóides
são compostos constituídos basicamente de trinta unidades de carbono – seis
isoprenos (CARDOSO et al., 2001). A maioria possui em sua constituição hidroxilas
que podem ser glicosiladas, produzindo os heterosídeos cardiotônicos, importantes
agentes terapêuticos para doenças cardiovasculares e as saponinas.
As plantas medicinais freqüentemente apresentam diferenças químicas
sazonais, afetando a produção de princípios ativos nas diferentes épocas do ano.
Análises realizadas em folhas de M. aquifolium nas quatro estações do ano
revelaram que na primavera o teor de flavonóides e fenóis totais foram maiores,
enquanto que para os triterpenos o maior teor ocorreu no inverno, sendo que a
proporção de friedelan-3-ol para a friedelina foi de 5:1 (YARIWAKE et al., 2005).
2.A.2.1 Triterpenos
Os triterpenóides são compostos constituídos basicamente de trinta unidades
de carbono – seis isoprenos (CARDOSO et al., 2001). A maioria possui em sua
8
constituição hidroxilas que podem ser glicosiladas, produzindo os heterosídeos
cardiotônicos, importantes agentes terapêuticos para doenças cardiovasculares e as
saponinas. Biossinteticamente são derivados de condensação de duas moléculas de
farnesilpirofosfato (FPP) unidas cauda-cauda, produzindo o esqualeno. A provável
ciclização da molécula de esqualeno leva à formação da estrutura básica dos
triterpenóides, o ciclopentanohidrofenantreno, importante precursor dos esteróides
vegetais e animais e das saponinas triterpênicas. As saponinas triterpenóides
apresentam três tipos de estruturas básicas: oleanos, ursanos e lupanos.
Itokawa et al. (1991) identificaram em M. ilicifolia os triterpenos denominados
cangoronina e ilicifolina. Eles são do tipo friedelano e foram fracionados junto com
outros sete triterpenos já conhecidos. Os autores mostraram que alguns destes
compostos têm ação citotóxica, como, por exemplo, a pristimerina, indicando que
podem ser úteis no tratamento de tumores.
Shirota et al. (1994) elucidaram a estrutura de alguns triterpenos aromáticos.
Estes compostos mostraram atividade citotóxica moderada para três linhagens
celulares. As estruturas de outros dois triterpenos dímeros, denominados
cangorosina A e cangorosina B, foram elucidadas por Shirota et al. (1997) em
extrato de raízes de M. ilicifolia. Ohsaki et al. (2004) relatam a descoberta de quatro
novos triterpenos, além de outros conhecidos, presentes nas folhas de espinheira
santa. Dentre estes novos triterpenos, o erithrodiol exibiu significativa ação citotóxica
(antitumoral) in vitro, contra algumas linhagens de células tumorais.
Apesar de a literatura destacar os triterpenos como os principais compostos
bioativos em espinheira-santa, Corsino et al. (1998a) destacaram que a família
Celastraceae é uma fonte rica de sesquiterpenos. Os autores isolaram e elucidaram
a estrutura química de dois sesquiterpenos, a aquifoliulina E-I e a aquifoliulina EII.
Ao verificarem a ação citotóxica do extrato de M. aquifolium em mutantes de
Saccharomyces cerevisiae, eles sugeriram que os sesquiterpenos podem ser os
principais responsáveis por causar pequenos danos no DNA. Em outro trabalho,
Corsino et al. (1998b) também elucidaram a estrutura de outros dois sesquiterpenos,
a aquifoliulina E-III e a aquifoliulina E-IV.
Os triterpenos quinonametídeos maitenina e 22β-hidroximaitenina são
membros de um pequeno grupo de produtos naturais peculiares às espécies das
famílias Celastraceae e Hippocrateaceae (GUNATILAKA, 1996) com potencial
anticancerígeno (BAVOVADA et al., 1990). A ligação da maitenina ao DNA sugere
9
uma interação celular que pode elucidar a atividade antitumoral (CAMPANELLI et al.,
1980). Santana, Asfora e Cortias (1971) mostraram que estes compostos são
efetivos contra carcinoma epidermóide.
Corsino et al (1998c) quantificaram os triterpenos maitenina e 22β-
hidroximaitenina a partir da técnica de calos oriundos de explantes de folhas de M.
aquifolium por meio de HPLC (High Performance Liquid Chromatography) cultivados
em dois meios de cultura com diferentes concentrações de cinetina. O rendimento
dos triterpenos no meio é dependente da diminuição da concentração de cinetina.
Corsino et al. (2000), ao estudarem a biossíntese de triterpenóides em M.
aquifolium, identificaram que as folhas produzem 3β-friedelanol e friedelina
(friedelano) e raízes acumulam maitenina e pristimerina (quinonametídicos). Os
triterpenos derivados de friedelano, uma vez biossintetizados nas folhas, são
translocados para as raízes e posteriormente transformados nos triterpenóides
quinonametídicos, que apresentam ação antitumoral.
Buffa Filho et al. (2002), por meio do método HPLC de fase-reversa,
quantificaram triterpenóides citotóxicos em cinco tipos morfológicos de M. ilicifolia.
Os compostos encontrados em baixas concentrações foram 20α-hidroximaitenina e
22β-hidroximaitenina e os em altas maitenina, celastrol e pristimerina.
2.A.2.2 Substâncias fenólicas
As substâncias fenólicas possuem pelo menos um anel aromático ligado a um
grupamento hidroxila. Estão distribuídas amplamente no reino vegetal e, porém os
animais são praticamente incapazes de sintetizar o anel aromático. São derivados
metabolicamente do ácido chiquímico e fenilpropanóides (ROBARDS et al., 1999
apud NEGRI, 2007). A maioria das substâncias fenólicas não é encontrada na
natureza na forma livre, mas como ésteres ou heterosídeos. Nas plantas,
encontram-se armazenados nos vacúolos, no estado reduzido ou frequentemente
como heterosídeos, que não são tóxicos às plantas (BECKMAN, 2000 apud NEGRI,
2007). No corte ou esmagamento da planta que normalmente ocorre durante a
colheita, os polifenóis são oxidados pela PPO (polifenol oxidase) a quinonas dando
coloração escura. Se as quinonas se ligarem aos aminoácidos contendo S (enxofre)
ou N (nitrogênio) há formação de complexos quinona-aminoácido alterando cor,
aroma e sabor da planta (BITTNER, 2006 apud NEGRI, 2007).
10
As substâncias fenólicas são encontradas principalmente como polifenóis e
estão presentes em várias classes de metabólitos secundários, como os taninos e os
flavonóides e são facilmente oxidáveis por enzimas, metais, luz e calor (SIMÕES et
al., 2003). A composição fenólica é determinada genética e ambientalmente, porém
o processamento e o armazenamento podem modificar os teores por reações
oxidativas, principalmente nas frutas.
As reações mais importantes que ocorrem nos polifenóis estão relacionadas
com o potencial redox, mais especificamente a atividade antioxidante e o
escurecimento oxidativo (ROBARDS et al., 1999 apud NEGRI, 2007).
Martins, Guterres e Ortega (2003) encontraram nas folhas de M. ilicifolia: 8,72;
5,61 e 3,11 g% de polifenóis totais, polifenóis não-tanantes e taninos totais,
respectivamente.
Na espinheira-santa as substâncias fenólicas são encontradas no mesofilo,
predominantemente no segundo extrato paliçádico (DUARTE e DEBUR, 2005).
Os usos das substâncias fenólicas são variados. Na indústria alimentícia e
farmacêutica são utilizados como flavorizante, corante, aromatizante e
principalmente como antioxidante (SIMÕES et al., 2003).
2.A.2.2.1 Taninos
Os taninos são polifenóis encontrados em plantas superiores e são utilizados
desde muito tempo no curtimento de couro (SIMÕES et al., 2003).
O termo tanino foi o nome dado à infusão de cascas de árvores como o
carvalho e a castanheira, na qual peles de animais eram tratadas para obtenção de
couros maleáveis e de grande durabilidade (QUEIROZ, MORAIS e NASCIMENTO,
2002). Nas plantas os taninos exercem função de proteção contra os herbívoros e
ataques de insetos, fungos e bactérias (MADHAN et al., 2005 apud NEGRI,2007).
Segundo Cardoso et al. (2001) os taninos são compostos de sabor
adstringente, derivados de fenilpropanos, capazes de formar complexos com
proteínas, açúcares e alcalóides indólicos. Dividem-se em duas categorias:
derivados de esqueletos (C6- C1)n, chamados de taninos hidrosolúveis, e derivados
de esqueletos (C6-C3-C6)n, chamados de taninos condensados ou
proantocianidinas. Os taninos hidrolizáveis possuem rotas biossintéticas ainda
desconhecidas. Sabe-se que seu precursor é o ácido gálico ou seu dímero de
condensação, o ácido elágico. Os taninos condensados são biossintetizados pelas
11
condensações de derivados de ácido chiquímico e unidades de malonil-CoA,
levando à formação das catequinas. Estas são importantes precursoras das
proantocianidinas (taninos condensados) e antocianidinas. Caracterizam-se por
serem oligômeros e polímeros formados pela policondensação de duas unidades
flavonoídicas (flavan-3-ol e flavan-3,4-diol). Portanto, são também considerados
compostos flavonóides, sendo denominados de flavolanas, diferenciando-se dos
taninos hidrolisáveis por não possuírem resíduos glicosídeos em sua estrutura. Entre
as atividades farmacológicas que os taninos condensados apresentam – quando
complexados com proteínas – destacam-se a proteção da mucosa do estômago em
tratamento de úlcera péptica, as propriedades antiinflamatórias e cicatrizantes, e o
bloqueio da formação da placa dental por meio da inibição da glicosiltransferase,
produzida por bactérias bucais.
Acredita-se que as atividades farmacológicas dos taninos são devidas a três
características gerais que são comuns em maior ou menor grau aos dois grupos de
taninos, condensados e hidrolisáveis: 1) complexação com íons metálicos (ferro,
manganês, vanádio, cobre, alumínio, cálcio, entre outros); 2) atividade antioxidante e
sequestradora de radicais livres; 3) habilidade de se complexar com outras
moléculas, incluindo macromoléculas como proteínas e polissacarídeos. Foi
sugerido também que os possíveis modos de ação dos taninos no tratamento de
doenças estão intimamente relacionados com estas três propriedades (HASLAM,
1996).
Plantas ricas em taninos são empregadas na medicina tradicional para o
tratamento de diversas moléstias orgânicas, tais como diarréia, hipertensão arterial,
reumatismo, hemorragias, feridas, queimaduras, problemas estomacais (azia,
náusea, gastrite e úlcera gástrica), problemas renais e processos inflamatórios em
geral (HASLAM, 1996).
As propriedades fisiológicas e farmacológicas dos taninos foram estudadas
por Haslam et al. (1989). Estes autores estudaram também o princípio da
adstringência e da cicatrização como base terapêutica em ferimentos da mucosa, já
que os taninos ajudam no processo de cura de feridas, queimaduras e inflamações
por meio da formação de uma camada protetora (complexo taninoproteína e/ou
tanino-polissacarídeo).
Hatano et al. (1989) observaram que taninos condensados e hidrolisáveis
possuem a propriedade de capturar radicais livres de oxigênio e desempenham um
12
importante papel no processo inflamatório. Isto leva a acreditar em um possível
efeito antimutagênico, uma vez que a sua função protetora também se estende ao
DNA das células. Estas observações foram confirmadas por Buelga e Scalbert
(2000) referente à atividade anticâncer; por Negro, Tommasi e Miceli (2003)
referente à atividade antioxidante.
A característica fundamental que dá aos taninos suas propriedades biológicas
parece ser a alta concentração de grupos orto-fenol-hidroxila (HASLAM, 1974).
A ocorrência de taninos condensados e hidrolisáveis no reino vegetal segue
padrões significativamente diferentes. Enquanto taninos condensados ocorrem
amplamente em gimnospermas e angiospermas, taninos hidrolisáveis estão quase
restritos às Choripetalae das dicotiledôneas e não foram encontrados nas
Sympetalae (MELLO e SANTOS, 2003).
2.A.2.2.2 Flavonóides
Os flavonóides existem em abundância no reino vegetal e são encontrados
em sua maioria nas angiospermas (CARDOSO et al., 2001). Caracterizam-se
estruturalmente por serem polifenólicos derivados de C6-C3-C6, ligados na
orientação cabeça-cauda, e que podem conter, como substituintes, hidroxilas ou
seus derivados funcionais, tais como ésteres, metoxilas, além de glicosídeos,
isoprênicos, presos em posições específicas dos anéis. Os flavonóides têm como
precursores a fenilalanina e a acetil-CoA. São originados de reações de derivados
do ácido chiquímico e derivados do acetato. Os flavonóides são divididos nas
seguintes classes: flavonas, flavonóis, antocianinas e isoflavonóides, sendo esta
última classe restrita à família Fabaceae. Os compostos mais importantes
encontrados nos vegetais, para cada uma das três primeiras classes são: flavonas
(apigenina e luteolina), flavonóis (canferol, quercetina, miricetina e galangina) e
antocianinas (cianidina e malvidina).
Para os flavonóides são relatados usos na proteção contra radiação UV e
visível, proteção aos ataques de insetos, fungos, vírus e bactérias, atração de
polinizadores, propriedades antioxidantes, estrogênicas, alelopáticas e também a
capacidade de inibir a ação de enzimas. Usados como pigmentos, para tanagem de
couro e fermentação de chás. Na terapêutica tem atividade antitumor,
antiinflamatória, antioxidante, antiviral e, além disso, são utilizados na reposição
hormonal dentre outras atividades (SIMÕES et al., 2003).
13
Numa dieta alimentar normal, ingere-se aproximadamente de 20 mg a 1 g de
flavonóides por dia (RICE-EVANS, MILLER e PAGANGA, 1996). No entanto, são
controversos os estudos de absorção dos flavonóides. Alguns autores sugerem que
a quercetina heterosídica tem melhor absorção que a aglicona (ROBARDS et al.,
1999 apud NEGRI, 2007), enquanto outros pesquisadores dizem o oposto
(MUROTA e TERAO, 2003).
Na espinheira-santa, a maior parte dos flavonóides é do tipo heterosídico. A
quercetina heterosídica é mal absorvida no intestino delgado, devido à porção
açúcar que a torna mais hidrofílica. Após a ingestão, os heterosídeos são
hidrolisados em agliconas (formas ativas) no intestino delgado por enterobactérias.
As agliconas pelo caráter mais lipofílico são melhores absorvidas no intestino grosso
pelos fosfolipídeos de membrana. Em seguida, entram na circulação e no fígado
sofrem O-metilação, glicuronidação ou sulfatação. São excretados pela bile e
retornam ao intestino, sendo reabsorvidas ou excretadas pelas fezes (MUROTA e
TERAO, 2003).
A determinação quantitativa dos flavonóides heterosídicos é difícil, devido à
presença de diferentes açúcares ligados à molécula principal, além de possuírem
açúcares ligados a outras moléculas de açúcares e em diferentes posições
(HERTOG, HOLLMAN e VENEMA, 1992). Os flavonóides heterosídicos têm a
porção glicona normalmente ligadas à posição 3, no anel C (ROBARDS et al., 1999
apud NEGRI, 2007). Em geral, para o doseamento dos flavonóides utiliza-se a
metodologia de espectrofotometria por UV e por CLAE (Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência) realizando uma hidrólise ácida do flavonóide para a retirada da parte
glicona. Segundo Leite et al. (2001) os flavonóides tetra-glicosilados são úteis como
marcadores químicos para o controle de qualidade em Maytenus, como já
anteriormente descrito por Vilegas et al. (1998), os quais distinguiram, por meio da
técnica HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographic), amostras
autênticas de M. ilicifolia e M. aquifolium e amostras alteradas com Sorocea
bomplandii, uma espécie muitas vezes confundida com a espinheira-santa, devido à
morfologia similar da folha.
2.A.3 Propriedades farmacológicas
A M. ilicifolia apresenta diversos usos, são descritas ações anticonceptiva,
abortiva, anti-séptica, digestiva, antiespasmódica, tratamento de feridas, de úlceras
14
estomacais, diurética, laxativa, antiasmática, antitumoral, combate problemas
hepáticos e disfunção erétil. Porém, a principal indicação das folhas de espinheira-
santa é o tratamento de gastrites, úlceras gástricas e duodenais (HNATYSZYN et al.,
2003; FERREIRA et al., 2004; REIS e SILVA, 2004).
Souza-Formigoni et al. (1991) compararam em ratos, previamente induzidos à
úlcera gástrica, os efeitos do extrato de M. ilicifolia com os de cimetidina - droga de
ação anti-histamínica, inibitória sobre a hemorragia digestiva e sobre a secreção
gástrica de ácidos, comumente observados na úlcera péptica. O efeito protetor
dependente da dose foi demonstrado tanto com a administração do extrato aquoso
via oral quanto intraperitoneal. Observaram que a planta mostrou-se menos nociva à
parede estomacal, pois provocou um aumento no volume e pH do suco gástrico.
Também mencionam que extratos liofilizados mostram a mesma atividade
antiulcerogênica depois de até 15 meses de estocagem. Dessa forma, os extratos
liofilizados apresentam grande estabilidade, o que dá valor ao uso de produtos
comerciais da planta. O efeito antiulcerogênico foi associado à presença de taninos
hidrolisáveis (REIS e SILVA, 2004). Porém, Faleiros et al. (1992) apud Magalhães
(2002) atribuíram o efeito às substâncias triterpênicas friedelina e friedelanol,
enquanto que Queiroga et al. (2000) avaliando os efeitos desses triterpenos em
modelo de úlcera induzida por indometacina em ratos, observaram que associados
ou isolados foram inativos na redução das úlceras. Este resultado sugeriu que estes
terpenos possivelmente não sejam os responsáveis diretos pela ação
aintiulcerogênica da espinheira-santa.
Análises por espectrografia e raios-X cristalográfico das raízes de M. ilicifolia,
mostraram que esta planta possui compostos citotóxicos para três linhagens
celulares (SHIROTA et al., 1994) e efeito antitumoral (BAVOVADA et al., 1990), o
qual foi demonstrado por Fox (1991) em ensaio clínico utilizando coquetéis
fitoterápicos contendo também Catharanthus roseus, Combretus caffrum, Maytenus
ovatus, Bugula neritina, Pancratium littorale, Phyllanthus acuminatus, Dolabella
auriculata, Taxus brevifolia e Taxus species.
Melo et al. (2001) realizaram experimento com bactérias Escherichia coli que
foram colocadas em meio contendo SnCl
2
– substância com propriedade genotóxica-
e extrato de M. ilicifolia. Neste experimento observou-se que a planta demonstrou
proteção à toxicidade do SnCl
2
e maior sobrevivência às bactérias, devido à redução
do estanho, demonstrando efeito antioxidante do meio contendo o fitoterápico, efeito
15
também demonstrado e atribuído aos flavonóides em estudos de Oshima et al.
(1998); Magnani, Gaydou e Hubaud (2000); Mora et al. (1990) e Cotelle et al. (1992)
que afirmam ainda, a capacidade desses flavonóides de atuarem sobre radicais
hidroxilas, devido a propriedade de doar hidrogênio.
Segundo Cunico et al. (2002) o extrato etanólico bruto das folhas de M.
ilicifolia atuou em fungos fitopatógenos, inibindo o crescimento micelial de Fusarium
oxysporum em 10% e estimulando o crescimento de Colletotrichum acutatum em
30%.
Martins, Guterres e Ortega (2003) verificaram que o extrato aquoso seco
obtido por spray-dryer das folhas não apresentou atividade antiulcerogênica
significativa na administração oral em ratos machos Wistar. Porém, o extrato aquoso
liofilizado reduziu em 77% a lesão em úlcera gástrica, utilizando a indometacina
como ulcerogênica e cimetidina como antiulcerogênica. A menor atividade foi
associada à diminuição de taninos.
Jorge et al. (2004), avaliaram a eficácia dos extratos hexânico (triterpenos) e
acetato de etila (polifenóis - taninos condensados e flavonóides) de M. ilicifolia como
antiinflamatório, antinociceptivo e em lesões gástricas, como protetor e cicatrizante.
O extrato hexânico apresentou melhor atividade que o acetato de etila, ambos
mostraram ser ativos na dose de 320 mg/kg em ratos e houve aumento de volume
gástrico e pH. As substâncias flavônicas apresentam atividade antiinflamatória pela
diminuição na formação de mediadores proinflamatórios como as prostaglandinas,
leucotrienos, espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico. Os triterpenos são
antiulcerogênicos pelo estímulo da síntese de muco ou pela manutenção do
conteúdo de prostaglandinas na mucosa gástrica em níveis elevados.
De acordo com Rattmann et al. (2006) a atividade biológica vasorelaxante
atribuída ao extrato das folhas de M. ilicifolia possivelmente esta envolvida com a
produção de óxido nítrico, ativação da guanilato ciclase e abertura dos canais de
potássio.
Costa et al. (2008) demonstraram a citotoxicidade da pristimerina, isolada de
M. ilicifolia, para várias linhagens de células tumorais humanas. Os autores
apontaram a pristimerina como representante de uma classe emergente de produtos
químicos com potencial anticancerígeno.
16
Recentemente foi demonstrado in vivo, em experimento realizado com ratos,
o potente efeito hipotensor dependente de óxido nítrico via guanilato ciclase das
preparações obtidas a partir das folhas de M. ilicifolia (CRESTANI et al., 2009).
Existem várias espécies medicinais do gênero Maytenus – além de M. ilicifolia
e M. aquifolium – que vêm sendo amplamente estudadas, como M. senegalensi, M.
macrocarpa e M. canariensis (DI STASI, 2004). O autor cita alguns trabalhos com
estas espécies. M. senegalensis apresenta atividade antimalárica, leishmanicida e
inibitória sobre a replicação do vírus HIV-1 por meio da ação da pristimerina. M.
canariensis apresenta atividade antibacteriana, antifúngica e inseticida. M
macrocarpa apresenta compostos com ação citotóxica e leishmanicida. Foi
evidenciada por Kennedy et al. (2001), a ação leishmanicida de M. magellanica e M.
chubutensis. Macari, Portela e Pohlit (2006) demonstraram o efeito antioxidante e a
citotoxicidade de M. guyanensis. Bruni et al. (2006) relataram a antimutagenicidade e
a ação antimicrobiana de M. krukovii e Fonseca et al. (2007) as atividades
antinociceptiva, antiedematogênica e antiulcerogênica de M. truncata.
17
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EXPERIMENTO I - Maytenus ilicifolia
1. INTRODUÇÃO
Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss., Celastraceae, espécie medicinal autóctone
(nativa) do Brasil, conhecida popularmente como espinheira-santa, é uma das
plantas medicinais mais comercializada por raizeiros no Centro de Campo Grande-
MS. Por meio de um levantamento realizado nesta cidade, foram detectadas
informações referentes às partes usadas (raízes, caule ou casca de caule, fruto,
semente etc.), modos de preparo, via de administração e indicações terapêuticas
das plantas utilizadas pela população rural e urbana (SIQUEIRA et al., 1994; NUNES
et al., 2003).
Os estudos da ação farmacológica da espinheira-santa foram realizados
utilizando principalmente as folhas, pois é a parte da planta que normalmente é
utilizada pela população nas infusões ou pela indústria farmacêutica para elaboração
de medicamentos (MARIOT e BARBIERI, 2007).
Na medicina popular brasileira, é usada principalmente para o tratamento de
úlceras, indigestão, gastrites crônicas e dispepsias (BALBACH, 1980; CRUZ, 1982;
CARLINI, 1988; BORN, 2000; FERREIRA et al., 2004; FREITAS et al., 2005;
CIPRIANI et al., 2006; BAGGIO et al., 2007a, b).
Em uma ampla revisão sobre o uso tradicional da espinheira-santa, Scheffer
(2004) cita como indicação popular o uso como vulnerário (para curar feridas), anti-
séptico, antiespasmódico, diurético, antiasmático, antitumoral, laxativo, para a cura
do vício da bebida e enfermidades do fígado, para tratar a hidropisia devido ao
abuso do álcool.
Estudos etnobotânicos também relatam a indicação popular da espinheira-
santa para outras funções, como, por exemplo, depurativo do sangue e tratamento
de diabetes, problemas urinários e intestinais (MARIOT, 2005).
Segundo Hnatyszyn (1974), Arenas e Azorero (1977) e Martinez-Crovetto
(1987), a infusão das folhas de M. ilicifolia é utilizada como contraceptivo, abortivo e
emenagogo, principalmente, entre as populações rurais e indígenas do Paraguai.
Oliveira et al. (1991) verificaram os efeitos dos extratos (aquoso e
hidroalcoólico) de M. ilicifolia e M. aquifolium, na fertilidade de ratos machos e
fêmeas, bem como a teratogenicidade. Porém, não encontraram resultados
significativos e sugeriram então, que fossem realizados estudos mais detalhados.
28
Montanari, Carvalho e Dolder (1998) testaram os efeitos do extrato etanólico
de M. ilicifolia em testículos de camundongos. Observaram células germinativas
imaturas e/ou mortas com núcleos picnótipos e vacuolizações nos túbulos
seminíferos. Apesar de serem observadas espermátides com núcleos menores e
acúmulo de lipídeos nas células de Sertoli, não houve efeito significativo do extrato
sobre a formação dos espermatozóides.
Montanari e Bevilacqua (2002) testaram os efeitos do extrato hidroalcoólico
de M. ilicifolia administrado oralmente em camundongos em períodos distintos da
gestação. Efeitos abortivos só foram observados no período de pré-implantação
(entre o 1º e 3º dia de gestação). Provavelmente o útero neste período, estava
inapto para receber o concepto, sugerindo que o extrato influenciou na atividade do
hormônio estrogênio. A atividade estrogênica do extrato sugere que o mesmo pode
interferir com a receptividade uterina ao embrião. Entretanto, os efeitos não foram
uniformes entre os animais, sendo que, em alguns, nenhuma alteração foi
observada, nem mesmo na fase de pré-implantação do embrião. Segundo os
autores, isto significa que, em humanos, o aborto poderia ocorrer em algumas
mulheres e em outras não.
Camparoto et al. (2002) testaram a ação mutagênica do extrato das folhas de
M. ilicifolia e Bauhinia candicans, entretanto, não conseguiram obter significância
estatística que comprovasse tal ação em células da medula de rato e raiz de cebola.
Apesar do difuso uso popular, as informações toxicológicas de M. ilicifolia no
desempenho reprodutivo ainda são escassas e limitam-se a parâmetros que ainda
podem ser mais explorados. Torna-se também necessário investigar possíveis
efeitos tóxicos decorrentes da interação de substâncias químicas do extrato com
órgãos que estão em intensa proliferação celular, como são os tecidos embrionários
e ainda, verificar se houve alterações nos órgãos maternos, uma vez que a rata na
prenhez torna-se mais sensível devido às bruscas alterações hormonais às quais
são submetidas neste período.
29
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o risco toxicológico da exposição ao extrato hidroacetônico seco das
folhas de M. ilicifolia no sistema reprodutivo de ratas Wistar e em seus fetos, a fim de
confirmar sua segurança na dose preconizada pela utilização na medicina popular.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar os sinais indicativos de toxicidade materna: clínicos, consumo (ração
e água filtrada), toxicidade de órgãos, perdas sanguíneas vaginais e ocorrência
de morte;
Avaliar o desempenho reprodutivo materno e o desenvolvimento de seus
fetos;
Verificar a possibilidade de alterações anátomo-histológicas nos órgãos
(baço, fígado e rins) das ratas e em seus fetos;
Avaliar o processo de ossificação, desenvolvimento do sistema nervoso e
das vísceras dos fetos;
Verificar a possibilidade de alterações histológicas nas placentas e
variações e/ou malformações nos fetos.
30
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Procedência e Coleta do Material Botânico
As partes aéreas (folhas) de M. ilicifolia (Celastraceae) foram cultivadas e
colhidas no Horto de Plantas Medicinais (HPM) da Universidade Federal da Grande
Dourados (UFGD), em Dourados/MS, pela Dra. Maria do Carmo Vieira.
Visando garantir a qualidade e uniformidade do material vegetal, as folhas
foram coletadas no período da manhã, selecionadas e secas em estufa de
circulação forçada de ar à temperatura de 36 a 38ºC, até a obtenção de massa
constante.
A espécie vegetal foi identificada pela Dra Ezilda Jacomassi (UNIPAR,
Umuarama, PR, Brasil) por meio do envio de réplicas das exsicatas de números 902
e 2.191, as quais se encontram depositadas como documento taxonômico no
Herbário DDMS da UFGD, Dourados, MS, Brasil.
No Laboratório de Farmacognosia da Universidade Federal de Mato Grosso
do Sul (UFMS), em Campo Grande/MS, sob a orientação do Dr. João Máximo de
Siqueira, o material vegetal foi processado visando à obtenção de diferentes extratos
(Percolação, Ultra-Turrax, Maceração) em diferentes solventes (Acetona, H
2
O,
Hidroetanólico).
3.2 Obtenção do Extrato Vegetal
Avaliações farmacognósticas dos extratos (cromatografia em camada
delgada-CCD, teor extrativo) foram efetuadas visando otimizar e selecionar o melhor
extrato a ser utilizado na proposta deste trabalho.
A partir dos resultados obtidos com cromatografia em camada delgada-CCD
confirmou-se que o extrato de M. ilicifolia obtido em Acetona:Água (70:30) foi o mais
apropriado para a condução do experimento, pois este possui constituição química
mais complexa (por CCD) e sendo esta mistura de solventes indicada para plantas
ricas em substâncias fenólicas.
O extrato das folhas de M. ilicifolia (40 g) foi obtido com acetona:água (70:30;
v/v) à 10% (p/v) em Ultra-Turrax (UTC 115 KT) durante 20 min, filtrado, seguido de
concentração à pressão reduzida em evaporador rotatório (FIZATON). Este extrato
foi mantido em dessecador por 72 horas até a obtenção de um resíduo sólido amorfo
de coloração marrom. O resíduo sólido marrom foi triturado em cápsula de
31
porcelana, fornecendo um pó amorfo marron, rendendo 9,1 g de extrato hidro-
acetônico (22,8% extrato seco/droga vegetal).
3.3 Animais de Experimentação
Utilizou-se ratas albinas (Rattus norvegicus) Wistar nulíparas, heterogênicas,
de padrão sanitário convencional, com cerca de dois meses de idade, pesando
aproximadamente 200 ± 10 g, cedidas pelo Biotério Central da UFMS.
O número total de animais fornecidos pelo Biotério foi de 56 fêmeas e 12
machos com idade de 65 e 94 dias de nascidos, respectivamente.
Os animais foram alojados em gaiolas (caixas) de polipropileno (49X34X26
cm), providas de camas de maravalha selecionadas (Pinnus sp – não esterilizada),
bebedouro plástico para água e cocho para ração comercial do tipo peletizada. As
gaiolas eram higienizadas três vezes por semana. Durante todo procedimento
experimental, água filtrada e comida (ração peletizada para ratos Nuvilab CR1-
Nuvital, Curitiba-PR) foram fornecidas “ad libitum”.
Os animais foram mantidos sob condições padronizadas de climatização
(Estante ventilada): temperatura de 22 C 2 C, umidade relativa do ar entre 55 e
75% e fotoperíodo de 12 horas (ciclo invertido: 06:00 – 18:00 escuro, 18:00 – 06:00
claro).
Os experimentos foram conduzidos (julho a setembro/2008) no Laboratório de
Biologia Geral do Departamento de Biologia (DBI) - Centro de Ciências Biológicas e
da Saúde (CCBS) da UFMS.
O protocolo para uso de animais em experimentação (nº 115/2006) foi
aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UFMS. Foram seguidos os
princípios éticos de experimentação animal estabelecidos pelo atual Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e pelo Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1996).
3.4 Acasalamento e Diagnóstico de Prenhez
Após 10 dias de aclimatização na estante ventilada, foi realizado o período de
acasalamento dos animais.
Para a determinação das fêmeas prenhes, fez-se o acasalamento pelo
sistema poligâmico, usando-se machos de fertilidade previamente comprovada.
Foram acasaladas, durante três horas (07:00 às 10:00), duas fêmeas para cada
32
macho. O diagnóstico de prenhez foi confirmado por meio da observação de
espermatozóides e de células de estro (caracterizada como a fase estrogênica
máxima) no esfregaço vaginal, sendo este considerado o dia zero da gestação
(TAYLOR, 1986). Os esfregaços foram avaliados a fresco, em microscopia óptica
(aumento 200X). Após esta confirmação as fêmeas foram separadas e então
distribuídas, randomicamente, nos grupos experimentais. Os acasalamentos foram
repetidos diariamente até a obtenção de 10 progenitoras em cada grupo
experimental. As 10 fêmeas prenhes de cada grupo foram mantidas em quatro
caixas (duas ou três fêmeas por caixa) de polipropileno.
3.5 Determinação da Dosagem
A dosagem de 15,1 mg/animal/dia (mg/kg de peso corpóreo) foi determinada
com base na dose preconizada pela utilização na medicina popular, consumo diário
de quatro a cinco xícaras de chá preparado com as folhas em infusão (BALBACH,
1986; FREITAS, 1992), e fazendo a proporção em termos de peso corpóreo, tendo
como base um adulto de 70 kg.
3.6 Grupos e Delineamento Experimental
No rato, o implante do blastocisto no útero materno ocorre até o quinto dia de
prenhez (DP), a organogênese vai do sexto ao décimo quinto dia e deste até o
vigésimo primeiro ocorre o desenvolvimento fetal (MANSON e KANG, 1989). O
período mais crítico do desenvolvimento é o da organogênese, quando tecidos e
órgãos estão se diferenciando rapidamente, ficando susceptíveis a interferências de
agentes externos (teratógenos) capazes de alterar seu desenvolvimento
aumentando a incidência de anomalias congênitas (MOORE e PERSAUD, 2004).
Para a realização do experimento, 40 ratas prenhes foram distribuídas,
randomicamente, em quatro grupos experimentais (dois grupos controles e dois
grupos tratados) com 10 animais cada.
Os grupos foram submetidos ao seguinte esquema de tratamento diário:
Grupo Controle 1 (C1): recebeu, via gavage, 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º
DP;
Grupo Tratado 1 (T1): recebeu, via gavage, extrato seco de M. ilicifolia (15,1 mg/kg
de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada do 1º ao 20º DP;
33
Grupo Controle 2 (C2): recebeu, via gavage, 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º
DP;
Grupo Tratado 2 (T2): recebeu, via gavage, extrato seco de M. ilicifolia (15,1 mg/kg
de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada do 6º ao 15º DP.
3.7 Avaliação da Toxicidade Materna
Os indicativos de toxicidade materna avaliados foram sinais clínicos;
decréscimo ou aumento de peso corpóreo, de consumo de ração e água; toxicidade
de órgãos; perdas sanguíneas vaginais e mortalidade materna (MANSON e KANG,
1994; LEMONICA, DAMASCENO e STASI, 1996; CHAHOUD et al., 1999).
Para detectar sinais clínicos indicativos de toxicidade materna, as ratas
prenhes foram observadas decorridos 30 minutos e depois de seis horas após os
tratamentos. Quando não eram mais tratadas foram observadas apenas uma vez ao
dia. A toxicidade materna foi avaliada pela presença de pêlos eriçados, hipoatividade
ou hiperatividade no interior da gaiola, presença de sialorréia, diarréia e/ou mortes
(CHRISTIAN, 2001).
Para avaliar alterações de peso corpóreo, as ratas prenhes foram pesadas no
1º, 6º, 15º e 20º dia de prenhez (DP). A partir destes dados, foi calculado o ganho de
peso e ganho de peso líquido (corrigido) das progenitoras. Ganho de peso (GP) =
peso final (20º DP) – peso inicial (1º DP). Ganho de peso líquido (GPLQ)= GP - peso
do útero com fetos.
Para avaliar alterações no consumo de água filtrada e ração, a estimativa do
consumo foi efetuada pela diferença entre o que foi colocado às 07:00 em um dia e o
que sobrou às 07:00 do dia seguinte (água 100 mL/animal e ração 50 g/animal). Ao
final de cada cálculo, a quantidade consumida era reposta. A água dos bebedouros
foi trocada diariamente e o consumo foi estimado nos próprios bebedouros.
A estimativa do consumo médio de ração e água filtrada, por rata, foi avaliada
em função de quatro intervalos (M2-6, M7-15, M16-20 e M2-20) definidos ao longo
do período de prenhez. O intervalo M2-6 correspondeu à média de consumo do 2º
ao 6º DP (cinco dias), o M7-15 à média de consumo do 7º ao 15º DP (9 dias), o
M16-20 a média de consumo do 16º ao 20º DP (cinco dias) e o M2-20 a média de
consumo do 2º ao 20º DP (19 dias).
34
3.8 Avaliação do Desempenho Reprodutivo Materno e do Desenvolvimento
Embrionário
No 20º DP, as ratas prenhes foram submetidas à eutanásia experimental, que
significa “boa morte”, ato de induzir a morte sem dor ou tensão (NOGUEIRA et al
2002). Para isso, foram acondicionadas em câmara de sacrifício com dióxido de
carbono. O fornecimento de gás na câmara de sacrifício foi realizado com, no
máximo, duas ratas de cada vez a fim de se evitar o mínimo de sofrimento e
estresse (medo, angústia, tentativa de fuga) possível. A causa das mortes foi por
hipóxia cerebral, processo rápido e de baixo custo.
O reconhecimento e a confirmação da morte ocorreram quando os sinais, em
conjunto, foram parada respiratória e ausência dos sinais de batimento cardíaco e
das contrações musculares reflexas (calafrios, tremores e espasmos).
Após a eutanásia, baço, fígado e rins maternos foram retirados, pesados e
avaliados externamente para verificar possíveis alterações referentes à cor, ao
tamanho, à textura (consistência) e à presença de cistos. Posteriormente, os órgãos
foram fixados em formol 10% tamponado visando o processamento e as análises
histológicas.
A eutanásia foi efetuada no 20º DP por causa dos recém nascidos
malformados ou com baixa viabilidade serem freqüentemente mortos e
canibalizados pelas genitoras (GLEICH e FROHBERG, 1977).
Após eutanásia e subsequente laparotomia, os cornos uterinos, ovidutos e
ovários foram expostos e removidos. Os ovários foram dissecados (destituídos de
tecido conectivo adjacente), pesados e foi contado o número de corpos lúteos de
gestação.
Os cornos uterinos foram seccionados longitudinalmente, de forma a permitir
visualizar os fetos e quantificá-los, assim como os pontos de implantação (implantes)
e a presença de reabsorções.
Com o toque de uma pinça, foram contados os fetos vivos (apresentaram
movimento reflexo ao toque) e mortos (sem movimento reflexo). O útero foi pesado
com os fetos (útero cheio) e, após a onfalectomia, sem os fetos (útero vazio). Fetos
e respectivas placentas foram removidos e pesados. O peso das placentas foi
tomado como medida indireta do desenvolvimento fetal. Foi determinado o número
de fetos vivos machos e fêmeas por meio da inspeção pélvica.
35
Todos os fetos vivos tiveram a distância crânio caudal (comprimento do
corpo) e o tamanho encefálico determinados. A distância crânio caudal foi obtida
com o feto colocado em posição decúbito ventral, membros fletidos, pescoço em
extensão e cauda estendida. Em uma placa de vidro depositada sobre papel
milimetrado, marcou-se a projeção do ápice do nariz e do início da região escamosa
da cauda. A distância entre os dois pontos foi considerada como comprimento do
corpo fetal.
O tamanho encefálico (distância inter auricular) foi obtido com o feto colocado
em posição frontal. Com o auxílio de um paquímetro foi medida a distância entre as
aberturas do conduto auditivo. A avaliação do crescimento fetal foi realizada com
base no comprimento crânio caudal, na distância inter auricular (tamanho encefálico)
e no peso dos fetos. O peso das placentas foi tomado como medida indireta do
desenvolvimento fetal.
Os fetos foram minuciosamente examinados sob microscópio estereoscópico,
para avaliação de sua morfologia externa (cor e textura da pele, presença de pontos
hemorrágicos e malformações e/ou anomalias).
A partir destes dados foram calculados os parâmetros relativos à fertilidade:
Índice placentário = (peso placentário) / (peso do feto); Taxa de eficiência de
implantação = (nº de implantações / nº de corpos lúteos) X 100; Taxa de reabsorção
= (nº de reabsorções / nº de implantações) X 100; Taxa de perdas pré-implantação =
(nº de corpos lúteos – nº de implantações) / nº de corpos lúteos) X 100; Taxa de
perdas pós-implantação = (nº de implantações – nº de fetos vivos) / nº de
implantações) X 100; Taxa de viabilidade fetal = (nº de fetos vivos / nº de
implantações) X 100; Razão sexual = (nº de machos nascidos / nº de fêmeas
nascidas) X 100.
O peso relativo do baço, fígado e rins materno, ovários e útero com os fetos e
sem os fetos também foram calculados (peso do órgão / peso do animal no dia da
eutanásia).
A adequação do peso à idade da prenhez foi obtida segundo a metodologia
de Oliveira et al. (2009). Para este autor, os fetos podem ser classificados como:
fetos com peso adequado para a idade prenhez (PAIP) – peso compreendido entre a
média de peso dos fetos do grupo controle mais ou menos o desvio padrão; fetos de
baixo peso para a idade de prenhez (BPIP) – peso corpóreo inferior à média de peso
36
dos fetos do grupo controle menos o desvio padrão deste mesmo grupo; fetos acima
do peso para a idade de prenhez (APIP) – peso corpóreo superior à média de peso
dos fetos do grupo controle mais o desvio padrão deste mesmo grupo.
3.9 Avaliação do Desenvolvimento das Ninhadas
Cada ninhada foi dividida randomicamente em três grupos distintos, para
análise de possíveis malformações esqueléticas ou malformações viscerais e para
análise histológica de alguns órgãos fetais.
3.9.1 Fixação e Análise Visceral
Os corpos dos fetos foram colocados em solução de Bodian`s para fixação. A
análise foi realizada segundo os cortes propostos por Barrow e Taylor (1969) para
estudo de tórax e abdômen e pelos cortes estratégicos propostos por Wilson (1965)
para estudo de cabeça. Os métodos consistem em seccionar transversalmente os
fetos, de maneira que seja possível a avaliação de possíveis malformações e/ou
anomalias viscerais em palato, ouvido interno, medula, cavidade nasal, septo nasal,
retina, córnea, cristalino, hemisfério cerebral, ventrículos (cérebro), glândula salivar,
tireóide, esôfago, traquéia, timo, coração, fígado, rins, bexiga, ureter e gônadas. A
classificação das alterações foi baseada, principalmente, nos trabalhos de Taylor
(1986), Manson e Kang (1994) e modificações propostas por Oliveira et al. (2009).
Os exames das vísceras e esqueletos fetais foram realizados em
estereomicroscópio.
As alterações encontradas, neste estudo, foram denominadas de anomalias
quando havia alteração do processo normal do desenvolvimento sem comprometer a
função geral ou específica, ou o desenvolvimento pós-natal do feto. Quando as
anormalidades estruturais eram incompatíveis com a sobrevivência, foram
consideradas malformações, visto que não foram realizados métodos de estudos
complementares que provissem outras alterações.
Segundo Bernardi (1999) o termo malformação não significa somente
formação anormal de tecidos, ele remete também a anormalidades bioquímicas.
Visando facilitar o entendimento dos resultados da análise visceral, foi
inserida uma relação de fotos contendo os tipos de cortes utilizados (Foto 1 a 6)
durante o estudo de malformações viscerais (OLIVEIRA, 2001).
37
Foto 1 – Relação e localização de cortes utilizados
durante o estudo de malformações viscerais: (1)
Corte transversal na altura da cavidade oral; (2)
Corte frontal na região pré-gabelar; (3) Corte
frontal na região orbital; (4) Corte frontal na região
do vértex; (5) Corte transversal na região de
pescoço; (6) Corte transversal na região do terço
médio toráxico; (7) Corte transversal na região
abdominal inferior; (8) Corte transversal na região
pélvica. Fonte: Oliveira, 2001.
5
6
7
8
38
Foto 2 – Sequência de cortes para estudo visceral
em feto normal. (A) Corte transversal na altura da
cavidade oral: 1 – Palato, 2 – Cérebro; (B) Corte
frontal na região pré-gabelar: 1 – Septo nasal; 2 –
Coana; (C) Corte frontal na região orbital: 1 – Bulbo
olfatório, 2 – Cristalino, 3 – Coana, 4 – Retina; (D)
Corte frontal na região do vértex: 1 – Ventrículo
Lateral, 2 – Terceiro ventrículo; (E) Corte transversal
na região de pescoço: 1 – Traquéia, 2 – Esôfago, 3
– Medula espinhal; (F) Corte transversal na região
do terço médio toráxico: 1 – Traquéia, 2 – Timo, 3 –
Coração, 4 – Aurícula direita; 5 – Fígado. Fonte:
Oliveira, 2001.
39
Foto 3 – Sequência de cortes para estudo visceral em feto normal. (A) Corte
transversal na região do terço inferior do tórax: 1 – Medula, 2 – Diafragma; (B)
Corte transversal na região do terço superior do tórax: 1 – Medula espinal, 2 –
Artéria Aorta, 3 – Fígado, 4 – Veia Cava Inferior, 5 – Veia hepática; (C) Corte
transversal na região do terço médio abdominal: 1 – Estômago, 2 – Rins, 3 –
Fígado, 4 – Alças intestinais, 5 – Medula espinal; (D) Corte transversal na
região do terço inferior abdominal: 1 – Rins, 2 – Medula espinhal, 3 – Fígado, 4
– Alças intestinais. Fonte: Oliveira, 2001.
A
B
C
D
2
1
1
2
3
4
5
1
2
2
3
4
5
3
1
1
4
2
40
Foto 4 – Sequência de cortes para estudo visceral em feto
normal. (A) Corte transversal na região pélvica: 1 – Rins, 2 –
Medula espinhal, 3 – Fígado, 4 – Alças intestinais, 5 – Pelve
renal; (B) Cortes transversal na região pélvica: 1 – Ovários, 2 –
Cornos uterinos (útero bicórneo), 3 – Bexiga, 4 – Alças
Intestinais; (C) Corte transversal na região pélvica: 1 –
Testículos, 2 – Bexiga, 3 – Intestino grosso. Fonte: Oliveira,
2001.
41
Foto 5 – Corte transversal de rins, com aspecto
normal: 1 – Papila renal, 2 – Pelve renal, 3 –
Medula espinhal. Fonte: Oliveira, 2001.
Foto 6 – Corte transversal de rins. (A) Aspecto
dismórfico: 1 – Hidronefrose; (B) Aspecto
dismórfico: 1 – Hidronefrose e hipoplasia de
papila renal; (C) Aspecto dismórfico: 1 –
Hidronefrose, 2 – Hidronefrose e hipoplasia de
papila renal. Fonte: Oliveira, 2001.
1
2
3
42
3.9.2 Diafanização e Análise Esquelética
Para preparação dos fetos foi utilizado o procedimento proposto por Staples e
Schnell (1964). Baseados neste método, os corpos dos fetos foram colocados em
acetona e após 24 horas foram eviscerados. A acetona foi substituída por uma
solução de KOH a 0,8% misturada a solução saturada de alizarina red. Esta mistura
de soluções foi trocada quatro vezes com intervalo mínimo de 24 horas. Ao término
das quatro trocas, a solução foi substituída pela solução clareadora. A partir daí,
foram realizadas as análises baseadas na contagem dos pontos de ossificação
proposta por Aliverti et al. (1979), a qual determina o grau de desenvolvimento fetal e
no roteiro proposto por Taylor (1986) para observação de parâmetros como
anomalias e/ou malformações nos osso cranianos (vista superior: nasal, frontal,
parietal, inter-parietal e supra-occipital), esterno (manúbrio, centros esternais e
processo xifóide), vértebras (cervicais, torácicas, lombares, sacrais e caudais),
costelas, pelve, clavícula, membros anteriores (carpos, metacarpos e falanges) e
posteriores (tarsos, metatarsos e falanges).
Visando facilitar o entendimento dos resultados da análise esquelética, foram
inseridas algumas fotos dos ossos do crânio e do esterno (Foto 7 a 10) de fetos
(DAMASCENO et al., 2008).
43
Foto 7 – Vista superior da ossificação craniana normal:
(A) Nasal; (B) Frontal; (C) Parietal; (D) Interparietal; (E)
Supraoccipital. Fonte: Damasceno et al., 2008.
Foto 8 – Vista lateral da ossificação craniana normal: (F) Pré-
maxilar; (G) Maxilar; (H) Zigomático; (I) Escamoso; (J) Exoccipital.
Fonte: Damasceno et al., 2008.
44
Foto 9 – Vista ventral da ossificação craniana normal: (L)
Volmer; (M) Palato; (N) Présfenóide; (O) Basisfenóide; (P)
Hamulo; (Q) Basoccipital, (R) Orbtosfenóide; (S) Tímpânico.
Fonte: Damasceno et al., 2008.
(A)
(B)
(C)
Foto 10 – Pontos de ossificação do esterno adulto anormal: (A) Esternébrio
anormal; (B) Agenesia de esternébrio; (C) Esternébrio com ossificação
incompleta. Fonte: Damasceno et al., 2008.
45
3.9.3 Fixação e Análise Histológica
Os corpos dos fetos e suas placentas foram fixados em formol 10%
tamponado e Methacarn, respectivamente. Após fixação, foram selecionados,
randomicamente, dois fetos e três placentas de cada ninhada. Cada placenta foi
seccionada em duas partes iguais antes da inclusão em parafina. Os procedimentos
histológicos de rotina foram efetuados e cortes histológicos com aproximadamente
5 m, transversais e longitudinais conforme o material, foram obtidos e corados pela
técnica de H.E. (hematoxilina – eosina) para avaliação microscópica da morfologia.
Foram analisados no microscópio de luz dois cortes de cada feto e placenta.
Os órgãos maternos (baço, fígado e rins) foram fixados em formol 10%
tamponado e foram efetuados os mesmos procedimentos descritos, quanto à
coloração do tecido, espessura e número de cortes analisados por rata prenhe.
Na leitura das lâminas, considerou-se padrão de normalidade para o fígado:
bom estado de conservação, homogeneidade de aspecto, identificação de lóbulos
hepáticos íntegros, espaço porta íntegro e veias hepáticas bem definidas; cordões
sinusóides presentes, íntegros, confluindo para veia centro-lobular. Nos capilares
sinusóides entendeu-se como normal a presença de algumas hemácias. Nas células
hepáticas, consideraram-se normais aquelas com um ou mais núcleos íntegros, em
geral centralizados, e nucléolos bem evidentes. No citoplasma, foi considerado
padrão de normalidade encontrar áreas basófilas e eosinófilas.
Quando houve alteração da coloração padrão já bem estabelecida para as
estruturas hepáticas, alteração na morfologia de núcleos, rompimento de limites de
alguma organela citoplasmática e presença de congestão vascular, foram
entendidos como sendo possível de ser provocado pela M. ilicifolia (espinheira-
santa) em sua dose de aplicação.
Nos rins, a normalidade obedeceu aos quesitos: bem conservados,
apresentando corpúsculos renais e túbulos contorcidos proximais e distais íntegros;
os glomérulos formados por capilares, podócitos, células endoteliais e mesangiais
sem alterações histológicas. Outros itens avaliados: cápsula de Bowman íntegra,
presença de células cúbicas ou poliédricas, apresentando citoplasma eosinófilo e
núcleo arredondado. Na região medular, analisaram-se as alças de Henle junto aos
capilares e túbulos coletores, estes com citoplasma bem delimitado e núcleo
esférico, quando dentro da normalidade.
46
Quanto ao baço, na leitura das lâminas, foram considerados os seguintes
aspectos na avaliação: cápsula esplênica, estrutura tecidual (polpa branca e
vermelha) e vascularização.
Todas as etapas relacionadas à confecção e análise do material histológico
foram efetuadas no Laboratório de Histotecnologia do Departamento de
Morfofisiologia da UFMS.
3.10 Análise Estatística e Registro do Material Fotográfico
Para a comparação dos resultados quantitativos foram utilizados testes
paramétricos e não paramétricos (ANOVA e Kruskal-Wallis – Programa GraphPad
InStat), conforme a natureza de distribuição dos dados. Após a detecção de
diferenças pela ANOVA e pelo Teste de Kruskal-Wallis foi utilizado o teste de
comparação múltipla de Tukey e Dunn, respectivamente. Os dados qualitativos e as
freqüências obtidas tiveram a ninhada utilizada como unidade-base, conforme
recomenda a literatura especializada (MANSON, ZENICK e COSTLOW, 1982;
HANSEMAN e HOGAN, 1995). Em todos os casos, quando p 0,05, a diferença foi
considerada estatisticamente significativa.
As fotos foram obtidas por meio de uma câmara digital Nikon e,
posteriormente, impressas em papel fotográfico.
47
4. RESULTADOS
4.1 Toxicidade Materna
Quando os grupos experimentais foram comparados por meio de sinais
clínicos de toxicidade, não foram registradas mortes maternas, eriçamento de pêlos,
alteração da deambulação (hipo ou hiperatividade locomotora) e diarréia.
O acompanhamento diário da evolução gestacional demonstrou que não
houve diferenças significativas entre os grupos experimentais quanto ao peso
corpóreo, ganho de peso e ganho de peso líquido. Portanto, não houve variações,
todas as ratas ganharam peso entre o início da gestação, durante o tratamento e a
eutanásia, indicando uma gestação normal, sem efeito dos tratamentos (Fig. 1 e 2).
Figura 1 - Peso corpóreo (média erro padrão da média) das ratas prenhes no 1º, 6º,
15º e 20º dia(s) de prenhez (DP) nos grupos experimentais: controle 1 (C1) –
receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1 (T1) -
receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; controle 2 (C2)
- receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP e tratado 2 (T2) - receberam
extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5
mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP. Teste Estatístico: ANOVA/Tukey,
p 0,05. Campo Grande (UFMS), 2009.
0
50
100
150
200
250
300
1º DP
6º DP
15º DP
20º DP
P
e
s
o
C
o
r
p
ó
r
e
o
G
r
a
m
a
s
Dia da Gestação ou Prenhez (DP)
Controle 1
Tratado 1
Controle 2
Tratado 2
48
Figura 2 - Ganho de peso e ganho de peso líquido (média erro padrão da média)
das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) - receberam 0,5 mL de
água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1 (T1) - receberam extrato
seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia
de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de
água filtrada do 6º ao 15º DP e tratado 2 (T2) – receberam extrato seco de
Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP. Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05.
Campo Grande (UFMS), 2009.
Outro critério indicativo de toxicidade materna refere-se às alterações no
consumo de alimento e água. A estimativa do consumo médio de água filtrada do 2º
ao 6º DP (M2-6) e do 16º ao 20º DP (M16-20) foi similar entre os grupos
experimentais. Não houve efeito dos tratamentos, quanto ao consumo de água,
durante os cinco primeiros (M2-6) e os cinco últimos dias (M16-20) de administração
dos tratamentos (Fig. 3). Considerando a estimativa do consumo médio de água do
7º ao 15º DP (M7-15) e do 2º ao 20º DP (M2-20), o grupo experimental T2
apresentou diferenças significativas com relação aos grupos C1 e C2, ou seja,
durante nove dias após o intervalo M2-6 e também considerando todo o intervalo
M2-20 (19 dias), a redução no consumo de água do grupo tratado durante o período
de organogênese (T2) foi detectada quando comparada com qualquer um dos
grupos controles (Fig. 3).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
GP
GPLQ
G
r
a
m
a
s
Ganho de Peso (GP) e Ganho de Peso Líquido (GPL)
Controle 1
Tratado 1
Controle 2
Tratado 2
49
Figura 3 - Estimativa do consumo de água filtrada (média erro padrão da média) das
ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) - receberam 0,5 mL de água
filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1 (T1) - receberam extrato seco de
Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada
do 6º ao 15º DP; tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1
mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP; média de consumo do 2º ao 6º DP (M2-6); média de consumo do 7º ao 15º DP
(M7-15); média de consumo do 16º ao 20º DP (M16-20) e média de consumo do 2º ao
20º DP (M2-20). Letras diferentes no mesmo intervalo gestacional indicam diferenças
significativas entre os grupos experimentais (Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05).
Campo Grande (UFMS), 2009.
Com relação à estimativa do consumo médio de ração comercial do 2º ao 6º
DP (M2-6), os resultados foram similares entre os grupos experimentais. Não houve
efeito dos tratamentos, quanto ao consumo de ração, durante os cinco primeiros dias
de administração dos tratamentos (Fig. 4). Entretanto, considerando a estimativa do
7º ao 15º DP (M7-15), os grupos experimentais T1 e T2 diferiram significativamente
do C1. Durante nove dias, após o intervalo M2-6, a redução no consumo de ração
dos grupos tratados (T1 e T2) foi detectada quando comparada com o grupo controle
que recebeu água durante todo período gestacional (Fig. 4).
Considerando a estimativa do 16º ao 20º DP (M16-20), o grupo experimental
T2 apresentou diferenças significativas com todos os demais grupos. Durante os
cinco últimos dias de administração dos tratamentos (M16-20), a redução no
consumo de ração do grupo tratado durante o período de organogênese (T2) foi
detectada quando comparada com todos os grupos experimentais (Fig. 4). Quanto à
a
a
a
a
a
a,b
a
a,b
a
a
a
a
a
b
a
b
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
M2-6
M7-15
M16-20
M2-20
C
o
n
s
u
m
o
d
e
Á
g
u
a
m
L
/
d
i
a
Intervalo Gestacional ou Prenhez (Dias)
Controle 1
Tratado 1
Controle 2
Tratado 2
50
estimativa do 2º ao 20º DP (M2-20), o grupo experimental T1 diferiu,
significativamente, dos grupos C1 e C2. Durante todo o intervalo M2-20 (19 dias), a
redução no consumo de ração do grupo tratado durante todo período gestacional
(T1) foi detectada quando comparada com qualquer um dos grupos controles (Fig.
4).
Figura 4 - Estimativa do consumo de ração comercial (média erro padrão da média)
das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) - receberam 0,5 mL de
água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1 (T1) - receberam extrato
seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de
água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de
água filtrada do 6º ao 15º DP; tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Maytenus
ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 6º ao 15º DP; média de consumo do 2º ao 6º DP (M2-6); média de
consumo do 7º ao 15º DP (M7-15); média de consumo do 16º ao 20º DP (M16-20) e
média de consumo do 2º ao 20º DP (M2-20). Letras diferentes no mesmo intervalo
gestacional indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais (Teste
Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05). Campo Grande (UFMS), 2009.
Tomados em conjunto, os resultados parecem indicar presença de
efeitos tóxicos de M. ilicifolia relativos ao consumo de água durante o período
de organogênese e de ração tanto no período de organogênese quanto durante
todo o período gestacional.
a
a
a
a
a
b
a
b
a
a,b
a
a
a
b
b
a,b
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
M2-6
M7-15
M16-20
M2-20
C
o
n
s
u
m
o
d
e
R
a
ç
ã
o
g
/
d
i
a
Intervalo Gestacional ou Prenhez (Dias)
Controle 1
Tratado 1
Controle 2
Tratado 2
51
Encontram-se descritos na Tabela 1, os valores referentes ao peso absoluto e
relativo dos órgãos maternos nos grupos experimentais.
Tabela 1. Peso (média erro padrão da média) absoluto (PA) e relativo (PRel) dos órgãos
maternos nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
Parâmetros
Grupos experimentais
C1 (n=10)
T1 (n=10)
C2 (n=10)
T2 (n=10)
PA Baço (mg)
519,30 9,44
514,90 16,28
480,30 23,21
459,50 26,51
PRel
0,2085 0,0047
0,2043 0,0076
0,1984 0,0110
0,1864 0,0098
PA Fígado (g)
10,55 0,32
11,67 0,35
11,04 0,51
10,43 0,42
PRel
4,2321 0,1276
4,6187 0,1166
4,5237 0,1471
4,2225 0,1164
PA Ovários (mg)
165,10 7,45
165,60 10,71
165,90 10,37
167,80 5,74
PRel
0,0662 0,0029
0,0653 0,0036
0,0677 0,0030
0,0684 0,0028
PA Rins (mg)
1.526,80 51,35
1.639,60 49,72
1.550,10 42,98
1.491,90 52,58
PRel
0,6129 0,0222
0,6479 0,0139
0,6377 0,0168
0,6044 0,0118
PA Útero com fetos (g)
36,84 3,88
38,49 3,93
36,65 4,25
46,46 2,54
PRel
14,6250 1,4320
15,1050 1,4690
14,7727 1,4750
18,8345 0,9449
PA Útero sem fetos (g)
3,87 0,28
3,90 0,30
3,79 0,25
4,21 0,18
PRel
1,5452 0,0955
1,5328 0,1110
1,5473 0,0871
1,7059 0,0564
Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; Controle 2 (C2): receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP;
Tratado 2 (T2): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5
mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP; (nº de animais estudados). Teste Estatístico:
ANOVA/Tukey, p 0,05.
No modelo experimental e na dose utilizada, pode-se constatar que não
houve diferenças significativas entre os grupos experimentais (Tab. 1). Não houve
efeito dos tratamentos para peso absoluto e relativo de baço, fígado, ovários, rins e
útero materno com fetos e sem fetos.
A análise macroscópica externa dos órgãos maternos (baço, fígado e rins)
não revelou nenhuma alteração morfológica perceptível (cor, tamanho, textura,
hemorragias e cistos).
4.2 Desempenho Reprodutivo Materno e Desenvolvimento Embrionário
A Tabela 2 apresenta os valores relativos à fertlidade, desempenho
reprodutivo das ratas e análise dos fetos nos grupos experimentais.
52
Tabela 2. Desempenho reprodutivo (média erro padrão da média) das ratas e análise dos fetos nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
Parâmetros
Grupos experimentais
C1 (n=10)
T1 (n=10)
C2 (n=10)
T2 (n=10)
Nº de corpos lúteos no ovário direito
1
5,10 0,59
5,80 0,36
5,30 0,61
5,20 0,44
Nº de corpos lúteos no ovário esquerdo
1
5,60 0,45
5,50 0,37
5,10 0,48
6,40 0,37
Nº de corpos lúteos nos ovários
1
10,70 0,67
11,30 0,42
10,71 0,37
11,60 0,45
Nº de implantes no corno uterino direito
1
4,80 0,63
5,70 0,42
5,40 0,50
5,20 0,44
Nº de implantes no corno uterino esquerdo
1
5,70 0,45
4,90 0,66
4,50 0,50
6,40 0,37
Nº de implantes nos cornos uterinos
1
10,50 0,65
10,60 0,93
9,90 0,75
11,60 0,45
Nº de fetos vivos no corno uterino direito
1
3,80 0,66
5,00 0,52
4,50 0,52
4,70 0,42
Nº de fetos vivos no corno uterino esquerdo
1
4,40 0,54
3,80 0,57
3,20 0,55
5,20 0,36
Nº de fetos vivos nos cornos uterinos
1
8,20 0,96
8,80 0,93
7,70 0,93
9,90 0,57
Nº de reabsorções no corno uterino direito
1
1,00 0,37
0,70 0,42
0,90 0,43
0,50 0,22
Nº de reabsorções no corno uterino esquerdo
1
1,30 0,62
1,10 0,38
1,30 0,50
1,00 0,21
Nº de reabsorções nos cornos uterinos
1
2,30 0,84
1,80 0,74
2,20 0,89
1,50 0,22
Peso Fetal
1
(g)
2,65 0,13
2,54 0,03
2,80 0,24
2,79 0,16
Adequação do peso a idade de prenhez
PAIP
PAIP
Comprimento Fetal
1
(cm)
3,55 0,09
3,47 0,03
3,58 0,12
3,61 0,08
Peso Placentário
1
(g)
0,49 0,02
0,48 0,01
0,50 0,02
0,47 0,01
Índice Placentário
1
0,19 0,01
0,19 0,01
0,18 0,01
0,17 0,01
Razão Sexual
2
(%)
103,97 7,95
97,83 8,68
106,33 14,16
103,16 6,90
Taxa de eficiência de implantação
2
98,33 ± 1,67
93,00 ± 7,00
92,17 ± 5,92
100,00 ± 0,00
Taxa de perdas pré-implantação
2
1,67 ± 1,67
7,00 ± 7,00
7,83 ± 5,92
0,00 ± 0,00
Taxa de perdas pós-implantação
2
21,87 ± 8,49
15,20 ± 5,80
21,39 ± 7,48
12,92 ± 2,03
Taxa de reabsorção
2
21,87 ± 8,49
15,20 ± 5,80
21,39 ± 7,48
12,92 ± 2,03
Taxa de viabilidade fetal
2
78,13 ± 8,49
84,80 ± 5,80
78,61 ± 7,48
87,08 ± 2,03
Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; Controle 2 (C2): receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP; Tratado 2 (T2): receberam
extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP; (nº de animais estudados); Recém
nascido com peso adequado para a idade de prenhez (PAIP). Teste Estatístico:
1
ANOVA/Tukey, p 0,05;
2
Kruskall-Wallis, p 0,05.
53
De acordo com os resultados pode-se constatar que não houve diferenças
significativas entre os grupos para número de corpos lúteos nos ovários e número de
implantes, fetos vivos e reabsorções nos cornos uterinos (Tab. 2).
Do mesmo modo, verificou-se que os resultados para tamanho dos fetos,
assim como seu peso corpóreo e de suas placentas, índice placentário e taxas
(implantação, perdas pré e pós-implantação, reabsorção e viabilidade fetal)
encontravam-se semelhantes entre os grupos (Tab. 2). Sendo assim, os tratamentos
não alteraram as condições fisiológicas e intra-uterinas relacionadas com a
reprodução e desenvolvimento fetal.
Em nenhum dos grupos estudados foi registrado fetos mortos e desvio da
proporção esperada de 1:1 para razão sexual (Tab. 2). Portanto, os tratamentos não
afetaram os processos de organogênese e diferenciação sexual dos fetos.
4.3 Desenvolvimento das Ninhadas
4.3.1 Análise Visceral
Não foram observadas alterações macroscópicas externas nos fetos dos
grupos controles e tratados, assim como no sistema urogenital dos mesmos (Foto
11).
54
Foto 11 – Corte transversal na região pélvica normal em feto do
grupo Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia
(15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Aspecto Normal do Sistema
Urogenital. (A) Maculino: 1 – Testículos, 2 – Bexiga, 3 – Alças
Intestinais, 4 – Rins, 5 – Uretéres, 6 - Intestino grosso; (B):
Feminino: 1 – Ovários, 2 – Cornos uterinos (útero bicórneo), 3 –
Bexiga, 4 - Rins. Campo Grande (UFMS), 2009.
1
1
2
←3
4
4
5→
6→
←5
A
B
2→
3→
←2
←1
1→
4
4
55
Foi constatado hidrocefalia em todos os grupos estudados (Foto 12). Apenas
um caso de hidronefrose (Foto 13) e um de agenesia esofágica nos grupos C2 e T1,
respectivamente, os quais foram considerados eventos isolados, uma vez que,
estatisticamente, não houve diferenças significativas quando comparadas com os
demais grupos experimentais (Tab. 3).
Foto 12 – Corte frontal na região do vértex em feto do grupo Controle 2 (C2)
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP. (A) Aspecto
Normal: 1 – Ventrículo Lateral, 2 – Terceiro Ventrículo, 3 – Quarto Ventrículo, 4 –
Hemisfério cerebral; (B) Aspecto Alterado (Dismórfico): 1 - Hidrocefalia à custa
de dilatação do terceiro e quarto ventrículos; (C) 1 - Hidrocefalia à custa de
dilatação dos ventrículos laterais, 2 – terceiro e quarto ventrículos. Campo
Grande (UFMS), 2009.
A
B
A
C
1
1
2
3
4
1
1
2
56
Foto 13 – Corte transversal de rim em feto do grupo Controle 2 (C2):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP.
Aspecto dismórfico do rim - Hidronefrose. Campo Grande (UFMS), 2009.
Tabela 3. Anomalias viscerais fetais (médias ± erro padrão da média) observadas nos grupos
experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
Parâmetros
Grupos experimentais
C1 (n=10)
T1 (n=10)
C2 (n=10)
T2 (n=10)
Total de Fetos
28
31
25
34
Hidrocefalia
71,67 11,13
87,50 6,72
75,00 10,32
82,50 9,89
Hidronefrose
0,00 0,00
0,00 0,00
5,00 5,00
0,00 0,00
Agenesia Esofágica
0,00 0,00
5,00 5,00
0,00 0,00
0,00 0,00
Total de Anomalias
71,67 11,13
92,50 5,34
80,00 10,18
82,50 9,89
Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); Tratado 1 (T1): receberam
extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP; Controle 2 (C2): receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP; Tratado 2 (T2):
receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP; (nº de animais estudados). Teste Estatístico: Kruskal-Waliis/Dunn, p>0,05.
↑
Hidronefrose
57
4.3.2 Análise Esquelética
As variações observadas, em função da idade gestacional dos fetos, foram
discriminadas por região anatômica e tipo (Foto 14 a 16).
Foto 14 – Vista superior da ossificação craniana com fontanela
normal (*) em feto do grupo Tratado 1 (T1): receberam extrato seco
de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5
mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; (a) nasal; (b)
frontal; (c) parietal; (d) interparietal; (e) supraoccipital. Campo Grande
(UFMS), 2009.
a
b
c
d
e
*
58
Foto 15 – Pontos de ossificação do esterno normal em feto do grupo
Tratado 2 (T2): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg
de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage
do 6º ao 15º DP; (a) Manúbrio; (b) 4 Centros Esternais; (c) Processo
Xifóide. Campo Grande (UFMS), 2009.
Foto 16 – Pontos de ossificação do esterno anormal em feto do grupo
Controle (C2) receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP. Ossificação Reduzida e Agenesia de Esternébrios. Campo
Grande (UFMS), 2009.
c
____b____
a
59
Constatou-se nos grupos tratados (T1 e T2) uma tendência de aumento na
incidência das alterações esqueléticas, as quais foram consideradas variantes do
normal, uma vez que não houve diferenças significativas entre os grupos tratados e
controles. (Tab. 4).
Tabela 4. Anomalias esqueléticas fetais (média erro padrão da média) observadas nos grupos
experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
Parâmetros
Grupos Experimentais
C1 (n=10)
T1 (n=10)
C2 (n=10)
T2 (n=10)
Total de Fetos
27
29
27
35
Taxa de Anomalia Esquelética
100,00 ± 0,00
100,00 ± 0,00
90,00 ± 10,00
90,00 ± 10,00
Alterações do Crânio
26,67 ± 12,96
53,33 ± 26,39
22,50 ± 7,03
34,17 ± 13,29
Alterações do Nasal
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
Alterações do Frontal
5,00 ± 5,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
Alterações do Parietal
7,50 ± 5,34
23,33 ± 13,19
9,17 ± 4,72
15,00 ± 7,64
Alterações do Interparietal
2,50 ± 2,50
20,00 ± 13,33
6,67 ± 4,44
10,83 ± 5,83
Alterações do Supraoccipital
11,67 ± 6,11
10,00 ± 10,00
6,67 ± 4,44
8,33 ± 4,31
Alterações do Esterno
93,33 ± 15,75
116,67 ± 7,03
84,17 ± 16,59
90,00 ± 10,00
Esternébrios Ausentes
78,33 ± 10,56
94,17 ± 3,94
74,17 ± 12,94
77,50 ± 9,47
Esternébrios Reduzidos
12,50 ± 7,16
16,67 ± 7,03
6,67 ± 4,44
7,50 ± 3,82
Esternébrios Assimétricos
2,50 ± 2,50
5,83 ± 3,94
3,33 ± 3,33
5,00 ± 3,33
Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); Tratado 1 (T1): receberam
extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP; Controle 2 (C2): receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP; Tratado 2 (T2):
receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP; (nº de animais estudados). Teste Estatístico: Kruskal-Waliis/Dunn, p 0,05.
60
4.3.3 Análise Histológica
A análise microscópica dos baços maternos revelou que, o grupo das ratas
tratadas durante todo período gestacional (T1), apresentou alterações
histopatológicas, hemossiderose (deposição de hemossiderina) e congestão
vascular (Fig. 5).
Figura 5 – Fotomicrografia de baço de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP.
Congestão vascular (→) e deposição de hemossiderina (* grânulos de cor
marrom escura). HE, 400X.
*
61
Os fetos do grupo tratado durante o período de organogênese (T2), controle
C1 (Fig. 6) e C2 não apresentaram nenhuma alteração morfológica no baço.
Figura 6 – Fotomicrografia de baço de rata do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem
alteração. HE, 400X.
62
Nenhuma alteração foi observada no fígado das ratas. Os parâmetros
histológicos apresentaram-se dentro da normalidade nos grupos experimentais (Fig.
7).
Figura 7 – Fotomicrografia de fígado de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem
alteração. HE, 400X.
63
Com relação aos rins maternos, o grupo das ratas tratadas durante todo
período gestacional (T1) apresentou alteração do tipo congestão vascular (Fig. 8).
Figura 8 – Fotomicrografia de rim de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia (15,1 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao
20º DP. Congestão vascular (→). HE, 200X.
64
Os fetos do grupo tratado durante o período de organogênese (T2), controle
C1 (Fig. 9) e C2 não apresentaram nenhuma alteração morfológica nos rins.
Figura 9 – Fotomicrografia de rim de rata do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem
alteração. HE, 400X.
65
Na avaliação dos cortes histológicos da secção transversal do abdômen dos
fetos, foram observadas alterações do tipo congestão e hemorragia hepática (Fig.
10), além de hemoperitônio nos fetos do grupo das ratas tratadas durante todo
período gestacional - T1 (Fig. 11).
Figura 10 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia
(15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada,
via gavage do 1º ao 20º DP. Congestão vascular (*) e hemorragia hepática
(→). HE, 200X.
*
66
Figura 11– Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia
(15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Hemoperitônio (→). HE, 100X.
Os fetos do grupo tratado durante o período de organogênese (T2), controle
C1 (Fig. 12) e C2 (Fig. 13) não apresentaram nenhuma alteração morfológica
hepática e no peritônio, respectivamente.
67
Figura 12 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração hepática. HE, 200X.
Figura 13 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração no peritônio. HE, 200X.
68
Os vasos da derme também se apresentaram congestos nos fetos das ratas
tratadas durante todo período gestacional - T1 (Fig. 14).
Os fetos do grupo tratado durante o período de organogênese (T2), controle
C1 (Fig. 15) e C2, não apresentaram nenhuma alteração na derme.
Figura 14 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Maytenus ilicifolia
(15,1 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Vasos da derme congestos (→). HE, 200X.
69
Figura 15 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração na derme. HE, 200X.
Com relação às placentas, nenhuma alteração foi observada nos grupos. As
regiões, decídua basal, zona juncional e zona labiríntica não apresentaram
diferenças morfológicas entre os grupos estudados (Fig. 16 a 21).
70
Figura 16 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle 1
(C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP. Observe que o côrio viloloso (CV) e as áreas, decídua basal (DB),
zona juncional (ZJ) e zona labiríntica (ZL), estão bem organizadas.
Sem alteração na placenta. HE, 100X.
Figura 17 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle
1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao
20º DP. Maior aumento das áreas de decídua basal (DB) e zona
juncional (ZJ). Sem alteração na placenta. HE, 200X.
DB
ZJ
DB
ZJ
ZJ
ZJ
ZL
CV
DB
71
Figura 18 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle
1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao
20º DP. Maior aumento da zona labiríntica. Os vasos fetais (→) e as
lacunas vasculares maternas estão bem definidos (*). HE, 200X.
Figura 19 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle
1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao
20º DP. Observe a zona labiríntica com os vasos fetais (→) e as
lacunas vasculares maternas (*) bem definidos. HE, 200X.
*
*
*
*
*
*
*
*
72
Figura 20 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle
1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao
20º DP. Maior aumento da zona labiríntica (ZL) próxima a placa
coriônica. Observe o tronco viloso (TV) ramificado entre os vasos
fetais (→) e as lacunas vasculares maternas (*). HE, 200X.
Figura 21 – Fotomicrografia da placenta de ratas do grupo Controle
1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao
20º DP. Observe o tronco viloso (TV) ramificado entre os vasos
fetais (→) e as lacunas vasculares maternas (*). HE, 200X.
TV
*
*
*
TV
ZL
*
*
*
73
5. DISCUSSÃO
5.1 Toxicidade Materna
Considerando que não ocorreram mortes maternas, alteração na atividade
locomotora, nem ocorrência de piloereção, diarréia, perdas sangüíneas vaginais e
que em nenhum dos grupos pareceu existir indicação de desconforto ou estresse,
pode-se inferir que a administração do extrato de M. ilicifolia às ratas prenhes não
causou toxicidade, observável por critérios clínicos.
A gravidez é caracterizada por aumento progressivo do peso materno,
decorrente do crescimento do feto e de seus anexos (em torno de 40%) e de
adaptações próprias do organismo (os 60% restantes), caracterizadas por
anabolismo no início e catabolismo no final da gestação (RUDGE, BORGES e
CALDERON, 2000).
Neste trabalho, durante a evolução da gestação, foi verificado um aumento do
peso das ratas muito semelhante entre os diferentes tratamentos. Provavelmente,
este fato estava relacionado com o crescimento dos fetos e de seus anexos,
indicando uma gestação normal, sem efeitos nocivos à saúde materna e fetal.
Alterações no consumo médio de água e ração constituem sinais clínicos que
indicam toxicidade de um fármaco (MANSON e KANG, 1994).
Apesar dos resultados encontrados sugerirem indícios de toxicidade do
extrato no período de organogênese (redução no consumo de água e ração) e
durante todo período de prenhez das ratas (redução no consumo de ração), os
efeitos parecem ter sido transitórios, uma vez que não foram constatadas diferenças
quanto ao peso corpóreo (1º, 6º, 15º e 20º DP), ganho de peso e ganho de peso
líquido entre os grupos estudados.
Segundo Maciel, Pinto e Veiga (2002), as plantas contêm inúmeros
constituintes e seus extratos, quando testados podem apresentar efeitos sinérgicos
entre os diferentes princípios ativos devido à presença de compostos de classes ou
estruturas diferentes, contribuindo para a mesma atividade.
A elucidação dos componentes ativos presentes nas plantas, bem como seus
mecanismos de ação e estudos farmacocinéticos pré-clínicos constituem grandes,
desafios para a química farmacêutica, bioquímica e a farmacologia (GEBHARDT,
2000).
74
A análise do peso corpóreo visa avaliar possíveis efeitos tóxicos no
organismo como um todo. Já o peso de órgãos e sua observação macroscópica são
utilizados para avaliar efeitos tóxicos específicos em algum sistema ou órgão
específico (MANSON e KANG, 1994).
Neste trabalho, os resultados encontrados para peso absoluto e relativo dos
órgãos maternos (baço, fígado, ovários, rins e útero com fetos e sem fetos) foram
similares entre os grupos experimentais. Por meio do parâmetro peso relativo
qualquer erro de conclusão quanto ao ganho ou perda de peso em relação a
tratamento poderia ser corrigido. Desta forma, garantiu-se que os animais maiores
ou menores não apresentariam as médias maiores ou menores, respectivamente.
A análise macroscópica dos órgãos maternos (baço, fígado e rins) não
revelou nenhuma alteração morfológica perceptível referente à cor, ao tamanho, à
textura (consistência) e à presença de cistos.
5.2 Desempenho Reprodutivo Materno e Desenvolvimento Embrionário
Quando se analisa os efeitos tóxicos de alguma substância sobre um embrião
em fase de desenvolvimento é importante verificar se as condições fisiológicas,
relacionadas com a reprodução, encontram-se uniformes entre os grupos
experimentais.
Khera (1987) definiu toxicidade materna como alterações transitórias ou
permanentes na fisiologia materna (alteração na homeostasia, dos níveis hormonais
das membranas fetais ou mesmo alterações comportamentais) com potencial para
causar efeitos adversos nas proles durante o desenvolvimento embrio-fetal ou pós-
natal. O mesmo autor, em 1985, já tinha correlacionado malformações fetais que
ocorrem com baixa frequência (exencefalia, encefalocele, micro ou anoftalmia e
outras) à redução do peso materno.
Embora essa relação tenha sido contestada por Chahoud et al. (1999), não
existem dúvidas de que a toxicidade materna pode influir no desenvolvimento
adequado do embrião.
O peso do ovário depende bastante do número e do volume dos corpos
lúteos, visto serem eles as maiores estruturas no órgão (WAYNFORTH, 1971). Os
corpos lúteos são a fonte principal de secreção de progesterona (KATO,
MORISHIGE e ROTHCHILD, 1979); eles aumentam de volume durante a gestação,
tendo sido demonstrado que seu crescimento está intimamente correlacionado com
75
o aumento de secreção de progesterona e 20-hidroxi-progesterona (UCHIDA et al.,
1970), hormônios indispensáveis à manutenção da prenhez em rata.
Durante o início da prenhez, a secreção de estrogênios ovarianos é
responsável tanto por estimular a proliferação de células epiteliais do endométrio
como para tornar o estroma uterino receptivo para a implantação (PARIA et al.,
2000; SMITH, 2001).
Em ratas, diferente do que acontece em humanos, os corpos lúteos mantêm-
se ativos durante todo o período gestacional (KELLER, 2006).
Como o peso dos ovários não diferiu entre os grupos experimentais, é
possível inferir que as ratas tiveram produção hormonal semelhante. Portanto, o
ambiente hormonal materno não diferiu entre os tratamentos.
Uma das medidas que pode ser utilizada em estudos biológicos é a
correlação entre o número de corpos lúteos e o de implantes, uma vez que a cada
corpo lúteo, teoricamente, corresponderia um implante (INMAN e MARKIVEE, 1963;
KATO, MORISHIGE e ROTCHILD, 1979). Quanto maior a proporção entre o número
de corpos lúteos e o de implantes, maior será o número de ovulações que resultam
em oócitos fertilizados e blastocistos implantados.
A implantação é o processo pelo qual o embrião realiza o contato físico e
fisiológico íntimo com o endométrio materno para o estabelecimento da gestação.
Apesar de haver variação neste processo entre espécies, certos eventos básicos
são similares. A característica fundamental deste processo é o desenvolvimento
sincronizado do embrião para o estágio de blastocisto e a diferenciação do útero
para o estado receptivo. Em seguida, ocorrem interações entre o blastocisto ativado
e o epitélio uterino para iniciar a implantação (PARIA et al., 2000).
O fato do número de implantes viáveis/rata não apresentar diferenças
significativas entre os grupos, indica que os tratamentos, provavelmente, não
afetaram o processo de implantação dos blastocistos.
A partir da implantação, o blastocisto pode continuar seu desenvolvimento
normal, desenvolver-se de forma anormal ou então morrer. Reabsorção é nome que
se dá para a lise in situ de um embrião ou feto (KALTER, 1980); quanto maior a
proporção de reabsorções maior, evidentemente, o número de fetos cujo
desenvolvimento foi interrompido.
76
Como o número de reabsorções/rata não apresentou diferenças significativas
entre os grupos, pode-se inferir que os tratamentos não interferiram com o progresso
do desenvolvimento embrionário após a implantação.
Sabe-se que o índice (proporção) de implantação correlaciona-se com o
número de corpos lúteos, e é um indicador do sucesso da implantação do blastocisto
no endométrio (FORD, 1982). Contrastando com o índice de implantação, a
presença de reabsorções indica uma falha no desenvolvimento embrionário. Como
os dois índices não apresentaram diferenças significativas entre os grupos
experimentais estudados, pode-se inferir que a capacidade reprodutiva materna não
foi afetada pelos tratamentos.
A placenta tem uma importância crucial para o desenvolvimento do feto, pois
fornece os nutrientes necessários para seu crescimento, entre outras funções
(REGNAULT et al., 2002). Distúrbios no suprimento sangüíneo uterino estão
associados com alta morbidade pré-natal e neonatal e restrição de crescimento intra-
uterino (AUGUSTIN, 2000; ZYGMUNT et al., 2003). Uma estreita relação entre o
peso fetal e placentário já foi demonstrada em algumas espécies: humanos
(THOMPSON, BILLEWICZ e HYTTEN, 1969), coelhos (BRUCE e ABDUL, 1973),
roedores (GILBERT e LETURQUE, 1982) e porcos (SANIN et al., 2001).
O fato do tamanho dos fetos, assim como seu peso corporal e o de suas
placentas terem sido semelhantes em todos os grupos experimentais estudados,
indica que os tratamentos não alteraram a disponibilidade de nutrientes maternos
necessários para a manutenção do metabolismo e desenvolvimento fetal. Tal
suposição parece ser corroborada pela ausência de significância do índice
placentário e pelo fato dos recém nascidos terem tido peso adequado para a idade
gestacional.
5.3 Desenvolvimento das Ninhadas
5.3.1 Análises Esquelética e Visceral
Certas variações esqueléticas ocorrem espontaneamente em fetos e recém
nascidos. Sabe-se que a incidência dessas variantes anatômicas aumenta após o
tratamento de fêmeas prenhes com agentes teratogênicos (TAYLOR, 1986).
Variações esqueléticas podem ser consideradas como efeito de drogas em
doses maiores (14ª costela extra) ou apenas variações normais (14ª costela
77
rudimentar e variações de esternébrios). Quando constituem os únicos sinais de
embriotoxicidade, elas não devem ser classificadas como anormalidades. Variações
do esterno, por exemplo, parecem ter um valor duvidoso na previsão do potencial
teratogênico, pois só aumentam consideravelmente sua incidência quando também
já se mostraram claramente teratogênicas por outros critérios. Deve-se enfatizar que
algumas variações esqueléticas são consideradas espécie-específicas e,
conseqüentemente, podem apresentar diferentes magnitudes de resposta em outras
linhagens ou espécies (KIMMEL e WILSON, 1973).
Alguns tipos de malformações (fenda palatina em camundongos) podem
resultar de distúrbios da homeostasia do organismo materno e, portanto, não
representarem uma ação tóxica direta sobre o embrião ou o feto (MANSON, 1986).
Diversos fatores de crescimento (CUETO e GERTON, 2001) e citocinas
(TORCHINSKY e TODER, 2004) relacionados ao desenvolvimento normal do
embrião já foram identificados e caracterizados. Para uma gestação bem sucedida, é
necessário que haja um balanço intrauterino de citocinas. Trabalhos demonstram
que o estresse embriopático modula a expressão de um grande número de citocinas
e que dependendo de como a maquinaria apoptótica funciona, os estresses
embrionários, independentemente de sua natureza, podem ou não resultar em
desenvolvimento fetal inadequado ou perda gestacional (TORCHINSKY e TODER,
2004).
As anomalias encontradas, tanto esqueléticas como viscerais, apresentaram-
se nos grupos tratados em quantidades e de natureza muito semelhante àquelas
observadas nos grupos controles. Dados da literatura que apontam a incidência
dessas anomalias para essa espécie experimental estão de acordo com as
encontradas neste estudo (KIMMEL e WILSON, 1973; SZABO, 1989).
Portanto, é possível inferir que as alterações encontradas nos ossos do crânio
e do esterno, geralmente transitórias e reversíveis em roedores, podem constituir
indicativos de leve atraso no desenvolvimento ósseo, não adversos a sobrevivência
dos fetos, decorrentes da laparotomia no 20º DP.
Com relação às alterações viscerais, sabe-se que após o nascimento, as
hidrocefalias leves e algumas vezes moderadas, podem regredir em algumas
espécies e inclusive em humanos e que as diferenças entre espécies podem ocorrer
devido às possíveis transformações farmacocinéticas que se impõe a unidade
materno/placentária/fetal (SPINOSA, GÔRNIAK e BERNARDI, 1999). Portanto, é
78
possível inferir que as hidrocefalias nos graus encontrados (grupos tratados maior
incidência que controles) nos fetos são variantes do normal e sugere-se que as
mesmas até pudessem regredir caso a prenhez chegasse a termo e/ou depois de
algum tempo após o nascimento.
Quanto à constatação de hidronefrose e agenesia esofágica, é possível inferir
que surgiram de eventos isolados e devido ao acaso. Portanto, não resultaram da
ação dos tratamentos, uma vez que só foram observadas em um feto do grupo
controle (C2) e um feto do tratado (T1), respectivamente. Outro fato que reforça esta
possibilidade é que, estatisticamente, não houve diferenças significativas quando
comparados com os demais grupos experimentais.
5.3.2 Análise Histológica
Quando se testa um possível efeito tóxico de uma determinada substância em
um concepto, faz-se necessário estabelecer se esses efeitos são causados direta ou
indiretamente no mesmo. Por meio de alterações no organismo materno pode-se,
secundariamente, interferir no desenvolvimento normal do concepto (CHANG et al.,
2002).
A maioria das substâncias químicas consideradas como agentes tóxicos são
substâncias exógenas conhecidas como xenobióticos. A planta medicinal utilizada
como medicamento é um xenobiótico, isto é, um produto estranho ao organismo,
nele introduzido com finalidades terapêuticas. A maioria dos xenobióticos é
lipossolúvel, característica que permite sua absorção por difusão passiva através da
membrana lipídica das células. O organismo remove os xenobióticos por meio de
uma série de alterações estruturais mediante diversos processos de
biotransformação. A biotransformação geralmente leva à formação de compostos
mais polares, portanto, mais hidrofílicos, consequentemente mais facilmente
excretados do que seu composto original (SMITH e CLARK, 1987; RAHMAN,
RAILKAR e VENKATARARN, 1992; YUAN et al.,1995; VESSEY, 1996).
Para que um determinado xenobiótico provoque lesão, dependerá da dose,
de sua forma estrutural e dos mecanismos que utilize o organismo para conferir-lhe
polaridade e lhe excretar. Desta forma, a eficiência da eliminação de substâncias
lipofílicas, depende de sua conversão a substâncias polares e hidrossolúveis,
fenômeno que é habitualmente o fator limitante na eliminação das drogas do
organismo (SOUSA et al., 2003; SOUSA, 2004).
79
O órgão mais comumente envolvido com a biotransformação de xenobióticos
é o fígado. O fígado atua na emulsão de gorduras por meio da produção da bile, na
metabolização de substâncias presentes na corrente sanguínea, na regulação do
metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios, homeostasia e auxílio à resposta
imune. Esta atuação é devida a sua posição estratégica e por suas células
(hepatócitos) estarem entre as células mais ricamente perfundidas do organismo
(OGA, 1995; VESSEY, 1996; GUYTON e HALL, 2002; SCHINONI, 2006).
Os xenobióticos são absorvidos por difusão passiva através da membrana
lipídica das células e percorrem o organismo unido a proteínas plasmáticas,
basicamente a albumina, ou se ligam à célula adiposa. Os sistemas de
desintoxicação preferentemente hepáticos servem para dar maior polaridade, a fim
de facilitar sua excreção. O fígado os modifica para aumentar sua polaridade e
torná-los hidrossolúveis. As moléculas já hidrossolúveis podem voltar ao plasma e
serem eliminadas pela urina, ou passar para a bile e serem eliminados com as
deposições (OGA e BASILE, 1994; VESSEY, 1996; STURGILL e LAMBERT, 1997;
MEEKS, HARRISON e BULL, 2000).
Considerando que na análise histológica do fígado das ratas não foi
evidenciado nenhum tipo de alteração nos grupos, é possível inferir que as enzimas
existentes nos microssomas hepáticos (ex: citocromo P
450
) e as enzimas não
microssômicas tenham catalisado os processos de biotransformação (VESSEY,
1996; STRECK e DALLA COSTA, 1999; MEEKS, HARRISON e BULL, 2000) do
extrato de M. ilicifolia, aumentando sua polaridade e facilitando sua excreção, o que
pode ser verificado pela ausência de alterações morfológicas no órgão.
Quanto às alterações histopatológicas evidenciadas no baço e nos rins das
ratas do T1 pode-se inferir que, a célula endotelial dos capilares sanguíneos foi mais
sensível a algum componente do extrato de M. ilicifolia. No baço, sua toxicidade
deve ter alterado a célula endotelial, gerando a congestão e consequente acúmulo
de hemossiderina no órgão. O efeito hemossiderose evidenciado no baço das ratas
(T1), está relacionado com as hemácias que estavam estagnadas no baço, devido
ao fenômeno de congestão vascular observado, as quais foram fagocitadas por
macrófagos. Portanto, o acúmulo do extrato de M. ilicifolia no baço resultou no efeito
citotóxico observado pela interação biológica entre dose e tempo de exposição com
receptor biológico apropriado, a célula endotelial.
80
A hemossiderina é visível ao microscópio óptico como grânulos de cor
marrom escura, tamanho variável e aspecto refringente (BLOOD e RADOSTITS,
1989; COLES, 1993; COWELL e TYLER, 1993).
O baço como órgão linfóide, tem importante papel na defesa orgânica devido
a seus mecanismos de filtração sanguínea e fagocitose, além da produção de
fatores do complemento e imunoglobulinas (BABCOCK, AMOSCATO e NISHIODA,
1983; DOWNEY et al., 1987).
Com relação aos rins maternos, a congestão vascular detectada, no grupo
das ratas T1, pode ter sido gerada pelo mesmo componente do extrato de M.
ilicifolia, metabólitos secundários, que foi citotóxico na congestão dos vasos do baço
materno.
Segundo Finco (1997), o rim é particularmente um órgão vulnerável aos
efeitos de agentes tóxicos, devido à alta taxa de perfusão e à habilidade de
concentrar muitas substâncias na luz tubular, o que pode se agravar na gestação,
devido ao aumento fisiológico na taxa de filtração glomerular (HYTTEN, 1984).
Diversas substâncias isoladas de vegetais considerados medicinais podem
apresentar efeitos tóxicos. Segundo Capasso et al. (2000), espécies vegetais que
contêm terpenos e saponinas podem ocasionar ação tóxica renal e as espécies ricas
em lactonas sesquiterpênicas e produtos naturais do tipo furanocumarinas alguns
tipos de dermatites.
Quanto ao comprometimento das funções do fígado e dos vasos da derme
detectado nos fetos das ratas do T1 pode-se inferir que, a presença do mesmo
componente do estrato de M. ilicifolia tenha sido tóxica provocando lesões em
células endoteliais dos vasos da região abdominal, ocasionando hemoperitônio e
dilatações vasculares dérmicos consoantes aos ingurgitamentos capilares e
conseqüentes hemorragias evidenciadas nestes fetos. O tamanho do fígado fetal
aumenta linearmente com a idade gestacional, só que durante a vida intra-uterina o
fígado é imaturo, o retículo endoplasmático dos hepatócitos ainda pouco
desenvolvido reduz a sua capacidade de metabolizar xenobióticos, levando a uma
maior permanência dos mesmos no organismo. É possível, que ao longo da
exposição o efeito foi sendo somado no organismo fetal, até alcançar o nível tóxico.
Portanto, é possível que o rompimento do vaso (hemorragia) no fígado fetal e
cavidade abdominal (hemoperitônio), possam ter sido gerados pelo mesmo
componente do extrato que foi citotóxico na congestão dos vasos do baço e rins
81
maternos. Entretanto, nos fetos o efeito citotóxico foi maior porque chegou a causar
rompimento da parede do vaso, ocasionando hemorragia. O fato dos fetos
apresentarem os vasos mais sensíveis e, seu organismo ser menor que o materno, o
que deve estar relacionado com o peso corporal e concentração de extrato ou do
seu produto de biotransformação, pode ter contribuído com o efeito citotóxico mais
acentuado nos mesmos.
Como exemplos de substâncias presentes em plantas com efeitos
hepatotóxicos podem ser citados os do safrol, apiol, lignanas e alantoína (AKERELE,
1993). Um caso importante de efeito tóxico relatado recentemente foi ocasionado
pelo uso de cápsulas de têucrio (Teucrium chamaedrys L. – Labiateae), que causou
uma epidemia de hepatite na França. A origem do efeito tóxico foi atribuída a
diterpenos do tipo neo-clerodano, transformados pelo citocromo P
450
em metabólitos
hepatotóxicos, que apresentavam uma subunidade epóxido. Anteriormente, o uso do
têucrio era tido como seguro até que a comercialização do vegetal em cápsulas
associadas à camomila, prescrito para dietas de emagrecimento, desencadeou os
casos de hepatite tóxica (LOEPER et al., 1994; SAVVIDOU et al., 2007).
Outro exemplo é o do confrei (Symphytum officinale L.). Esta planta é utilizada
na medicina tradicional como cicatrizante devido à presença da alantoína, mas
também possui alcalóides pirrolizidínicos, os quais são comprovadamente
hepatotóxicos e carcinogênicos (BUCKEL, 1998). Após diversos casos de morte
ocasionados por cirrose resultante de doença hepática veno-oclusiva,
desencadeadas por esses alcalóides, o uso do confrei foi desaconselhado pela
OMS.
Os compostos com ação bioativa de importância farmacológica são
produzidos por meio da biossíntese dos metabólitos secundários. Estudos
fitoquímicos revelam a presença de muitos constituintes químicos (metabólitos) em
M. ilicifolia, como flavonóides glicosilados (LEITE et al., 2001), triterpenóides
(PEREIRA et al., 1993; CORDEIRO et. al., 1999), taninos (SOUZA-FORMIGONI et
al., 1991; MARTINS, GUTERRES e ORTEGA, 2003, REIS e SILVA, 2004) e
polissacarídeos como a arabinogalactana (CIPRIANI et al., 2006). Os triterpenóides
e a arabinogalactana foram sugeridos como importantes para o efeito
antiulcerogênico de M. ilicifolia (CORDEIRO et al., 1999; CIPRIANI et al., 2006).
Estudos relatam a ação citotóxica (antitumoral) dos triterpenos maitenina,
pristimerina e do erithrodiol em várias linhagens de células tumorais (SHIROTA et
82
al., 1994; OHSAKI et al., 2004; COSTA et al., 2008). Os flavonóides têm sido
relacionados com redução na mortalidade desencadeada por doenças que atingem
as artérias coronárias (HERTOG et al., 1993; KNEKT et al., 1991). De acordo com
vários autores, esses compostos têm potencial vasodilatador (HERRERA et al.,
1996) tanto na presença (LEMOS et al., 1999) quanto na ausência de endotélio
vascular (HERRERA et al., 1996). Dentre os flavonóides com efeitos
vasodilatadores, encontrados na M. ilicifolia constatou-se a presença de catequina e
epicatequina (SOARES DE MOURA et al., 2002; RATTMANN et al., 2006; BAGGIO
et al., 2007a, b; CRESTANI et al., 2009). Dentre outras atividades biológicas
atribuídas aos flavonóides destacam-se a antiinflamatória (JORGE et al., 2004),
antioxidante (MELO et al., 2001; CORSINO et al., 2003; VELLOSA et al., 2006;
PESSUTO et al., 2009) e antimutagenica (HORN e VARGAS, 2003).
Segundo Tennant (1977), o fígado por ser o principal órgão responsável pelo
metabolismo e detoxificação de xenobióticos, está sujeito a danos induzidos por
várias substâncias químicas. Na gestação essa susceptibilidade está aumentada,
uma vez que nesse período há um decréscimo no metabolismo hepático e uma
redução no nível de albumina plasmática, aumentando a proporção de drogas livres
no plasma da gestante (HYTTEN e PAINTIN, 1963; HYTTEN, 1981 e 1984; TURK e
CASTEEL, 1997).
A eficácia e a toxicidade das drogas usadas na gestação são difíceis de
serem estimadas devido às alterações em muitos parâmetros fisiológicos (ex:
hormonais) e pela variação das atividades enzimáticas no metabolismo das
mesmas, ditadas pela presença da placenta e do feto. Quando a mãe é exposta a
substâncias tóxicas durante a gestação, pode haver um mecanismo de indução, que
aumenta a metabolização de drogas pelo feto (HODGE e TRACY, 2007; WEIER et
al., 2008).
Morgan (1997) relata que a extensão da exposição fetal ás drogas
(substâncias tóxicas) administradas ao organismo materno depende de numerosos
fatores – em particular dos mecanismos de eliminação materno-fetal e da
permeabilidade placentária. Refere que, na gravidez, devido ao aumento do trabalho
cardíaco há elevação de 50% no fluxo plasmático renal efetivo e nível de filtração
glomerular. Isto resulta em aumento correspondente do clearance renal da droga. A
transferência placentária de pequenas moléculas lipofílicas da mãe para o feto é
eficiente, porque a membrana placentária é uma membrana lipofílica muito delgada,
83
com extensa área de superfície para trocas e elevados níveis de fluxo sanguíneo
placentário fetal e materno. Não obstante, a transferência placentária de moléculas
relativamente hidrofílicas é lenta e isto pode limitar a exposição fetal à droga.
No presente estudo, é possível inferir que o extrato de M. ilicifolia (metabólitos
secundários) tenha atravessado a placenta passando pela veia umbilical, fígado fetal
e, então, para a circulação sistêmica do feto, criando o efeito potencial de passagem
evidenciado no fígado dos fetos (ratas do T1).
Em ratos e seres humanos o blastocisto rompe o epitélio uterino e invade o
estroma endometrial, levando à formação da placenta que se caracteriza por uma
íntima relação entre as circulações fetal e maternal (hemocorial). A implantação em
ratos e seres humanos é caracterizada por uma pronunciada reação estroma-
endométrio, referida como decidualização, a decídua forma o componente maternal
da placenta (RASWEILER IV e BADWAIK, 1999; WITORSCH, 2002a, b; GRAY e
col., 2004).
A placenta consiste em duas partes, uma porção fetal derivada do córion
viloso e uma porção materna formada pela decídua basal. Ela apresenta três zonas
distintas: labiríntica, juncional e basal. A zona labiríntica é formada por células
gigantes trofoblásticas (citotrofoblasto), sinciciotrofoblasto e mesênquima fetal, no
qual existem canais vasculares maternos e vasos fetais, responsáveis pelas trocas
de substâncias entre a mãe e o feto. A zona juncional é composta por células
gigantes secundárias trofoblásticas, de glicogênio e espongiotrofoblásticas que
secretam hormônios imprescindíveis para a viabilidade fetal uma vez que sua
ausência resulta em morte fetal. A zona da decídua basal, formada por células
deciduais, no qual a porção fetal da placenta está ligada à parede uterina (CSAPO,
DRAY e ERDOS, 1974; MUNTENER e HSU, 1977; LLUSIA, 1992;
BARTHOLOMEUSZ, BRUCE e LYNCH, 1999; RIDER et al., 2000).
A placenta é um órgão vital para o crescimento e desenvolvimento fetal, pois
transporta oxigênio e nutrientes, além de proteger contra possíveis traumas. Mediar
à transferência de nutrientes da mãe para o feto e remover produtos de metabolismo
da circulação fetal constitui uma de suas funções primordiais (ADAMSON et al.,
2002; CROSS, 2005). No entanto, são ainda pouco conhecidos os mecanismos de
transporte de substâncias bioativas na placenta, bem como a sua regulação. Sabe-
se que é mediado por uma rede complexa de transportadores de membranas que se
distribuem de uma forma polarizada no sinciciotrofoblasto e que depende de
84
algumas características da droga, como lipossolubilidade e peso molecular (CROSS,
2005; WEIER et al., 2008; COX et al., 2009).
Em algumas situações, muitas substâncias podem interferir nas propriedades
funcionais da placenta, e causar alterações em sua estrutura, levando a possíveis
perdas ou danos ao feto (LEVARIO-CARRILO et al., 2004; HODGE e TRACY, 2007;
WEIER et al., 2008).
Segundo Cox et al (2009), a placenta do ser humano e do rato apresentam
similaridades estruturais interessantes, pois mais de 80% dos genes conhecidos por
causar fenótipo placentário (envolvidos com a estrutura e/ou função) no rato são co-
expressos no ser humano. Outros fatores como curto ciclo estral, breve período
gestacional (ENDERS e BLANKENSHIP, 1999) e placenta do tipo hemocorial, igual
à de humanos, tornam o rato um dos melhores modelos para se estudar os
mecanismos da placenta e as patologias obstétricas (BURDON et al., 2007).
De acordo com os resultados do presente estudo a exposição ao extrato de
M. ilicifolia não causou alterações na morfologia da placenta das ratas Wistar, mas
teve implicações vasculares nos fetos.
Os resultados obtidos no presente estudo não excluem a possibilidade de
toxicidade humana durante a gestação. Essa é a razão principal de se evitar o uso
de medicamentos nessa fase (UIGNARD e JOHN, 1986; HODGE e TRACY, 2007;
WEIER et al., 2008). Se a intenção é utilizar a M. ilicifolia como medicamento, ela
deve ser previamente validada, isto é, ter sua ação comprovada e sua toxicidade
potencial avaliada cientificamente na espécie humana, como qualquer outro
medicamento. Sua utilidade medicamentosa na gestação deve ser fundamentada
em evidências experimentais comprobatórias de que o risco a que se expõem
aquelas que a utilizam é suplantado pelos benefícios individuais que dela possam
advir. Portanto, é preciso muita cautela, os efeitos da exposição em ambos os
organismos, materno e fetal, devem ser considerados, respeitando-se a
complexidade farmacológica e as possíveis transformações que se impõe a unidade
materno/placentária/fetal.
85
6. CONCLUSÕES
Com base no modelo experimental, dose utilizada e face aos resultados
expostos, concluiu-se que o extrato de Maytenus ilicifolia:
1) Durante o período de organogênese (6º ao 15º DP) e todo período
gestacional (1º ao 20º DP)
não causou toxicidade materna clinicamente observável e morte;
não alterou o consumo de água, ração e as condições fisiológicas e intra-
uterinas relacionadas com a reprodução;
não interferiu com o desenvolvimento fetal e a capacidade de levar a termo
uma gestação;
não provocou alterações anátomo-histológicas no fígado das ratas;
não causou efeitos tóxicos ou alterações morfológicas na placenta das
ratas;
não apresentou efeitos teratogênicos nos fetos.
2) Durante todo período gestacional (1º ao 20º DP)
apresentou-se tóxico para as células maternas renais e do baço;
apresentou-se tóxico para os fetos no fígado, hemoperitôneo e vasos da
derme.
Portanto, é preciso muita cautela na utilização da planta durante o período de
prenhez, devendo-se levar em consideração os efeitos da exposição em ambos os
organismos, materno e fetal, respeitando-se a complexidade farmacológica e as
possíveis transformações que se impõe a unidade materno/placentária/fetal.
86
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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100
2.B REVISÃO DE LITERATURA
2.B.1 Achyrocline alata (Jateí-kaá ou Jataí-kaá)
O gênero Achyrocline (Less) DC pertence à família Asteraceae, tribo
Gnaphalieae, grupo Helichrysum. Asteracea constitui uma das maiores famílias das
Angiospermaes, com aproximadamente 1.535 gêneros e cerca de 23.000 espécies,
arranjadas em três subfamílias e 17 tribos (BREMER, 1994).
Segundo Barroso et al. (1991), no Brasil, a tribo Gnaphalieae apresenta cerca
de 16 gêneros com poucas espécies, sendo que o grupo Inuleae-Gnaphaliinae,
possui sistemática complexa em virtude da homogeneidade dos caracteres
vegetativos, do tamanho reduzido dos capítulos e da pouca variação dos caracteres
florais, que tornam duvidosos os limites entre os diferentes gêneros.
A sistemática do gênero é problemática e a classificação de cada espécie
ainda não está bem definida. Apesar de algumas espécies serem amplamente
utilizadas, são poucas as informações disponíveis sobre suas propriedades
terapêuticas, algumas podem relacionar-se a altas concentrações de polifenóis
(BROUSSALIS et al., 1988).
O gênero Achyrocline é popularmente conhecido como marcela, macela-do-
campo, marcela-da-terra (ALMEIDA, 1993), marcelinha, losna-do-mato (PIO-
CORREA, 1984); jateikaá (MARQUES e BARROS, 2001), jataí-kaá ou jateí-kaá
(NUNES et al., 2003), macela, camomila nacional e macela-amarela (LORENZI e
MATOS, 2002).
As espécies deste gênero estão amplamente distribuídas, desde Minas
Gerais até a Argentina (BROUSSALIS et al., 1988; CORRÊA, 1978). Muitas crescem
em regiões secas; algumas em áreas muito extensas como, por exemplo, A.
satureioides (Lam.) DC. e outras restritas, como A. ramosissima (Sch. Bip.) Rusby,
encontrada na Argentina, Peru e Bolívia em altitudes acima de 2000 m.
Segundo Lorenzi e Matos (2002), A. satureioides (Lam) DC e A. alata (Kunth)
DC apresentam propriedades e características muito semelhantes e, seus
constituintes químicos estão associados a várias propriedades funcionais de
importância biológica.
101
2.B.2 Substâncias químicas
A. satureioides (Lam) DC é a espécie mais estudada do ponto de vista
químico, apresentando ácido caféico (FERRARO, NORBEDO e COUSSIO, 1981;
SIMÕES, 1984; DESMARCHELIER, COUSSIO e CICCIA, 1998), ácido clorogênico e
isoclorogênico (BROUSSALIS et al., 1988 e 1989; KADARIAN et al., 2002),
derivados de fenilpirona e cavapirona (KALOGA, HÄNSEL e CYBULSKI, 1983),
flavonóides (SIMÕES, 1984; MESQUITA et al., 1986; BROUSSALIS, FERRARO e
COUSSIO, 1993; DESMARCHELIER, COUSSIO e CICCIA, 1998), minerais
(PUHLMANN et al., 1992), óleos voláteis (LABUCKAS et al., 1999; LORENZO et al.,
2000; RODRIGUES et al., 2002) e polissacarídeos (PUHLMANN et al., 1992).
A. alata (Kunth) DC, segundo Bohlmann et al. (1980), não apresenta
constituição química característica na raiz. Entretanto, nas partes aéreas já foram
isolados os seguintes compostos químicos: esqualeno, cariofileno (MERXMIILLER,
LEINS e ROESSLER, 1977), copaeno (BOHLMANN, BURKHARDT e ZDERO,
1977), 5,6-dihidroxi-3,7–dimetoxiflavona, quatro derivados de geranilfloroglucinol
(BURKART, 1974; HÄNSEL e OHLENDORF, 1971) e trihidroxilabdan-7,13-dieno
(BOHLMANN et al., 1980). Além disso, dois novos floroglucinois estão presentes,
ambos contendo um anel adicional de pirona.
Broussalis et al. (1988) elucidaram a constituição química (compostos
fenólicos) de quatro espécies de Achyrocline. Foram encontrados em A. alata
flavonas (Apigenina); flavonóides: Quercetina, 3-OMe-Quercetina, Quercetina-7-
Glic., Gnafalina (5,7-diOH-3,8-diOMe-flavona) e Isognafalina (5-8-diOH-3,7-diOMe-
flavona); flavononas (5-OMe-Naringenina); ácido caféico e seus estéres (ácido
caféico, ácido clorogênico, ácido isoclorogênico, ésteres de ácido caféico).
Bauer et al. (1989), por meio de estudos fitoquímicos com inflorescências de
A. alata, também isolaram e identificaram gnafalina, quercetina, quercetina-3-
metiléter, quercetina-3-metiléter-7-O-glicosídeo e quercetina-3-metiléter-4’-O-
glicosídeo. Este estudo apresentou o primeiro relato de glicosídeo para esse gênero.
Broussalis et al. (1989) determinaram as diferenças entre A. satureioides, A.
tomentosa, A. flaccida e A. alata por meio de estudos cromatográficos com
compostos polifenólicos (conteúdo de flavonóides e derivados de ácido caféico). A
presença do composto apigenina ocorreu apenas em A. alata, derivados epoxibutoxi
de flavonóides foram característicos de A. flaccida, cafeoilcalerianinas estavam
presentes em A. satureioides, luteolina e 5,7,4’-trihidroxi-8,3’-dimetoxiflavona foram
102
encontradas somente em A. tomentosa. Os autores enfatizaram que os compostos
apigenina, luteolina, calerianinas e os derivados epoxibutoxi podem ser utilizados
como marcadores quimiotaxonômicos para esse gênero.
Gerard et al. (1991) relataram sobre a obtenção de óleos essenciais em 8
amostras de Achyrocline, coletadas em diferentes regiões do Brasil e analisadas por
Cromatografia Gasosa e Cromatografia Gasosa/Espectroscopia de Massa (CG e
CG/EM). Foram identificados 32 compostos, representando cerca de 86 a 98% dos
óleos. Em cada um dos óleos, -pireno constava sempre como o mais abundante
(41 a 78%). A distribuição dos outros constituintes, principalmente (Z)- e – (E)- -
ocimenes, 1,8-cineole, -cariofileno, permitiu a classificação das oito amostras em
três grupos. A composição do óleo essencial de A. alata mostrou-se muito parecida
com a do óleo de A. satureioides.
Broussalis, Ferraro e Coussio (1993) isolaram das inflorescências de A. alata
e identificaram os seguintes constituintes fenólicos: 7-hidroxy-3,5,4'-
trimetoxyflavanona, galangin-3-Me ether, apigenina, rhamnazin, isokaempferide,
quercetina-3-Me éter (HARBORNE e MABRY, 1982), 3,5-diidroxy-6,7,8-trimetoxy
flavona (HANSEL e CUBUKCU, 1972); quercetina e ácido clorogênico, ácido
isoclorogênico, ácido caféico e 1,5-ácido dicafeoilquínico.
Labuckas et al. (1999) relataram a composição dos óleos essenciais obtidos
das inflorescências de A. satureioides, A. alata e A. tomentosa. As amostras foram
coletadas nas áreas centrais da Argentina e foram analisadas por CG e CG/EM.
Foram identificados 52 compostos, representando cerca de 93 a 98% dos óleos.
Cariofileno foi o composto mais abundante de todos os óleos estudados (39 a 48%).
Rodrigues et al. (2002) determinaram a composição do óleo volátil obtido das
folhas e flores de A. alata ao longo do dia, das 7 às 14 horas, em intervalos de hora
em hora. Os óleos da folha e da flor foram obtidos por hidrodestilação e as análises
por meio de GC/MS. Os principais componentes do óleo da folha variaram da
seguinte forma: alfa-pineno (1,7-7,6%), 1 octeno-3-ol (1,7-5,6%), cineol 1,8 (0,4-
5,1%), beta-cariofileno (14,6-16,7%), alfa-humuleno (20,6-25,1%) e
bicyclogermacreno (7,3-12,4%). Na flor as variações dos óleos foram: alfa-pineno
(5,4-21,9%), 1 octeno-3-ol (8,0-11,6%), cineol 1,8 (7,3-10,9%), beta-cariofileno (12,0-
17,5%), alfa-humuleno (17,2-22,8%) e bicyclogermacreno (5,8-8,3%). Alfa-humuleno
103
e beta-cariofileno foram os dois principais compostos com teores de matéria seca
que variaram de 20,6-25,1% e 12,0-17,5%, respectivamente.
Leal et al. (2006) avaliaram a composição e atividade antioxidante dos
extratos de folhas e ramos finos de A. alata e A. satureioides obtidos por extração
supercrítica fluida (SFE), etanol a baixa pressão (LPEE) e hidrodestilação (HD). Os
principais compostos voláteis obtidos foram o trans-cariofileno e α-humuleno. O
conteúdo de trans-cariofileno e α-humuleno nos extratos obtidos por HD foram
maiores do que no SFE e extratos LPEE. A atividade antioxidante dos extratos SFE
e LPEE foi duas vezes maior que o do óleo volátil (HD), este talvez estivesse
associado a outros compostos fenólicos como os flavonóides. O conteúdo de trans-
cariofileno em A. alata (extrato obtido a 200 bar e 300°C), foi cinco vezes maior do
que nos extratos de A. satureioides.Todos os extratos de A. alata e A. satureioides
exibiram atividade antioxidante mais forte do que β-caroteno. No entanto, a
correlação entre a atividade antioxidante e o conteúdo de trans-cariofileno e α-
humuleno não pôde ser estabelecida.
2.B.3 Propriedades farmacológicas
Diferentes extratos (aquoso, etanólico, hidroalcóolico) e frações purificadas
(polissacarídeos, flavonóides) das inflorescências, folhas e caules de Achyrocline
têm sido extensivamente estudados, in vitro e in vivo, por diferentes autores,
apresentando resultados promissores para várias atividades biológicas. O estudo de
flavonóides é interessante não só pela investigação química, como também por sua
importância farmacológica (ARAÚJO et al., 2005; COUTINHO, MUZITANO e
COSTA, 2009).
Infusões das inflorescências de A. satureioides são muito utilizadas na
medicina popular brasileira para tratar desordens gastrointestinais e reduzir os níveis
de colesterol sanguíneo (GUGLIUCCI e MENINI, 2002; RITTER et al., 2002).
Segundo Vendruscolo, Rates e Mentz (2005), essa espécie aparece entre as 10
medicinais mais utilizadas na forma de chá na medicina alternativa de uma
comunidade de Porto Alegre, RS.
Segundo Hilgert (2001), o uso popular do infuso das partes aéreas frescas de
A. alata foi descrito para o tratamento de infecções respiratórias e resfriados, em
uma comunidade rural na Argentina.
104
A presença dos compostos fenólicos nas espécies de Achyrocline está
correlacionada com as propriedades etnofarmacológicas. Estudos experimentais
com A. satureioides demonstraram ação antiinflamatória, antiespasmódica e
analgésica sobre a musculatura lisa genital de ratos (LANGELOH e SCHENKEL,
1982; SIMÕES, 1988; SIMÕES et al., 1988), imunoestimulante in vitro (SIMÕES,
RECH e LAPA, 1986; PUHLMANN et al., 1992), mutagênica e genotóxica em
procariontes (VARGAS et al., 1990), antioxidativa in vitro (DESMARCHELIER,
COUSSIO e CICCIA, 1998), mutagênica sobre Aspergillus nidulans (FERRARI,
GIUSTI e CARNEIRO, 1993), citotóxica contra carcinoma hepático humano in vitro
(RUFFA et al., 2002), hepatoprotetora (KADARIAN et al., 2002) e anti-hiperglicêmica
em ratos (CARNEY et al., 2002).
Segundo Almeida (1993), a atividade mutagênica in vitro em Salmonella e
Escherichia coli pode explicar seu uso popular na disenteria, diarréia e infecções
intestinais.
A atividade antiviral de espécies de Achyrocline pode ser representada por A.
flaccida (Weinm.) DC. (GARCIA et al., 1995) e por A. satureioides, que possuem
atividade antiviral para Herpesvírus (ZANON et al., 1999; BETTEGA et al., 2004) e
HIV (ABDEL-MALEK et al., 1996).
Hnatyszyn et al. (2004) utilizando extratos etanólicos das partes aéreas de A.
satureioides comprovaram o significativo efeito dose-dependente vasorelaxante dos
flavonóides (quercetina e quercetina 3-metil éter) sobre a musculatura lisa dos
corpos cavernosos de suínos da Guiné. Além disso, foi demonstrado que o número
de grupos metil (Me) no núcleo da quercetina não teve influência significativa sobre a
efetividade desses compostos.
Polydoro et al. (2004) avaliaram as propriedades antioxidantes de 5 diferentes
extratos obtidos das inflorescências de A. satureioides. Todos os extratos
apresentaram potencial antioxidante significativo, o qual aumentou na presença de
plasma humano. A caracterização dos flavonóides em cada extrato demonstrou que
FDP 80 (etanol 80%) e FFr (fração enriquecida de flavonóides), continham alto teor
de flavonóides. A citotoxicidade dos extratos foi determinada em cultura de células
de Sertoli, demonstrando que FDP 80 e FFr foram altamente tóxicos na maioria das
concentrações testadas. Os extratos levaram a um aumento significativo nos níveis
de peroxidação lipídica em células de Sertoli. Os resultados sugerem que os extratos
de ervas medicinais que contêm altas concentrações de flavonóides e mostram
105
maior proteção antioxidante in vitro nem sempre são os que podem produzir o maior
benefício.
Demo et al. (2005) avaliaram à atividade antibacteriana e antifúngica de óleos
essenciais obtidos de 14 plantas medicinais da república da Argentina. Os
microorganismos utilizados foram Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis, Escherichia
coli, Klebsiella sp., Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, e levedura de
Candida albicans. O método de difusão de disco foi realizado para testar atividade
antimicrobiana. Bacillus cereus e Staphylococcus aureus foram inibidos pela maioria
dos óleos essenciais. Aloysia triphylla, Psila spartoides e Anemia tomentosa tiveram
os compostos mais efetivos contra Bacillus cereus, enquanto que Aloysia triphylla e
Baccharis flabellata foram efetivos contra Staphylococcus aureus. Nenhum dos óleos
inibiu Pseudomonas aeruginosa. Baccharis flabellata e Pectis odorata mostraram-se
ativos apenas contra bactérias Gram-positivas. Aloysia triphylla e Psila spartoides
inibiram todos os microorganismos testados, e os óleos essenciais remanescentes
demonstraram atividade variada. O estudo contribuiu para ampliar o conhecimento
etnobotânico e ajudar a descobrir substancias com potencial terapêutico inibidor de
patógenos.
Calvo et al. (2006) relatam que A. satureioides (infusão) apresenta atividade
antimicrobiana para Staphylococcus spp. (inibição de 95%) e efeitos
imunomoduladores sobre linfócitos humanos (expansão de 40% das células T
CD8+).
Segundo Brandão et al. (2006), a importância de A. satureioides levou sua
inclusão na primeira edição da Farmacopéia Brasileira.
De acordo com De Souza, Bassani e Schapoval (2007) os flavonóides
quercetina, 3-O-metil quercetina e luteolina, presentes no extrato etanólico de A.
satureioides, são de fundamental importância no processo antiinflamatório, quando
administrado por via intraperitoneal.
Segundo Fachinetto et al. (2007), as infusões de A. satureioides possuem
ação antiproliferativa sobre o ciclo celular de Allium cepa e ação inibitória da divisão
celular que aumenta de acordo com a concentração, bem como após o
armazenamento (30 meses).
Consentino et al. (2008) relatam que A. satureioides (infusão) pode exercer
diversos efeitos imunomoduladores como agente antiinflamatório em células
106
mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) e em leucócitos
polimorfonucleares.
Os produtos medicinais de origem vegetal (Herbal Medicine Products -
HMPs), já possuem uma pequena documentação na literatura (Web of Knowledge,
2009). Independente da situação sócio-econômica, o relato de uso de plantas
medicinais atinge diferentes países e geralmente predomina o conceito de que estes
produtos são uma alternativa segura, desprovida de riscos (ERNST, 2002; LANINI et
al., 2009), quando comparados a drogas convencionais.
Inúmeros produtos de origem vegetal são utilizados pela população, sendo
que o percentual de grávidas usuárias em alguns países já foi registrado (ERNST,
2002). O uso desses produtos por grávidas e a ocorrência de efeitos indesejáveis
como abortivos (LANINI et al., 2009), partos prematuros, problemas cardíacos no
feto ainda necessitam de comprovação, entretanto uma série de ocorrências tem
forte evidência de que as plantas podem induzir, por exemplo, malformação, aborto
espontâneo, doenças hepato-veno-oclusica, inclusive com relatos de mortes e outros
(ERNST, 2002).
Apesar de alguns estudos já realizados, a possibilidade de efeitos tóxicos dos
extratos de A. alata ainda é pouco conhecida, ainda mais quando se considera que é
muito utilizada pela população e que o uso inadequado pode originar efeitos
adversos retardados e/ou assintomáticos, interações medicamentosas ainda não
estudadas e dificilmente reconhecidas, além de retardar o diagnóstico e o tratamento
apropriado.
107
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113
EXPERIMENTO II- Achyrocline alata
1. INTRODUÇÃO
O gênero Achyrocline (Less.) DC., pertencente à família Asteraceae, inclui
cerca de 30 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais, não só no
Brasil como também nas Américas do Sul e Central e na África, incluindo
Madagascar (BREMER et al., 1994). Na América do Sul, são encontradas A. alata,
A. tomentosa, A. flaccida e A. satureioides (SONAGLIO, 1987; DE SOUZA,
SCHAPOVAL e BASSANI 2002).
Muitas espécies de Achyrocline crescem em regiões secas; algumas em
áreas muito extensas como, por exemplo, A. satureioides (Lam.) DC. e outras
restritas, como A. ramosissima (Sch. Bip.) Rusby, encontrada na Argentina, Peru e
Bolívia em altitudes acima de 2000 m (CORRÊA, 1978; BROUSSALIS et al., 1988).
A sistemática do gênero Achyrocline é muito problemática e a classificação de
cada espécie ainda não está bem definida. Apesar de algumas espécies serem
amplamente utilizadas, são poucas as informações disponíveis sobre suas
propriedades terapêuticas, sendo que algumas podem estar relacionadas às altas
concentrações de polifenóis (BROUSSALIS et al., 1988).
Em algumas regiões do Brasil, Achyrocline alata (Kunth) DC., é popularmente
conhecida como marcela ou macela e no Mato Grosso do Sul (MS) como Jataí-Kaá,
Jateí-Kaá ou jateí-ka-há. Por meio de um levantamento realizado em Campo
Grande/MS foi detectado junto aos raizeiros informações referentes às partes
usadas (raízes, caule ou casca de caule, fruto, semente etc), modo de preparo, vias
de administração e indicações terapêuticas das plantas mais utilizadas pela
população rural e urbana. Em 1992, A. alata era comercializada somente na forma
de flores e apresentava um alto índice de contaminação por insetos e sujidades. A
partir de 2002, à adição de caules e folhas passaram a totalizar mais de 50% do
peso em todas as amostras adquiridas, motivo adicional para atestar sua reprovação
para consumo humano. A. alata foi considerada a terceira planta mais solicitada pela
população de Campo Grande/MS aos raizeiros e/ou por eles indicadas, sendo
utilizada a parte aérea para infecção no útero e próstata, hérnia, apendicite, dores no
estômago, labirintite e bronquite. Esta espécie, juntamente com outra do mesmo
gênero – A. satureioides (Lam.) DC., são utilizadas de forma indistinta, sendo a
primeira considerada sucedânea desta última (NUNES et al., 2003).
114
Segundo Lorenzi e Matos (2002), A. alata e A. satureioides apresentam
propriedades e características muito semelhantes e, seus constituintes químicos
(compostos fenólicos) estão associados a várias propriedades etnofarmacológicas
de importância biológica.
Estudos experimentais com A. satureioides têm demonstrado ação
antiinflamatória (DE SOUZA, BASSANI e SCHAPOVAL, 2007), antiespasmódica e
analgésica sobre a musculatura lisa genital de ratos (LANGELOH e SCHENKEL,
1982; SIMÕES, 1988; SIMÕES et al., 1988), imunoestimulante in vitro (SIMÕES,
RECH e LAPA, 1986; PUHLMANN et al., 1992), mutagênica e genotóxica em
procariontes (VARGAS et al., 1990), antioxidativa in vitro (DESMARCHELIER,
COUSSIO e CICCIA, 1998; POLIDORO et al., 2004), mutagênica sobre Aspergillus
nidulans (FERRARI, GIUSTI e CARNEIRO, 1993), citotóxica contra carcinoma
hepático humano in vitro (RUFFA et al., 2002), hepatoprotetora (KADARIAN et al.,
2002), anti-hiperglicêmica em ratos (CARNEY et al., 2002), relaxante da musculatura
lisa em porcos da Guiné (HNATYSZYN et al., 2004), antibacteriana e antifúngica
(DEMO et al., 2005).
Em uma comunidade rural na Argentina, o uso popular do infuso das partes
aéreas frescas de A. alata é indicado para o tratamento de infecções respiratórias e
resfriados (HILGERT, 2001).
Calvo et al. (2006) relatam que A. satureioides (infusão) apresenta atividade
antimicrobiana para Staphylococcus spp (inibição de 95%) e efeitos
imunomoduladores sobre linfócitos humanos (expansão de 40% das células T
CD8+).
Segundo Brandão et al. (2006), a importância de A. satureioides levou sua
inclusão na primeira edição da Farmacopéia Brasileira.
De acordo com De Souza, Bassani e Schapoval (2007) os flavonóides
quercetina, 3-O-metil quercetina e luteolina, presentes no extrato etanólico de A.
satureioides, são de fundamental importância no processo antiinflamatório, quando
administrado por via intraperitoneal.
Segundo Fachinetto et al. (2007), as infusões de A. satureioides possuem
ação antiproliferativa sobre o ciclo celular de Allium cepa e essa ação inibitória da
divisão celular aumenta de acordo com a concentração, bem como após o
armazenamento (30 meses).
115
Consentino et al. (2008) relatam que A. satureioides (infusão) pode exerce
diversos efeitos imunomoduladores como agente antiinflamatório em células
mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) e em leucócitos
polimorfonucleares.
Apesar de se observar certos avanços na literatura de plantas medicinais,
poucos estudos químicos e biológicos foram conduzidos com A. alata,
especialmente os que estão relacionados com a possibilidade de intoxicações. O
conhecimento sobre os efeitos de A. alata no organismo é de fundamental
importância, sobretudo, quando se considera que é muito utilizada pela população e
não há informações disponíveis sobre posologia, tempo de utilização, possibilidade
de ação tóxica e risco de malformações e/ou aborto em caso de desenvolvimento
gestacional.
116
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o risco toxicológico da exposição ao extrato hidroetanólico seco das
sumidades floridas de A. alata no sistema reprodutivo de ratas Wistar e em seus
fetos, a fim de confirmar sua segurança na dose preconizada pela utilização na
medicina popular.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar os sinais indicativos de toxicidade materna: clínicos, consumo (ração
e água filtrada), toxicidade de órgãos, perdas sanguíneas vaginais e ocorrência
de morte;
Avaliar o desempenho reprodutivo materno e o desenvolvimento dos seus
fetos;
Verificar a possibilidade de alterações anatômico-histológicas nos órgãos
(baço, fígado e rins) das ratas e em seus fetos;
Comparar o processo de ossificação, desenvolvimento do sistema nervoso e
das vísceras dos fetos;
Verificar a possibilidade de alterações histológicas nas placentas e
variações e/ou malformações nos fetos.
117
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Procedência e Coleta do Material Botânico
As inflorescências de A. alata (Asteraceae) foram coletadas (abril de 2002) de
mais de um espécime no Horto de Plantas Medicinais (HPM) da Universidade
Federal da Grande Dourados (UFGD), em Dourados/MS, pela Dra. Maria do Carmo
Vieira.
A espécie vegetal já havia sido identificada pela Dra Lilian Auler Mentz
(UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil) e as exsicatas encontram-se depositadas como
documento taxonômico no Herbário CGMS do Centro de Ciências Biológicas e da
Saúde (CCBS / UFMS, Campo Grande, MS, Brasil) sob número de registro 11.486.
3.2 Obtenção do Extrato Vegetal
As inflorescências de A. alata (Jateí-kaá) foram extraídas exaustivamente
pelo processo de percolação, ou seja, maceração com etanol 70º GL por 6 h ao
abrigo da luz, seguida de extração (gotejamento a 1 mL/min). Os extratos obtidos
foram reunidos e concentrados em rotavapor, um sólido amorfo foi obtido e mantido
em dessecador até a total secagem (6 dias). Obteve-se um sólido vítreo, que foi
triturado em cápsula de porcelana, fornecendo um pó amorfo de coloração marrom-
amarelado, com rendimento de 19% (Farmacopéia Brasileira, 4 ed.).
3.3 Animais de Experimentação
Utilizou-se ratas albinas (Rattus norvegicus) Wistar nulíparas, heterogênicas,
de padrão sanitário convencional, com cerca de dois meses de idade, pesando
aproximadamente 200 ± 20 g, cedidas pelo Biotério Central da UFMS.
O número total de animais fornecidos pelo Biotério foi de 62 fêmeas e 12
machos com idade de 63 e 92 dias de nascidos, respectivamente.
Os animais foram alojados em gaiolas (caixas) de polipropileno (49X34X26
cm), providas de camas de maravalha selecionadas (Pinnus sp – não esterilizada),
bebedouro plástico para água e cocho para ração comercial do tipo peletizada. As
gaiolas eram higienizadas três vezes por semana. Durante todo procedimento
experimental, água filtrada e comida (ração peletizada para ratos Nuvilab CR1-
Nuvital, Curitiba-PR) foram fornecidas “ad libitum”.
118
Os animais foram mantidos sob condições padronizadas de climatização
(Estante ventilada): temperatura de 22 C 2 C, umidade relativa do ar entre 55 e
75% e fotoperíodo de 12 horas (ciclo invertido: 06:00 – 18:00 escuro, 18:00 – 06:00
claro).
Os experimentos foram conduzidos (março e abril/2008) no Laboratório de
Biologia Geral do Departamento de Biologia (DBI) - Centro de Ciências Biológicas e
da Saúde (CCBS) da UFMS.
O protocolo para uso de animais em experimentação (nº 115/2006) foi
aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UFMS. Foram seguidos os
princípios éticos de experimentação animal estabelecidos pelo atual Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e pelo Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1996).
3.4 Determinação da Dosagem
A dosagem de 3,9 mg/animal/dia (mg/kg de peso corpóreo) foi determinada
com base na dose preconizada pela utilização na medicina popular, consumo diário
de três a quatro xícaras de chá preparado com as inflorescências em infusão
(BALBACH, 1986; FREITAS, 1992), e fazendo a proporção em termos de peso
corpóreo, tendo como base um adulto de 70 kg.
3.5 Grupos e Delineamento Experimental
No rato, o implante do blastocisto no útero materno ocorre até o quinto dia de
prenhez (DP), a organogênese vai do sexto ao décimo quinto dia e deste até o
vigésimo primeiro ocorre o desenvolvimento fetal (MANSON e KANG, 1989). O
período mais crítico do desenvolvimento é o da organogênese, quando tecidos e
órgãos estão se diferenciando rapidamente, ficando susceptíveis a interferências de
agentes externos (teratógenos) capazes de alterar seu desenvolvimento
aumentando a incidência de anomalias congênitas (MOORE e PERSAUD, 2004).
Para a realização do experimento, 40 ratas prenhes foram distribuídas,
randomicamente, em quatro grupos experimentais (dois grupos controles e dois
grupos tratados) com 10 animais cada.
119
Os grupos foram submetidos ao seguinte esquema de tratamento diário:
Grupo Controle 1 (C1): recebeu, via gavage, 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º
DP;
Grupo Tratado 1 (T1): recebeu, via gavage, extrato seco de Achyrocline alata (3,9
mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada do 1º ao 20º DP;
Grupo Controle 2 (C2): recebeu, via gavage, 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º
DP;
Grupo Tratado 2 (T2): recebeu, via gavage, extrato seco de Achyrocline alata (3,9
mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada do 6º ao 15º DP.
Todos os demais subitens de Material e Métodos foram conduzidos e
efetuados de forma idêntica ao do Experimento I – Maytenus ilicifolia.
120
4. RESULTADOS
4.1 Toxicidade Materna
Quando os grupos experimentais foram comparados por meio de sinais
clínicos de toxicidade, não foram registradas mortes maternas, eriçamento dos pêlos
corporais, alteração da deambulação (hipo ou hiperatividade locomotora) e diarréia.
O acompanhamento diário da evolução gestacional demonstrou que não
houve diferenças significativas entre os grupos experimentais quanto ao peso
corpóreo, ganho de peso e ganho de peso líquido. Portanto, não houve variações,
todas as ratas ganharam peso entre o início da gestação, o tratamento e a data da
eutanásia, indicando uma gestação normal sem efeito dos tratamentos (Fig. 22 e
23).
Figura 22 - Peso corpóreo (média erro padrão da média) das ratas prenhes no 1º,
6º, 15º e 20º dia(s) de prenhez (DP) nos grupos experimentais: controle 1 (C1) -
receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1 (T1) -
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido
em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; controle 2 (C2) -
receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP e tratado 2 (T2) - receberam
extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5
mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP. Teste Estatístico: ANOVA/Tukey,
p 0,05. Campo Grande (UFMS), 2009.
0
50
100
150
200
250
300
350
1º DP
6º DP
15º DP
20º DP
P
e
s
o
C
o
r
p
ó
r
e
o
G
r
a
m
a
s
Dia da Gestação ou Prenhez (DP)
Controle 1
Tratado 1
Controle 2
Tratado 2
121
Figura 23 - Ganho de peso e ganho de peso líquido (média erro padrão da
média) das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) -
receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1
(T1) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso
corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º
DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP e
tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP. Teste Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05. Campo Grande (UFMS),
2009.
Outro critério indicativo de toxicidade materna refere-se às alterações no
consumo de alimento e água. A estimativa do consumo médio de água filtrada do 2º
ao 6º DP (M2-6) foi similar entre os grupos experimentais. Não houve efeito dos
tratamentos, quanto ao consumo de água, durante os cinco primeiros dias (M2-6) de
administração dos tratamentos. Por outro lado, considerando a estimativa do
consumo médio de água do 7º ao 15º DP (M7-15) e do 2º ao 20º DP (M2-20), o
grupo experimental T2 apresentou diferenças significativas em relação ao grupo C1
(Fig. 24), isto é, durante nove dias após o intervalo M2-6 e também considerando
todo o intervalo M2-20 (19 dias). A redução no consumo de água do grupo tratado
durante o período de organogênese (T2) só foi detectada quando comparada com o
grupo controle que recebeu água durante todo período gestacional (C1).
Com relação à estimativa do consumo médio de água do 16º ao 20º DP (M16-
20), os grupos experimentais C2 e T2 apresentaram diferenças significativas em
relação ao grupo C1 (Fig. 24). A redução no consumo de água nos últimos cinco
dias (M16-20) de administração dos tratamentos foi detectada nos grupos controle e
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
GP
GPLQ
G
r
a
m
a
s
Ganho de Peso (GP) e Ganho de Peso Líquido (GPL)
Controle 1
Tratado 1
Controle 2
Tratado 2
122
tratado durante o período de organogênese (C2 e T2), quando comparada com o
grupo controle que recebeu água durante todo período gestacional (C1).
Figura 24 - Estimativa do consumo de água filtrada (média erro padrão da média)
das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) - receberam 0,5 mL de
água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1 (T1) - receberam extrato
seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de
água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5 mL de
água filtrada do 6º ao 15º DP; tratado 2 (T2) - receberam extrato seco de Achyrocline
alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 6º ao 15º DP; média de consumo do 2º ao 6º DP (M2-6); média de
consumo do 7º ao 15º DP (M7-15); média de consumo do 16º ao 20º DP (M16-20) e
média de consumo do 2º ao 20º DP (M2-20). Letras diferentes no mesmo intervalo
gestacional indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais (Teste
Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05). Campo Grande (UFMS), 2009.
Com relação à estimativa do consumo médio de ração comercial do 2º ao 6º
DP (M2-6) e do 16º ao 20º DP (M16-20), os resultados foram similares entre os
grupos experimentais (Fig. 25). Não houve efeito dos tratamentos, quanto a
consumo de ração, durante os cinco primeiros (M2-6) e os últimos cinco dias (M16-
20) de administração dos tratamentos. Entretanto, considerando a estimativa do 7º
ao 15º DP (M7-15), os grupos experimentais C2 e T2 diferiram, significativamente,
do T1 (Fig. 25). A redução no consumo de ração dos grupos C2 e T2 durante o
período de organogênese só foi detectada quando comparada com o grupo tratado
durante todo período gestacional (T1).
a
a
a
a
a
a, b
a, b
a, b
a
a, b
b
a, b
a
b
b
b
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
M2-6
M7-15
M16-20
M2-20
C
o
n
s
u
m
o
d
e
Á
g
u
a
m
L
/
d
i
a
Intervalo Gestacional ou Prenhez (Dias)
Controle 1
Tratado 1
Controle 2
Tratado 2
123
Considerando a estimativa do 2º ao 20º DP (M2-20), o grupo experimental T2
diferiu, significativamente, do T1 (Fig. 25). A redução no consumo de ração do grupo
tratado durante o período de organogênese (T2) só foi detectada, quando
comparada com o grupo tratado durante todo período gestacional (T1).
Figura 25 - Estimativa do consumo de ração comercial (média erro padrão da
média) das ratas prenhes nos grupos experimentais: controle 1 (C1) - receberam 0,5
mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); tratado 1 (T1) - receberam
extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5
mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; controle 2 (C2) - receberam 0,5
mL de água filtrada do 6º ao 15º DP; tratado; 2 (T2) - receberam extrato seco de
Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP; média de consumo do 2º ao 6º DP (M2-6); média
de consumo do 7º ao 15º DP (M7-15); média de consumo do 16º ao 20º DP (M16-20)
e média de consumo do 2º ao 20º DP (M2-20). Letras diferentes no mesmo intervalo
gestacional indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais (Teste
Estatístico: ANOVA/Tukey, p 0,05). Campo Grande (UFMS), 2009.
Tomados em conjunto, os resultados parecem indicar presença de efeitos
tóxicos de A. alata relativos ao consumo de água durante o período de
organogênese e relativos ao consumo de ração tanto no período de organogênese
quanto durante todo período gestacional.
Encontram-se descritos na Tabela 5, os valores referentes ao peso absoluto e
relativo dos órgãos maternos nos grupos experimentais.
a
a, b
a
a, b
a
a
a
a
a
b
a
a, b
a
b
a
b
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
M2-6
M7-15
M16-20
M2-20
C
o
n
s
u
m
o
d
e
R
a
ç
ã
o
g
/
d
i
a
Intervalo Gestacional ou Prenhez (Dias)
Controle 1
Tratado 1
Controle 2
Tratado 2
124
Tabela 5. Peso (média erro padrão da média) absoluto (PA) e relativo (PRel) dos órgãos
maternos nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
Parâmetros
Grupos experimentais
C1 (n=10)
T1 (n=10)
C2 (n=10)
T2 (n=10)
PA Baço (mg)
519,20 10,70
b
622,50 35,80
a
547,70 15,20
a, b
577,00 13,50
a, b
PRel
0,1878 0,0056
a
0,2210 0,0175
a
0,2195 0,0097
a
0,2213 0,0069
a
PA Fígado (g)
11,28 0,44
a
12,25 1,30
a
10,71 0,55
a
10,86 0,33
a
PRel
4,0585 0,0960
a
4,2804 0,4677
a
4,2343 0,1184
a
4,1719 0,1716
a
PA Ovários (mg)
170,40 7,30
a
188,10 15,10
a
175,50 6,70
a
179,40 9,50
a
PRel
0,0612 0,0017
a
0,0661 0,0059
a
0,0696 0,0013
a
0,0687 0,0037
a
PA Rins (mg)
1.569,30 60,30
a
1.717,10 155,70
a
1.536,90 66,20
a
1.708,10 66,60
a
PRel
0,5621 0,0192
a
0,5989 0,0520
a
0,6089 0,0139
a
0,6556 0,0301
a
PA Útero com fetos (g)
47,25 5,22
a
55,22 9,98
a
39,46 4,41
a
31,58 2,71
a
PRel
16,6216 1,4080
a
19,0013 3,2110
a
15,3453 1,2270
a
12,0814 1,0860
a
PA Útero sem fetos (g)
4,17 0,23
a
4,49 0,33
a
3,99 0,30
a
3,80 0,10
a
PRel
1,4934 0,0507
a
1,6032 0,1521
a
1,5796 0,1046
a
1,4598 0,0504
a
Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; Controle 2 (C2): receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP;
Tratado 2 (T2): receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5
mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP; (nº de animais estudados). Letras diferentes na mesma
linha indicam que houve diferenças significativas entre os grupos experimentais (Teste Estatístico:
ANOVA/Tukey, p 0,05).
No modelo experimental e na dose utilizada, pode-se constatar que houve
diferenças significativas entre os grupos experimentais. Houve efeito dos
tratamentos com relação à variável peso absoluto do baço. Os demais órgãos
(fígado, ovários, rins e útero materno com fetos e sem fetos) não apresentaram
diferenças (Tab. 5).
A análise macroscópica externa dos órgãos maternos (baço, fígado e rins)
não revelou nenhuma alteração morfológica perceptível (cor, tamanho, textura,
hemorragias e cistos).
4.2 Desempenho Reprodutivo Materno e Desenvolvimento Embrionário
A Tabela 6 apresenta os valores relativos à fertilidade, desempenho
reprodutivo das ratas e análise dos fetos nos grupos experimentais.
125
Tabela 6. Desempenho reprodutivo (média erro padrão da média) das ratas e análise dos fetos nos grupos experimentais. Campo Grande (UFMS), 2009.
Parâmetros
Grupos experimentais
C1 (n=10)
T1 (n=10)
C2 (n=10)
T2 (n=10)
Nº de corpos lúteos no ovário direito
1
6,50 0,86
7,10 0,92
5,90 0,85
5,30 0,45
Nº de corpos lúteos no ovário esquerdo
1
5,80 0,70
5,80 0,53
6,10 0,57
6,20 0,83
Nº de corpos lúteos nos ovários
1
12,30 0,88
12,90 1,02
12,00 0,58
11,50 0,70
Nº de implantes no corno uterino direito
1
6,00 0,98
6,20 1,32
5,30 0,58
4,80 0,51
Nº de implantes no corno uterino esquerdo
1
6,00 0,68
5,70 0,54
5,20 0,66
4,80 1,02
Nº de implantes nos cornos uterinos
1
12,00 0,92
11,90 1,49
10,50 0,87
9,60 0,76
Nº de fetos vivos no corno uterino direito
1
5,30 0,87
5,60 1,35
4,50 0,43
3,70 0,56
Nº de fetos vivos no corno uterino esquerdo
1
4,70 0,67
5,20 0,53
4,20 0,77
3,40 0,70
Nº de fetos vivos nos cornos uterinos
1
10,00 1,02
10,80 1,56
8,70 0,98
7,10 0,62
Nº de reabsorções no corno uterino direito
1
0,70 0,30
0,60 0,27
0,80 0,29
1,10 0,23
Nº de reabsorções no corno uterino esquerdo
1
1,30 0,72
0,50 0,22
1,00 0,21
1,40 0,43
Nº de reabsorções nos cornos uterinos
1
2,00 0,94
1,10 0,46
1,80 0,44
2,50 0,52
Peso Fetal
1
(g)
2,81 0,15
2,76 0,31
2,43 0,11
2,31 0,07
Adequação do peso a idade de prenhez
PAIP
PAIP
Comprimento Fetal
1
(cm)
3,59 0,09
3,54 0,14
3,45 0,05
3,47 0,09
Peso Placentário
1
(g)
0,50 0,02
0,49 0,01
0,49 0,02
0,48 0,01
Índice Placentário
1
0,18 0,01
0,20 0,02
0,20 0,01
0,21 0,01
Razão Sexual
2
(%)
104,08 9,34
117,54 20,67
106,43 15,24
118,50 21,74
Taxa de eficiência de implantação
2
95,50 ± 1,78
88,73 ± 6,97
87,00 ± 5,77
86,20 ± 7,31
Taxa de perdas pré-implantação
2
2,50 ± 1,78
11,27 ± 6,97
13,00± 5,77
13,80 ± 7,31
Taxa de perdas pós-implantação
2
15,79 ± 8,06
9,26 ± 3,90
18,26 ± 4,08
25,66 ± 4,58
Taxa de reabsorção
2
15,79 ± 8,06
9,26 ± 3,90
18,26 ± 4,08
25,66 ± 4,58
Taxa de viabilidade fetal
2
84,21 ± 8,06
90,74 ± 3,90
81,74 ± 4,08
74,34 ± 4,58
Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); Tratado 1 (T1): receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP; Controle 2 (C2): receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP; Tratado 2 (T2): receberam extrato
seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP; (nº de animais estudados); Recém nascido com
peso adequado para a idade de prenhez (PAIP). Teste Estatístico:
1
ANOVA/Tukey, p 0,05;
2
Kruskall-Wallis, p 0,05.
126
De acordo com os resultados pode-se constatar que não houve diferenças
significativas entre os grupos para número de corpos lúteos nos ovários e número de
implantes, fetos vivos e reabsorções nos cornos uterinos (Tab. 6). Do mesmo modo,
verificou-se que os resultados para tamanho dos fetos, assim como seu peso
corpóreo e de suas placentas, índice placentário e taxas (implantação, perdas pré e
pós-implantação, reabsorção e viabilidade fetal) encontravam-se semelhantes entre
os grupos (Tab. 6). Sendo assim, os tratamentos não alteraram as condições
fisiológicas e intra-uterinas relacionadas com a reprodução e desenvolvimento fetal.
Em nenhum dos grupos estudados foi registrado fetos mortos e desvio da
proporção esperada de 1:1 para razão sexual (Tab. 6). Portanto, os tratamentos não
afetaram os processos de organogênese e diferenciação sexual dos fetos.
127
4.3 Desenvolvimento das Ninhadas
4.3.1 Análise Visceral
Não foram observadas alterações macroscópicas externas nos fetos dos
grupos controles e tratados, assim como no sistema urogenital dos mesmos (Foto
17).
Foto 17 – Corte transversal na região pélvica normal em feto do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido
em 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Aspecto Normal do
Sistema Urogenital: (A) Maculino: 1 – Testículos, 2 – Bexiga, 3 – Rins, 4 – Medula
espinhal; (B) Feminino: 1 – Ovários, 2 – Cornos uterinos (útero bicórneo), 3 – Bexiga,
4 - Rins. Campo Grande (UFMS), 2009.
A
B
3
3
←1
1→
←2
4
1→
←1
2→
←2
←3
4
4
128
Em todos os grupos estudados foram constatadas hidrocefalias (Foto 18).
Foto 18 – Corte frontal na região do vértex em feto do grupo
Controle 1 (C1) receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. (A) Aspecto Alterado (Dismórfico): 1 -
Hidrocefalia à custa de dilatação do terceiro e quarto
ventrículos; (B) 1 - Hidrocefalia à custa de dilatação dos:
ventrículos laterais, 2 - terceiro e quarto ventrículos. Campo
Grande (UFMS), 2009.
A
B
1
1
2
129
Foi constatado um caso de hidronefrose nos grupos C1 e T1 e três casos nos
grupos C2 (Foto 19) e T2.
Foto 19 – Corte transversal de rim em feto do grupo Controle 2
(C2): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 6º ao
15º DP. (A) Aspecto Normal do Rim: 1 – Papila renal, 2 – Pelve
renal, 3 – Medula espinhal. (B) Aspecto dismórfico do rim -
Hidronefrose. Campo Grande (UFMS), 2009.
1→
←2
3
↑
Hidronefrose
B
A
130
As alterações foram consideradas variantes do normal, uma vez que,
estatisticamente, não houve diferenças significativas entre os grupos controles e
tratados (Tab. 7).
Tabela 7. Anomalias viscerais fetais (médias ± erro padrão) observadas nos grupos experimentais.
Campo Grande (UFMS), 2009.
Parâmetros
Grupos experimentais
C1 (n=10)
T1 (n=10)
C2 (n=10)
T2 (n=10)
Total de Fetos
34
35
29
24
Hidrocefalia
57,17 10,85
56,00 11,38
44,00 10,84
59,67 14,93
Hidronefrose
2,50 2,50
5,33 3,69
9,50 5,40
22,50 13,15
Total de Anomalias
59,67 10,30
61,33 10,50
53,50 12,44
82,17 10,67
Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); Tratado 1 (T1): receberam
extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP; Controle 2 (C2): receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP; Tratado 2 (T2):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP; (nº de animais estudados). Teste Estatístico: Kruskal-Waliis/Dunn, p>0,05.
131
4.3.2 Análise Esquelética
As variações observadas, em função da idade gestacional dos fetos, foram
discriminadas por região anatômica e tipo (Foto 20 a 21).
Foto 20 – Vista da ossificação craniana em feto do grupo Tratado 2
(T2): receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 6º ao 15º DP. (A) Fontanela Normal (*), 1 - nasal, 2 -
frontal, 3 - parietal, 4 - interparietal, 5 - supraoccipital. (B) Fontanela
um pouco aumentada (*). Campo Grande (UFMS), 2009.
*
*
B
B
A
1
1
2
3
2
3
4
5
*
132
Foto 21 – Pontos de ossificação do esterno
adulto em feto do grupo Controle (C2)
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 6º ao 15º DP: (A) Manúbio, (B)
Centros Esternais (Esternébrios Assimétricos),
(C) Processo Xifóide. Campo Grande (UFMS),
2009.
A
B
C
]
133
As alterações foram consideradas variantes do normal, uma vez que não
houve diferenças significativas entre os grupos tratados e controles (Tab. 8).
Constatou-se nos grupos tratados uma tendência de aumento na incidência das
alterações esqueléticas.
Tabela 8. Anomalias esqueléticas fetais (média erro padrão da média) nos grupos experimentais.
Campo Grande (UFMS), 2009.
Parâmetros
Grupos Experimentais
C1 (n=11)
T1 (n=11)
C2 (n=11)
T2 (n=11)
Total de Fetos
33
35
28
24
Taxa de Anomalia Esquelética
100,00 ± 0,00
95,00 ± 5,00
100,00 ± 0,00
100,00 ± 0,00
Alterações do Crânio
65,17 ± 15,55
74,17 ± 41,51
90,83 ± 21,10
113,33 ± 50,85
Alterações do Nasal
14,17 ± 7,86
19,17 ± 9,94
19,17 ± 10,10
20,00 ± 11,06
Alterações do Frontal
6,67 ± 6,67
10,00 ± 10,00
12,50 ± 6,72
15,00 ± 10,67
Alterações do Parietal
13,33 ± 6,94
13,33 ± 10,18
24,17 ± 7,08
28,33 ± 13,16
Alterações do Interparietal
15,83 ± 10,13
18,33 ± 11,24
21,67 ± 7,47
30,00 ± 13,33
Alterações do Supraoccipital
11,83 ± 6,61
13,33 ± 5,85
13,33 ± 6,94
20,00 ± 13,33
Alterações do Esterno
92,50 ± 11,82
115,83 ± 12,33
103,33 ± 3,33
113,33 ± 8,89
Esternébrios Ausentes
74,50 ± 11,47
80,00 ± 11,33
92,50 ± 7,50
100,00 ± 0,00
Esternébrios Reduzidos
10,00 ± 5,53
24,17 ± 10,86
7,50 ± 7,50
6,67 ± 4,44
Esternébrios Assimétricos
8,50 ± 6,24
11,67 ± 7,88
3,33 ± 3,33
6,67 ± 4,44
Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL de água filtrada do 1º ao 20º dia de prenhez (DP); Tratado 1 (T1): receberam
extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP; Controle 2 (C2): receberam 0,5 mL de água filtrada do 6º ao 15º DP; Tratado 2 (T2):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em 0,5 mL/dia de água
filtrada, via gavage do 6º ao 15º DP; (nº de animais estudados). Teste Estatístico: Kruskal-Waliis/Dunn, p 0,05.
134
4.3.3 Análise Histológica
A análise microscópica dos baços maternos revelou que, somente o grupo
das ratas tratadas durante todo período gestacional (T1) apresentou alteração
histopatológica do tipo congestão vascular (Fig. 26).
Os demais grupos, tratado durante o período de organogênese (T2) e os
controles, C1 (Fig. 27) e C2, não apresentaram nenhuma alteração morfológica no
baço.
135
Figura 26 – Fotomicrografia de baço de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP.
Congestão vascular (→). HE, 200X.
Figura 27– Fotomicrografia de baço de rata do grupo Controle 1 (C1):
receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem
alteração. HE, 200X.
136
Quanto aos demais órgãos maternos, fígado (Fig. 28) e rins (Fig. 29), nenhum
tipo de alteração morfológica foi observada nos grupos experimentais.
Figura 28 – Fotomicrografia de fígado de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em
0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração.
HE, 400X.
137
Figura 29 – Fotomicrografia de rim de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo) dissolvido em
0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração.
HE, 400X.
Com relação aos cortes histológicos da secção transversal do abdômen dos
fetos, nenhuma alteração morfológica foi observada nos grupos experimentais
quanto ao fígado (Fig. 30), peritônio (Fig. 31) e derme (Fig. 32).
138
Figura 30 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º
ao 20º DP. Sem alteração hepática. HE, 200X.
Figura 31 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Tratado 1 (T1): receberam: Achyrocline alata (3,9 mg/kg de
peso corpóreo) dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º
ao 20º DP. Sem alteração no peritôneo. HE, 200X.
139
Figura 32 – Fotomicrografia da secção transversal do abdômen de feto de
rata do grupo Controle 1 (C1): receberam 0,5 mL/dia de água filtrada, via
gavage do 1º ao 20º DP. Sem alteração na derme. HE, 200X.
140
Foi observado processo inflamatório agudo na porção materna das placentas
dos grupos T1 (Fig. 33) e C2 (Fig. 34). Os efeitos foram mais intensos no grupo dos
animais tratados que receberam o extrato de A. alata durante todo o período
gestacional (T1).
Figura 33 – Fotomicrografia da placenta de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP.
Concentração de infiltrados de neutrófilos ao redor e na decídua basal
(DB). HE, 200X.
DB
141
Figura 34 – Fotomicrografia da placenta de rata do grupo Tratado 1 (T1):
receberam extrato seco de Achyrocline alata (3,9 mg/kg de peso corpóreo)
dissolvido em 0,5 ml/dia de água filtrada, via gavage do 1º ao 20º DP.
Concentração de infiltrados de neutrófilos ao redor e na decídua basal (DB).
HE, 400X.
DB
142
5. DISCUSSÃO
5.1 Toxicidade Materna
Considerando que não ocorreram mortes maternas, alteração na atividade
locomotora, nem ocorrência de piloereção, diarréia, perdas sangüíneas vaginais e
que em nenhum dos grupos pareceu existir indicação de desconforto ou estresse
dos animais, pode-se inferir que a administração do extrato de A. alata às ratas
prenhes não causou toxicidade, observável por critérios clínicos.
A gravidez é caracterizada por aumento progressivo do peso materno,
decorrente do crescimento do feto e de seus anexos (em torno de 40%) e de
adaptações próprias do organismo (os 60% restantes), caracterizadas por
anabolismo no início e catabolismo no final da gestação (RUDGE, BORGES e
CALDERON, 2000).
Neste trabalho, durante a evolução da gestação, foi verificado um aumento do
peso das ratas muito semelhante entre os diferentes tratamentos. Provavelmente,
este fato estava relacionado com o crescimento dos fetos e de seus anexos,
indicando uma gestação normal, sem efeitos nocivos à saúde materna e fetal.
Alterações no consumo médio de água e ração constituem sinais clínicos que
indicam toxicidade de um fármaco (MANSON e KANG, 1994).
Apesar dos resultados encontrados sugerirem indícios de toxicidade do
extrato no período de organogênese (redução no consumo de água e ração) e
durante todo período de prenhez das ratas (aumento no consumo de ração), os
efeitos parecem ter sido transitórios, uma vez que não foram constatadas diferenças
quanto ao peso corpóreo (1º, 6º, 15º e 20º DP), ganho de peso e ganho de peso
líquido entre os grupos estudados.
Segundo Maciel, Pinto e Veiga (2002) as plantas contêm inúmeros
constituintes e seus extratos, quando testados podem apresentar efeitos sinérgicos
entre os diferentes princípios ativos devido à presença de compostos de classes ou
estruturas diferentes contribuindo para a mesma atividade.
A elucidação dos componentes ativos presentes nas plantas, bem como seus
mecanismos de ação e estudos farmacocinéticos pré-clínicos constituem grandes,
desafios para a química farmacêutica, bioquímica e a farmacologia (GEBHARDT,
2000).
143
A análise do peso corpóreo visa avaliar possíveis efeitos tóxicos no
organismo como um todo. Já o peso de órgãos e sua observação macroscópica são
utilizados para avaliar efeitos tóxicos específicos em algum sistema ou órgão
específico (MANSON e KANG, 1994).
Os resultados encontrados para peso absoluto (PA) e relativo (PRel) dos
órgãos maternos (fígado, ovários, rins e útero com fetos e sem fetos) foram similares
entre os grupos experimentais, com exceção do baço que foram discrepantes (PA
significativo e PRel não significativo). Por meio do parâmetro peso relativo qualquer
erro de conclusão quanto ao ganho ou perda de peso em relação a tratamento
poderia ser corrigido. Desta forma, garantiu-se que os animais maiores ou menores
não apresentariam as médias maiores ou menores, respectivamente.
A análise macroscópica dos órgãos maternos (baço, fígado e rins) não
revelou nenhuma alteração morfológica perceptível referente à cor, ao tamanho, à
textura (consistência) e à presença de cistos.
5.2 Desempenho Reprodutivo Materno e Desenvolvimento Embrionário
Quando se analisa os efeitos tóxicos de alguma substância sobre um embrião
em fase de desenvolvimento é importante verificar se as condições fisiológicas,
relacionadas com a reprodução, encontram-se uniformes entre os grupos
experimentais.
Khera (1987) definiu toxicidade materna como alterações transitórias ou
permanentes na fisiologia materna (alteração na homeostasia, dos níveis hormonais
das membranas fetais ou mesmo alterações comportamentais) com potencial para
causar efeitos adversos nas proles durante o desenvolvimento embrio-fetal ou pós-
natal. O mesmo autor, em 1985, já tinha correlacionado malformações fetais que
ocorrem com baixa freqüência (exencefalia, encefalocele, micro ou anoftalmia e
outras) à redução do peso materno.
Embora essa relação tenha sido contestada por Chahoud et al. (1999), não
existem dúvidas de que a toxicidade materna pode influir no desenvolvimento
adequado do embrião.
O peso do ovário depende bastante do número e do volume dos corpos
lúteos, visto serem eles as maiores estruturas no órgão (WAYNFORTH, 1971). Os
corpos lúteos são a fonte principal de secreção de progesterona (KATO,
MORISHIGE e ROTHCHILD, 1979); eles aumentam de volume durante a gestação,
144
tendo sido demonstrado que seu crescimento está intimamente correlacionado com
o aumento de secreção de progesterona e 20-hidroxi-progesterona (UCHIDA et al.,
1970), hormônios indispensáveis à manutenção da prenhez em rata.
Durante o início da prenhez, a secreção de estrogênios ovarianos é
responsável tanto para estimular a proliferação de células epiteliais do endométrio
como para tornar o estroma uterino receptivo para a implantação (PARIA et al.,
2000; SMITH, 2001).
Em ratas, diferente do que acontece em humanos, os corpos lúteos mantêm-
se ativos durante todo o período gestacional (KELLER, 2006).
Como o peso dos ovários não diferiu entre os grupos experimentais, é
possível inferir que as ratas tiveram produção hormonal semelhante. Portanto, o
ambiente hormonal materno não diferiu entre os tratamentos.
Uma das medidas que pode ser utilizada em estudos biológicos é a
correlação entre o número de corpos lúteos e o de implantes, uma vez que a cada
corpo lúteo, teoricamente, corresponderia um implante (INMAN e MARKIVEE, 1963;
KATO, MORISHIGE e ROTCHILD, 1979). Quanto maior a proporção entre o número
de corpos lúteos e o de implantes, maior será o número de ovulações que resultam
em oócitos fertilizados e blastocistos implantados.
A implantação é o processo pelo qual o embrião realiza o contato físico e
fisiológico íntimo com o endométrio materno para o estabelecimento da gestação.
Apesar de haver variação neste processo entre espécies, certos eventos básicos
são similares. A característica fundamental deste processo é o desenvolvimento
sincronizado do embrião para o estágio de blastocisto e a diferenciação do útero
para o estado receptivo. Em seguida, ocorrem interações entre o blastocisto ativado
e o epitélio uterino para iniciar a implantação (PARIA et al., 2000).
O fato do número de implantes viáveis/rata não apresentar diferenças
significativas entre os grupos, indica que os tratamentos, provavelmente, não
afetaram o processo de implantação dos blastocistos.
A partir da implantação, o blastocisto pode continuar seu desenvolvimento
normal, desenvolver-se de forma anormal ou então morrer. Reabsorção é nome que
se dá para a lise in situ de um embrião ou feto (KALTER, 1980); quanto maior a
proporção de reabsorções maior, evidentemente, o número de fetos cujo
desenvolvimento foi interrompido.
145
Como o número de reabsorções/rata não apresentou diferenças significativas
entre os grupos, pode-se inferir que os tratamentos não interferiram com o progresso
do desenvolvimento embrionário após a implantação.
Sabe-se que o índice (proporção) de implantação correlaciona-se com o
número de corpos lúteos, e é um indicador do sucesso da implantação do blastocisto
no endométrio (FORD, 1982). Contrastando com o índice de implantação, a
presença de reabsorções indica uma falha no desenvolvimento embrionário. Como
os dois índices não apresentaram diferenças significativas entre os grupos
experimentais estudados, pode-se inferir que a capacidade reprodutiva materna não
foi afetada pelos tratamentos.
A placenta tem uma importância crucial para o desenvolvimento do feto, pois
fornece os nutrientes necessários para seu crescimento, entre outras funções
(REGNAULT et al., 2002). Distúrbios no suprimento sangüíneo uterino estão
associados com alta morbidade pré-natal e neonatal e restrição de crescimento intra-
uterino (AUGUSTIN, 2000; ZYGMUNT et al., 2003). Uma estreita relação entre o
peso fetal e placentário já foi demonstrada em algumas espécies: humanos
(THOMPSON, BILLEWICZ e HYTTEN, 1969), coelhos (BRUCE e ABDUL, 1973),
roedores (GILBERT e LETURQUE, 1982) e porcos (SANIN et al., 2001).
O fato do tamanho dos fetos, assim como seu peso corporal e o de suas
placentas terem sido semelhantes em todos os grupos experimentais estudados,
indica que os tratamentos não alteraram a disponibilidade de nutrientes maternos
necessários para a manutenção do metabolismo e desenvolvimento fetal. Tal
suposição parece ser corroborada pela ausência de significância do índice
placentário e pelo fato dos recém nascidos terem tido peso adequado para a idade
gestacional.
5.3 Desenvolvimento das Ninhadas
5.3.1 Análises Esquelética e Visceral
Certas variações esqueléticas ocorrem espontaneamente em fetos e recém
nascidos. Sabe-se que a incidência dessas variantes anatômicas aumenta após o
tratamento de fêmeas prenhes com agentes teratogênicos (TAYLOR, 1986).
Variações esqueléticas podem ser consideradas como efeito de drogas em
doses maiores (14ª costela extra) ou apenas variações normais (14ª costela
146
rudimentar e variações de esternébrios). Quando constituem os únicos sinais de
embriotoxicidade, elas não devem ser classificadas como anormalidades. Variações
do esterno, por exemplo, parecem ter um valor duvidoso na previsão do potencial
teratogênico, pois só aumentam consideravelmente sua incidência quando também
já se mostraram claramente teratogênicas por outros critérios. Deve-se enfatizar que
algumas variações esqueléticas são consideradas espécie-específicas e,
consequentemente, podem apresentar diferentes magnitudes de resposta em outras
linhagens ou espécies (KIMMEL e WILSON, 1973).
Alguns tipos de malformações (fenda palatina em camundongos) podem
resultar de distúrbios da homeostasia do organismo materno e, portanto, não
representarem uma ação tóxica direta sobre o embrião ou o feto (MANSON, 1986).
Diversos fatores de crescimento (CUETO e GERTON, 2001) e citocinas
(TORCHINSKY e TODER, 2004) relacionados ao desenvolvimento normal do
embrião já foram identificados e caracterizados. Para que uma gestação seja bem
sucedida, é necessário que haja um balanço intrauterino de citocinas. Trabalhos
demonstram que o estresse embriopático modula a expressão de um grande número
de citocinas e que dependendo de como a maquinaria apoptótica funciona, os
estresses embrionários, independentemente de sua natureza, podem ou não resultar
em desenvolvimento fetal inadequado ou perda gestacional (TORCHINSKY e
TODER, 2004).
As anomalias encontradas, tanto esqueléticas como viscerais, apresentaram-
se nos grupos tratados em quantidades e de natureza muito semelhante àquelas
observadas nos grupos controles. Dados da literatura que apontam a incidência
dessas anomalias para esta espécie experimental estão de acordo com as
encontradas neste estudo (KIMMEL e WILSON, 1973; SZABO, 1989).
Portanto, é possível inferir que as alterações encontradas nos ossos do crânio
e do esterno, geralmente transitórias e reversíveis em roedores, podem constituir
indicativos de leve atraso no desenvolvimento ósseo, não adversos a sobrevivência
dos fetos, decorrentes da laparotomia no 20º DP.
Com relação às alterações viscerais, sabe-se que após o nascimento, as
hidrocefalias leves e algumas vezes moderadas, podem regredir em algumas
espécies, inclusive em humanos, e que as diferenças entre espécies podem ocorrer
devido às possíveis transformações farmacocinéticas que se impõe a unidade
materno/placentária/fetal (SPINOSA, GÔRNIAK e BERNARDI, 1999). Portanto, é
147
possível inferir que as hidrocefalias nos graus encontrados (grupos tratados maior
incidência que controles) nos fetos são variantes do normal e sugere-se que as
mesmas até pudessem regredir caso a prenhez chegasse a termo e/ou depois de
algum tempo após o nascimento.
Quanto à constatação de hidronefrose, é possível inferir que não resultou da
ação dos tratamentos, uma vez que foi observada em todos os grupos, sendo um
feto no grupo controle e um feto no tratado durante todo o período gestacional (C1 e
T1) e três fetos no grupo controle e três fetos no tratado durante o período de
organogênese (C2 e T2). Outro fato que reforça esta possibilidade é que,
estatisticamente, não houve diferenças significativas entre os grupos (tratados e
controles).
Portanto, de forma generalizada, pode-se inferir que as alterações viscerais e
ósseas encontradas nos grupos são reversíveis e apresentam baixa gravidade, não
representam riscos à vida e podem ser corrigidas ou adaptadas com o
desenvolvimento e maturação do sistema ósseo e orgânico dos fetos no período
pós-natal sem maiores consequências, se a laparotomia não tivesse sido realizada
no 20º DP.
De acordo com as considerações anteriores, os resultados obtidos neste
estudo e os encontrados na literatura pode-se inferir que o extrato hidroetanólico de
A. alata não é tóxico para o organismo materno e não é teratogênico. Em síntese as
alterações encontradas constituem variações da normalidade e não malformações
propriamente ditas.
5.3.2 Análise Histológica
Quando se testa um possível efeito tóxico de uma determinada substância em
um concepto, faz-se necessário estabelecer se esses efeitos são causados direta ou
indiretamente no mesmo. Por meio de alterações no organismo materno pode-se,
secundariamente, interferir no desenvolvimento normal do concepto (CHANG et al.,
2002).
A maioria das substâncias químicas consideradas como agentes tóxicos são
substâncias exógenas conhecidas como xenobióticos. A planta medicinal utilizada
como medicamento é um xenobiótico, isto é, um produto estranho ao organismo,
nele introduzido com finalidades terapêuticas. A maioria dos xenobióticos é
lipossolúvel, característica que permite sua absorção por difusão passiva através da
148
membrana lipídica das células. O organismo remove os xenobióticos por meio de
uma série de alterações estruturais mediante diversos processos de
biotransformação. A biotransformação geralmente leva a formação de compostos
mais polares, portanto, mais hidrofílicos. Consequentemente, mais facilmente
excretados do que seu composto original (SMITH e CLARK, 1987; RAHMAN,
RAILKAR e VENKATARARN, 1992; YUAN et al.,1995; VESSEY, 1996).
Para que um determinado xenobiótico provoque lesão, dependerá da dose,
de sua forma estrutural e dos mecanismos que utilize o organismo para conferir-lhe
polaridade e lhe excretar. Desta forma, a eficiência da eliminação de substâncias
lipofílicas depende de sua conversão a substâncias polares e hidrossolúveis,
fenômeno que é habitualmente o fator limitante na eliminação das drogas do
organismo (SOUSA et al., 2003; SOUSA, 2004).
O órgão mais comumente envolvido com a biotransformação de xenobióticos
é o fígado. O fígado atua na emulsão de gorduras por meio da produção da bile, na
metabolização de substâncias presentes na corrente sanguínea, na regulação do
metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios, homeostasia e auxílio à resposta
imune Esta atuação é devida a sua posição estratégica e por suas células
(hepatócitos) estarem entre as células mais ricamente perfundidas do organismo
(OGA, 1995; VESSEY, 1996; GUYTON e HALL, 2002; SCHINONI, 2006).
Os xenobióticos são absorvidos por difusão passiva através da membrana
lipídica das células e percorrem o organismo unido a proteínas plasmáticas,
basicamente a albumina, ou se ligam a célula adiposa. Os sistemas de
desintoxicação preferentemente hepáticos servem para dar maior polaridade, a fim
de facilitar sua excreção. O fígado os modifica para aumentar sua polaridade e
torná-los hidrossolúveis. As moléculas já hidrossolúveis podem voltar ao plasma e
serem eliminadas pela urina, ou passar para a bile e serem eliminados com as
deposições (OGA e BASILE, 1994; VESSEY, 1996; STURGILL e LAMBERT, 1997;
MEEKS, HARRISON e BULL, 2000).
Considerando que na análise histológica do fígado das ratas não foi
evidenciado nenhum tipo de alteração nos grupos, é possível inferir que as enzimas
existentes nos microssomas hepáticos (ex: citocromo P
450
) e as enzimas não
microssômicas tenham catalisado os processos de biotransformação (VESSEY,
1996; STRECK e DALLA COSTA, 1999; MEEKS, HARRISON e BULL, 2000) do
extrato de A. alata, aumentando sua polaridade e facilitando sua excreção. O que
149
pode ser verificado pela ausência de alterações morfológicas no órgão (lóbulos
hepáticos, espaços porta e veias hepáticas bem delineadas, os hepatócitos
formavam cordões confluentes para a veia centro-lobular etc).
Com relação à alteração morfológica do tipo congestão vascular evidenciada
no baço das ratas do T1 pode-se inferir que, a presença de algum componente do
extrato de A. alata (metabólitos secundários) tenha sido tóxica para as células da
parede dos vasos sanguíneos, ocasionando dilatação vascular e consequente
fenômeno de congestão no órgão. É possível que no baço a célula endotelial fosse
mais sensível ao do extrato da planta.
O baço como órgão linfóide, tem importante papel na defesa orgânica devido
a seus mecanismos de filtração sanguínea e fagocitose, além da produção de
fatores do complemento e imunoglobulinas (BABCOCK, AMOSCATO e NISHIODA,
1983; DOWNEY et al., 1987).
Quanto à morfologia dos rins maternos, não foi evidenciado nenhum tipo de
alteração morfológica nos grupos. Portanto, não houve efeito dos tratamentos. Os
corpúsculos renais e túbulos contorcidos proximais e distais apresentaram padrões
de normalidade, tanto no córtex quanto na medula, sem sinais de alteração celular.
Segundo Finco (1997), o rim é particularmente um órgão vulnerável aos
efeitos de agentes tóxicos, devido à alta taxa de perfusão e à habilidade de
concentrar muitas substâncias na luz tubular, o que pode se agravar na gestação,
devido ao aumento fisiológico na taxa de filtração glomerular (HYTTEN, 1984).
Com relação aos cortes histológicos da secção transversal do abdômen dos
fetos, nenhuma alteração morfológica hepática, peritoneal e de derme, perceptíveis
à microscopia de luz, foram observadas nos grupos experimentais. Portanto, pode-
se inferir que não houve efeito dos tratamentos. Foram observados núcleos de
hepatócitos bem evidentes, células da linhagem eritrocitária em diferentes fases do
desenvolvimento. Não foram evidenciados os limites dos lóbulos hepáticos, padrão
compatível com a normalidade morfológica nessa etapa do desenvolvimento dos
fetos.
Os compostos com ação bioativa de importância farmacológica são
produzidos por meio da biossíntese dos metabólitos secundários. Do ponto de vista
químico A. alata apresenta flavonóides (BROUSSALI et al., 1988 e 1993) e óleos
essenciais (LABUCKAS et al., 1999; RODRIGUES et al., 2002). O estudo de
flavonóides é interessante não só pela investigação química, como também por sua
150
importância farmacológica (COUTINHO, MUZITANO e COSTA, 2009; ARAÚJO et
al., 2005) e atividade antiviral (SEMPLE, 1999).
Estudos experimentais com flavonóides presentes em A. satureioides têm
demonstrado efeito analgésico, antiinflamatório (DE SOUZA, BASSANI e
SCHAPOVAL, 2007), antiespasmódico e sedativo (SIMÕES et al., 1988), além de
efeito imunomodulatório (SANTOS et al., 1999), atividade mutagênica e genotóxica
em microrganismos (VARGAS et al., 1990) e atividade antioxidante (POLYDORO et
al., 2004).
A eficácia e a toxicidade das drogas usadas na gestação são difíceis de
serem estimadas devido às alterações em muitos parâmetros fisiológicos (ex:
hormonais) e pela variação das atividades enzimáticas no metabolismo das
mesmas, ditadas pela presença da placenta e do feto. Quando a mãe é exposta a
substâncias tóxicas durante a gestação, pode haver um mecanismo de indução, que
aumenta a metabolização de drogas pelo feto (HODGE e TRACY, 2007; WEIER et
al., 2008).
Em ratos e seres humanos o blastocisto rompe o epitélio uterino e invade o
estroma endometrial, levando à formação da placenta que se caracteriza por uma
íntima relação entre as circulações fetal e maternal (hemocorial). A implantação em
ratos e seres humanos é caracterizada por uma pronunciada reação estroma-
endométrio, referida como decidualização, a decídua forma o componente maternal
da placenta (RASWEILER IV e BADWAIK, 1999; WITORSCH, 2002a, b; GRAY e
col., 2004).
A placenta consiste em duas partes, uma porção fetal derivada do córion
viloso e uma porção materna formada pela decídua basal. Ela apresenta três zonas
distintas: labiríntica, juncional e basal. A zona labiríntica é formada por células
gigantes trofoblásticas (citotrofoblasto), sinciciotrofoblasto e mesênquima fetal, no
qual existem canais vasculares maternos e vasos fetais, responsáveis pelas trocas
de substâncias entre a mãe e o feto. A zona juncional é composta por células
gigantes secundárias trofoblásticas, de glicogênio e espongiotrofoblásticas que
secretam hormônios imprescindíveis para a viabilidade fetal uma vez que sua
ausência resulta em morte fetal. A zona da decídua basal, formada por células
deciduais, no qual a porção fetal da placenta está ligada à parede uterina (CSAPO,
DRAY e ERDOS, 1974; MUNTENER e HSU, 1977; LLUSIA, 1992;
BARTHOLOMEUSZ, BRUCE e LYNCH, 1999; RIDER et al., 2000).
151
A placenta é um órgão vital para o crescimento e desenvolvimento fetal, pois
transporta oxigênio e nutrientes, além de proteger contra possíveis traumas. Mediar
à transferência de nutrientes da mãe para o feto e remover produtos de metabolismo
da circulação fetal constitui uma de suas funções primordiais (ADAMSON et al.,
2002; CROSS, 2005). No entanto, são ainda pouco conhecidos os mecanismos de
transporte de substâncias bioativas na placenta, bem como a sua regulação. Sabe-
se que é mediado por uma rede complexa de transportadores de membranas que se
distribuem de uma forma polarizada no sinciciotrofoblasto e que depende de
algumas características da droga, como lipossolubilidade e peso molecular (CROSS,
2005; WEIER et al., 2008; COX et al., 2009).
Em algumas situações, muitas substâncias podem interferir nas propriedades
funcionais da placenta, e causar alterações em sua estrutura, levando a possíveis
perdas ou danos ao feto (LEVARIO-CARRILO et al., 2004; HODGE e TRACY, 2007;
WEIER et al., 2008).
Segundo Cox et al (2009) a placenta do ser humano e do rato apresentam
similaridades estruturais interessantes, pois mais de 80% dos genes conhecidos por
causar fenótipo placentário (envolvidos com a estrutura e/ou função) no rato são co-
expressos no ser humano. Outros fatores como curto ciclo estral, breve período
gestacional (ENDERS e BLANKENSHIP, 1999) e placenta do tipo hemocorial (igual
à de humanos), tornam o rato um dos melhores modelos para se estudar os
mecanismos da placenta e as patologias obstétricas (BURDON et al., 2007).
De acordo com os resultados encontrados, o processo inflamatório intenso
evidenciado nas placentas (porção materna) das ratas do grupo tratado durante todo
período gestacional (T1) e uma tendência para as ratas do grupo C2, indicam a
necessidade da realização de medições morfométricas e análises histoquímicas
nestas placentas (C2 e T1) para corroborar a possibilidade de A. alata apresentar
efeitos tóxicos na placenta, uma vez que houve diferenças morfológicas entre os
grupos. Novos estudos também serão necessários para avaliar as conseqüências
destas alterações placentárias para os fetos.
A diferença significativa encontrada entre os grupos quanto à variável peso
absoluto (PA) e relativo (PRel) do baço, também reforçam e tornam imprescindível o
estudo farmacocinético do extrato de A. alata, uma vez que os parâmetros de
toxicidade relativos à reprodução e embriofetotoxicidade geralmente apresentam
variações inter e intra-espécies importantes.
152
Os resultados obtidos no presente estudo não excluem a possibilidade de
toxicidade humana durante a gestação. Esta é a razão principal de se evitar o uso
de medicamentos nessa fase (UIGNARD e JOHN, 1986; HODGE e TRACY, 2007;
WEIER et al., 2008). Se a intenção é utilizar A. alata como medicamento, ela deve
ser previamente validada, isto é, ter sua ação comprovada e sua toxicidade potencial
avaliada cientificamente na espécie humana, como qualquer outro medicamento.
Sua utilidade medicamentosa na gestação deve ser fundamentada em evidências
experimentais comprobatórias de que o risco a que se expõem aquelas que a
utilizam é suplantado pelos benefícios individuais que dela possam advir. Portanto, é
preciso cautela, os efeitos da exposição em ambos os organismos, materno e fetal,
devem ser considerados, respeitando-se a complexidade farmacológica e as
possíveis transformações que se impõe a unidade materno/placentária/fetal.
153
6. CONCLUSÕES
Com base no modelo experimental, dose utilizada e face aos resultados
expostos, concluiu-se que o extrato de Achyrocline alata:
1) Durante o período de organogênese (6º ao 15º DP) e todo período
gestacional (1º ao 20º DP)
não causou toxicidade materna clinicamente observável e morte;
não alterou o consumo de água, ração e as condições fisiológicas e intra-
uterinas relacionadas com a reprodução;
não interferiu com o desenvolvimento fetal e a capacidade de levar a termo
uma gestação;
não provocou alterações anátomo-histológicas no fígado e rins maternos;
não provocou alterações nas células fetais do fígado, região peritoneal e
derme;
não apresentou efeitos teratogênicos nos fetos.
2) Durante todo período gestacional (1º ao 20º DP)
apresentou-se tóxico para as células maternas do baço (vascular);
apresentou-se tóxico para as células da face materna das placentas.
Portanto, é preciso muita cautela na utilização da planta durante o período de
prenhez, deve-se levar em consideração os efeitos da exposição em ambos os
organismos, materno e fetal, respeitando-se a complexidade farmacológica e as
possíveis transformações que se impõe a unidade materno/placentária/fetal.
154
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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166
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
É importante destacar que o estudo da Toxicidade Reprodutiva de agentes
naturais é uma das áreas mais complexas da Toxicologia Preditiva. Os estudos em
animais e os estudos epidemiológicos são essenciais para a realização plena da
avaliação de risco de uma dada substância. Tanto os estudos conduzidos em
animais como os dados epidemiológicos apresentam algumas vantagens e, em
contra partida, certo grau de limitação. Diferenças entre espécies são, sem dúvida, a
maior limitação dos estudos conduzidos em animais.
Por razões óbvias, substâncias potencialmente tóxicas na gestação não são
avaliadas em estudos clínicos prospectivos randomizados. Desta forma, os dados no
homem são unicamente aqueles provenientes de condições de exposição pré-
existentes e o tipo de informação mais frequente neste contexto é aquela originária
de registros médicos. Além disso, algumas alterações reprodutivas, como
malformações congênitas, são eventos raros e somente estudos muito extensos
seriam capazes de detectá-los em associação com determinada exposição.
Independente da situação sócio-econômica, o relato de uso de plantas
medicinais ocorre em diferentes países e geralmente predomina a crença de que
produtos naturais não causam efeitos adversos, constituem alternativa segura e
desprovida de riscos quando comparados a drogas convencionais. No Brasil, a
maioria dos produtos derivados de plantas utilizados culturalmente não apresenta
estudos pré-clínicos de toxicidade reprodutiva. Portanto, o efeito desses produtos
sobre o sistema reprodutivo é pouco conhecido.
Além de salientar que no presente trabalho os efeitos adversos da exposição
ao extrato hidroacetônico de M. ilicifolia e hidroetanólico de A. alata foram causados
com a dose preconizada pela utilização na medicina popular, é importante esclarecer
à população em geral, e aos profissionais de saúde em particular, que a utilização
de produtos provenientes destas plantas deve ser cautelosa ou até mesmo contra
indicada para gestantes, até que sejam realizadas mais pesquisas para
caracterização do risco toxicológico.
167
9. ANEXOS
1- Documento da Dra Ezilda Jacomassi (Coordenadora do Horto Medicinal do
Campus 2 da Universidade Paranaense – UNIVPAR e Profa Titular do Curso de
Farmácia) informando que as exsicatas encaminhadas correspondem à espécie
Maytenus ilicifolia Mart. Ex Reissek.
2- Protocolo para uso de animais em experimentação (nº 115/2006) aprovado pelo
Comitê de Ética no Uso de Animais da UFMS.
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