( PDF ) Analise da comunidade bacteriana séssil presente em um sistema dinamico contendo água de produção com e sem o tratamento de nitrato

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I. Introdução

1. O Petróleo e a Água de Produção

A palavra petróleo tem origem no latim petroleum (“óleo de pedra”). O petróleo

começou a ser utilizado há mais de 3000 anos por povos antigos como os egípcios, por

exemplo, que o utilizavam em processos de embalsamento para preparar as múmias

(DICKEY, 1959; PEES & STEWART, 1995).

O petróleo formou-se na crosta terrestre como resultado inicial da decomposição

anaeróbica parcial de matéria orgânica (animal, vegetal e planctônica) que se depositou

no fundo de mares e lagos (SEBASTIÁN, 1999). O produto gerado dessa decomposição

anaeróbia parcial é ainda transformado sob alta pressão e a temperaturas de até 150°C

para formação final do petróleo. Além disso, essas reações de transformação são

realizadas na presença de água, ácido sulfúrico, enxofre e outros compostos inorgânicos

(SPEERS & WHITHEHEAD, 1969).

O petróleo caracteriza-se como uma substância oleosa, inflamável, menos densa que

a água com cheiro característico e de cor variando entre o negro e o castanho escuro

(www.petrobras.com.br, janeiro de 2010). Este composto não permanece na rocha em

que é gerado, a rocha matriz, mas desloca-se até as bacias sedimentares ou rochas

reservatórios onde se acumula ocupando os poros. As rochas reservatórios são formadas

por camadas porosas de areia, arenitos ou calcários e é a permeabilidade dessas rochas

que irá permitir a produção do petróleo. Por possuir uma densidade inferior a das rochas

que constituem o subsolo, o petróleo tende a migrar para a superfície. O confinamento

do petróleo na rocha reservatório ocorre quando uma estrutura impermeável impede a

migração do óleo para regiões de menor pressão. Dessa forma, ocorrerá a formação

lenta (alguns milhares de anos) de um reservatório de petróleo (ENGLAND et al.,

1987). Na rocha reservatório são encontrados o gás natural, na parte mais alta, e

petróleo e água nas mais baixas (www.petrobras.com.br, janeiro de 2010).

O petróleo flui da jazida através da perfuração de poços petrolíferos. A produção do

petróleo é denominada primária quando a sua liberação da rocha-reservatório ocorre

devido à pressão natural do reservatório, mas essa técnica permite apenas a liberação de

8 a 30% do petróleo ali existente (LEONARD, 1986; DAVIDOVA et al., 2001;

PLANCKAERT, 2005). Por esse motivo, existem técnicas de recuperação

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convencionais, como a injeção de gás ou água, para aumentar a produtividade de um

poço produtor, permitindo uma maior eficiência na extração do petróleo ainda

remanescente. Dessas técnicas, a injeção de água pressurizada na rocha-reservatório,

também conhecida como recuperação secundária do petróleo (Figura 1), é a mais usual

e mundialmente empregada e tem como objetivo manter a pressão no reservatório, e

desalojar e empurrar o óleo residual retido na rocha-reservatório até o poço produtor.

Esta técnica consiste essencialmente na injeção de água para o interior do reservatório,

permitindo assim o deslocamento do petróleo. Neste processo de recuperação do

petróleo podem ser utilizadas águas de superfície coletadas em mares, rios e lagos.

(POSTGATE, 1984; SHENNAN & VANCE, 1987; PLANCKAERT, 2005). No Brasil,

a água de injeção mais utilizada é a água do mar.

Figura 1: Desenho esquemático da injeção de água em reservatórios petrolíferos.

Adaptado do site do KANSAS GEOLOGICAL SURVEY

(http://www.kgs.ku.edu/index.html).

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A água do mar utilizada na recuperação secundária do petróleo é retirada de locais

próximos à plataforma, desaerada (para prevenir a corrosão pelo oxigênio), tratada,

filtrada e injetada para manter a pressão do reservatório, a qual se denomina água de

injeção. À água de injeção, no reservatório de petróleo, soma-se a água residual

existente no próprio poço, a água de formação (HAMILTON, 1983). Esta última é

geralmente salina e tem sido considerada como remanescente de águas salinas ou

marinhas, que acabaram incrustando-se nos poros da rocha-reservatório. Por outro lado,

existem reservatórios de petróleo que contêm água de formação que não tem sua origem

nem composição química relacionada com a água do mar (DAVIS, 1967). Ao resultado

dessa junção dá-se o nome de água produzida, a qual é caracterizada por emulsões

água/óleo, rica em sulfato e nutrientes. Esta água produzida pode ser re-injetada no poço

de petróleo, na recuperação secundária do petróleo, ou pode ser descartada após

tratamento adequado (VANCE & THRASHER, 2005).

Diferente da água do mar, a água produzida sempre contém concentrações

significativas de doadores de elétrons e de fontes de carbono na forma de acetato,

propionato e nitrogênio (como amônia) e, comparada com a água de injeção, a água

produzida contém diferentes produtos químicos como inibidores de encrustamento,

inibidores de corrosão, desemulsificantes, inibidores de parafina e hidrocarbonetos com

uma variada gama de concentrações e natureza. Estes hidrocarbonetos podem contribuir

para o grande aumento de nutrientes disponíveis paras as bactérias redutoras de sulfato

(BRS) (PLANCKAERT, 2005; VANCE & THRASHER, 2005). Além disso, a água de

produção (ou água produzida) pode apresentar uma salinidade significativa de mais de

300 g/l (na forma de cloretos, sulfatos ou bicarbonatos) e uma alta temperatura (40 a

90°C), (PLANCKAERT, 2005).

A água produzida tende a conter uma boa porção da água de injeção que atravessou

o reservatório; se a água de injeção é marinha, ela contém uma alta concentração de

sulfato. Além disso, a água produzida contém sempre uma densidade populacional de

BRS viáveis muito maior do que a água marinha. As BRS presentes na água produzida

podem gerar H

S em concentrações extremamente altas (SUNDE & TORSVIK, 2005;

VANCE & THRASHER, 2005). De fato, segundo DAVIDOVA e colaboradores

(2001), os reservatórios de petróleo não são os únicos, e nem mesmo os mais afetados

pelos problemas provocados pela a produção de sulfeto em operações em campos

petrolíferos. A produção de sulfeto e a atividade de BRS também causam danos

evidentes em equipamentos de superfície, como tanques de armazenagem de óleo entre

outros.

2. Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS)

O enxofre é um dos elementos químicos mais importantes da terra estando presente

em nosso planeta principalmente nas formas de pirita (FeS

) ou gesso natural (CaSO

)

em rochas e sedimentos e como sulfato na água do mar. O ciclo do enxofre é complexo

devido a uma ampla variação do nível de oxidação (Nox) desse elemento que vai desde

-2 (estado completamente reduzido) até +6 (estado completamente oxidado) podendo o

enxofre ser transformado química e biologicamente. Além disso, o ciclo do enxofre está

diretamente ligado a ciclos de outros elementos químicos como o do carbono e do

nitrogênio. Os microrganismos têm um importante papel nas transformações químicas

do enxofre. O sulfato pode ser utilizado como nutriente pelos microrganismos e

reduzido a sulfeto (redução assimilatória do sulfato) que, posteriormente, é incorporado

a aminoácidos e enzimas que têm o enxofre em sua composição. As reações de

oxidação e redução para geração de energia também são importantes como a oxidação

por bactérias quimiolitotróficas e a redução dissimilatória do sulfato pelas BRS

(MUYZER & STAMS, 2008).

As BRS são microrganismos anaeróbios amplamente distribuídos em habitats

anóxicos onde estes utilizam o sulfato como aceptor final de elétrons para a degradação

de compostos orgânicos, resultando na produção de sulfeto. Posteriormente, o sulfeto

pode ser oxidado em condições aeróbias por bactérias quimiolitotróficas ou em

condições anaeróbias por bactérias fototróficas. A redução do sulfato pode ser

responsável por mais de 50% da mineralização do carbono orgânico em sedimentos

marinhos. Essa estimativa demonstra a importância das BRS em ambos os ciclos do

enxofre e do carbono e, por conseguinte, o porquê deste grupo (BRS) ser

extensivamente estudado (MUYZER & STAMS, 2008).

As BRS podem ser agrupadas em sete linhagens filogenéticas sendo cinco

pertencentes ao domínio Bacteria e duas ao domínio Archaea (Figura 2) (MUYZER &

STAMS, 2008).

Figura 2: Árvore filogenética baseada na similaridade das sequências completas do

RNA ribossomal 16S de espécies de bactérias redutoras de sulfato (MUYZER &

STAMS, 2008).

Existem aproximadamente 40 gêneros de BRS descritos, estando divididos nos

quatro maiores grupos bacterianos: (I) Proteobacteria, (II) bactéria Gram-positiva, (III)

o gênero termofílico Gram-negativo Thermodesulfobacterium, e (IV) os gêneros

termofílicos Gram-negativos Thermodesulfovibrio e Thermodesulfobium

(BIRKELAND, 2005).

De acordo com os seus modelos de oxidação de substratos orgânicos, as BRS foram

divididas em dois grupos metabólicos (CROLET, 2005). Um grupo de BRS realiza a

oxidação incompleta dos substratos a acetato e CO

, e raramente oxidam ácidos

graxos;

o outro grupo de BRS oxida completamente os substratos a CO

, e freqüentemente

oxidam uma larga variedade de substratos, incluindo ácidos graxos e compostos

aromáticos (BIRKELAND, 2005). A Tabela 1 (abaixo) lista 18 gêneros de BRS,

exemplificando a grande diversidade morfofisiológica presente nesses gêneros

(MADIGAN & MARTINKO, 2006).

Tabela 1: Características das bactérias redutoras de sulfato (MADIGAN &

MARTINKO, 2006).

Gênero Características DNA(%GC)

Redutoras de sulfato grupo I: não oxidantes de acetato

Desulfovibrio

Bacilos curvos com flagelação polar, sem

esporos; Gram-negativos; contêm desulfoviridina;

46-61

Desulfomicrobium

Bacilos móveis, sem esporos; Gram-negativos;

desulfoviridina ausente;

52-57

Desulfobotulus

Vibriões; Gram-negativos; desulfoviridina

ausente;

Desulfotomaculum

Bacilos retos ou curvos; móveis por flagelação

peritríquia ou polar; Gram-positivos;

desulfoviridina ausente; forma endósporos;

37-46

Desulfomonile

Bacilos; realiza a descloração redutora de 3-

clorobenzoato a benzoato;

Desulfobacula

Células ovais a cocóides, marinhos; capazes de

oxidar vários compostos aromáticos, incluindo o

hidrocarboneto aromático tolueno a CO

;

Archaeoglobus

Archaea; hipotermófila, temperatura ótima,

83ºC; contem algumas coenzimas únicas de

bactérias metanogênicas, produzem pequenas

quantidades de metano durante o crescimento; H

formato, glicose, lactato e piruvato são doadores de

elétrons, SO

, S

ou SO

são aceptores de

elétrons;

41-46

Desulfobulbus

Células ovóides ou em forma de limão; sem

esporos; Gram-negativos; desulfoviridina ausente;

quando móveis possuem flagelo polar único;

utilizam propionato como doador de elétrons, com

59-60

acetato e CO

como produtos;

Thermodesulfobacterium

Pequenos bacilos Gram-negativos;

desulfoviridina presente; termofílicos, crescimento

ótimo a 70ºC; contem lipídeos com ligações éter;

Redutoras de sulfato grupo II: oxidantes de acetato

Desulfobacter

Bacilos; sem esporos, Gram-negativos;

desulfoviridina ausente; quando móveis possuem

flagelo polar único; utilizam apenas acetato como

doador de elétrons, oxidando-o a CO

, pelo ciclo do

ácido cítrico;

45-46

Desulfobacterium

Bacilos, alguns com vesículas de gás,

marinhos; capazes de crescimento autotrófico pela

via da acetil-CoA;

41-59

Desulfococcus

Células esféricas; imóveis; Gram-negativas;

desulfoviridina presente, sem esporos; utilizam

ácidos graxos C

a C

como doadores de elétrons,

oxidando-os totalmente a CO

; crescimento

autotrófico pela via da acetil-CoA;

Desulfonema

Grandes bactérias filamentosas; Gram-

positivas, sem esporos; desulfoviridina presente ou

ausente; utilizam ácidos graxos C

a C

como

doadores de elétrons, oxidando-os totalmente a

; crescimento autotrófico pela via da acetil-

CoA (H

como doador de elétron);

35-42

Desulfosarcina

Células em cubos (arranjo em sarcina); Gram-

negativos; sem esporos; desulfoviridina ausente;

utilizam ácidos graxos C

a C

como doadores de

elétrons, oxidando-os totalmente a CO

;

crescimento autotrófico pela via da acetil-CoA (H

como doador de elétron);

Desulfoarculus

Vibriões; Gram-negativos; móveis;

desulfoviridina ausente; utilizam apenas ácidos

graxos como doadores de elétrons;

Desulfacinum

Células cocóides a ovais; Gram-negativas;

utiliza ácidos graxos C

a C

, grande diversidade

nutricional, capazes de crescimento autotrófico;

Tabela 1:

Continuação

termofílicos;

Desulforhabdus

Bacilos; sem esporos Gram-negativos; imóveis;

utilizam ácidos graxos com total oxidação a CO

;

Thermodesulforhabdus

Bacilos móveis, Gram-negativos; termofílicos;

utilizam ácidos graxos até C

;

Os gêneros Desulfovibrio e Desulfotomaculum foram os primeiros gêneros de BRS

a serem estabelecidos (POSTGATE, 1984), sendo Desulfovibrio o gênero mais

estudado (MADIGAN & MARTINKO, 2006). É pertencente a ele a primeira espécie de

BRS a ser isolada e descrita, por Beijerinck em 1895 na Delft School of Microbiology

na Holanda, e chamada por ele de Spirillum desulfuricans. Posteriormente, essa espécie

foi reclassificada em Desulfovibrio desulfuricans (POSTGATE, 1984). As espécies

pertencentes a este gênero foram utilizadas como modelo para investigação do

mecanismo da redução dissimilatória de sulfato pelo fato de serem relativamente mais

fáceis de isolar (BIRKELAND, 2005; RABUS, HANSEN & WIDDEL, 2005;

WIDDEL & BAK, 2005).

As bactérias redutoras de sulfato podem se estabelecer em diversas condições e

diferentes ambientes. Esses microrganismos são amplamente distribuídos, podendo ser

encontrados em ambientes naturais e artificiais onde há a presença do sulfato. As BRS

já foram isoladas de sedimentos marinhos, fontes hidrotermais, lama de vulcões e estão

presentes abundantemente em agregados microbianos encontrados em condições

hipersalinas, mesmo na presença do oxigênio. Essas bactérias já foram encontradas em

habitats com valores de pH extremos, como locais de drenagem de minas (pHs menores

que 2) e lagos alcalinos (pHs maiores que 10). Além disso, elas também já foram

isoladas de campos petrolíferos, sedimentos de água doce, rizosfera de plantas,

aqüíferos e sistemas artificiais anaeróbios para o tratamento da água destinada à

irrigação de plantas (MUYZER & STAMS, 2008).

As BRS, no processo de respiração anaeróbia, reduzem sulfato à água mais sulfeto

(POSTGATE, 1984), em uma reação que envolve a transferência de oito elétrons. Esta

reação ocorre via muitos intermediários e requer uma variedade de enzimas

(BIRKELAND, 2005; RABUS, HANSEN & WIDDEL, 2005). Todo o processo da

redução de sulfato a sulfeto acontece no citoplasma celular (RABUS, HANSEN &

WIDDEL, 2005). Após passar pela membrana citoplasmática, na maioria das BRS

através de gradiente iônico, o primeiro passo na redução dissimilatória do sulfato é a

Tabela 1:

Continuação

ativação do íon sulfato. Antes de ser reduzido, o sulfato é ativado a adenosina-5’-

fosfosulfato (APS) através da reação com ATP sulfurilase. A APS é então reduzida, em

um processo catalisado pela enzima APS redutase (aprBA), a sulfito + AMP (adenosina

monofosfato), numa transferência de dois elétrons (Eo -0,06V), como exemplificado na

seguinte equação química:

APS + 2 e

→ SO

+ AMP

A redução do sulfito a sulfeto é catalisada pela enzima sulfito redutase (dsrAB)

numa transferência de seis elétrons (Eo -0.116V) (POSTGATE, 1984; HAMILTON,

1998; BIRKELAND, 2005; RABUS, HANSEN & WIDDEL, 2005; MADIGAN &

MARTINKO, 2006), conforme a seguinte equação:

+ 6 e

+ 8 H

→ H

S + 6 H

Durante todo o processo de redução de sulfato apenas uma pequena quantidade de

enxofre reduzido é assimilada pelo organismo, mas praticamente tudo é liberado para o

ambiente como íon sulfeto, em geral, hidrolisado a H

S livre. Um dos principais pré-

requisitos para o desenvolvimento e metabolismo das BRS é o potencial redox (Eh) do

ambiente. Este deve estar por volta de -0,1V, sendo um potencial redox maior que -0,1V

inibitório ao metabolismo das BRS (POSTGATE, 1984).

Embora as BRS tenham sido assim denominadas devido a sua capacidade de utilizar

o sulfato como aceptor final de elétrons, algumas redutoras de sulfato podem utilizar

muitos outros aceptores de elétrons para seu crescimento como, por exemplo, o nitrato.

Na ausência de aceptores de elétrons inorgânicos, as BRS podem ainda obter energia

pela oxidação de compostos orgânicos como o piruvato, por exemplo. Dessa forma, a

ocorrência de uma alta incidência de BRS em um ambiente não necessariamente reflete

a ocorrência da redução do sulfato nesse local. As redutoras de sulfato podem reduzir

outros compostos contendo enxofre (tiosulfato, sulfito, entre outros) a sulfeto ou pode

ainda reduzir nitrato ou nitrito a amônia (DALSGAARD & BAK, 1994; MOURA et al.,

1997). Outros compostos que são aceptores de elétrons para algumas BRS incluem ferro

(III), urânio (VI), tecnécio (VII), selênio (VI), cromo (VI) e arsênio (VI) (LOVLEY &

PHILLIPS, 1992; LOVLEY et al., 1993; LOVLEY & PHILLIPS, 1994; TUCKER,

BARTON & THOMPSON, 1998; LLOYDE et al., 1999; MACY et al., 2000; PARK,

LIN & VOORDOUW, 2007). Compostos orgânicos também podem ser utilizados como

aceptores finais de elétrons para o crescimento das BRS como o fumarato, sulfonatos,

clorobenzoatos, entre outros. Em ambientes de água doce com baixa concentração de

sulfato, as BRS têm um importante papel na fermentação e na oxidação anaeróbica de

compostos orgânicos (MUYZER & STAMS, 2008).

A maioria das BRS é de vida livre, entretanto, algumas podem ser encontradas

formando consórcios com outros microrganismos, tais como Archaeas metanotróficas

(BOETIUS, 2000). A anaerobiose geralmente obrigatória das BRS e sua nutrição

relativamente restrita permitem que este grupo seja, freqüentemente, encontrado na

forma de biofilmes, em interfaces ou sobre substratos sólidos, e permitindo a formação

de microambientes (habitats) anaeróbios dentro de um ambiente aeróbio (HAMILTON,

1998).

A visão de que todas as bactérias redutoras de sulfato são estritamente anaeróbias

começou a mudar em 1978 quando Jørgensen (apud MUYZER & STAMS, 2008)

observou a ocorrência de algumas dessas bactérias em ambientes aeróbios. Essas BRS

toleram a aeração até mesmo quando a redução do sulfato é reprimida pela presença do

oxigênio (KJELDSEN, JOULIAN & INGVORSEN, 2004; MOGENSEN, KJELDSEN

& INGVORSEN, 2005). Existem evidências que a exposição ao oxigênio leva a uma

modificação da hidrogenase solúvel e da pirofosfatase in vivo nessas BRS. Essas

modificações podem ter funções regulatórias, prevenindo o metabolismo em condições

inapropriadas (aeróbias) (POSTGATE, 1984). Além disso, desde 1990, já se conhecem

algumas BRS que respiram utilizando o oxigênio e têm seu crescimento dependente

desse elemento (DILLING & CYPIONKA, 1990; SIGALEVISH et al., 2000).

Diferentes técnicas têm sido utilizadas para detectar e estudar as bactérias redutoras

de sulfato, assim como sua atividade e diversidade. Métodos tradicionais ou

dependentes de cultivo foram extensivamente utilizados com esse intuito e, embora

eficientes, suas limitações podem acarretar em equívocos graves, já que menos de 1%

dos microrganismos existentes podem ser cultivados. Assim, o conhecimento sobre a

diversidade das BRS, tanto em ambientes naturais quanto em artificiais, foi obtido a

partir de métodos independentes de cultivo através de genes evolutivamente

conservados como o RNA ribossomal 16S (MUYZER & STAMS, 2008).

Diversos pares de iniciadores têm sido descritos na literatura (DALY, SHARP &

MC CARTHY, 2000) para a amplificação específica de fragmentos do gene que

codifica o RNAr 16S de diferentes grupos de BRS, tais como os gêneros

Desulfotomaculum, Desulfobulbus, Desulfovibrio, entre outros. Uma estratégia mais

eficiente para a detecção de BRS pode estar no uso de genes funcionais que codificam

enzimas que apresentam papel importante na via de redução do sulfato. Três enzimas

são envolvidas na redução metabólica dissimilatória de sulfato: ATP sulfurilase, a

flavoproteina Fe-S adenosina-5-fosfosulfato (APS) redutase e a sirohaem sulfito

redutase. O gene dsrAB e o gene aprBA codificam, respectivamente, a sulfito redutase

(WAGNER et al., 1998) e a adenosina-5’-fosfosulfato (APS) redutase (MEYER &

KUEVER, 2007). Essas proteínas são altamente conservadas em relação as suas

propriedades físico-químicas e parecem ser enzimas ideais para análises filogenéticas de

BRS (MUYZER & STAMS, 2008). Segundo FRITZ e colaboradores (2000), a APS

redutase bacteriana é composta por uma subunidade

α com uma FAD (flavina adenina

dinucleotídeo) e uma subunidade β com dois centros ativos [4Fe–4S] próximos. O gene

da APS redutase, aprBA, codifica as subunidades que parecem formar um heterodímero

1:1 αβ. Ambas as subunidades da APS redutase são altamente conservadas (HIPP et al.,

1997; FRITZ et al., 2000).

As técnicas de clonagem e eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) de

fragmentos amplificados através da reação em cadeia da polimerase (PCR) do gene que

codifica o RNA ribossomal 16S (DAR, KUENEN & MUYZER, 2005; DAR et al.,

2007), dsrAB (MINZ, 1999; GEETS, 2006) ou aprBA (MEYER & KUEVER, 2007)

têm sido utilizadas para verificar a diversidade das BRS em diversos habitats.

3. Impactos Microbiológicos das BRS na Indústria

 Biofilmes Bacterianos

Em ambientes aquáticos, podem ser encontradas bactérias nas formas planctônicas

(livres) e sésseis (aderidas a superfícies) (COSTERTON, 1995). O estado séssil é a

forma predominante dos microrganismos tanto em ecossistemas naturais quanto em

artificiais. A maioria das bactérias tem a capacidade de se aderir eficientemente a

superfícies quando se encontram viáveis e metabolicamente ativas (JAYARAMAN et

al., 1997). Assim, as células fixadas às superfícies constituem verdadeiros reservatórios

para as células planctônicas de um ambiente (GILBERT, EVENS & BROWN, 1993;

ZOTTOLA, 1994).

Biofilmes bacterianos são definidos classicamente como comunidades de bactérias

aderidas a superfícies sólidas ou semi-sólidas, envoltas por uma matriz de polímeros

extracelulares (EPS) (SCHNEIDER, 2008). A hipótese de que bactérias crescem

preferencialmente aderidas a superfícies levou aproximadamente 150 anos para se

consolidar. Em 1847, Antonie van Leeuwenhoek (apud COSTERTON, 1999)

identificou agregados que ele chamou de “animalcules” enquanto observava com seu

microscópio primitivo um material raspado da superfície de dentes humanos. Quase um

século depois, em

1934, Claude Zobell (apud COSTERTON, 1999) observando

populações marinhas naturais por microscopia direta concluiu que essas bactérias eram

atraídas para as superfícies e muitas vezes se aderiam a essas formando populações

sésseis. Entre 1935 e 1978, Ron Gibbons e van Houte (apud COSTERTON, 1999)

examinaram biofilmes microbianos que constituíam a placa dentária formando

agregados macroscópicos nessas superfícies. Ainda nesse período, em 1964, Ralph

Mitchell e Kevin Marshall (apud COSTERTON, 1999) verificaram a transição da

adsorção reversível a superfícies para a adsorção irreversível em uma cultura pura

bacteriana.

A formação de um biofilme envolve a adesão de um pequeno número de células a

uma superfície sendo, geralmente, um processo que ocorre por meio de colisões

aleatórias e involuntárias das células com as superfícies. Esta adesão das células é

facilitada pela deposição de matéria orgânica, formando a camada condicionante

(SASAHARA & ZOTTOLA, 1993). Entretanto, o processo de adesão também pode

ocorrer por orientação celular através da liberação de prótons e moléculas sinalizadoras

e, através da concentração dessas moléculas, uma célula pode se orientar em relação à

proximidade de uma superfície (COSTERTON, 1999).

A adesão é um processo bacteriano específico podendo envolver a excreção de uma

grossa camada de exopolissacarídeos (EPS) o que permite a ligação de uma célula à

outra formando pontes celulares e, também, a fixação de células individuais a

superfícies. O EPS consiste de uma mistura complexa de polissacarídeos, proteínas,

lipídeos e ácidos nucléicos e está geralmente associado a adesões firmes (irreversíveis) e

não específicas a superfícies inertes. Esse polímero complexo é capaz de armazenar

água e nutrientes que poderão ser posteriormente mineralizados em caso de escassez de

fontes de carbono (BEECH & GAYLARDE, 1999). Dessa forma, a formação do

biofilme ocorre em quatro etapas (Figura 3): (I). Colonização primária do substrato

sobre camada condicionante; (II). Crescimento celular e produção de EPS, que ancoram

as células às superfícies de uma forma, geralmente, irreversível; (III). Co-agregação de

células no biofilme com aumento da espessura e mudanças nas condições de sua base;

(IV) Formação de um biofilme maduro (RICKARD et al., 2003). A transição de uma

adesão celular reversível para uma adesão irreversível a uma superfície inclui a

regulação positiva de genes específicos para adesão, com indução de fator sigma para

mudanças no envoltório celular e enzimas envolvidas na síntese de EPS

(COSTERTON, 1999).

Figura 3: Diagrama ilustrativo da coagregação de bactérias e formação do biofilme

(extraído e adaptado de Rickard et al., 2003). Colonização primária do substrato sobre

camada condicionante (A); Crescimento celular e produção de SPE, que ancoram as

células à superfície de uma forma geralmente irreversível (B); Co-agregação de células

no biofilme com aumento de espessura e mudanças nas condições em sua base;

formação de um biofilme maduro (D).

Os biofilmes têm em sua composição 10 a 25% de células e 75 a 90% de matriz de

exopolissacarídeos (EPS), que é determinada pela comunidade bacteriana aderida.

Geralmente, sua estrutura tem um formato de cogumelo, com uma maior concentração

de células na coroa, sendo irrigado por um sistema de canais de água altamente

permeáveis formados em regiões menos densas em EPS por onde nutrientes e

antagonistas (biocidas, antimicrobianos, entre outros) penetram nessas comunidades

(REN, SIMS & WOOD, 2002). A arquitetura dos biofilmes está ilustrada na Figura 4.

As microcolônias fazem parte da estrutura básica dos biofilmes e são constituídas por

comunidades de células bacterianas de uma ou várias espécies. Quando um biofilme é

composto por diferentes espécies, os subprodutos metabólicos de um organismo podem

servir de suporte para o crescimento de outro, enquanto que a adesão de uma espécie

confere ligantes para que outras sejam anexadas. Porém a competição por nutrientes e o

acúmulo de subprodutos tóxicos podem limitar a diversidade no biofilme (DUNNE Jr,

2002). Desta forma, a arquitetura do biofilme é influenciada tanto pela comunidade

bacteriana quanto pelas condições ambientais (DAVEY & O’TOOLE, 2000).

Figura 4: Arquitetura básica dos biofilmes. Estruturas em formato de cogumelo

constituídas por microcolônias com grande concentração de células na coroa e irrigada

por um sistema de canais de água (adaptado do site www.erc.montana.edu, janeiro de

2010).

Os primeiros colonizadores dos biofilmes são as bactérias aeróbias. São elas as

responsáveis pela criação de zonas de microaeração, devido à produção de EPS,

favorecendo a chegada das bactérias anaeróbias (BRS entre outras) (Figura 5). Assim, a

constituição final de um biofilme é representada por uma primeira camada anaeróbia

(junto à superfície colonizada) e a segunda camada aeróbia por cima dessa primeira.

Essa constituição é responsável pela formação de células de aeração diferencial o que

por conseqüência gera um dos maiores problemas para as indústrias petrolíferas, a

corrosão induzida por microrganismos (CIM) (COSTERTON, 1999).

Figura 5: Constituição final de um biofilme. Primeira camada anaeróbia (junto à

superfície colonizada); Segunda camada aeróbia com entrada de nutrientes e oxigênio

pelo sistema de canais advindos da coluna de água (adaptado do site

www.googleimages.com, janeiro de 2010).

 Corrosão Induzida por Microrganismos (CIM)

Em ambientes naturais e artificiais a corrosão ocorre quando materiais feitos de

metal puro e/ou uma mistura destes metais sofrem uma mudança química de seu estado

estável para um estado ionizado. A corrosão é um processo eletroquímico envolvendo

uma reação anódica com a ionização ou oxidação do metal e uma reação catódica

baseada na redução de um espécime químico. Estas reações podem ser influenciadas em

especial por atividades microbianas quando esses microrganismos estão em contato

direto com a superfície metálica formando biofilmes. Conhecidamente, os biofilmes são

responsáveis pela maior parte das interferências causadas por microrganismos em

processos tecnológicos. O acúmulo desses biofilmes microbianos deletérios em

superfícies pode levar à formação de camadas microbianas indesejáveis. Esse processo é

designado como bioencrustamento ou “biofouling” (SCHNEIDER, 2008).

Os microrganismos e/ou os produtos de suas atividades metabólicas como enzimas,

exopolímeros, ácidos orgânicos e inorgânicos assim como compostos voláteis tais como

a amônia ou o sulfeto de hidrogênio podem interferir nas reações anódicas e/ou

catódicas junto à superfície do metal. Dessa forma, esses metabólitos alteram processos

eletroquímicos na interface biofilme/metal levando a uma deterioração desse material.

Essa conseqüente deterioração do metal é conhecida como biocorrosão ou corrosão

influenciada por microrganismos (CIM) (BEECH & GAYLARD, 1999). A biocorrosão

é mais freqüentemente promovida por bactérias, embora fungos e algas possam também

estar envolvidos nesse processo. Assim, quando ocasionada por bactérias esta pode,

também, ser chamada de corrosão bacteriana (GENTIL, 2005).

Os principais grupos de bactérias freqüentemente associados com a corrosão são as

bactérias redutoras de sulfato, bactérias oxidantes de enxofre, bactérias

oxidantes/redutoras de ferro, bactérias oxidantes de manganês e bactérias que secretam

ácidos orgânicos e exopolímeros. Dentro desses grupos, as BRS se destacam desde

1930 quando teve início a investigação sobre corrosão em ferro fundido, demonstrando

o papel dessas bactérias na corrosão por pite (pontual ou localizada) em vários metais e

suas ligas. Além disso, a corrosão pelas BRS foi confirmada em ambientes terrestres e

aquáticos, sob condições aeróbias e anaeróbias. Muitos modelos têm sido propostos

para elucidar os mecanismos pelos quais as BRS podem influenciar a corrosão, estando

claro que a atividade de redução do sulfato está de alguma forma correlacionada a esse

processo (BEECH & GAYLARD, 1999).

A formação de biofilmes sobre superfícies metálicas confere um gradiente de

concentração de oxigênio e formação de zonas de aeração diferencial, o que pode

contribuir no processo de CIM. Quando a CIM se dá sobre condições de anaerobiose em

pH neutro é geralmente atribuída à ação das BRS (CAVALCANTI, 2001). Segundo

revisão sobre o tema, AGUIAR (1991) sugeriu que a participação das BRS nos

mecanismos de corrosão se dá por três vias. A primeira via é direta e ocorre por uma

necessidade metabólica de algumas bactérias, visto que suas hidrogenases de superfície

consomem o filme de H

que se forma na região catódica como conseqüência da reação

de elétrons derivados do metal com íons H

resultantes da dissociação iônica da água. O

hidrogênio formado na área catódica pode ficar adsorvido ao material metálico,

polarizando-o e assim reduzindo a velocidade do processo corrosivo. Entretanto, em

presença de bactérias redutoras de sulfato, estas fazem uma despolarização catódica,

acelerando, portanto, o processo corrosivo. Dessa forma, esse consumo de hidrogênio

)

desloca a reação de dissociação iônica da água, atraindo mais elétrons que

regeneram a formação de novas moléculas de H

, liberando mais Fe

na região anódica

(perda de massa) (Figura 6).

Figura 6: Esquema de corrosão por despolarização catódica pelas BRS.

A segunda via de corrosão por BRS, também direta, ocorre pelos produtos

metabólicos das BRS, que colocam em solução o H

S (sulfeto de hidrogênio) que, por

sua vez, reage com Fe

formando sulfeto de ferro, e que gera mais íons H

, estimulando

o consumo de elétrons na região catódica. Em casos de biofilmes contínuos, a reposição

dos íons hidrogênio na superfície metálica pode ser vista como uma repolarização

catódica dessa superfície protegendo essa estrutura. A terceira, indireta, gera zonas de

aeração diferencial sobre o metal, com a deposição de elementos de matriz extracelular

e a formação irregular do biofilme (AGUIAR, 1991). Algumas revisões sugerem que

nenhum dos mecanismos citados acima pode ser considerado predominante para a

corrosão influenciada pelas BRS devido ao grande número de fatores que estão

envolvidos nesse processo (LEE et al., 1995; HAMILTON, 1998).

As seguintes reações eletroquímicas para o processo de CIM induzida pelas BRS

foram sugeridas em 1934 por van Wolzogen Kuhr e van der Vlugt (apud LEE et al.,

1995) e a reação global foi descrita para o processo de despolarização catódica

(GENTIL, 2005).

4Fe  4Fe

+ 8e- (anodo)

O  8H

+ 8OH

(catodo)

+ 8e- 8H (adsorvido)(reação catódica)

+ 8H S

+ 4H

O (via ação bacteriana)

+ S

FeS (produtos de corrosão)

4Fe + SO

-2

+ 4 H

O  3 Fe(OH)

+ FeS + 2OH (reação global)

O padrão de corrosão característico da ação das BRS sobre o aço é a corrosão

localizada denominada “pitting”, com os pites (buracos) sendo formados e preenchidos

por produtos de corrosão de cor negra na forma de sulfetos de ferro (HAMILTON,

1985) (Figura 7). A taxa e a natureza dos processos de CIM são influenciadas pela

natureza química e física dos produtos de corrosão precipitados (sulfetos de ferro), e

pelo acesso de oxigênio ao sistema (HAMILTON, 1998). Essas taxas de corrosão

podem não estar diretamente relacionadas com a biomassa total aderida a uma

superfície e sim com o estado metabólico dessas células (BEECH et al., 1994). Como

descrito por Pedersen (1988) (apud CAVALCANTI, 2001), também são parâmetros

importantes para a CIM as espécies microbianas envolvidas nesse processo, as fontes de

carbono e o metal utilizado. Além disso, o EPS excretado pelas células dos biofilmes

também tem seu papel na corrosão, pois facilita a adesão irreversível de células às

superfícies e de precipitados inorgânicos derivados da fase aquosa e/ou produtos de

corrosão de substratos metálicos (BEECH & GAYLARD, 1999).

Figura 7: Padrão de corrosão característico da ação das BRS sobre o aço, denominada

“pitting”. Colonização não uniforme do biofilme resulta em células de aeração

diferencial onde concentrações variáveis de oxigênio geram uma diferença de potencial

e, conseqüentemente, corrente elétrica, levando à corrosão (adaptado de CHARACKLIS

& MARSHAL, 1990).

Apesar das BRS estarem associadas a processos corrosivos em campos de petróleo

pela formação de biofilmes e geração de produtos metabólicos corrosivos (como o H

S),

outros grupos de bactérias também devem ser considerados, por contribuir direta ou

indiretamente para a corrosão dos materiais, como por exemplo, o grupo das bactérias

produtoras de ácidos (CAVALCANTI, 2001). Além disso, é importante ressaltar que,

na natureza, os vários mecanismos de corrosão que refletem a variedade das atividades

fisiológicas dos diferentes tipos de microrganismos envolvidos não ocorrem como

processos isolados, mas, em conjunto com forças químicas e eletroquímicas do

ambiente em particular (BEECH & GAYLARD, 1999).

Os impactos econômicos causados por biofilmes são estimados em 1% do PIB em

países industrializados, podendo ser classificados nas categorias de

superdimencionamento do processo ou da estrutura, gastos de controle de biofilmes,

gastos com interrupção da produção e risco para a saúde da população (SCHNEIDER,

2008).

 Acidulação em Reservas Petrolíferas

O crescimento microbiano em campos petrolíferos é limitado pela concentração de

aceptores de elétrons disponíveis (O

, nitrato, Fe

ou sulfato) (HUBERT et al., 2004).

A presença simultânea de ácidos orgânicos de cadeia curta e sulfato cria um ambiente

favorável para atividade das bactérias redutoras de sulfato levando a produção de H

(acidulação).

A acidulação é um problema freqüente dos reservatórios “offshore” (plataformas em

alto mar) onde a água do mar rica em sulfato (aproximadamente 30mM) é utilizada para

injeção nos poços reservatório. O sulfeto de hidrogênio contamina o óleo, o gás e a água

produzida, diminuindo a qualidade do óleo e representando um risco para a segurança

dos funcionários. Sua presença também causa corrosão em oleodutos e equipamentos

(HUBERT et al., 2005).

Como já dito, a injeção de água marinha ou outras águas contendo sulfato, com

populações indígenas viáveis de BRS, é uma prática comum utilizada para aumentar a

recuperação do petróleo após a produção primária, mantendo a reserva pressurizada e

carregando o óleo em direção do poço produtor (ECKFORD & FEDORAK, 2002a;

VANCE & THRASHER, 2005). A água utilizada na recuperação secundária é

desaerada com o intuito de prevenir a corrosão dos dutos pela presença de oxigênio.

Posteriormente, essa água é tratada com produtos químicos como antiespumante,

inibidores de encrustamento e substâncias químicas que reagem com o oxigênio

dissolvido, como os íons sulfeto (SO

-2

) e bisulfeto (HSO

) que combinam com o

oxigênio para formar sulfato (SO

-2

) (HAMILTON, 1983; POSTGATE, 1984; VANCE

& THRASHER, 2005).

O sulfeto de hidrogênio (H

S) produzido pelas BRS é um gás tóxico e corrosivo e é

responsável por uma variedade de problemas econômicos nas indústrias petrolíferas

(OLLIVIER & CAYOL, 2005). A diretriz de padrão internacional, NACE (“National

Association of Corrosion Engineers – NACE International”), define sob a

MR0175/ISO-15156 que serviços de proteção contra a corrosão pelo sulfeto devem ser

usados em instalações petrolíferas aonde a pressão parcial de H

S exceda os níveis de

resistência dessas instalações (VANCE & THRASHER, 2005). Khatib & Salanitro

(1997) (apud VANCE & THRASHER, 2005) estimam que estes serviços podem

resultar em milhões de dólares de custos adicionais para cada poço, e por conseguinte,

para o projeto inteiro de perfuração, extração e recuperação de petróleo.

A acidulação em instalações petrolíferas também implica em custos adicionais para

o controle da exposição dos operadores ao H

S tóxico; administração de sulfetos

ferrosos sólidos que interferem na limpeza da água produzida para re-injeção;

administração do acúmulo de bases de sulfetos ferrosos sólidos que se depositam e

promovem corrosão e danos a equipamentos. Além dos custos de todos os mecanismos

de controle e prevenção de acidulação (ex: tratamentos químicos para remoção do H

produzido; necessidade de transporte e estocagem do material para tratamento da

acidulação; uso de biocidas; etc). Todos estes fatores geram grandes implicações

logísticas para as indústrias petrolíferas (VANCE & THRASHER, 2005).

4. Controle da Acidulação

A acidulação consiste em um dos principais problemas da indústria do petróleo

devido à toxidade e ao potencial corrosivo do sulfeto produzido pelas bactérias

redutoras de sulfato (BRS). Esse processo diminui o valor econômico do óleo produzido

devido ao aumento da concentração de enxofre e confere riscos a segurança e a saúde de

funcionários. Além disso, acidulação de reservatórios pode levar a uma recuperação

secundária ineficiente do óleo pela redução na permeabilidade dos poros rochosos

devido ao crescimento bacteriano ou até mesmo ao seu entupimento por meio de

sulfetos de ferro insolúveis (NEMATI, JENNEMAN & VOORDOUW, 2001;

JURELEVICIUS et al., 2008). Todos esses fatores motivaram um crescente interesse

em estratégias para prevenir e/ou diminuir a geração de sulfeto (LOMAS et al., 2007).

O tratamento da acidulação por fechamento do poço petrolífero mais afetado e por

“sweetening” (processo de remoção de H

S e CO

da fonte gasosa) tem sido a resposta

industrial mais comum para esse problema em um estágio mais avançado (VANCE &

THRASHER, 2005). Outras opções envolvem a prevenção de condições contaminantes

pela inibição da atividade biológica (“inhibition of biological activity” – IBA) ou pela

prevenção específica da atividade anaeróbia (“specific prevention of anaerobic activity”

– PAA) (LOMAS et al., 2006).

Considerando a IBA, o tratamento com a injeção de água adicionada de biocidas é

uma das ferramentas mais comumente utilizadas na tentativa de prevenir o início da

acidulação de ambientes fechados como tanques de armazenamento. Outros inibidores

como nitrito e molibdato (dois inibidores do metabolismo das BRS) também

apresentaram inibição da produção biogênica de sulfeto (NEMATI et al., 2001;

GARDNER & STEWART, 2002; HAVEMAN, GREENE & VOORDOUW, 2005).

Os biocidas podem ser divididos em dois grupos, os oxidantes (clorinas e

cloraminas) e os não oxidantes (compostos tipo amina, antraquinonas e aldeídos). Os

mais utilizados são as antraquinonas, glutaraldeídos e o THPS (sulfato de tetrakis-

hidrometilfosfonio). Entretanto, o custo dessa alternativa, os impactos ambientais em

sistemas abertos e o risco à saúde humana são aspectos que sempre devem ser levados

em conta antes da utilização desses compostos (NEMATI, JENNEMAN &

VOORDOUW, 2001; KORENBLUM et al., 2005; JURELEVICIUS et al., 2008). Além

disso, a eficácia dos biocidas é questionada, pois existem casos de resistência

microbiana citados na literatura (TELANG et al., 1998; GARDNER & STEWART,

2002).

A natureza da formação e da estrutura dos biofilmes dificulta a remoção dessas

estruturas quando aderidas a uma superfície. Métodos convencionais de controle e

remoção dessas estruturas são geralmente inadequados contra biofilmes bacterianos em

sistemas industriais. A matriz de EPS secretada pelas células reduz a eficácia dos

biocidas, pois inviabiliza a penetração uniforme desses compostos na estrutura do

biofilme o que leva ao aparecimento de zonas de acesso reduzido ou inacessíveis a esses

antagonistas. Estratégias para contornar este problema empregam o uso de biocidas em

altas concentrações. Entretanto esta alternativa pode levar indiretamente a grandes

impactos ambientais (JAYARAMAN, ERTHMAN & WOOD, 1999; KORENBLUM et

al., 2008).

Já a PAA pode envolver a eliminação de sulfato da fonte de água através de nano-

filtração (BAKKE, RIVEDAL & MEHAN, 1992), a qual é um método muito caro para

uma aplicação em larga escala, ou incentivando a competição microbiana pela adição de

compostos termodinamicamente favoráveis como o oxigênio (POSTGATE, 1984),

nitrato (TELANG et al., 1997; NEMATI, JENNEMAN & VOORDOUW, 2001;

SUNDE & TORSVIK, 2005) e nitrito (NEMATI et al., 2001; GARDNER &

STEWART, 2002; MYHR et al., 2002).

Muitos estudos vêm sendo realizados mostrando a possível utilização do nitrato ao

invés dos biocidas (THORSTENSON et al., 2002; SUNDE et al., 2004). O efeito

inibitório do nitrato na produção de sulfeto vem sendo estudado há muitos anos. Desde

1929, quando foi reconhecido que o uso do nitrato abatia o odor causado pelo

metabolismo das BRS em tratamentos de águas residuais, muitos estudos usando o

nitrato foram realizados no controle da produção de sulfeto (JENNEMAN,

MCINERNEY & KNAPP, 1986). Entretanto, o mecanismo envolvido nessa inibição

continua controverso (LOMAS et al., 2006), embora seja sempre baseado na interação

entre o ciclo do nitrogênio e do enxofre (DAVIDOVA et al., 2001).

Alguns mecanismos podem contribuir para a mitigação da produção de sulfeto pelo

uso do nitrato, como: (I) aumento do potencial redox como resultado da presença do

nitrato e da ação das BRN heterotróficas (JENNEMAN, McINERNEY & KNAPP,

1986; ECKFORD & FEDORAK, 2002c), resultando na inibição do metabolismo das

BRS, já que a redução de sulfato, por estas bactérias, ocorre somente quando o potencial

redox esta abaixo de -0,1V (POSTGATE, 1984); (II) sendo nitrato e o sulfato aceptores

terminais de elétrons, para BRN e BRS respevtivamente, uma competição baseada na

termodinâmica e na cinética bacteriana é estabelecida quando os dois ânions estão

presentes, podendo levar a uma exclusão competitiva das BRS, já que a redução de

nitrato fornece aproximadamente três vezes mais energia para a bactéria do que a

redução de sulfato (DAVIDOVA et al., 2001; ECKFORD & FEDORAK, 2002a,b,c;

HUBERT et al., 2004; LARSEN, ROD & ZWOLLE, 2004); (III) a troca do

metabolismo energético das BRS para reduzir nitrato ao invés de sulfato

(DALSGAARD & BAK, 1994; DUNSMORE et al., 2004; GONZÁLEZ et al., 2006);

(IV) uso do nitrato ou nitrito como aceptor de elétrons para a reoxidação do sulfeto para

sulfato ou enxofre elementar pelas BRN-OS (bactérias redutoras de nitrato, oxidantes de

sulfeto) (TELANG et al., 1997; ECKFORD & FEDORAK, 2002b; HUBERT et al.,

2005; SUNDE & TORSVIK, 2005), resultando numa redução da concentração de

sulfeto, mas não na inibição das BRS, já que as atividades das BRS e das BRN-OS são

complementares, e que as BRN-OS não competem com as BRS por fonte de carbono

(HUBERT et al., 2004); e (V) inibição da produção de sulfeto pela ação tóxica do

nitrito e do oxido nítrico gerado a partir da redução de nitrato (NEMATI, JENNEMAN

& VOORDOUW, 2001; MYHR et al., 2002; SUNDE & TORSVIK, 2005). O nitrito,

especificamente, inibe as BRS agindo diretamente no último passo da redução de

sulfato (HAVEMAN et al., 2004) embora algumas BRS possuam a capacidade de

resistir a esta inibição (GREENE et al., 2003; HUBERT et al., 2004).

Dependendo das circunstâncias, os vários mecanismos listados acima podem

ocorrer ao mesmo tempo, o que faz do uso do nitrato um mecanismo muito versátil

(LARSEN, ROD & ZWOLLE, 2004). A Figura 8 exibe as atividades microbianas

determinantes do processo de acidulação e o comportamento das BRS, BRN

heterotróficas e BRN-OS na presença de nitrato.

Figura 8: Atividades microbianas determinantes do mecanismo de acidulação. (a) BRS

oxidam óleos orgânicos degradáveis a CO

, enquanto reduz sulfato a sulfeto. A redução

de sulfato pode ser inibida pelo nitrito (\\). (b) Muitas BRS reduzem nitrito à amônia

para prevenir esta inibição. (c e d) BRN-OS usam nitrato ou nitrito para re-oxidar o

sulfeto produzido pelas BRS através da redução do sulfato. As BRN-OS utilizam

somente o CO

como fonte de carbono para formação de biomassa. (e e f) BRN

heterotróficas oxidam óleos orgânicos degradáveis a CO

, enquanto reduzem nitrato ou

nitrito a nitrogênio ou amônia. (g e h) A soma das reações catalisadas pelas BRS e

BRN-OS é a mesma da catalisada pela BRNh: oxidação de óleos orgânicos com nitrato

(ou nitrito) (adaptado de HUBERT et al., 2004).

5. Métodos para o Estudo de Biofilmes

 Métodos Microscópicos para o Estudo de Biofilmes

Um aspecto fundamental do estudo da adesão bacteriana a superfícies é a

necessidade de métodos confiáveis para quantificação de células aderidas. Muitos

métodos de contagem bacteriana incluem metodologias de contagem direta por

microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV) (AN & FRIEDMAN,

1997).

A microscopia óptica convencional pode fornecer informações sobre a distribuição e

a atividade fisiológica dos microrganismos, bem como a extensão da superfície

colonizada. Entretanto, seu uso é limitado quando se estuda biofilmes maduros, onde a

natureza tridimensional da comunidade mascara a observação dos microrganismos

constituintes destes biofilmes. A microscopia eletrônica trouxe um avanço considerável

para a microbiologia e é uma técnica muito utilizada para o estudo dos biofilmes.

Devido ao seu alto poder de resolução, é possível obter informações detalhadas sobre a

distribuição e a ultra-estrutura das células (CAVALCANTI, 2001).

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) oferece uma contribuição valiosa para

a investigação biológica. Entretanto, o ambiente de vácuo e a própria irradiação de

elétrons durante a observação representam condições adversas para a amostra. Por isso,

os métodos de preparo para MEV visam justamente contornar ou minimizar essas

limitações tornando o material biológico resistente e condutor. Assim, se pode dizer que

o sucesso de uma boa preparação é fundamental para garantir a melhor imagem de uma

amostra biológica. Para tal, a amostra biológica deve preencher alguns requisitos

básicos como: (I). ter dimensões reduzidas (até 1 cm

); (II). estar limpa e seca, ou seja,

desidratada; (III). estar bem preservada nas três dimensões, que serão “vistas” pelo feixe

de elétrons; (IV). ser condutora de cargas elétricas e; por fim (V). estar devidamente

fixada a um suporte através de um adesivo também condutor (SILVEIRA, 2007).

As aplicações da microscopia eletrônica de varredura em biologia incluem desde o

estudo de objetos macroscópicos (organismos inteiros, partes de vegetais, órgãos

isolados, células em cultura) até o estudo de macromoléculas orgânicas, bactérias,

frações celulares, entre outros. Dessa forma, a maneira de preparar estas amostras é

altamente diversificada e por vezes laboriosa. Somente objetos rígidos, como sementes,

madeira, conchas, podem ser estudados no MEV com um tratamento mínimo. Para

outros materiais, as alternativas disponíveis para processar amostras originalmente

hidratadas são a liofilização (manutenção da forma por meio puramente físico através de

um congelamento ultra-rápido) e o método do ponto crítico (fixação, desidratação

seguida de secagem em câmara pressurizada usando o gás carbônico como fluido de

transição) (SILVEIRA, 2007). O método do ponto crítico é o mais popular e se baseia

no princípio de que para cada fluido existe uma única condição de temperatura e pressão

característica onde as fases líquidas e gasosas desse não podem co-existir, esta

combinação corresponde ao ponto crítico do fluido. Os métodos criogênicos (“freeze-

drying”) também são considerados alternativas viáveis, porém, mais lentas e limitadas

sendo mais utilizados para estudos de histoquímica de enzimas e micro-análises por

raios-X (SILVEIRA, 2007).

Estudos de biofilmes também podem ser realizados através da análise por

microscopia de epifluorescência e utilização de uma grande variedade de sondas

fluorescentes. Como exemplo de fluoróforos comumente utilizados, temos: DAPI

(dihidrocloreto 4’, 6 diamino-2-fenilindol), IP ( iodeto de propídeo) e laranja de acridina

(LA). O DAPI é um composto que se liga ao DNA e fluoresce em azul quando excitado

por luz UV sendo útil para visualizar bactérias totais em uma amostra. O iodeto de

propídeo é freqüentemente utilizado para corar células não-viáveis. Este composto se

intercala entre as bases de DNA e quando excitado por lâmpadas de mercúrio e xenônio,

fluoresce em vermelho. O corante laranja de acrididina fluoresce em verde quando

ligado a dupla fita de DNA e, em laranja quando ligado a ácidos nucléicos de fita

simples, como o RNAm. O LA já foi muito utilizado como um corante vital, já que a

atividade celular é indicada com o aumento da quantidade de RNAm devido ao

metabolismo celular ativo. Assim, identificando geralmente a viabilidade com a

fluorescência laranja e a inviabilidade com fluorescência verde. Entretanto, o

mecanismo exato da diferença na fluorescência não é conhecido (SURMAN et al.,

1996; RAPPOSH, ZANGERI & GINZINGER, 2000; CAVALCANTI, 2001).

A importância da microscopia para o estudo dos biofilmes se encontra na

possibilidade de se estudar biofilmes intactos, o que permite melhorar a compreensão

sobre a sua organização espacial e ampliar os conhecimentos sobre a interação in situ

desses organismos em ambientes naturais. A microscopia representa uma ferramenta

indispensável para o estudo dessas estruturas e vem sendo freqüentemente utilizada em

muitos trabalhos científicos (JAYARAMAN et al., 1997; LINDSAY & VON HOLY,

1997; NEMATI, JENNEMAN & VOORDOUW, 2001; KORENBLUM et al., 2008).

 Técnicas Moleculares para o Estudo da Diversidade e Ecologia Microbiana.

Os métodos para analisar a diversidade microbiana e a função da comunidade

podem ser divididos em métodos dependentes de cultivo e independentes de cultivo,

sendo que ambos devem incluir técnicas de caracterização taxonômica (VAN HAMME,

SINGH & WARD, 2003).

Os métodos tradicionais, dependentes de cultivo, são os mais comuns e estão

baseados nas diferenças morfológicas, metabólicas e fisiológicas dos microrganismos.

Isto inclui o isolamento e cultivo em meio sólido, ensaios em meio líquido como o

NMP (Número Mais Provável) e a utilização de substrato em placas Biolog (VAN

HAMME, SINGH & WARD, 2003). Entretanto, utilizando estes métodos, a

enumeração e o monitoramento de populações microbianas podem levar um tempo

longo e, na maioria das vezes, subestima a quantidade real dos microrganismos

presentes como conseqüência da dificuldade existente em cultivar a maioria dos

microrganismos (LLOYD-JONES et al., 1999).

Atualmente, técnicas moleculares vêm sendo utilizadas para caracterizar os ácidos

nucléicos dos microrganismos contidos na comunidade microbiana das amostras

ambientais. O principal benefício dessas análises moleculares é a possibilidade de

estudar comunidades microbianas sem cultivar bactérias e fungos. Enquanto as análises

usando incubação no laboratório (microbiologia clássica) são indiretas, e produzem

mudanças artificiais na estrutura e na atividade metabólica da comunidade microbiana,

os métodos moleculares diretos preservam o estado metabólico in situ e a composição

da comunidade microbiana, porque as amostras são congeladas imediatamente após a

amostragem. Além disso, a extração direta dos ácidos nucléicos de amostras ambientais

proporciona a detecção de microrganismos não-cultiváveis em laboratório, que podem

ser responsáveis por atividades metabólicas de interesse (BROCKMAN, 1995).

Dentre os métodos para avaliar a estrutura de comunidades podemos citar a

eletroforese em gel de gradiente desnaturante ou DGGE (Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis), a eletroforese em gel de gradiente de temperatura ou TGGE

(Temperature Gradient Gel Electrophoresis), o polimorfismo da conformação da fita

simples ou SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), a técnica de DNA

polimórfico amplificado randomicamente ou RAPD (Random Amplified polymorphic

DNA) e a análise de restrição do DNA ribossomal amplificado ou ARDRA (Amplified

Ribossomal DNA Restriction Analysis) (KENT & TRIPLETT, 2002).

A separação de seqüências específicas de DNA, ou a detecção de pequenas

diferenças existentes entre elas, pode fornecer informações importantes sobre a estrutura

da comunidade e a diversidade dos microrganismos contendo o gene procurado.

Geralmente essas técnicas são acopladas com a reação de PCR para amplificar

seqüências que não são abundantes. Os produtos de PCR amplificados podem ser

examinados utilizando técnicas como o DGGE e o TGGE (SCHNEEGURT-MARK &

KULPA-CHALER, 1998).

O DGGE e o TGGE são métodos pelos quais fragmentos de DNA do mesmo

tamanho, mas que apresentam seqüências diferentes, podem ser separados por

eletroforese (MUYZER, 1999). Quando o DNA é submetido à eletroforese em

condições crescentes de desnaturação, seja essa química ou térmica, os fragmentos

permanecem em dupla fita até que eles atinjam as condições necessárias para a

desnaturação dos domínios ricos em AT, chamados domínios de desnaturação. Quando

um domínio desses se desnatura, processa-se uma transição na conformação da

molécula, que passa de helicoidal para parcialmente desnaturada e, nessa situação, a

migração da molécula no gel é praticamente interrompida. Variações nas seqüências de

nucleotídeos desses domínios levam a uma diferença nessas condições desnaturantes e

as moléculas com diferentes seqüências vão interromper sua migração em diferentes

posições no gel (ROSADO & DUARTE, 2002).

A DGGE vem sendo empregada recentemente em centenas de trabalhos de análise

de diversidade de comunidade bacteriana total baseados no gene que codifica o RNAr

16S, permitindo a detecção e monitoramento de membros predominantes da

comunidade, os quais muitas vezes são organismos não cultiváveis em laboratório

(ROSADO et al., 1998; SALLES, SOUZA & VAN ELSAS, 2002). O número, a

posição e a intensidade das bandas no gel de DGGE fornecem uma estimativa da

diversidade e da abundância relativa das populações numericamente predominantes em

uma amostra e permitem a comparação de diversas comunidades microbianas (BOON

et al., 2002). Também através do DGGE, grupos bacterianos específicos podem ser

estudados dentro de uma comunidade através de iniciadores específicos baseados no

gene que codifica o RNA ribossomal 16S (SALLES, SOUZA & VAN ELSAS, 2002)

ou em outros genes de interesse (ROSADO et al., 1998; PICENO, NOBLE &

LOVELL, 1999).

II. Justificativa do Trabalho

A indústria do petróleo é uma grande consumidora e produtora de água. Ao final do

tempo de vida (útil) de um campo petrolífero, os poços podem produzir mais de 95% de

água. No Brasil, por exemplo, em 1998, um volume estimado de 9,3 x 10

de água

de produção foi liberado no mar por sete plataformas fixadas na Bacia de Campos

(JEREZ VEGUERIA, GODOY & MIEKELEY, 2002). Inúmeros grupos de bactérias

têm sido isolados ou detectados em amostras de água de produção de campos de

petróleo, através de técnicas moleculares. As bactérias redutoras de sulfato (BRS) são

um dos principais grupos encontrados nesse ambiente e, muitas vezes, envolvidas na

biocorrosão. Este tipo de corrosão está, invariavelmente, associado à formação pelas

BRS de biofilme em superfícies metálicas e a geração de produtos metabólitos

corrosivos como o sulfeto de hidrogênio (H

S). A produção biogênica de H

S é o maior

problema das indústrias petrolíferas, pois esse reduz a qualidade do óleo, promove a

corrosão de materiais de aço, pode causar entupimento de dutos devido à formação de

sulfetos ferrosos insolúveis e conseqüente redução do rendimento da recuperação do

óleo. Todos estes fatores podem levar a um abandono prematuro do reservatório pelo

aumento do custo de tratamento e redução da produção. Além disso, a produção desse

composto representa risco para a saúde humana devido a sua alta toxidade.

Um variado número de abordagens pode ser utilizado para conter ou minimizar

os efeitos dos microrganismos em reservas petrolíferas e em suas instalações.

Entretanto, métodos convencionais de controle e remoção de biofilmes, como a

introdução de biocidas, nem sempre são eficientes e podem levar a impactos ambientais

graves. Por isso, esse trabalho teve como proposta avaliar uma tecnologia alternativa no

controle de biofilmes formados por BRS através da utilização do nitrato no tratamento

da água de produção proveniente da Estação Coletora de Entre Rios do campo

petrolífero de Sergipe. Muitos estudos vêm sendo realizados mostrando a possível

utilização do nitrato em substituição aos biocidas, tendo esse primeiro um efeito

inibitório na produção de sulfeto. Vários mecanismos podem estar envolvidos nessa

inibição e, dependendo das circunstâncias, os vários mecanismos de inibição podem

ocorrer ao mesmo tempo, o que faz do uso do nitrato um mecanismo muito versátil.

Em nosso estudo, um sistema dinâmico foi empregado para mimetizar as condições

da formação de biofilme em uma indústria petrolífera. Dessa forma, foi verificado não

somente o efeito do nitrato na formação do biofilme e na corrosão, mas também, seu

efeito na estrutura da comunidade da amostra de água de produção através de técnicas

moleculares. Além disso, estudos da estrutura da comunidade de biofilmes bacterianos

de água produzida podem levar a um maior conhecimento microbiológico desses

ambientes podendo assim favorecer um aprimoramento de estratégias já utilizadas no

combate aos “vilões” da indústria do petróleo. Acreditamos que nosso trabalho

contribui com resultados interessantes para o estudo e controle de biofilmes nas

indústrias petrolíferas que são as maiores prejudicadas pela corrosão microbiana (CIM)

e pela produção de sulfeto de hidrogênio pelas BRS.

III. Objetivos

1. Objetivo Geral e Objetivos Específicos

Este trabalho teve como enfoque principal estudar a diversidade bacteriana presente

na água produzida proveniente da Estação Coletora de Entre Rios do campo petrolífero

de Sergipe. Utilizando biorreatores, os objetivos deste estudo foram: (I) estudar a

comunidade bacteriana séssil total presente na água de produção de Entre Rios através

de PCR-DGGE; (II) detectar e quantificar comunidades de BRS predominantemente

envolvida nos processos de corrosão microbiológica através de PCR e contagem direta

de células (NMP); (III) estudar o efeito do nitrato na comunidade bacteriana total, na

população de bactérias redutoras de sulfato (BRS) e na biocorrosão dos cupons.

2. Etapas do Projeto

2.1 Montagem dos Reatores (com e sem o Tratamento com o Nitrato).

 Montagem de dois reatores contendo água de produção, solução nutritiva

e cupons de aço-carbono; sendo o nitrato adicionado em somente um dos

sistemas. Os sistemas dinâmicos têm como objetivo principal mimetizar

as condições para a formação de biofilme em superfícies metálicas

(ambiente anaeróbio) encontradas nas indústrias petrolíferas.

 Amostragem dos cupons de aço-carbono em duplicata e utilização desses

para a realização de testes analíticos.

2.2 Contagem do Número de Células nos Reatores.

 Realização de análises quantitativas das células totais presentes nos

biofilmes aderidos aos cupons de aço-carbono através de fluoróforos

(Laranja de Acridina) utilizando um microscópio de epifluorescência.

 Realização de contagem das células viáveis aderidas aos cupons de aço-

carbono por meio da técnica de tubos múltiplos ou do número mais

provável (NMP) para bactérias redutoras de sulfato (BRS).

2.3 Avaliação da Biocorrosão e Acidulação dos Reatores.

 Observação da formação de biofilme aderido aos cupons de aço-carbono

e da corrosão microbiana (CIM) da superfície metálica desse material

através de microscopia eletrônica de varredura (MEV).

 Determinação da corrosão dos cupons de aço-carbono através de perda

de massa desse corpo de prova durante o experimento com os reatores.

2.4 Análise Molecular da Comunidade Bacteriana Séssil dos Reatores.

 Realização da extração do DNA total das células aderidas aos cupons de

aço-carbono de ambos os reatores.

 Amplificação via PCR com iniciadores universais para o gene que

codifica o RNAr 16S das células aderidas aos cupons de aço-carbono.

 Detecção através de amplificação via PCR com iniciadores específicos

para o gene aprBA (que codifica a enzima adenosina-5-fosfosulfato

redutase) da presença de bactérias redutoras de sulfato (BRS) aderidas

aos cupons de aço-carbono. Averiguação das conseqüências da

introdução do nitrato para esse grupo bacteriano.

 Análise, através da técnica de DGGE, da estrutura da comunidade total

dos biofilmes aderidos aos cupons de aço-carbono.

 Ainda através da técnica de DGGE, averiguação do efeito da introdução

do nitrato na estrutura da comunidade total aderida aos cupons de aço

carbono durante o experimento com os reatores.

 Extração do gel, reamplificação por PCR, clonagem e seqüenciamento de

bandas de interesse observadas através da técnica de DGGE.

IV. Materiais e Métodos

1. Meios de Cultura

• Meio Postgate E modificado para bactérias redutoras de sulfato mesófilas

(m-BRS). (POSTGATE, 1984)

0,5g

Cl 1g

CaCl

.6H

O 1g

MgCl

.6H

O 1,83g

Lactato de sódio (50% p/v) 7ml

Acetato de sódio 2g

Extrato de levedura 1g

Àcido Ascórbico 0,1g

FeSO

.7H

O 0,5g

Agar 1,9g

Resazurina (0,025%p/v) 4ml

Água Mar sintética 1L

pH 7,6

O meio de cultura citado acima foi preparado sob purga de nitrogênio (N

distribuído em frascos de vidro de 10ml que, em seguida, foram lacrados com septo de

borracha e tampa de metal.

• Luria-Bertani Broth (LB) (SCHLEIF & WENSINK, 1981)

Triptona 10g

Extrato de levedura 5g

NaCl 5g

Água destilada q.s.p 1L

pH7,2

Os meios de cultura citados acima foram autoclavados a 121°C por 20min e

estocados a temperatura ambiente.

2. Soluções

• Solução tioglicolato de sódio

Tioglicolato de sódio 1,24g

Água destilada 100ml

• Solução redutora para meio Postgate E modificado

Tioglicolato de sódio 0,124g

Ácido ascórbico 0,1g

Resazurina (0,025% p/v) 4ml

Água do mar sintética 1L

pH 7,6

• Solução nutritiva para a formação de biofilme

Lactato de sódio (70%)

4ml

Extrato de levedura

Glicose

0,25g

Água destilada q.s.p

• Solução de Nitrato

Nitrato de sódio 1,5g

Água destilada q.s.p

As soluções descritas acima foram preparadas sob purga de nitrogênio (N

) sendo

lacradas com septo de borracha e tampa de metal em seguida autoclavadas a 121°C por

15min e estocadas a temperatura ambiente.

• Solução Adsorvedora

3 CdSO4. 8H2O 4,2g

Hidróxido de sódio 1,8g

Água destilada q.s.p

A solução foi preparada em frasco âmbar e foi estocada a 4°C.

• Água do mar sintética

NaF 0,03g

SrCl

.6H

0,2g

0,3g

KBr 1g

KCl 7g

CaCl

11,13g

40g

MgCl

.6H

107,8g

NaCl 235g

NaSiO

.9H

0,2g

EDTA

0,1g

NaHCO

Água Milli-Q q.s.p. 10L

A solução foi submetida a agitação por cerca de 20 horas (durante a noite), e em

seguida foi filtrada em membrana Millipore 0,45µm com o auxílio de uma bomba de

vácuo.

• Soluções de acrilamida / bis-acrilamida 40%

Acrilamida 38,93g

Bis-acrilamida 1,07g

Água Milli-Q q.s.p. 100ml

A acrilamida foi dissolvida em 30ml de água Milli-Q e a bis-acrilamida foi

acrescentada aos poucos, sendo o volume completado para 100ml com água Milli-Q.

Após a filtragem da solução em membrana Millipore de 0,45µm. A solução foi estocada

a 4°C em frasco âmbar.

• Solução corante de corrida para eletroforese de DNA em gel de agarose

Glicerol 50ml

EDTA (pH 7,5) 20mM

Azul de bromofenol 0,05g

Xileno cianol 0,05g

Água destilada q.s.p. 100ml

• Solução corante de corrida para DGGE

Glicerol 70% (v/v)

Azul de bromofenol 0,05% (p/v)

Xileno cianol 0,05% (p/v)

Água Milli-Q q.s.p.

100ml

• Solução corante de gradiente para DGGE

Azul de bromofenol 0,05% (p/v)

Xileno cianol 0,05% (p/v)

Tampão TAE 50x 2ml

Água Milli-Q q.s.p. 100ml

• Solução 0% desnaturante – gel de acrilamida 8%

Solução de acrilamida/Bis-acrilamida 40% 20ml

Tampão TAE 50x 2ml

Água Milli-Q q.s.p. 78ml

Após a filtragem da solução em membrana Millipore de 0,45µm, a solução foi

estocada a 4°C em frasco âmbar

• Solução 100% desnaturante – gel de acrilamida 8%

Solução de acrilamida/Bis-acrilamida 40% 20ml

Tampão TAE 50x 2ml

Formamida deionizada 32ml

Uréia 33,6g

Água Milli-Q q.s.p. 78ml

Após a filtragem da solução em membrana Millipore de 0,45µm, a solução foi

estocada a 4°C em frasco âmbar.

• Solução de persulfato de amônio (10%)

Persulfato de amônio 0,1g

Água destilada q.s.p. 1ml

A solução foi estocada a -20°C.

• Solução de formamida deionizada

Resina AG501-X8 da (Bio-Rad) 5g

Formamida 100ml

A resina foi adicionada à formamida e colocada sob agitação em placa por

aproximadamente 1 h. Em seguida, a solução foi filtrada em papel de filtro Whatman

n°4 e estocada em frasco âmbar a temperatura ambiente.

• Solução fixadora para MEV

Tampão cacodilato 0,1M

Glutaraldeído 2,5%

A solução foi estocada a 4°C.

• Solução de ampicilina

A solução de ampicilina foi preparada em água destilada estéril e mantida em

solução estoque a -20°C contendo 100µg/ml da droga.

3. Tampões

• Tampão TAE 50x

Tris 2M

Ácido acético glacial 1M

EDTA 0,5M pH 8 50mM

Água Milli-Q q.s.p 1L

pH 7,8

• Tampão TEB

Tris 89mM

EDTA 2,5mM

89mM

Água destilada q.s.p. 1L

pH 7,8

Após o preparo, os tampões foram autoclavados a 121°C por 20min e estocados a

temperatura ambiente.

• Tampão Fosfato

1,4mM

KCl 2,7mM

HPO

.7H

O 4,3mM

pH 7,2

• PBS

NaCl 137mM

Tampão fosfato (pH 7,2) 20mM

4. Procedência das Amostras de Água de Produção

As amostras de água de produção utilizadas nesse trabalho são provenientes da

Estação Coletora de Entre Rios do campo petrolífero de Sergipe e foram fornecidas pelo

Centro de Pesquisas da Petrobras (CENPES). A composição físico-química da água

produzida de Entre Rios está relacionada na tabela abaixo (Tabela 2).

Tabela 2: Análise físico-química da água produzida da Estação Coletora de Entre Rios

do Campo de Sergipe.

Característica Resultado Limite Inferior Limite Superior

Salinidade 90.118,7mg/l - 350.000

Densidade a 20/4°C 1,03 0,997 1,3

pH 6,5 1 14

Bário 24,1mg/l - 100

Cloretos 54.617,4mg/l - 200.000

Ferro Total 46,2mg/l - 100

Cálcio 1.931,7mg/l - 6.000

Magnésio 634,6mg/l - 2.000

Estrôncio 49,7mg/l - 100

Sódio 20.266,6mg/l - 100.000

Potássio 365,2mg/l - 50.000

Hidróxidos - - 100

Carbonatos - - 150

Bicarbonatos 558,3mg/l - 2.000

Sulfatos 42,3mg/l - 2.500

Alumínio Total 3,8mg/l - 1,5

Cromo Total 0,2mg/l - 1,1

Manganês total 1,4mg/l - 1

Cádmio < 0,01mg/l - 0,2

Chumbo 0,07mg/l - 0,5

Cobre Total 0,2mg/l - 1

Níquel 0,02mg/l - 2

Prata < 0,01mg/l - 0,1

Zinco 0,04mg/l - 5

5. Montagem do Biorreator

Foram preparados dois reatores de vidro de 1L (Figura 9). Cada reator contem

500ml de mosto (água de produção da estação de Entre Rios), 50ml de solução nutritiva

e nove cupons de aço-carbono ou corpos de prova (quatro cupons do Tipo 1 [com as

dimensões 10x10x2mm

] e os restantes do Tipo 2 [com as dimensões 10x20x2mm

])

presos à tampa do reator (Figura 9) . Cada biorreator tem quatro orifícios, sendo três na

parte superior (tampa) e um último localizado na altura de 500ml do frasco do reator. Os

três orifícios da parte superior foram destinados a: (1). entrada de caldo nutritivo e

nitrato (em somente um dos sistemas); (2). entrada de gás nitrogênio; e (3). saída de ar

(filtro). O quarto orifício (localizado no nível de 500ml dos reatores [4]) foi destinado

ao descarte de líquido e estava conectado a um Erlenmeyer de 6L.

A injeção de nutrientes nos biorreatores ocorreu a cada 24 horas. Ambos os sistemas

foram incubados sob purga contínua de nitrogênio, com agitação (60rpm) e temperatura

(30°C) constantes (Figura 10). A injeção contínua de uma solução de nitrato de sódio

(60ml/dia) foi realizada gota a gota através de um gotejador somente em um dos

reatores. O tratamento da superfície dos cupons foi realizado utilizando-se da técnica de

jateamento de areia.

Figura 9: Foto do reator de vidro de 1L (a) e esquema com ilustração dos nove cupons

de aço-carbono (quatro cupons do Tipo 1 [com as dimensões 10x10x2mm

] e os

restantes do Tipo 2 [com as dimensões 10x20x2mm

]) presos à tampa do reator (b). Os

orifícios presentes na tampa do reator (a e b) foram destinadas a entrada de caldo

nutritivo e nitrato (1), entrada de gás nitrogênio (2) e saída de ar (3). O quarto orifício

(4) foi destinado ao descarte de líquido (b).

Figura 10: Preparação e montagem do experimento com os reatores. Ambos os reatores

foram posicionados em cima de placas agitadoras e aquecedoras e conectados a

Erlenmeyers descartes de 6L.

1 2 3

6. Descrição dos Experimentos com os Reatores

Foram realizados três experimentos com o reator controle (reator C) e com o reator

que recebeu a injeção do nitrato (reator N). Todos os experimentos foram realizados nas

mesmas condições experimentais diferindo apenas no tempo de duração (Tabela 3).

Dessa forma, o primeiro experimento (E1) teve 5 dias de duração e os reatores

permaneceram por 48 horas em batelada para o estabelecimento do biofilme. Após esse

período, teve início a injeção contínua do nitrato (60 ml de solução de nitrato de sódio

por dia) no reator N até o final do experimento. O segundo experimento (E2) teve 45

dias de duração, sendo que, nos primeiros 12 dias os reatores permaneceram em

batelada, como no experimento anterior, e após esse período teve início a injeção

contínua do nitrato no reator N até o final do experimento. O terceiro e último

experimento (E3) teve a duração de 80 dias e, como nos experimentos anteriores, os

reatores permaneceram os primeiros 40 dias em batelada e, nos 40 dias restantes para o

término do experimento, somente o reator N recebeu a injeção contínua de nitrato até o

final do experimento.

Durante os três experimentos, a amostragem dos cupons foi realizada antes e após o

início da injeção do nitrato, constituindo dois tempos de amostragem para cada

experimento. Dessa forma, a cada tempo de amostragem quatro cupons (dois cupons do

Tipo 1 e os restantes do Tipo 2) foram retirados dos reatores durante os experimentos

E1, E2 e E3 com, respectivamente, 2 e 5 dias, 12 e 45 dias e 40 e 80 dias de

experimento. Ao final de cada experimento, foi amostrado ainda um cupom do Tipo 1

sobressalente de cada reator. Desses quatro cupons, os corpos de prova do Tipo 2 foram

raspados com o auxílio de uma espátula de madeira estéril e esse raspado foi

ressuspenso em 9 ml de solução redutora. A partir dessa suspensão do raspado, foram

retiradas alíquotas para contagem direta de células [fluoróforo (Laranja de Acridina -

LA)], contagem de BRS viáveis [número mais provável (NMP)] e para análise

molecular (extração do DNA total, amplificação por PCR e DGGE). Após o

procedimento de raspagem, esses cupons foram utilizados para avaliação da biocorrosão

através da perda de massa. Os cupons restantes (Tipo 1) foram destinados à microscopia

eletrônica de varredura para a análise da biocorrosão de suas superfícies e da formação

de biofilme. Durante todos os experimentos, as diferenças na turbidez e na coloração da

água de produção (originalmente transparente) foram acompanhadas diariamente

através de observação visual dos reatores.

Tabela 3: Esquema com descrição de duração dos experimentos, tempos de

amostragem e período da injeção do nitrato nos experimentos E1, E2 e E3 realizados

com os reatores N e C

Experimento

Duração do

experimento

1ª

amostragem

de cupom (t1)

2ª

amostragem

de cupom (t2)

Período de

injeção do nitrato

no reator N

E1 5 dias 2º dia 5º dia 3 dias

E2 45 dias 12º dia 45º dia 33 dias

E3 80 dias 40º dia 80º dia 40 dias

7. Contagem do Número de Células

A realização da contagem do número de células aderidas aos cupons de aço-carbono

de cada um dos sistemas utilizados (reator N e C) foi feita com o auxílio de duas

técnicas distintas: através do fluoróforo laranja de acridina (LA) e da técnica de número

mais provável (NMP).

Análises quantitativas das células presentes nos biofilmes aderidos aos cupons

foram realizadas através do fluoróforo laranja de acridina (LA) utilizando-se um

microscópio de epifluorescência (microscópio Zeiss Axioplan 2; filtro para LA (laranja

de acridina - 487nm a 520nm). Os cupons foram raspados (utilizando uma espátula de

madeira estéril) para a remoção das células dos biofilmes aderidos. O raspado foi

mergulhado em 9ml de solução redutora de onde foi retirada uma alíquota de 3 ml. As

amostras foram sonicadas por 7 minutos e foram em seguida, como descrito por PAIVA

(2004), incubadas com LA (30mg/ml em solução de PBS 1:1000) por 30 minutos no

escuro à temperatura ambiente. Após o término da marcação com o fluoróforo LA, as

amostras foram filtradas e as membranas de filtro obtidas foram posicionadas em

lâminas de vidro. Uma gota de 5µl de solução de DABCO (diazabiciclo [2.2.2] octano)

1% em glicerol (para retardar a perda da fluorescência) foi colocada sobre as amostras

nos filtros.

A contagem de bactérias redutoras de sulfato (BRS) foi realizada por meio da

técnica de número mais provável (NMP) como descrito por COUTINHO,

MAGALHÃES & ARAÚJO-JORGE (1993), crescendo essas bactérias em suspensão

(POSTGATE, 1984). Os cupons foram raspados (utilizando uma espátula de madeira

estéril) para a remoção das células dos biofilmes aderidos e, em seguida, o raspado foi

mergulhado em 9ml solução redutora. A partir de alíquotas de 1ml dessa solução, foram

realizadas diluições seriadas decimais em 9ml de solução de água do mar sintética

desaerada e estéril com o auxílio de seringas estéreis. Em seguida, de cada diluição foi

retirada novamente uma alíquota de 1ml que foi transferida com o auxílio de seringas

estéreis para o meio Postgate E que, em seguida, foram incubados a temperatura de

32°C. A contagem direta do número de células nos frascos foi realizada com o auxílio

da Tabela Referência de NMP (TAYLOR, 1962).

8. Avaliação da Biocorrosão

Os cupons foram observados através de microscopia eletrônica de varredura (MEV)

em colaboração com o laboratório de Ultraestrutura de Procariotos (IMPPG, UFRJ)

para verificar a formação de biofilme e a corrosão induzida por esses microrganismos

sobre essa superfície metálica.

Para verificar a formação de biofilme, os cupons amostrados de ambos os sistemas

(reatores N e C) foram fixados utilizando tampão de fixação para MEV (tampão

cacodilato 0,1M e glutaraldeído 2,5%) e mantidos por uma semana a 4°C. Após esse

perído, os cupons foram lavados três vezes em tampão cacodilato 0,1M por 10 minutos.

Em seguida, as células dos biofilmes foram desidratadas utilizando concentrações

crescentes de etanol (30%, 50%, 70%, 90% e 100%). Completada a desidratação, as

amostras obtidas foram submetidas a uma etapa de secagem utilizando dois protocolos

diferentes. O primeiro utilizando um aparelho de ponto crítico de CO

(CPD-030 da

Balzers). No segundo protocolo, a etapa de secagem foi realizada com o solvente

hexametildisilazano (HMDS) que foi utilizado na remoção de líquidos do espécime

microbiológico, ao invés do CPD. Para tal, após a desidratação das amostras, essas

foram mantidas em uma solução de HMDS e etanol absoluto (1:1) durante 30 minutos.

Em seguida, os cupons foram mantidos em uma solução de HMDS por 1hora a 4°C. Por

fim, os cupons de aço-carbono tiveram suas superfícies recobertas por uma camada de

ouro com 15nm de espessura no aparelho metalizador (SCD-040 da Balzers) e foram

observadas em um microscópio eletrônico de varredura (microscópio ZEISS LEO EVO

40).

Os cupons selecionados para a avaliação da biocorrosão da superfície do metal

foram raspados para a retirada do biofilme. Em seguida, os cupons foram submetidos a

uma decapagem ácida para a limpeza total da superfície (NEMATI, JENNEMAM &

VOORDOUW, 2001), onde esses foram banhados em solução de ácido clorídrico 18%

por 5 segundos, neutralizados em uma solução saturada de bicarbonato de sódio durante

5 segundos e lavados com água destilada. Ao final desse processo, os cupons foram

imersos em acetona por mais 5 segundos e, em seguida, mantidos sob uma corrente de

ar para garantir a retirada de toda umidade. Por fim, os cupons de aço-carbono tiveram

suas superfícies observadas em um microscópio eletrônico de varredura (microscópio

JEOL 5310). O programa de captura de imagens utilizado foi o Sem Afore JEOL 3.0

Pro e as imagens foram adquiridas com uma resolução de 1024x768 pixels. Como

parâmetro de comparação, também foram observados cupons de aço carbono “branco”

que não fizeram parte dos experimentos com os reatores. Os cupons “branco” também

foram submetidos à decapagem ácida antes da observação no MEV.

A corrosão dos cupons de aço-carbono foi observada através de perda de massa

como descrito por NEMATI, JENNEMAM & VOORDOUW (2001). Os cupons foram

pesados ao décimo de miligrama no início, durante a primeira amostragem e ao final

dos experimentos E1, E2, E3 utilizando os reatores (N e C). Durante os experimentos,

os cupons retirados dos reatores foram raspados para a retirada do biofilme formado e

após submetidos a uma decapagem ácida, esses foram novamente pesados a fim de se

determinar a perda de peso por corrosão. Na decapagem ácida, os cupons foram

banhados em solução de ácido clorídrico 18% por 5 segundos, neutralizados em uma

solução saturada de bicarbonato de sódio durante 5 segundos e lavados com água

destilada. Ao final desse processo, os cupons foram imersos em acetona por mais 5

segundos e, em seguida, mantidos sob uma corrente de ar para garantir a retirada de

toda umidade. Os valores obtidos referentes à perda de peso total foram representados

em porcentagem e utilizados para a realização de análises estatísticas (teste t).

9. Extração de DNA dos Biofilmes Bacterianos

Foi realizada a extração do DNA total dos biofilmes bacterianos aderidos aos

cupons de aço-carbono amostrados em duplicata de ambos os sistemas testados (reator

N e C), como descrito por SELDIN & DUBNAU (1985) utilizando fenol-clorofórmio.

O DNA total extraído de cada uma das amostras foi aplicado a um gel de agarose

0,8% (p/v) em tampão TEB para a realização de uma eletroforese horizontal. Durante

aproximadamente 2 horas, foi utilizada uma corrente elétrica de 80V em tampão TEB

com o intuito de analisar a pureza e a qualidade das amostras de DNA extraídas. Na

proporção de 1:3, as amostras foram misturadas a uma solução corante para eletroforese

de DNA em gel de agarose antes da aplicação no gel. O marcador de peso molecular

utilizado foi o “1Kb Plus DNA Ladder” (Promega ).

O gel foi mantido à temperatura ambiente ao final da corrida eletroforética por,

aproximadamente, 20 minutos em uma solução de brometo de etídio (2µg/ml) para ser

corado. Em seguida, o gel foi observado e fotografado sob luz UV no sistema de análise

de imagens IMAGO (B & L, Holanda).

10. Amplificação por PCR

O DNA total extraído a partir dos biofilmes bacterianos aderidos aos cupons de aço-

carbono amostrados em duplicata de ambos os sistemas testados (reatores N e C) foi

amplificado por PCR utilizando-se iniciadores universais para o gene que codifica o

RNA ribossomal 16S e iniciadores específicos para o gene aprBA que codifica a

enzima adenosina-5-fosfosulfato redutase presente em bactérias redutoras de sulfato.

O par de iniciadores universais que foi utilizado é baseado no gene de E. coli, sendo

o U968f-GC1 (grampo GC + 5’ ACC GCG AAG AAC CTT AC 3’) homólogo à região

968-984 do gene para RNAr 16S e o L1401r (5’ GCG TGT GTA CAA GAC CC 3’)

homólogo à região 1384-1401 do mesmo gene (NUBEL et al., 1996). A seqüência

conhecida como “grampo GC” possui 40 pares de bases que agem estabilizando as

formas de transição da molécula de DNA aplicada ao DGGE (ROSADO & DUARTE,

2002). As reações de amplificação foram realizadas em tubos, com o volume final de 50

µl, contendo uma mistura de tampão da enzima GOTaq®Flex 5x, 5 mM de MgCl

, 200

µM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP), 1 µl de cada iniciador (20ρmol), 2,5 U

da enzima GOTaq®Flex, 1 µl (50 a 100 ng) de DNA e água Milli-Q estéril. Além disso,

em cada reação de amplificação por PCR foram utilizada 0,5 µl de soro albumina

bovina (BSA) para melhorar a eficiência da amplificação do DNA (KREADER, 1996;

CHAKRABARTI & SCHUTT, 2001). O ciclo aplicado foi: um ciclo de desnaturação

de 3 min a 94°C, seguido de 35 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min e 30 s a 55°C e 1 min a

72°C e da extensão a 72°C por 10 min (NUBEL et al., 1996).

O outro par de iniciadores que foi utilizado nesse trabalho se baseia em uma região

conservada do gene da subunidade A da enzima APS redutase (aprBA gene -

adenosine-5-phosphosulfate reductase) (F2 = 5’ CCA GGG CCT GTC CGC CAT CAA

TAC 3’ e R2 – 5’ CCG GGC CGT AAC CGT CCT TGAA 3’) como descrito por

ZINKEVICH & BEECH (2000). O iniciador F2 é homólogo à região 969-992 do gene

aprBA de Desulfovibrio vulgaris, enquanto que o iniciador R2 é homólogo à região

1603-1624 deste mesmo gene. As reações de PCR para o gene aprBA foram realizadas

em tubos contendo 50 µl do mix composto de 10 mM Tris-HCl (pH 9), 50 mM KCl,

3,25mM MgCl

, 200 µM de cada dNTP, 0,5 µM de cada iniciador, 100 ng de DNA e

2,5 U da enzima Taq polimerase. O ciclo aplicado foi: 1x (2 min 95°C); 35x (1min

95°C; 1 min 62°C; 1 min 72°C); 10 min 72°C; 4°C. Foi utilizado como controle

positivo da reação uma amostra de DNA da estirpe A11 de Desulfovibrio alaskensis.

Os fragmentos obtidos em ambas as reações foram submetidos à eletroforese

horizontal em gel de agarose a 0,8% (p/v) a 80V em tampão TEB por aproximadamente

2h a temperatura ambiente a fim de confirmar se o DNA foi amplificado em cada reação

de PCR. Na proporção de 1:3, as amostras foram misturadas a uma solução corante para

eletroforese de DNA em gel de agarose antes da aplicação no gel. O marcador de peso

molecular utilizado foi o “1Kb Plus DNA Ladder” (Promega ). O gel foi mantido à

temperatura ambiente ao final da corrida eletroforética por, aproximadamente, 20

minutos em uma solução de brometo de etídio (2µg/ml) para ser corado. Em seguida, o

gel foi observado e fotografado sob luz UV no sistema de análise de imagens IMAGO

(B &L, Holanda).

11. Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE)

Para verificar a estrutura das comunidades presentes nos biofilmes aderidos aos

cupons amostrados em duplicata dos reatores (N e C) e avaliar o efeito da introdução do

nitrato nas mesmas, foi realizada uma eletroforese em gel de gradiente desnaturante

(DGGE) dos produtos que foram obtidos na reação de PCR para amplificação do gene

que codifica o RNAr 16S.

Alíquotas de 15 a 20µl dos produtos de PCR foram adicionadas de 10µl de corante

de corrida para DGGE e separadas em um gel vertical de poliacrilamida 8% (p/v)

preparado em tampão TAE 1x em uma corrida eletroforética a 60 V nesse mesmo

tampão por aproximadamente 16h a 60°C. O gradiente linear desse gel foi de 35-65%

dos agentes desnaturantes uréia e formamida (100% de desnaturantes correspondem a

7M de uréia e 40% de formamida deionizada).

A corrida eletroforética foi realizada no sistema “Dcode Universal Mutation

Detection System” da Bio-Rad (Richmond, USA). Ao final da corrida, o gel foi corado

por aproximadamente 40 minutos com SYBR Green I (Molecular Probes) na ausência

de luz e digitalizado no sistema STORM (Pharmacia).

12. Análise dos perfis de DGGE

Os perfis de bandas obtidos nos géis de DGGE foram analisados com o auxílio do

programa “Image Quant” (acoplado ao sistema de imagens STORM). A comparação

entre as bandas presentes nos diferentes genótipos foi realizada com o auxílio do

software GelCompar II 4.06 (Applied Maths, Sint Martens-Latem, Belgium). A partir

destas análises, foram construídos dendrogramas através do programa BioNumerics

utilizando-se o coeficiente de similaridade de Pearson e o método UPGMA.

Algumas bandas foram selecionadas para excisão do gel de DGGE e reamplificação

por PCR. Bandas individualizadas obtidas nos géis de DGGE foram extraídas dos géis

com o auxilio de um bisturi estéril e o DNA contido em cada fragmento foi eluído em

20µl de água estéril a 4°C, durante uma noite. Uma alíquota de 1µl do DNA eluído foi

reamplificada através da PCR nas mesmas condições descritas anteriormente. O sucesso

desse procedimento foi testado através da realização de um novo DGGE com 3µl do

DNA eluído nas mesmas condições anteriores. Produtos de PCR representando bandas

individuais no gel de DGGE que migraram na mesma posição das bandas originalmente

extraídas do primeiro gel, foram então purificados com a utilização do kit de purificação

comercial “WizardTM Rapid PCR Purification System” (Promega). Dessa forma,

alíquotas de 2µl dos produtos purificados foram utilizadas na ligação ao vetor pJET 1.2,

à temperatura ambiente durante 30 minutos, segundo as recomendações do fabricante do

kit “CloneJET

PCR Cloning Kit” 9fermentas). Em seguida, células competentes de

Escherichia coli JM109 foram transformadas através de eletroporação de acordo com as

instruções do mesmo fabricante. Após a transformação as células foram mantidas em

meio LB por 2 horas a 37ºC sob agitação. Uma quantidade de 100µl de cada cultura foi

semeada em placas contendo meio LB com ampicilina 100µg/ml, Em seguida, as placas

foram incubadas a 37ºC por 24 horas. Para a confirmação da presença do inserto nos

clones, foi realizada uma reação de PCR diretamente da colônia, utilizando os

iniciadores pJET 1.2 forward (5

′CGA CTC ACT ATA GGG AGA GCG GC 3′) e pJET

1.2 reverse (5’AAG AAC ATC GAT TTT CCA TGG CAG 3’). Após a confirmação, os

produtos da reação foram então seqüenciados em seqüenciador automático ABI Prism

3100 (Applied Biosystems, USA).

Foi realizada uma análise de todas as seqüências obtidas (forward e reverse)

utilizando o programa BioEdit 7.0 (HALL, 1999), e as seqüências que continham bases

ambíguas não foram consideradas para as análises seguintes. Em seguida, as bases

correspondentes à seqüência do vetor de clonagem foram detectadas utilizando a

ferramenta VecScreen, encontrada no site NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html) e retiradas manualmente

usando-se o programa BioEdit. As seqüências selecionadas para este estudo foram então

comparadas com as presentes no banco de dados GenBank utilizando-se a ferramenta

blastn (Basic Local Alignment Search Tool) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

(ALTSHUL et al., 1990) para identificação das seqüências do gene que codifica o

RNAr 16S mais próximas.

V. Resultados

1. Experimentos com os Biorreatores

Foram realizados três experimentos com os reatores (reator C e reator N) nas

mesmas condições experimentais, porém com tempos de duração diferentes (Tabela 3).

Dessa forma, o experimento E1 teve 5 dias de duração, o experimento E2 teve 45 dias

de duração e o experimento E3 teve a duração de 80 dias. Em todos os experimentos, os

reatores permaneceram inicialmente em batelada, ou seja, estáticos para o

estabelecimento do biofilme. Após esse período, teve início a injeção contínua do

nitrato (60ml de solução de nitrato de sódio por dia) no reator N até o final dos

experimentos. Além disso, ambos os sistemas foram incubados sob purga de nitrogênio,

com agitação (60rpm) e temperatura (30°C) constantes em todos os experimentos.

No decorrer dos três experimentos, os reatores foram observados visualmente e

apresentaram diferenças na turbidez da água de produção que originalmente era

transparente. Durante o experimento E1, a água de produção não apresentou grandes

variações em sua turbidez (dados não mostrados). Mesmo após a introdução do nitrato

no reator N, não foi possível verificar diferenças na turbidez da água de produção desse

sistema em relação ao reator C. Já no experimento E2 (Figura 11), foi possível observar

um aumento na turbidez do mosto de ambos os reatores (N e C) em relação ao

experimento E1. Além disso, foi verificado um aumento no amarelamento da água de

produção após a introdução do nitrato no reator N, quando comparado ao reator C

(Figura 11). No experimento E3 (Figura 12), os reatores também apresentaram um

aumento na turbidez da água de produção em relação aos experimentos anteriores. No

período em que ambos os reatores (N e C) permaneceram em batelada (40 dias), houve

a formação de um precipitado negro indicando a existência de sulfeto de ferro e,

consequentemente, indicando a presença de bactérias redutoras de sulfato (BRS). Após

o início da injeção do nitrato, o reator N apresentou uma alteração em sua coloração,

passando do negro ao amarelo, enquanto o reator C manteve a coloração negra do mosto

até o final do experimento (Figura 12b). Ainda durante o experimento E3 foi possível

verificar o odor provocado pelo sulfeto de hidrogênio, indicando uma provável

acidulação dos reatores. Nesse mesmo experimento, houve também uma variação no pH

do reator N após a injeção do nitrato passando de 7,6 para 8,7. O pH do reator C se

manteve próximo a neutralidade até o final do experimento.

Figura 11: Fotos do sistema completo dos reatores (N e C) ao final do experimento E2

(a) indicando o aumento na turbidez do mosto no reator N após a injeção do nitrato (c)

em relação ao reator C (b). Os cupons de aço carbono estão indicados por setas pretas

em ambos os reatores C (b) e N (c).

Figura 12: Fotos do sistema completo dos reatores (N e C) ao final do experimento E3

(a) indicando uma mudança na coloração de negro para amarelo do mosto no reator N

após a injeção do nitrato (c). O reator C (b) manteve a coloração negra do mosto até o

final do experimento E3. Um cupom de aço carbono está indicado pela seta preta no

reator N (c).

2. Contagem do Número de Células Aderidas sobre os Cupons

A realização da contagem do número de células aderidas aos cupons de aço-carbono

de cada um dos sistemas utilizados (reator N e C) foi feita com o auxílio de duas

técnicas distintas: através do fluoróforo laranja de acridina (LA) e da técnica de número

mais provável (NMP).

• Contagem Direta de Células Sésseis Totais

As análises quantitativas das células presentes nos biofilmes aderidos aos cupons

foram realizadas através do fluoróforo laranja de acridina (LA). Essa técnica foi

utilizada para a quantificação das células sésseis totais aderidas aos cupons durante os

três experimentos realizados (E1, E2 e E3). Entretanto, nas amostras do experimento

E1, não foi possível realizar a contagem de células devido ao estado do material raspado

dos cupons. Este apresentava muitos aglomerados de EPS intacto encobrindo as células

e impedindo sua visualização. Assim, as contagens de células totais foram realizadas

somente nos experimentos E2 e E3 (Figura 13). Como pode ser observado no gráfico da

Figura 13(a), as contagens de células referentes ao experimento E2 mostram que ambos

os reatores apresentavam uma contagem de células/mm² da superfície do cupom

semelhante no início do experimento. A partir de 12 dias de experimento, os reatores

apresentaram um aumento na contagem de células/mm² da superfície do cupom. Em

relação ao experimento E3, podemos observar na Figura 13(b) que as contagem de

células/mm² da superfície do cupom, assim como no experimento E2, foram

semelhantes entre os reatores no início do experimento (40 dias) mantendo as condições

de um biofilme maduro e estável. Após 40 dias de experimento e com o início da

injeção contínua do nitrato, o reator N apresentou um aumento na contagem de

células/mm² da superfície do cupom em relação ao reator C. Além disso, as contagens

provenientes do reator C mostraram-se praticamente constantes desde o início até o final

do experimento E3. Dessa forma, esses resultados sugerem que o nitrato está

estimulando a população séssil total do reator N em ambos os experimentos (E2 e E3).

Figura 13: Contagem do número de células presentes nos biofilmes aderidos aos

cupons realizadas através do fluoróforo laranja de acridina (LA) utilizando-se um

microscópio de epifluorescência. Os gráficos acima apresentam um aumento no número

de células dos biofilmes em ambos os reatores (N e C) ao final do experimento E2 (a) e

um aumento no número de células do biofilme no reator N após a injeção do nitrato no

experimento E3 (b). As contagens provenientes do reator C estão representadas em azul

e as contagens do reator N em vermelho.

• Contagem do NMP de BRS

A técnica do NMP foi utilizada para quantificação das bactérias redutoras de sulfato

(BRS) nos três experimentos realizados com os reatores (E1, E2 e E3). Entretanto,

somente no experimento E3, foi possível observar o crescimento de BRS em suspensão

através de redução do meio de cultura e formação de um precipitado negro (sulfeto de

ferro). Como podem ser observadas no gráfico da Figura 14, as contagens iniciais de

BRS com 40 dias de experimento, ou seja, antes da introdução do nitrato no reator N,

foram semelhantes em ambos os reatores. A partir do início da injeção contínua do

nitrato, o número de BRS presentes varia entre os reatores N e C. No reator C, foi

possível observar com 80 dias de experimento um aumento na contagem de células de

BRS em relação aos 40 dias iniciais do experimento. Já no reator N, a contagem de BRS

diminuiu com 80 dias de experimento em relação às contagens iniciais representadas no

gráfico abaixo (Figura 14). Esses resultados sugerem que a injeção contínua do nitrato

levou a uma redução na população de BRS viáveis no reator N mesmo com o aumento

da população séssil total aderida aos cupons (Figura 13b).

Figura 14: Contagem de bactérias redutoras de sulfato (BRS) presentes nos biofilmes

dos cupons dos reatores (N e C) do experimento E3 por meio da técnica de número mais

provável (NMP). O gráfico apresenta um aumento no número de BRS no reator C

(representado em azul) e um declínio do número de BRS no reator N (representado em

vermelho) ao final do experimento E3.

3. Avaliação da Biocorrosão

• Análise da Formação de Biofilme por MEV

A superfície dos cupons foi observada através de microscopia eletrônica de

varredura (MEV) para verificar a formação de biofilme pelos microrganismos presentes

na água de produção de Entre Rios nessa superfície metálica. Para essa análise, foram

utilizados os cupons dos experimentos E2 e E3. Os cupons obtidos com 12 (t1) e 45 dias

(t2) do experimento E2 foram processados utilizando, respectivamente, o CPD

(aparelho do Ponto Crítico) e o solvente HMDS (hexametildisilazano). Os cupons

oriundos do segundo tempo de amostragem (80 dias) do experimento E3 também foram

processados utilizando o solvente HMDS. Ambas as estratégias apresentadas acima

foram utilizadas na etapa de secagem das amostras do biofilme. Na Figura 15, com o

auxílio do CPD, foi possível observar que já com 12 dias do experimento E2 haviam

células fortemente aderidas à superfície dos cupons de ambos os reatores (N e C)

indicando uma adesão celular irreversível à superfície metálica. Entretanto, nesse

estudo, esse método não foi capaz de manter intacta a estrutura do biofilme. Dessa

forma, não foi possível observar a estrutura tridimensional da amostra e com isso

determinar se com 12 dias já havia um biofilme maduro aderido aos cupons dos

reatores. Já nos cupons retirados com 45 dias dos reatores, processados com HMDS, foi

possível observar em ambos os reatores: i. adesão celular irreversível à superfície dos

cupons (Figura 16a e b) e; ii. a estrutura tridimensional da amostra de biofilme (Figura

16c e d). Assim, os resultados obtidos mostram a presença de um biofilme maduro em

ambos os reatores (N e C) com 45 dias do experimento E2. Nas amostras do

experimento E3, foi possível observar nos cupons de ambos os reatores (C e N) uma

estrutura tridimensional de biofilme semelhante à observada na superfície dos cupons

do experimento E2 (Figura 16c e d). Dessa forma, baseado em nossos resultados, o

solvente HMDS demonstrou ser eficiente na conservação da estrutura tridimensional

dos biofilmes maduros dos experimentos E2 e E3.

Figura 15: Micrografias eletrônicas de varredura mostrando células aderidas à

superfície dos cupons do reator C (a e c) e do reator N (b e d) processados com CPD

oriundos do primeiro tempo de amostragem (12 dias) do experimento E2. As barras de

escala são equivalentes a 2µm e estão representadas no canto inferior direito das

imagens.

Figura 16: Micrografias eletrônicas de varredura mostrando células aderidas à

superfície dos cupons dos reatores C (a) e N (b) e as estruturas tridimensionais dos

biofilmes maduros aderidos aos cupons de ambos os reatores C (c) e N (d). Os cupons

foram processados com HMDS e são oriundos do segundo tempo de amostragem (45

dias) do experimento E2. As barras de escala são equivalentes a 2µm e estão

representadas no canto inferior direito das imagens. As setas pretas indicam a presença

de células nas micrografias.

• Análise da Biocorrosão da Superfície dos Cupons por MEV

Para avaliar a biocorrosão da superfície metálica dos cupons, esses foram

raspados e em seguida suas superfícies foram observadas através de microscopia

eletrônica de varredura (MEV). Somente os cupons retirados dos reatores ao final dos

experimentos E2 (45 dias) e E3 (80 dias) foram observados por MEV. Cupons

“branco”, ou seja, que não fizeram parte dos experimentos com os reatores, foram

utilizados como parâmetro de comparação. Os cupons obtidos ao final experimento E2

estão representados na Figura 17. Como pode ser observado nessa figura (b e e), os

cupons oriundos do reator C com 45 dias apresentam pequenos pites (buracos) em sua

superfície quando comparada à superfície dos cupons “branco” (Figura 17a e d).

Entretanto, quando a superfície dos cupons do reator N (Figura 17c e f) foi comparada

com a superfície dos cupons “branco” e dos cupons oriundos do reator C, foi possível

observar que a superfície desse primeiro apresenta uma maior corrosão por pites em

relação às demais superfícies analisadas. O mesmo pode ser observado na Figura 18

quando a superfície dos cupons “branco” (Figura 18a e d), dos cupons do reator C

(Figura 18b e e) e dos cupons do reator N (Figura 18c e f) foram comparadas ao final do

experimento E3. A diferença na superfície dos cupons oriundos do reator N em relação

às demais superfícies dos outros cupons foi visível e estes cupons apresentaram ainda

uma maior corrosão (quantidade maior de pites) quando comparados com os cupons do

reator N no experimento E2 (Figura 17c e f). Dessa forma, os resultados sugerem que a

corrosão em forma de pites foi mais severa nos cupons oriundos do reator N, tanto no

experimento E2 quanto no experimento E3.

Figura 17: Micrografias eletrônicas de varredura mostrando uma maior quantidade de

buracos (pites) na superfície dos cupons raspados do reator N (c e f) em relação a

superfície dos cupons do reator C (b e e) e dos cupons “branco” (a e d). Os cupons

analisados por MEV são oriundos do segundo tempo de amostragem (45 dias) do

experimento E2. As barras de escala estão posicionadas na parte inferior das

micrografias e são equivalentes a 10µm (Figuras a, b e c) e 5µm (Figuras d, e e f). As

setas pretas indicam a presença dos pites na superfície dos cupons.

Figura 18: Micrografias eletrônicas de varredura mostrando uma maior quantidade de

buracos (pites) na superfície dos cupons raspados do reator N (c e f) em relação a

superfície dos cupons do reator C (b e e) e dos cupons “branco” (a e d). Os cupons

analisados por MEV são oriundos do segundo tempo de amostragem (80 dias) do

experimento E3. As barras de escala estão posicionadas na parte inferior das

micrografias e são equivalentes a 10µm (Figuras a, b e c) e 5µm (Figuras d, e e f). As

setas pretas indicam a presença dos pites na superfície dos cupons.

• Avaliação da Perda de Massa dos Cupons

A avaliação da corrosão dos cupons de aço-carbono foi realizada através do cálculo

da porcentagem de perda de massa desses corpos de prova, pesando-os no início (t0), no

primeiro (2, 12 e 40 dias) e no último tempo de amostragem (5, 45 e 80 dias) de cada

experimento realizado (respectivamente E1, E2 e E3). Durante os três experimentos, foi

verificada uma perda de massa em todos os corpos de prova testados em ambos os

reatores (C e N) (Figura 19). Já no primeiro tempo de amostragem (t1), foi possível

verificar uma perda de massa dos cupons de ambos os reatores em todos os

experimentos realizados (quando comparados ao tempo 0). Como pode ser observada na

Figura 19(a), a porcentagem de perda de massa foi semelhante entre os reatores no

primeiro experimento até o início da injeção contínua do nitrato no reator N. Após a

introdução do nitrato, houve uma aceleração da perda de massa dos cupons do reator N

em relação aos cupons do reator C. Ao final de E1, os corpos de prova do reator N

apresentavam uma perda significativa de 0,47% (p < 0,05) da massa total dos cupons.

Resultados semelhantes puderam ser observados nos experimentos E2 e E3 após a

introdução do nitrato (Figura 19b e c) onde os cupons do reator N perderam,

respectivamente, 0,56% e 2,15% (p < 0,05) de massa total ao final desses experimentos.

Figura 19: Gráficos representando um aumento na perda de massa dos cupons do reator

N após a injeção do nitrato em relação aos cupons do reator C nos experimentos E1 (a),

E2 (b) e E3 (c). A avaliação da corrosão dos corpos de prova foi realizada através da

porcentagem de perda de massa dos cupons/tempo (dias) de experimento realizado. As

retas representando a porcentagem de perda de massa dos cupons do reator C estão na

cor azul em E1, verde em E2 e lilás em E3. As retas representando a porcentagem de

perda de massa dos cupons do reator N estão na cor vermelha em E1, verde limão em

E2 e laranja em E3.

4. Extração do DNA Total dos Biofilmes e Amplificação por PCR do Gene que

Codifica a Enzima APS Redutase

A técnica descrita por SELDIN & DUBNAU (1985) utilizando Fenol-Clorofórmio

se mostrou eficiente na extração do DNA total a partir dos biofilmes bacterianos

aderidos aos cupons de aço-carbono nos experimentos realizados com os reatores. O

DNA total extraído de ambos os sistemas testados (reatores N e C) foi então submetido

a uma reação de PCR utilizando-se iniciadores específicos para o gene aprBA que

codifica a enzima adenosina-5-fosfosulfato redutase presente em bactérias redutoras de

sulfato. Nos resultados observados, não foi possível obter o produto do tamanho

esperado nos experimentos E1 e E2 (respectivamente 5 e 45 dias de duração). Somente

no terceiro experimento (E3), o fragmento com o tamanho esperado foi obtido em

ambos os tempos de amostragem (40 e 80 dias) nos dois sistemas testados (reatores N e

C). Esses resultados sugerem a presença de BRS em ambos os sistemas mesmo após a

injeção de nitrato no reator N.

5. Análise da Estrutura da Comunidade Bacteriana dos Biofilmes Presentes

nos Reatores

O DNA total extraído de ambos os sistemas testados (reatores N e C) foi então

submetido a uma reação de PCR utilizando-se iniciadores específicos para o gene que

codifica o RNAr 16S. Nos resultados observados, foi possível obter produtos do

tamanho esperado nos três experimentos E1, E2 e E3. Dessa forma, foi possível analisar

a estrutura da comunidade séssil dos reatores através de eletroforese em gel de gradiente

desnaturante (DGGE) em todos os experimentos realizados (Figuras 20, 21 e 22).

A partir dos perfis de DGGE gerados a partir do experimento E1(Figura 20a), foi

observada a presença de poucas bandas no gel em todas as amostras analisadas. Esses

resultados sugerem que o tempo de 5 dias de experimento talvez não tenha sido

suficiente para a formação de um biofilme maduro, apresentando ainda poucas células

aderidas aos cupons. O dendrograma gerado a partir do gel de E1(Figura 20a) mostra

que, com a exceção de duas amostras que se separaram em 54% de similaridade das

demais, as amostras dos reatores C e N formaram dois grupos em 82% de similaridade.

Além disso, as amostras do reator C com 2 dias de experimento (t1) e com 5 dias (t2)

ainda se dividiram em dois subgrupos em 90% de similaridade. O mesmo ocorreu com

os perfis do reator N antes (t1) e após o início da injeção contínua do nitrato (t2) que se

dividiram em dois subgrupos em 91% de similaridade. Assim, observando-se os perfis

gerados no gel, é possível sugerir que não houve grandes alterações na estrutura da

comunidade bacteriana dos biofilmes com o passar do tempo e com a introdução do

nitrato em E1.

Nos perfis de DGGE gerados a partir do experimento E2 (Figura 20b), foi

observada a presença de várias bandas no gel em todas as amostras analisadas. Esses

resultados sugerem que com 12 dias de experimento (t1) provavelmente já havia sido

formado um biofilme maduro. Observando-se os perfis gerados no DGGE de E2, é

possível verificar que existem alterações na intensidade das bandas dos perfis gerados a

partir da comunidade do reator N antes (t1) e após a introdução do nitrato (t2). Assim,

foi possível observar que uma banda presente nos perfis do reator N (t1) diminuiu de

intensidade após o início da injeção contínua do nitrato (Figura 20b) Essa banda

(denominada de B1) foi extraída do gel, clonada e os clones foram seqüenciados com

sucesso. As seqüências obtidas apresentaram 98% de similaridade com Marinobacter

sp.. Já nos perfis gerados a partir do reator C, não foi possível verificar grandes

alterações na estrutura da comunidade com o passar do tempo. No dendrograma gerado

a partir do gel de E2 (Figura 20b), foi possível observar que as amostras dos reatores N

(t1 e t2) e do reator C (t1 e t2) formaram dois grupos distintos em 80% de similaridade.

As amostras do reator N antes (t1) e após a injeção do nitrato (t2) ainda se dividiram em

dois subgrupos em 88% de similaridade. Assim, esses resultados sugerem que a

estrutura da comunidade do biofilme maduro sofreu alterações após a injeção contínua

do nitrato no reator N.

Figura 20: Análise da estrutura da comunidade séssil dos reatores (N e C) utilizando

iniciadores para o gene que codifica o RNAr 16S através de eletroforese em gel de

gradiente desnaturante (DGGE) e seus respectivos dendrogramas (construídos pelo

método UPGMA e utilizando o coeficiente de Pearson). Os perfis foram gerados a partir

do experimento E1(a) e E2 (b). Foram utilizadas amostras em duplicata (A e B) de cada

tempo de amostragem dos experimentos, sendo eles: 2 dias (t1) e 5 dias (t2) para o

experimento E1 (a); e 12 dias (t1) e 45 dias (t2) para o experimento E2 (b). As setas

pretas indicam a presença da banda B1 (98% de similaridade com Marinobacter sp.)

nos perfis do reator N antes da injeção do nitrato nesse sistema. Os reatores controle e

com o tratamento do nitrato estão representados no gel, respectivamente, pelas letras C

e N.

Quando os dendrogramas gerados a partir dos experimentos E1 e E2 foram

comparados entre si (Figura 21), pode ser observada a formação de dois grupos em 57%

de similaridade. Esses resultados indicam que o tempo de experimento foi um fator

importante para o desenvolvimento da comunidade bacteriana dos biofilmes. Também

foi possível observar que uma banda era comum a todos os perfis dos experimentos E1

e E2. Essa banda (denominada de B2) foi extraída do gel, clonada e os clones foram

seqüenciados com sucesso. As seqüências obtidas apresentaram 99% de similaridade

com Achromobacter xylosoxidans.

Figura 21: Análise da estrutura da comunidade séssil dos reatores (N e C) utilizando

iniciadores para o gene que codifica o RNAr 16S através de eletroforese em gel de

gradiente desnaturante (DGGE) e seu respectivo dendrograma (construído pelo método

UPGMA e utilizando o coeficiente de Pearson). Os perfis foram gerados a partir dos

experimentos E1 e E2. Foram utilizadas amostras em duplicata (A e B) de cada tempo

de amostragem dos experimentos, sendo eles: 2 dias (t1) e 5 dias (t2) para o

experimento E1; e 12 dias (t1) e 45 dias (t2) para o experimento E2. A seta preta indica

a presença da banda B2 (99% de similaridade com Achromobacter xylosoxidans) em

todos os perfis analisados dos experimentos E1 e E2. Os reatores controle e com o

tratamento do nitrato estão representados no gel, respectivamente, pelas letras C e N.

No DGGE do experimento E3 (Figura 22), foi possível observar a presença de

várias bandas no gel em todas as amostras analisadas. Além disso, foram verificadas

alterações na intensidade das bandas dos perfis gerados a partir da comunidade do reator

N antes (t1) e após a introdução do nitrato (t2). Já nos perfis oriundos do reator C, não

foi possível verificar grandes alterações na estrutura da comunidade com o passar do

tempo. No dendrograma construído a partir do gel de E3 (Figura 22), foi possível

observar que as amostras do reator N após o início da injeção contínua do nitrato (t2) se

separaram das demais amostras formando dois grupos em 64% de similaridade . As

demais amostras, com exceção de uma amostra do reator C (t2) que se separou do grupo

em 72% de similaridade, se dividiram novamente em dois grupos com 82% de

similaridade. Assim, os resultados sugerem que a estrutura da comunidade do biofilme

maduro sofreu alterações com a injeção contínua do nitrato no reator N.

Figura 22: Análise da estrutura da comunidade séssil dos reatores (N e C) utilizando

iniciadores para o gene que codifica o RNAr 16S através de eletroforese em gel de

gradiente desnaturante (DGGE) e seu respectivo dendrograma (construído pelo método

UPGMA e utilizando o coeficiente de Pearson). Os perfis foram gerados a partir do

experimento E3. Foram utilizadas amostras em duplicata (A e B) de cada tempo de

amostragem, sendo eles: 40 dias (t1) e 80 dias (t2) do experimento E3. Os reatores

controle e com o tratamento do nitrato estão representados no gel, respectivamente,

pelas letras C e N.

VI. Discussão

Os microrganismos têm um importante papel na transformação do enxofre. As

bactérias redutoras de sulfato (BRS), que estão diretamente envolvidas no ciclo do

enxofre, são microrganismos geralmente anaeróbios amplamente distribuídos em

habitats anóxicos onde esses utilizam o sulfato como aceptor final de elétrons para a

degradação de compostos orgânicos, resultando na geração do sulfeto. As BRS são

comumente encontradas nos reservatórios de óleo formando biofilmes, envolvidas pelo

polímero de EPS e protegidas da ação de inibidores. O fluxo de água dentro de um

reservatório, que é determinante para a formação de um biofilme, se caracteriza como

um processo semi-contínuo, onde as características hidrodinâmicas e o transporte de

partículas diferem de sistemas em batelada. Dessa forma, uma simulação mais próxima

da realidade do ambiente de um reservatório requer uma comunidade microbiana

representativa crescendo em biofilmes dentro de um sistema contínuo em biorreatores

(HUBERT et al., 2003).

Em nosso estudo, foram realizados três experimentos com os reatores (N e C)

sendo eles: E1 (com 5 dias de duração), E2 (com 45 dias de duração) e E3 (com 80 dias

de duração). O experimento E3 foi o único que apresentou a formação do precipitado

negro de sulfeto de ferro (FeS) antes da introdução do nitrato (40 dias de experimento)

em ambos os reatores (Figura 12). O FeS é um indicador da presença de BRS e de

sulfeto de hidrogênio em um ambiente com ferro. Esse composto é gerado a partir da

reação do sulfeto de hidrogênio (H

S - gerado a partir da reação de redução do sulfato)

com o íon ferro liberado da superfície do metal. Além disso, durante a fase inicial do

experimento (nos 40 dias iniciais), mais dois indícios da presença de BRS foram

notados: o cheiro de H

S e o pH do mosto em torno de 7,6 em ambos os reatores. Já foi

descrito na literatura que as BRS preferem o pH neutro entre 6 e 8 para se

desenvolverem (HAO et al., 1996; WIDDEL, 1988). O reator controle (C) apresentou

as mesmas características até o fim do experimento E3 (80 dias) mantendo o pH neutro,

o cheiro característico de H

S e a presença do precipitado negro (FeS). Entretanto,

alterações interessantes puderam ser notadas no reator N após a introdução do nitrato

como: o desaparecimento do precipitado negro (FeS) e uma alcalinização do mosto (pH

8.7). Esses resultados sugerem uma provável atenuação da produção do H

S nesse

sistema, com a introdução do nitrato. Entretanto, com apenas esse resultado não

podemos afirmar que houve uma eliminação das bactérias redutoras de sulfato (BRS)

devido ao fato de que alguns mecanismos do nitrato para minimização da acidulação

não levam necessariamente ao desaparecimento das BRS (Figura 8). DALSGAARD &

BAK (1994) descreveram uma BRS da espécie Desulfovibrio desulfuricans que é capaz

de reduzir o nitrato a amônia na ausência de sulfeto e em baixas concentrações de

sulfato. LARSEN, ROD & ZWOLLE (2004) descreveram em seus experimentos uma

redução na acidulação de um reservatório após a injeção do nitrato e isolaram uma BRS

que foi capaz de reduzir nitrato em um ambiente com altas concentrações de sulfato.

No experimento E1, não foi possível observar alterações no mosto e acreditamos

que o tempo de 5 dias de experimento não tenha sido suficiente para o estabelecimento

de uma comunidade bacteriana séssil, ou seja, de um biofilme maduro na superfície dos

cupons. HUBERT e colaboradores (2003) observaram em biorreatores contendo água

de produção de Coleville (Canadá) que a biogênese do sulfeto começou depois de 7 a 10

dias da fase lag do crescimento bacteriano. Além disso, nesse mesmo trabalho, a

redução completa do sulfato só foi observada após 2 a 3 semanas de experimento. Um

outro estudo feito por HUBERT e colaboradores (2005) também em reatores com água

de produção mostrou novamente que a produção do sulfeto ocorreu somente depois de

23 dias de experimento. Já no experimento E2 (Figura 11), foi possível observar

alterações na turbidez do mosto, entretanto não foi verificada a formação do precipitado

negro (FeS) durante os 45 dias de experimento.

As contagens de células totais dos biofilmes aderidas aos cupons foram

realizadas somente com as amostras do experimento E2 e E3. Não foi possível realizar

as contagens das amostras do experimento E1. Nas contagens do experimento E2

(Figura 13a), podemos observar que houve um crescimento da população de ambos os

reatores (N e C) ao final do experimento. Os dados gerados no experimento E3 (Figura

13b) mostram que, após a injeção do nitrato, houve um aumento nas contagens do

reator N enquanto que a população do reator C parece ter permanecido estável. O

aumento da população do reator N após a injeção do nitrato em relação ao reator C já

era esperado, pois a redução do nitrato fornece aproximadamente três vezes mais

energia para a bactéria do que a redução do sulfato (HUBERT et al., 2004). Entretanto,

as contagens do reator C indicam que essa população pode estar provavelmente

entrando na fase estacionária do crescimento celular. Essa inibição do crescimento no

reator C pode ser explicada pelo fato do sulfeto livre ser tóxico para todas as bactérias e

exercer um efeito negativo nas células ao precipitar com metais traço formando sulfetos

de metal como o FeS (KOSCHORRECK, 2008). A presença do FeS no reator controle

foi detectada até o final dos 80 dias do experimento E3. Dessa forma, os resultados

sugerem que pode estar havendo uma diminuição do número de células em resposta a

toxidade do FeS.

Utilizando a técnica do número mais provável para a quantificação de BRS, não

foi possível observar o crescimento dessas bactérias na suspensão do meio de cultura

nos experimentos E1 e E2. Esses resultados já eram esperados, pois como já foi visto

anteriormente, não houve indicações fortes da presença dessas bactérias nos reatores

durante os experimentos E1 e E2. Dessa forma, somente durante o experimento E3, o

crescimento das BRS pode ser observado através da redução do meio de cultura e da

formação do FeS. Esses resultados também já eram esperados devido à presença do

precipitado negro (FeS), pH neutro e ao mal cheiro provocado pelo H

S durante o

experimento E3. Antes da injeção do nitrato, as contagens do NMP de BRS mostraram-

se semelhantes entre os reatores, o que era também esperado já que os reatores

encontravam-se sob as mesmas condições experimentais até aquele momento. Após a

injeção do nitrato, houve uma redução do NMP de células viáveis de BRS no reator N.

SUNDE e colaboradores (2004) observaram que após o tratamento de uma água de

injeção com nitrato houve uma redução no número e na atividade das BRS. HUBERT e

colaboradores (2004) também observaram inibição de BRS em água de produção após a

injeção do nitrato.

Quando os resultados do NMP de BRS viáveis do reator N são comparados com

os resultados das contagens de células totais desse mesmo reator no experimento E3, é

possível observar que a injeção do nitrato levou a um aumento da população séssil total

e a uma redução da população de BRS nesse reator. Esses resultados sugerem que a

introdução do nitrato no reator N esteja favorecendo o crescimento da população total e

beneficiando alguns grupos bacterianos em detrimento das BRS. Já no reator C, houve

um crescimento da população viável de BRS enquanto a população séssil total

permaneceu estável. Este fato indica que as condições do reator C estejam beneficiando

especificamente o grupo das BRS.

As análises da superfície dos cupons dos reatores para observação da formação

de biofilme foram realizadas por MEV. Os cupons referentes ao primeiro tempo do

experimento E2 (12 dias) foram processados através do aparelho CPD (aparelho do

Ponto Crítico). Os resultados (Figura 15) mostram a adesão irreversível de células nos

cupons de ambos os reatores (N e C). Entretanto, através desse método, não foi possível

observar a estrutura tridimensional do biofilme nessas amostras. Já nas amostras dos

experimentos E2 (45 dias) e E3 (80 dias), processadas através do solvente HMDS para

MEV, foi possível a observação da estrutura tridimensional intacta do biofilme (Figura

16b e d). Alguns autores já haviam descrito melhores resultados com a utilização de

solventes químicos para remoção de líquidos de tecidos de animais e plantas ao invés do

CPD (BRAY, BAGU & KOEGLER, 1993; KENNEDY, WILLIAMS & GRAY, 1989;

NATION, 1983). ARAÚJO e colaboradores (2003) concluíram que o solvente HMDS

seria o mais adequado para tratar células procarióticas de um biofilme anaeróbio

proveniente de biorreatores para serem observadas por MEV. Outro estudo em células

endoteliais hepáticas também obteve bons resultados ao tratar as células com HMDS e

em seguida observa-las utilizando o MEV (BRAET, DE ZANGER & WISSE, 1997).

Dessa forma, os resultados de nosso estudo sugerem que o solvente HMDS foi mais

eficiente na conservação das amostras de biofilme dos reatores do que o aparelho CPD,

permitindo a visualização do biofilme maduro com 45 dias (E2) e com 80 dias (E3) em

ambos os reatores.

Para avaliar a corrosão da superfície metálica, os cupons com as superfícies

raspadas foram observados por MEV ao final do experimento E2 (45 dias) e do

experimento E3 (80 dias). Cupons “branco”, que não fizeram parte dos experimentos

com os reatores, foram utilizados como parâmetro de comparação. Como pode ser

observado na Figura 17, os cupons provenientes do reator C do experimento E2

apresentaram em sua superfície pequenos pites que não foram observados na superfície

dos cupons “branco”. Nesse mesmo experimento, a superfície dos cupons oriundos do

reator N apresentou uma maior corrosão por pites em relação aos cupons do reator C. O

mesmo ocorreu no experimento E3 (Figura 18), onde os cupons do reator N

apresentaram uma corrosão mais severa com muitos pites em sua superfície em relação

aos cupons do reator C com 80 dias. Nossos resultados sugerem, portanto, que a injeção

do nitrato aumentou a corrosão da superfície dos cupons presentes no reator N em

ambos os experimentos.

Alguns trabalhos descritos na literatura apresentaram resultados semelhantes aos

resultados gerados em nosso estudo. NEMATI, JENNEMAM & VOORDOUW (2001)

observaram um aumento expressivo na corrosão dos cupons de aço-carbono, conforme

as concentrações de nitrato eram aumentadas em seus reatores contendo um consórcio

enriquecido de água de produção. HUBERT e colaboradores (2005) observaram que a

injeção do nitrato levou a uma corrosão por pites (buracos) nos cupons de seus reatores.

Em um outro trabalho, HUBERT e colaboradores (2004) mostraram em seu estudo com

reatores contendo um consórcio enriquecido de água de produção que a injeção do

nitrato pode levar a um aumento na corrosão ou, ao contrário, não apresentar efeito

algum sobre essa. Entretanto, existem alguns estudos em que o nitrato foi eficiente no

controle da corrosão (LARSEN, ROD & ZWOLLE, 2004; SUNDE et al., 2004)

Os resultados obtidos através da avaliação da perda de massa dos cupons

confirmam as análises realizadas na superfície dos cupons por MEV. Em todos os

experimentos (E1, E2 e E3), a perda de massa se mostrou significativamente mais

acentuada nos cupons oriundos do reator N (Figura 17). Nessas análises, o início da

injeção do nitrato parece ter levado a uma aceleração na perda de massa dos cupons. Os

cupons provenientes do reator N do experimento E3 foram os que apresentaram a maior

perda de massa (mais de 2% de perda de massa) e a corrosão mais severa em sua

superfície. Esses resultados indicam que a corrosão dos cupons é proporcional ao tempo

de injeção do nitrato. A introdução do nitrato em um ambiente anaeróbio pode levar ao

aparecimento de grupos bacterianos como bactérias redutoras de nitrato (BRN) e

bactérias redutoras de nitrato e oxidantes de sulfeto (BRN-OS). As BRN-OS reduzem o

nitrato a N

e amônia enquanto oxidam o sulfeto a sulfato (Figura 8). Durante essas

reações químicas, pode ocorrer a formação de espécies agressivas de enxofre como o

polissulfeto, o S

(aq)

e o tiossulfato. O tiossulfato e o polissulfeto estão entre as espécies

de enxofre mais corrosivas e catalisam a formação de pites (buracos) em superfícies

metálicas (WEBSTER & NEWMAN, 1994). Assim, nossos resultados sugerem que o

nitrato pode estar promovendo uma possível seleção de bactérias que, em seu

metabolismo, geram metabólitos secundários extremamente corrosivos.

A formação de biofilmes em superfícies metálicas pode inibir ou acelerar o

processo de corrosão. O biofilme pode levar ao aparecimento de zonas de aeração

diferencial na superfície do metal formando áreas anódicas e catódicas nessa superfície,

corrente de elétrons e biocorrosão (Figura 7). Entretanto, a matriz do biofilme também

pode servir como uma proteção, formando uma barreira, que pode prevenir a penetração

de agentes corrosivos como o oxigênio e diminuir o contato desses agentes com a

superfície do metal e, dessa forma, reduzir a corrosão (ZUO, 2007). GAYLARD &

VIDELA (1987) observaram que as BRS, quando em pH apropriado, podem proteger o

metal através da formação de camadas passivadoras de sulfeto sob a superfície.

WERNER e colaboradores (1998) observaram que as BRS tiveram um menor efeito na

formação de pites do que o esperado de acordo com os altos níveis de sulfeto

produzidos por essas bactérias em seu estudo. Em nosso estudo, o reator C apresentou

ao final do experimento E3 um aumento do NMP de BRS viáveis, formação de biofilme

maduro e uma corrosão menor do que as do reator N.

Utilizando-se iniciadores específicos para o gene que codifica a enzima APS

redutase nas BRS, foi possível obter o produto de tamanho esperado em ambos os

reatores (C e N) em todas as amostras do experimento E3. Dessa forma, foi possível

detectar a presença das BRS por meio de PCR antes e após o início da injeção contínua

do nitrato no reator N. Alguns mecanismos do nitrato para o controle da acidulação não

levam necessariamente a uma total inibição das BRS (Figura 8). Algumas dessas

bactérias podem passar a reduzir o nitrato ao invés do sulfeto ou ainda se beneficiar do

aparecimento das BRN-OS (bactérias redutoras de nitrato e oxidantes de sulfeto) que

tem seu metabolismo integrado aos das BRS. LOMAS e colaboradores (2007)

detectaram BRS em seus reatores de águas residuais de esgoto até 60 dias após o início

do tratamento com nitrato através de PCR. JURELEVICIUS e colaboradores (2008),

utilizando o mesmo par de iniciadores que nesse estudo, também detectaram BRS em

água produzida após dois meses de injeções repetitivas de nitrato. Dessa forma, através

de PCR, um método qualitativo muito sensível, foi possível detectar a presença de BRS

mesmo após 40 dias de injeção de nitrato no reator N. Assim como na técnica de

número mais provável (NMP), não foi detectada a presença de BRS através de PCR nos

experimentos E1 e E2.

Os perfis gerados através das técnicas de PCR e DGGE obtidos através de

iniciadores baseados no gene que codifica o RNAr 16S freqüentemente geram padrões

complexos que refletem a composição das populações dominantes incluindo os

microrganismos não cultiváveis (LAPARA et al., 2000). Entretanto, os resultados

gerados pela utilização dessas duas técnicas em conjunto devem ser interpretados com

muita cautela, já que erros podem ocorrer em todas as etapas moleculares envolvidas

(extração de DNA do solo, amplificação por PCR e DGGE) (HEUER & SMALLA,

1997; MUYZER & SMALLA, 1998). A técnica de DGGE tem sido utilizada para o

estudo de diversidade microbiana ambiental e para verificar alterações na abundância

relativa de populações (MUYZER, 1999) em sistemas complexos como biorreatores

anaeróbios (CONNAUGHTON, COLLINS & O’FLAHERTY, 2006; LIU, CHAN &

FANG, 2002; MIURA et al., 2007; ROEST et al., 2005). Todavia, são poucos os

trabalhos encontrados na literatura que fazem uma análise polifásica de reatores

utilizando técnicas dependentes de cultivo e DGGE, como em nosso trabalho.

Os perfis de DGGE gerados nesse estudo durante os três experimentos (E1, E2 e

E3) não mostraram grandes alterações na estrutura da comunidade dos biofilmes. A

comunidade bacteriana dos reatores se estabeleceu com 12 dias (Figura 20b) e a partir

desse momento não houve grandes alterações nessa estrutura. Entretanto, nos perfis do

DGGE onde o nitrato foi introduzido ocorreram mudanças na intensidade de bandas

(Figura 20b e 22). Essas mudanças puderam ser observadas principalmente nos

experimentos E2 e E3 tanto no DGGE quanto no dendrograma gerado a partir do gel

(Figura 22). JURELEVICIUS e colaboradores (2008) observaram que os perfis de

DGGE se mantiveram estáveis durante 2 meses de injeções repetitivas de nitrato em um

tanque contendo água de produção. Nesse trabalho também foi observada uma mudança

na intensidade e/ou desaparecimento de algumas bandas em momentos específicos do

experimento. Nossos resultados sugerem que a introdução do nitrato pode estar

favorecendo certos grupos bacterianos presentes no biofilme formado a partir da água

de produção. Além disso, o fator tempo parece ter sido prioritário para essas alterações

causadas na comunidade bacteriana do biofilme, já que no experimento E1 não foi

possível observar nenhuma alteração na estrutura da comunidade.

As bandas B1 e B2 extraídas do gel do experimento E2 tiveram, respectivamente,

98% de similaridade com Marinobacter sp. e 99% de similaridade com Achromobacter

xylosoxidans. Membros do gênero Marinobacter já foram isolados de ambientes

marinhos, solos salinos e de fontes termais, sendo considerados microrganismos

halofílicos e redutores de nitrato (YOON et al., 2004). A espécie Achromobacter

xylosoxidans também é encontrada em ambientes aquáticos, são halofílicas e redutoras

de nitrato (COENYE et al., 2003). Ambas espécies já foram detectadas em amostras de

água de injeção (KORENBLUM et al., 2010), de óleo cru (SETTE et al., 2007) e em

nosso trabalho essas bactérias estão presentes em água de produção. Esses resultados

sugerem que essas bactérias estão provavelmente presentes em todas as etapas da

recuperação secundária do óleo, sendo introduzidas em um reservatório com a água de

injeção e recuperadas com o óleo e a água de produção.

Nos perfis de DGGE do experimento E2 (Figura 20b), a banda B1 aparece nas

amostras do reator N antes da introdução do nitrato e praticamente desaparece nas

amostras do reator N após a injeção do nitrato (t2). Já a banda B2 (Figura 21) estava

presente em todos os perfis analisados (experimento E1 e E2) de ambos os reatores,

independente da introdução do nitrato ou não. Esses resultados sugerem que a

introdução do nitrato no ambiente do biorreator pode ter levado a uma maior

competição entre as espécies que são capazes de reduzi-lo. Dessa forma, a espécie mais

adaptada se estabeleceu nos reatores, ocorrendo uma possível seleção dentro do grupo

das BRN (bactérias redutoras de nitrato). Alguns trabalhos na literatura também

descrevem a seleção de BRN. LOMAS e colaboradores (2007) observaram em seus

reatores de águas residuais, através de DGGE, que a injeção do nitrato levou à seleção

de populações de BRN-OS (bactérias redutoras de nitrato e oxidantes de sulfeto).

NEMATI, JENNEMAM & VOORDOUW (2001) e NEMATI e colaboradores (2005)

obtiveram resultados semelhantes, após a injeção de nitrato em reatores com consórcios

enriquecidos de água de produção, através de RSGP (Reverse Sample Genome Probe).

Os resultados apresentados em nosso estudo sugerem que o nitrato inibiu a

formação do FeS e reduziu o número de BRS viáveis, alterando a estrutura da

comunidade com a possível seleção de bactérias capazes de reduzir o nitrato. Entretanto,

a introdução do nitrato levou a um aumento da biocorrosão dos cupons. Assim,

acreditamos que nosso trabalho contribuiu com resultados interessantes para o estudo e

controle de biofilmes nas indústrias petrolíferas que são as maiores prejudicadas pela

corrosão microbiana (CIM) e pela produção de sulfeto de hidrogênio pelas BRS.

VII. Conclusões

Avaliando os resultados obtidos através dos três experimentos com os reatores

(E1, E2 e E3) foi possível concluir que:

• A injeção contínua do nitrato no experimento E3 levou ao desaparecimento do

FeS e alcalinização do pH sugerindo uma diminuição na produção do H

S pelas

BRS no reator N. Essas alterações não foram observadas no reator C desse

mesmo experimento;.

• A injeção do nitrato levou a um aumento da população séssil total e a uma

redução da população de BRS viáveis no reator N do experimento E3, indicando

um possível incremento da população total e de alguns grupos bacterianos em

detrimento das BRS.

• A biocorrosão dos cupons foi acelerada em todos os experimentos a partir da

introdução do nitrato, com o aumento da corrosão por pites e da perda de massa

do metal proporcionais ao tempo de injeção desse composto;

• O nitrato provocou uma mudança na intensidade de bandas nos géis de DGGE

provenientes dos experimentos E2 e E3, resultando em uma alteração na

estrutura da comunidade e uma provável seleção de alguns grupos bacterianos

com o passar do tempo;

• O seqüenciamento das bandas B1 e B2 indicaram a presença de BRN nos

reatores antes e/ou após a injeção do nitrato no experimento E2.

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