( PDF ) Envolvimento dos receptores CXCR1/CXCR2 e da CINC-1 na resposta febril induzida pelo LPS

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

Envolvimento dos receptores CXCR1/CXCR2 e da

CINC-1 na resposta febril induzida pelo LPS

Lívia Harumi Yamashiro

Ribeirão Preto

2010

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LÍVIA HARUMI YAMASHIRO

Envolvimento dos receptores CXCR1/CXCR2 e da

CINC-1 na resposta febril induzida pelo LPS

Dissertação apresentada ao Departamento de

Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo para obtenção

do título de Mestre em Ciências. Área de

Concentração: Farmacologia

Orientadora: Profa Dra Glória Emilia Petto de Souza

Ribeirão Preto

2010

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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer

meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que

citada a fonte.

Ficha Catalográfica

Folha de Aprovação

Yamashiro, Lívia Harumi

Envolvimento dos receptores CXCR1/CXCR2 e da

CINC-1 na resposta febril induzida pelo LPS.

Lívia Harumi Yamashiro; Orientadora: Profa Dra Glória Emilia

Petto de Souza – Ribeirão Preto, 2010.

107 folhas

Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação

em Ciências. Área de Concentração: Farmacologia) –

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de

São Paulo.

Palavras-chave: CXCR1/CXCR2, Febre, LPS, PGE

, CINC-1,

Reparixina.

Folha de Aprovação

Lívia Harumi Yamashiro

Envolvimento dos receptores CXCR1/CXCR2 e da CINC-1 na resposta

febril induzida pelo LPS

Dissertação apresentada ao Departamento de

Farmacologia da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

para obtenção do título de Mestre em

Ciências. Área de Concentração:

Farmacologia

Aprovada em:

Banca Examinadora:

__________________________________________

Profa Dra Glória Emilia Petto de Souza

FMRP-USP

__________________________________________

Prof Dr Fernando de Queiróz Cunha

FMRP-USP

___________________________________________

Prof Dr Waldiceu Aparecido Verri Jr

CCB - UEL

Trabalho realizado no Laboratório de Farmacologia do Departamento de Física

e Química da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo com auxílio financeiro da Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

“Inevitavelmente, nossos pensamentos

moldam nossa vida.”

L. Tom Perry

"That which comes easily departs easily.

That which comes of struggle remains."

Gordon B. Hinckley

DEDICO ESTE TRABALHO

Ao meu pai por mesmo longe se preocupar

comigo e especialmente a minha mãe

querida pelo amor e exemplo, por me

ensinar o valor do estudo, ser a luz na

minha vida e por tornar seu sonho a

realização dos meus.

Aos meus irmãos queridos Rafael e Evelin

e à Juliana pelo amor e apoio incondicional

mesmo sem, muitas vezes,

compreenderem o que eu fazia.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, meu Pai Celestial, por sempre me mostrar o caminho a

seguir e por me indicar os meios de como trilhá-lo;

À Profa Dra Glória Emilia Petto de Souza pela confiança, compreensão, apoio

profissional e carinho com que me orientou, contribuindo para meu crescimento

científico e intelectual;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e à

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pela concessão da

bolsa de mestrado e pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa;

Às Profas Dra Ana Maria de Oliveira, Dra Lusiane Maria Bendhack e a Dra

Sâmia Regiane Lourenço Joca do Laboratório de Farmacologia da Faculdade

de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) – USP pela amizade,

apoio e pelas conversas enriquecedoras;

À banca examinadora, Profs Dr Fernando de Queiroz Cunha e Dr Waldiceu

Aparecido Verri Jr pela disposição em participar da banca, atenção e

discussões enriquecedoras;

Ao Prof Dr Mauro Teixeira, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Minas Gerais pela colaboração;

À todos os docentes do Departamento de Farmacologia da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) – USP pela contribuição na minha

formação científica e pelo exemplo de dedicação à ciência e à docência;

Ao Reinaldo e ao Ramon, funcionários do Biotério da FCFRP- USP e aos

funcionários do Biotério Central do campus de Ribeirão Preto- USP pelo

companheirismo, profissionalismo e atenção;

À todos os alunos do Departamento de Farmacologia da FMRP-USP;

Aos funcionários da secretaria do Departamento de Farmacologia da FMRP-

USP, Fátima Petean, José Waldik Ramon e Sônia Stefanelli por todo carinho e

apoio;

À todos os pós-graduandos e alunos de iniciação científica e funcionários do

Laboratório de Farmacologia da FCFRP-USP pelo apoio, carinho, amizade

sempre demonstrados;

Aos funcionários do Laboratório de Farmacologia da FCFRP-USP Miriam

Cristina Contim Melo, Juliana Aparecida Vercesi, Mayara Gomes, Flavia Salata,

Luciana Ceribeli, Marlene Rodrigues da Silva e Maria Aparecida Rosa da Silva

pela amizade, carinho e apoio sempre;

Aos funcionários José Maria Puga, do Laboratório de Farmacotécnica da

FCFRP-USP e Giuliana Bertozi Francisco, do Laboratório de Farmacologia da

FMRP-USP pela amizade e pelo apoio técnico;

Aos amigos do Laboratório de Farmacologia da resposta febril da FCFRP-USP

Alexandre Kanashiro, Andréa Carla Pessini, Daniel Fraga, Daniela Tagliari

Longhi, David do Carmo Malvar, Denis de Melo Soares, Fernando Armani

Aguiar, Juliano Manvailer Martins, Maria Carolina Mazetto Gazola, Maria José

Figueiredo, Michele Yamamoto, Renes de Resende Machado e Veridiana

Pansiera pela amizade, alegria, apoio em todos os momentos e pelas

discussões científicas. Obrigada por tudo, sem vocês não teria chegado até

aqui.

Às grandes amigas Fernanda e Helen pela eterna amizade e carinho;

Às amigas Karen e Letícia pelo companheirismo, amizade e convívio agradável;

Ao Fernando pelo amor, carinho, compreensão e por me inspirar a me tornar

uma pessoa melhor a cada dia;

À todos os amigos e colegas que torceram por mim e que, de alguma forma,

contribuíram direta ou indiretamente para que este trabalho fosse concluído.

SUMÁRIO

RESUMO................................................................................................................

ABSTRACT............................................................................................................

iii

LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................

1.1. Termoregulação e Febre..............................................................................

1.2. Quimiocinas..................................................................................................

1.3. CINC-1..........................................................................................................

1.4. Drogas antipiréticas......................................................................................

1.5. Reparixina....................................................................................................

2. OBJETIVOS........................................................................................................

2.1. Objetivo geral...............................................................................................

2.2. Objetivos específicos...................................................................................

3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................

3.1. Animais.........................................................................................................

3.2. Esterilização.................................................................................................

3.3. Cirurgia para implante de cânulas no ventrículo lateral e microinjeção de

corante para controle do sítio de injeção.....................................................

3.4. Controle histológico......................................................................................

3.5. Fixação dos encéfalos..................................................................................

3.6. Cortes histológicos.......................................................................................

3.7. Coloração.....................................................................................................

3.8. Vias de administração dos estímulos pirogênicos.......................................

3.9. Drogas e doses............................................................................................

3.10. Protocolo experimental...............................................................................

3.11. Determinação da variação da temperatura retal e da pele da cauda por

telemetria...................................................................................................

3.12. Cirurgia para implante do transmissor de temperatura na cavidade

abdominal..................................................................................................

3.13. Determinação da variação da temperatura corporal por radiotelemetria...............

3.14. Coleta do fluido cerebroespinhal (CSF).....................................................

3.15. Determinação da concentração da CINC-1 no CSF, hipotálamo, fígado e

plasma........................................................................................................

3.16. Análise estatística......................................................................................

4 . RESULTADOS..................................................................................................

4.1. Efeito da administração da reparixina, antagonista de receptores CXCR1

e CXCR2 para quimiocinas, sobre a resposta febril induzida pelo LPS em

ratos.............................................................................................................

4.2. Determinação da concentração do agonista CINC-1 no CSF, hipotálamo,

fígado e plasma de ratos após a injeção de LPS.......................................

4.3. Efeito da administração i.c.v. de diferentes doses do agonista CINC-1

sobre a temperatura corporal de ratos.......................................................

4.4. Efeito da injeção i.h. de CINC-1 na temperatura retal.................................

4.5. Efeito da administração do agonista CINC-1 sobre a temperatura retal e

da pele da cauda em ratos..........................................................................

4.6. Efeito da administração de reparixina sobre a resposta febril induzida

pela CINC-1 em ratos.................................................................................

4.7. Efeito do tratamento com drogas antipiréticas sobre a febre induzida pela

ativação dos receptores CXCR1/CXCR2....................................................

4.8. Efeito de drogas antipiréticas sobre a concentração de PGE

no CSF dos

ratos após a ativação dos receptores CXCR1/CXCR2..............................

4.9. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a resposta

febril induzida pela IL-1β, TNF-α e IL-6 em ratos........................................

4.10. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a resposta

febril induzida pelo CRF em ratos.............................................................

4.11. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a resposta

febril induzida pelas prostaglandinas PGF

2α

e PGE

em ratos...................

5. Discussão..........................................................................................................

6. Considerações Finais.......................................................................................

7. Conclusões........................................................................................................

8. Referências Bibliográficas...............................................................................

RESUMO

O primeiro relato da atividade pirogênica das quimiocinas foi feito por

Davatellis et al., em 1989 através da injeção do dubleto MIP-1 em coelhos.

Desde então, diferentes grupos de investigadores demonstraram a atividade

pirogênica do MIP-1α e , IL-8, RANTES e CINC-1. Para exercer sua função as

quimiocinas ligam-se aos seus receptores presentes na superfície da célula-

alvo. O presente estudo investigou a participação dos receptores

CXCR1/CXCR2 na resposta febril induzida pela administração i.v. de LPS (5

μg/kg), bem como seu envolvimento na resposta induzida pelos mediadores

desencadeados por este estímulo. CINC-1, um agonista de receptores CXCR1

e CXCR2, injetado intracerebroventricular (i.c.v. 25 ng) ou

intrahipotalamicamente (i.h. 50 pg) promoveu, de maneira dose-dependente,

resposta febril e não hipertermia, pois o aumento de temperatura corporal foi

acompanhado por uma diminuição na temperatura da pele da cauda.

Investigamos também o efeito do antagonista destes receptores (reparixina) na

febre induzida pelo LPS (300 ng, i.c.v.) e pela CINC-1 (150 ng, i.c.v.). A

reparixina aboliu a febre induzida pelo agonista e reduziu a induzida pelo LPS.

Além disso, 1 h após a administração do LPS a concentração da CINC-1

aumentou significativamente no fígado, hipotálamo, fluido cerebrospinal (CSF)

e plasma sendo que os maiores aumentos ocorreram no fígado e no

hipotálamo. A febre induzida pela ativação dos receptores CXCR1/CXCR2

centrais, através da administração i.c.v. de CINC-1, mostrou ser dependente de

prostaglandinas, pois no pico desta resposta (4ª h) ocorreu aumento da

concentração de PGE

no CSF (4ª h: aCSF=45,0 ± 25,4 pg/ml; CINC-1=2120,0

± 413,0 pg/ml). Apoiando este resultado, o tratamento dos animais com

inibidores não seletivos para ciclooxigenases (COX), ibuprofeno (10mg/kg, i.p.)

e indometacina (2 mg/kg, i.p.) ou com inibidor seletivo para COX-2, celecoxibe

(5 mg/kg, p.o.) aboliu a febre e o aumento de PGE

no hipotálamo. O bloqueio

dos receptores CXCR1/CXCR2 não alterou a resposta febril induzida por IL-1β

(3,12 ng, i.c.v.), TNF-α (250 ng, i.c.v.), IL-6 (300 ng, i.c.v.), CRF (2,5 µg, i.c.v.),

PGF

2α

(250 ng, i.c.v.) e PGE

(250 ng, i.c.v.), mediadores que sabidamente

estão envolvidos na resposta febril induzida pelo LPS. Este conjunto de

resultados indica que os receptores CXCR1/CXCR2 estão envolvidos na

resposta febril induzida pelo LPS. Indica também que a CINC-1 é um dos

mediadores envolvidos nesta resposta e em uma via dependente de PGE

entretanto estes receptores não estão envolvidos na febre induzida pelas

citocinas estudadas, pelo CRF ou pelas prostaglandinas PGF

2α

e PGE

Palavras-chave: CXCR1/CXCR2, Febre, LPS, PGE

, CINC-1, Reparixina.

iii

ABSTRACT

The first relate of pyrogenic activity of chemokines was done by

Davatellis et al., (1989) by injecting the doublet MIP-1 in rabbits. Since then,

different groups of investigators showed the pyrogenic activity of MIP-1 and ,

IL-8, RANTES and CINC-1. In order to exert its functions chemokines bind to

their receptors, present on the surface of the target cell. The present study

investigated the participation of CXCR1/CXCR2 receptors in the fever response

induced by i.v. administration of LPS (5 μg/kg) as well as its involvement in the

response induced by the mediators liberated by this stimulus. CINC-1 injected

intracerebroventricularlly (i.c.v. 25 ng/site) or intrahypothalamically (i.h. 50

pg/site) promoted a dose-dependent febrile response and not hyperthermia,

since this increase in body temperature was accompanied by a decrease in the

tail skin temperature. We also investigated the effect of the receptors antagonist

(reparixin) on the fever induced by LPS (300 ng, i.c.v.) and CINC-1 (150 ng,

i.c.v.). Reparixin abolished the fever induced by the agonist and reduced the

LPS-induced one. Moreover, 1 h after LPS, the concentration of CINC-1

increased in the liver, hypothalamus, cerebrospinal fluid (CSF) and plasma. The

highest concentration of CINC-1 was found in the liver and hypothalamus. The

fever induced by the central activation of these receptors through i.c.v.

administration of CINC-1 was prostaglandin-dependent, since an increase of

PGE

in the CSF (from 45,0 to 2120 pg/ml) was observed 4 h later. Supporting

this result, the treatment with ibuprofen (10 mg/kg, i.p.), indomethacin (2 mg/ kg,

i.p.) and celecoxib (5 mg/kg, p.o.) abolished the fever and PGE

increase in the

hypothalamus. The blockade of CXCR1/CXCR2 receptors did not alter the fever

response induced by IL-1β (3,12 ng, i.c.v.), TNF-α (250 ng, i.c.v.), IL-6 (300 ng,

i.c.v.), CRF (2,5 μg, i.c.v.), PGF

2α

(250 ng, i.c.v.) and PGE

(250 ng, i.c.v.),

known mediators involved in the fever response induced by LPS. Altogether

these results indicate that CXCR1/CXCR2 receptors are involved in the fever

induced by LPS. It also indicates that CINC-1 is one of the mediators involved in

this response in a prostaglandin-dependent pathway, however these receptors

are not involved in the fever induced by cytokines, CRF or prostaglandins

PGF

2α

and PGE

Key words: CXCR1/CXCR2, Fever, LPS, PGE

, CINC-1, Reparixin.

LISTA DE ABREVIATURAS

AH/POA Área pré- óptica do hipotálamo anterior

CINC Citocina quimioatraente para neutrófilos

COX Ciclooxigenase

CRF Fator liberador de corticotropina

CSF Fluido cerebroespinal

ENA Peptídeo ativador de neutrófilos derivado de células epiteliais

GRO Oncogene regulador de crescimento

ICAM Molécula de adesão intercelular

IFN Interferon

IL Interleucina

LPS Lipopolissacarídeo

MCP Proteína quimiotática para monócitos

MIP Proteína inflamatória derivada de macrófagos

NF-κB Fator de transcrição nuclear kappa B

PG Prostaglandina

RANTES Citocina regulada sob ativação, expressa e secretada por células

T normais

REPA Reparixina

SAL Salina

TNF Fator de necrose tumoral

________________________________________________________________________________Introdução 16

1. Introdução

1.1. Termorregulação e Febre

A resposta de fase aguda é uma resposta altamente complexa a uma

variedade de agressões, tais como, infecções de origem bacteriana, virais ou

parasitárias, traumas, necrose isquêmica ou tumores. Em mamíferos, essa

resposta é um processo dinâmico que visa restabelecer a homeostasia do

organismo e envolve os sistemas imune, cardiovascular e sistema nervoso

central. A resposta de fase aguda é caracterizada por alterações na

permeabilidade vascular, leucocitose ou leucopenia, alteração na síntese de

muitos hormônios, diminuição dos níveis plasmáticos de ferro e zinco, ativação

dos sistemas de coagulação e complemento, formação de cininas e outros

mediadores inflamatórios, assim como alterações nas concentrações das

proteínas de fase aguda (Zeisberger, 1999). Uma das características

fundamentais da resposta de fase aguda é o desenvolvimento de febre, que é

um sinal cardinal da resposta do hospedeiro a um estímulo patogênico. Assim,

a febre, um dos primeiros componentes da resposta de fase aguda a ser

reconhecido, é definida como uma elevação controlada da temperatura interna

de um organismo para níveis acima dos normais em decorrência da elevação

do ponto de termorregulagem hipotalâmico (Dinarello et al., 1988).

Dessa forma, o controle da temperatura corporal é extremamente

importante para a sobrevivência de todos os organismos, uma vez que a

temperatura influencia diretamente a energia cinética das moléculas e,

consequentemente, todas as reações químicas conhecidas (Deeb & Alvares-

Cohen, 1999). Sendo assim, os fenômenos fisiológicos e bioquímicos que

dependem de reações químicas e das interações moleculares são diretamente

________________________________________________________________________________Introdução 17

influenciados pela temperatura. Mais especificamente, tem-se observado que a

temperatura influencia, dentre outros processos, reações enzimáticas (Dejours,

1991), contratilidade muscular (Wasserstrom & Vites, 1999), interação

hormônio-receptor (Hinkle et al.,1980), atividade neuronal (Aihara et al., 2001)

e função imunológica (Wenisch et al., 1996).

Surpreendentemente, muitas das funções específicas da febre e sua

influência no estado enfermo e na resolução da doença não estão totalmente

esclarecidas, pois, sendo uma resposta fisiopatológica estereotipada ela ocorre

em decorrência de infecções ou estímulos relacionados, como endotoxinas

bacterianas, inflamação e lesão e é desencadeada pela liberação local ou

sistêmica de citocinas pró-inflamatórias e pirogênicas, como fator de necrose

tumoral (TNF-) α, interleucina (IL)-1  e β e IL-6 (Appenheimer et al., 2005).

Neste contexto, Atkins (1960) sugeriu que as substâncias produzidas por

fungos, bactérias e vírus constituem os pirogênios exógenos, incapazes de

ativarem diretamente os centros cerebrais responsáveis pela febre, porém,

capazes de estimularem a produção de pirogênios endógenos (PE) pelas

células fagocíticas, sendo esses os responsáveis pela alteração do termostato

(set-point) hipotalâmico. Durante o desenvolvimento da resposta febril há o

envolvimento, de forma coordenada, de uma ampla variedade de respostas

autonômicas, neuroendócrinas e comportamentais, fazendo com que a sua

manifestação seja, de modo geral, estereotipada e independente do agente

causal (Saper & Breder, 1994).

A área responsável pelo controle da regulação da temperatura corporal

está localizada no hipotálamo, que apresenta neurônios termossensíveis cuja

frequência de disparo é afetada tanto por variações na temperatura sanguínea

________________________________________________________________________________Introdução 18

da área adjacente, como por influência de conexões diretas com

termorreceptores distribuídos na pele e nos músculos (Dinarello et al., 1988). A

área pré-óptica do hipotálamo anterior (AH/POA) exerce um papel central na

regulação da temperatura corporal integrando informações de aferentes

periféricos, assim como, informando sua própria temperatura e ativando

mecanismos que promoverão a perda ou produção/retenção de calor. Dessa

forma, a AH/POA funciona como um termostato desencadeando mecanismos

para o ajuste da temperatura corporal quando estes se fazem necessários,

controlando todas as respostas termoregulatórias em torno de um ponto de

regulagem relativamente constante (Boulant, 2006).

Os efeitos benéficos da febre foram confirmados por vários estudos,

entre eles o de Vaughn e colaboradores (1980) os quais demonstraram que a

febre aumentou a sobrevida de animais infectados com bactérias P. multocida.

Ainda, o aumento da temperatura corporal em níveis semelhantes àqueles

observados durante a resposta febril promove aumento da fagocitose, da

migração de neutrófilos, proliferação de células T, produção de radicais de O

aumento da síntese de interferon, aumento das atividades anti-tumorais e anti-

virais e diminuição do crescimento de bactérias dependentes de ferro (Blatteis,

1998).

Muitos estudos têm demonstrado que o aumento da temperatura

potencializa a síntese/liberação de mediadores celulares da resposta imune

inata. Altas temperaturas aumentam a migração, mobilidade e quimiotaxia de

neutrófilos, resultando no aumento de infiltrado de granulócitos nas áreas

inflamadas (Hasday et al., 2003; Nahas et al., 1971). Uma série de estudos

demonstrou que temperaturas febris regulam a migração de células dendríticas

in vivo (Ostberg et al., 2000). Dessa forma, a exposição de camundongos a

________________________________________________________________________________Introdução 19

temperaturas altas resulta na mobilização de células de Langerhans (células

dendríticas da pele) para dentro dos linfonodos, onde são capazes de funcionar

como ativadoras de células T antígeno-específicas (Ostberg et al., 2001).

Além disso, foi demonstrado que temperaturas elevadas aumentam a

imunidade adaptativa e que as atividades de células T, incluindo citotoxicidade

e resposta proliferativa a mitógenos ou citocinas (IL-1 e IL-2), também estão

elevadas em temperaturas altas (Di et al., 1997; Lederman et al., 1987). Além

disso, a elevação da temperatura corporal estimula a função de células T

helper, resultando em aumento da síntese de anticorpos por células B murina

(Jampel et al., 1983). A exposição de linfócitos a estresse térmico altera a

organização intracelular, expressão ou estado de ativação de proteínas

citoesqueléticas, proteínas de fase aguda (família hsp70, heat shock protein) e

moléculas sinalizadoras de transdução (proteína quinase C, ERK1/2) (Chen et

al., 2004; Hasday e Singh, 2000); eventos que podem casualmente estar

ligados a ativação, mobilidade e adesão de linfócitos.

Embora existam estudos que demonstrem o papel benéfico da febre, há

também evidências que sugerem o contrário. Altas temperaturas ocasionam

efeitos complexos na produção e bioatividade de citocinas. Na ausência de

qualquer estímulo patogênico ou inflamatório, não foi observado aumento na

produção de citocinas ou quimiocinas (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12,IL-13, TNF-

α, IFN-α, IFN-γ, RANTES, MCP-1) em leucócitos ou células endoteliais

expostas a estresse térmico in vitro (Chen et al., 2004; Hasday et al., 2001;

Shah et al., 2002). Entretanto, a associação de um estimulo inflamatório, como

o LPS, com o estresse térmico febril induziu aumento nos níveis de citocinas

pró-inflamatórias in vitro e in vivo (IL-6, TNF-α, IL-1β) (Fairchild et al., 2000;

Ostberg et al., 2000).

________________________________________________________________________________Introdução 20

Sobre algumas circunstâncias, a febre pode limitar alguns efeitos da

defesa imune. Foi demonstrado que temperaturas alcançadas em uma

resposta febril atenuam respostas de citocinas através da inibição da

expressão de RNAm de TNF-α (Ensor et al., 1995; Hasday et al., 2000). Além

disso, mesmo moderadas elevações de temperatura suprimem a função de

células NK (natural killer) in vitro (Azocar et al., 1982; Roberts, 1991) enquanto

temperaturas mais elevadas inibem respostas de linfócitos T citotóxicos (Harris

e Meneses, 1978).

Desde os primórdios, a febre é conhecida como sinal de irregularidade

no organismo. Com isso, vários tipos de tratamento foram surgindo ao longo do

tempo. Entre esses tratamentos destacamos as drogas antipiréticas como a

aspirina, que vem sendo usada desde o século XIX. Porém, os mecanismos

pelos quais estas drogas aliviam a febre vêm sendo estudados e conhecidos

apenas nas últimas décadas. Infelizmente, ao passo que as ações antipiréticas

dessas drogas vêm sendo estudadas, suas eficiências clínicas ainda não estão

esclarecidas. Seu uso não é indicado para qualquer condição febril, pois em

algumas destas pode ocorrer desconforto ao paciente, interferência no

tratamento com antibióticos e ainda pré-disposição a efeitos adversos a outros

medicamentos (Aronoff et al., 2001).

Desse modo fica evidente a importância de estudos que buscam

conhecer mais sobre esse complexo evento chamado febre, bem como seus

componentes e tratamentos.

________________________________________________________________________________Introdução 21

1.2. Quimiocinas

Quimiocinas são proteínas relativamente pequenas (8-10 kDa) que

direcionam o recrutamento de leucócitos da corrente sanguínea para os tecidos

(Baggiolini et al., 1998). Algumas das quimiocinas também têm demonstrado

atividade pirogênica, entre elas podemos citar a proteína inflamatória derivada

de macrófagos-1 (MIP-1; Davatelis et al., 1989; Miñano et al., 1990) α, a

interleucina-8 (IL-8; Rothwell et al., 1990; Zampronio et al., 1994; 1995), a

citocina regulada sob ativação, expressa e secretada por células T normais,

RANTES (Tavares e Miñano, 2000 ; Machado et al., 2007) e a citocina

quimioatraente para neutrófilos, CINC-1 (Soares et al., 2008). Essas

quimiocinas são produzidas por genes distintos, presentes nos cromossomos

humanos 4 e 17, e apresentam de 20 a 70% de homologia na sequência de

aminoácidos.

Quatro diferentes subfamílias de quimiocinas e receptores de

quimiocinas foram identificados: CC, CXC, CX3C e C (Murphy et al., 2000;

Pease and Williams, 2006). As quimiocinas apresentam quatro resíduos de

cisteína conservados formando duas pontes dissulfeto essenciais, podendo ser

divididas em quatro tipos distintos; aquelas que possuem um curto domínio

amino-terminal antecedendo a primeira cisteína, formando o grupo denominado

CC ou -quimiocinas; as separadas por um aminoácido, denominado de CXC

ou -quimiocinas ou separadas por três aminoácidos, formando as CX3C

quimiocinas. Além disso, também já foi descrita uma proteína que possui

apenas dois resíduos de cisteína em sua estrutura, denominada de C

quimiocina (Rajarathman, 1995).

________________________________________________________________________________Introdução 22

As quimiocinas do grupo CXC ligam-se aos receptores da classe CXCR

(CXCR1 a CXCR5) e as quimiocinas CC ligam-se a receptores da classe CCR

(CCR1 a CCR11) (Murphy et al., 1996). No grupo CX3C, somente um tipo de

receptor foi identificado em humanos, o CX3CR1.

As duas maiores subfamílias de quimiocinas são do grupo das CXC e

CC, elas diferem quanto à atividade biológica em estimular diferentes tipos de

células efetoras. Enquanto as quimiocinas da classe CXC, como é o caso da

IL-8 (CXCL8), do peptídeo ativador de neutrófilos (NAP)-2, do oncogene

regulador de crescimento (GRO) -, -, -, do peptídeo ativador de neutrófilos

derivado de células epiteliais (ENA)-78, ativam predominantemente células

polimorfonucleares como os neutrófilos (Ahuja et al, 1996), as quimiocinas da

classe CC como a eotaxina, a RANTES e a proteína quimiotática para

monócitos (MCP)-4 ativam eosinófilos, basófilos e linfócitos T (Kapp et al., 1994;

Jose et al., 1994; Elsner et al, 1996; Petering et al, 1998).

Outro fato importante já observado no grupo das quimiocinas CXC é a

presença de uma sequência de aminoácidos formada pelo ácido glutâmico (Glu

ou E) -leucina (Leu ou L) -arginina (Arg ou R), conhecido como domínio ELR.

Esta sequência localiza-se próxima ao N-terminal, precedendo a sequência

CXC e, parece determinar uma atividade específica sobre neutrófilos, enquanto

que as quimiocinas que não apresentam essa sequência em sua estrutura

seriam mais seletivas para linfócitos.

As quimiocinas pertencentes à classe C e CX3C não são seletivas e

podem ser quimioatraentes para monócitos, células T e células NK.

________________________________________________________________________________Introdução 23

Para exercer suas funções as quimiocionas ligam-se aos seus

receptores, presentes na superfície da célula alvo. Os receptores para

quimiocinas pertencem à superfamília da rodopsina, proteínas que se ligam à

proteína G (Baggiolini et al., 1994; Clark-Lewis, 1995). Estes receptores

possuem sete domínios transmembrana ricos em aminoácidos hidrofóbicos,

conservados na maioria dos receptores desta classe, entretanto, não existe

aminoácido específico ou um padrão comum entre os receptores de

quimiocinas. A ligação da quimiocina ao seu receptor dissocia a subunidade G

αI

a mais comum G

associada a esses receptores, e a subunidade G

βγ

proteína heterotrimérica G, levando a um fluxo de cálcio e ativação da fosfatidil

inositol 3-quinase (PI3K) e de vias de sinalização Rho GTPases, entre outras

(Mellado et al., 2001). Pela associação a G

, grande parte das respostas das

quimiocinas são inibidas por tratamento com a toxina pertussis (PTx) (Goldman

et al., 1985). No entanto, em algumas circunstâncias, PTx pode não bloquear

completamente as respostas induzidas pelas quimiocinas devido a sua

associação com outras proteínas G, que não somente a G

, tais como G

q/11

(Mellado et al., 2001). Dessa forma, dependendo do seu acoplamento com

distintas proteínas G, os receptores de quimiocinas podem iniciar distintas vias

de sinalização e exercer diversas funções biológicas.

Os receptores de quimiocinas são definidos por sinalizar ligações em um

ou mais membros da extensa família de quimiocinas (Premack and Schall,

1996; Baggiolini et al., 1997). A principal função biológica compartilhada entre

tais receptores é o deslocamento de leucócitos e processos dependentes como

inspeção do sistema imune, respostas imune inata e adaptativa e várias formas

de patologias inflamatórias (Springer, 1994; Foxman et al., 1997). Dentro dessa

________________________________________________________________________________Introdução 24

área geral, no entanto, cada receptor parece possuir papel específico,

determinado pela sua expressão padrão em diferentes subtipos de leucócitos e

por uma especificidade temporal e espacial da expressão de seu ligante

cognato. Papéis exclusivos também foram delimitados na hematopoiese

(Broxmeyer et al., 1996, 1999; Reid et al., 1999), angiogênese (Salcedo et al.,

1999), desenvolvimento (Forster et al., 1996; Nagasawa et al., 1996) e

facilitação de certas doenças infecciosas. Embora cada receptor possua maior

afinidade para determinada quimiocina, essa característica pode sobrepor-se

consideravelmente, pois estes receptores podem estabelecer ligações com

mais de uma quimiocina e, esta pode acoplar-se a mais de um tipo de receptor,

indicando que há redundância e versatilidade no sistema das quimiocinas.

Essa redundância de ligação também se reflete em uma redundância de

função.

Além de recrutarem leucócitos para tecidos inflamados após serem

ativadas por um processo inflamatório ou infeccioso, as quimiocinas

constitutivamente produzidas estão envolvidas na manutenção do tráfico

leucocitário, bem como, na arquitetura de órgãos linfóides secundários. No

entanto, essa é uma tênue distinção, pois algumas quimiocinas podem estar

em ambas as categorias dependendo do contexto biológico (Viola & Luster,

2008).

O CXCR1 e CXCR2 foram os primeiros receptores a serem definidos.

Eles são os únicos receptores conhecidos para as quimiocinas ELR1+CXC,

incluindo IL-8, que se liga a ambos receptores com alta e similar afinidade.

Também são os receptores mais expressos em neutrófilos e são os receptores

protótipo para quimiocinas inflamatórias. Eles possuem 78% de similaridade na

________________________________________________________________________________Introdução 25

sequência de aminoácidos (Murphy et al., 1996). Os genes de ambos os

receptores são expressos em tecidos e células responsáveis pela síntese de

quimiocinas. A expressão do CXCR2 foi detectada em pulmão, fígado e

neutrófilos, enquanto a expressão do CXCR1 também é evidente em pulmões

assim como em macrófagos e ausente em neutrófilos em repouso ou ativados

(Dunstan et al., 1996). Os receptores CXCR1 e CXCR2 foram descritos em

humanos, camundongos e ratos (Dunstan et al., 1996; Nasser et al., 2007;

Barsante et al., 2008). Ainda, tais receptores são encontrados em

monócitos/macrófagos, eosinófilos, basófilos, linfócitos T, mastócitos, células

endoteliais (Sun et al., 2009), células dendríticas (Morohashi et al., 1995),

projeções dos neurônios e medula espinhal (Horuk et al., 1997).

Dentre esses receptores, o CXCR1 parece ter um papel dominante,

como sugerido por experimentos mostrando que anticorpos para CXCR1

inibem grande parte da resposta quimiotática da IL-8, enquanto anti-CXCR2

possui menor efeito em neutrófilos humanos (Hammond et al., 1995). Por outro

lado, a inibição de CXCR2 em camundongos e ratos, com anticorpos ou genes

nocautes diminui diversas respostas inflamatórias, sugerindo que há

contribuição para a ação de quimiocinas semelhantes à IL-8 (KC, GRO, MIP-2)

(Garau et al., 2006). Em ratos, estudos indicam o receptor CXCR2 seja o

receptor comum para as três formas da CINC (-1, -2 e -3) e através dele as

isoformas de quimiocina exercem diferentes atividades biológicas (Shibata et

al., 2002).

A quimiocina IL-8 ativa os receptores CXCR1 e CXCR2. O receptor

CXCR1 é específico para CXCL8, enquanto CXCR2 também interage com

CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 e CXCL7 (Baggiolini, 2000). Diante

________________________________________________________________________________Introdução 26

de ativação, CXCR1 (mas não CXCR2) ativa a fosfolipase D e medeia a

produção de espécies reativas do oxigênio, sugerindo que esses receptores

possuem diferentes papéis patofisiológicos (Jones et al., 1996). Mais de 95%

de CXCR2 internaliza nos primeiros 2 – 5 minutos de ativação comparado com

10% de CXCR1 (7-10 minutos). Além disso, o CXCR2 recupera-se mais

lentamente (~35% depois de 90 minutos) na superfície da célula do que o

CXCR1 (~100% depois de 90 minutos) após remoção de CXCL8 (Barlic et al.,

1999; Feniger- Barish et al., 1999). Essa diferença na modulação da expressão

dos receptores parece ser um importante fator de distinção na habilidade dos

mesmos em mediar a ativação e a regulação em resposta ao CXCL8

(Richardson et al., 1995; 2003).

Em 1995, Lloyd e colaboradores demonstraram que o LPS induz a

diminuição da expressão dos receptores para IL-8, uma rápida degradação dos

seus RNAm além de inibir a transcrição dos mesmos em neutrófilos. Anos

mais tarde (1998), foi demonstrado que a menor expressão dos receptores

causada pelo LPS ocorre por um mecanismo independente e distinto daquele

mediado pelo seu agonista (IL-8). A diminuição da expressão de CXCR1 e

CXCR2, devido a internalização do complexo ligante-receptor (Samanta et al.,

1990), estava correlacionada com um estado de hiporresponsividade a IL-8.

Tais dados sugerem que a regulação desses receptores é um importante

mecanismo para o controle da ativação de neutrófilos pelas quimiocinas. Esse

mecanismo acontece de maneira não uniforme nessas células, independente

de TNF-α, IL-1β e IL-8, mas dependente de tirosina quinase (Khandaker et al.,

1998).

________________________________________________________________________________Introdução 27

O bloqueio de receptores de quimiocinas pode representar uma

interessante possibilidade no desenvolvimento de novas drogas para o

tratamento de doenças inflamatórias (Pease & Williams, 2006; Wells et al.,

2006). O recrutamento de leucócitos para sítios de inflamação e infecção é um

componente essencial na resposta do hospedeiro à doença. Quimiocinas e

seus receptores são parte integral desse processo e estão envolvidos na

patofisiologia de vários processos inflamatórios e infecciosos. (Gerard & Rollins,

2001; Charo & Ransohoff, 2006; Luster 1998). Apesar das quimiocinas serem

importantes para o controle da infecção, também podem ser prejudiciais em

certas doenças inflamatórias, tais como asma, aterosclerose, artrite reumatóide

e esclerose múltipla, nas quais células inflamatórias são recrutadas para o

tecido levando a um infiltrado inflamatório que resulta em lesão tecidual. O eixo

quimiocina-receptor participa na pato-fisiologia dessas doenças por ocasionar

acúmulo e ativação de leucócitos para os tecidos afetados. Em tais desordens,

tem sido sugerido que as quimiocinas e seus receptores poderiam ser alvos

terapêuticos para o controle da inflamação (Viola & Luster, 2008).

1.3. CINC-1

A CINC (citocina quimioatraente para neutrófilos) - 1 é um peptídeo pró-

inflamatório de 8 kDa e membro da família CXC das quimiocinas, com potente

atividade quimioatrativa para neutrófilos (Watanabe et al., 1989; 1991; 1992;

Harada et al., 1993; Larsen et al., 1989), capaz de ligar-se aos receptores

CXCR1 e CXCR2. O influxo de neutrófilos para o foco inflamatório é

predominantemente regulado por essas citocinas quimioatraentes, tais como

IL-8 e GRO-α em humanos, ou CINC-1 e MIP-2 em ratos, através da ativação

________________________________________________________________________________Introdução 28

do receptor CXCR2 (White et al., 1998). O bloqueio dos receptores CXCR1 e

CXCR2 em camundongos reduz a adesão e migração de neutrófilos (Morgan et

al., 1997; Coelho et al., 2008; Bento et al., 2008) induzido por LPS (Cacalano et

al., 1994). Os neutrófilos são as primeiras células de defesa a chegar num foco

infeccioso e são essenciais para a eliminação de bactérias patogênicas por

possuírem grande conteúdo de enzimas proteolíticas e rápida produção de

espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (Seely et al., 2003). Foi visto que

ELR+CXC quimiocinas são capazes de atrair neutrófilos e estender a meia-vida

dessas células, dessa maneira, prolongando a sua funcionalidade em diversas

patologias (Dunican et al., 2000).

A produção de CINC-1 não é constitutiva, mas pode ser induzida por

diversos estímulos inflamatórios, tais como IL-1β, LPS, TNF-α (Watanabe et al.,

1989; Watanabe & Nakagawa, 1987; Nakagawa et al., 1993). Os mecanismos

intracelulares regulatórios que desencadeiam o aumento na expressão da

CINC-1 ainda não estão totalmente esclarecidos. Entretanto, tem sido

demonstrado que a CINC-1 é expressa no sistema nervoso central de roedores

após estresse (Sakamoto et al., 1996a), infarto (Yamagami et al., 1999) ou

injeção periférica de endotoxina (Sakamoto et al., 1996b); bem como em

astrócitos, micróglia e neurônios (De Haas et al., 2007). Além de células não

parenquimais, como as células de Kupffer, as células parenquimais do fígado

(hepatócitos) também produzem CINC-1 em processos inflamatórios hepáticos

(Maher, 1995; Copple et al., 2003; Kaibori et al., 2004; Handa et al., 2004).

Estudos de Sheikh (2006) sugerem que a CINC-1 é produzida no fígado como

uma proteína de fase aguda muito antes de outras proteínas de fase aguda,

tais como α1-glicoproteína ácida, inibidor de proteinase α1, α2-macroglobulina

e heme- oxigenase-1 (Tron et al., 2005).

________________________________________________________________________________Introdução 29

CINC-1 é, em ratos, a molécula homóloga do oncogene regulador do

crescimento (GRO) da família da IL-8 (Simpson et al., 2003; Handa et al., 2004;

Takaishi et al., 2000). CINC-1 não apresenta nenhuma similaridade em sua

sequência com a IL-8 humana, mas a sua função é muito parecida com esta

interleucina (Simpson et al., 2003). Consequentemente, CINC-1 é considerada

como a equivalente da IL-8 em ratos (Harada et al., 1994).

A IL-8 é expressa por monócitos, macrófagos e também astrócitos e sua

expressão é induzida por múltiplos estímulos, como LPS, bactérias vivas e

outras citocinas pró-inflamatórias, como TNF e IL-1 no nível transcripcional, em

uma variedade de células (Matsushima et al., 1992; Mukaida et al., 1992;

Haskill et al., 1990). A quimiocina é responsável por aumentar a sobrevida de

neurônios da região do hipocampo in vitro (Horuk et al., 1997) e parece possuir

um papel neuromodulatório na atividade sináptica cerebelar (Giovanelli et al.,

1998). Existem muitas linhas de evidência que atribuem participação da IL-8

em muitos tipos de inflamação, tais como sinovite (Endo et al., 1991), dermatite

aguda induzida por LPS (Harada et al., 1993) e lesão de reperfusão em pulmão

isquêmico (Sekido et al., 1993).

Paralelamente, alguns estudos demonstraram que a CINC-1 contribui

para a infiltração de neutrófilos em resposta ao LPS em ratos, por exemplo, nos

pulmões (Haddad et al., 2002), úvea (Cui et al., 2007) e fígado (Pennington et

al., 1998). Esses achados sugerem um papel patofisiológico da CINC-1 e da IL-

8 em reações inflamatórias. Assim, a regulação desta quimiocina e/ou a

produção de IL-8 está criticamente envolvida no controle de respostas

inflamatórias associadas à infiltração de neutrófilos.

________________________________________________________________________________Introdução 30

Um dos potenciais candidatos envolvidos no controle da transcrição da

CINC-1 é o NF-κB. Existem inúmeros estudos demonstrando a importância

desse fator de transcrição para a expressão de CINC-1 por diversas células,

como células epiteliais gástricas (Hiraoka et al., 2001), renais (Watanabe et al.,

1989), intestinais (Yoshida et al., 2001), miócitos cardíacos (Seino et al., 1995),

células de lavado pulmonar (Blackwell et al., 1994) entre outras. Foi

demonstrado que o promoter da CINC-1 contém um domínio ligante NF-κB,

reforçando ainda mais o papel do NF-κB na regulação da transcrição da CINC-

1 (Shibata et al., 1998). Em geral, o NF-κB existe no citoplasma

predominantemente como um heterodímero formado pelas subunidades p50 e

p65. A sua entrada no núcleo é impedida em virtude da sua associação com

proteínas inibitórias, IκB. Várias citocinas (por exemplo, TNF-α e IL-1β) ativam

NF-κB pela indução da fosforilação, ubiquitinação e subsequente degradação

de IκB pela via do proteassoma. A perda de IκB permite que os dímeros do NF-

κB transloquem-se para o núcleo e iniciem a transcrição dos genes alvo

(Cepinskas et al., 2003).

Estudos de Handa e colaboradores (2004) indicam que a porção p65 é

translocada para o núcleo de uma linhagem de células da mucosa gástrica

devido a estimulação com TNF-α e que a ativação de NF-κB resulta na

produção de CINC-1 por essas células. Corroborando esses resultados,

existem outros estudos que confirmam que o sítio de ligação do NF-κB na

região promotora da IL-8 e do GRO é indispensável para a expressão gênica

em resposta a estimulação por citocinas (Anisowicz et al., 1991; Mukaida et al.,

1990).

________________________________________________________________________________Introdução 31

A participação de quimiocinas na resposta febril foi evidenciada pela

capacidade da IL-8 (Rothwell et al., 1990; Zampronio et al., 1994; Zampronio et

al.,1995) e da MIP-1 (Davatelis et al .,1989; Miñano et al., 1990) de induzirem

resposta febril em coelhos e ratos. Estudos de nosso e de outros laboratórios

também demonstraram a capacidade da RANTES (Tavares e Miñano et al.,

2000; Machado et al.,2007 ), do MIP-1 (Soares et al., 2006) e do MIP-1

(Miñano et al., 1996) de induzir febre em ratos. Ainda, demonstramos que a

injeção central de CINC-1 em ratos atua diretamente em neurônios termo-

sensíveis da AH/POA promovendo resposta febril acompanhada por aumento

significativo da concentração de PGE

no CSF dos animais. Foi demonstrado

também que o anticorpo neutralizante específico anti-CINC-1 e inibidores

seletivos e não-seletivos para COX-2 aboliram a febre induzida pela CINC-1.

Inibidores não seletivos de COX-2 também abolem o aumento da concentração

de PGE

no CSF, sugerindo o envolvimento de prostaglandinas na atividade

pirogênica da CINC-1 (Melo-Soares et al., 2008).

1.4. Drogas antipiréticas

É importante enfatizar que, embora a febre seja considerada uma

resposta adaptativa do hospedeiro às agressões, principalmente infecções,

nem toda febre necessariamente é benéfica, o que tem levado vários

investigadores a aceitar com uma certa reserva esta teoria (revisado por Moltz,

1993).

A febre aumenta a atividade dos componentes dos sistemas de defesa

imune (celular e humoral) ou não-imune e, em doenças auto-imunes

controladas ou inativas como o lupus e artrite reumatóide ocorrem

________________________________________________________________________________Introdução 32

reincidências da doença (revisado por Blatteis, 2006). Além disso, o aumento

da temperatura corporal também provoca sensações de mal-estar e

desconforto, podendo ainda ser potencialmente perigoso em situações de

desidratação, caquexia, lesões cerebrais e/ou doenças cardiorrespiratórias,

gravidez e nos aumentos acima dos níveis tolerados, pode ser incompatível

com a manutenção da vida.

Assim, muitas vezes a terapia antipirética se faz necessária, e o efeito

benéfico desta terapia não somente se dá pelo fato de reduzir a temperatura

corporal, mas também por diminuir a dor e o mal-estar marcantes nas doenças

infecciosas e inflamatórias que, como na resposta febril, estão relacionados

aos altos níveis de citocinas e prostaglandinas locais e circulantes,

respectivamente.

Desse modo, torna-se importante investigar se a resposta febril induzida

pela CINC-1 é modificada pela ação de drogas antipiréticas, como

indometacina, ibuprofeno e celecoxibe.

O ibuprofeno, derivado do ácido aril-propiônico, possui atividade

antiinflamatória, sendo usado clinicamente em diversos países (Chowdhbury et

al., 1996). Sua eficácia tem sido atribuída à inibição não seletiva de ambas as

ciclooxigenases (Kantor, 1979). Entretanto, esta droga também apresenta

atividades independentes da inibição da síntese de PGs. Stuhlmeier e

colaboradores (1999) demonstraram in vitro que o ibuprofeno inibe a

translocação do fator de transcrição NF-κB para o núcleo, estabilizando-o sob a

forma do complexo NF-κB/IκB no citoplasma, inibindo assim, dose-

dependentemente a síntese de TNF e IL-1. Stratman e colaboradores (1997),

por sua vez, mostraram redução do RNAm da forma induzida da sintase de NO

(iNOS), apresentando um novo mecanismo de ação terapêutica para esta

droga.

________________________________________________________________________________Introdução 33

Estudos de Hofbauer e colaboradores (1998) mostraram uma

significante redução na expressão de moléculas de adesão na superfície de

células endoteliais de animais tratados com ibuprofeno, com consequente

redução da migração leucocitária.

Estudos de nosso laboratório demonstraram que o ibuprofeno (10 mg/kg)

bloqueou, enquanto a indometacina (2 mg/kg) apenas reduziu as respostas

febris produzidas pela injeção sistêmica de LPS ou central de IL-1β, IL-6 ou

TNF-α e ácido araquidônico. Além disso, o ibuprofeno (10 mg/kg), assim como

a indometacina (2 e 8 mg/kg), foi capaz de bloquear a síntese de

prostaglandina E

no CSF sem alterar os níveis plasmáticos de IL-1, TNF- e

IL-6 após a injeção i.v. de LPS em ratos. Neste mesmo estudo demonstrou-se

também que, durante a resposta febril induzida pelo LPS, a antipirese induzida

por 10 mg/kg de ibuprofeno ou 8 mg/kg de indometacina foi bloqueada pela

injeção na área septal-ventral do antagonista do receptor V

da arginina-

vasopressina (AVP) (Soares e colaboradores em análise).

A indometacina é um derivado metilado do ácido indolacético e

apresenta propriedades antiinflamatórias, analgésicas e antipiréticas similares

àquelas dos salicilatos. Esta droga antipirética, antiálgica e antiinflamatória é

rapidamente absorvida pelo trato gastrointestinal após administração oral e, em

ratos, atinge o pico de concentração plasmática 2 horas após a ingestão. Seu

tempo de meia-vida atinge cerca de 3 horas em média (Palakurthi et al., 2005).

Entretanto, tem sido usada largamente como ferramenta farmacológica em

laboratórios para a investigação da participação de prostanóides em diferentes

sistemas biológicos e como droga antipirética em certas condições patológicas

nas quais a febre se mostra resistente ao controle por outras drogas. Tem sido

________________________________________________________________________________Introdução 34

demonstrado que a antipirese induzida pela indometacina é inibida pelo

antagonista de receptores V1 da AVP (Wilkinson & Kasting, 1989; Souza et al.,

2002), o que evidencia a existência de um mecanismo de ação adicional

àquele da inibição da produção de prostaglandina para esta droga.

O celecoxibe (Seibert & Masferrer, 1994; Chan et al., 1995) é um

analgésico e antiinflamatório efetivo em humanos. É tido como inibidor seletivo

para COX-2. Desse modo, além de causar menos efeitos colaterais, o

celecoxibe é um eficiente antipirético, em relação àquelas drogas (diclofenaco

e ibuprofeno) não seletivas das ciclooxigenases, COX-1 e COX-2, já que esta

última é a principal responsável pela síntese de prostagladinas durante a febre

(Cao et al., 1997).

O celecoxibe e rofecoxibe, ambos inibidores seletivos para COX-2

promoveram redução na resposta febril em macacos e humanos comparável à

induzida por inibidores não seletivos como o diclofenaco e ibuprofeno

(Schwarts et al., 1999).

O celecoxibe aboliu as respostas febris induzidas pelos pirogênios

endógenos MIP-1α, endotelina-1 e pelo fator pirogênico pré-formado em

macrófagos, PFPF que independem de prostaglandinas para promover febre

(Souza et al., 2002; Fabrício et al., 2005; Veiga-Souza et al., 2004) sugerindo

que o celecoxibe exerça atividade antipirética através de mecanismos

adicionais à inibição da COX-2 o que parece ser verdade, pois a indometacina

e a dexametasona não reduzem a febre induzida pelo MIP-1 (Souza et al.,

2002).

________________________________________________________________________________Introdução 35

1.5. Reparixina

Reparixina, inicialmente denominada de repertaxina, é um inibidor

alostérico não competitivo dos receptores para CXCL8 (IL-8), ou seja, para

CXCR1 e CXCR2 (Bertini et al., 2004), que funciona bloqueando esses

receptores numa conformação inativa prevenindo a cascata de transdução de

sinal e a quimiotaxia leucocitária. A reparixina explora um novo conceito de

inibição farmacológica de receptores acoplados a proteína G (GPCR),

denominados inibidores alostéricos não competitivos da ativação de receptores.

Bertini e colaboradores (2004) demonstraram que a reparixina não afeta a

ligação da IL-8 às células PMN humanas, mas sim inibe a mobilização de Ca

e a ativação da tirosina quinase induzida pela quimiocina, sugerindo então que

a droga afeta a transdução de sinal mais do que a própria ligação quimiocina-

receptor.

Como já dito anteriormente, os receptores CXCR1/2 pertencem à família

dos GPCR. Múltiplas vias de transdução de sinal intracelular são ativadas por

esses receptores. A ativação da proteína G é responsável pela indução de

segundos mensageiros, como a fosfolipase Cb e a ativação de PI3k (Hirsh et

al., 2000; Naccache et al., 2000). A habilidade da reparixina de inibir múltiplas

respostas biológicas induzidas pela IL-8 está em concordância com o

mecanismo de ação dessa molécula. De fato, foi demonstrado que a reparixina

age como um inibidor alostérico não competitivo de CXCR1/2, prevenindo a

ativação da proteína G induzida pela IL-8, mas não pelo fMLP (Bertini et al.,

2004).

O efeito inibitório da reparixina na ativação e função leucocitária é

específico. Assim, o antagonista bloqueia as atividades induzidas pelo CXCL8

________________________________________________________________________________Introdução 36

e CXCL6, duas quimiocinas que agem através da ativação de CXCR1/2. Por

outro lado, a ativação de proteína G, e, portanto, a quimiotaxia de células T e a

adesão de células PMN induzidas por outro estímulo, como C5a, fMLP e

CXCL12 não foram afetadas pela reparixina. Além de fatores quimiotáticos, a

reparixina não afeta a ativação de receptores induzida por outros agonistas de

GPCRs, tais como aminas biogênicas (Tagat et al., 2001; Mirzadegan et al.,

2000).

Entre os dois receptores, a reparixina parece possui maior eficácia em

inibir CXCR1 do que CXCR2 (Bertini et al., 2004; Casilli et al., 2005). Estudos

de Casilli e colaboradores (2005) mostraram que a adesão de células PMN, a

liberação do conteúdo granular e a produção de citocinas proinflamatórias,

assim como a migração de linfócitos T e células NK induzidas pela IL-8, são

eventos eficazmente inibidos pela reparixina. Essa droga é ativa em modelos

animais de lesão de reperfusão e isquemia (I/R) hepática (Cugini et al., 2005),

I/R intestinal (Souza et al., 2004), I/R cerebral (Garau et al., 2005), lesão

pulmonar aguda (Zarbock et al., 2008), artrite induzida por antígeno (AIA)

(Coelho et al., 2008), lesão na medula espinhal (Gorio et al., 2007) e tem sido

considerada droga exclusiva para a prevenção de rejeição tardia do enxerto em

transplante de órgãos.

Dessa forma, percebe-se que o antagonista reparixina mostra-se

bastante eficaz em alterar os sistemas biológicos em diversas doenças,

evidenciando-se a importância do papel dos receptores CXCR1/CXCR2 e seus

ligantes nos diferentes processos patológicos, entre eles a febre.

________________________________________________________________________Objetivos 38

2. Objetivos

2.1. Objetivo Geral

 Investigar o envolvimento dos receptores CXCR1/CXCR2 na resposta

febril induzida pelo LPS e seu envolvimento na cascata de mediadores

pirogênicos que regem esta resposta, bem como o efeito pirogênico

induzido pela CINC-1.

2.2. Objetivos Específicos

 Através do tratamento dos animais com a reparixina, avaliar a

participação dos receptores CXCR1/CXCR2 na resposta febril induzida

pelo LPS;

 Determinar a concentração do agonista dos receptores CXCR1/CXCR2,

CINC-1 em diferentes órgãos/fluidos (CSF, hipotálamo, fígado e plasma)

dos animais após a injeção intravenosa de LPS;

 Verificar se a administração de CINC-1 é capaz de induzir resposta febril

em ratos;

 Investigar se a resposta febril induzida pela CINC-1 é modificada por

drogas que inibem a síntese de prostaglandinas como a indometacina, o

ibuprofeno e o celecoxibe;

 Determinar em animais tratados ou não com indometacina, ibuprofeno

ou celecoxibe a concentração de PGE

no fluido cerebroespinhal após a

injeção intracerebroventricular de CINC-1;

 Investigar a participação dos receptores CXCR1/CXCR2 nas respostas

febris induzida pelos mediadores da resposta febril do LPS (IL-1β, TNF-

α, IL-6, CRF, PGF

2α

e PGE

________________________________________________________________Materiais e Métodos 40

3. Materiais e Métodos

3.1. Animais

Ratos Wistar (Ratus novergicus), machos, pesando entre 180-200g

mantidos sob condições controladas de temperatura (24°C) e luminosidade

(ciclo claro / escuro de 12 h) com livre acesso à ração e água. Nos dias dos

experimentos, os animais foram levados para a sala de experimentação por

aproximadamente 1 h antes do início de qualquer tratamento. Todos os

experimentos foram conduzidos entre 8:00 e 17:00 h.

3.2. Esterilização

Os materiais utilizados nos experimentos foram autoclavados a 127°C

por 30 minutos (material plástico e soluções) ou esterilizados por calor seco a

180°C por 2 horas (material de vidro).

3.3. Cirurgia para implante de cânulas no ventrículo lateral e microinjeção

de corante para controle do sítio de injeção

Os ratos foram anestesiados com ketamina (58 mg/Kg) e xilazina (20

mg/Kg) por via intraperitoneal. Após tricotomia e assepsia da pele, as cabeças

dos animais foram imobilizadas em um aparelho estereotáxico (David-Kopf,

modelo 900-USA). Em seguida administrou-se 0,2 mL de solução injetável de

lidocaína a 3%, com norepinefrina, subcutaneamente na parte superior da

cabeça. Uma incisão, de aproximadamente um centímetro de diâmetro, no

local da injeção foi feita para a exposição da calota craniana. Este

procedimento tem como objetivo facilitar a remoção do periósteo e a

implantação das cânulas, por inibir o estímulo doloroso e diminuir o

sangramento.

________________________________________________________________Materiais e Métodos 41

Assumindo o bregma como ponto de referência, os parâmetros

estereotáxicos utilizados para a perfuração do crânio e posterior implantação

da cânula i.c.v. foram situados a -1,5 mm anteroposterior e -1,6 mm

lateralmente ao bregma, sendo a inclinação da barra incisal de -2,5 mm. Os

parâmetros utilizados para a cirurgia intrahipotalâmica tiveram como referência

o meio da linha intraaural, que corresponde ao zero dos três eixos do

estereotáxico. As coordenadas utilizadas foram +7,7 mm antero-posterior e -0,6

mm lateralmente ao zero, com uma inclinação na barra incisal de -3,0 mm.

Cânulas esterilizadas, constituídas de um segmento de agulha hipodérmica

BD-7, com 10 mm de comprimento e 0,7 mm de diâmetro, foram conectadas

por meio de um segmento de polietileno PE-50 a uma cânula guia, fixada ao

estereotáxico. Para injeção i.h. as cânulas esterilizadas eram constituídas de

um segmento de agulha hipodérmica BD-24G, com 15 mm de comprimento e

0,55 mm de diâmetro.

As cânulas foram introduzidas no tecido cerebral com coordenada

ventral de 2,5 mm abaixo da superfície craniana para injeção i.c.v. e 6,5 mm

para injeção i.h. Todas as coordenadas utilizadas foram determinadas com

base no Atlas de Paxinos & Watson (1986).

A fixação das cânulas foi feita por meio de uma prótese de acrílico auto-

polimerizável com o auxílio de dois parafusos rosqueados à calota craniana. No

final da cirurgia, os animais receberam injeção intramuscular de 400 mg/kg de

cloridrato de oxitetraciclina. Os animais recém-operados foram mantidos em

gaiolas, sem restrição de água ou ração, em sala com temperatura controlada

a 24ºC, com ciclos dia-noite (intervalos de 12 horas), por no mínimo sete dias,

para recuperação pós-cirúrgica.

________________________________________________________________Materiais e Métodos 42

Após o término do experimento os animais foram eutanaziados, e as

posições das cânulas verificadas histologicamente.

3.4. Controle histológico

O controle histológico foi efetuado nos encéfalos dos animais que

receberam injeção na área pré-óptica do hipotálamo rostral.

3.5. Fixação dos encéfalos

Os animais foram anestesiados com éter e 0,5 uL de corante azul de

Evans foi injetado no local correspondente ao da injeção. Em seguida os

animais foram perfundidos por punção cardíaca com solução fisiológica de

cloreto de sódio a 0,9% seguida por formaldeído a 10%. Os encéfalos foram

extraídos e armazenados por no mínimo três dias em formaldeído a 10%.

3.6. Cortes histológicos

Os encéfalos foram cortados em plano frontal sobre uma plataforma cuja

inclinação antero-posterior corresponde àquela utilizada na estereotaxia. O

bloco foi colocado sobre a plataforma de um micrótomo de congelamento,

cortado em secções de 100 m de espessura. As secções foram montadas

sobre lâminas de vidro preparadas com ovalbumina em glicerina e secas à

temperatura ambiente.

3.7. Coloração

Após secagem, as secções foram coradas por 15 minutos em vermelho

neutro 1% (p/v) e em seguida lavadas sob água corrente. Quando secas, as

lâminas foram observadas sob microscopia de luz.

________________________________________________________________Materiais e Métodos 43

Quando os cortes observados, com auxílio da microscopia,

apresentaram as cânulas fora da área desejada, os respectivos animais

tiveram seus dados extraídos dos grupos experimentais.

3.8. Vias de administração dos estímulos pirogênios

Intravenosa: LPS (lipopolissacarídeo de E.coli 0111:B4) diluído em

solução salina.

Intracerebroventricular: foram administrados no ventrículo lateral direito

no volume de 3 uL por meio de uma agulha de microinjeção (30 G) conectada a

uma microseringa Hamilton (10 uL) por um tubo de polipropileno P20, sendo

que a agulha excede a cânula em 2,5 mm. Para injeção i.h. os estímulos foram

administrados no volume de 0,3 uL com a agulha excedendo a cânula em 1

mm e atingindo a AH/POA apenas na hora da injeção.

3.9. Drogas e doses

LPS (lipopolissacarídeo de E.coli 0111: B4): 5 ug/ kg i.v. e 50 ug/ kg i.p.

CINC-1: 1 a 50 ng i.c.v. ou 5 a 100 pg i.h.

Reparixina: 150 a 1200 ng i.c.v. ou 4,0 μg a 3,125 ng i.h.

IL-1 rr: 3,12 ng i.c.v.

TNF-α: 250 ng i.c.v.

IL-6: 300 ng i.c.v.

CRF: 2,5 ng i.c.v.

PGF

2α

: 250 ng i.c.v.

PGE

: 250 ng, i.c.v.

Ibuprofeno: 10 mg/kg i.p.

Indometacina: 2 mg/ kg i.p.

Celecoxibe: 5 mg/kg p.o.

________________________________________________________________Materiais e Métodos 44

3.10. Protocolo experimental

De maneira geral, os experimentos foram conduzidos da seguinte

maneira: - determinação da concentração de CINC-1 no CSF, hipotálamo,

fígado e plasma

A concentração de CINC-1 foi determinada após a injeção endovenosa

de LPS (5 µg/ kg) nos tempos 1; 2,5 e 5 h. Durante o experimento foi também

medido a temperatura dos animais.

 efeito da CINC-1 na temperatura corporal, retal e da pele da cauda dos

animais

A CINC-1 foi administrada por via i.h. ou i.c.v. e a temperatura dos

animais foi medida por 6 h, em intervalos de 30 min. Além disso, a

determinação da temperatura da pele da cauda foi feita concomitantemente a

temperatura retal.

 tratamento com reparixina e administração de diferentes estímulos

Os animais foram tratados com reparixina (i.c.v.) e imediatamente após

receberam estímulo pirogênico ( LPS (i.v.), CINC-1, IL-1β, TNF-α, IL-6, CRF,

PGF

2α

e PGE

(i.c.v.)).

 tratamento com drogas antipiréticas

Os animais receberam tratamento com os antipiréticos 30 minutos antes

do estímulo CINC-1 (25 ng/ 2 μl, i.c.v.).

 ibuprofeno (IBU), inibidor não seletivo das ciclooxigenases (10 mg kg

-1

i.p.);

________________________________________________________________Materiais e Métodos 45

 indometacina (INDO), inibidor não seletivo das ciclooxigenases (2 mg kg

, i.p.) e

 celecoxibe (CELE), inibidor seletivo COX-2 (5 mg kg

-1

, per os).

 determinação da concentração de PGE

no CSF dos animais

Após o tratamento dos animais com as drogas antipiréticas acima

descritas, foi determinado a concentração de PGE

no CSF dos ratos na 4ª h

após a injeção i.c.v. de CINC-1 (25 ng) ou salina.

3.11. Determinação da variação da temperatura retal e da pele da cauda

por telemetria

Foi possível realizar a medida da temperatura retal dos animais através

da inserção de uma sonda (YSI, n° 402-USA) conectada a um teletermômetro

(modelo 46 TUC, YSI, EUA) a 4,0 cm de profundidade no reto dos animais,

sem que os animais fossem retirados de suas respectivas caixas. Os animais

foram adaptados às condições experimentais por meio da realização desse

procedimento duas vezes no dia anterior ao experimento, a fim de minimizar

variações de temperatura induzidas por estresse decorrente do manuseio.

No mínimo 72 h antes do início do experimento, os animais foram

colocados em uma sala cuja temperatura ambiente é controlada a 24±1°C.

Durante o experimento a temperatura ambiente foi controlada a 27±1°C.

Após o transporte dos animais para a sala onde os experimentos foram

realizados, permitiu-se que os animais permanecessem por no mínimo uma

noite em repouso e, só então, suas temperaturas basais foram determinadas

por três ou mais medidas, a intervalos de 30 minutos, antes da administração

de qualquer estímulo pirogênico ou pré-tratamento. Somente os animais com

________________________________________________________________Materiais e Métodos 46

temperatura estável e na faixa de 36,8 a 37,4°C foram utilizados. As medidas

foram feitas a intervalos de 30 minutos a partir da administração dos estímulos.

A temperatura da pele da cauda foi medida por meio de uma sonda

posicionada na superfície lateral da cauda no seu primeiro terço distal. A sinda

foi fixada à cauda e isolada da perda de calor para o ambiente com a utilização

de uma fita adesica de 2 a 3 cm de largura. O isolamento da referida extensão

da cauda não comprometeu os mecanismos de perda de calor, uma vez que os

animais controle não apresentaram alteração da temperatura retal.

3.12. Cirurgia para implante do transmissor de temperatura na cavidade

abdominal

Anteriormente à cirurgia, os transmissores foram esterilizados em

solução de glutaraldeído 2% (v/v; imersão por 24h). Os animais foram

anestersiados com pentobarbital sódico (Nembutal), 40 mg/kg por via

intraperitoneal. Após a tricotomia e assepsia da pele, foi executada uma incisão

de aproximadamente 2 cm na pele e músculos abdominais. O transmissor foi

então lavado com solução salina estéril e inserido na cavidade peritoneal. Os

músculos e a pele foram suturados separadamente e os animais receberam 0,2

ml de terramicina (400mg/kg) para uso veterinário.

3.13. Determinação da variação de temperatura corporal por

radiotelemetria

No processo de leitura da temperatura corporal por radiotelemetria,

transmissores operados por bateria (mini-mitter) foram implantados na

cavidade abdominal conforme descrito anteriormente e acionados no dia

________________________________________________________________Materiais e Métodos 47

anterior ao experimento. A frequência de saída (Hz) do transmissor foi

monitorizada por uma antena montada em uma mesa receptora situada abaixo

da caixa de contenção de cada animal e conectada a um processador

periférico (Dataquest Sistem LabPro versão 3.1) conectado, por sua vez, a um

computador pessoal. As frequências foram amostradas em intervalos de 10 min

e convertidas para graus Celsius (°C) pelo processador. O procedimento

utilizado para as injeções e os parâmetros de temperatura ambiente foram

aqueles descritos para a medida por telemetria. Não houve diferenças

quantitativas significativas entre os valores de temperatura obtidos pelos dois

métodos de medida de temperatura corporal utilizados.

3.14. Coleta do fluido cerebroespinhal (CSF)

A técnica de coleta de CSF foi padronizada segundo o método descrito

por Consiglio & Lucion (2000). O CSF foi coletado, em horários estabelecidos

com base no decurso da resposta febril após a administração de LPS (5,0μg/kg,

i.v.).Os animais do grupo controle receberam salina estéril. Antes do momento

da coleta os animais foram deixados nas mesmas condições a que são

submetidos por ocasião do experimento de febre, isto é, foram deixados em

sala com temperatura ambiente controlada a 27±1°C. Além disso, após o

transporte dos animais para a sala onde os experimentos foram realizados, foi

permitido que os animais permanecessem por no mínimo 1 h em repouso e

então suas temperaturas foram determinadas por 3 ou mais medidas, a

intervalos de 30 min antes da injeção do estímulo pirogênico. Somente os

animais com temperatura estável e na faixa de 36,8 a 37,4°C foram utilizados.

________________________________________________________________Materiais e Métodos 48

O animal foi então anestesiado com ketamina (58 mg/Kg) e xilazina (20

mg/Kg) por via intraperitoneal e fixado ao aparelho estereotáxico. A cabeça foi

colocada no plano de fixação dos incisivos superiores com o occipital

posicionado quase no plano horizontal. O corpo do animal foi deitado por baixo

das barras auriculares de forma que o tórax ficou posicionado verticalmente

(Fig. 1).

Figura 1. Coleta de fluido cerebroespinhal (CSF). Representação esquemática do

posicionamento de um rato adulto anestesiado para coleta de CSF da cisterna magna

com o auxílio de um “scalp” (Consiglio & Lucion, 2000).

Com o animal nesta posição, é possível a visualização de uma pequena

depressão entre a protuberância occipital e a espina do atlas. Esta depressão

torna-se ainda mais visível após a tricotomia e passando-se um algodão

embebido em álcool sobre esta superfície. Um “scalp” conectado a uma seringa

de 1 ml foi inserido verticalmente e centralmente nesta superfície.

________________________________________________________________Materiais e Métodos 49

A cisterna magna é atingida, o que foi percebido por meio da mudança

de resistência durante o percurso. Com uma leve aspiração o CSF pode ser

coletado no “scalp”. Um volume variável de 60 a 100 μl de CSF foi coletado e

transferido para um tubo de plástico do tipo eppendorf e mantido em gelo até a

centrifugação. As amostras de CSF foram centrifugadas durante 15 min a 4°C

e estocadas a -70°C até o momento do ensaio. As amostras que foram

contaminadas com sangue não foram utilizadas.

3.15. Determinação da concentração da CINC-1 no CSF, hipotálamo,

fígado e plasma.

Os animais tiveram o sangue coletado por punção cardíaca, armazenado

em tubos de ensaio em gelo até a centrifugação para obtenção do plasma. A

seguir o plasma foi aliquotado em eppendorfs e estocados a -70°C até o

momento da dosagem. Os animais foram sacrificados por decapitação, logo

após a coleta do sangue, e seus cérebros foram rapidamente removidos. O

hipotálamo foi dissecado do cérebro com os seguintes limites: a borda anterior

do quiasma óptico, a borda anterior dos corpos mamilares e o sulco

hipotalâmico lateral, com uma profundidade de 2 mm. O tempo de dissecção

total foi de, aproximadamente, 2 minutos após a decapitação e, em seguida, foi

congelado em nitrogênio líquido e estocado a -70ºC.

O hipotálamo, aproximadamente 100 mg de tecido, foi homogeneizado em

250 μl de solução salina em tampão fosfato (PBS) contendo inibidor de

protease (Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche Diagnostics

GmbH, Germany), utilizando um sonicador. Os tubos contendo o homogenato

foram centrifugados a 20.000 g ( 15000 rpm) por 15 min a 4ºC e o

________________________________________________________________Materiais e Métodos 50

sobrenadante coletado. Um pedaço de fígado de aproximadamente 100 mg foi

retirado sempre do lobo direito e congelado em nitrogênio líquido, estocado a -

70°C e homogeneizado em 500 μl de solução idêntica a do hipotálamo, sendo

tratado da mesma forma. A concentração da CINC-1 no CSF, hipotálamo,

fígado e plasma foi determinada por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA),

como indicado no manual do kit (R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA).

A quantidade da CINC-1 foi normalizada de acordo com o peso do hipotálamo

e do fígado e multiplicada pelo fator de diluição. O limite de detecção deste

método é de 2 pg/ml.

Foi feita a quantificação de CINC-1, empregando anticorpo específico

(purificado e biotinilado) e citocina-padrão, de acordo com instruções do

fabricante. O anticorpo de captura foi diluído em tampão carbonato 0,1 M, pH

5,0 (100 µl/poço), na concentração de 2 a 4 μg/ml, e após incubação das

placas por 18 horas a 4C, as mesmas foram lavadas 3 vezes com 300 μl de

solução salina em tampão fosfato (PBS) com 0,05% de Tween (Sigma, St.

Louis, MO) (tampão de lavagem). Após as sucessivas lavagens e secagem da

placa, foram adicionados 200 µl/poço de PBS contendo 1% de BSA (GIBCO

BRL, Grand Island, NY, USA) (tampão de bloqueio) seguido de incubação à

temperatura ambiente no mínimo por 2 horas. Após o bloqueio, os poços foram

novamente lavados 3 vezes com o tampão de lavagem, e então adicionados

100 l das amostras para a quantificação da citocina. O limite de detecção

deste método é de 2 pg/ml.

Após incubação por 18 horas a 4C, foi repetido o procedimento de

lavagem da placa, e adicionado 100 µl/poço do anticorpo de detecção

biotinilado diluído em tampão de bloqueio na concentração de 2 a 4 μg/ml.

________________________________________________________________Materiais e Métodos 51

Percorrido 2 horas de incubação à temperatura ambiente, foi repetido novo

ciclo de lavagem, e em seguida feita a amplificação da reação pela adição de

100 µl/poço de estreptoavidina/biotina/peroxidase (Dako, Carpinteria, CA, USA),

diluído em tampão de bloqueio com 0,05% de Tween, na concentração de 1,25

mg/ml com incubação por mais 1 hora. Após novo ciclo de lavagem, foram

adicionados 100 l/poço da solução de substrato, contendo H

tetrametilbenzidina (TMB) (BD, Pharmingen, San Diego, CA), e a placa foi

incubada por 20 minutos à temperatura ambiente. A reação foi bloqueada

adicionando 50 µl/poço de ácido sulfúrico (H

1M). A densidade ótica (D.O.)

foi avaliada em leitor de microplacas em 450 nm (Quant, Bio-Tek Instruments

Inc., Winooski, VT, USA) e a concentração de citocina calculada a partir da

curva padrão.

3.16. Análise estatística

Todas as variações na temperatura retal foram expressas como variação

em relação à média do valor basal (i.e. variação de T em graus Celsius). Todos

os valores foram apresentados como média ± erro padrão da média.

Inicialmente foi realizada análise de variância (ANOVA two way, Prisma) e,

após, as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Bonferroni.

As concentrações da CINC-1 (expressos em pg/ml ou pg/g) foram avaliadas

por análise de variância (ANOVA one way, Prisma) seguido por teste de Tukey.

Em ambas as análises, foram utilizadas os níveis de significância de 5%.

_______________________________________________________________________Resultados 53

4. Resultados

4.1. Efeito da administração da reparixina, antagonista de receptores

CXCR1 e CXCR2 para quimiocinas, sobre a resposta febril induzida pelo

LPS em ratos.

Visando investigar a participação dos receptores CXCR1/CXCR2 na

resposta febril induzida pelo LPS (5 μg/kg, i.v.), os animais foram tratados com

reparixina (Repa), antagonista desses receptores, nas doses de 150, 300, 600

e 1200 ng/ rato (i.c.v.) e imediatamente após receberam a injeção do estímulo.

A reparixina na dose de 150 ng reduziu a febre induzida pelo LPS,

enquanto na dose de 300 ng reduziu significantemente essa resposta a partir

da 2,5ª hora até o fim do período observado (6ª hora) (Figura 1A). Na figura 1B

podemos verificar que a dose de 600 ng promoveu uma redução, porém sem

significância estatística e a dose de 1200 ng não alterou a febre induzida pelo

LPS.

Assim, a dose de 300 ng foi selecionada para os próximos experimentos

com o LPS. Os animais do grupo controle, tratados com reparixina, não

apresentaram variação significativa da temperatura retal.

_______________________________________________________________________Resultados 54

0 1 2 3 4 5 6

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Sal / LPS (n=7)

Repa 150ng / LPS (n=5)

Repa 300ng / LPS (n=9)

Repa 300ng / Sal (n=7)

Sal / Sal (n=6)



T (



0 1 2 3 4 5 6

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Repa 600ng / LPS (n=7)

Sal / LPS (n=6)

Repa 1200ng / LPS (n=4)

Repa 1200ng / Sal (n=3)

Sal / Sal (n=3)

Tempo (h)



T (



Figura 1. Efeito da administração do antagonista de receptores CXCR1/CXCR2

reparixina sobre a resposta febril induzida pelo LPS em ratos. LPS (5 μg/kg, i.v.)

foi administrado imediatamente após a administração i.c.v. de reparixina (Repa) (150,

300, 600 e 1200 ng/ 3μL). Os valores representam a média ± EPM da variação da

temperatura retal (T, °C). Os animais do grupo controle receberam reparixina e salina

estéril (Sal). As temperaturas basais anteriores aos tratamentos estavam na faixa de

36,8 – 37,4 °C. * p< 0,05 quando comparado ao grupo Salina / LPS.

_______________________________________________________________________Resultados 55

4.2. Determinação da concentração do agonista CINC-1 no CSF,

hipotálamo, fígado e plasma de ratos após a injeção de LPS.

Para investigarmos se o LPS é capaz de induzir a síntese de agonistas

de receptores CXCR1/CXCR2 realizamos a determinação da concentração do

agonista CINC-1 em diferentes órgãos e fluídos biológicos, ou seja, no CSF,

hipotálamo, fígado e plasma para delinear a cinética da síntese desse

mediadore. A concentração de CINC-1 foi determinada 1; 2,5 e 5 h após a

injeção endovenosa de LPS (5 μg/kg) ou salina estéril.

Como representado na figura 2A, a administração i.v. de LPS promoveu

aumento da concentração da CINC-1 em todos os órgãos e fluidos

investigados quando comparados aos animais controle que receberam injeção

de salina, com exceção da 5ª h no plasma. É importante destacar que na 1ª h

após a injeção i.v. de LPS ocorreu aumento máximo de CINC-1 no hipotálamo,

tempo em que a resposta febril ainda não havia se estabelecido (figura 2B) o

que aconteceu somente depois da 2,5ª hora e se manteve no mesmo grau até

a 5ª h. Ainda, a partir da 2,5ª h a concentração hipotalâmica de CINC-1

começou a diminuir e na 5ª h chegou à metade da 1ª h demonstrando uma

relação inversa entre resposta febril e concentração de CINC-1 no hipotálamo.

Há também que se destacar que a concentração de CINC-1 no CSF foi

significativamente menor do que no hipotálamo (mas semelhante à plasmática),

e se manteve razoavelmente constante embora, também elevada na ausência

de resposta febril. Pode-se observar também que a maior quantidade de CINC-

1 encontrada foi perifericamente, no fígado, em todos os tempos.

_______________________________________________________________________Resultados 56

Plasma

200

400

600

800

1000

CINC-1 (pg/ml)

Fígado

2000

4000

6000

8000

CINC-1 (pg/g)

CSF

200

400

600

800

1000

1h 2,5 h

nd nd

CINC-1 (pg/ml)

Hipotálamo

1000

2000

3000

4000

1h 2,5 h

CINC-1 (pg/g)

Figura 2. Concentração de CINC-1 no plasma, fígado, hipotálamo e CSF de ratos

após a injeção de LPS. Determinação da concentração do agonista CINC-1 nos

diferentes tecidos e fluidos em tempos distintos (1h, 2,5h e 5h) após a injeção de LPS

(5 μg/kg, i.v.) ou salina estéril (A). Temperatura retal dos animais nos tempos de

coleta (B). Os valores representam a média ± EPM da variação da temperatura retal

(T, °C) (3 a 5 animais por grupo). A temperatura retal basal antes do estímulo esteve

entre 36,8 e 37,4°C. * p< 0,05 quando comparado ao grupo salina. Em A, nd= não

detectado.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Salina

LPS

1h 2.5h



T (



_______________________________________________________________________Resultados 57

4.3. Efeito da administração i.c.v. de diferentes doses do agonista CINC-1

sobre a temperatura corporal de ratos.

Com o objetivo de verificarmos o efeito da ativação desses receptores

sobre a temperatura corporal, os animais receberam o agonista CINC-1 nas

doses de 1, 5, 25 e 50 ng / rato e os animais controle receberam solução salina

estéril.

A figura 3A mostra que a injeção i.c.v. de CINC-1 induz uma duradoura e

dose-dependente elevação da temperatura corporal dos ratos. Na dose de 1 ng

de CINC-1, a temperatura dos animais é similar a dos animais controle que

receberam a injeção de salina, enquanto as doses de 5, 25 e 50 ng

aumentaram consideravelmente a temperatura corporal. No entanto, não há

diferença estatística no aumento da temperatura causada pelas doses de 25 e

50 ng de CINC-1. Assim, a dose de 25 ng foi selecionada para experimentos

posteriores. Além disso, nem a injeção de salina ou de CINC-1 fervida (25 ng)

modificaram a temperatura dos animais (Figura 3B). As injeções nas doses

descritas foram administradas em um volume de 3,0 µL.

_______________________________________________________________________Resultados 58

0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.5

1.0

1.5

1 ng

5 ng

25 ng

50 ng

Sal



T (ºC)

0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.5

1.0

1.5

CINC-1 25ng

CINC-1 25ng (fervida)

Sal

# #

Tempo (h)



Figura 3. Efeito da injeção i.c.v. de CINC-1 na temperatura corporal. O agonista foi

injetado intracerebroventricularmente (i.c.v.) nas doses de 1, 5, 25 e 50 ng (3 uL) e a

temperatura corporal foi medida nos tempos indicados (figura A). Em B, os animais

receberam CINC-1 fervida ou não (25 ng). Os animais controle receberam injeção de

salina (Sal) i.c.v. Os valores representam a média ± EPM da variação da temperatura

retal (T, °C). A temperatura retal basal antes do estímulo esteve entre 36,8 e 37,4°C.

,*p<0,05 quando comparado ao grupo salina (controle) ou CINC-1 fervida, A e B

respectivamente.

_______________________________________________________________________Resultados 59

4.4. Efeito da injeção i.h. de CINC-1 na temperatura retal.

Verificamos também se a injeção intrahipotalâmica (i.h.) de CINC-1

promoveria aumento na temperatura dos animais. Assim, o agonista foi

administrado nas doses de 5, 50 e 100 pg promovendo um aumento dose-

dependente em forma de sino na temperatura retal dos animais. Nas doses de

5 e 50 pg (volume de 0,3 uL), a CINC-1 causa um aumento significante e dose-

dependente da temperatura retal dos ratos, enquanto na dose de 100 pg o

aumento na temperatura retal promovido por CINC-1 não é diferente do

induzido pela dose de 5 pg. Assim, a dose de 50 pg foi selecionada para os

experimentos posteriores. A injeção i.h. de salina não alterou significativamente

a temperatura retal dos animais (figura 4A).

Através da administração de corante in situ e de cortes histológicos (60

μm de espessura) pode-se averiguar o trajeto da cânula bem como a

profundidade alcançada pela agulha durante a injeção da CINC-1 na AH/POA

(figura 4B).

_______________________________________________________________________Resultados 60

1 2 3 4 5 6

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

SAL

50 pg

100 pg

5 pg



T (

Figura 4A. CINC-1 injetada intrahipotalamicamente (i.h.) promove aumento dose-

dependente na temperatura retal de ratos. Os animais receberam injeção i.h. nas

doses indicadas e como controle, salina estéril (Sal) em um volume de 0,3 uL. Os

valores representam a média ± EPM da variação da temperatura retal (T, °C). A

temperatura retal basal antes do estímulo esteve entre 36,8 e 37,4°C. *p<0,05 quando

comparado ao grupo controle (salina).

_______________________________________________________________________Resultados 61

Figura 4B: Fotomicrografia de corte coronial seriado do cérebro de ratos

Wistar indicando o sítio da microinjeção de CINC-1 ou salina na AH/POA. Os

círculos pretos representam o sítio de microinjeção, localizados em planos coronais:

Inclinação (I):-3,0 mm; Antero-posterior (AP): +7,7 mm; Lateral (L): -0,6 mm e

Profundidade: -6,5 mm, em relação ao meio da linha intraaural. Abreviações

anatômicas: LV, ventrículo lateral; 3V, terceiro ventrículo; PaMC, núcleo

paraventricular magnocelular; SO, núcleo supra-óptico; OX, quiasma óptico; AHP/A,

área pré-óptica hipotalâmica.

AHP

so so

PaMC

so so

PaMC

AHP

Local da injeção



_______________________________________________________________________Resultados 62

4.5. Efeito da administração do agonista CINC-1 sobre a temperatura retal

e da pele da cauda em ratos.

Investigamos também, se o aumento da temperatura corporal induzido

pela injeção da CINC-1 na AH/POA se tratava de febre ou hipertermia.

Dessa forma, observamos que a injeção intrahipotalâmica de CINC-1

ativando os receptores CXCR1/CXCR2 na dose de 50 pg/rato promoveu um

aumento da temperatura retal acompanhado por redução da temperatura da

pele da cauda dos animais, sendo esta última significativa entre 1,5ª h e 3,5ª h.

Os animais que receberam salina estéril na AH/POA não apresentaram

alteração da temperatura retal ou da pele.

Dessa forma, o aumento da temperatura induzido pela injeção da CINC-

1 está associado às respostas termorregulatórias para retenção de calor, como

a vasoconstrição periférica verificada pela queda da temperatura da pele da

cauda.

_______________________________________________________________________Resultados 63

Figura 5. Efeito da administração da CINC-1 sobre a temperatura retal e da pele

da cauda dos animais. Os animais receberam injeção i.h. de CINC-1 na dose de 50

pg/ 0,3 μl e como controle, salina estéril (Sal) em um volume de 0,3 uL. Os valores

representam a média ± EPM da variação da temperatura retal (T, °C). A temperatura

retal basal antes do estímulo esteve entre 36,8 e 37,4°C e da cauda em torno de 33°C.

*p<0,05 quando comparado ao grupo controle (salina).

_______________________________________________________________________Resultados 64

4.6. Efeito da administração de reparixina sobre a resposta febril induzida

pela CINC-1 em ratos.

A fim de confirmarmos a eficácia da reparixina sobre os receptores

CXCR1 e CXCR2, os animais foram tratados com este antagonista na mesma

faixa de doses utilizada para reduzir a febre induzida pelo LPS, ou seja, 150,

300 e 600 ng/animal imediatamente antes da administração i.c.v. do seu

respectivo agonista CINC-1. Todas as doses aboliram a febre induzida pela

injeção i.c.v. de CINC-1. A temperatura dos animais do grupo controle não foi

modificada pela administração de reparixina 600 ng (figura 6). Dessa forma, a

dose de 150 ng de reparixina foi selecionada para os experimentos posteriores.

_______________________________________________________________________Resultados 65

0 1 2 3 4 5 6

-0.5

0.0

0.5

1.0

Repa 150ng / CINC-1 (n=5)

Repa 300ng / CINC-1 (n=7)

Repa 600ng / CINC-1 (n=4)

Repa 600ng / Sal (n=3)

Sal / CINC-1 (n=7)

Tempo (h)



T (



Figura 6. Efeito da administração i.c.v. de reparixina sobre a resposta febril

induzida pela CINC-1 em ratos. A reparixina (Repa) (150, 300 e 600ng/animal, i.c.v.,

3,0μl) foi administrada imediatamente antes do estímulo CINC-1 (25ng/animal, i.c.v.,

3,0μl). Os valores representam a média ± EPM da variação da temperatura retal

(T, °C). Os animais do grupo controle receberam reparixina e salina estéril (Sal). A

temperatura retal basal antes do estímulo esteve entre 36,8 e 37,4°C. * p< 0,05

quando comparado os grupos tratados com reparixina ao grupo Sal/CINC.

_______________________________________________________________________Resultados 66

4.7. Efeito do tratamento com drogas antipiréticas sobre a febre induzida

pela ativação dos receptores CXCR1/CXCR2.

Com o objetivo de investigar a participação de PGE

como um possível

mediador final na resposta febril induzida pela ativação dos receptores

CXCR1/CXCR2, verificamos o efeito de três fármacos antipiréticos: i)

ibuprofeno (IBU), inibidor não seletivo das ciclooxigenases (10 mg kg

-1

, i.p.)

(figura 7A); ii) indometacina (INDO), inibidor não seletivo das ciclooxigenases

(2 mg kg

-1

, i.p.) (figura 7B) e, iii) celecoxibe (CELE), inibidor seletivo COX-2 (5

mg kg

-1

, per os) (figura 7C) administrados 30 minutos antes do agonista CINC-

1 (25 ng/ 2 μl, i.c.v.).

Verificamos que o tratamento com essas drogas reduziu e em grande

parte aboliu a febre induzida por CINC-1. Na figura 7A, os animais tratados

com o inibidor não seletivo ibuprofeno apresentaram redução significativa na

temperatura a partir da 1ª hora, chegando próxima à dos animais controle até o

fim do período observado (6ª h). Redução semelhante foi causada pelo

tratamento dos animais com indometacina, também um inibidor não seletivo

das ciclooxigenases (Figura 7B) enquanto o tratamento dos animais com

celecoxibe aboliu a febre induzida pela CINC-1 durante todo o período

observado (figura 7C).

Os animais controle para as drogas ibuprofeno e indometacina

receberam Tris.HCl, pH 8,2 ou salina estéril e não apresentaram alteração na

temperatura basal. A administração oral da mesma dose de celecoxibe ou de

salina estéril ao grupo controle também não alterou a temperatura basal dos

animais.

_______________________________________________________________________Resultados 67

0 1 2 3 4 5 6

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

SAL / SAL

IBU / CINC-1

TRIS / CINC-1



T (

0 1 2 3 4 5 6

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

INDO / CINC-1

TRIS / SAL

TRIS / CINC-1



T (

0 1 2 3 4 5 6

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

CELE / SAL

O / CINC-1

CELE / CINC-1

Tempo (h)



T (

Figura 7. Efeito de antipiréticos na febre induzida pela ativação dos receptores

CXCR1/CXCR2 pela CINC-1. Em A os ratos receberam ibuprofeno (IBU) (10 mg kg-1, i.p.) ou

salina estéril (Sal) (i.p.) 30 minutos antes da injeção i.c.v. de CINC-1 (25 ng/ 2 μl). Em B, os

animais receberam indometacina (INDO) (2 mg kg-1, i.p.) ou TRIS.HCl (i.p.) 30 minutos antes

da injeção de CINC-1 (25 ng/ 2 μl, i.c.v.). Animais controle receberam TRIS.HCl (i.p.) ou salina

estéril (2 μl, i.c.v.). Em C, celecoxibe (CELE) (5 mg kg-1) ou água estéril foi administrada per os

(p.o.), 30 minutos antes da injeção de CINC-1 (25 ng) i.c.v. Os valores representam a média ±

EPM da variação da temperatura retal de 5 a 7 animais por grupo (T, °C). A temperatura retal

basal antes do estímulo esteve entre 36,8 e 37,4°C. Em A *p< 0,05 quando comparado o grupo

Sal/ Sal a Sal/ CINC-1;

p <0,05 quando comparado o grupo Sal / CINC-1 a Ibu / CINC-1. Em

B, * p< 0,05 quando comparado o grupo Tris/ Sal a Tris/ CINC-1;

p <0,05 quando comparado

o grupo Tris / CINC-1 a Indo / CINC-1. Em C, *,

p <0,05 quando comparado H

O / Sal ou Cele

/CINC-1 a H

O / CINC-1, respectivamente.

_______________________________________________________________________Resultados 68

4.8. Efeito de drogas antipiréticas sobre a concentração de PGE

no CSF

dos ratos após a ativação dos receptores CXCR1/CXCR2.

Investigamos a seguir se esses receptores, uma vez ativados pela

CINC-1, promoveriam aumento do conteúdo de PGE

no fluido cerebroespinhal

(CSF) e se as drogas antipiréticas, paralelamente à redução da resposta febril

(Figura 7), também reduziriam a concentração deste eicosanóide no CSF. Para

tanto, a coleta do CSF foi efetuada na 4ª h após a injeção i.c.v. de CINC-1 (25

ng) ou salina e a determinação da concentração de PGE

no CSF dos ratos foi

determinada pelo método de ELISA.

Observamos então que em comparação aos animais controle (salina,

i.c.v.), a administração i.c.v. de CINC-1 (25 ng) elevou significantemente a

concentração de PGE

no CSF (Figura 8). Observamos ainda que o tratamento

dos animais com ibuprofeno (10 mg kg

-1

, i.p.) e indometacina (2 mg kg

-1

, i.p.),

inibidores não seletivos das ciclooxigenases, e celecoxibe, inibidor seletivo da

COX-2 (5 mg kg

-1

, per os) administrados 30 minutos antes do CINC-1 reduziu a

concentração de PGE

a valores próximos aos de animais controles (figura 8).

_______________________________________________________________________Resultados 69

Figura 8. Efeito da indometacina (INDO), ibuprofeno (IBU) e celecoxibe (CELE)

sobre o aumento da concentração de PGE

no CSF causado pela ativação dos

receptores CXCR1/CXCR2 pela CINC-1. O CSF foi obtido da cisterna magna dos

animais 4 h após a injeção i.c.v. de CINC-1 (25 ng/ 2 μl) ou salina estéril (Sal). Os

níveis de PGE

foram determinados por ELISA. Os valores representam a média ±

EPM (5 a 7 animais por grupo). A temperatura retal basal antes dos tratamentos

esteve entre 36,8 e 37,4°C. *,

p< 0,05 quando comparado o grupo Tris/ CINC-1 a Tris

/ Sal e Tris / CINC-1 aos grupos tratados Indo, Ibu ou Cele, respectivamente.

_______________________________________________________________________Resultados 70

4.9. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a

resposta febril induzida pela IL-1β, TNF- e IL-6 em ratos.

Com o objetivo de verificar o efeito do antagonismo dos receptores

CXCR1/CXCR2 na febre induzida pelos mediadores que orquestram a resposta

febril induzida pelo LPS, investigamos o efeito da reparixina sobre a febre da

IL-1β, TNF- e IL-6.

A reparixina foi administrado na dose de 150 ng (i.c.v.) e imediatamente

após os animais receberam a injeção de IL-1β (3,12 ng/ 3μl, i.c.v.), TNF-

(250ng/3μl, i.c.v.) ou IL-6 (300ng/3μl, i.c.v.). Verificamos que a resposta febril

induzida por estas citocinas não foi alterada pelo pré-tratamento dos animais

com a reparixina. Os animais do grupo controle tratados com reparixina não

apresentaram variação significativa na temperatura retal (figuras 9, 10 e 11).

_______________________________________________________________________Resultados 71

0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.5

1.0

1.5

Repa / IL-1 (n=8)

Sal / IL-1 (n=6)

Repa / Sal (n=6)

Tempo (h)



T (



Figura 9. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a resposta

febril induzida pela IL-1β em ratos. A reparixina (Repa) (150 ng/ 3 μl, i.c.v.) foi

administrada e imediatamente após os animais receberam a injeção de IL-1β (3,12 ng/

3μl, i.c.v.) ou salina estéril (Sal) (3 μl). Os valores representam a média ± EPM da

variação da temperatura retal (T, °C). Os animais do grupo controle receberam

reparixina ou salina estéril. A temperatura retal basal antes do estímulo esteve entre

36,8 e 37,4°C. * p< 0,05 quando comparado o grupo Sal / IL-1β ao Repa / Sal.

_______________________________________________________________________Resultados 72

0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.5

1.0

1.5

Sal / TNF- (n=6)

Repa / TNF- (n=7)

Repa / Sal (n=6)

Tempo (h)



T (ºC)

Figura 10. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a

resposta febril induzida pelo TNF-α em ratos. A reparixina (Repa) (150 ng/ 3 μl,

i.c.v.) foi administrada e imediatamente após os animais receberam a injeção de TNF-

α (250ng/ 3μl, i.c.v.) ou salina estéril (Sal) (3 μl). Os valores representam a média ±

EPM da variação da temperatura retal (T, °C). Os animais do grupo controle

receberam reparixina ou salina estéril. A temperatura retal basal antes do estímulo

esteve entre 36,8 e 37,4°C. * p< 0,05 quando comparado o grupo Sal/ TNF-α ao Repa

/ Sal.

_______________________________________________________________________Resultados 73

0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Sal / IL-6 (n=6)

Repa / IL-6 (n=7)

Repa / Sal (n=7)

Tempo (h)



T (



Figura 11. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a

resposta febril induzida pela IL-6 em ratos. A reparixina (Repa) (150 ng/ 3 μl, i.c.v.)

foi administrada e imediatamente após os animais receberam a injeção de IL-6 (300

ng/ 3μl, i.c.v.) ou salina estéril (Sal) (3 μl). Os valores representam a média ± EPM da

variação da temperatura retal (T, °C). Os animais do grupo controle receberam

reparixina ou salina estéril. A temperatura retal basal antes do estímulo esteve entre

36,8 e 37,4°C. * p< 0,05 quando comparado o grupo Sal/ IL-6 ao Repa / Sal.

_______________________________________________________________________Resultados 74

4.10. Efeito do antagonismo de receptores CXCR1/CXCR2 sobre a

resposta febril induzida pelo CRF em ratos.

Investigamos também o efeito do bloqueio desses receptores sobre a

resposta febril induzida pelo CRF, o qual é secretado pelo núcleo

paraventricular hipotalâmico em resposta a pirogênios endógenos como a IL-1

(Buckingham et al., 1996; Zampronio et al., 2000) e também a PGF

2

(Strijbos

et al., 1992).

Assim, utilizando o mesmo esquema de pré-tratamento e dose de

reparixina (150 ng, 3 μl, i.c.v.), observamos que este bloqueio não alterou a

resposta febril induzida pelo CRF e nem a temperatura basal dos animais

controle (figura 12). Os animais do grupo controle tratados com reparixina não

apresentaram variação significativa na temperatura retal.

_______________________________________________________________________Resultados 75

0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Sal / CRF (n=8)

Repa / CRF (n=8)

Repa / Sal (n=6)

Tempo (h)



T (



Figura 12. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a

resposta febril induzida pelo CRF em ratos. A reparixina (Repa) (150 ng/ 3 μl, i.c.v.)

foi administrada e imediatamente após os animais receberam a injeção de CRF (5 μg /

3μl, i.c.v.) ou salina estéril (Sal) (3 μl). Os valores representam a média ± EPM da

variação da temperatura retal (T, °C). Os animais do grupo controle receberam

reparixina ou salina estéril. A temperatura retal basal antes do estímulo esteve entre

36,8 e 37,4°C. * p< 0,05 quando comparado o grupo Sal/ CRF ao Repa / Sal.

_______________________________________________________________________Resultados 76

4.11. Efeito do antagonismo de receptores CXCR1/CXCR2 sobre a febre

induzida pelas prostaglandinas PGF

2α

e PGE

em ratos.

Como descrito no item anterior, a PGF

2

é um potente liberador de CRF;

desta forma existe a possibilidade de um mediador intermediário atuar sobre os

receptores CXCR1/CXCR2 entre este prostanóide e o CRF.

Para testar esta hipótese animais foram pré-tratados com reparixina (150

ng / 3μl, i.c.v.) e imediatamente após receberam injeção central de PGF

2α

(250

ng, i.c.v.). Investigamos também a reparixina nos animais que receberam

injeção de PGE

(250 ng, i.c.v.). Em nenhum dos casos o antagonismo desses

receptores foi efetivo (figura 13 e 14). Os animais do grupo controle tratados

com reparixina não apresentaram variação significativa na temperatura retal.

_______________________________________________________________________Resultados 77

0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Sal / PGF

2

(n=9)

Repa / PGF

2

(n=9)

Repa / Sal (n=4)

Tempo (h)



T (ºC)

Figura 13. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a

resposta febril induzida pela PGF

2α

em ratos. A reparixina (Repa) (150 ng/ 3 μl,

i.c.v.) foi administrada e imediatamente após os animais receberam a injeção de

PGF

2α

(250 ng / 3μl, i.c.v.) ou salina estéril (Sal) (3 μl). Os valores representam a

média ± EPM da variação da temperatura retal (T, °C). Os animais do grupo controle

receberam reparixina ou salina estéril. A temperatura retal basal antes do estímulo

esteve entre 36,8 e 37,4°C. * p< 0,05 quando comparado o grupo Sal/ PGF

2α

ao Repa

/ Sal.

_______________________________________________________________________Resultados 78

0 1 2 3 4 5 6

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Repa / Sal (n=6)

Sal / PGE

(n=6)

Repa / PGE

(n=7)

* *

Tempo (h)



T (



Figura 14. Efeito do antagonismo dos receptores CXCR1/CXCR2 sobre a

resposta febril induzida pela PGE

em ratos. A reparixina (Repa) (150 ng/ 3 μl, i.c.v.)

foi administrada e imediatamente após os animais receberam a injeção de PGE

(250

ng / 3μl, i.c.v.) ou salina estéril (Sal) (3 μl). Os valores representam a média ± EPM da

variação da temperatura retal (T, °C). Os animais do grupo controle receberam

reparixina ou salina estéril. A temperatura retal basal antes do estímulo esteve entre

36,8 e 37,4°C. * p< 0,05 quando comparado o grupo Sal/ PGE

ao Repa / Sal.

________________________________________________________________________Discussão 80

5. Discussão

Já é conhecido que pirogênios endógenos, ou citocinas, como IL-1α e

IL-1β (Dinarello, 1984; 1994), IL-6 (Helle et al., 1988) e TNF-α (Dinarello et al.,

1986) são sintetizados/liberados em resposta a inúmeros pirogênios exógenos,

como LPS, poli I: poli C, terebentina entre outros (Zampronio et al., 2000; Van

Miert et al., 1990; Leon, 2002). Além disso, tem sido descrito o efeito pirogênico

de uma outra classe de mediadores inflamatórios, as quimiocinas. Davatelis et

al. (1989) foram os primeiros a demonstrar em coelhos os efeitos pirogênicos

do dubleto MIP em coelhos. Em seguida, Miñano et al. (1990) mostraram os

efeitos pirogênicos desta quimiocina em ratos e, ainda neste mesmo ano,

Rothwell et al. demonstraram a eficácia da IL-8 na indução da resposta febril

em ratos, o que posteriormente foi confirmado por Zampronio e colaboradores

(1994). Outros estudos de nosso laboratório demonstraram os efeitos

pirogênicos do MIP-1 (Melo Soares et al., 2006), da RANTES (Machado et al.,

2007) e da CINC-1 (Soares et al., 2008).

O presente estudo visa melhor investigar o envolvimento dos receptores

CXCR1/CXCR2 na resposta febril induzida pelo LPS e seu envolvimento na

cascata de mediadores pirogênicos que regem esta resposta.

Dessa maneira, demonstramos através da eficácia da administração i.c.v.

de reparixina, antagonista de receptores CXCR1 e CXCR2, em diminuir a febre

induzida pelo LPS, o envolvimento, pelo menos em parte, destes receptores

nesta resposta. Nossos dados corroboram os resultados de Zarbock e

colaboradores (2008) que o bloqueio desses receptores inibiu o recrutamento

de neutrófilos e a permeabilidade venular na resposta inflamatória induzida

________________________________________________________________________Discussão 81

pelo LPS. Estes pesquisadores demonstraram que a inibição terapêutica do

receptor CXCR2 pela reparixina foi a responsável pelos efeitos

antiinflamatórios deste antagonista. Entretanto, Bertini et al., (2004) e Casilli et

al., (2005) demonstraram que a reparixina é mais eficaz sobre os receptores

CXCR1 do que sobre o CXCR2, o que também nos permite hipotetizar que o

efeito antipirético observado ocorreu pelo duplo bloqueio de ambos os

receptores, CXCR1 e CXCR2, uma vez que não se pode afirmar qual deles

está sendo preferencialmente bloqueado nesta resposta.

Demonstramos através da determinação da concentração do agonista

de receptores CXCR1/CXCR2, CINC-1, nos diferentes sítios (CSF, hipotálamo,

plasma e fígado) que, uma vez ativados pela injeção sistêmica de LPS, eles

induzem a síntese/liberação dessa quimiocina em níveis bastante elevados a

partir da 1ª h, quando a resposta febril ainda não havia se instalado. Este

achado sugere o envolvimento desses receptores na fase de instalação desta

resposta. Esta hipótese é apoiada pela cinética do efeito do antagonismo dos

mesmos pela reparixina, administrada intracerebroventricularmente

imediatamente após a injeção intravenosa de LPS. Conforme mostra a figura 1,

o efeito antipirético da reparixina instalou-se somente 2,5 h após a

administração deste estímulo o que sugere que centralmente a ativação desses

receptores promova e/ou participe da síntese de outros mediadores pirogênicos

responsáveis pelo desencadeamento e manutenção da resposta febril. É

importante destacar que na 1ª hora após a injeção i.v. de LPS ocorreu o

aumento máximo de CINC-1 no hipotálamo, tempo em que a resposta febril

ainda não havia se estabelecido (figura 2B), o que aconteceu somente depois

da 2,5ª hora e se manteve no mesmo grau até a 5ª hora. Ainda, a partir da 2,5ª

________________________________________________________________________Discussão 82

hora a concentração hipotalâmica de CINC-1 começa a diminuir e na 5ª hora

chega à metade da 1ª hora demonstrando uma relação inversa entre resposta

febril e ativação de receptores CXCR1/CXCR2 no hipotálamo. Há também que

se destacar que a concentração de CINC-1 no CSF foi significativamente

menor do que no hipotálamo (mas semelhante à plasmática), e se manteve

razoavelmente constante embora também elevada na ausência de resposta

febril. Portanto, existe a possibilidade de que centralmente esta ativação

promova e/ou participe da síntese de outros mediadores pirogênicos,

culminando na febre.

Perifericamente, a maior quantidade de CINC-1 foi encontrada no fígado,

e isto é válido para todos os tempos (1ª; 2,5ª e 5ª h). Esse dado confirma os

achados de Campbell (2003) que demonstram a grande e rápida indução da

expressão do RNAm para CINC-1 no fígado após a estimulação intraperitoneal

com altas doses de LPS. Estes autores qualificam a CINC-1 como uma

proteína de fase aguda e um dos mediadores responsáveis pela disfunção

múltipla de órgãos.

Com o intuito de analisarmos o efeito da ativação central dos receptores

CXCR1/CXCR2 sobre a temperatura corporal dos animais, a quimiocina

agonista CINC-1 foi injetada tanto i.c.v. quanto i.h.. Verificamos então, que a

ativação desses receptores induziu aumento da temperatura corporal e retal

dos animais. Esse aumento de temperatura foi associado a uma resposta

termorregulatória efetora constatada pela redução da temperatura da pele da

cauda, resultante da vasoconstrição periférica e indicativa da retenção de calor

que ocorre após a elevação do ponto de regulagem hipotalâmico (Gordon,

2002; Romanovsky et al., 2002) o que caracteriza a verdadeira resposta febril.

________________________________________________________________________Discussão 83

É importante enfatizar que o fluxo de sangue da vasculatura da cauda é

regulado pela atividade dos nervos simpáticos, controlada especificamente

pelos neurônios do núcleo da rafe, região envolvida no controle da temperatura

corporal através da regulação do leito vascular cutâneo (Blessing & Nalivaiko,

2001).

Após a identificação dos receptores CXCR1 e CXCR2 como importantes

na mediação da resposta febril desencadeada pelo LPS, investigamos se este

antagonismo seria confirmado na resposta induzida por um dos seus agonistas,

ou seja, a CINC-1. De fato, o pré-tratamento com reparixina (i.c.v.) aboliu a

febre induzida pela CINC-1 (i.c.v.). Ambos receptores foram encontrados em

diversas células, inclusive em neurônios de ratos nos quais a IL-8 liga-se aos

dois tipos de receptores (Puma et al., 2001). Outros autores demonstraram a

presença de CXCR2 em neutrófilos de ratos (Shibata et al., 2000; Souza et al.,

2004; Barsante et al., 2008). No entanto, é prematuro dizer qual dos receptores

está sendo ativado e promovendo febre. O uso de antagonistas seletivos para

CXCR1 e CXCR2 poderia responder a essa questão.

Investigamos também o envolvimento de PGE

nesta resposta, como um

possível mediador final através do qual a ativação desses receptores pela

CINC-1 agiria e finalmente culminaria em resposta febril nos animais. Nossos

resultados mostraram que a ativação central (i.c.v.) pelo agonista CINC-1

promoveu aumento na concentração de PGE

no CSF de ratos, sugerindo que

este prostanóide seja, pelo menos em parte, responsável pela febre induzida

por esta ativação. As três drogas antipiréticas utilizadas neste estudo

(indometacina, ibuprofeno e celecoxibe) foram capazes de reduzir/abolir a febre

induzida pela CINC-1. Além disso, a redução da resposta febril por estes

________________________________________________________________________Discussão 84

fármacos reduziu a níveis basais a concentração de PGE

no CSF dos animais.

Logo, podemos concluir que os receptores CXCR1/CXCR2, quando ativados,

promovem a síntese/liberação de PGE

que atuaria como um mediador final

responsável por elevar a temperatura dos animais.

O celecoxibe, inibidor seletivo para COX-2, foi responsável por abolir a

febre da CINC-1 durante todo o período observado (6h). Isso indica que as

prostaglandinas, geradas via COX-2, estão envolvidas nesta resposta. Muitos

estudos sustentam essa hipótese, uma vez que a COX-2 parece ser a enzima

responsável pela biossíntese de prostanóides durante respostas inflamatórias e

febris (Bakhle & Botting, 1996; Cao et al., 1995; Fabrício et al., 2005; Machado

et al.,2007). Ainda mais, a indução da expressão de RNAm de COX-2 ocorre

na superfície interna da vasculatura cerebral, incluindo a área pré-óptica e sua

vizinhança, durante o curso temporal da febre induzida pelo LPS em ratos (Cao

et al., 1995). No entanto, parece que a expressão constitutiva de COX-2 pode

ocorrer em várias áreas do cérebro, como o hipotálamo (Breder et al., 1995).

Em paralelo com esses paradigmas, muitos estudos têm demonstrado que o

mecanismo de ação de algumas drogas antiinflamatórias não esteroidais, como

o celecoxibe (Shishodia et al., 2004; Raju et al., 2005) e o ibuprofeno (Lo et al.,

1998; Glibetic et al., 2001) baseia-se não somente na inibição da

ciclooxigenase mas também na síntese e ativação de fatores nucleares como o

NF-κB, componente crucial para a síntese de citocinas e quimiocinas (ver

Introdução) e a produção de COX-2 durante um estado febril ou inflamatório. O

estudo de Miyamoto e colaboradores (2006) demonstra que o celecoxibe

previne a encefalomielite autoimune experimental (EAE) em camundongos

através do bloqueio da síntese de MCP-1, P-selectina e ICAM-1; dessa forma

________________________________________________________________________Discussão 85

prevenindo o infiltrado de células inflamatórias no sistema nervoso central.

Além disso, esses autores também mostraram que o efeito inibitório do

celecoxibe na EAE também foi observado em animais nocaute para COX-2,

reforçando o seu mecanismo independente de COX-2.

Com relação à indometacina, seu efeito inibitório na ativação de NF-κB é

controverso (Tegeder et al., 2001; Takada et al., 2004; Shen et al., 2007),

portanto mais estudos são necessários para elucidar qual mecanismo de ação

é mais relevante nos efeitos antipiréticos aqui investigados.

Diante dos resultados obtidos até agora e com o intuito de verificar o

papel desses receptores na cascata de mediadores da resposta febril induzida

pelo LPS, investigamos a sua possível participação na resposta febril induzida

por diversos desses mediadores.

Uma vez observado que a resposta induzida pelos receptores ativados é

dependente de prostaglandinas, sua participação foi também investigada nos

estímulos que dependem desses prostanóides para as suas atividades

pirogênicas como a IL-1β, o TNF-α e a IL-6. Além disso, também foi verificado

o envolvimento dos mesmos nas respostas induzidas por mediadores

independentes dessa via, o CRF, e nas respostas induzidas pelas

prostaglandinas PGF

2α

e PGE

Observamos que o bloqueio desses receptores não modificou a resposta

pirogênica induzida por nenhum dos mediadores estudados, o que nos leva a

hipotetizar que é improvável a participação destes na febre por eles induzida.

Há controvérsias entre os resultados obtidos no nosso estudo e alguns

descritos na literatura. Com relação à IL-1β; apesar de nosso antagonismo não

ter promovido nenhum efeito significativo na resposta induzida por esse

________________________________________________________________________Discussão 86

mediador, estudos de Zhu e colaboradores (2006) verificaram que a ativação

dos receptores CXCR1/CXCR2 em uma linhagem de células cancerígenas por

IL-1β foi capaz de aumentar a expressão da quimiocina GCP (proteína

quimiotática para granulócitos)-2, conhecido agonista desses receptores. Além

disso, existem estudos que demonstram que a ativação de ambos receptores

por IL-1β ou TNF-α promove a migração/ativação de leucócitos por células

endoteliais (Sheikh et al., 2005; Kuboki et al., 2008) o que nos faria esperar que

o antagonismo dos receptores CXCR1 e CXCR2 em nosso estímulo

provocasse alguma diferença na resposta induzida pela ativação desses

receptores. O seu antagonismo mostrou-se eficaz em inibir funções relativas à

sua ativação como recrutamento de neutrófilos, edema, lesão por I/R e

produção de citocinas (Chapman et al., 2007; Barsante et al., 2008; Garau et

al., 2006; Kuboki et al., 2008). Era natural, portanto, esperarmos que a febre,

uma resposta também vinculada a essa ativação, fosse menos intensa com o

bloqueio desses receptores. Dessa forma, nossos resultados in vivo diferem

dos dados obtidos já existentes na literatura.

O CRF parece estar envolvido nas ações centrais das citocinas,

especialmente com relação a febre e termogênese (Figueiredo et al., em

análise; Emoto et al., 1993; Rothwell 1989; Strijbos et al., 1992). Esse hormônio

ainda ativa o eixo HPA (hipotálamo-pituitária-adrenal), responsável por

promover ativação simpática, com a síntese/ liberação de noradrenalina e

ativação de receptores α-1 resultando na geração da primeira fase da febre

induzida pelo LPS (revisado por Blatteis, 2007). Além disso, o CRF está

envolvido em uma via de indução de febre mediada por quimiocinas, porém

independente de prostaglandinas (Soares et al., 2009). Foi demonstrado por

________________________________________________________________________Discussão 87

Terawaki et al. (2001) que a ativação central dos receptores CXCR1/CXCR2

promove efeito inibitório sob os efeitos mediados pelo CRF, como a atividade

locomotora. Entretanto, em nosso estudo não observamos a participação

desses receptores na febre induzida por esse peptídeo.

Resultados recentes de nosso laboratório demonstraram que, na 1ª hora

após a injeção i.v. de LPS, há um aumento significativo de citocinas

inflamatórias como o TNF-α, mesmo quando a resposta febril ainda não se

instalou. Este perfil de dissonância entre febre e presença de mediadores

pirogênicos foi semelhante à cinética de aparecimento do agonista CINC-1 e,

portanto, da ativação dos receptores CXCR1/CXCR2, e da resposta febril.

Somente por volta da 3ª hora, momento em que os animais apresentam

claramente um estado febril, citocinas como IL-1β têm concentração elevada; e

no entanto, durante as 3 primeiras horas a IL-6 não se encontra em

quantidades significativas no hipotálamo dos animais. Dessa forma, podemos

perceber que as três citocinas classificadas como mediadores pirogênicos,

possuem expressão temporal diferenciada e, supõe-se, têm participações

igualmente únicas na gênese dessa resposta.

Assim como o TNF-α, a CINC-1 também está presente no hipotálamo

logo na 1ª hora após a administração de LPS, mesmo na ausência de resposta

febril e sua concentração diminui com o passar do tempo, sugerindo que a

ativação dos receptores per si, induziria a síntese e/ou liberação de outros

mediadores que então agiriam sobre os neurônios hipotalâmicos resultando em

alteração do set point, culminando na febre.

Corroborando o fato de que a resposta febril desenvolve-se num curso

temporal diferente do aparecimento de seus mediadores e consequente

________________________________________________________________________Discussão 88

funcionalidade pela interação com seus respectivos receptores, Loram e

colaboradores (2007) demonstraram que a secreção de citocinas inflamatórias

(IL-1β, TNF-α, IL-6 e CINC-1) não coincide e não é essencial para o início da

hiperalgesia pós- operatória em ratos.

Ainda faltam estudos que definam de forma precisa o papel dos

receptores CXCR1/CXCR2 na cascata de mediadores envolvidos na resposta

induzida pelo LPS, mas diante dos resultados obtidos até então, podemos

sugerir que esses receptores são ativados nesta resposta e que promovem a

síntese/liberação de mediadores induzindo uma resposta febril prostaglandina-

mas não citocinas ou CRF- dependente.

______________________________________________________________Considerações Finais 90

6. Considerações Finais

 Os resultados obtidos mostram que:

 os receptores CXCR1 e CXCR2 para quimiocinas estão envolvidos na

resposta febril induzida pela administração endovenosa de LPS e pela

administração intracerebroventricular de seu agonista CINC-1;

 a administração endovenosa de LPS eleva a concentração de CINC-1 no

CSF, plasma e mais exacerbadamente no fígado e hipotálamo;

 o aumento de temperatura corporal induzido pela ativação central dos

receptores CXCR1/CXCR2 pela CINC-1 é característico de resposta

febril e não de hipertermia;

 a resposta febril induzida por essa ativação depende da síntese de

prostaglandinas formadas pela atividade da COX-2;

 a resposta febril induzida pela ativação desses receptores parece não

estar envolvida nas respostas desencadeadas por mediadores como IL-

1β, TNF-α, IL-6, CRF, PGF

2α

e PGE

Diante dos resultados obtidos até o momento, podemos concluir que:

LPS

CINC-1

CXCR1/R2

IL-1β, TNF-α, IL-6

PGE

Febre

_______________________________________________________________________Conclusões 92

7. Conclusões

Este conjunto de resultados indica que os receptores CXCR1/CXCR2

estão envolvidos na resposta febril induzida pelo LPS. Indica também que a

CINC-1 é um dos mediadores envolvidos nesta resposta e em uma via

dependente de PGE

, entretanto estes receptores não estão envolvidos na

febre induzida pelas citocinas estudadas, pelo CRF ou pelas prostaglandinas

PGF

2α

e PGE

__________________________________________________________Referências Bibliográficas 94

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