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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO ENDODONTIA
ANÁLISE DA SINALIZAÇÃO MOLECULAR DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA E
DO PROCESSO DE BIOMINERALIZAÇÃO PROMOVIDOS PELA IMPLANTAÇÃO
DE PROROOT MTA E HIDRÓXIDO DE CÁLCIO EM TECIDO SUBCUTÂNEO DE
CAMUNDONGOS.
Tese de Doutorado
Jessie Fabiola Reyes Carmona
Florianópolis
2009
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JESSIE FABIOLA REYES CARMONA
ANÁLISE DA SINALIZAÇÃO MOLECULAR DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA E
DO PROCESSO DE BIOMINERALIZAÇÃO PROMOVIDOS PELA IMPLANTAÇÃO
DE PROROOT MTA E HIDRÓXIDO DE CÁLCIO EM TECIDO SUBCUTÂNEO DE
CAMUNDONGOS.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, da Universidade Federal de Santa Catarina,
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Odontologia. Área de concentração:
Endodontia.
Orientador: Prof. Dr. Wilson Tadeu Felippe
Co-orientadora: Profª. Drª. Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro
Florianópolis
2009
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Catalogação na fonte por: Vera Ingrid Hobold Sovernigo CRB-14/009
R457a Reyes Carmona, Jessie Fabiola
Análise da sinalização molecula
r da resposta inflamatória e do processo
de
biomineralização promovidos pela implantação de ProRoot MTA e
hidróxido de
cálcio em tecido subcutâneo de camundongos / Jessie Fabiola Reyes
Carmona;
orientador Wilson Tadeu Felippe. – Florianópolis, 2009.
110 f.
Tese (Doutorado) –
Universidade Federal de Santa Catarina. Centro
de Ciências
da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia –
Opção
Endodontia.
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A Deus por tantas oportunidades,
pela minha vida tão cheia de alegrias,
pela proteção constante.
Ao meu esposo, Juanca, pela dedicação,
trabalho , estímulo e apoio, por formar
parte dos momentos mais importantes
de minha vida.
Aos meus filhos, Juan Carlos Jr. e José Daniel,
que todos os momentos vividos sirvam de exemplo
e inspiração. Saibam que esta luta é para e por vocês.
Com amor, a vocês, dedico este trabalho.
5
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Wilson Tadeu Felippe, por ter aberto as portas da
disciplina, onde adquiri conhecimento técnico e científico. Pelas oportunidades colocadas em
meu caminho, pela dedicação e ensinamentos recebidos durante estes 4 anos , os quais
contribuíram de modo especial para a minha formação em endodontia.
À minha co-orientadora, Prof
a
. Dr
a
. Mabel Mariela Cordeiro, por ter acreditado em mim,
por ter lutado junto a mim, minuto a minuto na realização deste trabalho. Pela orientação, pelo
constante incentivo, apoio, confiança e pelo exemplo de competência e dedicação, que guardarei
por toda a vida.
Ao Prof. Dr. Adair Roberto Soares dos Santos, por abrir-me as portas de seu
laboratório para que ali eu pudesse realizar a parte experimental deste trabalho. Pela confiança e
as oportunidades recebidas. Pelo seu exemplo de profissionalismo e humildade. Obrigada por ter
viabilizado a realização deste trabalho.
À Prof
a
. Dr
a
. Mara Cristina Santos Felippe, pelo seu exemplo de determinação, pelo apoio
e exemplo de competência e dedicação. Pela paciência em corrigir meu português. Obrigada pelos
ensinamentos que contribuíram de forma especial na minha formação.
À, Claudia FigueIredo, pela paciência em me ensinar e pela ajuda recebida passo a passo,
na realização da imunoistoquímica. Obrigada por ter aberto a possibilidade de aprender
imunoistoquímica o seu auxilio foi fundamental para a realização deste trabalho.
A todos minha eterna gratidão...
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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À Universidade de Costa Rica, por ter sido o princípio de tudo, por ter proporcionado a
oportunidade de realizar meus estudos de pós-graduação no exterior e pela ajuda para a
realização deste trabalho.
Ao Prof. Carlos Filloy, pela oportunidade concedida, por ter viabilizado meus estudos.
Ao Prof. Luis Murillo, pela confiança em nós depositada e pela ajuda recebida. Parabéns
pelo exemplo de coragem e amor ao ensino. Um exemplo de dedicação ao magistério.
Ao Prof. Rafael Huete, obrigada pela amizade, amabilidade e pela disposição e ajuda
recebida.
Ao Prof. Rodolfo Zeledón, pela disposição e orientação recebida durante o meu estágio
na Disciplina de Endodontia.
7
AGRADECIMENTOS
À minha familia, Mami, Mario e Alex, pelo exemplo de coragem e de união, pelo apoio
incondicional em minhas decisões, pelo incentivo e por estar sempre a meu lado, obrigado por
tudo o que fizeram por mim nesses meus anos de vida. Saudades!!!!!
À Maria Helena Pozzobon e à Miriam Marly Becker , os meus anjos da guarda e grandes
amigas, muito obrigada por serem tão lindas, por terem me auxiliado e apoiado em cada momento
desde a minha chegada e, principalmente, por serem tão especiais e amorosas com os tesouros
maiores de minha vida: meus filhos. É bom tê-las por perto. Sentirei muitas saudades!!!
À Ana Maria H. Alves, pelo exemplo de sinceridade e simplicidade, pelos conselhos, por
suas palavras de estímulo, amizade, amabilidade e ajuda. Você é muito especial.
À Cleonice da Silveira Teixeira, pela ajuda, pelos conselhos, por estar sempre à
disposição, pela amizade e carinho.
À Caroline Martins, pela amizade tão sincera nestes 4 anos, pelo apoio sempre recebido
e pelas experiências trocadas.
À Beatriz Mendez Souza, pela amizade, pelas conversas, pela acolhida afetuosa. Pelos
bons momentos vividos. Foi bom ter você por perto.
À Bianca, pela amizade, acolhida e conversas. Por ser tão especial, muito obrigada!!
Ao Guillerme Carpena, pela disposição, por toda a ajuda recebida e pela amizade.
Ao Eduardo Bortoluzzi, pelo convívio, obrigada pela sua disponibilidade.
À Luonothar A. Dreger, pela acolhida e conversas. Pela amizade e carinho. Obrigada!!
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À, Cristina, pela ajuda na realização do ELISA.
À Liene Campos, pela revisão deste trabalho e pela sua disponibilidade. Obrigada!!
Aos Jackeline, Sérgio e Marly, pela presteza, amabilidade e acolhida afetuosa. Muito
obrigada por tudo o que fizeram por mim nestes 4 anos!!!!
À disciplina de Endodontia e à UFSC, todos os professores e funcionários, muito
obrigada pelo convívio, pela disposição e por contribuir com minha formação.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram no desenvolvimento deste
trabalho, meus sinceros agradecimentos !!!
9
“A mente que se abre a uma nova idéia
jamais voltará ao seu tamanho original.”
Albert Einstein
10
REYES CARMONA, J. F. Análise da sinalização molecular da resposta
inflamatória e do processo de biomineralização promovidos pela implantação
de ProRoot MTA e hidróxido de cálcio em tecido subcutâneo de camundongos.
2009. 113f. Tese (Doutorado em Endodontia) - Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta tecidual e a biomineralização que
ocorre após a implantação, em tecido subcutâneo de camundongos, de tubos de
dentina preenchidos com ProRoot MTA ou pasta de hidróxido de cálcio (HC). Tubos
de dentina com 5,3 mm de diâmetro externo, 1,3 mm de diâmetro interno e 5,0 mm
de comprimento foram confeccionados a partir de 83 dentes humanos. Os tubos
foram divididos aleatoriamente e preenchidos com ProRoot MTA, HC ou mantidos
vazios. Quatro sítios de implantação foram realizados no tecido subcutâneo dorsal
de 55 camundongos. Em 3 desses sítios foram implantados um tubo preenchido com
MTA, um tubo preenchido com HC ou um tubo vazio. O quarto sítio foi utilizado para
observar a resposta inflamatória induzida pelo ato cirúrgico (Sham). Decorridos 12h,
1, 3, 7, 15, 30 e 60 dias, foi realizada a eutanásia dos animais. Os tecidos
subcutâneos foram removidos para dosagem de citocinas teciduais, análise
histológica e imunoistoquímica e os tubos de dentina foram processados para
avaliação em MEV. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de
ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni em um nível de significância
de 5%. Os achados mostraram que em 12h e nos dias 1 e 3, os níveis teciduais das
citocinas TNF-α, IL-1ß e IL-10 apresentaram-se elevados nos tecidos em contato
com tubos de dentina preenchidos com MTA ou HC, quando comparados com os em
contato com o tubo vazio ou o Sham. Em 12h o MTA estimulou uma expressão
significativamente maior de TNF-α, quando comparado ao HC. A análise
imunoistoquímica mostrou que a maior expressão de MPO, NF-κB, COX-2, iNOS e
VEGF foi no dia 1 para todos os grupos. O MTA estimulou, no dia 1, uma expressão
significativamente maior de COX-2 quando comparado ao HC. Na visualização em
MEV, foi possível observar a presença de aglomerados similares à apatita
depositados sobre as fibras colágenas a partir de 12h pós-implantação. A deposição
de precipitados aumentou ao longo do tempo, formando uma camada compacta de
apatita já aos 7 dias pós-implantação. Na análise da interface MTA-dentina, a
mineralização intratubular foi observada a partir das primeiras 12h pós-implantação,
11
sendo que os prolongamentos de apatita se tornaram maiores e mais compactos ao
longo do tempo. O HC promoveu um processo de mineralização intratubular com a
formação de prolongamentos mais curtos e em menor densidade. Foi possível
concluir que o MTA e o HC induzem um ambiente pró-inflamatório e pró-reparo,
sendo mais precoce com o MTA. Simultaneamente à resposta inflamatória aguda, o
processo de biomineralização ocorreu na interface biomaterial-dentina-tecido,
promovendo a formação de uma camada de apatita que permitiu a integração do
biomaterial ao ambiente receptor.
Palavras-chave: Agregado de Trióxido Mineral. Apatita. Bioatividade.
Biomineralização. Hidróxido de cálcio (HC). Inflamação.
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REYES CARMONA, J. F. Análise da sinalização molecular da resposta
inflamatória e do processo de biomineralização promovidos pela implantação
de ProRoot MTA e hidróxido de cálcio em tecido subcutâneo de camundongos.
2009. 113f. Tese (Doutorado em Endodontia) - Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
ABSTRACT
The aim of this study was to analyze the inflammatory process and the
biomineralization ability after subcutaneous implantation in mice of dentin tubes filled
with ProRoot MTA and calcium hydroxide (CH). A hundred and sixty-five dentin tubes
were prepared from extracted human tooth roots. The tubes were randomly divided
and filled with Tooth-colored ProRoot MTA, CH or kept empty. Immediately, the tubes
were implanted subcutaneously on the mice’s backs. Each mouse received 3 dentin
tubes, 2 filled with each material and 1 empty, whereas no specimen was inserted in
the fourth pocket (Sham). After 12h, 1, 3, 7, 15, 30 and 60 days, the tubes and
surrounding tissues were removed in order to determine cytokines level expression,
or histological and immunohistochemical staining. The dentin tubes were processed
for SEM evaluation. Data obtained were statistically analyzed by Two-way ANOVA
followed by Bonferroni post test with 5% level of significance. The biomaterials
induced an overall pro-inflammatory cytokine upregulation during the first three days
in a time-dependent manner. TNF-α, IL-1ß and IL-10 expressions, at 12h and days 1
and 3, from MTA or CH groups, were significantly upregulated when compared to
empty tubes and Sham. It was also observed that MTA stimulated an upregulation
on TNF-α expression at 12h when compared to CH. The immunohistochemical
analyses showed an upregulated expression of MPO, NFκB, COX-2, iNOS and
VEGF on day 1 for all groups. MTA provided a significant increase in the expression
of COX-2 on day 1 when compared to CH. As soon as 12h, SEM examination
showed the presence of apatite-like clusters deposited on collagen fibrils, all over the
surface of the dentin tubes containing the biomaterials. As the implantation time
increased, a more extensive mineralization process was observed leading to the
formation of a compact layer of apatite, 7 days post-implantation. MTA-dentin
interface showed an intratubular mineralization process, as early as 12h post-
implantation. Tag-like structures became denser and more compact over time.
Therefore, CH promoted a lesser and denser intratubular mineralization process. In
conclusion, MTA and CH induced a pro-inflammatory and pro-wound healing
13
environment, although it was earlier promoted by MTA. Simultaneously to the acute
inflammatory response, a biomineralization process occurred at the biomaterial-
dentin-tissue interface promoting the formation of an apatite-like layer that allowed
the integration of the biomaterial into the environment.
Key-words: Mineral Trioxide Aggregate (MTA). Apatite. Bioactivity. Biomineralization.
Calcium hydroxide (CH). Inflammation.
14
LISTA DE ABREVIATURAS
COX Ciclooxigenase
COX -2 Ciclooxigenase – 2
DMP-1 Proteína da matriz dentinária - 1
DNA Ácido desoxiribonucléico
D.O. Densidade óptica
EDAX Microanálise por energia dispersiva
EDTA Acido etilenodiaminotetracetico
ELISA Enzima imuno-ensaio
E.P.M. Erro padrão da média
IκB Proteína inibitória do NF-κB
IKK Proteína IκB quinase
IL Interleucina
IL-1ß Interleucina-1 ß
IL-10 Interleucina-10
iNOS Óxido nítrico sintase induzida
MPO Mieloperoxidase
NF-κB Fator nuclear-κB
NO Óxido nítrico
PBS Tampão salina-fosfato
PCR Reação em cadeia da polimerase
PGE2 Prostaglandina E2
TNF Fator de necrose tumoral
TNF-α Fator de necrose tumoral α
VEGF Fator de crescimento endotelial
15
SUMARIO
1
INTRODUÇÃO
1
5
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS 15
1.2 INFLAMAÇÃO
17
1.3 RELAÇÃO ENTRE HC E MTA E O PROCESSO INFLAMATÓRIO
22
1.4 BIOATIVIDADE DO MTA
24
2 PROPOSIÇÃO
28
3 MATERIAL E MÉTODOS
29
3.1 OBTENÇÃO E PREPARO DOS TUBOS DE DENTINA
29
3.2 ANIMAIS
30
3.3 INTERVENÇÃO CIRÚRGICA – IMPLANTAÇÃO SUBCUTÂNEA 30
3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO DAS AMOSTRAS
32
3.5 IMUNOISTOQUÍMICA 33
3.6 ANÁLISE DAS IMAGENS HISTOLÓGICAS
34
3.7 QUANTIFICAÇÃO DAS CITOCINAS TECIDUAIS PELO TESTE ELISA
36
3.8 PROCESSAMENTO PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
VARREDURA (MEV)
38
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
40
4 RESULTADOS
41
4.1 AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS TECIDUAIS DAS CITOCINAS
INFLAMATÓRIAS TNF-Α, IL-1Β E IL-10
41
4.2 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO PROCESSO INFLAMATÓRIO
42
4.3 AVALIAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DA EXPRESSÃO DO FATOR DE
TRANSCRIÇÃO NF-κB, DAS PROTEÍNAS INFLAMATÓRIAS COX-2, INOS E
VEGF E DA ENZIMA MPO
43
4.4 ANÁLISE DO PROCESSO DE BIOMINERALIZAÇÃO PROMOVIDO PELO
MTA E PELO HIDRÓXIDO DE CÁLCIO.
44
5 DISCUSSÃO
60
6 CONCLUSÕES
70
REFERÊNCIAS
76
ARTIGO VERSAO EM INGLÊS
78
ANEXOS
111
A - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA- CEP/UFSC
112
B - PARECER DO COMITÊ DE USO EM ANIMAIS 113
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS
As pastas de hidróxido de cálcio (HC) e o agregado de trióxido mineral (MTA)
são os materiais mais recomendados para criar um ambiente favorável à deposição
de tecido mineralizado em sítios de exposição pulpar, perfuração radicular e no
ápice de dentes despolpados com rizogênese incompleta.
O HC apresenta um alto pH que, além de lhe conferir grande poder
antimicrobiano, pode ativar a fosfatase alcalina e a adenosina trifosfatase
dependente de cálcio (FOREMAN; BARNES, 1990), ambas importantes no processo
de reparo dos tecidos calcificados.
O MTA, por sua vez, tem comportamento biológico similar ao HC (HOLLAND
et al., 2001). Inúmeras pesquisas demonstraram que o agregado é biocompatível
(TORABINEJAD et al., 1995, PITT FORD et al., 1995; HOLLAND et al., 1999) e
promove a formação de tecido mineralizado quando colocado em contato com a
polpa dental (SOARES, 1996; TORABINEJAD; CHIVIAN, 1999; FARACO;
HOLLAND, 2001; MENEZES et al., 2004) e com os tecidos periodontais
(TORABINEJAD; CHIVIAN, 1999; HOLLAND et al., 1999; FELIPPE; FELIPPE;
ROCHA, 2006).
O sucesso clínico observado com o emprego do MTA pode ser atribuído à
sua natureza bioativa (SARKAR et al., 2005; REYES-CARMONA; FELIPPE;
FELIPPE, 2009). A capacidade do material bioativo de interagir com o tecido permite
a sua integração com o ambiente receptor (YU et al., 2005). Quando um material
bioativo é implantado, uma série de reações bioquímicas e biofísicas ocorre na
interface implante-tecido que resulta na formação de apatita carbonatada (HENCH,
1991). Assim, biomineralização é o termo aplicado a todo processo de precipitação
mineral induzido e controlado biologicamente (BOSKEY, 1996).
Recentemente, foi demonstrado que os cimentos MTA e Portland branco,
imersos em tampão fosfato salino (PBS), dissolvem alguns de seus componentes no
meio, propiciando a precipitação de apatita carbonatada nas suas superfícies
(REYES-CARMONA; FELIPPE; FELIPPE, 2009). Mediante a colocação de MTA e
17
cimento Portland em canais ampliados de dentes humanos, o processo de
biomineralização proporcionou a formação de uma camada de apatita carbonatada
na interface cimento-dentina, inclusive com deposição mineral no interior dos túbulos
dentinários (REYES-CARMONA; FELIPPE; FELIPPE, 2009). A bioatividade do MTA
pode ser então, atribuída à sua capacidade de propiciar a formação de apatita
carbonatada (REYES-CARMONA; FELIPPE; FELIPPE, 2009).
A biocompatibilidade e a bioatividade de materiais odontológicos têm sido
investigadas por metodologias que envolvem proliferação e expressão celular,
implantação intraóssea e subcutânea e contato direto com os tecidos dentais (polpa
e ligamento periodontal).
Vários estudos têm avaliado a biocompatibilidade do HC e do MTA em tecido
subcutâneo de ratos (HOLLAND et al., 1999; HOLLAND et al., 2001; YALTIRIK et
al., 2004; GOMES-FILHO et al., 2008; GOMES-FILHO et al., 2009), tecido pulpar
(HOLLAND et al., 2001; TZIAFAS et al., 2002; DOMINGUEZ et al., 2003; MENEZES
et al., 2004), tecidos periapicais (TORABINEJAD et al., 1997; ECONOMIDES et al.,
2003; FELIPPE et al., 2005; FELIPPE; FELIPPE; ROCHA, 2006) e cultura de células
(KOH et al., 1998; ABDULLAH et al., 2000; HUANG et al., 2005; BALTO, 2004;
PELLICIONI et al., 2004; NAKAYAMA et al., 2005; MINAMIKAWA et al., 2009).
Pesquisas avaliando a resposta em tecido subcutâneo de ratos têm
demonstrado que o MTA (HOLLAND et al., 1999; HOLLAND et al., 2001; YALTIRIK
et al., 2004; GOMES-FILHO et al., 2008; GOMES-FILHO et al., 2009) e o HC
(HOLLAND et al., 1999) provocam uma moderada resposta inflamatória. Alguns
achados são comuns aos diferentes autores. Sete dias após a implantação
subcutânea, é possível observar a presença de necrose por coagulação e de
infiltrado inflamatório, composto principalmente por macrófagos e células
polimorfonucleares. Aos 15 dias, o quadro é de reação inflamatória moderada, com a
presença de células mononucleares e fibras colágenas. Após 30 dias, ocorre uma
diminuição da área reacional que passa a ser caracterizada pela presença de
poucas células mononucleares e de uma fina cápsula fibrosa. Aos 60 dias pode-se
notar a presença de uma da cápsula fibrosa mais espessa, com infiltrado moderado
de macrófagos, fibroblastos e células gigantes. Aos 90 dias, o infiltrado inflamatório
não está mais presente (YALTIRIK et al., 2004).
18
Estudos demonstraram que o HC e o MTA induzem uma série de reações que
resultam em um processo de mineralizacão, comumente denominado calcificação
distrófica (HOLLAND et al., 1999; HOLLAND et al., 2001; GOMES-FILHO et al.,
2008; GOMES-FILHO et al., 2009). Quando implantados em tecido subcutâneo,
houve a formação de granulações birrefringentes à luz polarizada próximo à abertura
dos tubos de dentina contendo os materiais (HOLLAND et al., 1999). Holland et al.
(1999) descreveram essas granulações como sendo cristais de calcita, originados da
reação do cálcio com o dióxido de carbono proveniente dos tecidos. Diante dos
resultados, os autores postularam que o mecanismo de ação do MTA, na indução de
deposição de tecido duro, é similar ao do HC.
A exposição celular aos diferentes materiais pode levar a efeitos imunotóxicos
(WOODS et al., 1994). Quando um material é colocado em contato com tecido vivo
há uma reação inflamatória, mediada por células de defesa do organismo, a qual
está intimamente relacionada ao reparo (LARSEN; HENSON, 1983; TAKAHASHI,
1998). As reações de defesa do organismo envolvem várias funções regulatórias e
diversos mediadores moleculares (LARSEN; HENSON, 1983). Como o reparo inicia
já nas primeiras fases da inflamação, é necessário entender o processo inflamatório
detalhadamente.
1.2 INFLAMAÇÃO
A inflamação se caracteriza pela reação do tecido vascularizado a uma
agressão local, seja de natureza física, química ou biológica. Esse mecanismo de
defesa inclui uma série de reações bioquímicas que acontecem, principalmente na
microcirculação e no tecido conjuntivo (ROITT; BROSTOFF; MALE, 2002).
A resposta inflamatória consiste de dois principais componentes: uma reação
vascular e uma reação celular. Muitos tecidos e células estão envolvidos nessas
reações, incluindo o fluido tissular e suas proteínas plasmáticas, as células
circundantes, os vasos sangüíneos e os componentes celulares e extracelulares do
tecido conjuntivo. As células circulantes incluem neutrófilos, monócitos, eosinófilos,
linfócitos, basófilos e plaquetas. As células do tecido conjuntivo incluem mastócitos,
que estão intimamente ligados aos vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos
19
locais e linfócitos. Dentre os componentes da matriz extracelular se incluem
proteínas estruturais (colágeno e elastina), glicoproteínas de adesão (fibronectina,
laminina, colágeno não-fibrilar e tenascina entre outras) e proteoglicanas (ROBBINS;
COTRAN, 2005).
A inflamação aguda tem uma duração relativamente curta, com duração de
minutos até 1 ou 2 dias. Esse processo possui três componentes principais:
aumento do fluxo sanguíneo, aumento da permeabilidade capilar e aumento da
migração dos leucócitos, que se acumulam no foco da lesão, e são ativados para
eliminar ou controlar o agente nocivo (LARSEN; HENSON, 1983; ROBBINS;
COTRAN, 2005). Por outro lado, a inflamação crônica pode persistir por semanas,
meses ou anos. Nesse processo, além dos fenômenos exsudativos ocorrem também
os proliferativos, envolvendo a proliferação de vasos, fibroblastos e a migração e
proliferação de monócitos e linfócitos (ROBBINS; COTRAN, 2005).
As reações vasculares e celulares do processo inflamatório são mediadas por
fatores químicos derivados de proteínas plasmáticas ou de células (LARSEN;
HENSON, 1983). Tais mediadores agem em conjunto ou em sequência,
amplificando a resposta inflamatória e consequentemente influenciando a sua
evolução. Os mediadores derivados do plasma estão presentes na forma de
precursores e devem ser ativados por meio dos fatores de transcrição, fator nuclear
kappa B (NF-κß) e phospho-c-jun (AP-1) e de uma série de clivagens proteolíticas
para adquirir suas propriedades biológicas. Os mediadores derivados de células
normalmente estão armazenados em grânulos intracelulares que precisam ser
secretados ou sintetizados em resposta a um estímulo. As principais fontes de
mediadores são as plaquetas, neutrófilos, monócitos/macrófagos e mastócitos. No
entanto, algumas células mesenquimais também podem induzir a liberação de
alguns mediadores (LARSEN; HENSON, 1983).
A maioria dos mediadores químicos desempenha sua atividade biológica
ligando-se, inicialmente, a receptores específicos nas células-alvo. Os mediadores
podem atuar em um ou em alguns tipos celulares, ter vários alvos, ou até apresentar
efeitos distintos de acordo com os tipos de células e tecidos ou os genes de
expressão envolvidos (ROBBINS; COTRAN, 2005).
Dentre os mediadores químicos mais importantes estão a mieloperoxidase
(MPO), as aminas vasoativas (histamina e serotonina), proteases plasmáticas
(sistema de complemento e sistema de cininas), metabólitos do ácido araquidônico
20
(prostaglandinas e leucotrienos), fatores ativadores plaquetários, citocinas,
quimiocinas e reativos intermediários do oxigênio e nitrogênio (LARSEN; HENSON,
1983; ROITT; BROSTOFF; MALE, 2002; ROBBINS; COTRAN, 2005).
Acredita-se que o controle molecular da resposta inflamatória seja mediado
por citocinas (HUANG et al., 2005; MINAMIKAWA et al., 2009). Citocinas são
proteínas de baixo peso molecular produzidas por vários tipos celulares,
principalmente linfócitos, macrófagos ativados e por células do endotélio, epitélio e
tecido conjuntivo (LARSEN; HENSON, 1983; ROITT; BROSTOFF; MALE, 2002). As
citocinas podem atuar sobre a mesma célula que as produz (efeito autócrino), afetar
células vizinhas (efeito parácrino) ou afetar várias células sistemicamente (efeito
endócrino).
A interleucina-1 (IL-1) e o fator de necrose tumoral (TNF) são as duas
principais citocinas que participam do processo inflamatório (HUANG et al., 2005;
MINAMIKAWA et al., 2009). Essas citocinas são produzidas principalmente por
macrófagos ativados.
A IL-1 é um mediador chave na resposta inflamatória. É liberada pelos
macrófagos ativados, monócitos e células dendríticas em resposta ao TNF-"
(MINAMIKAWA et al., 2009). A IL-1 é quimiotática para monócitos e neutrófilos,
aumenta a proliferação de fibroblastos e induz a produção da colagenase e
prostaglandinas. Existem duas isoformas principais, a IL-1" e a IL-1ß. A IL-1"
permanece de forma constitutiva nas células, enquanto a IL-1ß estimula a infiltração
de neutrófilos e pode agir como mediador final através da indução e secreção de
eicosanóides e quimiocinas (LARSEN; HENSON, 1983; ROITT; BROSTOFF; MALE,
2002).
O TNF-", uma proteína de 17 kD, foi descrita originalmente como um fator
antitumoral. Posteriormente foi demonstrada sua participação nas reações
inflamatórias ativando o endotélio vascular local durante a fase aguda da resposta.
O TNF-" estimula a liberação do óxido nítrico, promovendo a vasodilatação e o
aumento da permeabilidade vascular. Essas alterações promovem o recrutamento
de células inflamatórias e a ativação da expressão de vários genes, como outras
citocinas, imunoglobulinas e antígenos do complexo principal de
histocompatibilidade (MINAMIKAWA et al., 2009). O TNF-" é produzido
principalmente por macrófagos ou monócitos ativados. No entanto, as células
21
endoteliais, as natural killer, as da musculatura lisa, os mastócitos e os
queratinócitos também são capazes de induzir a sua liberação (LARSEN; HENSON,
1983; ROITT; BROSTOFF; MALE, 2002).
Os efeitos da IL-1ß e o TNF-" dependem, em parte, da ativação do fator de
transcrição NF-κB (LEE et al., 2007a; MINAMIKAWA et al., 2009). O fator NF-κB
está presente na maioria das células, onde permanece no seu estado inativo no
citoplasma, ligado ao seu inibidor endógeno, o IκB (HAYDEN; WEST; GHOSH,
2006; LEE et al.a, 2007). Quando a célula é exposta a sinais ativadores, como a
ligação do TNF-" aos receptores da superfície celular, a proteína IκB é fosforilada e
degradada. Este processo libera o complexo NF-κB, o qual é translocado para o
núcleo, ligando-se a sequências especificas do DNA para ativar a transcrição de
diversos genes como a ciclo-oxigenase-2 (COX-2) (LEE et al., 2007b; MINAMIKAWA
et al., 2009) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (GÜVEN et al.,
2007).
A IL-10 é caracterizada por sua potente propriedade anti-inflamatória, inibindo
a produção das citocinas pró-inflamatórias como o TNF-" e a IL-1ß (LARSEN;
HENSON, 1983; ROITT; BROSTOFF; MALE, 2002; HUANG et al., 2005). Esta
citocina pode agir como antagonista natural do TNF-" e da IL-1ß, através da inibição
da ativação do NF-κß, preservando o Iκß (LEE et al., 2007a).
A MPO é uma proteína catiônica com 144 kD de peso molecular, sendo a
principal constituinte dos grânulos azurófilos dos neutrófilos (LARSEN; HENSON,
1983). Desta forma, ela é considerada um marcador de neutrófilos ativados durante
a fase aguda da reação inflamatória. A mieloperoxidase, através da reação com
peróxido de hidrogênio, forma radicais livres e substâncias oxidantes difusíveis com
atividade antimicrobiana. No entanto, também promove dano oxidativo no tecido do
hospedeiro nos locais de inflamação (LARSEN; HENSON, 1983; ROITT;
BROSTOFF; MALE, 2002).
Dentre os principais mediadores oxidativos que participam da resposta
inflamatória aguda e crônica destaca-se o óxido nítrico (NO). O NO é um mediador
pleiotrópico da inflamação, produzido por uma ampla variedade de células, incluindo
as endoteliais, epiteliais e inflamatórias. Este mediador apresenta um mecanismo de
ação parácrino sobre a célula, induzindo a guanosina monofosfato cíclico (GMP), a
qual apresenta uma potente ação vasodilatadora. O NO é produzido a partir do
22
aminoácido L-arginina através da reação da enzima óxido nítrico sintase (NOS)
(ROBBINS; COTRAN, 2005; MINAMIKAWA et al., 2009). Existem três tipos
diferentes de NOS – endotelial (eNOS), neuronal (nNOS) e induzível (iNOS). As
enzimas eNOS e nNOS estão expressas de forma constitutiva em níveis baixos. A
iNOS, por outro lado, é induzida somente quando os macrófagos e outras células
são ativadas pelas citocinas ou outros agentes inflamatórios (DE COUTA PITA et al.,
2009; MINAMIKAWA et al., 2009).
Um importante mecanismo do processo inflamatório é a ativação da cascata
do ácido araquidônico, liberado a partir dos fosfolipídios da membrana através da
ação das fosfolipases celulares (fosfolipase A
2
) (ROBBINS; COTRAN, 2005). O
ácido araquidônico pode ser convertido por duas classes principais de enzimas: as
ciclo-oxigenases que resulta na produção de prostaglandinas (PG) e as lipo-
oxigenases, que formam leucotrienos e lipoxinas (LARSEN; HENSON, 1983; ROITT;
BROSTOFF; MALE, 2002).
A ciclo-oxigenase (COX) representa a enzima limitante na produção das
prostaglandinas e pode estar presente na maioria das células, incluindo as epiteliais,
as endoteliais, os macrófagos e os fibroblastos (NAKANISHI et al., 2001; ROITT;
BROSTOFF; MALE, 2002). Duas isoformas principais (COX-1 e COX-2) e uma
variante da COX-1 (COX-3) têm sido clonadas e identificadas (GÜVEN et al., 2007).
A COX-1 participa na manutenção dos níveis basais de prostaglandinas, exercendo
funções de homeostase fisiológica (NAKANISHI et al., 2001). Já a COX-2 é
constitutivamente expressa em pequenas quantidades em determinados tecidos
(cérebro, intestinos, rins, endotélio vascular e pâncreas). No entanto, em resposta a
estímulos pró-inflamatórios da IL-1ß e do TNF-α, a sua expressão pode ser
aumentada cerca de 20 vezes (SCHONBECK et al., 1999; COON; GULATI;
COWAN, 2007; GÜVEN et al., 2007; MINAMIKAWA et al., 2009).
À medida que a agressão tecidual é controlada, fatores de crescimento de
fibroblastos, metaloproteinases e fatores angiogênicos são produzidos visando o
reparo tecidual. O VEGF é um mitógeno específico para células endoteliais
vasculares (BOTERO et al., 2006). Devido à sua potente propriedade angiogênica e
mitogênica, o VEGF participa de processos biológicos cruciais, incluindo o reparo
tissular (FERRARA, 1999). O VEGF é um potente vasodilatador e funciona como
regulador da permeabilidade vascular, considerada importante para o início da
angiogênese. Estudos têm mostrado que a sobrevivência das células endoteliais
23
nos vasos recém-formados é dependente do VEGF (NISSEN et al., 1998;
FERRARA, 1999, INIGUEZ et al., 2003). Níveis elevados de VEGF têm sido
detectados durante a fase de cicatrização ou reparo e estão presentes em tecidos
com células endoteliais inativas, confirmando que a ação deste fator não está
limitada à indução do crescimento. Recentemente, tem sido reportado que o VEGF
desempenha um papel importante no crescimento celular endotelial, na prevenção
da apoptose de células endoteliais e na formação vascular colateral (NISSEN et al.,
1998; FERRARA, 1999, INIGUEZ et al., 2003). E sabido que durante a resposta pró-
inflamatória, o aumento na expressão de VEGF ocorre via COX-2, promovendo a
angiogênese no local agredido (MAJIMA et al., 2000; GÜVEN et al., 2007).
1.3 RELAÇÃO ENTRE MTA E HC E O PROCESSO INFLAMATÓRIO
A resposta inflamatória induzida pelo HC e MTA tem sido avaliada em
diversos modelos experimentais. No entanto, foram poucos os estudos que
avaliaram os mecanismos e mediadores químicos envolvidos no processo
inflamatório desencadeado pelos materiais.
Em estudos realizados para avaliar a resposta de osteoblastos humanos ao
MTA foi observado, mediante teste ELISA, um aumento na produção de IL-1", IL-1ß,
IL-6 e osteocalcina (KOH et al., 1998; KOH et al., 1997). Os autores concluíram que
é possível que o MTA ofereça um substrato biologicamente ativo para as células
ósseas, promovendo a produção de citocinas (KOH et al.,1998). De forma
semelhante, células de osteossarcoma humano em contato com o MTA expressaram
IL-4, IL-6, IL-8 e IL-10 (MITCHELL et al., 1999; HUANG et al., 2005). A expressão
dessas citocinas sugere que o agregado é biocompatível, estimula a liberação de
citocinas anti-inflamatórias e favorece a angiogênese (SILVA; VIEIRA; SOBRINHO,
2008).
Gomes; Gomes Filho; Oliveira (2008) avaliaram os mecanismos envolvidos na
migração de neutrófilos induzida pelo MTA em distintas concentrações (0,25; 2,5; 25
e 250 mg/cavidade), para a cavidade peritoneal de camundongos. Dentre os
resultados obtidos nesse estudo, foi observado que a injeção intraperitoneal do MTA
induziu a migração neutrofílica de maneira dose-dependente, sendo esta resposta
24
observada nas doses de 2,5, 25 e 250 mg/cavidade. O pico de recrutamento de
neutrófilos ocorreu 6h após a injeção do MTA. Foi possível verificar que 48h após o
estímulo, ocorreu a migração de células mononucleares. Ao analisar o efeito de
diferentes drogas, dentre elas a indometacina (inibidor da ciclo-oxigenase),
dexametasona (glicocorticóide), BWA4C (inibidor da lipo-oxigenase), U75302
(antagonista do LTB
4
) sobre a resposta inflamatória promovida pelo MTA, os autores
observaram que a indometacina foi a única droga que não se mostrou efetiva na
inibição da migração de neutrófilos. Esse achado sugere que os produtos derivados
da ciclo-oxigenase não estão envolvidos no recrutamento de neutrófilos. Ainda, foi
sugerido que o MTA induz uma resposta inflamatória mediada pela liberação de IL-
1ß e MIP-2 e também induz o processo de recrutamento de neutrófilos mediante a
participação da lipo-oxigenase, das citocinas e das quimiocinas.
Com o intuito de conhecer o processo de migração de neutrófilos promovido
pelo HC, Teixeira de Moraes Costa; Oliveira; Gomes Filho (2008) realizaram um
estudo, in vivo, para avaliar os mecanismos e os mediadores envolvidos no
recrutamento celular. Para tanto, foram produzidas cavidades de ar no subcutâneo
de camundongos e distintas concentrações de HC (15, 30 e 150 mg/cavidade) foram
injetadas. Os resultados mostraram que a migração de neutrófilos promovida pelo
material foi significativa a partir das 48h aumentando até 96h após o estímulo. O
acúmulo de células mononucleares foi significativo a partir das 48h e se manteve por
até 120h. Foi possível detectar a presença do LTB
4
, TNF", IL-1ß, KC e MIP-2 no
exsudato proveniente das cavidades de ar. Esses achados sugerem que o TNF",
produtos derivados da ciclo-oxigenase e da lipo-oxigenase, citocinas e quimiocinas
estão envolvidos no processo de recrutamento de neutrófilos e representam uma
parte dos componentes presentes na cascata inflamatória. Nesse estudo foi
observado que o aumento da população de macrófagos não alterou o processo de
migração de neutrófilos, sugerindo que os macrófagos e os mastócitos não estão
envolvidos nessa resposta inflamatória específica. Os autores salientaram que o HC,
provavelmente tem a habilidade de estimular outros tipos celulares, como as
endoteliais, as mesenquimais, os linfócitos e os fibroblastos.
Minamikawa et al. (2009) realizaram um estudo com o objetivo de analisar a
citotoxicidade do MTA em células clonais da polpa de ratos (RPC-C2A). Para tanto,
a resposta inflamatória foi analisada por meio da reação em cadeia da polimerase
(PCR) para detecção de COX-2 e iNOS. A detecção das proteínas p65, pIkB e IkBk
25
foi realizada com o ensaio de Western Blot. O teste ELISA foi efetuado para a
análise dos níveis de PGE
2
. Os achados desse estudo demonstraram que o MTA
promoveu a expressão de COX-2 e de iNOS. O meio condicionado com MTA
aumentou de forma significativa a produção de PGE
2
, sendo que 12h após houve a
sua máxima expressão. Sabe-se que a expressão de COX-2 é regulada pela ação
de diversos fatores de transcrição. Os autores comprovaram que o MTA induz a
fosforização do IkB. Assim, é sugerido que esse complexo se transloca ao núcleo
induzindo a liberação de outros mediadores da inflamação, como por exemplo, a
COX-2. Com a finalidade de determinar se a expressão de COX-2 e iNOS é mediada
pelo NFkB, as células foram tratadas com curcumina (curucumin), um supressor da
ativação do NFkB. Os resultados mostraram que a curcumina suprimiu a expressão
de COX-2 e iNOS. Os autores concluíram que o MTA estimula a expressão de COX-
2 e produz PGE
2,
a qual simultaneamente induz iNOS de forma autócrina via
ativação do NFkB.
1.4 BIOATIVIDADE DO MTA
O sucesso clínico do MTA tem sido atribuído à sua natureza bioativa
(SARKAR et al., 2005). Vários estudos têm demonstrado que a interação do MTA
com o PBS promove a formação de cristais (SARKAR et al., 2005; BOZEMAN;
LEMON; ELEAZER, 2006, TAY et al., 2007; TAY; PASHLEY, 2008; REYES-
CARMONA; FELIPPE; FELIPPE, 2009).
Com o intuito de conhecer as propriedades físico-químicas do MTA, Sarkar et
al. (2005) realizaram um estudo, in vitro, para avaliar as interações do agregado com
o fluido tissular sintético (PBS). Os autores reportaram que, após 1 ou 2h de
armazenamento, precipitados de cor branca foram observados na superfície do
cimento. Os cristais, analisados em microscópio eletrônico de varredura (MEV),
apresentaram composição química similar à hidroxiapatita (oxigênio, cálcio e
fósforo). Na análise em MEV, de cortes transversais, de dentes preenchidos com o
agregado e imersos por 2 meses no PBS, foi observada a presença de uma
intercamada entre o MTA e a dentina, composta principalmente de cálcio, fósforo e
oxigênio. Os autores concluíram que os íons cálcio liberados pelo MTA reagem com
26
o fosfato proveniente do PBS formando cristais de hidroxiapatita. Os cristais de
hidroxiapatita preenchem espaços microscópicos entre o MTA e a parede de
dentina, formando, nessa interface, uma camada com aparente adesão química à
dentina. Os autores sugeriram ainda que o sucesso clínico obtido com o MTA, em
termos de selamento, biocompatibilidade e atividade dentinogênica, pode ser
atribuído a essas reações físico-químicas.
Um ano mais tarde, Bozeman; Lemon; Eleazer (2006) analisaram a
quantidade e o tipo de cristais formados nas superfícies do MTA branco, do MTA
cinza e de um cimento experimental (Dentalcrete). Na análise química dos cristais
formados pela interação dos cimentos com PBS foram encontrados cálcio e fósforo
de forma similar à hidroxiapatita. Os autores confirmaram os resultados de Sarkar et
al. (2005) salientando que os cristais provenientes do MTA branco e cinza são
química e estruturalmente similares à hidroxiapatita. Foi sugerido que o
preenchimento dos microporos do MTA pela constante precipitação de cristais e a
camada formada entre o MTA e a dentina podem explicar os resultados favoráveis
obtidos nos testes de microinfiltração.
Martin et al. (2007), avaliando o selamento marginal de tampões apicais de
MTA, observaram que a interação do MTA com o PBS melhora o selamento
marginal ao longo do tempo.
Tay et al. (2007) desenvolveram um estudo, in vitro, com o objetivo de
caracterizar a bioatividade do cimento Portland branco (principal constituinte do MTA
branco) quando submetido ao contato com tampão fosfato-salino. Blocos de cimento
Portland foram imersos em PBS (pH 7,3) por 10 dias. Os precipitados foram
avaliados por meio de microanálise de energia dispersiva (EDAX) no microscópio
eletrônico de varredura (MEV), difração de raios-X (XRD) e espectroscopia de luz
infravermelha (FT-IR). O pH e a turbidade das soluções onde os blocos estiveram
imersos também foram analisados. Os valores de pH aumentaram de 7,3 para 11,0
em 52h e declinaram para 10,2 no fim do período experimental. Foram observados
precipitados esféricos brancos com prolongamentos de forma agulheada, de 50 a
200 nm de diâmetro. A análise em FT-IR dos precipitados produzidos antes de
alcançar o pH máximo (aproximadamente após 4h de imersão) mostrou anéis de
difração de elétrons difusos, característicos da formação de fosfato de cálcio amorfo.
A análise em MEV dos precipitados coletados depois de 240h revelou a presença de
esferas de agregados cristalinos compostos por uma fase de fosfato de cálcio
27
(deficiente em cálcio), com uma razão molar cálcio/fósforo (Ca/P) de 1,40 a 1,50. A
FT-IR revelou anéis concêntricos, característicos de pequenos agregados
pobremente cristalinos. Os autores concluíram que a bioatividade do cimento
Portland branco, em presença de PBS, deve ser atribuída à formação de apatita
carbonatada tipo B, deficiente em cálcio.
Em estudo recente, Tay; Pashley (2008) observaram que o cimento Portland
imerso em PBS tem a capacidade de remineralizar a dentina. De acordo com os
autores, os precipitados de apatita carbonatada apresentam afinidade pela proteína
da matriz dentinária (DMP-1), a qual serve de guia durante a incorporação dos
precipitados pela trama colágena, promovendo, assim, um processo de
biomineralizacão controlada.
Recentemente, Reyes-Carmona; Felippe; Felippe (2009) analisaram a
interação dos cimentos ProRoot MTA, MTA Branco, MTA BIO e cimento Portland
com ou sem cloreto com a dentina após a imersão em PBS. Através da avaliação
ultraestrutural e a análise química pontual em MEV, foi possível verificar a presença
de precipitados com diferentes morfologias, compostos, principalmente, por íons
cálcio e fósforo. Em maior quantidade foram observados precipitados esféricos com
prolongamentos agulheados (aciculars). Precipitados em forma de pétalas de flor
apresentaram composição química similar aos primeiros, com uma razão molar Ca/P
de 1,41 a 1,55. Também foram observados precipitados mais compactos e
aglomerados lembrando esponjas com uma razão molar Ca/P de 1,60 a 1,63.
Diferentemente dos primeiros, nestes foi detectada pequena quantidade de
magnésio. A observação das diferentes formas ultraestruturais, somada aos
resultados da análise da composição química e da proporção Ca/P dos precipitados,
permitiram deduzir que inicialmente é formada uma fase de fosfato de cálcio amorfo,
a qual atua como precursora da fase secundária durante a qual é formada a apatita
carbonatada. Na visualização em MEV da interface cimento-dentina foi possível
distinguir a presença do cimento, intercamada e dentina. A intercamada mostrou
constituição diferente da dos cimentos, sendo composta principalmente por íons
cálcio e fósforo. Além da presença da intercamada já identificada por Sarkar et al.
(2005), este estudo reportou a formação de prolongamentos que têm origem na
intercamada e se estendem para o interior dos túbulos dentinários, semelhantes aos
tags reportados na interface resina-dentina. Na microanálise por energia dispersiva,
os prolongamentos revelaram composição química similar à intercamada e à
28
dentina, apesar de apresentarem maior quantidade de íons sílica. Segundo os
autores, a constante precipitação de apatita carbonatada contribui não somente na
formação da intercamada como também promove um processo de mineralização
intratubular. Proteínas não colágenas da dentina, como a DMP-1, apresentam uma
especificidade molecular com os precipitados de apatita, servindo de guia durante a
sua incorporação na matriz colágena, promovendo, assim, um processo de
biomineralização controlada. Esse processo contínuo de intercâmbio iônico entre o
cimento, o PBS, a apatita e a dentina seria responsável pela adesão química
sugerida por Sarkar et al. (2005). Os autores concluíram que o ProRoot MTA, MTA
Branco, MTA BIO e Portland branco são bioativos. Por apresentar a formação de
prolongamentos mais longos e mais densos, o ProRoot MTA demonstrou melhor
desempenho. Os cimentos dissolveram alguns de seus componentes no meio e
propiciaram a formação de precipitados de apatita carbonatada. Essa constante
precipitação promoveu um processo de biomineralização, o qual resultou na
formação de uma intercamada com prolongamentos na interface cimento-dentina.
Os mecanismos celulares e moleculares que regulam os eventos observados
na resposta tecidual e no processo de biomineralização promovidos pelo MTA e pelo
HC têm sido estudados por meio de uma variedade de modelos experimentais. No
entanto, ainda não há relatos de experimentos in vivo que tenham analisado e
comparado os eventos envolvidos na reação inflamatória e sua correlação com o
processo de biomineralização promovido pelo MTA e pelo HC.
Com base nestas informações, este trabalho teve como objetivo avaliar a
resposta tecidual e a ocorrência do processo de biomineralização após a
implantação, em tecido subcutâneo de camundongos, de tubos de dentina
preenchidos ou não com ProRoot MTA e HC.
29
2 PROPOSIÇÃO
Avaliar a resposta tecidual e a ocorrência do processo de biomineralização
após a implantação, em tecido subcutâneo de camundongos, de tubos de dentina
vazios e preenchidos com ProRoot MTA e hidróxido de cálcio.
Objetivos específicos da análise da resposta tecidual:
• Analisar, em cortes histológicos corados com Hematoxilina e Eosina, o
infiltrado celular e as características do tecido, nos períodos de 12h, 1, 3, 7,
15, 30 e 60 dias pós-implantação.
• Dosar, por meio de teste ELISA, as concentrações das citocinas pró-
inflamatórias interleucina 1 beta (IL- 1ß) e fator de necrose tumoral alfa
(TNFα), e da citocina anti-inflamatória interleucina 10 (IL-10), nos períodos de
12h, 1, 3 e 7 dias.
• Analisar, por meio de imunoistoquímica, o padrão de expressão das proteínas
MPO, NF-κB (p65), iNOS, COX-2 e VEGF nos períodos de 12h, 1, 3 e 7 dias.
• Calcular a freqüência da expressão das proteínas MPO, NF-κB (p65), iNOS,
COX-2 e VEGF nos períodos de 12h, 1, 3 e 7 dias.
Objetivos específicos da análise do processo de biomineralização:
• Avaliar, por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), a ocorrência
do processo de biomineralização na superfície de tubos de dentina nos
períodos de 12h, 1, 3 e 7 dias pós-implantação.
• Avaliar, por meio de MEV, a influência do tempo sobre a deposição mineral na
interface biomaterial-dentina e no interior dos túbulos dentinários, nos
períodos de 12h, 1, 3, 7, 15, 30 e 60 dias.
30
3 MATERIAL E MÉTODOS
O projeto de pesquisa foi submetido à apreciação pelo Comitê de Ética no Uso
de Animais e pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) (ANEXO 1).
3.1 OBTENÇÃO E PREPARO DOS TUBOS DE DENTINA
Foram utilizados 83 dentes humanos hígidos, unirradiculados, extraídos por
motivos alheios a esta pesquisa e doados por pacientes de 15 a 30 anos de idade,
através do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
A partir de um corte transversal realizado no terço cervical da raiz com disco
diamantado SBT (South Baytechnology, San Clemente, CA, U.S.A.) montado na
máquina ISOMET 1000 Low Speed Saw (Buehler Ltda., São Paulo, SP, Brasil), as
coroas e os terços apicais dos dentes foram removidos. Em cada raiz, o espaço do
canal radicular foi ampliado com brocas Gates-Glidden # 5 em toda a sua extensão,
a fim de obter uma cavidade padronizada com 1,3 mm de diâmetro. As raízes foram
desgastadas externamente com broca diamantada (KG, Sorensen, São Paulo, SP,
Brasil) montada em alta rotação, sob refrigeração contínua com água destilada, de
modo a obter 165 tubos com as seguintes dimensões: 5,3 mm de diâmetro externo,
1,3 mm de diâmetro interno e 5,0 mm de comprimento. Em seguida, os tubos foram
lavados com soro fisiológico, secos e autoclavados.
Previamente à intervenção cirúrgica, os tubos de dentina foram imersos em 10
mL de solução de EDTA 17% por 3 min e em 10 mL de solução de hipoclorito de
sódio 1% também por 3 min. Posteriormente, os tubos foram divididos
aleatoriamente e preenchidos com ProRoot MTA (Dentsply, Tulsa Dental, OK, USA)
(n=55) ou pasta de Hidróxido de cálcio (HC) (MERCK, Alemanha) veiculada em
água destilada (n=55) ou, ainda, mantidos vazios (n=55).
31
3.2 ANIMAIS
Foram utilizados 55 camundongos machos (Mus muscullus), com peso entre
35 e 40g, provenientes do Biotério Central da UFSC. Os animais foram mantidos em
gaiolas coletivas para 5 camundongos sob ciclo claro/escuro de 12/12h. A
temperatura ambiente da sala foi mantida em 22 ± 1°C e a umidade do ar em (60 ±
5%).
Para a realização da intervenção cirúrgica, os camundongos foram
distribuídos segundo o período experimental e os materiais a serem implantados
(Tabela 1).
Grupo Materiais 12h
(n=10)
1 dia
(n=10)
3 dias
(n=10)
7 dias
(n=10)
15 dias
(n=5)
30 dias
(n=5)
60 dias
(n=5)
A
Tubo + MTA A1 A2 A3 A4 A5 A7
B
Tubo + pasta
de hidróxido de
cálcio (HC)
B1 B2 B3 B4 B5 B7
C
Tubo vazio C1 C2 C3 C4 C5 C7
D
“Falso
operado”
(Sham)
D1 D2 D3 D4 D5
A6
B6
C6
D6
D7
QUADRO 1 – Distribuição dos grupos em relação aos materiais e períodos experimentais.
3.3 INTERVENÇÃO CIRÚRGICA – IMPLANTAÇÃO SUBCUTÂNEA
Os animais foram anestesiados por via intramuscular com uma associação de
cloridrato de ketamina (80 mg/kg) e cloridrato de xilazina (10 mg/kg). Após depilação
da região dorsal com a utilização de um aparelho de barbear, foi realizada a
antissepsia da área com gaze estéril umedecida em álcool 70%.
Quatro incisões longitudinais, de aproximadamente 1 cm, foram realizadas
com auxilio de bisturi e lâmina n° 15 (RPC, Shanghai, China), 2 na região dorso-
escapular e 2 na região dorso-pélvica. A divulsão do tecido foi realizada lateralmente
a cada incisão com a ajuda de uma tesoura com ponta romba, de forma a obter os 4
sítios de implantação. Em 3 sítios foram implantados, individualmente, um tubo
32
preenchido com MTA, outro com HC e um vazio. O quarto sítio foi utilizado para
observar a resposta inflamatória induzida pelo ato cirúrgico (controle negativo para
tubo e material - Sham) (FIG. 1). Os implantes obedeceram uma ordem de
colocação previamente estabelecida, havendo rodízio dos grupos em relação às
regiões anatômicas. A distância da implantação dos tubos à linha de incisão foi de
aproximadamente 1 cm. As bordas da incisão foram aproximadas com auxílio de
uma pinça cirúrgica e suturadas com fio de seda 4.0 (ETHICON, Johnson
&Johnson, SP, Brasil).
Decorridos 12h, 1, 3, 7, 15, 30 e 60 dias, os animais foram anestesiados como
detalhado previamente e, posteriormente, foi realizada a eutanásia por meio de
deslocamento cervical.
Em seguida, as peles dorsais foram excisadas e distendidas em papel cartão.
Após localizar as regiões contendo os tubos, foram realizados cortes macroscópicos
com a finalidade de obter as 4 peças (tubo + tecido) com formato circular, as quais
foram distribuídas segundo a metodologia de avaliação (FIG. 1). As peças
destinadas à análise histológica e imunoistoquímica foram imersas individualmente
em recipientes de vidro previamente identificados, contendo 10 mL de solução de
formaldeído tamponado a 10% (Sigma-Aldrich, SP, Brasil) por um período de 24h, a
temperatura de 4°C. Nas peças destinadas à dosagem de citocinas, o tubo de
dentina foi removido e o tecido pesado, congelado em nitrogênio líquido e
armazenado para homogeneização e posterior dosagem.
33
Figura 1 – Distribuição dos grupos em relação aos períodos experimentais e às metodologias
realizadas.
3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO DAS AMOSTRAS
Concluída a fixação, as peças destinadas à análise histológica foram imersas
em álcool 70% (v/v). Em seguida, os tecidos moles foram processados de acordo
com a técnica de rotina e os tubos de dentina foram removidos previamente à
inclusão em parafina. Cortes de 3 a 4µm de espessura foram montados sobre
lâminas carregadas positivamente, preparadas pela imersão das mesmas em
solução de ATPS (3-aminopropyltriethoxysilene; Sigma-Aldrich, São Paulo, SP,
Brasil). As lâminas contendo os cortes foram coradas pela técnica da Hematoxilina e
Eosina (HE) e Von Kossa ou mantidos não-corados para posterior reação
imunoistoquímica.
34
3.5 IMUNOISTOQUÍMICA.
A imunodetecção das proteínas de interesse foi realizada utilizando os
anticorpos antifosfo-p65 NF-κB de (1:100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA,
USA), anticiclo-oxigenase-2 (COX-2, 1:200, Cell Signaling Technology), anti-óxido
nítrico síntase induzível (iNOS) (1:200, NeoMarks, Fremont, CA, USA), antiVEGF
(1:600, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) e antimieloperoxidase
(MPO, 1:300, Dako Cytomation, Carpinteria, CA, USA). A análise de
imunoistoquímica foi realizada entre 12 h e 7 dias após o procedimento cirúrgico.
Em seguida as lâminas foram mantidas em estufa durante 1 h a uma
temperatura de aproximadamente 50°C para fixação das secções histológicas nas
mesmas. Após fixação, as secções histológicas foram desparafinadas através de
imersões consecutivas em xilol e rehidratadas por passagens sucessivas em etanol
em concentrações decrescentes (etanol absoluto, etanol 90%, 80% e 70%). O
bloqueio da peroxidase endógena dos tecidos foi realizado com o objetivo de
eliminar reações inespecíficas. Para tanto, as lâminas foram imersas em solução de
metanol com 1,5% peróxido de hidrogênio, durante 20 min, com posterior lavagem
em água destilada.
Previamente à incubação com o anticorpo primário, as amostras foram
submetidas à reativação antigênica, com a finalidade de recuperar os sítios
antigênicos mascarados pela fixação e inclusão do tecido em formol e parafina. Para
isso, as lâminas foram imersas em tampão citrato 0,01 M, pH 6,0 durante 35 min, em
banho-maria ajustado para 95–98°C. Logo após, ainda como parte do processo
térmico de reativação antigênica, as lâminas foram retiradas do banho-maria,
mantidas durante 20 min à temperatura ambiente e lavadas em água destilada e
tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4. Os anticorpos primários foram diluídos em
líquido diluidor de anticorpos com componente redutor de reações inespecíficas
(Dako Cytomation, Carpinteria, CA, USA), de acordo com as diluições especificadas
anteriormente. A solução contendo os anticorpos foi adicionada sobre os cortes
teciduais e as lâminas foram mantidas em câmara úmida de 12 a 16h, a uma
temperatura de 2 a 8°C. Em seguida, as lâminas foram lavadas em PBS e os cortes
histológicos incubados com o anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de coelho ou
anti-IgG de camundongo dependendo da natureza do anticorpo primário (Dako
35
Cytomation, Carpinteria, CA, USA) em câmara úmida durante 50 min à temperatura
ambiente. As lâminas foram lavadas em PBS e a detecção foi realizada utilizando o
sistema da streptavidina-biotina-peroxidase (Dako Cytomation). Após 30 min de
incubação em câmara úmida dos cortes com a solução de streptavidina-biotina-
peroxidase à temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas com PBS e a
detecção foi completada com uma solução cromógena contendo 0,03% de 3,3´-
diaminobenzidina (3,3´,4,4´-tetraaminobifeniltetrahidrocloreto) (Sigma-Aldrich) e
0,3% de peróxido de hidrogênio (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA).
Posteriormente, foi realizada a contracoloração das secções histológicas em solução
de hematoxilina de Harris, desidratação das mesmas através de imersões em
concentrações crescentes de etanol (etanol 70%, 80%, 90% e etanol absoluto),
diafanização em xilol e montagem em meio de montagem permanente (Entellan,
Merck). Para cada reação foi utilizado um controle negativo, o qual foi incubado
somente com a solução diluente (abolição do anticorpo primário).
3.6 ANÁLISE DAS IMAGENS HISTOLÓGICAS
3.6.1 Avaliação histológica
As lâminas coradas com HE foram examinadas ao microscópio óptico de luz
(Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) com câmera digital (Cannon
A620) acoplada. As lâminas foram analisadas com objetiva 5x, percorrendo toda a
extensão do corte com a finalidade de localizar o tecido conjuntivo em contato com a
abertura do tubo de dentina contendo os materiais ou a abertura vazia. Após da
localização da região, cada lâmina foi fotografada com aumento de 5x e, em
seguida, com aumento de 40x para análise de 4 campos microscópicos consecutivos
(FIG. 2).
Os campos microscópicos foram analisados por dois observadores
previamente calibrados, percorrendo toda a extensão do tecido, analisando de forma
descritiva à presença e localização de células inflamatórias, proliferações
fibroblásticas e/ou angioblásticas e a densidade da cápsula fibrosa.
36
Figura 2 – (A) Microfotografia (5x) representativa do tecido conjuntivo em contato com a abertura do
tubo de dentina. (B) Microfotografias dos 4 campos consecutivos (40x) utilizadas para a análise
descritiva.
3.6.2 Avaliação imunoistoquímica
As lâminas foram analisadas com objetiva 10x, percorrendo toda a extensão
do tecido, registrando em fichas apropriadas as observações quanto à presença ou
ausência de marcação para cada proteína e seu padrão de expressão. Cada
amostra foi inicialmente fotografada com aumento de 10x e, em seguida, com
aumento de 40x para análise dos 4 campos microscópicos consecutivos na região
em contato com a abertura do tubo contendo o material (FIG. 3). A
imunopositividade de cada anticorpo, caracterizada pela marcação nuclear e
citoplasmática (NF-κB), padrão de membrana, citoplasmático e nuclear da
mieloperoxidase (MPO) ou pelo padrão de expressão difusa (COX-2, iNOS, VEGF),
foi obtida pela média da porcentagem de área marcada (pixels positivos) em relação
à área total do tecido em cada campo (pixels totais). A intensidade total de pixels foi
determinada e os dados foram expressos como densidade óptica (D.O.). Todas as
contagens foram obtidas com auxílio do software NIH ImageJ 1.36 (National
Institutes of Health, EUA).
37
Figura 3 – (A) Microfotografia (5x) representativa do tecido conjuntivo em contato com a abertura do
tubo de dentina das laminas destinadas à análise imunoistoquímica; (B) microfotografias dos 4
campos consecutivos (40x) utilizadas para a análise no Image J; (C) respectivas imagens em 8 bits
(preto) após a utilização do plugin “Threshold” do Image J
para a determinação da densidade óptica
(D.O.).
3.7 QUANTIFICAÇÃO DAS CITOCINAS TECIDUAIS PELO TESTE ELISA
3.7.1 Obtenção e homogeneização dos tecidos
Imediatamente após o sacrifício, os tecidos dorsais, destinados à análise da
quantificação de citocinas, foram removidos, pesados, congelados em nitrogênio
líquido e armazenados a -80 °C para dosagens posteriores.
Durante o processo de homogeneização, os tecidos foram descongelados de
forma gradativa, diluídos em 1:10 em tampão de lise celular HEPES 10mM (pH 7,9),
contendo: MgCl
2
1,5 mM, KCl 10 mM, fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) 0,5 mM, DTT
0,5 mM, NaF 50 mM, Na
3
VO
4
2 mM, inibidor de tripsina 1,5 µg/ml, pepstatina A 7
µg/ml, leupeptina 5 µg/ml e aprotinina 10 µg/ml. As amostras foram processadas em
duas etapas. Na primeira, os tecidos foram rompidos através da suspensão e
ressuspensão em pipeta com tip de 1 mL por 20 vezes. Na segunda etapa, os
tecidos foram homogeneizados em processador de tecidos (Tissue tearor; Biospec
Products, INC., OK, USA) a 4°C em 3 pulsos rápidos (< 1s cada). Findo os dois
procedimentos de homogeneização, as amostras foram centrifugadas a 15000 RPM,
38
durante 20 min a 4°C e o sobrenadante coletado armazenado a -80 °C para
posterior dosagem.
3.7.2 Determinação da concentração de proteínas totais do homogeneizado
A quantificação das proteínas totais nos tecidos avaliados foi determinada
através do kit Protein Assay-Bradford Method BioteHCnology Grade (E535,
AMRESCO, Inc. USA). Este procedimento foi baseado no método colorimétrico
descrito por Bradford M. (1976), o qual utiliza o corante Coomassie Brilliant Blue G-
250. As concentrações de proteína foram então determinadas a partir da curva
padrão de albumina (0,05 – 0,5 µg / µL).
As amostras (diluídas em 100 vezes) e os pontos da curva foram plaqueados
em triplicatas, com 10 µL por poço. Após este procedimento, acrescentou-se 190 µL
de Coomassie Brilliant Blue G-250, diluído em 10 vezes. A leitura foi realizada em
espectrofotômetro (EL808; Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) a 595 nm.
Os dados de absorbância (eixo x) foram plotados junto aos valores referentes às
diferentes concentrações da curva-padrão (eixo y) e, após a elaboração da curva da
reta (regressão linear), os valores foram expressos em µg / µL de proteína tecidual.
3.7.3 Enzima imuno-ensaio (ELISA)
Para dosagem das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 foi utilizado o método
enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) (R&D System, Inc., Minneapolis,
USA). Este ensaio foi realizado nas amostras previamente homogeneizadas,
provenientes dos diferentes grupos experimentais. Placas com 96 poços foram
sensibilizadas com 100 µL de anticorpo monoclonal anticamundongo TNF-α, IL-1β
ou IL-10 (anticorpo de captura) e incubadas overnight em temperatura ambiente.
Após este período, os poços foram lavados por 3 vezes com tampão para lavagem
(0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,2 – 7,4). Posteriormente para evitar ligações
inespecíficas, a placa foi bloqueada com 300 µL de solução de bloqueio (1% BSA
39
em PBS, pH 7,2 – 7,4, 0,2 µm filtrado) e incubada por 1h em temperatura ambiente.
Findo este prazo, os poços foram lavados novamente como descrito acima.
Em seguida, foram adicionados 100 µL por poço dos padrões diluídos
previamente em reagente de diluição (1% BSA em PBS, pH 7,2 – 7,4, 0,2 µm
filtrado), e cobertos com fita adesiva . Em dois poços foram colocados somente o
reagente de diluição para caracterização do branco. A placa foi incubada por 2h em
temperatura ambiente. Após este período, os poços foram lavados por 3 vezes com
tampão de lavagem (0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,2 – 7,4). Após as lavagens,
adicionou-se 100 µL do anticorpo de detecção (Anticorpo anticamundongo IL-10, IL-
1β e ou TNF-α Biotinilado) diluídos previamente em reagente de diluição (1% BSA
em PBS, pH 7,2 – 7,4, 0,2 µm filtrado) na concentração estabelecida, cobertos com
fita adesiva e incubados por 2h em temperatura ambiente. Os poços foram lavados
novamente como descrito acima. Posteriormente, adicionou-se 100 µL de
Streptoavidina-HRP (1:250) por poço, e as placas foram cobertas com papel
laminado e incubadas por 30 min, à temperatura ambiente. Seguidamente, os poços
foram lavados novamente e, a solução de substrato (mistura dos reagentes de cores
A - H
2
O
2
e B - Tetrametilbenzidina) foi adicionada na diluição de 1:1 por poço,
seguido de incubação por 30 min à temperatura ambiente, evitando-se contato direto
da placa com a luz. A reação foi interrompida com 50 µL de H
2
SO
4
30% por poço
sob agitação lenta. A leitura da densidade ótica (D.O.) foi feita em leitor de ELISA
(EL808; Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA), utilizando-se filtro de 450 nm
e posteriormente de 550 nm, sendo este resultado subtraído do primeiro.
3.8 PROCESSAMENTO PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
(MEV)
Os tubos de dentina retirados do tecido subcutâneo que foi destinado à
análise da quantificação de citocinas teciduais foram lavados em água destilada e
secos em estufa a 37°C por 24h. Posteriormente, as amostras foram levadas ao
aparelho metalizador HUMMER VII (Bal-Tec SCD 005, Bal-Tec Co.), o qual recobriu
as amostras com uma camada de ouro de 300 Å. Os espécimes foram examinados
ao microscópio eletrônico de varredura (Philips SEM XL 30), operando com 15 Kv. A
40
superfície dos tubos de dentina em contato com o tecido foi analisada em diferentes
aumentos (500-15.000x) a fim de avaliar a deposição mineral promovida pelos
materiais. Quando constatada, a sua composição química por elementos foi
determinada através de 3 avaliações pontuais em cada amostra, por meio de
microanálise por energia dispersiva (EDAX).
Os tubos de dentina retirados do tecido subcutâneo destinado à análise
histológica e imunoistoquímica foram lavados em água destilada por 2h e tratados
segundo metodologia empregada por Reyes-Carmona; Felippe; Felippe (2009).
Após a fixação em glutaraldeído 2,5% tamponado com solução fosfato 0,2 M
por 12h a 4°C, foi realizada a lavagem em tampão fosfato 0,2 M durante 1h com 2
trocas, seguida de uma breve lavagem com água deionizada. A desidratação foi feita
em concentrações ascendentes de álcool etílico. Em seguida, as amostras foram
imersas em hexametildisilazano (HMDS) (Baker Ink, Kirwan, Qld, Austrália) durante
10 min. Concluída a fixação e a desidratação, as amostras foram submetidas ao
embutimento a frio com resina acrílica (Vigodent, São Paulo, SP, Brasil). Após a
polimerização da resina, cada uma das superfícies a ser avaliada foi lixada com lixa
de carbeto de silício 1200, 1500, 2000 e polida com abrasivo à base de alumina de
1, 0,3 e 0,05 µm de granulação em lixadeira elétrica rotativa Politriz (APL-40, São
Paulo, SP, Brasil). A cada troca de lixa e de abrasivo o corpo-de-prova foi lavado em
água destilada e limpo em ultrassom (Termotrom, São Paulo, SP, Brasil) por 5 min.
Concluído o polimento, as amostras foram imersas em ácido clorídrico 6 M
durante 30s e lavadas em água deionizada. Depois, foram imersas em solução de
hipoclorito de sódio 2% durante 10 min. Posteriormente, foi realizada a lavagem final
em água deionizada pelo mesmo período de tempo. As amostras foram secas em
estufa a 37°C durante 48h e, em seguida, fixadas em bases cilíndricas de metal
(stubs).
O conjunto foi levado ao aparelho metalizador HUMMER VII (Bal-Tec SCD
005, Bal-Tec Co.), que recobriu as amostras com uma camada de ouro de 300 Å. Os
espécimes foram examinados ao microscópio eletrônico de varredura (Philips SEM
XL 30), operando com 15 Kv.
A região da interface cimento-dentina foi analisada em diferentes aumentos
(500-3000x) a fim de avaliar a interface material-dentina e verificar a formação de
mineralização intratubular (REYES-CARMONA; FELIPPE; FELIPPE, 2009).
41
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Uma análise descritiva das observações foi realizada para todos os
experimentos propostos e para todos os grupos estudados.
Os dados foram expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.). A
avaliação estatística dos dados paramétricos foi realizada através da análise de
variância (ANOVA) de duas vias. Posteriormente, os grupos foram comparados entre
si empregando-se o teste post-hoc de Bonferroni. Valores de P menores do que 0,05
(p < 0,05) foram considerados como indicativos de significância.
42
4 RESULTADOS
4.1 AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS TECIDUAIS DAS CITOCINAS INFLAMATÓRIAS
TNF-Α, IL-1Β E IL-10
As médias ± erro padrão da média (EPM) dos valores da concentração (pg/mg)
das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 nos diferentes grupos e períodos experimentais
são apresentados no Gráfico 1.
O teste ELISA revelou que a concentração total de citocinas inflamatórias
expressas nos homogenatos dos diferentes grupos experimentais declinou após 7
dias. A análise dos resultados demonstrou que não houve efeito do material sobre
as classes de citocinas produzidas. No entanto, foi observada uma expressão
tempo-dependente. O maior aumento na expressão das citocinas TNF-" e IL-1ß foi
observado em 12h e no dia 1, respectivamente, para todos os grupos experimentais
(GRAF. 1 A e B). A maior expressão da IL-10 foi encontrada no dia 1 (GRAF. 1C).
O gráfico 1 (A e B) demonstra que os níveis teciduais das citocinas TNF-α e
IL-1β apresentaram-se elevados nos tecidos em contato com tubos de dentina
preenchidos com MTA ou HC, quando comparados com os em contato com o tubo
vazio ou a loja cirúrgica (Sham) (p < 0,001). De forma semelhante, em 12h, 1 e 3
dias, os níveis da citocina IL-10 também se mostraram elevados nos homogenatos
dos tecidos em contato com o MTA ou HC quando comparados com aqueles em
contato com o tubo vazio e o Sham (GRAF. 1C) (p < 0,01). Entretanto, após 7 dias,
os tecidos em contato com os materiais apresentaram níveis de TNF-α, IL-1β e IL-10
semelhantes aos observados no Sham (p > 0,05).
Ao analisar os níveis da concentração das citocinas suscitado pelos diferentes
materiais, foi possível observar que o MTA estimulou um aumento significativamente
maior de TNF-α em 12h, quando comparado ao HC (p = 0,036). No entanto, não
houve diferença significativa nos demais períodos experimentais, nem na expressão
de IL-1β e IL-10 (p > 0,05).
Em conjunto, estes dados sugerem que o processo inflamatório induzido pelo
MTA e pelo HC é caracterizado por um aumento na concentração de citocinas
inflamatórias durante a fase aguda (12h, 1 e 3 dias), a qual retorna ao seu nível
normal 7 dias após o procedimento cirúrgico.
43
4.2 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO PROCESSO INFLAMATÓRIO
De forma geral, tanto o MTA como o HC promoveram um aumento no
infiltrado inflamatório nos diferentes intervalos de tempo, quando comparados ao
Sham (FIG. 4). Foi possível observar que a resposta do tecido em contato com o
MTA e o HC foi mais severa quando comparada à resposta daquele em contato com
o tubo vazio.
Em 12h, o tecido conjuntivo em contato com os tubos preenchidos com os
materiais e com os vazios apresentou uma discreta reação inflamatória, a qual
estava representada, basicamente, por polimorfonucleares (neutrófilos) (FIG. 4). O
recrutamento de neutrófilos diminuiu entre os dias 1 e 3. No entanto nesse período,
foi observado um aumento da população de células mononucleares (macrófagos e
linfócitos).
O maior aumento do infiltrado inflamatório foi observado no dia 1 em todos os
grupos (FIG. 4). Neste período, foi possível observar um aumento da densidade do
tecido conjuntivo neoformado e uma maior organização capsular.
No dia 3, nos tecidos em contato com o MTA ou com o HC, foi possível
constatar a presença de infiltrado inflamatório crônico moderado representado,
principalmente por linfócitos e macrófagos. Neste período junto às aberturas dos
tubos foi observada distribuição periférica de células inflamatórias. No tecido
contendo a loja cirúrgica (Sham) houve a presença predominante de fibroblastos
associados a uma discreta população de mononucleares. No dia 3 também foi
possível constatar a diminuição do edema (FIG. 4).
Nos dias 7 e 15 foi observada diminuição do infiltrado inflamatório crônico
(FIG. 4). Aos sete dias, foi notada a presença de alguns fibroblastos e proliferação
angioblástica. Cabe ressaltar que, já no dia 7, foi observada a presença de uma
reação de corpo estranho ao redor dos tubos de dentina preenchidos ou não com os
materiais.
Aos 30 e 60 dias, a intensidade do infiltrado inflamatório crônico diminuiu
consideravelmente e houve um notável aumento na população de fibroblastos (FIG.
4).
Cabe ressaltar que, apesar de a resposta tecidual promovida pelos dois
materiais ter se mostrado semelhante, houve uma maior presença de áreas de
44
necrose por coagulação no tecido em contato com o hidróxido de cálcio quando
comparado ao MTA.
4.3 AVALIAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DA EXPRESSÃO DA ENZIMA MPO, DO
FATOR DE TRANSCRIÇÃO NF-κ
κκ
κB E DAS PROTEÍNAS INFLAMATÓRIAS COX-2,
INOS E VEGF
Os resultados da análise imunoistoquímica para avaliação da expressão da
enzima MPO, do fator de transcrição NF-κB e das proteínas COX-2, iNOS e VEGF
são apresentados nas figuras 5, 6, 7, 8 e 9, respectivamente. De maneira geral, o
pico dessa expressão foi observado no dia 1 para todos os grupos.
A análise imunoistoquímica para a MPO demonstrou um aumento significativo
na expressão da proteína entre 12h e o dia 1, no tecido em contato com o tubo de
dentina preenchido com MTA quando comparado com o tubo vazio e o Sham (p <
0,001). Nos mesmos períodos experimentais, o tecido em contato com o HC revelou
maior expressão da MPO quando comparado ao tubo vazio (p < 0,001). Já, em 12h
e nos dias 1 e 3, a análise imunoistoquímica demonstrou um aumento significativo
da expressão de MPO no tecido em contato com o HC quando comparado ao Sham
(p < 0,001). Ao analisar o padrão de expressão promovido pelos materiais, foi
possível observar que o MTA proporcionou um aumento significativo na expressão
desta enzima no dia 1, quando comparado ao HC (p < 0,01).
Ao analisar o efeito dos materiais sobre o padrão de expressão das proteínas,
a análise imunoistoquímica mostrou que o MTA estimulou, no dia 1, uma expressão
significativamente maior de COX-2 quando comparado ao HC (p = 0,032). No
entanto, não houve diferença significativa nos demais períodos de tempo, nem na
expressão de NF-κß, iNOS e VEGF.
Entre 12 h e 3 dias, O MTA foi capaz de induzir um aumento significativo na
expressão de NF-κB, COX-2, iNOS e VEGF, quando comparado ao tubo vazio (p <
0,05). No entanto, após 7 dias não houve diferença significativa entre os 2 grupos (p
> 0,05). Para todos os períodos experimentais, o MTA também proporcionou um
aumento significativo na expressão de NF-κB, COX-2, e VEGF, quando comparado
45
com o Sham (p < 0,01). Ainda quando comparado com o Sham, o MTA induziu um
aumento significativo de iNOS em 12 h e nos dias 1 e 3 (p < 0,01). Após 7 dias não
houve diferença estatística (p > 0,05).
Adicionalmente, o HC foi capaz de aumentar de forma significativa a
expressão de NF-κB e de COX-2 em todos os períodos avaliados, quando
comparado ao tubo vazio e ao Sham (p < 0,01). Em relação à iNOS, a análise
imunoistoquímica demonstrou um aumento significativo dessa proteína entre 1 e 3
dias, no tecido em contato com o tubo de dentina preenchido com HC quando
comparado com o em contato com o tubo vazio e o Sham (p < 0,001). O HC também
foi capaz de induzir um aumento significativo na expressão do VEGF nos dias 1 e 7
quando comparado ao tubo vazio e ao Sham (p < 0,05).
Ao analisar o efeito do tubo de dentina vazio em contato com o tecido
subcutâneo, foi observado no dia 1, um aumento significativo na expressão de NF-
κB, COX-2 e iNOS (p < 0,05), e nos dias 1 e 3, na expressão de VEGF (p < 0,05) em
comparação com o controle cirúrgico (Sham).
4.4 ANÁLISE DO PROCESSO DE BIOMINERALIZAÇÃO PROMOVIDO PELO
MTA E PELO HIDRÓXIDO DE CÁLCIO
A bioatividade do MTA e do hidróxido de cálcio foi analisada no tecido (Von
Kossa) e no tubo de dentina (MEV). A análise por microscopia de luz revelou áreas
Von Kossa positivas no tecido conjuntivo em contato com as aberturas dos tubos
preenchidos com os materiais (FIG. 10). Em 12h foi possível observar que essas
estruturas se encontravam dispersas no tecido conjuntivo, provavelmente devido ao
extravasamento dos materiais (FIG. 10 A, B, C e D). No entanto, conforme aumentou
o tempo pós-implantação foi possível observar a formação de estruturas mais
densas nas aberturas dos tubos, evidenciando a mineralização promovida pelos
materiais (FIG. 10 E e F). Nos tecidos em contato com o tubo de dentina vazio e os
Sham não foram evidenciadas estruturas Von Kossa positivas (FIG. 10 G e H).
Na visualização dos tubos de dentina em MEV, foi possível observar a
presença de aglomerados similares à apatita. Os resultados obtidos a partir das
avaliações pontuais por amostra (EDAX) indicaram, principalmente, a presença de
46
cálcio e fósforo com razão molar Ca/P de 1,60 a 1,65 (FIG. 11 C e 12 C). As
fotomicrografias revelaram a presença de precipitados semelhantes à apatita
depositados sobre as fibras colágenas. Em 12h, estes precipitados foram
observados ao longo da superfície dos tubos de dentina preenchidos com MTA e
HC. Foi observado ainda, que a deposição de precipitados aumentou ao longo do
tempo. Nas áreas de maior mineralização, as fibras colágenas exibiram uma
aparência de “espiga de milho” (corn-on-the-cob) (TAY; PASHLEY, 2008), e se
mostraram mais extensas à medida que o período de pós-implantação aumentou,
formando uma camada compacta aos 7 dias pós-implantação (FIG. 11 L e 12 L).
Na análise da interface material-dentina foi observado que os dois materiais
promovem um processo diferenciado de mineralização intratubular (FIG.13 e 15).
Na interface MTA-dentina a mineralização intratubular ocorreu a partir das
primeiras 12h pós-implantação. Os prolongamentos de apatita se estendiam a partir
da intercamada presente na interface MTA-dentina. Estas estruturas se tornaram
maiores e mais compactas ao longo do tempo, sugerindo a maturação do mineral
(FIG. 13). É importante ressaltar que a mineralização não estava restrita à entrada
dos túbulos, sendo também observada a presença do mineral na profundidade dos
túbulos dentinários (FIG. 14).
De forma geral, o hidróxido de cálcio promoveu um processo de
mineralização intratubular com a formação de prolongamentos mais curtos e em
menor densidade quando comparado ao MTA (FIG. 15). No dia 3, em algumas
amostras foi detectada a presença da intercamada. A partir dos dias 30 e 60 foram
observados prolongamentos menores e escassos (FIG. 15). Nas fotomicrografias do
tubo de dentina vazio não houve evidência de mineralização intratubular (FIG. 16).
47
Gráfico 1 – Valores da concentração (pg/mg) das citocinas (A) TNF-α, (B) IL-1β e (C) IL-10 nos
homogenatos dos diferentes grupos. Os valores representam a média ± E.P.M. (N = 5/grupo). *p <
0,05 comparado ao grupo contendo o tubo vazio.
#
p < 0,05 comparado ao Sham. ** p < 0,05 entre os
materiais.
12h
Di
a 1
Dia 3
Dia
7
0
500
1000
1500
2000
MTA
HC
Tubo vazio
Sham
*
*
*
*
*
*
#
#
#
#
#
#
Períodos de Tempo
TNF
α
α
α
α
(pg/mg)
12h
D
ia 1
Dia 3
Dia
7
0
500
1000
1500
2000
MTA
HC
Tubo vazio
Sham
#
#
*
*
*
*
*
*
#
#
#
#
Períodos de Tempo
IL-1
β
β
β
β
(pg/mg)
12h
D
ia 1
Dia 3
Di
a 7
0
500
1000
1500
2000
MTA
HC
Tubo vazio
Sham
#
#
#
Períodos de Tempo
IL-10 (pg/mg)
#
48
5 Discussão
Apesar dos progressos alcançados na compreensão dos distintos mediadores
moleculares que controlam o mecanismo de ação do MTA e HC (KOH et al., 1998;
HUANG et al., 2005; GOMES; GOMES-FILHO; OLIVEIRA, 2008; TEIXEIRA; DE
OLIVEIRA; GOMES-FILHO, 2008; KURATATE et al., 2008; MINAMIKAWA et al.,
2009), o exato mecanismo mediante o qual é promovido o reparo e a deposição de
tecido mineralizado ainda é incerto, e, consequentemente, motivo de diversas
pesquisas. O presente estudo procurou analisar alguns dos mecanismos celulares e
moleculares presentes na resposta inflamatória e a sua correlação com o processo
de biomineralização, visando assim, compreender os fenômenos envolvidos na
resposta do hospedeiro ao entrar em contacto com o MTA e o HC.
A reação inflamatória está intimamente relacionada ao processo de reparo
(LARSEN; HENSON, 1983; TEIXEIRA; DE OLIVEIRA; GOMES-FILHO, 2008;
MINAMIKAWA et al., 2009). As reações de defesa do organismo envolvem várias
funções reguladoras e diversos mediadores moleculares (LARSEN; HENSON,
1983). Como o reparo inicia já nas primeiras fases da inflamação, é necessário
compreender o processo inflamatório detalhadamente.
A reação inflamatória induzida durante a interação hospedeiro-biomaterial é
tradicionalmente avaliada por diversas metodologias, destacando-se a análise
histológica e imunoistoquímica (HO; CHEN; HSIANG, 2007). Além da análise
histomorfológica, a quantificação dos níveis teciduais de citocinas (KOH et al., 1998;
HUANG et al., 2005; HO; CHEN; HSIANG, 2007; GOMES; GOMES-FILHO;
OLIVEIRA, 2008; TEIXEIRA; DE OLIVEIRA; GOMES-FILHO, 2008; HSIANG; CHEN;
HO, 2009; SCHUTTE et al., 2009) e o número de células inflamatórias presentes
(GOMES; GOMES-FILHO; OLIVEIRA, 2008; TEIXEIRA; DE OLIVEIRA; GOMES-
FILHO, 2008; GOMES-FILHO et al., 2009) são métodos amplamente utilizados para
estudar esse fenômeno.
Atualmente, é sabido que os neutrófilos, macrófagos e linfócitos são
recrutados para o local da implantação e reagem à presença do material através de
sinais extra e ou intracelulares. Até recentemente, estudos in vivo, com o objetivo de
analisar a resposta inflamatória e o processo de sinalização intercelular, têm
utilizado diversas metodologias, entre elas a reação em cadeia da polimerase (PCR)
49
(SILVA; VIEIRA; SOBRINHO, 2008; MINAMIKAWA et al., 2009), e a imunodetecção
de proteínas com Western Blot ou ELISA (HO; CHEN; HSIANG, 2007; GOMES;
GOMES-FILHO; OLIVEIRA, 2008; TEIXEIRA; DE OLIVEIRA; GOMES-FILHO, 2008;
SCHUTTE et al., 2009). Neste estudo, a concentração das citocinas IL-1ß, TNF-" e
IL-10, na região da implantação, foi determinada através do teste ELISA.
As citocinas IL-1ß e TNF-" desempenham um papel importante na resposta
ao dano tecidual ou infecção, mediando a resposta inflamatória, o recrutamento de
linfócitos e monócitos para o local, e estimulando as células endoteliais a
expressarem moléculas de adesão e secreção de quimiocinas (SILVA; VIEIRA;
SOBRINHO, 2008). Durante o estabelecimento da resposta inflamatória, a IL-1ß e o
TNF-" promovem, inicialmente, um efeito pró-inflamatório, seguido de um efeito
regulatório nas fases posteriores da inflamação, reduzindo, assim, a resposta imune
(ZAKHAROVA; ZIEGLER; 2005; SILVA; VIEIRA; SOBRINHO, 2008).
Os dados do presente estudo demonstram que o MTA e o HC promoveram
um aumento significativo da expressão das citocinas IL-1ß e TNF-" às 12h e nos
dias 1 e 3, quando comparados ao tubo vazio e ao Sham. Já no dia 7, não houve
diferença significativa. Esses dados sugerem que a presença dos materiais nos
tubos de dentina teve um impacto sobre a sinalização intercelular no local da
implantação. Apesar de durante a fase aguda ter sido encontrado um aumento na
expressão de citocinas pró-inflamatórias, é interessante ressaltar que,
simultaneamente, houve uma expressão elevada da IL-10. Provavelmente o efeito
regulador das citocinas TNF-" e IL-1ß contribuiu para a cronificação da resposta
inflamatória e para a promoção do reparo. No entanto, a elevada expressão de IL-10
após a implantação, pode ter sinalizado a diminuição da produção de citocinas, uma
vez que a IL-10 tem demonstrado um efeito anti-inflamatório (LARSEN; HENSON,
1983). Estes dados suportam a ideia de que o MTA e o HC promovem um efeito
anti-inflamatório, como previamente sugerido (SILVA; VIEIRA; SOBRINHO, 2008).
A produção de citocinas tem um papel fundamental no processo inflamatório,
uma vez que coordenam a expressão de moléculas de adesão e a migração de
células do sistema imunológico para os sítios de inflamação (HO; CHEN; HSIANG,
2007). Em conjunto com os dados da literatura (ANDERSON, 2001; WILLIAMS,
2008; SCHUTTE et al., 2009), a análise imunoistoquímica de MPO e a avaliação
histomorfológica realizadas neste estudo demonstram que os neutrófilos são as
50
células predominantes no local da implantação durante as primeiras 24h. O
recrutamento de neutrófilos diminuiu, consideravelmente, entre os dias 1 e 3, a partir
do qual ocorreu, principalmente, a migração de macrófagos e linfócitos para o sítio
de implantação. Nos dias 7 e 15, foi observado o aumento da espessura da cápsula
fibrosa com infiltrado inflamatório crônico. Aos 30 e 60 dias, a presença de células
inflamatórias diminuiu e foi possível verificar o aumento da população de
fibroblastos, indicando a resolução do processo inflamatório. Esta variação
histomorfológica ilustra a transição da fase aguda pró-inflamatória para um ambiente
crônico anti-inflamatório e pró-reparo.
Os neutrófilos têm uma média-vida curta – que vai de horas a dias - e
desaparecem do tecido injuriado mais rapidamente do que os macrófagos, que por
sua vez, têm vida útil de dias a semanas ou meses (ANDERSON, 2001).
Eventualmente, os macrófagos tornam-se o tipo de célula predominante, resultando
em uma resposta inflamatória crônica (ANDERSON, 2001; WILLIAMS, 2008). Deste
modo, os macrófagos são, provavelmente, as células mais importantes na
inflamação crônica devido ao grande número de produtos biologicamente ativos que
secretam, incluindo proteases neutras, fatores quimiotáticos, metabólitos do ácido
araquidônico, espécies reativas de oxigênio, sistema do complemento, fatores de
coagulação, fatores de crescimento e citocinas (ANDERSON, 2001). É amplamente
aceito que essas células desempenham um papel crítico na mediação da resposta
do hospedeiro aos biomateriais (ANDERSON, 2001; WILLIAMS, 2008). Os dados do
presente estudo estendem aqueles existentes na literatura, indicando que o
recrutamento de macrófagos para o local da agressão ocorre de forma mais evidente
entre os dias 1 e 3. Este achado sugere que essas podem ser as células
responsáveis pela sinalização da resposta inflamatória através da liberação de
moléculas pró-inflamatórias, tais como a IL-1ß e o VEGF.
A reação inflamatória é um processo extremamente complexo que representa
uma extensa rede de mecanismos de interação, mediadores químicos e células
(LARSEN; HENSON, 1983; ANDERSON, 2001; WILLIAMS, 2008). É sabido que
biomateriais, em contato com o tecido vivo, podem estimular várias vias de
sinalização que ativam a cascata inflamatória. Nos últimos anos, a via do fator de
transcrição NF-κB tem sido amplamente estudada. O NF-κB é um coordenador
central da resposta imune inata e adaptativa e pode ser ativado por diversos
estímulos, incluindo citocinas pró-inflamatórias, infecção, dano físico e estresse,
51
entre outros (HSIANG; CHEN; HO, 2009). A ativação desse fator de transcrição
pode ser observada em condições fisiológicas e em diversos estados patológicos, e
está associada diretamente ao controle da expressão de várias proteínas da
resposta inflamatória, incluindo fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas,
moléculas de adesão, metaloproteinases, COX-2 e iNOS (NEWTON et al., 1997;
MINAMIKAWA et al., 2009). Diante destas informações, foi investigado se esse fator
de transcrição estaria envolvido na transdução de sinais durante a ativação da
cascata inflamatória promovida pelo MTA e HC.
Os achados do presente estudo demonstraram que ambos os biomateriais
induzem a ativação do NF-κB durante a fase aguda da inflamação. Sabe-se que a
ativação do NF-κB implica na indução da expressão dos genes COX-2 e iNOS
(NEWTON et al., 1997; MINAMIKAWA et al., 2009). COX-2 é uma enzima induzível
responsável pela elevada produção de prostaglandinas (PGE
2
) durante as fases
aguda e crônica da inflamação (SMITH; DEWITT; GARAVITO, 2000; LEE et al.,
2007b). A iNOS sintetiza NO, que é conhecida por ser uma importante molécula
efetora que induz a dilatação dos vasos sanguíneos (MINAMIKAWA et al., 2009).
Como demonstrado, o pico de expressão de NF-κB ocorreu no dia 1.
Simultaneamente, durante a fase aguda houve um aumento na expressão de COX-2
e de iNOS. Esses resultados corroboram aqueles obtidos por Minamikawa et al.
(2009), indicando que o MTA induz a fosforilação do complexos IκB". Após a
estimulação, este complexo permite a translocação do NF-κB, livre no citoplasma,
para o núcleo, estimulando assim a expressão da COX-2. Consequentemente, as
prostaglandinas liberadas induzem a transcrição da iNOS de maneira autócrina (FIG.
17). Neste estudo foi possível observar que o HC mostrou uma expressão similar, o
que sugere que o MTA e o HC têm mecanismos de ação semelhantes.
52
Figura 17 – Diagrama representativo da via de transcrição do NF-κB induzida pelo MTA e HC
(Modificado de MINAMIKAWA et al., 2009).
53
Evidências recentes demonstram que a produção de prostanóides a partir de
COX-2 promove a expressão de VEGF e, subsequentemente, a angiogênese
(GÜVEN et al., 2007). Na presente avaliação, foi observado que a expressão de
VEGF permaneceu estável nos diversos períodos de tempo. Na fase aguda, a
expressão de VEGF foi atribuída à sua capacidade de aumentar a permeabilidade
dos vasos sanguíneos, importante alteração vascular indispensável para a migração
celular nas fases iniciais da inflamação (GÜVEN et al., 2007). No dia 7, a expressão
de VEGF foi expressa principalmente por fibroblastos, sugerindo a indução do
processo de reparo.
Como a resposta do hospedeiro aos biomateriais é um processo complexo
que envolve vários mediadores, foi decidido correlacionar o padrão de expressão
das diferentes classes de proteínas analisadas neste estudo, baseado em seu
respectivo rol. De acordo com Brodbeck et al. (2003), as proteínas estudadas podem
ser classificadas como pró-inflamatórias (IL-1ß, VEGF e TNF-"), anti-inflamatórias
(IL-10), pró-reparo (IL-1ß e VEGF) e, anti-reparo (TNF-", IL-10). Com base nesta
classificação, foram obtidas algumas conclusões a partir dos achados. Os resultados
revelaram que às 12h houve um aumento na expressão de TNF-", enquanto que
nos dias 1 e 3, foi observada uma maior concentração de IL-1ß. Além disso, foi
possível observar uma diminuição ao longo do tempo na expressão de IL-10. Estes
achados sugerem que o TNF-" é a citocina responsável pelo gatilho da cascata
inflamatória, ativando a expressão de outras citocinas, como a IL-1ß. Entretanto, a
IL-1ß tem um efeito pró-inflamatório/pró-reparo, participando da sinalização das
células inflamatórias (linfócitos, macrófagos e monócitos) e de células envolvidas no
processo de reparo (fibroblastos). Em contrapartida, a IL-10 atua de maneira oposta,
inibindo a atividade desses tipos celulares e suprimindo a produção de citocinas,
exercendo um efeito anti-inflamatório/anti-reparo (BRODBECK et al., 2003). Deste
modo, parece que o aumento na expressão da IL-1ß até o dia 3, visa ativar as
células inflamatórias e os fibroblastos e, consequentemente, estimular o reparo,
enquanto que o aumento na expressão da IL-10 durante a fase aguda promove a
resolução do processo inflamatório. Contudo, após este período, a sua diminuição
parece ser necessária para orquestrar os processos de cicatrização e reparo, como
visto no dia 7.
54
Um dos objetivos deste estudo foi correlacionar a resposta inflamatória e o
processo de biomineralização promovido pelo MTA e HC.
O MTA e o HC promoveram a deposição de estruturas Von Kossa positivas,
ainda nas fases iniciais da inflamação. Esses achados estão de acordo com os de
estudos anteriores, nos quais foram obtidos resultados semelhantes para o MTA e
para o HC (HOLLAND et al., 1999; HOLLAND et al., 2001; GOMES-FILHO et al.,
2009). No tecido, ambos os biomateriais mostraram mecanismo de ação
semelhante, no entanto o MTA promoveu uma maior e mais densa deposição
mineral quando comparado ao HC.
A análise em MEV dos tubos de dentina preenchidos com os distintos
materiais mostrou a presença de precipitados semelhantes à apatita sobre as fibras
colágenas, já às 12h pós-implantação. O EDAX indicou que os precipitados são
compostos principalmente por cálcio e fósforo. Recentemente, foi demonstrado que
a interação do MTA com a dentina em PBS promove, inicialmente, a formação de
uma fase de fosfato de cálcio que atua como precursora da fase secundária durante
a qual é formada apatita carbonatada (REYES-CARMONA; FELIPPE; FELIPPE,
2009). Cabe ressaltar que o EDAX realizado nos precipitados formados pelo MTA e
HC após a implantação subcutânea, revelou resultados semelhantes. Holland et al.
(1999) sugeriram que os íons cálcio liberados pelos materiais reagem com o dióxido
de carbono do tecido, dando origem a cristais de calcita. No entanto, os autores não
utilizaram metodologias que tivessem como objetivo caracterizar essas calcificações
distróficas. Desta forma, essa afirmação baseia-se em suposições. Estudos in vitro
utilizando o fluido tissular sintético são mais indicados quando se tem como objetivo
a caracterização de precipitados, devido à dificuldade de obtenção dos cristais em
um ambiente in vivo (BOHNER; LEMAITRE, 2009). Estudos prévios, utilizando
metodologias in vitro, sugerem que os íons cálcio liberados pelo MTA reagem com
os íons fosfato do PBS, produzindo precipitados de hidroxiapatita (SARKAR et al.,
2005; BOZEMAN et al., 2006). Entretanto, sabe-se que a hidroxiapatita
estequiométrica não existe nos sistemas biológicos, sendo reconhecido que o
intermediário que precede o aparecimento da calcificação dos tecidos biológicos é o
fosfato de cálcio amorfo (LEGEROZ, 1991; TAY et al., 2007). Com base neste, e em
estudos anteriores (TAY et al., 2007; REYES-CARMONA; FELIPPE; FELIPPE,
2009), é possível concluir que o MTA e o HC promovem a formação de apatita
carbonatada.
55
Este estudo in vivo fornece evidências do processo de biomineralização
promovido pelo MTA e HC com a dentina. As fotomicrografias de MEV revelaram a
deposição de precipitados semelhantes à apatita sobre as fibras colágenas do
tecido. Conforme o tempo de implantação aumentou, esta deposição se tornou
maior. No dia 3, as regiões mais mineralizadas das fibras colágenas exibiram a
aparência de “espiga de milho” (corn-on-the-cob), que sugere mineralização
interfibrilar (TAY; PASHLEY, 2008). A deposição e maturação mineral aumentaram
com o tempo, sendo que, no dia 7 foi observada a formação de uma camada
recobrindo completamente a superfície dos tubos de dentina.
A análise em MEV da interface MTA-dentina revelou a presença de
mineralização intratubular a partir das 12h pós-implantação. Conforme o tempo de
implantação aumentou, a mineralização se tornou mais densa. Apesar das
semelhanças no mecanismo de ação de ambos os biomateriais sobre o tecido, o HC
mostrou uma menor e mais deficiente mineralização intratubular quando comparado
ao MTA. Isto pode ser explicado pela alta solubilidade da pasta de HC. Ao entrar em
contato com o tecido, a pasta é dissolvida, não podendo assim, se manter em íntimo
contato com a dentina.
Um achado interessante deste estudo foi a observação de que o processo de
mineralização intratubular não esteve restrito à entrada dos túbulos, sendo também
observada na sua profundidade. Este achado sugere que o processo de
biomineralização promove a formação de uma camada de apatita que permite a
integração do biomaterial ao ambiente receptor.
A matriz orgânica da dentina possui propriedades que podem iniciar e regular
a formação de cristais minerais. Assim, a nucleação e o crescimento mineral são
considerados processos mediados ou dependentes da matriz (VEIS, 1993). O
suporte para a deposição de fosfato de cálcio é o colágeno tipo I. Este, contudo, não
tem a capacidade, por si só, de induzir a mineralização da matriz (HAO et al., 2004).
As proteínas não colágenas que se encontram no interior da matriz mineralizada da
dentina, como a proteína da matriz dentinária 1 (DMP1), têm sido implicadas na
função reguladora da mineralização. Acredita-se que as moléculas recombinantes
DMP1 promovam o reconhecimento molecular específico da superfície da apatita,
guiando os precipitados de fosfato de cálcio, durante o recrutamento, para a
incorporação na matriz de colágeno (TAY; PASHLEY, 2008; REYES-CARMONA;
56
FELIPPE; FELIPPE, 2009). Este fenômeno tem sido descrito como um processo de
biomineralização controlado (REYES-CARMONA; FELIPPE; FELIPPE, 2009).
O MTA e o HC têm se mostrado capazes de criar um ambiente favorável a
formação de tecido duro em diversas situações clínicas e, subsequentemente, suas
aplicações na Odontologia têm se expandido. Os achados deste estudo apontam
que o mecanismo de ação do MTA e HC é semelhante. No entanto, cabe ressaltar
que o MTA desencadeia uma resposta pró-inflamatória e pró-reparo mais precoce
daquela observada no HC. Uma possível explicação pode ser atribuída à presença
de maiores áreas de necrose por coagulação no tecido em contato com o HC, o que
leva a uma diminuição da viabilidade celular e da microvascularização local,
repercutindo na reação inflamatória tecidual imediata. De fato, quando os materiais
foram comparados, foi possível observar que o MTA promoveu uma menor reação
inflamatória e necrose pulpar e induziu a formação de uma ponte de dentina mais
espessa, quando comparado ao HC (DOMINGUEZ et al., 2003). No entanto, esses
achados podem ser reflexo do tempo experimental, visto que nesses estudos as
avaliações foram realizadas tardiamente, fora do período de inflamação aguda e já
na fase de reparo.
A base biológica que explique os benefícios clínicos do MTA e HC ainda não
foi completamente elucidada. No entanto, estudos recentes sugerem que os
materiais podem modular o reparo dos tecidos dentais através da sua capacidade de
mobilizar componentes bioativos da matriz dentinária (GRAHAM et al., 2006;
THOMSON et al., 2007). Esses autores sugeriram que o MTA e o HC ao entrarem
em contato com a dentina promovem a mobilização de fatores de crescimento e de
moléculas bioativas do próprio tecido, as quais, posteriormente, estimulam o reparo
mediante a deposição de tecido mineralizado (THOMSON et al., 2007).
No nosso conhecimento, este estudo é o primeiro a prover evidência de que
durante a resposta inflamatória aguda ocorre, simultaneamente, o processo de
biomineralização. A formação de precipitados semelhantes à apatita foi observada a
partir das primeiras 12h pós-implantação. Em conjunto, os dados do presente estudo
permitem inferir que a precipitação de apatita promovida pelo MTA e HC durante a
fase aguda da inflamação, juntamente com a alcalinidade dos materiais, podem
contribuir na sinalização de diversos mecanismos moleculares nos diferentes tipos
celulares. Assim, as apatitas podem induzir mudanças na expressão gênica e,
subsequentemente, na atividade funcional das células, as quais podem contribuir no
57
processo de reparo e de biomineralização. Deste modo, sugerimos que diferentes
mecanismos biológicos, em conjunto com a sua bioatividade, podem explicar a
capacidade do MTA e do HC de induzir a deposição de tecido mineralizado.
Com base nos resultados obtidos, foi possível demonstrar que o MTA e o HC
induzem um ambiente pró-inflamatório e pró-reparo. Simultaneamente à resposta
inflamatória aguda, o processo de biomineralização ocorre tanto com a dentina,
quanto com o tecido conjuntivo adjacente. Quando os biomateriais são implantados,
uma série de reações bioquímicas e biofísicas ocorre na interface biomaterial-
dentina-tecido, as quais ativam eventos celulares da reação inflamatória e do
processo de biomineralização, promovendo a formação de uma camada de apatita,
a qual permite a integração do biomaterial ao ambiente receptor.
58
6 CONCLUSÕES
1) Os tecidos em contato com o MTA e o HC apresentaram uma resposta
inflamatória mais intensa nos períodos iniciais quando comparado àqueles em
contato com o tubo vazio e na loja cirúrgica. A resposta foi caracterizada pela
presença de células polimorfonucleares (neutrófilos).
2) A transição da fase aguda para a fase crônica da resposta inflamatória
aconteceu a partir do dia 3, quando houve um aumento da população de
células mononucleares (macrófagos, linfócitos e fibroblastos).
3) O nível de citocinas expressas pelos tecidos mostrou uma expressão tempo-
dependente, com aumento significativo durante a fase aguda (12h e dia 1)
para todos os grupos avaliados.
4) O MTA estimulou de maneira mais rápida (12h) uma expressão
significativamente maior de TNF-α quando comparado ao HC.
5) A análise imunoistoquímica para MPO, NF-κB, iNOS, COX-2 e VEGF revelou
que a maior sinalização da resposta inflamatória aguda aconteceu no dia 1,
independentemente do grupo avaliado.
6) Em conjunto, a análise por meio do teste ELISA e imunoistoquímica
demonstrou que houve a ativação da via de transcrição do NF-κB, a qual
promove a expressão de COX-2, que pode ter estimulado a secreção de
iNOS e VEGF.
7) Ambos os materiais promoveram o processo de biomineralização, tanto no
tecido conjuntivo quanto na dentina.
8) O MTA favoreceu a formação de prolongamentos de apatita mais longos e de
maior densidade, os quais se tornaram maiores e mais compactos ao longo
do tempo.
59
9) O MTA e o HC induzem um ambiente pró-inflamatório e pró-reparo, sendo
que no MTA isto acontece mais precocemente. O processo de
biomineralização inicia simultaneamente à resposta inflamatória aguda.
10) Em síntese, ambos os materiais se mostraram bioativos, promovendo uma
série de reações bioquímicas e biofísicas na interface biomaterial-dentina-
tecido, as quais resultam na formação de uma camada de apatita que permite
a integração do biomaterial ao ambiente receptor.
60
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66
Inflammatory response assessment and biomineralization process promoted
by host-biomaterial interaction in vivo
Jessie F. Reyes-Carmona, Adair S. Santos, Mara S. Felippe, Claudia P. Figueiredo,
Mabel M. Cordeiro, Wilson T. Felippe.
Postgraduate Program of the Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, SC,
Brazil.
Abstract: 195 words
Text: 5696 words
Figures: 10 figures
References: 46 references
Article formatted according to guidelines of Biomaterials.
67
Abstract
Some specific signaling molecules related to the inflammatory process and the
biomineralization ability of Mineral Trioxide Aggregate (MTA) and calcium hydroxide
(CH) were analyzed to assess host-biomaterial interactions in vivo. Human dentin
tubes were filled with ProRoot MTA, CH or kept empty. After 12h, 1, 3, 7, 15, 30 and
60 days of mice’s subcutaneous implantation, the tubes and surrounding tissues
were retrieved and cytokines level quantification, histological and
immunohistochemical staining and SEM evaluation were performed. Biomaterials
induced a time-dependent pro-inflammatory cytokine upregulation up to three days.
Immunohistochemical analyses showed an upregulated expression of MPO, NFκB,
COX-2, iNOS and VEGF on day 1 for all groups. SEM examination showed the
presence of apatite-like clusters on collagen fibrils over the surface of tubes
containing the biomaterials. As the implantation time increased, a more extensive
mineralization showing a compact layer of apatite was observed. Material-dentin
interface showed intratubular mineralization as early as 12 h post-implantation. In
conclusion, MTA and CH induced a pro-inflammatory and pro-wound healing
environment, although it was earlier promoted by MTA. A biomineralization process
occurs at the biomaterial-dentin-tissue interface, simultaneously to the acute
inflammatory response, promoting the integration of the biomaterial into the
environment.
Key-words: Apatite; Bioactivity; Biomineralization; Calcium hydroxide (CH); Mineral
Trioxide Aggregate (MTA ); Inflammation; Wound healing.
68
1. Introduction
A bioactive material should be capable to stimulate specific biologic responses
by allowing a series of biochemical and biophysical reactions that result in the
formation of an apatite layer [1-3]. The ability to induce the formation of apatite allows
the integration of the biomaterial into the environment [1-3]. However, host-
biomaterial interaction is a very complex process. Host responses to biomaterials are
dependent on the innate and non-specific immune response that occurs in the
surrounding tissue [4]. Biomaterials may evoke an inflammatory cascade comprising
neutrophil and macrophage recruitment and adhesion, foreign body reaction, and
fibrous encapsulation [4-6]. Cytokines and growth factors secreted by inflammatory
cells are the molecular messengers that promote inflammatory events, as well as
wound healing [7].
Inflammatory cytokines such as, interleukin-1ß (IL-1 ß), tumor necrosis factor-
α (TNF-α), and prostaglandins (PGs) play an important role in the development of
inflammatory response. The expression of these inflammatory proteins is controlled
by the transcription factor, nuclear factor kappa B (NF-κB) [4]. NF-κB consists of a
group of proteins, including p50, p65, and p105, that in the resting state are
sequestered in the cytoplasm. While being activated by agents such as cytokines,
NF-κB undergoes phosphorylation, leading to nuclear translocation, and binding to
specific sequences of DNA, which in turn results in gene transcription [8, 9]. A
cytokine-mediated activation of NF-κB in macrophages leads to nitric oxide (NO)
production [10]. NO is a small molecule that is generated by the nitric oxide synthase
enzymes (NOS). Three isoforms of NOS have been identified: a neuronal form
(nNOS) [11], an endothelial form (eNOS) [12], and an inducible form (iNOS) [13].
Both eNOS and nNOS are constitutively expressed at low levels in the tissues;
however iNOS gene is mainly activated at the onset of inflammation [14].
Experimental evidence suggests a relationship between NO and PGs biosynthesis
[14]. Prostaglandins (PGs), such as Prostaglandin E
2
(PGE
2
) are biologically active
lipids synthesized from arachidonic acid, which, production is regulated by
cyclooxygenase-2 (COX-2) expression [15]. ]. Another enzyme linked to the acute
phase of inflammation is myeloperoxidase (MPO). MPO is a leukocyte-derived
enzyme that catalyzes
the formation of a number of reactive oxidant species. In
69
addition
to being an integral component of the innate immune response,
evidence has
emerged that MPO-derived oxidants contribute to
tissue damage during
inflammation[14, 15].
Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a glycoprotein that has the ability
to increase the permeability of blood vessels [16], an important vascular change
observed during inflammatory processes [17]. Therefore, VEGF also plays a critical
role in angiogenesis and neovascularization, participating in critical biological
processes, such as tissue repair [18].
Calcium hydroxide (CH) and Mineral Trioxide Aggregate (MTA) have been
used extensively as promising biomaterials for stimulating dentinogenesis and
cementogenesis. Despite its wide use in clinical practice, the mechanism of action in
the induction of hard tissue deposition is still unknown. Previous studies have
demonstrated that MTA releases calcium hydroxide, which interacts with a
phosphate-containing fluid to produce calcium-deficient apatite via an amorphous
calcium phosphate phase [19, 20]. A preliminary study provided compelling evidence
of the biomineralization process promoted by the interaction of MTA with dentin. The
apatite formed by the MTA-PBS system was deposited among collagen fibrils,
promoting controlled mineral nucleation on dentin, triggering the formation of an
interfacial layer with an intratubular mineralization at the cement-dentin interface [20].
Based on these findings, the formation of carbonated apatite precipitates could be
responsible for the ability of these materials to stimulate repair and dentinogenesis or
cementogenesis.
Although CH and MTA have been studied in numerous clinical and histological
studies, up-to-date, there is little consensus about the mechanism involved during the
inflammatory reaction and its correlation with the repair process and hard tissue
formation. Therefore, in this study we evaluated some specific signaling molecules
related to the inflammatory process and the biomineralization ability of these
materials with the aim to assess host-biomaterial interactions in vivo.
70
2. Materials and methods
2.1 Animals
All animal care and experimental protocols used in this study were approved
by the Animal Ethics Screening Committee of the Federal University of Santa
Catarina (Florianópolis, Santa Catarina, Brazil). The experiments were conducted
using male Swiss mice (35–40 g) housed in polycarbonate cages placed in a
ventilated, temperature-controlled room. Animals were kept in a 12 h light/dark cycle,
with controlled humidity (60 ± 5%) and temperature (25 ± 1°C). The commercial pellet
diet and distilled water were available ad libitum. Experiments were performed during
the light phase of the cycle. The animals were acclimatized to this environment for
five days before testing.
2.2 Preparation of specimens
The research protocol was approved by the Ethics Committee for Research
with Human Beings of the Federal University of Santa Catarina. A hundred and sixty-
five dentin tubes were prepared from extracted human tooth roots. The crowns and
the apical third of the roots were removed by using a water-cooled low-speed
ISOMET diamond saw (Buehler, Lake Bluff, NY). In each root, the space of the canal
was enlarged with a #5 Gates-Glidden bur to obtain 1.3 mm-diameter standardized
cavities. The length of the tubes was 5 mm, and their outer walls were abraded with a
diamond bur to thin the walls to 2 mm thickness. The dentin tubes were washed in
distilled water and then autoclaved.
Before the implantation, the tubes were thoroughly irrigated with 17%
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 1% sodium hypochlorite and then were
filled with Tooth-colored ProRoot MTA (Dentsply, Tulsa Dental, OK, USA) and CH
(MERCK, Germany) or kept empty to be used as controls.
71
2.3 Experimental protocol
The animals were anesthetized with 80 mg/kg of ketamine hydrochloride
(Dopalen, Division Vetbrands Animal Health, Jacareí, SP, Brazil) and 10 mg/kg of
xylazine (Anasedan, Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia, SP, Brazil).
Four separate 1-cm incisions were made on the mice’s backs at least 1 cm
away from each other. The skin was deflected, creating four pockets by a blunt
dissection on one side of the incision, two in the cranial portion and two in the caudal
portion. Each mouse received 3 dentin tubes, 2 filled with each material and 1 empty,
whereas no specimen was inserted in the fourth pocket (Sham). The location of the
implants was decided using a pre-determined schedule, ensuring a rotation of sites.
The wound edges were closed with two sutures (Ethilon 4-0, Ethicon, Johnson &
Jonhson, Brussels, Belgium).
After 12 h, 1, 3, 7, 15, 30 and 60 days from the implantation time, the animals
were anesthetized and sacrificed by cervical dislocation. The tubes together with
surrounding tissues were removed and fixed in 4% paraformaldehyde solution for
histological and immunohistochemical staining.
In order to determine the protein level expression of IL-1ß, TNFα and IL-10,
another group of animals were sacrificed 12 h, 1, 3 and 7 days after the surgery. The
samples and surrounding tissues were excised, the tubes removed and the tissues
were processed for tissue homogenate.
2.4 Histological Analysis
All tissues were processed by using conventional histochemical techniques,
embedded in paraffin wax and then sectioned at 4 µm thicknesses, mounted on glass
slides and deparaffinized. For general histology and morphometric analysis, slices
were stained by using hematoxylin–eosin by standard techniques. The connective
tissue in contact with the material on the opening tube or with an empty opening was
photographed (5x) and, then 4 consecutive images per sample at 40 x magnification
were captured. Reactions in the tissue in contact with the material on the opening
tube were analyzed for the presence and localization of inflammatory cells and
angiogenic sprouting.
72
Other sections were stained according to the Von Kossa technique in order to
identify mineralized structures in the tissue.
2.5 Immunohistochemical analysis
Immunohistochemistry was performed using the following primary antibodies
and respective dilutions: anti-myeloperoxidase (MPO, 1:300, Dako Cytomation,
Carpinteria, CA, USA), anti-VEGF (1:200) (C-1, Santa Cruz Biotechnology Inc.,
Santa Cruz, CA, USA), anti-COX-2 (1:200), anti-phospho-p65 NF-κB (1:50) and anti-
iNOS (1:100) (all from Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). High
temperature antigen retrieval was applied by immersion of the slides in a water bath
at 95–98°C in 10 mM trisodium citrate buffer pH 6.0, for 45 min. The non-specific
binding was blocked by incubating sections for 1 h with goat normal serum diluted in
PBS. After overnight incubation at 4°C with primary antibodies, the slides were
washed with PBS and incubated with the secondary antibody Envision plus, ready-to-
use, for 1 h at room temperature. The sections were washed in PBS, and the
visualization was completed by the use of 3,3′- diaminobenzidine (DAB) (Dako
Cytomation, Carpinteria, CA, USA) and lightly counterstained with Harris’s
hematoxylin solution. Control and experimental tissues were placed on the same
glass slide and processed under the same conditions.
Images of tissue sections stained with antibodies to myeloperoxidase (MOP),
VEGF, COX-2, phospho-p65 NF-κB or iNOS were acquired using a digital camera
(Canon A620, Lake Success, NY, USA) connected to a light microscope (Axiostar
Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). Settings for image acquisition were
identical for control and experimental tissues. There were captured four images of
tissue sections per sample, and the threshold optical density was obtained using the
NIH ImageJ 1.36b imaging software (National Institutes of Health, Bethesda, MD,
USA). The total pixels intensity was determined and data were expressed as optical
density (OD).
2.6 Determination of cytokine levels
Briefly, full-thickness tissue samples were homogenized in phosphate buffer
containing 0.05% Tween 20, 0.1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 0.1 mM
73
benzethonium chloride, 10 mM EDTA and 20 KIU aprotinin A. The homogenate was
centrifuged at 3000¥ g for 10 min, and supernatants were stored at -80°C until further
analysis. IL-1ß, TNF-α and IL-10 levels were evaluated by using DuoSet ELISA kits
(R&D Systems,Minneapolis, MN, USA) according to the manufacturer’s
recommendations. The results were expressed as pg·mg
-1
tissue protein
concentration.
2.7 SEM Analysis
After the experimental periods, the removed dentin tubes (n=5) were washed
in distilled water for 2 hours and processed for SEM observation [20]. The specimens
were mounted on aluminum stubs and sputter-coated with a 300-A° gold layer. They
were then observed under a SEM (Philips SEM XL 30) at an accelerating voltage of
15 kV. The material-dentin interface was examined at different magnifications (250–
1000X) to verify the formation of an interfacial layer between the material and the
dentinal wall. When a layer was evident, its elemental composition was investigated
by EDAX with SEM (Philips SEM XL 30).
The five dentin tubes of each experimental group retrieved at 12 h, 1, 3 and 7
days from tissue samples designated to ELISA assay were washed in distilled water
and sputter-coated with gold for SEM observation.
2.8 Statistical analysis
For statistical analysis, all data were expressed as mean ± standard error of
the mean (SEM). For parametric data, statistical significance of differences between
the groups was determined by Two-way ANOVA followed by Bonferroni post test.
Statistical analyses were performed by using GraphPad Prism 4 software (GraphPad
Software Inc., San Diego, CA, USA). A P-value of less than 0.05 was considered to
be statistically significant.
74
3. Results
3.1 Inflammatory cytokine expression profile during host-biomaterial interaction
To assess the balance of some cellular mediators involved in the inflammatory
response, first, we measured the cytokine levels of the pro- and the anti-inflammatory
cytokines, IL-1ß, TNF-α and IL-10 respectively. The expression levels of cytokine
genes are shown in Fig.1.
For the tubes containing MTA or CH as well as the empty tubes and Sham
groups, the total amount of cytokine expressed decreased after day 3.
While the biomaterials induced an overall pro-inflammatory cytokine
upregulation during the first three days, there was no apparent material-dependent
effect on the classes of cytokines produced, whereas a time-dependent manner was
demonstrated. TNF-α and IL-1ß expressions peaked at 12 and 24 h, respectively in
all experimental groups.
IL-1ß and TNF-α expressions, at 12 h and days 1 and 3, from MTA or CH
groups, were significantly upregulated when compared to empty tubes and Sham (p
< 0.05). By day 7, no significant difference was found. These findings suggest that
the inflammatory response induced by MTA and CH has a peak during the acute
response and its resolution can be already seen from day 7.
Analyzing the relative differences between materials, the cytokine
measurement assay showed that MTA stimulated an upregulation on TNF-α
expression at 12 h when compared to CH (p <0.05). Therefore, at the other
experimental times, no statistical difference was found.
Meanwhile, IL-10 expression was upregulated during days 1 and 3 and
peaked on day 1 in all experimental groups (Fig.1C). MTA and CH displayed a
significant upregulation in IL-10 expression when compared with the empty tube and
sham at 12 h and days 1 (p < 0.05) and 3 (p < 0.01). On day 7, all the experimental
groups continued to induce IL-10 expression, however, its magnitude decreased and
no significant statistical difference was observed between the experimental groups.
It is also interesting to note that during the acute inflammatory phase from 12 h
to day 3, the total cytokine expression was pronounced and decidedly pro-
inflammatory, whereas the chronic phase was characterized by a diminished
inflammatory cytokine profile.
75
3.2 Inflammatory response assessment-histomorphological findings
At 12 h, the tissue surrounding all experimental groups contained primarily
neutrophils (Fig.2). Sham showed a mild acute inflammatory reaction consisting of
neutrophils, lymphocytes, macrophages and few young fibroblasts. Neutrophil
recruitment decreased between days 1 and 3, and cellular population of
macrophages and lymphocytes increased and remained elevated from day 3 to day 7
in all experimental groups. These findings illustrated the transition from an acute
phase to a moderate chronic response.
On day 3, a mild inflammatory cell infiltration consisting mainly of lymphocytes
and macrophages was present in a fibrous capsule surrounding the opening of the
tubes containing the biomaterials as well as the empty tube. The predominant cell
population present in Sham was fibroblasts while few macrophages and
lymphocytes were found within the tissue. Moreover, it was possible to observe a
decrease in edema.
On days 7 and 15, a chronic inflammatory cell infiltration consisting primarily of
macrophages, fibroblasts, lymphocytes and few giant cells were present in a thinner
fibrous capsule (Fig. 2). The intensity of the inflammation was reduced at 30 and 60
days, inflammatory cell population was diminished, and the fibrous capsule near the
tube was thinner (Fig. 2).
Despite the similarity in the responses of MTA and CH, it cannot be denied the
presence of greatest areas with necrosis by coagulation in tissues surrounding CH
when compared to MTA. This reaction might occur because CH has a high solubility,
so the paste must dissolve promoting necrosis in near areas.
3.3 Inflammatory response assessment-immunohistochemical findings
In order to define more clearly the cellular mechanisms induced by MTA and
CH, we carried out immunohistochemical studies of some components of the
inflammatory response. The immunoreactivity analysis for NF-kB, iNOS, COX-2,
VEGF and MPO is shown on Figs. 3 - 7. These analyses disclosed the expression of
the different proteins in a time-dependent manner.
76
MPO expression reached its peak at 24 h in all experimental groups (Fig. 3).
The immunoreactivity analysis for MPO showed a significant increase in protein
expression between 12 h and day 1, on tissue in contact with MTA as well as with the
empty tube and Sham (p <0.001). At 12 h and on day 1, the tissue in contact with the
HC showed higher expression of MPO when compared to the empty tube (p <0.001).
Already, at 12 h and on days 1 and 3, the immunohistochemical analysis showed a
significant increase in the expression of MPO in the tissue in contact with the HC
when compared to Sham (p <0.001).
To further define some signaling pathways activated by inflammatory stimuli,
we studied the transcriptional factor NF-kB, which is able to modulate the expression
of COX-2. All experimental groups induced pronounced phosphorylation of NF-kB
and their subsequent translocation to the nucleus of inflammatory cells (Fig. 4). This
transcriptional factor presented a peak of phosphorylation at 12 h and as expected,
MTA and CH significantly upregulated NF-kB expression when compared to empty
tubes and Sham (p < 0.01).
COX-2 and iNOS expression reached its peak at 12 and 24 h respectively,
after implantation of dentin tubes containing both materials as well as in the empty
tube and Sham (Fig. 5 and 6). No significant difference was shown between
biomaterials in the expression of these proteins (p > 0.05); therefore, an upregulated
expression was demonstrated when compared to the empty tube and Sham (p <
0.01). By analyzing the expression profile of COX-2 promoted by the biomaterials, it
was observed on day 1, that MTA provided a significant increase in the expression of
this protein when compared to CH (p <0.01).
It has also been demonstrated that COX-2 and iNOS are implicated in the
induction of VEGF [17], an inducer of vascular hyperpermeability and angiogenesis.
VEGF expression was upregulated at all time periods (Fig. 7). At the acute phase of
inflammation, VEGF was mainly expressed in the presence of neutrophils and
macrophages, probably because its ability to increase the permeability of blood
vessels. Therefore, at day 7, VEGF expression by fibroblasts was also demonstrated,
suggesting sustained angiogenesis stimulation during the chronic phase of
inflammation in order to maintain a wound healing environment.
77
3.4 In vivo biomineralization ability of MTA and CH
To determine the bioactivity of MTA and CH it was analyzed the
biomineralization ability on soft tissue as well as with dentin. Light microscopic
analyses demonstrated the presence of areas with dystrophic calcification positive to
Von Kossa staining even at 12 h (Fig. 8). Intensity of Von Kossa staining for mineral
deposition became denser from day 7 to day 60 (Fig. 8). Empty tubes and Sham did
not show areas of calcification positive to Von Kossa stain (Fig. 8).
SEM examination of dentin tubes showed the presence of apatite-like clusters
(Fig. 9). SEM-EDAX indicated that the precipitates contained mainly calcium and
phosphorus with Ca/P molar ratios of 1.60 – 1.64 (Fig. 9). SEM photomicrographs
revealed apatite-like crystallites deposition on tissue collagen fibrils (Fig. 9). As soon
as 12 h it was possible to observe numerous apatite-like clusters deposited on
collagen fibrils all over the surface of the dentin tubes containing the biomaterials. On
day 1, apatite deposition was greater and the collagen fibrils in the more highly
mineralized region exhibited a “corn-on-the-cob” appearance [23]. As the
implantation time increased, a more extensive mineralization was observed and
many of these precipitates formed agglomerates. After 7 days, a compact apatite
layer was formed all over the surface of the dentin tubes (Fig. 9).
On examination of the material-dentin interface, it was possible to differentiate
the biomineralization ability of each material with dentin (Fig. 10). MTA-dentin
interface showed an intratubular mineralization process, as early as 12 h post-
implantation. The tag-like structures (TS) resembling demineralized tubular dentin
were observed extending from the interfacial layer and seemed like these structures
grew in size, becoming more compact over time (Fig. 10). However, conclusions from
this analysis must be carefully drawn out because of the variety on the intratubular
anatomy of the teeth used in this study and also due to the methodology for
preparation of specimens for SEM observation.
Interestingly, the intratubular mineralization process was not limited to the
MTA-dentin interface, as it was possible to observe this phenomenon all over the
dentin surface (Fig. 10).
Until the third day, it was not possible to observe the intratubular
mineralization process on CH-dentin interface. In some samples after 3 days, it was
difficult to observe the presence of an interfacial layer. On days 15, 30 and 60, it was
78
shown the presence of fewer TS, suggesting that CH promotes a lesser and deficient
biomineralization process with dentin in comparison with MTA. SEM
photomicrographs of the empty tube demonstrated no intratubular mineralization (Fig.
10).
4. Discussion
Despite the progress made in understanding the molecular biology that
controls the mechanism of action of MTA and CH [24-28], the exact mechanism of
wound healing and the nature of hard tissue formation is still unclear, and
consequently, a matter of extensive research. Our study has focused on the
inflammatory reaction and its correlation with the biomineralization process to
understand the mechanisms underlying the host response to MTA and CH.
The inflammatory reaction is closely related to the healing process [27-29].
The body's defense reactions involve several regulatory functions and numerous
molecular mediators [29]. As repair begins in the onset of inflammation, it is
necessary to further understand the inflammatory process further.
The inflammatory response induced during host-biomaterial interaction is
traditionally assessed by histological or immunohistochemical analysis [10]. In
addition to histomorphologic changes, the cytokine expression profile [4, 7, 10, 24-
27] and the number of inflammatory cells [22, 24, 27] have been used to monitor this
phenomenon.
It is widely accepted that neutrophils, macrophages and lymphocytes are
recruited to the site of implantation and react to the presence of a foreign material
through extra and/or intracellular signals. Until recently, in vivo studies that
investigate the link between cell interrogation of materials and intercellular signaling
relied on PCR [30], protein array or ELISA [7, 10, 24, 27]. In this study, we assayed
the expression levels of cytokines IL-1ß, TNF-α and IL-10 in the implanted region
through ELISA.
MTA and CH induced an overall pro-inflammatory cytokine upregulation during
the acute phase in a time-dependent manner. IL-1ß and TNF-α play an important
role in the response to tissue damage or infection by promoting inflammation,
recruiting lymphocytes and monocytes to local sites, and stimulating endothelial cells
to express adhesion molecules and secrete chemokines [30]. During an inflammatory
79
response, IL-1ß and TNF-α have an initial pro-inflammatory effect followed by a
regulatory effect in the later stages of inflammation, reducing immune activity [30-31].
This statement may explain the findings of our study in which overexpressed cytokine
concentrations in the acute phase tended to decrease over time. Probably, the
regulatory effect of these cytokines signaled the resolution of the inflammatory
reaction during the chronic phase
IL-1ß and TNF-α expressions, at 12 h and days 1 and 3, from MTA or CH
groups, were significantly upregulated when compared to empty tubes and Sham.
By day 7, no significant difference was found. These data suggest that the presence
of these materials in the dentin tubes had an impact on the intercellular signaling that
occurs at the implantation site. Despite that, at the acute phase there was an
upregulation of pro-inflammatory cytokines. It is interesting to note that,
simultaneously, there was an IL-10 overexpression in MTA and CH specimens. The
IL-10 upregulation may have signaled the decrease in cytokine production observed
at later time points, since IL-10 has been shown to downregulate cytokine production
[29]. These data support the idea that MTA and CH promote an anti-inflammatory
effect, as suggested in previous studies [25, 30].
The production of cytokines subsequently leads to the expression of adhesion
molecules and the recruitment of inflammatory cells [10, 32]. As referred by previous
reports [5-7], MPO immunostaining showed that neutrophils were the predominant
cells at the site of implantation during the first day. Neutrophil recruitment decrease
after day 1 to day 3, after which, mostly macrophages and lymphocytes migrated into
the tissue. On days 7 and 15, a mild chronic inflammatory cell infiltration consisting
primarily of macrophages, fibroblasts and lymphocytes was present in a thicker
fibrous capsule. At 30 and 60 days, inflammatory cell numbers were diminished, and
the fibrous capsule near the tube was thinner indicating the beginning of the
resolution phase in the inflammatory process. This histomorphologic change may be
an explanation for the expected transition from an acute pro-inflammatory phase to
an anti-inflammatory and pro-wound healing chronic environment.
Neutrophils have short lifetimes – hours to days – and disappear from the
injured tissue more rapidly than do macrophages, which have a lifetime of days to
weeks or months [5]. Eventually macrophages become the predominant cell type,
resulting in a chronic inflammatory response [5,6]. Macrophages are probably the
most important cell in chronic inflammation because of the great number of
80
biologically active products they produce, including neutral proteases, chemotatic
factors, arachidonic acid metabolites, reactive oxygen metabolites, complement
components, coagulation factors, growth-promoting factors, and cytokines [5]. It is
widely accepted that macrophages play a critical role in mediating the host response
to biomaterials, and that is why perhaps in our study, macrophage recruitment was
more notably on day 1 until day 3. This finding suggests that macrophages could be
the guiding cells in charge of signalizing the host inflammatory response through the
release of inflammatory molecules such as IL-1 and VEGF.
The inflammatory reaction is a varied and extremely complex process that
represents an extensive network of interacting mechanisms, mediators and cells [5,
6, 29]. Because biomaterials might evoke several signaling pathways to trigger the
inflammatory cascade, we analyzed the expression of selected NF-κB-regulated
gene products (iNOS and COX-2) and VEGF through immunohistochemical staining.
NF-κB is a central coordinator of innate and adaptive immune responses and
could be activated by distinct stimuli, including proinflammatory cytokines, bacteria,
viruses, and physical and chemical stresses [4]. Activated NF-κB subsequently alters
the transcription of a large number of genes participating in inflammatory responses,
such as COX-2 and iNOS [28, 33]. Thus, we investigated whether NF-κB was
involved in the MTA/CH-stimulated signal transduction during the inflammatory
cascade. Our results showed that both biomaterials induced activation of NF-κB in
the early stage of inflammation.
It is widely known that the activation of NF-κB implicate in induction of gene
expression of COX-2 and iNOS [28, 33]. COX-2 is an inducible enzyme responsible
for elevated PGE
2
production during the acute and chronic phases of inflammation [9,
15]. iNOS synthesizes NO, which is known to be an important biologic effector
molecule that induce dilatation of the blood vessels [28]. As shown, the expression of
NF-κB peaked at day 1. Moreover, COX-2 and iNOS expression was increased also
at day 1 and despite the levels decreased on day 3, the expression of both genes
remained detectable until day 7. Our findings are in agreement with those of
Minamikawa et al. [28], who suggested that MTA induces phosphorylation of IκBα,
which leads to freeing NF-κB complexes. Activated NF-κB complexes translocate to
the nucleus and stimulate the expression of COX-2. Released prostaglandins induce
81
transcription of iNOS in an autocrine manner. As in our study CH showed a similar
expression, we suggest that both biomaterials have a similar mechanism of action.
Recent evidence demonstrates that the production of prostanoids by COX-2
promotes the expression of VEGF and subsequent angiogenesis [17]. However, we
observed that VEGF overexpression remained stable at the various time periods. At
the acute phase, VEGF upregulation was attributed to its ability to increase the
permeability of blood vessels, an important vascular change observed during the
early stages of inflammation [17]. On day 7, VEGF expression was mainly expressed
by fibroblasts, suggesting the induction of a repair process.
As the host responses to biomaterials are a complex process that involves
several mediators, we decided to analyze the integrated responses of the classes of
genes examined in this study, based on their respective role. According to Brodbeck
et al. [34], the genes detected in this study may be classified as: pro-inflammatory
(IL-1ß, VEGF and TNF-α), anti-inflammatory (IL-10), pro-wound healing (IL-1ß and
VEGF), and anti-wound healing (TNF-α and IL-10). Based on this classification we
can draw out some conclusions from our findings. Our study showed that TNF-α
expression peaked at 12 h, and that on days 1 and 3, IL-1ß expression was higher
than that of TNF-α. Also, it was possible to note a decrease over time on IL-10
expression. As known, IL-1ß has a proinflammatory/pro-wound healing cytokine role,
activating both inflammatory cells (lymphocytes and monocytes) and wound healing
cells (fibroblasts). On the other hand, IL-10 acts in the opposite fashion by
downregulating the activity of these cell types and suppressing further cytokine
production, leading to an anti-inflammatory/anti-wound healing effect [34]. Thus, it
seems that TNF-α, a pro-inflammatory/ anti-wound healing gene, triggers the
inflammatory cascade. IL-1ß upregulation until day 3 aims to activate inflammatory
cells and fibroblasts and consequently stimulate repair, while IL-10 upregulation at
the acute phase promotes the resolution of the inflammatory process. Therefore, at
later stages, its downregulation is necessary to orchestrate wound healing and repair,
as seen on day 7.
The aim of the current study was to correlate the inflammatory reaction and
the biomineralization process promoted by MTA and CH. Our study analyzes, on soft
tissue as well as on dentin, the biomineralization process promoted by the two
biomaterials.
82
MTA and CH exhibited deposition of Von Kossa positive mineralized
structures even at early stages of inflammation. Our results are in agreement with the
results of previous studies, who observed similar results for MTA and CH [22, 35, 36].
On soft tissue, both biomaterials showed similar mechanism of action, despite MTA
promoted a higher mineral deposition.
SEM analyses of dentin tubes with the materials showed the presence of
apatite-like clusters deposition on collagen fibrils, as soon as 12 h post-implantation.
SEM-EDAX indicated that the precipitates are mainly composed by calcium and
phosphorus. Previously, we have shown that the interaction of MTA with dentin in a
phosphate containing fluid produce an amorphous calcium phosphate phase which
act as precursor during the formation of carbonated apatite [20]. It is important to
highlight that SEM EDAX analysis for precipitates formed by MTA and CH after
subcutaneous implantation displayed similar results. Holland et al. [36] suggested
that the calcium ions released by the materials react with the carbon dioxide from the
tissue, giving rise to granulations of calcite crystals. However, the authors never
employed methodologies aiming to characterize these dystrophic calcifications, so
this statement is based on assumptions. In vitro studies employing simulated body
fluid are more indicated when aiming precipitates characterization, because of the
difficulty of obtainment the crystals in an “in vivo environment”[1]. Previous in vitro
studies suggested that calcium ions released by MTA react with phosphate in PBS,
yielding hydroxyapatite precipitates [37, 38]. However, it is well known that
stoichiometric hydroxyapatites do not exist in biological systems, indeed was
recognized that the intermediate key that precedes the appearance of biological
calcified tissues is amorphous calcium phosphate [19, 39]. Taken together, the data
of previous studies, our previous in vitro findings and the results of this study it may
be concluded that MTA and CH promotes carbonated apatite formation.
Our study provides compelling evidence of the in vivo biomineralization
process promoted by MTA and CH with dentin and collagen fibrils of the soft tissue.
SEM photomicrographs revealed apatite-like crystallites deposition on tissue collagen
fibrils. As the implantation time increased, this deposition was higher and it seemed
like precipitates grew in size. At higher magnification, numerous amorphous calcium
phosphate spheres along the surface of the collagen fibrils suggested the presence
of a mineral support within collagen fibrils. On day 3, collagen fibrils in the more
highly mineralized regions exhibited the “corn-on-the-cob” appearance that is
83
suggestive of interfibrillar mineralization [23]. This mineral deposition and maturation
increased over time and on day 7, a formed layer completely covered the surface of
the dentin tubes.
SEM analysis of MTA-dentin interface revealed the presence of intratubular
mineralization as soon as 12 h. This intratubular mineralization seemed to get more
mature and greater over time. Despite similarities in the mechanism of action on
tissue by both materials, CH showed a lesser and fewer intratubular mineralization.
One possible explanation is that CH paste has a high solubility avoiding the material
to stay in intimate contact with dentin.
An interesting observation of our study was to observe that the intratubular
mineralization process was not limited to the material-dentin interface; it was possible
to observe this phenomenon all over the dentin surface. It seems that the
biomineralization process occurs simultaneously with dentin as with soft tissue,
promoting an apatite layer that allows the integration of the biomaterial into the
environment.
It is well known that the organic matrix possesses properties that can initiate
and regulate the formation of mineral crystals. Thus, crystal nucleation and controlled
growth are considered to be matrix-mediated or matrix-regulated processes [40]. The
template for the controlled deposition of calcium phosphate is type I collagen, but by
itself does not have the capacity to induce matrix-specific mineralization [41].
Noncollagenous proteins present in the mineralized dentin matrix, such as dentin
matrix protein 1 (DMP1), have been implicated as having a regulatory function in
dentin formation. Recombinant DMP1 molecules have been thought to perform
specific molecular recognition with the apatite surface, guiding calcium phosphate
clusters during recruitment through the collagen matrix [20, 23]. This process has
been described as controlled biomineralization [20].
MTA and CH have been shown capable of inducing mineralized tissue
formation at a variety of oral and dental tissue sites and subsequently their potential
applications within dentistry have expanded. Indeed, in vivo analyses have shown
that MTA induces thicker dentine bridge formation, causes less inflammation and
pulp necrosis, when compared to CH [42-44].
The biological basis for the clinical benefits of both MTA and CH has yet to be
completely elucidated, although recent studies suggested that the materials may
modulate dental tissue repair through their capacity to mobilize bio-active
84
components of the dentin matrix [45, 46]. The authors hypothesize that MTA and/ or
CH interfaced with dentin potentially cause growth factor and other bio-active
molecule mobilization, which subsequently stimulates reparative events culminating
in mineral tissue deposition [46].
To our knowledge, this is the first study that provides evidence that during the
initial acute inflammatory response, simultaneously, a biomineralization process
occurs. Apatite-like cluster precipitation was observed even at 12 h post implantation.
We hypothesize that the precipitation of apatite by MTA and CH during the acute
phase of inflammation together with the alkalinity of the materials, may contribute to
signal several unrecognized pathways in different cell types. Apatites may induce
changes in gene expression and subsequently in cell functional activity, which are
likely to contribute in repair and biomineralization process [45]. Thus, we suggest that
several biological mechanisms in combination with their bioactivity may explain
MTA’s and CH ability to induce mineralized tissue deposition.
5. Conclusion
In conclusion, we demonstrated that MTA and CH induced a pro-inflammatory and
pro-wound healing environment. Simultaneously to the acute inflammatory response,
a biomineralization process occurs with dentin as well as with soft tissue. When the
biomaterials are implanted, we suggest that a series of biochemical and biophysical
reactions occurs at the biomaterial-dentin-tissue interface, which subsequently
activates cellular and tissue events in the inflammatory and biomineralization
process, culminating in the formation of an apatite-like layer that allows the
integration of the biomaterial into the environment.
85
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89
ANEXOS
90
91
Resultado de Solicitação de Protocolo
Protocolo
PP00284
Título
Analise in vivo da resposta inflamatória tecidual e periférica e do processo de biomineralizacão promovidos pelo
Agregado de Trióxido Mineral e hidróxido de cálcio
Data de Entrada
20/11/2008
Resultado:
Aprovado
Data/Prazo
06/03/09
Considerações
Oficio nº 023/CEUA/PRPe/2009
Do: Presidente da Comissão de ética no Uso de Animais-CEUA
Ao(à): Prof(a) Dr(a) Wilson Tadeu Felippe
Departamento de Estomatologia - CCS
Prezado(a) Professor(a),
Em relação ao protocolo de pesquisa sob sua responsabilidade a CEUA deliberou o seguinte:
- APROVADO, por 2 (dois) anos, para a utilização de 68 camundongos (Mus musculus).
- Processo cadastrado sob o número: 23080.057239/2008-70.
Por ocasião do término desse protocolo, DEVERÁ SER APRESENTADO RELATÓRIO detalhado relacionando o uso de
animais no Projeto desenvolvido aos resultados obtidos, conforme formulário ON LINE CEUA.
Atenciosamente,
Relatório Final previsto para (90 dias após término da vigência do protocolo ou no momento da
apresentação de um novo protocolo)
Data 09/06/2011
Data 10/03/2009
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