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ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO FATOR DE
CRESCIMENTO VASCULAR ENDOTELIAL (VEGF) E
DO RECEPTOR DO FATOR DE CRESCIMENTO
EPITELIAL (EGFR) COMO FATORES
PROGNÓSTICOS MOLECULARES PARA
METÁSTASES HEPÁTICAS DE CANCÊR
COLORRETAL
ADSON ROBERTO SANTOS NEVES
Dissertação apresentada à Fundação Antônio
Prudente para a obtenção do título de Mestre em
Ciências
Área de concentração: Oncologia
Orientador: Prof. Dr. Paulo Herman
Co-Orientador: Prof. Dr. Fernando Soares
São Paulo
2009
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente
Neves, Adson Roberto Santos
Análise da expressão do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)
e do receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR) como fatores
prognósticos moleculares para metástases hepáticas de câncer colorretal /
Adson Roberto Santos Neves – São Paulo, 2009.
73p.
Dissertação (Mestrado)-Fundação Antônio Prudente.
Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de concentração: Oncologia.
Orientador: Paulo Herman
Descritores: 1. RECEPTORES DE FATOR DE CRESCIMENTO DO
ENDOTELIO VASCULAR. 2. FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL
VASCULAR. 3. PROGNÓSTICO. 4. METÁSTASES. 5. HEPÁTICAS. 6.
CÂNCER COLORRETAL.
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DEDICATÓRIA
A minha esposa Adriana, presente de Deus. Razão
da minha vida. Pessoa que respeito, ouço, admiro e
amo de todo meu coração e toda a minha alma.
Aos meus pais Edson e Mara, por tudo que
sou... Pela vida que me proporcionaram; pelo
amor incondicional e pelo sacrifício por uma
educação privilegiada.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor Paulo Herman, meu orientador, exemplo a ser seguido
como médico e pesquisador, por sua impressionante capacidade de trabalho e clareza
de raciocínio. Pelo apoio e conselhos sempre sábios, não apenas para a realização
deste trabalho e de meu progresso profissional, mas também para a minha vida
pessoal.
Ao Professor Doutor Fernando Augusto Soares, por seu exemplo de
liderança e de chefia, dedicação médica e busca incessante por novos conhecimentos.
À Doutora Renata Coudry, por sua constante e incansável busca pela
pesquisa e desenvolvimento científico e apoio incondicional a este trabalho.
Ao amigo e colega de residência médica Wilson Costa, pelo auxílio e
atenção disponibilizados na elaboração deste trabalho.
Ao Dr. José Humberto Fregnani, pelo auxilio na análise estatística e pela
amizade.
RESUMO
Neves ARS. Análise da expressão do fator de crescimento vascular endotelial
(VEGF) e do receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR) como fatores
prognósticos moleculares para metástases hepáticas de câncer colorretal. São
Paulo; 2009. [Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente].
A ressecção hepática é o mais efetivo tratamento para os pacientes portadores de
metástases hepáticas de câncer colorretal. Vários estudos têm reportado de 25 a 57
% de sobrevida em 5 anos após a ressecção hepática. Atualmente, para avaliar o
prognóstico da metástase hepática, alguns marcadores biológicos têm sido
investigados e novos fatores de risco identificados, influenciando a sobrevida dos
pacientes submetidos à cirurgia hepática. Este estudo avaliou retrospectivamente 83
pacientes submetidos à ressecção hepática por metástase colorretal com proposta
curativa analisando a expressão do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)
e do receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR) no tecido tumoral, através do
método de tissue array, de forma automatizada, com o programa ACIS, e
interpretação desses resultados com ênfase em sobrevida e impacto nas variáveis
histopatológicas. Neste estudo a expressão do VEGF na metástase hepática foi
identificada com fator prognóstico independente e foi associada com pior
prognóstico. A expressão do EGFR não apresentou impacto na sobrevida, bem como
não esteve relacionado a nenhuma das variáveis histopatológicas.
SUMMARY
Neves ARS. [Analisys of the expretion of imunohistochemestry markers VEGF
and EGFR by tissue array in patients with liver metastases from colorectal
cancer]. São Paulo; 2009. [Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente].
Hepatic resection is the most effective treatment option available for patients with
metastases from colorectal carcinoma (CRC) limited to the liver. Several large series
have reported a 25 to 57 percent long-term survival rate after curative resection of
liver metastases. To evaluate the prognosis of liver metastasis, several biological
markers have been investigated and new risk factors have been reported to influence
survival after liver metastasis resection. This study assessed retrospectively 83
patients operated with curative intent, with the diagnosis of liver metastasis of
colorectal cancer. We assessed the impact on survival of immunohistochemical data
such as analysis of expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and
epidermal growth factor receptor (EGFR) through the method of tissue array and
trough an automated manner, with the ACIS program. In this study, vascular
endothelial growth factor expression on resected colorectal liver metastasis was an
independent prognostic factor and associated with worse survival. EGFR did not
show impact on survival, and was not related to any of the histopathological
variables.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Representação esquemática da punção e transferência das áreas
selecionadas do bloco doador para o bloco receptor – tissue
microarray........................................................................................ 21
Figura 2
Aspecto das lâminas receptoras (cada “core” corresponde a um
caso ou tecido a ser estudado).......................................................... 22
Figura 3
Aspecto do lay out da software utilizado, em detalhe a marcação
das áreas de interesse(focos de neoplasia)....................................... 25
Figura 4
Sobrevida global............................................................................... 31
Figura 5
Sobrevida livre de doença................................................................ 32
Figura 6
Gráfico da correlação entre o valor sérico do antígeno
carcinoembrionário (CEA) pré-hepatectomia e sobrevida
global................................................................................................ 33
Figura 7
Gráfico da correlação do tamanho das metástases com a
sobrevida..........................................................................................
34
Figura 8
Gráfico da correlação entre a presença de doença bilobar e
sobrevida global............................................................................... 35
Figura 9
Gráfico da correlação entre o número de nódulos e sobrevida
global................................................................................................ 36
Figura 10
Gráfico da correlação do número de lesões metastáticas e
sobrevida livre de doença................................................................. 37
Figura 11
Expressão do VEGF x Sobrevida Global......................................... 39
Figura 12
Expressão do EGFR(ACIS) x Sobrevida Global............................. 43
Figura 13
Expressão do EGFR (não automatizado) x Sobrevida Global......... 44
Figura 14
Correlação entre a expressão do EGFR avaliada pelo ACIS e por
imuno-histoquímica..........................................................................
45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Sobrevida em pacientes submetidos a ressecção hepática por
câncer colorretal...............................................................................
3
Tabela 2
Escore prognóstico........................................................................... 5
Tabela 3
Critérios de risco para pacientes com metástase hepática de câncer
colorretal........................................................................................... 6
Tabela 4
Número de nódulos hepáticos X Sobrevida..................................... 6
Tabela 5
Classificação da expressão protéica de EGFR na membrana........... 26
Tabela 6
Características clínicas e patológicas dos pacientes estudados
relacionado ao tumor primário.........................................................
30
Tabela 7
Probabilidades de sobrevida global em 5 anos de acordo com a
expressão do VEGF..........................................................................
38
Tabela 8
Avaliação dos valores medianos de expressão de VEGF obtidos
pelo ACIS de acordo com diversas variáveis...................................
41
Tabela 9
Probabilidades de sobrevida global em 5 anos de acordo com a
expressão do EGFR..........................................................................
43
Tabela 10
Avaliação dos valores medianos de expressão de EGFR obtidos
pelo ACIS de acordo com diversas variáveis...................................
46
Tabela 11
Avaliação dos valores medianos de expressão de EGFR obtidos
pela imuno-histoquímica de acordo com diversas variáveis............
47
Tabela 12
Resultado da análise multivariada. Fatores de risco para óbito de
acordo com o modelo de riscos proporcionais de Cox.....................
48
LISTA DE ABREVIATURAS
AJCC Comitê Americano de Câncer
AKT Proteína quinase ativada pela PI3K
bFGF Fator de crescimento fibroblástico básico
CCR Câncer colorretal
CEA Antígeno carcinoembrionário
DNA Ácido desoxirribonucléico
EGFR Receptor do Fator de Crescimento Epitelial
HIF Fatores induzidos por hipóxia
IC Intervalo de confiança
MAP Proteína mitógeno-ativada
MMPs Metaloproteinases da matriz
MHCCR Metástases hepáticas de câncer colorretal
N número de pacientes
OMS Organização Mundial da Saúde
OR Odds Ratio
p número de significância estatística
PDGF Fator de crescimento derivados de plaquetas
PDK Proteínas quinases dependentes de fosfoinositol
PI3K Fosfatidilinositol-3-quinase
PLC-1 Fosfolipase C-1
PTEM Proteína envolvida na inativação da via PI3K/AKT
RNA Ácido ribonucléico
TMA Tissue micro array
UICC União internacional contra o câncer
VEGF Fator de crescimento vascular endotelial
VEGFR1 Receptor tipo 1 do Fator de crescimento vascular endotelial
VEGFR2 Receptor tipo 2 do Fator de crescimento vascular endotelial
LISTA DE SIMBOLOS
% per cento
Cm centímetros
m meses
N número de pacientes
< menor que
> maior que
= igual a
ng nanogramas
nm nanometro
U unidades
ml mililitros
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Fatores prognósticos relacionados à metástase hepática 4
1.1.1 Número de lesões metastáticas hepáticas 6
1.1.2 Dimensões das metástases hepáticas 6
1.1.3 Margens cirúrgicas na ressecção hepática 7
1.1.4 Tempo livre de doença entre a ressecção do tumor primário e o
aparecimento das lesões metastáticas hepáticas < que 1 ano 8
1.1.5 Nível do CEA sérico pré-ressecção hepática 8
1.1.6 Presença de doença metastática extra-hepática 9
1.2 Fatores prognósticos moleculares relacionados à metástase hepática 9
1.2.1 Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF) 9
1.2.2 Receptor do Fator de Crescimento Epitelial (EGFR) 12
2 OBJETIVO 16
3 PACIENTES E MÉTODOS 17
3.1 Tipo de estudo 17
3.2 Métodos 17
3.3 Coleta de dados 18
3.4 Critérios de inclusão 18
3.5 Critérios de exclusão 18
3.6 Variáveis coletadas 19
3.7 Consentimento da comissão de ética e pesquisa 20
3.8 Análise imunoistoquímica 20
3.8.1 Tissue Micro Array (TMA) 20
3.8.2 Imunoistoquímica 23
3.8.3 Interpretação das reações imunoistoquímicas 24
3.9 Análise estatística 27
4 RESULTADOS 28
4.1 Análise univariada dos resultados das variáveis clínicas e patológicas
em relação ao prognóstico 32
4.2 Expressão do VEGF nas metástases hepáticas de câncer colorretal 37
4.3 Estudo da relação entre a expressão do VEGF no tecido tumoral com as
variáveis clínicas e patológicas 39
4.4 Expressão do EGFR na metástases hepáticas de câncer colorretal 42
4.5 Estudo da relação entre a expressão do EGFR com métodos
imunoistoqúimicos distintos 44
4.6 Estudo da relação entre a expressão do EGFR com as variáveis clínicas
e patológicas 45
4.7 Análise multivariada dos resultados das variáveis clínicas, patológicas
e imunoistoquímicas em relação ao prognóstico 48
5 DISCUSSÃO 49
6 CONCLUSÓES 60
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61
1
1 INTRODUÇÃO
O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias malignas mais comuns em
todo o mundo e representa um problema de saúde pública, pois é o segundo câncer
mais prevalente. Representa o quarto tipo de câncer mais freqüente em homens e o
terceiro em mulheres, sendo o risco acumulado de desenvolvimento de CCR ao
longo da vida de 6 %. No Brasil, a estimativa da incidência por 100.000 habitantes é
de 12.490 novos casos para homens e 14.500 novos casos para mulheres no ano de
2008 (Ministério da Saúde 2007).
Os métodos diagnósticos disponíveis atualmente possibilitam o rastreamento
de indivíduos de alto risco de desenvolvimento de CCR, sua detecção precoce e
cura. O rastreamento do CCR é viável e eficaz economicamente, mas sua aplicação
não é disseminada e, ao diagnóstico, a maioria dos tumores encontra-se localmente
avançada e com metástases hepáticas (SPEIGHTS et al. 1999).
A incidência de metástases hepáticas de câncer colorretal é de 15% a 25% ao
diagnóstico (FONG et al. 1996) e o desenvolvimento tardio dessas lesões no fígado
pode ocorrer em até 50% dos pacientes inicialmente sem metástases (CHOTI e
BULKLEY 1999). Estima-se, portanto, que cerca de metade dos pacientes
portadores de CCR desenvolverão metástases hepáticas (STEELE e RAVIKUMAR
1989).
A sobrevida de pacientes com metástases hepáticas não tratadas varia de 5 a
19 meses, com média inferior a 9 meses (NAGORNEY et al. 1987) e a
2
quimioterapia como tratamento exclusivo pode proporcionar sobrevida média de 15
meses (LISE et al. 1991; SHEINER e BROWER 1994).
O tratamento através das ressecções hepáticas de metástases de tumores
colorretais começou a ser definido a partir dos estudos de WOODINGTON e
WAUGH (1963), com taxa de sobrevida de 20% em 5 anos. BENGMARK e
HAFSTROM (1969), publicaram um estudo com 40% de sobrevida em 5 anos.
ADSON et al. (1984), relataram sobrevida de 28% em 5 anos nos pacientes
submetidos a ressecção de metástases hepáticas de câncer colorretal. No estudo de
SCHEELE e ALTENDORF-HOFMANN (1999), foram realizadas 434 ressecções
de metástases hepáticas de câncer colorretal em período de 32 anos (1960 a 1992)
com sobrevida de 32% em 10 anos e de 18% em 20 anos, com mortalidade
operatória inferior a 5%. Apesar de não haver estudos randomizados, em pacientes
passíveis de ressecção hepática, que compare quimioterapia exclusiva e ressecção de
metástases hepáticas, estudos retrospectivos sugerem fortemente uma melhor
sobrevida nos paciente submetido à cirurgia, tornando a ressecção hepática o
tratamento padrão para metástases de câncer colorretal (ADSON et al. 1984;
SCHEELE et al. 1991). Portanto, a ressecção cirúrgica é a única possibilidade de
cura para o paciente com metástases hepáticas de CCR, embora 43% dos pacientes
submetidos à ressecção desenvolverão nova recidiva sistêmica e hepática, sendo que
apenas hepática em 20% (TRANBERG et al. 1994).
As recidivas hepáticas isoladas podem ser tratadas com a utilização cada vez
mais freqüente de re-ressecções. Neste caso, observa-se sobrevida de 45% em 5
anos, incluindo pacientes submetidos a até três ressecções hepáticas (HUGHES et al.
1988; CHOTI e BULKLEY 1999).
3
Nos dias atuais, com o aprimoramento da técnica cirúrgica, avanços nos
cuidados da anestesia e terapia intensiva, abordagem multidisciplinar com utilização
de quimioterapia neoadjuvante, embolização portal prévia para aumentar o volume
dos segmentos hepáticos remanescentes e as ressecções programadas em dois
tempos, todos estes adventos tornaram possível a abordagem de pacientes que eram
considerados irressecáveis e também implicaram na melhora da sobrevida quando
comparado com séries históricas com as séries mais recentes (Tabela 1).
Tabela 1 – Sobrevida em pacientes submetidos à ressecção hepática por metástase
colorretal.
SOBREVIDA A LONGO PRAZO
5 anos 10 anos 20 anos
SCHEELE et al. (1995) 39% 3% 18%
JAMISON et al.(1997) 27% 20%
BISMUTH e ADAM (1998) 39% 20%
FONG et al. (1999) 37% 22%
NOURA et al. (2001) 49%
CHOTI et al. (2002) 47%
ABDALLA et al. (2004) 57%
FIGUERAS et al. (2007) 42% 30%
Hoje a indicação e a extensão da ressecção de metástases hepáticas são
baseadas na análise da condição clínica do paciente, extensão da doença e na função
hepática (LUPINACCI et al. 2007). Alguns estudos que investigaram possíveis
fatores prognósticos relacionados às metástases hepáticas de câncer colorretal, têm
sido usados para predizer a presença de doença irresecável na laparotomia
(JARNAJIN et al. 1999) e para selecionar pacientes que poderiam se beneficiar de
uma cirurgia com intenção curativa (NORDLINGER et al. 1996). Deve-se ressaltar,
no entanto, que o aspecto mais importante de todos esses estudos é que a ressecção
4
hepática melhora a sobrevida a longo prazo. Portanto, é imperativo avaliar os fatores
prognósticos para selecionar pacientes, inferir estimativas de sobrevida, delinear
grupos de risco que necessitem de terapia neoadjuvante ou adjuvante e
eventualmente indicar ressecções hepáticas repetidas, pois estes fatores prognósticos
podem interferir na evolução dos pacientes tratados de metástases hepáticas de
carcinoma colorretal (MHCCR).
1.1 FATORES PROGNÓSTICOS RELACIONADOS À METÁSTASE
HEPÁTICA
Vários estudos foram realizados com o propósito de identificar possíveis
fatores prognósticos de sobrevida e também de selecionarem pacientes utilizando
escore prognóstico. FONG et al. (1999), analisaram 1.001 pacientes submetidos à
ressecção por MHCCR e em um estudo multicêntrico em 85 instituições,
NORDLINGER et al. (1996), avaliaram 1.568 ressecções durante 22 anos.
No estudo de FONG et al. (1999), foram identificados, em análise
univariada, alguns fatores prognósticos clínicos para desenvolver um escore de risco
para os pacientes submetidos à ressecção hepática por metástases colorretais, sendo
que algumas dessas variáveis alcançaram significância estastística: pacientes com
mais do que 1 lesão metastática hepática, tumores maiores que 5cm, antígeno
carcinoembrionário (CEA) pré-operatório maior que 200ng/ml, linfonodos
comprometidos no tumor colorretal, tempo livre de doença entre a ressecção do
tumor primário e o aparecimento das lesões metastáticas hepáticas menor que 1 ano,
margens cirúrgicas positivas, presença de doença extra hepática.
5
Para cada variável positiva soma-se 1 ponto (Tabela 2). Quando até 2 fatores
estavam presentes, o resultado era favorável, porém quanto mais fatores, pior a
sobrevida.
Tabela 2 – Escore prognóstico.
FATORES PROGNÓSTICOS X SOBREVIDA
Fator prognóstico positivo Sobrevida (5 anos)
0 60%
1 44%
2 40%
3 20%
4 25%
5 14%
Fonte: FONG et al. (1999).
O sistema proposto por NORDLINGER et al. (1996), classifica os pacientes
como portadores de baixo, médio e alto risco e analisa a sobrevida em 2 anos de
acordo com os seguintes dados: estadiamento do tumor primário, linfonodos
comprometidos, tempo de aparecimento da metástases inferior 2 anos, número de
metástase superior a 4, diâmetro da metástase maior que 5cm, nível do CEA inferior
a 30ng/ml, margem de ressecção inferior a 1cm e idade superior a 60 anos (Tabela
3). Para cada variável positiva soma-se 1 ponto.
6
Tabela 3 – Critérios de risco para pacientes com metástase hepática de câncer
colorretal.
FATORES PROGNÓSTICOS
Risco Soma dos Pontos Sobrevida (2 anos)
Baixo 0 a 2 79%
Médio 3 a 4 60%
Alto 5 a 7 43%
Fonte: NORDLINGER et al. (1996).
1.1.1 Número de lesões metastáticas hepáticas
A ressecção de metástases hepáticas solitárias de tumores colorretais está
associada a 50% de sobrevida em 5 anos (KOKUDO et al. 2004; FIGUERAS et al.
2007).
FONG et al. (1999) associam sobrevida de 44% após a ressecção de
metástase única. Estudos revelam que pacientes submetidos a ressecção de múltiplas
lesões metastáticas hepáticas tem prognóstico reservado com sobrevida de 20% em
5 anos, mas aceitável quando comparada com outros tipos de câncer (GAYOWSKI
et al. 1994) (Tabela 4).
Tabela 4 – Número de Metástases Hepáticas X Sobrevida.
FONG et al. (1999) FIGUERAS et al. (2007)
4 nódulos = 33% 1 nódulo = 45%
5 nódulos = 22% até 4 = 39%
6 a 8 nódulos = 19% 4 ou mais = 30%
9 a 20 nódulos = 14% 6 ou mais = 24%
1.1.2 Dimensões das metástases hepáticas
Vários estudos reportam um pior prognóstico quando analisam a incidência
de recorrência e sobrevida em metástases hepáticas de tumores colorretais maiores
7
que 5cm (SCHEELE et al. 1991; FONG et al. 1999). No estudo de SCHEELE e
ALTENDORF-HOFMANN (1999), o tamanho das metástases foi fator
independente de sobrevida global e livre de doença após a ressecção hepática.
Alguns autores consideram o tamanho das lesões metastáticas menos importante e
que não influenciaria o prognóstico (CHOTI et al. 2002; KATO et al. 2003).
HAMADY et al. (2006) encontraram resultado semelhante, pois não houve
diferença estatística na análise de sobrevida em pacientes com lesões maiores que
5cm.
1.1.3 Margens cirúrgicas na ressecção hepática
A obtenção de margens livres deve ser sempre perseguida pelo cirurgião e
usualmente admite-se que deve-se obter uma margem de pelo menos 1 cm de tecido
normal (FONG et al. 1999). Muitos estudos tem identificado a margem da ressecção
hepática livre de doença maior que 1 cm como um dos mais importantes fatores que
influenciam a sobrevida global e livre de doença e os autores consideram a
impossibilidade de obtenção desta margem como uma contra indicação relativa da
ressecção hepática (EKBERG et al. 1986; SCHEELE et al. 1995; SHIRABE et al.
1997; ELIAS et al. 1998). Entretanto, em uma recente publicação HAMADY et al.
(2006), questionaram essa margem de 1 cm e seus resultados demonstraram que a
simples obtenção de margens livres, mesmo menores que 1 cm, não causou impacto
significativo na sobrevida.
8
1.1.4 Tempo livre de doença entre a ressecção do tumor primário e o
aparecimento das lesões metastáticas hepáticas inferior a 1 ano
Vários estudos têm demonstrado que as metástases sincrônicas
(diagnosticada no mesmo momento do câncer colorretal ou em um intervalo menor
que 1 ano) estão relacionadas a pior prognóstico quando comparadas com os
tumores metacrônicos (diagnosticados após um intervalo superiores a 1 ano do
tratamento do câncer colorretal) (SCHEELE et al. 1995; FONG et al. 1999). Por
outro lado, outros autores não encontraram diferença estatística entre tumores
sincrônicos e metacrônicos (VOGT et al. 1991). Em trabalho recente BOCKHORN
et al. (2008), encontraram sobrevida similar entre os pacientes com metástases
sincrônicas e metacrônicas tratados com ressecção hepática.
1.1.5 Nível do antígeno carcinoembrionário sérico pré-ressecção hepática
O antígeno carcinoembrionário (CEA) é um marcador tumoral e está
relacionado a tumores colorretais e seu prognóstico. Nível de CEA pré-ressecção
hepática superior a 200 ng/ml no estudo de FONG et al. (1999), teve significância
estatística na análise univariada, mas não na análise multivariada, embora a
probabilidade de morte tenha se mantido elevada. Resultados semelhantes foram
observados por SUGAWARA et al. (2001), analizando 304 pacientes. Outros
estudos demonstram que o nível pré-operatório de CEA é fator prognóstico
independente adverso (NORDLINGER et al. 1996). Atualmente, não há
unanimidade quanto a relação entre CEA e sobrevida, entretanto sabe-se que o nível
pré-operatório de CEA, qualquer que seja, não contra-indica a ressecção hepática de
metástases colorretais.
9
1.1.6 Presença de doença metastática extra-hepática
A presença de doença metastática extra-hepática concomitante com a
metástase hepática mostrou-se significante do ponto de vista estatístico na análise
univariada (FONG et al. 1999) e foi o fator prognóstico adverso com maior
influência no estudo.
Recente estudo de ELIAS et al. (2006) demonstraram sobrevida de até dez
anos, após ressecção de metástases hepáticas associada a ressecções de metástases
extra-hepáticas em pacientes selecionados.
A presença de doença extra-hepática não é uma contra-indicação absoluta à
hepatectomia, desde que esta seja passível de controle. SHAH et al. (2006)
demonstraram que metástases pulmonares quando ressecadas completamente antes
ou após hepatectomia podem apresentar resultados comparáveis a pacientes sem
metástase extra-hepática.
1.2 FATORES PROGNÓSTICOS MOLECULARES
RELACIONADOS À METÁSTASE HEPÁTICA
1.2.1 Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF)
Tanto as células normais quanto as células neoplásicas dependem de
adequado suprimento sanguíneo para obtenção de oxigênio e nutrientes e é graças à
formação de redes vasculares que a célula garante crescimento e manutenção dos
tecidos. A angiogênese é um processo complexo de formação de novos vasos
sanguíneos a partir de preexistentes, rigidamente controlado por fatores
estimuladores ou inibidores na dependência das necessidades locais. Na angiogênese
10
associada aos tumores sólidos os novos capilares são formados no estroma tumoral a
partir de células endoteliais do hospedeiro (BERGERS et al. 2003) e permite o
desenvolvimento dos vasos sanguíneos ao redor do tumor que é indispensável para o
crescimento tumoral e invasão local.
Estudos clínicos demonstram que a angiogênese também contribui para o
processo metastático, pois a medida que há expansão da vascularização, maior é a
superfície para escape de células tumorais na circulação, o que também pode ser
facilitado pela imaturidade dos novos vasos formados (LIOTTA et al. 1974). Desde
a demonstração pioneira de FOLKMAN (1971), o crescimento tumoral é
considerado angiogênese-dependente e numerosos fatores angiogênicos tem sido
identificados como o fator de crescimento derivados de plaquetas (PDGF),
metaloproteinases da matriz (MMPs), fator de crescimento fibroblástico básico
(bFGF), mas principalmente o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF).
O VEGF é o fator angiogênico que tem sido mais intensamente estudado,
uma vez que além de atuar na neoangiogênse, aumenta a permeabilidade vascular
(FOLKMAN et al. 1997).
Estudos sugerem que a hipóxia celular é o estímulo mais importante para
regular a expressão do VEGF (FERRARA 2002). A hipóxia no tecido tumoral
costuma ocorrer quando este está a 100-200nm distante de uma fonte vascular
nutridora (HELMLINGER et al. 1997) e a sobrevivência do tumor depende da
habilidade adaptativa em recrutar novos vasos sanguíneos através de fatores
angiogênicos. Os tumores humanos que resistem à condição de hipóxia demonstram
que se adaptaram a este ambiente na progressão tumoral. A célula normal em
condições de hipóxia é induzida a ativar um fator transcricional chamado HIF
11
(fatores induzidos por hipóxia), que são proteínas heterodiméricas, compostas do
HIF1, HIF2 e HIF3 e que regulam mais de 70 gens alvos (BODDY et al. 2005). O
HIF aumenta a expressão do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), além
de promover o aumento da expressão enzimas glicolíticas (FIRTH et al. 1995;
RYAN et al. 1998).
O VEGF é o fator chave dos processos fisiológicos de vasculogênese e
angiogênese (JAIN 2003). O VEGF (também chamado de VEGF-A) é uma
glicoproteína ligada a heparina pertencente a uma subfamília que inclui os fatores de
crescimento VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e fator de crescimento plaquetário
(SHIBUYA 2001).
O VEGF liga-se a dois receptores principais: VEGFR1 (Receptor tipo 1 do
fator de crescimento vascular endotelial) e o VEGFR2 (Receptor tipo 2 do fator de
crescimento vascular endotelial). Cada um destes receptores possui: um domínio
extracelular com regiões semelhantes a imunoglobulina; uma região transmembrana
e um domínio intracelular tipo tirosinoquinase. O VEGFR1 tem maior afinidade ao
VEGF do que o VEGFR2. Em contraste o VEGFR2 tem mais atividade
tirosinoquinase quando estimulado pelo VEGF. A ativação do VEGFR1 não tem
efeito direto na mudança do citoesqueleto (WALTENBERGER et al. 1994).
Entretanto a ativação do VEGFR1 está implicada no aumento da expressão do
plasminogênio ativado que está relacionado à degradação da matriz extracelular e
migração celular (OLOFSSON et al. 1998). São conhecidos seis resíduos C-terminal
do VEGFR1 incluindo 1169, 1213, 1242, 1309, 1327 e 1333, responsáveis pelos
sítios de fosforilação (ITO et al. 1998; OLSSON et al. 2006). O sítio 1169 é
implicado na ativação da fosfolipase C-1(PLC-1) que ativa a transdução de sinal da
12
via da proteína mitógeno-ativada (MAP), que em última análise promove a
sobrevivência celular (SAWANO et al. 1997). Vários estudos comprovam a
expressão do VEGF no tecido tumoral como fator prognóstico. SCHEELE e
ALTENDORF-HOFMANN (1999) relataram que pacientes com CCR possuem
níveis superiores de VEGF quando comparados a indivíduos saudáveis e que este
está associado ao desenvolvimento de metástases e pior prognóstico. ABE et al.
(2007) observaram que dos 27 pacientes submetidos a cirurgia colorretal por câncer
todos tinham aumento na expressão do VEGF no citoplasma, principalmente aqueles
com comprometimento linfonodal e invasão angiolinfática. Estes resultados sugerem
que a expressão do VEGF pode ser usada como um marcador da presença de
metástase.
1.2.2 Receptor do Fator de Crescimento Epitelial (EGFR)
O EGFR é uma glicoproteína da membrana plasmática celular, composta de
um domínio de ligação extracelular lipofílico e um domínio intracelular de
tirosinaquinase. É um membro da família dos fatores de crescimento e a ativação do
complexo EGFR-tirosinaquinase tem sido identificado como um evento iniciador da
cascata de sinalização intracelular levando a proliferação, sobrevivência,
angiogênese e metastatização (KARI et al. 2003). A ativação da via de sinalização
intracelular em resposta ao sinal molecular extracelular ocorre em quatro receptores
conhecidos: EGFR/ErbB1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 e ErbB4/HER4 (YARDEN
e SLIWKOWSKI 2001; GRANDIS e SOK 2004; HYNES e LANE 2005). São
identificadas pelo menos 30 moléculas sinalizadoras extracelulares, que geralmente
são pequenas proteínas secretadas pela célula no espaço intercelular, denominados
fatores de crescimento. Todos os fatores de crescimento são sintetizados a princípio
13
como precursores ancorados à membrana e de forma subseqüente são liberados da
célula por proteólise (HYNES e LANE 2005; FINNEGAN e CAREY 2007).
A interação entre o receptor e o seu fator de crescimento, inicia uma
mudança na conformação do seu domínio extracelular de inativo para ativo e
promove sua dimerização. Cada receptor homodimérico ou heterodimérico inicia
uma complexa cascata de sinalização, que resulta na proliferação celular,
diferenciação, migração, adesão e transformação (YARDEN e SLIWKOWSKI
2001; HYNES e LANE 2005; SERGINA e ALTENDORF-HOFMANN 2007).
Uma das vias mais importante de sinalização intracelular é o da
fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K/AKT) (YARDEN e SLIWKOWSKI 2001;
GRANDIS e SOK 2004; HYNES e LANE 2005). Através de várias etapas
intermediárias, a PI3K ativa a enzima AKT (proteína quinase ativada pela PI3K),
que então age sobre fatores de transcrição no núcleo, regulando as vias de
sinalização da apoptose, expressão gênica e proliferação celular (MENDELSOHN e
BASELGA 2000; YARDEN e SLIWKOWSKI 2001; GRANDIS e SOK 2004;
HYNES e LANE 2005). Este evento ocorre no momento em que há estimulação do
EGFR resultando em fosforilação dos resíduos de tirosina que é necessária para a
ligação da PI3K no receptor, desencadeando a fosforilação dos fosfoinostídeos de
membrana. Esta fosforilação das quinases dependentes de fosfoinositol 1 e 2 (PDKs
1e 2), recrutadas no local, são capazes de fosforilar e ativar o AKT (BELHAM et al.
1999). YANO et al. (1998) mostraram que a PDK1 fosforila o AKT na treonina 308,
sendo esta fosforilação dependente de cálcio e a PDK2 fosforila na serina 473,
parecendo que a fosforilção nos dois sítios é necessária para a completa ativação do
AKT (COFFER e WOODGETT 1998; DATTA et al. 1999). Estando a via da PI3K
14
ativada, a morte celular é bloqueada por vários mecanismos através de regulação de
proteínas envolvidas no processo da apoptose (COFFER e WOODGETT 1998;
DOWNWARD 1998) e sabe-se que a principal fosfatase capaz de inativar a cascata
da PI3K/AKT é a proteína envolvida na desfosforilação e inativação (PTEM) da via
PI3K/AKT, já tendo sido mostrado que sua deficiência leva a um aumento na
fosforilação e na atividade da AKT (KANAMORI et al. 2001).
Nas células tumorais, a família de receptores ErbB é ativada por vários
mecanismos, incluindo a mutação, a superexpressão e produção autócrina e
parácrina dos fatores de crescimento. Na estimulação parácrina dos receptores ErbB,
os fatores de crescimento são liberados pelas células do estroma, enquanto que a
estimulação autócrina resulta da liberação dos fatores de crescimento ancorados na
membrana celular (HYNES e LANE (2005).
O aumento da expressão do EGFR é frequente em tumores cerebrais e
encontradas em 40% dos gliomas. É também detectado nas lesões pré-malignas do
epitélio oral, pulmão, próstata e colo uterino (GRANDIS e SOK 2004). Na literatura
há estudos em câncer colorretal, investigando a expressão do EGFR no tumor
primário e os resultados variam de 16% para o câncer colorretal em estágios iniciais
a 97% nos avançados (SCARTOZZI et al. 2004; SPANO et al. 2005). BRALET et
al. (2005) observaram a expressão do EGFR em 95% dos tumores colorretais de 40
pacientes e de 79% das metástases hepáticas de câncer colorretal em 51 pacientes
operados. GOLDSTEIN e ARMIN (2001) observaram correlação entre a expressão
do EGFR em linfonodos metastáticos dos pacientes com pior sobrevida.
MENDELSOHN (1990) considerou que seria possível inibir a proliferação
de células neoplásicas através do bloqueio da ativação do EGFR, pois as células
15
normais são menos sensíveis a inibição do EGFR. Em virtude da expressão do
EGFR em vários tipos de câncer e no conhecimento no mecanismo molecular e
funcional, anticorpos monoclonais quiméricos como o cetuximab, inibidor
competitivo alvo do domínio extracelular do EGFR, foram desenvolvidos
(THOMAS e GRANDIS 2004).
Na última década, o conceito de tratamento na oncologia com terapia alvo
tem sido introduzido na prática clínica. Entretanto, um melhor conhecimento desta
terapia biológica molecular é necessário. O VEGF e o EGFR se apresentam como
dois alvos biológicos interessantes a serem estudados devido a sua aplicação na
oncologia atual.
16
2 OBJETIVO
Este trabalho tem como objetivo estudar alterações da expressão
imunohistoquímica das proteínas VEGF e EGFR em pacientes portadores de
metástases hepáticas de adenocarcinoma colorretal submetidos à ressecção e avaliar
a sua relação com o prognóstico.
17
3 PACIENTES E MÉTODOS
3.1 TIPO DE ESTUDO
Estudo retrospectivo longitudinal
3.2 MÉTODOS
Foram avaliados os prontuários de 85 pacientes submetidos à ressecção
hepática por metástase de CCR no Hospital do Câncer A.C.Camargo no período
compreendido entre setembro de 1999 à outubro 2006, entretanto após a seleção
inicial dos casos foram excluídos 2 pacientes, tendo como causas da exclusão
material insuficiente para análise e prontuário não encontrado. Foram estudados 83
pacientes e as variáveis de interesse foi a expressão imunoistoquímica de VEGF e
EGFR nas metástases hepáticas. As variáveis de controle foram: idade, sexo,
localização do tumor primário, tamanho do tumor primário, presença de linfonodos
comprometidos, grau histológico, CEA pré-ressecção hepática, realização de
quimioterapia neoadjuvante, tamanho das metástases hepáticas, quantidade de
metástases hepáticas, lesão sincrônica ou metacrônica, metástase lobar ou bilobar,
Foram armazenados em banco de dados os possíveis fatores prognósticos e
analisada a relação entre as variáveis e o risco de recidiva nos pacientes submetidos
a ressecções hepáticas por metástases do CCR durante o seguimento mínimo de 1
ano.
18
3.3 COLETA DE DADOS
Os dados clínicos e anatomopatológicos foram obtidos a partir dos
prontuários médicos arquivados no Serviço de Arquivo Médico e Estatística
(SAME) do Hospital do Câncer A.C. Camargo.
3.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Todos os pacientes incluídos no estudo obedeceram aos seguintes critérios de
elegibilidade:
a) confirmação de metástase hepática de adenocarcinoma de cólon ou reto;
b) margens da ressecção hepática livres de neoplasia;
c) disponibilidade de material conservado em parafina para estudo
imunoistoquímico.
3.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Foram considerados ineligíveis para o estudo os pacientes com:
a) material arquivado em parafina inadequado para a elaboração de novos
cortes para imunoistoquímica.
b) margens cirúrgicas comprometidas por doença neoplásica
19
3.6 VARIÁVEIS COLETADAS
a) Variáveis demográficas e clínicas, compreendendo os itens apresentados a
seguir: 1) idade; 2) sexo masculino ou feminino; 3) localização do tumor
primário: cólon ou reto, definida pela descrição do exame endoscópico
anotado no prontuário médico. Considerado reto o segmento até 12 cm da
margem anal (NELSON et al. 2001); 4) realização de quimioterapia
neoadjuvante: sim ou não; 5) nível sérico do antígeno carcinoembrionário
(CEA) pré-hepatectomia; 6) tempo de aparecimento da metástase hepática:
sincrônica ou metacrônica; 7) tamanho, número das lesões hepáticas e
localização unilobar ou bilobar. 8) necessidade de transfusão: sim ou não. 9)
tipo de cirurgia: hepatectomia menor (até 2 segmentos hepáticos);
hepatectomia maior (3 ou mais segmentos hepáticos). 9) complicações intra
e pós-operatórias.
b) Variáveis anatomopatológicas, compreendendo os itens a seguir: 1)
estadiamento TNM: utilizou-se a classificação TNM com base nos dados
obtidos dos laudos anatomopatológicos arquivados nos prontuários médicos.
A classificação foi feita de acordo com a última edição do TNM, proposta
pelo American Joint Comittee on Cancer (AJCC); 2) grau histológico do
tumor: utilizou-se a classificação padronizada no Departamento de Anatomia
Patológica do Hospital do Câncer A.C. Camargo, adaptada para três
categorias: grau 1: bem diferenciado; grau 2: moderadamente diferenciado;
grau 3: pouco diferenciado.
20
3.7 CONSENTIMENTO DA COMISSÃO DE ÉTICA E PESQUISA
Esse projeto foi submetido a apreciação e aprovado pelas comissões de ética
e pesquisa do Hospital AC Camargo, sendo aprovado.
3.8 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA
3.8.1 Tissue Micro Array (TMA)
Os blocos de parafina contendo fragmentos de metástases hepáticas de
câncer colorretal e tecido hepático normal foram selecionados para a realização de
“Tissue Microarray” (TMA). Desde a descrição pioneira de KONONEN et al.
(1998), vários trabalhos científicos envolvendo a utilização do TMA para estudo de
marcadores tumorais e mostrando a versatilidade e menor custo em relação ao
microarray na avaliação das amostras teciduais tem sido publicado (BUBENDORF
et al. 2001; RESNICK et al. 2004).
Utilizando agulhas de aço, biópsia tecidual é realizada em áreas
representativas previamente escolhidas dos blocos de parafina (doadores). Após a
realização da punção, o tecido é disposto em um bloco receptor (Figura 1). Um
dispositivo com precisão digital é o responsável pela realização deste procedimento,
fazendo com que o material seja disposto de forma ordenada e precisa. O bloco
receptor pode ser composto por dezenas ou milhares de amostras de tecidos
dependendo do diâmetro utilizado para a realização da biópsia (agulha) (Figura 2).
Os cortes da amostra podem ser corados com hematoxilina-eosina e podem
ser utilizados paralelamente para a detecção de DNA, RNA ou alvos protéicos
21
utilizando hibridização in situ (com fluorescência ou mRNA) ou imunohistoquímica.
Isto permite analisar marcadores tumorais na mesma amostra utilizando um bloco
apenas, podendo ser realizada correlação morfológica, genética e fenotípica. Isto
permite que as comparações possam ser realizadas de maneira homogênea, uma vez
que amostras do mesmo núcleo são utilizadas (KONONEN et al. 1998).
Fonte: Kononen J et al. (1998)
Figura 1 - Representação esquemática da punção e transferência das áreas
selecionadas do bloco doador para o bloco receptor – tissue microarray.
Para o presente estudo foi construído um bloco de TMA (Beecher
Instruments, Silver Springs, USA), cada um contendo 166 cores (83 amostras) de
1mm. As regiões a serem amostrada para a confecção do bloco de TMA foram
22
selecionadas por um patologista que orientou a confecção do bloco final de TMA. O
TMA foi construído utilizando o Manual Tissue Arrayer I, aparelho fabricado e
adquirido pela Beecher Instruments Inc.
Com o bloco de TMA pronto, foram obtidos cortes de 3 μm de espessura,
colhidos em lâminas com adesivos especiais para a técnica (Instrumedics Inc.).
Figura 2 - Aspecto das lâminas receptoras (cada “core” corresponde a um caso ou
tecido a ser estudado).
23
3.8.2 Imunoistoquímica
As reações de imunoistoquímica foram realizadas no Departamento de
Patologia do Hospital A.C. Camargo.
As regiões a serem amostradas para a confecção do bloco de TMA foram
selecionadas por um único patologista que orientou a confecção do bloco final de
TMA.
Duas lâminas de cada bloco de TMA, com cortes em dois níveis e com 40
cortes de diferença entre elas, foram submetidas às reações de imunoistoquímica. Os
cortes no bloco foram realizados com micrótomo manual e transferidos em fita
adesiva para as lâminas adesivas especias (Intrumentic Inc. Hackensack, NJ, USA).
As reações foram sempre acompanhadas de controle, em tecido sabidamente
positivo para o anticorpo testado e controle negativo, onde não foi utilizado o
anticorpo primário.
As reações de imuno-histoquímica foram realizadas pela técnica de polímero
sem biotina (Advance) utilizando o anticorpo primário: Dako® para VEGF e EGFR
(Epidermal Growth Factor Receptor – NCL-EGFR mouse monoclonal antibody,
Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle upon Tyne, UK).
Resumidamente,
1- Desparafinização e hidratação dos cortes histológicos: 3 banhos em Xilol (5
minutos cada), 4 banhos de álcool, lavagem por 5 minutos em água corrente;
2- Recuperação antigênica na Pascal (Câmara de Pressão) em solução Citrato
pH 6,0 à 125º C (30 segundos após atingir 125ºC e pressão entre 20 e 25
psi). Lavagem em água corrente por 5 minutos; (obs. Verificar qual método
de recuperação foi utilizado;
24
3- Bloqueio da peroxidase endógena: 3 banhos de 5 minutos cada com Peróxido
de Hidrogênio10 volumes;
4- Lavagem em PBS;
5- Bloqueio de proteínas: 20 minutos com Bloqueador de Proteínas (DAKO);
6- Incubação do anticorpo primário por 2 horas à temperatura ambiente (Ta) em
câmara úmida;
7- Lavagem em PBS;
8- Incubação com anticorpo secundário (Advance HRP Link -DAKO) por 30
minutos(Ta);
9- Lavagem em PBS;
10- Incubação com Polímero (Advance HRP enzyme- DAKO) por 30 minutos
(Ta);
11- Lavagem em PBS;
12- Revelação da reação com cromógeno diaminobenzidine (DAB) 5 minutos
(Kit Liquid DAB + Substrate Chromogen System; DakoCytomation,
Carpinteria, California);
13- Lavagem em água corrente;
14- Contracoloração com Hematoxilina de Harris por 2 minutos;
15- Lavagem em água corrente por 5 minutos;
16- Desidratação em álcool, Xilol, montagem em meio permanente.
3.8.3 Interpretação das Reações Imunoistoquímicas
A análise da expressão imunohistoquímica das proteínas VEGF E EGFR foi
realizada quantitativamente através da leitura automatizada pelo ACIS III (DAKO,
25
Carpinteria, CA, EUA). As lâminas foram escaneada no modo citoplasma para
VEGF e membrana para EGFR, e analisadas por meio de imagem magnificada,
campo por campo, que permite discriminação do detalhe histológico (Figura 3).
Os detalhes da técnica de escaneamento e quantificação da intensidade
podem ser avaliados no site do fabricante (http://www.chromavision.com). A análise
das reações foi realizada através do número absoluto obtido pela média de densidade
óptica do core estudado, marcado pelo patologista, que foi dividido pelo número de
background (considerado como densidade negativa), e realizado uma média entre as
quatro amostras de cada caso. Foram consideradas para análise quando duas ou mais
amostras informativas foram registradas. Excluiu-se da análise quando apenas uma
amostra das quatro de cada caso apresentou dados informatvos.
Figura 3 - Aspecto da imagem do programa utilizado, em detalhe a marcação das
áreas de interesse (focos de neoplasia).
26
Para o EGFR, além da leitura automatizada pelo ACIS III, foi utilizada a
interpretação subjetiva da expressão imunoistoquímica na membrana. Para efeito de
análise da marcação em membrana, o resultado desta expressão foi realizada de
acordo com as regras do teste reconhecido pela Food and Drug Administration para
o estudo do HER2 (HANNA et al. 2007; WOLFF et al. 2007) como demonstrado na
Tabela 5.
A análise subjetiva do EGFR foi avaliada através da intensidade da marcação
das células tumorais e divididas em quatro categorias:
0 nenhuma marcação;
1+ marcação com intensidade fraca, em parte de sua membrana, em menos de
10% das células;
2+ marcação completa de membrana de intensidade fraca a moderada em mais
de 10% das células e em menos de 30% das células;
3+ marcação de intensidade forte em mais de 30%
Tabela 5 - Classificação da expressão protéica de EGFR na membrana.
ESCORE PADRÃO DE COLORAÇÃO
0 Nenhuma coloração é observada nas células neoplásicas invasivas
1+ Coloração fraca e incompleta da membrana em qualquer proporção de
células neoplásicas invasivas ou coloração fraca e completa em menos de
10% das células neoplásicas invasivas
2+ Coloração de membrana completa, não uniforme ou coloração fraca, mas
com óbvia distribuição circunferencial em no mínimo 10% das células ou
intensa e completa em 30% ou menos das células
3+ Coloração forte e completa da membrana observada em mais de 30% das
células tumorais
27
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados coletados foram transcritos para ficha padronizada e digitados em
computador para gerenciamento do banco de dados e análise estatística. A confecção
do banco de dados e as análises foram feitas com auxilio do programa estatístico
“SPSS 15.0 for Windows”.
A caracterização da amostra foi realizada por meio da estatística descritiva.
Utilizou-se a análise da curva ROC para a determinação do melhor ponto de corte
para a expressão dos marcadores biomoleculares obtidas pelo ACIS. Para tanto,
considerou-se o óbito em 60 meses como o evento de estratificação. As associações
entre as variáveis categóricas foram realizadas pelo teste exato de Fisher. Os testes
de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis foram empregados para se comparar os valores
medianos de expressão dos marcadores biomoleculares e as diversas variáveis. O
coeficiente de Spearman foi utilizado para as análises de correlação.
As taxas de sobrevida global em 5 anos foram estimadas pelo método de
Kaplan-Meyer, sendo as curvas de sobrevida comparadas pelo teste de log rank. O
tempo de seguimento foi calculado a partir da data da primeira cirurgia até a data da
última informação objetiva na atualização dos dados. Para a identificação dos fatores
de risco independentes para o óbito empregou-se o modelo de riscos proporcionais
de Cox. Verificou-se a proporcionalidade de risco ao longo do tempo através do
gráfico log minus log. Para todos os testes estatísticos estabeleceu-se o nível de
significância em 5%.
28
4 RESULTADOS
Foram estudados 83 pacientes submetidos a ressecção hepática por
metástases de câncer colorretal. A idade variou entre 36 a 76 anos com média de
58,5 anos. Quarenta e quatro (53%) pacientes do sexo feminino e 39 (47%) do sexo
masculino.
Quanto à localização do tumor primário, 45 pacientes possuíam tumores de
colon (54,2%) e 38 do reto (45%).
A presença de linfonodos comprometidos identificados na peça após a
ressecção do tumor primário foi observado em 48 (57,8%) pacientes e dado não
disponível em casos 7 (8,4%).
Quanto ao grau histológico do tumor primário, 9 tumores foram considerados
bem diferenciados (10,8%); 54 moderadamente diferenciados (65,1%); 3, pouco
diferenciados (3,6%), 17 tumores não tinham essa variável disponível no prontuário
médico(20,5%).
A média do nível sérico do CEA pré-ressecção hepática foi de 64,57 ng/ml.
O valor mínimo foi de 1 e o máximo de 1100 ng/ml. Esta variável não estava
disponível em 22 casos (26,5%).
Vinte e quatro pacientes (28,1%) receberam quimioterapia neoadjuvante, 18
pacientes baseada em oxaloplatina (21,7%), 2 em irinotecam e em 59 pacientes
(71,1%) esta variável não estava disponível no prontuário.
Em relação ao tamanho das metástases hepáticas 36 (43,4%) pacientes
tinham metástases menores que 3 cm enquanto em 47 (56,6%), as metástases eram
29
maiores que 3 cm. O tamanho mínimo foi 1 cm e máximo 12 cm. A média do
tamanho das metástases neste estudo foi de 4,2 cm.
Na avaliação do número de lesões metastáticas, 38 pacientes tinham apenas 1
lesão (45,8%), enquanto 25 (30,1%) apresentavam 2 lesões e 13 (15,7%), 3 lesões.
Neste estudo um paciente era portador de 6 lesões metastáticas.
A maioria dos pacientes (70%) apresentava lesões hepáticas em apenas um
lobo hepático (unilobar).
Quanto ao aparecimento das metástases hepáticas em 42 (50,6%) pacientes
foi sincrônica e em 41(49,4%), metacrônica.
Em relação às cirurgias realizadas, consideramos a ressecção hepática maior
(quando 3 ou mais segmentos são ressecadas) e ressecção hepática menor (até 2
segmentos). Neste estudo foram realizadas 34 hepatectomias menores (40,4%) e 49
hepatectomias maiores (59,6%).
Houve 15% de complicações cirúrgicas, a maioria fístula biliar benigna e de
resolução clínica favorável. Em relação aos dias de internamento, o tempo mínimo
foi de 3 dias e máximo de 60 com uma média de 9 dias. Apenas 16 (19,3%)
pacientes foram submetidos a transfusão de concentrado de hemácias, enquanto a
maioria não necessitou (Tabela 6).
30
Tabela 6 – Características clínicas e patológicas dos pacientes estudados
relacionado ao tumor primário.
Variável n (%)
Idade <60 anos 45 (54)
>60 anos 38 (46)
Sexo Masculino 39 (47)
Feminino 44 (53)
Localização do primário Cólon 45 (54,2)
Reto 38 (45,8)
Linfonodos positivos Não 28 (33,7)
Sim 48 (57,8)
Tipo de Cirurgia maior 49 (59,6)
menor 34 (40,4)
Número de metástases 1 38 (45,8)
>1 45 (54.2)
Tamanho das metástases < /= 3cm 36 (43,4)
> 3cm 47 (56,6)
Doença bilobar Não 58 (70,0)
Sim 25 (30,0)
Doença sincrônica Não 42 (50,6)
Sim 41 (49,4)
A sobrevida global estimada da população estudada em 36 meses é de 73,3%
e em 5 anos de 58%.
31
Figura 4 - Sobrevida global
A sobrevida livre de doença estimada da população estudada em 36 meses foi
de 63,3% e em 5 anos de 40,8%.
32
Figura 5-Sobrevida livre de doença.
4.1 ANÁLISE UNIVARIADA DOS RESULTADOS DAS
VARIÁVEIS CLÍNICAS E PATOLÓGICAS EM RELAÇÃO AO
PROGNÓSTICO
Na análise univariada, idade, sexo, localização do tumor primário,
neoadjuvância, metástase sincrônica ou metacrônica, tipo de cirurgia, não se
mostraram significativas em relação à sobrevida dessa população estudada. Neste
estudo a presença de até duas metástases, estava relacionada com melhor sobrevida
livre de doença e com melhor sobrevida global. Além disso, o CEA inferior a 80
ng/ml, lesão metastática menor que 3 cm e doença unilobar, apresentaram
33
significado estatístico com melhor sobrevida global. As Figuras (6 a 10) abaixo
demonstram a representação gráfica dessas variáveis sobre a sobrevida.
p<0,01
Figura 6 - Gráfico da correlação entre o valor sérico do antígeno
carcinoembrionário (CEA) pré-hepatectomia e sobrevida global.
34
p<0,007
Figura 7 - Gráfico da correlação da dimensão das metástases com a sobrevida.
35
p<0,02
Figura 8 - Gráfico da correlação entre a presença de doença bilobar e sobrevida
global.
36
p<0,001
Figura 9 - Gráfico da correlação entre o número de nódulos e sobrevida global.
37
p<0,007
Figura 10 - Gráfico da correlação do número de lesões metastáticas e sobrevida
livre de doença
4.2 EXPRESSÃO DO VEGF NAS METÁSTASES HEPÁTICAS DE
CÂNCER COLORRETAL
Para a análise da expressão do VEGF foi utilizado o método automatizado
(ACIS III) que avalia o grau de intensidade (variando de 0 a 200) do marcador no
tecido estudado. Quase todos os pacientes, 96,4%, expressavam o marcador VEGF
no citoplasma e após obter média de expressão de duas amostras, foi obtido um
valor absoluto para análise dos resultados, conforme descrição prévia na sessão
métodos. Foi considerada baixa expressão quando o valor obtido foi até 90 e alta
expressão quando este valor encontrava-se acima de 90. A expressão do VEGF
38
apresentou um valor de intensidade mínima de 0, valor máximo de 144,3 e média
de 56,2.
Neste estudo a expressão imunoistoquímica positiva do VEGF no citoplasma
se associou a pior taxa de sobrevida global na análise univariada (Tabela 7).
Tabela 7 - Probabilidade de sobrevida em 5 anos de acordo com a expressão do
VEGF no tecido tumoral.
Sobrevida global (5 anos)
Variável Categorias
n %
valor de P
VEGF (ACIS)* Baixa expressão (até 90)
77 54,9 0,031
Alta expressão (> 90)
6 33,3
39
Figura 11 – Expressão do VEGF x Sobrevida Global
4.3 ESTUDO DA RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DO VEGF NO
TECIDO TUMORAL COM AS VARIÁVEIS CLÍNICAS E
PATOLÓGICAS
Foi realizada avaliação estatística da correlação entre nível de expressão do
VEGF com as seguintes variáveis: idade, sexo, grau histológico, localização do
tumor primário, tamanho do tumor primário, linfonodos comprometidos, CEA pré-
hepatectomia, metástase hepática sincrônica, tamanho da maior metástase hepática e
quantidade de nódulos hepáticos metastáticos.
VEGF: até 90
VEGF: > 90
P = 0,031
40
Na população estudada a expressão do VEGF foi maior nos pacientes com
idade superior a 60 anos com expressão mediana 69,6 e nos pacientes até 60 anos de
51,5 e esta diferença demonstrou resultado estatisticamente significativo na análise
univariada. Apesar da análise pelo coeficiente de Spearman ter sido concordante
entre as variáveis, a magnitude da correlação foi fraca.
O marcador VEGF não demonstrou associação com as outras variáveis
clínicas e histopatológicas deste estudo (Tabela 8).
41
Tabela 8 - Avaliação dos valores medianos de expressão de VEGF obtidos pelo
ACIS de acordo com diversas variáveis.
Variável Categoria
N
VEGF
(valor mediano) valor de P
Sexo
Feminino 39
56,4 W: P=0,855
Masculino 44
55,1
Idade
Até 60 anos 49
51,5 W: P=0,002
> 60 anos 34
69,6
Localização do tumor
Cólon 45
61,8 W: P=0,235
Reto 38
55,2
Tamanho do tumor primário
T2 15
65,0 W: P=0,889
T3 52
55,2
T4 8
61,7
Status linfonodal
N0 28
63,4 W: P=0,739
N1 – N2 48
54,4
Grau histológico do tumor
Grau 1 9
57,4 W: P=0,801
Graus 2 e 3 57
54,3
CEA pré-hepatectomia
Até 80 51
56 W: P=0,546
>80 12
65,3
Metástase sincrônica
Não 39
64,2 W: P=0,824
Sim 42
53,5
Tamanho da maior metástase Até 3 cm 36
46,6 W: P=0,122
> 3 cm 47
64,3
N° de nódulos metastáticos
Até 2 63
59,1 W: P=0,275
> 2 20
54,4
42
4.4 EXPRESSÃO DO EGFR NAS METÁSTASES HEPÁTICAS DE
CÂNCER COLORRETAL
Para a expressão do EGFR foram utilizados dois métodos para a análise: um
método automatizado (ACIS III), que avalia o grau de intensidade do marcador no
tecido estudado e outro através da interpretação subjetiva da expressão
imunoistoquímica na membrana, conforme descrição prévia na sessão métodos.
A expressão do EGFR foi de 97,6% nas metástases hepáticas e apresentou
um valor de intensidade mínima de 0, valor máximo de 173 e média de 86,2. Foi
considerada baixa expressão até 95 e alta expressão quando acima de 95. Neste
estudo, pelo método ACIS (automatizado), 53 (56%) pacientes apresentaram baixa
expressão e 30 (47%) alta expressão.
Com relação à análise do EGFR, pelo método subjetivo (não automatizado),
houve expressão nas metástases hepáticas em 57 (67,5%) pacientes. Vinte e sete
(32,7%) pacientes apresentavam tumores com expressão negativa, trinta e dois
(38,6%) pacientes com expressão baixa, enquanto quinze (18,1%) apresentavam
expressão moderada e em nove (10,8%), expressão forte para EGFR.
43
Tabela 9 - Probabilidades de sobrevida global em 5 anos de acordo com a expressão
do EGFR.
Sobrevida global ( anos)
Variável Categorias
n % Valor de P
EGFR (ACIS)* Baixa expressão (até 95)
53 56,0 0,230
Alta expressão (> 95)
30 47,0
EGFR Negativo – Fraco
59 58,1 0,072
Moderado – Forte
24 39,6
Figura 12 – Expressão do EGFR (ACIS) x Sobrevida Global
EGFR: até 95
EGFR: > 95
P = 0,230
44
Figura 13 - Expressão do EGFR (não automatizado) x Sobrevida Global.
4.5 ESTUDO DA RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DO EGFR
COM MÉTODOS IMUNOISTOQUÍMICOS DISTINTOS
Os métodos para a análise da expressão do EGFR foram através do
automatizado (ACIS) e o subjetivo (não automatizado). Houve correlação de
moderada a forte intensidade com coeficiente de correlação de Spearman positivo
0,751 e significância estatística (P<0,001) entre os dois métodos (Figura 14).
EGFR
(
-
)
/ EGFR
(
+ fraco
)
P = 0,072
EGFR
(
+ moderado
)
/ EGFR
(
+forte
)
45
EGFR (imuno-histoquímica)
3210
EGFR (ACIS)
200,0
150,0
100,0
50,0
0,0
Figura 14 - Correlação entre a expressão do EGFR avaliada pelo ACIS e por imuno-
histoquímica.
4.6 ESTUDO DA RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DO EGFR
COM AS VARIÁVEIS CLÍNICAS E PATOLÓGICAS
Foi realizada avaliação estatística da correlação entre nível de expressão do
EGFR com as seguintes variáveis: idade, sexo, grau histológico, localização do
tumor primário, tamanho do tumor primário, linfonodos comprometidos, CEA pré-
hepatectomia, metástase hepática sincrônica, tamanho da maior metástase hepática e
quantidade de nódulos hepáticos metastaticos.
Na população estudada utilizando os dois métodos de análise, a expressão do
EGFR não demonstrou associação com as outras variáveis clínicas e hitopatológica
(Tabela 10 e 11).
46
Tabela 10 - Avaliação dos valores medianos de expressão de EGFR obtidos pelo
ACIS de acordo com diversas variáveis.
Variável Categoria n
EGFR
(valor mediano)
Valor de P
Sexo Feminino 39 90,0 MW: P=0,820
Masculino 44 86,3
Idade
Até 60 anos
49 91,0 MW: P=0,259
> 60 anos 34 82,2
Localização do tumor Cólon 45 81,8 MW: P=0,141
Reto 38 88,9
Tamanho do tumor
primário
T2 15 77,8 KW: P=0,440
T3 52 89,5
T4 8 79,6
Status linfonodal N0 28 88,5 MW: P=0,613
N1 – N2 48 87,6
Grau histológico do
tumor
Grau 1 9 90,0 MW: P=0,455
Graus 2 e 3 57 88,5
CEA pré- hepatectomia Até 80 51 90,4 MW: P=0,861
> 80 12 88,5
Metástase sincrônica Não 39 87 MW: P=0,134
Sim 42 89
Tamanho da maior
metástase
Até 3 cm 36 83,9 MW: P=0,427
> 3 cm 47 90,4
N° de nódulos
metastáticos
Até 2 63 88,5 MW: P=0,651
> 2 20 87,6
47
Tabela 11 - Avaliação dos valores medianos de expressão de EGFR obtidos pela
imuno-histoquímica de acordo com diversas variáveis.
Negativo - Fraco Moderado - Forte
Variável Categoria
n (%) N (%)
Valor de
P *
Sexo Feminino 27 (69,2%) 12 (30,8%) 0,810
Masculino 32 (72,7%) 12 (27,3%)
Idade Até 60 anos 32 (65,3%) 17 (34,7%) 0,220
> 60 anos 27 (79,4%) 7 (20,6%)
CEA pré-hepatectomia Até 80 38 (74,5%) 13 (25,5%) 0,159
>80 6 (50%) 6 (50%)
Localização do tumor Cólon 36 (80,0%) 9 (20,0%) 0,057
Reto 23 (60,5%) 15 (39,5%)
Tamanho do tumor
primário
T2 12 (80,0%) 3 (20,0%) 0,369
T3-T4 40 (66,7%) 20 (33,3%)
Status linfonodal N0 22 (78,6%) 6 (21,4%) 0,301
N1 – N2 31 (64,6%) 17 (35,4%)
Grau histológico do
tumor
Grau 1 6 (66,7%) 3 (33,3%) 1,000
Graus 2 e 3 39 (68,4%) 18 (31,6%)
Metástase sincrônica Não 26 (66,7%) 13 (33,3%) 0,318
Sim 33 (78,6%) 9 (21,4%)
Tamanho da maior
metástase
Até 3 cm 27 (75,0%) 9 (25,0%) 0,626
> 3 cm 32 (68,1%) 15 (31,9%)
N° de nódulos
metastáticos
Até 2 45 (71,4%) 18 (28,6%) 1,000
> 2 14 (70,0%) 6 (30,0%)
48
4.7 ANÁLISE MULTIVARIADA DOS RESULTADOS DAS
VARIÁVEIS CLÍNICAS, PATOLÓGICA E IMUNOISTOQUÍMICAS
EM RELAÇÃO AO PROGNÓSTICO
Na análise multivariada, o CEA < 80 ng/ml e doença unilobar, não alcaçaram
significância estatística. Entretanto, o número de lesões metastáticas, tamanho das
metástases hepáticas e a expressão do VEGF foram os únicos fatores independentes
associados à sobrevivência dos pacientes estudados (Tabela 12).
Tabela 12 - Resultado da análise multivariada. Fatores de risco para óbito de acordo
com o modelo de riscos proporcionais de Cox.
VARIÁVEIS CATEGORIAS
HR
ajustada *
IC 95%
(HR ajustada)
P
Tamanho da maior metástase Até 3 cm 1,0 Referência 0,007
> 3 cm 4,2 1,5 - 12,2
Número de nódulos metastáticos Até 2 1,0 Referência 0,002
> 2 4,1 1,7 - 10,0
Doença bilobar Não 1 Referência
Sim 2,4 0,98 - 5,80 0,055
CEA <80 1 Referência
80 ou mais 1,9 0,78 – 4,68 0,154
Expressão de VEGF (ACIS) Até 90 1,0 Referência 0,004
> 90 6,7 1,8 – 24,4
49
5 DISCUSSÃO
Dependendo do estágio patológico do câncer colorretal e da evolução da
doença, a metástase hepática pode ser encontrada em até 50% dos pacientes e em
30% dos casos é o único sítio de doença sistêmica (STEELE e RAVIKUMAR 1989;
KEMENY et al. 2006). Sabe-se que o melhor tratamento para a metástase hepática é
a ressecção cirúrgica com sobrevida em 5 anos de 24% a 58% (WEI et al. 2006;
SIMMONDS et al. 2006; CUMMINGS et al. 2007; REES et al. 2008). Entretanto,
apesar dos benefícios da cirurgia, apenas 10% a 20% dos pacientes portadores de
metástases são candidatos cirúrgicos (VIBERT et al. 2005). Felizmente, houve
melhora no manejo dos pacientes portadores de metástase hepática e nos dias atuais,
aqueles pacientes que há alguns anos eram candidatos apenas a quimioterapia
paliativa, tornam-se elegíveis para cirurgias e se beneficiam com a ressecção
hepática com melhores índices de sobrevida (VIBERT et al. 2005).
A sobrevida global do nosso estudo foi de 58% em 5 anos e este resultado é
comparável com os melhores da literatura, como o de ABDALLA et al. (2004) que
demonstraram sobrevida de 57%. Atualmente, observa-se aumento na sobrevida dos
pacientes submetidos à ressecção de metástase hepática por câncer colorretal,
especialmente pelos avanços no tratamento oncológico com novas drogas
quimioterápicas, melhor seleção dos casos e avanços da técnica cirúrgica.
Nas últimas décadas, estudos identificaram fatores prognósticos relacionados
às metástases hepáticas de câncer colorretal e a análise de algumas destas variáveis
são utilizadas como marcadores de sobrevida. No nosso estudo, além de identificar
50
estas variáveis, abordamos o impacto da expressão imunoistoquímica do VEGF e
EGFR na metástase hepática do câncer colorretal da nossa população.
Na análise dos fatores demográficos, sexo e idade não estavam associados
com o prognóstico.
Os níveis séricos de CEA pré-hepatectomia superiores a 80ng/ml, se
correlacionaram com pior prognóstico na análise univariada, mas não na análise
multivariada. HUITRIC et al. (1976) reportaram associação entre níveis séricos
aumentados do CEA no câncer colorretal com grau histológico indiferenciado e
WANG et al. (1994) observaram que o CEA sérico aumentado, antes do tratamento
do tumor primário, foi fator prognóstico independente na sobrevida. Para o câncer
colorretal, está bastante claro a associação entre CEA e sobrevida e na conferência
de consenso realizada pelo Colorectal Working Group, em 1999, esse marcador foi
considerado como fator prognóstico independente. Entretanto, em relação ao CEA
pré-hepatectomia, estudos não o ratificaram como fator prognóstico. FONG et al.
(1999) já tinham observado que o CEA > 200ng/ml estava associado a um
prognóstico pior e maior chance de morte na análise univariada, mas na análise
multivariada não alcançou significância estatística. SUGAWARA et al. (2001)
encontraram resultados semelhantes.
As lesões metastáticas hepáticas maiores que 3 cm foram de forma
independente associadas a um pior prognóstico neste estudo. Vários autores
reportam um pior prognóstico quando analisam a incidência de recorrência e
sobrevida em metástases hepáticas de tumores colorretais maiores que 5cm
(NORDLINGER et al. 1996; FONG et al. 1999; IWATSUKI et al. 1999; SCHEELE
et al. 2001) e observaram que o tamanho das metástases foi um fator independente
51
de sobrevida global e livre de doença após a ressecção hepática. Sabe-se que quanto
maior a metástase hepática maior a chance de invasão vascular e, portanto pior
prognóstico. Por outro lado, no estudo de HAMADY et al. (2006), o tamanho da
metástase hepática não alcançou significância estatística na análise multivariada. Na
maioria dos estudos, o tamanho da metástase hepática é considerado fator
prognóstico adverso após a ressecção hepática, porém a presença de grandes lesões
não contra indica abordagem cirúrgica desde que se ofereçam margens da ressecção
sem evidência de neoplasia.
No nosso estudo, a presença de lesão metastática nos dois lobos hepáticos foi
identificada como um fator prognóstico adverso apenas na análise univariada
(p<0,02). Na literatura, há resultados conflitantes entre doença metastática hepática
bilateral e sobrevida. FONG et al. (1999) não identificaram a presença de tumor
bilobar como fator prognóstico adverso, entretanto, GAYOWSKI et al. (1994)
reportaram que envolvimento bilobar estava associado com pior sobrevida. Ainda
não está claro se o envolvimento bilobar seja um preditor de pior prognóstico.
A presença de mais do que 2 lesões metastáticas hepáticas, mostrou resultado
com significância estatística na análise univariada e foi identificada também como
um fator prognóstico independente na sobrevida neste estudo. FONG et al. (1999)
também observaram resultados semelhantes na presença de 2 ou mais lesões
metastáticas hepáticas que apresentavam pior prognóstico na análise multivariada.
Em estudo recente FIGUERAS et al. (2007) reportaram sobrevida de 30% em
pacientes com 4 ou mais metástases e de 24% acima de 5 lesões. Portanto, mesmo
sendo um fator de mau prognóstico, o número de metástases hepáticas não deve
desencorajar a abordagem cirúrgica.
52
Na última década, a ressecção hepática por metástases colorretais era contra-
indicada em pacientes com 4 ou mais metástases hepáticas, doença bilobar, grandes
lesões metástaticas, ou doença extra-hepática. Apesar das variáveis estarem
associadas a pior prognóstico, elas não contra indicam o tratamento cirúrgico. Deve-
se incentivar a ressecção hepática, pois é o único com potencial curativo e, além
disso, considerar o tratamento do paciente com metástases hepáticas em instituições
de oncologia que privilegiem abordagem multidiciplinar, pois muito destes pacientes
necessitam de tratamento quimioterápico adjuvante.
É imperativo identificar os pacientes com risco aumentado de recidiva da
doença através de fatores prognósticos e atualmente, além dos fatores prognósticos
já estabelecidos, pesquisas sugerem que as expressões do VEGF e do EGFR na
metástase hepática de câncer colorretal, podem sinalizar para um risco aumentado de
recidiva e menor sobrevida, tornando-os tão importantes quanto às variáveis já
identificadas. FOLKMAN (1971) consideraram o crescimento tumoral angiogênese-
dependente sendo o principal mediador neste evento o fator de crescimento vascular
endotelial (VEGF). CLASPER et al. (2008) demonstraram que a expressão do
VEGF no câncer colorretal está presente em 50% dos casos e com mínima expressão
ou ausência em cólon normal e adenomas, porém identificaram também aumento da
expressão em linfonodos comprometidos e nas metástases a distância, ou seja, na
evolução natural do tumor, a angiogênese é fundamental para o processo de invasão
e metástase e neste cenário há expressão aumentada do VEGF no tumor. KONDO et
al. (2000) observaram que o aumento da expressão do VEGF estava relacionado ao
maior potencial da vascularização tumoral e da metástase. No estudo de KANG et
al. (1997), com 163 pacientes, foi observada a expressão de VEGF em 49,1% dos
53
tumores primários e esta estava aumentada em pacientes portadores de metástases
hepáticas. Vale ressaltar que estes autores não observaram metástase em pacientes
com expressão negativa de VEGF no tumor primário. No estudo de KURAMOCHI
et al. (2006), foi observada uma forte correlação entre a expressão do VEGF no
câncer colorretal e o seu correspondente na metástase hepática. No entanto,
BERNEY et al. (1998) avaliaram a expressão do VEGF no câncer colorretal e na
metástase hepática e observaram redução da expressão do VEGF na metástase em
relação à expressão no primário. Além dos estudos demonstrando a expressão do
VEGF no tumor colorretal muitos autores têm estudado a sua relação com o
prognóstico. LEE et al. (2000) observaram que a sobrevida dos pacientes com
expressão do VEGF no câncer colorretal é pior do que naqueles com expressão
negativa. Uma recente meta-análise, que incluiu 27 estudos, reportou aumento da
expressão do VEGF no câncer colorretal e estava associado a piores taxas de
sobrevida na análise univariada e ressaltou que a expressão de VEGF foi um fator
independente no prognóstico dos pacientes operados, após análise multivariada
(DES GUETZ et al. 2006).
Na literatura há alguns estudos que investigaram a expressão do VEGF no
câncer colorretal e nos linfonodos comprometidos e sua relação com a sobrevida,
porém poucos investigaram a expressão do VEGF na metástase hepática e seu
impacto prognóstico. No nosso estudo a expressão do VEGF no citoplasma das
metástases hepáticas de câncer colorretal foi de 96,4%. Além disto, neste estudo a
expressão do VEGF na metástase foi fator independente de pior prognóstico.
NOIKE et al. (2008) observaram que a expressam do VEGF na metástase hepática
se correlacionou com a sobrevida na análise univariada, mas não alcançou
54
significância estatística na multivariada. TAMURA et al. (2004) realizaram um
estudo semelhante ao nosso e observaram que a expressão do VEGF na metástase
pulmonar de câncer colorretal estava associada a pior prognóstico. Portanto, apesar
de não haver na literatura muitos estudos que associem expressão do VEGF na
metástase hepática e sobrevida, nosso resultado revela que esta correlação deverá ser
considerada e investigada com mais casos e seguimento maior, além de encorajar
outros pesquisadores a estudar esta relação.
O nosso estudo avaliou também o impacto da expressão do VEGF em
relação a diferentes variáveis: sexo, grau histológico, localização do tumor primário,
tamanho do tumor primário, linfonodos comprometidos, CEA pré-hepatectomia,
metástase hepática sincrônica, tamanho da maior metástase hepática e quantidade de
nódulos hepáticos metastaticos. Nesta série, a expressão do VEGF não mostrou
correlação estatisticamente significativa entre sua expressão e estas variáveis, porém
foi observada uma correlação da expressão do VEGF com a idade. Na população
estudada, a expressão do VEGF foi maior nos pacientes com idade maior que 60
anos e apresentou uma expressão mediana 69,6 e nos pacientes até 60 anos de 51,5 e
esta diferença demonstrou resultado estatisticamente significativo na análise
univariada. A análise pelo coeficiente de Spearman foi concordante, observando-se
uma correlação positiva e significativa entre as variáveis, porém de magnitude fraca.
Nos últimos anos também tem sido investigada a expressão do EGFR como
um evento iniciador da cascata de sinalização intracelular levando a proliferação,
sobrevivência, angiogênese e metastatização (KARI et al. 2003). Muitos estudos
reportam aumento da expressão do EGFR no câncer colorretal e linfonodos
metastáticos. Em relação ao tumor primário, a expressão do EGFR pode variar de
55
16% para o câncer colorretal em estágios iniciais a 97% nos avançados
(SCARTOZZI et al. 2004; SPANO et al. 2005; BRALET et al. 2005). YASUI et al.
(1988) descreveram a expressão do EGFR em 26,6% dos pacientes com estágios II e
III de câncer colorretal. Além da investigação deste marcador molecular nos tumores
primários, alguns autores também avaliaram a sua relação com metástases
linfonodais. MCKAY et al. (2002) estudaram a expressão do EGFR em 249 tumores
colorretais e nas metástases linfonodais. Foi observada expressão positiva em 72,7%
nos tumores primários e em apenas 40,5% das metástases linfonodais. BRALET et
al. (2007) observaram a expressão do EGFR em 95% dos tumores colorretais de 40
pacientes e em 88% dos linfonodos metastáticos de 23 pacientes. No estudo de
DENG et al. (2009), a expressão do EGFR no tumor primário e nos linfonodos
metastáticos foi de 18% e 24%, respectivamente.
Em relação à expressão na metástase hepática, BRALET et al. (2007)
observaram expressão do EGFR em 79% das metástases hepáticas de câncer
colorretal em 51 pacientes operados. ITALIANO et al. (2005) observaram expressão
de 81,3% em 79 pacientes. No nosso estudo a expressão do EGFR na metástase
hepática pelo método automatizado (ACIS) foi de 97,6% e em relação à expressão
pelo método subjetivo (não automatizado) houve expressão nas metástases hepáticas
em 67,5%, ou seja, no nosso estudo, independentemente do método
imunoistoquímico, houve uma alta expressão do EGFR semelhante à maioria dos
trabalhos realizados.
Alguns autores têm encontrado discordância entra a expressão do EGFR no
tumor primário e sua correspondente metastática. SCARTOZZI et al. (2004), não
observaram correlação entre a expressão do EGFR no tumor colorretal e nos sítios
56
de metástases (hepática, pulmonar, óssea ou no sistema nervoso central). Neste
estudo, o EGFR foi avaliado em 99 pacientes e considerado positivo em 53% dos
tumores colorretais (tumor primário). No entanto, nas metástases, não foi observada
a expressão do EGFR. Além disso, foi encontrada expressão do EGFR em 15% das
metástases hepáticas cujo primário não expressava o EGFR. Estas observações
sugerem que as metástases são biologicamente diferentes do tumor de origem,
possivelmente por mutações adicionais e distinto comportamento molecular ao
longo do tempo. BRALET et al. (2007) observaram a perda da expressão do EGFR
nas metástases linfonodais e hepáticas, quando comparadas com o primário em 27%
dos pacientes. Por outro lado, ITALIANO et al. (2005) encontraram discordância
apenas em 6,3%.
BRALET et al. (2007) concluíram que a variabilidade da expressão pode ter
diferentes explicações. Para a análise imunoistoquímica ser confiável e reproduzível,
vários passos deveram ser padronizados: os anti-corpos anti-EGFR comercialmente
utilizados apresentam diferentes sensibilidades e não são específicos da forma
biologicamente ativa do receptor; a escolha da amostra tumoral para determinar o
status da expressão do EGFR na maioria das vezes é realizada em apenas um sítio
do tecido neoplásico; o ponto de corte do valor para definir a positividade de
expressão do EGFR não está claramente estabelecido, pois em alguns estudos é
considerado positivo quando é detectado em mais de 1% de células neoplásicas,
enquanto outros acima de 10%. Todas estas considerações podem conduzir a má
interpretação do resultado. CHUNG e SALTZ (2005) também sugerem que esta
discrepância aparente nos resultados seja possivelmente em virtude da falta de
padronização dos métodos imunoistoquímicas, implicando em interpretações
57
distintas. Em virtude destas considerações é importante reportar que no nosso
estudo, para a análise do EGFR, foram utilizados dois métodos de mensuração,
utilizando o habitual (subjetivo – não automatizado) e o automatizado (ACIS).
Observou-se concordância entre os métodos, já que se obteve um coeficiente de
correlação significativamente forte e positivo. Estes dados sugerem que os
resultados dos dois métodos são comparáveis caso haja necessidade de escolha por
um deles para a análise da expressão do EGFR. Além destas considerações a
respeito de diferentes resultados sobre a expressão do EGFR, há possibilidade de
modulações da expressão induzidas por quimioterapia como foi reportado por DE
PAS et al. (2004). Estes autores observaram que em pacientes portadores de câncer
de pulmão não pequenas células com expressão negativa para EGFR nos linfonodos
mediastinais antes do tratamento, tornaram-se EGFR positivo após quimioterapia
neoadjuvante nos linfonodos mediastinais e no tumor primário ressecados, ou seja,
muito possivelmente ao submeter os pacientes a esquemas quimioterápicos, podem
ocorrer mudanças no comportamento biológico tumoral e mudanças de expressão de
possíveis marcadores.
Na última década também tem sido investigada a relação da expressão do
EGFR com o prognóstico de sobrevida em pacientes com câncer colorretal. Estudos
do início da década e também recentes observaram correlação entre a expressão do
EGFR em linfonodos metastáticos de pacientes operados por câncer colorretal e
piora na sobrevida (GOLDSTEIN e ARMIN 2001; DENG et al. 2009). Além destes,
outros autores evidenciaram pior sobrevida quando os tumores primários ou
metastáticos do câncer colorretal expressavam EGFR (KHORANA et al. 2003;
RESNICK et al. 2004; GALIZIA et al. 2006). No nosso estudo não foi identificada a
58
associação entre expressão do EGFR nas metástases hepáticas com a sobrevida em
nenhum dos dois métodos imunoistoquímicos (ACIS e subjetivo). Outros autores já
tinham observado resultado semelhante ao nosso (MCKAY et al. 2002;
CUNNINGHAM et al. 2006). SPANO et al. (2005) avaliaram a expressão do EGFR
no câncer colorretal de 150 pacientes operados, com uma média de seguimento de
40 meses e não houve piora na sobrevida dos pacientes que expressavam o EGFR.
MCKAY et al. (2002), também não observaram correlação da expressão do EGFR
no tumor primário e sobrevida.
Neste trabalho, ao compararmos a expressão do EGFR nas metástases com
fatores clínicos e patológicos, não foi observada correlação com nenhuma das
variáveis estudadas e na literatura não encontramos estudos que investigaram
associação da expressão do EGFR nas metástases hepáticas com as variáveis citadas
no nosso trabalho.
Desde a observação pioneira de FOLKMAN (1971), o crescimento tumoral é
considerado angiogênese-dependente e o VEGF é o fator pró-angiogênico mais
extensamente estudado. Na prática clínica oncológica, o Fator de Crescimento
Vascular Endotelial (VEGF) figura como um alvo terapêutico no tratamento do
CCR metastático através de sua inibição com anticorpos anti-VEGF e estudos de
fase III mostram benefícios no tratamento com o emprego do anticorpo
Bevacizumabe nos pacientes com doença sistêmica (HURWITZ et al. 2009).
MENDELSOHN (1990) considerou que seria possível inibir a proliferação de
células neoplásicas através do bloqueio da ativação do EGFR, nesta linha o
cetuximabe, inibidor do Receptor do Fator de Crescimento Epitelial (EGFR), vem
sendo investigado em estudos fase III em associação com drogas quimioterápicas
59
como irinotecam no tratamento de primeira linha em pacientes portadores de doença
metastática hepática de câncer colorretal (VAN CUTSEM et al. 2009). Em um
recente relato, WEIHRAUCH et al. (2008) publicaram um caso de um paciente que
teve diagnosticado no ano de 2001 um adenocarcinoma de cólon estádio III. No ano
de 2008 este apresentou metástase hepática irressecável e linfonodos do hilo
hepático aumentados. Após tratamento adjuvante com cetuximabe, bevacizumabe
capecitabina e oxaliplatina o paciente mostrou completa remissão tumoral. Este
relato é intrigante e nos faz presumir que provavelmente este tumor expressava
VEGF e EGFR para ter ocorrido resposta completa ao tratamento, mas infelizmente
esta expressão não foi investigada antes do tratamento com os anticorpos
monoclonais.
Sabemos hoje que as metástases hepáticas do CCR têm componente genético
e que os inúmeros avanços no campo da biologia molecular muito têm contribuído
para o melhor entendimento da história natural da doença e para o desenvolvimento
de novas estratégias de tratamento. Ao identificar novos marcadores prognósticos
têm-se a possibilidade de selecionar o grupo de pacientes com maior risco para a
recidiva, progressão ou morte pela doença. Além disso, permite individualizar
tratamentos mais específicos para os pacientes sob risco aumentado de recidiva.
Portanto, a expressão do VEGF e do EGFR na metástase hepática poderá ser um
marcador não só de pior prognóstico, mas também preditor de resposta a terapias
com anticorpos monoclonais.
60
6 CONCLUSÕES
1 Neste estudo foi demonstrado aumento da expressão do VEGF e do EGFR
nas metástases hepáticas de câncer colorretal.
2 A expressão do EGFR nas metástases hepáticas colorretais não foi
identificada como variável independente no estudo.
3 O tamanho e o número de metástases hepáticas foram fatores prognósticos
independentes adversos na sobrevida
4 Os resultados da análise pelos dois métodos imunoistoquímicos (ACIS e não
automatizado) do EGFR nas metástases hepáticas tiveram correlação forte e
são comparáveis, ou seja, caso haja necessidade, pode-se utilizar um deles
para a análise da expressão do EGFR.
61
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