( PDF ) Análise citogenética em alta resolução de 2q37 e 22q13 molecular do gene SHANK3 em doença do espectro autístico

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Ana Luiza Bossolani Martins

Análise citogenética em alta resolução de 2q37 e 22q13 e molecular

do gene SHANK3 em Doenças do Espectro Autístico

São José do Rio Preto

2010

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Ana Luiza Bossolani Martins

Análise citogenética em alta resolução de 2q37 e 22q13 e molecular

do gene SHANK3 em Doenças do Espectro Autístico

Dissertação apresentada como parte dos

requisitos para obtenção do título de

Mestre em Genética, junto ao Programa de

Pós-Graduação em Genética, do Instituto

de Biociências, Letras e Ciências Exatas

da Universidade Estadual Paulista “Júlio

de Mesquita Filho”, Campus de São José

do Rio Preto.

Orientadora: Profª. Drª. Agnes Cristina

Fett Conte

São José do Rio Preto

2010

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Martins, Ana Luiza Bossolani

Análise citogenética em alta resolução de 2q37 e 22q13 e molecular

do gene SHANK3 em Doenças do Espectro Autístico / Ana Luiza

Bossolani Martins. - São José do Rio Preto: [s.n.], 2010.

86 f. : il. ; 30 cm.

Orientadora: Agnes Cristina Fett Conte

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas.

1. Citogenética. 2. Autismo em crianças - Aspectos genéticos. 3.

Crianças - Desvio do desenvolvimento - Aspectos genéticos. 4. Doenças

do espectro autístico - Aspectos genéticos. 5. 2q37. 6. 22q13. 7.

SHANK3. I. Fett-Conte, Agnes Cristina. II. Universidade Estadual

Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título.

CDU - 575

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE

Campus de São José do Rio Preto - UNESP

Ana Luiza Bossolani Martins

Análise citogenética em alta resolução de 2q37 e 22q13 e molecular

do gene SHANK3 em Doenças do Espectro Autístico.

Dissertação apresentada como parte dos

requisitos para obtenção do título de

Mestre em Genética, junto ao Programa de

Pós-Graduação em Genética, do Instituto

de Biociências, Letras e Ciências Exatas

da Universidade Estadual Paulista “Júlio

de Mesquita Filho”, Campus de São José

do Rio Preto.

Banca Examinadora

Profª. Drª. Agnes Cristina Fett Conte

UNESP – São José do Rio Preto

Orientadora

Profª. Drª. Carina Tatiana Giunco

Fundação Padre Albino – Catanduva

Profª. Drª. Ana Elizabete Silva

UNESP – São José do Rio Preto

São José do Rio Preto

24/fevereiro/2010

Agradecimentos

À Deus.

Aos meus pais, Maria Inês e José Manoel, e aos meus familiares, pelo

incentivo ao ensino, por me ensinarem a lutar na dificuldade e a não desistir nunca

diante de um sonho, como esse.

À minha orientadora, Profa. Dra. Agnes Cristina Fett Conte, pela

confiança depositada, aos ensinamentos científicos acumulados no decorrer da

minha vida acadêmica, à paciência, o carinho e dedicação durante a realização

desse trabalho, além da amizade formada entre nós.

A todas as famílias do grupo de estudos de pacientes pela participação,

tempo disponível, pelo contato, essa parte com certeza de muita aprendizagem.

A Adriana Barbosa Gonçalves por transmitir sua experiência, seja ao lidar

com as famílias envolvidas nesse projeto, seja durante os procedimentos

laboratoriais, mas principalmente por seu dinamismo, atenção, pela confiança

depositada em mim nesses últimos três anos, e por todos os bons momentos que

passamos juntas nos finais de semana no laboratório.

Aos amigos do Laboratório de Genética Cristina Benitez Vendrame

Goloni, Valéria Cristina Ferrarese da Silva, Brasilina Fátima Mafei, Andrea

Borduchi e Paula Abdala com os quais eu aprendo lições de vida todos os dias.

A Profa. Dra. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni pela orientação e

disponibilidade durante a execução de parte desse estudo.

Ao Prof. Dr. Maurício Lacerda Nogueira por pelo auxílio e precisão

durante a execução de parte desse estudo, e “por abrir as portas” do seu

laboratório.

Ao técnico do Laboratório de Marcadores Moleculares e Bioinformática

Médica, Tiago Henrique por todo auxílio, paciência e pela amizade formada entre

nós.

A técnica do Laboratório de Virologia, Silvia Helena Pereira Nunes por

realizar o processo final do sequenciamento de todos os indivíduos estudados e

também por sua atenção.

A Profa. Dra. Eloiza Helena Tajara da Silva por “abrir as portas do seu

laboratório” e por toda a cooperação recebida nesse estudo.

Aos amigos do Laboratório de Marcadores Moleculares e Bioinformática

Médica pela atenção, pelo auxílio, pelo ambiente de cordialidade e respeito que

tornaram esse trabalho agradável.

Aos amigos Camila Ive Ferreira Oliveira, Carlos Fabian Mendiburu e

Paula Curi de Freitas por toda ajuda, paciência, carinho e companheirismo durante

esses dois anos de trabalho.

Aos amigos Ana Paula da Silva Perez, Gustavo Cassiano Cappati, Leandro

Pires Araújo, Vanessa Bellini Bardella, Lilian Nogueira, Fabiana Nakashima,

Daniela Prudente Teixeira Nunes, Camila Vieira, Fernanda Castanheira, Natália

Guelfi Furlani, Getúlio Minoru, Patricia Zazeri Leite, Felipe Micalli, Felipe

Cavassan, Adriana Sicuto de Oliveira, que me ajudaram e estiveram ao meu lado

nos meus melhores e nos meus piores dias.

Aos membros da banca examinadora, pela disponibilidade e atenção.,

Ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, onde foi possível

iniciar meus conhecimentos científicos.

Ao Programa de Pós-Graduação em Genética do Instituto de Biociências,

Letras e Ciências Exatas pelo apoio e incentivo a participação de eventos

científicos durante esse período.

A Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (Capes),

pelo auxílio financeiro concedido para o desenvolvimento deste projeto.

VII

“Seja responsável por aquilo que deseja se tornar.”

(Autor desconhecido)

VIII

RESUMO

As Doenças do Espectro Autístico incluem o Autismo, o Transtorno

Invasivo do Desenvolvimento Sem Outra Especificação e a Síndrome de

Asperger. A etiologia é muito discutida, devido a sua variação e complexidade.

São doenças que se manifestam nos três primeiros anos de vida, com uma

variação clínica que inclui comportamento ritualístico, fala ausente ou pouco

desenvolvida, além de problemas graves de relacionamento. Em 5 a 37 % dos

casos são observadas em comorbidade com outras afecções. Em indivíduos com

estas doenças já foram descritas alterações em todos os cromossomos e há genes

propostos como candidatos de estarem envolvidos na etiopatogenia. Também, há

relatos de casos com alterações subteloméricas, especialmente deleções,

envolvendo as extremidades distais dos braços longos dos cromossomos 2 e 22.

Mais recentemente foram observadas mutações no gene SHANK3, que está

localizado em 22q13.3, na população com Doenças do Espectro Autístico. Este

trabalho apresenta os resultados de um estudo citogenético e molecular realizado

em 48 indivíduos com doenças do espectro autístico. Foram estudados o cariótipo

por bandamento GTG convencional, as regiões 2q37 e 22q13 pela técnica de

bandamento GTG em alta resolução, os éxons 8 e 22 do gene SHANK3 por

seqüenciamento direto. A análise cariotípica convencional e dos éxons 8 e 22

revelaram resultados normais. A análise em alta resolução de um indivíduo

mostrou resultado com possível deleção em 2q37, que não foi confirmada por

técnica complementar. O número restrito de pacientes estudados deve ser

considerado, porém pode ser sugerido que alterações em 2q37, 22q13 e dos éxons

8 e 22 do gene SHANK3, sejam eventos mais raros do que se supunha em Doenças

do Espectro Autístico e sua investigação pode ser indicada na triagem de

pacientes e para o aconselhamento genético das famílias não seja justificada.

Entretanto, essas investigações poderiam ser indicadas nessa população quando

ela for selecionada quanto à presença de características dismórficas indicativas de

possíveis deleções envolvendo as regiões 2q37 e 22q13. Além de avaliação

molecular do gene SHANK3, quando a região 22q13 estiver deletada.

Palavras-chave: doenças do espectro autístico, 2q37, 22q13, SHANK3.

ABSTRACT

The autism spectrum disorders including autism, Pervasive Developmental

Disorder Not Otherwise Specified and Asperger syndrome. The etiology is much

debated due to its variation and complexity. These are disorders that are

manifested in the first three years of life, with a clinical variant that includes

ritualistic behavior, speech absent or poorly developed, in addition to serious

relationship. In 5 to 37% of cases are observed in association with other diseases.

In individuals with these diseases have been described changes in all

chromosomes and genes are proposed as candidates to be involved in

pathogenesis. Also, there are reports of cases with subtelomeric changes,

especially deletions involving the distal ends of the long arms of chromosomes 2

and 22. More recently, mutations were observed in the gene SHANK3, which is

located on 22q13.3, in the population with autism spectrum disorders. This paper

presents the results of a cytogenetic and molecular study performed in 48

individuals with autistic spectrum disorders. We studied the karyotype by GTG

conventional regions 2q37 and 22q13 by GTG banding technique in high

resolution, the exons 8 and 22 SHANK3 gene by direct sequencing. The

conventional karyotype analysis and exons 8 and 22 point normal results. The

high resolution analysis of an individual with demonstrated results possible

deletion in 2q37, which was not confirmed by complementary technique. The

small number of patients should be considered, but may be suggested that changes

in 2q37, 22q13 and exons 8 and 22 of the gene SHANK3, are more rare than

previously thought on the autism spectrum disorders and their investigation may

be indicated in screening of patients for genetic counseling of families is not

justified. However, these investigations could be cited in this population when it is

selected for the presence of dysmorphic features indicative of possible deletions

involving regions 2q37 and 22q13. In addition to molecular analysis of gene

SHANK3, when the region 22q13 is deleted.

Keywords: autistic spectrum disorders, 2q37, 22q13, SHANK3.

XII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Regiões associadas com DEA, com seus respectivos genes

candidatos.....................................................................................

Figura 2 Sinapse excitatória mostrando a proteína shank (circulada em

vermelho) com a neuroligina (circulada em rosa), ligada a

neuroxina (circulada em azul) que participam da formação do

complexo de densidade pós-sináptica (PSD)................................

Figura 3 Diagrama do cromossomo 2 à esquerda e par de cromossomos

2 à direita, em bandamento GTG em alta resolução, com

destaque da região 2q37 presente no par de homólogos..............

Figura 4 Metáfase em bandamento GTG em alta resolução. O ideograma

do cromossomo 22 à esquerda e as setas indicam a região

22q13.3 presente no par de homólogos.......................................

Figura 5 (a) Esquema representativo das bandas GTG do cromossomo 2

à esquerda e par de cromossomos 2 normais à direita. As setas

indicam 2q37 (b) Esquema representativo das bandas GTG do

cromossomo 2 à esquerda, cromossomo 2 normal no centro e

sugestivo de deleção em 2q37 do paciente (seta vermelha), `a

direita (c) Metáfase parcial submetida à técnica de FISH, com

os quatro sinais normais em vermelho. As setas azuis e pretas

indicam a região centromérica e a região 2q37,

respectivamente............................................................................

Figura 6 Perfil eletroforético em gel de agarose 2% correspondente a

amplificação do éxon 8 do gene SHANK3 nas colunas 2-7 e 9-

11. Marcação com Ladder de 100pb na coluna 1, ausência de

amplificação na coluna 8 e controle negativo na coluna 12

......................................................................................................

Figura 7 Perfil eletroforético em gel de agarose 2% correspondente a

amplificação do éxon 22-ponto1 do gene SHANK3 nas colunas

de 2-4 e 6-13. Marcação com Ladder de 100pb na coluna 1,

ausência de amplificação na coluna 5 e controle negativo na

coluna 14.......................................................................................

XIII

Figura 8

Perfil eletroforético em gel de agarose 2% correspondente a 3,

6, 8-10 e 12. Marcação com Ladder de 100pb na coluna 1,

ausência de amplificação nas colunas 2, 4-5, 7 e controle

negativo na coluna 13...................................................................

Figura 9 Eletroferograma parcial das sequências right e left do éxon 8

do gene SHANK3 contendo a região de 80-157pb do amplícon

total de 200pb analisadas no programa DS Gene 2.0 (Accelrys,

USA).............................................................................................

Figura 10 Eletroferograma parcial das sequências right e left do ponto 1

do éxon 22 do gene SHANK3 contendo os primeiros 80pb do

total do amplícon de 186pb analisadas no programa DS Gene

2.0 (Accelrys, USA).....................................................................

Figura 11 Eletroferograma parcial das sequências right e left do ponto 2

do éxon 22 do gene SHANK3 contendo a região de 50-127pb do

total do amplícon de 183pb analisadas no programa DS Gene

2.0 (Accelrys, USA)......................................................................

XIV

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Caracterização da casuística quanto à idade (em anos), sexo,

diagnóstico e procedência.............................................................. 33

Tabela 2 Resultados obtidos das diferentes análises realizadas em cada

caso estudado.................................................................................. 45

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Programa de amplificação utilizado para os primers 1 e 2 do

gene SHANK3............................................................................... 39

Quadro 2 Programa de amplificação utilizado para o primer 3 do gene

SHANK3........................................................................................

Quadro 3

Condições de reação utilizadas para a amplificação dos éxons

oito e 22 do gene SHANK3............................................................ 40

Quadro 4 Primers para amplificação e sequenciamento do gene

SHANK3......................................................................................... 40

XVI

SUMÁRIO

Resumo.............................................................................................

VIII

Abstract............................................................................................

Introdução........................................................................................ 18

1.1 Caracterização dos Transtornos Invasivos do Desenvolvimento...... 18

1.2 Etiologia das DEA............................................................................ 21

1.3 Regiões subteloméricas e DEA........................................................ 24

1.4 Gene SHANK3.................................................................................. 26

Objetivos.......................................................................................... 30

Material e Métodos......................................................................... 31

3.1 Casuística.......................................................................................... 31

3.2 Métodos............................................................................................ 33

3.2.1 Cultura de linfócitos, bandamento GTG convencional e em alta

resolução............................................................................................

3.2.2 Extração de DNA.............................................................................. 35

3.2.3 Amplificação do DNA extraído........................................................ 36

3.2.4 Eletroforese em gel de agarose..........................................................

3.2.5 Purificação dos produtos de PCR para sequenciamento................... 40

3.2.6 Sequenciamento do gene SHANK3................................................... 40

Resultados........................................................................................ 42

Discussão.......................................................................................... 51

Conclusões........................................................................................ 57

Referências....................................................................................... 58

Anexos.............................................................................................. 68

8.1 Anexo A- Termo de Consentimento Livre e Esclarecido................. 68

Apêndices......................................................................................... 71

9.1 Apêndice A- Análise citogenética por bandamento GTG

convencional e em alta resolução da região 2q37 em pacientes

com doenças do Espectro Autístico.................................................. 71

XVII

9.2 Apêndice B- Molecular Evaluation of exon 8 e 22 of the SHANK3

gene in Autism Spectrum Disorders………………………………..

9.3 Apêndice C- Evaluation of 2q37 and 22q13 by High Resolution

Cytogenetics in Brazilians with Autism Spectrum Disorder……….

Introdução

1. INTRODUÇÃO

1.1 Caracterização dos Transtornos Invasivos do Desenvolvimento

A designação Transtornos Invasivos do Desenvolvimento (Pervasive

Developmental Disorders - PDD) surgiu no final dos anos 60, derivada

especialmente dos trabalhos de M. Rutter, I. Kolvin e D. Cohen

(MERCADANTE; VAN DER GAAG; SCHWARTZMAN, 2006). Refere-se a

um grupo de doenças psiquiátricas que se caracterizam por manifestações em três

áreas (domínios): social, da comunicação e do comportamento. A interação social

e as habilidades de comunicação estão qualitativamente prejudicadas. O

comportamento padrão é caracterizado por repetições e estereotipias, com

interesses muito limitados, entre outros (APA, 1994).

A identificação dos PDD e suas manifestações seguem os critérios

diagnósticos descritos no Manual Estatístico e Diagnóstico da Associação

Americana de Psiquiatria (DSM – IV) (APA, 1994), e se baseia no número e

distribuição de aspectos comportamentais de cada domínio, assim como na idade

das manifestações. Incluem cinco diagnósticos: Autismo, Síndrome de Asperger,

Síndrome de Rett, Transtorno Desintegrativo da Infância e Transtorno Invasivo do

Desenvolvimento Sem Outra Especificação (PDD-NOS). O Código Internacional

de Doenças (CID-10) inclui também outras duas categorias, Autismo Atípico e

Transtorno Hiperativo Associado com Retardo Mental e Movimentos

Estereotipados (CARVALHEIRA; VERGANI; BRUNONI, 2004; SCHMIDT et

al., 2008).

As manifestações cognitivas destas doenças psiquiátricas são altamente

variáveis e podem ser muito semelhantes. São descritos desde indivíduos com

quadros clínicos muito exacerbados, que incluem ausência total de linguagem

oral, retardo mental grave e auto-injúrias, até indivíduos com um QI acima da

média, apesar de apresentarem prejuízos na linguagem e habilidades sociais

inadequadas (GILLBERG; COLEMAN, 2000; BARON- COHEN et al., 2001;

MUHLE; TRENTACOSTE; RAPIN, 2004).

Indivíduos com PDD também podem apresentar outras manifestações

clínicas, como convulsões, que são observadas em cerca de 30% dos casos, o que

sugere a ocorrência de dano cerebral pela ação de fatores neurobiológicos

(HUGHES, 2009).

Dentre os diagnósticos, o Autismo é o mais estudado, provavelmente pela

precocidade das manifestações e maior freqüência populacional em geral

(HUGHES, 2009). Compromete quatro vezes mais meninos do que meninas e é

caracterizado por prejuízos no desenvolvimento global, que inclui respostas

anormais a estímulos auditivos e visuais, problemas graves de relacionamento

social, comportamento ritualístico, isolamento, aderência inflexível a rotinas e

rituais, preocupações persistentes com partes de objetos, estereotipias motoras,

agitar de mãos e balançar do corpo, capacidade diminuída para pensamentos

abstratos e simbólicos, ou para jogos imaginativos, e inteligência subnormal,

normal ou acima do normal. Também são observados déficits qualitativos na

comunicação, como a falta ou atraso no desenvolvimento da linguagem (não

compensada por outros meios de comunicação), dificuldade de abstração, uso

estereotipado de linguagem, incapacidade em iniciar e manter diálogo, entre

outros (NIKOLOV; JONKER; SCAHILL, 2006; BENÍTEZ-BURRACO, 2008).

O brincar também está comprometido no autista, que não participa de brincadeiras

imaginativas espontâneas e sociais imitativas que seriam apropriadas para sua

idade cronológica (LOSH et al., 2008; SINZIG et al., 2008).

O risco de recorrência na irmandade é alto e os estudos de gêmeos

monozigóticos mostram uma herdabilidade de 60 a 90 %, o que mostra a

participação de forte componente genético na etiologia da doença. Não há relação

com status de imigração, condições socioeconômicas ou etnia (MUHLE;

TRENTACOSTE; RAPIN, 2004).

Na Síndrome de Asperger também há prejuízos precoces na interação

social, os interesses são restritos e o comportamento é repetitivo, como os

observados no Autismo, porém, não há atraso significativo na linguagem, o

desenvolvimento cognitivo geralmente está preservado e a memória pode ser

prodigiosa. Os indivíduos com essa síndrome ficam isolados socialmente, mas não

por ficarem ausentes, mas porque na presença de outras pessoas eles se

aproximam, mas de forma excêntrica e totalmente inadequada. Por exemplo,

podem se apresentar ao interlocutor, geralmente um adulto, com uma conversa

caracterizada como longa e “pedante” sobre um assunto restrito e apenas de

interesse próprio (KLIN et al, 2003; KOPRA et al., 2008; ROY et al., 2009).

O Transtorno Desintegrativo da Infância é diagnosticado quando há

regressão, a partir de cerca de três anos de idade, de habilidades anteriormente

adquiridas de comportamento, cognição e de linguagem. Os pais referem uma

total regressão do comportamento, que passa a apresentar características autísticas

(MORDEKAR et al, 2009).

A Síndrome de Rett afeta predominantemente mulheres e também se

caracteriza por regressão do desenvolvimento, mas progressiva e acompanhada

por atrofia muscular e cerebral, que resulta em um quadro típico de estereotipia

manual e marcha alterada (BADOE, 2009).

PDD-NOS é uma categoria diagnóstica de exclusão. Um indivíduo pode

receber este diagnóstico se preencher critérios do domínio social e mais um dos

dois outros domínios (comunicação ou comportamento). Ocorrem prejuízos

graves no desenvolvimento da interação social recíproca e na capacidade de

comunicação verbal ou não-verbal, além de outros, mas em número insuficiente

para ser considerado o diagnóstico de Autismo ou outro PDD, de acordo com os

critérios convencionais (MERCADANTE et al., 2006; MATSON et al., 2008).

Assim, os PDD são doenças comportamentais com manifestações precoces

e muito semelhantes entre si, o que dificulta o diagnóstico diferencial (APA,

1994; BOSA, 2006; GUPTA; STATE 2006; SEGENRICH; MATTOS, 2007;

BENÍTEZ-BURRACO, 2008; LOSH et al., 2008). Em função desta dificuldade,

dada a sutileza e relativa subjetividade dos critérios diagnósticos, especialmente

entre Autismo, Síndrome de Asperger e PDD-NOS, essas três condições foram

incluídas em um grupo referido como Doenças do Espectro Autístico – DEA

(CDC, 2006).

A prevalência das DEA ainda não está esclarecida Há estimativas muito

variáveis, de 3:10.000 indivíduos da população em geral, até 66:10.000, o que

equivaleria a 1:150, ou seja, extremamente alta. Discute-se se há um aumento

progressivo real da freqüência destas doenças na população, e especulam-se

diversos fatores de risco, ou se este aumento resulta do fato dos diagnósticos

estarem se tornando mais precoces e dos profissionais da educação e da saúde

estarem mais atentos aos sintomas, o que levaria à identificação de um número

maior de casos (CURRENTI, 2009).

1.2 Etiologia das DEA

A etiologia das DEA possui um forte componente genético sugerido pelos

estudos de ligação, pela recorrência familial, alta concordância em gêmeos

monozigóticos e descrições de afetados com diferentes alterações em diversos

genes e regiões cromossômicas. Além disto, fatores ambientais também têm sido

sugeridos como importantes na etiologia e no aumento da prevalência das DEA,

não apenas pelos efeitos cerebrais disruptivos que causam no cérebro, mas por

seus possíveis efeitos sobre a regulação de alguns genes (HERBERT et al., 2006;

BUXBAUM et al., 2007; CURRENTI, 2009).

Entre os fatores ambientais sugeridos como envolvidos no

desenvolvimento das DEA estão: anticorpos maternos, que poderiam agir contra

proteínas do cérebro fetal e alterar seu desenvolvimento; terapias com

antipiréticos (antitérmicos), como acetaminofeno (paracetamol), que interferem no

desenvolvimento normal do cérebro; infecções virais durante a gestação, como

por rubéola, Hemophilius influenzae e citomegalovírus, que resultam em lesões

cerebrais, e exposição intra-uterina a medicamentos, como talidomida e valproato,

a metais pesados e a radiação eletromagnética (VORSTMAN et al., 2006;

BRAUNSCHWEIG et al., 2008; SINGER et al., 2008).

Na verdade, parece que fatores ambientais e genéticos combinados

definem o risco para as DEA, segundo a hipótese proposta por Deth et al (2008).

De acordo com a hipótese, o risco para o autismo não depende de fator isolado e

poderia ser influenciado por polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em

qualquer nível das vias neuro-anatômicas ou metabólicas, associados com a

exposição a fatores de risco ambiental. Por exemplo, o polimorfismo MTHFR

C677T causa uma diminuição na atividade enzimática relacionada ao

metabolismo do folato. A não suplementação dos afetados com ácido fólico no

período pós-natal poderia resultar em regressão neurológica e risco aumentado

para autismo (CURRENTI, 2009).

As DEA são etiologicamente muito heterogêneas. Em apenas 10% dos

casos a causa pode ser conhecida, incluindo-se as genéticas. Entre elas, as mais

freqüentes são as mutações no gene FMR1, que resultam na síndrome do

Cromossomo X Frágil (FRAXA), nos genes TSC1 e TSC2 da Esclerose Tuberosa

e anormalidades cromossômicas (MOESSNER et al., 2007).

A análise do cariótipo mostra alterações em 3 a 6% dos casos. As deleções

e duplicações em 2q, 7q, 15q e 22q são comumente relatadas (DURAND et al.,

2007, NEWBURY et al., 2009). Contudo, o significado funcional destas

alterações permanece desconhecido, pois há variação do tamanho das regiões

cromossômicas e diversidade de loci envolvidos. Também, a maioria dos

rearranjos é observada em casos esporádicos nas famílias ou ocorre de novo em

indivíduos com história familial positiva de DEA, o que dificulta a interpretação

(BATTAGLIA; BONAGLIA, 2006).

Anormalidades cromossômicas têm sido investigadas em DEA porque os

afetados, além dos sintomas nas três áreas do prejuízo, também apresentam uma

variedade de alterações físicas e comportamentais comumente associadas com tais

anormalidades, como retardo mental, epilepsia e dismorfismos faciais (WASSINK

et al., 2007).

Há uma variedade de genes candidatos propostos como envolvidos na

etiologia das DEA. Apesar dos resultados promissores e dos estudos de

associação, os dados obtidos ainda são inconclusivos, o que se deve à

heterogeneidade genética, ao provável envolvimento de muitos genes que

interagem entre si, epistasia, interações gene-ambiente e variabilidade na

expressão, além da influência de mecanismos epigenéticos, como imprinting e

inativação do X (VORSTMAN et al., 2006).

Outro fator complicador na interpretação da etiologia é o fato da expressão

de alguns genes ser influenciada por regiões reguladoras específicas localizadas a

distâncias relativamente grandes, mesmo em outros cromossomos, o que dificulta

a seleção de genes candidatos. Entre os já propostos, muitos se expressam no

cérebro ou durante o desenvolvimento cerebral, como os que codificam proteínas

envolvidas nas sinapses, no sistema serotoninérgico e genes do sistema ácido

gama-aminobutírico (VORSTMAN et al., 2006).

As regiões associadas com DEA, com seus respectivos genes candidatos,

são destacadas abaixo na Figura 1.

O desenvolvimento de microarray baseado em CGH (Comparative

Genomic Hybridization) tem possibilitado a detecção de microdeleções e

microduplicações submicroscópicas em pacientes com DEA. Estas têm sido

referidas como Variação no Número de Cópias (CNVs), que parecem ter um papel

fundamental no autismo, maior do que previamente se pensava. Um estudo

recente encontrou 51 CNVs específicas em 46 de 397 pacientes com DEA, que

possivelmente resultaram no desequilíbrio de dose de 272 genes, muitos dos

considerados candidatos. CNVs de novo também já foram observadas em 7% das

famílias com DEA e somente em 1% das famílias controles (CHRISTIAN et al,

2009; SYKES et al., 2009; WANG et al., 2009). Inclusive, a descoberta de CNVs

ligadas ao X pode contribuir para explicar a prevalência aumentada em homens

(MARSHALL et al., 2008).

Contudo, as mudanças no número de cópias no genoma humano não

ocorrem exclusivamente em pacientes, pois também são observadas em

indivíduos não afetados. Embora a prevalência na população seja desconhecida, é

possível que os desequilíbrios genômicos sustentem a variação fenotípica humana,

mas também a susceptibilidade a doenças (VORSTMAN et al., 2006).

Em DEA também foram descritas alterações submicroscópicas em regiões

subteloméricas, muito difíceis de serem diagnosticadas em uma avaliação

cariotípica de rotina. A extremidade distal do braço longo do cromossomo 2

(2q37) e do 22 (22q13.3) são as regiões alteradas em alguns casos, principalmente

com deleções (WOLFF et. al., 2002; LUKUSA et. al., 2005, SEGURADO et. al.,

2005).

Muitos estudos preconizam a análise convencional do cariótipo e em alta

resolução (HRK) em pacientes com DEA. A análise em alta resolução não detecta

de forma precisa anormalidades menores que ~5Mb e também pode não detectar

anormalidade maiores não detectadas em bandamento GTG convencional. Estas

limitações são particularmente problemáticas na análise das regiões

subteloméricas, que são ricas em genes, susceptíveis a rearranjos, como deleções e

duplicações, mas que são pequenas e estão localizadas no interior de uma única

banda. Por esta razão, a Hibridização in situ Fluorescente (FISH) é uma técnica

indicada para superar algumas limitações e esclarecer achados da HRK

(WASSINK et al., 2007).

1.3 Regiões subteloméricas e DEA

As regiões de bandas quase terminais dos cromossomos são denominadas

regiões subteloméricas. São as regiões mais ricas em genes do genoma, o que é

sugerido pela quantidade aumentada de GC (JOYCE et al., 2001; WASSINK et

al., 2007).

Algumas síndromes genéticas resultam de microdeleções cromossômicas

distais, como em 1p36, 2q37, 3q29 e 22q13.3 (DURAND, et al., 2007).

Deleções em 2q estão associadas com um fenótipo caracterizado por baixo

peso ao nascimento, atraso do desenvolvimento, defeitos craniofaciais, pescoço

curto, além de hipotonia e comportamento autístico. A incidência da deleção

subtelomérica em 2q37 na população geral, entretanto, não está esclarecida

(GALASSO et al., 2008). A associação com DEA foi primeiramente sugerida por

Stein et al. (1992). Desde então, vários relatos destacam o fenótipo

comportamental autístico, observado em 24% dos pacientes revistos por Casas et

al.(2004) e em 35% dos casos relatados por Aldred et al. (2004). Características

autísticas ocorrem em associação com deleções terminais com pontos de quebra

em qualquer sub-banda de 2q37. Além dos comportamentos repetitivos e

prejuízos na comunicação e na interação social, os pacientes apresentam

movimentos esteriotipados, agressão intermitente, déficit de atenção, transtorno

obssessivo-compulsivo e distúrbios do sono, sugerindo uma nova síndrome

envolvendo essa região (FALK; CASAS, 2007).

Entre os genes sugeridos como candidatos que estão mapeados em 2q37,

se destaca o CENTG2 (Centaurin Gamma2 -2q37.2), pois é expresso em regiões

do sistema nervoso central como amígdala, cerebelo e hipocampo, que estão

descritas como alteradas em alguns autistas. O CENTG2 apresenta 4.112 pares de

bases e codifica uma proteína do citoesqueleto envolvida em processos neuronais

múltiplos do desenvolvimento e da maturação cerebral. Algumas mutações

detectadas neste gene já foram relacionadas com susceptibilidade ao Autismo,

mas seu envolvimento na predisposição a esta doença não está esclarecido

(LUKUSA et al., 2004; WASSINK et al., 2005).

Entretanto, os estudos da associação CENTG2/autismo são contraditórios.

Por exemplo, Lukusa et al.(2004) descreveram três irmãos que apresentavam uma

deleção terminal em 2q37.3, atraso do desenvolvimento, deficiência mental,

anormalidades de mãos, pés e facies dismórficas, mas apenas um era autista.

Segundo os autores, esta diferença no fenótipo comportamental, apesar da deleção

terminal de 2q estar presente em todos eles, mostra a necessidade de uma

investigação para possíveis diferenças crípticas nos tamanhos dos segmentos

deletados, assim como a existência de outros fatores como penetrância incompleta

e imprinting (CASAS et al., 2004).

A Síndrome da Deleção 22q13.3, ou Síndrome de Phelan-McDermid, é

uma síndrome de microdeleção cromossômica caracterizada por hipotonia

neonatal, atraso global do desenvolvimento, crescimento normal a acelerado,

ausência a ou atraso grave da fala e características dismórficas menores. A

deleção ocorre com freqüência igual em homens e mulheres e foi relatada também

em mosaicismo. As características comportamentais incluem contato visual pobre,

movimentos estereotipados, socialização diminuída e prejuízos na linguagem,

consistentes com DEA. A incidência é desconhecida, porém é descrita uma

origem preferencialmente paterna (LUCIANI et al., 2003; PHELAN, 2008). Há

relatos de muitos pontos de quebra localizados no mesmo intervalo. Há uma

quantidade numerosa de seqüências Alu. Esses elementos Alu são conhecidos

como sítios de recombinação desigual, conduzindo a várias alterações

citogenéticas, como deleções, anéis ou translocações (LUCIANI et al., 2003). A

base molecular dos mecanismos que conduzem à deleção terminal ainda é pouco

definida, essencialmente por duas razões: os pontos de quebra podem ser

determinados no nível de pares de bases somente em poucos casos e podem ser

diferentes a partir dos pontos de quebra original, como conseqüência da ação de

mecanismos de reparo ativados por quebras no DNA dupla fita (BONAGLIA et

al., 2006).

As deleções em 22q13.3 têm sido um dos defeitos mais comumente

associados com autismo e parecem envolver principalmente o gene SHANK3

(PHELAN, 2008).

1.4 Gene SHANK3

A caracterização molecular das deleções em 22q13.3 mostra que há três

genes localizados nessa região, a partir do centrômero: SHANK3, ACR e RABL2B.

As alterações em SHANK3 provavelmente sejam a causa dos sintomas

neurocomportamentais. Segundo Bonaglia et al. (2006) há um hot spot localizado

dentro de SHANK3. Mais recentemente, mutações de novo foram encontradas em

pacientes com DEA (DELAHAYE et al., 2009).

O gene SHANK3 codifica uma proteína de densidade pós-sináptica (PSD)

de sinapses excitatórias que pode funcionar como suporte principal formando

grandes placas que compõem uma plataforma para a construção de um complexo

PSD. No complexo PSD, a proteína shank3 se liga a neuroliginas, que juntas com

as neuroxinas formam um complexo em sinapses glutamatérgicas, que sinaliza

moléculas e proteínas do citoesqueleto, presentes nas espinhas dendríticas e no

complexo PSD (Figura 2).

SHANK3, então, promove a formação, maturação e aumento de espinhas

dendríticas, num sistema complexo no qual perturbações em um número potencial

de moléculas, isoladas ou em combinação, podem resultar em quadros clínicos

comportamentais semelhantes (MOESSNER et al., 2007).

Alterações em SHANK3 já foram associadas com DEA, deficiência

cognitiva grave e alterações de fala e linguagem (DURAND et al., 2007;

MOESSNER et al., 2007). Estudos mais recentes têm revelado deleções de novo e

mutações em SHANK3 em indivíduos com autismo, ressaltando um papel

importante deste gene no fenótipo autístico (SYKES et al., 2009).

Particularmente no éxon 22, que possui 2.254pb, já foram encontradas

inserções e deleções de nucleotídeos que resultaram em mutações frameshift e na

formação de proteínas truncadas com perda de função. Por exemplo, foram

descritas a inserção de uma guanina na posição 3680 e uma deleção de 15

nucleotídeos na posição 4358-4372 do RNAm. Também no éxon 8, que tem 78pb,

foi encontrada uma mutação de novo, caracterizada pela troca A962G do RNAm,

que resultou na substituição Q321R em heterozigose. Os dados combinados

sugerem que a haploinsuficiência de SHANK3 pode causar uma forma

monogênica de autismo em uma freqüência suficiente para ser considerado em

testes diagnósticos de rotina (DURAND et al., 2007; MOESSNER et al., 2007).

Com estes achados ainda pouco explorados e não esclarecidos, o estudo de

alterações em 2q37 e 22q13.3, mutações no gene SHANK3 e dos fenótipos

clínicos correspondentes pode beneficiar pacientes, suas famílias e profissionais

que lidam com DEA.

A hipótese científica que foi testada neste estudo é que alguns pacientes

com DEA apresentam alterações em 2q37 e 22q13.3 que podem ser detectadas

por análise do cariótipo em alta resolução, além de mutações nos exons 8 e 22 do

gene SHANK3, numa freqüência que justifique sua avaliação rotineira nesta

população.

Figura 2. Sinapse excitatória mostrando a proteína shank (circulada em

vermelho) com a neuroligina (circulada em rosa), ligada a

neuroxina (circulada em azul) que participam da formação do

complexo de densidade pós-sináptica (PSD) (KIM; SHENG,

2004).

Objetivos

2. OBJETIVOS

Geral

Realizar a análise da ocorrência de alterações cariotípicas e moleculares de

indivíduos com Doenças do Espectro Autístico.

Específicos:

1- Estudar o cariótipo de indivíduos com diagnóstico de Doença do

Espectro Autístico pela técnica de bandamento GTG convencional;

2- Estudar as regiões 2q37 e 22q13 pela técnica de bandamento GTG em

alta resolução;

3- Avaliar a presença de mutações nos éxons 8 e 22 do gene SHANK3 por

seqüenciamento direto.

Material e Métodos

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Casuística

Em conformidade com as Normas Regulamentadoras de Pesquisas em

Seres Humanos, este projeto foi aprovado pelo CEP (FAMERP) e CONEP

(Processo 25000.015469/2007-59). Após a obtenção do Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido – (Resolução 196/96) (Anexo I), foram estudados 48

indivíduos com diagnóstico de Doença do Espectro Autístico (DEA), segundo os

critérios do DSM-IV (APA, 1994). Os probandos foram provenientes da Escola

Municipal do Autista Maria Lúcia de Oliveira (EMA) de São José do Rio Preto –

SP, da Associação dos Amigos dos Autistas (AMA) de Ribeirão Preto – SP, do

Ambulatório de Genética da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto –

SP (AG), do Recanto Tia Marlene de Votuporanga – SP (RTM) e de clínicas

especializadas (CE). Os diagnósticos foram realizados por psiquiatras e

psicólogos, membros de equipes interdisciplinares e especialistas em autismo.

Entre os indivíduos estudados, 35 (73%) eram do sexo masculino e 13

(27%) do sexo feminino. As idades variaram de três a 34 anos (X= 14,89) e

desvio padrão de 7,40. Quanto ao diagnóstico, 22 (46%) apresentavam Autismo,

20 (42%) PDD-NOS e seis (12%) Síndrome de Asperger. A Tabela 1 apresenta a

caracterização da casuística quanto ao sexo, idade, diagnóstico de PDD e

procedência.

Não foram incluídos no estudo pacientes com doenças de etiologia

genética ou ambientais, aqueles cujas famílias não concordaram em participar

deste estudo e aqueles que, mesmo com autorização do responsável para

participação do projeto, apresentaram desconforto exacerbado diante da

possibilidade da punção venosa.

Tabela 1. Caracterização da casuística quanto à idade (em

anos), sexo, diagnóstico e procedência.

Paciente

Idade

Sexo

Diagnóstico de

DEA

Procedência

1 12 M Autismo CE

2 13 M Asperger CE

3 8 M PDD-NOS AG

4 7 M PDD-NOS AG

5 13 M Autismo AG

6 19 M Asperger CE

7 17 F PDD-NOS AMA

8 13 M PDD-NOS AMA

9 7 M Autismo AMA

10 21 M PDD-NOS AMA

11 23 M PDD-NOS AMA

12 10 M PDD-NOS RTM

13 13 M Asperger CE

14 34 M PDD-NOS CE

15 22 F Asperger CE

16 13 F Autismo AMA

17 8 F Autismo AMA

18 3 M PDD-NOS CE

19 25 M Autismo AMA

20 13 F Autismo AG

21 12 M PDD-NOS RTM

22 29 F Autismo RTM

23 18 F Autismo RTM

24 7 F PDD-NOS RTM

25 27 M Autismo RTM

26 22 F Autismo RTM

27 3 M PDD-NOS CE

28 11 M PDD-NOS AG

29 9 M Autismo AMA

30 11 M PDD-NOS AMA

31 22 M Autismo AMA

32 19 F PDD-NOS EMA

33 15 M Asperger AMA

34 7 M Autismo AMA

35 23 M Autismo AG

36 30 M PDD-NOS AG

37 5 M Autismo AMA

Tabela 1- Continuação.

Paciente

Idade

Sexo

Diagnóstico de

DEA

Procedência

38 9 F PDD-NOS AMA

39 19 M Autismo AMA

40 18 M Autismo AMA

41 17 M Autismo AMA

42 14 M Autismo AMA

43 10 M PDD-NOS CE

44 13 M Asperger AG

45 10 M Autismo AMA

46 8 F PDD-NOS CE

47 8 F PDD-NOS CE

25 M Autismo AMA

EMA=Escola Municipal do Autista Maria Lúcia de Oliveira de São José do Rio Preto;

AMA=Associação dos Amigos dos Autistas de Ribeirão Preto – SP; AG=Ambulatório

de Genética da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – SP; RTM=Recanto

Tia Marlene de Votuporanga – SP; CE=clínicas especializadas; F= feminino; M=

masculino.

3.2 Métodos

De cada paciente foram coletados cerca de 10ml de sangue periférico. A

coleta foi realizada com seringa estéril descartável, por profissional qualificado.

Destes, 5ml foram transferidos para tubo vacutainer com heparina, para cultura de

linfócitos e estudo citogenético, e 5ml para tubo com EDTA, para extração de

DNA e estudo molecular.

Todos os indivíduos foram investigados quanto a presença de

cromossomopatias. Para isto foi realizado o estudo cariotípico convencional em

metáfases obtidas de culturas de linfócitos submetidas ao bandamento GTG.

A análise das regiões 2q37 e 22q13 foi realizada pela técnica de

bandamento GTG em alta resolução, que também necessitou de cultura de

linfócitos prévia com agente indutor para obtenção de cromossomos

prometafásicos.

Mutações nos éxons 8 e 22 do gene SHANK3 foram investigadas por

sequenciamento direto.

3.2.1 Cultura de linfócitos, bandamento GTG convencional e em alta

resolução

As culturas de linfócitos foram desenvolvidas por 72 horas, segundo a

técnica de Moorhead et al., (1960), com modificações, de acordo com o protocolo

utilizado pelo Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina de São José do

Rio Preto – FAMERP/FUNFARME.

Em três frascos foram colocados 5ml de meio de cultura RPMI 1640,

suplementado com 20% de soro fetal bovino, penicilina (100U/ml), fito-

hemaglutinina (PHA-Gibco 0,2ml/5ml de meio) e 0,2 ml de sangue total.

Para interrupção da divisão celular foi adicionado 0,1ml de solução de

colquicina Houdé (4x10M), que foi reincubado por 30 minutos antes da colheita.

Após o bloqueio celular, o material foi centrifugado a 900-1000rpm durante sete

minutos, o sedimento hipotonizado com 6ml de KCl a 0,075M por 10 minutos, a

37ºC, e fixado em metanol ácido acético (3:1). A suspensão celular foi, então

gotejada em lâminas limpas, molhadas e geladas.

Em dois frascos destinados à técnica de bandamento GTG em alta

resolução, após o período de incubação, foram adicionados 0,1ml de Actinomicina

D (concentração final de 2µg/ml), de acordo com o protocolo estabelecido no

Laboratório de Genética e estes foram novamente incubados à 37ºC por 40

minutos, após esse período foi adicionada colquicina Houdé (4x10M) durante seis

minutos e os frascos foram novamente reincubados na estufa a 37ºC. Após o

bloqueio celular, a colheita da cultura ocorreu igualmente aos demais frascos que

não receberam Actinomicina D.

Cada caso foi identificado durante toda a execução do projeto por um

código, que era conhecido apenas pelos responsáveis pela pesquisa.

As lâminas foram submetidas à técnica de bandamento GTG, realizada

segundo a técnica de Grouchy e Turleau (1984), com modificações.

As lâminas foram mergulhadas seqüencialmente em tampão Sorensen

pH6,8; solução de tripsina 0,2% e solução salina de PBS, respectivamente, por 15

minutos, dois a 10 segundos e um minuto. Posteriormente, foram coradas em

solução de Giemsa a 2% por três minutos e lavadas em água destilada.

O cariótipo convencional (resolução de 300-450 bandas) de cada indivíduo

foi analisado em 20 metáfases submetidas ao bandamento GTG. Para o estudo

cariotípico em alta resolução foram avaliadas outras cinco metáfases com

resolução mínima de 550 bandas. Todas as análises foram realizadas pela

mestranda e conferidas por outro orientadora, responsável pela conferência de

todos os resultados. Para determinação do padrão de resolução de bandas foram

selecionados segmentos dos cromossomos maiores (1-3) e o padrão observado foi

comparado às representações diagramáticas em diferentes resoluções contidas na

ISCN (2009).

Os achados e a descrição dos mesmos seguiram os critérios contidos na

ISCN (2009). As metáfases que apresentaram alterações foram fotografadas.

Para esclarecimento do resultado de um paciente, foram analisadas 10

metáfases pela técnica de FISH (Fluorescence in situ Hybridization) com a

utilização das sondas Tel Vysion 2q Spectrum Orange (Vysis) para a região

subtelomérica e CEP 2 Spectrum Orange (Vysis) para a região centromérica

controle, ambas com marcação em vermelho. A técnica foi realizada segundo as

instruções do fabricante e colaboração da doutoranda Adriana Barbosa Gonçalves.

3.2.2 Extração de DNA de leucócitos

O DNA genômico de cada indivíduo foi obtido a partir de leucócitos de

sangue venoso periférico segundo a técnica descrita por Miller et al. (1988), com

modificações.

Em um tubo de polipropileno de 15ml foram adicionados 3,5ml de

FICOLL PAQUE e 5ml de sangue periférico pela parede do mesmo. O material

foi centrifugado por 30 minutos a 3500rpm. O sobrenadante (plasma) foi retirado

e desprezado. O anel de leucócitos foi transferido com pipeta Pasteur descartável

para outro tubo e o volume de 15ml foi completado com PBS 1X. Nova

centrifugação foi realizada a 3500rpm por 12 minutos. O sobrenadante foi retirado

com pipeta Pasteur descartável, o “pellet” suspenso e novamente completado o

volume de 15ml com PBS 1X. O material foi centrifugado a 3500rpm por 12

minutos e o sobrenadante recolhido com pipeta descartável. O “pellet” de

leucócitos foi novamente suspenso e em seguida foram adicionados 1ml de PBS

1X, 3ml de Lysis Buffer, 0,2ml de SDS 10%, 50µl de proteinase K (20mg/ml) e

40µl de RNAse (20mg/ml). O material foi agitado e incubado à 37ºC overnight.

Ao “pellet” de leucócitos foi acrescentado 1ml de NaCl 6M saturado. O

tubo foi agitado vigorosamente até formar espuma e colocado no gelo por 15

minutos. O material foi novamente agitado e centrifugado a 3500rpm por 15

minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 15ml e completado

com 10ml de etanol absoluto gelado, para a precipitação do DNA. O tubo foi

invertido delicadamente até a visualização do DNA precipitado. O DNA foi,

então, colocado em um eppendorf de 1,5ml com 500µl de etanol 70% gelado. O

material foi centrifugado a 14.000rpm por três minutos, o etanol 70% descartado e

o tubo deixado em repouso por 15 minutos. O DNA foi diluído em água estéril e

incubado a 37ºC por três a quatro dias para diluição. Após este período, o material

foi estocado a -20ºC. A estimativa da concentração foi realizada pela leitura em

espectrofotômetro NanoDrop ND 1000.

3.2.3 Amplificação do DNA extraído

Esta etapa contou com a colaboração das Profas. Dras. Flávia Cristina

Rodrigues Lisoni e Eloíza Helena Tajara da Silva, do Laboratório de Marcadores

Moleculares e Bioinformática Médica. A amplificação do éxons 8 e 22 do gene

SHANK3 foi realizada segundo a técnica de Saiki et al. (1998), com algumas

modificações.

Para a padronização das concentrações dos reagentes e condições de

ciclagem da PCR para os éxons 8 e 22 do gene SHANK3, foram realizados

diferentes testes com variações da concentração do DNA (50ng/l, 25ng/l e

20ng/l), do volume dos primers, com concentração final de 10M, (2,5l, 2,0l

e 1l) e também da temperatura de anelamento (57°C a 61°C). Após a

padronização, a amplificação dos dois éxons do gene foi realizada seguindo os

programas de amplificação e as condições de reação que estão descritas nos

Quadros 1, 2 e 3.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi processada em termociclador

GeneAmp

PCR System 9700 da Applied Biosystems, em volumes de 25l. Em

todos os experimentos um dos tubos não recebeu DNA (controle de

contaminação).

O éxon 8 gera um produto de 200 pares de bases (pb), que correspondeu

ao primer 3, que flanqueia todo o éxon, ou seja, da posição 8671pb a 8870pb do

DNA.

Foram utilizados dois pares de primers para o éxon 22 do gene SHANK3,

pois se trata de um éxon grande. Foi flanqueando da posição 46748pb a 46934pb

do DNA, que correspondeu ao primer 1, e da posição 47435pb a 47617pb do

DNA, que correspondeu ao primer 2. Portanto, para o éxon 22 foram gerados

dois produtos de amplificação, um de 186 e outro de 183 pares de bases (pb).

Estas duas regiões estudadas foram chamadas respectivamente de pontos 1 e 2.

As sequências de bases dos primer utilizados estão descritas no Quadro 4.

3.2.4 Eletroforese em gel de agarose

Foram utilizados 5l de cada amostra, que foram aplicados em géis de

agarose a 2%, com brometo de etídeo (0,5 g/ml) e submetidos à eletroforese

horizontal por 30 minutos à corrente elétrica de 100 V constantes, conduzida em

tampão TEB 1x (Tris 89mM, EDTA 2,5mM e ácido bórico 89mM com pH 8,3).

Em todas as eletroforeses realizadas, foram utilizados como marcador o DNA

Ladder de 100pb.

Etapa Temperatura (°C) Duração

Desnaturação inicial

95 05 minutos

Desnaturação*

95 30 segundos

Anelamento*

57 30 segundos

Extensão*

72 01 minuto

Extensão final 72 10 minutos

*O ciclo desnaturação-anelamento-extensão foi repetido 30 vezes

Quadro 1. Programa de amplificação utilizado para os primers 1 e 2

do gene SHANK3.

Etapa Temperatura (°C) Duração

Desnaturação inicial

94 04 minutos

Desnaturação*

94 45 segundos

Anelamento*

62 45 segundos

Extensão*

72 01 minuto

Extensão final 72 10 minutos

*O ciclo desnaturação-anelamento-extensão foi repetido 35 vezes

Quadro 2. Programa de amplificação utilizado para o primer 3 do

gene SHANK3.

Reagentes Concentração final

Tampão

MgCl

50 mM

dNTP

1,25 mM

Right Primers 1, 2, 3

10M

Left Primers 1, 2, 3

10 M

Taq DNA Polimerase (Invitrogen)

5 U

Água Milli-Q

q.s.p. 25 l

DNA

25-50ng/ l

Quadro 3. Condições de reação utilizadas para a

amplificação dos éxons 8 e 22 do gene

SHANK3.

Primer

Função

Primers 5´ a 3´

Posição

Tamanho do

amplicon (pb)

Right

CACAGCCGCTGACTGCAT

Éxon 22

(ponto

46748pb

46934pb

186

Left GAAGTCACCCGAGGACAAGA

Right CCCCATAGCTTGGACCTTCT

Éxon 22

(ponto2)

47435pb

47617pb

183

Left CAAGCCCAAGCTCAAGTCC

Right GGGAAGAACCAAGGTTCAGA

Éxon 8

8671pb

8870pb

200

Left CAGCTGTGATTCCCTCTTCC

Quadro 4.

Primers para amplificação e sequenciamento do gene SHANK3.

Os géis de agarose foram visualizados sob luz UV no transiluminador

Hoefer MAcroVue UVis-20 da Amershan e armazenados em fotodocumentador

pelo sistema EDAS 290, o que permitiu observar se houve amplificação e se o

tamanho do segmento obtido coincidiu com o esperado.

3.2.5 Purificação dos produtos de PCR para sequenciamento

Os produtos obtidos em todas as reações de PCR foram purificados com

etanol, de acordo com metodologia descrita por Sambrook e Russel (2001). Os

amplicons foram inicialmente transferidos para tubos de 1,5ml, onde foi realizada

a purificação. A estes tubos foram adicionados 5l de acetato de sódio 3M

seguidos de 150l de etanol 100%. Os tubos foram, colocados em freezer -80ºC

por uma hora, para que o DNA fosse precipitado, e submetidos à centrifugação a

15.000rpm na centrífuga Sorvall Legend Match 1.6R da Thermo Scientific, por 20

minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 150l

de etanol a 70% (Merck). Em seguida, foi realizada centrifugação por 20 minutos,

a 15.000rpm, a 4ºC para obtenção de um precipitado, que foi homogeneizado em

20l de água ultra-pura (Invitrogen). Em seguida, as amostras foram novamente

quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop ND 1000 da Thermo Scientific.

3.2.6 Sequenciamento do gene SHANK3

As amostras amplificadas e purificadas foram submetidas ao

sequenciamento automático no aparelho de capilaridade 3130 Genetic Analyzer

(Applied Biosystems), gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Maurício Lacerda

Nogueira, do Laboratório de Virologia (FAMERP).

As seqüências dos éxons 8 e 22 do gene SHANK3 foram determinadas

utilizando-se o kit Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems), segundo

recomendações do fabricante. O sequenciamento teve como finalidade confirmar

se os amplicons correspondiam realmente às regiões especificadas e analisar a

presença de alterações não só nos pontos de mutações descritas, mas em todo o

amplicon. Na reação de PCR para sequenciamento foram utilizados 2,0µl de Big

Dye Terminator, 4,0µl de solução tamponante (5X), 1,0µl de primer específico

(3,2 µM), 1,0µl de DNA purificado com concentração aproximada de 200 ng/ml e

água Milli Q (Invitrogen) suficiente para completar 20µl de reação. Para cada

amostra foi realizada uma reação com o primer sense (right) e uma reação com o

anti-sense (left). As condições da PCR para sequenciamento estão descritas no

Quadro 5.

A análise das sequências foi realizada no programa DS Gene 2.0 (Accelrys,

USA) e feita uma comparação com sequências existentes no GenBank

(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Etapa Temperatura (°C) Duração

Desnaturação*

96 30 segundos

Anelamento*

50 15 segundos

Extensão*

60 04 minutos

Extensão final 4 ∞

O ciclo (*) foi repetido 25 vezes

Quadro 5. Programa de amplificação utilizado para reação de

sequenciamento do gene SHANK3.

Resultados

4. RESULTADOS

Foram investigados 48 indivíduos com Doenças do Espectro Autístico. A

análise citogenética convencional em bandamento GTG foi realizada nos 48

indivíduos e em alta resolução da região 2q37 e da região 22q13 em 43. O

sequenciamento direto do éxon 8 do gene SHANK3 foi possível em 31 indivíduos,

do ponto 1 do éxon 22 em 30 e do ponto 2 em 31 indivíduos.

A Tabela 2 apresenta os resultados das análises realizadas em cada caso.

Em alguns houve necessidade de repetição da cultura de linfócitos, por não

crescimento celular ou não obtenção de células em prometáfase ou metáfase

inicial, que não foi possível por dificuldade de contato com as famílias, recusa de

nova coleta, ou porque o indivíduo residia em locais muito distantes. Em outros

não foi possível o estudo do gene SHANK3 por problemas de amplificação das

amostras ou falta de tempo hábil para nova coleta de sangue e finalização.

Nenhum indivíduo apresentou alteração cromossômica numérica ou

estrutural pela análise convencional em bandamento GTG.

Com relação à análise citogenética por bandamento GTG em alta

resolução, 42 indivíduos apresentaram metáfases nitidamente normais para as

regiões 2q37 e 22q13 (Figuras 3 e 4, respectivamente).

Um paciente com diagnóstico de Síndrome de Asperger apresentou uma

alteração que foi caracterizada como possível deleção em 2q37, observada em um

dos cromossomos do par 2 em todas as metáfases analisadas (Figura 5a e b).

Contudo, para esclarecimento do achado, foi realizada a análise por FISH com a

sonda específica para a região subtelomérica do cromossomo 2 (2q37), que

mostrou os dois sinais normais esperados e afastou a suspeita da deleção nesta

região específica (Figura 5c).

Com relação à análise molecular por sequenciamento direto dos éxons 8 e

22 do gene SHANK3, todos os indivíduos mostraram as sequências selvagens

(normais).

As Figuras de 6 a 8 apresentam os géis de agarose para os amplicons de

200pb, 186pb e 183pb, correspondentes aos éxons 8 e pontos 1 e 2 do éxon 22,

respectivamente.

As Figuras de 9 a 11 apresentam os eletroferogramas parciais

correspondentes a partes de sequências do éxon 8 e das regiões selecionadas do

éxon 22.

Os artigos científicos originados à partir dos dados obtidos estão apresentados no

Apêndice.

Tabela 2- Resultados obtidos das diferentes análises realizadas em cada caso

estudado.

Caso

Cariótipo

convencional

Alta

resolução

2q37

Alta

resolução

22q13

Éxon 8 do

gene SHANK3

Éxon 22 do

gene SHANK3

(ponto 1)

Éxon 22 do

gene SHANK3

(ponto 2)

1 46,XY NL NL NR NR NR

2 46,XY NL NL NR NR NR

3 46,XY NL NL NR NR NR

4 46,XY NL NL NR NR NR

5 46,XY NL NL NR NR NR

6 46,XY NL NL NR NR NR

7 46,XX NL NL NR NR NR

8 46,XY NL NL S S S

9 46,XY NL NL S S S

10 46,XY NL NL NR NR NR

11 46,XY NL NL S S S

12 46,XY NL NL S S S

13 46,XY NL NL S NO S

14 46,XY NL NL NR NR NR

15 46,XX NL NL S S S

16 46,XX NL NL S S S

17 46,XX NL NL S S S

18 46,XY NL NL NR NR NR

19 46,XY NL NL S S S

20 46,XX NL NL S S S

21 46,XY NL NL NR NR NR

22 46,XX NL NL NR NR NR

23 46,XX NL NL NR NR NR

24 46,XX NL NL NR NR NR

25 46,XY NL NL NR NR NR

26 46,XX NL NL NR NR NR

27 46,XY NL NL NR NR NR

28 46,XY NO NO S S S

29 46,XY NL NL S S S

30 46,XY NL NL S S S

31 46,XY NL NL S S S

32 46,XX NL NL S S S

Cariótipo

convencional

Alta

resolução

2q37

Alta

resolução

22q13

Éxon 8 do

gene SHANK3

Éxon 22 do

gene SHANK3

(ponto 1)

Éxon 22 do

gene SHANK3

(ponto 2)

33 46,XY NL NL S S S

34 46,XY NL NL S S S

35 46,XY NL NL S S S

36 46,XY NL NL S S S

37 46,XY NL NL S S S

38 46,XX NO NO S S S

39 46,XY NL NL S S S

40 46,XY NL NL S S S

41 46,XY NO NO S S S

42 46,XY NL NL S S S

43 46,XY NO NO S S S

46,XY

46,XX

46,XY

NL = resultado nornal; NO= resultado não obtido; NR= resultado não realizado;

S= sequência selvagem.

Tabela 2- Continuação.

Figura 3. Diagrama do cromossomo 2 à esquerda e par de

cromossomos 2 à direita, em bandamento GTG em

alta resolução, com destaque da região 2q37

presente no par de homólogos.

Figura 4. Metáfase em bandamento GTG em alta resolução. O

ideograma do cromossomo 22 à esquerda e as setas

indicam a região 22q13.3 presente no par de

homólogos.

Figura 5. (a) Esquema representativo das bandas GTG do cromossomo 2

à esquerda e par de cromossomos 2 normais à direita. As

setas indicam 2q37. (b) Esquema representativo das bandas

GTG do cromossomo 2 à esquerda, cromossomo 2 normal

no centro e sugestivo de deleção em 2q37 do paciente (seta

vermelha), `a direita. (c) Metáfase parcial do paciente

submetida à técnica de FISH, com os quatro sinais normais

em vermelho. As setas azuis e pretas indicam a região

centromérica e a região 2q37, respectivamente.

Figura 6. Perfil eletroforético em gel de agarose 2%

correspondente a amplificação do éxon 8 do

gene SHANK3 nas colunas 2-7 e 9-11.

Marcação com Ladder de 100pb na coluna

1, ausência de amplificação na coluna 8 e

controle negativo na coluna 12 .

Figura 7.

Perfil eletroforético em gel de agarose 2%

correspondente a amplificação do

éxon 22-

ponto1 do gene SHANK3

nas colunas de 2-4 e

6-13. Marcação com Ladder de 100pb na

coluna 1, ausência de amplificação na

coluna 5 e controle negativo na coluna 14.

Figura 8. Perfil eletroforético em gel de agarose 2%

correspondente a amplificação

do (éxon 22-

ponto2)

nas colunas de 3, 6, 8-10 e 12.

Marcação com Ladder de 100pb na coluna 1,

ausência de amplificação nas colunas 2,4-5, 7 e

controle negativo na coluna 13.

3 e 4: Ausência de amplificação. A coluna 7 representa o

Figura 9. Eletroferograma parcial das sequências right e left do éxon 8 do gene

SHANK3 contendo a região de 80-157pb do amplícon total de 200pb

analisadas no programa DS Gene 2.0 (Accelrys, USA).

Figura 10. Eletroferograma parcial das sequências right e left do ponto 1 do éxon

22 do gene SHANK3 contendo os primeiros 80pb do total do amplícon

de 186pb analisadas no programa DS Gene 2.0 (Accelrys, USA).

Figura 11. Eletroferograma parcial das sequências right e left do ponto 2 do éxon

22 do gene SHANK3 contendo a região de 50-127pb do total do

amplícon de 183pb analisadas no programa DS Gene 2.0 (Accelrys,

USA).

Discussão

5. DISCUSSÃO

As DEA são um grupo de doenças de etiologia variável e muito complexa

que uma minoria de casos possui causa genética única conhecida. Entretanto, na

maioria há fortes evidências da participação de componentes genéticos. Inclusive,

foram descritos rearranjos envolvendo praticamente todos os cromossomos em

indivíduos com DEA (DELLA MÔNICA et al., 2007). Neste estudo, nenhum

caso apresentou alteração detectada por análise citogenética convencional, o que

pode ter ocorrido em função da casuística ser pequena. Entretanto, mesmo assim,

como as descrições de alterações cromossômicas em DEA referem uma

freqüência de 3-6% (GIUNCO, 2002; DURAND et al., 2007; NEWBURY et al.,

2009), seriam esperados um ou dois resultados positivos. Também deve ser

considerado que tais alterações são mais freqüentes que em autistas do que em

portadores de outras DEA, e a casuística aqui foi heterogênea.

Entre as regiões propostas sugeridas como possivelmente envolvidas na

etiologia das DEA estão 2q37 e 22q13, observadas como alteradas em alguns

pacientes e que levaram a sugestão de alguns genes candidatos (BARTLETT et.

al., 2005; SURESH et. al., 2006; VORTSMAN et. al., 2006). Casas et al. (2004)

descreveram 60 indivíduos com deleções em 2q35, 2q36 e 2q37, dos quais alguns

apresentavam comportamento autístico como um dos efeitos neurológicos.

Na região 2q37, após revisão da literatura, Gallasso et al. (2008)

encontraram um total de 50 casos de deleções com pontos de quebra em 2q37.1

(18 casos), 2q37.2 (10 casos) e 2q37.3 (22 casos), sugerindo alguns genes

importantes nessas sub-bandas.

Na banda 2q37.3 há alguns genes, como o KIF1A e o HES6. O gene

KIF1A participa do transporte axonal de precursores de vesículas sinápticas. Há

sugestões de que teria um possível papel crítico na plasticidade, manutenção e

maturação de neurônios, inclusive, no início da vida.

O gene HES6 codifica um co-fator de transcrição que é expresso em todo o

período de desenvolvimento do sistema nervoso central e desenvolve uma função

na neurogênese cortical e na diferenciação, pela inibição da atividade anti-

neurogênica de HES6 (GALASSO et al., 2008).

Embora muitos genes candidatos para o autismo tenham sido identificados

na banda 2q37.3, na síndrome da deleção em 2q37, a maioria das crianças com

autismo, como parte do quadro clínico, tem o ponto de quebra em 2q37.2. Nessa

região, estão mapeados o gene GBX2 ou gastrulation brain homeo box 2, que se

expressa na região cerebral anterior, e o gene CENTG2 ou centaurin gamma 2,

que se expressa em várias regiões do cérebro fetal (WASSINK, et al., 2005).

CENTG2 foi considerado um forte candidato para o autismo. Também se

expressa no cérebro adulto e a proteína desse gene é encontrada em vesículas de

crescimento neuronal, sinapses de desenvolvimento e em neurônios maduros. As

variantes encontradas neste gene geram substituição dos aminoácidos e pode ser

que variantes sinônimas podem alterar múltiplos aspectos da expressão gênica e

do processamento. Por outro lado, variantes não sinônimas, mais prováveis de

serem deletérias, frequentemente ocorrem sem qualquer associação com efeito

fenotípico (WASSINK, et al., 2005).

Já em 2q37.1 está localizado o gene NMUR1 (Receptor 1 da Neuromedina

U). As estruturas do sistema nervoso central expressam níveis menores da sua

proteína quando comparados os dos órgãos periféricos, mas proteínas Nmur1

foram detectadas em abundância no cerebelo, amidgala e hipocampo, o que sugere

um papel na modulação da ação dopaminérgica (GALASSO et al., 2008).

O potencial envolvimento destes genes, ainda não muito conhecidos, e a

ação sinérgica entre estes e outros genes envolvidos na função, diferenciação e

reparo neuronal, podem explicar as variações observadas nos déficts

neuropsicológicos associados com a síndrome da deleção em 2q37 e desperta a

atenção para o estudo desta região em DEA (GALASSO et al., 2008).

Contudo, deleções em 2q37 também já foram descritas em afetados com

características fenotípicas específicas e nos seus pais fenotipicamente normais,

sugerindo se tratar de um polimorfismo familial em alguns casos, mas a maioria

dos portadores tem comprometimento clínico (KITSIOU-TZELI et al., 2007)

No presente estudo, nenhum indivíduo apresentou deleção em 2q37 após

análise por bandamento GTG em alta resolução. Entretanto, um com diagnóstico

de síndrome de Asperger, apresentou uma suspeita de deleção de 2q37, mas que

não foi confirmada por FISH. Não é possível descartar que o paciente apresente

uma outra alteração na região terminal do braço longo do cromossomo 2, porém

envolvendo outras regiões que não foram avaliadas neste estudo, mas que não

envolve 2q37. Pois a sonda utilizada hibridiza-se em parte da sub-banda 2q37.3 e

não inteiramente, não descartando então que na mesma sub-banda possa ter

ocorrido deleção ou até mesmo em outra sub-banda de 2q37.

Quanto à região avaliada do cromossomo 22, há uma afecção denominada

síndrome da deleção de 22q13, ou síndrome de Phelan McDermid, caracterizada

por hipotonia neonatal grave (>97%), problemas globais do desenvolvimento

(>98%), incluindo comportamento autístico, crescimento normal a acelerado

(95%), fala ausente ou gravemente atrasada (>98%) e características dismórficas

menores (PHELAN, 2008; OMIM, 2009). O interesse científico crescente nesta

região decorre da sua ligação com quadros autísticos (HEILSTEDT et al., 2003;

RAVNAN et al, 2006). Inclusive, a deleção em 22q13 foi proposta como uma das

alterações cromossômicas mais comumente associadas com autismo (PHELAN,

2008).

Nesse estudo não foram encontradas deleções em 22q13.3 pela análise

citogenética em bandamento GTG em alta resolução. Desde que o tamanho dessas

deleções pode variar em tamanho, de 160Kb a 9Mb, a análise em alta resolução

pode realmente não detectar muitas delas. Há a necessidade de estudos pela

técnica de FISH para a confirmação de resultados (BARBOSA-GONÇALVES et

al., 2008). A análise em alta resolução pode realmente não ser suficiente para

detecção destas alterações (LUCIANI, et al., 2003), contudo, isto não ocorreu com

os casos aqui estudados, uma vez que através de um outro projeto vinculado ao

mesmo grupo de pesquisa da autora, todos foram avaliados por FISH e não

mostraram alterações em 2q37 e 22q13.3 (BARBOSA-GONÇALVES,

comunicação pessoal).

Nenhuma técnica é conclusiva quando é utilizada isoladamente. A análise

por FISH com sondas subteloméricas também pode gerar resultados ambíguos que

requerem avaliação cuidadosa da intensidade da hibridização do sinal (tamanho

do sinal). Apenas discriminar a presença ou ausência dos sinais não é suficiente

(LUCIANI, et al., 2003; BONAGLIA, et al., 2006).

Apesar do grande número de casos relatados de deleções nas regiões

referidas, muitos deles não foram descritos na literatura de DEA, pois alguns

estudos têm interesse específico em quadros autísticos e outros em citogenética,

mas não em ambos. Por exemplo, um caso pode ser apresentado com a

anormalidade citogenética bem descrita, mas sem a descrição do fenótipo

comportamental do afetado. Além disso, é provável que muitos casos clínicos não

foram publicados, enquanto ao mesmo tempo pode ocorrer um viés da publicação

em favor de casos clinicamente interessantes (VORSTMAN, et al., 2006).

Além disso, os indivíduos aqui estudados não foram selecionados quanto a

presença de quadros clínicos específicos que caracterizam as síndromes descritas

nas regiões 2q37 e 22q13.3, o que pode explicar também a não detecção de

alterações nessas regiões.

Portanto, em pacientes com DEA têm sido descritas alterações

cromossômicas subteloméricas crípticas, como em 2q37 e 22q13, mas estas são

mais raras que se supõe ou muito difíceis de serem diagnosticadas em uma

avaliação cariotípica convencional ou mesmo em alta resolução. Isto sugere que a

avaliação destas regiões na triagem de pacientes ou nos protocolos de investigação

laboratorial de rotina deve ser questionado.

A região 22q13.3 desperta interesse científico não só pelas deleções

associadas a DEA, mas também pelas alterações no gene SHANK3, mapeado

22q13.3 (LINTAS; PERSICO, 2008). Casos investigados por Delahaye, et al.

(2009), por exemplo, confirmam a haploinsuficiência de SHANK3 no fenótipo da

síndrome da deleção de 22q13.3, que inclui autismo.

No presente estudo foram avaliados os éxons 8 e 22 do gene SHANK3.

Inicialmente, a proposta era estudar o éxon 21, de acordo com alterações descritas

por Durand et al. (2007) e Moessnner et al. (2007). Entretanto, observou-se que os

primers descritos anelavam-se à região correspondente ao éxon 21 da sequência

genômica do SHANK3, inicialmente derivada do gene SHANK3 de rato com

Expressed Sequence Tags (ESTs) humanas listadas no UCSC Genome Browser,

mas não com as do éxon 21 humano, e sim com as do 22 , de acordo com o

Genbank. Assim, após comunicação pessoal com um dos autores, este confirmou

que as alterações estavam localizadas no éxon 22 humano.

A análise das seqüências do éxon 8 e dos dois pontos escolhidos do éxon

22 por sequenciamento direto, revelou seqüências selvagens, ou seja, normais em

todos os indivíduos estudados.

Este resultado pode ser explicado pelo fato de que as mutações em

SHANK3 em pacientes com DEA são raras e têm sido investigadas mais

recentemente nessa população. Alterações envolvendo este gene ocorrem em

cerca de 1,1% dos indivíduos com DEA e o número de indivíduos estudados ainda

é restrito (LINTAS; PERSICO, 2008).

Contudo, um estudo realizado em 330 famílias com mais de um indivíduo

com DEA e em 76 casos esporádicos em suas famílias, investigou SNPs e CNVs

no gene SHANK3 e não encontrou alterações. Uma das justificativas do autor foi

que utilizaram técnicas de rastreamento e que alterações podem não ter sido

detectadas, uma vez que eles não realizaram sequenciamento do gene para

confirmar os achados (SYKES et al., 2009). Pode ser sugerido, com os dados

obtidos aqui, inclusive porque o sequenciamento das regiões descritas como

alteradas no gene SHANK3 foi feito, que os achados são raros, porém estudos com

casuísticas maiores são necessários para conclusão.

Assim, em DEA são inúmeras e variáveis alterações descritas, com

envolvimento de diversas regiões cromossômicas e muitos genes propostos como

candidatos, além do que foi investigado neste estudo. Esta complexidade resulta

em dúvidas quanto ao que merece ser inicialmente incluído nos protocolos de

investigação laboratorial dos afetados para ser utilizado no Aconselhamento

Genético das famílias.

Sociedade Americana Psiquiatria sugere que em casos de DEA seja

realizada seleção clínica criteriosa, avaliação por um geneticista clínico, além da

análise do cariótipo e investigação molecular da síndrome do Cromossomo X

Frágil (PHILIPPE et al., 2008).

Conclusões

6. CONCLUSÕES

A introdução da análise de regiões específicas como 2q37 e 22q13 no

protocolo de investigação genética de rotina dos indivíduos com DEA parece não

ser necessária em indivíduos não selecionados, porém indivíduos que apresentem

fenótipos clínicos compatíveis com as síndromes caracterizadas nessas regiões

podem ser indicados para investigação das mesmas.

As suspeitas de deleção ou qualquer outra alteração estrutural detectadas

pela técnica de bandamento GTG em alta resolução em sujeitos com DEA devem

ser confirmadas por técnicas complementares como a técnica de FISH.

Não há sugestões de que a análise de mutações nos éxons 8 e 22 do gene

SHANK3 mereça ser investigada em protocolos de avaliação dos pacientes,

entretanto em indivíduos que apresentarem a síndrome da deleção de 22q13.3

após análise clínica e confirmação por um outro exame, como a técnica de FISH

específica para essa região, é sugestivo uma análise do gene SHANK3 para

investigação de alterações no mesmo.

Referências

7. REFERÊNCIAS

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Anexos

8. ANEXOS

8.1 Anexo A- Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

(Conselho Nacional de Saúde, Resolução 196/96)

Este documento tem o objetivo de convidar o

(a).............................................................................., pelo qual o (a) senhor (a) é

responsável legal, a participar do Projeto de Pesquisa “Análise Citogenética em

Alta Resolução de 2q37 e 22q13 e Molecular do gene Shank3 em Doenças do

Espectro Autístico”, que está sob a responsabilidade das pesquisadoras Prof

. Agnes Cristina Fett Conte (Depto de Biologia Molecular – FAMERP) e

Ana Luiza Bossolani Martins (mestranda – IBILCE/UNESP), cujos telefones

para contato são: (0xx17) 32015000 ramal 5813 (Comitê de Ética em Pesquisa) e

32015000, ramal 1931 (Serviço de Genética).

O objetivo é avaliar regiões específicas do material genético, denominadas

regiões subteloméricas dos braços longos dos cromossomos 2 (2q) e 22 (22q), em

pacientes com doenças do espectro autístico, que são doenças comportamentais,

como a que seu (sua) filho (a) apresenta. Estas regiões podem estar relacionadas

com a causa da doença e é isso que será estudado.

Para atingir este objetivo, será necessária a coleta de um pouco (5ml) de

sangue da veia do braço do (a) seu (sua) filho (a), sem necessidade de estar

em jejum. Será coletado por profissional especializado. Também serão tiradas

fotos em vistas frontal e lateral e será feita uma entrevista com os pais. O

Para uma investigação científica honesta e segura, a pessoa que vai

participar do estudo, ou o seu responsável legal deve dar seu consentimento

livremente, após ter sido muito bem informado sobre os riscos e benefícios do

estudo. É da responsabilidade do pesquisador lhe dar toda e qualquer informação

necessária e solicitada. Este termo de consentimento tem a finalidade de

proteger o participante do estudo.

sangue do paciente será utilizado única e exclusivamente para atingir o objetivo

deste estudo e após a sua utilização será descartado.

Os riscos para a saúde são: dor, ardência, infecção ou mancha roxa no

braço no local da retirada do sangue, mas todas as medidas de proteção serão

tomadas.

Para esclarecimento de dúvidas as pesquisadoras responsáveis podem ser

contatadas pelo telefone ou pessoalmente. Em caso de ser detectada alguma

alteração nos exames, os resultados serão muito bem esclarecidos e todas as

informações/esclarecimentos serão oferecidos em sessão de Aconselhamento

Genético, que será realizada pela pesquisadora orientadora deste estudo. Também

todas as informações obtidas da sua participação serão consideradas confidenciais,

ficando a identidade de toda sua família mantida em segredo, em qualquer

situação.As informações obtidas desta pesquisa só poderão ser divulgadas em

reuniões ou revistas científicas e sem revelar o nome do (a) seu (sua) filho (a).

Se decidir não participar ou interromper a sua participação, em qualquer época,

você não terá nenhum tipo de prejuízo, não perderá nenhum benefício e não

precisará dar justificativas da sua atitude.

Ao assinar esse documento, você estará confirmando que o leu, recebeu

informações claras sobre este estudo, que teve oportunidade de fazer perguntas e

todas foram respondidas, que está de acordo em participar livre e

espontaneamente e sabe que, sob hipótese alguma receberá qualquer tipo de

gratificação pela participação.

Este estudo poderá contribuir para o conhecimento das causas e das

manifestações envolvidas na doença do tipo autístico e que, dependendo do

resultado, no seu caso, poderá auxiliar no diagnóstico e orientação genética para a

sua família.

Eu dou o meu consentimento para participação do (a) meu (minha) filho (a).

Nome do responsável legal: ...........................................................................

Vínculo: Pai( ) mãe( ) outro( ).....................................

Quero receber os resultados dos exames? Sim ( ) Não ( )

Data:....../........./.........

Assinatura:..................................................................................................................

.........

DECLARAÇÃO DE RESPONSBILIDADE: Expliquei a natureza, objetivos,

riscos e benefícios desta investigação. Coloquei-me à disposição para perguntas e

respondi a todas. Obtive o consentimento de maneira livre e me coloquei à

disposição para qualquer outro esclarecimento pelo telefone (0xx17) 3201-5000

ramal 1931.

Pesquisador:.....................................................................

RG:.............................................................

Data:......../........./.........

Assinatura:.......................................................................

Apêndices

9. APÊNDICES

9.1 Apêndice A- Análise citogenética por bandamento GTG convencional e

em alta resolução da região 2q37 em pacientes com doenças do Espectro

Autístico

O artigo intitulado “Molecular Evaluation of exon 8 e 22 of the SHANK3

gene in Autism Spectrum Disorders” foi submetido à revista Molecular

Psychiatry.

9.2 Apêndice B- Molecular Evaluation of exon 8 e 22 of the SHANK3 gene in

Autism Spectrum Disorders

Molecular Evaluation of exons 8 and 22 of the SHANK3 gene in

Autism Spectrum Disorders

AL Bossolani-Martins

, FC

Rodrigues-Lisoni

Nogueira

, A Barbosa-Gonçalves

Tajara

and AC Fett-Conte

Biology Department, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,

Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto, SP, Brazil;

Biology and

Zoology Department, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira (FEIS), Ilha

Solteira, SP, Brazil;

Department of Dermatological, Infectios and Parasitic

diseases, Medicine School in São José do Rio Preto, São José do Rio Preto, SP,

Brazil;

Biology Department, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,

Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto, SP, Brazil.

Molecular

Biology Department, Medicine School in São José do Rio Preto, São José do Rio

Preto, SP, Brazil

Abstract

Autism spectrum disorders are a group of neurodevelopmental disorders with a

complex and heterogeneous etiology. Studies have shown that genetic factors play

an important role in the aetiology of these diseases. Recently, de novo mutations,

frameshifts and deletions have been described in the SHANK3 gene, also known

as ProSAP2 gene, which encodes a synaptic scaffolding protein. All the

participants of this study had normal karyotypes and underwent screening for

Fragile-X syndrome. Subsequently, they were analyzed by direct sequencing of

different points of exons 8 and 22 of the SHANK3 gene. None of the study

participants presented with changes in these regions. These findings may be due to

the fact that mutations, deletions and duplications of the SHANK3 gene are rare.

Key-words: Autism Spectrum Disorders, 22q13.3, SHANK3

Introduction

Autism Spectrum Disorders (ASDs) are a clinically complex group of childhood

disorders that have firm evidence of an underlying genetic etiology.

The group of

ASDs includes autism, as well as Pervasive Developmental Disorder not

otherwise specified (PDD-NOS) and Asperger’s syndrome.

The diagnosis of

ASDs is based on impairments in reciprocal social interaction and

communication, and restricted and stereotyped patterns of interests and activities

with abnormal development apparent within the first 3 years of life.

The

prevalence of ASDs is estimated at 1 per 150 children.

Cases are isolated or

associated and a recognized cause is identified in ~10% of individuals, most

commonly fragile-X syndrome, tuberous sclerosis and cytogenetically detectable

chromosome abnormalities.

5,6,7

Standard karyotype analyses show chromosomal

rearrangements in 3%-6% of cases, the most common being deletions and

duplications on chromosomes 2q, 7q, 15q and 22q.

8,9

The SHANK3 gene, mapped on chromosome 22q13.3, has been extensively

studied in this population. This gene encodes the postsynaptic density protein

(PSD) specialized at excitatory synapses, where it may function as a master

scaffolder forming large sheets that may well represent the platform for the

construction of the PSD complex, where it binds directly to neuroligins.

10,11

The

PSD is usually located at the tip of dendritic protrusions of about 1-2 m in

length, termed dendritic spines, and separated from the presynaptic transmitter-

containing terminal by the synaptic cleft. Thus shank proteins are not considered

to provide a direct scaffolding function for transmitter receptors, but rather work

indirectly by connecting different types of scaffold/receptor complexes, leading to

the concept of a “master” or “higher order” scaffold. This view is strongly

supported by different protein interactions in which Shank proteins are involved.

In addition to their function of assembling the PSD during synaptogenesis, the

SHANK3 protein may play a role in synaptic plasticity and in the regulation of

dendritic spine morphology.

SHANK3 mutations, deletions and duplications are rare, occurring in only 1.1% of

patients with ASD. However, the genotype-phenotype correlation suggests that

individuals with severe language and social impairment might be good candidates

for SHANK3 mutation screening.

Two recent studies reported possible correlations between mutations or small

cytogenetic rearrangements affecting the SHANK3 gene and an ASD phenotype

chiefly characterized by severe verbal and social deficits. The first study found a

deletion of 142 Kb in intron 8, one frameshift mutation (E409X) in exon 21, a

deletion of 800 kb, and R12C and R300C mutations in exons 1 and 8,

respectively.

The second work reported a missense mutation (Q321R) in exon 8,

a 15-nt deletion in exon 21 and deletions of 277 Kb, 3.2 Mb and 4.36 Mb in

22q13.

The lack of one functional copy of the gene would thus lead to severe

neurological deficits because individual neurons cannot provide enough Shank

proteins for synapse development and maintenance. In addition, it makes sense

that the amount of Shank protein in dendrites is tightly controlled, most likely by

local synthesis derived from dendritically transported mRNAs, and activity-

dependent degradation through the ubiquitin proteasome system.

This current pilot study evaluated exons 8 and 22 of the SHANK3 gene by direct

sequencing.

Subjects and Methods

This study was approved by the Research Ethics Committee (CEP) of the

Medicine School in São José do Rio Preto and CONEP (process

25000.015469/2007-59). After obtaining written informed consent from parents, a

total of 30 (22 male and 8 female) unrelated individuals with ASDs were studied.

These individuals, of mixed ethnicity and representative of the Brazilian

population, were aged from 5 to 30 years old (mean = 14.16 and standard

deviation = 6.30 years). Fifteen (50%) were diagnosed as autistic, 11 (36.67%)

with PDD-NOS and 4 (13.33%) with Asperger’s syndrome. The patients were

from two specialized autism schools and all individuals were conclusively

diagnosed by psychiatrists using different methods. Additionally, all were

evaluated by an interdisciplinary team composed of a psychiatrist, neurologist,

geneticist, psychologist, speech therapist and nurse before participating in this

study. Besides the clinical evaluation, the diagnosis of ASD was made if the

patient met the DSM-IV criteria. Patients were submitted to clinical and

karyotypic examinations and molecular investigations of the FMR1 gene. Only

those individuals with normal results for these tests were included in the study.

We also excluded patients with evidence of any other psychiatric or neurological

conditions and those with other genetic syndromes. Genomic DNA was isolated

from the leukocytes of peripheral blood

and the primer sequences were designed

using the Primer3 program.

For all patients, the entire exon 8 and parts of the coding region of exon 22 of the

SHANK3 gene were screened.

Exon 8 was targeted using the forward and reverse primers (5´-

CAGCTGTGATTCCCTCTTCC-3´ and 5´-GGGAAGAACCAAGGTTCAGA-3´)

flanking the positions 8671 and 8870 of DNA producing an amplification of 200

bp. Exon 22 was targeted using

two pairs of primers

; the first flanked the

positions 46748 and 46934 of DNA, producing an amplification of 186 pb

(forward primer 5´- GAAGTCACCCGAGGACAAGA-3´ and reverse primer 5´-

CACAGCCGCTGACTGCAT-3´) and the second flanked the positions 47435 and

47617 of DNA, producing an amplification of 183 pb (forward primer 5´-

CAAGCCCAAGCTCAAGTCC-3´ and reverse primer 5´-

GGGAAGAACCAAGGTTCAGA -3´).

Amplification was performed in a reaction volume of 25L containing 1x PCR

Buffer, 50mM of MgCl

1.25mM dNTPs (GE Healthcare), 50ng genomic DNA,

10M of each primer, and 5U Taq DNA polymerase (Invitrogen). The PCR

reaction was carried out in a GeneAmp

PCR System 9700 (Applied Biosystems,

CA) with 4 min of denaturation at 94ºC, followed by 35 cycles of 94ºC for 45s,

45s at an annealing temperature of 62ºC, and for exon 8, an extension for 1 min at

72ºC, with 5 min denaturation at 95ºC, followed by 30 cycles of 95ºC for 30s, 30s

at the annealing temperature at 57ºC, and for each primers of exon 22, extension

for 1 min at 72ºC.

PCR products were purified with ethanol.

Sequencing reactions were carried

out with the Applied Biosystems Dye-Terminator v3.1 Kit (Applied Biosystems,

USA) and analyzed on a 3730 DNA analyzer (Applied Biosystems, CA). Analysis

of sequences was performed using the DS Gene 2.0 program (Accelrys, USA) and

a comparison with existing sequences was made using GenBank

(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/24137474).

To date 30 individuals have been investigated. Karyotyping was performed when

possible on probands resulting in 27 individuals and 9 subjects for molecular

genetic testing of the Fragile-X syndrome with one affected individual in each

family. Direct sequencing of exon 8 and two exon 22 regions of the SHANK3

gene was performed for all subjects.

Results

All subjects had wild sequences according to Genbank. Thus, all participants had

normal sequences from 8700 to 8870, the position of exon 8 in the SHANK3 gene.

Furthermore, they were normal considering the regions from 46748 to 46934 and

from 47435 to 47617 positions of DNA of exon 22 of the SHANK3 gene when

analyzed by direct sequencing.

Discussion

SHANK3 is located on chromosome 22q13.3, spans approximately 57kb and

contains 23 exons. Seven of the exons are alternatively spliced, which may

influence the spectrum of SHANK-interacting proteins. SHANK3 expression in

the brain seems to be confined to the cortex, hippocampus and cerebellum.

Owing to its emerging role in neuropsychiatric disorders, SHANK3 was first

implicated in the field of neuro-psychiatric disorders when a patient with 22q13.3

deletion syndrome was found to have a de novo reciprocal translocation that

disrupted the gene. Subsequent studies have identified de novo deletions and

mutations of SHANK3 in individuals with autism, thus corroborating with

previous reports about the role of the gene within the autistic phenotype.

Exon 8 of the SHANK3 gene has 78 pb and exon 21 has 2254 pb. A de novo

mutation has been described in exon 8, characterized by the exchange of A962G

mRNA, which resulted in a heterozygous Q321R substitution.

In this study the

entire exon 8 was screened in all participants but no changes were identified.

A frameshift mutation (E409X) and a 15-nt deletion have also been found in exon

21.

2,8

We initially chose to study this site (exon 21) as it had previously been

reported as disrupted

2,8

, but the sequences of primers described by the authors

correspond to exon 22 of the human SHANK3 gene according to GenBank data. In

personal correspondence with Christian R. Marshall, one of authors, it was noted

that the sequence described was correct, but that it corresponded to exon 22

instead of 21. Thus, we chose to study parts of exon 22 and all the subjects were

normal.

A correlation between mutations or small cytogenetic rearrangements affecting

different exons of SHANK3 and ASD is possible.

2,14,19

Based on diagnostic tests,

karyotyping and fragile-X testing must be requested for all patients with ASD. In

the presence of dysmorphic features and evident neurological symptoms, it is

reasonable to suspect the chromosomal rearrangements exist even if the karyotype

appears normal. Depending upon availability and cost, BAC or CGH analysis is

strongly advised in these cases. As these technologies will become progressively

more available, it will be important not to restrict them to patients with

dysmorphia, as microdeletions and microduplications are also common among

patients with idiopathic, non-dysmorphic ASD.

However genetic screening is a

powerful tool when dealing with monogenic Mendelian disorders that are

characterized by direct genotype-phenotype correlations. In the case of complex

disorders, such as ASD, widespread genetic testing would not only be expensive

and time-consuming, but also generally inappropriate due to the etiological

complexity.

Our findings were normal possibly due to the fact that mutations, deletions and

duplications in SHANK3 are rare events, only occurring in approximately 1.1% of

individuals with ASD

14,18,21

and in this pilot study we investigated a small number

of Brazilian subjects. Sykes et al. (2009)

not found

SNP association and copy

number variants (CNVs) in SHANK3 but so rare mutations potentially could have

been missed within the gene, cause sequence analysis was not conducted, but we

did and not found too.

There are numerous and variable changes in ASD, involving different

chromosomal regions and many genes have been proposed as candidates

including the one investigated here. Maybe genetic screening programs for the

SHANK3 gene could be implemented but not for all patients with ASD, only for

those patients with severe verbal and social deficits bearing in mind that some

SHANK3 mutations have also been found to be transmitted to unaffected siblings

of ASD probands.

The etiological complexity results in misinformation about what deserves to be

initially included in the protocols of laboratory investigations of affected

individuals.

Conflict of Interest Statement. The authors declare that they have no competing

interests.

Acknowledgements

We thank all the patients and families who collaborated with this study. We also

thank David A. Hewitt for the correction of English and idiomatic adaptations.

Bossolani-Martins

AL is grateful to the Brazilian agency Coordination for the

Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) for a Ph.D. scholarship.

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O artigo intitulado “Evaluation of 2q37 and 22q13 by High Resolution

Cytogenetics in Brazilians with Autism Spectrum Disorders” será submetido a

revista Human Genetics.

9.3 Apêndice C- Evaluation of 2q37 and 22q13 by High Resolution

Cytogenetics in Brazilians with Autism Spectrum Disorders

Evaluation of 2q37 and 22q13 by High Resolution Cytogenetics in

Brazilians with Autism Spectrum Disorders

Ana L. Bossolani-Martins

 Adriana Barbosa-Gonçalves

 Agnes C. Fett-Conte

Biology Department, Instituto de Biociência Letras e Ciências Exatas,

Universidade Estadual de São Paulo, São José do Rio Preto, Brazil

Molecular Biology Department, Medicine School in São José do Rio Preto, São

José do Rio Preto, Brazil

Corresponding author: A.C. Fett-Conte

E-mail: [email protected]

Departamento de Biologia Molecular

Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto,

São José do Rio Preto, SP, Brasil

Abstract

Some reports have described an increased frequency of chromosomal

abnormalities in subjects with Autism Spectrum Disorders, including both visible

and cryptic anomalies such as deletions of 2q37 and 22q13. Using high resolution

G-banding techniques, we assessed these chromosomal regions in 43 patients with

sporadic cases of autism spectrum disorders

in their families

. All nonspecific

results were elucidated by Fluorescence in situ Hybridization. No abnormalities

were detected in these regions. We conclude that high resolution cytogenetic

analysis of the 2q37 and 22q13 regions should not be so broadly indicated in these

disorders. They seem to be rare events and this kind of investigation is not a

useful screening tool for the autism spectrum disorder population.

Key-words: Autism Spectrum Disorders, terminal deletions, 2q37, 22q13,

cytogenetics

Introduction

Autism Spectrum Disorders (ASD) are diagnosed in early childhood and include

Autism, Asperger’s disorder and Pervasive developmental disorder - not

otherwise specified (PDD-NOS). Thus, these disorders are associated to varying

degrees of dysfunctional communication and social skills, repetitive and

stereotypic behavior, as well as attention and learning disabilities (Theoharides

2009). ASD are about four times more common in boys than girls and currently 1

in 150 children are diagnosed with an ASD (Currenti 2009).

Chromosomal abnormalities have been the focus of research on the etiology of

ASD because individuals, in addition to core symptoms, also experience a variety

of physical and behavioral impairments that are commonly associated with

chromosomal abnormalities such as mental retardation, epilepsy, facial

dysmorphology and physical anomalies (Wassink et al. 2007). Different structural

chromosomal abnormalities have been reported in subjects with autism. There are

several reports of autistic patients who are described as having 22q13 and 2q37

monosomies resulting from simple terminal deletions involving the distal portions

of chromosomes (Bonaglia et al. 2006).

A diagnosis of autism or description of autistic behavior was reported by Casas et

al. (2004) in 24% of subjects with 2q37 deletions and by Aldred et al. (2004) in

35% of their cohort.

The 22q13 deletion has also been shown to be a chromosomal defect associated

with autism. It is known as Phelan-McDermid syndrome and manifests in patients

as dysmorphic features and with autistic behavior (Cohen et al. 2005).

High-resolution karyotyping has been proposed as a routine laboratory test for

patients with ASD because it detects cytogenetic anomalies in 5-10% of cases and

may discover the diagnosis of small chromosomal deletions (Conrad et al. 1995;

Wassink et al. 2007).

Here, we report on the results of a study that, using high resolution G-banding,

investigated the presence of abnormalities in the 2q37 and 22q13 regions in a

small cohort of selected probands with ASD.

Materials and Methods

Subjects

This study was approved by the Ethics Research Committee of the Medicine

School in São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. All families were recruited

from special clinics and schools for Pervasive Developmental Disorders.

The primary inclusion criterion for participation in the study was a DSM-IV

diagnosis for ASD. Diagnostic evaluations were conducted by psychologists,

psychiatrists, members of interdisciplinary teams and specialists in autism.

Subjects were excluded if they had been exposed to teratogenic agents, suffered

birth asphyxia or infections, any chromosomal abnormality detected by

conventional G-band, positive results of analysis for Fragile X syndrome or if

they had medical conditions or genetic syndromes associated with ASD. Forty-

three subjects, 31 males and 12 females, were evaluated in this study. Twenty

(46.52%) had been diagnosed with Autism, 6 (13.95%) with Asperger’s

Syndrome and 17 (39.53%) with PDD-NOS.

Cytogenetic Studies

Blood samples were collected from all participants in vacutainers containing

sodium heparin. Prometaphase chromosomes were prepared from

phytohemagglutinin stimulated peripheral lymphocytes using the standard method

for conventional and high-resolution GTG-banding techniques (>550 bands).

Cases with prometaphases suspected as having 2q37 deletions were submitted to

Fluorescence in situ Hybridization (FISH) using a Tel Vysion 2q Spectrum

Orange (Vysis) probe. In order to determine the banding resolution, we selected

segments of long chromosomes and compared them with diagrammatic

representations according to ISCN (2009).

Results

Normal karyotypes were obtained for all 43 probands by conventional and high

resolution G-banding. Cryptic rearrangements involving the 2q37 and 22q13

chromosomal regions were not detected in any of our patients. Cases with

prometaphases suspected as having 2q37 deletions were submitted to

Fluorescence in situ Hybridization (FISH) with the results proving to be normal.

Discussion

Cytogenetic abnormalities can lead to functional genetic changes in several ways:

dosage effects as a consequence of changes in gene copy number (e.g. as in

deletions or duplications), breakpoints associated with a rearrangement event may

directly disrupt a gene, genes may be separated from gene-regulatory sequences as

a consequence of a rearrangement (position effect) and deletions may lead to the

unmasking of a point mutation in a gene located in the corresponding region of

the non-deleted homologous chromosome (Vorstman et al. 2006). Because of this,

cytogenetic abnormalities are the focus of much research to investigate the

complex and heterogeneous etiology of ASD, including candidates such as 2q37

and 22q13.

Associations between deletions in the 2q37 and 22q13 regions and the diagnosis

of ASD do not seem to be common. These regions can be normal at the

cytogenetic level despite of presenting genes already described as being involved

in the autism phenotypes, such as CENTG2 in 2q37 and SHANK3 in 22q13.3. We

used the high resolution G-band technique which gave normal results for all

patients. However, this technique may fail to detect subtelomeric chromosomal

abnormalities of less than ~5Mb in length, which are gene-rich regions prone to

anomalies. The technique can also miss larger abnormalities that do not alter the

G-banding pattern (Salman, Jhanwar, Ostrer 2004). Thus, FISH can be used to

overcome some limitations in cases identified as positive by high resolution

banding analysis. The slides on which prometaphases were detected and thus

suggestive of abnormalities were subsequently submitted to FISH with all

demonstrating normal signals.

Hence, we conclude that high resolution cytogenetic analysis of subtelomeric

2q37 and 22q13 regions do not appear to prove useful as a cytogenetic screening

tool for Autism Spectrum Disorders.

Acknowledgements

We would like to thank the families who participated in this study. We would also

like to thank David A. Hewitt for the correction of English and idiomatic

adaptations.

Bossolani-Martins

AL is grateful to the Brazilian agency

Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) for a

Ph.D. scholarship.

References

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