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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
Soroprevalência de tristeza parasitária em bezerros na região de
Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil
Hébelys Ibiapina da Trindade
Dissertação apresentada para obtenção do
título de Mestre, junto ao Programa de Pós-
graduação em Ciência Animal Tropical da
Universidade Federal do Tocantins.
Área de Concentração: Produção Animal
ARAGUAÍNA
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
Soroprevalência de tristeza parasitária em bezerros na região de Araguaína, Estado
do Tocantins, Brasil
Hébelys Ibiapina da Trindade
Dissertação apresentada para obtenção do
título de Mestre, junto ao Programa de Pós-
graduação em Ciência Animal Tropical da
Universidade Federal do Tocantins.
Área de Concentração: Produção Animal
Linha de pesquisa: Patologia Animal aplicada à
Parasitologia
Orientador(a): Prof
a
. Dra. Katyane de Sousa
Almeida
ARAGUAÍNA
2010
4
T833s
Trindade, Hébelys Ibiapina da
Soroprevalência de tristeza parasitária em bezerros na região de
Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. / Hébelys Ibiapina da Trindade. --
Araguaina: [s.n.], 2010.
71 f.: il.
Orientador: Profª. Dra. Katyane de Sousa Almeida
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal Tropical) - Universidade
Federal do Tocantins, 2010.
1. Bezerros. 2. Anaplasma marginale. 3. Babesia bovis. 4. Babesia
bigemina. I. Título
CDD 636.3
5
SOROPREVALÊNCIA DE TRISTEZA PARASITÁRIA EM BEZERROS NA REGIÃO
DE ARAGUAÍNA, ESTADO DO TOCANTINS, BRASIL
HÉBELYS IBIAPINA DA TRINDADE
Dissertação aprovada como requisito
parcial para a obtenção do título de
Mestre, tendo sido julgado pela Banca
Examinadora formada pelos professores:
_____________________________________________________________
Presidente: Profª Dra. Katyane de Sousa Freitas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Fagner Luiz da Costa Freitas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
____________________________________________________________
Prof. Dr. Giovanny Rebouças Pinto
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
Araguaína, 24 de Fevereiro de 2010
6
À Deus, meu Pai e amigo nas minhas alegrias
e tristezas, minha eterna gratidão!!!!! Aos meus
pais Valdeni e Zeneide, e minha irmã Hylka
pelo amor e apoio, sem vocês não teria
conseguido!!!!! Aos meus amigos, Fagner e
Katyane, pelas longas conversas e risadas!!!!
A minha orientadora Profª Dra. Katyane pela
dedicação e carinho demonstradas nos
momentos mais difíceis. Aos meus amigos de
longas datas e aos novos amigos do mestrado,
vocês são muito importantes na minha vida!!!!!
7
AGRADECIMENTOS
À Deus pela presença constante em minha vida.
Meus Pais Valdeni e Zeneide, pelo exemplo de vida, amo vocês!
Minha irmã Hylka, pelo carinho e cuidados sempre dedicados a mim, te amo!
A Fátima, amiga para todas as horas, você é tudo de bom em minha vida.
A minha avó Iracy, pelo apoio e carinho. Aos avôs Tico, Onezi e Dico (In
memorian) que onde estiverem estão me iluminando nessa caminhada.
A toda minha família pelo apoio e carinho dedicados a mim.
A Profª. Dra. Katyane de Sousa Almeida pela amizade, cumplicidade e
orientação, nesta etapa tão importante da minha vida. Gostaria de ratificar sua
competência, sabedoria e empenho durante todo este trabalho.
Ao Prof. Dr. Fagner Luiz da Costa Freitas pela amizade, cumplicidade e
conselhos, obrigada por aceitar participar da minha banca.
A Profª Dra. Rosângela Zacarias Machado pela oportunidade de realizar a
segunda etapa deste trabalho, além de aceitar participar desse grande momento da
minha vida.
Ao Prof. Dr. Giovanny Rebouças Pinto por aceitar participar da formação da
banca, obrigada pela disponibilidade.
Ao Prof. Dr. Severino Vicente Silva pelos incentivos e apoio nessa nova
jornada.
A Profª Dra. Tânia Vasconcelos Cavalcante por tudo.
Aos meus queridos amigos e irmãos da UFPI: Agrícola Neto, Elizângela e
Maria Christina, pela força dada sempre na hora certa. Aos amigos de Codó, todos
moram no meu coração.
Aos amigos Lidiane, Gina Kathaline, Antonio Júnior e Bruna sem o apoio de
vocês não teria chegado aqui.
Aos novos amigos do mestrado da UFT, essa turma sempre será uma
família: Ernestina, Joana Patrícia, Josemara, Thássia, Kedma Nayra, Carla, Obede,
Iberê, Raylon, Wagner, Daiene, Suzana. E todos que direto e indiretamente
participaram da minha vida aqui em Araguaína, sou uma pessoa muito feliz por Deus
ter sempre enviado almas grandiosas, que se tornaram grandes amigos que sempre
iram morar no meu coração. Muito obrigado!
8
Ao amigo Gleisom Ribeiro pela ajuda e disponibilidade, que foi fundamental
para a realização deste trabalho.
A secretária da Pós-graduação Eline de Sousa Costa sempre atenciosa e
disposta a ajudar.
A todos os funcionários da UFT, que direto ou indiretamente ajudaram nesse
trabalho, em especial aos técnicos de laboratório: Paulo, Cristiane, Evanês,
Carmem, Leyde, que sempre me ajudaram.
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal
Tropical, pelos ensinamentos.
Muito obrigada!!!
9
BIOGRAFIA DA AUTORA
HÉBELYS IBIAPINA DA TRINDADE, filha de Zeneide Maria Ibiapina da Trindade e
Valdeni Lins da Trindade, nascida em Teresina, Estado do Piauí, em 28 de agosto
de 1978. Em 1996, concluiu o Ensino Médio, no Colégio Decisão, ingressando no
ano de 1998 no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí –
UFPI, onde obteve o grau de Bacharel em Medicina Veterinária, em março de 2004.
Realizou pós-graduação (latu-senso) em Saúde Pública na Universidade Federal do
Piauí em 2007. No mesmo ano, foi professora substituta na área de Zootecnia, no
Instituto Federal do Maranhão (IFMA) campus de Codó-MA. Em junho de 2008,
iniciou o curso de Mestrado no Programa de Pós-graduação em Ciência Animal
Tropical na área de concentração em Produção Animal na Escola de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal do Tocantins-UFT, tornando-se
bolsista CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior)
em dezembro de 2008.
10
“O valor das coisas não está no tempo em que elas
duram, mas na intensidade com que acontecem.
Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas
inexplicáveis e pessoas incomparáveis”
Fernando Pessoa
11
SUMÁRIO
RESUMO...................................................................................................... 13
ABSTRACT .................................................................................................. 14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ....................................................... 15
CAPITULO I
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................... 18
2.1 Tristeza Parasitária Bovina ..................................................................... 18
2.1.1 Babesiose bovina ................................................................................ 19
2.1.1.1 Histórico ........................................................................................... 19
2.1.1.2 Agentes etiológicos .......................................................................... 19
2.1.1.3 Biologia parasitária ........................................................................... 20
2.1.1.4 Epidemiologia ................................................................................... 21
2.1.1.5 Imunologia ........................................................................................ 22
2.1.1.6 Patogenia ......................................................................................... 23
2.1.1.7 Sinais clínicos e achados de necropsia ............................................ 24
2.1.2 Anaplasmose bovina ........................................................................... 25
2.1.2.1 Histórico ........................................................................................... 25
2.1.2.2 Agente etiológico .............................................................................. 25
2.1.2.3 Biologia parasitária ........................................................................... 26
2.1.2.4 Epidemiologia ................................................................................... 27
2.1.2.5 Patogenia ......................................................................................... 28
2.1.2.6 Sinais clínicos e achados de necropsia ............................................ 29
2.1.3 Diagnóstico .......................................................................................... 29
2.1.4 Tratamento .......................................................................................... 31
2.1.5 Controle ............................................................................................... 31
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 34
CAPITULO II
Soroprevalência de Babesia bovis e Babesia bigemina em bezerros na
região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil ....................................... 42
RESUMO...................................................................................................... 43
ABSTRACT .................................................................................................. 44
12
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 45
2 MATERIAL E MÉTODO ............................................................................ 46
2.1 Área de estudo ....................................................................................... 46
2.2 Amostragem dos soros .......................................................................... 46
2.3 Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto .............................................. 47
2.4 Análise estatística .................................................................................. 48
3 RESULTADO ............................................................................................ 48
4 DISCUSSÃO ............................................................................................. 50
5 CONCLUSÃO ............................................................................................ 53
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 53
CAPITULO III
Soroprevalência de anaplasmose bovina na região de Araguaína, Estado do
Tocantins, Brasil ........................................................................................... 58
RESUMO...................................................................................................... 59
ABSTRACT .................................................................................................. 60
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 61
2 MATERIAL E MÉTODO ............................................................................ 62
2.1 Área de estudo ....................................................................................... 62
2.2 Amostragem dos soros .......................................................................... 62
2.3 Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto .............................................. 63
2.4 Análise estatística .................................................................................. 64
3 RESULTADO ............................................................................................ 64
4 DISCUSSÃO ............................................................................................. 66
5 CONCLUSÃO ............................................................................................ 68
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 68
13
RESUMO
Soroprevalência da tristeza parasitária bovina em bezerros na região de
Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil
A tristeza parasitária bovina pode ser causada pelos agentes Anaplasma marginale,
Babesia bovis e Babesia bigemina, ocasionando perdas econômicas significativas
no rebanho. Devido à importância da enfermidade e a escassez de dados sobre a
epidemiologia da tristeza parasitária bovina na região de Araguaína-Tocantins a
pesquisa teve por objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos anti-A.
marginale, anti-B. bovis e anti-B. bigemina na referida região. Foram coletadas 506
amostras de sangue de bezerros com faixa etária compreendida entre oito e 24
meses, fêmeas e machos, obtendo-se 10 mL de sangue, assepticamente, por
punção da veia coccígena, sendo centrifugado para separação do soro e
armazenado a -20ºC até o momento da realização do teste sorológico. A
determinação dos anticorpos anti-B. bovis, anti-B. bigemina e anti-A. marginale foi
realizada por meio do ensaio imunoenzimático de adsorção indireto e como análise
estatística utilizou-se o Qui-Quadrado (χ
2
) com correção de Yates, para distribuição
da prevalência das enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção.
Para verificação se o sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi
calculado a Odds ratio (OR). Todas as análises estatísticas foram realizadas
utilizando o programa estatístico Graphpad Prism. 5 – Windows (2009), com
intervalo de confiança de 95%. A infecção por B. bovis (OR=1,703) e por B.
bigemina (OR=0,5689) não foi verificado influência do sexo, porém para a infecção
por A. marginale (OR=2,040) o sexo funcionou como um fator de proteção para as
fêmeas. As soroprevalências obtidas foram de 89,9%, 90,5% e 91,7%, para A.
marginale, B. bigemina e B. bovis, respectivamente, caracterizando a região como
de estabilidade enzoótica para as três espécies analisadas, oferecendo risco diante
da introdução de animais suscetíveis procedentes de áreas livres ou de
instabilidade.
Palavras-chave: Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Babesia bovis, bezerros.
14
ABSTRACT
Seroprevalence of calves “tristeza parasitária” in the region of Araguaina, State
of Tocantins, Brazil
The tick-borne disease (known as ‘Tristeza Parasitária’ in Brazil) can be caused by
the folowing agents: Anaplasma marginale, Babesia bovis and Babesia bigemina,
causing significant economic losses in the cattle. Due the diseases importance and
the lack of data on the epidemiology of tick-borne disease in the region of Araguaina,
Tocantins this research aimed at determining the prevalence of anti-A. marginale and
anti-B. bovis and anti-B. bigemina antibodies in calves from this region. We collected
506 blood samples from calves, from 8 to 24 months-old, females and males, the 10
mL blood samples were aseptically collected by puncture of the coccygeal vein, and
centrifuged to separate the serum, then stored at -20°C until the serological test. The
determination of anti-B. bovis, anti-B. bigemina and anti-A. marginale was made
using indirect Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. Statistical analysis between
the variables was obtained through the statistical test Chi-square (χ
2
) with Yates
correction, for distribution of the prevalence of disease by age group was not applied
this correction. To check if the sex was considered a risk factor or protection, we
calculated odds ratio (OR). All statistical analyzes were performed using the
statistical program Graphpad Prism. 5 - Windows (2009), with 95% a confidence
interval. Infection with B. bovis (OR = 1.703) and B. bigemina (OR = 0.5689) was not
observed influence of sex, but to infection by A. marginale (OR = 2.040) sex work as
a protective factor for females. The seroprevalence obtained was 89.9%, 90.5% and
91.7% for A. marginale, B. bigemina and B. bovis, respectively, characterizing the
region as enzootic stability for the three species and offering risk during the
introduction of susceptible animals from free or unstable areas.
Keywords: Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Babesia bovis, calves.
15
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
cELISA Ensaio imunoenzimático de adsorção por competição
iELISA Ensaio imunoenzimático de adsorção indireto
IFI Reação de imunofluorescência indireta
FC Fixação de complemento
PCR Reação em cadeia de polimerase
TC Teste do cartão
TCR Teste de conglutinação rápida
16
1 INTRODUÇÃO
O Brasil destaca-se como um dos maiores produtores mundiais de
bovinos, tanto para corte como para leite. Essa posição deve-se ao empenho do
produtor que além de visar o lucro, está buscando a melhoria das condições de
manejo e alimentação dos animais, para que seu produto seja bem aceito no
mercado interno e, principalmente, no exterior. Com isso, houve uma grande
demanda na procura pela carne brasileira, com os produtores buscando novas
fronteiras para criação desses animais, como a região norte do país que tem se
destacado no desenvolvimento da bovinocultura de corte e leite.
O Tocantins, mesmo sendo um Estado brasileiro de formação recente (20
anos), tem se destacado pela produção de bovinos de corte. Em 2006, o rebanho
bovino brasileiro foi estimado em 199.555.359 cabeças, sendo que 32.479.944
cabeças se encontravam na região norte do país, apresentando 6.361.204 cabeças
no Estado do Tocantins (ANUALPEC, 2006), demonstrando seu potencial para a
exploração pecuária. O município de Araguaína, localizado ao norte do Estado,
possui uma economia baseada na pecuária extensiva, destacando-se como
segundo maior produtor de rebanho bovino desse Estado, sendo considerada a
capital do boi verde da região norte do Tocantins com a população de bovinos em
2008, segundo a Agência de Defesa Sanitária do Estado do Tocantins – ADAPEC
(2008), estimada em 1.035.413 cabeças.
Para economia do país e rendimento do produtor, é necessário reduzir as
perdas na criação de bovinos logo, qualquer enfermidade que comprometa a
produção animal tem importância, dentre estas enfermidades está à tristeza
parasitária bovina, causada por hemoparasitos das espécies Babesia bigemina,
Babesia bovis e Anaplasma marginale. Esses hemoparasitos causam grandes
prejuízos ao produtor, geralmente, por diminuir a produção de leite e/ou carne,
atraso no crescimento de bezerros, gasto com medicamentos, vacinações e
medidas preventivas, principalmente, quando se introduz animais de áreas livres em
áreas endêmicas.
Essa enfermidade tem distribuição mundial, principalmente, em regiões
de clima tropical e subtropical, fator esse que favorece o aparecimento de vetores. A
tristeza parasitária bovina se distribui em praticamente três áreas, sendo elas: (1)
áreas livres da doença onde não ocorre a presença de vetores; (2) áreas de
17
instabilidade enzoótica, onde pode ocorrer à multiplicação dos vetores em uma
determinada época do ano, pois se o clima for desfavorável, os vetores não se
multiplicam, porém quando passado esse extremo, o clima fica favorável ao
desenvolvimento dos vetores, assim podendo ocorrer à manifestação da doença; (3)
áreas de estabilidade enzoótica onde o clima é totalmente favorável a multiplicação
dos vetores, nessas áreas os animais desde o nascimento estão exposto aos
vetores e nesse caso, possuem imunidade recebida pelo colostro da mãe, ocorrendo
assim poucos casos de manifestação da doença em relação às demais áreas
(VIDOTTO; MARANA, 2001).
Animais de todas as idades são suscetíveis, tendo maiores
consequências em bezerros, porém animais adultos que ainda não tiveram contato
com os vetores, vindo de áreas livres ou de instabilidade, são mais afetados pelos
patógenos. É importante o desenvolvimento de pesquisas a respeito da prevalência
de enfermidades que acometem esses animais no Estado do Tocantins, pois
existem poucos estudos acerca da prevalência da babesiose e anaplasmose bovina
nesta região, sendo necessário um estudo epidemiológico para o estabelecimento
de medidas racionais de controle e prevenção que resultem em diminuição das
perdas econômicas ao produtor.
18
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1Tristeza Parasitária Bovina
A tristeza parasitária bovina é um complexo de doenças que compreende
duas enfermidades bem conhecidas: a babesiose, causada pelos protozoários
Babesia bigemina e Babesia bovis, e a anaplasmose causada pela Anaplasma
marginale (ALMEIDA et al., 2006; GUEDES JÚNIOR et al., 2008), responsáveis por
grandes prejuízos econômicos como mortalidade no rebanho, queda na produção de
leite, diminuição do ganho de peso, além de gastos com controle e profilaxia
(GONÇALVES, 2000; GRISI et al., 2002; BARROS et al., 2005).
A babesiose e a anaplasmose bovinas são hemoparasitoses transmitidas
biologicamente pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus (DALGLIESH;
STEWART, 1983; GUEDES JÚNIOR et al., 2008), sendo que a anaplasmose pode
ainda ser transmitida mecanicamente por dípteros hematófagos (GUGLIELMONE,
1995) e por fômites (SOUZA et al., 2000b).
Nos bovinos, a manifestação clínica da tristeza parasitária, causada por
Babesia spp. e A. marginale, está na dependência da presença do vetor,
caracterizando a região para condições de instabilidade e/ou estabilidade enzoótica,
do clima, do manejo dos animais, das condições fisiológicas do hospedeiro e da raça
(SOUZA et al., 2000ab).
Segundo Grisi et al. (2002), essa doença é responsável por problemas
econômicos, observados no aumento do coeficiente de mortalidade, principalmente,
em bezerros, bem como os efeitos negativos na produção animal, tendo como
resultado o decréscimo na produção de leite e no ganho de peso. Ainda pode
ocorrer um aumento considerável nos custos de produção, pela necessidade de
aplicação de inseticidas e acaricidas, bem como pela diminuição das taxas de
conversão alimentar e os índices de fertilidade (DUTRA, 2002).
19
2.1.1 Babesiose bovina
2.1.1.1 Histórico
Babes, em 1888, um pesquisador romeno, descobriu a presença de um
microrganismo no interior de eritrócitos de bovinos doentes na Romênia, que se
relacionava com a hemoglobinúria enzoótica bovina; acreditando se tratar de uma
bactéria, ele denominou esse microrganismo de Haematococcus bovis. Em 1893,
dois pesquisadores americanos, Smith e Kilborne, associaram uma enfermidade
ocorrida nos Estados Unidos chamada de “Febre do Texas” a hemoglobinúria
enzoótica bovina, classificando o agente causador como um protozoário o qual
denominaram de Pyrosoma bigemina pelo seu formato em pêra, transmitido pelo
carrapato Boophilus annulatus. Esta descoberta foi o primeiro relato da transmissão
de um protozoário por um artrópode (BOCK et al., 2004).
No mesmo ano, 1893, Starcovici comprovou a similaridade do
microrganismo de Babes com os pesquisados por Smith e Kilborne, propondo a
inclusão de ambos para um novo gênero denominado de Babesia, em homenagem
ao pesquisador romeno. Assim, H. bovis passou a ser B. bovis e P. bigemina ficou
sendo B. bigemina (UILENBERG, 2006).
2.1.1.2 Agentes etiológicos
A babesiose é uma enfermidade causada por um protozoário do filo
Protozoa, subfilo Apicomplexa, da classe Sporozoasida, ordem Piroplasmida, gênero
Babesia (GUGLIELMONE, 1995; SEQUEIRA; AMARANTE, 2001; BROWMAN,
2006). Existem oito espécies que podem infectar os bovinos em todo o mundo
(UILENBERG, 2006), mas destas somente B. bigemina e B. bovis são encontradas
no Brasil e demais países da América Latina (ARAÚJO et al., 1997; OKASI et al.,
2002).
No sangue circulante ocorre a fase de invasão eritrocítica com
desenvolvimento por divisão binária simples desses protozoários. B. bigemina é um
parasito polimórfico, possuindo formas pequenas, bordos irregulares e suas
dimensões variam entre 3 a 5 µm, sendo as formas piriformes relacionadas com o
ciclo sexuado, que se completa no organismo dos vetores, enquanto as amebóides
20
com o ciclo assexuado. As dimensões da B. bovis atingem no máximo 3 µm,
apresentando-se na forma arredondada ou lanceolada aparecendo, frequentemente,
aos pares (MASSARD; FREIRE,1985).
2.1.1.3 Biologia parasitária
A babesiose bovina é transmitida biologicamente por carrapato,
principalmente, os que se encontram nas áreas entre os paralelos 32º Norte e 32º
Sul (GONZALES, 2002; JULIANO et al., 2007), sendo o carrapato R. microplus o
vetor mais encontrado nos países das Américas Central e Sul, África, Ásia, Austrália
e Sul da Europa (GUGLIELMONE, 1995; LIMA et al., 1999; BOCK et al., 2004).
Pode ocorrer também uma transmissão congênita na babesiose bovina
(BRACARENSE; VIDOTTO; CRUZ, 2001).
B. bovis é transmitida pelas larvas dos carrapatos, enquanto os estádios
de ninfas e adultos transmitem B. bigemina. O ciclo sexual se desenvolve no
intestino do carrapato, via hemolinfa, as formas sexuadas podem invadir outras
células como ovários, tubos de malpighi, evoluindo para estágios uninucleados,
sendo essas estruturas consideradas gametas. Após o ingurgitamento, 2-4 dias, os
gametas, aos pares, se unem para formar um zigoto esférico; dando origem a um
quineto móvel que irá se dividir assexuadamente nas células epiteliais do intestino,
formando os esporoquinetos. Esses invadem as glândulas salivares, que passam
por uma nova divisão assexuada, formando os esporozoítos (MARTINS, 2002).
No momento do repasto sanguíneo o carrapato, através da saliva, injeta
esporozoítos no hospedeiro vertebrado, via corrente sanguínea, atingindo as
hemácias sem que haja o seu rompimento. Estes esporozoítos se transformam em
trofozoítos (estádios após desenvolvimento inicial) que através de uma endocitose
evoluem em merozoítos, apresentando aspecto piriforme no interior das hemácias.
Os merozoítos se multiplicar através de uma divisão binária, resultando em dois (às
vezes quatro) merozoítos, que rompem a célula parasitada e penetraram em outra
hemácia íntegra para continuar sua multiplicação (MARTINS, 2002; BOCK et al.,
2004; UILENBERG, 2006).
21
2.1.1.4 Epidemiologia
A babesiose é uma doença de distribuição mundial, onde a presença do
carrapato infectante é fundamental para sua disseminação, sendo mais importante
nas regiões tropicais e subtropicais (CANTÚ-MARTÍNEZ et al., 2008) e
responsabilizada por grandes perdas econômicas em vários países da África, Ásia,
Austrália e Américas (BÖSE et al., 1995).
Existem três situações epidemiológicas distintas: áreas consideradas
livres da doença, onde a condição climática não é favorável ao aparecimento de
carrapatos; área de instabilidade enzoótica, que em determinadas épocas do ano,
devido às condições climáticas, impede o desenvolvimento da vida livre do
carrapato; e as áreas de estabilidade enzoótica, sendo que nessas áreas as
condições climáticas são favoráveis a presença dos carrapatos, bem como sua
multiplicação (MAHONEY; ROSS, 1972; KESSLER et al., 1983; FOLLY et al., 2009).
Em condições de clima tropical e subtropical, a babesiose assume
características de estabilidade enzoótica, os bezerros são infectados durante os
primeiros meses de vida, sendo protegidos por anticorpos maternos, através do
colostro, desenvolvendo sua imunidade ativa sem sofrer a doença clínica (KESSLER
et al., 1983; MADRUGA et al., 1984). Pode ocorrer uma situação de instabilidade
enzoótica em determinado período do ano, tendo uma probabilidade de infecção
baixa devido à presença do carrapato ser inconstante ou insuficiente para manter
elevado o nível de imunidade dos animais (KESSLER et al., 1983; FOLLY et al.,
2009).
O Brasil é considerado como um país enzoótico devido a constante
transmissão dos agentes, porém existem algumas regiões como sertão e sul
brasileiro, em que as condições edafoclimáticas não favorecem o desenvolvimento
do R. microplus (GONZALES, 1995; LIMA et al., 1999; SANTOS et al., 2001). No sul
do País esta doença tem um significado maior, dado ao prejuízo econômico que ela
causa por mortalidade e morbidade, em áreas de instabilidade enzoótica, devido a
transmissão esporádica ou irregular (KESSLER et al.,1983).
Mahoney e Ross (1972) relatam que uma área é considerada de
instabilidade enzoótica quando a frequência de anticorpos se apresentam inferiores
a 75%, quando superior a este valor a área é considerada de estabilidade enzoótica.
Alguns estudos no Brasil revelaram áreas de instabilidade para região de Londrina
22
(PR) com uma prevalência de 69,30% para B. bigemina e 60,19% para B. bovis
(VIDOTTO et al., 1997) e na mesorregião norte Fluminense (RJ) com prevalência de
69,74% para B. bigemina (SOUZA et al., 2000b). Soares et al. (2000) num estudo
nessa mesma região, constataram uma prevalência de 90,98% para B. bovis,
considerando essa área como de estabilidade enzoótica para este agente.
Foram consideradas como áreas de estabilidade enzoótica: o município
de Goiânia (GO) com prevalência de 98,90% de B. bovis e 94,40% de B. bigemina
(SANTOS et al., 2001); Paudalho, zona da mata de Pernambuco com 76,59% para
B. bovis e 97,61% para B. bigemina (BERTO et al., 2008); o nordeste do Estado do
Pará, constatando uma prevalência de 99,20% para B. bovis e 98,80% para B.
bigemina (GUEDES JÚNIOR et al., 2008); e o município de Campos dos
Goyatacazes (RJ) com prevalência de 90,50% para B. bovis e 78,70% para B.
bigemina (FOLLY et al., 2009).
2.1.1.5 Imunologia
Os protozoários são agentes infecciosos intracelulares que habitualmente
infectam o hospedeiro por longo período de tempo, em virtude de possuir
mecanismos que lhes permitem escapar das agressões mediadas pelo sistema
imune (MACHADO et al., 2004).
Vários componentes da resposta imune inata participam do mecanismo
de defesa contra os protozoários (MACHADO et al., 2004), monócitos, macrófagos e
neutrófilos ativados iniciam a imunidade do sistema celular. Durante a infecção
inicial por protozoários, os monócitos do sangue periférico e neutrófilos são atraídos
para o local da infecção antes do surgimento de anticorpos específicos com as
funções de fagocitar os agentes e liberar radicais oxidativos (COURT; JACKSON;
LEE, 2001). A resposta adaptativa contra os protozoários ocorre após a
apresentação de antígenos por macrófagos e células dendríticas, via MHC classe II
para as células T. Como outras células podem ser infectadas, e os macrófagos e
células dendríticas também expressam moléculas de MHC classe I, nas infecções
por protozoários há também ativação das células TCD8+ (MACHADO et al., 2004).
B. bovis causa uma infecção aguda que resulta na persistência e
imunidade contra a infecção, sendo essa dependente de macrófagos ativos,
incluindo citocinas inflamatórias e óxido nítrico e seus derivados. O agente estimula
23
a síntese do óxido nítrico e a produção deste nos macrófagos ativos, manifestando
um aumento nos níveis da citocinas inflamatórias nas interleucina-1 (IL-1), IL-12 e
fator de necrose tumoral α (TNF-α), que são importantes para estimular a imunidade
inata e adquirida contra estes patógenos. A IL-12 ativa a célula natural killer (NK)
produzindo interferon-γ (IFN-γ), contribuindo assim no desenvolvimento da
imunidade adquirida através da sua capacidade de promover a diferenciação de
IFN-γ de células produtoras de linfócitos T-helper (Th) (SHODA et al., 2000).
2.1.1.6 Patogenia
A dinâmica da infecção varia com a integração entre o agente, o vetor e o
hospedeiro (SILVA et al., 2007), a infecção por B. bovis tem um curso de três a sete
dias para a doença aguda. A presença de citocinas e outros agentes
farmacologicamente ativos têm uma função importante na resposta imune para
Babesia spp. e o excesso de produção do agente infeccioso contribui para o
progresso da doença causando vasodilatação, hipotensão, aumento da
permeabilidade capilar, edema, colapso vascular, distúrbios de coagulação, lesão
endotelial e estase circulatória (BOCK et al., 2004).
A ação anemiante está relacionada à destruição hemolítica, com baixa
nos valores eritrocitários bem como da hemoglobina, ou seja, causando uma
hemoglobinemia que pode resultar em icterícia e hemoglobinúria. Essa lise de
hemácias inicia quando os parasitos sofrem uma multiplicação assexuada,
ocorrendo uma diminuição do número de hemácias circulantes (MASSARD;
FREIRE, 1985).
Nos casos agudos, as hemácias destruídas podem ser liberadas pela bile
ou urina, essa hemoglobinúria é comum nos casos graves de babesiose, tendo uma
duração média de 2-3 dias, com morte do animal antes do desaparecimento do sinal
clínico. Nos casos crônicos, a fase hemolítica regenerativa é caracterizada por um
aumento do número hemácias imatura na circulação sanguínea. A ação dos
parasitos sobre os órgãos hematopoiéticos irá determinar uma hipocromia e uma
leucopenia no período inicial, essa disfunção também é consequência da destruição
eritrocítica, causando uma diminuição globular, trombose capilar e liberação de
24
hemoglobina, passando o animal de estado normal para um estado patológico grave
(MASSARD; FREIRE, 1985).
Enquanto B. bigemina parasita com mais frequência as hemácias da
circulação periférica, B. bovis é encontrada em capilares de órgãos centrais como
cérebro, cerebelo, meninges, e nas vísceras como rins, baço, fígado, coração e
pulmão (MASSARD; FREIRE, 1985).
B. bigemina é capaz de desencadear um mecanismo que provoca danos
celulares e tissulares, envolvendo inicialmente uma hemólise intravascular,
determinando anoxia e secundariamente lesões em vários órgãos, principalmente,
rins e fígado (MENDONÇA et al., 2002). Ainda, animais infectados por este agente
tendem a apresentar hemoglobinúria mais cedo e de forma mais consistente do que
as infecções por B. bovis (BOCK et al., 2004).
2.1.1.7 Sinais clínicos e achados de necropsia
Durante a infecção aguda, esses patógenos podem causar febre (41 a
41,5ºC), anorexia, apatia, ataxia, palidez de mucosas, taquipneia, hemoglobinúria,
icterícia, anemia, tremores musculares e ranger de dentes (SANTOS et al., 1998;
SOARES et al., 2000; SINGH; MISHRA; RAO, 2009). Segundo Bock et al. (2004), a
febre apresentada durante a alta parasitemia pode gerar abortamentos em vacas,
bem como, uma redução na fertilidade dos touros, e em estágios mais avançados
alguns animais podem apresentar problemas no sistema nervoso central, sendo
fatal. Os sinais clínicos de infecções subagudas são mais difíceis de detectar.
Um estudo retrospectivo no Rio Grande do Sul revela que B. bovis foi o
agente mais importante envolvido em casos de babesiose, sendo responsável por
41% dos casos clínicos diagnosticados nessa região com os animais apresentando
sinais clínicos característicos da doença (ALMEIDA et al., 2006).
Na necropsia em animais infectados com B. bovis pode ser observado
hepatomegalia, esplenomegalia, rins congestos e escuros, vesícula biliar distendida
com conteúdo denso, escuro e grumoso; tecido conjuntivo e adiposo ictérico. Em
alguns órgãos pode ser visualizada congestão ou petéquias, com possibilidade de
edema pulmonar; a superfície da massa cinzenta do cérebro pode aparecer na
coloração rosa Nos casos agudos se observa hemoglobinúria, podendo estar
25
ausente em casos subagudo ou crônico (KESSLER et al., 1983; BRACARENSE;
VIDOTTO; CRUZ, 2001; BOCK et al., 2004; ALMEIDA et al., 2006).
2.1.2 Anaplasmose bovina
2.1.2.1 Histórico
Sir Arnold Theiler, em 1910 na África do Sul, em uma pesquisa em
lâminas sanguíneas provenientes de bovinos doentes descobriu alguns ‘‘pontos’’
marginais que seriam os responsáveis pela doença sendo similar a febre do Texas e
denominou o agente como gênero Anaplasma, espécie Anaplasma marginale,
classificando-o como um protozoário. Em 1893, quando Smith e Kilborne,
descobriram sobre B. bigemina concluíram que os pontos marginais também faziam
parte deste protozoário, porém Theiler determinou que a babesiose e a
anaplasmose fossem doenças distintas que poderiam existir no mesmo animal,
conseguindo separar os dois agentes através de infecções puras com A. marginale.
Com as descobertas de Theiler sobre a anaplasmose em 1910-1911, ficou claro que
alguns dos bovinos que Smith e Kilborne haviam trabalhado estavam infectados com
Babesia e Anaplasma (KOCAN et al., 2010).
2.1.2.2 Agente etiológico
A anaplasmose bovina é uma doença causada pela rickettsia
intraeritrocítica Anaplasma marginale Theiler, 1910 e A. centrale Theiler, 1911, que
pertence a ordem Rickettsiales (SOUZA et al., 2001; VIDOTTO; MARANA, 2001;
ARAÚJO et al., 2003); baseada em análises genéticas dos genes 16S rRNA, groESL
e genes que codificam proteínas de superfície, houve uma reclassificação em
relação a família, que atualmente está incluída em duas: Anaplasmataceae e
Rickettsiaceae (KOCAN et al., 2010). Entre as espécies, A. marginale (Família
Anaplasmataceae) (MARANA et al., 2009) é a mais patogênica e de maior
importância para os bovinos (VIDOTTO; MARANA, 2001).
Todas as bactérias intracelulares obrigatórias são designadas à família
Rickettsiaceae, que crescem livremente no citoplasma de células eucarióticas, já os
26
organismos da família Anaplasmataceae, são parasitos intracelulares obrigatórios,
sendo encontrados exclusivamente na membrana, vinculado a vacúolos do
citoplasma da célula hospedeira. Além disso, quase todos os organismos
designados à família Anaplasmataceae se multiplicam em vertebrados e
invertebrados (principalmente carrapatos) (KOCAN et al., 2010), são cocos
pleomórficos, gram-negativos e transmitidas por vetores como carrapato; no
citoplasma da célula do hospedeiro são observados pequenos cocos erliquiais, na
coloração azul escuro ao roxo, com aspecto de amora, sendo denominado de
mórula, com tamanho de 0,2-0,4µm (RIKIHISA, 2006).
2.1.2.3 Biologia parasitária
A transmissão de A. marginale pode ser mecanicamente por dípteros
hematófagos e fômites contaminados ou, biologicamente, através do carrapato
(ARAÚJO et al., 1998; CARELLI et al., 2007), sendo que no Brasil o principal
transmissor é R. microplus (ARAÚJO et al., 1998), ocorrendo no carrapato a
transmissão transestadial e transovariana (KESSLER, 2001; BROWMAN, 2006).
Nos animais pode acontecer ainda transmissão congênita ou transplacentária
(RIBEIRO et al., 1995; KESSLER, 2001).
A transmissão mecânica pode ser através da picada do inseto, que realiza
a transferência direta de sangue de bovinos portadores para susceptíveis, ocorrendo
poucos minutos após a alimentação no bovino infectado (MARTINS, 2002), porém a
transmissão por insetos hematófagos deve ser objeto de mais estudos, devido à
escassez de infecções experimentais (KESSLER, 2001). Pode ainda ocorrer
inoculação do agente por agulhas contaminadas com sangue infectado durante a
vacinação ou pequenos procedimentos cirúrgicos, como castração, marcação por
tatuagem, entre outros (MARTINS, 2002; KOCAN et al., 2010).
Nos carrapatos, a transmissão pode ocorrer entre diferentes ínstares
(larva ou ninfa se infecta e transmite ao estádio subsequente – ninfa ou adulta)
sendo denominada transestadial ou pode ocorrer via transovariana (infecção na
forma adulta que após replicação no intestino da fêmea, transmitir para a próxima
geração) (MARTINS, 2002; BROWMAN, 2006). Pode ainda ocorrer uma transmissão
pelo carrapato macho, este se infecta em bovino portador e transmite,
posteriormente, para outro bovino sensível (KESSLER, 2001).
27
Durante o repasto sanguíneo, o carrapato, através da saliva, injeta o
agente patogênico no sangue circulante do animal. Nos bovinos A. marginale
penetra na hemácia sob forma de corpúsculo inicial devido a uma invaginação da
membrana dando origem a um vacúolo, depois dessa invasão, ocorre multiplicação
por divisão binária, formando um corpúsculo de inclusão, que deixará a hemácia,
sem rompimento da mesma, e invadirá outras células, propagando o ciclo (KOCAN
et al., 2010).
2.1.2.4 Epidemiologia
A anaplasmose ocorre mundialmente em regiões de clima tropical,
subtropical e temperado, é uma doença de grande importância econômica afetando
principalmente a produção bovina de muitos países (SOUZA et al., 2001; MOURA et
al., 2003; FELSHEIM et al., 2010; KOCAN et al., 2010). Sua distribuição nas
Américas Central e Sul é semelhante às babesioses, porém no sul da Argentina
ocorrem surtos esporádicos, mesmo em áreas livres de carrapatos
(GUGLIELMONE, 1995).
Algumas espécies de ruminantes selvagens infectadas, como veado e
alces, são importantes na epidemiologia e propagação da anaplasmose, como
hospedeiros de A. marginale, eles são considerados fonte de infecção, ocorrendo
uma maior disseminação pela via mecânica através de insetos, e biológica pelo
carrapato (KOCAN et al., 2010). No Brasil, mesmo os cervídeos sendo considerados
reservatórios naturais de A. marginale, é considerado com pouca importância
epidemiológica, pois os próprios bovinos servem de fonte de infecção de A.
marginale entre eles (GONÇALVES, 2000).
A distribuição da anaplasmose acontece em: (1) áreas livres, possuem
condições climáticas não favoráveis à multiplicação dos vetores; (2) áreas de
instabilidade enzoótica onde as condições edafoclimáticas não são totalmente
favoráveis ao desenvolvimento dos vetores, porém pode acontecer que em uma
determinada época do ano, ocorram episódios de infestação temporária em
população de risco; (3) áreas de estabilidade enzoótica onde têm clima favorável ao
desenvolvimento de vetores durante todo o ano (VIDOTTO; MARANA, 2001).
As taxas de soroprevalência de A. marginale têm uma variação
significativa entre os países das Américas, sendo que essa variabilidade contribui
28
para o desenvolvimento de regiões de instabilidade enzoótica (KOCAN et al., 2010).
A anaplasmose bovina tem maior destaque em regiões de instabilidade enzoótica,
devido à presença de um grande percentual de animais susceptíveis a infecção por
A. marginale, pois a maioria dos bovinos não se infectam nos primeiros meses de
vida, quando são mais susceptíveis a essa infecção (MADRUGA et al., 1985).
Nas áreas de estabilidade enzoótica, os animais se infectam com A.
marginale nos primeiros dias de vida, onde a presença dos vetores é persistente
durante todo o ano, entretanto, apresentam uma maior resistência devido à
absorção de anticorpos maternos, através do colostro (VIDOTTO; MARANA, 2001).
Porém o percentual de animais doentes, bem como a taxa de mortalidade, pode
depender de algumas condições epidemiológicas, tais como: número de vetores no
ambiente, estado nutricional e doenças concomitantes (GONÇALVES, 2000).
Num estudo feito no nordeste do Estado do Pará, foi constatada uma
prevalência de 68,30% para A. marginale, considerando essa região como de
instabilidade enzoótica (GUEDES JÚNIOR et al., 2008). Outra região que também
foi considerada como de instabilidade, foi a região centro-sul do Estado do Paraná,
que num estudo para detectar A. marginale apresentou uma prevalência de 58,74%
(MARANA et al., 2009).
No Brasil, pode ser considerada área de estabilidade o Sul com
prevalência de 92,9% em rebanho de bovinos leiteiros (ANDRADE et al., 2001); a
mesorregião do médio Paraíba sendo constatada uma prevalência de 98,21%
(SOUZA et al., 2001) e a mesorregião Norte Fluminense (RJ) com prevalência de
91,16% (SOUZA et al., 2000a).
2.1.2.5 Patogenia
A. marginale é uma rickettsia intraeritrocítica que infecta de 10 a 90% das
hemácias dos bovinos (KIESER; ERIKS; PALMER, 1990). A incubação ou período
pré-patente pode variar de 7 a 60 dias, com uma média de 28 dias. Após a infecção
eritrocítica é detectado um aumento no número de hemácias parasitadas (KOCAN et
al., 2010), podendo chegar a 109 hemácias infectados por mililitro de sangue
(SCOLES et al., 2005), essas hemácias são posteriormente fagocitadas por células
do sistema reticuloendotelial, resultando em desenvolvimento de anemia e icterícia,
sem que apresente hemoglobinemia ou hemoglobinúria (KOCAN et al., 2010).
29
2.1.2.6 Sinais clínicos e achados de necropsia
A anaplasmose bovina, muitas vezes, resulta em desenvolvimento de
anemia leve a grave e icterícia. Os bovinos que sobrevivem à infecção aguda
tendem a desenvolver infecções persistentes caracterizadas por baixo nível de
parasitemia (KOCAN et al., 2010).
Os sinais clínicos observados nos animais doentes são anemia
hemolítica, icterícia, dispnéia, taquicardia, febre, fadiga, lacrimejamento, sialorreia,
diarreia, micção frequente e anorexia, levando a morte do animal (VIDOTTO;
MARANA, 2001; ARAÚJO et al., 2003).
Durante a realização da necropsia as lesões macroscópicas mais
observadas são: sangue deficientemente coagulado, mucosas e serosas anêmicas
ou ictéricas, hepatoesplenomegalia, rins aumentados e escuros, vesícula biliar com
conteúdo denso e grumoso, e congestão cerebral (VIDOTTO; MARANA, 2001).
2.1.3 Diagnóstico
O diagnóstico das babesioses e anaplasmose bovina pode ser realizado
com base nos sinais clínicos e na visualização dos parasitos no interior das
hemácias em esfregaços sanguíneos delgados corados pelo Giemsa (LIMA et al.,
1999; VIDOTTO; MARANA, 2001; OKASI et al., 2002; CARELLI et al., 2007). Para
uma melhor realização do exame, deve-se preparar a lâmina a partir de sangue
coletado dos capilares periféricos, como da região marginal da orelha ou ponta da
cauda no caso de B. bovis, pois a circulação sanguínea geral possui 20 vezes
menos desse parasito do que no sangue periférico (BOCK et al., 2004); para B.
bigemina pode-se utilizar até mesmo, sangue coagulado por haver uma quantidade
maior desse protozoário no sangue circulante (VIDOTTO; MARANA, 2001; BOCK et
al., 2004).
Entretanto quando a parasitemia se apresenta muito baixa, como é o caso
das infecções subagudas, é difícil a demonstração do agente (MARTINS; CORRÊA;
CERESÉR, 1996; VIDOTTO; MARANA, 2001). Assim, várias técnicas sorológicas,
com variação de graus de sensibilidade e especificidade, foram desenvolvidas para
detecção de anticorpos para B. bovis, B. bigemina e A. marginale (MARANA et al.,
30
2006; JULIANO et al., 2007). As provas sorológicas são importantes nos estudos
epidemiológicos de uma determinada região (SOUZA et al., 2000ab; BOCK et al.,
2004) e são utilizados na avaliação de medidas profiláticas como premunição,
vacinação e controle de carrapatos (OSAKI et al., 2002; BOCK et al., 2004).
Vários são os testes sorológicos utilizados para a detecção da babesiose
e anaplasmose bovina, dentre elas pode-se destacar o teste da conglutinação rápida
(TCR), a aglutinação pelo látex, a hemaglutinação, fixação de complemento (FC)
(MARANA et al., 2006), o teste do cartão (TC), a prova de imunofluorescência
indireta (IFI) (SOUZA et al., 2001; MARANA et al., 2009), o ensaio imunoenzimático
de adsorção indireto (iELISA); ELISA por competição (cELISA) (MARANA et al.,
2009), além de técnicas moleculares como a Reação em Cadeia de Polimerase
(PCR) (OKASI et al., 2002; BOCK et al., 2004; CARELLI et al., 2007)
O teste de FC é baseada em reações de anticorpos IgM, que são
produzidos principalmente no início da infecção primária, porém devido a sua baixa
sensibilidade, o teste foi abandonado para o diagnóstico da babesiose bovina. A IFI
é amplamente utilizada para diagnosticar Babesia spp., porém a desvantagem do
teste é sua limitação pelo número de amostras realizadas por dia (BÖSE et al.,
1995). O teste de ELISA é considerado um avanço em termos de sensibilidade,
especificidade, padronização e reprodutibilidade para a detecção de anticorpos
específicos na babesiose bovina (MACHADO et al., 1997), além de ser o método
mais apropriado para se trabalhar com grande número de amostras devido a
utilização de um leitor específico (ARAÚJO et al., 1998).
Marana et al. (2006) num estudo comparativo entre iELISA e cELISA para
anaplasmose bovina, relatam que estes testes são mais adequados aos estudos
epidemiológicos em áreas de instabilidade enzoótica, onde se encontra uma
prevalência variável, devido a sensibilidade e especificidade dessas provas. Esse
mesmo estudo comparou a IFI e o TCR que, por serem testes mais simples e
rápidos, são mais utilizados em levantamentos epidemiológicos, porém não
apresentaram tanta especificidade quanto os anteriores.
Avanços recentes no campo da biologia molecular tornaram possível o
uso de técnicas de amplificação do ácido dexoribonucléico (DNA) dos agentes
causais das patologias parasitárias e infecciosas que acometem os animais. Esses
testes baseados na PCR são feitos de maneira relativamente rápida e apresentam
alta sensibilidade e especificidade tornando possível a verificação da presença de
31
agentes patogênicos, mesmo em animais assintomáticos. A PCR tem sido muito
utilizada em estudos epidemiológicos das hemoparasitoses bovinas, pois há uma
identificação direta desses parasitos por essa técnica (BRITO et al., 2006).
2.1.4 Tratamento
O tratamento da babesiose consiste em destruir os protozoários no
paciente com aplicação de medicamentos a base de aceturato de diminazeno,
dipropionato de imidocarb, diisetionato de amicarbalina, fenamidina, sendo que o
mais utilizado é o dipropionato de imidocarb por apresentar efeito prolongado devido
a sua lenta metabolização, porém suas ações colaterais como diarreia, cólica e
salivação são mais severas também (MELO; CARVALHO NETA, 2009).
Segundo Bock et al. (2004), o aceturato de diminazeno pode ser usado
contra B. bovis e B. bigemina na dose de 3,5 mg/kg intramuscular, protegendo o
animal por duas a quatro semanas; o dipropionato de imidocarb é usado por via
subcutânea na dose de 1-2 mg/kg para o tratamento, se utilizado na dose de
3mg/kg promoverá uma proteção contra B. bovis por quatro semanas e para B.
bigemina pelo menos uns dois meses.
Para a anaplasmose, o tratamento é baseado na utilização de antibióticos
como a tetraciclina ou oxitetraciclina, na dose de 2-4 mg/kg pela via intramuscular
com 2-4 aplicações em intervalos de 21 em 21 dias (GONÇALVES, 2000). Mesmo
os animais sendo tratados, podem se tornarem portadores crônicos da doença e, se
curados, continuam suscetíveis à reinfecção (FELSHEIM et al., 2010).
Às vezes a babesiose pode estar associada com a anaplasmose, assim é
comum no tratamento a utilização de aceturato de diminazeno e oxitetraciclina nos
animais que apresentam os sinais clínicos e quando não se podem aplicar testes
sorológicos na região (ASSIS et al., 2005).
2.1.5 Controle
Os métodos de profilaxia empregados para as hemoparasitoses são:
controle de vetores, quimioprofilaxia, premunição e uso de vacinas. O controle de
carrapato pode ser implementado através de um controle estratégico bem como sua
erradicação (GONÇALVES, 2000). As estratégias para o combate aos carrapatos
32
visam o uso de carrapaticidas, através dos banhos de imersão levando-se sempre
em consideração a dose e concentração correta; fazendo-se o rodízio do princípio
ativo quando necessário a fim de que seja evitada a resistência por parte dos
carrapatos (MELO; CARVALHO NETA, 2009). No caso da anaplasmose além do
carrapato, também deve ser feito um controle de moscas na propriedade
principalmente nas estações chuvosas, quando a população de dípteros
hematófagos é maior (GONÇALVES, 2000).
A premunição é outro método para controle da babesiose e anaplasmose,
consiste na exposição do animal ao agente, seguidos de correto tratamento para
que sejam ativadas as células de defesa (MELO; CARVALHO NETA, 2009).
Segundo Gonçalves (2000) premunição é um processo baseado na inoculação do
sangue do animal portador em animais susceptíveis, utilizando tratamento à base de
drogas específicas. É uma medida que determina proteção à infecção, mesmo
ocorrendo variações entre as amostras das espécies dos agentes. Porém esse
método apresenta alto custo, como riscos na disseminação da doença,
principalmente em bezerros. Outras limitações são apontadas por Kessler et al.
(2002), sendo a principal o risco de disseminação de outras doenças transmissíveis
pelo sangue, como a leucose bovina, a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), a
diarreia viral bovina (BVD), a tuberculose e a leptospirose que se tornaram
endêmicas, principalmente, nos rebanhos leiteiros .
A vacinação pode ser feita através da vacina atenuada na sua forma
tríplice (A. marginale, B. bovis e B. bigemina), entretanto, pode provocar uma
manifestação clínica da enfermidade, sendo necessário em alguns casos, o
tratamento para evitar as perdas (DIAS, 2001). A vacinação com cepas atenuadas
deve ser utilizada de maneira controlada em bovinos susceptíveis, principalmente,
os adultos quando estes terão um primeiro contato com os vetores (GONÇALVES,
2000).
A desvantagem dessa vacina está no fato da infecção com esses agentes
patogênicos nos bovinos, porém mesmo com o risco de infecção as vacinas vivas
mostraram eficiência de proteção em 95% dos animais vacinados (BOCK et al.,
2004). Para a produção da vacina viva para anaplasmose, bezerros
esplenectomizados são mantidos em condições de quarentena, são
experimentalmente inoculados com agentes selecionadas e servem como doadores
de sangue infectado, porém, a transmissão de outros hemoparasitos realizados
33
silenciosamente pelo bovino doador é sempre um risco com esta abordagem
(KOCAN et al., 2010).
No Brasil utilizam-se dois tipos de vacinas atenuadas contra a babesiose
e anaplasmose bovina. Uma refrigerada, à semelhança do que se faz na Austrália e
no Uruguai, e outra congelada em nitrogênio líquido, ambas as vacinas são tríplices
(B. bovis, B. bigemina e A. centrale). A primeira, apesar de aparentemente mais
prática e econômica, pode ser distribuída pronta para o uso, apresentando como
inconveniente ser aplicada até cinco dias após sua produção, o que impossibilita o
teste prévio da partida, com isto, apesar de ser produzida em condições controladas,
existe o risco de, acidentalmente, o produto conter os agentes virulentos ou outros
contaminantes. Os resultados só serão verificados após a aplicação nos animais a
serem imunizados (KESSLER et al., 2002).
A vacina congelada possui a vantagem de permanecer inalterada por
tempo indeterminado, permitindo o teste prévio de cada partida, cumprindo com as
exigências da Divisão de Produtos Veterinários (DIPROD) do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) evitando, assim, surpresas
desagradáveis após sua aplicação. Além disso, por ser mantida em botijões de
nitrogênio líquido, pode ser transportada para qualquer lugar, mesmo desprovido de
energia elétrica, e ser utilizada no momento mais apropriado. Pode ser aplicada,
simultaneamente, em grande número de animais, sem a necessidade de
acompanhamento intensivo, o que torna o processo mais econômico e seguro que
os demais métodos de imunização disponíveis (KESSLER et al., 2002).
No mercado brasileiro, existem registradas e comercialmente disponíveis,
as vacinas congeladas EMBRAVAC®, contra a tristeza parasitária bovina,
desenvolvidas pela Embrapa Gado de Corte. Os animais vacinados devem ser
mantidos livres de carrapatos, sob observação durante 60 dias, no estábulo ou no
campo. Exames laboratoriais só serão necessários, eventualmente, no caso de
algum animal apresentar sinais clínicos (KESSLER et al., 2002).
34
REFERÊNCIA
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42
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
Soroprevalência de Babesia bovis e Babesia bigemina em bezerros na região de
Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil
Hébelys Ibiapina da Trindade
ARAGUAÍNA
2010
43
RESUMO
Soroprevalência de Babesia bovis e Babesia bigemina em bezerros na região
de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil
A babesiose bovina é causada pelos agentes Babesia bovis e Babesia bigemina,
sendo transmitida pelo vetor biológico Rhipicephalus (Boophilus) microplus,
causando principalmente hemoglobinúria nos animais. Devido à importância da
enfermidade, a pesquisa objetivou determinar a soroprevalência de anticorpos anti-
B. bovis e anti-B. bigemina em bezerros da região de Araguaína-Tocantins. Foram
coletadas 506 amostras de soros de bezerros com faixa etária compreendida de oito
e 24 meses, fêmeas e machos, obtendo-se 10 mL de sangue, assepticamente, por
punção da veia coccígena, sendo centrifugado para separação do soro e
armazenado a -20ºC até o momento da realização do teste sorológico. A
determinação dos anticorpos anti-B. bovis e anti-B. bigemina foi realizada por meio
do ensaio imunoenzimático de adsorção indireto e como análise estatística utilizou-
se o Qui-Quadrado (χ
2
) com correção de Yates, para distribuição da prevalência das
enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção. Para verificação se o
sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi calculado a Odds ratio (OR).
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico
Graphpad Prism. 5 – Windows (2009), com intervalo de confiança (IC) de 95%. A
infecção para B. bovis (OR=1,703) e para B. bigemina (OR=0,5689) não foi
verificada a influência do sexo. As prevalências obtidas em bezerros foram de 90,5%
e 91,7% para B. bigemina e B. bovis, respectivamente. A soroprevalência
encontrada caracteriza esta região como de estabilidade enzoótica para as espécies
analisadas, oferecendo risco quando introduzidos animais suscetíveis, procedentes
de áreas livres ou de instabilidade, para região de Araguaína, sendo necessário o
uso de medidas preventivas adequadas a essas ocasiões.
Palavras-chave: Babesiose bovina, Rhipicephalus (Boophilus) microplus,
estabilidade enzoótica, B. bovis, B. bigemina
44
ABSTRACT
Seroprevalence of Babesia bovis and Babesia bigemina in calves from the
region of Araguaina, State of Tocantins, Brazil
Bovine babesiosis is caused by the following agents: Babesia bovis and Babesia
bigemina, and it is transmitted by the biological vector Rhipicephalus (Boophilus)
microplus, causing hemoglobinuria in the animals. Because of the importance of the
disease, this study aimed to determine the prevalence of anti-B. bovis and anti-B.
bigemina antibodies in calves from the region of Araguaina-Tocantins. We collected
506 blood samples from calves, from 8 to 24 months-old, females and males, the 10
mL blood samples were aseptically collected by puncture of the coccygeal vein, and
centrifuged to separate the serum, then stored at -20°C until the serological test. The
determination of anti-B. bovis and anti-B. bigemina antibodies Statistical analysis
between the variables was obtained through the statistical test Chi-square (χ
2
) with
Yates correction, for distribution of the prevalence of disease by age group was not
applied this correction. To check if the sex was considered a risk factor or protection,
we calculated odds ratio (OR). All statistical analyzes were performed using the
statistical program Graphpad Prism. 5 - Windows (2009), with 95% a confidence
interval (CI). We verified by odds ratio that there were no influence of sex for the
infection to B. bovis (OR=1.703) and B. bigemina (OR=0.5689). The seroprevalence
obtained was 90.5% and 91.7% for B. bigemina and B. bovis, respectively,
characterizing the region as enzootic stability for the three species and offering risk
during the introduction of susceptible animals from free or unstable areas in the
region of Araguaina, needing the use of appropriate preventive measures for such
animals.
Keywords: Bovine babesiosis, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, enzootic
stability, B. bovis, B. bigemina.
45
1 INTRODUÇÃO
A babesiose bovina é uma hemoparasitose causada pelos protozoários
Babesia bovis e Babesia bigemina, apresentando o carrapato Rhipicephalus
(Boophilus) microplus como vetor biológico, sendo caracterizada por febre, anemia,
anorexia, apatia, ataxia, taquipneia, hemoglobinúria e tremores musculares
(GUGLIELMONE, 1995; SOARES et al., 2000; SILVA et al., 2007; SINGH; MISHRA;
RAO, 2009). A importância econômica desta enfermidade está relacionada com
elevada morbidade e mortalidade dos animais, principalmente em bezerros, bem
como por diminuição do ganho de peso e queda na produção de leite, além de
gastos com controle e profilaxia (MARTINS; CORRÊA; CERESÉR, 1996; GRISI et
al., 2002; BARROS et al., 2005).
A enfermidade tem distribuição mundial, com destaque nas regiões de
clima tropical e subtropical (CANTÚ-MARTÍNEZ et al., 2008), podendo observar
áreas com situações epidemiológicas diferentes: áreas livres, áreas de instabilidade
e áreas de estabilidade. As áreas livres são aquelas em que as condições climáticas
não favorecem a multiplicação de carrapatos (BERTO et al., 2008) e no Brasil, são
consideradas restritas (KESSLER et al., 1987). As áreas de instabilidade enzoótica
ocorrem em condições climáticas que limitam a multiplicação de vetores (KESSLER
et al., 1983; BARROS et al., 2005; FOLLY et al., 2009), assim os animais não tendo
contato com o patógeno são mais susceptíveis a doença clínica, quando
transportados para a área de estabilidade (SANTOS et al., 2001). As áreas de
estabilidade enzoótica têm os efeitos minimizados em decorrência dos bezerros
serem protegidos por anticorpos maternos através do colostro e infectados durante
os primeiros meses de vida, desenvolvendo sua imunidade ativa, resultando em
menos casos clínicos da doença (MADRUGA et al., 1984; GONÇALVES, 2000;
OKASI et al., 2002).
Os estudos de prevalência destes hemoparasitos são de grande
importância para a determinação da condição epidemiológica de uma região,
indicando se há uma situação de instabilidade ou de estabilidade enzoótica, para
adoção ou não de medidas profiláticas, minimizando os efeitos dessa enfermidade
(MADRUGA et al., 2000).
Considerando a escassez de dados sobre a epidemiologia da babesiose
na região de Araguaína-TO, este trabalho teve como objetivo investigar a
soroprevalência de anticorpos anti
região.
2 MATERIAL E MÉTODO
2.1 Área de estudo
O referente trabalho foi desenvolvido na região de Araguaína que ocupa
uma área de 4.000,40
localizando-
se entre a latitude 07º11’28” e longitude 48º12’26”, com uma altitude
média de 227 metros
considerada como parte da Amazônia Oriental (KAMPEL; CÂMARA; MONTEIRO,
2001).
Figura 1
. Mapa do Estado do Tocantins, demonstrando a região de Araguaína.
(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c0/Tocantins_Municip_Araguaina.svg/365px
Tocantins_Municip_Araguaina.svg.p
2.2 Amostragem
dos soros
O cálculo da amostra foi realizado através do
considerando-se a
população de bovinos na faixa etária de 0
animais (ADAPEC, 2008),
soroprevalência de anticorpos anti
-B. bovis e anti-B. bigemina
2 MATERIAL E MÉTODO
O referente trabalho foi desenvolvido na região de Araguaína que ocupa
uma área de 4.000,40
km
2
, situada na região norte do
Estado do Tocantins,
se entre a latitude 07º11’28” e longitude 48º12’26”, com uma altitude
(Figura 1)
, clima tropical úmido (SEPLAN, 2009), sendo
considerada como parte da Amazônia Oriental (KAMPEL; CÂMARA; MONTEIRO,
. Mapa do Estado do Tocantins, demonstrando a região de Araguaína.
(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c0/Tocantins_Municip_Araguaina.svg/365px
Tocantins_Municip_Araguaina.svg.p
ng)
dos soros
O cálculo da amostra foi realizado através do
programa Epi Info 6.04
população de bovinos na faixa etária de 0
-
24 meses de 98.715
animais (ADAPEC, 2008),
possibilidade de detecção da doença de 50%
46
em bezerros desta
O referente trabalho foi desenvolvido na região de Araguaína que ocupa
Estado do Tocantins,
se entre a latitude 07º11’28” e longitude 48º12’26”, com uma altitude
, clima tropical úmido (SEPLAN, 2009), sendo
considerada como parte da Amazônia Oriental (KAMPEL; CÂMARA; MONTEIRO,
. Mapa do Estado do Tocantins, demonstrando a região de Araguaína.
(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c0/Tocantins_Municip_Araguaina.svg/365px
-
programa Epi Info 6.04
24 meses de 98.715
possibilidade de detecção da doença de 50%
47
(correspondente a doenças de ocorrência desconhecida em determinada
população), intervalo de confiança de 95% e o pior resultado esperado de 10%,
resultando no N amostral de 384 animais. Esse valor foi acrescido de 10% para
reduzir potenciais perdas, resultando assim, num total de 423 amostras. Ao final
foram coletados, aleatoriamente, 506 soros de bovinos com 8-24 meses de idade
entre machos e fêmeas.
A coleta foi realizada nos meses de março a junho de 2009, onde foram
coletados 10 mL de sangue, assepticamente, por punção da veia coccígena, sendo
estes centrifugados a 2000g por 10 minutos para separação dos soros e aliquotados
em tubos tipo “Eppendorf” de 2 mL, os quais foram armazenados a -20ºC até o
momento da realização do teste sorológico; durante as coletas foi verificado se havia
presença de carrapatos e se era realizado o controle dos mesmos.
2.3 Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto
A metodologia para análise dos soros foi a técnica do ELISA indireto
descrita por Machado et al. (1997) com algumas modificações. O material coletado
foi analisado no Laboratório de Imunoparasitologia da Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinária da UNESP (Jaboticabal-SP). Na microplaca de ELISA
(Nunclon
TM
Surface, Nunc, Denmark) em cada poço foram adicionados 100 µL do
antígeno solúvel diluído em tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,05M pH 9,6,
estando a concentração protéica padronizada em 10 µg/mL
-1
(anti B. bovis e anti B.
bigemina). As placas foram incubadas “overnight” a uma temperatura de 4ºC, o
excesso de antígeno foi removido por três lavagens com tampão fosfato 0,05%
(PBS) de Tween 20. As placas foram bloqueadas com 200 µL de Tween 20
contendo 5% de leite em pó desnatado por 90 minutos a 37ºC, para reduzir a ligação
não-específica, sendo removido após a incubação com três lavagens consecutivas
de PBS Tween 20. Cada amostra de soro (controle negativo, controle positivo, soro
teste) foi diluída (1:100) em PBS Tween 20 com 5% de soro de coelho normal,
adicionado em cada poço e incubadas por 90 minutos a 37ºC e lavadas como
descrito acima. Foram adicionados em cada poço 100 µL de conjugado fosfatase
alcalina anti-IgG bovina (Sigma Chemical Co.) diluído em 1:30.000 e, em seguida,
incubadas por 90 minutos a 37°C, sendo lavadas posteriormente. Finalizando o
processo foi adicionado 100 µL, em cada poço, de um substrato p-nitrofenilfosfato
48
diluído em um tampão de dietanolamina pH 9,8. Esta placa foi incubada a
temperatura ambiente por 30 minutos. A leitura da reação foi realizada em um leitor
de microplacas (Dynex Technology) a um comprimento de onda de 405 ηm.
Os valores de absorbância (ponto de corte) nos soros foram agrupados
em níveis de ELISA (NE), os quais variam de zero a nove preconizado por Machado
et al. (1997) e a discriminação da absorbância (valor de corte) foi determinada como
sendo duas vezes e meia a média do valor de absorção do grupo negativo,
considerando as leituras acima do valor de corte positivas.
2.4 Análise estatística
Para análise estatística das variáveis estudadas foi utilizado o teste
estatístico do Qui-Quadrado (χ
2
) com correção de Yates, para distribuição da
prevalência das enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção. Para
verificação se o sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi calculado a
Odds ratio (OR). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o
programa estatístico Graphpad Prism. 5 – Windows (2009), com intervalo de
confiança (IC) de 95%.
3 RESULTADO
Durante as coletas de sangue foi verificada alta infestação por carrapatos
em todas as propriedades, apesar do uso de medicamentos a base de avermectinas
para controle de ectoparasitos.
A pesquisa de anticorpos anti-B. bovis, em bezerros procedentes da
região de Araguaína revelou uma positividade de 91,7% e para B. bigemina foi de
90,5%, não havendo diferença significativa entre a prevalência das espécies na
região (p>0,05) (Tabela 1).
49
Tabela 1 - Prevalência dos bezerros positivos e negativos pelo Ensaio
Imunoenzimático de Adsorção Indireto (ELISAi) para anticorpos anti-
Babesia bovis e anti-Babesia bigemina, na região de Araguaína,
Estado do Tocantins, Brasil.
Parasito
Positivo Negativo Total
χ
χχ
χ²
Valor de p
OR
(IC 95%)
N
%
N
%
N
%
B. bovis
ns
460 91,7 42 8,3 506 100
0,3049 0,5808
1,158
(0,7503 a 1,787)
B. bigemina
458 90,5 48 9,5 506 100
ns
não significativo pelo teste de Qui-quadrado (χ²) com correção de Yates ao nível de 5% de probabilidade
OR= odds ratio; IC= intervalo de confiança
No presente trabalho, não houve influência do sexo no parasitismo
(p>0,05) (Tabela 2).
Tabela 2 - Prevalência sorológica de anticorpos anti-Babesia bovis e anti-Babesia
bigemina em bezerros segundo o sexo na região de Araguaína, Estado do
Tocantins, Brasil.
Sexo
Positivo Negativo Total
χ
χχ
χ
2
Valor de p
OR
(IC 95%)
N
%
N
%
N
%
Babesia
bovis
Macho
ns
188 94,0 12 6,0 200 100
1,827 0,1765
1,703
(0,8500 a 3,911)
Fêmea
ns
276 90,2 30 9,8 306 100
Babesia
bigemina
Macho
ns
175 87,5 25 12,5 200 100
2,942 0,0863
0,5689
(0,3132 a 1,033)
Fêmea
ns
283 92,5 23 4,5 306 100
ns
não significativo pelo teste de Qui-quadrado (χ²) com correção de Yates ao nível de 5% de probabilidade
OR= odds ratio; IC= intervalo de confiança
A análise segundo a faixa etária revelou uma prevalência de 90,8%,
83,5% e 98,9% soropositivos para B. bovis, para as faixas etárias de 8-12 meses,
13-18 meses e 19-24 meses, respectivamente; havendo diferença significativa entre
as faixas etárias de 19-24 meses com as demais (p<0,05) (Tabela 4). Para B.
bigemina a soroprevalência segundo a faixa etária foi de 90,2%, 90,7% e 90,5%
soropositivos, para as mesmas faixas etárias descritas para B. bovis, entretanto, não
houve diferença significativa entre elas (p>0,05) (Tabela 3).
50
Tabela 3 - Frequência sorológica de anticorpos anti-Babesia bovis e anti-Babesia
bigemina em bezerros segundo a faixa etária na região de Araguaína,
Estado do Tocantins, Brasil.
Faixa
etária
(meses)
Positivo Negativo Total
χ
χχ
χ
2
Valor de p
N
%
N
%
N
%
Babesia bovis
8-12
b
149 90,9 15 9,1 164 100
26,52 0,0001
13-18
b
127 83,5 25 16,5 152 100
19-24
a
188 98,9 02 1,1 190 100
Babesia
bigemina
8-12
ns
148 90,2 16 9,8 164 100
0,0274 0,9864
13-18
ns
138 90,8 14 9,2 152 100
19-24
ns
172 90,5 18 9,5 190 100
Variáveis seguidas por mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste do Qui-quadrado a 5% de probabilidade.
ns
não significativo pelo teste de Qui-quadrado (χ²) ao nível de 5% de probabilidade.
4 DISCUSSÃO
Os valores encontrados para B. bovis (91,7%) e para B. bigemina (90,5%)
em bezerros procedentes de Araguaína, Tocantins, demonstram uma alta
prevalência de animais soropositivos para os agentes. Esses dados são
aproximados aos resultados encontrados em bovinos no Estado do Pará (GUEDES
JÙNIOR et al., 2008) e consideravelmente superiores aos valores encontrados nos
Estados de Rondônia e Acre (BRITO et al., 2007), demonstrando que a enfermidade
assume distribuição diferente dentro de uma mesma região.
As diferenças encontradas em uma mesma região podem ser decorrentes
da variação na taxa de infecção por carrapatos e, subsequentemente, de uma
variação na taxa de inoculação nos bovinos (SALCEDO et al., 1987). Okasi et al.
(2002) num estudo com infecção natural em bovinos Nelore, na região de
Umuarama (PR), detectaram que entre as propriedades estudadas ocorreu uma
variação de 36,7% a 92% de animais soropositivos para B. bovis, mostrando que
dentro de uma mesma localidade, existem diferenças relevantes entre os rebanhos;
fator esse que pode estar ligado a aumentos sazonais da população de carrapatos,
51
falhas em seu controle ou a introdução de animais susceptíveis oriundos de áreas
livres de carrapato.
É classificada como área de estabilidade enzoótica, aquelas nas quais os
rebanhos apresentam uma frequência de anticorpos acima de 75% e áreas de
instabilidade cujos rebanhos apresentam frequência inferior a 75% (MAHONEY;
RONEY, 1972; D’ANDREA et al., 2006). A soroprevalência encontrada no presente
estudo foi superior 75%, caracterizando a região de Araguaína como área de
estabilidade enzoótica para babesiose bovina.
Segundo Kessler et al. (1983) numa situação de estabilidade enzoótica,
os bezerros são infectados nos primeiros meses de vida, sendo protegidos por
anticorpos colostrais (imunidade passiva), possibilitando o desenvolvimento de
imunidade ativa sem sofrer a doença clínica. Entretanto, Silva et al. (2007) num
estudo em bezerros de 1-50 dias de idade, concluíram que em condições de elevada
infestação por carrapatos pode ocorrer alta morbidade e mortalidade, mesmo no
período de proteção por anticorpos colostrais.
Outras regiões do país foram consideradas como áreas de estabilidade e
instabilidades como demonstra a Tabela 4.
Tabela 4 - Prevalência de Babesia bovis e Babesia bigemina
em diversas regiões
brasileiras.
Áreas
Prevalência (%)
B. bovis B. bigemina
ESTABILIDADE
Araguaína-TO (Presente estudo) 91,7 90,5
Nordeste do Pará (GUEDES JÚNIOR et al., 2008) 98,8 99,2
Goiânia-GO (SANTOS et al., 2001) 98,9 93,3
Mesorregião Fluminense-RJ (SOARES et al., 2000) 90,9 -
Campos dos Goyatacazes-RJ (FOLLY et al., 2009) 90,5 78,7
Zona da Mata-MG (SALCEDO et al., 1987) 79,0 82,5
Paudalho-PE (BERTO et al., 2008) 76,5 97,6
Semiárido da Bahia (BARROS et al., 2005) 77,7 75,5
INSTABILIDADE
Rondônia (BRITO et al., 2007) 9,0 3,0
Acre (BRITO et al., 2007) 7,1 0,8
Londrina-PR (VIDOTTO et al., 1997) 60,1 69,3
Mesorregião Fluminense-RJ (SOUZA et al., 2000) - 69,7
52
O hospedeiro e o meio ambiente são fatores que influenciam na
prevalência da babesiose em uma determinada região (MAHONEY; ROSS, 1972).
Considera a região Amazônica como área endêmica para babesiose devido a
existência do carrapato durante todo o ano (LIMA et al., 1999). A alta prevalência
observada nesse estudo corrobora os achados do levantamento formal, realizado no
momento da coleta das amostras, onde foi observado alto grau de infestação por
carrapatos mesmo nas propriedades que faziam uso de medicamentos do grupo
farmacológico das avermectinas. Essas observações associadas ao clima úmido da
região, que favorece a multiplicação de carrapatos principalmente na época
chuvosa, podem ter contribuído para alta prevalência.
Em relação ao sexo, não houve diferença significativa para B. bovis e
para B. bigemina, resultados estes semelhantes aos encontrados por Soares et al
(2000) e Souza et al. (2000) em pesquisa de Babesia spp em bovinos desenvolvida
na mesorregião Norte Fluminense do Estado do Rio de Janeiro, verificando que o
sexo não demonstrou ser fator de risco ou de proteção.
Também não houve diferença significativa para faixa etária em animais
infectados por B. bigemina, dados esses similares ao encontrado por Souza et al.
(2000). Porém houve significância para B. bovis, destacando a faixa etária de 19-24
meses com maior prevalência, resultado semelhante ao encontrado por Soares et al.
(2000), que constataram uma diferença significativa quanto ao grupo etário estudado
para B. bovis, sendo o grupo de um a três anos com maior prevalência do agente.
Essa diferença pode está relacionada ao fato da região de Araguaína ser
considerada como área de estabilidade e as fêmeas por possuírem anticorpos anti-
Babesia bovis passam aos bezerros através do colostro (imunidade passiva). A
imunidade perdura por aproximadamente dois meses quando então, o animal fica
suscetível às infecções, produzindo seus próprios anticorpos (imunidade ativa) logo,
quanto maior a idade maior a possibilidade do contato com o agente.
Além da classificação de Araguaína, pela prevalência global, em área de
estabilidade, outro fator levado em consideração é a distribuição da infecção pela
faixa etária. De acordo com Gonçalves (2000), considera áreas de estabilidade
enzoótica aquelas em que existe um equilíbrio entre imunidade e doença, tendo um
percentual de 75% dos animais com idade acima de nove meses portadores da
hemoparasitose, porém a infecção se mantém assintomática nos animais mais
velhos devido as reinfecções pela manutenção da população de R. microplus, que
53
infestam os animais durante todo o ano, resultando em baixa mortalidade em
animais adultos.
5 CONCLUSÃO
A região de Araguaína foi considerada como uma área de estabilidade
enzoótica para B. bovis e B. bigemina. Desta forma, a região estudada oferece risco
aos animais suscetíveis, procedentes de áreas de instabilidade, que são
introduzidos nessa região, sendo necessário o uso de medidas preventivas
adequadas nessas ocasiões, principalmente, estratégias eficazes para o controle de
carrapatos.
AGRADECIMENTO
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela
bolsa de estudo concedida. A Profª. Dra. Rosângela Zacarias Machado (Laboratório
de Imunoparasitologia UNESP/Jaboticabal-SP), pela realização dos exames
laboratoriais.
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58
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
Soroprevalência de anaplasmose bovina na região de Araguaína, Estado do
Tocantins, Brasil
Hébelys Ibiapina da Trindade
ARAGUAÍNA
2010
59
RESUMO
Soroprevalência de anaplasmose bovina na região de Araguaína, Estado do
Tocantins, Brasil
A anaplasmose bovina é uma hemoparasitose causada pela Anaplasma marginale.
Pode ser transmitida biologicamente pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus)
microplus, bem como mecanicamente por insetos hematófagos ou fômites
contaminados. Devido à importância da enfermidade, a pesquisa objetivou
determinar a soroprevalência de anticorpos anti-A. marginale da região de
Araguaína, Tocantins. Foram coletadas 506 amostras de soros de bezerros com
faixa etária compreendida de oito e 24 meses, fêmeas e machos, obtendo-se 10 mL
de sangue, assepticamente, por punção da veia coccígena, sendo centrifugado para
separação do soro e armazenado a -20ºC até o momento da realização do teste
sorológico. A determinação dos anticorpos anti-A. marginale foi realizada por meio
do ensaio imunoenzimático de adsorção indireto e como análise estatística utilizou-
se o Qui-Quadrado (χ
2
) com correção de Yates, para distribuição da prevalência das
enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção. Para verificação se o
sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi calculado a Odds ratio (OR).
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico
Graphpad Prism. 5 – Windows (2009), com intervalo de confiança (IC) de 95%. A
influência do sexo na infecção por A. marginale (OR=2,040) funcionou como um
fator de proteção para as fêmeas. A prevalência obtida para bezerros foi de 89,9%
para A. marginale, caracterizando a região como área de estabilidade enzoótica,
com os animais infectados servindo como fonte de infecção para os demais,
principalmente, aqueles procedentes de regiões de instabilidade ou de áreas livres,
onde o contato com o agente resultaria em doença potencialmente fatal.
Palavras-chave: Anaplasma marginale, bezerros, ELISA indireto, estabilidade
enzoótica.
60
ABSTRACT
Seroprevalence of bovine anaplasmosis in the region of Araguaina, State of
Tocantins, Brazil
The bovine anaplasmosis is a hemoparasitosis caused by Anaplasma marginale.
Can be transmitted biologically by Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks, and
mechanically by insect bites or contaminated fomites. Due the diseases importance,
this research aims to determinate the sereprevalence of anti-A. marginale in the
region of Araguaína, Tocantins. 506 blood samples were collected from calves, from
8 to 24 months-old, females and males, the 10 mL blood samples were aseptically
collected by puncture of the coccygeal vein, and centrifuged to separate the serum,
then stored at -20°C until the serological test. The determination of anti-A. marginale
antibodies was made using indirect Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA).
Statistical analysis between the variables was obtained through the statistical test
Chi-square (χ
2
) with Yates correction, for distribution of the prevalence of disease by
age group was not applied this correction. To check if the sex was considered a risk
factor or protection, we calculated odds ratio (OR). All statistical analyzes were
performed using the statistical program Graphpad Prism. 5 - Windows (2009), with
95% a confidence interval (CI). The influence of sex on infection by A. marginale (OR
= 2.040) functioned as a protective factor for females. The obtained prevalence in the
calves was 89.9% for A. marginale, characterizing the region as enzootic stability
region, in which the infected animals serve as source of infection to others, especially
those coming from regions of enzootic instability or free areas, where contact with the
agent would result in potentially fatal disease.
Keywords: Anaplasma marginale, calves, indirect ELISA, enzootic stability.
61
1 INTRODUÇÃO
A anaplasmose bovina é responsável por causar perdas econômicas,
principalmente, em países de clima tropical e subtropical, com alta morbidade e
mortalidade em bovinos (BARROS et al., 2005; GUEDES JÚNIOR et al., 2008), em
especial os bezerros (RIBEIRO; REIS, 1981), caracterizada por febre, anemia, perda
de peso, diminuição na produção de leite, abortamento e icterícia (OLIVEIRA et al.,
2003; RAMOS et al., 2007; MARANA et al., 2009).
É causada pela rickettsia intraeritrocítica Anaplasma marginale,
transmitida biologicamente por carrapatos e, mecanicamente por dípteros
hematófagos e fômites contaminados por sangue (SOUZA et al., 2001; ARAÚJO et
al., 2003; CARELLI et al., 2007). No Brasil, Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o
responsável pela transmissão biológica da anaplasmose; entre os carrapatos a
transmissão pode ocorrer tanto transestadial como intraestadialmente (KESSLER,
2001; PACHECO et al., 2004).
É importante conhecer a interação entre agente, hospedeiro e ambiente,
para caracterização das hemoparasitoses nas regiões fisiográficas, determinando as
áreas endêmicas do país (GONÇALVES, 2000). Existem vários métodos sorológicos
para detecção de anticorpos anti-A. marginale, sendo o ensaio de imunoadsorção
enzimática (ELISA) indireto o mais utilizado, devido à simplicidade do teste, alta
sensibilidade e especificidade, além de permitir a análise de um número maior de
amostras (BRAZ JÚNIOR et al., 1997; ARAÚJO et al., 1998; MADRUGA et al.,
2000).
A anaplasmose pode ser distribuída em áreas livres, as quais possuem
condições climáticas não favoráveis à multiplicação dos vetores; em áreas de
instabilidade enzoótica, onde as condições climáticas não são totalmente favoráveis
ao desenvolvimento dos vetores, porém podem ocorrer em uma determinada época
do ano, episódios de infestação temporária em população de risco; e áreas de
estabilidade enzoótica onde têm clima favorável ao desenvolvimento de vetores
durante todo o ano (VIDOTTO; MARANA, 2001).
A região de Araguaína possui o segundo maior rebanho de bovinos no
Estado do Tocantins (ADAPEC, 2008), sendo importante o desenvolvimento de
pesquisas a respeito da prevalência de enfermidades que interferem na
produtividade dos animais. Devido aos poucos estudos relacionados à epidemiologia
da anaplasmose e
m Araguaína foi desenvolvido o presente trabalho com o
de determinar
a soroprevalência de anticorpos anti
região.
2 MATERIAL E MÉTODO
2.1 Área de estudo
O referente trabalho foi desenvolvido na região de Araguaína que ocupa
uma área de 4.000,40
localizando-
se entre a latitude 07º11’28” e longitude 48º12’26”, com uma altitude
média de 227 metros
considerada como parte da Amazônia Oriental (KAMPEL; CÂMARA; MONTEIRO,
2001).
Figura 1
. Mapa do Estado do Tocantins, demonstrando a região de Araguaína.
(http://upload.wikimedia.
org/wikipedia/commons/thumb/c/c0/Tocantins_Municip_Araguaina.svg/365px
Tocantins_Municip_Araguaina.svg.png)
2.2 Amostragem
dos soros
O cálculo da amostra foi realizado através do
considerando-se a
população de bovinos na faixa etária de 0
m Araguaína foi desenvolvido o presente trabalho com o
a soroprevalência de anticorpos anti
-A.
marginale
2 MATERIAL E MÉTODO
O referente trabalho foi desenvolvido na região de Araguaína que ocupa
uma área de 4.000,40
km
2
, situada na região norte do Estado do Tocantins,
se entre a latitude 07º11’28” e longitude 48º12’26”, com uma altitude
(Figura 1)
, clima tropical úmido (SEPLAN, 2009), sendo
considerada como parte da Amazônia Oriental (KAMPEL; CÂMARA; MONTEIRO,
. Mapa do Estado do Tocantins, demonstrando a região de Araguaína.
org/wikipedia/commons/thumb/c/c0/Tocantins_Municip_Araguaina.svg/365px
Tocantins_Municip_Araguaina.svg.png)
dos soros
O cálculo da amostra foi realizado através do
programa Epi Info 6.04
população de bovinos na faixa etária de 0
-
24 meses de 98.715
62
m Araguaína foi desenvolvido o presente trabalho com o
objetivo
marginale
em bezerros desta
O referente trabalho foi desenvolvido na região de Araguaína que ocupa
, situada na região norte do Estado do Tocantins,
se entre a latitude 07º11’28” e longitude 48º12’26”, com uma altitude
, clima tropical úmido (SEPLAN, 2009), sendo
considerada como parte da Amazônia Oriental (KAMPEL; CÂMARA; MONTEIRO,
. Mapa do Estado do Tocantins, demonstrando a região de Araguaína.
org/wikipedia/commons/thumb/c/c0/Tocantins_Municip_Araguaina.svg/365px
-
programa Epi Info 6.04
24 meses de 98.715
63
animais (ADAPEC, 2008), possibilidade de detecção da doença de 50%
(correspondente a doenças de ocorrência desconhecida em determinada
população), intervalo de confiança de 95% e o pior resultado esperado de 10%,
resultando no N amostral de 384 animais. Esse valor foi acrescido de 10% para
reduzir potenciais perdas, resultando assim, num total de 423 amostras. Ao final
foram coletados, aleatoriamente, 506 soros de bovinos com 8-24 meses de idade
entre machos e fêmeas.
A coleta foi realizada nos meses de março a junho de 2009, onde foram
coletados 10 mL de sangue, assepticamente, por punção da veia coccígena, sendo
estes centrifugados a 2000g por 10 minutos para separação dos soros e aliquotados
em tubos tipo “Eppendorf” de 2 mL, os quais foram armazenados a -20ºC até o
momento da realização do teste sorológico; durante as coletas foi verificado se havia
presença de vetores e se era realizado o controle dos mesmos.
2.3 Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto
A metodologia para análise dos soros foi a técnica do ELISA indireto
descrita por Machado et al. (1997) com algumas modificações. O soro obtido foi
analisado no Laboratório de Imunoparasitologia da Faculdade de Ciências Agrárias
e Veterinária da UNESP (Jaboticabal-SP). Na microplaca de ELISA
(Nunclon
TM
Surface, Nunc, Denmark) em cada poço foram adicionados 100 µL do
antígeno solúvel diluído em tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,05M pH 9,6,
estando a concentração protéica padronizada em 10 µg/mL
-1
(anti A. marginale). As
placas foram incubadas “overnight” a uma temperatura de 4ºC, o excesso de
antígeno foi removido por três lavagens com tampão fosfato 0,05% (PBS) de Tween
20. As placas foram bloqueadas com 200 µL de Tween 20 contendo 5% de leite em
pó desnatado por 90 minutos a 37ºC, para reduzir a ligação não-específica, sendo
removido após a incubação com três lavagens consecutivas de PBS Tween 20.
Cada amostra de soro (controle negativo, controle positivo, soro teste) foi diluída
(1:100) em PBS Tween 20 com 5% de soro de coelho normal, adicionado em cada
poço e incubadas por 90 minutos a 37ºC e lavadas como descrito acima. Foram
adicionados em cada poço 100 µL de conjugado fosfatase alcalina anti-bovino IgG
(Sigma Chemical Co.) diluído em 1:30.000 e, em seguida, incubadas por 90 minutos
a 37°C, sendo lavadas posteriormente. Finalizando o processo foi adicionado 100 µL
64
em cada poço, um substrato p-nitrofenilfosfato diluído em um tampão de
dietanolamina pH 9,8. Esta placa foi incubada a temperatura ambiente por 30
minutos. A leitura da reação foi realizada em um leitor de microplacas (Dynex
Technology) a um comprimento de ondas de 405 ηm.
Os valores de absorbância (ponto de corte) nos soros foram agrupados
em níveis de ELISA (NE), os quais variam de zero a nove preconizado por Machado
et al. (1997). A discriminação da absorbância (valor de corte) foi determinada como
sendo duas vezes e meia a média do valor de absorção do grupo negativo,
considerando as leituras acima do valor de corte positivas.
2.4 Análise estatística
Para análise estatística das variáveis estudadas foi utilizado o teste
estatístico do Qui-Quadrado (χ
2
) com correção de Yates, para distribuição da
prevalência das enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção. Para
verificação se o sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi calculado a
Odds ratio (OR). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o
programa estatístico Graphpad Prism. 5 – Windows (2009), com intervalo de
confiança (IC) de 95%.
3 RESULTADO
Durante as coletas de sangue foi verificada alta infestação por carrapatos
e presença massiva de insetos hematófagos nas propriedades (Figura 2), apesar do
uso de medicamentos a base de avermectinas para carrapatos e de piretróides
como a cipermetrina usada como inseticida e acaricida.
65
Figura 2. Presença de insetos hematófagos durante a realização das coletas, na
região de Araguaína-TO.
A pesquisa de anticorpos anti-A. marginale em bezerros procedentes da
região de Araguaína revelou uma prevalência de 89,9%, com diferença significativa
para o sexo que funcionou como um fator de proteção para infecção por A.
marginale (OR=2,040) (Tabela 1), estando as fêmeas mais protegidas para infecção
que os machos.
Tabela 1 - Prevalência sorológica de anticorpos anti-Anaplasma marginale em bezerros
segundo o sexo na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil.
Sexo
Anaplasma marginale
χ
χχ
χ²
Valor de p
OR
(IC 95%)
Positivo
Negativo
Total
N
%
N
%
N
%
Macho
a
187 93,5 13 6,5 200 100
4,044 0,0443
2,040
(1,057 a 3,934) Fêmea
b
268 87,6 38 12,4 306 100
Variáveis seguidas por mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste do Qui-quadrado com correção de Yates a 5%
de probabilidade.
OR= odds ratio; IC= intervalo de confiança
Não houve diferença significativa entre as faixas etárias analisadas
(p>0,05) (Tabela 2).
66
Tabela 2 - Prevalência sorológica de anticorpos anti-Anaplasma marginale em bezerros
segundo a faixa etária na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil.
Faixa etária
(meses)
Anaplasma marginale
χ
χχ
χ²
Valor de p
Positivo
Negativo
Total
N
%
N
%
N
%
08-12
ns
141 87,0 21 13,0 162 100
3,713 0,1562 13-18
ns
144 93,5 10 6,5 154 100
19-24
ns
170 89,5 20 10,5 190 100
ns
não significativo pelo teste de Qui-quadrado (χ²) ao nível de 5% de probabilidade
4 DISCUSSÃO
A alta prevalência observada para A. marginale em bovinos da região de
Araguaína foi também encontrada em outras pesquisas realizadas no Norte do país
como a de Brito et al. (2007) em bovinos de Rondônia e Acre com uma prevalência
de 98,6% e 92,87%, respectivamente. Entretanto, no nordeste do Estado do Pará,
Norte do Brasil, foi observada uma prevalência um pouco mais baixa para a referida
enfermidade, 68,3% (GUEDES JÚNIOR et al., 2008).
A alta prevalência de A. marginale observada nesse estudo corrobora os
achados do levantamento formal no momento em que as coletas de sangue foram
realizadas, ocasionando altas infestações. Ressalta-se que mesmo com a utilização
de medicamentos à base de avermectinas e de piretróides como a cipermetrina, a
infestação permaneceu alta. A presença massiva de carrapatos bem como de
insetos hematófagos, associadas ao clima úmido da região, que favorece a
multiplicação dos vetores principalmente na época chuvosa, pode ter contribuído
para a alta prevalência. Gonçalves (2000) relata que a disseminação da
anaplasmose no Brasil ocorre com maior intensidade nas épocas quentes e úmidas
do ano, quando a população de vetores é maior.
Classifica-se como área de estabilidade enzoótica quando uma frequência
de anticorpos apresenta-se acima de 75%, áreas de instabilidade quando essa
frequência é inferior a 75% (MAHONEY; RONEY, 1972; D’ANDREA et al., 2006). A
prevalência de 89,9% para anticorpos anti-A. marginale encontrado na região de
Araguaína classifica a região como área de estabilidade enzoótica.
Classificadas também como área de estabilidade enzoótica para A.
marginale estão a mesorregião norte fluminense (RJ) com prevalência de 91,16%
(SOUZA et al., 2000); a mesorregião do médio Paraíba com uma prevalência de
67
98,21% (SOUZA et al., 2001) e as microrregiões de Rondônia e Acre com uma
prevalência de 98,6% e 92,87%, respectivamente (BRITO et al., 2007), e a região do
semi-árido da Bahia onde a prevalência de A. marginale foi de 98,9% (BARROS et
al., 2005).
No Brasil, são consideradas as áreas de instabilidade enzoótica para A.
marginale a região nordeste do Estado do Pará, com uma prevalência de 68,3%
(GUEDES JÚNIOR et al., 2008); Londrina, no Estado do Paraná, na qual a
prevalência observada foi de 67,38% (VIDOTTO et al., 1997); e as regiões de Ponta
Grossa, Guarapuava e Laranjeiras do Sul, região centro-sul do Estado do Paraná,
com uma prevalência de 58,74% (MARANA et al., 2009).
Algumas regiões demonstram diferenças na epidemiologia da infecção
por Anaplasma marginale com áreas de estabilidade e instabilidade em uma mesma
região ou localidade, ou ainda uma modificação da classificação ao longo dos anos,
como foi o caso do estudo realizado por Vidotto et al. (1997) em Londrina, Paraná
onde detectaram uma prevalência de 67,38% classificando a área como de
instabilidade e, posteriormente, na pesquisa de Andrade et al. (2001) também em
Londrina, onde detectaram uma prevalência 92,9% para A. marginale classificando a
área como de estabilidade enzoótica.
Na presente pesquisa, em relação ao sexo, houve diferença significativa,
sendo a fêmea considerada como fator de proteção para infecção por A. marginale,
porém não se tem uma explicação para este fato devido os animais serem criados
em mesmo pasto. Esse dado difere com os encontrados na literatura, que não
evidenciou diferença significativa segundo o sexo (SOUZA et al., 2000; SOUZA et
al., 2001).
Em relação à faixa etária os resultados aqui obtidos são semelhantes aos
encontrados por Souza et al. (2000) na mesorregião norte fluminense (RJ) e Souza
et al. (2001) na mesorregião do médio Paraíba, pois não houve diferença
significativa nas faixas etárias. Vale ressaltar que bezerros com 30-90 dias,
particularmente, 60 dias, é uma população com potencial risco de infecção e
manifestações clínicas, mesmo com a imunidade humoral como um dos fatores de
resistência à anaplasmose em animais jovens (MADRUGA et al., 1985) e que a
infecção natural dos bezerros pelo A. marginale após o nascimento é mais
dependente dos níveis de anticorpos colostrais absorvidos do que a intensidade da
infestação pelo carrapato R. microplus (PACHECO et al., 2004).
68
5 CONCLUSÃO
A região de Araguaína demonstrou uma alta prevalência para anticorpos
anti-A. marginale sendo, portanto, classificada como uma região de estabilidade
enzoótica para A. marginale, oferecendo risco principalmente na introdução de
animais suscetíveis, procedentes de áreas de instabilidade, para esta região. Assim,
tornam-se necessário o uso de medidas preventivas adequadas e melhores
programas de controle de vetores, principais transmissores dessa enfermidade.
AGRADECIMENTO
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela
bolsa de estudo concedida. A Profª. Dra. Rosângela Zacarias Machado (Laboratório
de Imunoparasitologia UNESP/Jaboticabal-SP), pela realização dos exames
laboratoriais.
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