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Julcimary Ricci
Análise da ocorrência de elementos de transposição em regiões reguladoras dos
genes da família Cyp em espécies de Drosophila
São José do Rio Preto
2009
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Julcimary Ricci
Análise da ocorrência de elementos de transposição em regiões reguladoras dos
genes da família Cyp em espécies de Drosophila
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre em
Genética , junto ao Programa de Pós-Graduação
em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas da Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de
São José do Rio Preto.
Orientadora: Profª. Drª. Claudia Marcia Aparecida
Carareto
São José do Rio Preto
2009
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Ricci, Julcimary.
Análise da ocorrência de elementos de transposição em regiões
reguladoras dos genes da família Cyp em espécies de Drosophila/
Julcimary Ricci - São José do Rio Preto : [s.n.], 2009.
128 f. : il. ; 30 cm.
Orientadora: Claudia Marcia Aparecida Carareto
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Genética. 2. Genes Cyps. 3. Elementos de transposição. 4.
DNAREP1_DM. 5. resistência a inseticidas. 6. regulação da expressão
gênica. 7. grupo melanogaster I. Carareto, Claudia Marcia Aparecida.
II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas. III. Título.
CDU - 575
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE
Campus de São José do Rio Preto - UNESP
JULCIMARY RICCI
Análise da ocorrência de elementos de transposição em regiões reguladoras dos
genes da família Cyp em espécies de Drosophila
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre em
Genética , junto ao Programa de Pós-Graduação
em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas da Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de
São José do Rio Preto.
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Claudia Marcia Aparecida Carareto
Professor Titular
UNESP – São José do Rio Preto
Orientadora
Prof. Dr. Ricardo De Marco
Professor Doutor
USP – São Carlos
Prof. Dr. André Luís Laforga Vanzela
Professor Assistente Doutor
UEL – Londrina
São José do Rio Preto, 27 de Abril de 2009.
O presente trabalho foi realizado no Departamento de Biologia do Instituto
de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, da Universidade
Estadual Paulista, sob a orientação da Profa. Dra. Claudia Marcia Aparecida
Carareto, com bolsa de Mestrado da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo (FAPESP).
Dedico este estudo à meus pais Arlindo e Sonia, por me ensinarem a viver
honestamente, a enfrentar situações difíceis sempre com sinceridade e amor, a ser ter
humildade e sempre respeitar as pessoas, e por terem me dado a condição de poder chegar
até está etapa. As minhas irmãs Bel e Meire, pelo carinho, apoio e respeito em todos
momentos. Ao meu amor Fernando, pela compreensão, paciência, pela força e
principalmente pelo amor. A minha orientadora Profa. Claudia Carareto pela paciência e
pelo imenso aprendizado.
Obrigada!!!
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Claudia Carareto, pela oportunidade e confiança, pela
paciência e persistência, pela imensa dedicação, responsabilidade e honestidade em atuar como
orientadora, e pelo grande aprendizado.
À Dra. Cristina Vieira, pela colaboração no desenvolvimento deste trabalho, pelas
críticas e sugestões, e pelo aprendizado em tão pouco tempo de convivência.
À Profa. Dra. Lílian Madi-Ravazzi, pela realização dos bioensaios utilizados nas
análises populacionais.
Ao doutorando e colaborador deste projeto Ba. Fabrício Ramon Lopes, pela imensa
paciência, atenção e, principalmente, pelo aprendizado das técnicas de bioinformática.
Ao Prof. Dr. Luís Gustavo Galego, pela confiança, pelo enorme apoio e aprendizado
que desde a graduação tive o privilégio de receber, e pela oportunidade de chegar até aqui.
À Profa. Dra. Hermione Elly Melara de Campos Bicudo, pela sua imensa experiência
e dedicação como educadora e pesquisadora, pelo amor com que nos ensina e pelo exemplo de
como ser uma pessoa elegante, respeitando a todos independentemente de sua posição.
À Profa. Dra. Lílian Castiglioni, pelo incentivo, pelo exemplo de educadora e pelo
carinho que jamais esquecerei.
Aos meus queridos companheiros e amigos do Laboratório de Evolução Molecular, onde
trabalhamos muito, aprendemos bastante, mas também demos muita risada. Foram com eles que
passei a maior parte dos meus dias nestes últimos anos. Ao Luis Gustavo, Fabrício, Nathalia,
Adriana, Leliane, Elaine, Lílian e Elias, meu muito obrigada pelo aprendizado, pelo apoio, pela
amizade, carinho e principalmente pela força.
Aos colegas, Marina, Marcelo, Márcia, Lílian, Hederson e Maza que tive o privilégio
de conhecer e conviver durante esse período de pós-graduação e, principalmente, a duas pessoas
especiais, Mariana e Leiza, pelo apoio, força, amizade e pelas risadas.
Ao meu avô Walter e a minha avó Tercília, por serem exemplo de pessoas honestas e
fortes, pelo amor e dedicação, e por serem os responsáveis por nossa grande família, cheia de
união, amor, paz e amizade; coisa rara de ser ver nos dias de hoje. É isso que me faz feliz!
A todos meus tios, tias, primos, primas (são muitos) e pelos irmãos na fé, pelo apoio,
força, incentivo e principalmente pelo amor de todos, que me levantou em cada dificuldade.
À minha tia Cláudia em especial, pelo exemplo de força, de fé, de pessoa batalhadora e
humilde que venceu mais uma etapa muito difícil em sua vida, sempre com muito ânimo, alegria
e coragem.
Ao meu amor Fernando, pessoa maravilhosa que Deus colocou em minha vida e que tem
sido a minha alegria. Agradeço pela paciência, pela força, pelas palavras de apoio e conforto e
pelo seu imenso amor, que me ajudou a vencer essa etapa difícil da minha vida.
As minhas irmãs Bel e Meire, e ao Leandro pelo apoio constante, paciência, força, ajuda
e pelo amor e respeito em todo esse processo.
Aos meus pais, Arlindo e Sonia, que sempre me ofereceram oportunidades únicas,
como a realização desse estudo. Pais unidos, um lar abençoado com muita paz, amor e
carinho! Exemplo de pessoas honestas, humildes, e que passaram por muitas batalhas e
venceram a todas, sempre juntos. Agradeço pela imensa paciência, pelo apoio e por sempre
me darem forças quando tudo parecia não ter saída! Obrigada meus queridos pais por me
ensinarem sempre o caminho certo!!! Deus sempre continuará vos abençoando!!!
Amo vocês!!!
A Deus, minha eterna gratidão por ter iluminado meus passos em todos os dias da minha
vida. Pelo amor, pela força, pela saúde, pelo ânimo, pela alegria nas horas de angústia, por
ser minha condição em cada etapa. Por aprender a retribuir aquele que te afligir sempre
com amor e humildade.
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original.
Procure ser um homem de valor, em vez de ser um homem de sucesso”
(Albert Einstein)
“O mundo pirou, enlouqueceu. Agora amor é cafona, sinceridade é careta, pudor é
ridículo e sentimento é bobagem. Roubar pode, envelhecer não. A sociedade só
pensa em imagem, estética medidas e beleza. Não importa os sentimentos, a
ajuda, a amizade, não importa o outro”
(Herbert Vianna)
Respeitar as opções do outro em qualquer aspecto, é uma das maiores virtude que
um ser humano pode ter. As pessoas são diferentes, agem diferente e pensam
diferente. Nunca Julgue, apenas compreenda.
Respeito é bom sempre.
"Aquilo que não nos mata, torna-nos mais fortes"
(Friedrich Wilhelm Nietzsche)
“Estou convencido das minhas próprias limitações e esta convicção é minha força”
(Mahatma Gandhi)
“Um homem cheio de si é sempre vazio”
(Pégismanet)
RESUMO
A resistência aos inseticidas é um modelo de processo evolutivo onde o inseticida atua como
agente seletivo e, como resposta à seleção, ocorre a evolução da resistência nas populações de
insetos. As enzimas citocromo P450 monooxigenases (CYP) formam uma família responsável
pela resistência aos inseticidas. Tem sido proposto que a inserção de elementos transponíveis
(TEs) em regiões reguladoras ou codificadoras dos genes da família Cyp pode alterar a
expressão gênica e induzir a resistência aos inseticidas. No presente estudo foram realizadas
análises in silico que permitiram identificar a ocorrência de inserções de fragmentos de TEs
em 35 genes Cyps com diferentes funções, e em seus genes flanqueadores, em Drosophila
melanogaster e D. simulans, além de 13 genes Cyps de seis espécies do grupo melanogaster
de Drosophila. As inserções de TEs ocorreram principalmente nas regiões flanqueadoras 5´
dos Cyps associados à resistência aos inseticidas e à função monooxigenase geral. Os
resultados não indicaram qualquer relação entre a distância em relação ao gene e o número de
inserções. As análises mostraram que a maioria das inserções pertence à classe de transposons
de DNA, sendo o transposon DNAREP1_DM o que apresentou o maior número de cópias. O
fato de essas seqüências apresentarem putativos sítios de ligação de fatores de transcrição
sugere que possam desempenhar algum papel na regulação dos genes Cyps. Também foi
analisada a ocorrência de polimorfismos de inserção de TEs em regiões flanqueadoras de
genes da família Cyp, em diferentes linhagens geográficas resistentes e suscetíveis, de D.
melanogaster e D. simulans. Análises evidenciaram a presença de polimorfismo
interpopulacional de tamanho das regiões flanqueadoras dos genes Cyp6w1, Cyp6a2 e
Cyp12d1, porém, não indicaram ocorrência de associação entre a presença de TEs e a
resistência aos inseticidas. Os resultados também mostraram que a inserção de TEs nas
proximidades dos genes Cyps associados à resistência é diferencial entre as seis espécies do
grupo melanogaster, não seguindo a proporção genômica de TEs em cada espécie, o que
também sugere que esses TEs possam desempenhar um papel adaptativo nessas espécies.
Palavras-chave: Cyps. elementos de transposição. DNAREP1_DM. regulação da expressão
gênica. resistência aos inseticidas. grupo melanogaster.
ABSTRACT
Insecticide resistance is a model of evolutionary process where the insecticide acts as the
selective agent and resistance in the insect populations evolves as an answer to selection.
Cytochrome monooxygenases (CYP) is family of enzymes responsible for the insecticide
resistance. It has been proposed that insertion of transposable elements (TEs) in regulatory or
coding regions of the Cyp genes can alter gene expression and induce insecticide resistance.
In the present study in silico analyses allowed identifying the insertion of TE fragments in 35
Cyp genes with different functions, in Drosophila melanogaster and D. simulans, as well as in
13 Cyps of six species of the melanogaster group of Drosophila. The TE insertions occurred
mainly in the 5´ flanking regions of Cyp genes associated to resistance and to those with a
general monooxygenase function. The results did not indicate any relationship between the
number of insertions and the distance in relation to the gene. The analyses showed that most
of the insertions belong to the DNA transposon class, being DNAREP1_DM the most
numerous. Since this element carry putative biding sites of transcription factors it can be
suggested they play same role in gene regulation. The polymorphism of TE insertions in the
flanking regions of Cyp6w1, Cyp6a2 and Cyp12d1, genes associated to resistance, found in
resistant and as well as in susceptible geographical strains of D. melanogaster and D.
simulans, does not indicate any relationship between the presence of TEs in those regions and
the insecticide resistance. The results also showed that the insertions of TEs in the proximities
of the Cyps associated to resistance is differential among six species of the melanogaster
group, not following the genomic proportion of TEs in each species. These results also
suggest that TEs inserted in the Cyp flanking regions can carry out an adaptive role for those
species.
Keyswords: Cyps. transposable elements. DNAREP1_DM. gene expression regulation.
insecticide resistance. melanogaster group.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL 13
1.1
Ocorrência e atuação dos elementos transponíveis no
14
1.2 Relação dos elementos transponíveis com resistência a inseticidas
17
2 CAPÍTULO I 21
2.1 INTRODUÇÃO 22
2.2 OBJETIVOS 26
2.3 MATERIAL E MÉTODOS 27
2.3.1 Análises in silico
27
2.3.2 Análises populacionais
28
2.3.2.1 Espécies
28
2.3.2.2 Amostras de DNA e reação de PCR
29
2.3.2.3 Clonagem e seqüenciamento
30
2.3.2.4 Análise das seqüências
30
2.4 RESULTADOS 32
2.4.1 Inserções de TEs em genes Cyps com funções distintas
32
2.4.2 Distribuição de TEs em regiões intergênicas e gênicas dos genes Cyps e seus
flanqueadores
37
2.4.3 Ocorrência de inserções de TEs em regiões flanqueadoras distantes em até
3kb do gene
39
2.4.4 Distribuição das classes e ordens de TEs nas regiões intergênicas
44
2.4.5 Ocorrência do elemento DNAREP1_DM em genes Cyps e em seus
flanqueadores em D. melanogaster e D. simulans
e
D. melanogaster e D. simulans
46
2.4.6 Investigação da presença de sítios de ligação de fatores de transcrição (FTs)
nas cópias do DNAREP1_DM dos genes Cyps
51
2.4.7 TEs em regiões flanqueadoras de genes Cyps em linhagens resistentes e
suscetíveis de D. melanogaster e D. simulans
55
2.5 DISCUSSÃO 60
2.5.1 Inserção de TEs em genes Cyps e seus flanqueadores
61
2.5.2
Inserção do elemento DNAREP1_DM
63
2.5.3 Análises de seqüências de TEs em regiões flanqueadoras de genes Cyps em
linhagens de D. melanogaster e D. simulans resistentes e suscetíveis a
inseticidas
64
2.6 CONCLUSÃO 65
REFERÊNCIAS 66
APÊNDICE 73
SUMÁRIO
3 CAPÍTULO II 86
3.1 INTRODUÇÃO 87
3.2 OBJETIVOS 89
3.3 MATERIAL E MÉTODOS 90
3.3.1 Análises de Bioinfomática
90
3.3.2 Análises Evolutivas
92
3.4 RESULTADOS 93
3.4.1 Ocorrência de inserções de TEs em genes Cyps e em suas regiões
flanqueadoras 5’ e 3’ distantes até 3 kb do início da transcrição do gene
93
3.4.2 DNAREP1_DM e Helitron-1_Dyak: os TEs mais freqüentes nos Cyps
analisados nas espécies do grupo melanogaster
104
3.5 DISCUSSÃO 108
3.6 CONCLUSÃO 111
REFERÊNCIAS 112
4 DISCUSSÃO GERAL 117
5 CONCLUSÕES 121
REFERÊNCIAS 123
13
1 INTRODUÇÃO GERAL
Elementos de transposição (TEs) são seqüências de DNA medianamente repetidas
capazes de se movimentarem nos genomas. Encontrados na maioria dos organismos, foram
descobertos na década de 50 por Barbara McClintock (McCLINTOCK, 1957). Observando o
padrão de coloração dos grãos, em estudos realizados com milho, McClintock propôs que os TEs
agiam como “elementos controladores” da atividade gênica. Durante quase meio século, muitos
cientistas, por não conhecerem completamente a função desses elementos, os consideraram como
DNA egoísta ou parasita (DOOLITTLE; SAPIENZA, 1980; ORGEL; CRICK, 1980) ou mesmo
DNA lixo (OHNO; YOMO, 1991), pois imaginavam que os TEs agiam nos genomas apenas para
garantir sua sobrevivência. Contudo, estudos posteriores mostraram que essas seqüências também
podem ter efeitos positivos, gerando mutações e rearranjos cromossômicos que contribuem
significativamente para a evolução da estrutura e função gênica e do genoma de várias espécies
(BROSIUS, 1999; MAKALOWSKI, 2000; 2003; KIDWELL, 2002; LORENC;
MAKALOWSKI, 2003; KIDWELL; HOLYOAKE, 2001; FONTANILLAS et al., 2007).
Os TEs foram classificados inicialmente por Finnegan (1989) que, de acordo com seu
modo de transposição, agrupou-os em duas classes: retrotransposons (classe I) e transposons de
DNA (classe II). Os elementos da classe I são aqueles que se transpõem via um RNA
intermediário (o qual é transcrito reversamente) pelo mecanismo “copy-and-paste”, gerando
assim, múltiplas cópias no genoma. Por outro lado, os elementos da classe II, denominados
transposons de DNA, apresentam atividade transposicional mediada pela transposase e se
movimentam pelo mecanismo “cut-and-paste”. Os elementos da classe I codificam algumas
proteínas, dentre elas a proteína do capsídio (GAG), a proteinase aspártico (AP), a integrase
(INT), a transcriptase reversa (RT), a RNAse (RH), a proteína do envelope (ENV) e a
endonuclease apurínica (APE). Os TEs da classe II codificam outras proteínas, tais como a
transposase (Tase), a tirosina recombinase (YR), a proteína de replicação A (RPA), a helicase
(HEL), a protease cisteína (CYP), a DNA polimerase B (POL) e a integrase C (C-INT).
Recentemente, Wicker et al. (2007) propuseram um sistema de classificação unificado para os
TEs, também com base em seu mecanismo de transposição, similaridades de seqüência e
características estruturais. Na nova classificação, mantiveram-se as duas classes já usuais
(retrotransposons e transposons de DNA), mas a classe II foi subdividida em duas subclasses.
14
Os retroelementos da classe I foram subdivididos em cinco ordens: de acordo com sua
estrutura, organização e filogenia da transcriptase reversa (RT). A ordem LTR (do Inglês: Long
Terminal Repeat), que apresenta como característica uma longa repetição terminal, sítio de
duplicação e domínios codificantes de proteínas (GAG e POL), foi subdividida em cinco
superfamílias: Copia, Gypsy, Bel-Pao, Retrovirus e ERV. A ordem DIRS, cujos componentes não
geram sítios de duplicação no local de inserção, é representada pelas superfamílias DIRS, Ngaro
e VIPER. A ordem PLE (Penelope-like elements) contém elementos que codificam apenas a
transcriptase reversa (RT) e a endonuclease (EN), contidos em apenas uma superfamília
(Penélope). As ordens LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) e SINE (Short Interspersed
Nuclear Elements), por sua vez, não apresentam LTRs. Os elementos LINE estão agrupados em
cinco superfamílias (R2, RTE, Jockey, L1 e I) e, os SINEs, em três (tRNA, 7SL RNA e 5sRNA).
As duas subclasses da classe II diferem quanto ao número de fitas de DNA cortadas
durante a excisão: na subclasse 1, as duas fitas são cortadas e, na subclasse 2, apenas uma fita é
cortada. A subclasse 1 é composta pela ordem TIR (do Inglês: Terminal Inverted Repeat), que
apresenta repetições terminais invertidas e sítio de duplicação no local de inserção no genoma, e
possui nove superfamílias (Tc1-Mariner, hAT, Mutator, Merlin, Transib, P, PiggyBac, PIF –
Harbinger, CACTA) e, pela ordem Crypton, com apenas uma superfamília (Crypton), cujos
transposons não possuem TIRs. A subclasse 2 é representada por duas ordens, com apenas uma
superfamília cada: Helitron (Helitron) e Maverick (Maverick). Os Helitrons não geram
duplicação no sítio alvo de inserção e apresentam um curto hairpin na extremidade 3’; enquanto
os elementos Maverick, por sua vez, possuem longas TIRs.
1.1 Ocorrência e atuação dos elementos transponíveis no genoma
Devido a sua capacidade de se replicarem aumentando o número de cópias, e de se
moverem para porções diferentes do genoma, os TEs constituem uma parcela representativa
(revisão em KIDWELL; LISCH, 2000; 2001; WICKER et al., 2007) e estão envolvidos na
evolução do tamanho dos genomas (PETROV, 2001; KIDWEL, 2002). Representam uma grande
parcela do genoma de plantas, alcançando cerca de 80 % em Zea mays (MEYERS et al., 2001);
15
dentre os animais, compreendem cerca de 45 % do genoma humano (VAN DE LAGEMAAT et
al., 2003; POLAVARAPU et al., 2008); 12 % do genoma do verme Caenorhabditis elegans
(GANKO et al., 2003); e, do genoma de Drosophila melanogaster 5,5 % (BERGMAN et al.,
2006), mas apenas 2,73 % em sua espécie críptica D. simulans (CLARCK et al., 2007).
A maior parte das inserções de TEs está localizada em regiões intergênicas, introns e
UTRs, possuindo desse modo maior chance de serem mantidas no genoma, pois, estão sob menor
pressão seletiva (KIDWELL, 2002; SELA et al., 2007; FONTANILLAS et al., 2007; YANG;
BARBASH, 2008). Segundo Jordan et al. (2003), inserções de TEs em regiões promotoras de
genes de mamíferos, próximas do sítio de início da transcrição do gene, são possivelmente
deletérias sendo, portanto, eliminadas por seleção. Por outro lado, quando inseridos em regiões
reguladoras, os TEs também podem afetar positivamente a expressão do gene, como também de
genes adjacentes, devido à introdução de elementos reguladores (CONTE et al., 2002; JORDAN
et al., 2003; THORNBURG et al., 2006). Em diversos TEs, foram identificadas seqüências que
atuam como sítios de ligação de fatores transcrição (TFBS), nas quais se ligam motivos
reguladores da expressão gênica (THORNBURG et al., 2006; ALMEIDA; CARARETO, 2006;
POLAVARAPU et al., 2008).
Os TEs podem também se inserir em regiões codificadoras de proteínas. Tem sido
mostrado que estas inserções, inicialmente deletérias, podem também ser mantidas por gerarem
mudanças adaptativas, caracterizando o evento de exaptação, ou domesticação (NEKRUTENKO;
LI, 2001; LORENC; MAKALOWSKI, 2003; LOPES et al., 2008). Três principais tipos de
inserções relacionadas a regiões codificantes são encontrados nos genomas, com diferentes
resultados evolutivos: 1) em introns próximos a um éxon, podendo posteriormente se tornar em
uma extensão do éxon; 2) em introns, de modo a se tornar um novo éxon, caracterizando um
evento de exonização; 3) diretamente nos éxons, podendo alterar a seqüência protéica e,
conseqüentemente, induzir a modificações no fenótipo. A Figura 1 ilustra os três tipos.
16
Figura 1. Inserção de TE em regiões codificantes de proteínas. Inserção do TE (a) em introns próximos a
um éxon, podendo se tornar extensão do éxon; (b) em introns, de modo a se tornar um novo éxon e (c)
diretamente no exon (elaborada por F. R. Lopes).
As inserções de TEs em regiões codificantes têm sido observadas preferencialmente em
nível transcricional, por serem possivelmente deletérias em nível protéico; como reportado em
humanos (NEKRUTENKO; LI, 2001; GOTEA; MAKALOWSKI, 2006; SELA et al., 2007),
vertebrados (LORENC; MAKALOWSKI, 2003), camundongo (SELA et al., 2007) e café
(LOPES et al., 2008). Entretanto, domesticação de TEs, isto é, manutenção de suas seqüências na
proteína tem sido também relatada (MILLER et al., 1999, BUNDOCK; HOOYAKAAS, 2005,
REISS et al., 2005; GOTEA; MAKALOWSKI, 2006). Desta maneira, os TEs podem ser
considerados fontes de variabilidade para o genoma, além de desenvolverem um importante papel
na evolução gênica e em sua regulação (revisão em KIDWELL; LISCH, 2000; MAKALOWSKI,
2000; JORDAN et al., 2003; VAN DE LAGEMAAT et al., 2003; GANKO et, al. 2003; 2006;
THORNBURG et al., 2006).
Dentre as 12 espécies de Drosophila que possuem o genoma seqüenciado, a porcentagem
de inserções de TEs varia de 2,73 % em D. simulans e 24,93 % em D. ananassae,
respectivamente as espécies com a menor e a maior porcentagem de TEs (CLARCK et al., 2007).
Dentre esses elementos, o transposon DNAREP1_DM é o mais abundante nesses 12 genomas,
apresentando centenas a milhares de cópias.
17
D. melanogaster e D. simulans diferem quanto à porcentagem genômica de TEs. Na
primeira espécie, a porcentagem é praticamente o dobro (5,35 %) do valor observado na segunda
(2,73 %). Nas duas espécies, os TEs têm sido associados à evolução da resistência aos inseticidas,
por estimularem a expressão de genes responsáveis pela resistência metabólica, ou mesmo, por
atuarem na geração de novas funções protéicas devido à alteração da estrutura gênica (DABORN
et al., 2002; AMINETZACH et al., 2005).
1.2 Relação dos elementos transponíveis com resistência aos inseticidas
A resistência aos inseticidas pode ser causada por mutações de ponto, amplificação gênica
e elevada transcrição. Mutações de ponto podem alterar as proteínas-alvo dos inseticidas,
impedindo a ligação do inseticida e, conseqüentemente, sua ação no organismo, gerando a
resistência (FFRENCH-CONSTANT et al., 1998; AMICHOT et al., 2004). Por outro lado, a
amplificação gênica aumenta o número de cópias dos genes e, conseqüentemente, sua expressão,
aumentando o número de proteínas-alvo dos inseticidas. A terceira causa da resistência se deve a
alteração da regulação dos genes envolvidos na resistência (revisão em LI et al., 2007). Essa via
se caracteriza pela ocorrência de alterações genômicas, como por exemplo, inserções de TEs, que
podem elevar a expressão dos genes codificadores das enzimas responsáveis pelo metabolismo
dos inseticidas (DABORN et al., 2002).
O metabolismo de xenobióticos, como os inseticidas, é composto por dois tipos de
reações enzimáticas (denominadas fases), as quais tornam o substrato mais solúvel em água,
facilitando assim sua eliminação. As enzimas de fase I (P450 monooxigenases) são responsáveis
pelo metabolismo oxidativo de muitos xenobióticos (biotransformação), enquanto que as de fase
II (glutationa-S-transferases - GSTs) agem como inativadoras dos produtos da fase I, tornando-os
passíveis de excreção. Nesta fase, ocorre a conjugação com um substrato endógeno por meio das
GSTs (conjugação). As enzimas P450 monooxigenases agem principalmente no fígado, contudo,
existe expressão por todo o organismo, incluindo intestino, túbulos de Malpighi, pulmões, rins e
corpo gorduroso (McCART; FFRENCH-CONSTANT, 2008; CHUNG et al., 2009).
18
Em geral, os inseticidas possuem uma ação que leva à mortalidade rápida, por serem
neurotóxicos. Os insetos podem apresentar resistência aos xenobióticos naturais (como
defensivos químicos produzidos pelas plantas), bem como, aos inseticidas sintéticos. A
resistência aos inseticidas envolve aumento no nível de metabolização das enzimas que
transformam o xenobiótico, reduzindo a sensibilidade ao inseticida para se ligar ao seu sítio-alvo
no sistema nervoso. Portanto, a detoxificação só é ativada se o inseticida não alcançar seu sítio
alvo, sendo metabolizado e degradado pelas enzimas CYP P450, caracterizando assim,
indivíduos resistentes (revisão em HEMINGWAY; RANSON, 2000; RANSON et al., 2002;
DABORN et al., 2002; revisão em LI et al., 2007). Dentre os genes codificadores de proteínas
relacionadas com a resistência metabólica aos inseticidas, por detoxificação de xenobióticos
(drogas e outros compostos), destacam-se aqueles codificadores de três famílias de enzimas
(carboxilesterases, glutationa-S-transferases e citocromo P450 monooxigenases).
O genoma de D. melanogaster tem aproximadamente 90 seqüências pertencentes à
família multigênica citocromo P450 monooxigenase (Cyps), sendo 83 genes ativos e sete
prováveis pseudogenes (TIJET et al., 2001). A família CYP possui genes envolvidos em uma
ampla variedade de processos biológicos, como no desenvolvimento do organismo (biossíntese
de hormônios ecdisona, juvenil e ferormônios) e no metabolismo de xenobióticos (inseticidas,
drogas, carcinógenos). O nome citocromo P450 é derivado do fato que estas são proteínas
celulares (cito) coloridas (cromo) com um pigmento com um comprimento de onda de 450 nm. A
reação mais comum catalisada pelo citocromo P450 é uma reação monooxigenase, que se
caracteriza pela inserção de um átomo de oxigênio em um substrato orgânico, enquanto o outro
átomo oxigênio é reduzido à água.
A nomenclatura usual para os genes da superfamília CYP é grafada em itálico e é
composta pelo prefixo Cyp seguido pelo número da família a qual ele pertence, uma letra que
indica a subfamília e por um número que representa o gene, por exemplo, Cyp6g1. Para a
designação da proteína, do RNAm ou cDNA, são utilizadas letras maiúsculas (CYP6G1).
Membros de uma mesma família compartilham mais de 40% de identidade na seqüência de
aminoácidos, enquanto que em subfamílias essa identidade corresponde a mais de 55% (revisão
em HEMINGWAY; RANSON, 2000; TIJET et al., 2001).
Dentre os genes Cyps associados à resistência aos inseticidas em D. melanogaster
destacam-se nove: Cyp4e2 (AMICHOT et al., apud CHEN; LI, 2007), Cyp6a2 (MAITRA et al.,
19
2000; PEDRA et al., 2004), Cyp6a8 (MAITRA et al., 2000), Cyp6a9 (MAITRA et al., 1996),
Cyp6g1 (DABORN et al., 2002; CATANIA et al., 2004; SCHLENKE; BEGUN, 2004), Cyp6w1
(PEDRA et al., 2004), e os Cyp12a4 (BOGWITZ et al., 2005), Cyp12d1 (BRANDT et al., 2002)
e Cyp308a1 (Gene Ontology). Muitos dos genes Cyps responsáveis pela detoxificação de
inseticidas em D. melanogaster, como por exemplo, o Cyp6g1 (DABORN et al., 2001, BRANDT
et al., 2002) e o Cyp12d1 (BRANDT et al., 2002) estão localizados no loco Rst(2)DDT, ou DDT-
R (DABORN et al., 2001).
Estudos realizados com espécies de Drosophila têm associado à resistência aos
inseticidas, a superexpressão de genes Cyps, em decorrência da inserção de fragmentos de
elementos de transposição em suas regiões reguladoras ou mesmo dentro dos genes. A inserção
do elemento Accord a 291 pb antes do sitio de início de transcrição do gene Cyp6g1 em D.
melanogaster (DABORN et al., 2002; CATANIA et al., 2004; CHUNG et al. 2007), do elemento
Doc no gene ortólogo ao Cyp6g1 em D. simulans (SCHLENKE; BEGUN, 2004) e do transposon
de DNA Bari1 na região 3’ do gene Cyp12a4 (MARSANO et al., 2005; BOGWITZ et al., 2005),
são alguns exemplos. Essa associação, contudo, não está completamente caracterizada, visto que
tem sido relatado que em algumas linhagens susceptíveis, que apresentam a inserção de Accord, a
expressão do Cyp6g1 também é aumentada (SCHLENKE; BEGUN, 2004; FESTUCCI-
BUSELLI et al., 2005; KURUGANTI et al., 2007). A relação entre a inserção de elementos
transponíveis em genes associados à resistência aos inseticidas e a conseqüente evolução da
resistência é um problema atual não solucionado, que merece, portanto, ser investigado. Neste
trabalho, duas estratégias foram utilizadas para se investigar essa questão. A primeira foi
investigar in sílico, a ocorrência de inserções preferenciais de TEs em genes Cyps associados ao
metabolismo de xenobióticos e, assim, inferir sua relação com a origem da resistência aos
inseticidas em espécies de Drosophila do grupo melanogaster, com foco em D. melanogaster e
D. simulans. A outra foi analisar, nessas duas espécies, a ocorrência de polimorfismos de
inserção de TEs nas regiões intergênicas ou codificantes de genes Cyps em linhagens susceptíveis
e resistentes a inseticidas, e avaliar se há correlação positiva entre a inserção dos TEs e a
resistência. O conhecimento dos processos associados à evolução da resistência aos inseticidas e
aos xenobióticos tem importância científica, como também, econômica e de saúde pública.
Esclarecer o papel dos elementos transponíveis nesse processo é, portanto, uma questão que
merece ser investigada.
22
2.1 INTRODUÇÃO
A análise do tema resistência aos inseticidas é de particular interesse, visto que o uso
destes compostos, em lavouras e centros urbanos, no controle de pragas, tem aumentado
consideravelmente nas últimas décadas. Essa resistência pode ser causada por mutações de ponto,
amplificação gênica e elevada transcrição. Mutações de ponto podem alterar as proteínas-alvo
dos inseticidas, impedindo a ligação do inseticida e, conseqüentemente, sua ação no organismo,
gerando a resistência (FFRENCH-CONSTANT et al., 1998; AMICHOT et al., 2004). Por outro
lado, a amplificação gênica aumenta o número de cópias dos genes e, conseqüentemente, sua
expressão, aumentando o número de proteínas-alvo dos inseticidas. A terceira causa da
resistência se deve à alteração da regulação dos genes envolvidos na resistência. Essa via se
caracteriza pela ocorrência de alterações genômicas, as quais elevam a expressão dos genes
codificadores das enzimas responsáveis pelo metabolismo dos inseticidas (revisão em LI et al.,
2007). Dentre os genes codificadores de proteínas relacionadas com a resistência metabólica aos
inseticidas, por detoxificação de xenobióticos (drogas e outros compostos), destacam-se aqueles
codificadores de três famílias de enzimas (carboxilesterases, glutationa-S-transferases e
citocromo P450 monooxigenases). Neste estudo focamos a análise de genes que compõem a
família das citocromo P450 monooxigenases (CYP).
O genoma de D. melanogaster tem aproximadamente 90 genes Cyps, sendo 83 genes
ativos e sete prováveis pseudogenes (TIJET et al. 2001). A família CYP possui genes envolvidos
em uma ampla variedade de processos biológicos, como no desenvolvimento do organismo
(biossíntese de hormônios ecdisona, juvenil e ferormônios) e no metabolismo de xenobióticos
(inseticidas, drogas, carcinógenos). Dentre os genes Cyps associados à resistência aos inseticidas
em D. melanogaster destacam-se nove: Cyp4e2 (AMICHOT et al., apud CHEN; LI, 2007),
Cyp6a2 (MAITRA et al., 2000; PEDRA et al., 2004), Cyp6a8 (MAITRA et al., 2000), Cyp6a9
(MAITRA et al., 1996), Cyp6g1 (DABORN et al., 2002; CATANIA et al., 2004; SCHLENKE;
BEGUN, 2004), Cyp6w1 (PEDRA et al., 2004), e os Cyp12a4 (BOGWITZ et al., 2005),
Cyp12d1 (BRANDT et al., 2002) e Cyp308a1 (Gene acesso FBgn0030949). Em seis deles, a
resistência aos inseticidas (a mais do que um composto), de maneira geral, está associada à
elevada transcrição gênica, tais como o Cyp6g1 (DDT, imidaclopride, malathion, nitenpyram,
23
dicyclanil, acetamipride, regulador de crescimento lufenuron), Cyp6g2 (diazinon, nitenpyram),
Cyp6a2 (DDT, malathion), o Cyp6a8 (imidaclopride, ácido láurico), o Cyp12a4 (lufenuron), e o
Cyp12d1 (DDT, dicyclanil) (DABORN et al., 2002; 2007; LE GOFF et al., 2003; AMICHOT et
al., 2004; HELVIG et al., 2004; BOGWITZ et al., 2005).
Diversos estudos têm associado à resistência aos inseticidas em Drosophila à inserção de
elementos de transposição em genes Cyps. Inserções de TEs próximas aos sítios de início da
transcrição dos genes são possivelmente deletérias sendo, portanto, eliminadas por seleção
(JORDAN et al., 2003); entretanto, quando inseridos em regiões reguladoras, podem afetar a
expressão do gene, como também de genes adjacentes, devido à introdução de motivos
reguladores da transcrição (CONTE et al., 2002; JORDAN et al., 2003; THORNBURG et al.,
2006).
Daborn et al. (2002) relataram que a resistência aos inseticidas, mapeada no loco DDT-R
de D. melanogaster, se deve a superexpressão de um único gene P450, o Cyp6g1, e que um alelo
relacionado à resistência tem sido distribuído globalmente. Esse alelo, ao contrário dos diversos
relacionados à resistência, não é caracterizado por uma mutação de ponto, mas sim, pela inserção
de 491 pb do elemento transponível Accord a 291 pb antes do sítio de início de transcrição do
gene. Essa associação resulta em elevada expressão do Cyp6g1 (DABORN et al., 2002;
CATANIA et al., 2004; CHUNG et al. 2007). Schlenke e Begun (2004) reportaram a associação
entre inserção de um TE e a resistência aos inseticidas em D. simulans. Nessa espécie, o elemento
Doc está inserido na região anterior ao ortólogo Cyp6g1 de D. melanogaster, e também está
associado a superexpressão desse gene. Também Marsano et al. (2005), e Bogwitz et al. (2005),
sugeriram que a presença do transposon de DNA Bari1 na região 3’ do gene Cyp12a4 de D.
melanogaster eleva a expressão desse gene. Esses trabalhos associam a inserção dos TEs à
superexpressão dos genes Cyps e à resistência aos inseticidas. No entanto, estudos posteriores não
corroboram essa relação, pois algumas linhagens suscetíveis de D. melanogaster, também
continham o elemento Accord inserido na região flanqueadora do gene Cyp6g1 e apresentavam,
da mesma forma, elevada expressão desse gene (SCHLENKE; BEGUN, 2004; FESTUCCI-
BUSELLI et al., 2005; KURUGANTI et al., 2007). Esses resultados indicam que existe
associação entre a inserção do TE e o aumento da expressão gênica, mas não necessariamente a
alta expressão desses genes está associada à resistência aos inseticidas e, que o fenótipo para
resistência é um fenômeno complexo, que pode ser poligênico e determinado por diversos
24
fatores, dentre eles, a inserção de um TE, como a do elemento Accord na região 5’ do gene
Cyp6g1 (KURUGANTI et al., 2007).
A investigação do papel adaptativo da inserção de TEs em genes Cyps foi também
realizada por meio de análises in silico. Recentemente, Chen e Li (2007), pesquisando o genoma
de D. melanogaster, analisaram a inserção de TEs em oito genes Cyps associados à resistência
aos inseticidas e em um gene Gst (Gstd1), responsável pela detoxificação de xenobióticos e, em
cinco genes Cyps relacionados à biossíntese de ecdisona e à regulação do desenvolvimento
(Cyp302a1, Cyp306a1, Cyp307a1, Cyp314a1, Cyp315a1). Sete dos oito Cyps relacionados com a
resistência aos inseticidas possuíam inserções de TEs (Cyp6a9 foi o único gene Cyp que não
possuía TEs). Por outro lado, todos os Cyps relacionados à biossíntese de ecdisona e ao
desenvolvimento em D. melanogaster não apresentaram TEs inseridos nas regiões intergênicas
5´ou 3´. Chen e Li (2007) explicaram as diferenças observadas pelo fato que genes envolvidos
em respostas ambientais como o estresse, e o metabolismo de xenobióticos, tendem a ser mais
tolerantes a mudanças genômicas causadas pela inserção de TEs e, assim, apresentarem maior
número de inserções (VAN DE LAGEMAAT et al., 2003). Essas mudanças podem alterar a
regulação desses genes e, conseqüentemente, aumentar sua expressão, conferindo a resistência
aos inseticidas via elevada expressão (revisão em LI et al., 2007), visto que os TEs podem afetar
a transcrição de genes por conterem elementos reguladores em suas seqüências (SCHLENKE;
BEGUN, 2004). Entretanto, genes com funções básicas essenciais para o desenvolvimento, são
altamente conservados, estando sob uma forte seleção negativa contra inserções de TEs (VAN
DE LAGEMAAT et al., 2003; LOWE et al., 2007).
Em decorrência da inserção preferencial de TEs em genes Cyps relacionados à
detoxificação de xenobióticos, Chen e Li (2007) concluíram que os TEs podem ser seletivamente
enriquecidos em genes relacionados a respostas ambientais a xenobióticos, mas relativamente
excluídos de genes essenciais housekeeping, resultando em maior plasticidade genômica nos
primeiros, e maior conservação nos últimos. Tais mudanças genômicas seriam vantajosas para
organismos, tais como os insetos, que apresentam alto grau de plasticidade genética que os
habilita a co-evoluir com seus ambientes altamente variáveis e seletivos.
Drosophila melanogaster e sua espécie críptica D. simulans são as principais espécies do
gênero Drosophila utilizadas em estudos sobre a associação entre inserções de TEs e a resistência
aos inseticidas. Embora estreitamente relacionadas, essas espécies apresentam diferenças
25
relevantes quanto ao grau de diferenciação genética entre as populações (MORIYAMA;
POWELL, 1996), variação nas seqüências de DNA (AQUADRO et al., 1988; MARTIN-
CAMPOS et al., 1992) e variação protéica (CHOUDHARY; SINGH, 1987). Outros dois aspectos
importantes, e altamente relacionados ao presente estudo, dizem respeito à resposta diferencial
dessas espécies sob a seleção a inseticidas (WALLACE, 1986; WINDELSPECHT et al., 1995) e
o número e tipos de elementos transponíveis presentes em seus genomas. De acordo Vieira et al.
(1999), D. melanogaster apresenta o triplo de TEs (15 %) que D. simulans (5 %), sendo que as
proporções de TEs nas regiões eucromáticas correspondem, respectivamente a 5,35 % e 2,73 %
(BERGMAN et al., 2006, CLARCK et al., 2007).
Em face das características particulares de D. melanogaster e D. simulans, acima
mencionadas, neste estudo visamos reavaliar in silico, e em estudos populacionais, a questão da
inserção preferencial de TEs em genes associados à resistência aos inseticidas, ampliando o
número de genes já estudados. As análises in silico foram realizadas em 35 genes Cyps, dentre
eles nove genes associados à resistência, 20 com função monooxigenase ainda não especificada e
seis relacionados ao desenvolvimento, estando envolvidos na biossíntese de ecdisona.
Adicionalmente, foram analisados os genes flanqueadores desses Cyps, tanto em D.
melanogaster, como em D. simulans. As análises populacionais foram realizadas em linhagens de
D. melanogaster e de D. simulans, suscetíveis e resistentes a inseticidas, procedentes de
diferentes regiões geográficas.
26
2.2 OBJETIVOS
Para avaliar a existência de possíveis associações entre a presença de TEs e a resistência
aos inseticidas em D. melanogaster e D. simulans, e comparar as duas espécies quanto a essa
característica, os objetivos específicos deste estudo foram os seguintes:
1. Verificar se há inserção preferencial de TEs em regiões intergênicas e gênicas de genes Cyps
com funções distintas, comparados aos seus genes flanqueadores nas extremidades 5’ e 3’.
2. Relacionar o número de inserções de TEs com o tamanho da região intergênica dos genes
estudados;
3. Verificar se os TEs se inserem preferencialmente em regiões promotoras;
4. Analisar, em populações naturais de D. melanogaster e D. simulans, possíveis polimorfismos
de inserção de TEs, nas regiões flanqueadoras 5´ e 3´ dos genes Cyps, selecionados a partir da
análise in silico, como potenciais candidatos a apresentarem inserções diferenciais entre
linhagens resistentes e suscetíveis a inseticidas nas duas espécies.
27
2.3 MATERIAL E MÉTODOS
2.3.1 Análises in silico
Neste trabalho foram estudados 35 genes Cyps e seus genes flanqueadores, nos genomas
de D. melanogaster e D. simulans. Estes genes foram selecionados após uma busca na literatura
por genes Cyps associados à resistência aos inseticidas, e também por outros Cyps que se
localizam próximos aos primeiros, em Drosophila e outros insetos. Para a análise, foram
utilizados o genoma seqüenciado de D. melanogaster (versão 5.5:
ftp://ftp.flybase.net/releases/FB2008_01/dmel_r5.5/fasta/) e o assembly mosaico, correspondente
a diferentes linhagens geográficas de D. simulans, cujas seqüências dos braços cromossomais 2L,
2R, 3L, 3R, 4, X e a parte não agrupada (chamada de U) correspondem a primeira versão do
genoma de D. simulans, disponível no sítio ftp do Genome Sequencing Center da Washington
University Medical School (ftp://ftp.flybase.net/releases/FB2008_01/dsim_r1.0/fasta/)
.
Modelos gênicos estão disponíveis tanto no genoma de D. melanogaster (13.733 genes)
quanto em D. simulans (15.983) entretanto, apenas o primeiro apresenta seus genes
extensivamente anotados e depositados no LocusLink (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
query.fcgi.db=gene). Assim, a identificação dos genes da família Cyp nos dois genomas foi
obtida por meio das coordenadas genômicas em D. melanogaster e por meio de comparações por
BLASTN (ALTSCHUL et al. 1990) entre as seqüências completas dos genes Cyps de D.
melanogaster contra D. simulans, com os parâmetros com E = e-0.5, V = 10000, B = 10000.
Após levantamento da localização genômica de cada gene Cyp, foram extraídas suas seqüências e
de seus genes flanqueadores, além das regiões intergênicas 5’ e 3’. Essas seqüências foram
utilizadas como fonte de dados para avaliação da ocorrência de fragmentos de elementos de
transposição nas regiões intergênicas 5’ e 3’ e para uma análise comparativa dos resultados
obtidos para os genes Cyps, e seus flanqueadores. A contagem das inserções dos genes
flanqueadores foi realizada na região intergênica não comum ao Cyp. Como controle, foi
realizada uma busca por inserções de TEs em uma amostra de 70 genes não Cyps selecionados
aleatoriamente nos genomas de ambas as espécies.
28
A identificação de elementos de transposição nesses genes, e suas respectivas regiões
intergênicas 5’ e 3’, foi realizada pelo programa RepeatMasker (RM) versão 3.1.9
(http://www.repeatmasker.org), com a ferramenta de alinhamento Cross_match versão 0.990329
(pacote Phrap/cross_match/swat: http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html) contra o banco
de seqüências de TEs de referência do gênero Drosophila oriundas do Repbase (JURKA et al.,
2005). Para eliminar resultados espúrios, somente escores de matches RM > 225 foram aceitos,
condições de procura de maior sensibilidade/menor velocidade (condição “-s”), matriz relativa ao
conteúdo GC do query (“-gccalc”) e seqüências de DNA de baixa complexidade não foram
mascaradas (“-nolow”). Foram considerados todos os alinhamentos registrados pelo
RepeatMasker para análises posteriores sem imposição de escores adicionais e comprimento
mínimo. Sequências do mesmo elemento que estavam separadas em até 200 pb, foram
consideradas como sendo apenas uma cópia. A avaliação da significância das diferenças entre
número de inserções entre as regiões 5’ e 3’, foi realizada por meio do teste do x
2
.
Foi ainda realizada uma predição de putativos sítios de ligação de fatores de transcrição,
nas cópias do elemento DNAREP1_DM, utilizando a ferramenta Alibaba2 (GRABE, 2002). Este
programa consiste em alinhar a seqüência de entrada com uma seqüência já conhecida do banco
de dados. Para o parâmetro de conservação da matriz foi utilizado o padrão do programa (75 %
de conservação) e para o parâmetro de similaridade da seqüência analisada com a matriz foi
utilizada a opção 100 %, o que significa que a seqüência de entrada apresenta praticamente os
mesmos nucleotídeos da seqüência da matriz.
2.3.2 Análises populacionais
2.3.2.1 Espécies
Foram analisadas nove linhagens de D. melanogaster e 10 de D. simulans, classificadas
como resistentes ou suscetíveis ao DDT por meio de bioensaios realizados por Granzotto 2007
(Tabela 1).
29
2.3.2.2 Amostras de DNA e reação de PCR
O DNA genômico foi extraído de 30 indivíduos de cada linhagem (DANIELS;
STRAUSBAUGH, 1986, com modificações). Foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores
que amplificam fragmentos das regiões flanqueadoras 5’ ou 3´ dos genes Cyps selecionados a
partir da análise in silico (Tabela 2). As reações de PCR foram ajustadas para cada seqüência a
partir das seguintes condições padrões: 200 ng de DNA genômico, 0.4 mM de cada dNTP, 2 mM
de MgCl
2
, 0.4 µM de cada iniciador, 1 U de Taq Platinum DNA polimerase (Invitrogen) em
tampão 1X, completando-se com água ultrapura até o volume final de 25 µL. A ciclagem constou
de 3 minutos a 94 °C para desnaturação inicial; e 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 65
°C, 3 minutos a 72 °C, finalizando com um ciclo de 10 minutos a 72 °C para extensão final.
Como controle negativo foi utilizada água ultrapura. Os fragmentos amplificados foram
separados por eletroforese (90 volts durante 35 minutos) em gel de agarose 1 % preparado com
tampão TAE 0,5x e, em seguida, corado com brometo de etídeo e visualizado sob luz ultravioleta.
Tabela 1. Espécies e linhagens analisadas, características quanto à resistência (R) ou suscetibilidade
(S), procedências geográficas e ano da coleta.
Espécies Linhagens
R/S Procedência Geográfica Coletor/Ano de Coleta
D.melanogaster
SE
S
Aracaju/SE
Taline B. Pínula/2004
LE
R
Lençóis/BA
Maura H. Manfrin/2005
MU
R
Mucuri/BA
Maura H. Manfrin/2005
ITA
R
Itaúnas/ES
Maura H. Manfrin/2005
RP
R
São José do Rio Preto/SP
Lilian Madi
-
Ravazzi/2005
BG
R
B
ento Gonçalves/RS
Gladis F. da Cunha/2006
SM
R
Santa Maria/RS
Paulo R. P. Hoffman /2005
TAV
R
Tavares/RS
Paulo R. P. Hoffman/2005
Canton
-
S
S
Laboratório Padrão
-
D. simulans
LE
S
Lençóis/BA
Maura H. Manfrin/2005
MU
S
Mucuri/BA
Maura H. Manfr
in /2005
ITA
S
Itaúnas/ES
Maura H. Manfrin /2005
PF
R
Paulo de Faria/SP
Leiza Penariol /2005
OV
R
Onda Verde/SP
Adriana Granzotto/2005
RAT
R
Ratones/SC
Paulo R. P. Hoffman /2005
BG
R
Bento Gonçalves/RS
Gladis F. da Cunha /2006
AMI
S
Amieu/Nova
Caledonia
Cristina Vieira/2005
MAK
S
Makindu/África
Cristina Vieira/2005
MAD
S
Madagascar
Cristina Vieira/2005
30
Tabela 2 Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores e tamanho esperado dos fragmentos (pb)
amplificados de genes da família Cyp relacionados à resistência aos inseticidas.
Genes Primer Forward Primer Reverse pb
Cyp6w1_5’_Dm
5´ TCGGTGTGCCATCCAGGTTATACT 3´ 5´ TGCTACATTAGGGACACCCAACCT 3´
670
Cyp6w1_5’_Ds
5´ TCGGTGGCACTCCAGGTTATAGTT 3´ 5´ TTTGGGCGTCTTTGGAATCTGC 3´
1024
Cyp6w1_3’_Ds
5´ AGATGTGGCACCGATTTGGTTGTC 3´ 5´ GCATTCAACATGACACGGCCAAGA 3´
923
Cyp6a2_5’_Dm
5´ CATTCGAAAGCAATGTCGCGTAGT 3´ 5´ TCTTCTCGTCGGGCGCTTCATTAT 3´
896
Cyp6a2_5’_Ds
5´ CCAAACTTGGTTTGTCGGCTTATCTG 3´ 5´ CCCGGCACAAATGCACATCCTAAT 3´
1035
Cyp6a2_3’_Ds
5´ TCCAATTTACGCGTGACAAGCCAG 3´
5´ TTTCGCAAATGTCAATGCCTCCGC 3´
834
Cyp4e2_5’_Dm
5´ CGGAAGAACAACGAACAGAATAATGCCG 3´ 5´ TTCTGTTCCGCTCCGTCACGTTT 3´
427
Cyp12d1_5’_Dm
5´ AATCGCCGTGAATTGCCTACCTCA 3´ 5´ AGATGCTAGAACTCTGGAGATGCC 3´
636
Cyp12a4_3’_Dm
5´ GATCAACTTGCCAAACATTCCGCTC 3´ 5´ GGACTGGCTCAATGGTATCACAAC 3´
1852
2.3.2.3 Clonagem e seqüenciamento
A maioria dos fragmentos com polimorfismo de tamanho entre as linhagens geográficas
suscetíveis e resistentes de D. melanogaster e D. simulans, obtidos a partir da PCR foram
diretamente purificados usando o Kit GFX
TM
PCR DNA and Gel Band Purification (GE
Healthcare), e seqüenciados. Outros fragmentos foram extraídos do gel de agarose, purificados e,
posteriormente, clonados com o kit TOPO
XL Cloning (Invitrogen), segundo as especificações
do fabricante, e seqüenciados.
2.3.2.4 Análise das seqüências
As seqüências obtidas foram analisadas com auxílio dos programas BioEdit (HALL,
1999), BLAST (ALTSCHUL et al., 1990), BLAST 2 sequences (TATUSOVA; MADDEN, 1999)
e alinhadas com o ClustalW (THOMPSON et al., 1994). O programa RepeatMasker foi utilizado
para identificar elementos transponíveis nas seqüências obtidas, visando detectarem-se inserções
de TEs em regiões regulatórias dos genes.
31
Para análise do polimorfismo dos TEs inseridos mais freqüentemente nas regiões
flanqueadoras seqüenciadas dos genes Cyps, foi estimada a diversidade nucleotídica (π) (NEI;
KI, 1979), como implementado pelo programa DnaSP versão 4.10.9. (ROZAS et al., 2003).
32
2.4 RESULTADOS
A família multigênica Citocromo P450 monooxigenases possui 90 genes no genoma de
D. melanogaster, os quais desempenham diferentes funções biológicas (DABORN et al., 2007;
McCART; FFRENCH-CONSTANT, 2008). Segundo Chen e Li (2007), dentre os Cyps com
funções já determinadas, seis estão envolvidos na síntese de hormônios relacionados ao
desenvolvimento (Cyp302a1, Cyp306a1, Cyp307a1, Cyp314a1, Cyp315a1 e também o Cyp18a1)
e nove estão associados ao metabolismo de xenobióticos, tais como os inseticidas (Cyp4e2,
Cyp6a2, Cyp6a8, Cyp6a9, Cyp6g1, Cyp6w1, Cyp12a4, Cyp12d1 e também o Cyp308a1).
2.4.1 Inserções de TEs em genes Cyps com funções distintas
Neste trabalho foram analisados in silico 35 genes Cyps (incluindo os 15 acima citados) e
seus genes flanqueadores nas extremidades 5’ e 3’, para a detecção de inserções de elementos
transponíveis (TEs) no genoma de D. melanogaster e D. simulans. Para verificar se havia
inserção preferencial de TEs em genes Cyps com diferentes funções e em seus flanqueadores, os
genes Cyps foram agrupados em três categorias funcionais, de acordo com sua função dada pela
nomenclatura The Gene Ontology (2001): 1) nove genes relacionados à resistência aos
inseticidas; 2) 20 genes relacionados à atividade de monooxigenase (detoxificação) em geral,
cujas funções específicas não foram ainda definidas e, por isso, passam aqui a serem chamados
simplesmente de atividade monooxigenase e 3) seis genes relacionados ao desenvolvimento. Os
genes flanqueadores foram agrupados de acordo com a função do seu Cyp vizinho. As inserções
presentes em cada gene são apresentadas nos Apêndices A a D, da seguinte maneira: genes Cyps
(Apêndice A) e genes flanqueadores (Apêndice B) de D. melanogaster e genes Cyps e
flanqueadores de D. simulans, respectivamente nos Apêndices C e D. Essas inserções pertencem
à diferentes classes e ordens de elementos de transposição.
O número total de inserções, bem como seus tamanhos médios e divergências médias (em
relação ao elemento canônico) são apresentados na Tabela 3. Em D. melanogaster, dentre os
33
genes Cyps, o maior número médio de inserções por gene ocorreu nos Cyps associados à
resistência (1,67), enquanto que o menor foi observado nos Cyps associados ao desenvolvimento
(0,50). Nos genes flanqueadores dos Cyps, tanto a maior média (2,0), quanto a menor (0,33),
também foram observadas naqueles associados à resistência e ao desenvolvimento,
respectivamente. Para o tamanho, a maior média das inserções nos Cyps ocorreu nos genes
associados à atividade monooxigenase (1.619 pb) e, a menor, nos genes associados ao
desenvolvimento (77 pb). Para os flanqueadores dos Cyps, a maior média foi encontrada naqueles
associados à resistência (417 pb) e, a menor, nos associados à atividade monooxigenase (75 pb).
A divergência das inserções encontradas nos genes Cyps variou de 22,75 %, em média, nos Cyps
de desenvolvimento, a 3,50 %, nos Cyps associados à atividade monooxigenase. Nos genes
flanqueadores, a divergência variou de 19,86 %, também naqueles associados aos Cyps de
desenvolvimento, a 14,06 %, nos flanqueadores dos Cyps associados à resistência.
Para D. simulans (Tabela 3), o número médio de inserções nos genes Cyps variou de 3,33
a 0,35, respectivamente nos genes associados à resistência e à atividade monooxigenase. Nos
genes flanqueadores dos Cyps, a maior média foi 1,12 inserções (flanqueadores dos Cyps
associados à atividade monooxigenase) e, a menor, foi 0,17 inserções (flanqueadores dos Cyps
associados à resistência). Para o tamanho, a maior média das inserções nos Cyps ocorreu nos
genes associados à atividade monooxigenase (314 pb) e, a menor, nos genes associados à
resistência (159 pb). Para os flanqueadores dos Cyps, a maior média foi encontrada naqueles
associados à atividade monooxigenase (238 pb) e, a menor, nos associados à resistência (85 pb).
A divergência média das inserções encontradas nos genes Cyps variou de 16,72 %, nos
associados à resistência, a 10,07 %, nos Cyps associados à atividade monooxigenase. Da mesma,
a maior e menor divergência média ocorreu nos flanqueadores desses Cyps, 20,51 % (dos Cyps) e
15,60 % (atividade monooxigenase).
As porcentagens de TEs inseridos em genes e regiões intergênicas foram calculadas para
os genes de cada categoria funcional, em relação ao total de TEs nos genes analisados em D.
melanogaster (29 nos Cyps e 38 em seus flanqueadores) e D. simulans (40 nos Cyps e 23 em seus
flanqueadores), respectivamente (Figura 1). Os Cyps envolvidos na resistência aos inseticidas
apresentaram, em D. melanogaster, proporcionalmente maior número de inserções de TEs (15 =
51,72 %) que aqueles associados à atividade monooxigenase (11 = 37,93 %) e ao
desenvolvimento (3 = 10,34 %), o mesmo ocorrendo para seus respectivos genes flanqueadores
34
(resistência: 57,89 %; atividade monooxigenase: 34,21 % e desenvolvimento: 7,89 %) (Figura 1
a). A mesma relação foi observada em D. simulans; os genes Cyps associados à resistência
apresentaram maior proporção de TEs (30 = 75,00 %) que os associados à atividade
monooxigenase (7 = 17,50 %) e ao desenvolvimento (3 = 7,50 %). Porém, para os genes
flanqueadores, os associados aos Cyps com atividade monooxigenase apresentaram maior
porcentagem de inserções (82,6 %), enquanto para as demais categorias funcionais, a proporção
foi a mesma (8,70 %) (Figura 1 b). As diferenças entre as proporções de inserções de TEs nos
genes Cyps e seus respectivos flanqueadores não foram significantes em ambas as espécies (D.
melanogaster, x
2
: 0,77; p > 0,05; D. simulans, x
2
: 3,37; p > 0,05).
35
Tabela 3. Número total de genes analisados em cada categoria funcional (N), valores médios, mínimos (<) e máximos
(>) do número, do tamanho e da divergência de elementos de transposição em genes Cyps e seus genes flanqueadores.
D. melanogaster D. simulans
Genes
N número
(< >)
tamanho
(< >)
divergência (%)
(< >)
N número
(< >)
tamanho
(< >)
divergência (%)
(< >)
Cyps de resistência
9
1,67
(1; 7)
724
(31; 7914)
9,72
(0; 26,67)
9
3,33
(2; 22)
159
(36; 392)
16,72
(7,32; 25,86)
Flanqueadores Cyps
de resistência
11
2
(1; 23)
417
(33; 5126)
14,06
(0,14; 24,14)
12
0,17
(2)
85
(74; 95)
20,51
(18,92; 22,11)
Cyps monooxigenase
20
0,55
(1; 3)
1619
(31; 7914)
3,50
(0; 13,63)
20
0,35
(1; 3)
314
(34; 1728)
10,07
(0,23; 26,15)
Flanqueadores aos
Cyps monooxigenase
16
0,81
(1; 7)
75
(32; 142)
16,98
(0; 26,27)
17
1,12
(1; 10)
238
(35; 1728)
15,60
(0,23; 24,99)
Cyps de
desenvolvimento
6
0,50
(3)
77
(80; 84)
22,75
(18,75; 28,92)
6
0,50
(1; 2)
198
(60; 385)
12,43
(2,64; 25,00)
Flanqueadores Cyps
de desenvolvimento
9
0,33
(1; 3)
134
(88; 189)
19,86
(12,20; 31,09)
9
0,22
(2)
107
(87; 127)
19,75
(12,79; 26,72)
36
Figura 1. Porcentagem de inserções de TEs (ordenada) em diferentes
categorias funcionais de genes Cyps e de seus flanqueadores (abscissa),
em relação ao total de TEs inseridos em D. melanogaster (a) e D.
simulans (b). Genes Cyps e seus flanqueadores associados à resistência
aos inseticidas (preto), genes Cyps e seus flanqueadores associados à
atividade de monooxigenase (branco) e genes Cyps e seus flanqueadores
associados ao desenvolvimento (cinza). Números de inserções indicados
acima de cada coluna.
37
2.4.2 Distribuição de TEs em regiões intergênicas e gênicas dos genes Cyps e seus flanqueadores
Foi realizada uma busca por inserções de TEs tanto nas regiões gênicas dos Cyps e seus
flanqueadores quanto nas regiões intergênicas inteiras, independente do seu tamanho, para
analisar a ocorrência de distribuição diferencial entre essas regiões. As inserções estavam
principalmente localizadas em regiões intergênicas quando comparadas às regiões codificantes,
ocorrendo em maior número nas extremidades 5’ do que nas 3’ (Apêndices A a D), tanto para D.
melanogaster (Figura 2 a), como para D. simulans (Figura 2 b). As diferenças observadas entre as
duas regiões foram significantes para os genes Cyps (x
2
: 16,60; p < 0,01), mas não para seus
flanqueadores (x
2
: 1,80; p < 0,05) em D. melanogaster, entretanto, foram significantes tanto para
os Cyps (x
2
: 7,60; p < 0,01) quanto para seus flanqueadores (x
2
: 13,19; p < 0,01) em D. simulans.
Porém, quando considerados os números de inserções nas regiões 5’ e 3’ de genes de cada
categoria funcional (Apêndices A a D), as diferenças foram significantes para os Cyps associados
à resistência (x
2
: 10,42; p < 0,01) e para os Cyps associados à atividade monooxigenase (x
2
:
19,60; p < 0,01) e seus flanqueadores (x
2
: 7,01; p < 0,01) em D. melanogaster. Em D. simulans,
as diferenças foram significantes para os Cyps associados à resistência (x
2
: 13,69; p < 0,01) e à
atividade monooxigenase (x
2
: 8,76; p < 0,01). Entre os genes flanqueadores houve diferença
significante apenas para aqueles associados aos Cyps com atividade monooxigenase (x
2
: 22,05; p
< 0,01).
Todas as inserções detectadas nos 35 genes Cyps localizavam-se nas regiões intergênicas
de D. melanogaster (29) e D. simulans (40), como pode ser observado nos Apêndices A e C. Para
os genes flanqueadores dos Cyps de D. simulans, o resultado foi muito semelhante, pois, foram
detectadas apenas duas inserções (8,69 % do total de 23) em introns, no gene GD12614
(FBgn0184341), como mostrado no Apêndice D. Por outro lado, os genes flanqueadores dos
Cyps de D. melanogaster apresentaram inserções de TEs não apenas nas regiões intergênicas
(15), mas também, em introns (19), éxons (1) e UTR (3). Quando se compara o número de
inserções de TEs entre introns e éxons dos genes flanqueadores dos Cyps de D. melanogaster,
nota-se que os primeiros apresentaram 19 inserções (50 % do total de 38), enquanto que os
últimos apresentaram apenas uma inserção (2,63 % do total de 38), como mostrado no Apêndice
B.
38
Figura 2. Porcentagem de inserções de TEs (ordenada) em relação ao
total de inserções nas regiões intergênicas 5’ (cinza escuro) ou 3’
(branco) em genes Cyps e em seus flanqueadores (abscissa) em D.
melanogaster (a) e D. simulans (b). Números de inserções indicados
acima de cada coluna.
39
2.4.3 Ocorrência de inserções de TEs em regiões flanqueadoras distantes em até 3 kb do gene
Como a presença de sinais reguladores nas seqüências de TEs pode afetar a transcrição
dos genes vizinhos e, conseqüentemente, alterar seu padrão de expressão, neste trabalho, foi
realizada uma busca por inserções de TEs em regiões flanqueadoras 5’ distantes em até 3 kb do
início da seqüência gênica, onde se localizam a maior parte dos promotores (Figura 3 e
Apêndices E e F), como também distantes em até 3 kb do término do gene (3’).
A Figura 3 mostra que as proporções de inserções de TEs nas regiões flanqueadoras em
até 3 kb dos genes analisados em D. melanogaster, ocorreram preferencialmente nas
extremidades 5’ dos genes Cyps (71,43%; x
2
: 8,76; p < 0,01), o mesmo não ocorrendo para os
genes resultantes da amostragem aleatória do genoma (63,64 %; x
2
: 3,44; p > 0,05). Os genes
flanqueadores dos Cyps de D. melanogaster apresentaram apenas uma inserção na região 3’,
próxima em até 3 kb do término do gene. Por outro lado, em D. simulans, as proporções de TEs
nas extremidades 5´ e 3´ dos genes Cyps (53,33 % vs 46,67 %) e dos genes amostrados
aleatoriamente (57,41 % vs 42,59 %) não diferiram significantemente (Cyps: x
2
: 0,16; p > 0,05;
amostra aleatória: x
2
: 0,95; p > 0,05 ). Os genes flanqueadores dos Cyps de D. simulans, ao
contrário, apresentaram uma inserção na região 5’ (25 %) e três na região 3’ (75 %), sendo a
diferença significante (x
2
: 12,00; p < 0,01).
Outra abordagem foi a análise das proporções de inserções de TEs em regiões
flanqueadoras 5’e 3’ em até 3 kb do gene, em intervalos de 0,5 kb (0 a 0,5 kb e 0,5 a 1 kb) e de 1
kb (1 a 2 kb e 2 a 3 kb), de modo a se avaliar a ocorrência de inserções preferenciais de TEs em
alguns desses intervalos (Figura 4).
Em D. melanogaster (Apêndice E), as regiões 5’ dos Cyps (Figura 4 a) associados à
resistência aos inseticidas apresentaram inserções em todos os intervalos de distância, com
proporções variando de 20 a 40 %, sendo que a região de 0,5 a 1 kb foi a que apresentou a maior
proporção de inserções (40 %). De modo semelhante, as proporções de inserções presentes nos
Cyps relacionados à atividade monooxigenase (Figura 4 a) variaram de 20 a 40 %, não havendo
inserções no intervalo de maior distância (2 a 3 kb). As regiões distantes de 0 a 0,5 kb e de 1 a 2
kb apresentaram maior proporção de inserção (40 %). Por outro lado, tanto os genes Cyps
associados ao desenvolvimento (Figura 4 c), quanto os genes flanqueadores aos Cyps das três
40
categorias funcionais (Figura 4 e), não apresentaram inserções de TEs nesta região. Nas regiões
3’, os genes Cyps que apresentaram inserções foram apenas aqueles associados à resistência
(Figura 4 b), sendo estas distribuídas em distâncias de 0 a 2 kb. Quanto aos genes flanqueadores,
foi encontrada apenas uma única inserção na região 3’ de um gene flanqueador a um Cyp
associado ao desenvolvimento (Figura 4 d).
Em D. simulans, as inserções presentes na região 5’ dos genes Cyps associados à
resistência estavam distribuídas nas distâncias de 0 a 2 kb, sendo o maior valor encontrado no
intervalo de 1 a 2 kb (71,42 %), enquanto que os Cyps associados à atividade monooxigenase
apresentaram inserções apenas no intervalo de 1 a 2 kb de distância (Figura 5 a). Entre os genes
flanqueadores, houve apenas uma inserção na região 5’ de um gene flanqueador de um Cyp
associado à atividade monooxigenase, sendo esta localizada na região mais próxima ao gene (0 a
0,5 kb) (Figura 5 d). Quando analisadas as regiões 3’, nota-se a ocorrência de inserções apenas
em Cyps associados à resistência (Figura 5 b), e que as inserções estavam distribuídas em dois
intervalos de distância, 0 a 0,5 kb (57,14 %) e 1 a 2 kb (42,85 %). Ainda, para a região 3’, foram
encontradas inserções apenas nos genes flanqueadores dos genes Cyps associados à atividade
monooxigenase (Figura 5 e), sendo estas localizadas nos intervalos de menor e maior distâncias,
66,67 % e 33,33 %, respectivamente. A heterogeneidade de distribuição e a variação das
proporções de inserções dos TEs nos diferentes intervalos de distância do gene sugerem não
haver associação entre distância em relação ao gene e o número de inserções, nas regiões
próximas aos genes.
Foram também comparadas as proporções de inserções de TEs nas regiões próximas em
até 3 kb dos genes de cada categoria funcional dos genes Cyps. Em D. melanogaster, o número
médio de inserções por Cyp em cada categoria funcional foi 2 (resistência: 10/5 genes), 1,33
(atividade monooxigenase: 4/3 genes) e zero (desenvolvimento). Em D. simulans, as médias de
inserções foram 4,66 (resistência: 14/3 genes), 1 (atividade monooxigenase: 1/1gene) e zero
(desenvolvimento). Para as duas espécies, ocorre, portanto, maior número de inserções de TEs
próximos a genes Cyps que nas demais categorias.
41
Figura 3. Porcentagem de inserções de TEs (ordenada) nas regiões
flanqueadoras 5’ (cinza) e região 3’ (branco), distantes até 3 kb (abscissa) do
gene. (a) D. melanogaster (b) D. simulans. Números de inserções indicados
acima de cada coluna.
42
Figura 4. Porcentagem de inserções de TEs em relação a distância em que estão
inseridas em regiões intergênicas distantes em até 3 kb do gene alvo em D.
melanogaster: região 5’ dos genes Cyps (a) e seus flanqueadores (b); região 3’ dos
genes Cyps (c) e seus flanqueadores (d); Total de inserções dos genes Cyps (e) e
seus flanqueadores (f). Genes Cyps associados à resistência e seus flanqueadores
(preto), genes Cyps e seus flanqueadores associados à atividade de monooxigenase
(branco) e genes Cyps e seus flanqueadores associados ao desenvolvimento (cinza).
Números de inserções indicados acima de cada coluna.
43
Figura 5. Porcentagem de inserções de TEs em relação a distância em que estão
inseridas em regiões intergênicas distantes em até 3 kb do gene alvo em D. simulans:
região 5’ dos genes Cyps (a) e seus flanqueadores (b); região 3’ dos genes Cyps (c) e
seus flanqueadores (d); Total de inserções dos genes Cyps (e) e seus flanqueadores
(f). Genes Cyps associados à resistência e seus flanqueadores (preto), genes Cyps e
seus flanqueadores associados à atividade de monooxigenase (branco) e genes Cyps e
seus flanqueadores associados ao desenvolvimento (cinza). Números de inserções
indicados acima de cada coluna.
44
2.4.4 Distribuição das classes e ordens de TEs nas regiões intergênicas
Para avaliar se ocorre distribuição diferencial de TEs de diferentes classes e ordens, as
inserções foram agrupadas em transposons de DNA, retrotransposons com LTR e LINEs. Do
total de inserções nos Cyps de D. melanogaster (Apêndice G; Figura 6 a, b, c), as pertencentes
aos elementos de DNA (DNAREP1_DM, PROTOP, PROTOP_A, PROTOP_B, ISFUN1,
POGON1, BARI_DM, hAT-1_DP) foram as mais freqüentes (73,92 %: 17/23), sendo o de
DNAREP1_DM o mais freqüente desta classe (41,17 %: 7/17) e do total geral de inserções
(30,43 %: 7/23). Tanto os retrotransposons com LTRs (MAX_LTR e MAX_I), quanto os LINEs
(TART_DV e LINEJ1_DM), representam 13,05 % do total de 23 inserções. Nos genes
flanqueadores, as inserções presentes pertenciam a elementos de DNA (DNAREP1_DM e
PROTOP_B), retrotransposons com LTRs (ROO_I) e elementos LINEs (TART_DV). Os genes
flanqueadores apresentaram maior porcentagem de inserções de elementos de DNA (60 %: 9/15),
seguido pelos elementos LINEs (33,33 %: 5/15), enquanto que os retrotransposons com LTRs
apresentaram a menor porcentagem (6,67 %: 1/15). DNAREP1_DM foi o elemento mais
freqüente (53,33 %: 8/15), seguido pelo TART_DV (33,33 %: 5/15) e os elementos PROTOP_B
e ROO_I (6,67 %: 1/15), com apenas uma inserção cada.
Em D. simulans (Apêndice H, Figura 6 d, e, f), as inserções dos genes Cyps foram
também preponderantemente (95 %: 38/40) de elementos de DNA (DNAREP1_DM, Helitron-
1_Dyak, Helitron-1_Dvir, BARI_DM, PROTOP_B, FB4_DM, TransibN1_DP, BARI1 e
HOBO), representados principalmente pelo DNAREP1_DM (39,47 %: 15/38) e o Helitron-
1_Dyak (34,21 %: 13/38). Apenas duas inserções não se classificaram como transposon de
DNA: o retroposon (MINIME_DN) e um elemento não classificado DMRP1. Os genes
flanqueadores apresentaram menor número de superfamílias de elementos de DNA, quando
comparados aos Cyps, pois os TEs Helitron-1_Dyak, PROTOP_B, TransibN1_DP e HOBO não
foram encontrados, mas ainda assim foi a classe mais freqüente (47,61 %: 10/21). Por outro lado,
apresentaram algumas inserções adicionais de LTRs (Stalker2_LTR e ROO_I) e LINEs
(TART_DV). O elemento com o maior número de cópias foi o TART_DV (42,86 %: 9/21),
seguido pelo Helitron-1_Dyak (19,05 %: 4/21), DNAREP1_DM e BARI_DM (9,52 %: 2/21) e,
por último, os elementos BARI1, FB4_DM, ROO_I e Stalker2_LTR (4,76 %: 1/21).
45
Figura 6. Porcentagem de inserções de TEs em regiões intergênicas. Em D. melanogaster: (a) região 5’
(b) região 3’ (c) Totais de inserções. Em D. simulans: (d) região 5’ (e) região 3’ (f) Totais de inserções.
Genes Cyps são representados em cinza e genes flanqueadores em branco. Números de inserções
indicados acima de cada coluna; classe ou ordem a que cada TE pertence indicadas abaixo do eixo x.
46
2.4.5 Ocorrência do elemento DNAREP1_DM em genes Cyps e seus flanqueadores em D.
melanogaster e D. simulans
O elemento transponível DNAREP1_DM (Drosophila interspersed element 1) ou também
chamado DINE-1 ou INE-1, descrito por Kapitonov e Jurka (1999) como um transposon de DNA
não autônomo de 594 pb, é o TE mais abundante do genoma de D. melanogaster. Segundo
Kapitonov e Jurka (2003), o DNAREP1_DM é um elemento ancestral que possivelmente sofreu
uma explosão transposicional há mais de três milhões de anos e, a partir daí, permaneceu inativo.
Diversos estudos têm mostrado a alta abundância deste elemento no genoma de D. melanogaster.
Yang e Barbash (2008), analisando os 12 genomas de Drosophila, comprovaram que todas as
espécies possuem centenas a milhares de cópias de DNAREP1_DM distribuídas no genoma. Em
geral, a estrutura do elemento DNAREP1_DM consiste em dois blocos conservados (A e B),
separados por uma região de repetições centrais variáveis (Figura 7). O bloco A é subdividido em
região A1 e A2, separadas por uma região de repetição microssatélite. O bloco A1 é composto
por uma repetição terminal invertida 5’ (subTIR 5’), outra repetição parcial (IR) e uma região
conservada (Core). O bloco B é formado por uma subTIR 3’ e por duas IRs que formam um Stem
loop na extremidade 3’.
Cada cópia do DNAREP1_DM inserida nas regiões intergênicas dos genes Cyps foi
comparada à cópia consenso do DNAREP1_DM (Figura 7), para identificar a qual região do
elemento elas correspondiam. Em D. melanogaster, de modo geral, tais cópias não correspondem
preferencialmente a uma região específica do elemento. Das sete cópias, três (42,85 %)
correspondem à extremidade 5’ do elemento: uma delas, a cópia Cyp6w1_5’ inclui a região 5’
subTIR (subterminal inverted repeats), a 5’ IR (inverted repeat) e parte da região Core, sendo
todas regiões bem conservadas quando comparadas ao elemento consenso; a cópia do
Cyp6a14_3' também corresponde as regiões 5’ IR e parte da região Core; a cópia do Cyp6a2_3’ é
formada pela região de microssatélite (CCGT)
n
, (CTGT)
n
e pela região A2. Das quatro cópias
restantes, uma cópia do Cyp6w1_3’ corresponde a uma parte da região A2, a região de repetições
centrais (com tamanho e repetições variáveis) e praticamente todo bloco B (3’ subTIR e 3’ stem-
loop), e outra cópia Cyp6w1_5’ corresponde à metade da região de repetições centrais até o fim
47
do bloco B. As outras duas cópias correspondem à parte central das repetições centrais
(Cyp6w1_5’) e à região 3’ subTIR e 3’ stem-loop do bloco B (Cyp6a22_5’).
Em D. simulans, as 15 cópias do DNAREP1_DM ocupavam as regiões intergênicas de
seis genes Cyps, três associados à resistência aos inseticidas (Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1), dois a
atividade de monooxigenase (Cyp6a14 e Cyp6a22) e um ao desenvolvimento (Cyp315a1). Nessa
espécie, ao contrário do observado em D. melanogaster, os resultados mostram que cópias do
DNAREP1_DM com diferentes tamanhos correspondem preferencialmente à extremidade 3’ do
elemento consenso (Figura 8). Oito do total de 15 cópias (53,33 %) de DNAREP1_DM em D.
simulans estavam associadas ao gene Cyp6w1, sete delas na região intergênica 5’ e uma na 3’.
Este elevado número de cópias na região intergênica 5’ do Cyp6w1 pode ser devido ao grande
tamanho desta região, com 21.297 pb. Do total de 15 cópias, apenas três (20 %) correspondem à
extremidade 5’ do elemento: a cópia do Cyp6w1_5’, que inclui a 5’ subTIR, a 5’ IR, o Core, a
região A2 e o início da região de repetições centrais; a cópia do Cyp6a14_5’, que se estende da
região 5’ IR até o primeiro nucleotídeo do Core; e outra cópia do Cyp6w1_5’, representando
parte do Core, a região de microssatélite total até o início da região A2. Todas as outras 12 cópias
(80 %) do DNAREP1_DM correspondem à extremidade 3’ do elemento, sendo que oito delas
(66,66 %) correspondem exclusivamente à região do bloco B, principalmente das regiões 3’
subTIR e 3’ stem-loop. As outras quatro cópias (33,33 %) correspondem à parte do bloco B e
parte da região de repetições centrais, sendo que uma delas representa o bloco B todo e quase
toda a região de repetições centrais.
Neste estudo, foi possível analisar a porcentagem de identidade e o tamanho das cópias do
DNAREP1_DM inseridas nas regiões intergênicas dos genes Cyps (Figura 8 a) e de seus genes
flanqueadores (Figura 8 b) de D. melanogaster e de D. simulans (Figura 8 c e 9 d). Dos 35 Cyps
analisados, apenas quatro (11,42 %) apresentaram inserções de DNAREP1_DM (Cyp6w1,
Cyp6a2, Cyp6a22 e Cyp6a14) em D. melanogaster (Figura 8 a). Do total de sete inserções,
quatro (57,14 %) estão localizadas no Cyp6w1 (três na região intergênica 5’ e uma na região 3’).
As cópias são em geral de pequeno tamanho, com maior distribuição entre 40 e 100 pb, com
exceção de duas no Cyp6w1, com 220 e 400 pb. A identidade dessas cópias, em relação ao
elemento consenso, variou de 73 % a 87 %, com uma média de 82 %. Dentre as sete cópias deste
elemento, seis estavam localizadas em até 3 kb do gene.
48
Por outro lado, os genes flanqueadores desta mesma espécie (Figura 8 b) apresentaram
oito cópias de DNAREP1_DM em suas regiões intergênicas. Dentre os 36 genes flanqueadores,
três (8,33 %) apresentaram cópias deste TE (CG12780, CG6040 e CG9628). Tais cópias
possuíam tamanho médio de 85 pb, quatro delas (50 % do total) inseridas na região 3’ do gene
CG12780. Essas cópias apresentaram tamanhos que variaram de 37 a 189 pb e a porcentagem de
identidade variou de 76 a 92 %, sendo a identidade média de 85 %. Apenas a cópia do
DNAREP1_DM inserida na região 3’ do gene CG9628 estava localizada na região próxima em
até 3 kb do gene.
Em D. simulans, dentre os 35 genes Cyps, apenas seis (17,14 % do total de 35) possuíam
cópias do DNAREP1_DM (Figura 7), as quais variaram de 34 a 332 pb. Em relação ao elemento
consenso, a porcentagem de identidade das cópias variou de 74 a 92 %, sendo a identidade média
82 %. Do total de 15 cópias deste elemento presentes nos Cyps, sete estavam localizadas até 3 kb
de distância dos genes. Os quatro genes Cyps de D. melanogaster que possuíam cópias do
DNAREP1_DM são associados à resistência aos inseticidas (Cyp6w1 e Cyp6a2) ou à atividade
monooxigenase (Cyp6a14 e Cyp6a22). No total de sete inserções, quatro (57,14 %) estão
localizadas nas regiões intergênicas 5’ (três inserções) e 3’ (uma inserção) do gene Cyp6w1. Os
outros três genes apresentaram apenas uma inserção cada um (Cyp6a2_3', Cyp6a14_3' e
Cyp6a22_5').
No entanto, apenas duas cópias do elemento DNAREP1_DM foram localizadas nas
regiões intergênicas dos genes flanqueadores aos Cyps. Tais cópias estavam inseridas na região
5’ dos genes GD10156 e GD19271 e apresentaram, respectivamente, tamanho de 215 e 95 pb e
porcentagem de identidade de 82,48 % e 78,95 %.
49
Figura 7. Localização das cópias do elemento DNAREP1_DM inseridas em genes Cyps de D.
melanogaster e D. simulans na cópia consenso do elemento. *Cyps associados à resistência; ** Cyps
associados à atividade monooxigenase; *** Cyps associados ao desenvolvimento.
*6w1_3’
*6w1_5’
*12d1_5’
*6w1_5’
6
81
Bloco A
571-577
26
-
33
56
-
149
150
-
163
164-211
541-553
557-563
5’
IR
Core
Repetição
Microssatélite
A2
Rep
etições centrais
3’
subTIR
3’ Stem
loop
Bloco B
A1
212
-
474
375
594
330
416
*6w1_5’
188
587
150
211
*6a2_3’
20
59
**6a14_3’
535
578
118
178
*6w1_5’
19
220
*6w1_5’
594
522
530
567
593
483
594
263
594
469
411
568
594
443
575
511
565
530
482
562
534
593
24
57
**6a14_5’
523
586
*6w1_5’
*6w1_5’
*6a2_5’
***315a1_5’
*6w1_5’
*6w1_3’
**6a22_5’
*6w1_5’
*12d1_5’
**6a22_5’
3
-
15
**6a14_3’
D. melanogaster
D. simulans
50
Figura 8. Porcentagens de identidade de cópias de diferentes tamanhos do elemento DNAREP1_DM
inseridas em: (a) genes Cyps (b) genes flanqueadores de D. melanogaster; (c) genes Cyps (d) genes
flanqueadores de D. simulans.
51
2.4.6 Investigação da presença de sítios de ligação de fatores de transcrição (FTs) nas cópias do
DNAREP1_DM dos genes Cyps
A ligação de fatores de transcrição (FTs) ao DNA tem um importante papel na regulação
da transcrição gênica. Assim, muitos sítios de ligação de fatores de transcrição são adjacentes a
genes expressos. Utilizando a ferramenta Alibaba2 (GRABE, 2002), foi realizada uma busca por
possíveis sítios de ligação de fatores de transcrição nas cópias do elemento DNAREP1_DM
presentes nas regiões intergênicas dos genes Cyps de D. melanogaster e D. simulans (Tabela 4).
Todas as cópias do DNAREP1_DM que apresentam motivos homólogos a sítios de ligação de
FTs, são seqüências correspondentes à região 3’ (bloco B e parte das repetições centrais) do
elemento consenso, com exceção de apenas uma cópia, em D. simulans (Figura 9).
Em D. melanogaster, os motivos foram encontrados em três cópias de DNAREP1_DM
inseridas nas regiões intergênicas 5’ (duas inserções, localizadas a aproximadamente 1 kb do
início do gene) e 3’ (uma inserção, localizada a 1.724 pb do início do gene) do gene Cyp6w1, as
quais apresentam de três a quatro seqüências similares a FTs. Essas seqüências podem ser
incluídas em quatro superclasses de fatores de transcrição. Da superclasse Helix-turn-helix foram
localizados os sítios de ligação de FTs Oct-1
(fator octâmero ligante) envolvido na regulação de
genes relacionados ao ciclo celular, e o HSTF (fator heat shock) em genes expressos quando
submetidos a situações de estresse. Da superclasse Zinc finger foram encontrados os sítios de
ligação de FTs Hb (fator hunchback), o qual age na fase do desenvolvimento do embrião,
determinando sua segmentação, e Sp1 (proteína estimulante 1) inserido geralmente em genes
reguladores do ciclo celular. O sítio de ligação de FTs NF-1 (fator nuclear 1) pertence à terceira
superclasse, de domínios básicos, o qual também se liga a genes reguladores do ciclo celular. Da
última superclasse,
beta-Scaffold, foi identificado o sítio de ligação de FTs SRF (sinais de
resposta externa), geralmente inserido em genes expressos em resposta a estímulos externos.
Todos os sítios de ligação de FTs estão localizados na região das repetições centrais do elemento,
com exceção do HSTF (Cyp6w1_5’) o qual corresponde ao início do bloco B. Entre eles o mais
freqüente foi o Sp1, o qual está localizado em todas as cópias do DNAREP1_DM. Todos os sítios
de ligação de FTs encontrados nessas cópias de D. melanogaster foram também localizados na
cópia consenso do elemento, com exceção do Oct-1 e SRF.
52
Todos os motivos correspondentes aos sítios de ligação de FTs encontrados nas cópias do
DNAREP1_DM de D. simulans foram localizados também no elemento consenso. Foram
encontrados motivos em seis cópias de DNAREP1_DM, localizadas em três genes Cyps
associados à resistência aos inseticidas: quatro cópias nas regiões intergênicas do gene Cyp6w1
(três na região 5’ e uma na região 3’) e uma cópia na região intergênica 5’ dos genes Cyp6a2 e
Cyp12d1. Apenas uma cópia de DNAREP1_DM no Cyp6w1_5’ apresentou um motivo (TBP)
correspondente à extremidade 5’ do elemento consenso. Em outra cópia do Cyp6w1_5’, foram
localizados motivos correspondentes à região das repetições centrais (Sp1, NF-1 e Hb) e ao bloco
B do elemento (HSTF). As outras quatro cópias (Cyp6w1_5’, Cyp6w1_3’, Cyp6a2_5’ e
Cyp12d1_5’) possuem o mesmo motivo (HSTF) correspondente à região do bloco B, do
elemento consenso.
53
Tabela 4. Predição de sítios de ligação de fatores de transcrição (FTs) na seqüência consenso do DNAREP1_DM em D. melanogaster e D. simulans,
de acordo com Alibaba2 (GRABE, 2002).
Motivos: nome e seqüência consenso do fator identificado no banco de dados TRANSFAC; D. melanogaster: seqüências identificadas como
motivos na seqüência do DNAREP1 de D. melanogaster; posição nt: a posição de cada motivo na seqüência DNAREP1; D. simulans: seqüências
identificadas como motivos na seqüência de DNAREP1 de D.simulans.
D. melanogaster
D. simulans
Motivos
(Consenso)
Seqüência Gene
Posição
no TE
Motivos
(Consenso)
Seqüência Gene
Posição
no TE
Superclasse Helix
-
turn
-
hel
ix
Supe
rclasse Helix
-
turn
-
helix
Oct
-
1
(fator octâmero ligante)
HSTF
(fator heat shock)
Cyp6w1_5’
wTwnCATATk
ttttcatatt
Cyp6w1_5’
337-346 GmAryTTCks
gaaatttcgc
Cyp6w1_3’
511-520
Cyp6a2_5’
HSTF
(fator heat shock)
Cyp12d1_5’
GmAryTTCks
gaaatttcgc
Cyp6w1_3’
511-520
Superclasse Zinc finger
Superclasse Zinc finger
Hb
(fator hunchback)
Hb
(fator hunchback)
nmmAAAAAAC
gccaaaaaac
Cyp6w1_5’
377-386 nmmAAAAAAC
gccaaaaaac
Cyp6w1_5’
377-386
Sp1
(proteína estimulante 1)
Sp1
(proteína estimulante 1)
CmCrCCCmyn
cacgcccact
Cyp6w1_3’
266-275 CmCrCCCmyn
cacgcccact
Cyp6w1_5’
394-403
Cyp6w1_5’
394-403 CGCsCmnwCT
cgcccactct
Cyp6w1_5’
396-405
CGCsCmnwCT
cgcccactct
Cyp6w1_3’
268-277 mymCGCCymy
ccacgcccac
Cyp6w1_5’
303-312
Cyp6w1_5’
396-405
mymCGCCymy
ccacgcccac
Cyp6w1_3’
303-312
krGGyGksGy
gccacgccca
Cyp6w1_5’
393-402
GwGGGnGnGG
ccacgcccac
394-403
GTGrGsGkGr
tcacgcccac
432-441
nGTGkGGGnG
cgcccacact
435-444
Superclasse domínios básicos
Superclasse domínios básicos
NF
-
1
(fator nuclear 1)
NF
-
1
(fator nuclear 1)
wnnTTGGCAA
ttgccaaaaa
Cyp6w1_5’
375-384 nwGCCAArAn
ttgccaaaaa
Cyp6w1_5’
375-384
Superclasse beta-Scaffold
Superclasse beta-Scaffold
SRF
(sinais de resposta externa)
TBP
(proteína de ligação TATA )
wwTGGGyrkC
gccgcccaaa
Cyp6w1_5’
418-427 ryATAymTwn
atatatatat
C
yp6w1_5’
97-106
54
Figura 9. Possíveis sítios de ligação de fatores de transcrição identificados pela ferramenta Alibaba2
nas cópias do TE DNAREP1_DM inseridas em genes Cyps de D. melanogaster e D. simulans. O
símbolo corresponde à localização do possível sítio de ligação de FTs.
D. melanogaster
*6w1_5’
330
416
337
-
346
Oct
-
1
394-403
396-405
Sp1
377
-
386
Hb
188
587
*6w1_3’
266-275
268
-
277
Sp1
303-312
Sp1
511-520
HSTF
593
483
*6w1_5’
511-520
HSTF
411
568
*6w1_3’
511
-
520
HSTF
594
44
3
*6a2_5’
511-520
HSTF
482
562
*12d1_5’
511
-
520
HSTF
19
220
*6w1_5’
97-106
TBP
594
263
*6w1_5’
511
-
520
HSTF
303-312
Sp1
375-384
377
-
386
NF
-
1
303
-
312
Sp1
375
594
*6w1_5’
432-441
435-444
Sp1
393-402
395-404
Sp1
375
-
384
NF1
418-427
SRF
consenso
394-403
396
-
405
Sp1
97-106
TBP
266-275
268-277
Sp1
303-312
Sp1
511
-
520
HSTF
NF1
375-384
377-386
Hb
Hb
571-577
541-553
557-563
56
-
149
150
-
163
164
-
211
3
-
15
26
-
33
5’ subTIR
5’ IR
Core
Repetição
Microssatélite
A2
Repetições centrais
3’ su
bTIR
3’ Stem loop
Bloco B
A1
212
-
474
D. simulans
Bloco A
55
2.4.7 TEs em regiões flanqueadoras de genes Cyps em linhagens resistentes e suscetíveis de
D. melanogaster e D. simulans
Os genes Cyps associados à resistência foram selecionados para serem investigados
quanto à ocorrência inserções de TEs em suas regiões flanqueadoras 5´ e 3´ em linhagens
resistentes e suscetíveis de D. melanogaster e D. simulans. Esses genes foram selecionados a
partir dos resultados obtidos da análise in silico, em face de apresentarem inserções diferenciais
de TEs em suas regiões flanqueadoras nas linhagens que tiveram seus genomas seqüenciados,
sendo, portanto, potenciais candidatos a apresentarem polimorfismos populacionais relacionados
com a resistência aos inseticidas.
Foram eles os genes Cyp6w1, Cyp6a2, Cyp4e2, Cyp12d1 e
Cyp12a4.
O gene Cyp6w1 foi investigado, em D. melanogaster por apresentar três inserções do
transposon DNAREP1_DM em sua região flanqueadora 5’ e uma inserção na região 3’. D.
simulans, apresentou em sua região flanqueadora 5’ uma inserção do DNAREP1_DM e duas do
Helitron-1_Dyak. Para o Cyp6a2 D. melanogaster apresentou na região flanqueadora 3’ uma
inserção do DNAREP1_DM e uma do ISFUN1. Por outro lado, na região flanqueadora 5’ de D.
simulans ocorreram uma inserção DNAREP1_DM e outra do Helitron-1_Dyak, enquanto que na
região 3’ foram encontradas uma cópia do TE Helitron-1_Dyak e do MINIME_DN, e duas cópias
do TE Helitron-1_Dvir. No gene Cyp4e2 de D. melanogaster, ocorreu apenas uma inserção do
elemento ISFUN1 na região flanqueadora 5. O gene Cyp12d1, que apesar de não conter inserções
nas regiões flanqueadoras da linhagem seqüenciada de D. melanogaster, foi analisado nas
linhagens de ambas as espécies, pois é um Cyp associado à resistência aos inseticidas, e por
conter em D. simulans duas inserções do DNAREP1_DM na região flanqueadora 5’.
As análises de PCR evidenciam a presença de polimorfismo interpopulacional de tamanho
das regiões flanqueadoras dos genes Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1 (Figura 10). Não parece existir
qualquer padrão relacionado à resistência aos inseticidas. O padrão de bandas não difere em
relação a essa característica, nem em D. melanogaster (linhagens resistentes: LE, UM, ITA, RP,
BG, SM, TAV; linhagens susceptíveis: SE, CS), nem em D. simulans (linhagens resistentes: ITA,
PF, OV, RAT, BG; linhagens susceptíveis: LE, MU, AMI, MAK, MAD). As bandas polimórficas,
ou aquelas monomórficas que supostamente apresentavam um TE na região flanqueadora do
56
respectivo gene foram seqüenciadas em algumas linhagens, de modo a ser realizada uma análise
populacional das inserções nas diferentes linhagens e espécies. A Tabela 5 apresenta as
informações sobre os fragmentos de TEs
encontrados nas regiões flanqueadoras desses genes.
Apesar de não ocorrer polimorfismo, a região flanqueadora 5’ do gene Cyp6w1 foi
seqüenciada em cinco linhagens de D. melanogaster, para verificar se as inserções presentes nas
populações correspondiam às mesmas da análise in silico. Todas, exceto RP, apresentaram uma
das três inserções do elemento DNAREP1_DM (fragmento 594-375), que estava presente na
linhagem genômica. Além disso, as linhagens ITA, BG e TAV apresentaram uma inserção do
Helitron-1_Dyak (fragmento 314-415), que não ocorre linhagem genômica. Em D. simulans, foi
seqüenciada a região flanqueadora 5’ do gene Cyp6w1 na linhagem PF, que apresentou
exatamente as mesmas inserções encontradas na linhagem genômica. Para a análise na região
flanqueadora 3’ do gene Cyp6w1 de D. melanogaster foram seqüenciadas as linhagens RP e BG.
A primeira apresentou uma inserção do DNAREP1_DM (fragmento 419-587), que corresponde à
parte da cópia presente na linhagem genômica e segunda não apresentou inserção de TEs nessa
região. Para D. simulans, essa região foi monomórfica.
A região flanqueadora 5’ do gene Cyp6a2 de D. melanogaster foi monomórfica, sem
inserções de TEs. Em D. simulans, foi seqüenciada a linhagem ITA, que apresentou a mesma
inserção do DNAREP1_DM, mas não a inserção do Helitron-1_Dyak, presentes na linhagem
genômica. Na região flanqueadora 3’ da linhagem RP em D. melanogaster foi encontrada uma
inserção do TE Helitron-1N1_Dvir (fragmento 108-263), que difere do fragmento encontrado na
linhagem genômica, mas não as inserções dos elementos ISFUN1 e DNAREP1_DM encontrados
nessa linhagem. Em D. simulans, essa região foi analisada nas linhagens AMI e MAK, que
apresentaram a mesma inserção presente em na linhagem RP D. melanogaster, o Helitron-
1N1_Dvir. No entanto, AMI apresentou mais duas inserções, uma do Helitron-1_Dvir (108-212)
e outra do elemento MINIME_DN (fragmento 319-474), que correspondem às cópias presentes
na linhagem genômica, mas não a inserção do Helitron-1_Dyak.
A análise in silico mostrou que o gene Cyp12d1 não possuía nenhuma inserção de TEs em
suas regiões flanqueadoras, mas, por se tratar de um Cyp associado à resistência aos inseticidas,
essa região foi seqüenciada em linhagens de D. melanogaster (LE, ITA, RP e BG) para verificar
um possível polimorfismo de inserção de TEs em populações naturais. Em concordância com os
resultados da análise in silico, não foram encontradas inserções nessas regiões.
57
Foi calculada a diversidade nucleotídica (
π
) das cópias inseridas nas regiões
flanqueadoras 5’e 3’ de duas ou mais linhagens. O valor de
π
dos fragmentos do DNAREP1_DM
inseridos nas regiões flanqueadoras 5’ e 3’ do gene Cyp6w1 nas diferentes linhagens de D.
melanogaster (quatro linhagens geográficas mais a linhagem genômica), foi igual a 0.011. Para
D. simulans (linhagem genômica e PF), o valor
π
foi igual a 0. Já, as cópias do Helitron-1_Dyak,
que ocorrem nas mesmas linhagens de D. melanogaster, têm uma diversidade muito menor (
π
:
0.006). A diversidade nucleotídica do Helitron-1N1_Dvir presente na região flanqueadora 3’ do
Cyp6a2 das linhagens de D. melanogaster (genômica e RP) foi igual a 0.097 e nas linhagens de
D. simulans (genômica, AMI e MAK) foi igual a 0.028.
A análise populacional das regiões flanqueadoras dos genes Cyp6w1 e Cyp6a2 também
confirma os dados da análise in silico das linhagens genômicas de que as cópias do elemento
DNAREP1_DM, presentes nas regiões flanqueadoras desses genes, correspondem à extremidade
3’ do elemento consenso. Assim, também foi realizada uma busca por possíveis sítios de ligação
de fatores de transcrição (FTs) nas cópias seqüenciadas do DNAREP1_DM provenientes das
linhagens geográficas. Foram encontrados os mesmos FTs da análise in silico (Tabela 4), como
também novos sítios (C/EBPalpha, GATA-1, Repressor, Kr, NF-ATc3 e HNF-3B). As cópias do
elemento Helitron-1N1_Dvir presentes na região 3’ do mesmo gene das linhagens de D.
melanogaster (RP) e duas linhagens de D. simulans (AMI e MAK) não apresentaram possíveis
sítios de ligação para FTs.
58
Tabela 5. Fragmentos de TEs encontrados em genes Cyps cujas regiões flanqueadoras 5’ e 3’ foram
seqüenciadas (+: inserção em sentido sense; -: inserção em sentido antisense; FTs: sítios de ligação de
fatores de transcrição).
Genes Elemento
Posição no
TE
FTs nos TEs
Cyp6w1_5’_DmGenômica
DNAREP1_DM
(+) 6-81
(-) 594-375
(+) 330-416
-
TBP
NF-1, C/EBPalpha
Cyp6w1_5’_DmLE
DNAREP1_DM
(-) 594-375 TBP
Cyp6w1_5’_DmITA
DNAREP1_DM
Helitron-1_Dyak
(-) 594-375
(+) 314-415
TBP, NF-1, C/EBPalpha
C/EBPalpha, NF-1
Cyp6w1_5’_DmRP
-
Cyp6w1_5’_DmBG
DNAREP1_DM
Helitron-1_Dyak
(-) 594-375
(+) 314-415
TBP, NF-1, C/EBPalpha, Oct-1
NF-1, C/EBPalpha, Oct-1
Cyp6w1_5’_DmTAV
DNAREP1_DM
Helitron-1_Dyak
(-) 594-375
(+) 314-415
TBP, NF-1, C/EBPalpha
NF-1, C/EBPalpha, TBP
Cyp6w1_5’_DsGenômica
DNAREP1_DM
Helitron-1_Dyak
(-) 594 -469
(-) 564-314
(+) 1-415
C/EBPalpha
Repressor, Sp1, Hb, TBP, Kr
C/EBPalpha
Cyp6w1_5’_DsPF
DNAREP1_DM
Helitron-1_Dyak
Helitron-1_Dyak
(-) 594-469
(-) 564-314
(+) 1-415
Sp1, C/EBPalpha, SRF, Repressor, Kr
Repressor, Sp1, C/EBPalpha, SRF, Kr
C/EBPalpha, Sp1
Cyp6w1_3’_DmGenômica
DNAREP1_DM (+) 188-587 NF-ATc3, YBP, HNF-3B, Hb, Oct-1,
GATA-1
Cyp6w1_3’_DmRP
DNAREP1_DM
(+) 419-587 TBP, Hb, C/EBPalpha, GATA-1,
Cyp6w1_3’_DmBG
-
Cyp6a2_5’_DsGenômica
Helitron-1_Dyak
DNAREP1_DM
(+) 1-392
(+) 443-594
TBP, GATA-1, Sp1, C/EBPalpha, HNF-
3B
GATA-1
Cyp6a2_5’_DsITA
DNAREP1_DM
(+) 443-594
GATA-1
Cyp6a2_3’_DmGenômica
ISFUN1
DNAREP1_DM
(+) 87-208
(+) 150-211
-
-
Cyp6a2_3’_DmRP
Helitron-1N1_Dvir
(+) 108-263 -
Cyp6a2_3’_DsGenômica
Helitron-1_Dvir
MINIME_DN
Helitron-1N1_Dvir
Helitron-1_Dyak
(+) 108-212
(+) 319-475
(+) 148-263
(+) 135-211
-
-
-
-
Cyp6a2_3’_DsAMI
Helitron-1_Dvir
MINIME_DN
Helitron-1N1_Dvir
(+) 108-212
(+) 319-474
(+) 148-263
-
-
-
Cyp6a2_3’_DsMAK
Helitron-1N1_Dvir
(+)108-263 -
59
Cyp6w1_5’_Dm Cyp6w1_5’_Ds
Cyp6w1_3’_Dm Cyp6w1_3’_Ds
Cyp6a2_5’_Dm Cyp6a2_5’_Ds
Cyp6a2_3’_Dm Cyp6a2_3’_Ds
Cyp12d1_5’_Dm Cyp12d1_5’_Ds
Figura 10. Análises por PCR das regiões flanqueadoras 5’e 3’dos genes Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1 em
linhagens de D. melanogaster (SE: Aracaju, SE; LE: Lençóis, BA; MU: Mucuri, BA; ITA: Itaúnas, ES;
RP: São José do Rio Preto, SP; BG: Bento Gonçalves, RS; SM: Santa Maria, RS; TAV: Tavares, RS;
Canton-S: laboratório) e de D. simulans (LE: Lençóis, BA; UM: Mucuri, BA; ITA: Itaúnas, ES; PF: Paulo
de Faria, SP; OV: Onda Verde, SP; RAT: Ratones, SC; BG: Bento Gonçalves, RS; AMI : AMIEU, Nova
Caledônia; MAK: Makindu, Quênia; MAD: Madagáscar, África).1 (1Kb Plus DNA Ladder).
60
2.5 DISCUSSÃO
Genes responsáveis por codificarem hormônios, fatores de transcrição e outros produtos
envolvidos no desenvolvimento de um organismo, são considerados essenciais para sua
sobrevivência. Devido a essa restrição funcional, tais genes tendem a ser altamente conservados,
e a ocorrência de mutações deletérias, dentro ou próximas a eles, resulta em efeitos letais
(WAGNER et al., 2003; SIMONS et al., 2006). Por outro lado, genes ligados a respostas
ambientais e a estímulos externos, tais como aqueles envolvidos no metabolismo de xenobióticos,
no sistema imunológico e de resposta ao estresse, apresentam maior plasticidade genômica (VAN
DE LAGEMAAT et al., 2003; CHEN; LI, 2007).
Os genes da família Citocromo P450 monooxigenases (Cyps) são responsáveis pela
detoxificação de xenobióticos, dentre eles, os inseticidas (AMICHOT et al., 2004). A inserção de
TEs nas proximidades desses genes pode alterar a regulação e causar um forte impacto na
expressão gênica e, conseqüentemente, conduzir à superexpressão das enzimas CYPs, o que pode
induzir a resistência aos inseticidas (DABORN et al., 2001; 2002; CATANIA et al., 2004;
JOUBEN et al., 2008). Entretanto, a ocorrência de TEs em genes essenciais para o
funcionamento do organismo, devido à alta restrição funcional, geralmente é deletéria e estes são
eliminados da população.
A relação entre genes envolvidos na imunidade ou a respostas a estímulos externos e
maior número de TEs em suas regiões promotoras, que em genes relacionados ao
desenvolvimento foi demonstrada, in silico, por van de Lagemaat et al. (2003), em regiões
transcritas dos genes de humanos e camundongo, e por Chen e Li (2007), em Cyps associados a
resistência, em D. melanogaster. Em face desses resultados, os autores formularam a hipótese de
que inserções de TEs nos Cyps relacionados à resistência a xenobióticos podem ser adaptativas e
serem mantidas nas populações, enquanto aquelas em genes relacionados ao desenvolvimento
estariam sob forte pressão seletiva negativa, resultando em maior plasticidade genômica nos
primeiros, e maior conservação nos últimos. Tal fonte de variabilidade genética seria vantajosa
para organismos, tais como os insetos, que ocupam ambientes altamente variáveis e seletivos.
61
2.5.1 Inserção de TEs em genes Cyps e seus flanqueadores
A maior parte das inserções de TEs nos 35 genes investigados neste trabalho, em D.
melanogaster e D. simulans, ocorreu em seqüências não codificantes (regiões intergênicas e
introns), e foram praticamente ausentes em regiões codificantes, como descrito anteriormente em
Drosophila (MILLER et al., 2000; KAMINKER et al., 2002; FONTANILLAS et al., 2007). Esta
distribuição se deve ao fato de inserções em regiões não codificantes serem mais toleradas
enquanto que, inserções em regiões codificantes ou próximas a elas podem causar efeitos
deletérios, e assim, serem removidas por seleção normalizadora (LIPATOV et al., 2005; SELA et
al., 2007; YANG; BARBASH, 2008).
Para testarmos a hipótese de que genes Cyps relacionados à resistência aos inseticidas
apresentam maior plasticidade genômica, foram comparados os números de inserções de TEs em
genes Cyps com diferentes funções, em genes flanqueadores dos Cyps e em uma amostra
aleatória de 35 genes, tanto em D. melanogaster, como em D. simulans. Neste estudo, as
inserções de TEs foram, em média (total de inserções/número de genes), mais freqüentes em
regiões intergênicas de genes Cyps associados à resistência aos inseticidas, tanto em D.
melanogaster (três vezes maior) como em D. simulans (seis vezes maior) do que nos Cyps
associados ao desenvolvimento. Os genes flanqueadores aos Cyps em D. simulans também
apresentaram maior número de inserções na região intergênica, porém, os flanqueadores aos Cyps
em D. melanogaster apresentaram maior número de inserções em regiões gênicas, principalmente
nos introns. Diferente dos Cyps, a maior média de inserções ocorreu nos flanqueadores dos Cyps
associados à atividade monooxigenase, em ambas as espécies. Esses resultados sugerem que a
pressão seletiva contrária à inserção, ou manutenção de TEs, em genes associados ao
desenvolvimento se estende aos genes vizinhos.
As inserções de TEs encontradas nas regiões intergênicas não correspondem a elementos
completos, ao contrário, são fragmentos pequenos (D. melanogaster: 564 nt, D. simulans: 196 nt,
em média), correspondentes em média a 15,49 % (D. melanogaster) e 4,93 % (D. simulans) do
tamanho das seqüências consensos (3.641 pb e 3.970 pb) dos TEs. Essas inserções, de forma
geral, localizam-se preferencialmente na região intergênica 5’ dos genes, como também descrito
por Yant et al. (2005), em humanos e camundongo. Este resultado suporta a hipótese de que
62
fragmentos de TEs enriquecem as regiões promotoras, doando sinais reguladores da transcrição e
podendo alterar a expressão gênica, como relatado em humanos por Jordan et al. (2003) e
Thornburg et al. (2006). A comparação do número de inserções nas regiões flanqueadoras
distantes em até 3 kb do início dos genes, independente de sua categoria funcional, reforça essa
hipótese apenas para os Cyps de D. melanogaster. Entretanto, considerando as diferentes classes
funcionais, os genes Cyps associados à resistência apresentaram, em média, duas vezes mais
inserções em D. melanogaster, e quatro vezes mais em D. simulans, do que nas demais
categorias. Esses resultados reforçam a proposta já discutida anteriormente de que fragmentos de
TEs são seletivamente enriquecidos em genes associados à resistência em Drosophila (CHEN;
LI, 2007) e indicam que D. melanogaster e D. simulans apresentam características particulares
não apenas quanto à proporção genômica de TEs, como também quanto a proporção de TEs
inseridos nas regiões adjacentes aos Cyps.
Em D. melanogaster, as classes de TEs com maior abundância (BERGMAN et al., 2006)
são, em ordem decrescente: DNA (56,6 %: 3.050/5.390) > LTR (24,5 %: 1.321/5.390) >
Retroposons (18,9 %: 1.019/5.390), sendo as proporções em parênteses correspondentes ao
número de TEs de cada classe em relação ao número total de TEs do genoma. Quando excluído o
DNAREP1_DM da classe dos transposons de DNA, em decorrência da dúvida quanto a sua
classificação, a proporção de TEs se altera para: LTR > Retroposons > DNA. Nossos resultados
mostram que, de modo geral, mesmo excluindo o DNAREP1_DM, os genes Cyps apresentam
maior quantidade de transposons de DNA, pois, outros elementos de DNA como o PROTOP_A e
Helitron-1_Dyak, também apresentaram elevado número de cópias, seguidos pelos Retroposons e
LTRs. Tendência à inserção de transposons próximos a regiões reguladoras de genes pode
explicar esse resultado, como relatado para o transposon P (TOWER et al., 1993; SPRADLING
et al., 1995) e Sleeping Beauty (YANT et al., 2005). Outra explicação poderia ser que a inserção
de diferentes elementos em todas as regiões intergênicas é casual, mas ocorre manutenção
preferencial dos elementos de DNA na região 5’ dos genes. Feschotte (2008) observou que a
manutenção de transposons de DNA no genoma, ou de seqüências codificantes de suas
transposases, se deve ao fato de que essas seqüências podem ser fontes para ligação de fatores de
transcrição. Assim, os fragmentos de TEs podem representar um importante papel na regulação
gênica, sendo mantidos ou até exaptados nas proximidades dos genes.
63
2.5.2 Inserção do elemento DNAREP1_DM
O elemento DNAREP1_DM ocorre em elevado número de cópias nas doze espécies de
Drosophila que tiveram seus genomas seqüenciados estando, a maioria delas, inserida em introns
e regiões intergênicas (YANG; BARBASH, 2008). De acordo com Yang e Barbash (2008), as
cópias desse TE em D. melanogaster, D. simulans, D. sechellia, D. erecta e D. grimshawi
apresentam identidade média de 90 %, mas em D. yakuba, D. ananassae, D. persimilis, D.
pseudoobscura e D. willistoni, a identidade é maior que 95 %; por isso, esses autores sugeriram
que o DNAREP1_DM deve ter sofrido uma recente explosão transposicional nas espécies do
segundo grupo, por apresentarem cópias jovens e pouco divergentes.
Nosso estudo mostrou que as sete cópias do DNAREP1_DM localizadas nas regiões
intergênicas dos genes Cyps de D. melanogaster, dessas 6 localizadas nas regiões próximas até 3
kb de cada gene, apresentaram identidade média de 82 %. As 15 cópias (seis inseridas em até 3kb
do gene) dos Cyps de D. simulans apresentaram 81 % de identidade média. Esses resultados
indicam que as inserções do DNAREP1_DM em regiões intergênicas dos Cyps são mais
divergentes do que a média das cópias distribuídas ao longo do genoma. Este percentual inferior
de identidade, associado ao pequeno tamanho, corroboram o fato de serem cópias antigas nas
duas espécies, desse modo já expostas ao crivo da seleção normalizadora que resulta em
eliminação de TEs deletérios em regiões próximas a genes. Segundo Gotea e Makalowski (2006),
são necessários longos períodos evolutivos para que as cópias de TEs sejam exaptadas e possam
adquirir uma função biológica. Assim, cópias jovens, além de sofrerem grande pressão seletiva,
não teriam tido tempo necessário para evoluírem e adquirirem novas funções. A presença de
cópias pequenas e divergentes do elemento DNAREP1_DM, inseridas preferencialmente nas
regiões 5’ dos genes e, apresentando putativos sinais reguladores da transcrição gênica (motivos
de ligação de fatores de transcrição), sugerem que possam atuar de maneira positiva na expressão
de genes Cyps.
64
2.5.3 Análises de sequências de TEs em regiões flanquedoras de genes Cyps em linhagens de
D. melanogaster e D. simulans suscetíveis e resistentes a inseticidas
A diversidade nucleotídica entre algumas cópias dos elementos mais freqüentes nas
linhagens geográficas foi utilizada para avaliar o grau de diversidade em diferentes elementos
inseridos nas regiões flanqueadoras dos genes Cyps associados à resistência aos inseticidas.
Embora os valores de
π
tenham sido obtidos com um número reduzido de sequências, foi feita
uma comparação aproximada com o nível de diversidade nucleotídica de outros TEs. Os valores
estimados para os TEs DNAREP1_DM e Helitron-1N1_Dvir foram semelhantes aos encontrados
por Subramanian et al. (2008) para TEs presentes em populações de Anopheles gambiae. O
elemento Topi, por exemplo, localizado em regiões codificantes, apresentou um elevado nível de
diversidade nucleotídica (
π
= 0.051), sugerindo serem residentes antigos nessa espécie. O mesmo
pode ser concluído em relação aos elementos DNAREP1_DM (
π
= 0.011) e Helitron-1N1_Dvir
(
π
= 0.028 e 0.097), inseridos nas regiões flanqueadoras dos Cyps de D. melanogaster e D.
simulans. Essas cópias antigas poderiam ser remanescentes do crivo da seleção normalizadora e
terem adquirido uma função biológica (GOTEA; MAKALOWSKI, 2006), atuando na expressão
dos genes vizinhos, devido a esses elementos transportarem diferentes sítios de ligação para
fatores de transcrição.
65
2.6 CONCLUSÃO
Neste trabalho não foi possível identificar qualquer diferença quanto à freqüência de
elementos de transposição nas regiões flanqueadoras de genes Cyps associados à resistência aos
inseticidas em linhagens de D. melanogaster e D. simulans resistentes ou suscetíveis. Entretanto,
foi possível mostrar que os genes associados à resistência aos inseticidas acumulam fragmentos
de TEs em maior proporção que os demais Cyps e que essas proporções variam nas duas espécies
crípticas, D. melanogaster e D. simulans. Um desses elementos foi o DNAREP1_DM, que ocorre
nesses genes como fragmentos antigos, correspondentes à extremidade 3´ do elemento consenso,
que contêm seqüências homólogas a sítios de ligação de fatores de transcrição. Essas
características corroboram achados anteriores (DABORN et al., 2002; CATANIA et al., 2004;
CHUNG et al. 2007) de que TEs interfiram na transcrição, elevando a expressão desses genes.
O que torna os TEs ricos estoques de elementos cis-regulatórios? De acordo com
Feschotte (2008) uma explicação pode ser que o acúmulo de TEs cria o material bruto para
evolução “de novo” dessas seqüências por mutação, desde que a maior parte dos sítios de ligação
de fatores de transcrição é constituída por seqüências curtas e degeneradas (WRAY et al., 2003).
Desse modo, mutações de ponto poderiam originar essas seqüências em TEs. Outro cenário,
segundo Feschotte (2008), é que os elementos cis-regulatórios pré-existam nos TEs, no momento
de sua inserção, e sejam co-optados imediatamente após a inserção, ou após a modificação do
ambiente flanqueador. Uma larga variedade de elementos regulatórios tem sido identificada em
seqüências ativas ou consensos reconstruídos de TEs ativos (JOHNSON et al., 2006; POLAK &
DOMANY, 2006; THORNBURG et al., 2006; WANG, et al. 2007) e muitos estudos empíricos
demonstram que esses elementos são incorporados nos aparatos regulatórios dos genes adjacentes
(WESSLER et al., 1995; FERRIGNO, et al., 2001; BROSIUS, 2003; MEDSTRAND et al., 2005;
ROMANISH et al., 2007). Esse segundo cenário ajusta-se aos resultados obtidos para o elemento
DNAREP1_DM neste trabalho, entretanto, estudos empíricos com transfecção e testes de
expressão dessas putativas seqüências reguladoras são necessários para corroborar essa hipótese.
66
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WRAY, G. A. The Evolution of Transcriptional Regulation in Eukaryotes. Mol. Biol. Evol., v.
20, p. 1377-1419, 2003.
WINDELSPECHT M., RICHMOND R. C., COCHRANE B. J. Malathion resistance levels in
sympatric populations of Drosophila simulans (Diptera, Drosophilidae) and Drosophila
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YANG, H-P.; BARBASH, D. A. Abundant and species-specific DINE-1 transposable elements in
12 Drosophila genomes. Genome Biol., v. 9, R39, 2008.
YANT, S. R. et al. High-Resolution Genome–Wide Mapping of Transposon Integration in
Mammals. Mol. Cell. Biol., v. 25, p. 2085-2094, 2005.
Apêndice A - Número total e porcentagem (%) de inserções de
TEs em regiões intergênicas 5’ e 3’, em relação ao total de
inserções, em 35 genes Cyps associados com resistência aos
inseticidas (N: 9), com atividade monooxigenase (N: 20) e ao
desenvolvimento (N: 6) em D. melanogaster.
N: número de genes.
* x
2
: p < 0,05 entre o número de inserções 5’ e 3’.
Inserções presentes na região intergênica comum a dois genes
foram contadas para ambos:
a
inserção comum entre dois genes
Cyps.
nº de inserções
Cyp/função
5’
3’
Total
Resistência aos inseticidas
Cyp6w1 6
1
7
Cyp6a2 2
2
Cyp4e2 1
a
1
Cyp12d1 1
1
Cyp6g1
Cyp6a9
Cyp6a8 3
a
3
Cyp12a4 1 1
Cyp308a1
%
73,33 26,6
x
2
10,42*
Atividade monooxigenase
Cyp4ad1 1
a
1
Cyp4e1
Cyp6a14 2
a
1 3
Cyp6a15Psi 2
a
2
Cyp6a13
Cyp6g2
Cyp6t3
Cyp301a1
Cyp9h1 1
1
Cyp6a22 1
1
Cyp6a17
Cyp6a23
Cyp6a19
Cyp6a20
Cyp6a21
Cyp317a1 3
a
3
Cyp12c1
Cyp12a5
Cyp6a18
Cyp4g1
%
81,81
18,1
9
x
2
19,60*
Desenvolvimento
Cyp302a1
Cyp307a1
Cyp314a1
Cyp315a1
Cyp306a1
3
3
Cyp18a1
%
100
x
2
73
Apêndice B - Número total e porcentagem (%) de inserções de TEs em regiões intergênicas e gênicas em
relação ao total de inserções em 36 genes flanqueadores aos Cyps associados com resistência aos inseticidas
(N: 11), com atividade monooxigenase (N: 16) e ao desenvolvimento (N: 9) em D. melanogaster.
N: número de genes.
* x
2
: p < 0,05 entre o número de inserções 5’ e 3’.
sem hit: não foi encontrado alinhamento significativo com nenhuma proteína depositada no The Gene Ontology
nº de inserções
Genes flanqueadores
aos Cyps
Função
5’ 3’
éxon intron UTR Total
Resistência aos
inseticidas
EcR receptor de ecdisona 14 3 17
CG8343 ligante da manose
Epac fosforilação 2
2
SdhB succinato
CG30490 desconhecida 1 1
BBS4 mobilidade do 2 2
DebB biossíntese de ecdisona
Chmp 1 proteína de transporte
CG6893 proteína de transporte
CG5629 sem hit
CCKLR-17D1 receptor de membrana
%
4,55 81,81 13,64
x
2
Atividade
monooxigenas
e
Lcp4 proteína da cutícula
LvpH proteína visceral larval
CG12780 ligante de bactéria 4 4
CG14748 sem hit
CG8858
catabolismo de
ferormônio
CG33775 desconhecida
CG8816
fosforilação de
aminoácido
CG17580 sem hit
Or49b receptor do olfato
Pcf11 clivagem de RNA
CG10249 sem hit 1 1
CG6040 sem hit 7 7
CG13978 crescimento celular 1 1
Gr98a receptor gustativo
Ase
desenvolvimento do
sistema nervoso
Exp6 proteína de transporte
%
69,23 30,77
x
2
7,01*
Desenvolvimento
CG18869 atividade transferase
CG32259 desconhecida
CG5146 sem hit
CG10592 atividade fosfatase
HGTX sistema nervoso 1 1 2
CG9628 sem hit 1 1
CG6959
proteína de ligação
CG6962
sem hit
CG6696 proteólise
%
33,33 33,33 33,33
x
2
74
Apêndice C - Número total e porcentagem (%) de inserções de
TEs em regiões intergênicas 5’ e 3’, em relação ao total de
inserções, em 35 genes Cyps associados com resistência aos
inseticidas (N: 9), com atividade monooxigenase (N: 20) e ao
desenvolvimento (N: 6) em D. simulans.
N: número de genes.
* x
2
: p < 0,05 entre o número de inserções 5’ e 3’.
nº de inserções
Cyp/função
5’
3’
Total
Resistência aos
inseticidas
Cyp6w1 19
3
22
Cyp6a2 2 4
6
Cyp4e2
Cyp12d1 2 2
Cyp6a9
Cyp6a8
Cyp6g1
Cyp12a4
Cyp308a1
%
77 23
x
2
13,69*
Atividade
monooxigenase
Cyp4ad1
Cyp6a14 1
2
3
Cyp6a13
Cyp301a1
Cyp9h1 3
3
Cyp6a22 1
1
Cyp6a17
Cyp6a23
Cyp6a19
Cyp6a20
Cyp6a21
Cyp317a1
Cyp4e1
Cyp6a15Psi
Cyp6g2
Cyp6t3
Cyp12c1
Cyp12a5
Cyp6a18
Cyp4g1
%
29 71
x
2
8,76*
Desenvolvimento
Cyp302a1
Cyp307a1
Cyp314a1
2
2
Cyp315a1 1
1
Cyp306a1
Cyp18a1
%
100
x
2
75
Apêndice D - Número total e porcentagem (%) de inserções de TEs em regiões intergênicas e
gênicas em relação ao total de inserções em 38 genes flanqueadores aos Cyps associados com
resistência aos inseticidas (N: 12), com atividade monooxigenase (N: 17) e ao desenvolvimento
(N: 9) em D. simulans.
N: número de genes.
* x
2
: p < 0,05 entre o número de inserções 5’ e 3’.
sem hit: não foi encontrado alinhamento significativo com nenhuma proteína depositada no The Gene Ontology
nº de inserções
Genes flanqueadores
aos Cyps
Função
5’ 3’
intron Total
Resistência aos
inseticidas
GD10333 sem hit
GD10399 ligante da manose
GD10301 fosforilação
GD10299 fosforilação
GD10562 atividade monooxigenase
GD17879 desconhecida
GD25944 metabolismo de resistência
GD15241 atividade monooxigenase
GD20134
sem hit
GD15624 sem hit
GD15623 metabolismo de resistência 2 2
GD15622 ligante de actina
%
100
x
2
Atividade
monooxigenase
GD10560 proteína da cutícula larval 1 1
GD10159 sem hit
GD10574 atividade monooxigenase
GD10156 sem hit 2 2
GD25831 desconhecida
GD25830 sem hit
GD10922 sem hit 1 3
4
GD10923 receptor do olfato
GD25648 clivagem de RNA
GD25644 metabolismo de resistência
GD15274 proteína visceral larval
GD15377 atividade monooxigenase
GD12332 sem hit
GD14765 transporte transmembrana
GD19271
sem hit 10 10
GD21335 sem hit 2 2
GD21337 receptor gustativo
%
84,21 15,79
x
2
22,72*
Desenvolvimento
GD13807
glucuronosiltransferase
GD13298
sem hit
GD13188
biossíntese de ecdisona
GD13186
atividade fosfatase alcalina
GD12614
desenvolvimento do sistema
nervoso
2 2
GD14494 sem hit
GD20627
sem hit
GD20628 receptor ligante
GD24857 biossíntese de ecdisona
%
100
x
2
76
77
Apêndice E - Número e orientação sense (s) e antisense (as) de inserções de TEs em intervalos de 500pb até 3 kb das regiões flanqueadoras de
D. melanogaster.
genes Cyps genes flanqueadores
5’ 3’ Total 5’ 3’ Total
Distância das
inserções
s as n % s as n % n % s as
n % s as n % n %
Resistência
0
-
500 pb
1
1
20
1
1
25
2
22,22
500
-
1000 pb
1
1
2
40
2
2
50
4
44,44
1000
-
2000 pb
1
1
20
1
1
25
2
22
,22
2000
-
3000 pb
1
1
20
1
11,11
Subtotal
3
2
5
10
4
4
10
9
Monooxigenase
0
-
500 pb
1
1
2
40
2
40
500
-
1000
pb
1
1
20
1
20
1000
-
2000 pb
1
1
2
40
2
40
2000
-
3000 pb
Subtotal
3
2
5
10
5
100
Desenvolvimento
0
-
500
pb
500
-
1000 pb
1000
-
2000 pb
2000
-
3000 pb
1
1
100
1
100
Subtotal
1
1
100
1
100
Total
6 4
10 4 4 14 100 1 1
1
2
100
78
Apêndice F - Número e orientação sense (s) e antisense (as) de inserções de TEs em intervalos de 500pb até 3 kb das regiões flanqueadoras de
D. simulans.
genes Cyps genes flanqueadores
5’ 3’ Total 5’ 3’
Total
Distância das
inserções
s as n % s as n % n % s as
n % s as n %
n %
Resistência
0
-
500 pb
1
1
14,28
4
4
57,14
5
35,71
500
-
1000 pb
1
1
14,28
1
7,14
1000
-
2000 pb
3
2
5
71,42
2
1
3
42,85
8
57
,14
2000
-
3000 pb
Subtotal
4
3
7
100
6
1
7
100
14
100
Monooxigenase
0
-
500 pb
1
1
10
0
1
1
2
66
,66
3
75
500
-
1000 pb
1000
-
2000 pb
1
1
10
0
1
10
0
2000
-
3000 pb
1
1
33,33
1
25
Subtotal
1
1
100
1
100
1
1
10
0
1
2
3
100
4
100
Desenvolvimento
0
-
500 pb
500
-
1000 pb
1000
-
2000 pb
2000
-
3000 pb
Subtota
l
Total
4 4
8 6 1 7 15 100 1 1 100 1 2 3 4 100
79
Apêndice G - Classes e sentido de orientação sense (s) e antisense (as) do número de inserções de TEs (n) em regiões
intergênicas de genes Cyp e de seus flanqueadores em D. melanogaster.
5’
3’
Subtotal
Total
Classes Inserções
s as
n %
s as
n %
s as
n %
Cyps
DNA
DNAREP1_DM
1
3
4
23,50
1
2
3
50
2
5
7
30,43
PROTOP_A
2
1
3
17,65
2
1
3
13,04
ISFUN1
1
1
5,88
1
1
16,67
2
2
8,70
PROTOP_B
1
1
5,88
1
1
4,35
PROTOP
1
1
5,88
1
1
4,35
POGON1
1
1
5,88
1
1
4,35
BARI_DM
1
1
16,67
1
1
4,35
hAT
-
1_DP
1
1
5,88
1
1
4,35
LTR
MAX_LTR
2
2
11
,76
2
2
8,70
MAX_I
1
1
5,88
1
1
4,35
LINE
TART_DV
2
2
11,76
2
2
8,70
LINEJ1_DM
1
1
16,67
1
1
4,35
Subtotal
7
10
17
100
4
2
6
11
12
23
100
Genes
flanqueadores
DNA
DNAREP1_DM
1
2
3
33,33
5
5
83,33
6
2
8
53,33
PROTOP_B
1
1
11,11
1
1
6,67
LTR
ROO_I
1
1
11,11
1
1
6,67
LINE
TART_DV
2
2
4
44,44
1
1
16,67
3
2
5
33,33
Subtotal
3 6
9 100
6
6 100
9 6
15 100
80
Apêndice H - Classes e sentido de orientação sense (s) e antisense (as) do número de inserções de TEs (n) em regiões
intergênicas de genes Cyp e de seus flanqueadores em D. simulans.
5’
3’
Subtotal
Total
Classes Inserções
s as
n
%
s as
n
%
s as
n
%
Cyps
DNA
DNAREP1_DM
8
5
13
46,43
1
1
2
16,67
9
6
15
37,50
Helitron
-
1_Dyak
6
3
9
32,14
2
2
4
33,33
8
5
13
32,50
Helit
ron
-
1_Dvir
2
2
16,67
2
2
5
BARI_DM
2
2
16,67
2
2
5
PROTOP_B
1
1
2
7,14
1
1
2
5
FB4_DM
1
1
3,57
1
1
2,50
TransibN1_DP
1
1
3,57
1
1
2,50
BARI1
1
1
8,33
1
1
2,50
HOBO
1
1
3,57
1
1
2,50
Retroposon
MINIME_DN
1
1
8,33
1
1
2,50
Não classificado
DMRP1
1
1
3,57
1
1
2,50
Subtotal
1
12
28
100
7
5
12
100
23
17
40
100
Genes
flanqueadores
DNA
Helitron
-
1_Dyak
2
2
4
25,00
2
2
4
19,04
DNAREP1_DM
2
2
12,50
2
2
9,52
BARI_DM
2
2
40,00
2
2
9,52
FB4_DM
1
1
6,25
1
1
4,76
BARI1
1
1
20,00
1
1
4,76
LTR
Stalker2_LTR
1
1
6,25
1
1
4,76
ROO_I
1
1
6,25
1
1
4,76
LINE
TART_DV
4
3
7
43,75
2
2
40,00
4
5
9
42,86
Subtotal
8 8
16 100
1 4
5 100
9 12
100
81
Apêndice I. Seqüências das regiões flanqueadoras dos genes Cyps amplificadas em linhagens resistentes e
suscetíveis de D. melanogaster (Dm = LE: Lençóis/BA; ITA: Itaúnas/ES; RP: São José do Rio Preto/SP;
BG: Bento Gonçalves/RS; TAV: Tavares/RS) e D. simulans (Ds = ITA: Itaúnas/ES; PF: Paulo de Faria/
SP; AMI : AMIEU/Nova Caledônia; MAK: Makindu/Quênia;). Letras minúsculas representam a
seqüência do TE inserido na região flanqueadora do gene Cyp.
>6w1_5_DmLE
TACATACATATATACATACATATTTACAAAAGCAGCTTAAACATATGTAT
ATAATTTTGATATTAACTATTGTGACGACATATGATTTTCCATTTAACTA
TGTAATACAAAATaaacaagaggtaatgctatagtcgagttcgccgaata
tcagatacccgttacccaactagtgtgaatgcgaacaggaaattttataa
ttttaatgggatattgatagatattggggaataaactgagaaaaaaattt
taaattgttccaagtgagggggtgaccggtttagcggcttaagggcgtta
gagcgtggcaaaacgttttttaggaaaAATATCAAACATTTAACAT
>6w1_5_DmITA
TAACCAGAAAAAGCTTTTAAGCTGTATCTTCTTAGGTGATTNATCCNTAC
ATACATATATACATACATATTTACAAAAGCAGCTTAAACATATGTATATA
ATTTTGATATTAACTATTGTGACGACATATGATTTTCCATTTAACTATGT
AATACAAAATaaacaagaggtaatgctatagtcgagttcgccgaatatca
gatacccgttacccatctagtgtgaatgcgaacacgaaattttataattt
tgatgggatattgatagatattggggaataaactgagaaaaaatttttaa
attgttctaagtgagggggtgaccggtttagcggcttaagggcgttagag
cgtggcaaaacgttttttaggaaaaatatcaaacatttaacattttctta
ttttatgatttgcttttagaatttctattggtatgccaaaaatgttttgc
cacgcgcactctaacgctcTAACTA
>6w1_3’_DmRP
GNATTGGTTCATGATGAGACACCCTRGWAAAWYYATWTYCGCSCCCAATA
TATAKGKATATAAACTTWAWTKTTTCAWTAWAWAWGTTYTTGAMTAGAGG
AGTYTGCTAGAGCCAMYTGGCTTTGAAAATTGTTACGATTTTTAATCGTT
TTATCAWTTTTCTTCTCATTTATTATGGACACGCCMAAATTATTTTGATG
TTTCCGACTCTAACCTCATAGAATTGTCGTTTTAAAAAGTTGTTTATTTT
TTATTTTAATAATTGAATTTAAATTTATAATTTTATTAAAAAAAAAAAAT
TATTAAAATTTATAAATTTTATCAGGAGTGTATTAAAATATAGAATAGKG
AAAGATTAGGCGAGAARGAACCCTTAGARRRACGTTARRACGTTARRAGC
AAATTTATTTGAGAAAGCTGGCAATCCCACAATTctgcccaaaactgcga
taccacaaaaatgttctgatttcttttttatttwactattttttttattc
aatttaataccccaattggcaatwaaaaattgttgcaatttcgtgcatgc
actccaaactagctcagtaaccgggtgctctgcatagtcaaggaaatagc
gttttttATAACCTAATARATTAGTTWACGGCTCGGCTGTTTTACACTGA
CCAGGAWTAAAATATACATCTTAAATKGTCGAAAATGTTTCTCTAACTGG
AAAACATCTCGCCAATCGATTGATCCGYGTTCTTTGACTATTCGTCATGC
TACAWTARRT
82
>6w1_5_DmBG
ACTTACATATCTAACTCACATTSKYMAYYCYKYTKYACTMAMAAGACTTA
GGAACACTATTAATCTTATAGTACATTAAATATAACCAGAAAAAGCTTTT
AAGCTGTATCTTCTTAGGTGCATACATACATACATACATATATACATACA
TATTTACAAAAGCAGCTTAAACATATGTATATAATTTTGATATTAACTAT
TGTGACGACATATGATTTTCCATTTAACTATGTAATACAAAATaaacaag
aggtaatgctatagtcgagttcgccgaatatcagatacccgttacccaac
tagtgtgaatgcgaacaggaaattttataattttaaatgggatattgata
gatattggggaataaactgagaaaaaaattttaaattgttctaagtgagg
gggtgaccggtttagcggcttaagggcgttagagcgtggcaaaacgtttt
ttaggaaaaatatcaaacatttaacatattcttattttatgatttgcttt
tagaatttctattggtatgccaaaaatgttttgccacgcgcactctaacg
ctcTAACTACGTCATATAAGCACTAAAGCATTAAAATTKGRRGCGTGCCA
CRKRMGKTWGATAGATTGTCTTAGGTGGGTGCTAT
>6w1_5_DmTAV
ACGTAGTTAgagcgttagagtgcgcgtggcaaaacatttttggcatacca
atagaaattctaaaagcaaatcataaaataagaatatgttaaatgtttga
tatttttcctaaaaaacgttttgccacgctctaacgcccttaagccgcta
aaccggttaccccctcacttagaacaatttaaaatttttttctcagttta
ttccccaatatctatcaatatcccattaaaattataaaatttcctgttcg
cattcacactagttgggtaacgggtatctgatattcggcgaactcgacta
tagcattacctcttgtttATTTGTATTACATAGTTAAATGGAAAATCATA
TGTCGTCACAA
> 6a2_3_DmRP
GTACACTAAACGAATAAAGTTCTGGAAATGAAAACAGTTTCCAGCTAAAA
TAAGAAATATACTACTACGTTTGCCATTGAGAATAAATAAAACAAAAGTC
AAGTGCTGACAACtatagttcttgttcgtgctaactagcccagacgatct
agccatgcccgtctcgatgtctgtctgtccgttatgtccgtatgtccgtt
tgtccgtttgtccgttcgttcgtgtgaaagtcgagatatccgggaaccat
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>12d1_5_DmBG (não houve inserção de TEs)
AGCGGCGCAGTGTGCATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTAATCGCCGTG
AATTGCCTACCTCACTCAACTGAAAAAATAAACAAATGAACGTGACTGGC
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83
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TTATGTTTGTTTTGCTAATTTCTATCGGTATAACAAAACACTTTGGCCCT
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ATACATTAAATATAATCAGAAAAAGCTTTTAAACTGCTCCTTATTGTGTC
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84
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gtccgtatgtccgtatgtccgtatgtccgtatgtccatttgtccgtccgt
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GTTTTGAAATTTAATAATTCAGCTACTTTATATGATATCACAAAAAATAT
CTATGATAAGTGGGCGAACTCATGAGCGATAAGCCGTAAAAATTTCTCAT
ATCTGGATGTCTGGCGGAGGCATTGAC
87
3.1 INTRODUÇÃO
Classicamente, os elementos transponíveis, seqüências medianamente repetidas do
genoma, foram considerados como parasitas genômicos (DOOLITTLE; SAPIENZA, 1980;
ORGEL; CRICK, 1980; OHNO; YOMO, 1991) em decorrência de sua capacidade intrínseca de
mobilização. Um corpo crescente de evidências mostra, entretanto, que os TEs têm exercido forte
influência na trajetória evolutiva dos organismos, por desempenharem um papel chave na
evolução da estrutura, função e regulação gênica dos eucariotos (BROSIUS, 1999;
MAKALOWSKI, 2000; 2003; KIDWELL, 2002; LORENC; MAKALOWSKI, 2003;
KIDWELL; HOLYOAKE, 2001; FONTANILLAS et al., 2007; FESCHOTTE, 2008), como
também para a evolução do tamanho dos genomas (PETROV 2001; KIDWELL, 2002).
Dentre os estudos que sugerem a participação dos TEs na regulação dos genes (e.g.
FESCHOTTE, 2008), destacam-se alguns relacionados com a evolução da resistência aos
inseticidas. Tem sido demonstrado que a presença de inserções de TEs em genes Cyps,
codificadores da família multigênica citocromo P450 monooxigenase, estimula a expressão de
genes responsáveis pela resistência metabólica em Drosophila (DABORN et al., 2002;
CATANIA et al., 2004; SCHLENKE; BEGUN, 2004; BOGWITZ et al., 2005; MARSANO et
al., 2005; CHUNG et al. 2007). A elevada expressão dos genes Cyps associados a detoxificação
de xenobióticos devido à inserção desses TEs, pode ser vantajosa por caracterizar a resistência
aos inseticidas ao hospedeiro. Análises in silico também têm sugerido uma vantagem seletiva da
inserção de TEs nas proximidades dos genes Cyps. Chen e Li (2007) mostraram que genes Cyps
de Drosophila melanogaster associados à resistência aos inseticidas possuem inserções de TEs ao
contrário daqueles associados ao desenvolvimento dos insetos, como por exemplo, os Cyps
associados à biossíntese de ecdisona. Esses resultados sugerem que genes envolvidos em
respostas ambientais tendem a ser mais tolerantes a mudanças genômicas causadas pela inserção
de TEs, e assim, apresentarem maior número de inserções, enquanto que genes envolvidos em
processos biológicos, como o desenvolvimento do organismo, são altamente conservados e,
portanto, as inserções são seletivamente eliminadas.
As espécies de Drosophila apresentam proporções bastante variáveis de TEs, como
ilustrado na Tabela 1. O grupo melanogaster, particularmente, apresenta as variações mais
88
extremas: D. ananassae, por exemplo, apresenta a maior proporção (24,03 %), enquanto D.
simulans apresenta a menor (2,73 %). Essa variação tende a estar diretamente relacionada ao
tamanho dos genomas: espécies com os maiores genomas são as que apresentam a maior
porcentagem de TEs e vice e versa. Com exceção de D. erecta, essa relação ocorre nas espécies
do grupo melanogaster (retângulo).
Tabela 1. Proporções de elementos de transposição em regiões eucromáticas de espécies de
Drosophila.
Grupos de Drosophila
Espécies
Tamanho do Genoma
Mb*
TEs (%)
melanogaster D. melanogaster
118 5,35
D. simulans
111
2,73
D. sechellia
115 3,67
D. yakuba
127 12,04
D. erecta
134 6,97
D.annanassae
176
24,93
obscura D. pseudoobscura
127 2,76
D. persimilis
138 8,47
saltans D. willistoni
187 15,57
repleta D. virilis
172 13,96
D. mojavensis
161 8,92
hawaianas D. grimshawi
138 2,84
* Clarck et al., 2007; em negrito as maiores e as menores proporções para o grupo melanogaster.
Duas questões podem ser formuladas em relação à inserção preferencial de TEs em genes
Cyps associados à resistência aos inseticidas. A primeira é se essa é uma particularidade da
espécie D. melanogaster, ou uma propriedade que se manteria para outras espécies do gênero
Drosophila. A segunda é se as variações acentuadas do número de TEs que se observa nas
diferentes espécies estariam refletidas na inserção preferencial de TEs nesses Cyps. Para
responder a essas questões, este trabalho teve por objetivo analisar nas espécies do grupo
melanogaster (D. melanogaster, D. simulans, D. sechellia, D. yakuba, D. erecta e D. ananassae),
os 13 genes Cyps estudados em D. melanogaster (CHEN; LI, 2007), com ênfase nas suas regiões
flanqueadoras 5’ e 3’, próximas em até 3 kb do sítio de início da transcrição de cada gene.
89
3.2 OBJETIVOS
Os objetivos específicos deste estudo foram:
1. Verificar se há inserção preferencial de TEs em genes Cyps associados à resistência aos
inseticidas nas espécies do grupo melanogaster que possuem o genoma seqüenciado;
2. Analisar se há inserção preferencial de TEs nas regiões intergênicas distantes em até 3 kb do
sítio de início da transcrição dos genes Cyps (região onde se localizam preferencialmente os
promotores) do que nas regiões gênicas;
3. Verificar se as espécies que possuem maior proporção de TEs possuem proporcionalmente
maior número de inserções nas regiões flanqueadoras dos Cyps.
90
3.3 MATERIAL E MÉTODOS
3.3.1 Análises de Bioinformática
Neste estudo foram analisados os genomas seqüenciados das seis espécies do grupo
melanogaster de Drosophila. O genoma de D. melanogaster está organizado em cromossomos e
o de D. simulans foi montado como um assembly mosaico correspondente a diferentes linhagens
geográficas. As seqüências dos braços cromossomais 2L, 2R, 3L, 3R, 4, X e a parte não agrupada
(chamada de U) correspondem à versão do genoma de D. simulans disponível no sítio ftp do
Genome Sequencing Center da Washington University Medical School
(ftp://genome.wustl.edu/pub/organism/Invertebrates/Drosophila_simulans_mosaic/assembly/Dros
ophila_simulans_mosaic-1.0). Os genomas das outras quatro espécies (D. sechellia, D. yakuba,
D. erecta e D. ananassae) foram seqüenciados, mas, ainda não estão organizados em
cromossomos. As versões dos genomas utilizados e o número de genes de cada espécie estão
indicados na Tabela 2.
Tabela 2. Número de genes e genomas utilizados para a análise de inserções de TEs nas espécies
do grupo melanogaster.
Espécies Número de genes
1
Genomas
2
D. melanogaster
13.733
ftp://ftp.flybase.net/releases/FB2008_01/dmel_r5.5/fasta
D. simulans
15.983
ftp://ftp.flybase.net/releases/FB2008_01/dsim_r1.0/fasta/
D. sechellia 16.884 ftp://ftp.flybase.net/releases/FB2008_01/dsec_r1.0/fasta/
D. yakuba 16.423 ftp://ftp.flybase.net/releases/FB2008_01/dyak_r1.0/fasta/
D. erecta 15.324 ftp://ftp.flybase.net/releases/FB2008_01/dere_r1.0/fasta/
D. ananassae 15.276 ftp://ftp.flybase.net/releases/FB2008_01/dana_r1.0/fasta/
1
Clarck et al. (2007).
2
ftp://ftp.flybase.net/releases/FB2008_01/
91
As seqüências disponibilizadas nestes releases foram analisadas quanto à ocorrência de
fragmentos de elementos de transposição nas regiões intergênicas 5’ e 3’, distante em até 3 kb do
sítio de início da transcrição do gene, bem como nas seqüências de 13 genes da família Cyp
nestas espécies. Dentre os 90 genes Cyps identificados em D. melanogaster (TIJET et al., 2001),
13 estão bem caracterizados quanto a sua função (CHEN; LI, 2007), oito deles estando
envolvidos no metabolismo de inseticidas e cinco na biossíntese de ecdisona (Tabela 3).
Tabela 3. Genes Cyps analisados.
Genes Função
Cyp6w1
Resistência aos
Cyp6a2
Resistência aos
Cyp4e2
Resistência aos
Cyp12d1
Resistência aos
Cyp6g1
Resistência aos
Cyp6a9
Resistência aos
Cyp6a8
Resistência
aos
Cyp12a4
Resistência aos
Cyp302a1
Biossíntese de ecdisona
Cyp307a1
Biossíntese de ecdisona
Cyp314a1
Biossíntese de ecdisona
Cyp315a1
Biossíntese de ecdisona
Cyp306a1
Biossíntese de ecdisona
Modelos gênicos estão disponíveis para as espécies do grupo melanogaster, entretanto,
apenas o genoma de D. melanogaster apresenta seus genes extensivamente anotados e
depositados no LocusLink (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi.db=gene). Assim, a
identificação dos genes da família Cyp nos genomas de D. simulans, D. sechellia, D. yakuba, D.
erecta e D. ananassae foi obtida por meio das coordenadas genômicas em D. melanogaster e por
meio de comparações por meio de BLASTN (ALTSCHUL et al. 1990) entre as seqüências
completas dos genes Cyps de D. melanogaster contra os genes preditos dos demais genomas. Em
D. ananassae, uma espécie mais divergente de D. melanogaster foi necessário realizar um
BLASTX para obtenção de um resultado mais fidedigno. Após levantamento da localização
92
genômica, foram extraídas as seqüências de cada gene Cyp, bem como suas regiões
flanqueadoras 5’ e 3’ distantes em até 3 kb do sítio de iniciação da transcrição.
A identificação de elementos de transposição foi realizada nas seqüências extraídas por
meio do programa RepeatMasker (RM) versão 3.1.9 (http://www.repeatmasker.org), com a
ferramenta de alinhamento Cross_match versão 0.990329 (pacote Phrap/cross_match/swat:
http://www.phrap.org/ phredphrapconsed.html) contra o banco de seqüências de TEs de
referência do gênero Drosophila oriundas do Repbase (JURKA et al., 2005). Para eliminar
resultados espúrios, somente escores de matches RM ≥ 225 foram aceitos, condições de procura
de maior sensibilidade/menor velocidade (condição “-s”), matriz relativa ao conteúdo GC do
query (“-gccalc”) e seqüências de DNA de baixa complexidade não foram mascaradas (“-
nolow”). Foram considerados todos os alinhamentos registrados pelo RepeatMasker para análises
posteriores sem imposição de escores adicionais e comprimento mínimo. O teste estatístico
aplicado para saber se houve diferença no número de inserções entre as regiões 5’ e 3’, foi o qui-
quadrado (x
2
).
3.3.2 Análises Evolutivas
Foram realizadas análises de distância (p), como implementado no programa DnaSP4
(ROZAS et al., 2003) entre as seqüências dos elementos DNAREP1_DM e das relações
evolutivas entre as cópias de diferentes genes e espécies por meio de neighbor-joining (NJ),
como implementado no programa MEGA 4 (TAMURA et al., 2007).
93
3.4 RESULTADOS
Como as seqüências de TEs podem possuir sinais reguladores da transcrição, os quais
podem alterar a expressão gênica, foi realizada uma busca por inserções de TEs em genes Cyps
associados à resistência aos inseticidas e Cyps associados ao desenvolvimento, para verificar se
havia inserção diferencial entre Cyps com funções distintas.
3.4.1 Ocorrência de inserções de TEs em genes Cyps e em suas regiões flanqueadoras 5’ e 3’
distantes até 3 kb do início da transcrição do gene
Dentre os Cyps associados à resistência, o número médio de inserções por gene, bem
como, seus tamanhos médios e taxa de divergência média são apresentados na Tabela 4. As
maiores médias de inserções por gene ocorreram em D. yakuba (4,75) e D. simulans (4,67),
seguidas por D. sechellia (3,33), D. erecta (2) e D. melanogaster (1,80). A espécie com menor
média de inserções foi D. ananassae, com apenas um TE por gene, sendo a espécie com o maior
genoma dentre as do grupo melanogaster. Por outro lado, a maioria dos Cyps associados ao
desenvolvimento não apresentou inserções, apenas D. yakuba e D. erecta tiveram uma inserção
respectivamente nos genes Cyp306a1 e Cyp302a1.
O tamanho médio dos fragmentos de TEs inseridos nos Cyps associados à resistência,
variou 97 pb (D. ananassae) a 1.093 pb (D. melanogaster) e, nas demais espécies, entre 110 e
222 pb. Os Cyps associados ao desenvolvimento que continham inserções apresentaram
fragmentos muito pequenos, com 62 pb (Cyp302a1 de D. erecta) e 90 pb (Cyp306a1 de D.
yakuba). Os fragmentos de TEs presentes nos Cyps associados à resistência apresentaram a maior
porcentagem de divergência em D. ananassae (21,04%), seguido por D. sechellia (19,38%), D.
erecta (18,07%), D. simulans (16,35%) e D. yakuba (13,76%). Quanto à cópia inserida no Cyp
associado ao desenvolvimento de D. yakuba apresentou 24,71% de divergência e a cópia presente
em D. erecta, 16,13%.
94
Com exceção de D. erecta, que apresentou duas inserções na região gênica do Cyp12a4
(intron) e uma inserção no Cyp302a1 (intron), as outras cinco espécies apresentaram inserções
apenas nas regiões flanqueadoras (Tabelas 5 a 10). D. yakuba foi a espécie com maior número de
inserções (20; Tabela 8), enquanto que D. ananassae foi a espécie com o menor número (2;
Tabela 10). As Tabelas 5 a 10 e a Figura 1 mostram que as inserções de TEs nas regiões
flanqueadoras estão principalmente localizadas na região 5’ dos genes de D. melanogaster (seis),
de D. yakuba (12) e de D. erecta (cinco). Por outro lado, em D. sechellia, foi observado o maior
número de inserções na região 3’ (seis) do que na região 5’ (quatro) dos Cyps. Em D. simulans e
D. ananassae, o número de inserções foi o mesmo para ambas regiões, sendo sete na primeira
espécie e uma na segunda. Porém, essas diferenças entre o número de inserções nas regiões 5’ e
3’ não foram significativas: D. melanogaster, D. sechellia e D. yakuba (x
2
:
1,80; p > 0,05) e D.
erecta (x
2
:
0,51; p > 0,05).
A Figura 1 mostra a distribuição dos elementos nas regiões flanqueadoras 5’ e 3’ dos
genes Cyps em cada espécie do grupo melanogaster. D. melanogaster apresentou dez inserções,
das quais, cinco, foram do elemento DNAREP1_DM, três cópias localizadas na região 5’ e duas
na 3’. O elemento ISFUN1 apresentou duas cópias inseridas na região 3’ dos genes Cyps. Os
elementos MAX_LTR e MAX_I tiveram apenas uma inserção na região flanqueadora 5’,
enquanto o BARI_DM também apresentou uma inserção, porém, na região 3’.
Do total de 14 inserções de TEs encontradas nos Cyps de D. simulans, seis foram do
Helitron-1_Dyak, estando três na região 5’ e três na região 3’. Das cinco cópias do elemento
DNAREP1_DM, quatro se localizavam na região 5’ e uma na região 3’. Apenas uma cópia dos
elementos Helitron-1_Dvir, Helitron-1N1_Dvir e MINIME_DN foram encontradas na região
flanqueadora 3’ dos Cyps.
D. sechellia apresentou dez inserções, sendo seis do elemento Helitron-1_Dyak, estando
três cópias em cada região flanqueadora. Apenas duas cópias do TE DNAREP1_DM foram
encontradas nessa espécie, estando uma em cada região flanqueadora. Uma cópia do elemento
Helitron-1_Dvir e do Helitron-2_Dvir foram localizadas na região 3’.
Em D. yakuba, a espécie com maior número de inserções de TEs (20), dentre as espécies
analisadas, metade das inserções (10) foram do DNAREP1_DM, distribuídas igualmente nas
duas regiões flanqueadoras. Dentre os elementos restantes, sete foram inserções do TE Helitron-
95
1_Dyak, localizando-se quatro na região 5’ e três na região 3’. Outros três elementos
(PROTOP_B, FB4_DM e hAT-1_DP) apresentaram apenas uma cópia na região flanqueadora 5’.
D. erecta apresentou 12 inserções de TEs nas regiões flanqueadoras dos genes Cyps.
Dessas inserções, cinco foram do DNAREP1_DM, estando quatro localizadas na região 5’ e uma
na região intrônica. O TE Helitron-1N1_Dvir apresentou duas inserções, estando cada uma em
uma das regiões flanqueadoras, e o Helitron-1_Dyak apenas uma inserção na região 3’ e duas em
região intrônica. Foram ainda encontrados os elementos MINIME_DN e TART_DV, com uma
cópia de cada na região flanqueadora 3’.
A espécie com o menor número de TEs nos genes Cyps, dentre as analisadas neste estudo,
foi D. ananassae, com apenas duas inserções, um fragmento do Helitron-2_Dvi, presente na
região flanqueadora 5’, e um do elemento TART_DV, localizado na região 3’.
96
Tabela 4. Valores médios (mínimos e máximos) do número, tamanho e divergência dos TEs inseridos em
genes Cyps.
Cyps de resistência (N = 8)
Cyps de desenvolvimento (N = 5)
Espécies
número
(< >)
tamanho
(< >)
divergência
(%)
(< >)
número
(< >)
tamanho
(< >)
divergência
(%)
(< >)
D. melanogaster
1,80
(1; 3)
1093
(31; 7914)
10,79
(0; 26,67)
0 0 0
D. simulans
4,67
(2; 6)
156
(36; 392)
16,35
(0; 25,86)
0 0 0
D. sechellia
3,33
(1; 7)
160
(31; 317)
19,38
(9,81; 26,85)
0 0 0
D. yakuba
4,75
(2; 6)
222
(38; 623)
13,76
(5,02; 24,13)
1
(1)
90
(90)
24,71
(24,71)
D. erecta
2
(1; 4)
110
(46; 194)
18,07
(10,76; 23,81)
1
(1)
62
(62)
16,13
(16,13)
D. ananassae
1
(1)
97
(77; 116)
21,04
(18,18; 23,90)
0 0 0
97
Tabela 5. Inserções de TEs em genes Cyps de D. melanogaster e em suas regiões flanqueadoras 5’ e 3’.
TE
Genes
tamanho
(orientação)
Região
Posição na região
flanqueadora
(pb)
orientação (+/-)
Família
score
RM
tamanho
(pb/ % no TE
consenso)
divergência
(%)
deleção
(%)
inserção
(%)
Posição no
TE consenso
(pb)
Tamanho do TE
consenso (pb)
5’
1593 - 1667 (+)
3293 - 3506 (-)
3518
-
3604
(+)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
243
1154
254
75 (12,63 %)
220 (37,03 %)
87 (14,65
%)
26.67
12.62
18.82
1.33
2.80
2.30
0
0
2.30
6 - 81
594 - 375
330
-
416
594
gene
Cyp6w1
1747 (+)
3’
1724
-
1981 (+)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
361
400 (67,34
%)
26.10
11.40
5.7
188
-
587
594
5’
gene
Cyp6a2
1741 (-)
3’
17052 - 17216 (+)
17163
-
17225 (+
)
LINE/Penelope/ISFUN1
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
228/314
370
163 (17,56 %)
62 (10,44
%)
21.47
16.13
2.45
0
4.29
1.59
87 - 208
150
-
211
928
594
5’
gene
Cyp4e2
2460 (+)
3’
1196
-
1226
(+)
LINE/Penelope/ISFUN1
239
31
(3,34
%)
0
0
0
76
-
106
928
5’
255 - 575 (-)
576
-
8483 (
-
)
LTR/Pao/MAX_LTR
LTR/Pao/MAX_I
2718
68921
321 (100 %)
7914
(100
%)
1.25
0.18
0
0.19
0
0.11
321 - 1
7914
-
1
321
7914
gene
Cyp6a8
1842 (-)
3’
5’
gene
Cyp12a4
1982 (+)
3’
1
-
960 (+)
DNA/Tc1/BARI
_DM
8946
960
(55,55
%)
0
0
0
17
-
976
1728
+: sentido sense; -: sentido antisense.
98
Tabela 6. Inserções de TEs em genes Cyps de D. simulans e em suas regiões flanqueadoras 5’ e 3’.
TE
Genes
tamanho
(orientação)
Região
Posição na região
flanqueadora
(pb)
orientação (+/-)
Família
score
RM
tamanho
(pb/% no TE
consenso)
divergência
(%)
deleção
(%)
inserção
(%)
Posição no TE
consenso (pb)
Tamanho do
TE consenso
(pb)
5’
19610 - 19729 (-)
19727 - 19967 (-)
19967 - 20357 (+)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
746
1254
23/1089
126 (21,21 %)
251 (2,31 %)
292 (2,70 %)
10.83
13.75
18.15
5.00
4.56
4.79
0
0.41
0
594 - 469
564 - 314
1 - 415
594
10846
gene
Cyp6w1
1660 (+)
3’
1348 - 1412 (+)
1800 - 1949 (+)
1996 - 2088 (-)
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
355
405
281
65 (0,6 %)
158 (26,6 %)
90 (0,83 %)
16.92
21.24
25.56
0
8.00
0
0
2.67
3.23
92 - 156
411 - 568
157
-
68
10846
594
10846
5’
1351 - 1810 (+)
1817
-
1967 (+)
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/Helitron
/DNAREP1_DM
1803
527
392 (3,61 %)
152 (25,6
%)
12.89
15.71
2.61
7.95
17.39
7.28
1 - 392
443
-
594
10846
594
gene
Cyp6a2
1590 (-)
3’
1273 - 1379 (+)
1293 - 1551 (+)
1431 - 1550 (+)
1471 - 1547 (+)
DNA/Helitron/Helitron-1_Dvir
MINIME_DN
DNA/Helitron/Helitron-1N1_Dvir
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
339
398/400
452
456
105 (1,19 %)
248 (20,36 %)
116 (1,32 %)
77 (0,71 %)
24.03
23.39
25.86
16.88
0.93
0.81
0
0
2.80
3.23
3.33
0
108 - 212
319 - 475
148 - 263
135 - 211
8816
1218
10846
10846
5’
373 - 408 (-)
740
-
821 (+)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
266
316
36 (6,06 %)
82 (13,80
%)
8.33
19.23
0
3.66
0
4.88
565 - 530
482
-
562
594
gene
Cyp12d1
1741 (-)
3’
+: sentido sense; -: sentido antisense.
99
Tabela 7. Inserções de TEs em genes Cyps de D. sechellia e em suas regiões flanqueadoras 5’ e 3’.
TE
Genes
tamanho
(orientação)
Região
Posição na
região
flanqueadora
(pb)
orientação (+/-)
Família
score
RM
tamanho
(pb/ % no TE
consenso)
divergência
(%)
deleção
(%)
inserção
(%)
Posição no TE
consenso (pb)
Tamanho do TE
consenso (pb)
5’
1239-1555 (-)
1318-1634 (-)
1839-2024 (-)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
1958
1425
1164
317 (53,36%)
317 (2,92%)
186 (1,71%)
9.81
16.72
13.44
5.05
5.36
4.84
0.32
0
0
594 - 263
647 - 314
1 - 195
594
10846
10846
gene
Cyp6w1
1660 (+)
3’
1344-1409 (+)
1790-1920 (+)
1914-2025 (-)
1940-2025 (-)
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron-2_Dvir
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
357
306
271
288
66 (0,60%)
131 (22,05%)
112 (1,22%)
86 (0,79%)
18.18
19.35
26.85
22.89
0
19.08
4.46
5.81
0
5.34
3.57
3.49
91 - 156
442 - 590
169 - 57
155 - 68
10846
594
9141
10846
5’
gene
Cyp6a2
1590 (-)
3’
2147-2281 (+)
2183-2278 (+)
DNA/Helitron/Helitron-1_Dvir
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
524
531
135 (1,53%)
96 (0,88%)
24.06
19.79
3.70
2.08
1.48
0
108 - 245
116 - 213
8816
10846
5’
1978
-
2130 (+)
DNA/
Helitron/Helitron
-
1_Dyak
437
153 (1,41%)
22.66
25.49
1.96
122
-
310
10846
gene
Cyp4e2
2238 (+)
3’
+: sentido sense; -: sentido antisense.
100
Tabela 8. Inserções de TEs em genes Cyps de D. yakuba e em suas regiões flanqueadoras 5’ e 3’.
+: sentido sense; -: sentido antisense.
TE
Genes
tamanho
(orientação)
Região
Posição na
região
flanqueadora
(pb)
orientação (+/-)
Família
score
RM
tamanho
pb/ % no TE
consenso)
divergência
(%)
deleção
(%)
inserção
(%)
Posição no TE
consenso (pb)
Tamanho do TE
consenso (pb)
5’
729-766 (-)
858-911 (-)
888-941 (-)
2227-2849 (-)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/P/PROTOP_B
DNA/Tc1/FB4_DM
269
310
329
1924
38 (6,39 %)
54 (0,49 %)
54 (4,68 %)
623 (15,23 %)
7.89
9.62
9.62
21.12
2.63
0
0
14.13
0
3.70
3.70
1.93
594 - 556
559 - 508
52 - 1
2755 - 2057
594
10846
1153
4089
gene
Cyp6w1
1659 (-)
3’
381-591 (-)
1626-1899 (-)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
561
921
211 (35,52 %)
274 (2,52 %)
20.59
15.65
16.59
17.88
3.32
4.38
362 - 124
591 - 281
594
10846
5’
gene
Cyp6a2
1592 (-)
3’
957-1092 (-)
1089-1404 (-)
1173-1404 (-)
1738-1882 (+)
2356-2558 (-)
2578-2670 (-)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/ DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
512
663
1168
800
481-876
686
136 (22,89 %)
316 (53,19 %)
232 (2,13 %)
145 (24,41 %)
200 (33,67 %)
93 (0,85 %)
18.65
24.13
11.74
15.17
9.17
8.60
2.21
5.38
17.67
5.52
7
0
1.47
9.49
0.86
0
1.41
0
590 - 454
594 - 292
564 - 294
113 - 265
594-525/309-158
94 - 2
594
10846
594
10846
5’
1094-1310 (-)
1306-1401 (+)
1445-1862 (+)
1882-1953 (+)
1968-2102 (+)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
618
493
3435
562
578
217 (36,53 %)
96 (0,88 %)
418 (3,85 %)
72 (12,12 %)
135 (22,72 %)
21.53
12,63
5.02
8.33
15.32
3.23
1.04
3.35
0
0.74
10.14
1.04
0
0
8.15
593 - 392
304 - 399
1 - 432
523 - 594
470 - 594
594
10846
10846
594
gene
Cyp4e2
2228 (+)
3’
5’
1850-2288 (+)
1898
-
2355 (+)
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
398-1625
1407
439 (4,04 %)
458 (77,10
%)
9.31
17.35
10.48
13.32
1.66
9.39
1-49/105-564
119
-
594
10846
594
gene
Cyp12d1
1739 (+)
3’
5’
2779-2868 (+) DNA/hAT/hAT-1_DP 238 90 (16,15 %) 24.71 8.89 1.11 2478 - 2574 557
gene
Cyp306a1
2244 (+)
3’
101
Tabela 9. Inserções de TEs em genes Cyps de D. erecta e em suas regiões flanqueadoras 5’ e 3’.
TE
Genes
tamanho
(orientação)
Região
Posição na
região
flanqueadora
(pb)
orientação (+/-)
Família
score
RM
tamanho
(pb/ % no TE
consenso)
divergência
(%)
deleção
(%)
inserção
(%)
Posição no TE
consenso (pb)
Tamanho do TE
consenso (pb)
5’
gene
Cyp6a2
1589 (+)
3’
757-931 (-)
760-835 (-)
770-909 (-)
2021-2083 (+)
DNA/Helitron/Helitron-1N1_Dvir
DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak
MINIME_DN
LINE/TART_DV
457
466
529
242
175 (33,71 %)
76 (0,70 %)
140 (11,49 %)
63 (0,41 %)
22.82
19.74
22.96
23.81
5.14
0
0
0
14.86
0
3.57
0
265 - 108
213 - 138
464 - 330
6982 - 7044
519
10846
1218
15099
5’
1190
-
1383 (+)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
1072
194 (32,65
%)
10.76
5.13
4.62
396
-
591
594
gene
Cyp4e2
2212 (-)
3’
5’
2528
-
2573 (
-
)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
236
46 (7,74
%)
17.39
2.17
0
575
-
529
594
gene
Cyp12d1
1743 (+)
3’
5’
2184-2295 (+)
2311
-
2387 (+)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
703
392
112 (18,85 %)
77
(
12,96
%)
11.61
15.50
0.89
0
0
7.79
1 - 113
523
-
593
594
gene
Cyp6a9
1566 (+)
3’
5’
gene
1683-1767 (-)
1799
-
18
51 (
-
)
DNA/Helitron/DNAREP1_DM
DNA/Helitron/Helitron
-
1_Dyak
393
449
85 (14,30 %)
53 (0,48
%)
17.65
0
5.88
0
0
0
590 - 501
53
-
1
594
10846
Cyp12a4
2042 (-)
3’
5’
gene
732-785 (+) DNA/Helitron/Helitron-1_Dyak 400 54 (9,09 %) 5.56 0 0 2 - 55 10846
Cyp302a1
1887 (+)
3’
5’
72-133 (+) DNA/Helitron/Helitron-1N1_Dvir
288 62 (11,94 %) 16.13 1.61 0 146 - 208 519
gene
Cyp306a1
2147 (+)
3’
+: sentido sense; -: sentido antisense.
102
Tabela 10. Inserções de TEs em genes Cyps de D. ananassae e em suas regiões flanqueadoras 5’ e 3’.
TE
Genes
tamanho
(orientação)
Região
Posição na
região
flanqueadora
(pb)
orientação (+/-)
Família
score
RM
tamanho (pb/
% no TE
consenso)
divergência
(%)
deleção
(%)
inserção
(%)
Posição no TE
consenso (pb)
Tamanho do TE
consenso (pb)
5’
1927-2042 (-)
DNA/Helitron/Helitron-2_Dvir
311 116 (1,26 %)
23.90 4.31 2.59 170 - 53 9141
gene
Cyp6w1
2131 (+)
3’
5’
gene
Cyp12a4
1954 (-)
3’
147-223 (+) LINE/TART_DV
266 77 (0,50 %) 18.18 3.90 0 11459 - 11538 15099
+: sentido sense; -: sentido antisense.
103
Figura 1. Porcentagem de inserções de TEs em regiões flanqueadoras. As colunas em preto representam a
porcentagem de inserções na região 5’ e as colunas em branco as inserções nas regiões 3’. (a) D.
melanogaster, (b) D. simulans, (c) D. sechellia, (d) D. yakuba, (e) D. erecta e (f) D. ananassae. Números
de inserções indicados acima de cada coluna; classe ou ordem a que cada TE pertence indicadas abaixo do
eixo x.
104
3.4.2 DNAREP1_DM e Helitron-1_Dyak: os TEs mais freqüentes nos Cyps analisados nas
espécies do grupo melanogaster
Consideramos como um elemento freqüente nos genes Cyps aqueles que estavam
presentes no mesmo gene em, no mínimo, três das seis espécies analisadas. Com este critério,
dois elementos foram freqüentes dentre os 13 genes Cyps, o DNAREP1_DM e o Helitron-
1_Dyak, cujas seqüências consenso apresentam, respectivamente, 594 pb e 10.846 pb (Tabela
11). A maioria das inserções do DNAREP1_DM encontradas correspondem à extremidade 3’ do
elemento consenso, ou à região da repetição central do elemento, com tamanho médio de 170 pb.
As inserções do elemento Helitron-1_Dyak correspondem à extremidade 5’ do elemento
consenso e apresentaram tamanho médio de 181 pb.
Dentre as cópias dos elementos DNAREP1_DM (20), foi possível realizar um
alinhamento entre 11 seqüências de modo a se fazer uma análise evolutiva objetivando avaliar se
essas eram inserções ancestrais entre as espécies do grupo melanogaster ou decorrentes de
eventos recentes de transposição. Para o Helitron-1_Dyak (16 cópias) não foi possível realizar tal
análise, visto as seqüências apresentarem pequeno tamanho e corresponderem a regiões distintas
do elemento consenso.
As análises das seqüências do DNAREP1_DM (Tabela 12 e Figura 2) mostraram que as
cópias presentes na região flanqueadora 5’ do gene Cyp6w1 de D. simulans (594 - 469), D.
sechellia (594 - 263) e D. melanogaster (594 - 375) são seqüências derivadas de uma inserção
presente no ancestral das três espécies, inseridas em sentido anti-sense em relação ao Cyp (p entre
D. simulans vs D. sechellia: 0.000 e, entre as duas espécies e D. melanogaster: 0.143). O mesmo
cenário se repete com as cópias inseridas em sentido sense na região 3’ desse gene; porém, nesse
caso, as cópias de D. simulans (411 - 568) e D. sechellia (442 - 590) são mais divergentes (p
entre D. simulans vs D. sechellia: 0.071) do que aquelas na região flanqueadora 5’. Do mesmo
modo, as cópias presentes no gene Cyp6a2 não evidenciam terem sido transmitidas verticalmente
entre as espécies a partir do ancestral comum. Elas se agrupam com aquelas inseridas na região
flanqueadora 5’ ou 3’ do Cyp6w1, o que sugere serem derivadas de eventos de transposição
ancestrais entre essas posições genômicas.
105
Tabela 11. Número dos elementos DNAREP1_DM e Helitron-1_Dyak nos genes
Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1.
Gene TE Espécie 5’ 3’ Total
Cyp6w1 DNAREP1_DM
D. melanogaster
3
1
4
D. simulans
1
1
2
D. sechellia
1
1
2
D. yakuba
1
1
2
Helitron-1_Dyak
D. simulans
2
2
4
D. sechellia
2
2
4
D. yakuba
1
1
2
Cyp6a2 DNAREP1_DM
D. melanogaster
-
1
1
D. simulans
1
-
1
D. yakuba
-
4
4
Helitron-1_Dyak
D. simulans
1
1
2
D. sechellia
1
1
D. yakuba
2
2
D. erecta
1
1
Cyp12d1 DNAREP1_DM
D. simulans
2
2
D. yakuba
1
1
D. erecta
1
1
106
Tabela 12. Distâncias p entre cópias do elemento DNAREP1_DM inseridas em regiões flanqueadoras 5’
(5) e 3’ (3) de genes Cyps (Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1) em D. melanogaster (Dmel), D. simulans
(Dsim), D. sechellia (Dsec) e D. yakuba (Dyak). Os números após o símbolo de cada espécie indicam a
região que a seqüência da cópia representa no elemento consenso e o sentido sense (+) ou antisense (-) da
inserção no TE.
Cópias do DNAREP1_DM
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1. 6w1_5_Dmel_594-375 (-)
2. 6w1_5_Dsim_594-469 (-) 0.143
3. 6w1_5_Dsec_594-263 (-) 0.143 0.000
4. 6w1_3_Dmel_188-587 (+) 0.357 0.314 0.314
5. 6w1_3_Dsim_411-568 (+) 0.371 0.329 0.329 0.100
6. 6w1_3_Dsec_442-590 (+) 0.357 0.314 0.314 0.071 0.071
7. 6a2_5_Dsim_443-594 (+) 0.314 0.329 0.329 0.400 0.414 0.386 0.586
8. 6a2_3_Dyak_590-454 (-) 0.371 0.314 0.314 0.329 0.329 0.314 0.600 0.357
9. 6a2_3_Dyak_594-292 (-) 0.357 0.343 0.343 0.329 0.314 0.329 0.557 0.443 0.371
10. 12d1_5_Dyak_119-594 (+) 0.557 0.557 0.557 0.557 0.557 0.557 0.571 0.557 0.543 0.457
107
Figura 2. Árvore de neighbor-joining para cópias do elemento DNAREP1_DM inseridas em regiões
flanqueadoras 5’ e 3’ de genes Cyps (Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1) em D. melanogaster (Dmel), D.
simulans (Dsim), D. sechellia (Dsec) e D. yakuba (Dyak). Os números após o símbolo de cada espécie
indicam a região que a seqüência da cópia representa no elemento consenso e o sentido sense (+) ou
antisense (-) da inserção no TE.
108
3.5 DISCUSSÃO
De modo geral, as inserções de TEs tendem a se localizarem em seqüências não
codificantes (regiões intergênicas e introns), estando menos presentes em regiões codificantes do
genoma de Drosophila e outros organismos (e.g. MILLER et al., 2000; KAMINKER et al., 2002;
FONTANILLAS et al., 2007) em decorrência de inserções em regiões não codificantes serem
mais toleradas, enquanto que, inserções em regiões codificantes ou próximas a elas poderem
causar efeitos deletérios, e assim, serem removidas por seleção normalizadora (LIPATOV et al.,
2005; SELA et al., 2007; YANG; BARBASH, 2008). Os resultados obtidos para os genes Cyps
foram concordantes com essa expectativa, pois, praticamente todas as inserções estavam
presentes nas regiões flanqueadoras dos genes.
Dentre os genes Cyps analisados neste trabalho, praticamente todas as inserções
ocorreram em Cyps associados à resistência aos inseticidas, com exceção de uma inserção na
região flanqueadora 5’ do gene Cyp306a1 de D. yakuba e de D. erecta, e no intron do Cyp302a1
de D. erecta. Esses resultados são concordantes com aqueles obtidos por Chen e Li (2007) em D.
melanogaster, analisando os mesmo genes estudados neste trabalho, e por Ricci e colaboradores
(dados não publicados), em 35 genes Cyps de D. melanogaster e de D. simulans. Comparando os
três trabalhos notam-se algumas diferenças no número e ordem das inserções encontradas, as
quais podem ser explicadas devido ao tamanho da região flanqueadora analisada em cada
trabalho, pois Ricci e colaboradores analisaram as regiões intergênicas 5’ e 3’ até encontrarem o
próximo gene, independente do seu tamanho, e Chen e Li (2007), analisaram essas mesmas
regiões até encontrarem o próximo gene, ou até a uma região intergênica de no máximo 10 kb.
Apesar de a diferença não ser significante, verifica-se que os TEs inserem-se
preferencialmente na região 5’ dos genes Cyps de D. melanogaster, D. yakuba e D. erecta,
resultado esse concordante com aquele observado por Ricci e colaboradores (dados não
publicados) em D. melanogaster e D. simulans utilizando uma amostragem maior de genes. Esse
resultado reforça a hipótese de que inserções de TEs na região 5’ podem afetar a regulação e,
conseqüentemente, a expressão dos genes, de maneira geral (JORDAN et al., 2003; van de
LAGEMAAT et al., 2003; THORNBURG et al., 2006), dentre eles os Cyps associados à
109
resistência aos inseticidas (DABORN et al., 2002; CATANIA et al., 2004; SCHLENKE;
BEGUN, 2004; CHUNG et al. 2007).
Além de ter como objetivo avaliar se as demais espécies de Drosophila tinham os genes
Cyps associados à resistência aos inseticidas enriquecidos por TEs, como demonstrado por Chen
e Li (2007), para 13 genes de D. melanogaster, e por Ricci e colaboradores (dados não
publicados), para 35 genes de D. melanogaster e D. simulans, um dos objetivos deste trabalho foi
também avaliar se existia alguma relação entre a proporção genômica de TEs, que é variável
entre espécies do grupo melanogaster, e a proporção de TEs inseridos nos Cyps associados à
resistência. Em outras palavras, nosso objetivo foi avaliar se a distribuição de TEs nas regiões
flanqueadoras dos Cyps associados à resistência é casual, decorrente da proporção genômica de
TEs característica de cada espécie, ou não.
Neste trabalho, mostramos que essa relação não se mantém para inserções nas regiões
flanqueadoras dos genes Cyps (distantes em até 3 kb do gene). Dentre as espécies do grupo
melanogaster, D. ananassae, a espécie com a maior porcentagem genômica de TEs (24,93%),
apresentou o menor número médio de inserções por gene Cyp (1). Por outro, D. simulans, a
espécie com a menor porcentagem (2,73 %) apresentou o segundo maior número de TEs por gene
Cyp (4,67), porcentagem essa semelhante àquela observada em D. yakuba, que apresenta 4,75
inserções/Cyp, mas tem uma proporção genômica de TEs cinco vezes maior (12,04 %). Já, D.
melanogaster, com praticamente o dobro de TEs que D. simulans, apresentou apenas 1,8 inserção
por Cyp associado à resistência. Esses resultados mostram que a inserção de TEs nas
proximidades dos genes Cyps associados à resistência é diferencial entre as espécies e não segue
a proporção genômica, o que sugere que possam desempenhar um papel adaptativo para essas
espécies.
Essa hipótese também se aplica ao TE mais abundante no genoma de Drosophila, o
DNAREP1_DM, também denominado DINE-1 (Drosophila interspersed element 1). Yang et al.,
(2006) analisando o elemento DNAREP1_DM em D. melanogaster e D. yakuba, sugerem que
esse elemento em D. melanogaster seja um resquício de uma transposição ancestral ocorrida
aproximadamente de cinco a dez milhões de anos, e que suas cópias sejam inativas. Yang e
Barbash (2008), construindo uma filogenia a partir de blocos conservados do DNAREP1_DM
mostraram que D. simulans e D. sechellia se agruparam, seguidas por D. melanogaster e depois
por D. yakuba, da mesma forma que a conhecida filogenia das espécies de Drosophila,
110
confirmando que cópias ancestrais desse elemento foram transmitidas verticalmente de um
ancestral comum de Drosophila. Entretanto, o número de cópias e a divergência entre essas
cópias, variam entre espécies do grupo melanogaster. D. melanogaster (355), D. simulans (478) e
D. sechellia (502) têm números semelhantes, com identidade entre as cópias de cada espécie
entre 90-91 %. Os valores de D. erecta (1013) aproximam-se mais àqueles dessas três espécies do
que aos de D. ananassae (5027) e D. yakuba (5424), que apresentam 10 vezes mais cópias do
DNAREP1_DM que as demais espécies do grupo melanogaster, como também uma porcentagem
de identidade entre as cópias maior que 95 %. Essas diferenças levaram Yang e Barbash (2008) a
proporem que o DNAREP1_DM sofreu uma explosão recente de transposição no genoma dessas
duas espécies.
Como observado para os TEs inseridos nos Cyps associados à resistência, a distribuição
do DNAREP1_DM também não segue a proporção genômica esperada, se a distribuição nas
regiões flanqueadoras dos Cyps fosse casual. A Figura 1 fornece o número de cópias desse
elemento nas regiões distantes em até 3 Kb do início de cada gene. Embora D. yakuba apresente
mais do que o dobro de inserções (10), como esperado pelo número de cópias genômicas (5424),
D. ananassae, com número semelhante (5027) não tem qualquer inserção de DNAREP1_DM
nesses genes. Já, D. melanogaster, D. simulans e D. sechellia, com números genômicos
aproximados, diferem quanto ao número de inserções nesses Cyps, a última espécie tem menos
que a metade (2) do que as duas primeiras (5). D. erecta, por sua vez, com mais que o dobro de
seqüências DNAREP1_DM em seu genoma, apresenta número de inserção nas regiões
flanqueadoras semelhantes aos de D. melanogaster e D. simulans. Essas distribuições não
seguem aquela esperada em decorrência do número de cópias total desse elemento em cada
espécie, como também não são concordantes com a distribuição com base nas relações de
parentesco entre as espécies (D.ananassae(D.erecta(D.yakuba(D.melanogaster,D.sechellia,
D.simulans)))), esperada se essas cópias fossem todas transmitidas verticalmente, inativas e
neutras. Um papel seletivo para as inserções do DNAREP1_DM encontradas nas regiões
flanqueadoras do Cyps também descortina a partir dessas comparações.
111
3.6 CONCLUSÃO
Um possível papel seletivo para as inserções de fragmento de TEs, em geral, e do
DNAREP1_DM, em particular, vem dos estudos de Ricci e colaboradores (dados não
publicados). Esses autores demonstraram a presença de motivos de ligação de fatores de
transcrição nas cópias desse elemento inseridas nas regiões flanqueadoras dos genes Cyps em D.
melanogaster e D. simulans, como também na seqüência consenso desse elemento. Uma larga
variedade de elementos regulatórios tem sido identificada em seqüências ativas ou consensos
reconstruídos de TEs ativos (JOHNSON et al., 2006; POLAK; DOMANY, 2006; THORNBURG
et al., 2006; WANG, et al. 2007) e muitos estudos empíricos demonstram que esses elementos
são incorporados nos aparatos regulatórios dos genes adjacentes (WESSLER et al.,
1995; FERRIGNO, et al., 2001; BROSIUS, 2003; MEDSTRAND et al., 2005; ROMANISH et
al., 2007). A presença de motivos regulatórios diferenciais estar relacionada à distribuição
diferencial de TEs e do DNAREP1_DM em genes Cyps das espécies do grupo melanogaster.
Contudo, estudos empíricos detalhados de transfecção dessas putativas seqüências reguladoras e
testes de expressão são necessários para corroborar essa hipótese.
112
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117
4 DISCUSSÃO GERAL
O movimento e o acúmulo dos TEs nos genomas têm exercido uma forte influência na
trajetória evolutiva de seus hospedeiros desde que podem gerar mutações e rearranjos
cromossômicos que contribuem para a evolução da estrutura e função do genoma onde estão
inseridos (BROSIUS, 1999; MAKALOWSKI, 2003; KIDWELL, 2002; GOTEA;
MAKALOWSKI, 2006; FESCHOTTE, 2008). Quando inseridos em regiões reguladoras,
também podem afetar positivamente a expressão do gene hospedeiro, como também de genes
adjacentes, devido à introdução de elementos reguladores nessas seqüências (CONTE et al.,
2002; JORDAN et al., 2003; THORNBURG et al., 2006). Em diversos TEs, foram identificadas
seqüências que atuam como sítios de ligação de fatores transcrição (TFBS), nas quais se ligam
motivos reguladores da expressão gênica (THORNBURG et al., 2006; ALMEIDA; CARARETO,
2006; POLAVARAPU et al., 2008). Feschotte (2008) observou que a manutenção de transposons
de DNA ou de suas transposases, no genoma hospedeiro deve-se ao fato de que essas seqüências
podem ser fontes para ligação de fatores de transcrição. Assim, os fragmentos de TEs podem
representar um importante papel na regulação gênica, sendo mantidos ou até exaptados nas
proximidades dos genes hospedeiros.
A maior parte das inserções de TEs está localizada em regiões intergênicas, introns e
UTRs tendo, desse modo, maior chance de serem mantidas no genoma, pois, estão sob menor
pressão seletiva (KIDWELL, 2002; SELA et al., 2007; FONTANILLAS et al., 2007; YANG;
BARBASH, 2008). Neste trabalho, essa relação também fica explícita para os genes Cyps e seus
genes flanqueadores, nos quais a maior parte das inserções de TEs ocorreu nas regiões
intergênicas.
No genoma de D. melanogaster, as classes de TEs com maior abundância (BERGMAN et
al., 2006) são, em ordem decrescente, DNA > LTRs > Retroposons, quando incluído o elemento
DNAREP1_DM, mas LTR > Retroposons > DNA, quando o DNAREP1_DM não é computado
na classe dos transposons de DNA, em decorrência da dúvida quanto a sua classificação. Os
resultados relatados no Capítulo 1 mostram que, dentre as inserções presentes nos genes Cyps, a
maior parte corresponde a transposons de DNA (mesmo excluindo o DNAREP1_DM), seguidos
pelos Retroposons e LTRs. A mesma tendência à inserção de transposons próximos a regiões
118
reguladoras de genes foi demonstrada para o transposon P (TOWER et al., 1993; SPRADLING
et al., 1995) e o Sleeping Beauty (YANT et al., 2005). Uma explicação para essa predominância
poderia ser que a inserção de diferentes elementos em todas as regiões intergênicas é casual, mas
ocorreria uma manutenção preferencial dos elementos de DNA na região 5’. Essa predominância
de inserção nas regiões flanqueadoras 5’, onde se acumula a maior parte das seqüências
reguladoras da expressão gênica, suporta a hipótese de que fragmentos de TEs enriquecem as
regiões promotoras, doando sinais reguladores da transcrição e podendo alterar a expressão
gênica, como relatado em humanos por Jordan et al. (2003) e Thornburg et al. (2006). Outra
hipótese seria que as seqüências codificadoras das transposases podem ser fontes para ligação de
fatores de transcrição e, assim, seriam mantidas ou até exaptadas nas proximidades dos genes
hospedeiros, desempenhando um importante papel na regulação gênica (FESCHOTTE, 2008).
Dentre os elementos freqüentemente inseridos em regiões flanqueadoras dos genes Cyps
destacou-se o elemento DNAREP1_DM, ocorrendo em maior número nas seis espécies estudadas
do grupo melanogaster de Drosophila. As cópias desse TE nos genomas de D. melanogaster e de
D. simulans apresentam identidade média de 90 % (YANG; BARBASH, 2008). Mostramos no
capítulo I deste trabalho que as cópias do DNAREP1_DM localizadas nas regiões intergênicas
dos genes Cyps dessas duas espécies são mais divergentes, e mais antigas, em relação às cópias
distribuídas ao longo do genoma. Este percentual inferior de identidade, associado ao pequeno
tamanho, corroboram o fato de serem cópias antigas nas duas espécies, desse modo, já expostas
ao crivo da seleção normalizadora que resulta em eliminação de TEs deletérios em regiões
próximas a genes. Esses fragmentos do elemento DNAREP1_DM correspondem à extremidade
3´ do elemento consenso, que mostramos conter seqüências homólogas a sítios de ligação de
fatores de transcrição. A análise da inserção de TEs em linhagens de diferentes regiões
geográficas também confirma os achados da análise in silico de que as cópias do elemento
DNAREP1_DM presentes nas regiões flanqueadoras desses genes correspondem à extremidade
3’ do elemento consenso. Embora tendo tamanhos variáveis, essas seqüências preservam
possíveis sítios de ligação de fatores de transcrição e essa pode ser a causa de sua manutenção nas
regiões flanqueadoras dos genes Cyps.
Os elementos de transposição têm sido associados à evolução da resistência aos
inseticidas, por estimularem a expressão de genes responsáveis pela resistência metabólica em
insetos, ou mesmo, por atuarem na geração de novas funções protéicas devido à alteração da
119
estrutura do gene (DABORN et al., 2002; AMINETZACH et al., 2005). Porém, essa associação,
não está completamente caracterizada, visto ter sido relatada também a presença de inserções de
TEs e elevada expressão de genes Cyps em algumas linhagens suscetíveis (SCHLENKE;
BEGUN, 2004; FESTUCCI-BUSELLI et al., 2005; KURUGANTI et al., 2007). Os resultados
relatados nos Capítulo 1 e 2 indicaram que as regiões flanqueadoras distantes em até 3kb dos
genes Cyps associados à resistência acumulam fragmentos de TEs em maior proporção que os
demais Cyps e, que essas proporções, variam entre as espécies do grupo melanogaster de
Drosophila. Mostramos, neste trabalho, que a ocorrência de TEs preferencialmente em regiões
flanqueadoras de Cyps associados à resistência não se restringe a D. melanogaster, como
inicialmente sugerido por Chen e Li (2007).
Entretanto, a relação entre a presença dos fragmentos de TEs em genes Cyps associados à
resistência e a manifestação da resistência não ficou evidenciada pelo estudo de linhagens de D.
melanogaster e D. simulans resistentes e suscetíveis ao DDT (Capítulo 1). Não encontramos
qualquer evidência de que esses fragmentos desempenhem alguma função diretamente
relacionada à resistência aos inseticidas. Entretanto, o fato de que a inserção de TEs nas
proximidades dos genes Cyps associados à resistência é diferencial entre as espécies, e não segue
a proporção genômica de TEs em cada uma, como mostrado no Capítulo 2, é mais um indício de
que essas sequências possam desempenhar algum papel adaptativo nessas espécies.
121
5 CONCLUSÕES
O presente trabalho permitiu estabelecer as seguintes conclusões:
1. Genes Cyps associados à resistência aos inseticidas e à função monooxigenase geral, bem
como, seus flanqueadores (exceto em D. simulans) apresentaram maior acúmulo de
elementos de transposição, ao contrário dos Cyps associados ao desenvolvimento nos
quais as inserções foram praticamente ausentes. Esses resultados indicam que os
primeiros apresentam maior plasticidade genômica enquanto os últimos estão sob pressão
seletiva contrária à inserção ou à manutenção de elementos de transposição.
2. A maior parte das inserções de TEs nos 35 genes investigados ocorreu em seqüências não
codificantes (regiões intergênicas e introns), e foram praticamente ausentes em regiões
codificantes.
3. As inserções de elementos de transposição se localizaram preferencialmente nas regiões
flanqueadoras 5’ dos genes, onde se encontram a maior parte das seqüências reguladoras,
podendo assim, influenciar a expressão gênica.
4. As análises populacionais de seqüências de elementos de transposição inseridas nas
regiões flanqueadoras dos genes Cyps associados à resistência evidenciaram a presença de
polimorfismo interpopulacional, porém, não permitiram esclarecer a associação entre
inserção desses elementos em genes Cyps e resistência aos inseticidas em linhagens
resistentes de D. melanogaster e D. simulans.
5. A análise in silico nas seis espécies do grupo melanogaster mostrou que a distribuição de
elementos de transposição nas regiões flanqueadoras dos Cyps associados à resistência é
diferencial e não segue a proporção genômica de TEs das espécies, o que sugere que esses
elementos possam desempenhar um papel adaptativo nessas espécies.
6. O elemento DNAREP1_DM, o elemento de transposição mais abundante nas regiões
flanqueadoras dos genes Cyps, pode estar sendo mantido nessas regiões pelo fato de
apresentarem putativos sítios de ligação de fatores de transcrição, e desse modo,
desempenhar algum papel na regulação dos genes Cyps nas espécies de Drosophila.
123
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