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GIOVANA DE SOUZA MAGNANI
ANÁLISE DA BIODIVERSIDADE DE BACTÉRIAS
ENDOFÍTICAS DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR
CULTIVADA NO NOROESTE DO PARANÁ
Tese apresentada como requisito parcial à
obtenção do título de Doutor em Ciências –
Bioquímica, Curso de Pós Graduação em
Bioquímica, Setor de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi de
Souza
Co-orientador: Prof. Dr. Leonardo Magalhães
Cruz
Curitiba
DEZ/2009
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ii
Dedico esse trabalho ao meu filho
Mateus e ao meu esposo Leonardo. O
primeiro que me presenteia todas as manhãs e
brinda todos os finais de tarde com o seu
sorriso, carinho e encanto. Você e o seu papai
fizeram nascer em mim os mais nobres
sentimentos e me fizeram ver que posso muito
mais do que eu imaginava.
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iii
AGRADECIMENTOS
- À coordenação do curso de pós-graduação em Bioquímica e Biologia Molecular,
em nome das professoras Leda Chubtasu e Maria Eugênia Duarte e posteriormente aos
professores Miguel Noseda e Leonardo Cruz, e ao colegiado desse Programa de Pós-
graduação.
- À CAPES e ao CNPq.
- Ao Prof. Fabio de Oliveira Pedrosa, por permitir que eu trabalhasse em seu
laboratório, pelo seu exemplo e pela análise desse trabalho.
- Aos meus orientadores professores Emanuel Maltempi de Souza e Leonardo
Magalhães Cruz, pelas discussões, correções e por toda a atenção a mim dispensadas
durante o Doutorado. Agradeço também pelo exemplo de pesquisadores sérios e
competentes que vocês são para mim e para todos os seus alunos.
- Aos pesquisadores do Departamento de Fitotecnia do Setor de Agrárias da
Universidade Federal do Paraná, Prof. João Carlos Bespalhok, Prof. Edeuclaiton Davos,
e Dr. Heroldo Weber. A esse último, por montar o experimento em Paranavaí e pelas
coletas das plantas.
- Aos Funcionários e amigos D. Julieta, D. Roseli Prado e Valter Baura,
funcionários e amigos queridos e em especial ao Valter pelas inúmeras reações de
seqüenciamento corridas.
- À professora RoseAdele, pela amizade, pelas discussões nas reuniões de
grupo e pelo empenho pessoal em me ajudar a construir as bibliotecas.
- À professora Maria Berenice, pela amizade e apoio, por sua dedicação ao
laboratório e pela correção desse trabalho.
- À professora Cyntia Pichetch, pela amizade e incentivo ao meu trabalho e pela
avaliação da tese.
- Aos amigos do grupo de discussão de Biodiversidade e Metagenômica, em
especial ao Helisson, pelas discussões, trocas de experiências, por toda a paciência,
iv
amizade e boa vontade a mim dedicadas. E, aos amigos Giovani, Rafael, Arnaldo e
Vivian pelas discussões, pelo apoio e amizade.
- Aos colegas da sala 279, muitos passaram por lá...André Luiz, Marco Aurélio,
Larissa (s), Ju Osaki e aos atuais Marco Antonio, Vivian, Fabi, Marina e Leandro.
Obrigada pela amizade, pela paciência e pela torcida !!!!!
- Aos colegas da 275, Vânia, Giovana e Gus.
- Ao pessoal do Anexo: Michelle Sfeir, Tuca, Anelis, Arnaldo, Vivi, Stefania,
Rafael Ioris, Daniela Seixas, Roseli Wassen, pelos empréstimos de cubas, fluxo,
enzima, etc e por todo o carinho e amizade.
- Às amigas de coração, de luta, de lágrimas, e de muitos risos: Ju Inaba, Paty
Castelen, Liziane, Tati Herrerias, Ana Helena, Fernanda Pacheco, Ana Claudia, Márcia
Heidmann...Com vocês eu entendi que os frutos do doutorado não só os resultados
mas também os fortes laços de amizade e companheirismo que aqui nascem e não se
perdem jamais. Obrigada por tudo amigas. E aos meninos-irmãos de turma Marcelo
Muller e Gustavo.
- Aos demais professores e amigos do Núcleo de Fixação de Nitrogênio,
obrigada pelo carinho, pela torcida e pela amizade.
- Ao Prof. Humberto Madeira, por permitir que eu iniciasse os meus estudos de
biologia molecular em seu laboratório e por incentivar o meu crescimento profissional.
- Aos meus pais, amados, dedicados, abençoados. Para fazer justiça à
importância de vocês na minha vida e no meu trabalho, outra tese deveria ser escrita...
em mais umas 100 páginas quem sabe eu conseguiria agradecer à altura do amor, da
importância e da dedicação que vocês tiveram e tem comigo e com a minha família.
Agradeço a Deus todos os dias por vocês existirem, por serem esses pais e avós tão
doces, presentes e preocupados. Amo vocês.
- Aos meus irmãos queridos; a vida adulta, a nova família e os compromissos
particulares tomam parte do nosso tempo, mas não desfazem a ligação que temos. Não
v
rompe o compromisso que espontaneamente assumimos um com o outro, de estarmos
sempre ligados, torcendo um pelo outro, comemorando cada vitória pessoal como se
fosse dos três. Obrigada pelo carinho, pelo apoio, pelas orações. Nem 10.000 km de
distância vão romper isso. Amo vocês.
- Aos meus sogros e cunhados pelo apoio, pelas orações, pela torcida.
- Aos meus avós, pela torcida, carinho e orações constantes.
- Ao meu esposo e colaborador Leonardo, outra tese deveria ser escrita só para
lhe agradecer...Você que foi que é o meu co-orientador, colaborador, amigo, super-pai,
meu companheiro de dupla, tripla, quádrupla jornada... Obrigada pela dedicação,
atenção, carinho e todo o amor dedicados a mim, a minha tese, ao nosso filho. Sem
você nada seria possível, nada teria graça... Amo você.
- Ao meu filho, lindo, abençoado e amado. Obrigada por aceitar ficar com a vovó,
ir para a escolinha, enquanto a mamãe trabalha. Você que mesmo antes de nascer já
entendia de bactérias, clones e PCRs...Você é um anjinho na minha vida, um presente
divino. Mamãe ama muito você e promete estar mais tranquila a partir de agora.
- A Deus, por me guiar e me abençoar. Obrigada por colocar todas essas
pessoas no meu caminho e mostrar a importância de cada uma delas na minha vida
através dos desafios e alegrias que surgiram durante esse período.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.................................................................................. x
LISTA DE TABELAS ................................................................................. xii
RESUMO ................................................................................................... xiii
ABSTRACT ................................................................................................ xiv
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................15
1.1 BIODIVERSIDADE BACTERIANA ...........................................................................15
1.2 DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS.....................................................18
1.3 BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS FIXADORAS DE NITROGÊNIO.................................22
1.4 BACTÉRIAS ASSOCIADAS À CANA-DE-AÇÚCAR ................................................24
1.5 MÉTODOS MOLECULARES PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA ....................25
1.5.1 GENES UTILIZADOS NA INFERÊNCIA FILOGENÉTICA .........29
1.6 FILOGENIA DO DOMÍNIO BACTERIA ....................................................................31
1.6.1 FILO PROTEOBACTERIA..........................................................34
1.6.1.1 CLASSE γ-PROTEOBACTERIA ...........................................35
1.6.1.1.1 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE...............................35
1.6.1.1.2 FAMÍLIA PSEUDOMONADACEAE.................................36
2 JUSTIFICATIVA ......................................................................................38
3 OBJETIVOS............................................................................................39
3.1 OBJETIVO GERAL: .................................................................................................39
4 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................40
4.1 ESTIRPE DE ESCHERICHIA COLI E PLASMÍDIO UTILIZADOS ...........................40
4.2 MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES DE CULTIVO .............................................40
4.2.1 ANTIBIÓTICOS ..........................................................................43
4.3 PLANTIO E COLETA DE CANA-DE-AÇÚCAR EM PARANAVAÍ-PR...................... 43
4.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR.....................48
4.5 EXTRAÇÃO DO DNA DE EXTRATOS DE COLMOS DE CANA-DE-AÇÚCAR.......48
vii
4.6 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS...............................................................................49
4.7 AMPLIFICAÇÃO DO GENE 16S RRNA A PARTIR DO DNA EXTRAÍDO DE PLANTAS
DE CANA-DE-AÇÚCAR..............................................................................................49
4.8 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DOS GENES 16S RRNA.................................50
4.8.1 PREPARO DE CÉLULAS ELETROCOMPETENTES ................51
4.8.2 ELETROTRANSFORMAÇÃO BACTERIANA .............................51
4.8.3 COLETA DOS CLONES TRANSFORMANTES .........................52
4.8.4 PURIFICAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL EM PLACAS DE 96 POÇOS
52
4.8.5 PURIFICAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL EM COLUNA SEPHADEX G-
50 53
4.9SEQUENCIAMENTO DE DNA PLASMIDIAL............................................................54
4.10 ANÁLISES DE SEQUÊNCIA..................................................................................55
4.10.1 PESQUISA DE HOMOLOGIA DE SEQUÊNCIA.......................57
4.10.2 ANÁLISES FILOGENÉTICAS ...................................................57
4.10.3 NOMENCLATURA DAS BIBLIOTECAS E DOS CLONES........58
4.11ESTIMATIVAS DE DIVERSIDADE .........................................................................59
4.11.1COBERTURA DA BIBLIOTECA........................................................................59
4.11.2CURVA DE RAREFAÇÃO E DO COLETOR ..................................................59
5 RESULTADOS ....................................................................................61
5.10 ANÁLISE DA DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ASSOCIADAS À
CANA-DE-AÇÚCAR POR MÉTODO INDEPENDENTE DE CULTIVO.......................61
5.10.1COLETA DAS PLANTAS DE CANA-DE-AÇÚCAR VAR RB72454
61
5.10.2 EXTRAÇÃO DE DNA DO MATERIAL VEGETAL .....................62
5.11 AMPLIFICAÇÃO DO GENE 16S RRNA A PARTIR DO DNA EXTRAÍDO DA CANA-
DE-AÇÚCAR...............................................................................................................64
viii
5.12 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DO GENE 16S RRNA AMPLIFICADO DE DNA
EXTRAÍDO DE TECIDO DE CANA-DE-AÇÚCAR ......................................................67
5.13 EXTRAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL PARA SEQUENCIAMENTO.........................70
5.14 SEQUENCIAMENTO DAS BIBLIOTECAS DO GENE 16S RRNA.........................73
5.15 ESTATÍSTICAS DE SEQUENCIAMENTO.............................................................73
5.15.1 ANÁLISES DE QUALIDADE .....................................................77
5.16 COMPARAÇÃO ENTRE AS SEQUÊNCIAS OBTIDAS DE BACTÉRIAS
ENDOFÍTICAS PRESENTES NA CANA DE AÇÚCAR COM BANCO DE DADOS....81
5.16.1 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DE 16S RRNA DA AMOSTRA CA01
..................................................................................................81
5.16.1.1 ANÁLISE PELO PROGRAMA BLASTN .............................81
5.16.2 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DO GENE 16S RRNA DA
AMOSTRA CA22.................................................................................................85
5.16.3 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DO GENE 16S RRNA DA
AMOSTRA CA23.................................................................................................90
5.16.4 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DO GENE 16S RRNA DA
AMOSTRA CA62.................................................................................................91
5.16.5 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DO GENE 16S RRNA DA
AMOSTRA CA63.................................................................................................91
5.17 ANÁLISES FILOGENÉTICAS DAS BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ASSOCIADAS À
CANA-DE-AÇÚCAR OBTIDAS POR MÉTODO INDEPENDENTE DE CULTIVO ......92
5.18 ESTIMATIVAS DE DIVERSIDADE ......................................................................101
5.18.1 COBERTURA DA BIBLIOTECA..............................................101
5.19 CURVA DE RAREFAÇÃO E CURVA DO COLETOR ..........................................101
5.20 ANÁLISE DA DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ASSOCIADAS À
CANA-DE-AÇÚCAR POR MÉTODO DEPENDENTE DE CULTIVO.........................104
ix
5.20.1 ISOLAMENTO E CONTAGEM DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS EM
CANA-DE-AÇÚCAR RB-72454 (AMOSTRA CA01)..........................................108
6 DISCUSSÃO......................................................................................109
7 CONCLUSÕES..................................................................................114
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................115
9 ANEXOS............................................................................................128
10 ÍNDICE DOS ANEXOS .....................................................................129
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 ÁRVORE FILOGENÉTICA REPRESENTANDO OS TRÊS DOMÍNIOS DA VIDA
PROPOSTOS POR WOESE E COLABORADORES (1990)........................................................
17
FIGURA 2 ESTRUTURA SECUNDÁRIA DA MOLÉCULA DE 16S rRNA da bactéria Escherichia
coli ...................................................................................................................................................
30
FIGURA 3 ÁRVORE FILOGENÉTICA DO DOMÍNIO BACTERIA (KELLER E ZANGLER,
2004)..............................................................................................................................................
33
FIGURA 4 VISTA DOS BLOCOS...................................................................................................
45
FIGURA 5 VISTA DAS FILEIRAS DO BLOCO QUE NÃO RECEBEU ADUBAÇÃO......................
45
FIGURA 6 ETAPAS PARA DETERMINAÇÃO DA DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS
ENDOFÍTICAS DE CANA-DE-AÇÚCAR........................................................................................
46
FIGURA 7 FLUXOGRAMA DAS ANÁLISES DE SEQUÊNCIA PARCIAIS DO GENE 16S rRNA
........................................................................................................................................................
56
FIGURA 8 DNA EXTRAÍDO DAS AMOSTRAS DE CANA-DE-AÇÚCAR ......................................
63
FIGURA 9 PRODUTO DE AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO 27f-1492r DO GENE 16S rRNA DE
EXTRATOS DE CANA-DE-AÇÚCAR.............................................................................................
65
FIGURA 10 PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO UTILIZANDO O PAR 27f-16S805r DE DNA
EXTRAÍDO DE TECIDOS DE CANA-DE-AÇÚCAR.......................................................................
66
FIGURA 11 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DE PRODUTOS DE RESTRIÇÃO COM
EcoRI DOS CLONES DE BIBLIOTECA CA22 DE 16S rRNA DE CANA-DE-AÇÚCAR.................
69
FIGURA 12 DNA PLASMIDIAL PURIFICADO PARA SEQUENCIAMENTO DA BIBLIOTECA
CA22.................................................................................................................................................
71
FIGURA 13 DNA PLASMIDIAL DA BIBLIOTECA CA22 PURIFICADO POR GEL FILTRAÇÃO
EM SEPHADEX G-50.....................................................................................................................
72
FIGURA 14 DISTRIBUIÇÃO DOS COMPRIMENTOS DE SEQUÊNCIA .......................................
78
FIGURA 15 DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DAS SEQUÊNCIAS COM VALOR DE PHRED >20
.................................................................................................................................................
79
xi
FIGURA 16 DISTRIBUIÇÃO SEQUÊNCIAS DE ACORDO COM VALOR PHRED DE
QUALIDADE ..................................................................................................................................
80
FIGURA 17 ALINHAMENTO ENTRE AS SEQUÊNCIAS DOS GENES DE 18S RRNA DE
MITOCÔNDRIA DE SORGHUM BICOLOR E DE 16S RRNA DE ESCHERICHIA COLI...............
87
FIGURA 18. ANÁLISE FILOGENÉTICAS DAS SEQUÊNCIAS DOS CLONES DAS
BIBLIOTECAS DE 16S rRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR..............................................
94
FIGURA 19 ANÁLISE FILOGENÉTICAS DAS SEQUÊNCIAS DOS CLONES DAS
BIBLIOTECAS DE 16S rRNA DE COMO DE CANA-DE-AÇÚCAR IDENTIFICADOS COMO
ENTEROBACTÉRIAS.....................................................................................................................
96
FIGURA 20 ANÁLISE FILOGENÉTICAS DAS SEQUÊNCIAS DOS CLONES DAS
BIBLIOTECAS DE 16S rRNA DE COMO DE CANA-DE-AÇÚCAR IDENTIFICADOS COMO DA
FAMÍLIA PSEUDOMONADACEAE................................................................................................
98
FIGURA 21 ANÁLISE FILOGENÉTICAS DAS SEQUÊNCIAS DOS CLONES DAS
BIBLIOTECAS DE 16S rRNA DE COMO DE CANA-DE-AÇÚCAR ..............................................
100
FIGURA 22 CURVA DE RAREFAÇÃO DA BIBLIOTECA DE GENES 16S rRNA DA AMOSTRA
CA0101...........................................................................................................................................
102
FIGURA 23 CURVAS DO COLETOR DA BIBLIOTECA DE GENES 16S rRNA DA AMOSTRA
CA0101............................................................................................................................................
103
FIGURA 24 ANÁLISE FILOGENÉTICA DOS ISOLADOS DE CANA-DE-AÇÚCAR
IDENTIFICADOS COMO DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE................................................
107
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 PRINCIPAIS TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS NO ESTUDO
DA DIVERSIDADE BACTERIANA ...........................................................................
28
TABELA 2 GÊNEROS ENCONTRADOS NAS DIFERENTES CLASSES DAS
PROTEOBACTÉRIAS...............................................................................................
34
TABELA 3 ANTIBIÓTICOS UTILIZADOS.................................................................
43
TABELA 4 INICIADORES UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE 16S
rRNA..........................................................................................................................
50
TABELA 5 AMOSTRAS DE CANA-DE-AÇÚCAR UTILIZADAS PARA AS
ANÁLISES DE DIVERSIDADE .................................................................................
62
TABELA 6 BIBLIOTECAS DO GENE 16S rRNA AMPLIFICADO DE DNA
EXTRAÍDO DE TECIDO DE CANA-DE-AÇÚCAR ...................................................
68
TABELA 7 NÚMERO DE CLONES SUBMETIDOS AO SEQUENCIAMENTO POR
BIBLIOTECA ................................................................................................
............
73
TABELA 8 RESUMO DO SEQUENCIAMENTO DAS BIBLIOTECAS DO GENE
16S rRNA.................................................................................................................
75
TABELA 9 IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DO COLMO DE
CANA-DE-AÇÚCAR DA AMOSTRA BIBLIOTECA CA01 COM BASE NA
SEQUÊNCIA DO GENE 16S RRNA....................................................................
83
TABELA 10. IDENTIFICAÇÃO COM BASE NA SEQUÊNCIA DO GENE 16S
rRNA DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DO COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR
BIBLIOTECA CA0115..........................................................................................
84
TABELA 11 RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO DA AMOSTRA CA22.........
85
TABELA 12 RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO DA AMOSTRA CA23.........
90
TABELA 13 RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO DA AMOSTRA CA62..........
91
TABELA 14 RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO DA AMOSTRA CA63.........
92
TABELA 15 RESULTADOS DA BUSCA POR IDENTIDADE DE SEQUÊNCIAS
REALIZADA PELO PROGRAMA BLASTn DAS SEQUÊNCIAS ISOLADAS DE
CANA-DE- AÇÚCAR.................................................................................................
106
xiii
RESUMO
Bactérias endofíticas são encontradas no interior dos tecidos da maioria das
espécies de plantas e podem trazer benefícios, como fixação de nitrogênio, produção
de fitormônios e controle biológico de patógenos. No presente trabalho a diversidade
bacteriana endofítica da cana-de-açúcar foi analisada por métodos independentes de
cultivo e comparada com aquela previamente obtida através de metodologia
dependente de cultivo. Os colmos de plantas vindas da Estação Experimental da UFPR
localizada em Paranavaí foram externamente desinfectados, macerados e usados para
a extração de DNA. O DNA purificado foi utilizado como molde para a amplificação do
gene 16S rRNA utilizando os conjuntos de oligonucleotídeos iniciadores 27f e 16805r e
27f e 1492r. Esses pares amplificam, respectivamente, a porção inicial (800 pb) e todo o
gene 16S rRNA (1500 pb). Os amplicons foram então clonados no vetor PCR 2.1. Dois
mil cento e doze clones foram coletados e os insertos de 866 clones foram
sequenciados e analisados. A maioria das sequências apresentou alta identidade (mais
que 91%) com sequências do gene 16S rRNA do filo Proteobacteria. Uma alta
prevalência de representantes da classe γ-Proteobacteria foi observada, com
dominância das famílias Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. Dentro das
enterobactérias, foram encontradas bactérias relacionadas aos gêneros Enterobacter sp
Pantoea sp, Klebsiella sp, Serratia sp e Citrobacter sp. A família Pseudomonadaceae foi
representada pelo gênero Pseudomonas sp. Apenas seis sequências foram
identificadas como α-Proteobacteria e uma como β-Proteobacteria. Vinte e duas
sequências apresentaram alta identidade com genes 16S rRNA de bactérias não-
cultivadas, mas foram re-classificadas como Enterobactérias. Resultados semelhantes
foram observados com os métodos dependentes de cultivo. Esses resultados revelam
uma diversidade diferente da classicamente observada em cana-de-açúcar, mostrando
que há nessa planta um potencial reservatório de organismos ainda a ser explorado e
que, a comunidade bacteriana endofítica pode variar de acordo com o genótipo da
planta analisada e também com sua localização geográfica.
xiv
ABSTRACT
Endophytic bacteria are found in inner tissues of most plant species and can promote
benefits such as nitrogen fixation, phytohormone production and biological control of
pathogens. In the present work the bacterial diversity of sugarcane endophytes was
analyzed by cultivation-dependent and independent methods. Stem of sugarcane from a
commercial crop located in the Northwest of the Parana state (Brazil) was externally
disinfested, ground and subjected to DNA extraction. The purified DNA was used as a
template for amplification of the 16S rRNA gene using primers 27f and 805r and 27f and
1492r. The amplicons were then cloned into the pCR 2.1 vector. Two thousand and one
hundred twelve clones were collected, and the inserts of 866 clones were sequenced
and analyzed. The majority (99%) of the sequences were similar (more than 91%
identity) to Proteobacteria 16S rRNA gene. The highest prevalence were of
representatives of the gama-Proteobacteria such as from Pseudomanadaceae and
Enterobacteriaceae families. Among the latter were found the genera Enterobacter sp,
Pantoea sp, Klebsiella sp, Serratia sp and Citrobacter. The Pseudomonadaceae family
was represented by Pseudomonas genus. Sequences with high identity to the alpha-
Proteobacteria Devosia sp, Roseomonas sp, Asaia sp and the beta-Proteobacteria
Alcaligenes sp were also found. Twenty-two sequences showed high identity with
sequences from uncultured bacteria but they were classified as Enterobateriaceae.
Similar results were observed with the culture-dependent method. The results reveal a
rich diversity of bacteria in the stem of healthy sugarcane, with some taxons not
described in this plant yet.
1 INTRODUÇÃO
1.1 BIODIVERSIDADE BACTERIANA
O termo biodiversidade diz respeito à organização biológica como um todo,
abrangendo um nível que vai do macroscópio ao molecular. Esssa definição inclui a
variedade de espécies nos ecossistemas (riqueza), variabilidade genética dentro de
cada espécie (conjunto de genes em uma determinada espécie) e sua relativa
abundância das espécies no seu habitat natural (SPANGENBERG, 2007).
O termo biodiversidade esteve por muito tempo diretamente relacionado às
espécies vegetais existentes nos ecossistemas de florestas, à diversidade de espécies
de insetos e também muito ligada às questões da diminuição da biodiversidade pelos
processos de desmatamento e aquecimento global. Organismos procarióticos eram
pouco considerados nesse contexto. Com os trabalhos de Woese e colaboradores na
década de 90, as bactérias ganharam maior evidência, constituindo uma das três
divisões nas quais todos os seres vivos foram re-classificados (WOESE et al., 1990).
Essa nova proposta de classificação foi feita baseada em dados moleculares e não
morfológicos. Atualmente, técnicas de Biologia Molecular que permitem a extração e
sequenciamento de DNA diretamente de amostras ambientais permitem o estudo da
comunidade microbiana dependente ou não de cultivo, estendendo o termo
biodiversidade também para este grupo de organismos.
Uma estimativa da diversidade microbiana é essencial para o entendimento da
função dos microrganismos nos ecossistemas (OVREAS e TORSVIK, 1998). Entender
essa função se faz necessário porque muitos dos processos ambientais que sustentam
a vida no planeta, tais como ciclagem de nutrientes, fixação de carbono e de nitrogênio,
decomposição de matéria orgânica, entre outros, são realizados com a participação
16
indispensável dos microrganismos (DÖBEREIBER 1992, BEL et al., 2005).
Um dos aspectos mais notáveis das bactérias é a sua onipresença. Elas
colonizam uma grande variedade de habitats, daqueles que oferecem condições
brandas e ricas em nutrientes até os mais extremos. Elas habitam solos, lagos,
oceanos, outros organismos, fontes termais (com temperaturas perto do ponto de
ebulição) e também são encontradas no fundo de geleiras e quilômetros abaixo da
superfície terrestre (LOVELAND-CURTZE et al., 2009).
Há quase duas décadas atrás era impossível acessar essa diversidade
microbiana. Porém, com o desenvolvimento de técnicas de identificação molecular
independente de cultivo e o uso de moléculas que funcionam como marcadores
evolucionários os estudos de diversidade de microrganismos tornou-se viável e vem
contribuindo enormemente para o conhecimento do papel dos microrganismos no
ecossistema e para sua taxonomia. Os 5 reinos (Animalia, Plantae, Fungi, Protista e
Monera) propostos seguindo a taxonomia Lineana tradicional, baseada em dados
morfológicos e fisiológicos (WHITTAKER, 1969) foram divididos em três grandes
grupos taxonômicos (Domínios), Archaea, Bacteria e Eucarya, dentre os quais os dois
primeiros são procariotos: Bacteria e Archaea (Figura 1). Essa nova divisão
taxonômica traz a tona uma nova perspectiva: a maior parte da diversidade genética do
planeta vem das formas de vida microscópicas (HUGENHOLTZ e PACE, 1996).
17
FIGURA 1. ÁRVORE FILOGENÉTICA REPRESENTANDO OS TRÊS DOMÍNIOS DA
VIDA PROPOSTOS POR WOESE E COLABORADORES (1990)
Árvore filogenética universal modificada mostrando os três domínios. O comprimento e ordem dos ramos
são baseados em comparação de sequências do gene 16S rRNA. A posição da raiz foi determinada ao
se comparar sequências de pares de genes parálogos que divergiram antes que as linhagens primárias
emergissem de sua condição ancestral comum.
Os microrganismos procariotos (Bactéria e Arqueabactérias) apresentam uma
grande diversidade genética e desempenham funções cruciais na manutenção dos
ecossistemas, sendo componentes fundamentais de cadeias alimentares (MYERS,
1996). São considerados também como verdadeiros reservatórios para o
descobrimento de novas drogas e processos metabólicos (CURTIS & SLOAN, 2005).
Ao estimar o número total de procariotos no planeta (4-6 x 10
30
células) e a
quantidade total de seu carbono celular (355-550 x 10
9
toneladas), Whitman e
colaboradores especularam que a quantidade total de carbono estocada em todas as
células procarióticas na Terra correspodem à 60-100% do carbono total estimado como
presentes nos vegetais (WHITMAN et al., 1998). A extrapolação de resultados obtidos
em vários estudos sugere que 1 grama de solo contém cerca de 10 bilhões de
18
procariotos pertencentes a milhares de espécies diferentes (ROSSELÓ-MORA e
AMANN, 2001).
Apesar da sua importância a diversidade e ecologia microbiana são pouco
conhecidas. Estima-se que grande parte dos microrganismos que existem na natureza
não possam ser cultivados pelos métodos tradicionais (AMANN et al., 1995). Como os
métodos de classificação microbiana clássicos requerem o isolamento e cultivo do
microrganismo, a maioria das espécies bacterianas são formalmente desconhecidas.
Conforme já mencionado, técnicas que permitam a identificação dos microrganismos
sem a necessidade de cultivo tem sido desenvolvidas e amplamente utilizadas para
esse fim (AMANN et al., 1995).
1.2 DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS
As plantas são responsáveis por parte da fixação de CO
2
atmosférico na
Terra, que é feita também por algas e bactérias fotossintetizadoras. A energia solar
capturada pelas plantas as habilita a reduzir o carbono contido no CO
2
e a sintetizar
compostos orgânicos. Por isso, os seres fotossintetizadores representam as maiores
fontes de carbono, nitrogênio e energia para os microrganismos heterotróficos.
Em particular, plantas são bastante atrativas como fontes de nutrientes para
as bactérias (VANDENKOORNHUYSE et al., 2007), constituindo um verdadeiro
ecossistema microbiano. Os diferentes nichos das plantas hospedeiras como a
superfície de raízes e folhas e o interior de diversos tecidos vegetais podem ser
ocupados por bactérias.
Entretanto, para a maioria das bactérias, o interior e mesmo o exterior das
plantas são territórios proibidos por conta dos compostos antimicrobianos como
terpenóides, benzoxazinona e particularmente flavonóides e isoflavonóides, que são
produzidos (principalmente pelas raízes) (BAIS et al., 2006). Bactérias endofíticas são
19
definidas como aquelas que vivem no interior das plantas sem causar danos visíveis
(HALLMANN et al., 1997). Essas bactérias conseguem penetrar na planta, em geral
através das raízes, mas também pelos estômatos e pelas partes aéreas, como as
flores, caules e cotilédones. Uma vez dentro da planta, podem colonizar o entorno
ponto de entrada ou se dispersar de forma sistêmica (HALLMANN et al. 1997; ZINNIEL
et al., 2002). Estes microrganismos parecem penetrar ativamente nos tecidos de
plantas usando enzimas hidrolíticas, como celulases e pectinases, além de usarem
aberturas naturais devido ao crescimento da planta ou provocadas por injúrias (QUADT-
HALLMANN et al., 1997) .
Sob o aspecto fisiológico, a colonização dos tecidos internos das plantas
por bactérias endofíticas confere vantagens sobre outros microrganismos, pois estes
passam a viver em um ambiente mais protegido e são menos afetados pelos efeitos de
extremos de temperatura, potencial osmótico e radiação ultravioleta (LODEWYCKX et
al., 2002).
As bactérias endofíticas têm despertado atenção devido ao seu potencial para
aplicações biotecnológicas (HALLMANN et al., 1997). Mecanismos diretos de promoção
de crescimento vegetal podem envolver a produção de comospostos como auxinas,
citocininas e giberelinas, supressão de estresse por etileno produzido pela atividade da
1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidase (ACC), fixação de nitrogênio e mobilização
de nutrientes indisponíveis como fósforo e outros nutrientes minerais. Endófitos podem
também promover indiretamente o crescimento vegetal ao prevenir a colonização por
patógenos competindo pelo espaço e nutrientes com eles, produzindo enzimas
hidrolíticas, por antibiose, indução de mecanismos de defesa da planta e através da
inibição de enzimas ou toxinas produzidas pelos patógenos (ROSENBLUETH &
MARTÍNEZ-ROMERO, 2006).
Assim as bactérias endofíticas podem atuar como antagonistas, ou seja,
podem interferir na infecção, crescimento e sobrevivência de um determinado patógeno
20
(CHERNIN et al., 1995). Espécies de Pseudomonas podem suprimir a infecção por
Ralstonia solanacearum em berinjela (RAMESH et al., 2008); Gluconacetobacter
diazotrophicus, um endófito de cana-de-açúcar, produz uma bacteriocina contra o
patógeno Xanthomonas albilineans (PINON et al., 2002), além de fixar nitrogênio e
produzir o fitormônio ácido indol acético (AIA). Estirpes de Bacillus sp induzem
resistência sistêmica contra patógenos em diversas plantas (CHOUDHARY e JOHRI,
2008). Estirpes de Azospirillum brasilense promovem o crescimento vegetal através da
produção de hormônios vegetais como ácido abcíssico, giberelina e ácido indol acético
(PERRIG et al., 2009).
A fixação de nitrogênio é outra contribuição importante das bactérias
endofíticas. Gramíneas de importância econômica, tais como cana-de-açúcar, arroz,
trigo, sorgo, milho foram identificados com hospedeiros de diversas espécies de
bactérias endofíticas fixadoras de nitrogênio sendo as principais Gluconacetobacter
diazotrophicus, Herbaspirillum spp. e Azospirillum spp (JAMES e OLIVARES, 1997;
BALDANI et al., 1997; JAMES 2000; BODDEY et al. 2003).
Outras contribuições das bactérias endofíticas são: 1) produção de
sideróforos, observada em bactérias endofíticas isoladas de nabo (Brassica napus),
(SHEN et al. 2008), 2) a capacidade de solubilizar fosfatos (ROSENBLUETH e
MARTÍNEZ-ROMERO, 2006) e 3) conferir à planta resistência a estresses
(HALLMANN, 1997).
Em geral as densidades populacionais das bactérias endofíticas são menores
que as de patógenos e bactérias da rizosfera (ROSENBLUETH & MARTÍNEZ-
ROMERO, 2006). A densidade populacional dos endofíticos é altamente variável,
dependendo principalmente das espécies bacterianas e genótipo do hospedeiro, e
também do estágio de desenvolvimento do hospedeiro, densidade do inóculo e
condições ambientais (PILLAY e NOWAK, 1997; TAN et al., 2003). Muitos fatores,
como a rotação de culturas, condições do solo e população de fitopatógenos podem
21
influenciar a estrutura da população das bactérias endofíticas (CHO et al., 2007).
O início dos estudos com bactérias endofíticas é controverso. Em 1984,
BECKING isolou endofíticos de nódulos de raízes de plantas da família Rosaceae e
identificou as características morfológicas de espécies de Frankia através de
microscopia eletrônica de transmissão (BECKING, 1984). Nos anos seguintes diversos
autores investigaram a diversidade de bactérias endofíticas utilizando técnicas como
morfologia das culturas bacterianas e microscopia de transmissão (DONG et al., 1994),
análise dos ácidos graxos celulares (FAME) e testes bioquímicos por meio de
crescimento com diferentes fontes de carboidrato, presença de determinadas enzimas)
(GERMIDA et al., 1998). No decorrer da década de 1990, após o trabalho de WOESE,
os pesquisadores começaram a utilizar a abordagem molecular nos estudos de
diversidade (HUGENHOLTZ, et. al., 1996; KIRCHHOF et al., 1996; LUDWIG &
SCHLEIFER, 1994). Recentemente, a diversidade endofítica bacteriana de uma grande
variedade de plantas tem sido analisada utilizando principalmente as técnicas
moleculares. MOCALI e colaboradores (2003) pesquisaram a diversidade endofítica em
Ulmus spp. utilizando seqüenciamento do gene 16S rRNA e ARDRA (análise de
restrição de DNA ribossomal amplificado), e encontraram representantes dos gêneros
Bacillus, Curtobacterium, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Sphingomonas,
Enterobacter e Staphlylococcus.
Em três variedades diferentes de batata foram encontrados representantes
das classes α, β e γ-Proteobacteria (BERG et al., 2004; SESSITCH et al., 2002). As
técnicas moleculares permitiram a descrição de bactérias endofíticas também em soja
(KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004), plantas cítricas (ARAUJO et al., 2002), arroz
(VERMA et al., 2001; CHAINTREUL et al., 2000) e trigo (CONN e FRANCO, 2004).
Em colmos e raízes de arroz a diversidade de bactérias e de
actinobactérias endofíticas foi analisada por métodos dependentes e independentes de
cultivo, e sequenciamento do gene 16S rRNA de isolados e RFLP (TIAN et al., 2007,
22
SUN et al., 2008).
1.3 BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS FIXADORAS DE NITROGÊNIO
O nitrogênio é um elemento químico fundamental na formação de
biomoléculas como proteínas, aminoácidos e ácidos nucléicos. Porém a maior parte do
nitrogênio está na forma gasosa (N
2
), inerte para vegetais e animais. Na natureza a
incorporação do nitrogênio ao ecossistema é feita principalmente pelas bactérias
fixadoras de nitrogênio ou diazotróficas (POSTGATE, 1982). A fixação biológica de
nitrogênio tem importância ecológica, pois representa um aporte de nitrogênio fixado em
muitos habitats terrestres e aquáticos.
As bactérias diazotróficas ocupam nichos distintos, podendo ser de vida livre,
associativas e simbióticas. As bactérias diazotróficas associativas foram inicialmente
isoladas da rizosfera e do rizoplano de uma grande variedade de plantas não-
leguminosas. Porém, algumas evidências posteriores indicam que bactérias
diazotróficas podem colonizar tecidos vegetais internos, principalmente de gramíneas,
sendo, portanto bactérias endofíticas (OLIVARES et al., 1996; URETA et al., 1995). As
bactérias endofíticas diazotróficas estabelecem associação com diversas espécies de
planta e fixam nitrogênio de maneira mais eficiente que os diazotrofos associados à
rizosfera (DÖBEREINER, 1992).
Bactérias fixadoras de nitrogênio são encontradas em gramíneas de
importância econômica, tais como cana-de-açúcar, arroz, trigo, sorgo, milho e algumas
forrageiras (JAMES e OLIVARES, 1997, JAMES 2000) e também em plantas como
abacaxizeiros e bananeiras (CRUZ et al., 2001), entre outras.
A contribuição da fixação biológica de nitrogênio por bactérias endofíticas em
cana-de-açúcar é responsável por até 60% do total de nitrogênio acumulado
(URQUIAGA et al., 1992). Porém, essa contribuição parece estar relacionada ao
23
genótipo do hospedeiro (URQUIAGA et al., 2003, COELHO et al., 2003). Grande parte
das evidências da contribuição da fixação biológica de nitrogênio pelas bactérias
endofiticas vem de estudos com balanço de N, diluição isotópica de
15
N e abundância
natural de 15N em plantas de cana-de-açúcar, arroz e “kallar grass”, que podem obter o
nitrogênio que necessitam através da fixação biológica de nitrogênio (JAMES, 2000).
Diazotróficos endofíticos melhor estudados estão distribuídos entre os
gêneros Azospirillum, Gluconacetobacter, Azoarcus, Herbaspirillum e Burkholderia
(BALDANI et al., 1997). Muitas enterobactérias possuem a capacidade de fixar
nitrogênio também e as mais relacionadas com essa atividade são estirpes de
Enterobacter sp, Klebsiella sp, Citrobacter sp (KENNEDY et al., 2004; ROESCH et al.,
2008; RENNIE 1982).
Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria endofítica diazotrófica que foi
isolada inicialmente de raízes de milho, sorgo e arroz em 1984, e coloniza raízes,
colmos, folhas e sementes de cana-de-açúcar, plantas forrageiras, cereais e palmeiras
(BALDANI et al., 1984; BALDANI et al., 1986; REIS et al., 2000).
O gênero Azospirillum possui diversas espécies fixadoras de nitrogênio, que
podem ser de vida livre ou endofíticos, estão distrbuídos em quatorze espécies: A.
brasilense (TARRAND et al., 1979), A. lipoferum, A. amazonense (MAGALHÃES et al.,
1984), A. canadense (MEHNAZ etal, 2007), A. melinis (PENG et al., 2006), A. oryzae
(XYE e YOKOTA 2005), A. picis (LIN et al., 2009), A. rugosum (YOUNG et al. 2008), A.
zeae (MEHNAZ et al, 2007), A. irakense (KAMMAS et al., 1989), A. halopraeferans
(REINHOLD et al. 1987), A. largomobile (BEN DEKHIL et al., 1997), A. largimobile (BEN
DEKHIL et al., 1997) e A. doebereinerae (ECKERT et al., 2001). As espécies de
Azospirillum, principalmente A. brasilense e A. lipoferum (TARRAND et al., 1978) tem
sido isoladas de cereais (milho, trigo, arroz e sorgo), gramíneas forrageiras, cana-de-
açúcar, palmeiras oleaginosas e plantas tuberosas, a partir de tecidos da raiz, caule,
folhas, tubérculos, do interior do xilema e de frutos e sementes, principalmente em
24
regiões tropicais (BALDANI et al., 1997).
Gluconacetobacter diazotrophicus foi isolada dos tecidos de cana-de-açúcar, e
tem recebido especial atenção como um potencial contribuinte para a fixação biológica
de nitrogênio em cana-de-açúcar brasileira (BODDEY et al., 1995). Esssa bactéria
também já foi isolada de plantas de café (JIMENEZ-SALGADO et al., 1997).
Burkholderia inclui 66 espécies e constitui um dos grupos de diazotróficos
mais recentemente descobertos. Incluem-se várias espécies fixadoras de nitrogênio:
Burkholderia silvatlantica (PERIN et al., 2006), B. vietnamiensis, isolada de rizosfera de
arroz cultivadas no Vietnam (GILLIS et al., 1995), B. kururiensis (ZHANG et al, 2000).
1.4 BACTÉRIAS ASSOCIADAS À CANA-DE-AÇÚCAR
A cana-de-açúcar pertence à família Poaceae, uma das maiores famílias da
classe das angiospermas (JOLY, 1993). Essa cultura é uma das mais importantes do
Brasil, o maior produtor mundial. A produção brasileira de açúcar em 2007-2008 foi de
aproximadamente 490 milhões de toneladas. O Paraná é o segundo maior produtor
brasileiro, atrás apenas de São Paulo
(http://www.unica.com.br/dadosCotacao/estatistica).
Além dos produtos açúcar, álcool e aguardente, os subprodutos da cana
(bagaço, vinhaça e torta de filtro) são de grande importância socioeconômica e são
insumos para produção de energia, ração animal, aglomerados, fertilizantes etc
(http://www.alcopar.org.br/produtos/subprodutos.php).
Devido à grande importância da cultura da cana-de-açúcar, é essencial
aumentar a sua produtividade e/ou diminuir o custo de produção. Um dos fatores que
pode levar a um aumento de produtividade é o controle ou erradicação de
microrganismos que possam provocar doenças à planta, podendo esses
microrganismos ser vírus, fungos ou bactérias, além da fixação biológica de nitrogênio.
25
O estudo de bactérias associadas à cana-de-açúcar sempre esteve
relacionado às bactérias fixadoras de nitrogênio. Em 1958, DÖBEREINER e RUSCHEL
isolaram a bactéria Beijerinckia fluminensis da rizosfera de cana-de-açúcar
(DÖBEREINER e RUSCHEL, 1958). Outros autores também estudaram endófítos
utilizando meios seletivos para organismos fixadores de nitrogênio (CABALLERO-
MELLADO E MARTINEZ-ROMERO, 1994; OLIVARES, 1996, ELBELGATY, 2001
LOIRET, 2004). Porém, em 2001, SUMAN e colaboradores analisaram 22 isolados
endofíticos de raízes de cana-de-açúcar da Índia e encontraram representantes
diazotróficos e não diazotróficos. Estes mesmos autores mostraram que apenas uma
pequena
fração dos endófitos de cana é formada por fixadores de nitrogênio.
Em
2005 foram analisados isolados endofíticos de cana-de-açúcar através de tipagem
bioquímica e molecular. Estes isolados foram classificados predominantemente junto às
γ-Proteobacteria (MAGNANI, 2005).
1.5 MÉTODOS MOLECULARES PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
Taxonomia é a ciência da classificação dos organismos, ou seja, a ciência de
ordená-los em grupos com base em suas características comuns (BUSSE et al., 1996).
Desde a década de 1920, bactérias são classificadas taxonomicamente através de
testes bioquímicos, nutricionais e fisiológicos (BUSSE et al., 1996). Estes métodos
avaliam, entre outros parâmetros, características morfológicas, composição química da
parede celular, a capacidade de utilização de diferentes fontes de carbono e a presença
de determinadas enzimas. De forma geral, a semelhança de fenótipos era usada para
agrupar os diferentes organismos em grupos relacionados e, portanto, para definir sua
classificação taxonômica.
Segundo OLSEN e WOESE, 1993, uma vez que os organismos são produtos
da evolução, é necessário conhecer a sua história evolutiva para entender e defini-los
26
em termos biológicos. Entretanto, morfologia bacteriana, fisiologia e as demais
propriedades citadas não são informativas o suficiente para serem usadas como
marcadores filogenéticos (LUDWIG e SCHLEIFER, 1994), uma vez que determinada
característica fenotípica pode ter-se originado de uma forma independente ou ter sido
adquirida por transferência lateral. Atualmente, é senso comum que a sistemática
bacteriana deve utilizar critérios moleculares além dos fenotípicos para identificação e
classificação (WOESE, 1990). Para tanto, tem-se usado moléculas denominadas de
marcadores moleculares que refletem não só a semelhança genotípica entre diferentes
bactérias, mas podem descrever a história evolutiva comum, permitindo sua
classificação a partir de critérios filogenéticos. Marcadores moleculares são genes ou
sequências de DNA que podem ser usadas para identificar um organismo, espécie,
estirpe ou característica fenotípica (WOESE, 1987).
O uso de marcadores em sistemática foi primeiramente introduzido por
Zuckerkandl e Pauling em 1965 em seu artigo intitulado “Moléculas como documentos
da história evolutiva”. Sequências de moléculas são documentos da história evolutiva
porque elas são lineares e contem de dezenas a milhares de caracteres mais ou menos
independentes (WOESE, 1991). Como há um número enorme de possíveis sequências
de uma dada composição ou tamanho, a similaridade de sequências indica uma origem
comum das moléculas ou genes. O número e natureza das diferenças nas sequências
do mesmo marcador molecular em diferentes organismos refletem o curso da evolução
e podem ser usados para a reconstrução de genealogias moleculares (LUDWIG &
SCHLEIFER, 1994).
Para este fim, o marcador molecular deve ter as seguintes características: a)
estar presente em todos os organismos do grupo estudado; b) ser funcionalmente
homólogo nos diferentes organismos; c) o alinhamento de suas seqüências deve ser
possível para permitir a identificação de regiões conservadas e não-conservadas; d)
sua sequência deve ter uma taxa de mutação definida para permitir inferir o padrão
27
temporal de divergência entre os organismos (MADIGAN et al.,1997). Estes critérios
têm o objetivo de garantir que a similaridade entre as sequências aponta para uma
origem comum e possa servir de critério de comparação entre os organismos (LUDWIG
& SCHLEIFER, 1994).
Um marcador molecular ideal funciona como um “relógio molecular”,
acumulando mudanças aleatoriamente ao longo do tempo. Consequentemente, o
número de mudanças poderia ser usado para medir o tempo de divergência entre esse
organismo e seu ancestral comum. Se essas mudanças são neutras e independentes
do fenótipo, a mudança contida no genoma dá ao pesquisador a capacidade de inferir
filogenia (WOESE 1987).
Baseando-se na utilização dos marcadores moleculares, métodos de DNA
recombinante e de filogenia molecular têm sido utilizados como meios de estabelecer
relações evolutivas entre bactérias que ocorrem em ambientes naturais e até mesmo
aquelas não cultiváveis (HUGENHOLTZ & PACE, 1996; WISE et al., 1997). Estas
técnicas permitem a determinação da diversidade microbiana em diferentes
ecossistemas, como solos, ambientes aquáticos e tecidos de plantas (FELSKE et al.,
1998; FRANKLIN et al., 1999; CHELIUS & TRIPLETT, 2001; SESSITSCH et al., 2002;
CONN & FRANCO, 2004). Um fato importante nesse contexto foi o desenvolvimento da
técnica da PCR (SAIKI et al., 1988), que permitiu o aparecimento de vários métodos
para a análise da comunidade microbiana (TABELA 1).
28
TABELA 1. PRINCIPAIS TÉCNICAS MOLECULARES APLICADAS AO ESTUDO DA DIVERSIDADE BACTERIANA
QUE UTILIZAM A PCR
NOME DA
TÉCNICA
SIGNIFICADO INDICAÇÕES DE USO
Clonagem e
sequenciamen
to
Clonagem de produtos de
PCR e posterior
sequenciamento dos insertos
Quando o posicionamento filogenético é relevante
e o sequenciamento em larga escala é possível
ARDRA Análise de restrição de DNA
ribossomal amplificado
Para comparações de comunidades simples ou
para triagem de clones para posterior
sequenciamento
ARISA Análise da região espaçadora
intergênica ribossomal
Para resolver sutis diferenças entre espécies
T-RFLP Análise do polimorfismo do
fragmento de restrição
Para comunidades com grande riqueza de
espécies e para estudos com grande número de
amostras
DGGE Eletroforese em gel com
gradiente desnaturante
Para comunidades com um número limitado de
membros abundantes.
SSCP Polimorfismo de
Conformação de Fita Simples
Quando uma alta sensibilidade é desejada
DHPLC Cromatografia Líquida de Alta
Performance Desnaturante
Análise rápida após uma otimização inicial
TGGE Eletroforese em gel com
gradiente de temperatura
As indicações são as mesmas do DGGE
Fonte: NOCKER et al., 2007
29
1.5.1 Genes utilizados na inferência filogenética
As sequências de rRNAs ocupam uma posição central no estudo da evolução
e ecologia dos microrganismos (FOX, PECKMAN e WOESE, 1977). Os RNAs
ribossomais são moléculas antigas, funcionalmente constantes, universalmente
distribuídas entre os organismos e moderadamente bem conservadas. Diferentes
posições em suas sequências mudam a diferentes taxas, o que permite a inferência
filogenética. Uma vez que o número de sequências possíveis de RNA ribossomal seja
grande, a similaridade entre duas sequências indica alguma relação filogenética entre
elas (MADIGAN et al., 1997). As seqüências de rRNA contêm domínios altamente
conservados, intercalados com regiões variáveis (HEAD et al., 1998), o que torna a
comparação de sequência de rRNA uma ferramenta importante para deduzir relações
filogenéticas e evolutivas entre os organismos (WOESE et al., 1987). Na figura 2 está a
estrutura secundária da molécula de 16S rRNA de E. coli, mostrando os diferentes
domínios existentes na molécula e a variabilidade em cada nucleotídeo dessa molécula.
O método original de análise consistia na extração de rRNA de culturas puras
seguido por análises comparativas realizadas com o uso dos catálogos de
oligonucleotídeos produzidos por digestão do gene para o 16S rRNA com a
ribonuclease T1 (FOX, PECKMAN e WOESE, 1977). Atualmente, análises
comparativas da estrutura primária dos genes de rRNA transformaram a taxonomia
microbiana de um simples sistema de identificação para um sistema baseado na
história evolutiva dos organismos (OLSEN, WOESE e OVERBEEK, 1994). PACE e
colaboradores (1986) foram os primeiros autores a sugerirem o uso do gene 16S rRNA
como um marcador molecular para o estudo de populações microbianas em amostras
do ambiente, independente do seu cultivo.
30
FIGURA 2. ESTRUTURA SECUNDÁRIA DA MOLÉCULA DE 16S rRNA DA
BACTÉRIA Escherichia coli.
Modelo proposto por VAN DER PEER (1996) mostrando a variabilidade dos nucleotídeos da molécula de
16S rRNA. Em cinza estão as regiões mais variáveis e em rosa as absolutamente conservadas.
DOMÍNIO I
DOMÍNIO II
DOMÍNIO III
DOMÍNIO IV
31
Genes que cifificam proteínas também são utilizados para estudar
determinados grupos com capacidades fisiológicas semelhantes, entre eles genes que
codificam a amônio monooxigenase (amoA), a subunidade β da RNA polimerase
(rpoB), metano monooxigenase (pmoA), nitrogenase (nifH), nitrito redutase (nirS/nirK)
etc (NOCKER et al., 2007).
Nas análises filogenéticas que utilizam esses genes e se baseiam em
distâncias, elas são expressas como a fração de sítios que diferem entre duas
sequências num alinhamento múltiplo. Apesar de ser natural de se pensar que quanto
mais tempo se passou após a divergência das sequências da original maior será a
diferença entre as duas sequências, isso nem sempre é verdade. Isso porque uma
linhagem pode ter evoluído mais rápido que a outra. E, mesmo quando elas evoluem à
mesma taxa, a possibilidade de múltiplas substituições deve ser considerada. Pelo fato
de que o número de diferenças observadas quase sempre subestima o número de
modificações reais, uma variedade de modelos é usada para estimar distâncias
corrigidas a partir do número de diferenças observadas (HALL, 2008).
1.6 FILOGENIA DO DOMÍNIO BACTERIA
Em 1987, Woese publicou seu clássico artigo “Bacterial Evolution”, onde
descreveu os diferentes grupos (filos) bacterianos estudados até aquele momento
baseando-se na sequência do gene 16S rRNA, em catálogos de oligonucleotídeos do
gene 16S rRNA (com a enzima ribonuclease T1, que produzia fragmentos de
aproximadamente 20 pares de base) e na sua estrutura secundária (WOESE, 1987).
Os 12 filos do Domínio Bacteria descritos até aquele momento estão representados na
figura 3 como ramos preenchidos na cor preta. Na mesma figura veem-se 14 ramos em
branco, que são os filos de bactérias cultiváveis reconhecidos após o trabalho de
Woese de 1987. Os ramos em cinza são os filos que não contem representantes
32
cultiváveis (KELLER E ZANGLER, 2004).
33
FIGURA 3. ÁRVORE FILOGENÉTICA DO DOMÍNIO BACTERIA (KELLER E
ZANGLER, 2004)
Árvore filogenética ilustrando os filos do domínio Bacteria. Em preto estão os 12 filos originais,
como descritos por Woese, em branco estão os 14 filos com representantes cultivados reconhecidos
desde 1987, e em cinza estão os 26 filos candidatos que não contem representantes cultiváveis. Essa
análise foi construída por comparação entre 600 sequências do gene 16S rRNA quase completas usando
o pacote de análise de sequências ARB, selecionados de um banco de dados maior de aproximadamente
34
12.000 sequências. Uma versão modificada da “Lane mask” foi utilizada nessa análise, com um fator de
correção evolutiva Olsen e o algoritmo neighbor-joining. Os nomes dos filos estão designados ao
selecionar a primeira opção aplicável das 3 seguintes: (a) nomenclatura convencional no Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology, se existir; (b) o primeiro gênero representativo descrito dentro do filo,
se este possui representante cultivável; (c) o primeiro nome dado a um filo candidato se já publicado
previamente; ou (d) o primeiro clone ou ambiente onde os primeiros clones foram retirados, para um filo
candidato sem nomenclatura anterior.
1.6.1 FILO PROTEOBACTERIA
O termo Proteobacteria vem do grego: Proteus (deus dos oceanos capaz de
mudar de forma); e bakterion (pequeno bastão) (STACKEBRANDT et al., 1988). Esse
filo é um dos maiores grupos entre os procariotos e um dos mais diversos
fenotipicamente; seus representantes estão presentes em quase todos os ambientes
(GUPTA, 2000)
O filo Proteobacteria compreende 5 classes, α-Proteobacteria, β-
Proteobacteria, γ-Proteobacteria, D-proteobacteria e ε-Proteobacteria (Tabela 2).
TABELA 2. GÊNEROS REPRESENTATIVOS ENCONTRADOS NAS DIFERENTES
CLASSES DAS PROTEOBACTÉRIAS
Classe Gêneros
α-Proteobacteria Agrobacterium, Rhizobium, Beijerinckia, Gluconoacetobacter,
Azospirillum
β-Proteobacteria Burkholderia, Herbaspirillum, Chromobacterium, Neisseria, Iodobacter
γ
-Proteobacteria Escherichia, Enterobacter, Pseudomonas, Vibrio, Actinobacillus
ε-Proteobacteria Campylobacter, Sulfurospirillum, Helicobacter
δ-proteobacteria Cystobacter, Desulfovibrio, Desulfuromonas, Myxococcus
Modificada de Madigan et al., 1997.
35
1.6.1.1 CLASSE γ -PROTEOBACTERIA
A classe das γ-Proteobactérias é a mais estudada dentro desse filo. Esta
classe inclui as bactérias gram-negativas clássicas e, baseando-se em análises cultivo-
independentes e cultivo-dependentes são consideradas um dos grupos de bactérias de
maior sucesso no planeta (RAPPÈ & GIOVANONNI, 2003). Há representantes com
metabolismo bem variado: fototróficos, não-fototróficos, aeróbicos, anaeróbicos,
heterotróficos, quimiolitotróficos etc. Os gêneros das bactérias mais bem estudadas
deste grupo são: Escherichia e Pseudomonas. A primeira pertence à família
Enterobacteriaceae e a segunda à família Pseudomonadaceae.
1.6.1.1.1 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE
Essa é uma família de bacilos gram-negativos, não formadores de esporos,
aróbicas facultativas e oxidase negativas. Entre as bactérias dessa família, há muitas
espécies patogênicas associadas a diversas infecções em humanos incluindo infecções
do trato intestinal (BARON et al., 1996), mas elas podem ser encontradas também em
praticamente todos os ambientes naturais. Por conta da importância médica dessas
bactérias, elas constituem um dos grupos mais conhecidos.
Como exemplo de enterobactérias temos as bactérias Escherichia coli,
Salmonella spp, Shigella, Enterobacter, Citrobacter, Pantoea, Klebsiella, Yersinia,
Serratia etc. A E. coli, tem um papel fundamental no trato intestinal, ao sintetizar
vitaminas, particularmente a vitamina K (MADIGAN et al., 1997). Ela está também
relacionada a algumas patologias e várias estirpes desse microrganismo são
amplamente utilizadas como estirpes hospedeiras para técnicas de DNA recombinante
(GIANELLA, 1981; SAMBROOK et al., 1989)
As Enterobactérias são um dos grupos de bactérias endofíticas mais
frequentemente encontrados nas plantas (WEYNES et al., 2009). Algumas delas podem
36
provocar doenças, como Erwinia amylovora atroseptica causadora da podridão mole em
batata, maçã e pêra (BURSE et al., 2004), e Pantoea ananatis, que causa doenças em
plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas (COUTINHO E VENTER, 2009).
Por outro lado, enterobactérias que vivem associadas às plantas podem
promover crescimento vegetal através de mecanismos como fixação biológica de
nitrogênio e também atuam no controle biológico de fitopatogenias (TYLER e
TRIPPLET, 2008).
Em arroz inundado, por exemplo, membros da família Enterobacteriaceae
isoladas de superfície de sementes esterilizadas fixam nitrogênio, produzem ácido indol
acético e solubilizam fosfatos insolúveis (VERMA et al., 2001). Em rizoma e colmo de
gramíneas de dunas (Ammophila arenaria) foram encontradas as enterobactérias
fixadoras de nitrogênio Enterobacter hormaechei e Pantoea ananatis (DALTON et al.,
2004). Por meio de sequenciamento do gene nifH , em rizosfera de capim praturá,
foram identificadas espécies de Klebsiella (LOVEL et al., 2000). Pantoea agglomerans e
Enterobacter asburiae diazotróficas foram encontrados em batata-doce no Japão (ASIS
e ADACHI, 2003).
Outras espécies de enterobactérias (P.agglomerans e Enterobacter cloacae)
foram isoladas de citros (LACAVA et al., 2004) e de raiz de canola e trigo (E.
agglomerans) (GERMIDA et al., 1998).
1.6.1.1.2 FAMÍLIA PSEUDOMONADACEAE
O gênero Pseudomonas tem 186 espécies descritas
(http://www.bacterio.cict.fr/p/pseudomonas.html) e muitas delas estão relacionadas com
doenças, tanto em animais quanto em vegetais. É o caso da espécie Pseudomonas
aeruginosa, que pode causar endocardite, infecção respiratória, septicemia, otite entre
37
outras patogenias humanas (BARON et al., 1996).
Em plantas, estirpes de Pseudomonas syringae são consideradas
fitopatógenas de uma ampla gama de hospedeiros, como tomate, batata, maçã, café
etc. Pseudomonas corrugata está associada a sintomas de necrose-da-medula em
campo de produção de tomate (QUEZADO-DUVAL et al., 2007)
Porém várias espécies de Pseudomonas associadas às plantas e não lhes
causam mal algum e ainda, trazem alguns benefícios. Por exemplo, algumas estirpes
de Pseudomonas fluorescens têm sido usadas para controle biológico de fitopatógenos
associada à raiz (COUILLEROT et al., 2009). Em arroz a presença de bactérias
endofíticas do gênero Pseudomonas com atividade contra os patógenos Achlya
klesbiana e Phytium spinosum foi verificada (ADHIKARY et al.,2004). Em tomate a
aplicação de Pseudomonas sp (PsJN) induziu resistência sistêmica em Verticillium
dahliae (SHARMA E NOVAK, 1998).
Espécies de Pseudomonas também possuem a capacidade de fixar nitrogênio
atmosférico. Bactérias diazotróficas do gênero Pseudomonas foram isoladas de vários
ambientes, como por exemplo, de sementes de arroz, de gramíneas presentes em
dunas, e até em raízes de gramíneas de regiões frias como o Ártico Canadense
(PRAKAMHANG et al., 2009; DALTON et al., 2004; LIFSHITZ et al., 1986).
38
2
JUSTIFICATIVA
A cana-de-açúcar é uma das culturas mais importantes do Brasil, maior produtor
mundial. Dois de seus derivados, açúcar e álcool têm grande peso na economia
brasileira: o açúcar é uma das principais commodities de exportação e o álcool é a
principal alternativa de combustível renovável. Assim, aumentos de produtividade desta
cultura são essenciais para manter o país na posição de liderança econômica. O estudo
da interação endófitos-planta, incluindo fisiologia, ecologia e diversidade, é bastante
recente. Já se sabe que a diversidade bacteriana nos sistemas agrícolas é de grande
importância e que pode variar de acordo com o genótipo da planta, condições climáticas
da região, solo etc. Conhecer a comunidade bacteriana endofítica e investigar os seus
efeitos é essencial para explorar essa cultura adequadamente. O uso de métodos
cultivo-independentes no estudo das bactérias endofíticas pode revelar organismos e
composições de comunidades ainda não observadas. A descoberta de novas estirpes
promotoras de crescimento vegetal capazes de promover um aumento de produtividade
e/ou resistência a pragas pode resultar no desenvolvimento de novas alternativas de
tecnologias para uma agricultura sustentável.
39
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL:
- Determinar a diversidade de bactérias endofíticas em cana-de-açúcar,
utilizando métodos independentes e dependentes de cultivo;
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Isolar bactérias endofíticas a partir de plantas de cana-de-açúcar
esterilizadas superficialmente;
- Sequenciar o gene 16S rRNA das bactérias isoladas;
- Amplificar, clonar e sequenciar o gene 16S rRNA a partir do DNA total
extraído diretamente de colmo de plantas de cana-de-açúcar;
- Determinar as relações filogenéticas das bactérias endofíticas caracterizadas
utilizando as sequências do gene 16S rRNA obtidas.
40
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ESTIRPE DE BACTÉRIA E PLASMÍDIO UTILIZADOS
A estirpe DH10B de E. coli (GRANT et al., 1990) foi utilizada como
hospedeira dos plamídIos derivados do vetor pCR 2.1 (Invitrogen, Anexo - Figura 24).
4.2 MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES DE CULTIVO
Células de E. coli DH10B foram cultivadas em meio líquido LB, SOB, SOC
ou Terrific Broth (SAMBROOK et al., 1989), sob agitação constante de 120 rpm à 37
°
C.
As composições dos meios de cultura utilizados são apresentadas abaixo:
MEIO LB
Componentes g/L
Triptona 10
Extrato de levedura 5
Cloreto de sódio 10
O pH foi ajustado para 7,5 com uma solução de NaOH 2 mol/L. Para obtenção
do meio sólido ágar na concentração de 15 g/L foi adicionado ao meio líquido. O meio
sólido foi denominado LA.
MEIO SOB (SAMBROOK et al., 1989)
Componentes g/L
Triptona 20
Extrato de levedura 5
41
Cloreto de sódio 0,584
Cloreto de potássio 0,186
Para obtenção do meio SOC foram adicionados 3,6 g/L glucose, 0,94 g/L
MgCl
2
e 1,2 g/L MgSO
4
ao meio SOB. O pH dos meios de cultura foram corrigidos com
uma solução de NaOH 2 mol/L para pH 7.
MEIO TERRIFIC BROTH (SAMBROOK et al., 1989)
Componentes g/L
Extrato de levedura 24,0
Glicerol 4,0
KH
2
PO
4
2,31
K
2
HPO
4
12,54
O meio NFbHP foi utilizado para isolamento de bactérias endofíticas de
plantas de cana-de-açúcar e também para contagem das unidades formadoras de
colônia (UFC).
MEIO NFbHPN (PEDROSA E YATES, 1984)
Componentes g/L
Lactato de sódio 5,0 g
K
2
HPO
4
6,0 g
KH
2
PO
4
4,0 g
MgSO4.7H
2
O 0,2 g
NaCl 0,1 g
CaCl
2
0,2 g
Ácido Nitrilo triacético 56 mg
FeSO
4
.7H
2
O 20 mg
Biotina 0,1 mg
42
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 2 mg
MnSO
4.
H
2
O 2,4 mg
H
3
BO
3
2,8 mg
CuSO
4
.5H
2
O 0,08 mg
ZnSO
4
.7H
2
O 0,24 mg
O pH foi ajustado para 6,5 – 6,8 com KOH. Fonte de nitrogênio: NH
4
Cl 20mmol/L
Para preparo do meio NFbHP sólido foi adicionado ao meio 15g/L de ágar
bacteriológico ao meio líquido.
O meio de cultura BATATA foi utilizado para isolamento de bactérias endofíticas
de plantas de cana-de-açúcar pela Dra Claudia M. Didonet. Os isolados foram
gentilmente cedidos para caracterização molecular durante esta tese. Este meio foi
utilizado também para o crescimento dessas bactérias, que se encontravam estocadas
em glicerol 50% a -20ºC.
MEIO BATATA (DÖBEREINER e BALDANI, 1995)
Componentes g/L
Batata 200 g
Ácido málico 2,5 g
Açúcar cristal 2,5 g
Solução de micronutrientes 2 mL*
Solução de vitaminas 1 mL**
*Solução de micronutrientes g/L
CuSO
4
.5H
2
O 0,04 g
ZnSO
4
.7H
2
O 1,2 g
H
3
BO
3
1,4 g
Na
2
MoO
4
.2H
2
0 1 g
43
MnSO
4
.H2O 1,175 g
**Solução de vitaminas mg/L
Biotina 10 mg
Piridoxol-HCl 20 mg
4.2.1 Antibióticos
As soluções dos antibióticos utilizados foram preparadas conforme
SAMBROOK et al. (1989) e os estoques mantidos a -20°C. As concentrações das
soluções de estoque, bem como as utilizadas para os cultivos estão apresentadas na
tabela 3.
TABELA 3 – ANTIBIÓTICOS UTILIZADOS
Antibióticos Abreviatura Solução estoque
(mg/mL)
Concentração final (µg/mL)
Ampicilina Amp 250 250
Canamicina Km 100 50
Estreptomicina Sm 80 10
4.3 PLANTIO E COLETA DE CANA-DE-AÇÚCAR EM PARANAVAÍ-PR
As plantas utilizadas neste trabalho vieram da Estação Experimental da
UFPR, localizada
em Paranavaí,
Noroeste do Paraná, no terceiro planalto, (Latitude
23º 05’ S, Longitude 52º 26' W e Altitude de 480m)
. Duas plantas de cana-de-açúcar
da variedade RB-72454 em ponto de corte foram coletadas na Estação
Experimental em junho de 2006 (06/06/06).
Para estudar a diversidade em diferentes estágios de desenvolvimento e
regime de adubação, foi delimitada uma área de aproximadamente 20 m
2
, separada em
44
dois blocos (Figura 4). Um dos blocos recebeu adubação nitrogenada (90 kg/ha)
enquanto o outro não recebeu nenhum adubo nitrogenado. Cada bloco continha seis
fileiras (Figura 5), onde foram plantadas mudas de cana-de-açúcar variedade RB-
72454). As mudas foram plantadas em setembro de 2006. Durante o período de
setembro de 2006 a outubro de 2007 amostras de cada tratamento foram coletadas em
intervalos de 45 a 60 dias, enviadas para o Núcleo de Fixação de Nitrogênio no
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular para a extração do DNA total e
análises posteriores. Essas amostras se constituíam de uma planta de cana-de-açúcar
vinda do bloco que recebeu adubação nitrogenada e outra planta vinda do bloco que
não recebeu adubação nitrogenada. Cada planta recebida foi separada em folha, colmo
e raiz. As raízes e o solo aderido a elas foram passadas para o aluno de doutorado
Giovani Pisa. Foram recebidas um total de sete amostras nesse período.
No mês de agosto de 2007, em virtude do clima extremamente seco em
Paranavaí e à presença de fortes ventos, as plantas do experimento foram
acidentalmente queimadas.
Na figura 6 está representado o fluxograma das principais etapas realizadas
para a análise e determinação da diversidade de bactéria endofíticas em colmo de
plantas de cana-de-açúcar.
45
FIGURA 4.
VISTA DOS BLOCOS DE PLANTIO DE CANA-DE-AÇÚCAR
FIGURA 5.
FIGURA 5. VISTA DAS FILEIRAS DO BLOCO QUE NÃO RECEBEU ADUBAÇÃO
Data da foto: 22/01/07. Vista do experimento delineado na Estação Experimental da UFPR em Paranavaí,
norte do Estado. Nessa foto aparecem dois blocos, um que recebeu adubação nitrogenada e outro que
não recebeu adubação nitrogenada.
AUTORA DA FOTO: Giovana de Souza Magnani
FIGURA 5 VISTA DAS FILEIRAS DOS BLOCOS DE PLANTIO DE CANA-DE-
AÇÚCAR SEM ADUBAÇÃO NITROGENADA
Data da foto: 22/01/07.Foto mostrando três das seis
fileiras do bloco sem adubação, com aproximadamente
50 cm entre elas.
AUTORA DA FOTO: Giovana de Souza Magnani
Bloco com adubação
Bloco sem adubação
FIGURA 6. DETERMINAÇÃO DA DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS EM CANA-DE-AÇÚCAR
• O isolamento e contagem das bactérias foi feito somente na amostra de 06 de junho de 2006 (06/06/06)
4.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DO COLMO DE PLANTAS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Cada planta de cana-de-açúcar que chegou ao laboratório foi fotografada e
separada em raiz, colmo e folhas. Em seguida foi feita a desinfecção da superfície
externa do colmo com álcool 70% e o colmo foi flambado. O colmo foi então
descascado assepticamente e sua porção inicial (~50 cm) foi cortada em pedaços de
aproximadamente 5 cm. Três pedaços foram selecionados aleatoriamente para
obtenção do extrato. A partir desse ponto, duas metologias diferentes foram utilizadas
para a obtenção dos extratos:
1) os pedaços do colmo foram macerados em nitrogênio líquido e triturados, em
fluxo laminar, com o auxílio de pistilo e gral. Os extratos (colmo esterilizado,
descascado, congelado e triturado em nitrogênio líquido) eram guardados em
tubos tipo Falcon de 50 mL a -80ºC até o momento da extração do DNA;
2) os pedaços do colmo foram macerados em tampão TrisHCl 8 mmol/L e
triturados, em fluxo laminar, com o auxílio de pistilo e gral. Os extratos eram
guardados em tubos tipo Falcon de 50 mL a -80ºC até o momento da extração
do DNA.
4.5 EXTRAÇÃO DO DNA DE EXTRATOS DE COLMOS DE CANA-DE-AÇÚCAR
O DNA
dos colmos de cana-de-açúcar foi extraído com o kit “PowerPlant
DNA Isolation” (MOBIO) segundo as orientações do fabricante.
Somente uma amostra foi processada de modo diferente. O colmo da
amostra de junho de 2006, após a esterilização externa, foi descascado
assepticamente, e um pedaço (10 g)
foi macerado em tampão Tris-HCl 8 mmol/L pH
8,0 com auxílio de pistilo e gral, e armazenado a –80ºC.
49
4.6 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DE CANA-DE-AÇÚCAR
O isolamento das bactérias de folhas e colmo de cana-de-açúcar, em meio
batata, foi feito pela Dra Claudia Martim Didonet durante o seu pós-doutorado. As
plantas foram coletadas e as bactérias isoladas de diferentes tecidos (folha, colmo e
raiz). Para o isolamento de bactérias endofíticas de folha, estas foram primeiramente
picadas e submetidas à esterilização da sua superfície através da imersão em solução
de álcool 70%. O colmo foi esterilizado por imersão em álcool 70%, posteriormente
flambado em chama e, em seguida, descascado assepticamente. Folhas e colmos
foram triturados separadamente em Tris-HCl 10 mmol/L pH 8,0 estéril e preparadas
diferentes diluições (de 10
-1
a 10
-7
). As suspensões foram semeadas em placas de agar
batata. Um novo cultivo em meio líquido foi feito e usado para estocar os isolados em
solução de glicerol a 50% a –20º C. A partir desses estoques, as bactérias foram
novamente crescidas em meio líquido e o seu DNA foi extraído para posterior
amplificação e sequenciamento do gene 16S rRNA. Durante o mestrado foram
realizados testes bioquímicos nessas estirpes e sequenciamento do gene 16S rRNA de
alguns isolados (MAGNANI, 2005).
A contagem das unidades formadoras de colônias foi feita somente na
amostra CA01 da cana-de-açúcar var. RB-72454. Para a contagem das unidades
formadoras de colônias (UFC) os extratos frescos foram diluídos serialmente (10
-1
a 10
-
7
) em salina tamponada estéril e plaqueados em meios LB e NFbHPN lactato. Após 24
horas, as colônias foram contadas e 384 foram selecionadas aleatoriamente e
armazenadas em solução de glicerol 50% a –20º C.
4.7 AMPLIFICAÇÃO DO GENE 16S rRNA A PARTIR DO DNA EXTRAÍDO DE
EXTRATOS DE COLMO DE PLANTAS DE CANA-DE-AÇÚCAR
O gene 16S rRNA das bactérias existentes nas amostras de plantas de
50
cana-de-açúcar foi amplificado por PCR com os pares de oligonucleotídeos iniciadores
27f/1492r e 27f/805r. O uso desses pares de oligonucleotídeos permitiu amplificação de
fragmentos de DNA de 1500 e 800 pares de base do gene, respectivamente. As
seqüências desses iniciadores estão indicadas na tabela 4.
O sistema de reação da PCR foi o seguinte: tampão de reação para a Taq
DNA polimerase (20 mmol/L Tris-HCl pH 8,4, 50 mmol/L KCl), 200 µmol/L de cada
dideoxinucleotídeo, 1,5 mmol/L de cloreto de magnésio, 0,4 pmol/µL de cada iniciador e
água ultra pura estéril para um volume final de 25 µL. Como molde foram utilizados de
50 a 100 ng de DNA extraído dos extratos de colmos de plantas de cana-de-açúcar.
Os ciclos utilizados foram os seguintes: 1 ciclo inicial de 95ºC por 3
minutos, 28 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 62ºC por 40 segundos e 72ºC por 1 minuto e
45 segundos (27f-1492r) ou 1 minuto (par 27f-805r ) e, por último, um ciclo de 72ºC por
10 minutos.
TABELA 4. INICIADORES UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE 16S RRNA
4.8 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DOS GENES 16S RRNA
O gene 16S rRNA amplificado das amostras de cana-de-açúcar foi
clonado no vetor pCR 2.1 (TA Cloning Kit - Invitrogen). Esse vetor é fornecido
linearizado e possui uma timina não pareada nas suas extremidades. Dessa maneira os
vetores se aproveitam da capacidade que a Taq DNA polimerase possui de adicionar a
base nitrogenada adenina não pareada na extremidade 3’ da nova fita de DNA,
permitindo o pareamento com a ponta T do vetor.
A reação de ligação foi feita utilizando-se 50 ng de vetor pCR 2.1,
Nome Tamanho (pb) Sequência (5’->3’) Referência
27f 20 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG LANE et al., 1991
16S805r 23 GACTACCAGGGTATCTAATCCTG SOARES-RAMOS et al., 2003
1492r 19 GGTTACCTTGTTACGACTT LANE et al., 1991
51
aproximadamente 10 ng de inserto de DNA, 1 unidade de enzima T4 DNA ligase,
tampão de reação (60 mM Tris-HCl pH 7,8, 20 mM MgCl
2
, 20 mM DTT, 2 mM ATP, 10%
polietileno glicol) e água ultrapura estéril para um volume final de 10 µl. Além do vetor, a
enzima T4 DNA ligase e o tampão de reação também foram fornecidos com o kit. O
sistema de ligação foi incubado durante a noite em geladeira (aproximadamente 4°C) e
posteriormente transformado.
4.8.1 Preparo de células eletrocompetentes
Células eletrocompetentes da estirpe DH10B de E. coli foram preparadas da
seguinte forma. As células foram inicialmente inoculadas em 4 mL de meio SOB e
cultivadas em agitador rotatório a 37ºC sob agitação constante (120 rpm) durante a
noite. A seguir, 1 mL dessas células foi transferido para 100 mL de meio SOB e
incubado a 37ºC a 120 rpm até a cultura atingir uma D.O.
600
de 0,5 a 0,7. A cultura foi
então colocada em gelo por 15 a 30 minutos. Após esse período a cultura foi
centrifugada a 4000 rpm (2.500 g) por 5 minutos, a 2ºC. O sobrenadante foi descartado,
as células foram ressuspensas em água gelada e centrifugadas novamente a 4000 rpm
(2.500 g) por 5 minutos a 2ºC. O sobrenadante foi descartado e as células foram
lavadas mais uma vez em água gelada. O sobrenadante foi novamente descartado e as
células ressuspensas em glicerol 15% e submetidas à centrifugação como
anteriormente. Finalmente, as células foram ressuspensas em 200 µL de glicerol 15%.
Alíquotas de 100 µL foram mantidas em gelo e utilizadas em seguida para proceder a
eletrotransformação.
4.8.2 Eletrotransformação bacteriana
A eletrotransformação foi realizada utilizando-se 100 µL da suspensão de
células eletrocompetentes de E. coli DH10B e 1 µL do sistema de ligação. Esta mistura
52
foi posteriormente transferida para cubetas de eletroporação de 0,2 cm (BIORAD). Para
a eletrotransformação foi usado o Gene pulser II (BioRad), no qual as amostras foram
submetidas a um choque elétrico de 2,5 kV. Para promover a recuperação das células
eletrotransformadas foi adicionado 1 mL de meio SOC e o sistema foi incubado a 37ºC
em agitador rotatório durante 30 minutos. Após esse período as células elas foram
plaqueadas em meio LA contendo 250 µg/mL de ampicilina, 50 µg/mL de canamicina e
10 µg/mL de estreptomicina.
4.8.3 Coleta dos clones transformantes
As colônias de E. coli DH10B contendo os plasmídeos recombinantes das
bibliotecas (vetor ligado ao gene 16S RNA) foram coletadas e repicadas em meio sólido
LA contendo 250µg/mL de ampicilina, 50 µg/mL de canamicina, e 10 µg/mL de
estreptomicina em placas de Petri. Após o crescimento das colônias, os clones foram
repicados com o auxílio do replicador de 96 pinos para placas do tipo ELISA contendo
100 µL de meio terrific Broth e antibióticos adequados e incubadas na estufa a 37ºC
durante a noite. No dia seguinte foram adicionados 100 µL de glicerol 87% estéril a
cada poço. As placas foram então seladas e armazenadas a -20ºC.
4.8.4 Purificação de DNA plasmidial em placas de 96 poços
Para purificar os plasmídios recombinanates, os clones estocados em glicerol
foram cultivados em placas tipo deep well de 96 poços contendo 1,25 mL de meio
Terrific Broth e os antibióticos adequados. As colônias foram repicadas com o auxílio do
replicador e os poços selados com adesivo, que foi posteriormente perfurado para
permitir a aeração necessária para o crescimento bacteriano. Essas culturas foram
incubadas a 37ºC sob agitação de 180 rpm durante aproximadamente 16 horas.
53
Após o período de crescimento, o bloco contendo as culturas foi
centrifugado por 7 minutos a 4.000 rpm a 20ºC. Terminada a centrifugação, o selo foi
removido e o meio foi retirado dos blocos. As células foram ressuspendidas pela adição
de 180 µL de tampão GET (glucose 50 mmol/L, EDTA 10 mmol/L e Tris-HCl 25 mmol/L
pH 8) a cada poço e os blocos foram agitados em vórtex de placa à velocidade
máxima. Em seguida o bloco foi centrifugado por 7 minutos a uma velocidade de 4.000
rpm a 20ºC.
Após retirar o sobrenadante, foram adicionados aos poços 80 µL de GET
contendo 2,5 µg/mL de RNAse. A suspensão foi transferida para uma microplaca de
polipropileno de 96 poços de fundo U. Às suspensões contidas nos poços foram então
adicionados 80 µL de solução de lise (NaOH 0,2 mol/L e SDS 1%), a placa foi
devidamente selada e o sistema de lise foi misturado por inversão (20 vezes). A seguir
acrescentaram-se 80 µL da solução de acetato de potássio (3 mol/L) e o conteúdo dos
poços foi misturado por inversão (30 vezes). A placa foi então deixada à temperatura
ambiente por 10 minutos e em seguida incubada (sem o selo) a 90ºC em estufa por 30
minutos. A placa foi selada e resfriada em banho de gelo por 15 minutos. Em seguida,
a solução foi centrifugada durante 10 minutos a 4000 rpm e temperatura ambiente. O
sobrenadante foi então transferido para uma placa de 96 poços Millipore (MAGV N22),
fixada sobre outra placa de fundo V e centrifugado sem tampa por 5 minutos a 4.000
rpm. Ao filtrado adicionaram-se 90 µL de isopropanol e o material foi centrifugado por
45 minutos a 4.000 rpm a 8ºC. O sobrenadante foi então descartado e o precipitado de
DNA foi então lavado com 150 µL de etanol 80% e seco na estufa a 37ºC. Por último o
DNA foi dissolvido em 30 µL de água ultra pura.
4.8.5 Purificação do DNA plasmidial por cromatografia em SEPHADEX G-50
Inicialmente a resina sephadex G-50 foi depositada nos 96 poços de uma
54
placa para filtração Multiscreen HV com o auxílio do suporte Column Loader (Millipore).
A resina foi inchada pela adição de água ultrapura e incubada por 3 horas à
temperatura ambiente. Uma vez inchada a resina, a placa poderia ser estocada a 4ºC
por duas semanas (em sacos plásticos para evitar desidratação). Após as 3 horas, o
suporte de alinhamento (Millipore) para centrífuga foi colocado no topo de uma placa de
96 poços padrão e a placa Multiscreen HV foi alinhada e submetida à centrifugação a
910 x g por 5 minutos para empacotar a resina. A resina foi lavada com 150 µL de água
ultrapura estéril para remover contaminantes. Logo após, as soluções de plasmídios
isolados foram adicionadas ao centro de cada poço. Usando o suporte de alinhamento
para centrífuga, a placa foi submetida à centrifugação a 910 x g por 5 minutos e o
eluato foi coletado numa placa de 96 poços com fundo V.
4.9 SEQUENCIAMENTO DE DNA PLASMIDIAL
O seqüenciamento de DNA foi realizado pelo método de Sanger (Sanger
et al., 1977), utilizando dideoxinucleotídeos fluorescentes como terminadores de cadeia.
O sistema de reação continha aproximadamente 250 ng de DNA, 3,5 pmol de iniciador,
3 µL de reativo ET terminador mix (GE Health Care) e água ultra pura suficiente para
7,5 µL. A reação de seqüenciamento foi conduzida em termociclador Eppendorf Master
CyclerGradient 5331 nas seguintes condições: 1 ciclo de 95°C por 1 minuto seguido de
35 ciclos de 94°C por 20 segundos e 62°C por 2 minutos. A seguir o produto das
reações foi purificado adicionando-se a cada tubo 12,5 µL de água ultra pura, 2 µL de
acetato de amônio 7,5 mol/L e 3 volumes de etanol 96% e homogenizado por inversão.
O DNA foi coletado por centrifugação a 13.000 rpm por 15 minutos, lavado com 100 µl
de etanol 80% e seco em estufa à 37ºC. O DNA seco e purificado foi dissolvido em
água ultra pura e aplicado no sequenciador automático Megabace 1000 (GEHealthcare)
ou ABI 377 (Applied Biosystems).
55
4.10 ANÁLISES DE SEQUÊNCIA
O fluxograma das etapas dados de análise das sequências está na figura
7. Os dados dos eletroforetrogramas gerados pelos seqüenciadores foram inicialmente
analisados pelo programa PHRED para a identificação das bases e avaliação da
qualidade das sequências. As regiões de sequência de baixa qualidade das
extremidades foram retiradas (trimming). Em seguida as sequências foram analisadas
utilizando o programa BioEdit e submetidas ao programa BLASTn para uma busca por
identidade entre sequências. As sequências foram alinhadas pelo CLUSTALW
(THOMPSON et al., 1994) e o alinhamento foi utilizado como arquivo de entrada no
programa MEGA4 (TAMURA et al., 2007) para a construção das árvores filogenéticas e
para a construção de matriz de identidade pelo programa DNADIST versão 3.5c
(FELSENISTEIN, J. 1986). As matrizes foram utilizadas para a avaliação da
diversidade, feita através da construção da curva de rarefação, do cálculo de cobertura
da biblioteca e pela construção da curva do coletor.
56
FIGURA 7. FLUXOGRAMA DAS ANÁLISES DE SEQUÊNCIAS PARCIAIS DO GENE
16S rRNA
Identificação dos
clones e isolados
Busca de similaridade/identidade em Banco de Dados
Análises
filogenéticas
Análise da qualidade dos eletroforetrogramas (PHRED)
Sequenciamento do gene 16S rRNA das bactérias endofíticas de colmo de plantas de
cana-de-açúcar
Avaliação da Diversidade
Edição das sequências no BioEdit e alinhamento pelo CLUSTALW
Matriz de Identidade
Cálculo da cobertura
Curva de rarefação
57
4.10.1 Pesquisa de homologia de sequência
A busca de similaridade entre sequências obtidas com sequencias
depositadas no banco de dados GenBank foi realizada com o programa BLASTn. Esse
programa realiza alinhamentos locais entre a sequência fornecida pelo usuário (query) e
as sequências do banco de dados e identifica as sequências de maior semelhança com
o alvo.
4.10.2 Análises filogenéticas
Para determinar a relação de parentesco, as sequências obtidas dos
clones das bibliotecas da cana-de-açúcar foram alinhadas com as sequências do banco
de dados com as quais apresentaram maior grau de identidade. Isso foi feito pelo
programa CLUSTAW. Esse alinhamento foi utilizado pelo programa MEGA4 para a
construção das árvores filogenéticas. Nessa análise, a distância evolutiva foi calculada
para cada par de sequências através do método de JUKES & CANTOR (SAITOU &
NEI, 1987). Este método constrói uma matriz numérica, onde cada valor representa a
estimativa da distância entre cada par de sequências. Para que não haja uma
subestimativa da distância real que separa os organismos, o programa aplica um
modelo evolutivo específico, com correção para ocorrência de substituições múltiplas. A
partir da matriz de distância, a topologia da árvore filogenética foi inferida através do
método de neighbor-joining (SAITOU & NEI (1987). Este método, evolução mínima,
parte de uma topologia sem resolução (estrela) e procura, a cada ciclo, o par de
sequências que contribui com a menor soma de ramos para a topologia da árvore
(CAVALLI-SFORZA & EDWARDS, 1967).
58
4.10.3 Nomenclatura das bibliotecas e dos clones
A fim de facilitar as análises e a identificação das diferentes sequências das
diferentes amostras e condições de adubação, foi definido um código com 10 dígitos
para denominar as sequências
.
Legenda:
DATA DA COLETA TECIDO E ADUBAÇÃO
0 – 06/06/06 1- CC (colmo de cana adulta sem tratamento)
2 – 16/11/06 2- CCN+ (colmo de cana com adubação nitrogenada)
6 – 26/06/07 3- CCN- (colmo de cana sem adubação nitrogenada)
COMBINAÇÃO DE PRIMERS DE AMPLIFICAÇÃO E PRIMER DE
SEQUENCIAMENTO
01 - 27f-16S805r:27f
02 - 27f-16S805r:805r
05 - 27f-1492r:27f
poço na placa de 96
nú
mero da placa
Data da coleta da planta - AMOSTRA
Cana-de-açúcar
tecido e adubação
Combinação de primers
CA 1 1 001 A01
59
4.11 ESTIMATIVAS DE DIVERSIDADE
4.11.1 Cobertura da biblioteca
Para inferir a representatividade das bibliotecas, ou seja, o quanto as
seqüências obtidas representam a diversidade do ambiente avaliado, foi utilizada a
seguinte fórmula para calcular a cobertura (C) da biblioteca (SUN et al., 2008).
n1= número de sequências únicas
N= número total de clones sequenciados da biblioteca
4.11.2 Curva de rarefação e curva do coletor
Rarefação é um método estatístico utilizado para estimar o número de
espécies (ou unidades taxonômicas operacionais – UTO) esperado em uma amostra
casual de indivíduos retirada de uma comunidade. A curva mostra na abscissa o
número de indivíduos amostrados e na ordenada o número de espécies ou UTO
esperado. O número esperado de espécies ou UTO é dado pela equação:
E (Sn)= número esperado de espécies em uma amostra casual de n
indivíduos
Sn= número total de espécies na população
N= número total de indivíduos na população
Ni= número de indivíduos da espécie i
n= tamanho da amostra
100
1
1
x
N
n
C
−=
∑
=
−
−=
S
i
N
n
NN
n
n
C
C
SE
i
1
1)(
60
A curva de rarefação foi calculada pelo programa DOTUR (SCHLOSS
HANDELSMAN, 2005). Esse programa divide as sequências em UTOs (unidades
taxonômicas operacionais) baseando-se na distância genética entre elas. Ele define
estas OTUs levando-se em consideração diferentes porcentagens de dissimilaridade
entre as sequências.
Inicialmente um alinhamento com todas as sequências é feito pelo programa
CLUSTALW e a apartir desse uma matriz de distância é calculada pelo programa
PHYLIP (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). Esta matriz foi usada
como arquivo de entrada para o DOTUR, que divide as sequências nas diferentes
UTOs para cada possível distância (1%, 2%, 3%, 5% etc). O DOTUR então calcula
valores que são usados para construir curvas de rarefação e do coletor das diferentes
UTOs observadas. Esses valores podem ser calculados pelos algoritmos nearest
neighbor, furthest neighbor, e average neighbor.
Como resultado vê-se as curvas de rarefação e do coletor. Nessas curvas
pode-se observar o número de UTOs versus o número de sequências analisadas para
cada porcentagem de dissimilaridade entre as UTOs. Com elas, pode se ter uma noção
se a amostragem conseguiu recuperar as UTOs existentes na amostra.
5 RESULTADOS
5.10 ANÁLISE DA DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ASSOCIADAS À
CANA-DE-AÇÚCAR POR MÉTODO INDEPENDENTE DE CULTIVO
5.10.1 Coleta das plantas de cana-de-açúcar var RB72454
Amostras de plantas de cana-de-açúcar, variedade RB-72454, oriundas da
Estação experimental de Paranavaí foram colhidas e enviadas ao laboratório.
Inicialmente, uma planta adulta foi colhida em junho de 2006 (amostra CA01) e levada
ao laboratório para análise da diversidade de bactérias endofíticas. Em seguida, na
mesma área, foi implantado um experimento onde mudas de cana de açúcar foram
plantadas em um bloco que recebeu adubação nitrogenada e em outro que não
recebeu. No período de setembro de 2006 a junho de 2007, a um intervalo de 45-60
dias, foram coletadas e enviadas para o laboratório duas plantas de cana-de-açúcar,
uma proveniente do bloco que recebeu adubação nitrogenada (N+) e outra do bloco
que não recebeu adubação nitrogenada (N-). As folhas e os colmos de todas as
amostras foram esterilizados, triturados e utilizados para a extração do DNA, mas os
colmos de amostras selecionadas é que foram utilizadas para o presente estudo
(Tabela 5).
A amostra CA01 foi esterilizada externamente e macerada em tampão para a
preparação dos extratos. E os demais colmos, vindos dos blocos com e sem nitrogênio,
foram congelados em nitrogênio líquido e então triturados.
62
TABELA 5. AMOSTRAS DE CANA-DE-AÇÚCAR UTILIZADAS PARA AS ANÁLISES
DE DIVERSIDADE
Coleta Data Denominação das amostras utilizadas
nessa tese
Coleta planta adulta 06/06/06 CA01
2ª coleta 16/11/06 CA22 e CA23
6ª coleta 26/06/07 CA62 e CA63
Foram utilizadas as amostras CA01 por ser de uma planta adulta, e as amostras
CA22/CA23 e CA62/CA63 por representarem o maior intervalo de tempo, o que
resultaria numa maior variação da comunidade de bactérias endofíticas associadas às
plantas de cana-de-açúcar.
5.10.2 Extração de DNA do material vegetal
Para a extração do DNA dos extratos vegetais foi utilizado o PowerPlant DNA
Isolation Kit (MOBIO) e a aplicação do protocolo recomendado pelo fabricante mostrou-
se eficiente para extração do DNA pois possibilitou a extração de DNA Apesar do DNA
obtido se mostrar bastante fragmentado (Figura 8), este pode ser utilizado como molde
para a amplificação dos genes 16S rRNA das bactérias endofíticas presentes no colmo
da cana-de-açúcar.
As segundas e sextas coletas foram escolhidas por representarem um intervalo
maior de tempo, dentro do qual poderia ser observada uma maior variação na
diversidade das bactérias endofíticas. O material das coletas 1, 3, 4, 5 e 7 foi
esterilizado, macerado, seu DNA foi extraído e guardado a -20ºC.
63
FIGURA 8. DNA EXTRAÍDO DAS AMOSTRAS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE 1X, a 60 V por 2 horas do DNA extraído das
amostras de cana-de-açúcar. FC: folha de cana-de-açúcar (dados não mostrados nesse trabalho). O
DNA das amostras CA32 e CA33 foi extraído em 2 experimentos diferentes.
Poço 1: Marcador de massa molecular GeneRuler 1kb DNA Ladder (Fermentas).
Poço 2: CA32.
Poço 3: FCN+ 16/11/06.
Poço 4: CA33
Poço 5: CA32.
Poço 6: CA33.
Poço 7: FC 06/06/06.
Poço 8: CA11.
Poço 9: FCN- 16/11/06.
64
5.11 AMPLIFICAÇÃO DO GENE 16S rRNA A PARTIR DO DNA EXTRAÍDO DA
CANA-DE-AÇÚCAR.
O DNA extraído de colmo de cana de açúcar da amostra CA01 foi amplificado
por PCR utilizando o par de oligonucleotídeos iniciadores 27f-1492r, que amplifica
aproximadamente 1.500 pb do gene 16S rRNA a partir da extremidade 5’. Esse par de
oligonucleotídeos iniciadores é utilizado para amplificação do gene 16S rRNA do
domínio Bacteria (TIAN et al., 2005).
Porém, como pode ser visto no gel da figura 9, houve a amplificação de um
produto de PCR inespecífico, de cerca de 2.000 pb. Esse fragmento de DNA tem o
mesmo tamanho que o gene 18S rRNA mitocondrial da cana-de-açúcar e constituiria
um fragmento clonado indesejável nas bibliotecas do gene 16S rRNA para análise da
diversidade de bactérias endofíticas. Esse par de oligonucleotídeos iniciadores foi
utilizado em apenas uma amostra analisada nesse tabalho, a amostra CA01, triturada
em tampão.
Para evitar a amplificação de um produto de PCR inespecífico nas demais
amostras, a reação de PCR foi realizada com o par de oligonucleotídeos iniciadores
27f-16S805r, que amplifica aproximadamente 800 pb da extremidade 5` do gene 16S
rRNA
.
Uma análise realizada no programa Probe Match, disponível no sítio do RDP II
(http://rdp.cme.msu.edu/probematch/search.jsp) mostrou que os oligonucleotídeos
iniciadores 27f e 16S805r são capazes de anelar com sequências de representantes de
diferentes filos bacterianos (26 de um total de 34 disponíveis no banco de dados). Por
essa razão, esse último par de primers foi escolhido para a amplificação do DNA
extraído a partir dos demais extratos da cana-de-açúcar.
A figura 10 mostra o resultado da amplificação com o par de oligonucleotídeos
iniciadores 27f-16S805r. Neste caso, aparentemente não houve amplificação de
fragmento inespecífico.
65
FIGURA 9 PRODUTO DE AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO 27F-1492R DO GENE 16S
RRNA DE EXTRATOS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Eletroforese (60 V por 2 horas) em gel de agarose 1% em tampão TBE 1X do produto de PCR
amplificado com os oligonucleotídeos 27f-1492r a partir de DNA extraído das amostras de cana-de-
açúcar. Os poços 3-5 são de produtos de PCR amplificados a partir de folhas de cana-de-açúcar (dados
não mostrados nesse trabalho).
Poço 1: Marcador de peso molecular Gene ruler 1 kb DNA ladder (Fermentas).
Poço 2: CA01.
Poço 3-5: amostras de folha de cana-de-açúcar.
Poço 6: controle negativo (tubo de reação sem DNA).
2 kb
1,5 kb
1 2
3 4
5
6
66
FIGURA 10 PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO 27F-16S805R DE
ENDÓFITOS DE TECIDOS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Eletroforese (60 V por 2 horas) em gel de agarose 1% em tampão TBE 1X do produto de PCR
amplificado com os oligonucleotídeos 27f-16S805r a partir de DNA extraído de colmos de cana-
de-açúcar.
Poço 1: Marcador de massa molecular Gene ruler 1 kb DNA ladder (Fermentas).
Poço 2: CA22.
Poço 3: CA32.
Poço 4: CA33.
Poço 5: CA23
Poço 6: controle negativo (tubo de reação sem DNA)
750pb
1
2
3 4 5
6
67
5.12 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DO GENE 16S RRNA AMPLIFICADO DE
DNA EXTRAÍDO DE TECIDO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Os amplicons do gene 16S rRNA foram ligados em vetor pCR2.1 e
transformados em E. coli DH10B. Na tabela 6 estão listadas as amostras utilizadas, o
tamanho de fragmento clonado e o número de clones coletados e armazenados. Foi
observada uma grande variação na eficiência de clonagem e, consequentemente, no
número de transformantes contendo inserto. Foram coletados um mínimo de 192 clones
de cada amostra, totalizando 2.112 clones de 6 amostras. O DNA do colmo da planta
adulta, CA01, foi utilizado para amplificar os fragmentos amplificados de 1,5Kb e 0,8 kb
do gene 16S rRNA e ambos os fragmentos foram clonados.
Como não foi possível sequenciar todas as bibliotecas do gene 16S rRNA
representativas de todas as coletas (Tabela 5), priorizou-se a obtenção de bibliotecas
para amostras de plantas em diferentes estágios de maturação: amostras iniciais
(plantas jovens, 50 dias após plantio, amostras CA22 e CA23), amostras no final do
período experimental (270 dias após o plantio, amostras CA62 e CA63) e amostras de
plantas em época de colheita (CA01) (Tabela 6). Estas amostras permitiriam também
avaliar a diversidade endofítica em diferentes estações e, portanto, submetidas a
diferentes condições de temperatura, e regime pluviométrico.
68
TABELA 6. BIBLIOTECAS DO GENE 16S RRNA AMPLIFICADO DE DNA EXTRAÍDO
DE TECIDO DE CANA-DE-AÇÚCAR
O fragmento de 1,5 kb foi amplificado com o par de
oligonucleotídeos iniciadores 27f-1492r e o de 0,8 kb com o par
27f-16S805r
Para confirmar a clonagem e verificar o tamanho dos insertos, o DNA plasmidial
de 12 clones da biblioteca CA22 foi extraído e digerido com EcoRI (Figura 10). Essa
enzima foi utilizada porque o vetor no qual os produtos de PCR foram clonados (pCR
2.1) possui sítios de restrição EcoRI flanqueando o sítio de clonagem. Foram testadas
12 colônias brancas (indicando que houve a clonagem do inserto de 800 pb).
Amostra Tamanho
do fragmento clonado
Clones
coletados
CA01 1,5 Kb 192
CA01 0,8 Kb 672
CA22 0,8 Kb 288
CA23 0,8 Kb 480
CA62 0,8 Kb 192
CA63 0,8 Kb 288
69
FIGURA 11 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DE PRODUTOS DE
RESTRIÇÃO COM ECORI DOS CLONES DA BIBLIOTECA CA22 DE 16S RRNA DE
CANA-DE-AÇÚCAR
Eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE 1X, a 90 V por 1,5 hora do
DNA plasmidial purificado e digerido com a enzima EcoRI de clones da biblioteca
CA22.
Poço 1: Marcador de massa molecular Gene ruler 1 kb DNA ladder (Fermentas)
Poço 2 a 13: colônias brancas.
4 kb
1 2 3
4
5
6 7 8
9
10
11 12
13
70
5.13 EXTRAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL PARA SEQUENCIAMENTO
Para realizar as reações de sequenciamento dos genes 16S rRNA das
bactérias endofíticas presentes na cana-de-açúcar, o DNA plasmidial foi extraído pelo
método de lise alcalina. Essa etapa é crítica para a obtenção das sequências de DNA e
somente aquelas preparações contendo quantidade de plasmídio homogêneo, não
degradado e livre de contaminação de DNA cromossomal e RNA foram usadas para as
reações de sequenciamento (Figura 12).
As reações de seqüenciamento das bibliotecas do gene 16S rRNA foram
conduzidas em seqüenciador automático MEGABACE 1000 (GE Healthcare). A
qualidade das leituras de sequência obtidas neste aparelho é altamente sensível à
pureza das amostras de DNA. Inicialmente não foram obtidas leituras de seqüências
satisfatórias, sendo necessária a inclusão de uma etapa de purificação das
minipreparações de plasmídeos com resina Sephadex G-50. A inclusão desta etapa
resultou em aumento da qualidade do DNA sem causar perda da quantidade (Figura
13) e esse DNA foi utilizado para o sequenciamento dos clones.
71
FIGURA 12 DNA PLASMIDIAL PURIFICADO PARA SEQUENCIAMENTO DA
BIBLIOTECA CA22
Eletroforese a 90 V em gel de agarose 1% em tampão TBE 1X, por 1,5
hora do DNA plasmidial obtido por lise alcalina de 96 clones da bilioteca
CA22.
72
FIGURA 13 DNA PLASMIDIAL DA BIBLIOTECA CA22 PURIFICADO POR GEL
FILTRAÇÃO EM SEPHADEX G-50
Eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE 1X, a 90 V por 1,5
hora do DNA plasmidial obtido por lise alcalina e purificado por cromatografia
em SEPHADEX G-50 .
73
5.14 SEQUENCIAMENTO DAS BIBLIOTECAS DO GENE 16S RRNA
Foram sequenciados os insertos dos clones de 6 bibliotecas diferentes
(Tabela 8) a partir de DNA plasmidial extraído por lise alcalina e purificado em coluna
de Sephadex G-50. Nota-se, nessa tabela 8, que o número de clones submetidos ao
sequenciamento foi menor que o número de clones coletados (Tabela 6).
As bibliotecas derivadas da amostra CA01, bibliotecas CA0101 e CA0115, e
demais bibliotecas sequenciadas estão listadas na Tabela 7. O número de clones
sequenciados para cada biblioteca está mostrado também nessa tabela.
TABELA 7. NÚMERO DE CLONES SUBMETIDOS AO SEQUENCIAMENTO POR
BIBLIOTECA
Biblioteca Clones submetidos à reação de
sequenciamento
CA0115 96 clones
CA0101 288 clones
CA2201 192 clones
CA2301 192 clones
CA6201 192 clones
CA6301 96 clones
TOTAL 1056 clones
74
5.15 ESTATÍSTICAS DE SEQUENCIAMENTO
Os eletroforetrogramas gerados correspondentes aos sequenciamentos foram
analisados pelo programa PHRED para chamada de bases, determinação das
qualidades e eliminação das extremidades das sequências de acordo com a essa
qualidade. As sequências de bases resultantes foram utilizadas para as análises de
diversidade e identificação taxonômica. Foi gerado um total de 1.953 leituras de
sequências, das quais 697 foram descartadas devido à falta de sinal produzido pela
reação de seqüenciamento ou baixa qualidade de bases ao longo de toda a sequência
(tabela 8). As 1.256 sequências restantes corresponderam a 866 clones sequenciados,
com uma média de 1,45 sequência por clone (as sequências obtidas por clone variaram
de 1 a 5 sequências por clone).
75
TABELA 8. RESUMO DO SEQUENCIAMENTO DAS BIBLIOTECAS DO GENE 16S
rRNA
Bibliotecas No. de clones
sequenciados
Sequências de alta
qualidade
Sequências descartadas
CA0115X 69 101 (34%) 196 (66%)
CA01011 81 81 (84,4%) 15 (15,6%)
CA01014 65 65 (72,3%) 25 (27,7%)
CA22011 88 222 (57%) 168 (43%)
CA22021 90 162 (86,2%) 26 (13,8%)
CA23013 76 76 (79,2%) 20 (20,8%)
CA23014 51 82 (42,7%) 110 (57,3%)
CA62011 82 144 (75,8%) 46 (24,2%)
CA62012 83 83 (90,2%) 9 (9,8%)
CA63012 85 144 (75,0%) 48 (25,0%)
CD01013 96 96 (74,0%) 34 (26,0%)
TOTAL 866 1256 (64,3%) 697 (35,7%)
CA0115X: placa X da biblioteca do gene 16S rRNA obtido a partir de DNA extraído de colmo de cana
coletado no dia 06/06/06. Esse DNA foi amplificado com os primers 27 e 1492r e sequenciado com o
primer 27f. CA01011: placa número 1 da biblioteca do gene 16S rRNA obtido a partir de DNA extraído de
colmo de cana coletado no dia 06/06/06. Esse DNA foi amplificado com os primers 27 e 16805r e
sequenciado com o primer 27f. CA01014: placa número 4 da biblioteca do gene 16S rRNA obtido a partir
de DNA extraído de colmo de cana coletado no dia 06/06/06. Esse DNA foi amplificado com os primers
27 e 16805r e sequenciado com o primer 27f. CA22011: placa número 1 da biblioteca do gene 16S rRNA
obtido a partir de DNA extraído de colmo de cana coletado no dia 16/11/06, vindo do bloco abubado com
nitrogênio. Esse DNA foi amplificado com os primers 27f e 16805r e sequenciado com o primer 27f.
CA22012: placa número 2 da biblioteca do gene 16S rRNA obtido a partir de DNA extraído de colmo de
cana coletado no dia 16/11/06, vindo do bloco abubado com nitrogênio. Esse DNA foi amplificado com os
primers 27 e 16805r e sequenciado com o primer 27f. CA23013: placa número 3 da biblioteca do gene
16S rRNA obtido a partir de DNA extraído de colmo de cana coletado no dia 16/11/06, vindo do bloco
sem abubação nitrogenada. Esse DNA foi amplificado com os primers 27 e 16805r e sequenciado com o
primer 27f. CA23014: placa número 4 da biblioteca do gene 16S rRNA obtido a partir de DNA extraído de
colmo de cana coletado no dia 16/11/06, vindo do bloco sem abubação nitrogenada. Esse DNA foi
amplificado com os primers 27 e 16805r e sequenciado com o primer 27f. CA62012: placa número 2 da
biblioteca do gene 16S rRNA obtido a partir de DNA extraído de colmo de cana coletado no dia 26/06/07,
vindo do bloco com abubação nitrogenada. Esse DNA foi amplificado com os primers 27 e 16805r e
sequenciado com o primer 27f. CA63012: placa número 2 da biblioteca do gene 16S rRNA obtido a partir
76
de DNA extraído de colmo de cana coletado no dia 26/06/07, vindo do bloco sem abubação nitrogenada.
Esse DNA foi amplificado com os primers 27 e 16805r e sequenciado com o primer 27f. CD01013: placa
número 3 da biblioteca do gene 16S rRNA obtido a partir de DNA extraído de colmo de cana coletado no
dia 06/06/06. Esse DNA foi amplificado com os primers 27 e 16805r e sequenciado com o primer 27f.
77
5.15.1 ANÁLISES DE QUALIDADE
Após a avaliação da qualidade pelo programa PHRED, as regiões de
sequência de baixa qualidade das extremidades das sequências dos insertos foram
retiradas ou aparadas (trimming). A figura 14 mostra a distribuição dos comprimentos
(pb) das sequências não editadas e após editação das bibliotecas do gene 16S rRNA.
Essas sequências foram aparadas utilizando a opção “-trim_alt” do programa PHRED.
No total foram analisadas 1.256 sequências. Essa etapa causou a perda de,
aproximadamente, 300 pb em cada sequência.
Não houve perda significativa de bases de alta qualidade (≥20) quando as
sequências foram aparadas (figura 15), mas houve um aumento na qualidade média
das bases em cada sequência (figura 16) confirmando que as bases retiradas foram
bases de baixa qualidade.
Essas sequências aparadas foram usadas nas análises posteriores.
78
FIGURA 14. DISTRIBUIÇÃO DOS COMPRIMENTOS DE SEQUÊNCIA
D
istribuição dos comprimentos das sequências não editadas e após editação pelo programa
PHRED. No eixo X estão os comprimentos das sequências (em pb) e no eixo Y o número de
sequências.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
<100
1
01
-2
00
201-
3
00
301-
4
00
401-500
5
01
-60
0
6
01
-700
7
01
-80
0
801-
9
00
90
1
-
1
00
0
1
0
01
-
1
1
00
1
1
01
-12
0
0
12
0
1-13
0
0
comprimento (pb)
nº de sequências
Não aparadas
Aparadas
79
FIGURA 15 .DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DAS SEQUÊNCIAS COM VALOR DE
PHRED >20
0
50
100
150
200
250
300
<100 101-200 201-300 301-400 401-500 501-600 601-700
comprimento (pb)
nº de sequências
Não aparadas
Aparadas
Comparação entre sequências aparadas e não aparadas com valor médio de PHRED>20.
80
FIGURA 16. DISTRIBUIÇÃO SEQUÊNCIAS DE ACORDO COM VALOR PHRED
DE QUALIDADE.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
<10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60
intervalo de valor de qualidade Phred
nº de isolados
Não aparadas
Aparadas
Análise dos valores PHRED de qualidade com as sequências aparadas e não aparadas.
81
5.16 COMPARAÇÃO ENTRE AS SEQUÊNCIAS OBTIDAS DE BACTÉRIAS
ENDOFÍTICAS PRESENTES NA CANA DE AÇÚCAR COM BANCO DE DADOS
As sequências de nucleotídeos de alta qualidade foram comparadas com o
banco de dados Genbank utilizando o programa BLASTn (www.ncbi.nlm.nih.gov) e o
programa Seqmatch do banco de dados RDP II (http://rdp.cme.msu.edu/), que faz uma
busca por sequências de alta identidade com as sequências alvo. Foram analisadas
sequências das amostras CA01, CA22, CA23, CA62 e CA63 (Tabela 8).
5.16.1 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DE 16S rRNA DA AMOSTRA CA01
5.16.1.1 ANÁLISE PELO PROGRAMA BLASTn
Foram analisadas 186 sequências do gene 16S rRNA da amostra CA01
(Anexo Tabela 1). Dessas, 157 são de bibliotecas construídas a partir de produto de
PCR amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores 27f-16S805r (tabela 9) e 29 são
de inserto de 1500 pb clonado, a partir de amplificação com os primers universais 27f-
1492r (Tabela 10). O comprimento das sequências variou de 344 pb a 654 pb.
Todos os clones apresentaram identidade maior que 90% com pelo menos
uma sequência do Genbank. A maioria (150 clones – 92,6%) dos clones de 16S rRNA
foram classificados na classe γ-Proteobacteria. As duas famílias encontradas foram
Pseudomonadaceae e Enterobacteriaceae. O gênero mais frequentemente encontrado
foi Pseudomonas, com 80 clones com identidade de sequência entre 90-100% com as
sequências do banco de dados Genbank. A família Enterobacteriaceae está
representada com 69 clones. Entre esses, 34 clones foram identificados como do
82
gênero Enterobacter, 14 como Pantoea, 2 como Citrobacter e 1 como Klebsiella.
Os demais clones (6,7% do total) apresentaram a maior identidade com
sequências de bactérias não cultivadas e foram então classificadas, em diversos
táxons, por comparações com o Genbank.
83
TABELA 9. IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DO COLMO DE CANA-
DE-AÇÚCAR DA BIBLIOTECA CA0101 COM BASE NA SEQUÊNCIA DO GENE 16S
RNA
OTU CLONES IDENTIFICAÇÃO NÚMERO DE
ACESSO
% DE
IDENTIDA-
DE
1
COBERTURA
DO QUERY
1
1 1 Enterobacter sp FJ784695.1 97% 98%
6 2 Enterobacter sp. EU653006.1 98% 99%
22 1 Enterobacter sp FJ870557.1 97% 100%
7 4 Enterobacter ludwigii GQ380575.1 98% 99%
10 12 Enterobacter ludwigii FJ859683.1 99% 100%
17 3 Enterobacter cloacae EF219421.2 99% 100%
9 1 Pantoea sp. EU887713.1 99% 99%
13 6 Pantoea agglomerans FJ603033.1 100% 100%
20 2 Pantoea agglomerans EU931561.1 98% 99%
3 1 Uncultured Pantoea sp. FJ193637.1 100% 100%
5 7 Pantoea dispersa GQ246183.1 96% 99%
11 1 Uncultured Serratia sp. DQ279305.1 100% 99%
18 48 Pseudomonas
plecoglossicida
GQ301534.1 98% 100%
21 5 Pseudomonas putida DQ482656.1 99% 100%
25 2 Pseudomonas sp. EF581816.1 90% 100%
26 1 Pseudomonas sp. AB508856.1 94% 97%
28 16 Pseudomonas sp. FJ577973.1 94% 98%
31 1 Pseudomonas sp. FJ719329.1 98% 98%
33 1 Pseudomonas sp. FN421341.1 99% 99%
35 2 Pseudomonas sp. EU580707.1 99% 100%
29 1 Uncultured
Pseudomonadaceae
EU721823.1 96% 100%
19 2 Citrobacter freundii
2
GQ983053.1
98% 100%
23 16 Enterobacteriaceae
2
EU272859.1 99% 99%
2 1 Enterobacter sp
2
FN433019.1 88% 70%
4 1 Pantoea ananatis
2
AY579212.1 98% 100%
12 2 Enterobacter cloacae
2
AB244469.1 99% 100%
8 1 Klebsiella oxytoca
2
GU003834.1 99% 100%
14 5 Enterobacter sp
2
GQ360072.1 92% 87%
15 2 Enterobacteriaceae
2
DQ068793.1
99% 100%
16 4 Enterobacter sp
2
GQ062425.1 99% 99%
27 1 Enterobacteriaceae
2
DQ221401.1 96% 100%
30 1 Pseudomonas sp
2
EF581815.1 90% 78%
34 3 Pseudomonas sp
2
EF179816.1 99% 99%
1
Para as sequências tiveram alta identidade com mais de um clone, os valores de identidade e cobertura
(da query em relação à sequência do banco de dados) são uma média das porcentagens de identidade e
cobertura apresentadas pelos clones individualmente
2
Sequências anotadas como bactérias não
cultivadas foram classificadas em taxons baseando-se em comparações com o Genbank.
84
TABELA 10. IDENTIFICAÇÃO COM BASE NA SEQUÊNCIA DO GENE 16S rRNA DE
BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DO COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR DA
BIBLIOTECA CA0115
IDENTIFICAÇÃO NÚMERO DE
ACESSO NO
GENBANK
NÚMERO DE
CLONES
IDENTIDADE COBERTU-
RA DO
QUERY
Pseudomonas putida GQ240852.1 1 99% 98%
Pseudomonas
plecossida
EF600884 1 98% 99%
Pseudomonas monteilli GQ284481.1 1 98% 100%
Pseudomonas
aeruginosa
DQ318225.1 1 97% 99%
Pseudomonas sp GQ 284541.1 8 99% 99%
Pseudomonas sp GQ 284545.1 11 99% 98%
Pseudomonas sp FJ719329.1 1 98% 97%
Pseudomonas sp FJ646635.2 1 97% 100%
Uncultured Citrobacter GQ130029.1 1 100% 100%
Klebsiella oxytoca GQ144701.1 1 98% 100%
Stenotrophomonas sp AB461796.1 1 99% 98%
Enterobacter sp EU693574.1 1 96% 99%
TOTAL DE CLONES 29
85
5.16.2 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DO GENE 16S rRNA DA AMOSTRA CA22
Foram obtidas sequências de 86 clones do gene 16S rRNA amplificado da
amostra CA22. Essa biblioteca foi feita com produtos de PCR amplificados a partir do
colmo de cana-de-açúcar com 50 dias após plantio e que recebeu adubação
nitrogenada. Como observado na tabela 11, a maior parte das sequências apresentou
um tamanho entre 400 e 600 pb, sendo 36 sequências com comprimento de entre 401 e
500 pb e 27 entre de 501 e 600 pares de base.
TABELA 11. RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO DA AMOSTRA CA22
Apenas 3 sequências apresentaram semelhança com 16S rRNA bacteriano,
que corresponde a sequências de α-proteobacterias da espécie Asaia bogorensis,
Devosia sp e Roseomonas sp.
Quando comparadas com o Genbank, a maioria das sequências obtidas
apresentou alta identidade (~97%) com sequências de gene 18S rRNA mitocondrial.
Sabe-se que os ribossomos mitocondriais das plantas contem RNA ribossomal 5S, 18S
e 26S e que estes rRNAs são similares aos RNAs de bactérias e cloroplastos
(NEWTON, 1988). Na lista de hits extraída do programa, apareceram também
sequências de 16S rDNA de diversas bactérias, principalmente de bactérias não
cultiváveis (tabela 17 – Anexo). Baseando-se nessas informações, estas sequências
foram consideradas prováveis produtos de amplificação do gene 18S rRNA de cana-de-
açúcar. A amplificação do gene 18S rRNA mitocondrial não era esperada porque a
eletroforese dos produtos de PCR mostrou a presença apenas de um fragmento.
Entretanto, a comparação da sequência dos oligonucleotídeos iniciadores 27f e
16S805r com a sequência do gene 18S rRNA de Sorghum bicolor confirmou a
Comprimento (pb) Número de sequências
100-200 5
201-300 4
301-400 5
401-500 36
501-600 27
>600 9
86
possibilidade de amplificação do gene mitocondrial. A maior parte dos alinhamentos
com sequências de DNA mitocondrial mostraram uma alta identidade com sequências
de mitocôndria de S. bicolor.
Análises com o programa Seqmatch mostraram resultados semelhantes, com
uma alta prevalência de sequências de mitocôndria similares às sequências dos clones.
Uma análise comparativa das sequências do gene 16S rRNA de E. coli e 18S rRNA de
mitocôndria de Sorghum bicolor foi realizada a fim de verificar essa possibilidade de
amplificação do DNA. Essa análise apontou a presença de regiões conservadas para
estes genes nos locais de anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores usados para
amplificação (Figura 17). Através destas sequências foi possível inferir a amplificação
de 1.503pb e 1.917pb para E. coli e S. bicolor, respectivamente, com os pares de
oligonucleotídeos iniciadores 27f/1492r. Para o par 27f/16S805r os fragmentos são de
798pb e 831pb.
87
FIGURA 17. ALINHAMENTO ENTRE AS SEQUÊNCIAS DOS GENES DE 18S RRNA
DE MITOCÔNDRIA DE Sorghum bicolor (N
O.
DE ACESSO NO GENBANK, DQ984518)
E DE 16S rRNA DE Escherichia coli (N
O.
DE ACESSO NO GENBANK, NC_000913).
10 20 30 40 50 60 70
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
atcatagtcaaaatct-gagtttgatcctggctcagaaggaacgctagctatatgcttaacacatgcaag
E. coli
---------aaattgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaag
27f
80 90 100 110 120 130 140
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
tcgaacgttgttttcggggagctgggcagaaggaaaagaggctcctagctaaagttgtctcgccctgctt
E. coli
tcgaacg--gt--------aacagga-agaagctt----gcttctttgctgacga-gtggcggacgggtg
150 160 170 180 190 200 210
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
caaaactacagggcgcgcgc-tacggctttgacctaactccgtttgctggaatcggaa--tagttgagaa
E. coli
agtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactac------tggaaacggtagctaataccgca
220 230 240 250 260 270 280
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
caaagtggcgaacgggtgcgtaacgcgtgggaatctgccgaacagttcgggccaaatcctgaagaaagct
E. coli
taacgtcgc-aa---gacc--aaagaggggga-----cc------ttcgggcc---tcttg---------
290 300 310 320 330 340 350
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
caaaagcgctgtttgatgagcctgcgtagtattaggtagttggtcaggtaaaggctgaccaagccaatga
E. coli
ccat--cg------gatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacga
360 370 380 390 400 410 420
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
tgcttagctggtcttttcggatgatcagccacactgggactgagacacggcccggactcccacggggggc
E. coli
tccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggc
430 440 450 460 470 480 490
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....
S. bicolor
agcagtggggaatcttggacaatgggcgaaagcccgatccagcaatatcgcgtgagtgaagaagggcaat
E. coli
agcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggcc--t
500 510 520 530 540 550 560
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor g
ccgcttgtaaagctctttcgtcg-------agtgcgcga---------------tcat-gacaggactc
E. coli
tcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggagtaaagttaatacctttgctcattgacgttaccc
570 580 590 600 610 620 630
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor g
aggaagaagccccggctaactccgtgccagcagccgcggtaagacggggggggcaagtgttcttcggaa
E. coli g
cagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaa
88
640 650 660 670 680 690 700
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
tgactgggcgtaaagggcacgtaggcggtgaatcgggttgaaagtgaaagtcgc---caaaaagtggcgg
E. coli
ttactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgg-ga
710 720 730 740 750 760 770
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
aatgc-tctcgaaac---caattcacttgagtgagacagaggagagtggaatttcgtgtgtaggggtgaa
E. coli
actgcatct-gatactggcaag---cttgagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaa
780 790 800 810 820 830 840
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
atccgtagatctacgaaggaacgccaaaagcgaaggcagctctctgggtccctaccgacgctggggtgcg
E. coli
atgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcg
850 860 870 880 890 900 910
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
aaagcatggggagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatga-gtgttcgccctt
E. coli
aaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggtt
16S805r
920 930 940 950 960 970 980
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor g
-gtctacgcggatcaggggccc-agctaacgcgtgaaacactccgcctggggagtacggtcgcaagacc
E. coli g
tgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggtt
990 1000 1010 1020 1030 1040 1050
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor g
aaactcaaaggaattgacgggggcctgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatacaacgcgca
E. coli
aaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaa
1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
aaaccttaccagcccttgacatatgaacaacaaaacctgtccttaacgggatggtac--t---ga-cttt
E. coli g
aaccttacctggtcttgacat-----ccacggaagttttcagagatgagaatgtgccttcgggaaccgt
1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
catacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgtttggtcaagtcctataacgagcgaa
E. coli g
agacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgca
1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
accctcgttttgtgttgctgagacatgcgcctaaggagaaatagccgaggagccgagtgacgtgccagcg
E. coli
acccttatcctttgttgc-----------------------------------------------cagcg
1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
ctactacttgattgagtgccagcacgtagctgtgctttcagcaagaatttcaccattgggagccggtgcc
E. coli -------------------------------gt-----------------------------ccgg----
89
1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
tttcgaagcactttcacgtgtgaaccgaagtcgtcttgccgaactcaagacccacggagacctacctata
E. coli
------------------------ccg----------g--gaactcaa----------------------
1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor g
tgacgtcaaagtaccagtgagcatggaggtttggttaggcttggttacgagtcgagttggcggcggagg
E. coli
-------------------------------------------------------------------agg
1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
aagactcggcatgaaggccagccgcccggtggtgtggtacgtagtggtaatagtacgcgccccgctccga
E. coli
a---------------------------------------------------------------------
1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
aacaaagaaaaaggtgcgtgccgcactcacgagggactgccagtgagatactggaggaaggtggggatga
E. coli
----------------------------------gactgccagtgataaactggaggaaggtggggatga
1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
cgtcaagtccgcatggcccttatgggctgggccacacacgtgctacaatggcaatgacaatgggaagcaa
E. coli
cgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcga
1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor gg
ctgtaaggcggagcgaatccggaaagattgcctc--agttcggattgttctctgcaactcgggaacat
E. coli
cctcgcgagagcaagcgga-cctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccat
1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor g
aagttgaaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatatgtacccgggccctgtacacacc
E. coli g
aagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacacc
1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor g
cccgtcacaccctgggaattggtttcgcccgaagcatcggaccaatgatcacccatgacttctgtgtac
E. coli g
cccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagta--gg---------------tagctt--------
1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. bicolor
cactagtgccacaaaggcctttggtggtcttattggcgcataccacggtggggtcttcgactggggtgaa
E. coli
-------------aa--ccttcgggag-------ggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaa
1970 1980 1990 2000
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....
S. bicolor g
tcgtaacaaggtagccgtaggggaacctgtggctggattgaatcc---
E. coli gtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctta
1492r
90
5.16.3 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DO GENE 16S rRNA DA AMOSTRA CA23
Foram sequenciados 127 clones da amostra CA23. Essa biblioteca foi feita
com produtos de PCR amplificados a partir do colmo de cana-de-açúcar com 50 dias
após plantio, do bloco que não recebeu adubação nitrogenada. A maior parte das
sequências apresentou entre 301 e 600 pb, sendo 15 entre 301 e 400 pb, 9 entre 401 e
500 pb e 26 entre 501 e 600 pb (Tabela 12).
TABELA 12. RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO DA AMOSTRA CA23
Nessa biblioteca também houve uma grande prevalência (98,5%) de
sequências com alta identidade com a sequência do gene 18S rRNA de mitocôndria
(mais de 97% de identidade). Da mesma maneira que a biblioteca CA22, as análises
feitas pelo programa BLASTn mostraram muitas sequências de genes 18S rRNA de
mitocôndrias de diversas plantas (Tabela 3 Anexo).
Uma das sequências possui alta identidade (98%) com uma sequência de
uma α-Proteobacteria do gênero Asaia sp. e outra similar a uma Phyllobacteriaceae (α-
Proteobacteria). Esses resultados também foram confirmados por análises com
programa Seqmatch do RDP.
Tamanho de sequência Número de sequências
0-100 pb 4
100-200 pb 12
201-300 pb 19
301-400 pb 22
401-500 pb 15
501-600 pb 51
>600 pb 4
91
5.16.4 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DO GENE 16S rRNA DA AMOSTRA CA62
Essa biblioteca é do colmo de cana-de-açúcar com aproximadamente 9
meses após o plantio (270 dias após plantio). Foram obtidas 156 sequências dessa
biblioteca, com comprimento entre 204 a 633pb, considerando valores de PHRED ≥20.
A distribuição das sequências e seus tamanhos estão mostrados (Tabela 13).
TABELA 13. RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO DA AMOSTRA CA62
Tamanho de sequência Número de sequências
200-300 pb 8
301-400 pb 17
401-500 pb 31
501-600 pb 83
>600 pb 17
A análise realizada no programa BLAST mostrou a existência de bactérias não
cultivadas (2), com identidade igual ou maior que 97%, a uma β-proteobactéria da
família Alcaligenaceae (98% de identidade) e de uma sequência similar à sequências
de uma α-proteobacteria da família Rhizobiaceae (97%).
Também foram observadas várias sequências homólogas à sequência de 18S
rRNA de DNA mitocôndria, com mais de 97% de identidade (Tabela 19 – Anexo) e
foram desconsideradas para as análises filogenéticas.
5.16.5 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DO GENE 16S rRNA DA AMOSTRA CA63
Essa biblioteca de 16S rRNA é do colmo de cana-de-açúcar com
aproximadamente 9 meses após plantio (270 DAP - dias após plantio), e que não
recebeu adubação nitrogenada. Foram obtidas 79 sequências dessa biblioteca, com
comprimento de sequência de 147 a 662pb, com valor PHRED ≥ 20. A distribuição das
92
sequências e seus tamanhos estão mostrados (Tabela 14).
TABELA 14. RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO DA AMOSTRA CA63
Tamanho de sequência Número de sequências
<200 5
200-300 pb 5
301-400 pb 2
401-500 pb 12
501-600 pb 35
>600 pb 20
Nessa biblioteca foram encontradas sequências 2 homólogas às sequências
de bactérias relacionadas à família Rhizobiaceae (99% de identidade). Foi encontrada
também uma bactéria não-cultivável.
5.17 ANÁLISES FILOGENÉTICAS DAS BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ASSOCIADAS À
CANA-DE-AÇÚCAR OBTIDAS POR MÉTODO INDEPENDENTE DE CULTIVO
A fim de se estabelecer o posicionamento filogenético das bactérias
encontradas em colmo de cana-de-açúcar, as sequências dos clones que apresentaram
alta identidade com gene 16S rRNA de bactérias do banco de dados foram utilizadas
para proceder as análises filogenéticas. Nessas análises foram utilizadas sequências de
todas as bibliotecas (157 da biblioteca CA0101, 29 da biblioteca CA0115, 3 da
biblioteca CA22, 1 da CA23, 2 da CA62 e 3 da CA63).
Inicialmente as sequências foram alinhadas pelo programa ClustalW,
disponível no programa BioEdit. Em seguida, esse alinhamento foi salvo em formato
FASTA e utilizado pelo programa MEGA4 para a construção das árvores, através do
método neighbor-joining. A árvore filogenética obtida, com as 195 sequências dos
clones, não mostrou ramos e grupos confiáveis (valores de bootstrap muito baixos).
93
Para melhorar a análise, foram utilizadas na árvore apenas uma ou duas
sequências representativas de cada UTO (definidas como sequências que
apresentaram a mais alta identidade com uma mesma sequência do banco de dados)
(Tabela 9, 10 e 16). O resultado dessa análise (Figura 18) mostra claramente o
posicionamento das sequências em três grupos distintos: um com representantes da
família Pseudomonadaceae, um relacionado à família Enterobacteriaceae e outro com
clones com identidade com α-Proteobacteria, β-Proteobacteria e bactérias não
cultivadas. Nesse último, o clone CA62011D09 agrupou com uma sequência de uma
bactéria não cultivável e com uma sequência do gênero Streptococcus, ambas são
resultados da análise com o programa BLASTn. As sequências dos clones
CB62011B11, CB2304F11 e CA22012G04 são semelhantes às sequências de 16S
rRNA de α-Proteobactéria e de bactérias não-cultivadas.
Com o objetivo de melhorar a análise e dar maior confiabilidade aos
grupos e ramos formados, foram construídas árvores com cada subgrupo
separadamente.
94
FIGURA 18. ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS SEQUÊNCIAS DOS CLONES DAS
BIBLIOTECAS DE 16S rRNA DE COLMO DE CANA DE AÇÚCAR.
CA01011F11E
FJ009375.1 Enterobacter cancerogenus
CA01014E11KPa
AF543283.1 Klebsiella oxytoca
CA01011C05U E
CA01011E08E C
FJ405369.1 Enterobacter sp.
AM184214.1 Pantoea agglomerans
AB461815.1 Enterobacteriaceae bacterium
CA01011H09E Ef
CD01013E10E
CA01011H11U E
gi|161085548|dbj|AB369191.1| Uncultured
CA01011C10E Ef
CA01014C04E Pa
CA01011D02E
EU272859.1 Enterobacter sp
CA01011B07U K
FJ592991.1 Citrobacter sp
CD01013G12Pa
EF522820.1 Pantoea sp
FJ756350.1 Pantoea dispersa
CA01011E05U Pa
CA01014G04U Pa
FJ799754.1 Pantoea sp
CA01011A02Pa
EU816766.1 Pantoea sp
EU331415.1 Pantoea ananatis
CD01013H03U
FJ608707.1| Pseudomonas fluorescens
FJ577973.1 Pseudomonas sp
EU734169.1 Pseudomonas plecoglossicida
FJ646634.2 Pseudomonas sp
EF179822.1 Uncultured bacterium
FJ947054.1 Pseudomonas putida
CA01011B03P
CA01011A01U
CA01011D06U
CA01011G10P
CA01011C09P
FJ897847.1 Pseudomonas monteilii
DQ095908.1 Pseudomonas plecoglossicida
GQ104213.1 Uncultured bacterium
FJ768454.1 Pseudomonas putida
FJ407181.1 Pseudomonas fluorescens
EF581816.1 Pseudomonas sp
CA01014F06P
CA01013G01P
CA01011A03U P
CA01014C05PE
CA01011D01U P
CD01013A06P
GQ267990.1 Uncultured bacterium
GQ253962.1Streptococcus thermophilus
CA62011D09
FM873154.1 Uncultured bacterium
CA62011D12
CB62011D12
FJ719348.1 Achromobacter sp
CB62011B11
FJ978626.1 Uncultured bacterium
FJ437556.1Uncultured bacterium
AB292237.1 Asaia bogorensis
CB23014F11
EU742164.1 Roseomonas cervicalis
CA22012G10
DQ227786.1 Devosia sp
CA22012G04
AB485242.1| Uncultured bacterium
CA62012A02
GQ486032.1Agrobacterium tumefaciens
GQ355323.1Rhizobium sp
CB63012F03
EU401908.1 Agrobacterium sp
EF695652.1 Uncultured alpha proteobacter
99
57
99
51
99
99
99
99
99
99
81
79
79
92
30
99
29
36
24
22
15
2
0
44
93
78
66
33
19
85
96
99
53
55
58
56
37
25
26
15
29
0.02
Pseudomonadaceae
Enterobacteriaceae
α/β Proteobacteria /
bactéria não cultivada
95
Legenda da Figura 18: Esta árvore filogenética foi construída usando o método neighbour-joining a partir
de distâncias calculadas pelo método de Jukes e Cantor (SAITOU e NEI, 1987). A árvore não possui raiz.
Os valores nos ramos representam porcentagens em relação às 2.000 amostragens bootstrap.
Na primeira reconstrução filogenética (019) estão as sequências dos clones
relacionados à família Enterobacteriaceae e sequências relacionadas, obtidas no banco
de dados do Genbank. De cada UTO foram usadas uma ou duas sequências dos
clones para fazer a análise.
Os resultados indicam que esse grupo foi dividido em 3 subgrupos, sendo um
deles próximo a bactérias do gênero Pantoea sp (CD01013G12, CD01013A07,
CA01011E05, CD1013B10, CD1013H02, CA01011A02). As letras “Pa” colocadas após
os nomes dos clones indicam o resultado da pesquisa de homologia, ou seja, que essas
sequências foram similares a sequências do gênero Pantoea sp. e o número em
parênteses indica a sequência do banco de dados que apresentou maior identidade. O
clone CA01011B07 cuja sequência possui alta identidade com sequências de 16S rRNA
de Klebsiella oxytoca, ficou entre os grupos de Klebsiella sp e de Citrobacter sp. As
sequências relacionadas aos gêneros Enterobacter sp e Klebsiella sp foram agrupadas
em ramos distintos. Os grupos formados foram também aqui condizentes com os
resultados das análises do BLASTn.
A figura 20 mostra a reconstrução filogenéticas das sequências relacionadas à
família Pseudomonadaceae. Foram escolhidas apenas algumas sequências
representativas desse grupo. Grande parte das sequências das bibliotecas de colmo de
cana de açúcar formaram grupos próprios, como por ex., os clones CA01014C05,
CD0103A06, CD01013A05, CA01011D01, CA01014F06, CA01013G01 e CD1013C01.
Os clones CD01013D03, CD01013E02 e CD01013E05 também formaram um ramo à
parte. Já os clones CA01011B10, CA01011D06, CA01011A03, CA01011A01,
CA01011G10, CA01011D08 e CA01011D05 formaram grupos incluindo sequências do
banco de dados.
96
FIGURA 19. ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS SEQUÊNCIAS DOS CLONES DAS
BIBLIOTECAS DE 16S rRNA DE COLMO DE CANA DE AÇÚCAR IDENTIFICADOS
COMO ENTEROBACTÉRIAS.
CD01013A07Pa(17)
gi|220967110Pantoea sp.cc29
CA01011E05Pa(17)
gi|224815298Pantoea dispersa cc20
GQ246183.1 Pantoea dispersa
CD01013G12Pa(17)
CD01013B10Pa(22)
CD01013H02Pa(22)
EU931561.1 Pantoea agglomerans
CA01011A02Pa(12)
AM909657.1 Pantoea sp
Pantoea agglomerans strain 2Re40
EU816766.1 Pantoea sp
Pantoea ananatis strain ESS29
FJ494899.1 Citrobacter freundii
gi|220962071Citrobacter freundii cc16
Citrobacter sp F5-4
Citrobacter freundii strain CB1
CA01011B07C(9)
gi|114149024Klebsiella sp.cc22
gi|114149023Enterobacter sp.cc22
Klebsiella pneumoniae
CA01014D05E(7)
CA01014B07E(23)
CA01011C02E(7)
EU653006.1 Enterobacter sp
CA01014E11E(5)
GQ169799.1 Enterobacter sp
CD01013D04E(7)
CA01014D04E(25)
CD01013D11E(7)
GQ247734.1 Enterobacter sp
CD01013C12E(7)
CA01014H02E(10)
Klebsiella pneumoniae strain iCTE653
gi|222427476Enterobacteriaceae bacterium
FJ784695.1 Enterobacter sp
FJ859683.1 Enterobacter ludwigii
Klebsiella pneumoniae strain iCTE659
CA01011D03E(4)
AB244469.1 Enterobacter cloacae
CD01013G11E(4)
EF219421.2 Enterobacter cloacae
CA01011F11E(18)
CA01011G04EB(18)
FJ405369.1 Enterobacter sp
Escherichia coli
AB461815.1 Enterobacteriaceae
AY297788.1 Enterobacter sp
CA01011F04E(6)
gi|126742066Enterobacter sp.cc33
CA01011C10E(5)
FJ189785.1 Enterobacter sp
Enterobacter sp GIST-NKst3
CA01011B05E(8)
CA01011E08E(15)
CA01014E07E(6)
FJ976582.1 Enterobacter cancerogenus
FJ870557.1 Enterobacter sp
CA01011G01E(14)
CA01011H09E(20)
CA01011H11E(8)
64
87
99
45
57
14
34
98
49
38
50
21
19
9
1
0
99
64
77
95
30
48
45
24
37
46
52
43
46
35
22
50
23
39
28
37
0.005
97
Esta árvore filogenética foi construída usando o método Neighbour-Joining a partir de distâncias
calculadas pelo método de Jukes e Cantor. A árvore não possui raiz. Os valores nos ramos representam
porcentagens em relação às 2.000 amostragens bootstrap. As sequências dos clones estão indicadas
com um ♦, e as sequências do Genbank tem o número de acesso anteriormente ao nome do organismo.
Após o nome do clone (código com 10 letras) há uma letra ou uma sílaba que indicam a identificação de
acordo com o programa BLASTn. As sílabas PA indicam alta identidade com Pantoea sp, a letra C indica
identidade com sequências de Citrobacter sp, a letra E com Enterobacter sp e EB indica identidade com
sequências identtificadas como da família Enterobacteriaceae. Após essa letra o número em parênteses
indica a UTO a que corresponde essa sequência.
98
CA01014C05P(21)
CD01013A06P(1)
CD01013A05P(21)
CA01011D01P(11)
CA01014F06P(1)
CA01013G01P(11)
CD01013C01P(11)
CD01013D03P(1)
CD01013E02P(1)
CD01013E05P(1)
CA01011B10P(11)
FJ577973.1 Pseudomonas sp(11)
FJ577973.1 Pseudomonas sp
CA01011D06(11)
CA01011A03P(1)
CA01011A01P(1)
EF179822.1 Uncultured bacterium
EF581816.1 Pseudomonas sp(21)
CA01011G10P(27)
DQ095908.1 Pseudomonas plecoglossicida
CA01011D08P(2)
DQ482656.1 Pseudomonas putida(2)
FJ897847.1 Pseudomonas monteilii
FJ768454.1 Pseudomonas putida
GQ104213.1 Uncultured bacterium
FJ646634.2 Pseudomonas sp
GQ240852.1 Pseudomonas putida(1)
EU734169.1 Pseudomonas plecoglossicida
FJ947054.1 Pseudomonas putida
CA01011D05P(1)
FJ719329.1 Pseudomonas sp(27)
FJ719329.1 Pseudomonas sp.
FJ608707.1 Pseudomonas fluorescens(24)
CA01014C07P(1)
FJ939286.1 Pseudomonas sp
GQ214327.2 Pseudomonas sp(13)
FJ407181.1 Pseudomonas fluorescens
CA01011C09P(13)
CD01013H03P(24)
AF543283.1 Klebsiella oxytoca
59
94
78
41
60
55
23
56
51
49
2
21
0
0.000.020.040.060.080.10
FIGURA 20. ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS SEQUÊNCIAS DOS CLONES DAS
BIBLIOTECAS DE 16S rRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR IDENTIFICADOS
COMO DA FAMÍLIA PSEUDOMONADACEAE
Esta árvore filogenética foi construída usando o método Neighbour-Joining a partir de distâncias
calculadas pelo método de Jukes e Cantor. A árvore não possui raiz. Os valores nos ramos representam
porcentagens em relação às 2.000 amostragens bootstrap. As sequências dos clones estão indicadas
com um ▲, e as sequências do Genbank tem o número de acesso anteriormente ao nome do organismo.
Após o nome do clone (código com 10 letras) há uma letra ou uma sílaba que indicam a identificação de
acordo com o programa BLASTn. A letra P indica identidade com sequências de Pseudomonas sp. Após
essa letra o número em parênteses indica a UTO a que corresponde essa sequência.
99
A figura 21 mostra a análise das sequências dos clones que não foram
classificadas nas famílias Enterobacteriaceae e nem na família Pseudomonadaceae.
Essas sequências vieram de amostras diferentes (CA62, CA63, CA22 e CA23)
daquelas na qual essas famílias predominaram, sendo a maioria desses clones
identificados como α-Proteobacteria. Os clones CA62012A02, CB63012F03,
CA22012G10 e CB62011B11 agruparam com sequências de α-Proteobacteria do
Genbank. Já os clones CA22012G04 e CA62011D12 agruparam com sequências de
bactérias não-cultivadas. A sequência CB23014F11 formou um ramo consistente junto
com uma sequência de uma alfa-proteobactéria e com de uma bactéria não-cultivada,
cuja sequência é semelhante a sequências de α-Proteobacteria.
100
FIGURA 21. ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS SEQUÊNCIAS DOS CLONES DAS
BIBLIOTECAS DE 16S rRNA DE COLMO DE CANA DE AÇÚCAR
Legenda: Árvore filogenética construída usando o método Neighbour-Joining a partir de distâncias
calculadas pelo método de Jukes e Cantor. A árvore não possui raiz. Os valores nos ramos representam
porcentagens em relação às 2.000 amostragens bootstrap.
101
5.18 ESTIMATIVAS DA DIVERSIDADE
Ao contrário das análises anteriores que foram feitas com as sequências
de todas as bibliotecas, as próximas análises incluem somente as sequências da
amostra CA01, de colmo de cana-de-açúcar adulta. Isso se deve ao fato de que
somente essa biblioteca obteve número de clones suficientes de 16S rRNA confirmados
como do Domínio Bacteria para proceder as análises.
5.18.1 COBERTURA DA BIBLIOTECA
O cálculo da cobertura foi feito com base na fórmula descrita no item
4.11.1, levando-se em consideração uma diferença (divergência) de 3%, indicando uma
identidade de sequência de 97%. Essa análise mostrou que a cobertura da biblioteca de
16S rRNA foi de 86%, ou seja, que 86% das principais espécies bacterianas definidas
com 97% de identidade de 16S rRNA foram recuperadas.
5.19 CURVA DE RAREFAÇÃO E CURVA DO COLETOR
A curva de rarefação mostra a distribuição das UTOs em relação ao
número de sequências obtidas (figura 22). Quando não há tolerância para uma única
diferença de nucleotídeo na sequência, o número de UTOs máximo não foi alcançado
(sequências únicas). Mas, considerando 3% de diferença (divergência), a curva mostra
que o número máximo de UTOs foi alcançado, sugerindo uma baixa diversidade na
população de bactérias endofíticas associadas à cana-de-açúcar. A distância de 5% foi
utilizada porque alguns autores relacionam essa distância com OTUs representando
102
famílias. Nesse caso a saturação também foi atingida, indicando que o número de
famílias presentes na amostra foi alcançado.
FIGURA 22 CURVA DE RAREFAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DOS GENES 16S rRNA DA
AMOSTRA CA01
Curva de rarefação
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Número de sequências analisadas
Número de OTUs
1%diferença 2%diferença 5%diferença 3%diferença
No eixo X está o número de sequências analisadas e no eixo Y o número de UTOs encontradas pelo
programa DOTUR nas diferentes diferenças de sequência (divergências) consideradas.
103
FIGURA 23 CURVA DO COLETOR DAS SEQUÊNCIAS DOS GENES 16S RRNA DA
AMOSTRA CA01
No eixo X está o número de sequências analisadas e no eixo Y o número de UTOs.
A amostra das sequências da biblioteca CA0101 também foi analisada
utilizando curvas do coletor com diferença (divergência) de 1%, 2% e 3%. Esse é um
tipo de análise que não se baseia em estimativa, como é o caso das curvas de
rarefação, mas mostra o real número de OTUs presentes na amostra.
A figura 23 mostra que quando UTOs são definidas como sequências com 3%
de diferença (ou 97% de identidade), o número máximo de UTOs é atingido. A curva
atinge saturação, indicando que esse número de sequências é o suficiente para
resgatarmos as UTOs presentes na amostra.
Curvas do coletor
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Sequências analisadas
Nùmero de OTUs
3%difference 2%difference 1%difference
104
5.20 ANÁLISE DA DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ASSOCIADAS À
CANA-DE-AÇÚCAR POR MÉTODO DEPENDENTE DE CULTIVO
O Núcleo de Fixação de Nitrogênio busca elucidar, entre outros aspectos da
fixação biológica de nitrogênio, os fatores que influenciam na relação planta-bactéria.
Dentro desse aspecto, o isolamento de bactérias para posterior caracterização e
identificação é um dos meios de se esclarecer melhor essa relação. E, ao comparar os
resultados obtidos por métodos independentes de cultivo e métodos dependentes de
cultivo podemos ter uma melhor visão da diversidade das bactérias
A Dra Claudia M. Didonet, durante o seu estágio de pós-doutorado, isolou
bactérias de colmo, raiz e folhas da cana-de-açúcar em meio ágar batata. Essa planta
foi proveniente da localidade de Altônia, noroeste do Paraná e não pertence à mesma
variedade que a planta utilizada nos experimentos cultivo independentes. As bactérias
endofíticas isoladas da cana-de-açúcar foram gentilmente cedidas pela Dra Claudia
para identificação bioquímica e molecular durante o mestrado (Magnani, 2005). Os
resultados das análises mostraram algumas discrepâncias entre os resultados obtidos
pelos métodos bioquímicos e os obtidos pelo sequenciamento parcial do gene 16S
rRNA. A fim de se conseguir uma melhor identificação das bactérias endofíticas
presentes no colmo e nas folhas da cana-de-açúcar e melhorar a qualidade das
sequências obtidas, parte das bactérias analisadas durante o mestrado e outras
isoladas do mesmo material tiveram seus genes 16S rRNA sequenciados novamente.
Essas sequências foram alinhadas e analisadas filogeneticamente, identificadas através
de pesquisa de homologia com sequências do banco de dados do NCBI, o Genbank.
Foram obtidas 32 sequências do gene 16S rRNA a partir de DNAs extraídos
de bactérias isoladas de colmo e de folha de cana-de-açúcar (Tabela 15).
O tamanho médio das sequências foi de aproximadamente 280-290 pares de base.
Essas sequências foram classificadas em 5 diferentes grupos. O grupo I, com 14
105
sequências identificadas como pertencente à família Enterobacteriaceae: 8
Enterobacter sp, 4 Pantoea sp, 1 Citrobacter, 1 Klebsiella sp e 1 com Erwinia sp e
Pantoea sp. Uma constatação importante em relação a esse grupo é que a maior parte
dos isolados classificados nesse grupo foram isolados do colmo da cana-de-açúcar. A
única exceção é o isolado FC2P, isolado de folha de cana-de-açúcar.
O grupo II contém dois isolados de colmo, o isolado CC38 contendo
sequência de 16S rRNA com alta identidade (98%) com uma sequência de Brevibacillus
isolado do solo. O outro isolado (CC18) foi identificado como pertencente ao gênero
Staphylococcus sp.
Apenas o isolado CC27 compõe o grupo III, que foi identificado como
Curtobacterium sp. O grupo IV, com 14 sequências, é composto de bactérias da família
Pseudomonadaceae. Nesse grupo, todos os isolados pertencem ao gênero
Pseudomonas sp. O último grupo (grupo V) contem apenas uma sequência, relacionada
a uma bactéria não-cultivada, relacionada à família Pseudomonadaceae.
A reconstrução da árvore filogenética baseada na homologia de sequência do
gene 16S rRNA (Figura 24) mostrou que os isolados CC29, CC20 e CC21 se
agruparam juntamente com sequências de Pantoea, de Erwinia e Kluyvera sp. O
isolado CC26 formou um ramo à parte com sequências de Enterobacter sp e
Enterobacter aerogenes. A bactéria endofítica isolada de colmo de cana-de-açúcar
identificada como CC14 está relacionada com sequências de Citrobacter sp e a CC22
com espécies de Klebsiella. Várias espécies identificadas como Enterobacter sp (FC2P,
CC37, CC46, CC33, CC43 e CC34 não formaram ramos consistentes com sequências
do banco de dados. Os valores de bootstrap variaram bastante, desde valores baixos
como 23 (constituindo ramos com pouca confiabilidade) até valores altos como 94.
Os resultados mostrados aqui sugerem que a comunidade de bactérias
endofíticas pode variar dependendo do órgão da planta analisado.
106
TABELA 15. RESULTADOS DA BUSCA POR IDENTIDADE DE SEQUÊNCIAS
REALIZADA PELO PROGRAMA BLASTN DAS SEQUÊNCIAS DAS BACTÉRIAS
Isolado
Grupos
Identidade máxima
(%)
Identificação
baseada na
sequência do gene
(BLAST)
Caracterização da bactéria cuja
sequência apresentou melhor
alinhamento com a sequência analisada
CC14 98%-264 nt idênticos Citrobacter sp Bactéria que degrada lignina
CC16 100%-267 nt idênticos Enterobacter sp Bactéria isolada de pasta de soja
CC20 99%-266 nt idênticos Pantoea sp P. agglomerans associada à plantas
CC21 99%-292 nt idênticos Pantoea Bactéria diazotrófica de cana-de-açúcar
CC22 100%-263 nt idênticos Klebsiella sp Sistema de tratamento de água
CC26 100%- 263 nt idênticos Enterobacter sp PGPR em arroz
CC29 100%-267 nt idênticos Erwinia sp/Pantoea
sp
Bactéria diazotrófica de cana-de-açúcar
CC33 100%-262 nt idênticos Enterobacter sp Planta tratada com água residual
CC37 98%-263 nt idênticos Enterobacter sp Colmos de soja de campo
CC43 100%-264 nt idênticos Enterobacter sp Bactéria isolada de pasta de soja
CC46
97%
-
261 nt idênticos
Enterobacter sp
Colmos de
soja de campo
CC47 100%-265 nt idênticos Pantoea sp Bactéria endofítica resistente a cobre
FC2P 99%-263 nt idênticos Enterobacter sp Colmos de soja de campo
CC34
Grupo I
Família
Enterobact
eri-aceae
100%-263 nt idênticos Enterobacter sp Bactéria isolada de pasta de soja
CC38 98%-286 nt idênticos Brevibacillus sp Identificação de PGPR de solo
CC18
Grupo II
Bacilli
99%-300 nt idênticos Staphylococcus sp Sedimento terrestre
CC27 Grupo III
Actino-
bacteria
100%-289 nt idênticos Curtobacterium sp Curtobacterium sp causadora de septicemia.
CC24 98%-244 nt idênticos Pseudomonas sp Bactéria degradadora de óleo
CC35
FC5
98%-244 nt idênticos Pseudomonas sp Bactéria degradadora de óleo
FC6
FC10
96%-239 nt idênticos Pseudomonas sp Bactéria isolada do mar do Ártico
FC12
99%
-
331 nt
idênticos
Pseudomonas
sp
PGPR de raiz de milho
FC16
100%
-
247 nt
idênticos
Pseudomonas
sp
Um potencial agente de biocontrole
FC18
100%
-
247 nt
idênticos
Pseudomonas
sp
Um potencial agente de biocontrole
FC19
100%
-
247 nt
idênticos
Pseudomonas
sp
Um potencial agente de biocontrole
FC22
100%
-
242 nt
idênticos
Pseudomonas
sp
Pseudomonas fluorescens
de plantas
FC23
98%
-
243 nt
idênticos
Pseudomonas
sp
Bactéria retirada de uma região de um
FC35
98%
-
330 nt
idênticos
Pseudomonas
sp
PGPR de raiz de milho
FC38
98%-243 nt idênticos Pseudomonas sp Bactéria retirada de um riacho
98%
-
242 nt
idênticos
Pseudomonas
sp
Um poten
cial agente de biocontrole
97%
-
242 nt
idênticos
Pseudomonas
sp
Sedimento Marinho do Ártico
FC40
Grupo IV
Família
Pseuodo-
monada-
ceae
97%-283 nt idênticos Pseudomonas sp Bactérias endofíticas isoladas de Pinus
FC26 Group V 96%-239 nt idênticos Uncultured bacterium Bactéria retirada de um riacho
107
FIGURA 24. ANÁLISE FILOGENÉTICA DOS ISOLADOS DE CANA-DE-AÇÚCAR
IDENTIFICADOS COMO DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE
CC29
CC20
Pantoea dispersa cc20
Pantoea sp 092305
Pantoea sp cc29
Erwinia sp CU208
Erwinia sp8cc29(fromsugarcane)
Kluyvera sp DV48
CC21
Kluyvera cryocrescens cc20
Enterobacter sp cc26
CC26
Enterobacter aerogenes cc26
Pantoea ananatis strain ESS29
Pantoea agglomerans strain 2Re40
Citrobacter sp F5-4
CC14
Citrobacter freundii
Klebsiella sp cc22
Klebsiella pneumoniae
CC22
Pantoea agglomeranscc37
Serratia marcescens strain LHA
Pseudomonas fluorescens strain 3B
FC2P
CC37
CC46
CC33
Enterobacter sp cc33
Enterobacter sp GIST-NKst3
CC43
CC34
Enterobacter sp cc43
CC16
Enterobacter cloacae strain SREPS1
100
87
98
98
68
67
94
68
57
42
73
61
75
86
68
37
38
23
42
34
69
88
57
94
0.005
108
Legenda: Esta árvore filogenética foi construída usando o método neighbour-joining a partir de
distâncias calculadas pelo método de Jukes e Cantor (SAITOU e NEI, 1987). Os valores nos
ramos representam porcentagens em relação às 2.000 amostragens bootstrap.
5.20.1 ISOLAMENTO E CONTAGEM DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS EM CANA-DE-
AÇÚCAR RB-72454 (AMOSTRA CA01)
A amostra de colmo CA01 foi submetida à esterilização externa, e o tecido
interno do colmo foi diluído em tampão com auxílio de pistilo e gral e posteriormente
plaqueado em meio NFbHPN e LA para contagem de colônias. Em meio NFHPN-lactato
foram obtidas 7,3 x 10
6
unidades formadoras de colônias (UFC) por grama de colmo e
em meio LA 2,4 x 10
7
UFC por grama de colmo.
109
6 DISCUSSÃO
As plantas constituem um complexo ecossistema onde a comunidade
microbiana interage continuamente, competindo por nutrientes, água e abrigo nos
tecidos do hospedeiro. As bactérias endofíticas podem exercer um papel importante no
desenvolvimento das culturas de interesse agronômico, promovendo um maior
crescimento vegetal ou protegendo essas culturas contra doenças (STURZ et al., 2000).
Por outro lado, as plantas proporcionam um ambiente seguro para esses
microrganismos (
LODEWYCKX et al., 2002
). Portanto, o conhecimento da
diversidade endofítica, além de ser importante para a compreensão da ecologia
microbiana na planta, pode ser aplicado para melhorar a produtividade e facilitar o
manejo dessas culturas.
Desde o isolamento da bactéria diazotrófica Beijerinckia fluminensis em 1958
em rizosfera de cana-de-açúcar, muitos estudos tem focado a caracterização e
isolamento de organismos fixadores de nitrogênio nessa planta (RUSCHEL &
DÖBEREINER, 1958). Sabe-se que este grupo de bactérias pode trazer muitos
benefícios à cultura da cana-de-açúcar, seja pela fixação de nitrogênio e consequente
diminuição no uso de adubos nitrogenados ou pela promoção de crescimento vegetal.
As bactérias endofíticas mais comumente encontradas em raízes, colmos e folhas
cana-de-açúcar são Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum spp e de
Azospirillum spp (JAMES et al., 1994; BALDANI et al. 1986, REIS-Jr et al., 2000).
No presente estudo, a comunidade endofítica bacteriana no colmo de cana-
de-açúcar foi analisada principalmente por métodos independentes de cultivo. A maioria
das sequências obtidas de bactérias associadas ao colmo de cana-de-açúcar foi
identificada como pertencente à classe das γ-Proteobacterias. Dentro dessa classe, as
sequências foram divididas entre as famílias Pseudomonadaceae e Enterobacteriaceae.
110
Baseados nessa dominância de γ-Proteobacterias e no resultado obtido a partir da
fórmula de cobertura da biblioteca de 16S rRNA, que foi de aproximadamente 85%, nós
concluímos que a diversidade de bactérias endofíticas na amostra analisada é baixa.
Em raiz de arroz, por exemplo, SUN et al. (2008) encontraram as classes alfa, beta,
gamma, delta, e epsilon de Proteobacteria, o filo Cytophaga/Flexibacter/Bacteroides
(CFB), Firmicutes, Deinococcus-Thermus e Acidobacteria.
A principal crítica ao tipo de abordagem cultivo-independente para análise da
diversidade recai sobre a forte tendência dada pelas condições e os oligonucleotídeos
usados na reação da PCR (SUZUKI & GIOVANNONI, 1996). É consenso que esta
metodologia permite avaliar os organismos predominantes na amostra. Entretanto, os
oligonucleotídeos utilizados nesse trabalho possuem 100% de complementariedade
com as regiões correspondentes aos gene 16S rRNA dos principais diazotróficos
encontrados em cana-de- açúcar e já foram utilizados para amplificação da maioria
destes diazotróficos a partir de colônias isoladas (SOARES-RAMOS et al., 2003).
Além disso, a análise da diversidade de bactérias endofíticas do colmo de
cana-de-açúcar a partir do isolamento de bactérias em meio de cultivo também mostrou
a presença marcante e predominância de Enterobactérias, confirmando os resultados
obtidos pelas análises independentes de cultivo. Neste último caso o isolamento foi
realizado utilizando o meio batata, o que também pode gerar uma tendência nos grupos
de organismos observados.
Vários trabalhos mostraram a presença de bactérias diazotróficas em cana de
açúcar em uma quantidade que varia de cerca de 10
4
a 10
6
por grama de peso fresco
(REIS-Jr et al., 2000). Neste caso as bactérias foram isoladas em meio semi-seletivo
semi-sólido sem fonte de nitrogênio, o que elimina aqueles organismos incapazes de
fixar nitrogênio, mesmo que predominem na comunidade. Desta forma, enquanto a
abordagem independente de cultivo sofre tendência devido á reação da PCR,
permitindo a observação dos organismos predominantes na amostra, a abordagem
111
dependente de cultivo é muito influenciada pela composição dos meios de cultura
utilizados e por características dos organismos, como crescimento rápido.
As bactérias diazotróficas (já mencionadas acima) frequentemente isoladas
em grande número em cana-de-açúcar e apontadas como responsáveis pela
contribuição da fixação de nitrogênio, não foram encontradas em nossa amostra. A
ausência dessas bactérias neste trabalho pode ser devido à sua baixa população em
relação às bactérias identificadas, o que demandaria um maior esforço de
seqüenciamento para sua observação. Apesar da identificação de espécies de
bactérias através da sequência do gene 16S rRNA ser controversa e ambígua, a
identificação de grupos taxonômicos em níveis mais altos, como família, ordem e outros
não deixa dúvida. As principais bactérias diazotróficas associadas à cana de açúcar
pertencem às classes alfa (Azospirillum e Gluconacetobacter) e beta (Herbaspirillum)
das Proteobacterias, enquanto o grupo predominante das Enterobactérias identificadas
no presente trabalho pertence à classe gama das Proteobactérias.
É possível que a composição das comunidades endofíticas da cana-de-açúcar
possa ser dependente da localização geográfica, manejo da cultura, idade e genótipo
da planta.
Esta é a primeira vez que a comunidade endofitica de cana de açúcar
cultivada no Estado do Paraná é estudada e nos dois casos (método dependente
quanto idenpendente de cultivo) foram utilizadas plantas adultas, o que permite levantar
a hipótese de baixa prevalência de bactérias diazotróficas em cana neste estágio de
desenvolvimento e/ou nas regiões coletadas. Outra possibilidade é que este grupo de
bactérias esteja presente, mas seja minoritário e seria revelado através de cultivo em
meio seletivo.
Em concordância com este trabalho, Suman e colaboradores (2001)
obtiveram contagens baixas de bactérias endofíticas diazotróficas por grama de tecido
fresco comparado aos endofíticos totais (SUMAN et al., 2001). Estes autores mostraram
112
que a incidência de endofíticos diazotróficos é 0,02% a 3,86% em cana de açúcar da
Índia. Em um outro estudo foi mostrado que aproximadamente 90% das bactérias
isoladas de plantas de arroz desinfetada externamente foram não-diazotróficas
(Barraquio et al., 1997).
Por outro lado, foi demonstrada a presença de Azospirillum spp e
Herbaspirillum spp em colmo de raízes de milho sequenciando clones de uma biblioteca
de nifH obtido pela amplificação do DNA vegetal (ROESCH et al, 2008). Trabalhos
usando a abordagem independente de cultivo, onde são analisados os genes 16S rRNA
e nifH indicam que a diversidade total de bactérias é maior que a diversidade das
bactérias diazotróficas (CHOWDHURY et al., 2008).
Espécies do gênero Enterobacter (gênero encontrado no presente trabalho)
são encontradas numa ampla gama de espécies vegetais. Estas bactérias estão muitas
vezes relacionadas à promoção do crescimento vegetal, têm potencial para degradação
de hidrocarbonetos e podem ainda fixar nitrogênio (KÄMPFER et al., 2005; PHILIPS et
al., 2008; PRAKAMHANG et al., 2009). Outras enterobactérias já foram descritas em
cana-de-açúcar usando meio seletivo de isolamento (MIRZA et al., 2001; LOIRET et al.,
2004). Entretanto, essa é a primeira descrição de bactérias endofíticas utilizando
biblioteca gênica de 16S rRNA.
Curvas de rarefação com diferentes níveis de dissimilaridade foram
construídas para estimar se a comunidade endofítica da amostra de cana-de-açúcar
estudada foi bem representada. Os resultados mostraram que ao nível de
dissimilaridade das sequências de 16S rRNA de 3%, a amostra de sequências ainda
não atingiu a saturação, porém a curva do coletor mostra que o número de sequências
amostradas foi suficiente. Esses dados juntamente com o cálculo da cobertura da
biblioteca demonstraram que os grupos mais abundantes foram resgatados, indicando
uma baixa diversidade de bactérias endofíticas no colmo da cana-de-açúcar variedade
RB 72454 cultivada no noroeste do Estado do Paraná.
113
A avaliação da diversidade em diferentes estágios do desenvolvimento, com e
sem adubação nitrogenada, e submetida a diferentes condições de umidade e
temperatura não foi possível porque as sequências dos clones dessas bibliotecas
continham, em sua maioria (~95% das sequências), genes com alta identidade com
genes 18S rRNA mitocondriais. Como já mencionado, o DNA da mitocôndria possui
genes ribossomais 18S que são muito parecidos com o gene 16S rRNA de eubactérias
(Newton, 1988). Apesar de a maioria das sequências dos clones possuírem maior
identidade (best hit) com uma sequência de bactéria não cultivada, elas eram também
muito parecidas (alta identidade, alta cobertura, valor E baixo) com sequências do gene
18S de mitocôndrias de diferentes plantas. Isso pode indicar que, apesar do par de
primers amplificar o gene 16S rRNA de bactérias e não produzir uma banda
sobressalente no gel, o DNA da cana-de-açúcar foi amplificado, clonado e sequenciado.
E observando a sequência das bactérias do banco de dados que apresentaram alta
identidade com a dos clones, aquelas são todos de organismos não-cultivados, ou seja,
que pode ser também oriunda de DNA de planta e erroneamente classificada como de
bactéria. Para solucionar esse problema, novas bibliotecas poderão ser feitas com o par
de oligonucleotídeos 27f-1492r, que amplifica o gene inteiro e uma banda adicional de
2,0 kb. A banda de 1,5 kb, correspondente ao gene 16S rRNA de bactéria, poderia ser
purificada e clonada.
Essa é uma das primeiras descrições das comunidades bacterianas em colmo
de cana-de-açúcar baseada em biblioteca do gene 16S rRNA e que revela a
abundância relativa dos diferentes microrganismos. Uma vez que a população de
bactérias inoculadas para promoção de crescimento vegetal pode ser influenciada por
vários fatores, incluindo populações bacterianas residentes (OLIVEIRA et al., 2009), a
predominância das famílias Pseudomonadaceae e Enterobacteriaceae observada aqui
deve ser considerada no planejamento de programas de inoculação.
114
7 CONCLUSÕES
As análises por meio de métodos cultivo-dependentes e cultivo-independentes
empregados se mostraram eficientes para o estudo da diversidade de bactérias
endofíticas em cana-de-açúcar.
Foi observada uma prevalência de bactérias endofíticas pertencentes às
famílias Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae da classe γ-Proteobacteria.
Os resultados obtidos indicam que os grupos de bactérias dominantes foram
recuperados, refletindo uma baixa diversidade das bactérias endofíticas na planta
analisada.
Bactérias endofíticas diazotróficas frequentemente encontradas associadas à
cana-de-açucar tais como Herbaspirillum seropedicae, Gluconoacetobacter
diazotrophicus e Azospirillum brasilense não foram recuperados com a amostragem
utilizada.
A observação do efeito da idade da planta e adubação nitrogenada sobre a
dinâmica da população de bactérias foi prejudicada por conta da aparente amplificação
de genes com alta identidade com genes ribossomais mitocondriais de plantas.
Os resultados corroboram um conhecimento prévio de que a diversidade de
bactérias endofíticas pode ser influenciada por diversos fatores, tais como orgão,
estágio de desenvolvimento, localização geográfica e genótipo da planta.
E, como muitas sequências dos clones tiveram alta identidade com
sequências do gene 16S rRNA de bactérias relacionadas com promoção de
crescimento vegetal e degradação de substâncias tóxicas, há nessa planta um potencial
reservatório de microrganismos ainda a ser explorado.
115
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADHIKARY, T.B., JOSEPH, C.M., YANG, G.P., PHILIPS, D.A., NELSON, L.M.
Evaluation of the bacteria isolated from rice for plant growth promotion and biological
control of seedling disease of rice. Canadian J Microbiol, v. 47, p. 916-924, 2004.
ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHÄFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.;MILLER,
W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein
database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, p. 3389-3402, 1997.
AMANN, R. I., LUDWIG, W., SCHLEIFER,K. H. Phylogenetic identification and in situ
detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiological Reviews v.
59, p. 143-169, 1995.
ARAUJO, W.L. Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with
Xylella fastidiosa in citrus plants. Applied and Environmental Microbiology, v. 68, n.
10, p. 4906-4914, 2002.
ASIS, C.A.; ADACHI, K. Isolation of endophytic Pantoea agglomerans and nonzotrophic
Enterobacter asburiae from sweetpotato stem in Japan. Letters in Applied
Microbiology, v. 38, p. 19-23, 2003.
BARON, S., JAMES, D.A., SUSMAN, M., KENNEDY, C.A., SINLGETON, M.J.D.,
SCHUENKE, S. Medical Microbiology, 4 ed., 1996.
BECKING, J.H. Identification of the endophyte of Dryas in Rubus (Rosaceae). Plant and
Soil, v.78, p. 105-28, 1984.
BELL, T., NEWMAN, J. A., SILVERMAN, B. W., TURNER, S.L., LILLEY, A.K. The
contribution of species richness and composition to bacterial services. Letters in
nature. v. 436, 2005.
BERG, G., KRECHEL, A., DITZ, M., SIKORA, R. A., ULRICH, A, HALLMANN, J.
Endophytic and ectophytic potato-associated bacterial communities differ in strucuture
and antagonistic function against plant pathogenic fungi. FEMS Microbiology Ecology,
v. 51, p. 215-229, 2004.
BALDANI, J.I. Ocorrência e caracterização de Azospirillum amazonense em
comparação com as outras espécies deste gênero, em raízes de milho, sorgo e arroz.
Itaguai, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 1984. 110p. (Tese de Mestrado).
BALDANI, J.I., BALDANI, V.L.D., SELDIN, L., DÖBEREINER, J. Characterization of
Herbaspirillum seropedicae gen. nov. a root associated nitrogen fixing bacterium. Int. J.
System. Bacteriol., v.36, p.86-39, 1986.
116
BALDANI J. I., CARUSO, L., BALDANI, V. L. D., GOI, S. R., DÖBEREINER, J. Recent
advances in BNF with non-legume plants. Soil Biol. Biochem., v. 29, p. 911-922, 1997.
BODDEY, R.M. Biological nitrogen fixation in sugar cane: a key to energetically viable
biofuel production. Critical Reviews in Plant Sciences, v.14, p.263-279, 1995.
BODDEY, R. M., URQUIAGA, S., ALVES, B. J. R., REIS, V. Endophytic nitrogen fixation
in sugarcane: present knowledge and future applications. Plant and Soil, v. 252, p. 139-
149, 2003.
BAIS, H.P, WEIR, T.L., PERRY, L.G., GILROY, S., VIVANCO, J.M.. et al. The role of
root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev.
Plant Biol. V. 57, p. 233–266, 2006.
BARRAQUIO, W.L., REVILLA, L., LADHA, J.K. Isolation of endophytic diazotrophic
bacteria from wetland rice. Plant and Soil, v.194, p.15-24, 1997.
BURSE, A., WEINGART, H., ULLRICH, M. S. The phytoalexin-inducible multi-drug efflux
pump, AcrAB, contributes to virulence in the fire blight pathogen, Erwinia amylovora.
Mol. Plant-Microbe Interact. v. 17, p.43-54, 2004.
BUSSE, H. J., DENNER, E. B. M., LUBITZ, W. Classification and identification of
bacteria: current approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial
systematics. Journal of Biotechnology, v. 47, p. 3-38, 1996.
CABARELLO-MELLADO, J., MARTINEZ-ROMERO, E Limited genetic diversity in the
endophytic sugarcane bacterium Acetobacter diazotrophicus. Applied and
Environmental Microbiology, v. 60, n. 5, p. 1532-1537, 1994.
CAVALLI-SFORZA, L.L., EDWARDS, A.W.F.. Phylogenetic analysis: models and
estimation procedures. American Journal of Human Genetics 19:233-257, 1967.
CHAINTREUIL, C., GIRAUD, E., PRIN, Y., LORQUIN, J., B., A., GILLIS, M., DE
LAJUDIE, P., DREYFUS, B. Photosynthetic Bradyrhizobia Are Natural Endophytes of
the African Wild Rice Oryza breviligulata, Applied and Environmental Microbiology, v.
66, n. 12, p. 5437-5447, 2000.
CHERNIN, L., ISMAILOV, Z., HARAN, S., CHET, I. Chitinolytic Enterobacter
agglomerans Antagonistic to Fungal Plant Pathogens. Appl Environ Microbiol. v. 61,
n.5, p.1720-1726, 1995.
CHELIUS, M.K., TRIPLETT, E.W. The diversity of Archaea and Bacteria in the roots of
Zea mays L. Microbial Ecology. v. 41, p. 252-263, 2001.
CHO, K.M., HONG, S.Y., LEE, S.M., KIM, Y.H., KAHNG, G.G., LIM YP, KIM H, YUN
HD. Endophytic bacterial communities in ginseng and their antifungal activity against
pathogens. Microb. Ecol. v. 54, n. 2, p.341-51, 2007.
117
CHOUDHARY, D.K., JOHRI, B.N. Interactions of Bacillus spp. and plants – With special
reference to induced systemic resistance (ISR). Microbiological Research, v. 164, p.
493-513, 2008.
CHOWDHURY, S.P., SCHMID, M., HARTMANN, A., TRIPATHI, A.K. Diversity of 16S-
rRNA and nifH genes derived from rhizosphere soil and roots of an endemic drought
tolerant grass, Lasiurus sindicus. European Journal of Soil Biology, V. 45, p. 114-
122, 2009
COELHO, C.H.M., MEDEIROS, A.F.A., POLIDORO, J.C., XAVIER, R.P., RESENDE, A.,
QUESADA, D.M.Q., ALVES, B.J.R., BODDEY, R., URGUIAGA, S. Identificação de
genótipos de cana-de-açúcar quanto ao potencial de contribuição de fixação biológica
de nitrogênio. Agronomia, v. 37, p. 37-40, 2003.
CONN, V. M., FRANCO, M. M. F. Analysis of the Endophytic Actinobacterial Population
in the Roots of Wheat (Triticum aestivum L.) by Terminal Restriction Fragment Length
Polymorphism and Sequencing of 16S rRNA Clones. Applied and Environmental
Microbiology, v. 70, n. 3, p. 1787-1794, 2004.
COUILLEROT, O., PRIGENT-COMBARET, C., CABALLERO-MELLADO, J., MOËNNE-
LOCCOZ, Y. Pseudomonas fluorescens and closely-related fluorescent pseudomonads
as biocontrol agents of soil-borne phytopathogens. Lett Appl Microbiol. v.48, n.5,
p.505-12, 2009.
COUTINHO T.A., VENTER S.N. Pantoea ananatis: an unconventional plant pathogen.
Mol Plant Pathol. V.10, N. 3, P.325-35. 2009
CURTIS, T.P., SLOAN, W.T. Microbiology: Exploring microbial diversity-a vast below.
Science. v.26, n.309, p.1331-3, 2005
CRUZ, L.M. Caracterização e análise filogenética molecular de novos isolados de
bactérias fixadoras de nitrogênio. Curitiba, 2001. 168p. Tese (Doutorado em
Bioquímica)-Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal
do Paraná.
DALTON, D.A., KRAMER, S., AZIOS, N., FUSARO, S., CAHILL, E., KENNEDY, C.
Endophytic nitrogen fixation in dune grasses (ammophila arenaria and elymus mollis)
from Oregon. FEMS Microbiology Ecology, v. 49, p. 469-479, 2004.
DEKHIL, B., CAHILL, M., STACKEBRANDT, E., e SLY, L.I. Transfer of
Conglomeromonas largomobilis subsp. largomobilis to the genus Azospirillum as
Azospirillum largomobile comb. nov., and elevation of Conglomeromonas largomobilis
subsp. parooensis to the new type species of Conglomeromonas, Conglomeromonas
parooensis sp. Nov. Int. J. Syst. Bacteriol., v.47, p. 915-916. 1997.
118
DÖBEREINER, J. Recent changes in concepts of plant bacteria interactions, endophytic
N
2
fixing bacteria. Ciência e cultura, v. 44, n. 5, 1992.
DÖBEREINER, J., RUSCHEL, A.P. Uma nova espécie de Beijerinckia. Revista de
Biologia, Lisboa, v.1, p.261-272, 1958.
DÖBEREINER, J., BALDANI, V.L.D. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de
plantas não-leguminosas. Brasília:Embrapa-SPI, Itaguaí, RJ.Embrapa-CNPAB, 1995.
DONG Z., CANNY, M.J., MCCULLY, M.E., ROBOREDO, M.R., CABADILLA, C.F.,
ORTEGA, E., RODES. R. A Nitrogen-Fixing Endophyte of Sugarcane Stems. A New
Role for the Apoplast. Plant Physiol. v. 105, p. 1139-1147, 1994
ECKERT, B.; WEBER, O.B.; KIRCHHOF, G.; HALBRITTER, A.; STOFFELS, M.;
HARTMANN, A. Azospirillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium
associated with the C4-grass Miscanthus. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, v. 51, p. 17–26, 2001
EBELGATY, A., NISHIOKA, K., SATO, T., SUZUKI, H., YE, B., HAMADA, T., ISAWA,
T., MITSUI, H., MINAMISAWA, K. Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation
by a Herbaspirillum sp isolated from wild rice species. Applied and Environmental
Microbiology, v. 67, n. 11, p. 5284-5293, 2001.
EWING B, HILLIER L, WENDL MC, GREEN P. Base-calling of automated sequencer
traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Res., v. 8, n. 3, p.175-85, 1998.
FELSEISTEN,J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap.
Evolution, v. 39, p. 783-791, 1988.
FELSKE, A., AKKERMANS, A.D.L Prominent occurence of ribosomes from an
uncultured bacterium of the Verrumicrobiales cluster in grassland soils. Letters in Appl.
Microbiol. v. 26, p. 219-223, 1998.
FOX, G. E.; PECKMAN, K. J.; WOESE, C. R. Comparative cataloging of 16S
ribosomal ribonucleic acid: molecular approach to prokaryotic systematics. Inst.J.Syst.
Bacteriol, v. 27, p. 44-57, 1977.
FRANKLIN, R.B., TAYLOR, D. R., MILLS, A. L.Characterization of microbial
communities using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Journal of
Microbiological Methods, v. 35, p. 225–235, 1999.
GERMIDA, J. J., SICILIANO, S. D., FREITAS, R., SEIB, A. M. Diversity of root-
associated bacteria associated with field-grown canola (Brassica napus L.) and wheat
(Tritricum aestivum L.). FEMS Microbiology Ecology, v. 26, p. 43-50, 1998.
GIANNELLA RA. Pathogenesis of acute bacterial diarrheal disorders. Annu Rev Med.
v.32, p.341-57, 1981.
119
GILLIS, M., TRAN, V., BARDIN, R., GOOR, M., HERBBAR, P., WILLEMS, A., SEGERS,
P., KERSTERS, K., HEULIN, T., FERNANDEZ, M. P. Polyphasic taxonomy in the genus
Burkholderia leading to an emended description of the genus and proposition of
Burkholderia vietnamiensis sp.: nov. for N
2
-fixing isolates from rice in Vietnam.
International Journal of Systematic Bacteriology, v. 45, p. 274-289, 1995.
GRANT, S.G.N., JESSEET,J., BLOOMT,F.R, HANAHAN, D. Differential plasmid rescue
from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants.
GUPTA, R.S. The phylogeny of proteobacteria: relationships to other eubacterial phyla
and eukaryotes. FEMS Microbiol Rev. v. 24, p.367-402, 2000
HALL, B.G. Phylogenetic trees made easy : a how-to manual. 3rd ed. Sunderland,
Mass. : Sinauer Associates, 2008.
HALLMMAN et al. Bacterial endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol. V. 43,
p. 895-914, 1997.
HEAD, I. M., SAUNDERS, J. R.; PICKUP, J. Microbial evolution, diverdity and ecology:
a decade of ribosomal RRNA anaylis of uncultivated organisms. Microb. Ecology, v.
35, p. 1-21, 1998.
HEATHER L. TYLER, ERIC W. TRIPLETT. Plants as a Habitat for Beneficial and/or
Human Pathogenic Bacteria. Annual Review of Phytopathology, v. 46, p. 53-73, 2008.
HORNER-DEVINE, M.C., CARNEY, K.M.,BOHANNAN, B.J.M. An ecological
perspective on bacterial biodiversity. Proc. R. Soc. Lond. B. , v. 271, p. 113-122. 2003
HUGENHOLTZ, P, GOEBEL BM, PACE NR. Impact of culture-independent studies on
the emerging phylogenetic view of bacterial diversity. J Bacteriol., v. 180, n. 18, p.
4765-74, 1996.
JAMES, E. K., OLIVARES, F. L. Infection and colonization of sugarcane and other
graminaceous plants by endophytic diazotrophs. Critical Reviews in Plant Sciences, v.
17, n. 1, p. 77-119, 1997.
JAMES, E.K. Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis. Field Crops
Research , v. 65, p. 197-209, 2000.
JIMENEZ-SALGADO, T., FUENTES-RAMIREZ, L. E., TAPIA-HERNANDEZ, A.,
MASCARUA, M. A., MARTINEZ-ROMERO, E., CABALLERO-MELLADO, J. Coffea
arabica L., a new host plant for Acetobacter diazotrophicus and isolation of other
nitrogen-fixing acetobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 63, 3676–3683. 1997.
120
JOLY, H. B. Introdução à taxonomia vegetal. 11 ed., São Paulo, Editora Nacional,
1993.
KAMMAS, K. M., AGERON, E., GRIMONT, P. A. D. KAISER, P. Azospirillum irakense
sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil.
Res. Microbiol. v. 140, p. 679-694, 1989.
KELLER, M., ZENGLER, K. Tapping into microbial diversity. Nature Reviews
Microbiology v.2, p.141-150, 2004.
KENNEDY, I. R., CHOUDHURY, A.T.M.A., KECSKÉS, M.L. Non-symbiotic bacterial
diazotrophs in crop-farming systems: can their potential for plant growth be better
exploited? Soil Biology & Biochemistry, v. 36, p. 1229-1244, 2004.
KIRCHOFF, G., SCHLOTER, M., ABMUS, B., HARTMANN, A. Molecular microbial
ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes. Soil Biol.
Biochem., n. 5, p. 853-862, 1996.
KUKLINSKY-SOBRAL, J., ARAUJO, W. L., MENDES, R., GERALDI, I. O., PIZZIRANI-
KLEINER, A. A., AZEVEDO, J. L. Isolation and characterization of soybean-associated
bacteria and their potential for plant growth promotion. Environmental Microbiology, v.
6, n. 12, p. 1244-1251, 2004.
LACAVA, P. T., ARAÚJO, W. L., MARCON, J., MACCHERONI, W., AZEVEDO, J. L.
Interaction between endophytic bacteria from citrus plants and the phytopathogenic
bacteria Xylella fastidiosa, causal agent of citrus-variegated chlorosis. Letters in
Applied Microbiology, v. 39, p. 55-59, 2004.
LANE, D.J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing, pp. 115-175. In E. Stackebrandt and
Goodfellow (ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Wiley-Interscience,
West Sussex, England.
LIFSHITZ, R
.,
KLOEPPER, J.W
.,
SCHER, F.M
.,
TIPPING, E.M
.,
LALIBERTÉ, M
.
Nitrogen-Fixing Pseudomonads Isolated from Roots of Plants Grown in the
Canadian High Arctic.
Appl Environ Microbiol.
v.51, n.2, p.251-255, 1986.
LIN, S.Y., YOUNG, C.C., HUPFER, H., SIERING, C., ARUN, A.B., CHEN, W.M., LAI
W.A., SHEN, F.T., REKHA, P.D. e YASSIN, A.F. Azospirillum picis sp. nov., isolated
from discarded tar. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., v. 59, p. 761-765, 2009.
121
LODEWYCK C., VANGRONSVELD, J., PORTEOUS, F., MOORE, E.R.B., TAGHAVI S.,
MEZGEAY, M., VAN DER LIE,D. Endophytic bacteria and their potential application.
Crit Rev Plant Sci, v. 86, p.583–606, 2002.
LOIRET, F. G. A putative new endophytic nitrogen-fixing bacterium Pantoea sp. from
sugarcane. J Appl Microbiol., v. 97, n. 3, p.504-11, 2004.
LOVELL, C. R., PICENO, Y. M., QUATTRO, J. M., BAGWELL, C. E. Molecular analysis
of diazotroph diversity in the rizosphere of the smooth cordgrass, Spartina alterniflora.
Applied and Environmental Microbiology, v. 66, n. 9, p.3814-3822, 2000.
LOVELAND-CURTZE, J., MITEVA, V.I., BRENCHLEY, J.E. Herminiimonas glaciei sp.
nov., a novel ultramicrobacterium from 3042 m deep Greenland glacial ice. Int J Syst
Evol Microbiol. v. 59, p.1272-1277, 2009.
LUDWIG, W., SCHLEIFER, K. H. Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA
sequence analysis. FEMS Microbiol. Rev., v. 15, p. 155-173, 1994.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J.P. Brock Biology of microorganisms. 8 ed. London, UK.
1997
MAGALHÃES, F.M., BALDANI, J.I., SOUTO, S.M., KUYKENDALL, J.R., DÖBEREINER,
J. A new acid-tolerant Azospirillum species. An. Acad. Brasil Ciênc., v. 55, p. 417-430,
1983.
MAGNANI, G.S. Diversidade de bacterias endofiticas em cana-de-açucar. Dissertação
(Mestrado em Bioquímica)-Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Universidade Federal do Paraná. Curitiba, 92p, 2005.
MEHNAZ, S., WESELOWSKI, B., LAZAROVITS, G. Azospirillum canadense sp. nov., a
nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,
v. 57, p.620-624, 2007.
MIRZA S.M., AHMAD, W., LATIF, F. Isolation, partial characterization, and the effect of
plant growth-promoting bacteria (PGPB) on micro-propagated sugarcane in vitro. Plant
Soil, v. 237, p.47–54, 2001.
MOCALI, S., BERTELLI, E., DI CELLO, F., MENGONI, A., SFALANGA, A., VILIANI, F.,
CACIOTTI, A., TEGLI, S. Fluctuation of bacteria isolated from elm tissues during
different seasons and from different plant organs. Research in Microbiology, n. 154, p.
105-114, 2003.
MYERS, N. Environmental services of biodiversity. Proceeding of the National
Academy of Sciences, v. 93, p. 2764-2769, 1996.
NEWTON, K.J. Plant mitochondrial genomes: organization, expression and variation.
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.,v. 39, p.503-532, 1988.
122
NOCKER, A., BURR, M., CAMPER, A.K. Genotypic Microbial Community Profiling: A
Critical Techincal Review. Microbial Ecology, v. 54, p. 276-289, 2007.
OLIVARES, F. L., BALDANI, V. L. D., REIS, V. M., BALDANI, J. I., DÖBEREINER, J.
Occurrence of the endophytic diazotrophs Herbaspirillum spp. In roots, stems and
leaves, predominantly of Gramineae. Biol. Fertil. Soils, v. 21, p. 197-200, 1996.
Oliveira, A.L.M., Stoffels, M., Schmid, M., Reis, V.M., Baldani, J.I., Hartmann, A.
Colonization of sugarcane plantlets by mixed inoculations with diazotrophic bacteria.
European Journal of Soil Biology
v. 45, p. 106-113, 2009.
OLSEN, G.J., WOESE, C.R. Ribosomal RNA: a key to phylogeny. FASEB, J. 7, P. 113-
123, 1993.
OLSEN, G. J.; WOOSE, C. R.; OVERBEEK, R. The winds of (evolutionary)
change: breathing new life into microbiology. J. Bacteriol., v. 176(1) p. 1–6,1994.
ØVREÅS, L.; TORSVIK. "Microbial Diversity and Community Structure in Two Different
Agricultural Soil Communities”. Microb. Ecol. v. 36, p. 303-31, 1998.
PACE, N. R.; STAHL, D. A.; LANE, D. J.; OLSEN, G. J.. The analysis of natural
microbial populations by ribosomal RNA sequences. Adv. Microb. Ecol., v. 9,p. 1-55,
1986.
PERIN, L., MARTÍNEZ-AGUILAR. L., PAREDES-VALDEZ. G., BALDANI, J.I,,
ESTRADA-DE LOS SANTOS, P., REIS, V.M., CABALLERO-MELLADO, J. Burkholderia
silvatlantica sp. nov., a diazotrophic bacterium associated with sugar cane and maize.
Int J Syst Evol Microbiol. v.56, n. 8, p.1931-7, 2006.
PEDROSA, F.O., YATES, M.G. Regulation of nitrogen fixation (nif)genes of Azospirillum
brasilense by nifA and ntrC (glnG) type genes. FEMS Microbiol. Lett, v. 55, p. 95–101,
1984.
PENG, G., WANG, H., ZHANG, G., HOU, W., LIU,Y., WANG, E.T., TAN, Z. Azospirillum
melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass. Int. J.
Syst. Evol. Microbiol., v. 56, p.1263-1271, 2006.
PERRIG, D.; BOIERO, M.L.; MASCIARELLI, O.A.; PENNA, C.; RUIZ, O.A.; CASSÁN,
F.D. LUNA, M.V. Plant-growth-promoting compunds produced by two agronomically
important strains of Azospirillum brasilense and implications for inoculant formulation.
Appl Microbiol Technol, 2007.
PILLAY, V. J., NOWAK, J. Inoculum density, temperature, and genotype effects on in
vitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of tomato
123
(Lycopersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a pseudomonad bacterium.
Canadian Journal of Microbiology, v. 43, p. 354-361, 1997.
PIÑÓN D, CASAS M, BLANCH M, FONTANIELLA B, BLANCO Y, VICENTE C, SOLAS
MT, LEGAZ ME. Gluconacetobacter diazotrophicus, a sugar cane endosymbiont,
produces a bacteriocin against Xanthomonas albilineans, a sugar cane pathogen. Res
Microbiol. v.153, n. 6, p.345-51, 2002.
POSTGATE, J. R. The fundamentals of nitrogen fixation. Cambridge: Cam. Univ. Press,
1982.
PRAKAMHANG, J., K. MINAMISAWA, K., TEAMTAISONG, N. BOONKERD, N.
TEAUMROONG The Communities of Endophytic Diazotrophic Bacteria in Cultivated
Rice (Oryza Sativa L.) Appl. Soil Ecol. v. 42, p.141-149, 2009
QUADT-HALLMANN, A., BENHAMOU, N., KLOEPPER, J. W. Bacterial ndophytes in
cotton: mechanisms of entering the plant. Can. J. Microbiol., v. 43, p. 577-582, 1997.
QUEZADO-DUVAL, A. M., GUIMARAES, C. M. N., MARTINS, O. M. . Occurrence of
Pseudomonas corrugata Causing Pith Necrosis on tomato Plants in Goiás, Brazil.
Fitopatologia Brasileira, v. 32, p. 59, 2007.
RAMESH, R., JOSHI, A. A., GHANEKAR, M. P. Pseudomonads: major antagonistic
endophytic bacteria to suppress bacterial wilt pathogen, Ralstonia solanacearum in the
eggplant (Solanum melongena L.) World Journal of Microbiology and
Biotechnology, v. 25, n.1, 2009.
RAPPÉ, M. S., GIOVANNONI, S. J. The uncultured microbial majority. Annual Review
of Microbiology. v. 57, p. 369-394, 2003.
REIS-JUNIOR, F.B., SILVA, L.G., REIS, V.M., DÖBEREINER, J. Ocorrência de
bactérias diazotróficas em diferentes genótipos de cana-de-açúcar. Pesq. agropec.
bras. v.35, p. 985-995, 2000.
REIS, V. M. Biological Dinitrogen Fixation in Gramineae and Palm Trees. Critical
Reviews in Plant Science, v. 19, n.3, p. 227-247, 2000.
RENNIE, R.J., DE FREITAS, J.R., RUSCHEL, A.P. AND VOSE, P.B. Isolation and
identification of N2-fixing bacteria associated with sugarcane (Saccharum sp) Can. J.
Microbiol., v. 28, p.462 -467, 1982.
REINHOLD, B.; HUREK, T.; FENDRIK, I.; POT, B.; GILLIS, M.; KERSTERS, K.;
THIELEMANS, S.; DE LEY, J. Azospirillum halopraeferens sp. nov., a nitrogen-fixing
organism associated with roots of Kallar grass (Leptochloa fusca (L.)(Kunth).
International Journal of Systematic Bacteriology, Baltimore, v.37, n.1,p.43-51, 1987.
124
ROESCH, L. F. W., CAMARGO, F. A. O., BENTO, F. M., TRIPLETT, E. W. Biodiversity
of diazotrophic bacteria within the soil, root and stem of field-grown maize. Plant Soil,
302:91-104, 2008.
ROSSELÓ-MORA, R., AMANN, R. The species concept for prokaryotes. FEMS
Microbiology Review, v. 25, n. 1, p. 39-67, 2001.
ROSENBLUETH, M., MARTINEZ-ROMERO, E. Bacterial Endophytes and Their
Interactions with hosts. Molecular Plant Microbe Interations, v. 19, p. 827-837, 2006.
SAIKI, R., GELFAND, D., Stoffel, S., Scharf, S., Higuchi, R., Horn, G., Mullis, K. and
Erlich, H. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science, v. 239, p.487-91, 1988.
SANGER, F., NICKLEN, S., COULSON, A. R. DNA sequencing with chainterminating
inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci, v. 74, p. 5463-5467, 1977.
SAITOU, N., NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. Mol Biol Evol. v.4, p.406–425, 1987.
SAMBROOK, J., FRITSCH. E.F., MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual
2 ed. New York, Cold Spring Harbor laboratory, 1989.
SCHLOSS, P. D.; HANDELSMAN, J.. Introducing DOTUR, a computer program for
defining operational taxonomic units and estimating species richness. Appl. Environ.
Microbiol. v. 71, p.1501-1506, 2005.
SESSITSCH, A., REITER, B., PFEIFER, U., WILHELM, E. Cultivation-independent
population analysis of bacterial endophytes in three potato varietes based on eubacterial
and Actinomycetes-specific PCR of 16S rRNA genes. FEMS Microbiology Ecology,
v.39, p. 23-32, 2002.
SHARMA VK, NOVAK J (1998). Enhancement of verticillium wilt resistance in tomato
transplants by in vitro co-culture of seedlings with a plant growth promoting
rhizobacterium (Pseudomonas sp. strain PsJN). Can. J. Microbiol. v. 44, p. 528–536.
SHEN, X., XIA, J.J., JIANG, C.J., HE, L.Y., QIAN, M. Characterization of heavy metal-
resistant endophytic bacteria from rape (Brassica napus) roots and their potential in
promoting the growth and lead accumulation of rape. Environmental Pollution, v. 156, p.
1164–1170, 2008.
SOARES-RAMOS, J., RAMOS, H.J.O., CRUZ, L. M., CHUBATSU, L. S., PEDROSA, F.
O., RIGO, L. U., SOUZA, E. M. Comparative molecular analysis of Herbaspirillum strains
by RAPD, RFLP, and 16S rDNA sequencing. Genetics and Molecular Biology, v. 26,
p. 537-543, 2003.
125
SPANGENBERG, J.H.
Biodiversity pressure and the driving forces behind. Ecological
Economics, v 1, p. 146-158, 2007.
STACKEBRANDT, E.; MURRAY, l R. G. E. e TRUPER, H. G. Proteobacteria classis
nov. a Name for the Phylogenetic Taxon That Includes the “Purple Bacteria and Their
Relatives INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, p. 321-
325,1988.
STURZ, A.V., CHRISTIE, B.R., NOWAK, J. Bacterial Endophytes: Potential Role in
Developing Sustainable Systems of Crop Production. Critical Reviews in Plant
Sciences, v. 19, n. 1, p. 1 – 30, 2000.
SUMAN, A., SHASANY, A. K., SINGH, M., SHAHI, H. N., GAUR, A., KHANUJA, S. P. S.
Molecular assessment of diversity among endophytic diazotrophs isolated from
subtropical Indian sugarcane. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v. 17,
p. 39-45, 2001.
SUN, L., QIU, F., ZHANG, X., DAI, X., DONG, X., SONG, W. Endophytic Bacterial
Diversity in Rice (Oryza sativa L.) Roots Estimated by 16S rDNA Sequence Analysis.
Microb Ecol. V.55, p.415–424, 2008.
SUZUKI, M.T.; GIOVANNONI, S.J .Bias caused by template annealing in the
amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR. Appl Environ Microbiol, v. 62, p.
625–630, 1996.
TAMURA, K., DUDLEY, J., NEI, M., KUMAR, S. MEGA4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution. v.
24, p.1596-1599, 2007.
TAN, Z.; HUREK, T. & REINHOLD-HUREK, B. Effect of N-fertilization, plant genotype
and environmental conditions on nifH gene pools in roots of rice. Environ. Microbiol., v.
5, p. 1009-1015, 2003.
TARRAND, J. J., KRIEG, N.R., DOBEREINER, J. A taxonomic study of the Spirillum
lipoferum group, with descriptions of a new genus, Azospirillum gen. nov. and two
species, Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. nov. and Azospirillum brasilense sp.
nov.Can. J. Microbiol. v.24, p.967-980, 1978.
THOMPSON, J.D., GIBSON, T.J., PLEWNIAK. F., JEANMOUGIN, F., HIGGINS, D.G.
The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment
aided by quality analysis tools. Nucl Acids Res. v.25, p.4876–4882, 1997.
TIAN, X., CAO, L., TAN, H., HAN, W., CHEN, M., LIU, Y., ZHOU, S.. Diversity of
cultivated and uncultivated Actinobacterial endophytes in stems and roots of rice.
Microbial Ecology, v. 53, p.700-707, 2007
126
TYLER, H.L.,TRIPPLET, E.W. Plants as a Habitat for Beneficial and/or Human
Pathogenic Bacteria, Annual Review of Phytopathology, v. 46, p. 53-73, 2008.
URETA, A., ALVAREZ, B., RÁMON, A., VERA, M. A., MARTINÉZ-DRETS, G.
Identification of Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae and
Herbaspirillum rubrisubalbicans using biochemichal and genetic criteria. Plant and Soil.,
v. 127, p. 271-277, 1995.
URQUIAGA, S., CRUZ, K.H.S., BODDEY, R.M. Contribution of nitrogen fixation to sugar
cane: nitrogen-15 and nitrogen balance estimates. Soil Science Society of America.
Journal, v.56, p.105-114, 1992.
URQUIAGA, S., LIMA, R.M.L., XAVIER, R.P., RESENDE, A.S., ALVES. B.J.R.,
BODDEY, R. Avaliação da eficiência do processo de fixação biológica de nitrogênio em
diferentes variedades de cana-de-açúcar. Agronomia, v. 37, p. 55-58, 2003.
VAN DE PEER, Y.; CHAPELLE, S.; De WACHTER, R. A quantitative map of nucleotide
substituion rates in bacterial rRNA. Nucleic Acids Res, v. 24, n 17, p. 3381-3391, 1996.
VANDENKOORNHUYSE, P. et al. Active root-inhabiting microbes identified by rapid
incorporation of plant-derived carbon into RNA.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. v. 104,
p.16970–16975, 2007.
VERMA, S. C., LADHA, J. K., TRIPATHI, K. Evaluation of plant growth promoting and
colonization ability of endophytic diazotrophic from deep water rice. Journal of
Biotechnology, v. 91, p. 127-141, 2001.
YOUNG, J. P. W. Phylogenetic classification of nitrogen-fixing organisms. In: STACEY,
G.; BURRIS, R.M.; EVANS, H. J. Biological Nitrogen Fixation, New York, London,
Chapman e Hall, 1992.
WHITTAKER, R. New concepts of kingdoms or organisms. Evolutionary relations are
better represented by new classifications than by the traditional two kingdoms. Science,
v. 163, p. 150–160, 1969.
WISE, M. G., MCARTHUR, J. V., SHIMKETS, L. J. Bacterial diversity of a Carolina bay
as determined by 16S rRNA gene analysis: confirmation of novel taxa. Appl. Environ.
Microbiol. v.63, p. 1505-1514, 1997.
WHITMANN, W.B.; COLEMAN, D.C.; WIEBE, W.J. Prokaryotes: The unseen majority,
PNAS, v. 95, p. 6578-6583, 1998.
WOESE, C.R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. v. 51, p. 221–271, 1987.
127
WOESE, C. R., KANDLER, O, WHEELIS, M. L. Towards a natural system of organisms:
proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eucarya. Proc. Natl Acad. Sci. v. 87,
p. 4576–4579, 1990.
WOESE, .C.R. The use of ribosomal RNA in reconstructing evolutionary relationships
among bacteria. In: Selander RK, Clark AG, Wnittam TS (eds) Evolutionary at the
molecular level. p. 1–24, 1991.
XIE, C., YOKOTA, A. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated
from the roots of the rice plant Oryza sativa. Int J Syst Evol Microbiol 55, 1435-1438,
2005.
YOUNG, C.C., HUPFER, H., SIERING, C., HO, M.J., ARUN, A.B., LAI, W.A., REKHA
P.D., SHEN, F.T., HUNG M.H., CHEN, W.M., YASSIN, A.F. Azospirillum rugosum sp.
nov., isolated from oil-contaminated soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 58, 959-963,
2008.
ZHANG, J. Burkholderia kururiensis sp. nov., a trichloroethylene (TCE)-degrading
bacterium isolated from an aquifer polluted with TCE. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology . v.50, p. 743–749. 2000.
ZINNIEL, D. K., LAMBRECHT, P., HARRIS, N. B., FENG, Z., KUCZMARSKI, D.,
HIGLEY, P., ISHIMARU, C. A., ARUNAKUMARI, A., BARLETTA, R. G., VIDAVER, A. K.
Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops
and praire plants. Applied and Environmental Microbiology, v. 68, n. 5, p. 2198-2208,
2002.
ZUCKERKANDL, E.; PAULING. L. Molecules as documents of evolutionary history.
J.Theor Biol, v. 8, p. 357-366, 1965.
128
ANEXOS
129
ÍNDICE DOS ANEXOS
TABELA 16 RESULTADOS DA PESQUISA DE HOMOLOGIA DE SEQUÊNCIA DOS CLONES 16S
RRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR...........................................................................................
128
FIGURA 24 MAPA DO PLASMÍDEO UTILIZADO PARA A CLONAGEM DOS PRODUTOS DE
PCR...........................................................................................................................................................
TABELA 17 LISTA DE SEQUÊNCIAS COM ALTA HOMOLOGIA COM UM CLONE DA BIBLIOTECA
DE 16S rRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR CA22...............................................
138
139
TABELA 18 LISTA DE SEQUÊNCIAS COM ALTA HOMOLOGIA COM UM CLONE DA BIBLIOTECA
DE 16S RRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR DA AMOSTRA CA23.....................
TABELA 19 LISTA DE SEQUÊNCIAS COM ALTA HOMOLOGIA COM UM CLONE DA
BIBLIOTECA DE 16S RRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR CA62...............................................
TABELA 20 LISTA DE SEQUÊNCIAS COM ALTA HOMOLOGIA COM UM CLONE DA
BIBLIOTECA DE 16S RRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR CA63...............................................
CÓPIA DO ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA GMR.................................................
140
141
142
143
TABELA 16. RESULTADOS DA PESQUISA DE HOMOLOGIA DE SEQUÊNCIA DOS CLONES 16S rRNA DE
COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Sequência Tamanho Identificação pelo BLASTn % de
identida
de
Fonte
CA01011A01 427 bp Uncultured bacterium 97% Bacterial diversity in tree canopies of the Atlantic forest
CA01011A02 397 bp Pantoea sp. 99% Copper-resistant endophytic bacteria isolation from the plant grown in copper mine
CA01011A03 340 bp Pseudomonas putida 99% Sequence of full 16S rRNA of Pseudomonas putida HR5.1 isolated from Danang soil in Viet Nam
CA01011A05 469 bp Pseudomonas monteilii 100% Thermotolerant PGP P. monteilii s. GAP-P1
CA01011A07 361 bp Enterobacteriaceae bacterium
M506
100% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01011A08 490 bp Enterobacteriaceae 99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01011A09 396 bp Enterobacter sp 99% Detection of acetyl monoglyceride as a metabolite of newly isolated glycerol-assimilating bacteria
CA01011A10 464 bp Pseudomonas putida 100% Plant growth promoting activit. of isolate PS9
CA01011A11 471 bp Pseudomonas putida 100% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas putida strain AKM-P7
CA01011B01 468 bp Pseudomonas entomophila 100% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain
WAPP53 under drought stress
CA01011B02 490 bp Pseudomonas entomophila
99% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain
WAPP53 under drought stress
CA01011B03 487 bp Pseudomonas monteilii 100% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain GAP-P1
CA01011B04 468 bp Pseudomonas entomophila 100% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain GAP-P1
CA01011B05 407 bp Enterobacter sp. 'MS 412' 99% Identification of indole-3-acetic acid producing freshwater wetland rhizosphere bacteria associated with
Juncus effusus L
CA01011B06 482 bp Enterobacteriaceae 99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01011B07 441 bp Klebsiella sp 98% Genetic variability of exopolysaccharide producing bacteria from grapevine in Turkey
CA01011B08 355 bp Enterobacter sp
100% Microbial diversity in a natural ZnS-producing biofilm dominated by sulfate-reducing bacteria in a
subsurface acid mine drainage system (RDP)
CA01011B09 442 bp Pseudomonas putida 99% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas putida strain AKM-P7
CA01011B10 391 bp Pseudomonas entomophila 99% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain
WAPP53 under drought stress
CA01011B11 396 bp Pseudomonas entomophila 100% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain
131
WAPP53 under drought stress
CA01011B12 360 bp Enterobacter aerogenes
99% Occurrence and resistance of pathogenic bacteria along the Tiete River downstream of Sao Paulo in Brazil
CA01011C01 392 bp Pseudomonas entomophila 99% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain
WAPP53 under drought stress
CA01011C02 340 bp Uncultured bacteria
(Enterobacteriaceae)
99% Phylogenetic analysis of the microbial community inhabiting a high temperature mud pool from the Taupo
Volcanic Zone, North Island,New Zealand
CA01011C03 400 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Detection of acetyl monoglyceride as a metabolite of newly isolated glycerol-assimilating bacteria
CA01011C04 490 bp Pseudomonas monteilii 100% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain GAP-P1
CA01011C05 358 bp Enterobacter ludwigii 100% Characterization of phosphate-solubilizing bacteria from tea rhizosphere
CA01011C06 485 bp Pseudomonas aeruginosa Isolation and characterization of degradation bacteria for PAHs obtained from activated sludge
CA01011C08 434 bp Pantoea agglomerans 100% Isolation and identification of microorganisms performing decarboxylation of substituted cinnamic acid
CA01011C09 351 bp Uncultured Pseudomonas sp. 96% Novel prokaryotic diversity in sediments of two Tunisian multipond solar saltern
CA01011C10 365 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01011C11 397 bp Uncultured bacterium
(Enterobacteriaceae)
99% Bacterial Community wthin a gut of a Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus
CA01011C12 440 bp Uncultured bacterium 99% Bacterial diversity in tree canopies of the Atlantic forest
CA01011D01 340 bp Pseudomonas sp. 98% DDT degradation strain Pseudomonas ddt-2
CA01011D02 402 bp Enterobacter SP 95% Enterobacter spp. suppress Rhizoctonia solani through siderophore production
CA01011D03 358 bp Enterobacter cloacae 99% Association of insecticidal microorganisms with larvae of Myrmeleon bore
CA01011D05 340 bp Pseudomonas putida 99% Phylogenetic Analysis of Denitrogenated Bacteria in Sewage
CA01011D06 431 bp Uncultured bacterium
(gamma-proteob.)
96% Bacterial diversity in tree canopies of the Atlantic forest
CA01011D08 354 bp Pseudomonas putida 98% Isolation of chlorpyrifos-degrading bacteria
CA01011D09 398 bp Enterobacteriaceae bacterium 100% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown
soybeans with different nodulation phenotypes
CA01011D10 501 bp Pseudomonas putida 99% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas putida strain AKM-P7
CA01011D12 387 bp Uncultured bacterium 98% Molecular Investigation of the Endosymbiont Populations of the Pink Sugarcane Mealybug, Saccharicoccus
sacchari
CA01011E01 421 bp Pseudomonas entomophila 99% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain
WAPP53 under drought stress
CA01011E02 362 bp Enterobacter cloacae 100% Association of insecticidal microorganisms with larvae of Myrmeleon bore
CA01011E03 436 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01011E05 431 bp Pantoea SP 100% Diversity of diazotrophic bacteria associated with sugarcane in Guangxi, P.R. China
132
CA01011E08 340 bp Citrobacter freundii 97% Characteristics of Antibiotic Resistant Bacteria in Urban Sewage and River
CA01011E11 392 bp Pseudomonas putida 98% Occurrence of glufosinate resistance and analysis of natural glufosinate resistance gene transfer from Bt176
maize into soil bacterium Bacillus pumilus S1
CA01011E12 345 bp Pseudomonas putida 99% Occurrence of glufosinate resistance and analysis of natural glufosinate resistance gene transfer from Bt176
maize into soil bacterium Bacillus pumilus S1
CA01011F03 472 bp Enterobacter sp 100% Phylogenetic analysis of Enterobacter sp.
CA01011F04 354 bp Enterobacteriaceae bacterium 100% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01011F05 400 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Detection of acetyl monoglyceride as a metabolite of newly isolated glycerol-assimilating bacteria
CA01011F06 354 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01011F07 362 bp Pseudomonas entomophila 99% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain
WAPP53 under drought stress
CA01011F08 357 bp Pseudomonas putida 99% Isolation of chlorpyrifos-degrading bacteria
CA01011F11 354 bp Enterobacter sp 99% Screening and Toxicity of Micro-organisms for Killing Oncomelania hupensis
CA01011G01 354 bp Pseudomonas corrugata 97% Genetic Diversity of Siderophore Isolated from Cotton Rhizosphere in Xinjiang, China
CA01011G02 354 bp Pseudomonas putida 100% Plant growth promoting activities of isolate PS9
CA01011G03 442 bp Pseudomonas plecoglossicida 99% Isolation and characterization of a pnp-degradation strain from a polluted farmland
CA01011G04 434 bp bacterium G9 99% Microbial Communities in the Hawaiian Archipelago: A Microbial Diversity Hotspot
CA01011G05 395 bp Pseudomonas putida 100% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas putida strain AKM-P7
CA01011G07 360 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01011G10 354 bp Pseudomonas putida 100% Phylogenetic Analysis of Denitrogenated Bacteria in Sewage
CA01011H02 354 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% High diversity of cultivable heterotrophic bacteria in association with cyanobacterial water blooms
CA01011H03 430 bp Pseudomonas putida 100% Occurrence of glufosinate resistance and analysis of natural glufosinate resistance gene transfer from Bt176
maize into soil bacterium Bacillus pumilus S1
CA01011H05 409 bp Enterobacter sp 99% Molecular ecology using the ecological indicators species of arsenic-contaminated abandoned mine areas
CA01011H06 436 bp Pseudomonas putida 99% Plant growth promoting activities of isolate PS-9
CA01011H07 431 bp Pseudomonas aeruginosa 98% Isolation and characterization of degradation bacteria for PAHs obtained from activated sludge
CA01011H09 354 bp Enterobacteriaceae bacterium 98% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01011H11 354 bp Enterobacter sp 97% Characteristics of Antibiotic Resistant Bacteria in Urban Sewage and River
CA01013A03 354 bp Pseudomonas sp. 100% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013A04 354 bp Pseudomonas sp 100% New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013A05 354 bp Pseudomonas sp 94% The cell ultrastructure changes of some heavy metal resistant pseudomonads under the influence of Co,
133
Cu, Cd, Pb, Ni
CA01013A06 354 bp Pseudomonas sp 90% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013A07 354 bp Pantoea sp Diversity of diazotrophic bacteria associated with sugarcane in Guangxi, P.R. China
CA01013A09 390 bp Pseudomonas sp 99 % New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013B01 354 bp Enterobacter sp 100% Neonatal enteral feeding tubes as loci for colonisation by members of the Enterobacteriaceae
CA01013B02 392 bp Pseudomonas sp 99% DDT degradation strain Pseudomonas ddt-2
CA01013B03 420 bp Pseudomonas sp 99 % New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013B04 431 bp Pseudomonas sp 99 % New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013B05 354 bp Enterobacter sp 100% Neonatal enteral feeding tubes as loci for colonisation by members of the Enterobacteriaceae
CA01013B08 357 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01013B10 Pantoea sp 97% Diversity of diazotrophic bacteria associated with sugarcane in Guangxi, P.R. China
CA01013B11 517 bp Pseudomonas sp 99 % New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013B12 354 pb Enterobacter sp 100% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA01013C01 354 bp Pseudomonas sp 95% DDT degradation strain Pseudomonas ddt-2
CA01013C02 354 bp Pseudomonas sp 99% Microbial degradation of the organophosphate pesticide, omethoate
CA01013C07 354 bp Pantoea sp 99 % Diversity of diazotrophic bacteria associated with sugarcane in Guangxi, P.R. China
CA01013C10 Uncultures bacterium Topographical and Temporal Diversity of the Human Skin Microbiome
CA01013C11 468 bp Pseudomonas putida 99% Isolation of chlorpyrifos-degrading bacteria
CA01013C12 487 bp Enterobacter cancerogenus 99% Neonatal enteral feeding tubes as loci for colonization by members of the Enterobacteriaceae
CA01013D01 536 bp Pantoea sp 99% Diversity of diazotrophic bacteria associated with sugarcane in Guangxi, P.R. China
CA01013D03 521 bp Pseudomonas sp 98% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013D04 354 bp Enterobacter cancerogenus 99% Neonatal enteral feeding tubes as loci for colonisation by members of the Enterobacteriaceae
CA01013D11 354 bp Enterobacteriaceae 99% Vários hits com diferentes gêneros
CA01013D12 Pseudomonas sp 99% DDT degradation strain Pseudomonas ddt-2
CA01013E01 466 bp Pseudomonas sp 99% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013E02 654 bp Uncultures bacterium 97% Topographical and Temporal Diversity of the Human Skin Microbiome
CA01013E04 499 bp Pseudomonas sp
CA01013E05 354 bp Pseudomonas sp 95% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013E06 Pantoea sp
CA01013E10 354 bp Enterobacter aerogenes 91% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA01013F01 513 bp Pseudomonas sp 91% The cell ultrastructure changes of some heavy metal resistant pseudomonads under the influence of Co,
Cu, Cd, Pb, Ni
CA01013F02 417 bp Pseudomonas sp 99% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013F03 417 bp Pseudomonas sp 100% DDT degradation strain Pseudomonas ddt-2
CA01013F04 447 bp Uncultured bacterium 99% Topographical and Temporal Diversity of the Human Skin Microbiome
134
CA01013F05 354 bp Enterobacter cancerogenus 100% Neonatal enteral feeding tubes as loci for colonisation by members of the Enterobacteriaceae
CA01013F06 356 bp Enterobacter aerogenes 99% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA01013F07 366 bp Enterobacter cancerogenus 99% Neonatal enteral feeding tubes as loci for colonisation by members of the Enterobacteriaceae
CA01013F08 354 bp Uncultured bacterium 100% Microbiological Assessment of Circulation Mud Fluids During the First Operation of Riser Drilling by the
Deep-Earth Research Vessel
CA01013F10 413 bp Pseudomonas sp 100% DDT degradation strain Pseudomonas ddt-2
CA01013F11 463 bp Pseudomonas sp 100% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013F12 354 bp Pseudomonas sp 100% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013G01 523 bp Pseudomonas sp 99% DDT degradation strain Pseudomonas ddt-2
CA01013G02 386 bp Pseudomonas sp 100% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013G11 480 bp Enterobacter cloacae 99% Water Availability Is a Critical Determinant of a Population Shift from Proteobacteria to Actinobacteria during
Start-Up Operation of Mesophilic Fed-Batch Composting
CA01013G12 502 bp Pantoea sp Diversity of diazotrophic bacteria associated with sugarcane in Guangxi, P.R. China
CA01013H02 399 bp Pantoea sp 100% Diversity of diazotrophic bacteria associated with sugarcane in Guangxi, P.R. China
CA01013H03 454 bp Uncultured bacterium 96% Bacterial diversity in tree canopies of the Atlantic forest
CA01013H04 408 bp Enterobacter aerogenes 100% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA01013H05 354 bp Pseudomonas sp 100% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013H06 510 bp Pseudomonas sp 97% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01013H09 354 bp Pseudomonas sp 100% DDT degradation strain Pseudomonas ddt-2
CA01013H10 357 bp Citrobacter sp 100% Hydrogen production from autofermentation of vegetable refuses
CA01014A03 358 bp Pseudomonas putida 99% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas putida strain AKM-P7
CA01014A05 400 bp Enterobacter sp 100% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA01014B03 399 bp Pseudomonas putida 99% Plant growth promoting activities of isolate PS9
CA01014B05 396 bp Pseudomonas putida 99% Plant growth promoting activities of isolate PS9
CA01014B07 354 bp Enterobacter sp 99% Phylogenetic analysis of Enterobacter sp
CA01014B09 354 bp Enterobacter sp 100% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA01014B10 354 bp Enterobacter sp 99% Characterization of phosphate-solubilizing bacteria from tea rhizosphere
CA01014B12 469 bp Pseudomonas putida 99% Occurrence of glufosinate resistance and analysis of natural glufosinate resistance gene transfer from Bt176
maize into soil bacterium Bacillus pumilus S1
CA01014C04 501 bp Pantoea agglomerans
99% Occurrence and resistance of pathogenic bacteria along the Tiete River downstream of Sao Paulo in Brazil
CA01014C05 354 bp Pseudomonas sp 91% The cell ultrastructure changes of some heavy metal resistant pseudomonads under the influence of Co,
Cu, Cd, Pb, Ni
CA01014C07 354 bp Pseudomonas putida 99% Phylogenetic Analysis of Denitrogenated Bacteria in Sewage
CA01014D01 430 bp Pseudomonas entomophila
99% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain
WAPP53 under drought stress
135
CA01014D03 436 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01014D04 354 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Detection of acetyl monoglyceride as a metabolite of newly isolated glycerol-assimilating bacteria
CA01014D05 417 bp Enterobacter sp 100% Phylogenetic analysis of Enterobacter sp.
CA01014D07 354 bp Pseudomonas entomophila 99% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas monteilii strain
WAPP53 under drought stress
CA01014E01 431 bp Pseudomonas putida 99% Plant growth promoting activities of isolate PS9
CA01014E03 354 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01014E05 403 bp Pseudomonas entomophila 100% Abiotic stress tolerant, exopolysaccharide producing, plant growth promoting Pseudomonas
monteilii strain WAPP53 under drought stress
CA01014E07 354 bp Enterobacter sp 98% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown soybeans with different nodulation
phenotypes
CA01014E11 354 bp Pantoea sp Cultivable bacterial strains isolated from susceptible population of two spotted spider mite Tetranychus
urticae
CA01014F04 359 bp Pseudomonas putida 99% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas putida strain AKM-P7
CA01014F05 471 bp Pseudomonas putida 100% Plant growth promoting activities of isolate PS9
CA01014F06 354 bp Pseudomonas sp 97% Environmental isolates from New Zealand pulp and paper wastewater
CA01014F10 354 bp Enterobacter sp 100% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA01014G04 405 bp Pantoea sp 99% Diversity of diazotrophic bacteria associated with sugarcane in Guangxi, P.R. China
CA01014G05 354 bp Pseudomonas putida 100% Phylogenetic Analysis of Denitrogenated Bacteria in Sewage
CA01014G06 390 bp Pseudomonas putida 99% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas putida strain AKM-P7
CA01014H02 464 bp Enterobacter aerogenes 100% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA01014H03 468 bp Enterobacteriaceae bacterium 99% Community analysis of stem-associated bacteria in soybeans by a bacterial cell enrichment method
CA01014H04 404 bp Pantoea dispersa 99% Phylogeny and species identification of the family Enterobacteriacea based on dnaJ sequences
CA01014H05 397 bp Pseudomonas putida 100% Plant growth promoting activities of isolate PS9
CA01014H06 436 bp Enterobacter sp 99% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA01014H08 354 bp Pseudomonas putida 99% Thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas putida strain AKM-P7
CA01014A01 540 bp Unculturesd bacterium 98% Topographical and Temporal Diversity of the Human Skin Microbiome
CA01014A12 538 bp Pseudomonas putida 99% Isolation and identification of newly isolated Pseudomonas putida producing cysteine
CA01014A09 540 bp Pseudomonas putida 99% Isolation and identification of newly isolated Pseudomonas putida producing cysteine
CA01014A07 550 bp Pseudomonas putida 99% Isolation and identification of newly isolated Pseudomonas putida producing cysteine
CA01014B08 540 bp Enterobacter sp 96% Microbial diversity of traditional soy paste and soy sauce during fermentation
CA0105XH03 483 bp Pseudomonas SP 99% mangrove sediment
CA0105XF06 472 pb Pseudomonas SP 99% mangrove sediment
136
CA0105XA08 557 pb Uncultured Citrobacter 100% spacecraft assembly clean room floor
CA0105XG10 483 pb Pseudomonas SP 98% mangrove sediment
CA0105XG11 382 bp Pseudomonas monteilli 98% water sample
CA0105XE12 531 pb Pseudomonas SP 98% mangrove sediment
CA0105XF12 549 pb Pseudomonas SP 100% mangrove sediment
CA0105XC01 555 pb Pseudomonas SP
GQ284545.1
97% mangrove sediment
CA0105XG01 502 bp Pseudomonas SP 96% Pseudomonas aeruginosa in marine environments
CA0105XD02 518 pb Pseudomonas SP 99% mangrove sediment
CA0105XE02 537 pb Pseudomonas sp 99% mangrove sediment
CA0105XF02 572 pb Uncultured/Pseudomonas SP 98% mangrove sediment
CA0105XF04 463 bp Klebsiella oxytoca 98% Biodegradation of 2-chlorobenzoic acid by locally isolated and characterized bacterium, Klebsiella oxytoca
Mutah-01
CA0105XG05 479 pb Pseudomonas sp
98% mangrove sediment
CA0105XA06 336 pb Pseudomonas SP
97% Genetic Affiliation of Nitrogen-fixing Bacteria Associated with
Root Nodules of Acacia salicina and Acacia stenophylla Growing in
Southeastern Australia
CA0105XC06 565 pb Pseudomonas sp
99% mangrove sediment
CA0105XF06 642 pb Pseudomonas sp
99% pulp and paper wastewater
CA0105XB08 377 pb Pseudomonas sp
99% mangrove sediment
CA0105XF08 371 pb Enterobacter SP
99% Enteric bacteria of field-collected Colorado potato beetle larvae inhibit growth of the entomopathogens
Photorhabdus temperata and
Beauveria bassiana
CA0105XH08 608 pb Pseudomonas putida
99% 16S rDNA sequence of chlorobenzene-degrading bacteria
CA0105XB09 319 pb Pseudomonas SP
99% mangrove sediment
CA0105XH09 447 pb Pseudomonas SP
98% mangrove sediment
CA0105XB10 335 pb Pseudomonas sp
99% mangrove sediment
CA0105XH10 447 pb Pseudomonas SP 99% mangrove sediment
137
CA0105XA11 517 bp Pseudomonas plecossida
98% Genetic and functional diversity among fluorescent pseudomonads isolated from the rhizosphere of banana
CA0105XC11 405 pb Pseudomonas SP
99% mangrove sediment
CA0105XF11 317 pb Pseudomonas putida
99% mangrove sediment
CA0105XD11 592 pb Stenotrophomonas SP
99% Diversity of endophytic bacteria isolated from stems of field-grown
soybeans with different nodulation phenotypes
CA0105XE11 545 pb Pseudomonas SP
99% mangrove sediment
CA0105XA12 310 pb Pseudomonas putida
99% mangrove sediment
CA23014F11 572 pb Asaia bogorensis 100% Identification of Thai isolates assigned to the genus Asaia based on 16S rDNA restriction analysis
CA22011E07 367 pb Asaia bogorensis 99% Identification of Thai isolates assigned to the genus Asaia based on 16S rDNA restriction analysis
CA22011F03 530 pb Devosia albogilva 97% Devosia albogilva sp. nov. and Devosia crocina sp. nov., isolated from a hexachlorocyclohexane dump site
CA23013B02 249 pb Defluvibacter lusatiensis
97% Analysis of microbial diversity asociated with autotrophic denitrification in granular sludge
CA62011B11 530 pb Achromobacter sp. 98% Isolation of Oil-Degrading Bacteria from Various Ecological Sources
CA62012A02 482 pb Agrobacterium tumefaciens
97% Endophytic bacteria in plants from alpine grasslands
CA63012F03 584 pb Uncultured bacterium
99% Phylogenetic diversity and evolutionary relationships between rare and abundant members of the bacterial
communty in tallgrass prairie soil
FIGURA 24 MAPA DO PLASMÍDEO UTILIZADO PARA A CLONAGEM DOS PRODUTOS
DE PCR
139
TABELA 17 - LISTA DE SEQUÊNCIAS COM ALTA HOMOLOGIA COM UM CLONE DA
BIBLIOTECA DE 16S RRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR CA22
Accession Description
EU133393.1 Uncultured bacterium clone FFCH13347 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
DQ984518.1 Sorghum bicolor mitochondrion, complete genome
EU365401.1 Bambusa oldhamii mitochondrion, complete genome
EU534409.1 Triticum aestivum cultivar Chinese Yumai mitochondrion, complete genome
FJ390733.1 Uncultured bacterium clone Ontario1285 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ390643.1 Uncultured bacterium clone Ohio15071 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ390543.1 Uncultured bacterium clone Ohio121826 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EF664750.1
Uncultured proteobacterium clone GASP-MB1W1_C05 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
EF664441.1
Uncultured proteobacterium clone GASP-MA4W3_H07 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
AP008982.1 Triticum aestivum mitochondrial DNA, complete genome
Z14078.1 T.aestivum mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
K01229.1 Wheat mitochondrial small subunit (18S) rRNA gene (complete)
Z14060.1 T.aestivum mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
Z14059.1 S.cereale mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
FJ390553.1 Uncultured bacterium clone Ohio12351 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ837499.1 Uncultured bacterium clone YO00361D04 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
AK224092.1 Oryza punctata cDNA, clone: BBS10A05, expressed in shoot apical meristem of BB genome
BA000029.3 Oryza sativa Japonica Group mitochondrial DNA, complete genome
DQ167400.1 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cultivar Nipponbare mitochondrion, complete genome
DQ167807.1 Oryza sativa (japonica cultivar-group) isolate PA64S mitochondrion, complete genome
DQ167399.1 Oryza sativa (indica cultivar-group) isolate 93-11 mitochondrion, complete genome
AK109513.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-104-H01, full insert sequence
AK106331.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-101-F07, full insert sequence
AK064232.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-104-H07, full insert sequence
AK060528.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:001-020-G04, full insert sequence
AL713949.4
Oryza sativa chromosome 12, . BAC OJ1521_B04 of library Monsanto from chromosome 12 of
cultivar Nipponbare of ssp. japonica of Oryza sativa (rice), complete sequence
Legenda: foi mostrado o resultado de somente um clone nessa figura.
140
TABELA 18 - LISTA DE SEQUÊNCIAS COM ALTA HOMOLOGIA COM UM CLONE DA
BIBLIOTECA DE 16S RRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR DA AMOSTRA
CA23
Accession Description
EU133393.1 Uncultured bacterium clone FFCH13347 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
DQ984518.1 Sorghum bicolor mitochondrion, complete genome
EU365401.1 Bambusa oldhamii mitochondrion, complete genome
EU534409.1 Triticum aestivum cultivar Chinese Yumai mitochondrion, complete genome
FJ390733.1 Uncultured bacterium clone Ontario1285 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ390543.1 Uncultured bacterium clone Ohio121826 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EF664750.1 Uncultured proteobacterium clone GASP-MB1W1_C05 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EF664441.1 Uncultured proteobacterium clone GASP-MA4W3_H07 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
AP008982.1 Triticum aestivum mitochondrial DNA, complete genome
Z14078.1 T.aestivum mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
K01229.1 Wheat mitochondrial small subunit (18S) rRNA gene (complete)
Z14060.1 T.aestivum mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
Z14059.1 S.cereale mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
FJ837499.1 Uncultured bacterium clone YO00361D04 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
BA000029.3 Oryza sativa Japonica Group mitochondrial DNA, complete genome
DQ167400.1 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cultivar Nipponbare mitochondrion, complete genome
DQ167807.1 Oryza sativa (japonica cultivar-group) isolate PA64S mitochondrion, complete genome
DQ167399.1 Oryza sativa (indica cultivar-group) isolate 93-11 mitochondrion, complete genome
AK109513.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-104-H01, full insert sequence
AK106331.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-101-F07, full insert sequence
AK060528.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:001-020-G04, full insert sequence
AK064232.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-104-H07, full insert sequence
AL713949.4
Oryza sativa chromosome 12, . BAC OJ1521_B04 of library Monsanto from chromosome 12 of
cultivar Nipponbare of ssp. japonica of Oryza sativa (rice), complete sequence
DQ984517.1 Tripsacum dactyloides cultivar Pete mitochondrion, complete genome
DQ645538.1 Zea perennis mitochondrion, complete genome
Legenda: foi mostrado o resultado de somente um clone nessa figura.
141
TABELA 19 - LISTA DE SEQUÊNCIAS COM ALTA HOMOLOGIA COM UM CLONE DA
BIBLIOTECA DE 16S RRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR CA62
Accession Description
EU133393.1
Uncultured bacterium clone FFCH13347 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
DQ984518.1
Sorghum bicolor mitochondrion, complete genome
EU365401.1
Bambusa oldhamii mitochondrion, complete genome
EU534409.1
Triticum aestivum cultivar Chinese Yumai mitochondrion, complete genome
FJ390733.1 Uncultured bacterium clone Ontario1285 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ390543.1 Uncultured bacterium clone Ohio121826 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EF664750.1
Uncultured proteobacterium clone GASP-MB1W1_C05 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EF664441.1
Uncultured proteobacterium clone GASP-MA4W3_H07 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
AP008982.1
Triticum aestivum mitochondrial DNA, complete genome
Z14078.1 T.aestivum mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
K01229.1 Wheat mitochondrial small subunit (18S) rRNA gene (complete)
Z14060.1 T.aestivum mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
Z14059.1 S.cereale mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
FJ837499.1 Uncultured bacterium clone YO00361D04 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
BA000029.3
Oryza sativa Japonica Group mitochondrial DNA, complete genome
DQ167400.1
Oryza sativa (japonica cultivar-group) cultivar Nipponbare mitochondrion, complete genome
DQ167807.1
Oryza sativa (japonica cultivar-group) isolate PA64S mitochondrion, complete genome
DQ167399.1
Oryza sativa (indica cultivar-group) isolate 93-11 mitochondrion, complete genome
AK109513.1
Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-104-H01, full insert sequence
AK106331.1
Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-101-F07, full insert sequence
AK060528.1
Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:001-020-G04, full insert sequence
AK064232.1
Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-104-H07, full insert sequence
AL713949.4
Oryza sativa chromosome 12, . BAC OJ1521_B04 of library Monsanto from chromosome 12 of cultivar
Nipponbare of ssp. japonica of Oryza sativa (rice), complete sequence
DQ984517.1
Tripsacum dactyloides cultivar Pete mitochondrion, complete genome
DQ645538.1
Zea perennis mitochondrion, complete genome
AL606445.2
Oryza sativa genomic DNA, chromosome 4, BAC clone: OSJNBa0070O11, complete sequence
EU943646.1
Zea mays clone 1671421 mRNA sequence
DQ490951.2
Zea mays subsp. mays genotype CMS-S mitochondrion, complete genome
DQ645539.1
Zea mays subsp. parviglumis mitochondrion, complete genome
DQ645536.1
Zea mays subsp. mays genotype CMS-C mitochondrion, complete genome
DQ490953.1
Zea mays subsp. mays genotype CMS-T mitochondrion, complete genome
DQ490952.1
Zea mays subsp. mays genotype male-fertile NA mitochondrion, complete genome
AY506529.1
Zea mays strain NB mitochondrion, complete genome
M10248.1 Maize mitochondrial 18S ribosomal RNA gene
X00794.1 Maize mitochondrial gene for 18S rRNA
AL117265.3
Oryza sativa genomic DNA, chromosome 4, BAC clone: H0811D08, complete sequence
142
TABELA 20 - LISTA DE SEQUÊNCIAS COM ALTA HOMOLOGIA COM UM CLONE DA
BIBLIOTECA DE 16S RRNA DE COLMO DE CANA-DE-AÇÚCAR CA63
Accession Description
EU133393.1 Uncultured bacterium clone FFCH13347 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
DQ984518.1 Sorghum bicolor mitochondrion, complete genome
EU365401.1 Bambusa oldhamii mitochondrion, complete genome
EU534409.1 Triticum aestivum cultivar Chinese Yumai mitochondrion, complete genome
FJ390733.1 Uncultured bacterium clone Ontario1285 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ390543.1 Uncultured bacterium clone Ohio121826 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EF664750.1 Uncultured proteobacterium clone GASP-MB1W1_C05 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EF664441.1 Uncultured proteobacterium clone GASP-MA4W3_H07 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
AP008982.1 Triticum aestivum mitochondrial DNA, complete genome
Z14078.1 T.aestivum mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
K01229.1 Wheat mitochondrial small subunit (18S) rRNA gene (complete)
Z14060.1 T.aestivum mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
Z14059.1 S.cereale mitochondrion fMet, 18S, 5S repeat unit DNA
FJ837499.1 Uncultured bacterium clone YO00361D04 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
BA000029.3 Oryza sativa Japonica Group mitochondrial DNA, complete genome
DQ167400.1 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cultivar Nipponbare mitochondrion, complete genome
DQ167807.1 Oryza sativa (japonica cultivar-group) isolate PA64S mitochondrion, complete genome
DQ167399.1 Oryza sativa (indica cultivar-group) isolate 93-11 mitochondrion, complete genome
AK109513.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-104-H01, full insert sequence
AK106331.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-101-F07, full insert sequence
AK060528.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:001-020-G04, full insert sequence
AK064232.1 Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-104-H07, full insert sequence
AL713949.4
Oryza sativa chromosome 12, . BAC OJ1521_B04 of library Monsanto from chromosome 12 of cultivar
Nipponbare of ssp. japonica of Oryza sativa (rice), complete sequence
DQ984517.1 Tripsacum dactyloides cultivar Pete mitochondrion, complete genome
DQ645538.1 Zea perennis mitochondrion, complete genome
AL606445.2 Oryza sativa genomic DNA, chromosome 4, BAC clone: OSJNBa0070O11, complete sequence
EU943646.1 Zea mays clone 1671421 mRNA sequence
DQ490951.2 Zea mays subsp. mays genotype CMS-S mitochondrion, complete genome
143
Diversity of Endophytic Bacteria from Brazilian sugarcane
G. S. Magnani
1
; C. M. Didonet
3
; L.M. Cruz
1
; C. F. Picheth
2
; F.O. Pedrosa
1
; E.M. Souza
1
.
1
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR,
Brasil
2
Departamento de Patologia Médica, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brasil
3
Universidade de Goiás, Goiânia, GO, Brasil.
* Corresponding author: Emanuel Maltempi de Souza
Tel:(+55 41) 3361-1667
Fax:(+55 41)3361-1578
C. Postal 19046, 81531-990, Curitiba, PR, Brasil
Running title: Microbial diversity in sugar cane
Abstract
Endophytic bacteria live inside plant tissues without causing disease. Studies of
endophytes in sugarcane focused on the isolation of diazotrophic bacteria. In this work the
endophytic bacterial diversity of stem and leaves of sugarcane was evaluated using molecular and
biochemical methods.
Potato-agar medium was used to isolate endophytes, and a total of thirty two isolates were
selected. The DNA was extracted and the 16S rRNA gene was partially sequenced and used for
molecular identification. Gram stain, catalase and oxidase tests, and the API-20E system were used
to characterize the isolates. The strains were divided into five groups, based on the 16S rRNA
sequence. Group I, comprised 14 representatives of the Enterobacteriaceae; group II, related to
Bacilli; group III contained one representative, Curtobacterium sp.; group IV contained
representatives of the Pseudomonadaceae family; and group V, with one isolate related to an
144
uncultured bacterium. Four isolates were able to reduce acetylene to ethylene. The majority of the
strains isolated from the stem and leaves belonged to Enterobacteriaceae and Pseudomonaceae,
respectively, suggesting that distinct bacterial groups occupy preferential niches. Overall, the results
suggest that the bacterial endophytic diversity in sugarcane is more complex than previously
described.The prevalence of the endophytic bacteria shown here contributes to the knowledge of
taxonomic groups that occupy internal tissues of sugarcane.
Keywords: endophytic bacterium, microbial diversity, sugar cane, 16S rRNA
Introduction
Sugarcane (Saccharum spp) is one of the most important crops in Brazil, with a yield of 490 M tons
(2007), a quarter of the world’s production. Its two main products are sugar and alcohol, a clean
renewable alternative fuel. This crop is perhaps the most economically competitive source of ethanol
and can effectively contribute to a cleaner environment. Ways of improving its productivity are
subject to intense investigation in Brazil, chiefly because the worldwide climate change due to the
intense use of greenhouse gas-producing energy sources has focused much attention on the
development of sustainable energy.
Endophytic bacteria occupy internal tissues of plants without causing damage to their hosts
(Hallmann et al. 1997). This microbial community might play an important role in agriculture by
conferring advantages to the plant (Mengoni et al. 2003), since endophytic bacteria can contribute to
plant development by producing phytohormones (Feng et al., 2006), siderophores (Burd et al.
1998), increasing resistance to pathogens (Reiter et al. 2002) and parasites (Hallmann et al. 1997),
biological nitrogen fixation (Baldani et al. 1996) and antibiotic production (Strobel and Daisy,
2003). Understanding the diversity of plant-bacterial associations and their role in plant
development is necessary if these associations are manipulated to increase crop production, conserve
biodiversity and sustain agro-ecosystems (Germida et al. 1998; Sturz et al. 1999).
Bacterial endophytes are found in a variety of plants, such as sugar beet (Dent et al., 2004), prairie
plants, agronomic crops (Zinniel et al. 2002), potato varieties (Sessitich et al. 2002), wheat
(Germida and Siciliano 2001) and rice (Sun et al. 2008). The microbial community of endophytes
colonizes plant tissues and is capable of establishing interactions not only among themselves but
also with invaders such as pathogens, and in this way may influence the plant development. For
example, Araújo et al. (2002) described interactions between the phytopathogenic bacterium Xylella
fastidiosa and endophytes in Citrus sinensis, which, apparently, restricted the development of the
disease by suppressing the symptons in innoculated plants.
In sugarcane, most of the research on endophytic bacteria has been focused on diazotrophs, of which
the main representatives are Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum spp. (Cavalcante
and Dobereiner 1988; Baldani et al. 1986) and Azospirillum amazonense (Reis-Jr et al., 2000).
However, the presence of diazotrophs among the total population of bacteria in sugarcane tissues
seems to be low in Indian sugar cane (Suman et al. 2001). The aim of this work was to investigate
the diversity of the putative endophytic population in stems and leaves of Brazilian sugarcane.
145
Material and Methods
Bacterial isolation and identification
Sugar cane plants were from a 4-years old plantation in the Northeast of Paraná state
(Brazil). The plants were grown for livestock feeding. Sugarcane leaves and stems were collected
and then separated and maintained in ice until analysis. The leaves were washed with sterile
distilled water and their surface disinfested by washing with 70% ethanol. The stems were treated in
the same way; and after disinfestation, were flame sterilized. Stems (10g)and leaves (10g) were
macerated separately in sterile Tris-HCl 10mmol/L pH 8.0 and serially diluted to 10
-6
. One hundred
microliters of these dilutions were plated on potato-agar (Döbereiner and Baldani, 1995) and
incubated at 30ºC for up to 5 days. Thirty-two isolates from stems and leaves of sugarcane,
representing different types of colonies developed on agar, were randomly chosen, analyzed by
gram stain, cytochrome oxidase activity (gram negative rods) or catalase production (gram positive
cocci) (Koneman et al. 2001). The gram-negative rods were plated on MacConkey medium (Jones
et al. 1946) to identify candidate Enterobacteriaceae, and then submitted to biochemical analysis
using the API-20E test (bioMérieux).
Amplification and sequencing of the 16S rRNA gene
Three milliliters of fresh cultures of the isolates in LB medium were used for DNA
extraction according to Sambrook et al. (1989). The genomic DNA was used as a template in a
polymerase chain reaction (PCR) with the primers Y1 (5'-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-
3') and Y2 (5'-TACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTC-3'), allowing amplification of a fragment
of approximately 300 bp of the 5’ end of the 16S rRNA gene. The PCR mixtures contained 50-100
ng of the template DNA, 2.5 µL Taq buffer 10X (Tris-HCl pH 8.4 200 mM, KCl 500 mM), 1.5
mmol/L MgCl
2
, 0.2 mmol/L dNTP, 4 pmol/L of each Y1 and Y2 primers, and 1.0 U of Taq DNA
polymerase in 25 µL. The temperature cycles were: 94ºC/ 30 sec (once); 94ºC/20 sec, 58ºC/20 sec,
72ºC/1 min (30 times); and 72ºC/5 min (once).
146
The Y1-Y2 PCR products were purified using the AutoSeq 96 system (GE HealthCare)
and sequenced using dye terminator chemistry and an ABI PRISM 377 sequencer (Applied
Biosystems).
Sequence assembly and analysis
The PHRED program was used for base calling (Ewing et al., 1998). The forward and
reverse sequences were assembled with the CAP3 program (Huang and Madan, 1999). Nucleotide
sequence identities were determined by the BLAST and Seqmatch programs. The 16S rRNA genes
have been deposited in the Genbank (EF054896-EF054920/ FJ966050-FJ966056).
Determination of Nitrogenase activity
To test for nitrogenase activity of the Enterobacteriace, 100 µL of the cultures grown in
LB were used to inoculate 4 mL of NFDM (Dixon et al., 1977) medium containing 0.5 mmol/L
sodium glutamate in 10 mL bottles, which were sealed with suba-seals and incubated at 30ºC in a
rotary shaker (120 rpm) for 16 hours. Acetylene (10%) was then injected into the culture vials,
incubated for one hour and analyzed for ethylene by gas chromatography. To test for nitrogenase
activity of the Pseudomonads, 100 µL of the cultures grown in NfbHPN was used to inoculate 4 mL
of semi-solid N-free NfbHN and the acetylene reduction activity was determined as described
(Pedrosa and Yates, 1984).
Results
Phenotypic characterization of the sugarcane isolates
Thirty two isolates representing all colony types developed on potato agar cultures from
macerates of leaves and stems were randomly selected and stored in 50% glycerol at -20
o
C. Of
these, 18 strains were isolated from stems (designated as CC), and 14 strains from leaves (FC).
Frozen cultures were re-streaked on potato-agar and isolated colonies of each culture were selected.
147
Most of the isolates were gram-negative bacilli. The exceptions were strains CC18, a
gram-positive coccus, and strains CC38 and CC27, which were gram-positive bacilli. All the gram
negative bacilli were oxidase negative, but only 14 out of 29 of these grew on MacConkey agar;
these were tested using the API-20E kit for enteric bacteria. Based on the API and oxidase results,
these fourteen strains were classified as Enterobacteriaceae (Table 1), among which were
Enterobacter (CC14, CC26, CC29, CC33, CC34, CC37, CC43, CC46, FCP2), Pantoea (CC16,
CC21, CC47), Kluyvera (CC20) and Klebsiella (CC22). An interesting observation is that all but
one strain of this group (FC2P) were isolated from sugar cane stems.
The gram-positive isolates were catalase positive.
Sequence Analysis
The 5´end of the 16S rRNA gene of the 32 isolates was amplified by PCR and sequenced.
At least two sequencing reactions were performed for each orientation and the assembled sequences,
with primer sequences removed had lengths ranging from 275 to 301 bp.
The 16S rRNA sequences were used to search the Genbank and RDP databases using
Blast and SequeMatch programs, respectively. Most of the strains (28) belonged to the gamma
Proteobacteria. The results allowed clustering the sugarcane endophytic bacteria into 5 distinct
groups. Group I was composed of members of the Enterobacteriaceae family. The isolates of this
group were related to Pantoea (4), Enterobacter (8), Klebsiella (1) and Citrobacter (1). Again, all
but one strain of the enteric bacteria group (FC2P) were isolated from sugar cane stems.
Group II comprised two isolates of the Bacilli Class, which probably belong to the
Brevibacillus (CC38) and Staphylococcus (CC18) genera. Group III had a single representative of
the Actinobacteria phylum (CC27) related to Curtobacterium. Group IV contained 14 strains related
to Pseudomonadaceae which were all isolated from leaves with 2 exceptions (CC24 and CC35).
Although most Pseudomonads are oxidase positive, all the isolates in this study are oxidase
negative. Group V has only one isolate, related to an uncultured bacterium.
148
The endophytic population in the stem is more diverse than that of the leaves: the stems
harbors the largest number of 8 different genera distributed in all four groups with prevalence of
Enterobacteriaceae, whereas bacterial strains isolated from leaves belonged to only 2 genera with a
large predominance of Pseudomonas.
Screening for endophytic nitrogen fixing bacteria
Approximately 90% of these isolates showed no nitrogenase activity: only isolates CC22,
CC26, CC29 and CC35 reduced acetylene to ethylene. Based on 16S rRNA sequence identity, these
isolated were tentatively classified as Klebsiella, Enterobacter, Pantoea and Pseudomonas.
Discussion
Plants maintain a complex ecosystem where bacterial communities interact continuously,
competing for nutrients and water in the tissues of the host. Knowledge of the diversity of
endophytic bacteria is important for both ecological and biotechnological studies.
Most studies of sugarcane endophytes have focused on the diazotrophic bacteria
(Caballero-Mellado and Martinez-Romero, 1994; Cavalcante and Dobereiner 1988; Olivares et al.
1996). Since factors other than biological nitrogen fixation can contribute significantly to the host,
we investigated the diversity of bacteria from leaves and stems of sugarcane. In our study, the
prevalence of diazotrophs was very low: only 10% of the isolates had nitrogenase activity. The
absence of endophytic diazotrophs such as Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum spp.,
Burkholderia spp., and Azospirillum spp., which have been found in great numbers in sugar cane, is
most notable. This discrepancy may be due to the use of nitrogen-free medium for bacterial
isolation, geographic and environmental variations or a combination of these. In a study similar to
ours, Suman et al. 2001 isolated endophytic bacteria from several cultivars of Indian sugar cane on
LGI medium and found that the prevalence of diazotrophs varied from 3.86 to 0.02 %. It is possible
that by using rich medium such as potato-agar medium, which supports growth of many different
149
bacteria, a distinct portion of the bacterial community was assessed, suggesting a more complex
ecology of sugar cane endophytes than previously reported.
In this study the fermenting gram-negative bacilli where characterized both by phenotypic
identification and 16S rRNA gene sequencing. The identifications obtained by these methods agreed
at the genus level in 11 out of 14 isolates. In the remaining cases, the identifications were of closely
related genera. These discrepancies may be due to limited databases available for the phenotypic test
systems and that the system used was designed for clinical diagnostics: the closest sequence matches
to our isolates were always either plant endophytes or from other environmental sources, which are
unlikely to be represented in the API-20E system database.
The Enterobacter genus was the most frequently found in the stems. Enterobacter has
been identified as endophytes of several plants such as Citrus sinensis, soybean and crop plants
(Araujo et al., 2002; Kuklinsky-Sobral et al., 2004; Zinniel et al. 2002;). Other Enterobacteriaceae
identified in sugar cane have also been previously described as endophytes. The plant growth-
promoting bacteria Kluyvera ascorbata SUD165, resistant to heavy metals, was capable of
conferring resistance to high concentrations of nickel to canola and tomato plants (Burd et al. 1998).
Endophytic Pantoea was found in sugarcane (Loiret et al. 2004) and in soybean (Kuklinsky-Sobral
et al., 2004). Representatives of these three genera have also been associated with pathogenicity
(Gurtler et al. 2005; Medrano and Bell 2007). However, the results suggest no dominance of a
particular strain, indicating that it is unlikely a pathogenic association. Furthermore, a completely
different bacterial community, dominated by Pseudomonas, was identified in the leaves.
The two Bacilli genera identified in sugar cane have been identified before as endophytes:
Staphylococcus was found associated with sweet pepper (Rasche et al. 2006) and Brevibacillus was
found in cadmium contaminated soils and associated with soybean (Vivas et al. 2003; Sarkar 2002).
Curtobacterium, the only representative of the Actinobacteria, was identified in orange, grape, and
Pinus (Araujo et al. 2002; Bell et al. 1995; Idris et al. 2004, and interacting with the
phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa (Lacava 2004). To our knowledge, this is the first
characterization of Brevibacillus and Curtobacterium in sugarcane.
150
The microbial population of the leaves, colonized predominantly by Pseudomonaceae,
and stems of sugar cane, with prevalence of Enterobacteriaceae, were substantially different. Stems
presumably offer a more stable niche for the bacteria, since they contain a greater diversity of
genera: they are less exposed to drastic changes of their physicochemical conditions such as
temperature, humidity, UV irradiation and nutrients in the apoplast. In contrast, the more frequent
variation of the enviromental conditions of the leaves can restrict growth of bacterial populations
(Hirano and Upper, 2000). For example, the varying exudates of leaves imposes a metabolic
versatility on bacteria, a characteristic of the Pseudomonas genus (Mercier and Lindow 2000; Misko
and Germida 2002). This preference for different habitats has already been shown in other plants
(Mocali et al. 2003; Sessitsch et al. 2002).
The results reported here suggest that the population of sugar cane endophytes can vary
depending on the plant organ analysed. It is noteworthy that the relative number of diazotrophic
endophytes recovered was low, perhaps reflecting the lack of selective pressure in the isolation
procedure. Further studies will be necessary to thoroughly analyse the endophytic population of
sugar cane, including collection of plants from different geographic origins and the use of culture-
independent molecular analyses.
Acknowledgments
We thank Valter A. de Baura, Roseli Prado and Julieta Pie for technical support, and M.
G. Yates for reading the manuscript. This work was supported by CNPq-Instituto do Milênio,
PRONEX-Fundação Araucária and CAPES.
References
Araújo WL, Marcon J, Maccheroni W Jr, Van Elsas JD, Van Vuurde JW and Azevedo J L
(2002). Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xylella fastidiosa in
citrus plants. Appl and Environ Microbiol .68:4906-4914.
Baldani JI, Baldani VLD, Seldin L and Döbereiner J (1986). Characterization of
Herbaspirillum seropedicae gen. nov., sp. nov., a root-associated nitrogen fixing bacterium. Int J
Syst Bacteriol. 36: 86-93.
Bell CR, Dickie GA, Harvey WLG and Chan JWYF (1995). Endophytic bacteria in
grapevine. Can. J. Microbiol. 41:46-53.
Burd GI, Dixon DG and Glick BR (1998). A plant growth-promoting bacterium that
decreases nickel toxicity in Seedlings. Appl and Environ Microbiol. 64:3663-3668.
Cabarello-Mellado and Martinez-Romero (1994). Limited genetic diversity in the endophytic
sugarcane bacterium Acetobacter diazotrophicus. Appl and Environ Microbiol 60:1532-1537.
151
Cavalcante VA and Döbereiner J (1988). A new acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium
associated with sugarcane. Plant and Soil, 108: 21-23.
Dent KC, Stephen JR and Finch-Savage WE (2004) Molecular profiling of microbial
communities associated with seeds of Beta vulgaris subsp. vulgaris (sugar beet). J Microbiol
Methods, 56:17-26.
Dixon R, Kennedy C, Kondorosi A, Krishnapillai V and Merrick M (1977).
Complementation analysis of Klebsiella pneumoniae mutants defective in nitrogen fixation. Mol.
Gen. Genet. 157: 189–198.
Döbereiner J and Baldani VLD (1995). Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de
plantas não-leguminosas. Brasília:Embrapa-SPI, Itaguaí, RJ.Embrapa-CNPAB.
Feng Y, Shen D and Song W. (2006). Rice endophyte Pantoea agglomerans YS19 promotes
host plant growth and affects allocations of host photosynthates. Journal Appl Microbiol, 100:938-
945.
Ewing B, Hillier L, Wendl MC and Green P (1998). Base-calling of automated sequencer
traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Res., 8:175-85.
Germida JJ, Siciliano SD, Freitas R and Seib AM (1998). Diversity of root-associated
bacteria associated with field-grown canola (Brassica napus L.) and wheat (Tritricum aestivum L.)
FEMS Microbiol Ecol, 26:43-50.
Germida JJ and Siciliano SD (2001). Taxonomy diversity of bacteria associated with the
roots of modern, recent and ancient wheat cultivars. Biol. Fertil. Soils, 33:410-415.
Gurtler JB, Kornacki JL and Beuchat LR (2005). Enterobacter sakazakii: a coliform of
increased concern to infant health. Int J Food Microbiol. 104:1-34.
Hallmann J, Quadt-Hallmann, A, Mahaffee, WF and Kloepper, JW (1997) Bacterial
endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol. 43:895-914.
Hirano SS and Upper CD (2000). Bacteria in the Leaf Ecosystem with Emphasis on
Pseudomonas syringae, a Pathogen, Ice Nucleus, and Epiphyte. Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 64:624-653.
Huang X and Madan A (1999) CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Res.
9:868-77.
Idria R, Trifonova R, Puschenreiter M, Wenzel WW and Sessitsch A (2004). Bacterial
communities associated with flowering plants of the Ni hyperaccumulator Thlaspi goesingense.
Appl and Environ Microbiol. 70:2667-77.
Lacava PT, Araújo WL, Marcon J, Maccheroni W and Azevedo JL (2004). Interaction
between endophytic bacteria from citrus plants and the phytopathogenic bacteria Xylella fastidiosa,
causal agent of citrus-variegated chlorosis. Letters in Appl Microbiol. 39:55-59.
Loiret FG (2004). A putative new endophytic nitrogen-fixing bacterium Pantoea sp. from
sugarcane. J Appl Microbiol. 97:504-11.
Jones WD and Kubica GP(1946). The use of MacConkey agar for differential typing of M.
fortuitum. Am. J. Med. Technol. 30:182-195.
Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC and Winn WCJ (2001).
Diagnóstico Microbiológico. Texto e Atlas Colorido. 5ed., MEDSI Editora Médica e Científica.
Kuklinsky-Sobral J, Araujo WL, Mendes R, Geraldi IO, Pizzirani-Kleiner AA and Azevedo
JL (2004) Isolation and characterization of soybean-associated bacteria and their potential for plant
growth promotion. Environmental Microbiology. 6:1244-1251.
Medrano EG and Bell AA (2007). Role of Pantoea agglomerans in opportunistic bacterial
seed and boll rot of cotton (Gossypium hirsutum) grown in the field. J Appl Microbiol. 102:134-143.
152
Mengoni A, Mocali S, Surico G, Tegli S and Fani R. (2003) Fluctuaction of endophytic
bacteria and phytoplasmosis in elm trees. Microbiol Res. 158:363-369.
Mercier, J and Lindow SE (2000) Role of Leaf Surface Sugars in Colonization of Plants by
Bacterial Epiphyte Appl and Environ Microbiol, 66:369-374.
Misko A L and Germida JJ (2002). Taxonomic and functional diversity of pseudomonads
isolated from the roots of field-grown canola. FEMS Microbiol Ecol. 42:399-407.
Mocali S, Bertelli E, Di Cello F, Mengoni A, Sfalanga A, Viliani F, Caciotti A and Tegli S
(2003) Fluctuation of bacteria isolated from elm tissues during different seasons and from different
plant organs. Research in Microbiol, 5:105-114.
Olivares FL, Baldani VLD, Reis VM, Baldani J I and Döbereiner J (1996). Occurrence of the
endophytic diazotrophs Herbaspirillum spp. in roots, stems and leaves, predominantly of
Gramineae. Biol. Fertil. Soils. 21:197-200.
Pedrosa F O and Yates M G (1984). Regulation of nitrogen fixation (nif) genes of
Azospirillum brasilense by nif and ntr(gln) type gene products. FEMS Microbiol. Lett. 23:95-101.
Rasche F, Trondl R, Naglreiter C, Reichenauer TG and Sessitsch A (2006). Chilling and
cultivar type affect the diversity of bacterial endophytes colonizing sweet pepper (Capsicum anuum
L.). Can. J. Microbiol. 52:1036-1045.
Reis-Jr FB, Silva LG, Reis VM and Döbereiner J. (2000). Ocorrência de bactérias
diazotróficas em diferentes genótipos de cana-de-açúcar. Pesq. agropec.bras. 35:1-10.
Reiter B, Pfeifer U, Schwab H and Sessitch A (2002). Response of endophytic bacterial
communities in potato plants to infection with Ewinia carotovora subsp. Atroseptica. Appl and
Environm Microbiol. 68:2261-2268.
Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989). Molecular cloning: a laboratory manual 2 ed.
New York, Cold Spring, Harbor laboratory.
Sarkar PK, Hasenack B and Nout MJ (2002). Diversity and functionality of Bacillus and
related genera isolated from spontaneously fermented soybeans (Indian Kinema) and locust beans
(African Soumbala). Int J Food Microbiol, 25:175-186.
Sessitsch A, Reiter B, Pfeifer U and Wilhelm E (2002). Cultivation-independent population
analysis of bacterial endophytes in three potato varietes based on eubacterial and Actinomycetes-
specific PCR of 16S rRNA genes. FEMS Microbiol Ecol. 39:23-32.
Strobel G and Daisy B (2003). Bioprospecting for microbial endophytes and their natural
products. Microbiol Mol Biol Rev. 67:491-502.
Sturz AV, Christie BR, Matheson BG, Arsenault WJ and Buchanan NA (1999). Endophytic
bacterial communities in the periderm of potato tubers and their potential to improve resistance to
soil-borne plant pathogens. Plant Pathology.48:360-369.
Suman A, Shasany AK, Singh M, Shahi HN, Gaur A and Khanuja SPS (2001). Molecular
assessment of diversity among endophytic diazotrophs isolated from subtropical Indian sugarcane.
World Journal of Microbiology & Biotechnology, 17:39-45.
Sun L, Qiu F, Zhang X, Dai X, Dong X and Song W (2008). Endophytic Bacterial Diversity
in Rice (Oryza sativa L.) Roots Estimated by 16S rDNA Sequence Analysis. Microb Ecol. 55:415–
424.
Vivas A, Vörös I, Biró B, Campos E, Barea JM and Azcón R (2003). Symbiotic efficiency of
autochthonous arbuscular mycorrhizal fungus (G. mosseae) and Brevibacillus sp. isolated from
cadmium polluted soil under increasing cadmium levels. Environ Pollut. 126:179-89.
Zinniel DK, Lambrecht P, Harris NB, Feng Z, Kuczmarski D, Higley P, Ishimaru CA,
Arunakunari A, Barletta RG and Vidaver AK (2002). Isolation and characterization of endophytic
colonizing bacteria from agronomic crops and praire plants. Appl and Environm Microbiol.
153
68:2198-2208.
TABLE 1. Molecular and physiological characterization of the endophytic bacteria isolated from
Isolate
Groups
Max identity
(%)
Closest relative based
on 16S rRNA gene
sequence (BLAST)
Source of the best hit on BLAST
API-20E
CC14 98%-264 nt identical Citrobacter sp Lignin degrading bacteria Enterobacter sp
CC16
100%-267 nt identical Enterobacter sp Bacteria from soy paste and soy
sauce
Pantoea sp
CC20 99%-266 nt identical Pantoea sp Plant- and clinic-associated P.
agglomerans
Kluyvera sp
CC21 99%-292 nt identical Pantoea Diazotrophic bacteria associated with
sugarcane
Pantoea sp
CC22
100%-263 nt identical Klebsiella sp Wastewater treatment system reliant
on N
2
fixation
Klebsiella sp
CC26
100%- 263 nt identical Enterobacter sp PGPR in rice
Enterobacter sp
CC29 100%-267 nt identical Erwinia sp/Pantoea sp Diazotrophic bacteria associated with
sugarcane
Enterobacter sp
C33
100%-262 nt identical Enterobacter sp Urban wastewater treatment plant Enterobacter sp
CC37
98%-263 nt identical Enterobacter sp Stems of field-grown soybeans Enterobacter sp
CC43
100%-264 nt identical Enterobacter sp Bacteria from soy paste and soy
sauce
Enterobacter sp
CC46
97%-261 nt identical Enterobacter sp Stems of field-grown soybeans Enterobacter sp
CC47
100%-265 nt identical Pantoea sp Copper-resistant endophytic bacteria Pantoea sp
FC2P
99%-263 nt identical Enterobacter sp Stem-associated bacteria in soybeans
Enterobacter sp
CC34
Group I
Entero-
bacteriaceae
family
100%-263 nt identical Enterobacter sp Bacteria of soy paste and soy sauce
Enterobacter sp
CC38 98%-286 nt identical Brevibacillus sp Identification of a soil-born PGPR
NT
CC18
Group II
Bacilli
99%-300 nt identical Staphylococcus sp Terrestrial Deep Subsurface NT
C27
Group III
Actino-
Bactéria
100%-289 nt identical Curtobacterium sp Sepsis caused by Curtobacterium sp NT
C24
98%-244 nt identical Pseudomonas sp Oil degrading bacterium
NT
CC35
FC5
98%-244 nt identical Pseudomonas sp Oil degrading bacterium
NT
FC6
FC10
96%-239 nt identical Pseudomonas sp Bacteria isolated from Arctic
seawater
NT
FC12
99%-331 nt identical Pseudomonas sp PGPR in the maize root NT
FC16
100%-247 nt identical Pseudomonas sp A potential biocontrol agent NT
FC18
%-247 nt identical Pseudomonas sp A potential biocontrol agent NT
FC19
100%-247 nt identical Pseudomonas sp Apotential biocontrol agent NT
FC22
100%-242 nt identical Pseudomonas sp Plant interactions of Pseudomonas
fluorescens
NT
FC23
98%-243 nt identical Pseudomonas sp Bacteria from the region of a karst
water rivulet
NT
FC35
98%-330 nt identical Pseudomonas sp PGPR in the maize root NT
FC38
98%-243 nt identical Pseudomonas sp Bacteria from the upstream region of
a karst water rivulet
NT
98%-242 nt identical Pseudomonas sp A potential biocontrol agent NT
97%-242 nt identical Pseudomonas sp Marine sediment from Arctic NT
FC40
Group IV
Pseodomo-
nadaceae family
97%-283 nt identical Pseudomonas sp Enhanced in situ biodegradation of
toluene using a surfactant-modified
zeolite support
NT
FC26
Group V 96%-239 nt identical Uncultured bacterium Bacteria from the region of karst
water rivulet
NT
Brazilian sugarcane.
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