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L
EANDRO
F
REIRE
D
OS
SANTOS
PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DA LEVANA DE
Bacillus subtilis
NATTO
EM FILMES ISOLADOS PARA LIBERAÇÃO CÓLON
-
ESPECÍFICA DE FÁRMACOS
Londrina
2010
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L
EANDRO
F
REIRE
D
OS
SANTOS
PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DA LEVANA DE
Bacill
us subtilis
NATTO
EM FILMES ISOLADOS PARA LIBERAÇÃO CÓLON
-
ESPECÍFICA DE FÁRMACOS
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
em Biotecnologia, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do Grau de Mestre em
Biote
c
nologia,
área Agroindust
rial
.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Maria Antonia Pedrine
Colabone Celligoi
Co
-orientador: Prof. Dr. Osvaldo Albuquerque
Cavalcanti
LONDRINA
2010
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L
EANDRO
F
REIRE
D
OS
SANTOS
PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DA LEVANA DE
Bacillus subtilis
NATTO
EM FILMES ISOLADO
S PARA LIBERAÇÃO CÓLON
-
ESPECÍFICA DE FÁRMACOS
Banca Examinadora
Prof
a
. Dr
a
. Maria Antonia Pedrine Colabone Celligoi
Universidade Estadual de Londrina
Prof
a
. Dr
a
.
Márcia Portilho
Universidade Estadual de Maringá
Prof. Dr. João Batista Buzato
Un
iversi
dade
Estadual de Londrina
Londrina, 01 de março
de 2010
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais e a
Deus
.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Cláudio
e Branca pelo amor, suporte financeiro e emocional.
Ao meu irmão e cunhada, Tiago e Monica pelas horas compartilhadas, as
brincadeiras e a amizade.
Aos meus estimados orientadores
Prof
a
. Dr
a
. Maria Antonia Pedrine Colabone
Celligoi
e
Prof. Dr. Osvaldo Albuquerque Cavalcanti por todo suporte, conselhos,
ensinamentos
e pelo bom convívio durante a construção deste trabalho.
Ao Paulo,
Nelson
e Lucivana
, pela competência profissional e atenção.
Aos queridos amigos do mestrado, Anelize, Cristina, Leandra, Letícia, Luciana,
Rafael, Thaís e Vanessa, pela companhia na conclusão dos créditos,
apresentação de seminários, viagens e conversas.
Aos queridos amigos do laboratório, Elaine, Siliane, Adriano, Bruno e
Marcela pelo
compartilhamento de materiais e conhecimento.
Ao professor Wagner José Martins Paiva do Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Estadual de Londrina pelas contribuições nas análises de MTT e
micronúcleo.
Ao professor Edgardo Alfonso Gómez Pineda do Departamento de Química da
Universidade Estadual de Maringá pelas contribuições nas análises de DSC e
TGA.
Ao professor Dionísio Borsato do Centro de Ciências Exatas da Universidade
Estadual de Londrina pelas contribuições nas análises estatísticas.
Às professoras Marcela Maria Baracat e Geni Varéa Pereira pelas sugestões na
qualificação.
Aos professores João Batista Buzato e Márcia Portilho pelas sugestões na defesa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, pela
bolsa concedida, fato este que possibilitou a viabilização deste trabalho.
A todos aqueles que se fizerem presentes, que foram solidários e que torceram
por mim.
“Tudo passa sobre a terra”
José de Alencar
SANTOS, Leandro Freire dos. Produção e aplicação da levana de B
acillus
subtilis
NATTO
em filmes isolados para liberação cólon-específica de
fármacos
. 2010. 136 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) –
Universidade
Estadual de Londrina, Londrina. 2010.
RESUMO
Este trabalho teve o objetivo de apresentar a levana como candidata na
elaboração de um novo material polimérico conjuntamente com o Eudragit FS
30D
®
e RS
30D
®
. Filmes cólon-específicos, a base de polímeros metacrilatados,
possuem
maior controle na liberação do ativo quando aditivados de um prebiótico;
melhorando a terapêutica de patologias colônicas. Paralelamente ao objetivo
principal, o estud
o
buscou otimizar a
produção
de levana
pelo
Bacillus subtilis
NATTO
e caracterizá-
la
, bem como
caracterizar
os filmes produzidos. A condição
ótima de produção de levana, pela análise fatorial e metodologia de superfície de
resposta, foi obtida utilizando-se 400 g/L de sacarose com 16 h de tempo de
cultivo; com
a
produção
de 111,6 g/L.
A levana produzida apresentava duas faixas
de massas molares, aproximadamente 568 KDa e < 50 KDa; nas quantidades
13,39% e 86,61%, bem como apresentava um comportamento Newtoniano. A
levana também se apresentou não citotóxica e não mutagênica para células de
ovário
de hamster chinês nas diferentes concentrações de levana testadas.
As
películas isoladas confeccionadas forneceram
subsídi
os iniciais promissores
quanto
a
o futuro revestimento de fármacos na qual se deseja
absorção colônica.
Palavras chaves:
Levana,
Bacillus subtilis
,
filmes, Eudragit FS 30D
, Eudragit RS 30D.
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
ANOVA
Análise de Variância
DSC
Calorimetria Diferencial de Varredura
DTG
Termogravimetria derivada
EF
Eudragit FS 30 D
®
EFL
Eudragit FS 30 D
®
aditivado com levana
EPS
Exopolissacarídeo
ER
Eudragit RS 30 D
®
ERL
Eudragit RS 30 D
®
aditivado com levana
FSG
Fluído de Simulação Gástr
ica
FSI
Fluído de Simulação Intestinal
HPAEC
Cromatografia líquida de Alta Pressão em Coluna de Troca Aniônica
Ii%
Índice de Intumescimento
MEG
Monoestearato de glicerila
MTT
brometo de 3
-
(4,5
-
dimetiltiazol
-2-
il)
-2,5-
difeniltetrazólio)
PBS
Tampão fosfato
t
d
Temperatura de relaxação
TEC
Citrato de trietila
tg
Temperatura de Transição Vítrea
t
m
Temperatura de degradação
TGA
Termogravimetria
TGI
Trato gastrintestinal
TVA
Transmissão de Vapor d`
água
USP 23
Farmacopéia dos Estados Unidos da América 23
a
Ed.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
...................................................................................................
13
2 OBJETIVOS
.......................................................................................................
15
2.1 OBJETIVO GERAL
.......................................................................................
15
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
........................................................................
15
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
...............................................................................
16
3.1 Levana
..........................................................................................................
16
3.1.1 Produção de Levana
..................................................................................
18
3.1.2 Aplicação dos exopoliss
acarídeos
.............................................................
23
3.2 LIBERAÇÃO MODIFICADA DE FÁRMACOS
..............................................
28
4 MATERIAIS E MÉTODOS
..................................................................................
41
4.1 MATERIAIS
..................................................................................................
41
4.1.1 Microrganismo
........................................................................................
41
4.1.2 Meios de Cultura
.....................................................................................
41
4.1.2.1 Meio de preservação
(Ágar nutriente)
.................................................
41
4.1.2.2 Meio para obtenção do pré –
inóculo
(CALAZANS et al., 2000)
..........
42
4.1.2.3 Meio de fermentação (EUZENAT, GUILBERT e COMBES, 1996)
......
42
4.1.3 Ensaios de Citotoxicidade e Mutagenicidade
.........................................
43
4.1.3.1 Cultivo Celular
.....................................................................................
43
4.1.3.2 Meio de Cultura
...................................................................................
43
4.1.3.3 Solução salina balanceada (PBS) livre de Ca
+2
e Mg
2+
.......................
44
4.1.3.4 Solução Balanceada Salina de Hanks sem Ca
+2
e Mg
2+
......................
44
4.1.3.5 Tripsina EDTA 0,025%
........................................................................
45
4.1.3.6 Solução de MTT (3-
(4,5
-
dimetiltiazol
-2-
il)
-2,5-
difenil tetrazolium
bomídico) (Sigma®) 3,33 g/mL
......................................................................
45
4.1.3.7 Citocalasina 300µg/mL
........................................................................
45
4.1.3.8 Solução Hipotônica de Citrato de Sódio 3,4.10
-2
M
.............................
46
4.1.3.9 Fixador Metanol-
Ácido Acético 3:1
......................................................
46
4.1.4.0 Tampão de Sorensen
..........................................................................
46
4.1.4.1 Giemsa
................................................................................................
47
4.1.4.2 Corante Final de Giemsa 5%
...............................................................
47
4.1.5 Materiais para formação e análise dos Filmes
........................................
48
4.2
MÉTODOS
...................................................................................................
48
4.2.1 Preservação do microrganismo
..............................................................
48
4.2.2 Pré
–
Inóculo
...........................................................................................
48
4.2.3 Produção de Levana através do Planejamento Fatorial e Análise por
Metodologia de Superfície de Resposta (MSR)
...............................................
49
4.2.4 Fermentação em escala maior
...............................................................
51
4.2.5
Tratamento do fermentado com protease
...............................................
52
4.2.6 Precipitação e liofilização da levana
.......................................................
52
4.2.7 Quantificação da Levana
........................................................................
52
4.2.8 Estimativa da mas
sa molar da levana por cromatografia de exclusão
molecular
.........................................................................................................
53
4.2.9 Composição dos monossacarídeos da levana por Cromatografia lí
quida
de Alta Pressão em Coluna de Troca Aniônica (HPAEC)
................................
53
4. 2. 10 Determinação da viscosidade da levana produzida pelo
B. subt
ilis
NATTO
............................................................................................................
54
4.2.11 Meio de Cultura para células de ovário de hamster chinês (CHO-
K1)
nos testes de toxicidade da levana
..................................................................
55
4.2.12 Descongelamento das células CHO
-
K1
...............................................
55
4.2.13 Repique e Manutenção das Células
.....................................................
55
4.2.14 Citotoxicidade: Teste do brometo de 3
-
(4,5
-
dimetiltiazol
-2-
il)
-2,5-
difeniltetrazólio) (MTT)
.....................................................................................
56
4.2.15 Mutagenicidade: Teste do Micronúcleo
................................................
56
4.2.16 Preparação dos Filmes
.........................................................................
58
4.2.17 Caracterização Morfológica Macroscópica e Determinação da
Espessura dos Filmes
..........................................................................
60
4.2.18 Transmissão de Vap
or d`água (TVA)
...................................................
60
4.2.19 Determinação do Índice de Intumescimento (Ii%)
................................
61
4.2.20 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
..........................................
62
4.2.21 Análise Termogravimétrica (TGA)
........................................................
62
4.2.22 Análise
Estatística
................................................................................
63
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
.....................................................................
64
Artigo 1
: Caracterização da levana e otimização da sua produção pelo Bacillus
subtilis NATTO. Efeito da temperatura e concentração de sacarose
..............
66
Artigo 2:
Levana no desenvolvimento de novo material polimérico: Avaliação da
permeabilidade, hidratação e análises térmicas em filmes isolados de Eudragit
FS30D
®
............................................................................................................
90
Artigo 3:
Avaliação da permeabilidade
, hidratação e análises térmicas de
filmes isolados de Eudragit RS 30D
®
aditivados com levana de Bacillus subtilis
NATTO. Material candidato ao revestimento farmacêutico.
..........................
107
6. CONCLUSÕES
..........................................................................................
124
REFERÊNCIAS
................................................................................................
125
ANEXOS
...........................................................................................................
138
13
1
INTRODUÇÃO
É de grande interesse em biotecnologia a pesquisa e o
desenvolvimento de sistemas inovadores de liberação modificada de fármacos
.
Tais sistemas para liberação modificada de fármacos oferecem ao paciente um
melhor gerenciamento na liberação do medicamento; melhorando a resposta
terapêutica de substâncias farmacologicamente ativas, bem como a redução dos
seus efeitos adversos (SINHA et al., 2004).
Ex
opolissacarídeos têm se destacado,
nos últimos anos, no desenvolvimento de novos sistemas de liberação modificada
de fármacos. Sinha, Mittal e Kumria (2005) desenvolveram e avaliaram um
processo de revestimento por compressão à base de xantana;
um
exopolis
sacarídeo produzido por fermentação da bactéria
Xanthomana campetris
.
Há uma ampla variedade de sistemas de liberação modificada de
fármacos utilizados na indústria farmacêutica. Nestes sistemas incluem-se os
lipossomas, nano e micropartículas, microesferas biodegradáveis, bombas
osmóticas, filmes cólon-específicos, sistemas transdérmicos, pró-
fármacos,
sistemas poliméricos matriciais, entre outros (DELUCIA, 2007).
Apesar da crescente aplicabilidade dos exopolissacarídeos em
diversos dispositivos de liberação modificada, pouco se tem estudado quanto à
sua aplicação num dispositivo em específico: filmes isolados para liberação cólon-
específica de fármacos.
Estes filmes
apresentam em sua composição
um polímero
pH
- dependente ou
tempo
- dependente aditivado com algum substrato que é
biodegradado especificamente pela microflora colônica e
que
, conseqüentemente
,
auxilia
na liberação do medicamento no cólon. A garantia que o substrato será
atacado, apenas na região colônica, é que este é constituído de uma microf
lora
única e complexa, abrigando mais de 500 espécies
bacterianas;
com crescimento
ostensivo de microrganismos anaeróbicos (QUINTANILHA et al., 2007).
A levana, um
a frutana
de ligações
ß
(
2
6)
e ramificações
ß
(
2
1)
,
produzida com um bom rendimento pel
o B.
subtilis
NATTO e diversos outros
microrganismos
(EUZENAT
,
Guilbert
e C
ombes
,
1996
), apresenta-se com
excelente perspectiva para a aditivação de películas destinadas à liberação
14
controlada no ambiente colônico
devido
às suas características físico-
quím
icas de
biodegradabilidade colônica
(PAULA et al., 2008
).
Dentre as patologias, acometidas no ambiente colônico, que podem
se beneficiar pelo uso de filmes para liberação cólon-específica são: síndrome do
intestino irritável, câncer cólon-retal, doença de Crohn e colite ulcerativa (FRIEND,
2005; OLIVEIRA, 2006). As formulações farmacêuticas disponíveis, atualmente,
para tratamento destas doenças são: formulações orais de liberação lenta ou
enemas de uso retal. Estes tratamentos tradicionais não são, normalmente, sítio –
específicos e tem alta freqüência de efeitos colaterais (JAIN, GUPTA e JAIN
2007).
Outras substâncias que se beneficiarão pelo revestimento de
películas cólon – específicas são hormônio do crescimento, insulina, endorfinas e
calcitonina. Estas substâncias não suportam o ambiente inóspito das regiões
proximais do trato
gastrointestinal;
estômago e intestino delgado. Estas regiões
apresentam grande variação do pH, secreção de sais biliares e enzimas
digestivas
(DUPUIS et al., 2006). Ao contrário das características inóspitas do trato superior
gastrointestinal, o ambiente colônico apresenta pH próximo do neutro, tempo lento
de trânsito intestinal, baixa atividade enzimática proteolítica (TUOHY et al., 2003).
Considerando a alta produtividade da levana pelo B. subtilis
NATTO
e a
biodegradabilidade
desse
exopolissacarídeo
no ambiente
colônico
,
aliado
a
necessidade de maiores estudos dos
filmes
cólon-
específicos
para trazer
melhoras no tratamento de certas doenças; este trabalho tem o objetivo de aplicar
um
exopolissacarídeo
de frutose (levana de B. subtilis
NATTO)
em filmes
para
liberação controlada no cólon
.
15
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Produzir e caracterizar parcialmente a levana de
B.
subtilis
NATTO
e
aplicá
-
la
no desenvolvimento de novos materiais
poliméricos
: Filmes
isolados
para
liberação
cólon
-
específica
de fármacos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1.
Otimizar a produção de levana através do planejamento fatorial e
metodologia de superfície de resposta
.
2.2.2.
Estimar a massa molar da levana por cromatografia de exclusão
molecular
.
2.2.3. Avaliar a composição da levana por cromatografia de alta pressão
em coluna de troca aniônica.
2.2.4
.
Realizar uma caracterização reológica parcial da levana
.
2.2.5
.
Avaliar a
citotoxici
dade e mutagenicidade da levana produzida
.
2.2.6
. Produzir e caracterizar os filmes cólon-específicos aditivados com
levana por transmissão de vapor de água, índice de intumescimento e
análises térmicas (DSC e TGA)
.
16
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1
Levana
Os exopolissacarídeos (EPS) são polímeros
de
carboidratos que
podem ser amplamente produzidos por diferentes microrganismos. Os
polissacarídeos extracelulares, ou exopolissacarídeos, podem ser excretados
diretamente para o meio de cultura sob a forma de muco, ou então encontrar-
se
na forma de camada aderente à volta da parede celular a qual denomina-
se
cápsula (SUTHERLAND, 1972).
A levana é um polissacarídeo extracelular constituída
predominantemente por resíduos de D-frutose unidos por ligações glicosídicas ß-
(2
6); podendo ainda apresentar pontos de ramificações ß-
(2 1)
e um resíduo
de glucose terminal (ARVIDSON, RINEHART e GADALA-
MARIA,
2006)
. Pode ser
classificada como
fruto
-
oligossacarídeo
quando é constituída por uma cadeia curta
de resíduos de D-
fr
utose. É encontrada principalmente em microrganismos gram
positivos, embora alguns gram negativos a produzam (SACHA et al, 2001). Há
relatos da presença de levana em plantas (MALLEUX e VAN DEN ENDE, 2007).
A levana é um biopolímero com alta estabilidade. Bekers et al.
(2005) estudaram a estabilidade da levana, produzida pela Zymomonas mobilis
,
em diferentes pH`s e temperaturas; em meio líquido. Esses autores objetivaram
avaliar a integridade do EPS em culturas líquidas sob diferentes condições, bem
como estudar o comportamento hidrolítico da levana. A levana não foi degradada
quando estocada por 120 h a 25 ou 30°C, porém a 55 ou 60°C sua degradação foi
inversamente proporcional ao pH. A hidrólise com ácidos orgânicos (láctico,
acético e glucônico) asseguraram maior formação de monômeros de frutose;
enquanto que a hidrólise da levana por HCl assegurou altas quantidades de
fruto
-
oligossacarídeos
e levana de baixa massa molar. A produção metabólica da
levana acompanha a curva de crescimento da biomassa (SHIH e
t al., 2005).
17
A levana apresenta
-
se como prebiótico. Os prebióticos são alimentos
não digeríveis e que estimulam o crescimento e a atividade metabólica das
bactérias colônicas, presentes no intestino grosso. A levana é produzida, pelos
microrganismos, como forma de reserva energética e defesa. Apresenta ainda
baixa viscosidade e alta solubilidade em água. (BORSARI et al., 2006; DE PAULA
et al., 2008).
A levana é formada através das reações de transfrutosilação
catalisadas pela
levana
sacarase (sacarose: 2
,6
– ß D frutana: 6 ß D frutosil
transferase: EC. 2.4.1.10). Os resíduos frutofuranosil, da sacarose, são
transferidos para uma frutose como aceptador. Esta transferência ocorre por meio
da formação de ligações entre o carbono 2, do resíduo frutofuranosil, e o carbono
6 da frutose (YAMAMOTO et al., 1984). Neste estudo ainda, um parâmetro foi
essencial para a determinação da massa molar da levana; a força iônica. A
supressão da força iônica foi observada como condição para a síntese de levana
de alta massa m
ol
ar.
Gorrec et al. (2002) atribuíram três atividades para a
leva
na
sacarase; frutosiltransferase, sacarase e fruto-
polimerase.
Abdel
-
Fattah
,
Mahmoud e Esawy
(2005)
verificaram que a levanasacarase é produzida de modo
induzível e era constitutiva, n
o
Bacill
us subtilis NRC 33a, quando usado sacarose
e glucose como fonte
s
de carbono respectivamente.
Figura
1 –
Estrutura
linear da levana e suas
rami
ficações.
Ligações principais
do tipo ß
(2-6)
e ramificações
(
ß 2
-1)
(SIMMS, BOKYO e
EDWARDS
,
1990)
18
Diversos microrganismos se destacam pela produção de levana,
dentre eles Erwinia herbicola, Erwinia amylovora, Acetobacter suboxydans,
Gluconobacter oxydans, Rhanella aquatilis, Bacillus subtilis
NATTO
, Actinomyces
viscous, Zymomonas mobilis, Bacillus subtilis, Bacillus polymyia, Aerobacter
levanicum, Streptococcus sp., Pseudomonas sp.
e
Corynebacterium
laevaniformans
(BATISTA, 2006).
Euzenat, Guilbert e Combes
(1996) destacar
am um bom rendimento,
na produção de levana, pelo B.
subtilis
. A
bactéria B.
subtilis
é um bacilo
encontrado naturalmente no solo e é considerado um modelo de estudos, para
bactérias gram-positivas, devido ao grande conhecimento das suas características
genéticas e fisiológicas. Apresenta ainda as vantagens de não apre
sentar
patogenicidade, não colonizar tecidos e possui boa capacidade de formação de
esporos (HARWOOD, 1992). O B.
subtilis
tem sido aplicado em
diversas
abordagens
na indústria farmacêutica como a produção de antígenos de interesse
na fabricação de vacinas
(PACCEZ, 2007
).
3.1.1 Produção de Levana
A quantidade de EPS, produzido pelos microrganismos, está
intimamente relacionada com as condições específicas de crescimento celular e
com a composição do meio de cultura. Singh e Fett (1995) afirmaram que o
aumento da osmolaridade e a desidratação são importantes fatores na produção
de EPS; em especial o alginato e a levana. A adição de NaCl e etanol, visando o
aumento da osmolaridade e desidratação no meio de cultura, aumentaram a
capacidade de produção de levana na Pseudomonas pv. phaseolicola. Fungos
também podem produzir EPS, embora em quantidades muito menores
(WU
,
MAU
e LIANG,
2008).
Alguns fatores podem prejudicar negativamente a produção de EPS
como a presença de açúcares redutores e contaminações. A presença de glucose
19
e frutose, no meio de cultivo, podem reduzir a obtenção de EPS na faixa de 50-
80% (ANANTHALAKSHMY e GUNASEKARAN, 1999). As corretas técnicas de
manipulação microbiana também devem ser observadas para se obter melhores
rendimentos de EPS. A falta de técnicas apropriadas de manipulação microbiana
podem promover a produção de metabólitos indesejáveis; bem como o
crescimento de microrganismos contaminantes que são capazes de degradar o
EPS produzido. Microrganismos contaminantes, como o
Arthr
obacter ureafaciens,
podem degradar a levana através da expressão de frutotransferases; reduzindo o
rendimento da levana (TANAKA, 1989).
A produção enzimática da levana foi inicialmente descrita por
Hestrin, Shapiro e Aschner (1943) em cepas de B.
subtili
s,
B. polymyxa
N.C.T.C
4744 e Aerobacter levanicum (característica de Jerusalém). A produção de levana
foi analisada após precipitação do EPS com etanol a 72% seguida de hidrólise
ácida; a estimativa da frutose foi realizada colorimetricamente. As três esp
écies
estudadas produziram levana a partir de sacarose e rafinose. A levanasacarase,
produzida pelo B.
subtilis
, foi produzida de modo adaptativo (exocelular) a
um
meio saturado com o açúcar. Os outros microrganismos estudados apresentaram
esta enzima de modo constitutivo. A produção de levana foi realizada em meio
com 10% de sacarose por 4 dias a 30°C; atingindo a concentração de 12,5%.
Em 1945, Avineri e Hestrin avaliaram a produção de diferentes
polissacarídeos a partir da sacarose; por Aerobacter levani
cum
. O principal
objetivo deste trabalho foi estudar as variáveis que foram mais significativas para
se obter um bom rendimento de levana. O primeiro parâmetro estudado foi o pH
aonde constatou-se uma curva de pH-atividade regular e simétrica, na faixa de
5,0-5,8, para a levanasacarase. Nesta mesma faixa de máxima atividade
enzimática da levanasacarase, obtiveram-se também máximo rendimento de
levana; em torno de 250 mg/100 mL/5 h. O pH ideal, para a produção do EPS,
deve ser aquele que permite o melhor crescimento do microrganismo e melhor
atividade da enzima envolvida (PRASERTSAN et al., 2008).
A concentração de sacarose também influenciou no rendimento da
levana. Verificou-se que a atividade enzimática da levanasacarase crescia
20
exponencialmente até 3 % de sacarose. A partir de 3%, a atividade enzimática
entraria numa fase estacionária atingindo o rendimento máximo de 300
mg/100mL. A concentração enzimática também apresentou efeito na atividade
específica da levanasacarase. A partir de 0,5 mL da enzima, em 3 mL da mistura
reacional, a obtenção da levana passou a ser constante em 300 mg/100mL. Tal
fato ocorreu pela perda da especificidade enzimática.
Em 1955, Mattoon et al. estudaram a síntese de levana bacteriana
de massa molar intermediária (25.000 a 200.000 Da), para aplicação como
extensores plasmáticos. Inicialmente, realizou-se uma seleção dentre 850
espécies de culturas isoladas. Sete apresentaram as condições ideais para serem
usados para aumentar o volume plasmático. O B.
subtilis
foi um grande cand
idato,
dentre as sete espécies selecionadas. Verificou-se então algumas condições que
influenciaram no rendimento da levana. A porcentagem do inóculo foi um
parâmetro importante para se obter melhores rendimentos de levana. A
quantidade de inóculo ideal fo
i de 2% com 24 h de fermentação
a
30°C. Obtiveram
quantidades em torno de 8,4 mg/mL de levana.
A temperatura também demonstra ser um parâmetro importante para
se obter maior rendimento de levana. O comportamento da fermentação
diferenciou consideravelmente quando a temperatura de incubação foi variada em
apenas 5°C. Foram
testadas
duas temperaturas para a incubação: 25 e 30°C. Os
dados indicaram que a produção de levana, à temperaturas baixas, é muito mais
favorável para o B.
subtilis
; 9,3 mg/mL à 25°C/ 24 h e 6,8 mg/mL à 30°C/24 h. O
pH também influenciou na obtenção da levana; a melhor faixa da ação enzimática
estava entre 5,3
-
5,5, obtendo
-
se aproximadamente até 27 mg/mL.
Em 1983, Park, Mortatti e Sato estudaram a produção da levana, a
partir de sacarose, utilizando a Zymomonas mobilis. Observaram que a variação
de apenas 5°C na temperatura de incubação foi o suficiente para reduzir
significativamente a produção de levana; podendo afirmar que a levanasacarase
apresenta uma expressão termo
-
responsiva (LI e
t al., 2006).
As condições de produção podem influenciar na solubilidade da
levana; parâmetro observado no processo produtivo e aplicação industrial.
Bacillus
21
licheniformis
podem produzir uma levana, insolúvel em água, com potencial
aplicação na recuperação de óleo. Este EPS auxilia na obstrução dos poros do
solo, durante o processo de recuperação do óleo. A insolubilidade é essencial
para que o fluxo de água, presente no solo, não remova o EPS. Os parâmetros
observados para a produção da levana, insolúvel em água, foram em
temperaturas menores que 55°C, pH entre 6 e 9, pressão menor que 500 atm e
concentração de sais a 4% (RAMSAY, COOPER e NEUFIELD, 1989; GHALY et
al., 2007).
Em 1991, Takahama, Kuze e Okano caracterizaram a
levanasacarase do Bacillus natto. A condição otimizada enzimática observada foi
no pH 6,2 a 35°C, na produção de lactosacarase. A enzima permaneceu estável
na faixa de pH 5,5
-
7,0 até 35°C.
Em 1992, Han e Watson verificaram diferentes fontes de carbono na
produção da levana microbiana. Os
autores utilizaram a sacarose, caldo de cana e
melaço de beterraba; utilizando o Bacillus polymyxa. O microrganismo converteu
aproximadamente 46% da frutose, no meio contendo sacarose, em levana.
Entretanto, o rendimento da levana foi muito menor nos meios que continham
caldo de cana e melaço de beterraba.
Em 1996, Euzenat, Guilbert e Combes estudaram a produção de
fruto
-oligossacarídeos, pela levanasacarase obtida de B.
subtilis
. Duas variáveis
foram avaliadas quanto à produção de levana; a temperatura e a concentração de
sacarose. Foram testadas duas temperaturas, 37°C e 60°C e as seguintes
concentrações de sacarose, 1; 1,3; 1,8; 2,25 e 2,6 molar. Os melhores
rendimentos da produção de levana (31,7%) foram obtidos nos valores 1,8 molar
de sacarose, a 37°C, com 9,5 h de fermentação. As análises de HPLC também
demonstraram que a levanasacarase produziu simultaneamente tanto a levana
quanto fruto
-
oligossacarídeos (GP<50).
Choi, Sung e Choi (2001) verificaram a produção de uma substância
viscosa numa comida típica coreana, o chungkookjang ou soja fermentada;
também conhecida como Natto no Japão. Através de estudos de filogenia
descobriu
-se que o produtor dessa substância era o Bacillus subtilis BS62.
22
Extratos da soja fermentada foram precipitadas com etanol, hidrolisadas com HCl
0,1 N ou invertase; em seguida o hidrolisado foi analisado em cromatografia de
camada delgada e troca-iônica. Verificou-se que esta substância viscosa se
tratava da levana. Os extratos da soja fermentada foram obtidos fermentando-
se
a soja a 37°C com um dia de cultivo.
Shih et al. (2005) estudaram a produção e caracterização de levana,
produzida pelo B.
subtilis
, isolada do Natto. Foram utilizados 20% (p/p) de
sacarose com 21 h de fermentação. O rendimento da levana foi entre 40-
50
mg
/mL. O produto consistiu em duas frações com diferentes massas
mo
lares
(1794 e 11 KDa); a quantidade da levana de maior massa
mo
lar declinava com o
aumento do tempo de fermentação. Porém ambas as levanas, de maior e menor
massa
molar, eram produzidas simul
taneamente.
Recentemente tem-se usado o planejamento fatorial e a metodologia
de superfície de resposta para a otimização da produção de metabólitos de
interesse
. Um planejamento fatorial permite avaliar as contribuições de múltiplos
fatores em uma ou mais respostas. Pode-se realizar um delineamento fatorial
completo ou fracionado com vários fatores em diferentes níveis. A superfície de
resposta
modela
os fatores com a resposta obtida; o objetivo é otimizar esta
resposta.
Rahulan et al. (2009) otimizaram a
produção
de uma peptidase de
Streptomyces gedanensis modulando os fatores concentração do substrato, NaCl
e pH inicial.
Oliveira et al. (2007) realizaram um planejamento fatorial para a
produção de levana, a partir de Zymomonas mobilis, utilizando fontes de baixo
custo e regionais de carboidratos. Os autores utilizaram a sacarose comercial
,
caldo
e melaço de cana de açúcar como fontes de carbono. Os resultados
indicaram a obtenção de 21,7; 15,5 e 2.6 g/L de levana para a sacarose comercial,
melaço e caldo de cana de açúcar respectivamente. O crescimento da biomassa,
no
caldo
de cana de açúcar, foi 2,76 vezes maior
em
sacarose; justificando sua
escolha mesmo com o rendimento menor. Segundo os autores, a avaliação de
certas variáveis, numa resposta independente, torna-se necessária para não
23
ocorrer uma suplementação desnecessária dos meios de culturas; minimizando
custos
.
Melo et al. (2007) otimizaram a produção de levana por um
planejamento fatorial 2
4-1
variando as condições de fermentação. Todos os fatore
s
testados; concentração de sacarose, temperatura e agitação, influenciaram a
produção de levana.
Borsari et al. (2006) estudaram a influencia das fontes de carbono na
produção de levana por Zymomonas mobilis
.
Os autores utilizaram um modelo
fatorial 2
3
c
om um total de 8 experimentos.
Os fatores estudados foram
o
processo
de fermentação, concentração de caldo de cana de açúcar e de sacarose em g/L
;
as suas interações também foram consideradas. Os resultados demonstraram
que
o fator
caldo de cana teve um e
feito positivo nas
variáveis
respostas. A melhor
produção foi de 40,14 g
/
L em 150 g
/
L de sacarose em fermentação batelada.
3.1.2 Aplicação dos exopolissacarídeos
Os exopolissacarídeos, produzidos por microrganismos, apresentam
ampla aplicabilidade em diferentes setores da economia. Estes polissacarídeos
bacterianos e fúngicos tornam-se vantajosos para o emprego industrial; pois
apresentam propriedades semelhantes às do agar e características reológicas que
os tornam desejáveis na indústria. Grande aplicação pode ser observada na
indústria alimentícia; contribuem principalmente no aumento da textura,
viscosidade e elasticidade dos alimentos
(DUBOC e
MOLLET, 2001).
Viñarta et al. (2006) determinaram a capacidade dos
exopolissacarídeos, produzidos pelo
Sc
lerotium rolfsii, na redução da sinerese
experimentada por massas cozidas durante o processo de refrigeração. Houve
completa inibição ou redução de 91% da sinerese com o uso dos EPS. Tais
habilidades permitem que o produto alimentício seja conservado por mais tempo
sem comprometimento das suas propriedades funcionais e sensoriais. Esses
24
autores ainda avaliaram a viscosidade oferecida pelos EPS a diversos solventes.
Houve um aumento da viscosidade em solventes como a água, leite integral e
desnatado; além da caracterização de um comportamento pseudoplástico. Estas
propriedades podem ser interessantes na melhora sensorial dos alimentos.
A indústria oleífera também se beneficia do uso de EPS. Shah e
Ashtaputre, 1999, avaliaram as propriedades reológicas dos EPS, produzidos pelo
Sphingomonas paucimobilis GS1, na exploração de óleo. Verificaram que os EPS
podem melhorar as propriedades do fluxo do fluído, utilizado na perfuração,
durante o processo de extração do óleo. Os exopolissacarídeos aumentaram a
habilidad
e de suspensão do sedimento, perfuração e tixotropia do fluído de
perfuração. Tais propriedades permitem que a exploração de óleo seja mais
eficiente. O processo de recuperação do óleo também pode ser aumentado com a
aplicação de EPS. Bacillus licheniformis podem produzir uma levana, insolúvel em
água, com potencial aplicação na recuperação de óleo. Este EPS auxilia na
obstrução dos poros do solo durante o processo de recuperação do óleo. A
insolubilidade é essencial para que o fluxo de água, presente no solo, não
remova
o EPS (RAMSAY
, COOPER e NEUFIELD,
1989; GHALY et al., 2007).
Exopolissacarídeos microbianos podem, ainda, ser aplicados em
técnicas de imobilização enzimática. Cavalcante, Carvalho e Cunha
(2006)
imobilizaram covalentemente a tripsina sobre uma membrana produzida pela
Zoogloea sp., em melaço de cana. Os resultados fornecidos pelos filmes de EPS,
obtidos da Zoogloea sp., na imobilização da tripsina foram satisfatórios. As
enzimas apresentaram maior estabilidade térmica quando comparada com a
enzima nativa e não demonstraram diminuição da atividade após sete ciclos de
reutilização.
O uso destes filmes, obtidos a partir de EPS, vão além da sua
aplicação na enzimologia. Estas películas podem ser incorporadas em camadas
protetoras e em embalagens de alimentos devido à sua potencialidade em
aumentar a vida de prateleira de alimentos. Um prazo de validade maior significa
maiores chances de lucro para as indústrias. Nesta perspectiva, pesquisadores
25
aplicaram o EPS Kefirana na fabricação de biofilmes e avaliaram as variáveis que
influenciam nas características reológicas dos filmes
(PIERMARIA et al., 2008
).
A preocupação ambiental tem crescido enormemente, na última
década, com o objetivo do desenvolvimento sustentável. Para tal, torna-
se
necessário o desenvolvimento de técnicas eficientes de descontaminação.
Destaca
-se a biorremediação que consiste na utilização de seres vivos, ou seus
componentes, na recuperação de áreas contaminadas (KALOGERAKIS,
PSILLAKIS e ALVAREZ, 2005; JÖRDENING e WINTER, 2005). Shah et al. (2000)
produziram e caracterizaram um exopolissacarídeo produzido por uma
cianobactéria marinha, a Cyanothece sp.. Concluiu-se que o fenômeno de
gelificação, produzido pelo EPS, tem potencial aplicação na remoção de metais de
soluções. Mais de 90% do níquel, cobre e cobalto puderam ser removidos de
soluções contendo respectivamente 22,5; 17,5 e 5,0 mg destes metais. Os
exopolissacarídeos, produzidos pela Cyanothece sp., constituem então uma
alternativa para descontaminação de soluções contendo estes metais.
Yim et al. (2007) caracterizaram o modelo de biofloculação do EPS
p-KG03 da Gyrodinium impudicum. Floculantes microbianos são uma alternativa
para a solução de problemas ambientais pois promovem a agregação de
partículas e células em sua malha polimérica e neutralizam a carga das suas
moléculas. Podem se beneficiar, para o tratamento de resíduos, indústrias do
campo químico, alimentício, processamento de minerais, bem como o tratamento
da água. O EPS p-KG03 apresentou, como agente biofloculante, mais de 90% de
atividade floculante em suspensões de Kaolin 0,5 mg/L – 1,0 mg/L; mesmo em
baixas concentrações. Além de apresentar estabilidade química em pH ácido (3,0-
6,0), ampla faixa de temperatura (4
-90°C) e na presença de agentes catiônicos.
A levana apresenta ampla aplicação industrial e tecnológica.
Grande
destaque para indústria alimentícia; aonde é utilizada como
estabilizante,
fixador
de sabores, cores e espessante para vários alimentos, inclusive pode ser usado
na elaboração de produtos dietéticos por ser um polímero de frutana
(HARRINGTON e
HEYL, 1999).
26
A aplicação clínica da levana remonta desde a década de 50.
Mattoon et al. (1955) realizaram a síntese bacteriana de levana de massa molar
intermediária
, para aplicação como extensores plasmáticos. Sete cepas
apresentaram polissacarídeos com taxas adequadas de pressão osmótica e
quociente de viscosidade para aumentar o volume plasmático. A aplicação clínica
tem sido cogitada diante das características funcionais no organismo humano.
Pode ser aplicado como agente anticarcinogênico e hipocolesterolemiante;
auxiliando assim tratamentos terapêuticos convencionais (OLIVEIRA et al., 2007).
Calazans et al. (
2000
)
relacionaram a atividade
antitumoral
da levana
com
a massa molar do EPS. Ocorreu uma f
aixa
de massa molar com máxima
atividade contra o tumor. Nenhuma explicação satisfatória foi encontrada para
relacionar
a massa mo
lar com a atividade
antitumoral
.
Maciel, 2008,
realizou
a síntese e caracterização de partículas de
levana
-magnetita. Neste estudo, a levana foi utilizada como revestimento de
partículas de magnetita e caracterizada através de microscopia eletrônica de
varredura (MEV), magnetometria, difração de raios-X (DRX) e espectroscopia na
região do infravermelho (IV). Partículas magnéticas como a magnetita, revestida
com polissacarídeos, estão sendo usadas em número crescente de aplicações
médicas (meios de contraste, para imagem de ressonância magnética ou o
tratamento de câncer). O revestimento da magnetita, com polímeros, confere
estabi
lidade às partículas magnéticas; principalmente em meio fisiológico.
EPS têm se destacado também em aplicações em dispositivos de
liberação modificada de fármacos, na indústria farmacêutica. Estes polímeros
naturais são
pref
eridos, em detrimento de polímeros sintéticos, devido ao baixo
custo, alta disponibilidade e ausência de toxicidade (BRESOLIN et al., 2003). Os
polímeros microbianos apresentam propriedades desejáveis para a indústria
farmacêutica. Podem atingir altas produções em condições adequadas, obter EPS
específicos através de técnicas genéticas, produção pode ser controlada e não
dependem de condições climáticas, etc. Dentre os polissacarídeos microbianos, a
gelana, xantana e escleroglucana têm sido empregadas com resultados
promissores no contro
le da liberação de fármacos.
27
A gelana é um polímero aniônico, secretado por
Pseudomonas
elodea
, comercialmente disponível (Gelrite® e Kelcogel®) (BRESOLIN et al.,
2003). Kumar, Satish e Shivakumar
(2008)
elaboraram um implante para a
liberação do fármaco metotrexato baseado na gelana. Este medicamento é um
antagonista do ácido fólico interferindo na síntese de DNA; é usado para
tratamentos de câncer e doenças auto-imunes. O implante era formado de
múltiplas camadas de álcool polivinílico, quitosana e gelana. Os resultados in vivo
demonstraram que o metotrexato foi liberado vagarosamente por um período de
trinta dias, bem como não houve a formação de cápsula fibrosa ao redor do
implante.
A xantana é um
exopolissacarídeo
produzido por fermentação da
bactéria Xanthomana campetris. Sua estrutura primária é composta de uma
cadeia principal de unidades de glucose unidas por ligações ß (1
6)
. Pode
ocorrer
a formação, em unidades alternadas, de uma cadeia lateral composta de
um trissacarídeo formado por unidades de ß-D-manose, ß-D-ácido glucurônico e
a-D-ácido manurônico (BRESOLIN et al., 2003). Sankalia, Sankalia e Mashru
(2008) estudaram a liberação modificada da glipizida, através de uma matriz de
comprimido constituída do EPS xantana. A glipizida é um hipoglicemiante oral
utilizado para pacientes que possuem diabetes. Os resultados sugeriram que a
matriz do comprimido, constituída de xantana, promoveu uma liberação in vitro
sustentada e constante da glipizida por 12 h.
A escleroglucana é um polissacarídeo exocelular secretado pelo
Slerotium rolfsii e apresenta uma cadeia principal formada por unidades de
glucose, unidas por ligações
ß (1
6) (BRESOLIN et al., 2003). Casadei et al., em
2007, sintetizaram e caracterizaram um gel derivado da escleroglucana. Este gel
objetivava a liberação modificada do Aciclovir. O aciclovir é um agente antiviral
altamente ativo in vitro contra o vírus Herpes simplex (VHS), tipos 1 e 2, e o vírus
Varicela zoster (VVZ). Os resultados sugeriram que este gel poderá ser usado
para formulações de uso tópico e implantes in situ.
28
3.2 LIBERAÇÃO MODIFICADA DE FÁRMACOS
A liberação modificada de fármacos é a área do conhecimento que
estuda
dispositivos que possuem uma liberação sustentada e/ou uma liberação
controlada do fármaco. O objetivo da liberação sustentada é manter a
concentração plasmática do fármaco à níveis constantes, bem como por tempos
prolongados. A liberação do fármaco, nestes sistemas de liberação sustentada,
pode demorar dias até anos
(JANTZEN e
ROBINSON, 1996).
Nesta perspectiva, Ughini et al. (2004) desenvolveram e avaliaram
uma matriz de liberação sustentada composta de xantana e galactomanana
substituída; originárias respectivamente do Xanthomonas campestris
e
Mimosa
scabrella
. O fármaco utilizado para a avaliação da liberação sustentada foi o
diclofenaco de sódio. O sistema matricial hidrofílico formado foi testado em
comprimidos e cápsulas; contendo 50 e 100 mg de diclofenaco de sódio com os
seguintes valores de pH, 1,4; 4,0; 6,8. Os autores encontraram valores
interessantes para este sistema matricial à base de EPS; 78,6% e 35,1% do
fármaco foram liberadas depois de 24h para comprimidos e cá
psulas
respectivamente. Os autores concluíram ainda que o mecanismo de erosão
exercesse
um papel determinante para liberação do fármaco, bem como a
influência da quantidade de biopolímeros nestas formulações. A quantidade do
fármaco e
o
pH também foram variáveis importantes; os meios ácidos
promoveram uma cristalização intramolecular do diclofenaco de sódio,
prejudicando sua expulsão do dispositivo de liberação modificada.
A liberação controlada objetiva
definir
a concentração do fármaco
num tecido específico; ou seja, a liberação é sítio-específica (JANTZEN e
ROBINSON, 1996). Liberações sítio-específicos oferecem ao paciente um melhor
gerenciamento na liberação do fármaco com redução da dose, menos
efeitos
adversos ao medicamento (RAM), melhores
resposta
s t
erapêutica
s, maior
flexibilidade posológica e melhor estabilidade química (OLIVEIRA, 2006).
Colinet
et al. (2007) desenvolveram e avaliaram a estabilidade de géis pH-
dependente
29
formados de escleroglucana e borato; para liberação controlada. A escleroglucan
a
é um exopolissacarídeo produzido principalmente por microrganismos do gênero
Sclerotium
. A estabilidade do gel foi verificada em função do pH, concentração do
EPS e borato. Os autores encontraram que o gel apenas se dissolvia em meios
alcalinos; dada à conformação que a escleroglucana adquiria nesta faixa de pH.
Ainda segundo os autores, a erosão, um importante mecanismo na liberação
controlada, foi facilmente modulada através da densidade da rede polimérica e pH.
Há uma ampla variedade de sistemas de liberação modificada de
fármacos utilizados na indústria farmacêutica. Nestes sistemas incluem-se os
lipossomas, nano e micropartículas, microesferas biodegradáveis, bombas
osmóticas, filmes cólon-específicos, sistemas transdérmicos, pró-
fármacos,
sistemas po
liméricos matriciais, entre outros (DELUCIA, 2007).
Pitarresi et al. (2007) prepararam e caracterizaram um modelo de
hidrogel com dextrana, proveniente de
Leuconostoc
spp
.
,
e derivados de
poliaspartamida para a liberação cólon-específica de fármacos. Dextranas são
polímeros de glucose unidas por ligação
glicosídicas
a
(1 6) e que podem ser
degradadas por dextranases produzidas pela microbiota do cólon. Para reticulação
destes polímeros e conseguinte formação do hidrogel; foi preparada uma solução
aquosa que foi exposta a uma irradiação com o comprimento de onda de 313
nm.
A reticulação foi confirmada por análises de espectroscopia no infravermelho. Os
autores utilizaram o dipropionato de beclometasona, usado no tratamento de
doenças inflamatórias do cólon, para estudar o perfil de liberação do sistema; a
droga foi libe
rada por até 24 h, bem como apresentou
-
se sítio
-
específica.
Coviello et al. (2005) desenvolveram e caracterizaram uma matriz
gélica contendo escleroglucana carboxilada e cálcio, para liberação de fármacos.
A escleroglucana modificada foi capaz de formar gel na presença do íon, pois o
cálcio agiu como agente reticulante entre os grupos carregados negativamente
(grupos carboxilas) presentes nas cadeias vicinais; formando zonas de junção.
Foram utilizadas duas substâncias modelo para a determinação do perfil
de
liberação; a teofilina e mioglobina. A teofilina é um potente broncodilatador
amplamente utilizado em doenças pulmonares; a mioglobina é uma proteína
30
globular transportadora de oxigênio. Os autores, através do uso dessas
substâncias modelo, determinaram que a modulação da liberação está
intimamente relacionada com as dimensões moleculares.
Ringe e Randuz (2006) estudaram as nanopartículas, contendo
dextrana, para liberação modificada de fármacos. O autores objetivaram criar um
sistema de distribuição para o tratamento da transfecção celular; processo na qual
células eucarióticas são infectadas por DNA ou RNA viral. As nanopartículas
foram obtidas por um processo de microemulsionamento óleo/água. As
microemulsões são sistemas constituídos por dois líquidos imiscíveis, um disperso
formando a fase contínua e o outro na forma de microgotículas. Os autores
obtiveram maior estabilidade do sistema, contendo dextrana, para o
acondicionamento da daunorubicina; um quimioterápico utilizado na redução de
tumores.
Den
tre os dispositivos de liberação usados na atualidade, tem se
destacado o uso de filmes
cólon
-
específicos
(WEI et al., 2008). Estes filmes de
liberação cólon-específica apresentam em sua composição um polímero pH -
dependente ou tempo dependente aditivado com algum substrato que é
biodegradado especificamente pela microflora colônica
.
A garantia que o substrato
será atacado, apenas na região colônica, é que este é constituído de uma
microflora única e complexa, abrigando mais de 500 espécies bacterianas, co
m
crescimento ostensivo de microrganismos anaeróbicos (QUINTANILHA et al.,
2007)
.
Mundargi et al. (2007) desenvolveram um sistema cólon-
específico
para o tratamento da amebíase; uma doença que pode afetar o intestino, causada
pela
Entamoeba hystolitica. Os autores utilizaram o Eudragit-L 100 e diversos
substratos, com destaque a goma xantana; um heteropolissacarídeo obtido por
fermentação aeróbica do Xanthomonas campestris. O fármaco estudado neste
estudo foi o metronidazol; principal terapia em casos de amebíase. Os autores
encontram que o perfil de liberação estava relacionado com a natureza e
concentração dos biopolímeros usados nas formulações. O dispositivo composto
de xantana, revestido com o copolímero goma guar-ácido metacrilato, mostrou
31
uma liberação do fármaco em torno de 30-40% durante as primeiras 4-5 h; o
revestimento entérico possibilitou uma diminuição de 18-24% no perfil de
liberação.
Alguns biopolímeros podem trazer vantagens para os filmes. Tong,
Xiao e Lim (2008) estudaram as propriedades de filmes contendo pululano,
alginato e carboximetilcelulose. O pululano é um homopolissacarídeo exocelular
produzido pelo microrganismo Aureobasidium pullulans. Os resultados sugerem
que os filmes contendo pululana foram mais fortes do que os filmes co
nstituídos
apenas de alginato e carboximetilcelulose, principalmente na força tensil e quebra
por alongação. A permeabilidade ao vapor de água foi baixa para o filme puro de
pululano (4,4.10
-
7
g m/ Pa h m
2
) quando comparado à blenda
polimérica
contendo
pla
stificante glicerol (4,2.10
-
6
g m/ Pa h m
2
).
As condições idéias, inerentes à fisiologia do ambiente colônico, que
o tornam uma região propícia à liberação de fármacos são: pH próximo do neutro,
tempo lento de trânsito intestinal, baixa atividade enzimática proteolítica; bem
como a presença de substratos anabólicos ao metabolismo bacteriano, que fazem
com que o ambiente colônico seja amplamente diversificado, único e complexo,
abrigando mais de 500 tipos de espécies bacterianas, com crescimento ostensivo
de microrganismos anaeróbicos (TUOHY et al., 2003; MANNING e
GIBSON,
2004
; QUINTANILHA, 2007
).
O ambiente colônico está situado no intestino grosso
e é
responsável pela absorção de água e eletrólitos
das fezes (MOORE e
DALLEY
et al., 2001).
32
Figura
2 -
Diagrama representativo do cólon
(MERCK, 1996)
Considerando as características fisiológicas do ambiente
colônico,
Singh, Trombetta e Kim
(2004) investigaram um dispositivo à base de gelana, para
liberação sítio-específica da Azatio
prina.
A gelana consiste em unidades repetidas
de ß-
(1
3) glucose, ß-
(1
4)
– D – ácido glucurônico, ß-
(1
3) ramnose com
resíduos de acetato, acetil e glicerato ligados a resíduos de glucose adjacentes ao
ácido glucurônico. É produzida pelo Sphingomonas paucimobil
is
e é cólon -
específica, pois é susceptível às galactomanases produzidas pelas bactérias do
ambiente colônico. O sistema era constituído de um polímero pH-dependente
(Eudragit (R) S-100) e a
gelana;
substrato susceptível ao ataque enzimático da
microflor
a colônica. Os dispositivos foram caracterizados quanto à
morfologia,
através da microscopia eletrônica de varredura, e comportamento ante
a um fluído
de simulação colônica (FSC); na presença e ausência
das galactomanases.
Neste estudo, os autores constaram que, num período de 2 h de
liberação, houve 10% maior quantidade da droga no meio FSC contendo
galactomanases; mostrando a contribuição da gelana para a cólon especificidade
33
do sistema. A Azatioprina tem suas propriedades antileucêmicas e
antiinflamatór
ias melhoradas quando liberadas no ambiente colônico.
Outra diferença significativa
que faz do cólon uma região ideal para a
liberação de fármacos, está no sistema venoso. A drenagem da região distal do
TGI é realizada predominantemente pelo sistema linfático, enquanto, na região
proximal, é feito pela veia porta – hepática e sistema linfático. Sendo assim,
fármacos lipofílicos introduzidos na região distal do TGI, sofrerão menos
biotransformação hepática (efeito de primeira passagem) e melhorarão sua
biod
isponibilidade em caso de algum tratamento sistêmico (GERSHKOVICH et al.,
2007)
.
Biotransformação ou metabolismo de fármacos, segundo conceito
moderno, é toda alteração química que os fármacos sofrem no organismo,
geralmente por processos enzimáticos. O principal local de biotransformação, sem
dúvida, é o fígado; um órgão que encerra numerosas enzimas. Durante a
biotransformação, de regra, aparecem metabólitos mais polares e mais
hidrossolúveis, os quais são facilmente excretados pelos rins. Assim,
fisiolo
gicamente, pode-se dizer que a biotransformação é um mecanismo de
defesa do organismo que acelera a eliminação de substâncias estranhas. Quando
se pode diminuir o processo de biotransformação de um determinado fármaco,
pode
-se aumentar o seu efeito terapêutico. O cólon, pelas características
fisiológicas da sua drenagem venosa, é ideal para diminuir o processo de
biotransformação e assim minimizar a inativação do fármaco pelo organismo
(DELUCIA
,
PLANETA e FILHO
2004).
A microflora colônica é constituída principalmente pelas
bifidobactérias e lactobacilos. São responsáveis principalmente pela proteção do
cólon, pois impedem a proliferação de bactérias consideradas
patogênicas
, dentre
elas: Salmonella, Clostridium e algumas cepas de
Eubactérias.
A microflora
colônica apresenta um papel essencial para que um filme seja denominado cólon-
específico; pois
estas bactérias são produtoras de enzimas redutoras e hidrolíticas
que participam do processo de degradação fermentativa de algum componente
presente no filme.
34
Dentre as substâncias que são susceptíveis às enzimas redutoras e
hidrolíticas, da microflora colônica, estão os
inúmeros grupos de nutrientes como o
amido resistente, alguns oligossacarídeos e polissacarídeos não-amiláceos (JAIN,
GUPTA e JAIN,
2007;
VARDAK
OU et al., 2007)
.
Nesta degradação
fermentativa
enzimática são produzidos grandes quantidades de ácidos graxos de cadeia curta
(AGCC
). Estes AGCC podem ser absorvidos pelo epitélio do cólon e serem
usados como fonte de energia (MANNING e GIBSON, 2004;
OUWE
HAND et al.,
2005
).
Outros benefícios, dos AGCC, estão o controle do trânsito intestinal
(volume e frequência), aumento da biodisponibilidade de minerais, controle da
motilidade da mucosa, aumento da proliferação celular epitelial, modulação das
funções en
dócrinas e imunes
(ROBERFROID et al., 2002)
.
Basan, Gümüsderelioglu e Orbey (2007) avaliaram as características
de liberação de um hidrogel à base de dextrana; sensível à degradação
fermentativa colônica. O fármaco utilizado foi a calcitonina; hormônio po
lipeptídico
composto de 32 aminoácidos. Os autores encontraram que o sistema foi
conveniente
para liberação cólon-específica da calcitonina, pois a dextrana
apresentou biodegradabilidade no ambiente colônico. O agente
reticulante
utilizado foi o epiclorohidrina; formando o complexo dextrana-epiclorohidrina. A
reticulação foi estudada em diferentes temperaturas, bem como na presença ou
não de etanol. As melhores condições para a reticulação foram encontradas a
10°C na presença de etanol; pois a epiclorohidri
na foi melhor dissolvida em etanol.
As propriedades de hidratação foram de grande importância para embebedar o
hidrogel com uma solução aquosa de calcitonina.
Algumas patologias e respectivos tratamentos farmacológicos, que
podem se beneficiar pelo uso
de
filmes para liberação modificada de fármacos
,
estão apresentados na Tabela 1. Dentre estas patologias citam-se: síndrome
do
intestino irritável (SII), câncer colo-retal, doença de Crohn e colite ulcerativa
(FRIEND, 2005)
.
Estas várias afecções podem comprometer o cólon com quadros de
inflamações crônicas (edemas, fístulas e formação de úlceras). São
acompanhadas muitas vezes de cólicas abdominais recorrentes e diarréias. A SII
35
é uma
perturbação
da motilidade de todo o trato gastrintestinal que provoca dor
abdominal, prisão de ventre e diarréia. Esta doença tem três vezes mais incidência
em mulheres do que homens. O trato intestinal fica sensível a muitos estímulos
(estresse, alimentação, fármacos, hormônios, etc). A doença de Crohn é uma
inflamação crônica da parede intestinal. Nas últimas décadas, a incidência desta
doença aumentou tanto nos países ocidentais como nos orientais. As causas da
doença centram-se em três possibilidades: disfunção do sistema imunitário,
infecção ou dieta alimentar. A colite ulcerativa é uma doença crônica em que o
intestino se inflama e forma úlceras.
Provocam
diarréias com sangue, cólicas e
febre. As complicações incluem hemorragia maciça, perfuração intestinal e
infecção generalizada (MERCK, 1996). As formulações farmacêuticas
disponíveis
atualmente, para tratamento destas doenças são: formulações orais de liberação
lenta ou enemas de uso retal (Tabela
1)
. Estes tratamentos tradicionais não são
normalmente
sítio
– específicos e tem alta freqüência de efeitos colaterais
(JAIN
,
G
UPTA e JAIN,
2007)
.
36
Tabela 1- Principais doenças colônicas, sintomas e tratamento farmacológico
utilizado (JAIN
,
GUPTA e JAIN,
2006).
Doenças
Sintomas
Fármacos e agentes
ativos
Doença de Crohn
Diarréia
, dor e distensão
abdominal, úlcera, fezes
sanguinolentas, perda de
apetite e peso
Hidrocortisona,
Budenosida, Prednisolona,
Sulfasalazina, Olsalazina,
Mesalazina, Balsalazida,
Infliximab
Colite Ulcerativa
Inflamação e hemorragia
retal
5
–
Ácido Amino S
alicílico,
Sulfasalazina, Balsalazida,
Infliximab, Azatioprina,
Mercaptopurina
Síndrome do intestino
irritável (SII)
Dor e distensão abdominal,
constipação, diarréia,
flatulência, sensação de
inchaço
–
pessoas com SII
podem apresentar períodos
de altern
ância entre
constipação e diarréia
Diciclomina, Hioscina,
Propantelina, Cimetrópio,
Mebeverina, Trimebutina,
Escopolamina, Alosetron,
Tegaserod
Câncer Colo
-
retal
Mudança nos hábitos
intestinais, fezes estreitas ou
sanguinolentas, hemorragia
retal, ine
xplicável perda de
peso, distensões e gases
abdominais, dores
abdominais acompanhadas
de peristaltismo
5
–
Fluoruracil, Leucovorin,
Oxaliplatino, Irinotecano,
Bevacizumabe, Cetuximabe
Diverticulite
Formação do divertículo no
cólon devido à infecção
bact
eriana
Sulfametoxazol +
Trimetoprima, Metronidazol
Doença de
Hirschsprung
Formas severas de
constipações
–
peristaltismo
ocorrem
em torno de 1
a
2
vezes por semana
Metronidazol, Vancomicina,
Loperamida, Toxina
botulínica
37
Visando o tratamento da colite ulcerativa, Varshosaz et al. (2008)
desenvolveram um dispositivo de liberação cólon específico. Os autores
desenvolveram um pró-fármaco à base de dextrana. Pró-fármacos são fármacos
que se encontram na sua forma inativa quando administrados, porém são at
ivados
quando sofrem alguma biotransformação in vivo. A budesonida, um potente
glicocorticóide usado no tratamento da colite ulcerativa, foi conjugado com a
dextrana; susceptível ao ataque hidrolítico pela microflora colônica. Os autores
avaliaram que a de
xtrana foi altamente eficaz na promoção da cólon
-
especficidade
promovida à budosenida; tais fármacos apresentam baixa eficiência quando
administrados isoladamente. A massa molar do EPS contribuiu para o sucesso do
sistema. Dentre a
s
massas molares testados para a dextrana (10.000, 70.0
00,
500.000), a dextrana de massa 70.000 mostrou-se com melhores características
de solubilidade e melhor perfil de liberação. Os conjugados foram estáveis nos
tampões HCl 0,1N e tampão fosfato pH 6,8; a degradação se deu início em
condições colônicas; tampão fosfato pH 7,4, 37°C com 6 h de incubação.
Os filmes são formados a partir de dispersões poliméricas aquosas.
As partículas permanecem separadas no início da dispersão polimérica, no
entanto, durante o processo de evaporaç
ão, as partículas dos constituintes sólidos
das dispersões coalescem; formando o filme. Para o processo de evaporação,
leva
-se em conta a TMF (temperatura mínima para formação do filme polimérico)
que é responsável pela coalescência individual e gradual de
ssas partículas.
Filmes moldados em temperaturas diferentes da TMF podem
apresentar características indesejáveis (friavibilidade, opacidez,...). A coalescência
das partículas poliméricas é essencial para se obter filmes homogêneos. Os filmes
podem ser obtidos por espalhamento sobre várias superfícies: teflon, vidro e folha
de alumínio (LAMIN, 2006). Além da adição de substratos cólon-
específicos,
filmes poliméricos podem ser aditivados com plastificantes trazendo uma melhora
na termodinâmica do material, assim como na diminuição da força tensil, aumento
do alongamento, flexibilidade dos filmes e coalescência (SATTURWAR et al.,
2003)
. A escolha do plastificante ideal é primordial para o desempenho
eficiente
38
do processo de revestimento. Sua escolha depende da capacidade de solvatar o
polímero e alterar as interações de suas cadeias. Para otimização das
características desejadas, pode-se alterar o tipo e a concentração
dos
plastificantes
usados na fabricação do biofilme. O plastificante, quando não
escolhido de
forma
adequada, pode diminuir a temperatura de degradação das
amostras
; diminuindo a estabilidade térmica do material formado (LAMIM, 2006).
Ensaios podem ser feitos, respaldados na literatura, para avaliação
dos filmes
cólon
-
específicos
. Tem sido feito o índice de intumescimento (Ii),
em
diferentes meios de simulação das condições fisiológicas do trato gastrintestinal,
juntamente com o ensaio de transmissão de vapor d`água (TVA). E
stas
metodologias são consideradas de baixo custo e de grande valor analíti
co
(OLIVEIRA, 2006)
.
Tais metodologias são empregadas eficientemente na
caracterização de filmes aditivados com substratos susceptíveis à microflora
colônica. Os resultados destes estudos podem verificar um aumento de potencial
cólon
-
específico do filme ad
itivado (AKHGARI et al., 2006).
O
intumescimento ou hidratação constitui característica
imprescindível ao acesso e conseqüente favorecimento ao ataque do filme
pela
microflora colônica. Pode variar conforme densidade da reticulação, caráter iônico
do polí
mero
e osmolaridade (HUANG, YU e XIAO,
2007)
.
O intumescimento ou
hidratação dos filmes podem ser avaliados em diferentes meios do TGI. Filmes
cólon
-específicos devem possuir baixa hidratação em fluídos de simulação
gástrica (FSG) e fluídos de simulação intestinal (FSI). Porém devem ter um
aumento significativo da hidratação quando presentes em fluídos de simulação do
cólon (FSC) (AKHGARI et al., 2006).
Hirsch et al. (1999) investigaram a degradação microbiológica de
uma dextrana modificada, a laurildextra
na,
e de uma galactomanana reticulada
para revestimento de substâncias destinadas à liberação cólon-específica. Os
autores encontraram que o revestimento reticulado obteve um índice de
intumescimento entre 309-520%, enquanto o revestimento, contendo apenas
a
laurildextrana com grau de substituição 0,12 e 0,40, apresentou um índice de
intumescimento de 50-195%. Os autores encontraram ainda que a laurildextrana,
39
com baixo índice de intumescimento, exibiu baixa taxa de dissolução do fármaco
testado, bem como a
degradabilidade cólon
-
específica. Os autores verificaram que
a dissolução segue as leis de difusão que o sistema possui em ambientes
aquosos; a solubilidade do fármaco é um fator também a ser considerado.
O ensaio TVA determina a permeabilidade do filme à água, avalia a
efetiva mobilidade na matriz polimérica. Oferece um índice no qual é possível
avaliar a mobilidade da membrana relacionando o espaço de volume livre com as
moléculas de vapor de água (MONDAL e YONG, 2006). A TVA está intimamente
relacionada
com a hidrofilicidade dos polímeros presentes no filme. Filmes
aditivados com polímeros, contendo altas proporções de grupos hidroxilas (OH
-
),
podem aumentar a TVA; estes polímeros polihidroxilados formam pontes de
hidrogênio com a água. O uso de plastificantes pode influenciar o índice de TVA
de um filme. Os plastificantes podem diminuir a TVA de uma película por originar
estruturas mais compactas nas cadeias poliméricas, pois possibilitam a
coalescência maior das partículas poliméricas. Filmes contendo alta resistência à
transmissão de vapor d`água (TVA) são incapazes da liberação prematura de um
fármaco revestido com uma película cólon-específica. Sendo assim, os valores do
ensaio de TVA nos dão valores valiosos para inferir o comportamento do filme
cont
ra a umidade do ambiente fisiológico (AKHGARI et al., 2006).
Zenkiewicz e Richert (2008) aplicaram a metodologia de TVA para
filmes nanocompósitos à base de
polilactato
. Polilactatos são biopolímeros obtidos
da fermentação do ácido láctico, obtido por fermentação bacteriana da glicose. Os
autores concluíram que a TVA está ligado à hidrofilicidade, estrutura e tamanho
molecular dos biopolímeros.
Outras áreas do conhecimento aplicam exopolissacarídeos em
filmes. O campo de tecidos modificados tem se desenvol
vido rapidamente desde a
década passada, e muitas pesquisas caminham para criar uma vasta variedade de
tecidos vivos de substituição; trazendo novas alternativas de aplicação clínica.
Estes tecidos são baseados na associação de polímeros sintéticos condutores e
exopolissacarídeos. O compósito resultante apresentará a habilidade de
estimulação elétrica, conferida pelo polímero sintético, com a atividade biológica,
40
conferida pelo EPS. Dentre as atividades biológicas desejadas estão o aumento
da angiogênese (desenvolvimento de vasos sanguíneos). Neste sentido, França
(2007) estudou a produção de filmes automontados, constituídos por polianilina,
aditivados com o exopolissacarídeo
botriosferana;
uma glucana caracterizada
como (1 3; 1
6)
-ß-D-glucana (BARBOSA et al., 2003). O autor obteve
resultados satisfatórios
na produção do filme; constata
n
do uma boa associação do
polímero ao exopolissacarídeo.
Filmes aditivados com
exopolissacarídeos
também são usados na
indústria alimentícia; constituem uma alternativa para o acondicionamento de
alimentos. Estes biomateriais contribuem para o aumento da vida de prateleira dos
alimentos, bem como minimizam as conseqüências ambientais. Nesta perspectiva,
Piermaria et al. (2009) desenvolveram e caracterizaram um filme baseado na
kefirana. A kefirana é uma glucogalactana obtida a partir da fermentação de grãos
de kefir. A kefirana foi apta para formar filmes nas concentrações de 5 a 10 g/Kg.
Os filmes foram caracterizados quanto as suas características reológicas, físico-
químicas (umidade, atividade de água, espessura e transparência), caracterização
da micro-estrutura (microscopia eletrônica de varredura e grau de cristalinidade),
permeabilidade do vapor de água e propriedades mecânicas. Os filmes tamb
ém
apresentaram
comportamento pseudoplástico.
Além de EPS, filmes têm sido aditivados com peptídeos
denominados de pediocinas, provenientes do Pediococcus sp.; tais filmes podem
apresentar atividade antimicrobiana e trazer assim melhores perspectivas no
a
condicionamento de frios (SANTIAGO
-
SILVA et al., 2009).
Considerando as citações de que a levana apresenta características
físico
-químicas para aplicação biotecnológica e a alta produção por
microrganismos, aliado à sua aplicabilidade em filmes cólon-
espec
íficos para
liberação modificada de fármacos, este trabalho produziu levana de B. subtilis
NATTO
para desenvolvimento de filmes cólon
-específicos.
41
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MATERIAIS
4
.1.1 Micro
rganismo
O micro
rganismo
B
acillus
subtilis
, utilizado neste estudo,
foi
isolado
do alimento japonês Natto pelo Departamento de Bioquímica e Biotecnologia da
Universidade Estadual de Londrina. Sua identificação foi realizada
pel
o Instituto
André Tosello
–
Campinas, SP
(ANEXO A)
.
4.1.2 Meios de Cultura
4
.1.2.1 Meio de preservação
(Ágar nutriente)
Constituinte
Concentração
Peptona
5,0 g
Extrato de carne
3,0 g
Ágar
2,0 g
Água destilada
100
0
mL
42
4.1.2.2 Meio para obtenção do
pré
–
inóculo
(CALAZANS et al., 2000)
Constituinte
Concentração
Sacarose
10
0
,0 g
Extrato de levedura
2,0 g
KH
2
PO
4
2,0 g
(NH
4
)
2
SO
4
1,0 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5 g
Água destilada (qsp)
100
0
mL
4.1.2.3 Meio de fermentação
(EUZENAT
,
GUILBERT e COMBES,
1996
)
Constituinte
Concentração
Sacarose
400
,0 g
Extrato de levedura
2
,0 g
KH
2
PO
4
1,0 g
(NH
4
)
2
SO
4
3,0 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,06 g
MnSO
4
0,02 g
Água destilada (qsp)
1000 mL
43
4.1.3
Ensaios de Citotoxicidade e Mutag
enicidade
4.1.3.1
Cultivo Celular
Foram utilizadas, para os ensaios de mutagenicidade
e
citotoxicidade,
células de ovário de Hamster chinês, CHO-K1, fornecidos pelo
Laboratório de Mutagênese da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo. As células foram cultivadas como monocamada em
frascos de cultura de tecidos de 25 cm
2
.
4.1.3.2
Meio de Cultura
Foi utilizado, como meio de cultura das células CHO-K1, 1 pacote
do
F-
12 Nutrient Mixture (DMEM
)
fabricado pela
GibcoBRL®
.
Constituinte
Concentração
Meio
de cultura
1 pacote
NaHCO
3
1,2 g
Solução Antibiótica
-
antimicótica GibcoBR
L® cat.: 15240
-
096
1 mL
Água destilada q.s.p.
1000 mL
Observações:
Foi adicionado 10% de soro bovino fetal (GibcoBRL®) no meio de
cultura das células CHO
-
K1.
44
4.1.3.3
Solução salina balanceada (
PBS
)
livre de Ca
+2
e Mg
2+
Constituinte
Concentração
KCl
0,2 g
KH
2
PO
4
0,2 g
NaCl
8,0 g
Na
2
HPO
4
1,15 g
H
2
O deionizada q.s.p.
1000 mL
O pH foi ajustado para 7,4.
4.1.3.4
Solução Balanceada Salina de Hanks sem Ca
+2
e Mg
2+
Constituinte
Concentração
KCl
0,4 g
KH
2
PO
4
0,06 g
NaCl
8,0 g
NaHCO
3
0,35 g
Na
2
HPO
4
.7
H
2
O 0,09 g
D-
Glucose anidra C
6
H
12
O
6
1,0 g
Fenol Vermelho
0,0012 g
H
2
O deionizada q.s.p.
1000 mL
O pH foi ajustado para 7,4.
45
4.1.3.5
Tripsina EDTA 0,025%
Adicionar à 1000 mL de Solução salina de Hanks:
Constituinte
Concentr
ação
EDTA
–
Titriplex C
10
H
14
N
2
Na
2
O
6
.2
H
2
O
0,1 g
Tripsina (1:250) GibcoBRL car.: 27250
-
042
0,25 g
4.1.3.6
Solução de MTT
(3
-
(4,5
-
dimetiltiazol
-2-
il)
-2,5-
difenil
tetrazolium bomídico)
(Sigma®)
3,33 g/mL
0,005 g de MTT foi solubilizado em 5 mL de PBS. A solução foi
encaminhada para filtragem em papel filtro. Em seguida, foi adicionado meio de
cultura sem soro bovino fetal.
4.1.3.7
Citocalasina 300µg/mL
Constituinte
Concentração
Citocalasina 2mg/mL (Sigma®, CAS:14930
-
96
-
2)
300 µL
PBS
1,
7 mL
46
4.1.3.8
Solução Hipotônica de Citrato de Sódio 3,4.10
-2
M
Constituinte
Concentração
Na
3
C
6
H
5
O
7
.2H
2
O
10 g
H
2
O deionizada q.s.p.
1000 mL
4.1.3.9
Fixador Metanol
-
Ácido Acético 3:1
Constituinte
Concentração
Metanol
30 mL
Ácido Acétic
o glacial
10 mL
4.1.4.0
Tampão de Sorensen
Constituinte
Concentração
KH
2
PO
4
5,26 g
Na
2
HPO
4
8,65 g
H
2
O deionizada q.s.p.
1000 mL
Ajustado o pH para 7,0
47
4.1.4.1
Giemsa
Constituinte
Concentração
Giemsa
3,0 g
Glicerina
162 mL
Observaç
ões
:
Em frasco âmbar, o giemsa foi misturado à glicerina em banho-
maria
60°C overnight. Posteriormente, foi adicionado 252 mL de metanol e
homogeneizado.
4.1.4.2
Corante Final de Giemsa 5%
Constituinte
Concentração
Tampão de Sorensen
50 mL
Giemsa
2,5 mL
48
4
.1.5
Materiais para formação e análise dos Filmes
Os materiais que foram usados são: Eudragit® RS 30D
(copolímero
acrilato
-metacrilato com grupos amônio quaternário tipo B,
USP/NF/
Röhm
Pharma, Darmstadt –
Alemanha)
, Eudragit® FS 30D (copolímero aniônico
baseado no acrilato-metacrilato, metil-metacrilato e ácido metacrílito, Evonik®)
,
Citrato de trietila (TEC)
(Morflex®
–
EUA)
, Fluído de Simulação Gástrica (FSG) e
Fluído de Simulação Intestinal (FSI)
preparado
de acordo com a
farmacopé
ia
americana
USP 23°edição.
4
.2 MÉTODOS
4.2.1 Preservação do microrganismo
A preservação do B.
subtilis
foi realizada no meio 4
.1.2.1,
a uma
temperatura de 37 °C. Após crescimento, as culturas
foram
mantidas a
temperatura de 4 °C sendo repicados a cada 45 dias. A pureza
foi
verificada por
teste de gram.
4.2.2 Pré
–
Inóculo
O
pré
–
inóculo
foi
obtido através de fermentação por batelada, em
erlenmeyer de 250 mL, contendo 50 mL de meio de fermentação
(4.1.2.2
) durante
48 horas a 37 °C. Para o processo de inoculação, o pré – inóculo foi
centrifugado
a 4300 g por 20 min. O precipitado de células foi re-suspenso em NaCl 0,9% e a
concentração das células foi calculada por turbidimetria a 400
nm
c
omparada
a
uma curva padrão de
biomassa.
Todos os
inócu
lo
s foram
padronizado
s
em
0,2
g/L
.
49
4.2.3
P
rodução
de Levana através do P
lanejamento
Fatorial e Análise por
M
etodologia
de S
uperfície
de R
esposta (MSR)
Para
otimizar as condições de produção de levana, pelo B.
subtilis
NATTO
,
foi aplicado um planejamento fatorial e análise por
metodologia
de
superfície de
resposta (BOX, HUNTER e HUNTER,1976). A significância dos efeitos das
variáveis independentes
:
tempo de cultivo e concentração de sacarose, na
produção de levana, foram avaliadas em cultivos submersos, no meio
descrito
4.1.2.3; variando-
se
a concentração de sacarose conforme planejamento
proposto
. Foi utilizado um planejamento fatorial completo com
dois
fatores em
três
níveis
de variação 2
3
, para identificar os efeitos das variáveis na produção
de
leva
na.
Os valores das variáveis independentes, pontos fatoriais e centrais, para o
tempo de cultivo (X1) foram 12, 24 e 36 horas e para a concentração de sacarose
(X2) foram 100, 200 e 300 g/L (Tabela 2
).
As fermentações foram realizadas em
erlenmeyers
de 25
0 mL com
50 mL de meio a 37°C e 150 rpm.
A concentração de
levana, inferida pela concentração de unidades de frutose, foi escolhida como
variável dependente e dosada do sobrenadante após interrupção da fermentação
com proteases e conseguinte filtração
.
50
Tabela
2 - Delineamento fatorial
completo
3
2
para avaliar os efeitos das
variáveis tempo de cultivo (X
1
) e concentração de sacarose (X
2
) na produção
de levana por
B. subtilis
NATTO.
(*)
Ensaios
Variáveis codificadas
X
1
X
2
Variáveis Originais
Tempo
Concentração
(h)
(g/L)
1
-
1
-1
12
100
2
1
-1
36
100
3
-
1
1
12
300
4
1
1
36
300
5
0
1
24
300
6
0
-1
24
100
7
1 0
36
200
8
-
1 0
12
200
9
(C)
0 0
24
200
(*) Os ensaios foram
aleatorizados
Após
obtenção das
re
s
posta
s
do
primeiro
planejamento fatorial, foi
realizado o steepest ascent (caminho da máxima inclinação ascendente), seguido
de um planejamento fatorial fracionado de segunda ordem (2
2
) com dois pontos
centrais localizados e pontos estrela
(Tabela
3). As mesmas variáveis do
delineamento fatorial estatístico inicial foram testadas. A análise estatística dos
dados foi realizada utilizando-
se o software
Statistic
6.0.
51
Tabe
la
3 - Delineamento fatorial
fracionário
2
2
com pontos estrela para avaliar
os efeitos das variáveis tempo de cultivo
(X
1
) e concentração de sacarose (X
2
)
na produção de levana por
B. subtilis
NATTO.
(*)
Ensaios
Variáveis codifica
das
X
1
X
2
Variáveis Originais
Tempo
Concentração
(h) (g/L)
1 -
1
-1
8 2
00
2 -
1
1
8 600
3
1
-1
24
200
4
1
1
24
600
5 -1,8 0
1`36`` 4
00
6
1,8 0
30`24`` 4
00
7
0
-1,8 16 40
8
0
1,8
16 7
60
9
(C)
0 0
16 4
00
10
(C)
0 0
16 4
00
(*) Os ensaios foram
aleatorizados
4
.2.4
Fermentação
em
escala maior
Fermentações
na
obtenção da levana
foram
realizadas em batelada
a
par
tir do ponto ótimo observado no planejamento fatorial e superfície de resposta
(meio descrito em 4
.1.2.3
). A sacarose utilizada foi a comercial. A pré-
inoculação
foi realizada conforme item 4.2.2.
Foram
usados erlenmeyers de 2 L com volume
de trabalho de 5
00 mL. As condições de fermentação
foram
: temperatura de 37°C
,
16 h, a 150 rpm em mesa agitadora. A interrupção da fermentação foi realizada
conforme item
4.2.5
.
52
4
.2.5
Tratamento do fermentado com protease
Ao final das fermentações, o pH dos cultivos f
oi
corrigido para 8,5 com
NaOH 2N. Posteriormente, foram adicionados 20 mg de protease a
cada
500 mL
de meio fermentado. As amostras
foram
incubadas por 60 minutos a 60
o
C com
agitação
de
30 segundos a cada 15 minutos. A inativação da enzima foi realizada
em banho fervente por 10 minutos. As
amostra
s foram
então
filtrada
s
retirando
-
se
a biomassa
.
4.2.6 Precipitação
e liofilização
da levana
O volume total da fermentação, isenta de células,
foi
precipitado com
etanol
95%
(1:3). A levana precipitada
foi
lavada com água destilada
,
liofilizada
e
verificada
a contaminação de proteínas
conforme reação de Ninhidrina (MOORE e
STEIN, 1948).
4
.2.7
Quantificação
da Levana
Para determinação espectrofotométrica da levana, 0,3 mL do filtrado e
0,9 mL de etanol 95% foram misturados, seguindo de agitação em vortex, para a
precipitação do EPS. A mistura
foi
armazenada a 4
o
C por 12 horas e centrifugada
a 14000 rpm por 30 minutos. No precipitado (levana)
foi
adicionado 1 mL de HCl
0,1N e deixado a 100°C durante 1
hora
; em seguida neutralizada com 0,1 mL de
NaOH a 2M (Ananthalaksmy e Gunasekaran, 1999). O EPS foi determinado pelo
método de Somogy-Nelson através da quantificação dos açúcares redutores totais
presentes após hidrólise. Uma curva padrão
foi
confeccionad
a com frutose,
53
variando
-
se
a concentração de 0 a 100 g/ml e as leituras
foram
realizadas em
espectrofotômetro no comprimento de onda
-
=540 nm
(ANEXO B)
.
4.2
.8
Estimativa da massa molar da levana por cromatografia de exclusão
molecular
A levana
precip
itada do meio de fermentação foi submetida a uma
cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sepharose 6B. Este gel é de
agarose a 6%, com partículas de diâmetro de 45-165 µm; apresenta intervalo de
fracionamento para polissacarídeos 10
4
–
10
6
Da.
(CO
LLINS,
BRAGA e BONATO
1995). O gel foi empacotado numa coluna de 1,6 cm de diâmetro com 40 cm de
comprimento
,
volume de 80,43 mL.
O eluente foi o tampão fosfato 50 mM em pH 7,0, previamente
desaerado em sistema a vácuo. A vazão do eluente foi de 14mL/h, controlada por
bomba peristáltica. Os volumes coletados foram de 3,5 mL a cada 15 minutos. As
amostras
de 0,5 mL foram aplicadas a 4 mg/mL. Os açúcares eluídos foram
dosados pelo método fenol
-
sulfúrico
.
A partir dos padrões de dextrana de Leuconostoc mes
ente
roides, foi
confeccionada
a curva de calibração com os padrões de
50.000,
410.000 e
670.000
Da
(ANEXO
C).
4.2.9
Composição dos monossacarídeos da levana por Cromatografia líquida de
Alta Pressão em Coluna de Troca Aniônica (HPAEC)
Para avaliação da composição dos monossacarídeos da levana uma
amostra do EPS hidrolisado,
contendo
40,0 µg
/mL
de açúcares totais,
foi
analisada
. A amostra foi hidrolisada pela adição de 1,0 mL de HCl 0,1 N
em
54
ampola de vidro fechada hermeticamente
e submetida
a 100°C por 1 h
. O
ácido foi
neutralizado com NaOH 0,1N (Ananthalaksmy e Gunasekaran, 1999). A mesma
concentração do ácido foi utilizada para as condições 60°C/1 h e 100°C/2 h,
para
avaliação das condições de hidrólise.
Para fins comparativos, utilizou-
se
como padrão uma mistura
contendo
20 µg/mL de cada um dos seguintes monossacarídeos: L-frutose, L-glucose e 20
µg/mL de
sacarose.
Os monossacarídeos foram quantificados por cromatografia líquida de
troca iônica de alta pressão, consistindo de um sistema Dionex DX 500 e um
Detector de Amperometria Integrada (IAD). Os cromatogramas foram registrados
em um integrador modelo 4600. Os açúcares foram separados isocraticamente
(NaOH 14mM) usando uma coluna analítica CarboPac PA1 (4x250mm) equipada
com uma pré-coluna PA1 a velocidade de fluxo de 1,0 mL/min. As condições de
eluição foram produzidas usando H
2
O deionizada (eluente 1) e NaOH 200mM
(eluente 2), preparada a partir de solução de NaOH 50%. A coluna foi regenerada
após 25
min.
de corrida com 100% do eluente 2, por 10
min.
, seguida pelo retorno
de água deionizada
.
4. 2. 10
Determinação da viscosidade
da levana produzida pelo
B.
subtilis
NATTO
Para determinação da viscosidade, foi utilizado um viscosímetro
modelo LVDV-
I+
- Brookfield ®. A levana foi produzida conforme item 4.1.2.3 na
s
seguintes
condições de fermentação: temperatura de 37°C, 16 h, a 150 rpm em
mesa agitadora. A viscosidade foi avaliada em solução 33,1 % baseado no peso
da levana não liofilizada. As leituras foram anotadas quanto torques (%), rotações
(rpm) e c
entipoise (cP).
55
4.2.11
Meio
de Cultura
para células
de ovário de hamster chinês (
CHO
-
K1
) nos
testes de toxicidade da levana
Para os testes de citotoxicidade e mutagenicidade, o meio foi
preparado em balão volumétrico de 1000 mL. O meio de cultura (4.1.3.2) foi
solubilizado em 500 mL de água destilada e acrescentado posteriormente
o
bicarbonato de sódio e solução antibiótica-
antimicótica. Em seguida o conteúdo foi
homogeneizado e completado o volume para 1000 mL com água destilada. A
agitação foi realizada por cerca de 15 minutos protegido da luz direta. O pH foi
corrigido para 7,2 e, em seguida, filtrado em membrana de 0,22 µm em condições
estéreis. O meio foi guardado em frascos esterilizados. Foi adicionado 10% de
soro bovino fetal conforme os frasco
s aliquotados iam sendo utilizados.
4.2.12
Descongelamento
das c
élulas
CHO
-
K1
As células estocadas em nitrogênio líquido, após
descongelamento,
foram transferidas para o frasco de cultura com 10 mL de meio
de cultura
(4.2.11)
.
Em seguida foram
incubad
a
s a
37°C por 24 h.
4.2.13
Repique e Manutenção das Células
Para repique e manutenção das células
CHO
-
K1
, foi descartado o
meio
de cultivo
do frasco da cultura descongelada. As células foram então lavadas
duas vezes com 5 mL de PBS e o excesso de PBS foi retirado com o auxílio de
pipeta
Pasteur. As células
foram tratadas
com a adição
de 0,5 mL de tripsina por
2
min.
,
seguida pela adição de 1,5 mL de meio de cultura. Formou-se então
a
suspensão
celular
.
Para
manutenção
, foi utilizado 2 gotas da suspensão
celular
para cada frasco de cultura contendo 10 mL de meio de cultura. O frasco de
repique, ou pré-frasco, foi obtido adicionando-se 10 gotas da suspensão celular
em 5 mL de meio
de cultura
.
56
4.2.14
Citotoxicidade: Teste do
brometo de 3
-
(4,5
-
dimetiltiaz
ol
-2-
il)
-2,5-
difeniltetrazólio) (MTT)
Para os testes de citotoxicidade
utilizaram
-
se
três placas de Elisa
com
100 µL do meio de cultura
(4.2.11)
e
com
2,5.10
4
células
CHO
-
K1
em cada
poço. Foi reservado duas colunas para o branco, uma linha para o metilmetano
sulfanato (3,33.10
-5
mol/mL)
(indutor) e uma linha para o controle. Após 24 h de
incubação a 37°C
(
para estabilização da cultura
)
, foi retirado o meio de cultura dos
poços e a
dicionado 200 µL da levana em diferentes concentrações
.
Para os testes
fora
m utilizados 5 tratamentos, com adição de levana nas seguintes
concentrações
80,160,240, 320 e 400 µg/mL. O meio de cultura, nesta etapa,
foi
sem a adição de soro bovino fetal. Cada placa, após o tratamento com
diferentes
concentrações de levana, foi incubada a 37°C por 24 h. Após a incubação, foram
retirados os tratamentos e adicionado 150 µL de MTT (3,33 g/mL) em cada poço
por 4 h. Em seguida o MTT foi retirado e foi adicionado 150 µL de dimetil sulfóxido
.
As leituras foram a 550 nm em
Microelisa readers.
4.2.15 Mutagenicidade: Teste do Micronúcleo
1)
Tratamento
Para os testes de mutagenicidade os cultivos das células CHO-
K1,
após 72 h de crescimento, foram tratados
com
tampão fosfato salino (
PBS
)
,
tripsinizados, misturados e distribuídos
na
concen
tração de 0,95.10
6
células
CHO
-
K1
em
4 frascos de tratamento contendo 5 mL de meio de cultura e incubados por
24 h a 37°C
.
Após 24 h de
estabilização,
o meio de cultura foi descartado e as
células
foram lavadas duas vezes com 5 mL de PBS em temperatura ambiente. O
excesso de solução foi removido com pipeta Pasteur e
foram
iniciados
os
tratamentos
,
adicionando
-se 5mL de meio de cultura contendo 400 µg/mL e 1200
57
µg/mL de
levana.
Para controle positivo, ou indutor, foi utilizado o metilmetano
sulfato (2.10
-
4
M); o controle negativo continha apenas as células CHO-K1 com o
meio de cultura.
Os tratamentos foram incubados por 24 h a 37°C. Terminado o
período de incubação, As culturas
foram
lavadas duas vezes com 5 mL de PBS
em temperatura ambiente. Foi adicionado meio de cultura novo e 50 µL de
citocalasina B 300 µg/mL por 24 h
.
Após tratamento com citocalasina, os frascos
foram encaminhados para a colheita de micronúcleo.
2)
Colheita de Micronúcleos para Células CHO
-
K1
Foram reservados o meio de cultura dos frascos-tratamento e
controle positivo e negativo. As células foram
então lavadas
duas vezes com 5 mL
de PBS e o excesso removido com pipetas de Pasteur. As células foram então
soltas com a adição de 0,5 mL de tripsina 0,025%. A inativação da enzima foi
realizada com a adição do meio de cultura reservado anteriormente. Após
inativação, foi adicionado uma gota de formol,
homo
genizado
e centrifugado (1250
rpm por 5 minutos). Após centrifugação, foi desprezado o sobrenadante, deixando
1,5 mL de meio de cultura, e adicionado 1,5 mL citrato de sódio em temperatura
ambiente pela parede do frasco. Novamente o conteúdo foi homogeneizado
e
centrifugado (1250 rpm por 5 minutos) seguindo com o descarte total do
sobrenadante. Em seguida o sedimento foi suspendido em PBS q.s. Após
suspensão, foi adicionado 5 mL de fixador metanol/ácido acético e rapidamente
homogeneizado e centrifugado (1250 rpm/ 5minutos). O sobrenadante foi
descartado. A adição de fixador foi realizada novamente obtendo-se a diluição
desejada q.s.
Em seguida foi
depositada
uma gota da suspensão de células sobre
a lâmina limpa e gelada contendo um filme de água. Após secagem em
temperatura ambiente, as lâminas foram coradas cobrindo-as com cerca de 5 mL
de Giemsa 5% durante 5 minutos. Após coloração, o corante foi removido em
água corrente. As lâminas foram secadas em temperatura ambiente e levadas
58
para estudos no microscópio. As lâminas foram analisadas contando-se 1000
células binucleadas por tratamento, contabilizando as células binucleadas
po
r
tado
ras de micronúcleos.
4
.2.16
Preparação dos Filmes
Os filmes
foram
preparados a partir de dispersões em base aquosa,
inclusive a solubili
zação
da levana. Foi utilizado o método convencional para
polímeros termoplásticos e termorrígidos, denominado evaporação ou “casting
process” (SIPOS et al., 2008; TARANTILI e KOUMOULOS, 2008). A dispersão
polimérica de base aquosa
foi
preparada em quatro diferentes concentrações
variando a concentração de levana. A massa polimérica final será sempre de 4%
(p/v)
ou 4g/100 mL. As diferentes proporções poliméricas estão expressas
conforme Tabela 4. Os filmes a base de Eudragit® RS e FS 30D foram
confeccionados separadamente, embora, para simplificação, estejam agrupados
na mesma tabela. O plastificante escolhido foi o citrato de trietila (TEC),
adicionado na concentração de 20% em relação, exclusivamente, à massa do
polimetacrilato Eudragit® RS 30 D (ABBASPOUR
, SADEGHI e GAREKANI
, 2008).
Para o polímero Eudragit® FS 30D, foi
usado
uma dispersão 5% de
monoestearato de
glicerila
(MEG)
e 2% de tween 80 como agente deslizante
(
IBEKWE et al., 2006
).
59
Tabela 4 - Quantidade de polímeros e
levana
usados para um volume de 100 mL
de filme.
Eudragit®RS30D
ou
Eudragit®FS30D
(g)
-----------------------------------------------------
Levana
(g)
4,0 (100%)
0,0 (0%)
3,8 (95
%)
0,2
(5
%)
3,6
(90%)
0,4
(10%)
3,2
(80%)
0,8
(20%)
As dispersões contendo o Eudragit® RS 30 D e FS 30D, acrescidas do
TEC a 20% e
MEG
5% respectivamente, foram deixadas sob agitação magnética
por um período de 30 minutos em temperatura ambiente (TE= 25°C ± 2.0). Após
completa homogeneização das dispersões, foram adicionadas suavemente, as
quantidades variáveis da levana. A solução
foi
mantida sob agitação magnética
por mais 60 minutos em temperatura ambiente. Durante todo o processo de
homogeneização foi utilizada bomba de vácuo visando evitar a incorporação de ar
e formação de bolhas às misturas poliméricas. Após completa homogeneização
das diferentes dispersões, amostras de 10 mL, de cada dispersão, foram
vertidas
sobre os orifícios previamente demarcados na placa de Teflon®. Esta placa
foi
nivelada e mantida a 50°C (temperatura mínima para formação dos filmes) por
período de apro
ximadame
nte 24 horas até a formação dos filmes (CAVALCANTI
et al., 2002).
60
4
.2.17
Caracterização Morfológica Macroscópica
e Determinação da Espessura
dos Filmes
Foram
selecionados filmes que não
possu
ía
m rachaduras, bolhas de ar
ou quais
quer imperfeições que
poderiam
interferir na reprodutibilidade dos ensaios
propostos. A uniformidade de espessura
foi
provada, utilizando um Micrômetro
(Mitutoyo®), a partir de 5 pontos escolhidos aleatoriamente na superfície de cada
filme. As membranas se
lecionadas
foram
acondicionadas em dissecador
(contendo sílica gel) até o momento de realizar os testes posteriores (OLIVEIRA
e
CAVALCANTI, 2007; YE
et al., 2007).
4
.2.18
Transmissão de Vapor d`água (TVA)
O estudo de TVA
foi
desenvolvido em conformidade com método “B” da
ASTM
(American Society for Testing and Materials) designado E96-
66.
Inicialmente, no interior de cada cúpula de permeabilidade (modelo
Payne
permeability cup, Bélgica),
foram
adicionados 10,0 mL de água destilada. Em
seguida, os filmes candidatos à investigação, com área de 9,62 cm2,
foram
fixados às cúpulas individualmente. O conjunto (cúpula +
água destilada + amostra
filme)
foi
pesado no tempo zero e armazenado em dissecador contendo sílica-
gel.
As cúpulas, em triplicata, de cada fil
me,
foram
pesadas nos intervalos
de 0, 24, 48,
72, 96 e 120 horas, respectivamente. A cada intervalo de tempo pré-
estabelecido,
a sílica-
gel
foi
trocada por outra desidratada (50°C/24h). Os pesos perdidos
pelas
cúpulas nos respectivos intervalos de tempo f
oram
registrados e aplicados na
Equação 1. Esta equação fornec
eu
a taxa de transmissão de vapor d’água
transportada através dos filmes isolados.
61
TVA =
g
x 24
.............................................. Equação (1)
t
x
a
Onde,
g
é a perda de peso em gramas,
t
é tempo em horas e
a
a
área do filme.
4
.2.19
Determinação do Índice de Intumescimento (Ii%)
Os filmes das diferentes associações propostas
foram
minuciosamente
cortados com tesoura cirúrgica (modelo Professional F/1) em aproximadamente
1,0 cm². A seguir
foram
distribuídos no interior de placas de Petri devidamente
identificadas. Posteriormente, as placas de Petri
foram
colocadas em estufa
a
5
0°C, por
aproximadamente 24
horas, atingindo perda total da umidade
. Após este
tempo, as placas
foram
retiradas e mantidas em
dissecadores
durante a
realização do experimento. As amostras secas das diferentes associações
foram
pesadas em balança analítica, imediatamente imersas em recipientes contendo
Fluído de Simulação Gástrica (FSG) para filmes a base de Eudragit FS
30D
/Levana
e Fluído de Simulação Intestinal (FSI) e FSG para filmes a base de
Eudragit RS 30D
/Levana
, sem a presença de enzimas, e mantidas por diferentes
intervalos de tempo à temperatura ambiente. Tais flu
ídos
foram
feitos segundo a
23ª Farmacopéia dos Estados Unidos (
USP
XXIII). Cumpridos os intervalos de
tempo pré-estabelecidos, as amostras
foram
removidas dos meios com auxílio de
pinça e cuidadosamente enxugadas entre duas folhas de papel de filtro e
repesadas. O mesmo procedimento
foi
adotado para todas as outras amostras
mantidas por períodos correspondentes aos intervalos de 1 a 10, 30, 60, 75, 90,
105 e 120 minutos de imersão. Para o cálculo do índice de intumescimento (Ii%)
foi
utilizada a E
quação
2
segundo
Blanchon et al., 1991.
62
Ii% = (
P i
–
P s)
x 100 .................................... Equação (2)
Ps
Onde
Pi
é o peso do filme intumescido e Ps
é o peso do filme seco.
4.2.20
Calorimetria Exploratória Di
ferencial (DSC)
Para as análises de DSC, uma pequena quantidade das
amostra
s (6 mg)
,
padrão e associações, foram
aprisionada
s em cadinho de alumínio com tampa
furada e submetidos a programa de aquecimento controlado. Os ensaios foram
realizados em calorímetro diferencial de varredura marca Netzsch modelo DSC –
204 em uma atmosfera com fluxo de nitrogênio gasoso de 10 mL/min. A faixa de
temperatura
foi de 0 - 6
00ºC
a uma taxa de aquecimento de 10ºC por minuto.
Antes disso, foi aplicada uma isoterma de 100 ºC por 15 minutos objetivando a
perda total da umidade. A diferença de fluxo de calor da amostra e do padrão
foi
controlada
pel
a variação da entalpia e demonstrada em gráfico por picos
endotérmicos e exotérmicos.
4.2.21
Análise Termogravimétrica (TGA)
Foram conduzidos experimentos para investigar a estabilidade térmica, por
termogravimetria, tanto dos polímeros sintéticos
quanto
das diferentes
associações candidatas, utilizando aparelho Netzsch modelo DSC-204. Foram
utilizadas aproximadamente 10 mg em uma atmosfera de fluxo de nitrogênio
gasoso de 10 mL/min. A faixa de temperatura foi de 0 - 5
00ºC
a uma taxa de
aquecimento de 10ºC por minuto.
63
4
.2.22
Análise Estatística
As análises estatísticas
foram
usadas para determinar o nível de
signif
icância existente entre os valores obtidos em todos os ensaios envolvendo os
filmes.
As análises
estatísticas
d
e produção da levana
bem como
do
planejamento
fatorial e superfície de resposta
,
foram realizadas
pelo programa Statistic® (versão
6.0, 2001).
As análises de citotoxicidade e mutagenicidade (4.2.14 e 4.2.15)
foram
analisados pelo programa GraphPad InStat (versão 3.02, 1998) pelo teste de
Tukey para múltipla comparação das médias.
Os demais ensaios foram analisados pelo programa GraphPad Pris
m®
(versão 2.01, 1996). Os diferentes resultados referentes aos coeficientes de índice
de intumescimento e transmissão de vapor d’água, que
foram
obtidos nas
diferentes circunstâncias (meio de simulação do TGI),
foram
inicialmente avaliados
usando análise de variância (ANOVA), sendo os resultados sempre significativos
quando p<0,05. Quando o conjunto desses valores
forneceu
parâmetros
significativos,
foi
realizada aplicação das médias dos dados obtidos no teste de
múltipla comparação de Tukey. Está análise
comparar
á o efeito das diferentes
composições poliméricas.
A significância foi qu
a
ndo
p<0,05
.
64
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1
PRODUÇÃO DA LEVANA
A produção de levana, por B.
subtilis
, é influenciada por diversos
fatores; dentre eles as condiçõe
s específicas de crescimento celular e composição
do meio de cultura. A composição correta do meio de cultura é de grande
importância para a produção de levana; haja vista que
a
produção metabólica da
levana acompanha o crescimento da biomassa (SHIH et al., 2005). Nesta
perspectiva, pesquisas foram realizadas para se obter as melhores
composições
do meio cultivo, para produção de levana; objetivando um bom crescimento da
biomassa bacteriana. Os trabalhos de Calazans et al. (
2000
) e Euzenat, Guilbert e
Combe
s (
1996)
foram úteis para fornecer tais informações
.
Fatores de estresse também
foram
necessários na produção de
Levana. Singh e Fett (1995) afirmaram que o aumento da osmolaridade e a
desidratação são importantes fatores na produção de EPS; em especial o
alginato
e a levana. A adição de NaCl e etanol, visando o aumento da osmolaridade e
desidratação no meio de cultura, aumentaram a capacidade de produção de
levana na Pseudomonas pv. phaseolicola. Shih et al. (2005) estudaram a
produção e caracterização de levana, produzida pelo B.
subtilis
, isolada do Natto.
Os autores utilizaram, com a finalidade de aumentar a osmolaridade e
assim
o
estresse
, um meio saturado
a
20% (p/p) de sacarose.
De acordo com tais observações, este trabalho guiou-se utilizando o
aumento de osmolaridade como fator de estresse para a produção de levana por
B.
subtilis
.
Ainda s
egundo
Abdel
-Fattah, Mahmoud e Esawy (2005), a
levanasacarase é produzida de modo induzível, pelo Bacillus subtilis NRC 33a,
quando usado sacarose como fonte de carbono. Sendo assim, justifica-se o uso
do aumento da osmolaridade, com altas concentrações de sacarose, para a
65
indução da levanasacarase na
produção
de levana. No mesmo estudo foi
verificada
a importância do tempo de fermentação no rendimento da levana.
Outros estudos também sugeriram a importância do tempo de cultivo
na produção levana; Shih et al. (2005) verificaram a importância do tempo de
cultivo
na produção
de levana
de alta massa molar
por B.
subtilis
isolado do N
atto.
Considerando a importância dos fatores concentração de sacarose e
tempo de cultivo, na produção de levana, realizou-se uma otimização de produção
de levana através do planejamento fatorial e análise por metodologia de superfície
de resposta.
Os resultados serão apresentados na forma de artigos
científicos
:
Artigo
1: Caracterização da levana e otimização da sua produção pelo
Bacillus
subtilis
NATTO. Efeito da temperatura e concentração de sacarose, submetido à
“Food
Microbiology
” (normas de publicação no Anexo E
).
Pg.
66
Artigo
2:
Levana no desenvolvimento de novo material polimérico: Avaliação da
permeabilidade, hidratação e análises térmicas em filmes isolados de Eudragit
FS30D®, submetido à “World Journal of Microbiology and Biotechnology
”
(normas
de publicação no Anexo F)
. P
g.
90
Artigo 3: Avaliação da permeabilidade,
hidratação
e análises térmicas de filmes
isolados de Eudragit RS
30
D
®
aditivados com levana de Bacillus subtilis
NATTO.
Material candidato ao revestimento farmacêutico, submetido à
Applied
Microbiology and Biotech
nology
(normas de publicação no Anexo F)
. P
g.
107
66
Caracterização da levana e otimização da sua produção pelo
Bacillus
subtilis
NATTO. Efeito da temperatura e concentração de sacarose
Leandro Freire dos SANTOS
1*
, Sandra Regina LEPRI
2
, Wagner José Mar
tins PAIVA
2
,
Maria Antonia Pedrine Colabone CELLIGOI
1
1
Departamento de Bioquímica e Biotecnologia, Centro de Ciências Exatas, Universidade
Estadual de Londrina,
SC 86051
-
990
Londrina, Brasil
2
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas
, Universidade Estadual de
Londrina, SC 86051
-
990 Londrina, Brasil
*Corresponding author. Tel.: +55 44 9989
2982
E-
mail address
:
(L.F. Santos)
67
RESUM
O
Exopolissacarídeos têm ganhado grande destaque, nesta última década, na indústria
alimentícia. A levana, um exopolissacarídeo à base de
frutose
, tem sido utilizada como
estabilizante, fixador de sabores, cores e espessante para vários alimentos. Condiçõ
es
otimizadas de produção fazem-se necessárias para melhor aplicação industrial. Este
trabalho objetivou otimizar a produção de levana, produzida pelo
B.
subtilis
isolado do
Natto,
por planejamento fatorial e análise por metodologia de superfície de resposta, bem
como caracterizá-la quanto à
massa
molar,
comportamento reológico e toxicidade. Diante
das variáveis independentes pesquisadas, o delineamento experimental apresentou os
melhores resultados em 400 g/L de sacarose/ 16 h de tempo de cultivo; com o re
ndimento
de 111,6 g/L de levana. Nestas condições otimizadas a amostra apresentou, conforme
quantidade total de açúcares eluídos, levana de duas massas moleculares,
aproximadamente 568.000 Da e < 50.000
Da;
nas quantidades 13,39 e 86,61%
respectivamente. Conforme avaliação da viscosidade, mediante variação da taxa de
cisalhamento, a levana apresentou um comportamento Newtoniano. A levana não se
apresentou tóxica ou genotóxica. De acordo com a citotoxicidade, nenhum dos
tratamentos mostrou-se citotóxico para as células CHO-K1 (p>0,05), bem como nenhum
tratamento aumentou a freqüência de micronúcleos para células CHO-K1 quando
comparado com o controle; não apresentando potencial mutagênico.
Palavras
-
chave:
Levana, produção, planejamento fatorial, caracterização, massa molar,
citotoxicidade, micronúcleo
68
1.
INTRODUÇÃO
A levana é um polissacarídeo extracelular constituída
predominantemente por resíduos de D-frutose unidos por ligações glico
sídicas
ß-
(2
6); podendo ainda apresentar pontos de ramificações ß-
(2
1) e um resíduo
de glucose terminal (Arv
idson et
al.
2006).
A levana apresenta ampla aplicação industrial e tecnológica. Grande
destaque na indústria alimentícia; aonde é utilizada como estabilizante, fixador de
sabores, cores e espessante para vários alimentos; sendo utilizada também na
elaboração de produtos
dietéticos (Duboc e
Mollet, 2001).
Diante das aplicações vindouras e atuais da levana, faz-
se
necessário pesquisar fontes alternativas de produção, bem como otimizá-
la.
Diversos microrganismos, nesta última década, têm sido propostos como
potenciais produtores de levana. Oliveira et al. (2007) concluíram a
Zymomonas
Mobilis
como potencial produtor de levana; obtendo, em condições otimizadas por
planejamento fatorial e metodologia de superfície de resposta, até 21,68 g/L
de
levana.
A caracterização da massa molar da levana finda-se como
importante etapa na correta aplicação das condições otimizadas de produção;
sabe
-se que determinadas funções ou atividades biológicas são estritas a certas
faixas de massa molar. Calazans et al. (2000) relacionaram a atividade
antitumoral
da levana com a massa molar do exopolissacarídeo (EPS). Ocorreu uma faixa de
massa molar com máxima atividade contra o tumor. Ammar et al. (2002)
afirmaram que a levana de alta massa molar
possui
efeitos benéficos nos níveis
séricos de colesterol e triacilglicerídeos em humanos e animais.
A caracterização reológica da levana torna-se imprescindível para
sua aplicabilidade industrial principalmente na área alimentícia. Existem poucos
dados na literatura sobre a caracterização reológica da levana produzida
pelo
bacilo
isolado do Natto. O comportamento da viscosidade da levana, mediante
variação da taxa de cisalhamento, é um importante teste no âmbito de
metodologias para caracterização reológica; haja vista a possível variação da
69
viscosidade e escoamento de líquidos não-Newtonianos frente às mudanças na
taxa de cisalhamento (Bae et al., 2008).
Caracterizações do âmbito toxicológico também devem ser
realizadas na produção de substância com possível aplicação humana. Os testes
de toxicidade celular fornecem as primeiras informações sobre a segurança dos
compostos em teste. Muitas moléculas promissoras podem ser descartadas, logo
no início, devido à sua citotoxicidade. Assim o teste de citotoxicidade utilizando o
brometo de 3-
(4,5
-
dimetiltiazol
-2-
il)
-2,5-
difeniltetrazólio)
(MTT) foi aplicado para
verificar a segurança da aplicação da levana na indústria alimentícia. A
geno
toxicidade, por meio da metodologia de micronúcleo, também se faz
necessário para prognosticar uma potencial atividade mutagênica e/ou
carcinogênica (Miranda et al., 2008).
Um
B. subtilis, isolado do alimento japonês Natto pelo Departamento
de Bioquímica e Biotecnologia da Universidade Estadual de Londrina
e
identificado pela Fundação André Tosello
, mostrou
-
se em testes prévios, estimada
produção de levana. Diante disso, este estudo objetivou, primordialmente,
os
estudos iniciais de otimização da produção de levana. Amparando este objetivo
principal, estudos adicionais no que diz respeito à massa molar, caracterização
reológica e dados to
xicológicos da levana produzida
foram realizados com o intuito
de ampliar sua aplicabilidade industrial
.
2.
MÉTODOS
2.1
Produção
de Levana
2.1.1
Micr
organismo e condições de fermentação
O B.
subtilis
, isolado do alimento japonês Natto pelo Departamento de
Bioquímica e Biotecnologia da Universidade Estadual de Londrina e identificado
pela coleção de culturas tropicais André Tosello – Campinas SP, foi mantido e
m
meio de cultura contendo em g/L: Peptona 5,0; Extrato de carne 3,0 e
Agar
2,0. O
meio foi autoclavado a 121°C por 15 min. As culturas foram mantidas a 4°C e
renovadas a cada 45 dias. O meio para o pré-inóculo continha 100 g/L de
70
sacarose e sais conforme Calazans et. al (2000). A concentração de células foi
padronizada em 0,2 g/L. A concentração de células foi determinada por
turbidimetria a 400 nm. Fermentações em batelada forma conduzidas utilizando
frascos erlenmeyers de 250 mL com 50mL de meio de fermentação a 37°C, 150
rpm.
2.1.2 Meio de fermentação
Foram utilizados, no meio de cultura, sacarose comercial conforme
planejamento fatorial proposto. Demais sais utilizados foram em g/L: Extrato de
levedura 2,0;
KH
2
PO
4
1,0;
(NH
4
)
2
SO
4
3,0;
MgSO
4
.7H
2
O
0,06;
MnSO
4
0,02 e água
destilada qsp. Todos os sais são de grau analítico.
2.1.3
Planejamento Fatorial
Inicialmente foi utilizado um planejamento fatorial completo com dois fatores
em três níveis de variação 2
3
, para identificar os efeitos das variáveis tempo de
cultivo (x
1
) e concentração de sacarose (x
2
) na produção de levana (Tabela 1).
Após
obtenção das respostas do primeiro planejamento fatorial, foi realizado o
caminho da máxima inclinação ascendente, seguido de um planejamento fatorial
fracionado de segunda ordem (2
2
) com dois pontos centrais localizados e pontos
estrela (Tabela 2). A análise estatística dos dados foi realizada utilizando-se o
software
Statistic
6.0.
2.1.4
Métodos analíticos
Após cada fermentação, foram adicionadas proteases (40,0 mg.L
-1
; pH 8,5)
aos meios de fermentação e conseqüente filtração para interrupção da
fermentação. A levana (LEV) foi precipitada do extrato livre de células com etanol
absoluto (1:3)
gelado
(5°C). Contaminação protéica foi verificada conforme reação
de Ninhidrina (Moore e Stein, 1948). O rendimento de levana foi inferida pela
quantidade de açúcares redutores por Somogyi (1952) e Nelson (1944) após
hidrólise com 1 mL de HCl 0,1N (100°C, 1 h).
71
2.2 Caracterização
da levana
de
B. subtilis
NATTO
2.2.1
Análise da composição monossacarídica por cromatografia líquida de
alta pressão em coluna de troca aniônica (HPAEC)
A levana, após precipitação e hidrólise, foi avaliada quanto à composição
dos monossacarídeos. Os monossacarídeos foram quantificados por
cromatografia líquida de troca iônica de alta pressão, consistindo de um sistema
Dionex DX 500 e um Detector de Amperometria Integrada (IAD). Os
cromatogramas foram registrados em um integrador modelo 4600. Os açúcares
foram separados isocraticamente (NaOH 14mM) usando uma coluna analítica
CarboPac PA1 (4x250mm) equipada com uma pré-coluna PA1 a velocidade de
fluxo de 1,0 mL/min. As condições de eluição foram produzidas usando H
2
O
deionizada (eluente 1) e NaOH 200mM (eluente 2), preparada a partir de solução
de NaOH 50%. A coluna foi regenerada após 25 min de corrida com 100% do
eluente 2, por 10 min., seguida pelo retorno de água deionizada.
2.2.2 Estimativa da massa molar da levana por cromatografia de exclusão
molecular
A lev
ana
precipitada
das fermentações foi submetida a uma
cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sepharose 6B (Sigma). O gel
foi empacotado numa coluna de 1,6 cm de diâmetro com 40 cm de comprimento,
volume de 80,43 mL. O eluente foi o tampão fosfato 50 mM em pH 7,0,
previamente desaerado em sistema a vácuo. A vazão do eluente foi de 14mL/h,
controlada por bomba peristáltica. Os volumes coletados foram de 3,5 mL a cada
15 minutos. As amostras de 0,5 mL foram aplicadas a 4 mg/mL. Os açúcares
eluídos foram dosados pelo método fenol-sulfúrico. A partir dos padrões de
dextrana de Leuconostoc mesenteroides, foi confeccionada a curva de calibração
com pa
drões de 50 K, 410 K e 670 K Da.
2.2.3 Determinação da viscosidade
da
levana
72
Para determinação da viscosid
ade,
foi utilizado um viscosímetro modelo
LVDV
-
I+
- Brookfield ®. A viscosidade foi avaliada em solução 33,1 % baseado no
peso da levana não liofilizada. As leituras foram anotadas quanto torques (%),
rotações (rpm) e centipoise (cP).
2.2.4
Avaliação da
C
itot
oxicidade
Para este teste foi u
tiliz
ado
três placas de Elisa com 100 µL do meio de
cultura
DMEM
–
F12
GibcoBRL®
, suplementado com 10% de soro bovino fetal,
adicionados de 2,5.10
4
células
de ovário de hamster chinês (
CHO
-
K1
)
(doadas
pela Universidade Federal de São Carlos) em cada poço. Foram reservadas duas
colunas
para o branco, uma linha para o metilmetano
sulfanato
MMS
(3,33.10
-5
mol/mL)
(indutor) e uma linha para o controle. Após 24 h de incubação a 37°C
(para estabilização da cultura), foi retirado o meio de cultura dos poços e
adicionado 200 µL da levana em diferentes concentrações (80,160,240, 320 e 400
µg/mL).
O meio de cultura, nesta etapa, foi sem a adição de soro bovino fetal.
Cada placa, após o tratamento com diferentes concentrações de levana, foi
incubada a 37°C por 24 h. Após a incubação, foram retirados os tratamentos e
adicionado 150 µL de MTT
(3
-
(4,5
-
dimetiltiazol
-2-
il)
-2,5-
difenil
tetrazolium
bomídico
-
Sigma®)
(3,33 g/mL) em cada poço por 4 h. Em seguida o MTT foi
retirado e foi adicionado 150 µL de dimetil sulfóxido. As leituras foram a 550 nm
em
Microelisa readers.
2.2.5
Avaliação da mutagenicidade:
Micronúcleo com bloqueio de citocinese
As células CHO-K1 cresceram em DMEM –
F12
GibcoBRL®
por 24 h
antecipadamente à adição dos tratamentos para estabilização da cultura. Os
tratamentos foram realizados nos seguintes termos: a) controle contendo apenas
meio de cultura b) agente indutor de dano de DNA (MMS -
2.10
-
4
M) c) levana
400
µg
/mL e d) levana 1200 µg/mL. Após tratamento as culturas foram incubadas por
24 h, 37°C. Terminado o período de incubação, as culturas
foram
lavadas duas
vezes com 5 mL de tampão salino fosfato (
PBS
) em temperatura ambiente. Foi
adicionado meio
de cultura
novo e 50 µL de citocalasina B 300 µg/mL
por 24 h
. O
s
73
procedimentos de colheita e fixação das células foram
realizados
conforme
Menoli
et al. (2001). O critério utilizado para determinação dos micronúcleos em células
binucleadas foram estabelecidas
conforme Fenech (2000).
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 Pl
anejamento Fatorial
e Metodologia de Superfície de Resposta
O delineamento experimental foi planejado para avaliar a influência
de dois fatores (variáveis independentes), tempo de cultivo (X
1) e concentração de
sacarose (X2), na obtenção da levana do B. s
ubtilis
NATTO. O primeiro passo foi
estabelecer os níveis das variáveis independentes a serem testados; os valores
foram baseados
nos dados da
literatura (Shih et al., 2005).
A composição do meio de cultura, tempo e temperatura da
fermentação
foram fixadas conforme Euzenat, Guilbert e Combes (1996) e
resultados obtidos previamente do planejamento fatorial completo, para
produção
de levana por B.
subtilis
.
Tabela 1
A análise dos efeitos para o primeiro planejamento fatorial (Tabela 2
)
demonstrou que a sacarose (X2) teve efeito linear positivo na produção de levana,
com uma significância (p=0,035). Estes resultados indicaram que, para se
maximizar a produção de levana, deve-
se aumentar a concentração de sacarose.
Tabela 2
Com base nestes resultados, foi realizado o caminho de máxima
inclinação ascendente (steepest ascent) com o objetivo de localizar a região de
máxima produção de levana e os resultados estão da Tabela 3 e a su
perfície
obtida na Figura 1.
Figura 1
Tabela 3
A análise dos efeitos do segundo planejamento fatorial revelou que
os resultados obtidos estão praticamente no máximo já que o termo linear
referente à concentração de sacarose não foi significativa (p=0,83) e o termo
quadrático significativo (p=0,025). O valor de R
2
ajustado foi considerado aceit
ável
74
(p=0,80) e a falta de ajuste do modelo mostrou-se não significativa (p=0,55). A
escolha conveniente da amplitude da variação (a = ±1,8) foi necessária para
garantir a ortogonalidade dos blocos.
A condição ótima para a produção de levana, a partir d
e B.
subtilis
,
foi obtida utilizando-se 400 g/L de sacarose com 16 h de tempo de cultivo; com
uma produção média de 111,6 g/L (Tabela 2). Shih et al. (2005) encontraram que
200 g/L de sacarose produziram de 40-50 g/L de levana do B.
subtilis
isolado do
natto; o que foi similar se relativamente comparado à concentração de sacarose
utilizada neste estudo.
Oliveira et al. (2007) realizaram um planejamento fatorial para a
produção de levana, a partir de Zymomonas mobilis, utilizando fontes
de
carboidrato
de
baixo custo e regionais. Um dos planejamentos fatoriais realizados
foi a avaliação da variável dependente (rendimento de levana) com as mesmas
variáveis utilizadas neste trabalho; concentração de sacarose e tempo de cultivo.
Os autores conseguiram 21,7 g/L de levana na condição otimizada; 250 g/L de
sacarose em 24 h de cultivo.
Abdel
-Fattah et al. (2005) afirmaram que concentrações de açúcar,
acima de 10%, podem criar problemas na cultura devido à alta viscosidade
produzida pelo polímero. Porém o uso de
sacarose
a
40%
pelo
B. subtilis
NATTO
,
neste estudo, não impediu que a cultura se desenvolvesse e ocorresse uma alta
produção de levana
.
3.2
Caracterização da levana de
B. subtilis
NATTO por HPAEC
Os cromatogramas obtidos da levana hidrolisada do B. subt
ilis
NATTO
apresentaram respectivamente picos de glucose
(21%)
e frutose
(79%)
(Figura 2). Estes resultados corroboram com Bekers et al. (2005) que também
encontraram monômeros de glucose e frutose em todas as levanas testadas após
hidrólise
com ácido clorídrico quanto com ácidos orgânicos (láctico, acético e
glucônico). Abdel-Fattah et al. (2005) verificaram a presença de frutose e fruto-
oligossacarídeos nos hidrolisados de levana. Estes oligossacarídeos eram
constituídos basicamente de frutose; com quantidades pequenas de glucose. Shih
75
et al. (2005) encontraram altas quantidades de frutose quando a levana havia sido
hidrolisada com ácido oxálico 0,5%. Tais estudos, que abordam a hidrólise da
levana, indicam como possíveis produtos da hidrólise tanto monossacarídeos de
glucose e frutose; como fruto-oligossacarídeos apresentado frutose e glucose em
sua composição. Os produtos dependerão do lugar de clivagem, durante hidrólise,
na cadeia de levana; além de outras variáveis que precisam ser estudadas mais
profu
ndamente como o tipo de ácido usado e grau de ramificação da levana
produzida.
Figura 2
3.3
Estimativa da massa molar da levana por cromatografia de exclusão
molecular
A levana obtida na melhor condição de fermentação,
determinada
pelo delineamento fatorial e metodologia de superfície de resposta, foi precipitada,
liofilizada e submetida à cromatografia de permeação em gel. A amostra
apresentou
levana
s de duas massas molares, aproximadamente 568 K Da e < 50
K
Da;
nas quantidades 13,39 e 86,61% respectivamente. Tais resultados sugerem
que a natureza polimérica de grande parte do material formado era composta
principalmente de levana de baixa massa molar ou fruto-oligossacarídeos. Abdel-
Fattah et al. (2005) estudaram a síntese enzimática de levana e fruto-
oligossacarídeos a partir do Bacillus subtilis NRC 33a. Assim como neste estudo,
a levana de maior massa molar encontrada, pelos autores
, foi 568 K
Da. Porém os
autores apenas conseguiram produzir levana, nesta faixa de peso molecular,
quando aumentaram a concentração da levanasacarase, no processo de
produção de levana, de 5 para 1000 µg/mL. De acordo com tais observações,
sugere
-se que a levana de baixa massa molar, e demais fruto-
oligossacarídeos,
obtidos neste trabalho,
foi
produzido com 16 horas de f
ermentação
; haja vista o
caráter induzível da levanasacarase. Euzenat et al. (1996) afirmaram que o
tamanho da cadeia da levana diminui com o aumento da concentração de
sacarose; o que
explica
a
predominância
de levana de baixa massa molar nos
76
tempos iniciais de fermentação, devido às altas concentrações de sacarose
testada (400 g/L de sacarose).
A partir dessas observações, infere-se que a massa molar da levana
está atrelada às suas condições de fermentação e, devido ao caráter dinâmico de
alteração constante do meio de cultura durante a fermentação, obtêm-se levana
de diferentes massas molares.
3.4
Determinação da
viscosidade
da
levana
de
B. subtilis
NATTO
A levana, obtida do B.
subtilis
Natto, na concentração de 33,1 %
em
solução aquosa, baseada no peso da levana não liofilizada, foi submetida à
avaliação da sua viscosidade. A solução do exopolissacarídeo apresentou no
spindle S 1: 546,5
(cP)
de viscosidade
com
aplicação de 50 rpm e 90,0% de
torque.
Outras viscosidades foram medidas variando-se a taxa de cisalhamento;
observando-se leituras que se situaram entre 70-90% de torque entre os spindles
S 1 e 2. A F
igura
3 mostra os resultados das medidas e conclui-se que
a
viscosidade (cP) permaneceu praticamente constante durante as diferentes
taxa
s
de cisalhamento (s
-1
); apresentando um comportamento Newtoniano (viscosidade
independente da taxa de cisalhamento). Estes resultados
corro
boram
com Arvison
et al. (2006) que estudaram regimes de concentração de soluções de levana
obtida de Bacillus sp. Neste estudo, os autores encontraram um comportamento
Newtoniano também por volta de 30%.
Figura 3
3.5
Avaliação da
Citotoxicidade
O sal de tetrazolium ou MTT (brometo de 3
-
(4,5
-
dimetiltiazol
-2-
il)
-2,5-
difenil
-
tetrazólio) desenvolve um ensaio colorimétrico quantitativo para sobrevivência e
proliferação de células de mamíferos; inferindo uma possível citotoxicidade.
Segundo Mosmann (1983) e Slater et al. (1963), o anel de tetrazólio, presente no
MTT, é clivado por enzimas desidrogenases de mitocôndrias ativas, que
somente
ocorrem em células vivas de mamíferos, formando cristais de formazana de cor
77
azul escuro intenso. A obtenção de cores azuis menos intensas podem ser
indícios da diminuição da sobrevivência e proliferação de células de mamíferos.
Os resultados do teste do MTT, para levana do B.
subtilis
NATTO, podem ser
vistos
na Figura 4; diferentes concentrações de levana foram testadas avaliando-
se a atividade mitocondrial.
De acordo com os resultados, nenhum dos tratamentos mostrou-
se
citotóxico para as células
CHO
-K1. Estes resultados são comparáveis aos
de
scritos em Kang et al. (2009) que
avali
am a citotoxicidade da levana frente
linhagens celulares de fibroblastos e queratinócitos humanos. A levana não
apresentou citotoxicidade contra estas linhagens celulares incubadas com 100
µg/mL e 1 mg/mL de levana respectivamente. Nestes estudos, os testes de
citotoxicidade também foram avaliados por MTT.
Calazans et al. (1997) também
avaliaram
a toxicidade in vivo da levana
produzida por cepas de Zymomonas mobilis.
Ne
nhuma mortalidade ou efeito
adverso foram
observados
pelos pesquisadores após administração intraperitonial
de levana, bem como não foi possível determinar a LD
50
.
Figura 4
3.6
Avaliação da mutagenicidade:
Micronúcleo com bloqueio de citocinese
Segundo
Coutand et al. (2009) e Bonassi et al. (2007), os micronúcleos são
pequenos corpos de DNA localizados no citoplasma. São resultados de
fragmentos acêntricos (originado de quebras isocromatídicas ou cromatídicas do
cromossomo) ou de disfunções no fuso mitótico. Estes danos genéticos podem
sugerir um potencial mutagênico da substância teste dada a sua genotoxicidade,
bem como se encontram entre os múltiplos passos da carcinogênese pois são
responsáveis pela ativação de proto-oncogenes e inativação de genes
su
pressores tumorais. Os resultados de mutagenicidade, para levana do B.
subtilis
NATTO,
estão apresentados
na tabela 4.
Tabela 4
De acordo com os resultados, nenhum tratamento com levana aumentou a
freqüência de micronúcleos para células CHO-K1 quando comparado com o
78
controle; não apresentando potencial mutagênico. Assim estes resultados
confirmam
que a levana é segura do ponto de vista toxicológico e mutagênico,
podendo ser utilizada como aditivo alimentar; o que já vem ocorrendo no Japão
(Kang et al., 2
009)
.
Estudos revisados demonstraram apenas a atividade antimutagênica da
levana; não sendo mencionada sua capacidade em gerar câncer. Yoon et al.
(2004) avaliaram a atividade antimutagênica da levana, produzida pela
Microbacterium laevaniformans KCTC 9732, em diversos tipos de carcinomas;
dentre eles o hepático, ovariano e o colo retal. Resultado semelhante foi
encontrado por Yoo et al. (2004) que avaliaram a atividade antitumoral da levana,
produzida pelo Zymomonas mobilis, Rahnella aquatilis
e
Microbact
erium
laevaniformans
, também sobre diversos tipos de carcinomas.
A produção de exopolissacarídeos com diversas aplicações tecn
ol
ógicas e
clínicas, em especial a levana de B. subtilis
NATTO,
apresenta
-
se
como desafio à
comunidade acadêmica que objetivam
a
obtenção de processos biotecnológicos
com altos rendimentos de produção. Pelos resultados apresentados podem-
se
verificar a alta e promissora capacidade do B. subtilis
NATTO
em produzir levana;
permitindo que pesquisas, para sua aplicação industrial, sejam viabilizadas por
processos biotecnológicos eficientes.
79
REFERÊNCIAS
Abdel
-
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194
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82
TABELA
S
Tabela
1 – Planejamento fatorial completo (3
2
) para investigar o efeito do
tempo de cultivo (X
1
) e a concentração de sacarose (X
2
) na produção de
levana por
B. subtilis
NATTO
(*)
Ensaios
Variáveis
(X
1
)
(X
2
)
Tempo
Concentração
(h) (g/L)
(Y)
Levana
(g/L)
1
12 100
12,93
2
24 100
8,7
3
36
100
34
4
12 200
50,16
5
24 200
35,24
6
36 200
7,79
7
12 300
73,79
8
24 300
82,02
9
36 300
76,69
83
Tabela 2 - Análise de variância (ANOVA) e o efeito da concentração de
sacarose (X
1
) e tempo de fermentação (X
2
) na produção de levana por
B.
subtilis
NATTO
Fator
Efeito
p
X1
(L)
-
6,13
0,73
X1
(Q)
1,11
0,97
X2
(L)
58,98
0,035
X2
(Q)
33,94
0,
31
X1X2
-
9,09
0,68
84
Tabela 3- Delineamento central composto e estrela para avaliar a produção de
levana (g/L) por
B. subtilis
NATTO
(*)
Ensaios
Variáveis
codificadas
X1 X2
Variáveis Originais
Tempo
Concentração
(h) (g/L)
Levana (g/L)
1 -
1
-1
8 2
00
17,41
2 -
1
1
8 600
13,7
3
1
-1
24 200
40
4
1
1
24
600
23
5 -1,8 0
1`36`` 4
00
4,96
6
1,8 0
30`24``
4
00
80,2
7
0
-1,8 16 40
7,8
8
0
1,8
16 760
7,6
9
(C)
0 0
16 4
00
112,09
10
(C)
0 0
16 4
00
111,1
85
Tabela 4 - Avaliação da mutagenicidade da levana, produzida por B. subtilis
NATTO,
em células
de ovário de hamster chinês (
CHO
-
K1
)
Tratamentos
Número de células
binucleadas analisadas
Freqüência de
micronúcleos (%)
Controle
1000
1,0 %
MMS
1000
5,7 %
Levana 200,0 µg/mL
1000
0,9 %
Levana 1,2 mg/mL
1000
0,9 %
Levana 2,0 mg/mL
1000
0,9 %
Controle (PBS pH 7,4); Indutor -
MMS
–
metilmetanosulfonato 2.10
-4
M
86
FIGURAS
> 50
< 50
< 0
< -50
< -100
< -150
Figu
ra
1 - Superfície de resposta mostrando os efeitos do tempo (h) e
concentração de sacarose (g/L) na produção de levana por
B. subtilis
NATTO.
87
Figura
2 – Análise dos hidrolisados de levana de B. subtilis NATTO por
cromatografia líquid
a de alta pressão em coluna de troca aniônica (HPAEC)
.
88
400
420
440
460
480
500
520
540
560
580
600
0 0,2 0,4 0,6 0,8
Taxa de cisalhamento (s-1)
Viscosidade (cP)
Figura
3 - Viscosidade de solução aquosa de levana (33,1%) de B. subtilis
NATTO
a 25°C.
89
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
Incubação pós-tratamento (24 h)
Atividade mitocondrial (%)
Controle
Indutor
Levana 400 µg/mL
Levana 320 µg/mL
Levana 240 µg/mL
Levana 160 µg/mL
Levana 80 µg/mL
Figura
4 – Citotoxicidade das células de ovário de hamster chinês (CHO-
K1)
frente a diversos
tratamentos de levana seguido por 24 h de incubação.
90
Levana no desenvolvimento de novo material polimérico: Avaliação da
permeabilidade, hidratação e análises térmicas
em filmes isolados de
Eudra
git FS30D
®
Leandro F. dos SANTOS
1*
, Edgardo A. G. PINEDA
2
,
Maria Antonia P. C.
CELLIGOI
1
,
Osvaldo
A. CAVALCANTI
3
1
Departamento de Bioquímica e Biotecnologia, Centro de Ciências Exatas, Universidade
Estadual de Londrina,
SC 86051
-
990
Londrina, Brasil
2
D
epartamento de Química, Centro de Ciências Exatas, Universidade Estadual de Maringá,
SC 87020
-
900 Maringá, Brasil
3
Departamento de Farmácia e Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade
Estadual de Maringá, SC 87020
-
900 Maringá, Brasil
*
Au
tor para correspondência: [email protected]
91
RESUMO
A levana é um polissacarídeo extracelular constituída predominantemente por resíduos de D-
frutose
, unidos por ligações glicosídicas ß-
(2
6)
;
apresenta
ndo
-
se
como prebiótico
.
Filmes cólon-
específicos, a base de Eudragit FS 30D, podem ter maior controle na
liberação
do ativo
quando
aditivados de um prebiótico; melhorando a terapêutica de patologias colônicas. Este trabalho teve
o objetivo de apresentar a levana como candidata na elaboração de um novo material polimérico
conjuntamente com o Eudragit FS 30D
®
. Filmes de Eudragit FS 30D, aditivados com levana, foram
confeccionados por “casting process” e em seguidas caracterizados quanto à
permeabilidade,
hidratação,
calorimetria diferencial de varredura
(DSC)
e
termogravimetria
(TGA)
.
A levana
aumentou a permeabilidade dos filmes (p<0,001) entretanto não influenciou no índice de
in
tumescimento das formulações; apresentando p>0,05. As análises térmicas dos filmes indicaram
a
tempera
tura de transiç
ão
vítrea aproximada de 47°C e
deco
mposição
em torno de 400°C.
Os
resultados deste estudo indicaram que o exopolissacarídeo levana, produzido pelo
B.
subtilis
(NATTO), quando incorporado ao Eudragit FS 30D
®
na formação de filmes isolados, fo
rneceu
subsídios iniciais promissores quanto à perspectiva de aplicação deste novo material no
desenvolvimento de sistema voltado à liberação cólon
-
específica.
Palavras
-
chave:
Levana, filmes
poliméricos
,
liberação modificada, Eudragit FS 30D.
92
INTRODUÇÃO
Nesta última década inúmeras patologias oriundas do padrão de vida moderno,
especialmente
aquelas
proveniente
s da alimentação industrializada, têm ganhado interesse na
pesquisa médica e
farmacêu
tica. Estas doenças têm fortemente acometido o segmento distal do
trato gastrintestinal, o cólon.
Dentre
estas
patologias
,
destaca
m-
se a
síndrome do intestino irritável,
câncer cólon-retal, doença de Crohn e colite ulcerativa (Jain et al., 2007; Friend, 2005). P
olímeros
têm sido desenvolvidos para o revestimento de comprimidos ou cápsulas objetivando a liberaç
ão
do fármaco especificamente neste local de ação
.
Dentre os polímeros desenvolvidos
está
o Eudragit FS30D
®
que é um copolímero aniônico
composto de metil acrilato, metilmetacrilato e ácido metacrílico que apresenta propriedades de
dissolução em ambiente ligeiramente neutro (pH= 6,8) o que é encontrado no intestino grosso
(Beckert, 2000)
.
Esse polímero tem sido aplicado em sistemas de revestimentos
farmacêuticos
destinados à via oral, e constitui importante estratégia para a liberação cólon-
específica,
fundamentada nas variações de pH que o trato gastrintestinal possui em condições fisiológicas
normais
(Beckert, 2000; Gupta et al., 2001)
.
Adicionar
mecanismos adicionais, além da pH-dependência, poderia diminuir as falhas
destes sistemas cólon-
específicos
; haja vista que certas patologias como a colite ulcerativa podem
tornar o cólon mais ácido
(Gupta et al., 2001
; Nungent et al., 2001
).
A enzimo - especificidade é um dos possíveis mecanismos a serem convergidos para os
filmes
cólon
-
especifico
s; esta especificidade é dada por uma microflora
colônica
única
,
complexa
,
anaeróbica e
produtora
de enzimas
glucosidases
(Vardakou et al., 2007). A susceptibilidade
enzimática, que certos substratos possuem frente à microflora única do cólon,
oferece
imensuráveis expectativas de associação, num único sistema, de mecanismos enzimo e pH-
dependente
(Quintanilha et al., 2007; Akhgari et al., 2006)
.
Dentre os atuais substratos
,
com potencial
para conv
ergir a enzimo
-
especificidade para um
revestimento cólon-
específico
, estão os polissacarídeos microbianos extracelulares (EPS).
Estes
EPS apresentam-se como potenciais
alternativas
aos polissacarídeos vegetais
tradicionalmente
utilizados na aditivação de filmes cólon-específicos, haja vista o alto rendimento e a fácil
bioseparação que apresentam aos processos extrativos vegetais (Oliveira et al., 2007)
.
Os EPS
são produzidos por diferentes microrganismos e são conhecidos pelo seu efeito
pre
biótico;
onde
sof
rem
degradação enzimática
pela microflora colônica
(Rastall et al., 2002).
A levana, exopolissacarídeo constituída predominantemente por resíduos de D-
frutose
unidos por ligações glico
sídicas
ß-
(2
6); podendo ainda apresentar pontos de ramificações ß-
(2
1) e um resíduo de glucose terminal (Paula et al., 2008), apresenta-
se
como candidata à
aditivação de filmes cólon específicos
dada ao
seu efeito prebiótico
.
93
A liberação controlada do fármaco no c
ólon
oferece
ao paciente um melhor gerenciamento
na liberação do
medicamento
; melhorando a resposta terapêutica de substâncias
farmacologicamente ativas, bem como a redução dos seus efeitos adversos (Oliveira e Cavalcanti,
2007
).
Outras substâncias, além
dos
fármacos
utilizados no tratamento de doenças colônicas,
se
beneficiarão da liberação cólon-
específica
como o hormônio do crescimento, insulina, endorfinas e
calcitonina. Estas substâncias não suportam o ambiente inóspito das regiões proximais do trato
gastrointestinal; estômago e intestino delgado fazendo do cólon um local ideal para sua absorção
(Katsuma et al., 2006)
.
Sendo assim, a
levana
de
B. subtilis
NATTO
que apresenta susceptibilidade às enzimas da
flora
colônica se torna uma
candi
data na elaboração de um novo material polimérico,
conjuntamente com o Eudragit FS 30D
®
, para o desenvolvimento de um sistema enzimo e pH-
dependente para liberação de substâncias farmacologicamente ativas
.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Eudragit FS30D
®
(copolímero aniônico composto de metil acrilato, metilmetacrilato e ácido
metacrílico
, Evonik Industries
®
, Pharma Polymers, São Paulo, Brasil) e levana obtida do
B.
subtilis
isolado no alimento japonês Natto (Departamento de Bioquímica e Biotecnologia da U
niversidade
Estadual de Londrina, Brasil). Todos os demais materiais utilizados nos ensaios foram de grau
analítico.
Produção da levana
As fermentações, para obtenção da levana
do
B. subtilis
(NATTO)
, foram realizadas
em erlenmeyers de 2L com volume de trabalho de 500 mL nas seguintes condições: 16 h, 37°C e
150 rpm
no
seguinte
meio
em g/L; sacarose 400,0; extrato de levedura 2,0; KH
2
PO
4
1,0; (NH
4
)
2
SO
4
3,0; MgSO
4
.7H
2
O 0,06; MnSO
4
0,02 e água destilada.
Preparação dos filmes
Os filmes foram obtidos a partir de dispersões poliméricas de base aquosa preparadas em
quatro diferentes concentrações, fazendo variar a concentração do pseudolátex e/ou da levana,
permanecendo sempre a massa polimérica final de 4% (p/v) (Bunhak et al., 2007). As proporções
testada
s foram 100:0 (Eudragit FS30D
®
: Levana), 95:05, 90:10 e 80:20. Foi utilizado ainda, como
agente deslizante, uma dispersão de 5% de monoestearato de glicerila
(MEG)
e 2% de tween 80
(Ibekwe et al., 2006)
.
As dispersões contendo inicialmente o Eudragit FS30D
®
acrescidas do
94
agente deslizante foram deixadas sob agitação por um período de 30 minutos a 25 ± 2,0 °C. Após
completa
homogeneização
, foram adicionadas as soluções de levana (5, 10 e 20%
respectivamente), as quais foram deixadas sob agitação por mais 60
min
a 25 ± 2,0 °C. Durante
todo o processo de homogeneização foi utilizada bomba a vácuo visando evitar a incorporação de
ar e formação de bolhas às misturas poliméricas.
10 mL
d
as diferentes associações foram vertidas
sobre moldes de teflon®, previamente demarcados e fixados numa placa de nylon com uma área
de 28,27 cm
2
, devidamente nivelada e levada ao aquecimento em estufa a 50 °C por 24 h;
condições de tempo e temperatura mínima para a formação de filmes isolados adotados nesta
investigação.
Em seguida, foi realizada análise macroscópica dos filmes buscando selecionar
amostras dos materiais com ausência de rachaduras, bolhas de ar ou quaisquer imperfeições que
pudessem
interferir nos ensaios
. Concomitantemente, foi realizada a determinação das espessura
s
dos filmes isolados (5 amostras para cada formulação) usando micrômetro (Mitutoyo®) com
sensibilidade de 0,01 mm em cinco pontos aleatórios da superfície. As membranas selecionadas
foram acondicionadas em
dissecador
até o momento de realizar os testes po
steriores
(Cavalcanti
et al., 2002)
.
Determinação da t
ransmissão de vapor d´água
O estudo de transmissão de vapor d´água (
TVA
) foi desenvolvido em conformidade com
método “B” da ASTM
(American
Society for Testing and Materials)
designado E96
-
66. Inicial
mente,
no interior de cada cúpula de permeabilidade (modelo Payne permeability
cup,
Bélgica) foram
adicionados 10,0 mL de água destilada. Em seguida, os filmes candidatos à investigação, com
área de 9,62 cm2, foram fixados às cúpulas individualmente. O con
junto (cúpula + água destilada +
amostra filme) foi pesado no tempo zero e armazenado em
dissecador
contendo sílica-gel. As
cúpulas, em triplicata, para cada filme, foram pesadas nos intervalos de 0, 24, 48, 72, 96 e 120 h. A
cada intervalo de tempo pré-
es
tabelecido, a sílica-gel era trocada por outra desidratada (50 °C/24
h). A diferença de massa das cúpulas em cada intervalo de tempo foi registrada e aplicada na
Equação [
1
] para calcular a taxa de transmissão de vapor d’água através dos filmes isolados.
Onde,
g
é a perda de massa em gramas,
t
é
tempo em
h
e a a área do filme em m
2
.
Determinação do índice de intumescimento
Os filmes das diferentes associações foram minuciosamente cortados com tesoura cirúrgica
(modelo Professional F/1) em aproximada
mente
1,0 cm
2
, sendo em seguida distribuídos no interior
de placas de Petri devidamente identificadas. Posteriormente, as placas de Petri foram c
olocadas
em estufa a 50 °C, por
aproximadamente
24 h, atingindo massa constante. Após este tempo, as
TVA = g x 24 (1)
t x a
95
placas for
am retiradas e mantidas em
dissecadores
durante a realização
do experimento. Amostras
dos filmes secos representantes das diferentes composições foram pesadas em balança analítica,
e imediatamente imersas em recipiente por diferentes intervalos de tempo à
temperatura ambiente,
contendo
Fluído de Simulação Gástrica (FSG)
preparado
conforme a 23ª ed. Farmacopéia dos
Estados Unidos da
América
, sem a presença de enzimas. Em cada intervalo de tempo pré-
estabelecido às amostras (em triplicata) foram removidas dos meios com auxílio de pinça e
cuidadosamente enxugadas, entre duas folhas de papel de filtro, e repesadas retirando o excesso
de fluído. Foram retiradas amostras nos intervalos de 1, 10, 30, 60, 75, 90, 105 e 120 min de
imersão
. Para o cálculo do índice de intumescimento (Ii%) foi utilizada a Equação [2] (Blanchon et
al., 1991)
a seguir:
Onde
Pi
é o peso do filme intumescido, no tempo correspondente, e
Ps
é o peso do filme seco.
Calorimetria diferencial de varredura
A calorimetria diferencial de varredura foi realizada utilizando-se 6 mg das diferentes
associações com um calorímetro Netzch DSC-204 em uma atmosfera com fluxo de nitrogênio
gasoso de 10 mL/min. As amostras foram aprisionadas em cadinho de alumínio com tampa furada
e submetidas a um programa de aquecimento controlado; 0-
600°C
a uma taxa de aquecimento de
10°C por minuto. Antes disso foi aplicada uma isoterma de 100°C por 15 min objetivando a perda
total de umidade. A diferença de fluxo de calor da amostra e do padrão foi controlada, ve
rificando
-
se a perda ou ganho de energia da amostra pela variação da entalpia esboçada em gráficos por
picos endotérmicos e exotérmicos
(Cavalcanti et al., 2004)
.
Análise termogravimétrica
Foram conduzidos experimentos para investigar a estabilidade térmica, por
te
r
mogravimetria
, das diferentes associações candidatas, utilizando-se um aparelho Netzsch TGA-
204. Foram utilizadas aproximadamente 10 mg de amostra em uma atmosfera de fluxo de
nitrogênio gasoso de 10 mL/min. A faixa de temperatura foi de 0-6
00°C
a uma taxa de
aquecimento de 10°C por minuto
(Cavalcanti et al., 2004)
.
Análise estatística
As análises estatísticas foram usadas para determinar o nível de significância existente
entre os valores obtidos em todos os ensaios envolvendo os filmes. Estas análises foram
Ii%
=
Pi
-
Ps
x 100 (2
)
Ps
96
realizadas com ajuda do programa
GraphPad Prism
®
(versão 2.01, 1996). Os diferentes resultados
referentes aos coeficientes de Ii% e TVA, obtidos em FSG, foram inicialmente avaliados usando
análise de variância (ANOVA), sendo os resultados considerados significativos quando p<0,05.
Quando o conjunto desses valores forneceu parâmetros significativos, foi realizada aplicação das
médias dos dados obtidos no teste de múltipla comparação de Tukey, visando comparar o papel
das diferentes composições poliméricas. Também sendo considerados significativos os valores
registrados para p<0,05
(Cavalcanti et al
.
,
2002;
Cavalcanti et al., 2004).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Caracterização Morfológica Macroscópica e determinação da espessura dos filmes
A caracterização morfológica macroscópica dos filmes, bem como a determinação da sua
espessura, são etapas críticas para se garantir a reprodutibilidade dos ensaios propostos (
Oliveira
e
Cavalcanti
, 2007; Cavalcanti
et al., 2002).
Os filmes obtidos por evaporação (casting process) em placas de Teflon
®
, a partir de
dispersões poliméricas de base aquosa, não apresentaram rachaduras ou bolhas de ar, bem como
não apresentaram evidências de incompatibilidades entre o polímero sintético Eudragit FS30D
®
e
a l
evana.
A compatibilidade que certos polissacarídeos possuem, frente à polímeros
polimetacrilatados, são amplamente divulgados pela literatura científica. Oliveira e Cavalcanti
(2007) verificaram que não houve incompatibilidades entre a-
gluco
-
oligossacaríd
eo e o polímero
polimetacrilatado
utilizado.
Cavalcanti et al. (2002) avaliaram a permeabilidade e hidratação de
filmes polimetacrilatados aditivados com o polissacarídeo inulina. Não houve incompatibilidades
entre os polímeros polimetacrilatados e a inuli
na; quimicamente m
uito semelhante à levana (
Jain
et
al.
, 2007). Pelos resultados é possível sugerir que a levana não apresen
ta
incompatibilidade com o
polímero polimetacrilatado
Eudragit FS30D; reforçando a sua aplicabilidade em filmes isolados.
Os filmes obtidos, com a adição de levana, apresentaram homogeneidade na espessura
entre as várias formulações
testadas
(p=0,114)
. Entretanto, o aumento da concentração da levana
diminuiu a transparência e a flexibilidade dos filmes
isolados.
Bunhak et al. (2007) ta
mbém
obtiveram diminuição da flexibilidade e transparência conforme aumento do sulfato de condroitina
nos seus filmes polimetacrilatados; embora neste caso a flexibilidade e transparência ainda
permaneceram adequadas.
Transmissão de vapor d`água
97
A transmissão de vapor d`água (TVA) avalia a hidrofilia dos polímeros presentes nos
filmes, bem como oferece um índice na qual é possível relacionar a mobilidade da matriz
polimérica frente às moléculas de vapor de água (MONDAL e YONG, 2006). Os resultados revela
m
que a levana alterou a permeabilidade dos filmes. O ensaio de TVA, para os filmes Eudragit
FS30D
®
(EF) e levana (L), pode ser visto na Figura 1. A levana aumentou a permeabilidade dos
filmes (p<0,001), embora não haja diferença estatística entre as formulações EFL 95:05 e EFL
90:10 (p=0,069); e sim uma leve tendência de TVA maior no EFL 90:10. O índice de TVA foi
aumentado consideravelmente na formulação EFL 80:20 (p<0,001).
Estes resultados são semelhantes aos de Bunhak et. al (2007) que analisaram
a
transmissão de vapor de água de filmes isolados polimetacrilatados aditivados com o
polissacarídeo sulfato de condroitina. Os autores encontraram que o aumento da concentração do
polissacarídeo gerou aumento proporcional na taxa de transmissão de vapor d`água; fenômeno
que pôde ser explicado pelo aumento da hidrofilicidade do sistema, causado pela adição do
polissacarídeo. A levana, assim como o sulfato de condroitina, apresenta grande quantidade de
grupos funcionais hidroxilas (OH
-
) que são capazes de aumen
tar
a hidrofilia do sistema e
demonstrar
comportamento semelhante. Os índices de TVA foram proporcionais à concentração
da levana nos filmes isolados.
Figura 1
Determinação do Índice de Intumescimento (Ii%)
O intumescimento permite avaliar a hidrofilia dos polímeros constituintes do filme isolado
através do seu comportamento de hidratação inferida pelo índice de intumescimento. Segundo
Oliveira e Cavalcanti
(200
7) uma hidrofilia moderada, avaliada por intumescimento em fluídos
fisiológicos, fornece uma forte expectativa da garantia do acesso ao cólon das bactérias existentes
na porção distal do TGI. Neste estudo aplicou-se o índice de intumescimento de filmes isolados
polimetacrilatados, aditivados com a-
gluco
-oligossacarídeo, para se avaliar a hidrofilia do sistema.
Os índices de intumescimento, para as formulações EFL, podem ser vistas na Tabela 1. Os
desvios padrões foram considerados adequados; haja vista que estudos anteriores apresentaram
desvios padrões maiores que o nosso (>20) neste mesmo tipo de metodologia (AKHGARI et
al.,
2006). O Eudragit FS30D
®
, devido ao seu comportamento pH-dependente, não foi imerso em FSI
(BECKERT, 2000).
T
abela 1
Os resultados demonstram que a levana não influenciou no índice de intumescimento das
formulações EFL; apresentando p>0,05. Estes resultados foram comparáveis com Akhgari et al.
(2006). Esses pesquisadores encontraram que a inulina, nas concentrações 10-
20
-30%, não
influenciou o intumescimento de filmes isolados contendo Eudragit FS30D
®
, o mesmo polímero
sintétic
o utilizado neste modelo.
98
Análises térmicas
A calorimetria diferencial de varredura
(DSC)
permite a análise do perfil energético das
amostras num intervalo específico de temperatura. Estudos costumam evidenciar eventos
endotérmicos largos (35°C-
160°C
) atribuídos à perda de água, bem como eventos endotérmicos
referentes à sua fusão; eventos endo e exotérmicos também podem corresponder à decomposição
térmica dos produtos (CAVALCANTI et al., 2004). As curvas de DSC, para os filmes a base de
Eudragit FS30
D
®
, podem ser vistos na
F
igura
2
respectivamente.
Figura 2
Os resultados, das curvas de DSC para EFL, indicaram apenas uma temperatura de
transição vítrea (tgmáx ~ 47°C) indicando compatibilidade entre os materiais, bem como a
miscibilidade da mistura polimérica em todas as formulações. Esses resultados são compatíveis
com as especificações da Evonik Industries que indicaram, como tg do Eudragit FS30D, a
temperatura aproximada de 48°C. Também não houve diferenças significativas entre a formulação
controle
e as outras formulações aditivadas com levana (DP=1,51); inferindo-se que o
exopolissacarídeo não influenciou a transição vítrea. Entretanto as formulações EFL 80:20
apresentaram, logo após a transição vítrea, um pico exotérmico referente a uma relaxação
(td=120,6°C). Segundo
Sakamoto
et al. (2003) o pico de relaxação, que está associada à
temperatura de transição, é devida a uma movimentação das cadeias poliméricas ocasionando
uma assimetria na distribuição de cargas eletrônicas em torno de suas moléculas; ou devido ainda
à presença de cargas espaciais.
O pico endotérmico da decomposição não foi influenciado pela levana, nas formulações
EFL; ficando em torno de 400°C. Estes resultados estão em similitude com outros estudos
.
Rabito
(2009) analisou por DSC filmes isolados, a base de Eudragit FS30D, aditivados com a
arabinoxilana. Os resultados demonstraram que tanto os filmes EF 100%, como em todas as
concentrações de arabinoxilanas utilizadas, o pico da decomposição também foi observado em
torno de 400°C; o
plastificante e a concentração utilizada foram as mesmas.
Os perfis termogravimétricos
(TGA)
das formulações EFL
podem ser vistos na
F
igura
3. As
curvas termogravimétricas derivadas
(DTG)
podem ser verificadas
na
Figura 4. As análises
termogravimétricas
avaliam a estabilidade térmica dos compostos (Cavalcanti et al., 2004). Ainda
segundo Cavalcanti
et
al. (2004
), a derivada das curvas de TGA facilita a observação de diferentes
estágios de degradação. As curvas de TGA e DTG, para as formulações EFL, indica
ram perdas de
massa entre 405,9°C e 419,6°C; confirmando altas temperaturas de degradação. Em média, 90,8%
da massa foi perdida entre 300 e 450°C. Não foram observadas diferenças significativas na perda
de massa, entre as diferentes formulações contendo Eudragit FS30D, para temperaturas de até
100°C (EF 99,43±0,62; EFL95:05 99,33±0,68; EFL90:10 98,77±1,07; EFL80:20 99,06±0,88). A
levana aumentou proporcionalmente, conforme participação crescente nas diferentes formulações,
99
a perda de massa entre 100 e 350°C. As formulações, com maiores concentrações de levana,
apresentaram menores perdas de massa durante o ensaio; 97,52% e 97,89% para EFL 90:10 e
80:20 respectivamente,
e 99,40% e 99,15% para EF e EFL 95:05.
Figura 3
Figura 4
Estes resultados foram considerados positivos haja vista que o novo material polimérico,
aditivado com levana, apresentou altas temperaturas de degradação; bem como a levana não
influenciou na estabilidade térmica do material até 100°C.
Conclusões
A aplicação de polissacarídeos, principalmente aqueles produzidos por microrganismos,
permanece como grande desafio na área de excipientes farmacêuticos. Os resultados deste
estudo indicaram que o exopolissacarídeo levana, produzido pelo
B.
subtilis
NATTO
, quando
incorporado ao Eudragit FS 30D
®
na formação de filmes isolados, forneceu subsídios iniciais
promissores quanto à perspectiva de aplicação deste novo material no desenvolvimento de
sistema voltado à liberação cólon
-
específica.
A levana e o Eudragit FS 30D foram quimicamente compatíveis; não apresentando
separação de fases durante a fabricação do filme. A mobilidade das cadeias poliméricas do
Eudragit FS 30 D foi aumentada consideravelmente nas formulações EFL 80:20 pela ação da
levana; sendo consideradas moderadas nas formulações EFL 95:05 e EFL 90:10. Os filmes
também apresentaram alta estabilidade térmica (até 100°C).
Estes resultados nos permitem sugerir que os filmes isolados produzidos neste trabalho
poderão, após estudos complementares, serem utilizados para revestimento de comprimidos ou
cápsulas para liberação cólon
-
específica de fármacos.
100
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102
TABELAS
Tabela
1 - Índice de intumescimento das formulações EFL em fluído de
simulação gástrico (média dos dados ± S.D.; n=3
)
Formulação
Índice de intumescimento, Ii (%)
FSG
EF 100%
33,71
± 7,57
EFL 95:0
5
42,10 ± 7,81
EFL 90:10
33,05 ± 3,4
EFL 80:20
32,27 ± 1,07
103
FIGURAS
Figura
1 - Transmissão do vapor de água dos filmes nas diferentes
associações
–
Eudragit FS30D e levana (n=3)
de
B. subtilis
NATTO.
104
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Temperature (°C)
Heat Flux
Endo Exo
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura
2 -
Curvas da calorimetria diferencial de varredura
das diferentes
associações Eudragit FS 30D: Levana a) EF100% b) EFL 95:05 c) EFL 90:10
d) EFL 80:20
Tm = 400°C
Tg
= 47°C
Td=121°C
105
0
100 200 300 400 500 600
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
TGA (%)
Temperatura (°C)
EF 100
EFL 95:05
EFL 90:10
EFL 80:20
Figura
3 - C
urvas de
termogravimetria
dos filmes isolados Eudragit FS30D
®
aditivados com levana
de
B. subtilis
NATTO.
106
0
100
200 300 400 500 600
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
DTG (%°C
-1
)
Temperatura (°C)
406°C
(a)
0
100 200 300 400 500
600
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
DTG (%°C
-1
)
Temperatura (°C)
418°C
(b)
0
100
200 300 400
500
600
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
DTG (%°C
-1
)
Temperatura (°C)
418°C
(c)
0
100
200 300 400
500 600
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
DTG (%°C
-1
)
Temperatura (°C)
419°C
(d)
Figura
4 -
Curvas term
ogravimétricas derivadas
das diferentes associações de
filmes Eudragit FS 30 D: Levana
: a) EF 100, b)EFL 95:05, c) EFL 90:10 e d)
EFL 80:20
.
107
Avaliação da permeabilidade,
hidratação
e análises térmicas
d
e filmes
isolados de E
udragit RS 30D
®
aditivados
com levana
de
Bacillus subtilis
NATTO
. Material candidato ao revestimento farmacêutico.
Leandro F. dos SANTOS
1*
, Edgardo A. G. PINEDA
2
,
Maria Antonia P. C.
CELLIGOI
1
,
Osvaldo
A. CAVALCANTI
3
1
Departamento de Bioquímica e Biotecnologia, Centro de Ciências Exatas, Universidade
Estadual de Londrina,
SC 86051
-
990
Londrina, Brasil
2
Departamento de Química, Centro de Ciências Exatas, Universidade Estadual de Maringá,
SC 87020
-
900 Maringá, Brasil
3
Departamento de Farmácia e Farmacologia, Centro de
Ciências Biológicas, Universidade
Estadual de Maringá, SC 87020
-
900 Maringá, Brasil
*
Autor para correspondência: [email protected]
108
RESUMO
Membranas metacrilatadas tempo-dependentes, contempladas com a aditivação de prebiót
icos
como a levana, oferecem destacada liberação controlada cólon-
espec
ífica
.
Estas novas barreiras,
com uma cinética de liberação diferenciada, apresentam combinação de mecanismos tempo e
enzimo
-dependentes; sendo uma nova alternativa de revestimento para tratamentos de doenças
colônicas
. Este trabalho teve o objetivo de apresentar a levana, de B. subtilis
NATTO,
como
candidata na elaboração de um novo material polimérico conjuntamente com o Eudragit RS 30D
®
.
Filmes de Eudragit RS 30D, aditivados com levana, forma confeccionados por “casting process” e
em seguida caracterizados quanto à permeabilidade, hidratação, calorimetria diferencial de
varredura (DSC) e termogravimetria (TGA). As formulações Eudragit RS 30D:Levana (
ERL
)
95:05
e ERL 80:20 tiveram um aumento da transmissão de vapor d`água (
TVA
) condizente ao aumento
da participação do exopolissacarídeo nos filmes isolados; p<0,001. A levana influenciou no índice
de intumescimento das formulações ERL 95:05 e 90:10 em fluído de simulação gástrica (
FSG
)
;
se
ndo relativamente proporcional a participação do exopolissacarídeo no filme.
Em
fluído de
simulação intestinal (
FSI
), apenas a formulação ERL 90:10 apresentou significativamente diferente
ao controle (p<0,001). Nas formulações ER 100% e ERL 80:20, o intume
scimento foi maior em FSI
do que em FSG; respectivamente p=0,028 e p=0,0012. Em média, 94,08% da massa foi perdida
entre 150°C e 450°C; período de maior degradação térmica. O novo material polimérico
apresentou
-
se promissor para revestimento de fármacos em
que se deseja liberação colônica.
Palavras
-
chave:
Levana, filmes
poliméricos
,
liberação modificada,
Eudragit R
S 30D
.
109
INTRODUÇÃO
Desenvolver “medicamentos inteligentes” que saibam dirigir-se às regiões específicas do
organismo, liberando ativo exatamente onde este deverá atuar, evitando distribuição aleatória,
aliado a extinção dos longos esquemas posológicos, constitui grande desafio para pesquisadores
acadêmicos e industriais.
Dentre as pesquisas envolvendo esses sistemas terapêuticos, destacam-se formulações
destinadas à liberação modificada de fármacos as quais oferecem efetivo gerenciamento na
disponibilização dos fármacos, seja temporal e/ou espacial. Tais sistemas melhoram a resposta
terapêutica de substâncias farmacologicamente ativas, bem como reduzem os seus efeitos
adversos
(Sinha et al., 2004)
.
A Biotecnologia tem contribuído neste campo de pesquisa aonde exopolissacarídeos, por
exemplo, têm sido aplicados em implantes subcutâneos, matrizes de comprimido e hidrogéis
(
Pit
arresi
et al.,
2007
). Estes exopolissacarídeos são polímeros ou carboidratos amplamente
produzidos por diferentes microrganismos
com
potencial de aplicação não só junto ao mercado
industrial farmacêutico, como em diversos segmentos industriais, pois apresentam grande
produtividade e são de fácil purificação quando comparados a compostos de origem vegetal
(Oliveira et al., 2007)
.
Embora seja
notória
a potencial aplicabilidade dos exopolissacarídeos neste contexto,
pouco se tem estudado sobre sua inserção direta em dispositivo específico. Filmes poliméricos
destinados à aplicação no processo de revestimento de sólidos orais para liberação de fármacos,
em geral, apresentam na sua composição polímero pH - dependente ou tempo -
dependente,
podendo contemplar a presença de substrato vulnerável especificamente pela microflora colônica
auxiliando na liberação do fármaco no cólon.
Mecanismo pH ou tempo –
depende
nte aliado ao enzimo-dependente são
estratégias
que
podem auxiliar no tratamento de inúmeras patologias existentes no cólon. Dentre as patologias,
que podem se beneficiar pelo uso destes materiais poliméricos, estão a síndrome do intestino
irritável, câncer cólon
-
retal, doença de Crohn e colite ulcerativa
(Cavalcanti et al., 2002)
.
As formulações farmacêuticas disponíveis atualmente para tratamento dessas patologias
envolvem sistemas orais pH dependentes ou enemas. Estes tratamentos tradicionais não são sítio
– específicos e podem falhar com alta freqüência, prioritariamente devido às variações das
condições fisiológicas, aliado a restrição do acesso do fármaco à região lesada.
A levana é um exopolissacarídeo constituído predominantemente por resíduos de D
-
frutose
que apresenta susceptibilidade específica às enzimas do ecossistema colônico e apresenta-
se
como candidata a aditivação de filmes poliméricos tempo-dependente como o Eudragit RS 30D
(De Paula et al., 2008). O presente trabalho teve por objetivo adicionar a levana, polissacarídeo
extracelular produzido pelo
B.
subtilis
NATTO, na fabricação de filmes poliméricos isolados do
110
Eudragit RS 30D
®
, avaliando a influência da levana na permeabilidade,
hidratação
e análises
térmicas
destes filmes.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Eudragit RS
30D
®
(copolímero
metacrilato de amônio, tipo B, USP/NF/R
öm
Pharma, Darmst
adt
-
Alemanha
) e levana obtida do
B.
subtilis
isolado do alimento japonês Natto (Departamento de
Bioquímica e Biotecnologia da Universidade Estadual de Londrina, Brasil). Todos os demais
materiais utilizados nos ensaios foram de grau analítico.
Produção
da levana
As fermentações, para obtenção da levana
do
B. subtilis
(NATTO)
, foram realizadas
em erlenmeyers de 2L com volume de trabalho de 500 mL nas seguintes condições: 16 h, 37°C e
150 rpm
no
seguinte
meio
em g/L; sacarose 400,0; extrato de levedura 2,
0; KH
2
PO
4
1,0; (NH
4
)
2
SO
4
3,0; MgSO
4
.7H
2
O 0,06; MnSO
4
0,02 e água destilada.
Preparação dos filmes
Os filmes foram obtidos a partir de dispersões poliméricas de base aquosa preparadas em
quatro diferentes concentrações, fazendo variar a concentração do pseudolátex e/ou da levana,
permanecendo sempre a massa polimérica final de 4% (p/v) (Bunhak et al., 2007). As proporções
testadas foram 100:0 (Eudragit RS
30D
®
: Levana), 95:05, 90:10 e 80:20. Para obtenção das
películas foi usado o agente plastificante citrato de trietila a 20% (Abbaspour et al., 2008).
As
dispersões contendo inicialmente o Eudragit R
S30D
®
acrescidas do agente
plastificante
foram
deixadas sob agitação por um período de 30 minutos em temperatura ambiente (TA=25°C ± 2,0).
Após completa homogeneização, seguindo as proporções citadas anteriormente, foram
adicionadas quantidades variáveis da solução de levana (5, 10 e 20% respectivamente), as quais
foram deixadas sob agitação por mais 60 min em TA. Durante todo o processo de
homogeneização foi utilizada bomba a vácuo visando evitar a incorporação de ar e formação de
bolhas às misturas poliméricas. Após completa homogeneização, as diferentes associações foram
amostradas e vertidas no volume de 10,0 mL sobre moldes de teflon®, previamente demarcados e
fixados numa placa de nylon com uma área de 28,27 cm
2
, devidamente nivelada e levada ao
aquecimento em estufa a 45 °C por 24 h; condições de tempo e temperatura mínima para a
formação de filmes isolados adotados nesta investigação. Transcorridas às 24 h os filmes foram
cuidadosamente removidos do substrato. Em seguida, foi realizada análise macroscópica dos
filmes buscando selecionar amostras dos materiais com ausência de rachaduras, bolhas de ar ou
quaisquer imperfeições que pudessem interferir nos ensaios propostos. Concomitantemente, foi
111
realizada a determinação das espessuras dos filmes isolados (5 amostras para cada formulação)
usando micrômetro (Mitutoyo®) com sensibilidade de 0,01 mm em cinco pontos aleatórios da
superfície. As membranas selecionadas foram acondicionadas em
dissecador
até o momento de
realizar os testes posteriores (Cavalcanti et al., 2002).
Determinação da transmissão de vapor d´água (TVA)
O estudo de TVA foi desenvolvido em conformidade com método “B” da ASTM
(American
Society
for Testing and Materials) designado E96-66. Inicialmente, no interior de cada cúpula de
permeabilidade (modelo Payne permeability
cup,
Bélgica) foram adicionados 10,0 mL de água
destilada. Em seguida, os filmes candidatos à investigação, com área de 9,62 cm2, foram fixados
às cúpulas individualmente. O conjunto (cúpula + água destilada + amostra filme) foi pesado no
tempo zero e armazenado em
dissecador
contendo sílica-gel. As cúpulas, em triplicata, para cada
filme, foram pesadas nos intervalos de 0, 24, 48, 72, 96 e 120 h. A cada intervalo de tempo pré-
estabelecido, a sílica-gel era trocada por outra desidratada (50 °C/24 h). A diferença de massa das
cúpulas em cada intervalo de tempo foi registrada e aplicada na Equação [1] para calcular a taxa
de transm
issão de vapor d’água através dos filmes isolados.
Onde,
g
é a perda de massa em gramas,
t
é tempo em
h
e a a área do filme em m
2
.
Determinação do índice de intumescimento
Os filmes das diferentes associações foram minuciosamente cortados com tesoura cirúrgica
(modelo Professional F/1) em aproximadamente 1,0 cm
2
, sendo em seguida distribuídos no interior
de placas de Petri devidamente identificadas. Posteriormente, as placas de Petri foram colocadas
em estufa a 50 °C, por aproximadamente 24 h, atingindo massa constante. Após este tempo, as
placas foram retiradas e mantidas em
dissecadores
durante a realização do experimento. Amostras
dos filmes secos representantes das diferentes composições foram pesadas em balança analítica,
e imediatamente imersas
em recipiente por diferentes intervalos de tempo à temperatura ambiente,
contendo Fluído de Simulação Gástrica (FSG) e Fluído de Simulação Intestinal (FSI)
preparado
conforme a 23ª ed. Farmacopéia dos Estados Unidos da América, sem a presença de enzimas.
Em
cada intervalo de tempo pré-estabelecido às amostras (em triplicata) foram removidas dos meios
com auxílio de pinça e cuidadosamente enxugadas, entre duas folhas de papel de filtro, e
repesadas retirando o excesso de fluído. Foram retiradas amostras nos intervalos de 1, 10, 30, 60,
75, 90, 105 e 120 min de imersão. Para o cálculo do índice de intumescimento (Ii%) foi utilizada a
Equação [2]
(Blanchon et al., 1991) a seguir:
TVA = g x 24
(1)
t x a
112
Onde
Pi
é o peso do filme intumescido, no tempo correspondente, e
Ps
é o
peso do filme seco.
Calorimetria diferencial de varredura
A calorimetria diferencial de varredura foi realizada utilizando-se 6 mg das diferentes
associações com um calorímetro Netzch DSC-204 em uma atmosfera com fluxo de nitrogênio
gasoso de 10 mL/min. As amostras foram aprisionadas em cadinho de alumínio com tampa furada
e submetidas a um programa de aquecimento controlado; 0-600°C à uma taxa de aquecimento de
10°C por minuto. Antes disso foi aplicada uma isoterma de 100°C por 15 min objetivando a per
da
total de umidade. A diferença de fluxo de calor da amostra
foi controlada, verificando
-
se a perda ou
ganho de energia da amostra pela variação da entalpia esboçada em gráficos por picos
endotérmicos e exotérmicos (Cavalcanti et al., 2004).
Análise ter
mogravimétrica
Foram conduzidos experimentos para investigar a estabilidade térmica, por
temogravimetria, das diferentes associações candidatas, utilizando-se um aparelho Netzsch TGA-
204. Foram utilizadas aproximadamente 10 mg de amostra em uma atmosfera de fluxo de
nitrogênio gasoso de 10 mL/min. A faixa de temperatura foi de 0-
600°C
a uma taxa de
aquecimento de 10°C por minuto (Cavalcanti et al., 2004).
Análise
estatística
As análises estatísticas foram u
tilizadas
para determinar o nível de significância existente
entre os valores obtidos em todos os ensaios envolvendo os filmes. Estas análises foram
realizadas com ajuda do programa
GraphPad Prism
®
(versão 2.01, 1996). Os diferentes resultados
referentes aos coeficientes de Ii% e TVA, obtidos em FSG e FSI, foram inicialmente avaliados
usando análise de variância (ANOVA), sendo os resultados considerados significativos quando
p<0,05. Quando o conjunto desses valores forneceu parâmetros significativos, foi realizada
aplicação das médias dos dados obtidos no teste de múltipla comparação de Tukey, visando
comparar o papel das diferentes composições poliméricas. Também sendo considerados
significativos os valores registrados para p<0,05
(Cavalcanti et al.,
2002;
Cavalcanti et al., 2004).
RESULTADOS E DI
SCUSSÕES
Ii%
=
Pi
-
Ps
x 100 (2
)
Ps
113
Caracterização Morfológica Macroscópica e determinação da espessura dos filmes
A caracterização morfológica macroscópica dos filmes, bem como a determinação da sua
espessura, são etapas críticas para se garantir a reprodutibilidade dos ensaios
propostos
(
Cavalcanti
et al., 2002). Deve-se atentar para a presença de rachaduras, bolhas de ar,
homogeneidade de espessura ou quaisquer outras imperfeições. Os filmes obtidos por evaporação
(casting process) em placas de Teflon
®
, a partir de dispersões poliméricas de base aquosa, não
apresentaram rachaduras ou bolhas de ar, bem como não apresentaram evidências de
incompatibilidades entre a levana e o polímero sintético Eudragit RS30D
®
. A compatibilidade que
certos polissacarídeos possuem, frente à polímeros polimetacrilatados, são amplamente
divulgados pela literatura científica. Cavalcanti et al. (2002) avaliaram a permeabilidade e
hidratação de filmes polimetacrilatados aditivados com o polissacarídeo inulina. Não houve
incompatibilidades entre os polímeros polimetacrilatados e a inulina; quimicamente muito
semelhante à levana (Jain, Gupta e Jain, 2007). Pelos estudos revisados foi possível sugerir que a
levana provavelmente não apresentaria incompatibilidade com o polímero polimetacrilatado
Eudragit
RS30
D
®
; reforçando a sua aplicabilidade em filmes isolados. Os filmes obtidos, com a
adição de levana, apresentaram homogeneidade na espessura entre as várias formulações
testadas do grupo (
p=0,119
). Os filmes aditivados com levana apresentaram apenas opacidad
e;
não sendo detectadas alterações de flexibilidade.
Transmissão de vapor d´água (TVA)
A transmissão de vapor d`água (TVA) avalia a hidrofilia dos polímeros presentes nos
filmes, bem como oferece um índice na qual é possível relacionar a mobilidade da m
atriz
polimérica frente às moléculas de vapor de água (MONDAL e YONG, 2006). Os resultados revelam
que a levana alterou a permeabilidade dos filmes quando comparados entre si, incluindo o controle
100%.
O ensaio de TVA, para os filmes Eudragit RS30D
®
(ER)
e levana (L), pode ser visto na
F
igura 1
.
Figura 1
As formulações ERL 95:05 e ERL 80:20 tiveram um aumento do TVA condizente ao
aumento da participação do exopolissacarídeo nos filmes isolados; p<0,001 . O maior TVA foi
obtida na formulação ERL 80:20; d
evido
à maior participação do polissacarídeo. A levana
apresenta grande quantidade de grupos funcionais hidroxilas (OH
-
) que pode aumentar a hidrofilia
do sistema (Bunhak et al., 2007). Entretanto, na formulação ERL 90:10, a densidade da matriz
polimérica
aumentou, restringindo a difusão de moléculas de vapor de água pela diminuição do
volume livre (Mondal e Young, 2006). Este aumento da densidade da malha polimérica pode ser
114
inferido pelas alterações de cristalinidade e interações inter cadeias evidenciada
pela
caracterização térmica.
Determinação do Índice de Intumescimento (Ii%)
O intumescimento permite avaliar a hidrofilia dos polímeros constituintes do filme isolado
através do seu comportamento de hidratação inferida pelo índice de intumescimento.
Se
gundo
Cavalcanti et al.
(2002
) uma hidrofilia moderada, avaliada por intumescimento em fluídos
fisiológicos, fornece uma forte expectativa da garantia do acesso ao cólon das bactérias existentes
na porção distal do TGI. Os índices de intumescimento, para as formulações ERL, podem ser
vistas na Tabela 1 respectivamente. Os desvios padrões foram considerados adequados; haja
vista que estudos anteriores apresentaram desvios padrões maiores que o nosso (>20) neste
mesmo tipo de metodologia (
Akhgari
et al., 2006
).
Tabela 1
Conforme
a Tabela 1, a levana influenciou no índice de intumescimento das formulações
ERL 95:05 e 90:10 em FSG; sendo relativamente proporcional a participação do exopolissacarídeo
no filme. Entretanto, a formulação ERL 80:20 não apresentou diferenças estatísticas quando
comparado ao controle ER 100% em FSG (p=0,074). A levana, em maiores concentrações, pode
alterar as interações intercadeias e
consequentemente
alterar
a densidade da malha polimérica
das formulações; resultando numa hidratação não significativa como na formulação ERL 80:20.
Esta alteração de cristalinidade pode ser verificada nos ensaios de mobilidade das cadeias
poliméricas
e
caracterização térmica. Em FSI, apenas a formulação ERL 90:10 apresentou
significativamente diferente ao controle (p<0,001). Nas formulações ER 100% e ERL 80:20, o
intumescimento foi maior em FSI do que em FSG; respectivamente p=0,028 e p=0,0012. Tal
comportamento pode ser explicado pela presença de grupos amônio quaternário no Eudragit
RS30D que estão na forma de sal clorídrico. A dissociação destes grupos é responsável pelo
intumescimento dos filmes poliméricos. O FSG apresenta ânions clorídrico que apresentam menor
seletividade por trocas iônicas ao fosfato presente no FSI. Consequentemente ocorre menor
hidratação dos filmes em FSG quando comparados aos filmes imersos em FSI (
Akhgari
et al.,
2006). Embora possa ocorrer dissociação dos grupos de amônio quaternário, também se pode
esperar que não ocorram diferenças significativas entre as formulações imersa
s em FSG e FSI.
Análises térmicas (DSC e TGA)
A calorimetria diferencial de varredura permite a análise do perfil energético das amostras
num intervalo específico de temperatura. Estudos costumam evidenciar eventos endotérmicos
largos (35°C
-
160°C) atr
ibuídos à perda de água, bem como eventos endotérmicos referentes à sua
fusão; eventos endo e exotérmicos também podem corresponder à decomposição térmica dos
115
produtos (CAVALCANTI et al., 2004). As curvas de DSC, para os filmes a base de Eudragit
RS30D
®
, p
odem ser vistos na Figura 2 respectivamente.
Figura 2
O pico endotérmico da decomposição foi deslocado conforme a participação crescente da
levana nas formulações ERL 90:10 e 80:20. Segundo Kanis et al. (2006), alterações na
temperatura de decomposição podem ser devidas às mudanças na cristalização das cadeias.
Ainda segundo o autor, as alterações na cristalização da cadeia ocorrem conforme mudança na
interação intercadeias do sistema polimérico. A temperatura de transição vítrea
(tg)
, para as
formulações ERL, ficou
aproximadamente
em
49
°C.
Estes resultados corroboram com Abbaspour, Sadeghi e Garekani (2007) que
especificaram a temperatura vítrea do Eudragit RS como 50°C. Ainda segundo Haines e Wilburn
(1995) estas variações nas tg podem ser devidas às
dif
erenças nos equipamentos e condições de
análise. É importante destacar que a formação do filme é beneficiada por valores de tg baixo (WEI
et al., 2009). Nenhuma diferença significativa foi observada entre as formulações ER controle e
aquelas aditivadas com levana (DP=3,28); inferindo que a levana não influenciou na transição
vítrea destas formulações. Os perfis termogravimétricos podem ser vistos na F
igura
3 e as curvas
termogravimétricas der
ivadas podem ser verificadas na
F
igura
4
.
Figura 3
Figura 4
As análises termogravimétricas avaliam a estabilidade térmica dos compostos enquanto
a
derivada das curvas de TGA facilita a observação
de diferentes estágios de degradação. As curvas
de TGA e DTG, para as formulações ERL, indicaram perdas de massa entre 218,9°C e 241,5°C, e
381,1°C e 409,4°C; portanto dois estágios de degradação em altas temperaturas. Em média,
94,08% da massa foi perdida entre 150°C e 450°C; período de maior degradação térmica. Não
foram observadas diferenças significativas na perda de massa, entre as diferentes formulações
contendo Eudragit RS30D e levana, para temperaturas de até 150°C (ER 98,64±0,83; ERL95:05
98,97±0,8
4; ERL90:10 98,42±1,01 e ERL80:20 97,99±1,13). As formulações, com maiores
concentrações de levana, apresentaram menores perdas de massa durante o ensaio; 97,43% e
96,95% para ERL 90:10 e 80:20 respectivamente, e 99,09% e 99,15% para ER e ERL 95:05.
E
ste
s resultados foram considerados positivos haja vista que o novo material polimérico,
aditivado com levana, apresentou altas temperaturas de degradação; bem como a levana não
influenciou na estabilidade térmica do material até 150°C.
Conclusões
A elaboração de “medicamentos inteligentes” através do uso de produtos oriundos da
biotecnologia certamente estabelece imensuráveis desafios no desenvolvimento de novos
sistemas terapêuticos, prioritariamente cólon
-
específicos.
116
Os resultados deste estudo sugerem que o exopolissacarídeo levana, produzido pelo
B.
subtilis
NATTO
, quando incorporado ao Eudragit RS 30D
®
na formação de filmes isolados,
forneceu subsídios iniciais promissores quanto à perspectiva de aplicação deste material no
desenvolvimento de sistema vol
tado à liberação cólon
-
específica.
A levana e o Eudragit RS 30D foram compatíveis, não ocorrendo separação de fases
durante o processo de fabricação do filme. A levana também influenciou na mobilidade das
cadeias do Eudragit RS 30D
nas
formulações ERL 95:05 e ERL 80:20, entretanto a densidade da
matriz polimérica aumentou na ERL 90:10. Em concentrações mais baixas, a levana aumentou o
intumescimento do sistema
.
O novo material polimérico também apresentou altas temperaturas de
degradação (entre 150°C e 4
50°C).
Estes resultados nos permitem sugerir que os filmes isolados produzidos neste trabalho
poderão, após estudos complementares,
ser
utilizados para revestimento de sólidos orais
destinados ao tratamento de patologias que a acometem o cólon.
117
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119
TABELAS
Tabela
1 - Índice de intumescimento das formulações ERL em fluído de
simulação gástrico (FSG) e intestinal (FSI) (médi
a dos dados ± S.D.; n=3)
Formulação
Índice de intumescimento, Ii (%)
FSG FSI
ER 100%
21,63 ± 7,85 34,13 ± 10,70
ERL 95:05
48,87 ± 19,45 43,10 ± 16,40
ERL 90:10
60,05 ± 26,70 67,85 ± 14,24
ERL 80:20
18,66
± 10,45 43,72 ± 11,77
120
FIGURAS
Figura
1 -
Transmissão do vapor de água dos filmes nas diferentes
associações
–
Eudragit RS30D e levana
de
B. subtilis
NATTO
(n=3)
.
121
0
50
100 150 200 250 300 350 400 450 500
Heat Flux
Endo Exo
Temperature ( °C)
(d)
(c)
(b)
(a)
Figur
a
4 -
Curvas
da calorimetria diferencial de varredura
das diferentes
associações Eudragit RS 30D: Levana a) ER 100% b) ERL 95:05 c) ERL 90:10
d) ERL 80:20
372°C
385°C
395°C
372°C
Tg=49°C
122
0
100
200 300 400 500 600
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
TGA (%)
Temperatura (°C)
ER 100
ERL 95:05
ERL 90:10
ERL 80:20
Figura
3 -
Curvas
da termogravimetria
dos fil
mes isolados Eudragit RS30D
®
aditivados com levana
de
B. subtilis
NATTO.
123
0
100 200 300 400
500 600
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
DTG (%°C
-1
)
Temperatura (°C)
219°C
381°C
(a)
0
100 200
300
400 500
600
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
DTG (%°C
-1
)
Temperatura (°C)
241°C
398°C
(b)
0
100 200 300 400 500 600
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
DTG (%°C
-1
)
Temperatura (°C)
230°C
409°C
(c)
0
100 200 300 400 500 600
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
DTG (%°C
-1
)
Temperatura (°C)
221°C
401°C
(d)
Figura
4 -
Curvas
de termogravimetria derivada das diferent
es associações de
filmes Eudragit RS 30 D: Levana
: a)ER 100, b)ERL 95:05, c)ERL 90:10 e
d)ERL 80:20
.
124
6. CONCLUSÕES
• A produção de levana, a partir de B.
subtilis
NATTO
, foi favorecida
principalmente pelo aumento da concentração de sacarose. A condição
ótima para a
produção de levana, a partir de B.
subtilis
, foi obtida utilizando
-
se 400 g/L de sacarose com 16 h de tempo de cultivo; com uma produção
de
111,6 g/L e produtividade de 6,975 g/L.h.
• As amostras apresentaram duas faixas de massas molares,
aproximadamente 568 K Da e < 50 K Da; nas quantidades 13,39% e
86,61% respectivamente.
•
A levana, produzida pelo B.
subtilis
NATTO
, apresentou um comportamento
Newtoniano (viscosidade independente da taxa de cisalhamento).
• A levana
mostrou
-
se
não citotóxica para as células CHO-K1, bem como
nenhum tratamento aumentou a freqüência de micronúcleos para células
CHO
-K1 quando comparado com o controle; não apresentando potencial
toxicológico e mutagênico
.
• Os filmes não apresentaram evidências de incompatibilidades entre os
polímeros sintéticos e a levana. A levana, devido aos seus grupos
hidroxilas, pode aumentar a hidrofilia do sistema refletindo em aumento do
intumescimento e TVA. O novo material polimérico apresentou altas
temperaturas de degradação; bem como a levana não influenciou na
estabilidade térmica do material até 100°C.
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138
ANEXOS
139
ANEXO A
Relatório Técnico: Identificação de microrganismos
-
coleção de culturas
tropicais
–
André Tosello
–
Campinas, SP
140
141
142
143
ANEXO B
Curva de Calibração
da Solução Padrão
de Frutose
por Somogyi
(1954) e
Nelson
(1944)
em 540 nm
Curva de calibração - Frutose
y = 0,0059x - 0,0595
R
2
= 0,9979
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0
20
40
60 80
100
120
Concentração Padrão Frutose (µg/mL)
Absorvância
144
ANEXO C
Curva de Calibração da Cromatografia de Exclusão Molecular com Padrões
de Leuconsotoc mesenteroides Sigma de 50
.
000,
410.000 e
670
.000
Da
Curva de calibração - Eluição dos padrões de
Leuconostoc mesenteroides
y = -77,588x + 1111,2
R
2
= 0,9939
0
100
200
300
400
500
600
700
800
5 7 9
11
13
15
Tubo de eluição
Massa Molar (KDa)
145
AN
EXO D
Perfil de eluição da amostra
A amostra de levana
obtida
da condição ideal, determinada pelo
delineamento fatorial e metodologia de superfície de resposta, foi precipitada,
liofilizada
e
submetida
à cromatografia de permeação em gel. Os açúcares t
otais
foram medidos pelo método de fenol-
sulfúrico
e estão em porcentagem sobre o
total de açúcares eluídos
. Cada
tub
o de eluição corresponde a 3,5 mL/15’.
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Tubo de eluição
%
Figura
– Perfil cromatográfico da amostra de levana obtida
146
ANEXO E
Instruções e normas p
ara o encaminhamento e publicação do Artigo no
periódico
Food
Microbiology
Guide for Authors
Original research papers for
Food Microbiology
should be written in English and normally not exceed
6000 words. Short
research notes
describing interesting bu
t limited studies are welcome, but the
same rigorous review process will be applied. Short research notes will not normally exceed 3500
words. Short
reviews
on matters of immediate interest and longer, definitive reviews will be
published; authors should d
iscuss proposed topics with the editor before preparing a manuscript.
Book reviews
and
letters to the editor
are welcome.
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Food Microbiology
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1959). If a paper has more than two authors, use the form (Hobson et al. 1963). When more that one
paper by the same author is cited in a given year, the references should be distinguished in the
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for those with more than two authors, which should be listed in chronological order after any other
papers by the first author. References should include the title of the paper as well as both initial and
final page numbers. References to books should include the year of publication, the title, town of
publication and publisher.
T
he following formats should be used:
Baresi, L., Mah, R. A., Ward, D. M. and Kaplan, I. R., 1978. Methanogenesis from acetate: enrichment
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ntermediate in methanogenesis.
In:Schlegel, H.G., Barnea, J. (Eds.), Microbial energy conversion. Pergamon Press, Oxford, pp. 97
-
106.
Abbreviations and Units
Non
-
standard abbreviations should be kept to a minimum and on first use should be defined by a
footnote to the test. SI units are recommended, but conventional ones will be accepted if
unambiguous.
Nomenclature and Descriptions of Organisms
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synonyms
may be added in brackets when the name is first mentioned. Names of bacteria must
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underlined in the typescript and written in full at first mention, but su
bsequently the name of the
genus may be abbreviated, single letter abbreviations being used where they are not ambiguous. To
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Tables
Tables should be indicated with Arabic numerals and should be comprehensible without reference to
the text; titles should be brief and explanatory material should be referenced with lower case superior
letters and listed in footnotes. Appr
opriate indications of replication and variability should be included.
Each table should occupy a separate sheet in the manuscript.
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Arabic
numbers consecutively in the order to which they are referred. They should accompany the
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-
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alternatively, 25 free paper offprints. The PDF file is a wa
termarked version of the published article
and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and
conditions of use. If colour is paid for within an article then 100 extra offprints will be supplied at no
extra cha
rge. Additional offprints and copies of the issue can be ordered at a specially reduced rate
using the order form sent to the corresponding author after the manuscript has been accepted. Orders
for reprints (produced after publication of an article) will i
ncur a 50% surcharge.
Copyright
Upon acceptance of an article, authors will be asked to transfer copyright (for more information on
copyright see
http://www.elsevier.com/authorsrights
). This transfer will ensure the widest possible
dissemination of information. A letter will be sent to the corresponding author confirming receipt of
the manu
script. A form facilitating transfer of copyright will be provided. If excerpts from other
copyrighted works are included, the author(s) must obtain written permission from the copyright
owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has preprint
ed forms for use by authors in
these cases: contact Elsevier, Global Rights Department, P.O. Box 800, Oxford, OX5 1DX, UK; phone:
(+44) 1865 843830, fax: (+44) 1865 853333, e
-
mail:
Author Enquiries
A submission checklist can be found at
http://www.elsevier.com
/locate/guidepublication.
Register for free to receive email updates from the
article tracking service at
http://www.elsevier.com/trackarticle.
If you are interested in submitting a
book in this area go to
http://www.elsevier.com/bookauthors.
Do not contact the editors
-
they do
not have access to this information.
Food Microbiology carries no page charges.
151
ANEXO F
Instruções e normas para o encaminhamento e publicação do Artigo no
periódico
Applied Microbiology and Biotechnology
e
World Journal of Microbiology
and Biotechnology
Aims and scope -
Applied Microbiology and Biotechnology
The journal publishes two categories of articles: (i) Original Papers (preferred length of
6-8
printed pages), (ii)
Mini
-
Reviews (preferred length of
5-
6 printed pages).
Mini
-Reviews are short reviews critically summarizing the current state of and providing perspectives on
biotechnological processes, products, microbial genomes, methods and equip
ment.
Papers should deal with the following aspects of applied microbiology and biotechnology:
Biotechnological products and process engineering
Established and in pipe technologies of biotechnological processes using prokaryotic or eukaryotic cells or
e
nzymes and other proteins for production, conversion, degradation and detection of substances including
bioreactor design.
Biotechnologically relevant enzymes and proteins
Characterization of hitherto undescribed, biotechnologically relevant enzymes and
proteins or of known
proteins with novel properties and purification of proteins on a technical scale.
Applied genetics and molecular biotechnology
New vectors and methods for genetic transformation and all aspects of strain improvement employing
recombi
nant DNA technology including metabolic engineering and enzyme engineering.
Genomics and proteomics
Characterization and analyses of genomes, transcriptomes and proteomes.
Applied microbial and cell physiology
Physiological studies on biosynthesis, cat
abolism and biotransformation of biotechnologically relevant
compounds.
Environmental biotechnology
All aspects of environmental processes using microorganisms and biodegradation of hazardous chemicals.
Methods
Novel methods and techniques or significan
t modifications of already described methods.
Their novelty and
reliability must be concisely presented.
Aims and scope -
World Journal of Microbiology and Biotechnology
152
World Journal of Microbiology & Biotechnology publishes research papers, short commun
ications, technical
communications and review articles on all aspects of applied microbiology and biotechnology. Virological
topics however are outside the scope of the journal. The Journal provides a forum for research work directed
towards microbiologica
l and biotechnological solutions to global problems encouraging contributions from all
scientists from all across the globe who have an interest in tackling them. As many global issues, for example
improving crop productivity, public health and waste manag
ement, have more acute consequences in the
developing world, the Journal emphasizes the role of biotechnological advances, for and from developing
regions.
Short Communications should not normally exceed four printed pages (about 2000 words) which may incl
ude
up to three figures and/or tables, and no more than 20 references. Technical communications should consist of
descriptions of new or modified techniques with examples of their application and should not exceed three
printed pages.
The Journal also publ
ishes selected review articles on the social and educational aspects of biotechnology and
its applications if these address relevant policy or scientific issues or novel pedagogical practices. In addition,
topical Commentaries, often derived from significa
nt scientific meetings are published. Typically, these are
commissioned, but suggestions will be considered upon communication with the appropriate Editor.
All articles
published in the Journal are independently refereed.
Manuscript submission
Manuscript
Submission
Submission of a manuscript implies: that the work described has not been published before; that it is not under
consideration for publication anywhere else; that its publication has been approved by all co
-
authors, if any, as
well as by the resp
onsible authorities
–
tacitly or explicitly
–
at the institute where the work has been carried
out. The publisher will not be held legally responsible should there be any claims for compensation.
Permissions
Authors wishing to include figures, tables, or text passages that have already been published elsewhere are
required to obtain permission from the copyright owner(s) for both the print and online format and to include
evide
nce that such permission has been granted when submitting their papers. Any material received without
such evidence will be assumed to originate from the authors.
Online Submis
sion
Authors should submit their manuscripts online. Electronic submission substantially reduces the editorial
processing and reviewing times and shortens overall publication times. Please follow the hyperlink “Submit
online” on the right and upload all of
your manuscript files following the instructions given on the screen.
Title Page
Title Page
The title page should include:
The name(s) of the author(s)
A concise and informative title
The affiliation(s) and address(es) of the author(s)
The e
-
mail address, telephone and fax numbers of the corresponding author
Abstract
153
Please provide an ab
stract of 150 to 250 words. The abstract should not contain any undefined abbreviations
or unspecified references.
Keywords
Please provide 4 to 6 keywords which can be used for
indexing purposes.
Text
Text Formatting
Manuscripts should be submitted in Word.
Use a normal, plain font (e.g., 10
-
point Times Roman) for text.
Use italics for emphasis.
Use the automatic page numbering function to number the pages.
Do not use field functions.
Use tab stops or other commands for indents, not the space bar.
Use the table function, not spreadsheets, to make tables.
Use the equation edit
or or MathType for equations.
Note: If you use Word 2007, do not create the equations with the default equation editor but use the
Microsoft equation editor or MathType instead.
Save your file in doc format. Do not submit docx files.
Word template
Manuscripts with mathemat
ical content can also be submitted in LaTeX.
LaTeX macro package
Headings
Please use no more than three levels of displayed headings.
Abbreviations
Abbreviations should be defined at first mention and used consistently thereafter.
Footnotes
Footnotes can be used to give additional information, which may include the citation of a reference included in
the reference l
ist. They should not consist solely of a reference citation, and they should never include the
bibliographic details of a reference. They should also not contain any figures or tables.
Footnotes to the text are numbered consecutively; those to tables should be indicated by superscript lower
-
case letters (or asterisks for significance values and other statistical data). Footnotes to the title or the authors
of the article are not
given reference symbols.
Always use footnotes instead of endnotes.
Acknowledgments
Acknowledgments of people, grants, funds, etc. should be placed in a separate section before the reference
list. The names of funding organizations should be written in full.
References
154
Citation
Cite references in the text by name and year in parentheses. Some examples:
Negotiation research spans many disciplines (Thompson 1990).
This result was later contradicted by Becker and Seligman (1996).
This effect has been widely studied (Abbott 1991; Barakat et al. 1995; Kelso and Smith 1998; Medvec et al.
1993).
Reference list
The list of re
ferences should only include works that are cited in the text and that have been published or
accepted for publication. Personal communications and unpublished works should only be mentioned in the
text. Do not use footnotes or endnotes as a substitute for
a reference list.
Reference list entries should be alphabetized by the last names of the first author of each work.
Journal article
Gamelin FX, Baquet G, Berthoin S, Thevenet D, Nourry C, Nottin S, Bosquet L (2009) Effect of high
intensity intermittent training on heart rate variability in prepubescent children. Eur J Appl Physiol 105:731
-
738. doi: 10.1007/s00421
-
008
-
0955
-8
Ideally, the names of all authors should be provided, but the usage of “et a
l” in long author lists will also be
accepted:
Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance.
N Engl J Med 965:325
–
329
Article by DOI
Slifka MK, Whitto
n JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production.
J Mol Med.
doi:10.1007/s001090000086
Book
South J, Blass B (2001) The future of modern genomics.
Blackwell, London
Book chapter
Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (
ed) The rise of modern genomics, 3rd edn.
Wiley, New York, pp 230
-
257
Online docu
ment
Cartwright J (2007) Big stars have weather too. IOP Publishing PhysicsWeb.
http://physicsweb.org/articles/news/11/6/16/1. Accessed 26 June 2007
Dissertation
Trent JW (1975) Experimental acute renal failure. Dissertation, University of California
Always use the standard abbreviation of a journal’s name according to the ISSN List of Title Word
Abbreviations, see
www.issn.org/2
-
22661
-
LTWA
-
online.php
Tables
All tables are to be numbered using Arabic numer
als.
Tables should always be cited in text in consecutive numerical order.
For each table, please supply a table caption (title) explaining the components of the table.
Identify any previously published material by giving the original source in the form of a re
ference at the end
of the table caption.
Footnotes to tables should be indicated by superscript lower
-
case letters (or asterisks for significance
values and other statistical data) and included beneath the table body.
155
Languages
Articles and abstracts must
be in English or in the journal's official language(s), but the journal accepts
additional abstracts in other languages of the author’s choice (for instance in the author’s first language, if not
English or the journal's official language). Such abstracts
are optional. Authors would need to supply such
abstracts themselves, certify that they are a faithful translation of the official abstract, and they must be
supplied in Unicode (see www.unicode.org for details), especially if they are using non-
roman char
acters.
http://www.unicode.org
Such abstracts in other languages will carry a disclaimer:
"This abstract is provided by the author(s), and is for convenience of the users only. The author certifies that
the translation faithfully represents the official version in the language of the journal, which i
s the published
Abstract of record and is the only Abstract to be used for reference and citation."
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Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
