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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
MATÍAS VICTORIA MONTERO
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR E DISSEMINAÇÃO
DE NOROVÍRUS EM ECOSSISTEMAS AQUÁTICOS
Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em
Biologia Celular e Molecular do Instituto Oswaldo Cruz,
FIOCRUZ, como parte dos requisitos para obtenção do
título de Doutor em Ciências. Área de Concentração:
Virologia
Orientadores: Dra. Marize Pereira Miagostovich
Dr. José Paulo Gagliardi Leite
RIO DE JANEIRO
2010
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
MATÍAS VICTORIA MONTERO
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR E DISSEMINAÇÃO
DE NOROVÍRUS EM ECOSSISTEMAS AQUÁTICOS
Orientadores: Dra. Marize Pereira Miagostovich
Dr. José Paulo Gagliardi Leite
Aprovada em: 03/02/2010
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Marcelo Alves Pinto - Presidente
Prof. Dr. Liliana Spano
Prof. Dr. Regina Keller
Prof. Dr. Flávia Barreto dos Santos
Prof. Dr. Caroline Cordeiro Soares
Rio de Janeiro, 03 de Fevereiro de 2010
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iii
Dedico esta tese a Zully,
Dedico esta tese a Zully, Dedico esta tese a Zully,
Dedico esta tese a Zully,
Miguel e Sabina, pela
Miguel e Sabina, pela Miguel e Sabina, pela
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minha formação e apoio
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em cada uma d
em cada uma dem cada uma d
em cada uma das etapas
as etapas as etapas
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da minha vida.
da minha vida.da minha vida.
da minha vida.
iv
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores Dra. Marize Pereira Miagostovich e Dr. José Paulo Gagliardi
Leite, pela amizade, ensinamentos no mundo científico e, no que considero o mais importante,
na arte da vida; sempre acreditando em mim e me injetando doses importantes de otimismo.
Ao Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro deste trabalho.
À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular do
Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ.
A Alexandre Fialho, Alexandre Pina, Ana Carolina Ganime, Anna Carolina Tinga,
Ana Maria Pinto, Bernardo Loureiro, Carmen Baur, Edson Pereira, Eduardo Volotão, Fabiana
Fioretti, Fernando López, Flávia Guimarães, Francisca dos Santos, Gilmar Alcantara, Gonzalo
Bello, Irene Araújo, Joeler Vargas, Josélio Galvão, Júlia Fioretti, Juliana Andrade, Juliana
Bragazzi, Ludmila Rocha, Marcelle Figueira, Marcos César, Maria da Penha Xavier, María
Eugenia Galeano, Mariela Martínez, Marilda Almeida, Mônica Ferreira, Nilson Porto,
Pamella de Souza, Patrícia Duque, Rosane Assis, Silvana Portes, Suellen Possas, Tatiana
Prado, Tatiana Rose, Thaís Ramos e Tulio Fumian pela amizade e ajuda nesta etapa muito
importante da minha vida, sempre dispostos a colaborar nas atividades do laboratório e a
compartilhar bons momentos dentro e fora dele.
Aos Drs. Juan Cristina e Rodney Colina do Laboratório de Virologia Molecular da
Universidad de la República - Uruguai pela efetiva colaboração nos trabalhos de evolução
molecular dos norovírus realizados dentro do projeto CAPES-UdelaR.
Aos profissionais da Rede Municipal de Saúde do estado do Rio de Janeiro (hospitais
e secretarias) pela obtenção das amostras clínicas.
À equipe do Laboratório de Virologia Aplicada da Universidade Federal de Santa
Catarina pelo apoio na realização do monitoramento nos ecossistemas aquáticos realizado na
cidade de Florianópolis, Santa Catarina.
Aos Drs. Caroline Soares (IOC), Flávia Barreto (IOC), Liliana Spano (UFES),
Marcelo Pinto (IOC), Regina Keller (UFES) por aceitarem participar da banca examinadora
desta tese.
v
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................ vii
ABSTRACT ........................................................................................................................... viii
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1
1.1 Classificação e morfologia .................................................................................................. 1
1.2 Genoma e proteínas ............................................................................................................ 3
1.3 Replicação viral ................................................................................................................... 5
1.4 Patogênese, características clínicas e resposta imunológica do hospedeiro .................. 5
1.5 Características físico-químicas .......................................................................................... 6
1.6 Diagnóstico laboratorial ..................................................................................................... 7
1.7 Epidemiologia ...................................................................................................................... 9
1.7.1 Norovírus no ambiente .................................................................................................. 10
1.8 Prevenção e controle ......................................................................................................... 11
2. RELEVÂNCIA .................................................................................................................... 13
3. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 15
3.1 Objetivo geral .................................................................................................................... 15
3.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 15
4. RESULTADOS ................................................................................................................... 16
4.1 One year monitoring of norovirus in a sewage treatment plant in Rio de Janeiro,
Brazil ..................................................................................................................................... 17
4.2 Assessment of norovirus contamination in environmental samples from Florianópolis
City, Southern Brazil ........................................................................................................... 18
4.3 Evaluation of an adsorption–elution method for detection of astrovirus and
norovirus in environmental waters .................................................................................... 19
4.4
Acute gastroenteritis cases associated with noroviruses infection in the state of Rio de
Janeiro
.................................................................................................................................. 20
4.5 Surveillance of norovirus infection in the state of Rio de Janeiro, Brazil 2005-2008 . 21
4.6 Bayesian coalescent inference reveals high evolutionary rates and expansion of
Norovirus populations ......................................................................................................... 22
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 23
5.1 Avaliação de contaminação ambiental por norovírus ................................................... 23
5.1.1 Avaliação da contaminação por norovírus em águas residuárias (Artigo 4.1) ........ 24
5.1.2 Avaliação da contaminação por norovírus em diferentes matrizes aquáticas (Artigo
4.2) ......................................................................................................................................... 25
5.1.3 Avaliação do método de concentração viral em águas ambientais (Artigo 4.3) ....... 26
5.2 Epidemiologia e evolução molecular dos norovírus no estado do Rio de Janeiro ...... 27
5.2.1 Estudos de epidemiologia e caracterização molecular dos norovírus no estado do
Rio de Janeiro (Artigos 4.4 e 4.5) ....................................................................................... 27
5.2.2 Estudos de evolução molecular dos norovírus no estado do Rio de Janeiro (Artigo
4.6) ......................................................................................................................................... 29
6. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 31
7. PERSPECTIVAS ................................................................................................................ 32
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 33
9. ANEXOS .............................................................................................................................. 40
9.1 Anexo 1: “Environmental dissemination of group A rotavirus: P-type, G-type and
subgroup characterization”. ............................................................................................... 40
9.2 Anexo 2: “Assessment of adenovirus, hepatitis a virus and rotavirus contamination
in environmental samples in Florianópolis, south Brazil”. .............................................. 41
vi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
aa – Aminoácido
AdV – Adenovírus
Cl
-
– Íon cloro
CME – Criomicroscopia eletrônica
EIE – Ensaio imunoenzimático
ETE – Estação de tratamento de esgoto
FCV – Calicivírus felino, do inglês “Feline Calicivirus”
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
G – Genogrupo
HAV – Vírus da hepatite A, do inglês “Hepatitis A Virus”
IFN-γ – Interferon gama
Ig – Imunoglobulina
IL-2 – Interleucina 2
IME – Imunomicroscopia eletrônica
kDa – Kilodalton
log
10
– Logaritmo em base dez
ME – Microscopia eletrônica
mg/L – Miligrama por litro
MgCl
2
– Cloreto de magnésio
MNV – Norovírus murino, do inglês “Murine Norovirus”
NLV – Norwalk-like virus
nm – Nanômetro
nt – Nucleotídeo
NV – Norovírus
o
C – Grau Celsius
ORF – Fase aberta de leitura, do inglês “Open Reading Frame”
P – Domínio externo da proteína capsídica VP1
p.i – Pós-infecção
p.p.m. – Partes por milhão
PCR – Reação em cadeia pela polimerase, do inglês “Polymerase Chain Reaction”
pH – Potencial hidrogeniônico
Poli(A) – Sequência repetitiva de nucleotídeos de adenina
qPCR – PCR quantitativa
RNA – Ácido ribonucléico
RpRd – RNA polimerase RNA dependente
RV – Rotavírus
S – Domínio interno da proteína capsídica VP1
T – Número de triangulação
UTR – Região não traduzida, do inglês “Untranslated Region”
UV – Ultravioleta
VLP – Partículas semelhantes a vírus, do inglês “Virus-like Particles”
VPg – Proteína viral de união ao genoma, do inglês “Viral protein genome”
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR E DISSEMINAÇÃO DE NOROVÍRUS EM
ECOSSISTEMAS AQUÁTICOS
Matías Victoria Montero
RESUMO
Os norovírus (NV) são os principais agentes causadores de surtos de gastroenterite viral
aguda no mundo. Classificados na família Caliciviridae, pertencem ao gênero Norovirus que
inclui cinco genogrupos (GI-GV). A principal via de transmissão destes vírus é a fecal-oral
pela ingestão de águas ou alimentos contaminados, sendo importante a realização de estudos
epidemiológicos abordando aspectos clínicos e ambientais. O presente trabalho teve como
objetivo estabelecer, avaliar e aplicar metodologias de concentração, detecção e
caracterização molecular de NV em diferentes ecossistemas aquáticos. Desta forma espera-
se obter dados epidemiológicos de disseminação ambiental, assim como estudar a
variabilidade genética, a dinâmica populacional e a taxa de evolução destes vírus em casos
de gastroenterite aguda. Com este propósito foi realizada a investigação destes vírus em
amostras de águas ambientais pela realização de monitoramentos de ecossistemas aquáticos
e padronização de metodologias de concentração e detecção viral. Também foi realizada
uma vigilância laboratorial de casos de gastroenterite aguda ocorridos no estado do Rio de
Janeiro no período de 2005 a 2008. No primeiro estudo, o monitoramento de NV em
amostras de águas residuárias, realizado na Estação de Tratamento de Esgoto da FIOCRUZ,
ficou demonstrada a circulação de NV GII e GI com predominância do GII e uma baixa taxa
de remoção destes vírus após tratamento, resultando na detecção de NV no efluente e
conseqüente disseminação no ambiente. Neste mesmo estudo, a técnica de PCR quantitativa
foi a técnica mais sensível para a detecção dos NV quando comparada com a PCR
qualitativa e “semi-nested” PCR. Em outro monitoramento, realizado na cidade de
Florianópolis foi demonstrado uma ampla dispersão de NV GI e GII em diferentes
ecossistemas aquáticos, sendo estes os primeiros dados epidemiológicos sobre a circulação
destes vírus na região Sul do país. Posteriormente, o método de concentração utilizado
nestes estudos foi avaliado experimentalmente e se mostrou eficiente para recuperação de
NV em diferentes tipos de amostras de águas ambientais. Diferentes concentrações de
cloreto de magnésio devem ser utilizadas nas diferentes matrizes aquáticas a fim de se
maximizar a recuperação viral. Estudos realizados com amostras clínicas demonstraram que
o NV GII foi responsável pelos surtos de gastroenterite aguda ocorridos no estado do Rio de
Janeiro, sendo o NV GI detectado em um pequeno número de casos de gastroenterite
infantil. A genotipagem revelou a co-circulação de genótipos principalmente do GII, com
um predomínio do GII.4. O estudo de evolução molecular das amostras de GII.4 pela
inferência de coalescência bayesiana demonstrou uma elevada taxa de evolução no gene que
codifica para a proteína capsídica VP1 (1,21x10
-2
substituições/sítio/ano) sendo maior que
as taxas observadas para o vírus da hepatite C, o vírus sincicial respiratório e o vírus da
imunodeficiência humana; revelando que a população viral no estado do Rio de Janeiro
atualmente se encontra em processo de expansão.
viii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
MOLECULAR EPIDEMIOLOGY AND DISSEMINATION OF NOROVIRUS IN
AQUATIC ECOSYSTEMS
Matías Victoria Montero
ABSTRACT
Noroviruses (NV) are the most important agents causing outbreaks of viral acute
gastroenteritis worldwide. They are classified in the Caliciviridae family, belonging to the
Norovirus genus which includes five genogroups (GI-GV). The transmission of these viruses
is through the fecal-oral route by the consumption of contaminated water or food. Therefore,
it is important to perform epidemiological studies concerning clinical and environmental
aspects to characterize the virus spread. The goal of this study was to establish, evaluate and
apply methodologies for concentration, detection and molecular characterization of NV in
different aquatic ecosystems. Consequently, we aimed to obtain epidemiological data
concerning environmental spread, as well as to study the genetic variability, the population
dynamic and the evolution rate of these viruses in cases of acute gastroenteritis. Investigation
of these viruses in environmental water samples were performed through the monitoring of
aquatic ecosystems and standardization of concentration and detection methodologies. We
also analyzed clinical samples obtained from the laboratorial surveillance of cases of acute
gastroenteritis occurred in the state of Rio de Janeiro from 2005 to 2008. In the first study, the
monitoring of NV in sewage samples, performed in the Sewage Treatment Plant at
FIOCRUZ, demonstrated the circulation of NV GII and GI, being GII the most prevalent. A
low removal rate of these viruses was observed after treatment, resulting in the NV detection
in effluent samples with the consequent spread in the environment. In the same study, the
quantitative PCR was the most sensitive technique for NV detection when compared to both
qualitative and semi-nested PCR. In another laboratorial surveillance, carried out in the city of
Florianópolis, it was demonstrated the spread of NV GI and GII in different aquatic
ecosystems, constituting the first epidemiological data concerning the circulation of these
viruses in the South region of the country. The concentration method used in these studies
was also evaluated experimentally, demonstrating an efficient recovery of NV from different
types of environmental water samples. Different concentrations of magnesium chloride should
be used with different aquatic matrices in order to maximize the viral recovery. The studies
carried out with clinical samples demonstrated that NV GII was responsible for outbreaks of
acute gastroenteritis observed in the state of Rio de Janeiro, with NV GI detected only in a
few number of cases of infantile gastroenteritis. The genotypes characterization revealed the
co-circulation of different genotypes mainly from GII, with the predominance of GII.4. The
molecular evolution study of GII.4 samples through the bayesian coalescent inference
demonstrated a high evolution rate in the gene encoding the VP1 capsid protein (1,21x10
-2
substitutions/site/year) being higher than rates observed for the hepatitis C virus, respiratory
syncytial virus and human immunodeficiency virus; revealing that the viral population in the
state of Rio de Janeiro is currently in an expansion process.
1
1. INTRODUÇÃO
Os norovírus (NV) foram os primeiros vírus descritos como agente etiológico de casos
de gastroenterite aguda, sendo detectados por imunomicroscopia eletrônica (IME) a partir de
material fecal de crianças em uma escola primária na cidade de Norwalk, Ohio, Estados
Unidos da América (Kapikian et al. 1972). Foram identificados como agregados de partículas
de 27 nanômetros (nm) de diâmetro e denominados como “Norwalk-like” vírus (NLV).
Os NLV foram classificados na família Caliciviridae após estudos de caracterização
do genoma viral onde foram identificadas características compartilhadas com os outros vírus
pertencentes a esta família, tais como: a) presença de uma cauda poli(A) no extremo 3´ do
genoma viral; b) uma proteína VPg unida ao extremo 5´ do genoma; c) três fases abertas de
leituras (ORF) que codificam uma poliproteína não estrutural, uma proteína principal e outra
menor do capsídeo viral (Jiang et al. 1993; Green et al. 2000). A denominação Caliciviridae
deriva da palavra latina "calix", que significa taça, estrutura observada na criomicroscopia
eletrônica (CME) destes vírus que apresentam simetria icosaédrica sem envelope (Prasad et
al. 1999). Posteriormente, o gênero Norwalk-like virus foi renomeado como Norovirus tendo
o vírus Norwalk como vírus protótipo do gênero (ICTV, 2009).
A ausência de cultivo celular e modelo animal para a propagação dos NV resultou na
indisponibilidade de métodos diagnósticos capazes de detectar esse agente. Somente a partir
da década de 1990 com o avanço no desenvolvimento das técnicas de biologia molecular foi
possível a caracterização do genoma do vírus e o estabelecimento de ensaios moleculares para
a detecção destes vírus a partir de espécimes clínicos (Jiang et al. 1990, 1992). Atualmente, os
NV têm sido reconhecidos como os principais vírus entéricos responsáveis por mais de 90%
das epidemias de gastroenterite viral aguda no mundo sendo associadas a 1,1 milhão de
hospitalizações e 218.000 mortes em crianças de países em desenvolvimento (Patel et al.
2008).
1.1 Classificação e morfologia
Quando observados pela CME, a partícula viral dos NV é esférica com simetria
icosaédrica de 27 nm de diâmetro, com número de triangulação (T) igual a três, apresentando
32 depressões grandes na superfície do capsídeo. Os 90 capsômeros estão formados por
dímeros da proteína capsídica VP1. Esta proteína VP1 tem dois domínios principais: o
domínio S, mais interno e o domínio P, mais externo, unidos por uma “dobradiça”. O domínio
2
P está subdividido em dois subdomínios, o subdomínio interno P1 e o externo P2 (Figura 1.1)
(Prasad et al. 1999).
Figura 1.1. Estrutura do capsídeo e da proteína capsídica VP1 dos norovírus. a, b:
representação da superfície e corte transversal da partícula viral (sem genoma) obtida pela
criomicroscopia eletrônica, respectivamente. c, d: dímero e monômero da proteína capsídica
VP1 dividida nos domínios S e P e subdomínios P1 e P2, respectivamente. e: estrutura linear
da proteína VP1. (Adaptado de Tan & Jiang [2007]).
A família Caliciviridae é constituída por quatro gêneros: Vesivirus, Lagovirus,
Sapovirus e Norovirus. O gênero Norovirus está dividido em cinco genogrupos (G): GI, GII,
GIII, GIV e GV, baseado na análise da seqüência de aminoácidos (aa) que codifica a proteína
VP1 do capsídeo (Figura 1.2). Os NV identificados em humanos têm sido classificados
filogeneticamente como pertencentes aos GI, GII e GIV, porém dentro destes genogrupos
também têm sido detectados NV que infectam suínos, classificados como GII/11, GII/18 e
GII/19 (Zheng et al. 2006).
Os genogrupos são divididos em genótipos que representam a unidade mínima de
classificação dos NV. Estes genótipos consistem em amostras agrupadas por similaridade de
aa em um determinado ramo da árvore filogenética realizada com as seqüências de aa da
proteína VP1 (Figura 1.2). Duas amostras são consideradas como pertencentes a diferentes
genogrupos se a distância entre elas pelo método de distância pareada sem correção for ≥
45%. Dentro do mesmo genogrupo, amostras que apresentam distância ≥ 15% ≤ 45% são
3
agrupadas em diferentes genótipos. Amostras que apresentam distância de até 15% são
consideradas estirpes do mesmo genótipo. Utilizando esta classificação, têm sido
identificados oito genótipos pertencentes ao GI, 19 genótipos pertencentes ao GII, três
genótipos pertencentes ao GIII, dois genótipos pertencentes ao GIV e um genótipo
pertencente ao GV.
Figura 1.2. Árvore filogenética baseada na análise de seqüências de aminoácidos da
proteína do capsídeo VP1 completa dos norovírus representantes dos cinco genogrupos
(GI-V) e seus 33 genótipos (Adaptado de Patel et al. [2009]).
1.2 Genoma e proteínas
O genoma dos NV é constituído por um RNA de fita simples de polaridade positiva de
aproximadamente 7.700 nt organizado em três ORFs, uma região não traduzida (UTR) na
extremidade 3´ e 5´ e uma cauda poli(A) na extremidade 3' (Figura 1.3). Observa-se também
um RNA subgenômico de aproximadamente 2.300 nt que contém as ORF 2 e 3, e uma UTR
na extremidade 3´. A ORF1 de aproximadamente 5.000 nt codifica uma poliproteína não
estrutural de 200 kilodalton (kDa) que é processada proteoliticamente originando as proteínas
p48, nucleosídeo trifosfatase (NTPase), p20, VPg, protease e RNA polimerase RNA
dependente (RpRd). As ORFs 2 e 3, localizadas na extremidade 3' do genoma codificam para
as proteínas do capsídeo denominadas de VP1 e VP2. Na extremidade 5´ do RNA genômico e
4
sub-genômico se encontra a proteína VPg unida covalentemente. Esta proteína, de 15 kDa
atua, provavelmente, na síntese de novas moléculas de RNA viral (Hardy, 2005).
A RpRd está codificada na região aminoacídica localizada do aa 1.281 até o extremo
carboxi-terminal da ORF1 e apresenta elementos estruturais (domínios) e catalíticos
característicos das RpRd de outros vírus de RNA de polaridade positiva (Hardy, 2005).
A proteína VP1 contém aproximadamente 530 aa. Esta proteína apresenta dois
domínios conservados que flanqueiam um domínio variável central com propriedades
antigênicas que definem a especificidade da estirpe. A VP1 se dobra em dois domínios
principais designados domínio S e P. Os 225 aa do extremo N-terminal formam o domínio S e
contém elementos essenciais para a formação do capsídeo icosaédrico enquanto o domínio P
se estende do aa 225 ao aa 530 (extremo C-terminal). Os domínios P interagem em contatos
diméricos aumentando a estabilidade e formando as proeminências no capsídeo viral. Este
domínio P está dividido em dois subdomínios denominados P1 e P2. O domínio P2 é
composto por 127 aa que estão inseridos no domínio P1. A região hipervariável no domínio
P2 tem um papel importante no reconhecimento do receptor celular e na imunogenicidade do
virion (Hardy, 2005).
A proteína VP2 é constituída por 268 aa apresentando alta variabilidade genética na
seqüência nucleotídica entre diferentes estirpes virais. No virion, a VP2 está presente em uma
ou duas cópias, sendo essencial na síntese das partículas infecciosas (Hardy 2005). A região
da proteína localizada entre os aa 108 e 152 contém o domínio de interação com a proteína
VP1. A proteína VP2 atuaria na encapsidação do RNA genômico e na estabilização dos
dímeros da proteína VP1 para produzir partículas resistentes à degradação proteolítica
(Bertolotti-Ciarlet et al. 2003).
Figura 1.3. Organização genômica dos norovírus. p48: proteína amino terminal; NTPase:
proteína nucleosídeo trifosfatase; p20: proteína p20; VPg: proteína de união ao genoma; Pro:
protease; Pol: RNA polimerase; VP1: proteína principal do capsídeo; VP2: proteína menor do
capsídeo; círculo amarelo: VPg; (A)
n
: Cauda Poli(A); aa: aminoácido. ORF: “Open Reading
Frame” (Fase Aberta de Leitura). (Adaptado de Donaldson et al. [2008]).
5
1.3 Replicação viral
A adsorção viral dos NV se realiza pela união do subdomínio P2 da proteína VP1 aos
antígenos do grupo histo-sanguíneo que são carboidratos complexos presentes nas
glicoproteínas ou glicolipídeos de eritrócitos e células epiteliais das mucosas (Tan & Jiang,
2005). O RNA genômico funciona como molde para a síntese dos RNAs genômico e
subgenômico intermediários de polaridade negativa. Para realizar esta síntese de RNAs de
polaridade negativa a proteína VPg é uridilada e age como iniciador para a replicação destes
RNAs de polaridade negativa que estão poliadenilados. A enzima responsável por esta síntese
é a RpRd, que utiliza este RNA molde de polaridade negativa para sintetizar o RNA
genômico e sub-genômico da progênie viral de polaridade positiva, começando na
extremidade 3´ do genoma de forma independente da união de iniciador (Rohayem et al.
2006).
O início da tradução do RNA viral acontece quando os fatores de iniciação da tradução
celular se unem à proteína viral VPg e recrutam o ribossomo iniciando desta forma o processo
da tradução das proteínas virais (Goodfellow et al. 2005; Chaudhry et al. 2006). A proteína
VP1 é traduzida a partir do RNA subgenômico e sua expressão está regulada pela expressão
da proteína VP2 e pela presença da UTR na extremidade 3´ (Bertolotti-Ciarlet et al. 2003). A
protease viral processa as clivagens na poliproteína codificada na ORF1 originando as
proteínas não estruturais funcionalmente ativas (Scheffler et al. 2007). Finalmente, o RNA
genômico é empacotado formando as partículas virais infecciosas (Asanaka et al. 2005).
1.4 Patogênese, características clínicas e resposta imunológica do hospedeiro
A infecção por NV ocorre no intestino delgado provocando um achatamento rápido e
reversível das vilosidades e encurtamento das microvilosidades, provocando lesões na mucosa
que resulta no surgimento da diarréia. Nos pacientes infectados pelo NV observa-se uma
redução na área de superfície das vilosidades do duodeno intestinal, um aumento no número
de linfócitos T citotóxicos intraepiteliais, mudanças típicas de apoptose nas células epiteliais
tais como: condensação e compactação da cromatina na periferia do núcleo celular,
segmentação do núcleo; assim como uma redução na expressão das proteínas constituintes das
junções estreitas intercelulares (Troeger et al. 2009).
Após o período de incubação que varia de 24 a 48 horas, as principais manifestações
clínicas são diarréia e vômito, que podem estar acompanhadas por náusea, dor abdominal,
cefaléia, febre e mialgia. A gastroenterite causada por NV geralmente é auto-limitada e as
6
manifestações clínicas são resolvidas em quatro a seis dias. A infecção por NV acomete
indivíduos de todas as faixas etárias. A diarréia é mais prevalente em crianças menores de um
ano de idade e o vômito é mais freqüente em pacientes maiores de cinco anos de idade. Na
maioria dos casos não existe a presença de sangue ou muco nas fezes, que geralmente são
aquosas (Rockx et al. 2002; Lopman et al. 2004). Idosos e crianças menores de cinco anos de
idade que apresentam desidratação requerem hospitalização para realizar a terapia de
reidratação. Eventualmente, a infecção por NV pode levar ao óbito em pacientes subnutridos
com desidratação grave acometendo principalmente crianças menores de cinco anos de idade
e idosos maiores de 65 anos (Mattner et al. 2006; Harris et al. 2008).
Nas infecções por NV, Rockx e colaboradores (2005) evidenciaram uma resposta
imune com produção de
anticorpos de classe Imunoglobulina G (IgG) e A (IgA) que
fornecem imunidade protetora de curta duração.
O pico no título de anticorpos IgM e IgA
séricos é detectado no 12
o
dia pós-infecção (p.i), desaparecendo cerca de 40 a 60 dias p.i e
persistindo por um longo período em baixas concentrações, respectivamente. A IgA é
detectada nas fezes no 18
o
dia p.i e no leite de mães, apresentando uma reatividade cruzada
entre genótipos do mesmo e de diferentes genogrupos. Esta IgA quando ingerida pelo filho,
fornece uma imunidade protetora heterotípica contra certos genótipos dos NV (Iritani et al.
2007; Makita et al. 2007). A IgG sérica atinge o pico de concentração após os primeiros 18
dias persistindo por um longo período em altas concentrações. Esta IgG sérica tem alto título
para os NV do tipo homólogo apresentando pouca reação cruzada com os outros genótipos do
mesmo genogrupo não sendo observada reação cruzada com NV de outro genogrupo (Iritani
et al. 2007). Também é evidenciado um aumento significativo na secreção de interferon gama
(IFN-γ) e interleucina 2 (IL-2) incrementando a ativação de macrófagos e a produção de
subclases de IgG que favorecem a opsonização viral (Lindesmith et al. 2005).
1.5 Características físico-químicas
Os NV mantém a infecciosidade após o tratamento com éter 20% a 4
o
C durante 18
horas ou quando incubados a 60
o
C por 30 minutos (Green, 2007). A inativação dos calicivírus
é diretamente proporcional ao aumento da temperatura, apresentando alta taxa de inativação a
temperaturas superiores a 56
o
C. A inativação utilizando radiação ultravioleta (UV) é dose-
dependente. São inativados em pH ≤ 5 ou ≥ 10 e após 30 minutos em etanol 70%. São
resistentes à inativação por tratamento com íons cloro (Cl
-
) em uma concentração de 3,8 a 6,3
mg/L, porém são inativados por tratamento com Cl
-
a 10 mg/L (Green, 2007). Perdem a
7
infectividade após tratamento com cloro em concentrações maiores de 300 partes por milhão
(p.p.m.) à temperatura ambiente durante 30 minutos. Quando presentes em suspensão fecal
apresentam infecciosidade por até uma semana à temperatura < 20
o
C (Duizer et al. 2004).
Devido à ausência de cultura celular ou modelo animal para a replicação dos NV, os
calicivírus felinos (FCV) e NV murinos (MNV) têm sido utilizados como modelos nos
estudos de inativação viral. Os FCV apresentam uma inativação de 3 log
10
quando submetidos
a 71
o
C por um minuto ou em etanol 70% por 30 minutos (Duizer et al. 2004). Os MNV
atingem uma inativação de 4 log
10
quando expostos por cinco minutos a 1.000 p.p.m. de ácido
peracético, 2.500 p.p.m. de glutaraldeido, etanol 50% e l-propanol 30% (Magulski et al.
2009). Hewitt e colaboradores (2009) realizaram ensaios de inativação térmica comparando o
MNV com o vírus da Hepatite A (HAV) e os NV humanos GI e GII. Utilizando ensaio em
placa observaram que tanto os MNV quanto os HAV reduziram sua infecciosidade em mais
de 3 log
10
após cinco minutos de exposição a 63
o
C ou após o segundo minuto de exposição a
72
o
C. O título viral determinado pela Reação em Cadeia pela Polimerase quantitativa (qPCR)
evidenciou que tanto HAV quanto MNV apresentaram uma redução máxima de 1 log
10
após
10 minutos de exposição a 72
o
C. Entretanto, uma redução máxima de 0,8 log
10
no título de
qPCR foi observada para ambos os genogrupos de NV após os 10 minutos de exposição.
Foram evidenciadas diferenças significativas na redução da infecciosidade determinadas para
HAV e MNV quando comparadas com as reduções determinadas para os NV; também foi
evidenciada menor redução no título do NV GI quando comparado com GII. Os autores
sugerem que provavelmente os NV humanos sejam mais resistentes à inativação por calor que
os HAV e MNV e que se deve ter cuidado na extrapolação de parâmetros de inativação
observados em modelos (Hewitt et al. 2009).
1.6 Diagnóstico laboratorial
A IME utilizada para a detecção dos NV apresenta baixa sensibilidade (10
6
partículas
virais/grama de fezes) não sendo aplicável no diagnóstico de rotina ou estudos
epidemiológicos (Atmar & Estes, 2001).
Após a caracterização molecular do genoma dos NV, foi possível a expressão da
proteína capsídica VP1 no sistema de expressão utilizando o baculovírus como vetor de
expressão, gerando “vírus-like particles” (VLP) constituídas por um capsídeo morfológica e
antigenicamente similar as partículas virais, porém sem a presença do genoma viral (Jiang et
al. 1992; Leite et al. 1996). Utilizando estas VLPs para a imunização de diferentes animais foi
8
possível obter altos níveis de anticorpos poli e monoclonais para desenvolver ensaios
imunoenzimáticos (EIE). Este tipo de ensaio proporciona a vantagem de não apresentar
reatividade cruzada com outros vírus entéricos. Porém, a utilização desta técnica é limitada
devido à grande diversidade antigênica destes vírus mesmo utilizando diferentes VLPs
simultaneamente acarretando resultados falso negativos (Jiang et al. 2000; Richards et al.
2003).
A técnica mais amplamente utilizada na detecção dos NV a partir de amostras fecais
derivadas de casos esporádicos ou epidêmicos é a PCR precedida pela transcrição reversa
(RT-PCR). A sensibilidade e especificidade das diferentes técnicas de detecção dos NV tais
como a IME, EIE e a RT-PCR tem sido avaliada e em todos os casos a RT-PCR se apresenta
como a técnica mais sensível e específica para a detecção dos NV. Os EIE podem ser
utilizados para triagem de surtos de gastroenterite aguda. Porém, a detecção deve ser
complementada com a RT-PCR para a análise das amostras negativas pelo EIE (Bruin et al.
2006; Castriciano et al. 2007).
Diferentes regiões do genoma viral têm sido utilizadas para o desenho dos iniciadores
para realizar a amplificação genômica, sendo a região da RpRd a mais freqüentemente
utilizada devido à conservação dos nucleotídeos entre as diferentes estirpes dos NV (Beuret et
al. 2002; Boxman et al. 2006; La Rosa et al. 2007). Neste gene, os pares de iniciadores mais
utilizados flanqueiam as regiões denominadas A e B (Figura 1.4). As regiões denominadas
região C e D estão localizadas no gene VP1 que codifica para a proteína principal do capsídeo
e permitem a genotipagem da estirpe analisada através do seqüenciamento do amplicon obtido
na reação de RT-PCR (Kojima et al. 2002; Vinjé et al. 2004).
Recentemente, foi desenvolvida uma qRT-PCR “monoplex” para quantificar os GI e
GII que utiliza iniciadores direcionados à região mais conservada do genoma viral localizada
na junção das ORF1-ORF2. Este ensaio é mais sensível que as RT-PCR qualitativas que
utilizam iniciadores direcionados para a RpRd sendo capaz de detectar até 20.000 cópias de
RNA viral por grama de fezes e não apresenta reatividade cruzada com os outros vírus
entéricos (Kageyama et al. 2003). Posteriormente, esses iniciadores foram padronizados para
um formato “multiplex” para a detecção e quantificação simultânea dos NV GI e GII,
apresentando a mesma sensibilidade e especificidade que o ensaio “monoplex”,
economizando tempo e custo (Pang et al. 2005).
9
Figura 1.4. Representação esquemática do genoma dos norovírus com as localizações
das regiões mais utilizadas para a amplificação genômica e genotipagem do vírus.
(Adaptado de Vinjé et al. [2004]).
1.7 Epidemiologia
A transmissão dos NV é muito eficiente devido à alta infecciosidade deste vírus; a
probabilidade média de desenvolver uma infecção por uma única partícula viral é de 50%
(Teunis et al. 2008). Pessoas infectadas podem eliminar os vírus nas fezes após o período
sintomático por mais de 20 dias originando uma fonte de contaminação para possíveis novos
casos de gastroenterite (Rockx et al. 2002). Por estas características, os NV causam surtos de
gastroenterite principalmente em ambientes de uso coletivo tais como hospitais, clínicas
geriátricas, escolas, cruzeiros e restaurantes, afetando indivíduos de todos os grupos etários
(Rockx et al. 2002; Widdowson et al. 2005). A principal via de transmissão dos NV é fecal-
oral pela ingestão de água ou alimentos contaminados, sendo a transmissão por contato
pessoa-pessoa, fômites ou aerossóis também observada. A infecção causada pela ingestão de
água acontece pela contaminação da fonte de água de consumo ou diferentes corpos de águas
recreacionais, originando surtos de gastroenterite em indivíduos que entram em contato com
estas águas (Hoebe et al. 2004; Hewitt et al. 2007).
Diferentes tipos de alimentos têm sido identificados como a fonte de surtos de
gastroenterite causados pelo NV; os bivalves, especialmente as ostras, são os principais
alimentos envolvidos em tais surtos devido ao consumo cru destes organismos filtradores,
porém, saladas e sanduíches também têm sido associados (Daniels et al. 2000; Boxman et al.
2006; Schmid et al. 2007). Uma via freqüente de contaminação de alimentos é pela
manipulação destes por indivíduos infectados que não realizam uma higiene adequada
(Widdowson et al. 2005).
O padrão de sazonalidade para as infecções por NV não está bem esclarecido,
ocorrendo casos de gastroenterite aguda causados por NV durante todo o ano. Contudo, nos
10
países com clima temperado, picos de detecção têm sido identificados freqüentemente no
período do inverno (Patel et al. 2009).
Os NV têm uma distribuição mundial ubíqua sendo detectados tantos em países
desenvolvidos quanto em desenvolvimento. Nestes países, a ocorrência de infecções por NV
em pacientes hospitalizados varia de 3% a 35% apresentando uma média de 12% para
crianças com gastroenterite grave. Esta mesma variação na taxa de detecção é observada tanto
em casos de gastroenterite aguda na comunidade quanto em indivíduos atendidos em
ambulatórios (Schnagl et al. 2000; Wit et al. 2001; Parashar et al. 2004; Amar et al. 2007;
Patel et al. 2008).
Estudos de caracterização molecular dos NV nos casos de gastroenterite aguda
revelam uma freqüente co-circulação de diferentes genótipos de GII e GI, porém as estirpes
do GII são as mais prevalentes sendo responsáveis por 75% a 100% das estirpes
caracterizadas e o GII.4 o mais prevalente. Devido à rápida evolução destes vírus, novas
variantes surgem freqüentemente substituindo as variantes antigas e se disseminando em
diferentes regiões do mundo rapidamente. Este fenômeno tem sido evidenciado
particularmente com as variantes GII.4. O surgimento de novas variantes está relacionado
com um considerável aumento no número de surtos reportados (Kroneman et al. 2006;
Siebenga et al. 2007, 2009).
No Brasil, diferentes estudos têm detectado NV em casos de gastroenterite aguda em
crianças e adultos. A ocorrência destas infecções tem sido relatada com altas taxas de
detecção chegando a valores de 40%, como evidenciado no estudo realizado na cidade de
Vitória, Espírito Santo (Ribeiro et al. 2008). Diferentes genótipos de GI e GII têm sido
detectados sendo o GII.4 o mais prevalente (Victoria et al. 2007; Campos et al. 2008; Ribeiro
et al. 2008; Barreira et al. 2010). É importante destacar o estudo realizado por Nakagomi e
colaboradores (2008), em que analisando casos de crianças hospitalizadas por gastroenterite
aguda observaram uma gravidade similar entre os casos de gastroenterite causados pela
infecção por rotavírus A (RV-A) e NV.
1.7.1 Norovírus no ambiente
Os NV são eliminados nas fezes das pessoas infectadas em elevadas concentrações
que podem chegar até 1,6 x10
12
cópias de genoma/g de fezes (Atmar et al. 2008). Devido às
suas características físico-químicas, são altamente resistentes no ambiente persistindo aos
tratamentos convencionais nas Estações de Tratamento de Esgoto (ETE) atingindo diferentes
11
ecossistemas aquáticos tais como águas recreacionais, de consumo e águas de cultivo de
moluscos bivalves tais como ostras e mexilhões (Figura 1.5) (Berg et al. 2005; Haramoto et
al. 2004; Ueki et al. 2005).
Figura 1.5. Vias de disseminação dos norovírus.
Surtos de gastroenterite aguda por NV têm sido associados ao consumo de ostras e
águas contaminadas. Devido à alimentação pelo mecanismo de filtração de águas, os bivalves
acumulam estes vírus em seus tecidos, que, quando ingeridos, na maioria das vezes crus,
apresentam o potencial de causar infecção viral no consumidor. (Maunula et al. 2005; Hewitt
et al. 2007).
Os NV têm sido detectados em diferentes tipos de matrizes aquáticas tais como água
de mar, rio, subterrânea e de torneira (Katayama et al. 2002; Haramoto et al. 2004; Maunula
et al. 2005; Ueki et al. 2005).
1.8 Prevenção e controle
A prevenção de surtos de gastroenterites aguda causados pela infecção por NV
depende da identificação do modo de transmissão. De modo geral a interrupção da
transmissão se dá pela implementação de medidas de controle da contaminação de alimentos e
da água, mantendo ao mesmo tempo uma higiene adequada nos manipuladores de alimentos e
reduzindo a propagação do surto pelo contato pessoa-pessoa. Devido à excreção viral na fase
assintomática, é recomendado o afastamento temporal do manipulador de alimentos infectado
pelo NV para evitar qualquer tipo de contaminação (Patel et al. 2009).
12
Atualmente, existem metodologias que permitem a detecção dos NV diretamente de
águas ou alimentos contaminados, auxiliando na identificação e eliminação da fonte de
contaminação prevenindo novas infecções (Katayama et al. 2002; Fumian et al. 2009).
A higiene pessoal, e especialmente a higiene das mãos, é importante para prevenir a
transmissão pessoa-pessoa. Os NV são transferidos de forma eficaz de indivíduos com mãos
contaminadas para até sete superfícies limpas diferentes. É recomendada a aplicação da
combinação hipoclorito de sódio/detergente para uma desinfecção adequada uma vez que a
utilização exclusiva de detergentes não é efetiva na eliminação da contaminação por NV
(Barker & Vipond, 2004).
Os primeiros avanços para o desenvolvimento de uma vacina anti-NV têm sido
obtidos pela utilização de VLPs recombinantes para a imunização de camundongos e de
voluntários infectados pelo NV. As formulações orais de VLPs expressas em plantas
transgênicas utilizadas nestes estudos produziram uma resposta humoral nos camundongos e
voluntários desafiados (Tacket, 2005; Lobue et al. 2006). Outra estratégia de vacinação é a
utilização de adenovírus (AdV) recombinantes que expressam a proteína do capsídeo do NV.
Esta estratégia foi utilizada com sucesso para a imunização intranasal de camundongos na
obtenção de uma resposta imune humoral de mucosa com produção de IFN-γ (Guo et al.
2008).
13
2. RELEVÂNCIA
Os NV são os principais vírus responsáveis pelos casos de surtos de gastroenterite
aguda acometendo indivíduos de todas as faixas etárias em todo o mundo. Estimativas
indicam que os NV ocasionam 1,1 milhão de hospitalizações e 218.000 mortes em crianças a
cada ano nos países em desenvolvimento (Patel et al. 2008).
Apesar de terem sido os primeiros vírus associados com casos de gastroenterite aguda,
atualmente a ocorrência das infecções por NV é subestimada nos países em desenvolvimento,
uma vez que o diagnóstico que utiliza principalmente metodologias moleculares é de alto
custo. Recentemente, diferentes abordagens têm sido utilizadas no estudo da epidemiologia
destes vírus resultando em um aumento exponencial de estudos e relatos científicos que
demonstram a importância destes vírus nos quadros de gastroenterite infantil aguda e em
surtos de veiculação hídrica ou alimentar.
Diversos estudos têm demonstrado a importância de se analisar a presença dos NV em
ecossistemas aquáticos visando obter dados que reflitam a epidemiologia destes vírus nas
populações locais (Berg et al. 2005; Lodder & Husman, 2005; Ueki et al. 2005). Este tipo de
abordagem pode auxiliar na detecção de vírus proveniente de indivíduos assintomáticos,
como é comum nas infecções por NV, acrescentando informações aos dados epidemiológicos
obtidos a partir de amostras clínicas (Garcia et al. 2006; Barreira et al. 2010).
Os NV têm sido detectados em diferentes ecossistemas aquáticos assim como em
diferentes espécies de bivalves tais como ostras e mexilhões, evidenciando a importância do
monitoramento da contaminação viral em diferentes ambientes devido ao potencial risco para
a saúde humana pelo contato direto ou indireto de indivíduos com águas ou alimentos
contaminados (Beuret et al. 2002; Berg et al. 2005; Boxman et al. 2006; La Rosa et al. 2007).
Atualmente existe um consenso científico da ausência de correlação entre indicadores
bacterianos, universalmente adotados como critérios para garantir a qualidade sanitária dos
moluscos e águas, e a ocorrência de vírus entéricos (Lees, 2000).
Estudos em diferentes regiões do Brasil têm determinado o impacto dos NV em casos
de gastroenterite aguda em crianças hospitalizadas, em comunidades e em pacientes atendidos
em ambulatórios (Parks et al. 1999; Gallimore et al. 2004; Castilho et al. 2006; Soares et al.
2007; Victoria et al. 2007; Ribeiro et al. 2008). Entretanto, anteriormente a este trabalho,
apenas um estudo realizado no país evidenciou a contaminação ambiental de NV em igarapés
urbanos na cidade de Manaus (Miagostovich et al. 2008).
A investigação de NV em diferentes matrizes aquáticas é relevante para demonstrar a
disseminação destes vírus no ambiente, complementando os estudos clínicos de determinação
14
da ocorrência, de genótipos circulantes, dinâmica populacional viral e definindo o impacto
destes vírus em casos de gastroenterite aguda. A detecção e caracterização molecular dos NV
em amostras clínicas provenientes de casos esporádicos e surtos de gastroenterite aguda são
imprescindíveis para se determinar as taxas de morbidade e de internações hospitalares
resultantes destas infecções. Adicionalmente, a vigilância molecular com a determinação dos
genótipos circulantes contribui para a detecção de eventuais introduções de novos genótipos,
assim como para o futuro desenvolvimento de vacinas e terapias preventivas.
15
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
- Estabelecer, avaliar e aplicar metodologias de concentração, detecção e caracterização
molecular de NV em diferentes matrizes aquáticas fornecendo dados epidemiológicos de
disseminação ambiental, assim como estudar a variabilidade genética, a dinâmica
populacional e a taxa de evolução destes vírus em casos de gastroenterite aguda.
3.2 Objetivos específicos
- Avaliar a contaminação de NV em águas residuárias da ETE-FIOCRUZ (Rio de
Janeiro), determinando a prevalência, circulação dos genótipos e a eficiência de
remoção de NV nesta ETE.
- Avaliar a eficiência do método de concentração viral utilizando membrana carregada
negativamente para a detecção de NV nesta ETE.
- Avaliar metodologias moleculares de amplificação genômica para detecção e
quantificação de NV em águas residuárias.
- Avaliar a contaminação de NV em diferentes ecossistemas aquáticos determinando a
disseminação desses vírus na cidade de Florianópolis, Santa Catarina.
- Avaliar a eficiência do método de concentração viral utilizando membrana carregada
negativamente para a detecção de NV a partir de diferentes matrizes de águas
ambientais (água de mar, rio e consumo).
- Determinar os genótipos de NV em casos de gastroenterite aguda provenientes de surtos
e casos esporádicos ocorridos no estado do Rio de Janeiro durante o período de 2005 a
2008.
- Determinar a evolução molecular e a dinâmica populacional dos NV circulantes no
estado do Rio de Janeiro.
16
4. RESULTADOS
Os resultados deste trabalho de tese são apresentados sob forma de manuscritos
publicados, aceitos e submetidos à publicação.
17
4.1 One year monitoring of norovirus in a sewage treatment plant in Rio de Janeiro,
Brazil
Objetivos:
- Avaliar a contaminação de NV em águas residuárias da ETE-FIOCRUZ (Rio de
Janeiro), determinando a prevalência, circulação dos genótipos e a eficiência de
remoção de NV nesta ETE.
- Avaliar a eficiência do método de concentração viral utilizando membrana carregada
negativamente para a detecção de NV nesta ETE.
- Avaliar metodologias moleculares de amplificação genômica para detecção e
quantificação de NV em águas residuárias.
Revista: Journal of Water and Health (2010) 08: 158-165
18
19
20
21
22
23
24
25
26
4.2 Assessment of norovirus contamination in environmental samples from Florianópolis
City, Southern Brazil
Objetivo:
- Avaliar a contaminação de NV em diferentes ecossistemas aquáticos determinando a
disseminação desses vírus na cidade de Florianópolis, Santa Catarina.
Revista: Journal of Applied Microbiology. In press
27
28
29
30
31
32
33
34
35
4.3 Evaluation of an adsorption–elution method for detection of astrovirus and
norovirus in environmental waters
Objetivo:
- Avaliar a eficiência do método de concentração viral utilizando membrana carregada
negativamente para a detecção de NV a partir de diferentes matrizes de águas
ambientais (água de mar, rio e consumo).
Revista: Journal of Virological Methods (2009) 156:73-76
36
37
38
39
40
4.4 Acute gastroenteritis cases associated with noroviruses infection in the state of Rio de
Janeiro
Objetivo:
- Determinar os genótipos de NV em casos de gastroenterite aguda provenientes de surtos
e casos esporádicos ocorridos no estado do Rio de Janeiro durante o período de 2005 a
2008.
Revista: Journal of Medical Virology (2008) 80:338–344
41
42
43
44
45
46
47
48
4.5 Surveillance of norovirus infection in the state of Rio de Janeiro, Brazil 2005-2008
Objetivo
- Determinar os genótipos de NV em casos de gastroenterite aguda provenientes de surtos
e casos esporádicos ocorridos no estado do Rio de Janeiro durante o período de 2005 a
2008.
Revista: manuscrito submetido à publicação na revista
Journal of Medical Virology
49
SURVEILLANCE OF NOROVIRUS INFECTIONS
IN THE STATE OF RIO DE JANEIRO, BRAZIL 2005-2008
Ferreira MSR
1
; Victoria M
1
; Carvalho-Costa FA
2
; Vieira CB
1
; Xavier MPTP
1
; Fioretti JM
1
; Andrade J
1
; Volotão
EM
1
; Rocha M
3
; Leite, JPG
1
; Miagostovich, MP
1
.
1
Laboratory of Comparative and Environmental Virology, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Rio de
Janeiro, Brazil.
2
Laboratory of Biochemical Systemtics, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil.
3
Hospital Municipal Jesus
This work was carried out at the Laboratory of Comparative and Environmental Virology,
Oswaldo Cruz Institute – Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
*
Correspondence to: Marize Pereira Miagostovich, – Pavilhão Hélio & Peggy Pereira, Av.
Brasil 4.365 – Manguinhos – CEP 21045-900 – Rio de Janeiro – RJ – Brasil. Phone. 55-21-
2562-1875. Fax. 55 -21- 2562-1851.
E-mail: [email protected]
Shortened title: Norovirus infections in Rio de Janeiro, Brazil
Key Words: Norovirus, Gastroenteritis, Prevalence, Genetic diversity, Outbreaks, Rio de
Janeiro
50
ABSTRACT
A four-year (2005-2008) norovirus (NoV) surveillance study was performed in the state of Rio Janeiro,
Brazil, to demonstrate the role of these viruses in outbreaks and sporadic cases of acute gastroenteritis. This
study enrolled 267 outpatients from Municipal Public Health Centers and 820 inpatients, whose samples were
obtained by active surveillance in Public Hospitals. A total of 1,087 fecal samples were tested by reverse
transcription (RT) followed by polymerase chain reaction (PCR) using the MON 431- 434 set of degenerate
primers for NoV GI and GII detection, and there were 35.1% (381/1,087) positive samples for NoV, consisting
of 30.2% (248/820) and 49.8% (133/267) from inpatient and outpatient, respectively. Children infected by NoV
had significantly more frequent mucus in feces, vomiting and fever. No seasonality pattern in NoV infections
was observed from the hospitalized cases; however, two peaks of NoV infections were observed from
ambulatory cases, suggesting that there was an occurrence of outbreaks in those time periods. Molecular
characterization revealed GII to be the most prevalent genogroup, totaling 96.3% (104/108) of all sequences
analyzed, and GII.4 was the most frequently detected genotype (80.7%), followed by GII.6, 3, 14, 7 and 8. Two
GI strains, GI.2 and GI.3, were also observed. The number of outbreaks and sporadic cases reported in this study
highlights the need to implement a NoV diagnosis in surveillance laboratories.
51
INTRODUCTION
Acute gastroenteritis is a global public health problem with approximately 1.5 billion
diarrhea episodes occurring each year, and over 1.8 million deaths in children under 5 years of
age worldwide (Bryce et al., 2005; Patel et al., 2008). Norovirus (NoV) has emerged, and is
now recognized, as the cause of outbreaks and sporadic cases of acute gastroenteritis in
children and adults (Fankhauser et al., 2002; Kroneman et al., 2006; Soares et al., 2007;
Victoria et al., 2007). The absence of a cell culture system that is sensitive for replication of
NoV has hampered the development of diagnostic methods for this virus. Therefore, the
importance of NoV as an etiologic agent of acute gastroenteritis in both sporadic cases and
outbreaks has been determined after the development of molecular methods for NoV
detection (Jiang et al., 1990; Monroe, Ando & Glass, 2000). The genus Norovirus belongs to
the Caliciviridae family and consists of a single-stranded, positive-sense RNA genome of 7.7
kb encased within an icosahedral capsid (Prasad et al., 1999). The genome contains three open
reading frames (ORF) that encode non-structural proteins, including viral proteinase and RNA
polymerase (ORF1), and the major and minor capsid proteins (ORF2 and ORF3, respectively)
(Hardy, 2005). The genetic classification of NoV includes five genogroups (G) (I to V), and it
is based on phylogenetic analysis of the capsid region (ORF2), and the number of genotypes
is still increasing (Ando et al., 2000; Zheng et al., 2006). Globally, NoV outbreaks are caused
by different strains of GI and GII, and GII strains are predominant worldwide (Phan et al.,
2004; Ike et al., 2006; Ferreira et al., 2008).
Due to the great genetic variability of NoV, primers toward the most conserved region of
the virus (RNA polymerase) have been used for detection, while primers targeting a small
region of either polymerase (regions A and B) or major capsid (regions C, D and E) have been
used for genotyping strains (Noel et al., 1997; Beuret et al., 2002; Kojima et al., 2002;
Vennema et al., 2002; Vinjé et al., 2004; Mattison et al., 2009).
In developing countries, diagnosis of NoV infections is not performed routinely because it is restricted to
research laboratories, resulting in an underestimated burden of NoV gastroenteritis. This report presents results
obtained after a four year NoV surveillance performed in a Reference Laboratory for Viral Gastroenteritis in Rio
de Janeiro, Brazil, from January 2005 to December 2008. This study aims to investigate the rate of NoV
infection, the clinical aspects and the molecular epidemiology of these viruses as cause of outbreaks and sporadic
cases of acute gastroenteritis in children and adults in the state of Rio de Janeiro.
52
MATERIALS AND METHODS
Study Area – All of the cases enrolled in this study were from the state of Rio de Janeiro, Brazil. The state has a
population of 15,420,375 inhabitants in an area of 43,696,054 km
2
on the coast of the southeast region of the
country and has eight political administrative regions denominated as: Metropolitan, North, Northwest,
Mountains, Central-South, Coastal Lowlands, Middle Paraiba and Isla Grande Bay. The majority of the
population, 11,094,994 inhabitants, lives in the greater metropolitan region of the state, which includes the
capital, Rio de Janeiro and 17 other municipalities (IBGE, 2007).
Case definition – A gastroenteritis case was defined as a clinic manifestation of diarrhea that could be
accompanied with abdominal pain, loss of appetite, nausea, vomiting and discomfort.
Clinical Specimens – An initial universe of 1,687 fecal samples were obtained from patients with gastroenteritis;
324 (19.2%) were rotavirus-positive by
poliacrylamide gel eletrophoresis (PAGE), as previously described
(Pereira et al., 1983), and/or by different
enzyme immunoassay (EIA) methods, such as EIARA
(BioManguinhos, Fiocruz, Ministry of Health, Brazil),
IDEA
®
Rotavirus (OXOID Ltda, England), and
RIDASCREEN
®
Rotavirus (R Biopharm Group, Germany). Among the remainder 1,363 rotavirus-negative
samples, 1,087 samples had enough material to perform PCR in order to detect NoV genome. This included: i)
267 outpatients from outbreaks whose samples were obtained from Municipal Public Health Centers from
different municipalities of the state of Rio de Janeiro, and ii) 820 children hospitalized in two hospitals of the
Rio de Janeiro Municipality, which received patients from municipalities of the greater metropolitan region of
the state.
This study was approved by the Ethical Research Committee/Fiocruz (311/06) as part of a global study
concerning the diagnostic, surveillance and molecular epidemiology of viral acute gastroenteritis.
Fecal suspensions/genome extraction – Fecal samples collected from 2005-2006 (n = 716) had its viral RNA
extracted from 400 µl of a 10% (w/v) fecal suspension in Tris-calcium buffer pH 7.2 with the guanidine
isothiocyanate/silica method, as described by Boom et al. (1990) with modification introduced by Cardoso et al.
(2002). RNA extraction from samples received from 2007-2008 (n = 371) was performed by QIAamp Viral
RNA™ extraction kit (QIAGEN
, Valencia, CA, USA).
Reverse transcription (RT) - Complementary DNA (cDNA) was synthesized using random primer (hexamer
pd[N]
6
– 50 A
260
units – Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) at 42°C for one hour using the High
Capacity cDNA Reverse Transcription™ kit (QIAGEN
, Valencia, CA, USA) with a previous denaturation step
with dimethylsulfoxide for 7 min at 97°C,.
Polymerase chain reaction for Norovirus detection and molecular characterization - For
molecular procedures, four separate rooms were used to avoid cross-contamination of
samples. To
avoid false results, the NoV strain typed previously and Milli-Q water
(Invitrogen
®
, CA, USA) were used in all of the procedures as positive and negative controls,
respectively.
For NoV detection, a set of degenerate primers, MON 431/432 and MON 433/434, designed within the
3`-end of the ORF1 spanning 5305 to 5093 (RNA polymerase/ region B) for the detection of NoV GI and GII,
53
were used according to the PCR conditions described previously (Beuret et al., 2002). PCR products were
resolved on a 1.5% agarose gel during electrophoresis followed by ethidium bromide staining, and the images
were obtained using the image capture system with Labworks 4.0 software (UVP, Inc., Upland, CA, USA).
Samples showing a specific amplicon of 213 bp were considered positive for NoV.
For molecular characterization of NoV strains, a single PCR amplification was performed using a set of
primers that target an ORF-2 fragment, spanning from nucleotides 6738 to 6897 and 6432 to 6684 (region D),
specific for NoV GI and GII, respectively. These primers and PCR reaction conditions were described previously
(Vinjé et al., 2004). The amplicons of 177 bp for GI and 253 bp for GII, obtained in the PCR, were purified
using the QIAquick
PCR Purification Kit (QIAGEN, CA, USA), following manufacturer’s recommendation.
Amplicons were quantified on a 1.5 % agarose gel after electrophoresis using the Low DNA Mass Ladder
(Invitrogen
®
, CA, USA) as a molecular weight pattern. PCR products were sequenced in both directions using
the ABI Prism 3100 Genetic Analyzer and Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1 (Applied
Biosystems, CA, USA) with the same primers used in amplification reactions, as described by Otto et al. (2008).
Centri-Sep columns (Princeton Separations, CA, USA) were used for the purification of the sequencing reaction
products, according to manufacturer’s recommendation. Sequences were aligned and edited using the BioEdit
Sequence Alignment Editor (Hall, 1999) and compared with NoV GII and GI reference strains. GII: M87661-
GI.1-NV-USA93U07611-GII.1-Hawaii-USA94;X81879-GII.2-Msham-GBR95; U02030-GII.3-Toronto-CAN93;
X76716-GII.4-Bristol-GBR93; AJ277607-GII.5-Hilingd-GBR00; AJ277620-GII.6-Seacrof-GBR00; AJ277608-
GII.7-Leeds-GBR00; AF195848-GII.8-Amstdam-NLD99; AY038599-GII.9-VABeach-USA01; AF427118-
GII.10-Erfurt-DEU01; AB074893-GII.11-SW918-JPN01; AJ277618-GII.12-Wortley-GBR00; AY113106-
GII.13-Faytvil-USA02; AY130761-GII.14-M7-USA03; AY130762-GII.15-J23-USA02; AY502010-GII.16-
Tiffin-USA03; AY502009-GII.17-CSE1-USA03. GI: M87661-GI.1-Norwalk-USA93; L07418-GI.2-
Southampton-GBR93; U04469-GI.3-Desert-Shield-USA93; AB042808-GI.4-Chiba-JPN00; AJ277614-GI.5-
Musgrove/89/UK; AF093797-GI.6-Hesse-DEU98; AJ277609-GI.7-Winchester/94/UK; AF538679-GI.8-
Boxer-USA02. Sequences M87661-GI.1-NV-USA93 and U07611-GII.1-Hawaii-USA94 were used as outgroup
sequences for GII and GI analyses, respectively. Phylogenetic tree was constructed by using the MEGA 4
program (Tamura et al., 2007) with the neighbor-joining method, and the genetic distance was calculated by the
Kimura 2-parameters model with 2,000 pseudo-replicas for genotypic strain classification.
Statistical analysis. Rates of norovirus positivity and association between the frequency of symptoms
and the different age groups were compared using the chi-square test. A statistical significance was established at
p< 0.05.
54
RESULTS
NoV was detected in 35.1% (381/1,087) of analyzed stool samples: 30.2% (248/820) were samples
from hospitalized patients and 49.8% (133/267) from outbreak patients (Table 1). There was no statistically
significant difference among NoV-positivity rates of samples extracted through the technique described by
Boom (1990) and the QIAamp kit (240/716 vs. 135/371; p = 0.34, chi-square test).
The percentage of NoV
infection in hospitalized pediatric sporadic cases ranged from 15.3% to 40.4%, while in samples obtained from
outbreaks the percentage ranged from 36.8% to 50.5%, according to the year of analysis. Statistical analysis
revealed that NoV infections were more frequent in outpatient cases (p<0.001) from 2005. In this year, all of the
regions of the state reported NoV outbreaks except for the Central South, North and Coastal Lands. Data from
the largest outbreak, which occurred in 2005 in the Middle Paraiba Region, was published elsewhere (Ferreira et
al., 2008).
During the analyzed period, 24 NoV outbreaks were reported and were distributed as follows: nine
(2005), ten (2006), four (2007) and, one (2008). Two out of the four reported outbreaks in 2007 occurred at the
same Hospital with an interval of four months, being characterized as a nosocomial outbreak. All suspected
cases were from children and they were confirmed as NoV infection. The first outbreak was caused by GII.4
NoV and the other by GII.14. All other reported outbreaks were associated with GII.4, except for one that
occurred in the Middle Paraiba Region (GII.6). In January 2008, the only reported outbreak was an intra familiar
one that involved five individuals, with ages ranging from one year and three months to 61 years old, and NoV
GII.4 was detected in all of them.
After distribution analyses on the cumulative months of NoV infection in hospitalized children, there
was no seasonality pattern observed in those infections. However, two peaks of NoV infection were observed for
outpatients, which reflect the occurrence of outbreaks (Figure 1).
NoV infection was confirmed in all age groups: 47.5% (67/141) were observed in adults and 34.8%
(295/849) in children (p<0.001). Table 2 shows the age groups of cases according to their origin (outpatients
and inpatients).
Clinical manifestations, such as vomiting, fever, and presence of mucus in feces were significantly more
frequent in children infected by NoV. Among adults, fever was less frequent in the patients infected by NoV
(Table 3).
Molecular characterization
In order to perform sequencing for genotype classification, 108 NoV-positive cases were selected
according to the monthly distribution and origin of the sample.
Genogroup GII strains were the most prevalent, totaling 96.3% (104/108) of all sequences analyzed. The GII.4
genotype was the most prevalent over the entire period of analysis with 84 strains (80.7%), followed by GII.6
(nine strains), GII.3 (four strains), GII.14 (five strains) and one strain of GII.7 and GII.8 each. Only four GI
strains were detected, composed of two GI.2 and two GI.3 strains. After considering each year of the evaluated
period, GII.4 was found to be the most prevalent genotype varying from 61% of detection rate in 2007 to 100%
in 2006. A co-circulation of different genotypes was observed in all years analyzed in the present study, but in
2006 (Figure 3).
55
Nucleotide sequence data obtained in this work were submitted to the GenBank database under the
following accession numbers: FJ874636 to FJ874640, FJ874645, FJ874648, FJ874649, FJ874651, FJ874660,
FJ874665, FJ874672, and GU132457 to GU132470.
56
DISCUSSION
The absence of an active surveillance method to identify and report NoV foodborne or
waterborne outbreaks, or even sporadic cases in Brazil, has resulted in an underestimated
burden of these viruses in cases of acute gastroenteritis. Because NoV diagnosis is not
routinely performed in the country, data concerning NoV epidemiology result from studies
performed only by research laboratories that have separately assessed the rate of infection and
genetic diversity of NoV in communities, outpatients or hospitalized children (Parks et al.,
1999; Gallimore et al., 2004; Castilho et al., 2006; Soares et al., 2007; Victoria et al., 2007;
Campos et al., 2008; Ferreira et al., 2008; Ribeiro et al., 2008; Xavier et al., 2009). This four
year long NoV surveillance study enrolled outpatients and inpatients, and assessed the rate,
clinical manifestations and molecular epidemiology of NoV in the state of Rio de Janeiro.
Data from outpatients observed in the current study corroborate previous works that
have associated NoV infection with acute gastroenteritis outbreaks. In the year 2005, the
number of cases from outbreaks attending the ambulatory services was significantly higher
than sporadic cases observed in hospitals. The high percentage of NoV-positive outbreaks
cases that occurred in the Middle Paraiba Region might explain this data (Ferreira et al.,
2008).
Aside from 2005, the frequency of NoV infection in hospitalized patients was much
higher than that observed by Victoria et al. (2007), who observed prevalence of 21%. It was
also higher when compared to data obtained in studies conducted in the United States (12%),
Italy (19%) and Japan (23%) (Okada et al., 2005; Colomba et al., 2006). Furthermore, there
was a significant increase in the rate of NoV infection among hospitalized patients in 2006
that coincided with the implementation of a universal anti-RV-A vaccination in Brazil. In fact,
the frequency of rotavirus-positive children with gastroenteritis was reduced in 2006 in Rio de
Janeiro, Brazil (Carvalho-Costa et al., 2009).
The seasonality pattern of NoV infection is not well understood. Although a few studies found a higher
frequency in winter, others detected a peak in the spring or summer months (Marshall et al., 2003; Parashar et
al., 2004). Here, we observed two peaks of NoV detection in fecal samples obtained from outbreak cases, one in
the end of summer and one in the winter. These periods correspond with dry periods of the year in the analyzed
region and coincide with RV-A seasonal distribution of cases (Leite et al., 2008). These data are in concordance
with the seasonality pattern observed by Hansman et al. (2004) in a study performed in Vietnam. The peaks of
NoV detection in patients coincided with an increasing number of gastroenteritis outbreaks. The present study
was performed over a period of four years, allowing for a reliable seasonal pattern to be studied in the Southeast
region of the country. Despite that, a sesonality pattern in hospitalized patients was not observed in the studied
area.
In this study, differences in the frequency of some symptoms were observed between NoV-positive and
NoV-negative patients. Among children, vomiting and fever were more common among patients infected with
57
NoV. In Spain, a population based study demonstrated that, among patients infected by NoV, the presence of
vomiting was higher among children and adolescents than in adults (Arias et al., 2010). In addition, it has been
reported that NoV gastroenteritis is often severe, requiring hospitalization, being associated with vomiting and
high fever in Mexican children (Gutiérrez-Escolano et al., 2010). It is important to mention that vomiting makes
oral rehydration therapy substantially the more difficult, enhancing the risk of hospitalization. This makes clear
the potential severity of NoV infection among children.
For molecular characterization, the viral capsid protein coding region, region D, which
correlates with the classification of the entire VP1 capsid gene, was used for genotype
classification of the circulating strains (Vinje et al., 2004). In this study, partial sequencing of
the viral capsid gene showed a high prevalence of GII.4 strains, which corroborates previous
works that describe a great incidence and distribution of this genotype worldwide (Bon et al.,
2005; Goodgame R., 2007; Siebenga et al., 2009). GII.4 was responsible for all outbreaks
described in this work, except for two. One of them caused by GII.6 occurred in 2007, in the
Middle Paraiba Region. As described previously, a large GII.4 outbreak was reported in this
region in 2005 and this could have permitted the emergence of a distinct genotype in 2007. In
the other, GII.14 NoV was detected in five hospitalized children at the same infirmary,
characterizing a nosocomial outbreak. At the same hospital, four months later, another
nosocomial outbreak was reported, and all cases were positive for GII.4 NoV. Both outbreaks
highlight the need for effective preventative measures against new cases of gastroenteritis in
closed settings, such as hospitals and nursing homes (Junquera et al., 2009).
Moreover, co-circulation of different genotypes, mainly from GII, was detected; however, no genotype
was detected for more than once, with the exception of GII.4, which was detected in all analyzed years. It is
likely that when GII strains, other than GII.4, arise, the immune response of the population can control the
spread of these strains. The permanence of the GII.4 strains over the years can be explained by the origin of new
variants that emerge and replace the previous predominant variant. Emergence of these variants has been
associated with an increased number of outbreaks worldwide, and might be due to the absence of a heterotypic
immune response (Siebenga et al., 2007; 2009). Although region D protocol has been described as useful for
identifying new GII.4 (Mattison et al 2009), it was not possible to classify variant strains due to the low
bootstrap values obtained when phylogenetic analysis was performed (data not shown); further analysis of the
entire VP1 capsid sequence can elucidate the GII.4 variants circulating in the state of Rio de Janeiro.
The C-terminal region of the VP1 capsid protein, which includes the subdomains P1/P2 and epitopes
that are involved in binding to the cellular receptor, is considered targets for genotyping (Vinjé et al., 2004).
However, 38 samples that were detected with region B primers were negative when analyzed by region D
primers (data not shown). These data suggest that the latter region is less sensitive for PCR detection due to the
occurrence of a mismatch between the primers and the analyzed strains, or to the formation of a secondary
structure in the RNA molecule that affects the amplification efficiency, as previously suggested by Mattison et
al. (2009). Alternatively, the absence of amplified product when using region D primers might be due to possible
recombinant events occurring within the viral genome (Ambert-Balay et al., 2005; Tsugawa et al., 2006; Zheng
et al., 2006).
58
The current study demonstrates the impact of NoV as a causative agent of acute gastroenteritis in both
outpatients and inpatients in the state of Rio de Janeiro, Brazil by a four year long surveillance program. NoV
infection caused hospitalization primarily in children under five years old, as well as outbreaks that affected all
age groups. The implementation of national and international surveillance programs for NoV infection using
network database (Duizer et al., 2008) might assist in tracking outbreaks of acute gastroenteritis and help to
elucidate transmission routes and sources for NoV infection.
59
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ACKNOWLEDGEMENTS
Thanks to the Oswaldo Cruz Institute (IOC)/FIOCRUZ and General Coordination of Public Health
Laboratories/Ministry of Health, Brazil for financial support. The authors also thank the Secretary of Public
Health State of Rio de Janeiro (Epidemiology Service) staff. MP Miagostovich and JPG Leite are fellows of the
Brazilian National Council for Scientific and Technological Development (CNPq).
63
Table 1: Distribution of 1,087 studied cases according to the year and origin of samples.
Year Outpatients Inpatients Total
No. of positive/no.
of studied cases (%)
No. of outbreaks
(Genotypes)
No. of positive/no. of
studied cases (%)
No. of outbreaks
(Genotypes)
No. of positive/no. of
studied cases (%)
2005
55/99 (50.5)
9 (GII.4)
41/267 (15.3)
-
91/366 (24.8)
2006
49/100 (49)
10 (GII.4)
101/250 (40.4)
-
149/350 (42.6)
2007
22/49 (44.9)
2 (GII.4;GII.6)
78/208 (37.5)
2 (GII.4; GII.14)
100/257 (38.9)
2008
7/19 (36.8)
1 (GII.4)
28/95 (29.5)
-
35/114 (30.7)
Total
133/267 (49.8)
22
248/820 (30.2)
2
381/1,087 (35.1)
Table 2: Distribution by age group of norovirus cases of acute gastroenteritis in the state of Rio de Janeiro from
hospital admissions and outpatients cases of Municipal Public Health Centers of the state of Rio de Janeiro.
Years
Outpatients Inpatients
Nº of positive/
Studied samples (%)
Nº of positive/
Studied samples (%)
≤1yrs 136/ 399 (34.1) 19/28 (67.9)
>1yrs≤2yrs 56/167 (33.5) 15/25 (60)
>2yrs-≤ 5 yrs 32/105 (30.5) 12/32 (37.5)
>5yrs-≤10yrs 11/54 (20.4) 14/39 (35.8)
>10-≤ 20 yrs 1/4 11/26 (42.3)
>20yrs≤50yrs 0 38/82 (46.3)
>50 yrs 0 17/29 (58.6)
NI* 3/18 (16.7) 2/7
* Not informed
64
Table 3: Clinical manifestations of norovirus infection cases according to the age group.
* Cough and Coryza.
Clinical manifestations / age group Norovirus positive Norovirus
negative
p-value
Vomiting
Children 179 (60.7) 279 (50.4) 0.004
Adult 32 (47.8) 31 (41.9) 0.483
p=0.075
Respiratory*
Children 85 (28.8) 138 (24.9) 0.218
Adult 4 (6) 1 (1.4) 0.138
p=0.057
Mucus
Children 99 (33.5) 142 (25.6) 0.014
Adult 4 (6) 13 (17.6) 0.034
p=0.153
Fever
Children 87 (29.5) 129 (23.3) 0.023
Adult 12 (17.9) 29 (39.2) 0.005
p=0.184
Dehydration
Children 92 (31.2) 174 (31.4) 0.947
Adult 1 (1.5) 4 (5.4) 0.209
p=0.496
65
Fig. 1: Monthly distribution of cases of acute gastroenteritis associated with norovirus 2005-2008. A: samples
from inpatients; and B: samples from outpatients at the Municipal Public Health Centers of the state of Rio de
Janeiro.
A. B.
Fig. 2: Distribution of norovirus genotypes according to the year of isolation detected in Rio de Janeiro, Brazil,
from 2005 to 2008.
66
4.6 Bayesian coalescent inference reveals high evolutionary rates and expansion of
Norovirus populations
Objetivo:
- Determinar a evolução molecular e a dinâmica populacional dos NV circulantes no
estado do Rio de Janeiro.
Revista: Infection, Genetics and Evolution (2009) 9:927–932
67
68
69
70
71
72
73
5. DISCUSSÃO
O crescente número de relatos de surtos de gastroenterite aguda de veiculação hídrica
associados aos NV tem demonstrado a importância em se determinar o nível de contaminação
por estes vírus em diferentes ecossistemas aquáticos complementando estudos
epidemiológicos ou mesmo fornecendo dados originais, onde estudos com amostras clínicas
ainda não tenham sido realizados (Maunula et al. 2005; Hewitt et al. 2007).
Atualmente, existem diferentes métodos para realizar a concentração viral a partir de
diferentes matrizes aquáticas, sendo eles: ultracentrifugação, ultrafiltração, precipitação e
adsorção-eluição utilizando membranas carregadas eletricamente (Katayama et al. 2002;
Albinana-Gimenez et al. 2006; Rajal et al. 2007). Estes métodos concentram não somente os
vírus como outros agentes presentes nas águas e que podem interferir no momento de realizar
a detecção viral. Estes agentes são inibidores das reações enzimáticas, tais como os ácidos
húmico e fúlvico, carboidratos, assim como os compostos orgânicos utilizados para realizar a
eluição dos vírus do material particulado presente nas amostras de águas ambientais, que são
utilizados em diferentes métodos tais como o método de adsorção-eluição a membranas
carregadas positivamente e o método de precipitação (Abbaszadegan et al. 1993; Sedmak et
al. 2005). No caso da detecção dos NV no ambiente, a escolha do método de concentração é
direcionada, de modo que este não utilize reagentes descritos como inibidores das reações
enzimáticas utilizadas nas metodologias moleculares.
5.1 Avaliação de contaminação ambiental por norovírus
Para realizar a detecção de NV neste estudo foi utilizada a metodologia de concentração
viral baseada na adsorção-eluição dos vírus entéricos presentes em amostras de águas
ambientais à membrana de ésteres de celulose carregada negativamente seguida da eluição
dos vírus da membrana e reconcentração por ultrafiltração. Esta metodologia foi desenvolvida
por Katayama e colaboradores (2002) e tem sido utilizada para a detecção dos NV presentes
em diferentes tipos de ecossistemas aquáticos (Katayama et al. 2002; Haramoto et al. 2004,
2005, 2006). Esta metodologia que utiliza soluções inorgânicas para eluição viral tem sido
descrita como alternativa a métodos que utilizam membrana carregada positivamente e que
realizam a eluição dos vírus da membrana com extrato de carne, descrito como inibidor das
reações moleculares (Katayama et al. 2002).
74
5.1.1 Avaliação da contaminação por norovírus em águas residuárias (Artigo 4.1)
Inicialmente, a metodologia descrita por Katayama et al. (2002) foi aplicada às amostras
de águas residuárias em um estudo para avaliar a contaminação por NV. Com este objetivo
foram realizados ensaios moleculares de detecção em 48 amostras de afluente e efluente
obtidas da ETE localizada no campus da FIOCRUZ na cidade do Rio de Janeiro. Estas
amostras foram coletadas quinzenalmente durante um ano (2004 a 2005) e se encontravam
estocadas a -70
o
C. Para determinar o nível de contaminação de NV nestas águas foi avaliado
o desempenho de três variantes da técnica de PCR (qualitativa, “semi-nested” e quantitativa).
O método qualitativo utilizado para detecção de NV em amostras clínicas não se mostrou
eficiente na detecção destes vírus em um trabalho de campo realizado previamente pelo
grupo. A PCR qualitativa foi utilizada para a detecção dos NV em igarapés na cidade de
Manaus e detectou baixa freqüência de contaminação por NV quando comparada com as
freqüências de detecção dos outros vírus entéricos analisados (Miagostovich et al. 2008).
Análises comparativas realizadas neste estudo demonstraram a qPCR como a metodologia
mais sensível na detecção dos NV quando comparada com as demais técnicas de PCR. O
aumento no percentual de positividade de acordo com a metodologia utilizada destaca que a
escolha do método de detecção para o vírus a ser analisado é essencial, pois como foi
evidenciado no presente trabalho, um método com baixa sensibilidade irá subestimar a
presença e dispersão dos NV no ambiente devido ao número de amostras que apresentam
resultado falso negativo. A combinação do método de concentração viral de adsorção-eluição
utilizando uma membrana carregada negativamente seguido da ultrafiltração e detecção do
genoma viral por qPCR se revelou como uma estratégia para a detecção dos NV em amostras
ambientais. Entretanto, para estudos de epidemiologia molecular, deve-se realizar a “semi-
nested” PCR e sequenciamento do genoma viral. Um estudo desenvolvido por Ferreira e
colaboradores (2009) evidenciou o aumento de sensibilidade na detecção de RV-A por PCR a
partir de águas ambientais, dependendo do gene escolhido para a amplificação genômica
(Anexo 1).
A determinação quantitativa da contaminação por NV também permitiu avaliar a
eficiência de remoção destes vírus pelo processo de tratamento realizado na ETE da
FIOCRUZ. A baixa remoção destes vírus pelo processo de lodo ativado demonstrou que,
apesar do tratamento, o genoma do NV foi detectado nos efluentes originando um risco para a
saúde da população que eventualmente entra em contato com essas águas ambientais. Embora
o RNA simples fita não tenha capacidade infecciosa, a sua presença é indicativa da existência
de partículas infecciosas uma vez que a molécula de RNA livre no ambiente é rapidamente
75
degradada (Meleg et al. 2006). Este foi o primeiro trabalho realizado no Brasil que evidenciou
a resistência dos NV ao tratamento por lodo ativado em uma ETE, demonstrando a
disseminação do vírus no ambiente e o risco para o surgimento de surtos de gastroenterite
aguda na população. Foi evidenciada uma eficiente remoção dos indicadores bacterianos
(99,9%) e uma baixa remoção de HAV (42,3%) pelo tratamento da ETE (Villar et al. 2007).
Diferentes relatos têm evidenciado a baixa remoção dos vírus entéricos pelos diferentes
tratamentos de esgoto realizados em diferentes ETE no mundo (Berg et al. 2005; Haramoto et
al. 2008; He et al. 2008).
A caracterização molecular dos NV forneceu dados epidemiológicos da circulação de
diferentes genótipos deste vírus no ambiente, destacando que estudos epidemiológicos de
virologia ambiental podem ser realizados como alternativa a estudos clínicos uma vez que
refletem a circulação dos genótipos na população local da região.
Em adição aos dados epidemiológicos, estudos de virologia ambiental que incluem
monitoramento virológico de águas ambientais possuem grande repercussão. Atualmente,
existe um consenso de que parâmetros bacterianos clássicos de contaminação fecal não são
suficientes para se determinar o controle microbiológico da água (Wyer et al. 1995; Pusch et
al. 2005).
5.1.2 Avaliação da contaminação por norovírus em diferentes matrizes aquáticas (Artigo
4.2)
No manuscrito “Assessment of norovirus contamination in environmental samples from
Florianópolis City, Southern Brazil” foi realizado um monitoramento de diferentes
ecossistemas aquáticos (água de mar, lagoa, esgoto e consumo) na cidade de Florianópolis,
estado de Santa Catarina afim de se avaliar a contaminação de NV no ambiente. A cidade
possui mais de 40 praias, muitas das quais são utilizadas para o cultivo de ostras comerciais
da espécie Crassostrea gigas, sendo o principal produtor nacional de bivalves (Santos et al.
2009) e o consumo de bivalves contaminados por NV é uma das principais fontes de infecção
e surtos de NV. Desta forma se torna relevante avaliar a contaminação desses vírus nessa
região. Com este propósito, foram realizadas coletas mensais nos diferentes ecossistemas
aquáticos no período de junho de 2007 a maio de 2008. Os NV foram detectados em todos os
tipos de águas analisadas, demonstrando a ampla contaminação e co-circulação de diferentes
genótipos tanto do GI quanto do GII na área geográfica estudada. Este estudo ressalta a
importância do potencial risco para a saúde da população local que entra em contato com
76
estas águas contaminadas, seja pelo consumo ou pela recreação, originando surtos de
gastroenterite de veiculação hídrica, já que a probabilidade de infecção pelo contato com uma
única partícula de NV é de 50% (Teunis et al. 2008). Este foi o primeiro relato de circulação
de NV nos ecossistemas aquáticos na região Sul do país fornecendo dados epidemiológicos
originais a partir de uma abordagem ambiental.
A detecção dos NV foi realizada pela técnica de “semi-nested” RT-PCR descrita por
Boxman e colaboradores (2006), que apresenta maior sensibilidade que a PCR qualitativa
como evidenciado previamente (Artigo 4.2). Esta técnica que permite a determinação do
genogrupo viral pelo sequenciamento do fragmento amplificado foi originalmente utilizada
para a detecção dos NV em ostras provenientes de águas ambientais na Itália. Os GII e GI
foram detectados em amostras de esgoto e de água de mar (La Rosa et al. 2007).
Diferente dos NV GI que circularam esporadicamente, os NV GII foram detectados ao
longo do período estudado, corroborando observações de estudos clínicos de gastroenterite
aguda realizados em outras regiões do país onde os NV GII têm sido detectados ao longo do
ano com maior prevalência do que das estirpes do GI (Castilho et al. 2006; Victoria et al.
2007; Barreira et al. 2010). Entretanto, neste estudo a freqüência de estirpes do GI foi similar
à de GII. Observação similar foi detectada por Berg e colaboradores (2005) onde detectaram
uma freqüente co-circulação no ambiente de estirpes dos GII e GI. Estes diferentes padrões de
prevalência dos genogrupos de NV em amostras clínicas e ambientais poderiam estar
associados à excreção por indivíduos apresentado infecções assintomáticas por NV GI ou
devido à elevada excreção das estirpes do GII quando comparada com as estirpes do GI (Chan
et al. 2006; Bucardo et al. 2008).
Este estudo revelou a ampla disseminação dos NV em diferentes ecossistemas aquáticos
na cidade de Florianópolis, Santa Catarina ressaltando o risco de surtos de gastroenterite
aguda por veiculação hídrica nessa região do país. Simultaneamente à detecção de NV, outro
estudo demonstrou uma ampla circulação de AdV, RV e HAV nas mesmas amostras de águas
ambientais analisadas para NV (Anexo 2; Rigotto et al. submetido).
5.1.3 Avaliação do método de concentração viral em águas ambientais (Artigo 4.3)
A baixa recuperação de NV (Artigo 4.1) e HAstV (Guimarães et al. 2008) observada a
partir de amostras de águas residuárias (ETE-FIOCRUZ) apontou a necessidade de se avaliar
a metodologia de concentração viral utilizando membrana carregada negativamente em
diferentes matrizes aquáticas. Diferentes concentrações de magnésio foram testadas uma vez
77
que a adsorção viral à membrana pelo magnésio consiste em uma etapa crítica nesta
metodologia. Em um estudo experimental, Villar e colaboradores (2006) avaliaram a
concentração viral a partir de amostras de água utilizando membrana carregada negativamente
e uma concentração de cloreto de magnésio (MgCl
2
) de seis mM recuperando o HAV em
água de torneira, mineral e de rio. Porém, não detectaram o HAV a partir de água de mar. Esta
mesma metodologia foi utilizada no trabalho de campo realizado na cidade de Manaus, estado
do Amazonas, onde foi possível detectar RV-A, AdV, HAstV e NV a partir de amostras de
águas de diferentes igarapés daquela cidade (Miagostovich et al. 2008). Naquele momento, a
indisponibilidade de uma metodologia quantitativa não permitiu avaliar a eficiência da
metodologia de concentração viral utilizada. Dando continuidade aos trabalhos na área da
virologia ambiental, a metodologia de qPCR foi implementada para a detecção de NV e
HAstV permitindo avaliar o desempenho desta metodologia frente a diferentes concentrações
de magnésio em diferentes matrizes aquáticas tais como água de consumo (mineral e
torneira), mar e rio (Artigo 4.3). A utilização da qPCR para detecção e quantificação viral,
permitiu determinar a taxa de recuperação viral do método de concentração para estes vírus.
Este estudo demonstrou a recuperação de NV e HAstV a partir dos quatro tipos de águas
estudados, revelando que a concentração de MgCl
2
é crítica para a obtenção de uma maior
recuperação dos vírus estudados variando de acordo com o tipo de água. Diferentemente do
estudo realizado por Katayama e colaboradores (2002) onde não foi adicionado o MgCl
2
à
água de mar, no presente estudo foi evidenciada uma maior recuperação viral quando
utilizada uma concentração de MgCl
2
de 25 mM. Na análise utilizando amostras de água de
rio, a maior recuperação viral foi obtida com cinco mM de MgCl
2
, concentração similar à
utilizada no trabalho realizado nas águas de igarapés em Manaus, onde foi possível detectar
diferentes vírus entéricos (Miagostovich et al. 2008).
5.2 Epidemiologia e evolução molecular dos norovírus no estado do Rio de Janeiro
5.2.1 Estudos de epidemiologia e caracterização molecular dos norovírus no estado do
Rio de Janeiro (Artigos 4.4 e 4.5)
Paralelamente aos trabalhos de detecção de NV em amostras ambientais e em
continuidade ao trabalho realizado em 2004 em casos de gastroenterite infantil aguda
(Victoria et al. 2007), foram realizados estudos de vigilância de NV a partir de amostras
clinicas provenientes de casos de gastroenterite aguda do estado do Rio de Janeiro.
78
Inicialmente, foi realizado um estudo para caracterização molecular dos NV responsáveis por
surtos de gastroenterite aguda ocorridos no ano de 2005 na região do vale do Paraíba do Sul
(Artigo 4.4). Este foi o primeiro relato de um surto de NV analisado por vigilância
laboratorial no estado do Rio de Janeiro. O jogo de iniciadores utilizados para a detecção dos
NV direcionado para a região genômica que codifica a RNA polimerase viral (região B) se
revelou eficiente já que permitiu a detecção de estirpes virais dos GII e GI e apresentou igual
sensibilidade que a detecção realizada pela qPCR (Beuret et al. 2002; Kageyama et al. 2003).
Para realizar a genotipagem do vírus foi necessária a utilização do jogo de iniciadores
direcionado à região genômica que codifica o capsídeo viral denominada região D. Estes
iniciadores permitem a genotipagem dos NV sem a necessidade de se analisar a proteína VP1
completa (Vinjé et al. 2004). Utilizando esta abordagem molecular foi possível demonstrar a
associação do NV GII.4 com os casos de gastroenterite aguda e corroborar a alta freqüência
deste genótipo em surtos de NV, como ocorre mundialmente (Patel et al. 2008).
Posteriormente, com o estabelecimento das metodologias de detecção e caracterização
de NV no “Laboratório de Referência Regional para Gastroenterites de Etiologia Viral” (IOC)
implantou-se rotineiramente a vigilância laboratorial de NV em casos de gastroenterite aguda,
que são negativos para a investigação de RV-A. A realização desta vigilância determinou o
impacto destes vírus nos casos de gastroenterite aguda ocorridos no estado do Rio de Janeiro,
assim como também determinou os genótipos de NV circulantes no estado no período de
2005 a 2008 (Artigo 4.5). Para este fim, foram analisadas amostras fecais de pacientes
hospitalizados provenientes de uma busca ativa realizada em hospitais municipais do estado,
assim como amostras provenientes de atendimento ambulatorial, em sua maioria provenientes
de surtos. As prevalências das infecções por NV em pacientes hospitalizados nos quatro anos
analisados foram elevadas, e, com a exceção da prevalência detectada no ano de 2005, foram
maiores que a observada previamente na cidade do Rio de Janeiro (Victoria et al. 2007).
Infecções por NV foram detectadas em indivíduos de todas as faixas etárias, porém, nos
pacientes hospitalizados, os NV foram mais frequentemente detectados em crianças menores
de cinco anos de idade, confirmando o impacto desse vírus nas hospitalizações de crianças por
gastroenterite aguda (Rockx et al. 2002). Este estudo revelou a co-circulação principalmente
de diferentes genótipos do GII no período analisado como evidenciado previamente por
Victoria e colaboradores (2007), porém nenhum dos genótipos identificados permaneceu por
mais de um ano com a exceção do GII.4. Este genótipo foi prevalente em todos os anos do
período estudado. Provavelmente a ausência de continuidade no tempo dos NV que não
pertencem ao GII.4 seja o resultado da resposta imune montada pelos indivíduos da população
infectada que consegue eliminar estes NV. A permanência do GII.4 pode ser explicada pelo
79
surgimento periódico de novas variantes que emergem e substituem as variantes que
circulavam anteriormente (Siebenga et al. 2009). Estes resultados evidenciaram mais uma vez
a predominância do GII.4 frente aos outros genótipos do GII e do GI e a necessidade de se
aprofundar os estudos de epidemiologia molecular de modo a se estabelecer metodologias que
detectem variantes do GII.4 recentemente descritas (Kroneman et al. 2006; Siebenga et al.
2007; Zheng et al. 2009).
5.2.2 Estudos de evolução molecular dos norovírus no estado do Rio de Janeiro (Artigo
4.6)
Para determinar a evolução molecular e a dinâmica populacional dos NV circulantes
no estado do Rio de Janeiro, foram selecionadas e analisadas amostras do GII.4 caracterizadas
pela vigilância epidemiológica realizada no estado do Rio de Janeiro durante o período de
2004 a 2007 (Artigo 4.6). O estudo do padrão de evolução molecular dos NV revelou que a
região D do capsídeo de 256 nt dessas amostras apresenta alta taxa de mutação similar à
observada em amostras onde se realizou uma análise completa do gene que codifica para a
proteína do capsídeo viral. Estas taxas foram similares às observadas em outros membros da
família Caliciviridae, tal como o FCV e superior às taxas determinadas para outros vírus de
genoma de RNA simples fita considerados de “evolução rápida”, tais como o vírus da hepatite
C e o vírus sincicial respiratório. Este resultado corrobora a alta variabilidade genética que
apresentam os NV humanos isolados em diferentes regiões do mundo (Zheng et al. 2006).
Pela inferência bayesiana do padrão de evolução dos NV determinou-se que a população viral
dos NV no Rio de Janeiro se ajusta ao modelo de crescimento de expansão, assim como
também se identificou o ancestral comum mais recente de todas as variantes do GII.4
analisadas. Este ancestral teria circulado no Rio de Janeiro no ano de 2002 originando as
variantes genéticas do GII.4 que circulam atualmente. Coincidentemente, os diferentes centros
de referência de gastroenterites virais nos países europeus relataram um significativo aumento
nos surtos de gastroenterite aguda causados pelos NV no ano de 2002 (Lopman et al. 2004).
Possivelmente, este aumento no número de surtos tenha ocorrido em países da América do
Sul, porém devido à ausência de vigilância epidemiológica dos casos de gastroenterite aguda
causados por NV na região, esse fenômeno não tenha sido identificado.
Os estudos realizados demonstram que tanto por uma abordagem ambiental quanto
clínica existe uma necessidade de se estabelecer uma rede de vigilância para a detecção e
caracterização dos NV a exemplo das redes americanas e européias visando à compreensão da
80
epidemiologia do vírus. Estas redes auxiliariam no desenvolvimento de uma vacina anti-NV
uma vez que determinariam os genótipos circulantes na região que eventualmente poderiam
ser considerados na formulação de uma vacina multivalente.
81
6. CONCLUSÕES
- O monitoramento na ETE da FIOCRUZ na cidade do Rio de Janeiro demonstrou a
circulação de NV GII e GI com predominância do GII e pico de concentração nos meses de
inverno.
- O processo de lodo ativado demonstrou uma baixa taxa de remoção de NV GI (0,6 log
10
) e
GII (0,3 log
10
) resultando na detecção de NV no efluente e conseqüente disseminação
destes vírus no ambiente.
- A qPCR foi o método mais sensível quando comparado com a PCR qualitativa e a “semi-
nested” PCR, demonstrando que a metodologia molecular utilizada para detecção dos NV
nas águas residuárias é determinante no resultado da taxa de detecção.
- O monitoramento realizado na cidade de Florianópolis evidenciou uma ampla dispersão de
NV GI e GII em diferentes ecossistemas aquáticos, fornecendo os primeiros dados
epidemiológicos sobre a circulação destes vírus na região Sul do país.
- O método de adsorção-eluição viral utilizando membrana carregada negativamente seguido
de ultrafiltração se mostrou eficiente para recuperação de NV em diferentes tipos de
amostras de águas ambientais.
- A concentração de MgCl
2
deve ser considerada para atingir uma recuperação eficiente de
NV a partir de diferentes matrizes aquáticas.
- Os estudos realizados com amostras clínicas demonstraram que o NV GII foi responsável
pelos surtos de gastroenterite aguda observados no estado do Rio de Janeiro enquanto que
o NV GI foi observado em um pequeno número de casos de gastroenterite infantil aguda.
- A caracterização molecular dos NV detectados nos casos de gastroenterite aguda revelou a
co-circulação de genótipos principalmente do GII, com uma predominância do GII.4.
- O estudo de evolução molecular pela inferência de coalescência bayesiana demonstrou
uma elevada taxa de evolução (1,21x10
-2
substituições/sítio/ano) no gene que codifica para
a proteína capsídica VP1 nos NV GII.4 circulantes no estado do Rio de Janeiro detectados
no período de 2004 a 2007; também revelou que a população viral analisada se encontra
atualmente em processo de expansão.
82
7. PERSPECTIVAS
A grande variabilidade genética dos NV e a ausência de cultivo celular para replicação
viral apontam a necessidade de novas abordagens nos estudos de detecção, caracterização e
avaliação de risco de infecção por esses vírus.
A utilização do sistema de microarranjo que utiliza sondas direcionadas a
determinadas regiões do genoma viral permitirá a detecção e caracterização molecular
simultânea dos NV determinando rapidamente os diferentes genótipos circulantes em
amostras clínicas e ambientais.
Paralelamente, a utilização de MNV como modelo para estudar as propriedades físico-
químicas e a replicação dos NV permitirá realizar estudos de avaliação de risco, inativação e
desinfecção viral, visando à prevenção de surtos de gastroenterite aguda.
83
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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90
9. ANEXOS
9.1 Anexo 1: “Environmental dissemination of group A rotavirus: P-type, G-type and
subgroup characterization”.
Revista Water Science & Technology (2009) 60:633-642
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
9.2 Anexo 2: “Assessment of adenovirus, hepatitis a virus and rotavirus contamination
in environmental samples in Florianópolis, south Brazil”.
Revista Water Research, Submetido
102
ASSESSMENT OF ADENOVIRUS, HEPATITIS A VIRUS AND ROTAVIRUS CONTAMINATION IN
ENVIRONMENTAL SAMPLES IN FLORIANOPOLIS, SOUTH BRAZIL
Rigotto, C.
a
; Victoria, M.
b
;
Moresco, V.
a
;
Kolesnikovas, C.K.
a
; Corrêa, A.A.
a
; Souza, D.S.M.
a
; Miagostovich,
M.P.
b
; Simões, C.M.O.
a
; Barardi, C.R.M.
a*
a
Laboratory of Applied Virology, Federal University of Santa Catarina – UFSC, Florianópolis, Brazil.
b
Laboratory of Comparative Virology, Oswaldo Cruz Institute – FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil.
* Corresponding author. Tel: +55-48-37215207. Fax: +55-48-37219258. E-mail address:
ABSTRACT
The importance of water in the transmission of Hepatitis A viruses (HAV), Rotavirus (RV) and Human
Adenovirus (HAdV) and their potential health risks are widely recognized. The aim of the present study was to
assess the presence of these viruses in environmental samples from Florianópolis Island, Southern region of
Brazil. Water samples from various sources and Pacific oysters (Crassostrea gigas) of two growing-areas in the
island were analyzed. Enzymatic amplification (nested PCR and RT-PCR), quantification of HAdV genome
copies and infection assay by integrated cell culture PCR (ICC-PCR) over a one-year period (June 2007 – May
2008) were used to this assessment. From a total of 84 water samples there were 54 (64.2%) positive for HAdV,
16 (19.0%) for RV and 7 (8.3%) for HAV. Viability assays in water samples showed non-positive samples for
HAV, though infectious viruses were confirmed for RV, 2 of 16 (12.5%) and for HAdV, 48 of 54 (88.8%). From
24 oyster samples analyzed by nested PCR or RT-PCR, 87.5% were positive for HAdV, 8.3% for RV and none
for HAV. Quantitative PCR in oysters samples showed means loads of 9.1 x 10
4
gc/g (oyster farm south) and 1.5
x 10
5
gc/g (oyster farm north) and in waters: 3.0 x 10
6
gc/L (lagoon), 8.1 x 10
6
gc/L (lagoon urban runoff), 1.9 x
10
7
gc/L (chlorinated drinking water), 1.1 x 10
7
gc/L (seawater south), 6.3 x 10
6
gc/L (seawater north), 9.7 x 10
6
gc/L (untreated drinking water) and 1.1 x 10
7
gc/L (polluted creek). The high loads of HAdV in the environment
suggest the relevance of evaluating these viruses as indicators of viral contamination of water.
Key words: Environmental samples, HAV, Adenovirus, Rotavirus, ICC-PCR, qPCR, PCR.
103
INTRODUCTION
In highly populated coastal areas, large amounts of treated and untreated human wastewater are
discharged into environmental waters. In recent years, many researchers have demonstrated that the presence of
human enteric viruses in various sources of water samples, such as raw sewage, treated sewage, river water,
seawater and tap water
, may affect the water quality and human health (Formiga-Cruz et al., 2005; Haramoto et
al., 2007). The general demand for high-quality water has increased the pressure on environmental and public
health policies to ensure the microbiological safety of water. To reduce human health risk from waterborne and
water-related illness, water quality standards are established by the W.H.O. and are adopted by most nations
worldwide. Diseases caused by the consumption of bivalve mollusk shellfish containing pathogenic viruses from
human origin are frequently reported, particularly related to raw oysters. Human health problems associated with
shellfish consumption are well described and contaminating viruses have been linked to nearly all episodes of
gastroenteritis as well as outbreaks of illness related to consumption of contaminated shellfish.
Fecal coliform bacteria and other fecal bacterial indicators were established as safety standards to assess
water quality and the sanitary quality of shellfish (Formiga-Cruz et al., 2005). However, it has been clearly
established that bacterial standards do not reveal the presence of viruses in these samples. Moreover, outbreaks
of viral diseases have occurred as a result of the consumption of water and mollusks with accepted values of
coliform standards (Brooks et al., 2005; Le Guyader et al., 2008). On the other hand, improvements in molecular
techniques have been conducted extensively to detect enteric viruses from environmental samples. More
recently, PCR has become a major tool for detection, and various types of viruses have been isolated from water
samples and mollusks, including fastidious viruses (Ko et al., 2005). PCR can also contribute to epidemiological
studies because it is capable of differentiating specific viruses and also different genotypes of the same virus
through the use of specific primers. Nested PCR methods can be applied to increase the sensitivity of the
conventional PCR methods (Van Heerden et al., 2003). However, disadvantages of conventional PCR methods
include the fact that they do not differentiate between viable and nonviable viruses, or between whole virus, full
length DNA and partial-length DNA. Conventional PCR methods only determine the qualitative presence of
viruses and not the quantitative presence of them. In this way, real-time RT-PCR is a powerful and increasingly
popular technique for rapidly detecting and quantifying pathogenic microorganisms in clinical and
environmental samples (Ko et al., 2005). By combining conventional cell culture methods and PCR
amplification to a cell culture-PCR (ICC-PCR) assay, a method was obtained that combined selective
enumeration of infectious viruses with rapid detection. Such ICC-PCR assays have been successfully utilized for
the detection of several other enteric viruses in environmental samples (Reynolds et al., 2004; Ko et al., 2005;
Rutjes et al., 2009). Since only few virus particles are present in water samples, virus detection always requires
the prior concentration of the water sample such as adsorption and subsequent elution from electronegative or
electropositive membranes (Katayama et al., 2002). Recently, there has been much attention given to emerging
viruses because of their low infectious dose, survival in water, and considerable health impacts (from diarrhea to
death). Adenovirus is a member of the Adenoviridae family including 51 human serotypes; the widely diverse
population of adenoviruses infects a broad spectrum of species, including porcine, bovines and birds. Human
adenoviruses (HAdV) are easily detected in sewage and river water with fecal contamination and are reported to
be more stable than enteroviruses when subjected to UV irradiation and chlorination (Thurston-Enriquez et al.,
2003).
Hepatitis A Virus (HAV) is a member of the family Picornaviridae; it is the first etiologic agent of
acute hepatitis in the world and can cause substantial morbidity, principally in developing countries, such as
Brazil (De Paula et al., 2007). Although the prevalence of infection has diminished, outbreaks of the infection
continue to occur. Due to the occurrence of a number of outbreaks as well as isolated cases, HAV is currently
recognized as a significant waterborne human pathogen (Sánchez et al., 2007). Rotavirus (RV) is a member of
the Reoviridae family and has been recognized as the major cause of acute gastroenteritis in young children.
The viruses are excreted in large number in the feces of infected individuals and may be dispersed into
environmental waters. The stability of rotaviruses in environmental water and their resistance to water treatment
may facilitate transmission to humans. Every year, rotaviruses cause 114 million diarrhea episodes and 600,000
deaths in children under 5 years of age (Grimwood and Buttery, 2007). In developing countries acute diarrhea is
an important cause of death and is one of the determinants of malnutrition in children under 5 years of age.
Rotavirus surveillance has been conducted regularly in some areas in Brazil for the last two decades.
Nevertheless, few studies have been conducted in the southern region of the country.
The State of Santa Catarina is a major producer of mollusks in Brazil due to excellent geographical conditions
for marine organism cultures, especially bivalve mollusks such as the oyster specie Crassostrea gigas (Santos,
2001). Moreover, Florianópolis city (27°S, 48°W), composed of one main island, a continental part and
surrounding small islands, has a very important touristic trade due to the natural landscape including more than
40 beaches. The increasing pollution of the coastal waters of Santa Catarina State requires monitoring of cultured
bivalve mollusks to ensure health safety standards. In this study, the distribution of HAV, RV and HAdV was
evaluated in water samples and shellfish from Florianópolis for a one-year period (June 2007 – May 2008), by
enzymatic amplification (conventional PCR), quantification by real time PCR and viability by integrated cell
culture PCR (ICC-PCR).
104
MATERIALS AND METHODS
2.1. Environmental water and oyster samples
A total of 84 water samples (2 L each) were collected monthly over a period between June 2007 to May
2008 in seven different collection sites (Figure 1) in Florianópolis, as follows: seawater was collected from two
different sites of oyster farms, one in the northern (seawater north) and another in the southern (seawater south)
of the island; lagoon brackish water was collected from an important recreational area; urban wastewater thrown
in the former lagoon; two drinking waters (with and without chlorination) and the last site located in a polluted
creek in a suburban area of the city. From June 2007 to May 2008, Pacific oysters (Crassostrea gigas) samples
were collected monthly from two oysters farms, one in the northern region (oyster farm north) and another in the
southern region of the island (oyster farm south). Each sample consisted of 12 oysters that were dissected to
extract the digestive tissue for virological analysis. All water and oyster samples were kept at 4°C in sterile
containers and processed within 24 h of collection.
2.2 Virus concentration method from water samples
Concentration of viruses in water was performed by adsorption in an electronegative membrane and
subsequent elution as described by Katayama et al. (2002) with minor modifications. Treated drinking water was
dechlorinated with 80 mg/L of sodium thiosulfate before filtration step. Water samples were filtered into an HA
(mixed cellulose esters) negatively charged membrane (Nihon Millipore®, Tokyo, Japan) with a pore size of
0.45 µm and 142 mm diameter that was placed into a vacuum pump. Viruses were then adsorbed in presence of
25 mM MgCl
2
(except for seawater). The membrane was rinsed with 350 mL of H
2
SO
4
(0.5 mM, pH 3.0) to
elude cations and subsequently treated for 10 min with 15 mL of NaOH (1.0 mM, pH 10.5) to allow the elution
of viruses. The filtrate was neutralized with 50 µl of 50 mM H
2
SO
4
and 100× TE buffer (pH 8.0) and then
immediately ultrafiltered with a Centriprep Concentrator 50
®
system (Nihon Millipore
®
, Tokyo, Japan) at
1500×g for 10 min at 4
◦
C to obtain a final volume of 2 mL. Four hundred microliters of 2 mL was further used
for nucleic acid extraction. For some samples, an additional step of filtration with AP20 membrane was included
in the procedure when the concentration was carried out in order to eliminate debris.
2.3. Virus concentration method from oyster samples
After sampling, oysters’ shells were opened at the hinge with a sterile oyster knife for digestive tissue
dissection. For the recovery of viral particles, the method described by Lewis and Metcalf (1988) with minor
modifications was applied. Briefly, the solids-adsorbed viruses were eluted from 2 g of hepatopancreas
homogenate (corresponding to tissues derived from three dissected oysters) by resuspension in 10 mL of tryptose
phosphate broth (TPB) dissolved in 0.05 M glycine pH 9.0. The homogenate was purified with an equal volume
of chloroform-butanol (1:1) and centrifuged at 13,500×g at 4°C for 15 min. Viruses in the supernatant were
precipitated with 12% polyethylene glycol (PEG), dissolved in 0.75 M NaCl for 2 h at 4°C and centrifuged at
13,500×g and 4°C for 20 min. Each pellet was resuspended in 3 mL of ultrapure water, and clarified twice with
30% of chloroform.
2.4. Cell lines and viruses
For virus viability assays from environmental water, HAV-cytophatic strain HAF 203, Human AdV 5
(AdV5) (genogroup C, serotype 5) and Simian RV SA11 (group A, serotype G3), were respectively propagated
in a continuous line of fetal FRHK-4 cells (rhesus kidney-derived cells), Hep-2 cells (human larynx carcinoma)
and MA104 cells (a continuous line of fetal rhesus kidney cells).
2.5. Cytotoxicity assays
Cytotoxic assays were performed using 2-fold serial dilution (1:2 to 1:32) in serum-free MEM of
unseeded autoclaved water samples. Plates were incubated and observed for cytotoxic effects after 48h for
MA104 and 72h for Hep-2 cells; and up to a week for FRhK-4 cells. Each observation was compared with
negative controls containing only normal cell monolayer and medium. After the period of incubation, the cellular
integrity was confirmed by removing the medium by suction and staining with 250 µl of naphthalene black
(Sigma - Aldrich, USA) at 0.1% in 5% acetic acid pH 2.3. After 30 min of incubation, the stain was removed by
suction and the cells were air dried and observed under an inverted microscope. The cells were analyzed to
establish the first non-cytotoxic dilution to be used at ICC-PCR.
2.6. Integrated cell culture PCR (ICC-PCR)
ICC-PCR was performed as previously described by Rigotto et al. (2005) and applied to check the virus
viability in environmental water samples previously positive for virus by qualitative PCR. FRHK-4, Hep-2 and
MA104 cells monolayers were prepared in 24-well microplates. The water samples
and the positive controls
(infected cell supernatant of AdV5 or HAV-cytophatic strain HAF 203 or Simian RV SA11) were diluted in
maintenance medium. Inocula were then allowed to adsorb to PBS (150 mM NaCl, 1.5 mM KH
2
PO, 20 mM
Na
2
HPO
4
, 27 mM KCl, pH 7.2)-washed cell-layer for 90 minutes at 37°C with rocking every 15 minutes, and
105
non-adsorbed virus were removed from cell monolayers by washing with PBS for three times.
After incubation
as described above, plates were subjected to three cycles of freeze/thaw for cell lyses and virus releasing. The
supernatant was recovered and 0.5 ml was used for viral genome isolation and PCR detection.
2.7. Nucleic acid extraction
Viral nucleic acids were extracted by a procedure described by Boom et al. (1990). This procedure uses
guanidinium thiocyanate and adsorption of the nucleic acids to silica particles. To reduce the presence of
inhibitors of the PCR reactions, a 10-fold dilution of RNA/DNA of each sample was carried out.
2.8. Enzymatic amplification – qualitative and quantitative PCR
2.8.1. Reverse transcription
The reverse transcription reaction for RNA viruses was performed by using random primer (hexamer
pd(N)
6
- 50 A
260
units - Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) and SuperScript™ III Reverse
Transcriptase (Invitrogen
TM
, CA, USA) following manufacturer’s recommendations.
2.8.2. Qualitative PCR
AdV DNA was detected in samples by using the oligonucleotide primers pair hexAA 1885/hexAA 1913
and nexAA 1893/nexAA 1905 described by Allard et al. (1992). The expected size of the PCR product was 300
bp and 142 bp for nested PCR. HAV RNA was detected in sewage sludge and wastewater samples by nested
RT-PCR, using the oligonucleotide primers pair F6 (+) and F7 (-), which amplifies a 392 bp fragment, suitable
to amplify all HAV genotypes (‘universal primers’). Internal primers were F8 (+) and F9 (-), which amplifies a
247 bp fragment (De Paula et al., 2004). RV RNA was detected in sewage sludge and wastewater samples by
RT-PCR, using the oligonucleotide primers pair VP6-F (+) and VP6-R (-), which amplifies a 379 bp fragment of
the VP6 gene (Iturriza-Gómara et al., 2002).
2.8.3. Quantitative PCR
Oysters samples previously positive by PCR and water samples previously positive by PCR and ICC-
PCR were quantified in duplicate by quantitative PCR (qPCR) using the ABI 7500 Real-Time PCR System
®
(Applied Biosystems, CA, USA) following the manufacturer’s instructions. For the specific detection and
quantification of HAdV genomes, 10 µl of the 10-fold and 100-fold dilutions of every DNA extracted were also
assayed. These dilutions were made to avoid amplification inhibition due to this assay’s high sensitivity to
inhibitors.
The reaction for HAdV consisted of 10 µl of a DNA sample or 10 µl of a quantified HAdV41 cloned in
pBR322 (kindly donated by R. Girones, Barcelona University) in a 25 µl reaction mixture with the PCR Master
Mix (Applied Biosystems, CA, USA). HAdV genomes were quantified with 0.9 µM of primers AdF and AdR
and 0.225 µM of the AdP1 probe described by Hernroth et al. (2002). All samples were run in quadruplicate, and
positive and negative controls were included. The amount of DNA was defined as the average of the
quadruplicate data obtained.
2.9. Quality control
To avoid false positives results from carryover contamination of amplified virus
particles or viral nucleic acid, separate areas and equipment were used for each stage of the
process. Negative controls (non-spiked autoclaved distilled water) and positive controls (virus
suspensions) were included with each set of test samples and taken through nucleic acid
extraction and enzymatic amplification assays. Additional blank controls (containing the same
reaction mixture without the nucleic acid template) were incorporated in all PCR assays.
106
RESULTS
3.1. PCR analysis
3.1.1. Water samples
Water samples were analyzed over one year (Table 1) in order to detect HAdV, HAV and RV by
qualitative nested PCR, nested RT-PCR, and RT-PCR, respectively. From a total of 84 water samples there were
54 (64.2%) positive for HAdV with the highest incidence (75%) in lagoon water and polluted creek and lowest
incidence (33.3%) in non-treated drinking water. RV showed 16 (19.0%) positive waters samples with highest
value of 58% in polluted creek and none positive sample in both drinking waters. HAV achieved a total of 7
(8.3%) positive samples with 16.6% in lagoon, seawater north and non-treated drinking water and none positive
sample in treated drinking water, seawater south and pollute creek. Seasonal distribution of these viruses is
shown in Figure 2. HAV and RV showed a similar seasonal pattern showing higher concentrations in winter
months (July and August 2007) and in summer months (December 2007 and January 2008) (t-test, P < 0.05).
The highest incidence of RV (42.8 %) had occurred in December 2007 and January 2008 with no detection in
June and September 2007 and in May 2008. For HAV the highest incidence was in July and October 2007 (28.6
%) with absence in June, August, September and November 2007, and March to May 2008. On the other hand,
for HAdV there was a widespread distribution in the environment with the highest incidence in July and
November 2007 (100%) and absence only in September 2007. Positive samples by qualitative nested PCR were
further analyzed by ICC-PCR to verify the virus viability in cell culture.
3.1.2. Oyster samples
From the 24 oysters samples analyzed by conventional PCR (Table 2), none of them had amplification
for HAV, 2 of 24 (8.3%) were positive for RV, one from oyster farm north (June 2007) and the other from oyster
farm south (December 2007). For HAdV, at north site 10 of 12 were positive (exceptions were August 2007 and
November 2007) and at south site 11 of 12 were positive (except July 2007). Positive samples for HAdV were
quantified by real time PCR.
3.2. Infection assays (ICC-PCR)
For all environmental waters, the 1:2 dilutions were selected as a non-cytotoxic condition to be used in
MA104, Hep-2 and FRhk-4 cells when ICC-PCR was applied. ICC-PCR was performed to verify viruses
infectivity from the previously positive water samples by qualitative PCR. ICC-PCR results are described in
Table 1. From the 7 previously positive samples for HAV by nested RT-PCR, none of them were positive by
ICC-PCR. However, infectious viruses were confirmed for HAdV, 48 of 54 (88.8%) and for RV, 2 of 16
(12.5%).
3.3. Quantification of HAdV DNA by real time PCR
3.3.1 Water samples
Previously positive samples by qualitative nested PCR were analyzed by quantitative PCR to verify the
HAdV concentration in these samples.
The concentration of virus detected is expressed as genomic
copies (gc) per L, and the results are shown in Figure 3. The levels of HAdV were high in all
samples (mean of sites: 9.8 x 10
6
gc/L), with means loads of 3.0 x 10
6
gc/L (lagoon), 8.1 x 10
6
gc/L (lagoon urban runoff), 1.9 x 10
7
gc/L (chlorinated drinking water), 1.1 x 10
7
gc/L
(seawater south), 6.3 x 10
6
gc/L (seawater north), 9.7 x 10
6
gc/L (untreated drinking water) e
1.1 x 10
7
gc/L (polluted creek).
3.3.2 Oyster samples
Quantitative PCR results for oysters samples are summarized in Table 2. The levels of
HAdV in oyster farm south and north were high (mean of 9.1 x 10
4
gc/g and 1.91 x 10
5
gc/g,
respectively). All negative controls performed in these assays were negative.
107
DISCUSSION
The present study describes the distribution, viability and quantification of HAdV, HAV and RV in
water and oysters samples in Florianopólis Island, southern region of Brazil. The adsorption–elution method
with an HA negatively charged membrane methodology described by Katayama et al. (2002) was used to
process water samples. This method has been used in other studies, including Brazil (De Paula et al., 2007;
Miagostovich et al., 2008) to concentrate water samples for virus detection. It is based on the use of inorganic
solution for virus adsorption and elution, avoiding the use of organic solutions as beef extracts which is well
recognized as an important inhibitor of enzymatic amplification reactions. For oyster samples, we applied the
glycine elution and PEG precipitation method that have been used before in other studies which detected enteric
viruses from natural contaminated oysters (Rigotto et al, 2005).
Environmental samples may contain organic and inorganic compounds (humic acids, polyphenols and
heavy metals) that are toxic and might cause lysis in cell culture. These compounds are also responsible for
forming complexes with nucleic acids and for the inhibition of enzyme amplification. The inhibitory effect was
eliminated in this study by pre-dilution of the purified nucleic acids prior to the RT-PCR reaction as previously
observed (Brooks et al., 2005) to ensure specificity of detection, eliminate any false positive and negative results,
and increase the amplification signal. Two samples became positive for RV and four for HAV (data no shown)
after dilutions in RT-PCR and nested RT-PCR reactions, respectively.
This study demonstrated the occurrence of HAdV, HAV and RV in aquatic environments, showing a
high prevalence of HAdV in water and oyster samples. The primers used for HAdV were designed to detect all
human adenovirus types, and therefore target a conserved region of the hexon gene of human HAdV (Hernroth
et al., 2002). During the survey period, HAdV were detected in all seven kinds of water and at the two oyster
sites (oyster farms north and south), thus showing a widespread in the environmental samples, which is in
accordance with previous studies that have also investigated the presence of HAdV in oyster samples in the same
geographic region (Rigotto et al., 2005).
The monitoring of virus presence in these oyster farms areas is necessary since HAdV were detected
during almost every month of this study and RV in one sample from each site. In addition, HAdV and RV were
detected in two analyzed water sites consequently due to the shellfish filter-feeders characteristics; pathogens
may be concentrated within them, and consumption of raw or undercooked oysters can result in human disease.
Contamination of shellfish due to polluted waters has been a cause of gastroenteritis outbreaks and it has been
well documented since the late 19th and early 20th centuries (Le Guyader et al., 2008). The high prevalence of
HAdV in water and oyster samples indicates that there was no occurrence of seasonality. These results are
consistent with reports from Formiga-Cruz et al. (2005) which found that HAdV are excreted throughout the
year in higher numbers than enteroviruses and HAV. In temperate climate regions the prevalence of HAdV is
higher than in other regions. Although in tropical regions, as in Brazil, HAdV in water have been detected during
all months of the year (Horwitz, 1996). Overall, the prevalence of HAdV in this study was 64.2%, 54 out of the
84 samples. It is well known that virus detection by molecular techniques, without cell culture, indicates only the
presence of viral genome and does not provide any information on infectivity, which is directly related to the
human health risk. Infections assays in this study (ICC-PCR) confirmed the HAdV viability in 88.8%, 48 of 54
samples, same result was achieved with quantitative PCR. Despite carrying out DNA dilutions of HAdV, it was
not detected in 6 samples among the 54 previously tested positive by nested PCR, this may be due to the
presence of high concentration of inhibitors in these samples.
The mean loads of HAdV in this study ranged from 3.0 x 10
6
to 1.9x10
7
gc/L in water samples and from
9.1 x 10
4
to 1.5 x 10
5
gc/g in oyster samples. Less than 1 log difference in viral load was found between all water
samples and also between the samples from the two oyster farms. This viral load could represent a risk of
infections in the population if efficient drinking-water treatment is not applied and if population uses the surface
water as a recreational area. Previous work has shown that there is a poor correlation between levels of viruses
and the current recreational water indicators (Wong et al., 2009). Examination for the presence of viruses in
recreational waters, surface waters, drinking water and oysters is currently not required by legislation in Brazil,
many laboratories around the world perform molecular detection of human enteric viruses in water and shellfish
samples (Katayama et al., 2002; Boxman et al., 2006).
Viral loads results from this study corroborate with those described by Formiga-Cruz et al. (2005)
which showed that HAdV are the most prevalent human viruses detected by PCR in sewage and shellfish. HAdV
have been described as stable in the environment and highly resistant to UV disinfection (Thompson et al., 2003)
and have been found to be prevalent in surface water (Hundesa et al., 2006).
The results for HAdV reported here, support the hypothesis that these viruses are a suitable index for
human viral environment contamination. One of the reasons is the high number of samples which were positive
for HAdV but negative for RV and HAV. RV was more prevalent (58.3%) in polluted creek, similar result
achieved for HAdV so that suggests a possible discharge of non-treated sewage in this creek. RV is shed in
extremely high numbers (up to 10
10
/g) from the feces of infected individuals and can persist in the environment
for extended periods of time (Hamza et al., 2009). Furthermore, RV was confirmed viable (28.6%) in polluted
creek by ICC-PCR, although it has not been found in other samples. This result is also in agreement with Rutjes
108
et al. (2009), which in 55% of the samples, rotavirus genomes were 1,000 to 10,000 times (3 log
10
–4 log
10
) more
abundantly present than infectious rotavirus particles by ICC-PCR.
HAV showed the same prevalence in lagoon water, seawater north and non-treated drinking water
(16.6%), and was also detected in lagoon urban runoff (8.3%), corresponding to 8.3% of all analyzed water
samples. However, applying the ICC-PCR assay, we have not found any positive (viable) HAV. This result
suggests that the serotypes present in positive samples might be from fastidious HAV strains. Moreover, no
samples have been found positive for HAV in oysters. HAV results corroborate with previous studies that
indicate a low endemicity of HAV in southern Brazil (Saback et al., 2001). Other reports of HAV in
environmental samples have also shown a low incidence: 20% in sewage samples (Formiga-Cruz et al., 2005),
and 32% of HAV in raw and treated sewage in Brazil (Villar et al., 2007).
This study with an environmental approach provides data concerning the prevalence, viability and
quantification of enteric viruses in environmental waters and oysters in Florianopolis Island, southern region of
Brazil in order to better understand the distribution of these viruses in this region of the country.
CONCLUSIONS
Florianopólis Island has been adversely impacted by human fecal pollution and levels of pathogens
detected in this study indicate that they might pose a risk to population in contact with the environmental waters
searched. It is therefore particularly important to develop water quality indicators for contamination with human
sewage to address viral risks. This study presents the first surveillance approach for enteric viruses in water
samples in south Brazil.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by grants from the Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq, Council for Scientific and Technological Development, project number
473041/2007-3).
109
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111
Table 1: Detection of RV, HAV and HAdV in environmental waters by qualitative PCR and ICC-PCR, analyzed
from June 2007 to May 2008.
Water sample RV HAV HAdV
RT-PCR ICC-PCR RT-Nested PCR ICC-PCR Nested-PCR ICC-PCR
Lagoon water 16.6 (2/12) 0 (0/2) 16.6 (2/12) 0 (0/2) 75 (9/12) 88.8 (8/9)
Lagoon urban
runoff
8.3 (1/12) 0 (0/1) 8.3 (1/12) 0 (0/1) 66.6 (8/12) 100 (8/8)
Polluted Creek 58.3 (7/12) 28.6 (2/7) 0 (0/12) 0 (0/0) 75 (9/12) 100 (8/8)
Seawater North 25 (3/12) 0 (0/3) 16.6 (2/12) 0 (0/2) 66.6 (8/12) 100 (7/7)
Seawater South 25 (3/12) 0 (0/3) 0 (0/12) 0 (0/) 66.6 (8/12) 85.7 (6/7)
Chlorinated
drinking water
0 (0/12) 0 (0/0) 0 (0/12) 0 (0/0) 66.6 (8/12) 50 (4/8)
Non-treated
drinking water
0 (0/12) 0 (0/0) 16.6 (2/12) 0 (0/2) 33.3 (4/12) 100 (4/4)
Total % Positive 19.0 (16/84) 12.5 (2/16) 8.3 (7/84) 0 (0/7) 64.2 (54/84) 88.8 (48/54)
a
ICC-PCR samples analyzed were selected from previously positive samples tested by nested PCR or RT-PCR.
Results expressed as percentage.
Table 2: Detection of RV, HAV and HAdV in oysters samples by qualitative PCR and quantification of HAdV
by real time PCR analyzed from June 2007 to May 2008.
Oyster sample RV
HAV
HAdV
RT-PCR
a
Nested RT-PCR
a
Nested-PCR
a
Mean (min-max)
b
Oyster Farm South 8.3 (1/12) 0 (0/12) 91.6 (11/12) 9.1x10
4
(1.3x10
4
– 1.9x10
5
)
Oyster Farm North 8.3 (1/12) 0 (0/12) 83.3 (10/12) 1.5x10
5
(3.1x10
4
– 6.0x10
5
)
Total of positives 8.3 (2/24) 0 (0/24) 87.5 (21/24) 100 (21/21)
a
Results expressed as percentage.
b
Results obtained in real-time PCR from previously positive samples tested
by nested PCR or RT-PCR (expressed in gc/g).
112
Figure 1: Map of sampling area. Numbers indicate the collection sites in Florianópolis Island, Southern Brazil. 1-
seawater and oyster farm south, 2- recreational lagoon water, 3- chlorinated drinking water, 4- lagoon urban
runoff, 5- polluted creek, 6- untreated drinking water, 7- seawater and oyster farm north.
Figure 2: Seasonal distribution of RV, HAdV and HAV in environmental waters by RT-PCR, nested PCR and
nested RT-PCR, respectively, over a period from June 2007 to May 2008. Values in percentage of positivity.
113
Figure 3: Concentration of HAdV in water samples by real time PCR analyzed over a period from June 2007 to
May 2008 from previously positive samples tested by nested PCR.
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