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RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS E MECÂNICAS EM POPULAÇÃO SUSCETÍVEL E
RESISTENTE Plutella xylostella (L.) (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE) FRENTE A
FORMULAÇÕES COMERCIAIS À BASE DE Bacillus thuringiensis BERLINER
por
LÍLIAN MARIA DA SOLIDADE RIBEIRO
(Sob Orientação da Professora Valéria Wanderley-Teixeira)
RESUMO
A resistência de Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) pode ser atribuída a
vários mecanismos como alterações nos receptores de membrana celular no mesêntero e a
resposta imune às toxinas do Bacillus thuringiensis Berliner. A pesquisa testou as hipóteses de
que após exposição a formulações Bt: população suscetível (PS) e população resistente (PR) da
traça apresentam alterações quantitativas e qualitativas diferenciadas dos hemócitos e dos níveis
de óxido nítrico na hemolinfa, alterações histopatológicas e histoquímicas diferenciadas no
mesêntero e de que PR apresenta capacidade de recuperação do mesêntero. PS e PR expostas ao
Dipel
®
1,35 mg/L (PS), 64,93mg/L (PR); XenTari
®
5,17 mg/L (PS), 236,24 mg/L (PR), além da
testemunha, tiveram hemolinfa coletada nos intervalos de 1, 6 e 12 h para contagem total e
diferencial dos hemócitos e quantificação de óxido nítrico. O mesêntero foi coletado nos
intervalos: 0, 1, 6 e 12 h. A quantificação das células regenerativas foi efetuada através do
programa ImageLab 2000. Apesar de PR ter apresentado menor número de hemócitos, exibiu
maior quantidade de plasmatócitos, prohemócitos e esferulócitos, podendo isto estar relacionado
à resistência. Dipel
®
foi efetivo na redução do número total de hemócitos das PS e PR, enquanto
que o XenTari
®
alterou significativamente a contagem diferencial. O óxido nítrico aumentou em
i
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ambas as populações, não diferindo entre os inseticidas, indicando a não participação deste na
resistência. Os inseticidas ocasionaram alterações, de intensidades diferentes, no mesêntero das
PS e PR, Dipel
®
mostrou ser mais agressivo independente da população, levando a degeneração
do epitélio. A presença de esferites revestindo a lâmina epitelial, a hipertrofia das células
colunares e a riqueza de muco podem estar envolvidas na preservação do mesêntero em larvas da
população resistente, porém essas características não foram suficientes para impedir a
degeneração do epitélio ou induzir a hiperplasia das células regenerativas.
PALAVRAS-CHAVE: Traça-das-crucíferas, inseticida biológico, nitric oxide, hemócitos,
histopatologia, morfologia.
ii
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IMMUNOLOGICALS AND MECANICALS RESPONSES IN SUSCEPTIBLE AND
RESISTANT POPULATION OF Plutella xylostella (L.) (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE)
STAND UP TO COMMERCIALS FORMULATIONS OF Bacillus thuringiensis BERLINER
by
LÍLIAN MARIA DA SOLIDADE RIBEIRO
(Under the direction of
Professor Valéria Wanderley Teixeira)
ABSTRACT
The resistance of Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) has been attributed to
many mechanisms as alterations in cell membrane receptors on midgut and the immune response
to Bacillus thuringiensis Berliner toxin. The research tested the possibility that after expositions
to Bt formulations, insects from a susceptible population (SP) and a resistant population (RP)
presented qualitative and quantitative differentiated alterations of hemocytes and nitric oxide
levels in hemolymph, histopathological and histochemical differenced alterations in midgut and
that RP presented capacity of recovery midgut. SP and RP were exposed to Dipel
®
1,35 mg/L
(SP), 64,93mg/L (RP); XenTari
®
5,17 mg/L (SP), 236,24 mg/L (RP) plus witness had
hemolymph collected in intervals of 1, 6 and 12 h for total and differential counting of hemocytes
and quantification of nitric oxide. The midgut was collected in the intervals: 0, 1, 6, 12 h. The
regenerative cells quantification was made through the ImageLab 2000 program. In spite of RP
had showed less number of hemocytes, it exhibited greater quantity of plasmatocytes,
prohemocytes and spherulocytes, this can be related to resistance. Dipel
®
was effective in
reduction of total numbers of hemocytes of SP and RP, while XenTari
®
changed significantly the
iii
differential counting. The nitric oxide increased in both populations and it not differed between
the insecticides, indicating the no participation of it in the resistance. The insecticides induced
alterations in different intensities on midgut in SP and RP, Dipel
®
showed to be more aggressive
independently of population, taking to degeneration of epithelium. The presence of spherites
covering the epithelial lamina, the hypertrophy of columnar cells and mucus abundance can be
involved in midgut preservation in larvae of resistant population, however these features were not
sufficient to avoid the degeneration of epithelium or induce the hyperplasia of regenerative cells.
KEY WORDS: Diamondback moth, biological insecticide, nitric oxide, hemocytes,
histopathology, morphology.
iv
RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS E MECÂNICAS EM POPULAÇÃO SUSCETÍVEL E
RESISTENTE Plutella xylostella (L.) (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE) FRENTE A
FORMULAÇÕES COMERCIAIS À BASE DE Bacillus thuringiensis BERLINER
por
LÍLIAN MARIA DA SOLIDADE RIBEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola, da
Universidade Federal Rural de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de
Mestre em Entomologia Agrícola.
RECIFE - PE
Fevereiro – 2010
v
RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS E MECÂNICAS EM POPULAÇÃO SUSCETÍVEL E
RESISTENTE Plutella xylostella (L.) (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE) FRENTE A
FORMULAÇÕES COMERCIAIS À BASE DE Bacillus thuringiensis BERLINER
por
LÍLIAN MARIA DA SOLIDADE RIBEIRO
Comitê de Orientação:
Valéria Wanderley Teixeira – UFRPE
Álvaro Aguiar Coelho Teixeira – UFRPE
Herbert Álvaro Abreu de Siqueira – UFRPE
vi
RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS E MECÂNICAS EM POPULAÇÃO SUSCETÍVEL E
RESISTENTE Plutella xylostella (L.) (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE) FRENTE A
FORMULAÇÕES COMERCIAIS À BASE DE Bacillus thuringiensis BERLINER
por
LÍLIAN MARIA DA SOLIDADE RIBEIRO
Orientador:
Valéria Wanderley-Teixeira - UFRPE
Examinadores:
Maria Helena Neves Lobo Silva Filha – FIOCRUZ
Álvaro Aguiar Coelho Teixeira - UFRPE
Herbert Álvaro Abreu de Siqueira - UFRPE
vii
Aos meus pais, Terezinha e Luiz, por quem tenho
grande amor, respeito e carinho e
a todos que
amo.
DEDICO
viii
AGRADECIMENTOS
A Deus, que sempre esteve e está ao meu lado concedendo-me força para superar os
obstáculos.
À Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) e ao Programa de Pós-Graduação
em Entomologia Agrícola (PPGEA), pela oportunidade de execução deste curso.
À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE), pela
concessão da bolsa de estudo.
Aos meus amados pais Terezinha Rocha Ribeiro e Luiz Carlos Ribeiro pelo esforço
contínuo para sempre me oferecer o melhor e pelos seus maravilhosos ensinamentos.
Aos amigos conquistados durante o curso, poucos, porém verdadeiros, cuja relação vai além
da conveniência e da superficialidade. Em especial, agradeço a Vando Rondelli, Ricardo Lopes,
Jefferson Ellias, Andresa Cristina e Tadeu Martins, saibam que moram no meu coração, num
cantinho muito especial. Obrigada pelos conselhos, apoio e paciência.
Aos colegas de laboratório Mateus Ribeiro, Maria Júlia, Diogo Galindo, Paulo Estevão,
Ismaela Maria, Hilda Michelly, Alicely Correia, Thiago Alves, Vanessa Feitosa e Glaucilane dos
Santos pelos momentos de descontração e pelo apoio.
Às amadas irmãs (Biopoderosas) que Deus me permitiu escolher: Ana Cláudia Carvalho,
Carolina Ribeiro, Renata Janaína Carvalho e Vanessa de Castro (sempre em ordem alfabética);
Em especial, a Ana Cláudia Carvalho que muito me ajudou em vários momentos e pelo grande
exemplo que tem sido para mim, a cada dia que se passa aprendo a admirá-la mais.
A Franklin Magliano, pessoa maravilhosa, iluminada, que também muito me ajudou e tanto
admiro.
ix
À Ana Janaína pelo amparo prestado nos momentos de dificuldade e pelos bons conselhos.
A minha orientadora Valéria Wanderley Teixeira por ser uma pessoa tão especial e por ter
me presenteado com a oportunidade de trabalhar com o que tanto me identifico.
Ao professor Álvaro Aguiar Coelho Teixeira pela disponibilidade em ajudar e pela amizade
estabelecida.
Ao professor Herbert Álvaro Abreu de Siqueira pela paciência e assistência prestada.
Ao professor Jorge Braz Torres pela colaboração nas análises estatísticas.
Aos demais Professores do Programa de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola da
UFRPE, que me ajudaram no cumprimento de mais uma etapa profissional da minha vida. Em
particular ao professor José Vargas de Oliveira que tanto admiro e considero.
Ao professor Valdemiro Amaro da Silva Junior
da UFRPE por ter permitido a utilização das
instalações Laboratório de Patologia Veterinária para confecção das lâminas do material
processado em historesina.
A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho
e me apoiaram de alguma forma, cujos nomes não foram citados.
x
SUMÁRIO
Página
AGRADECIMENTOS...................................................................................................................ix
CAPÍTULOS
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 01
LITERATURA CITADA...................................................................................... 04
2 ANÁLISE COMPARATIVA DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE
POPULAÇÕES RESISTENTE E SUSCETÍVEL DE Plutella xylostella (L.)
(LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE) FRENTE A FORMULAÇÕES
COMERCIAIS À BASE DE Bacillus thuringiensis BERLINER ........................ 08
RESUMO .............................................................................................................. 09
ABSTRACT.......................................................................................................... 10
INTRODUÇÃO .................................................................................................... 11
MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 12
RESULTADOS..................................................................................................... 16
DISCUSSÃO......................................................................................................... 19
AGRADECIMENTOS.......................................................................................... 23
LITERATURA CITADA...................................................................................... 23
2 HISTOPATOLOGIA DO MESÊNTERO DE POPULAÇÕES RESISTENTE E
SUSCETÍVEL DE Plutella xylostella (L.) (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE)
FRENTE A FORMULAÇÕES COMERCIAIS À BASE DE Bacillus
thuringiensis BERLINER ..................................................................................... 37
xi
RESUMO .............................................................................................................. 38
ABSTRACT.......................................................................................................... 39
INTRODUÇÃO .................................................................................................... 40
MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 41
RESULTADOS..................................................................................................... 44
DISCUSSÃO......................................................................................................... 47
AGRADECIMENTOS.......................................................................................... 50
LITERATURA CITADA...................................................................................... 51
xii
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
O microlepidóptero, Plutella xylostella (L.), vulgarmente conhecida como traça-das-
crucíferas, é considerada a principal praga das plantas da família Brassicaceae no Brasil e no
mundo. As injúrias causadas por esse inseto, além de provocar a depreciação do produto, podem
acarretar perda total da lavoura, inviabilizando a produção (Castelo Branco & Gatehouse 2001).
As injúrias são ocasionadas pelas larvas, pois se alimentam inicialmente do parênquima foliar e
posteriormente da epiderme da parte inferior das folhas, resultando em perfurações que inutilizam
o produto para a comercialização (Imenes et al. 2002).
Dentre as diferentes técnicas de redução populacional de P. xylostella, o controle químico
tradicional é o mais empregado. Embora os danos causados pela praga justifiquem a adoção dessa
medida de controle, seu uso traz riscos de intoxicação para os produtores, animais domésticos e
selvagens, contaminação ambiental, danos aos inimigos naturais, podendo ainda deixar resíduos
nos alimentos que geralmente são consumidos in natura ou com pouco preparo. O uso contínuo e
desordenado de inseticidas também tem resultado na seleção de populações resistentes de P.
xylostella (Castelo Branco & Medeiros 2001, Castelo Branco & Amaral 2002, Medeiros et al.
2005).
Como alternativa ao controle químico, o uso de bactérias entomopatogênicas, a exemplo de
Bacillus thuringiensis Berliner, surgiu como uma importante ferramenta para o controle da traça-
das-crucíferas, uma vez que seu uso oferece diversas vantagens diante dos produtos químicos
clássicos: efeito não poluente ao meio ambiente, inocuidade aos mamíferos e aos outros
1
vertebrados, ausência de toxicidade para as plantas e especificidade para o inseto alvo (Cárdenas
et al. 2001, Hererro et al. 2001a, Siegel et al. 2001).
B. thuringiensis é uma bactéria gram-positiva, aeróbica ou facultativamente anaeróbica,
naturalmente encontrada em diversos substratos como solo, água, superfície de plantas, insetos
mortos e grãos armazenados, sintetizando, durante a fase de esporulação, inclusões protéicas que
se acumulam na periferia dos esporos sob a forma de cristais. Estes são compostos por uma ou
várias proteínas Cry, também chamadas de delta-endotoxinas ou “Insecticidal Crystal Proteins”
(ICPs), apresentando ação extremamente tóxica a insetos das Ordens Lepidoptera, Coleoptera,
Hymenoptera e Diptera.(Estela et al. 2004, Medeiros et al. 2005, Bravo et al. 2007).
As proteínas Cry são sintetizadas sob a forma de protoxinas, necessitando ser ativadas para
desempenhar seus efeitos tóxicos. Ao serem ingeridos pelos insetos suscetíveis, os cristais sofrem
ação do pH intestinal, sendo solubilizados e em seguida processados por proteases específicas. Os
produtos resultantes desses processos ligam-se irreversivelmente a receptores específicos
presentes nas microvilosidades apicais das células epiteliais do intestino médio (mesêntero),
causando lise osmótica por meio da formação de poros na membrana, ruptura da integridade
intestinal e conseqüente morte do inseto (Copping & Menn 2000, Herrero et al. 2001b,
Oestergaard et al. 2007).
Apesar da eficiência do B. thuringiensis ser comprovada para diversas pragas de diferentes
Ordens, tem sido relatada a seleção de populações resistentes de P. xylostella a esta bactéria em
várias partes do mundo, cuja resistência foi observada por Tabashnik (1990), Zhao et al. (1993),
Perez & Shelton (1997) e Wright et al. (1997) em populações dos USA (Flórida, Havaí e Nova
Iorque), América Central (Costa Rica, Guatemala, Honduras e Nicarágua) e Ásia (Japão,
Malásia). No Brasil, Castelo Branco et al. (2003) observaram resistência desta praga em
2
populações provenientes de ambientes onde é comum o uso de B. thuringiensis e onde não se
usava o entomopatógeno como bioinseticida.
A resistência da traça-das-crucíferas ao B. thuringiensis pode ser atribuída a alterações nos
receptores de membrana localizados nas células do mesêntero, ocasionando perda ou redução na
ligação da toxina ao receptor, e conseqüente perda da eficiência do inseticida (Ferré & Van Rie
2002, Sayyed et al. 2004). No entanto, outros mecanismos ou combinação de mecanismos
também podem reduzir a toxicidade do Bt, tais como mudanças no processamento proteolítico
das protoxinas, mudanças de pH no lúmen do mesêntero (Ma et al. 2005a) e recuperação das
células do intestino após exposição às toxinas (Loeb et al. 2001). Ao estudar insetos suscetíveis e
resistentes de Helicoperva armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), Ma et al. (2005b)
propôs um mecanismo de resistência baseado em elevada resposta imune, envolvendo aumento
da melanização e reações de coagulação que impediriam a solubilização das toxinas Bt.
O sistema imunológico dos insetos é composto por barreiras estruturais e por respostas
ativas contra elementos estranhos. As barreiras estruturais compreendem o rígido exoesqueleto, o
sistema digestivo e o sistema respiratório que constituem a primeira linha de defesa dos insetos
(Lavine & Strand 2002, Schmid-Hempel 2005). Quando essas barreiras estruturais são rompidas,
os agentes estranhos atingem a hemocele desencadeando complexos e interconectados
mecanismos celulares e humorais.
As defesas celulares são mediadas por células livres circulantes na hemolinfa, os
hemócitos, e referem-se a respostas imunes como fagocitose, nodulação, encapsulação e
citotoxidade (Schmid-Hempel 2005), sendo o sucesso da defesa dependente do número e dos
tipos de hemócitos envolvidos nesses mecanismos (Russo et al. 2001).
A resposta humoral consiste da síntese de uma grande variedade de peptídeos
antimicrobianos, ativação de uma complexa cascata proteolítica que leva à coagulação e
3
melanização da hemolinfa, bem como reações intermediárias de oxigênio e nitrogênio (Bogdan et
al. 2000, Vass & Nappi 2001, Lavine & Strand 2002).
Diante da dificuldade de controle do inseto em questão, das vantagens inerentes ao uso de
B. thuringiensis, do surgimento de populações resistentes ao Bt, a presente pesquisa objetivou
testar hipóteses que possam estar relacionadas a essa resistência tais como: o envolvimento de
outras células epiteliais do mesêntero, a hiperplasia das células intestinais, a capacidade de
recuperação do mesêntero em insetos resistentes, alterações histoquímicas, bem como
modificações nas respostas imunológicas celular e humoral de P. xylostella, frente a formulações
comerciais a base de B. thuringiensis.
Literatura Citada
Bravo, A., S.S. Gill & M. Soberón. 2007. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt
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7
CAPÍTULO 2
ANÁLISE COMPARATIVA DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE POPULAÇÕES
RESISTENTE E SUSCETÍVEL DE Plutella xylostella (L.) (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE)
FRENTE A FORMULAÇÕES COMERCIAIS À BASE DE Bacillus thuringiensis BERLINER
L
ÍLIAN M.S. RIBEIRO
1
, HERBERT A.A. SIQUEIRA
1
, FRANKLIN M. CUNHA
1
, VALÉRIA WANDERLEY-
T
EIXEIRA² EÁLVARO A.C. TEIXEIRA²
1
Departamento de Agronomia-Entomologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Av.
Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE.
2
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE.
Ribeiro, L.M.S., H.A.A. Siqueira, F.M. Cunha, V. Wanderley-Teixeira & A.A.C. Teixeira.
Análise comparativa da resposta imunológica de populações resistente e suscetível de Plutella
xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) frente a formulações comerciais à base de Bacillus
thuringiensis Berliner. A ser submtedio a Neotropical Entomology.
8
RESUMO – Apesar da eficiência do Bacillus thuringiensis Berliner ser comprovada, a seleção de
populações resistentes de Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) a essa bactéria tem
sido relatada em todo o mundo. Estudos têm proposto um mecanismo de resistência baseado na
resposta imune às toxinas Bt. Assim, testamos as hipóteses de que alterações quantitativas e
qualitativas nos hemócitos de larvas de P. xylostella, bem como modificações nos níveis de óxido
nítrico na hemolinfa dos insetos tratados com formulações Bt, possam estar relacionadas a
resistência. Utilizou-se uma população suscetível (PS) e outra resistente (PR) da traça ao Dipel
®
e
XenTari
®
. Insetos expostos às seguintes concentrações: Dipel
®
1,35 mg/L (PS), 64,93 mg/L (PR);
XenTari
®
5,17 mg/L (PS), 236,24 mg/L (PR) além da testemunha, tiveram sua hemolinfa
coletada nos intervalos de 1, 6 e 12 h para contagem total e diferencial dos hemócitos e
quantificação da produção de óxido nítrico. Apesar de PR ter apresentado menor número de
hemócitos, exibiu maior quantidade de plasmatócitos, prohemócitos e esferulócitos, fato que
pode estar relacionado à resistência devido à função desempenhada por estes tipos celulares no
processo de defesa. A resposta imune celular independente da suscetibilidade sofreu influência
dos inseticidas, sendo o Dipel
®
efetivo na redução do número total de hemócitos de insetos PS e
PR, enquanto que o XenTari
®
alterou de forma significativa a contagem diferencial dessas
células. O óxido nítrico aumentou em ambas as populações, não diferindo entre os inseticidas
utilizados, indicando a não participação desta molécula na resistência da praga.
PALAVRAS-CHAVE: Traça-das-crucíferas, Dipel, Xentari, hemócitos, óxido nítrico
9
COMPARATIVE ANALYSIS OF IMMUNOLOGICAL RESPONSE OF Plutella xylostella (L.)
(LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE) RESISTANT AND SUSCEPTIBLE POPULATIONS
STAND UP TO COMERCIAL FORMULATIONS OF Bacillus thuringiensis BERLINER
ABSTRACT – Despite the efficiency of Bacillus thuringiensis Berliner has been proved, the
selection of resistant population of Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) to this
bacterium has been reported worldwide. Studies have been proposed a mechanism of resistance
based on the immune response to Bt toxins. Therefore we tested the hypothesis that the
quantitative and qualitative alterations in hemocytes of P. xylostella larvae, as well modifications
in nitric oxide levels in hemolymph of insects treated with Bt formulations, could be related to
mechanism of resistance. It were used a susceptible population (SP) and other resistant (RP) of
the moth to Dipel
®
e XenTari
®
. Insects were exposed to the following concentrations: Dipel
®
1,35 mg/L (SP), 64,93 mg/L (RP); XenTari
®
5,17 mg/L (SP), 236,24 mg/L (RP), besides a
untreated group and hemolymph was collected in intervals of 1, 6 and 12 h to total and
differential counting of hemocytes, and quantification of nitric oxide production. Despite RP
showed less number of hemocytes, it exhibited greater quantity of plasmatocytes, prohemocytes
and spherulocytes, and this fact can be related to the resistance due the function played for these
cells types in defense process. The cell immune response independently of the susceptibility
status suffer the influence of insecticides. Dipel
®
was effective in reduction of total numbers of
hemocytes of SP and RP insects, while XenTari
®
changed significantly the differential counting.
The nitric oxide increased in both populations and it not differed between the used insecticides,
indicating the no participation of this molecule in the resistance.
KEY WORDS: Diamondback moth, Dipel, Xentari, hemocytes, nitric oxide
10
Introdução
Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae), também conhecida como traça-das-
crucíferas, é considerada a principal praga das plantas da família Brassicaceae acarretando
enorme gasto em compostos químicos ou biológicos para seu controle (Talekar & Shelton 1993).
O manejo desse inseto é dificultado pela facilidade com que evolui para a resistência, sendo
mencionado como o lepidóptero que se tornou resistente à maior quantidade de princípios ativos
diferentes, mais de 51 ingredientes ativos (Vasquez 1995), incluindo a bactéria entomopatogênica
Bacillus thuringiensis Berliner (Tabashnik et al. 1990, Castelo Branco et al. 2003).
Vários mecanismos de resistência dos insetos a B. thuringiensis têm sido propostos (Ferré
& Van Rie 2002). O mais conhecido envolve mudanças nos receptores de ligação da toxina das
células colunares do intestino médio como relatado em linhagens resistentes de P. xylostella
(Ferré & Van Rie 2002, Sayyed et al. 2004). No entanto, baixa ativação ou alta degradação das
protoxinas (Forcada et al. 1996), a ativação proteolítica diferenciada destas (Lightwood et al.
2000), seu sequestramento por proteases (Milne et al. 1995) e elevada resposta imune,
envolvendo aumento da melanização e reações de coagulação que impediriam a solubilização das
toxinas Bt. (Ma et al. 2005) também têm sido descritos como potenciais mecanismos alternativos
de resistência às toxinas de B. thuringiensis.
Sabe-se que os insetos possuem um sistema imunológico inato que tem revelado ser
altamente adaptado e efetivo contra várias espécies microbianas em concentrações
potencialmente fatais a vertebrados (Kavanagh & Reeves 2004). A imunidade inata dos insetos é
mediada por componentes celulares e humorais (Ribeiro & Brehélin 2006).
As reações celulares são executadas pelos hemócitos e envolvem os processos de
fagocitose, formação de nódulos e encapsulação. A variação no número e na proporção dos
diversos tipos de hemócitos presentes na hemolinfa constitui um dos parâmetros de grande
11
relevância a ser considerado em um quadro infeccioso. Em resposta a presença de patógenos, tais
variações decorrem da produção elevada de alguns tipos celulares e da imobilização de hemócitos
em nódulos e cápsulas ao redor dos organismos invasores (Silva 2002, Lavine & Strand 2002).
A defesa humoral é representada pela ação de peptídeos antimicrobianos, por uma
complexa cascata enzimática que regula a coagulação ou melanização da hemolinfa (Lavine &
Strand 2002), por mecanismos oxigênio-dependentes que incluem a síntese de lisozima, enzimas
proteolíticas e hidrolíticas e pela geração de compostos intermediários reativos do nitrogênio e do
oxigênio (Nappi et al. 1995, Meister et al. 1997,
Whitten et al. 2001).
O óxido nítrico (NO) tem sido apontado como molécula citotóxica, capaz de destruir células
tumorais e patógenos e como molécula sinalizadora em diversos processos fisiológicos nos
vertebrados (Dowling & Simmons 2009). Em invertebrados, muitos estudos têm relacionado a
produção de NO com os efeitos citotóxicos contra patógenos (Nappi & Ottaviani 2000, Gourdon
et al. 2001, Foley & O` Farel 2003), sendo o aumento da sua produção pelos hemócitos
correlacionado com a resposta contra agentes estranhos (Faraldo et al. 2005).
Diante da existência de diferentes mecanismos de resistência a B. thuringiensis e devido à
facilidade com que P. xylostella evolui para a resistência, esta pesquisa testou as hipóteses de que
alterações quantitativas e qualitativas nos hemócitos de larvas de P. xylostella, bem como
modificações nos níveis de óxido nítrico produzido na hemolinfa dos insetos tratados com
formulações a base de B. thuringiensis, possam estar relacionadas à resistência desse inseto.
Material e Métodos
A pesquisa foi desenvolvida nos Laboratórios de Interação Insetos-Tóxicos e Controle
Biológico e Ecologia de Insetos, ambos pertencentes ao Departamento de Agronomia, e no
12
Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da Universidade
Federal Rural de Pernambuco (UFRPE).
Obtenção e manutenção dos insetos. Foram utilizadas duas populações de P. xylostella: uma
suscetível e outra resistente às formulações comerciais Dipel
®
(B. thuringiensis var. kurstaki HD-
1, contendo Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa Cry2Ab) e XenTari
®
(B. thuringiensis var.
aizawai ATTC SD-1372, contendo Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C, Cry1D) obtidas de coletas
realizadas em cultivos de brássicas nos municípios de Recife-PE (população suscetível) e
Camocim de São Félix-PE (população resistente). As duas populações foram mantidas
individualmente no Laboratório de Interações Insetos-Tóxicos do Departamento de Agronomia
da Área de Fitossanidade da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), alimentadas
com folhas de couve Brassica oleracea var. acephala sem contato com inseticidas. A população
de Recife– PE tem sido mantida desde 1998 em condições de laboratório, enquanto que a
população de Camocim de São Félix-PE foi coletada durante a realização do experimento em
área com relato de dificuldade de controle e aplicação dos inseticidas Dipel
®
e XenTari
®
. Os
insetos coletados em Camocim de São Félix-PE foram levados para o laboratório onde foram
multiplicados e utilizados na F-1 para realização dos testes de suscetibilidade e para coleta da
hemolinfa.
Ensaios de suscetibilidade. Curvas de concentração-resposta foram estabelecidas para os
inseticidas Dipel
®
e XenTari
®
com as duas populações através de bioensaios para verificação da
suscetibilidade/resistência e obtenção das concentrações a serem utilizadas nos experimentos
subseqüentes. Para a realização dos bioensaios, discos de folhas de couve de 5 cm de diâmetro
foram lavados em solução de hipoclorito de sódio a 5%, enxaguados em água corrente e tratados
com concentrações crescentes dos inseticidas. Após secagem a temperatura ambiente, os discos
foram transferidos para placas de Petri (60 x 15 mm), contendo papel de filtro (5 cm) umedecido
13
com água destilada. Foram utilizadas sete concentrações de cada inseticida em água destilada
com o espalhante adesivo Triton X-100 a 0,01%, sendo cada concentração testada em triplicada.
As concentrações utilizadas para a população suscetível foram 0,062; 0,125; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e
4,0 mg/L (Dipel
®
) e 1,56; 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 mg/L (XenTari
®
). Para a população
resistente as concentrações utilizadas foram 12,5; 25; 50; 100; 200; 400 e 800 mg/L (Dipel
®
) e
50; 100; 200; 400; 600; 800 e 1000 mg/L (XenTari
®
). A testemunha contou de folhas tratadas em
água destilada com Triton X-100 na mesma concentração. Para cada placa foram transferidas 10
larvas de segundo ínstar, em seguida estas foram mantidas em câmara climatizada com
temperatura de 25 ± 1 ºC, umidade relativa de 60 ± 10% e fotofase de 12 h onde permaneceram
por 72 h. Após este intervalo de tempo a mortalidade foi avaliada e os dados submetidos à análise
de Probit utilizando o programa POLO-PC (LeOra Software 1987). Os valores de CL
50
foram
estimados e a razão de resistência entre as populações foi obtida dividindo-se a CL
50
da
população resistente pela CL
50
da população suscetível para ambos inseticidas.
Caracterização, contagem total e diferencial dos hemócitos. Foram realizadas coletas de
hemolinfa de insetos no quarto ínstar larval, submetidos aos seguintes tratamentos com as CL
50
s
estimadas através dos ensaios de suscetibilidade: larvas alimentadas com folhas de couve tratadas
com Dipel
®
, XenTari
®
,
além da testemunha (água destilada contendo o espalhante adesivo Triton
X-100 a 0,01%) de ambas as populações. Discos de folhas de 7 cm de diâmetro foram imersos
por 30 segundos no inseticida a ser utilizado e após secagem à temperatura ambiente foram
postos em placas de Petri (80 x 15 mm) sobre papel de filtro (7 cm) levemente umedecido com
água destilada. As coletas foram realizadas nos intervalos de 1, 6 e 12 h após os tratamentos. Para
contagem total de hemócitos realizou-se uma pequena incisão entre as falsas pernas dos insetos e
uma alíquota de 0,5 µL de hemolinfa de duas larvas (total de 1 µL) foi diluída em 9 µL de
solução anticoagulante II para insetos (Mead 1986). O material coletado foi depositado em
14
câmara de Neubauer e a contagem realizada mediante observação em microscópio óptico de luz
OLYMPUS
®
BX-49. A contagem diferencial foi feita por meio da técnica de perfusão, descrita
em Brayner et al. (2005). Com um capilar de vidro foi injetada solução anticoagulante para
insetos no corpo de larvas com posterior sucção da hemolinfa. Esta foi, então, depositada em
lâminas de vidro, sendo confeccionadas 10 lâminas, constituindo 10 repetições para cada
intervalo de tempo/tratamento, contendo hemolinfa de 10 insetos cada. As lâminas foram secas à
temperatura ambiente, coradas com Giemsa e observadas em microscópio óptico de luz
da marca
OLYMPUS
®
BX-49. A caracterização dos hemócitos foi realizada em lâminas confeccionadas
com a hemolinfa das larvas da testemunha. Para análise da dinâmica hemocitária e verificação de
possíveis alterações morfológicas nos tipos celulares, foram observadas e contadas 300 células
(Falleiros et al. 2003) por lâmina de todos os tratamentos. Os dados das contagens total e
diferencial foram submetidos à análise de variância em esquema fatorial 3 x 2 x 3, considerando
os três tratamentos (testemunha, Dipel
®
e XenTari
®
), as duas populações e os três intervalos de
avaliação, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey HSD a 5% de probabilidade e,
quando necessário, comparadas através do teste t. Após teste de normalidade, os dados da
contagem total foram transformados para log (x + 1), enquanto que os da contagem diferencial
foram transformados em raiz (x + 0,5), apenas para análise dos prohemócitos, esferulócitos,
adipohemócitos e oenocitóides. As análises foram realizadas utilizando-se o programa estatístico
SAS (SAS Institute, 1999-2001)
.
Análise dos níveis de óxido nítrico na hemolinfa. A produção de óxido nítrico foi determinada
com base no reagente de Griess (Green et al. 1981), conforme metodologia descrita em Faraldo et
al. (2005). Foram realizadas comparações das concentrações do íon nitrito (NO
2
-
) nas amostras
de hemolinfa coletadas nos intervalos de 1, 6, 12 h após tratamento com as formulações de B.
thuringiensis. Cada amostra constou da coleta de hemolinfa de dez insetos de quarto ínstar,
15
totalizando 5 µL, os quais foram depositados em tubo Eppendorf contendo 55 µL de
sulfanilamida (1%) em H
3
PO
4
(5%). Após coleta, as amostras foram armazenadas a -20ºC até o
momento da utilização. Para determinar as concentrações de NO
2
-
,
uma alíquota de 30 µL de cada
amostra/intervalo/tratamento (cinco amostras no total) foi depositada em placa de fundo chato de
96 poços contendo 30 µL de naphthylenediamine dihydrochloride (NEED, Sigma, St. Louis,
MO). Após cinco minutos, a absorbância foi medida com um leitor de microplacas (Biotek®)
com filtro de 562 nm. O NO
2
-
foi quantificado usando uma curva padrão de NaNO
2
como
referência. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância em esquema fatorial 3 x 2 x
3, considerando os três tratamentos (testemunha, Dipel
®
e XenTari
®
), as duas populações e os
três intervalos de avaliação, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey HSD a 5% de
probabilidade e quando necessário comparadas através do teste t. Após teste de normalidade, os
dados foram transformados em raiz (x + 0,5), utilizando-se o programa estatístico SAS (SAS
Institute 1999-2001).
Resultados
As CL
50s
estimadas para a população de Recife-PE foram de 1,3 mg/L para Dipel
®
e 5,1
mg/L para XenTari
®
, sendo esta população considerada como suscetível por apresentar valores de
CL
50
inferiores quando comparada com a população de Camocim de São Félix-PE, cujos valores
obtidos foram de 64,9 mg/L e 236,2 mg/L, para Dipel
®
e XenTari
®
respectivamente. Pelo cálculo
da razão de resistência, a população de Camocim de São Félix-PE apresentou 49,9 vezes mais
resistente ao Dipel
®
e 46,3 vezes mais resistente ao XenTari
®
(Tabela 1).
Na contagem total de hemócitos circulantes na hemolinfa de larvas do quarto ínstar de P.
xylostella, verificou-se que o número total dessas células na população resistente foi
significativamente menor em comparação com a população suscetível. Os insetos de ambas as
16
populações apresentaram redução significativa no número total de hemócitos após exposição ao
Dipel
®
, não sendo detectada variação significativa no número de hemócitos dos insetos
submetidos ao XenTari
®
(Fig. 1). Não foram verificadas diferenças entre os intervalos de tempo
analisados (F = 2,57, P = 0,0795).
A análise morfológica revelou a existência de seis tipos celulares na hemolinfa de P.
xylostella: plasmatócitos, granulócitos, prohemócitos, esferulócitos, adipohemócitos e
oenocitóides (Fig. 2).
Não foram observadas alterações morfológicas nesses tipos celulares
decorrentes dos tratamentos com Dipel
®
e XenTari
®
, tanto nos insetos suscetíveis quanto nos
resistentes.
Os tipos celulares mais abundantes na hemolinfa de P. xylostella na população resistente
foram os plamatócitos e os granulócitos com percentuais de 84,01% e 9,2% respectivamente,
seguidos dos esferulócitos (3,03%), oenocitóides (2,4%), adipohemócitos (0,76%) e
prohemócitos (0,6%). Na população suscetível também os plasmatócitos e os granulócitos foram
os tipos celulares mais freqüentes com percentuais de 81,53% e 12,86%, respectivamente. As
outras células apresentaram os seguintes percentuais: oenocitóides (2,21%), adipohemócitos
(1,8%), esferulócitos (0,98%) e prohemócitos (0,62%).
Diferenças significativas na quantidade dos tipos celulares foram verificadas entre as
populações, pois insetos resistentes apresentaram maior quantidade de plasmatócitos,
prohemócitos e esferulócitos que os insetos suscetíveis, enquanto que estes exibiram maior
número de granulócitos e adipohemócitos. Os oenocitóides foram as únicas células que não
diferiram significativamente em quantidade entre as populações (F = 0,01, P = 0,9030) (Fig. 3).
A análise de variância mostrou que plasmatócitos, granulócitos, prohemócitos e
oenocitóides não apresentaram interação população x tratamento, sendo então os dados de ambas
as populações agrupados para observação da variação quantitativa desses tipos celulares em
17
função da exposição aos inseticidas. Nos insetos tratados com XenTari
®
, o número de
plasmatócitos aumentou significativamente, enquanto que granulócitos, prohemócitos e
oenocitóides sofreram redução acentuada em relação à testemunha. Com relação ao inseticida
Dipel
®
verificaram-se apenas diferenças significativas dos oenocitóides em relação à testemunha
(Fig. 4).
Os esferulócitos e adipohemócitos foram os únicos tipos celulares que variaram
diferentemente entre as populações mediante tratamento com os inseticidas. O número de
esferulócitos foi significativamente maior na testemunha e nos insetos tratados com XenTari
®
na
população resistente em relação a população suscetível. Insetos suscetíveis apresentaram menor
número dessas células quando tratados com XenTari
®
em relação a Dipel
®
, embora não tenham
diferido significativamente da testemunha, nos insetos resistentes, seu número foi
significativamente menor nos insetos tratados com XenTari
®
em comparação com a testemunha
(Fig. 5). Com relação aos adipohemócitos, a população suscetível apresentou quantidade
significativamente maior dessas células na testemunha e nos insetos tratados com Dipel
®
que a
população resistente. Nos insetos resistentes, o número dessas células não variou
significativamente entre os tratamentos, enquanto que nos suscetíveis reduziram
significativamente após tratamento com o XenTari
®
(Fig. 6).
Variações em função dos tempos de avaliação foram significativas apenas para os
prohemócitos e adipohemócitos, os quais sofreram redução significativa no intervalo de 6 horas
(F = 3,18, P = 0,0440 e F = 3,55, P = 0,0307, respectivamente). Analisando estatisticamente a
interação entre os tratamentos e intervalo de tempo verificou-se, que apenas no intervalo de 1 h,
houve redução acentuada dos adipohemócitos em relação à testemunha, sendo esta mais
significativa para XenTari
®
(F = 3,37, P = 0,0112).
18
Os níveis de óxido nítrico não diferiram entre as populações (F = 0,81, P = 0,4469), desta
forma os dados das duas populações foram agrupados para analisar os efeitos do tempo e dos
tratamentos. A concentração de óxido nítrico aumentou nos insetos tratados com inseticidas em
relação à testemunha, sendo mais elevada no intervalo de 12 h diferindo da testemunha em ambos
os tratamentos (Tabela 2).
Discussão
De acordo com a análise morfológica, foram encontrados seis tipos celulares na hemolinfa
de P. xylostella os quais seguiram o padrão morfológico descrito por outros autores para a Ordem
Lepidoptera (Falleiros et al. 2003, Andrade et al. 2003, Negreiro et al. 2004, Correia et al. 2008).
Tal achado além de contribuir para uma padronização dessas células serve de subsídio para
estudos fisiológicos envolvendo o inseto em questão.
A comparação estatística do hemograma de populações suscetível e resistente de larvas do
quarto ínstar de P. xylostella revelou que a população resistente apresentou significativamente
menor número de hemócitos circulantes, fato este também observado por Ericsson et al. (2009),
em linhagem resistente de Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) ao Bt. Este achado sugere
uma possível correlação entre a resistência e menor quantidade de hemócitos circulantes na
hemolinfa, indicando assim, que o número de hemócitos não é um fator determinante que poderia
contribuir com a resistência e que os tipos celulares e ou aumento da resposta humoral poderiam
estar diretamente relacionados com este processo, visto que na presente pesquisa a contagem
diferencial dos hemócitos nos insetos resistentes mostrou que os plasmatócitos, prohemócitos e
esferulócitos são as células mais numerosas nos insetos resistentes, quando comparados com os
insetos da população suscetível, sendo essas células envolvidas diretamente na resposta de defesa
celular (Lavine & Strand 2002, Costa et al. 2005, Ling et al. 2005,
Ling & Yu 2006).
19
Götz (1987) verificou que o número reduzido de hemócitos em larvas de Chironomus
(Insecta: Diptera), foi compensado pela rápida e eficiente capacidade de melanização quando este
inseto foi desafiado com elevado número de bactérias e de acordo com Ma et al. (2005) ao
analisarem linhagens suscetível e resistente de Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera:
Noctuidae), verificaram que insetos resistentes apresentaram elevada resposta humoral, traduzida
pela alta taxa de melanização no plasma e nos extratos intestinais em comparação com os
suscetíveis quando expostos à toxina Cry 1Ac. Esses autores também detectaram a presença de
uma glicoproteína solúvel na hemolinfa e no lúmen intestinal dos insetos resistentes com
capacidade de se ligar a toxina ativada de B. thuringiensis, evitando sua interação com os
receptores presentes no intestino.
Quando as larvas de P. xylostella de ambas as populações foram tratadas com os inseticidas
houve redução significativa no número total de hemócitos em resposta apenas ao Dipel
®
,
mostrando dessa forma que as formulações a base de Bt podem interferir diferentemente na
resposta imunológica independentemente da suscetibilidade ou não da praga. Essa redução pode
ter sido em decorrência do aumento da atividade celular, pois de acordo com Dubovskiy et al.
(2008) há um aumento da atividade fagocítica e da taxa de encapsulação em larvas de Galleria
mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) durante infecção ocasionada por doses subletais de B.
thuringiensis. Mostafa et al. (2005) verificaram elevada formação de nódulos na hemocele de
larvas de Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) alimentadas com trigo contendo B.
thuringiensis var. kurstaki. Assim, o provável envolvimento dos hemócitos de P. xylostella
nesses eventos justificaria a redução do número total dessas células na hemolinfa.
Embora o tratamento com XenTari
®
não tenha provocado modificação significativa no
número total de hemócitos, ocasionou variação na quantidade dos tipos celulares presentes na
hemolinfa de P. xylostella de ambas as populações. Enquanto o Dipel
®
foi efetivo apenas na
20
redução dos oenocitóides. As variações no número de plasmatócitos e granulócitos estão
provavelmente relacionadas à função desses tipos celulares, os quais apresentam envolvimento
direto com o processo de defesa celular através da fagocitose e da formação de nódulos
(Lavine &
Strand 2002)
. A redução dos granulócitos pode está relacionada ao envolvimento dessas células no
processo inicial de nodulação, já que são as primeiras células ao entrarem em contato com o corpo
estranho. De acordo com Dean et al. (2004) o processo de nodulação compreende os seguintes
passos: reconhecimento e aderência dos granulócitos aos microrganismos invasores, degranulação
dos granulócitos com conseqüente aglutinação dos microrganismos, recrutamento de plasmatócitos,
difusão dos plasmatócitos em torno do nódulo em crescimento, formação do nódulo e finalmente sua
remoção da circulação pela adesão a parede do corpo do inseto. O fato dos plasmatócitos só
participarem dos estágios finais desse processo justificaria o seu aumento.
O declínio de
prohemócitos e aumento dos plasmatócitos sugerem que os prohemócitos, os quais são células
indiferenciadas, tenham se diferenciado nesses tipos celulares, contribuindo assim para o seu
aumento (Yamashita & Iwabuchi 2001,
Jiravanichpaisal 2006). Este processo parece ocorrer
mais intensamente nos insetos resistentes, já que apresentam maior quantidade de prohemócitos e
plasmatócitos circulantes na hemolinfa, podendo isto contribuir de forma positiva na resposta
celular desses insetos. Vale ressaltar que as diferentes repostas aos inseticidas podem estar
relacionadas à composição destes uma vez que são compostos por diferentes toxinas Cry.
Uma vez que a formação de nódulos é geralmente acompanhada pelo processo de
melanização e esta resulta de reações de oxidação catalisadas pela enzima fenoloxidase, a lise de
oenocitóides para liberação dessa enzima explicaria a sua redução na hemolinfa. (Silva 2002,
Lavine & Strand 2002). A diminuição no número de adipohemócitos verificada nos insetos
suscetíveis tratados com XenTari poderia estar relacionada ao gasto das reservas energéticas
destas células para reparação dos danos ocasionados pelas toxinas Cry no intestino das larvas
21
(Hillyer & Christensen 2002). Já o declínio verificado no número de esferulócitos dos insetos
resistentes tratados com XenTari
®
possivelmente é devido ao fato dessas células mediarem a
produção e liberação de heteroaglutininas, atuantes na destruição de bactérias (Yeaton 1983).
Caracteristicamente, insetos resistentes apresentaram maior quantidade de esferulócitos, sendo
também o terceiro tipo celular mais freqüente na hemolinfa, o que atribuiria vantagem a esses
insetos em relação aos suscetíveis dada a atuação deste tipo celular na defesa contra bactérias.
A produção de óxido nítrico não diferiu entre as populações, no entanto, os insetos tratados
com os inseticidas apresentaram produção mais elevada em relação à testemunha no intervalo de
12 h, evidenciando o envolvimento desta molécula no processo imune de defesa de P. xylostella.
O aumento na produção de óxido nítrico tem sido mencionado na literatura em insetos desafiados
por patógenos e parasitóides, Nappi et al. (2000) detectaram aumento na produção de óxido
nítrico durante processo de encapsulação em larvas de Drosophila melanogaster (Diptera:
Drosophilidae) e D. teissieri (Diptera: Drosophilidae) em resposta a presença de ovos do
parasitóide Leptopilina boulardi (Hymenoptera: Figitidae). Faraldo et al. (2005) verificaram
elevada produção desta molécula em Chrysomya megacephala (Diptera: Calliphoridae) após
inoculação com a levedura Saccharomyces cerevisiae, verificando diferenças entre os diferentes
períodos de avaliação, pois um pico na produção ocorreu com 24 horas, seguido por uma redução
48 horas após tratamento. Os autores atribuíram este fato a possível tentativa de controlar a
proliferação do microrganismo na hemocele.
Diante dos resultados obtidos, conclui-se que larvas do quarto ínstar de populações
resistente e suscetível de P. xylostella apresentaram resposta celular diferenciada aos inseticidas
Bt, sendo o Dipel
®
efetivo na redução do número total de hemócitos, enquanto que o XenTari
®
alterou de forma significativa a contagem diferencial dessas células sem, no entanto, diferirem
quanto a produção de óxido nítrico. Larvas da população resistente apresentaram menor número
22
total de hemócitos circulantes, porém contém quantidade elevada de plasmatócitos, prohemócitos
e esferulócitos, o que pode ser um fator relacionado com a resistência da traça-das-crucíferas.
Mediante o exposto, estudos complementares envolvendo outros mecanismos humorais tornam-
se relevantes para averiguar o possível envolvimento na resistência de P. xylostella.
Agradecimentos
À FACEPE pela concessão da bolsa de estudo ao primeiro autor, possibilitando a realização
deste trabalho.
Literatura Citada
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28
Tabela 1. Suscetibilidade das populações de Plutella xylostella aos inseticidas Dipel
®
e
XenTari
®
após 72 h de exposição.
População Inseticida N
(1)
Inclinação±EPM
(2)
CL
50
(IC 95%) mg/L
(3)
χ
2(4)
RR
(5)
Dipel
®
213 1, 30 ± 0,18 1, 3 (0, 95 - 2, 10) 4, 64 -
Recife- PE
XenTari
®
184 2, 47 ± 0, 33 5, 1 (4, 01 - 6, 58) 4, 66 -
Dipel
®
209 1, 24 ± 0,17 64, 9 (43, 89 - 43, 89) 4, 25 49,9
Camocim-PE
XenTari
®
214 2, 81 ± 0,29 236, 2 (193, 80 - 283, 11) 3, 72 46,3
1
Número total de insetos usados em cada bioensaio.
2
Erro padrão da média.
3
Concentração letal em miligramas de ingrediente ativo por litro de água para 50% dos insetos
com intervalo de confiança de 95% e 5 graus de liberdade.
4
Teste de qui-quadrado (P>0,05).
5
Razão de resistência: CL
50
da população resistente/CL
50
da população suscetível.
29
Tabela 2. Concentrações de óxido nítrico (µM de NO
2
-
/µL de hemolinfa)
em larvas de
Plutella. xylostella das populações suscetível e resistente agrupadas submetidas aos inseticidas
Dipel
®
e XenTari
®
em diferentes intervalos de tempo.
Tratamento Tempo N Média(±EP) Estatística
1
F=6,62;
P =0,0001
1 10 6.6±0.63 a A
Testemunha 6 10 5.0±0.34 a A
12 10 4.4±0.13 a B
1 9 5.2± 0,17a A
Dipel
®
6 10 5.0±0.18 a A
12 10 5.8±0.22 a A
1 10 5.4±0.50 a A
XenTari
®
6 10 6.1±0.29 a A
12 10 6.1±0.29 a A
¹Médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
significativamente entre si pelo teste de Tukey HSD (P>0,05).
30
Testemunha Dipel® XenTari®
Hemócitos x 10³/µL de hemolinfa
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Suscetível
Resistente
Figura 1. Número total de hemócitos de larvas de Plutella xylostella
(Média ± EP), suscetíveis e
resistentes, após tratamento com Dipel
®
e XenTari
®
. *Estatisticamente significante entre as
populações dento de cada tratamento pelo teste t (P<0,05).
Médias indicadas com mesma letra
maiúscula entre os tratamentos para a população suscetível e minúscula para população resistente,
não diferem pelo teste de Tukey HSD a 5% de probabilidade.
31
Figura 2. Hemócitos de larvas de Plutella xylostella. Plasmatócito (A) exibindo prolongamentos
citoplasmáticos (seta). Granulócito (B) com grande quantidade de grânulos irregulares no
citoplasma (seta), encobrindo o núcleo. Prohemócito (C) apresentando núcleo volumoso (N) e
escasso citoplasma. Adipohemócito (D) com gotículas de lipídios de forma e tamanhos
irregulares no citoplasma (seta) próximas ao núcleo (N). Esferulócito (E) com vesículas (seta)
dispostas em torno do núcleo (N). Oenocitóide (D) caracterizado pelo seu tamanho volumoso e
núcleo excêntrico (N). Coloração Giemsa. Barras = 10 µm.
D
F
B
N
N
N
N
C
E
A
32
Pl Gr Pr Es Ad Oe
Hemócitos (%)
0
20
40
60
80
100
Suscetível
Resistente
*
*
*
*
*
Figura 3. Diferenças quantitativas
(Média ± EP) de cada tipo celular (Pl: plasmatócito, Gr:
granulócito, Pr: prohemócito, Es: esferulócito e Oe: oenocitóide) entre larvas Plutella xylostella
suscetíveis e resistentes.
*Estatisticamente significante entre as populações pelo teste t (P<0,05).
33
Pl Gr Pr Oe
Hemócitos (%)
0
20
40
60
80
100
Testemunha
Dipel
XenTari
b
a
b
a
a
b
a
ab b
a
b
b
®
®
Figura 4.
Média (± EP) da contagem diferencial dos hemócitos de larvas de Plutella xylostella após
exposição aos inseticidas Dipel
®
e Xentari
®
. Pl: plasmatócito, Gr: granulócito, Pr: prohemócito e Oe:
oenocitóide de ambas as populações. Médias com mesma letra não diferem entre os tratamentos para
cada tipo celular pelo teste de Tukey HSD a 5% de probabilidade.
34
Figura 5.
Média (± EP) da contagem de esferulócitos de larvas de Plutella xylostella após exposição
aos inseticidas Dipel
®
e XenTari
®
. Médias com mesma letra não diferem entre os tratamentos dentro
de cada população pelo teste de Tukey HSD a 5% de probabilidade. *Significativo entre as
populações pelo teste de Fisher (P<0,05).
Suscetível Resistente
Esferulócitos (%)
0
1
2
3
4
Testemunha
Dipel
XenTari
b
a
ab
b
a
ab
*
*
®
®
35
Figura 6. Média (± EP) da contagem de adipohemócitos de larvas de Plutella xylostella após
exposição aos inseticidas Dipel
®
e Xentari
®
. Médias com mesma letra não diferem entre os
tratamentos
dentro de cada população pelo teste de Tukey HSD a 5% de probabilidade.
*
Significativo entre as populações pelo teste de Fisher (P<0,05).
Suscetível Resistente
Adipohemócitos (%)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Testemunha
Dipel
XenTari
a
a
b
a
a
a
*
*
®
®
36
CAPÍTULO 3
HISTOPATOLOGIA DO MESÊNTERO DE POPULAÇÕES RESISTENTE E SUSCETÍVEL
DE Plutella xylostella (L.) (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE) FRENTE A FORMULAÇÕES
COMERCIAIS À BASE DE Bacillus thuringiensis BERLINER
L
ÍLIAN M.S. RIBEIRO
1
, VALÉRIA WANDERLEY-TEIXEIRA
2
, HERBERT A.A. SIQUEIRA
1
, ANA
J
ANAINA J.M. LEMOS
2
E ÁLVARO A.C. TEIXEIRA
2
1
Departamento de Agronomia-Entomologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Av.
Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE.
2
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE.
Ribeiro, L.M.S., V. Wanderley-Teixeira, H.A.A. Siqueira, A.J.J.M. Lemos & A.A.C. Teixeira.
Histopatologia do mesêntero de populações resistente e suscetível de Plutella xylostella (L.)
(Lepidoptera: Plutellidae) frente a formulações comerciais à base de Bacillus thuringiensis
Berliner. A Ser submetido a Micron.
37
RESUMO – A resistência de Plutella xylostella (L.) ao Bacillus thuringiensis Berliner pode ser
atribuída a alterações nos receptores de membrana das células colunares do mesêntero.
Entretanto, outros mecanismos ou combinação destes também podem reduzir a toxicidade das
toxinas Bt. A pesquisa testou as hipóteses de que populações suscetível e resistente de P.
xylostella, apresentam alterações histopatológicas diferenciadas no mesêntero, tais como:
alterações morfológicas, hiperplasia e hipertrofia das células regenerativas, bem como alterações
histoquímicas e que insetos resistentes após exposição às formulações Bt apresentam capacidade
de recuperação do mesêntero. Utilizou-se uma população suscetível (PS) e outra resistente (PR)
da traça ao Dipel
®
e XenTari
®
. Insetos expostos às seguintes concentrações: Dipel
®
1,35 mg/L
(PS), 64,93 mg/L (PR) e XenTari
®
5,17 mg/L (PS), 236,24 mg/L (PR) além da testemunha,
tiveram o mesêntero coletado nos intervalos: 0, 1, 6 e 12 h e processado para análise em
microscopia de luz. A quantificação das células regenerativas foi efetuada através do aplicativo
de pontos, associado ao programa ImageLab 2000. De acordo com os resultados, conclui-se que,
embora os inseticidas estudados tenham ocasionado alterações histopatológicas, de intensidades
diferentes, no mesêntero em ambas as populações, o Dipel
®
mostrou ser mais agressivo
independente da população. A presença de esferites revestindo a lâmina epitelial, a hipertrofia das
células colunares e a riqueza de muco podem estar envolvidas na preservação do mesêntero em
larvas da população resistente.
PALAVRAS-CHAVE: Traça-das-crucíferas, resistência, inseticida biológico, morfologia
38
MIDGUT HISTOPATHOLOGY OF Plutella xylostella (L.) (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE)
RESISTANCE AND SUSCEPTIBLE POPULATIONS STAND UP TO COMERCIAL
FORMULATIONS OF Bacillus thuringiensis BERLINER
ABSTRACT – The resistance of Plutella xylostella (L.) to Bacillus thuringiensis Berliner has
been attributed to alterations in receptors from columnares cells of midgut. However, other
mechanisms or the combinations of these can also decrease the activity of Bt toxins. This study
tested the hypothesis that the susceptible and resistant population of P. xylostella, presents
differentiated histopathological alterations in midgut, such as morphological alterations,
hyperplasia and hypertrophy of regenerative cells, as well histochemical alterations and that
resistant insects after exposition to Bt formulations shows capacity to recover the midgut
epitelium. It were used a susceptible population (SP) and other resistant (RP) of the moth to
Dipel
®
e XenTari
®
. Insects were exposed to the following concentrations: Dipel
®
1,35 mg/L (SP),
64,93mg/L (RP); XenTari
®
5,17 mg/L (SP), 236,24 mg/L (RP), besides an untreated control, had
midgut collected in intervals of 1, 6 and 12 h and processed for analyses to light microscopy. The
quantification of regenerative cells was performed through applicative of points, associated to
ImageLab 2000 program. In accord with the results it was concluded that nevertheless the studied
insecticides had been provoked histopathological alterations of different intensities in midgut of
both populations, the Dipel
®
showed to be more aggressive independently of the population. The
presence of spherites covering the epithelial lamina, the hypertrophy of columnar cells and mucus
abundance can be involved in midgut preservation in larvae of resistant population.
KEY WORDS: Diamondback moth, resistance, biological insecticide, morphology
39
Introdução
A traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae), é considerada a
principal praga em todas as regiões que cultivam espécies da família Brassicaceae (Castelo
Branco & Gatehouse 2001). Seu controle se caracteriza pela intensa utilização de inseticidas,
havendo relatos de até dezesseis aplicações por cultivo (Dias et al. 2004), o que tem acarretado
problemas à saúde do agricultor, danos ao meio ambiente, além de proporcionar a seleção de
populações da praga resistentes a diversos compostos químicos como piretróides e
organofosforados (Vasquez 1995, Castelo Branco & Gatehouse 1997).
Bioinseticidas a base de proteínas tóxicas produzidas por Bacillus thuringiensis Berliner
surgiram como uma alternativa segura e eficaz à utilização de produtos químicos, constituindo
uma das mais importantes ferramentas no estabelecimento do manejo integrado de pragas. No
entanto, várias pesquisas vêm demonstrando também o desenvolvimento de resistência de P.
xylostella às toxinas de B. thuringiensis, tanto em campo quanto em laboratório (Tabashnik 1994,
Wright et al. 1997, Sayyed et al. 2000).
O canal alimentar representa uma área de contato entre os insetos e o meio ambiente, sendo
o foco de grande parte das pesquisas para se controlar o ataque de pragas (Chapman 1998, Levy
et al. 2004), principalmente a região do mesêntero, pois alterações nessa região podem afetar o
crescimento e o desenvolvimento dos mesmos, bem como todos os eventos fisiológicos, os quais
dependem da alimentação adequada, de sua absorção e transformação [Mordue (Luntz) &
Blackwell 1993, Mordue (Luntz) & Nisbet 2000]. Em insetos da Ordem Lepidoptera, o epitélio
do mesêntero é composto por quatro tipos de células, as quais estão envolvidas nos processos de
absorção e secreção de enzimas (células colunares), homeostase iônica (células caliciformes),
40
função endócrina (células endócrinas) e na renovação do epitélio (células regenerativas) (Terra et
al. 2006, Pinheiro et al. 2008a).
A resistência da traça a B. thuringiensis pode ser atribuída a alterações nos receptores de
membrana localizados nas células colunares do mesêntero, ocasionando perda ou redução na
ligação da toxina ao receptor, e conseqüente perda da eficiência do inseticida (Ferré & Van Rie
2002, Sayyed et al. 2004). No entanto, outros mecanismos ou combinação destes também podem
reduzir a toxicidade das toxinas Bt, tais como mudanças no processamento proteolítico,
mudanças de pH no lúmen do mesêntero (Ma et al. 2005) e recuperação das células do intestino
após exposição às toxinas (Loeb et al. 2001).
Diante do surgimento de populações resistentes ao Bt, a presente pesquisa objetivou testar
as hipóteses de que populações suscetível e resistente de P. xylostella, apresentam alterações
histopatológicas diferenciadas no mesêntero, tais como: alterações morfológicas, hiperplasia e
hipertrofia das células regenerativas, bem como alterações histoquímicas após exposição às
formulações comerciais à base de B. thuringiensis e de que insetos resistentes apresentam
capacidade de recuperação do mesêntero após exposição às concentrações testadas.
Material e Métodos
A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Interação Insetos-Tóxicos do Departamento
de Agronomia e no Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia e Fisiologia
Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE).
Obtenção e manutenção dos insetos. Foram utilizadas duas populações de P. xylostella: uma
suscetível e outra resistente às formulações comerciais Dipel
®
(B. thuringiensis var. kurstaki HD-
1 com Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa Cry2Ab) e XenTari
®
(B. thuringiensis var. aizawai
ATTC SD-1372 com Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C, Cry1D) obtidas de coletas realizadas em cultivos
41
de brássicas nos municípios de Recife-PE (população suscetível) e Camocim de São Félix-PE
(população resistente). As duas populações foram mantidas individualmente no Laboratório de
Interações Insetos-Tóxicos do Departamento de Agronomia da Área de Fitossanidade da
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) alimentadas com folhas de couve Brassica
oleracea var. acephala sem contato com inseticidas. A população de Recife – PE tem sido
mantida desde 1998 em condições de laboratório, enquanto que a população de Camocim de São
Félix-PE foi coletada durante a realização do experimento em área com relato de dificuldade de
controle e aplicação dos inseticidas Dipel
®
e XenTari
®
, os insetos coletados foram levados para o
laboratório onde foram multiplicados e utilizados na F-1 para realização dos testes de
suscetibilidade e montagem dos bionsaios para coleta do canal alimentar.
Coleta do mesêntero para análise em microscopia de luz e histoquímica. Curvas de
concentração-resposta foram estabelecidas para os inseticidas Dipel
®
e XenTari
®
com as duas
populações através de bioensaios para verificação da suscetibilidade/resistência e obtenção das
concentrações a serem utilizadas no experimento. Insetos do quarto ínstar larval de cada
população foram expostos por 24 h às CL
50s
estimadas para cada inseticida através das curvas de
concentração-resposta, perfazendo os seguintes tratamentos: larvas alimentadas com discos de
folhas de couve tratadas com Dipel
®
nas concentrações de 1,35 mg/L (população suscetível) e
64,93 mg/L (população resistente); larvas alimentadas com discos de folhas de couve tratadas
com XenTari
®
nas concentrações de 5,17 mg/L (população suscetível) e 236,24 mg/L (população
resistente) e larvas alimentadas com discos de folhas de couve tratadas com água destilada
contendo o espalhante adesivo Triton X-100 a 0,01% (testemunha). Em seguida, larvas de cada
tratamento alimentadas por 24 h (considerado intervalo de 0 h) foram dissecadas para remoção do
canal alimentar, e as outras restantes receberam folhas de couve não tratadas para coleta do canal
alimentar nos intervalos de 1, 6 e 12 h, seguindo a metodologia modificada de Knaak & Fiuza
42
(2005). Para descrição histológica do mesêntero e quantificação das células regenerativas, o
material coletado foi fixado em Formol a 10% com tampão Mollinig-Carson 0,1 M pH 7.2 por 24
h. A desidratação foi realizada em banhos crescentes de álcool etílico (70, 80 e 95%) por 10
minutos cada e a impregnação realizada em historesina Leica
®
durante 24 h. Cortes de 4 µm
obtidos em micrótomo Leica
®
RM 2245 foram corados com azul de toluidina. Para histoquímica
o material coletado foi fixado em Boüin aquoso por 24 h. Após o período de fixação foi realizada
a desidratação com banhos de álcool etílico (70, 90 e 100%) durante 10 minutos cada, em seguida
foram imersos por 10 minutos em Xilol (P.A) aquecido em estufa a 60 °C para diafanização. A
impregnação foi realizada em Paraplast diluídos em xilol nas seguintes proporções: 25, 50, 75 e
100% com 1 h cada e incluídos após o último banho. Os cortes obtidos através de um micrótomo
tipo Minot (LEICA
®
RM 2035) ajustado para 7 µm foram colocados em lâminas previamente
revestidas com albumina de Mayer e mantidas em estufa regulada à 37 ºC, durante 24 h. A
coloração das lâminas foi realizada pelo tricrômico de Mallory e P.A.S (Ácido Periódico de
Schiff), conforme a metodologia descrita por Behmer et al. (1976), Junqueira & Junqueira
(1983), Michalany (1990). Cada larva correspondeu a uma repetição, sendo utilizadas cinco
repetições/tratamento/intervalo.
Quantificação das células regenerativas. A quantificação foi realizada utilizando cinco secções
de cortes/tratamento/intervalo, corados pelo azul de toluidina, obtidas da região do mesêntero. A
captura de imagem foi efetuada por meio de câmera de vídeo Sony
®
acoplada ao microscópio
Olympus
®
Bx50. A morfometria foi realizada através do aplicativo de pontos, associado ao
programa ImageLab 2000 para Windows 3x. Em cada repetição (lâmina com a secção do corte)
foram contadas células regenerativas em todo o mesêntero. O número médio de células
regenerativas obtido nas amostras (repetições) de larvas de P. xylostella foi submetido a analise
43
de variância em esquema fatorial 3 x 4 considerando os três tratamentos (testemunha, Dipel
®
e
XenTari
®
) e quatro intervalos de avaliação (0, 1, 6 e 12 h) como fatores principais. No caso de
resposta significativa na quantidade de células regenerativas em função do intervalo de avaliação
após tratamento, os resultados foram submetidos à análise de regressão para a sua interpretação e
selecionadas as equações com base na sua significância (F e P) e maior coeficiente de
determinação (R
2
). As análises foram conduzidas utilizando o programa Estatístico SAS (SAS
Institute 1999-2001).
Resultados
Cortes histológicos do mesêntero de larvas do quarto ínstar de P. xylostella de ambas as
populações, suscetível e resistente, sem exposição às formulações Bt, alimentadas por 24 h com
folhas de couve tratadas apenas com água destilada mostraram que o epitélio é do tipo simples
apoiado em duas camadas de músculo, sendo a interna disposta circularmente e a externa
longitudinalmente (Fig. 1A). No epitélio foram identificados quatro tipos de células: colunares,
caliciformes, regenerativas e endócrinas distribuídas por toda a sua extensão. As células mais
freqüentes foram as colunares, células de tamanho variado com sua borda em escova
característica, núcleo com localização variando de central a apical e bastante heterocromático. As
células caliciformes caracterizaram-se pela presença de uma cavidade típica em forma de cálice
limitada pelas projeções da membrana plasmática, com núcleo basal. As células regenerativas
estão dispostas isoladamente na base do epitélio, com núcleo central e volumoso (Fig. 1B). A
célula endócrina foi observada na população suscetível, com morfologia alongada contendo
vários grânulos densos dispersos por todo o citoplasma, características típicas dessa célula (Fig.
2D).
44
Na população suscetível algumas células colunares exibiram grande quantidade de grânulos
citoplasmáticos bastante densos e dispersos, podendo também ser encontrados em fragmentos do
citoplasma no lúmen (Fig. 1C). Na região apical dessas células evidenciou-se ainda a presença de
vacúolos bem proeminentes (Fig. 1D). Já na população resistente notou-se que esses grânulos
densos estão localizados apenas na superfície da borda em escova e em contato com o alimento,
além de vesículas basófilas no lúmen do mesêntero (Figs. 1E e 1F).
Quando as larvas suscetíveis de P. xylostella foram expostas ao XenTari
®
, por 24 h o
mesêntero revelou áreas da lâmina epitelial íntegra (Fig. 2A) e áreas com alterações,
caracterizadas por apresentar células colunares bastante altas e bem vacuolizadas (Fig. 2B),
modificações na morfologia de algumas células caliciformes, as quais também apresentaram
grânulos densos e lúmen totalmente preenchido por material de secreção (Figs. 2C, 2D e 2E),
além de hipertrofia das células regenerativas (Fig. 2F). Já o mesêntero de larvas da população
resistente exposta ao mesmo inseticida pelo mesmo período apresentou o epitélio íntegro com
células colunares altas e células caliciformes apresentando morfologia padrão (Fig. 3A), porém
algumas células colunares apresentaram grande protuberância citoplasmática (Fig. 3B).
O tratamento com o Dipel
®
ocasionou alterações mais drásticas no mesêntero de larvas da
população suscetível produzindo uma desorganização total do tecido epitelial com áreas de
estratificação (metaplasia) sinalizando provavelmente uma tentativa de regeneração desse tecido
(Fig. 3C), além de afastamento das células. Verificou-se ainda que os grânulos densos
permaneciam no interior das células colunares (Fig. 3D). No entanto, analisando o mesêntero das
larvas da população resistente evidenciou-se que o epitélio continuava íntegro com células
colunares altas e várias células caliciformes. Os grânulos densos foram observados apenas na
superfície das células e em contato com o alimento (Figs. 3E e 3F).
45
Com o objetivo de esclarecer se ocorre ou não à recuperação da lâmina epitelial, larvas
tanto da população suscetível como da resistente após tratamento com os inseticidas por 24 h
foram em seguida alimentadas com folhas de couve sem tratamento e o mesêntero analisado nos
intervalos de 1, 6 e 12 h. Na população suscetível submetida ao XenTari
®
, após o intervalo de 1 h
verificou-se também metaplasia, porém algumas células colunares mostravam núcleos
vacuolizados, indicando processo degenerativo (Figs. 4A e 4B). No intervalo de 6 h é nítida a
intensa secreção das células caliciformes, vacuolização e formação de protuberâncias nas células
colunares, e o intenso afastamento entre essas células (Figs. 4C e 4D), e com 12 h evidenciou-se
parcial degradação do mesêntero (Fig. 4E). O tratamento com Dipel
®
foi extremamente agressivo
apresentando degeneração total do epitélio já no intervalo de 1 h (Fig. 4F).
Analisando o intervalo de 1 h após tratamento com XenTari
®
, as larvas da população
resistente mostrou a lâmina epitelial do mesêntero completamente revestida pelos grânulos
densos (Fig. 5A) e epitélio íntegro, embora tenha sido observado vacuolização proeminente e
hipertrofia das células colunares, além de alterações em algumas células caliciformes em
determinadas áreas (Fig. 5B). Essas características também permaneceram nos intervalos de 6 e
12 h. Com Dipel
®
a lâmina epitelial apresentou áreas de metaplasia (Fig. 5C), células colunares
com núcleo e citoplasma vacuolizados (Fig. 5D) e intensa secreção das células caliciformes (Fig.
5E), nos intervalos de 1 e 6 h. No intervalo de 12 h evidenciou-se degradação do mesêntero (Fig.
5F).
Histoquimicamente as larvas da população suscetível e resistente sem e com exposição aos
inseticidas por 24 h mostraram reação positiva pelo tricrômico de Mallory apenas na superfície
da lâmina epitelial, fato este também observado nas larvas da população suscetível nos intervalos
estudados (Figs. 6A e 6B). Contudo nas larvas da população resistente evidenciou-se um aumento
significativo da secreção no interior das células caliciformes semelhantemente em todos os
46
intervalos, quando comparado com o tratamento com 24 h e em relação à população suscetível
(Figs. 6C e 6D). A reação pelo P.A.S. mostrou-se mais positiva nas larvas suscetíveis em todos os
tratamentos e intervalos de tempo quando comparado com as larvas da população resistente
(Figs. 6E e 6F).
A análise quantitativa das células regenerativas mostrou que os tratamentos com os
inseticidas nas larvas da população suscetível ocasionaram uma redução significativa dessas
células apenas no tratamento com o Dipel
®
, a partir do intervalo de 1 h (Fig. 7). No entanto, nas
larvas da população resistente verificou-se uma redução significativa dessas células no tratamento
com Dipel
®
somente a partir do intervalo de 6 h e com XenTari
®
no intervalo 12 h (Fig. 8).
Discussão
Histologicamente o mesêntero de larvas do quarto ínstar de P. xylostella de ambas as
populações, sem exposição às formulações Bt mostraram as mesmas características descritas para
os insetos da Ordem Lepidoptera (Cristofoletti et al. 2001, Pinheiro et al. 2003, Sousa et al.
2009). No epitélio evidenciaram-se as células colunares, caliciformes, regenerativas e endócrinas
(tipo fechada) (Cavalcante & Cruz-Landim 1999), sendo esta última não identificada facilmente
na microscopia de luz pelas técnicas de rotina, corroborando as informações de Pinheiro et al.
(2008a) e Sousa et al. (2009) os quais citam a necessidade de análise ultraestrutural e
imunohistoquímica.
Os grânulos densos observados nas células e lúmen do mesêntero se assemelham às
estruturas denominadas de esferites, descritas em células de diferentes órgãos em invertebrados,
além da presença no mesêntero de insetos (Cruz-Landim 2000, Serrão & Cruz-Landim 2000).
Vários autores têm relatado que estes grânulos estão associados com excreção de íons e
detoxificação celular (Cruz-Landim 2000, Lipovsek et al. 2002, 2004), e alguns estudos têm
47
demonstrado a liberação de esferites para o lúmen intestinal (Serrão & Cruz-Landim 1996). Os
esferites são relacionados também ao processo de transporte rápido de fluidos e excreção de
metais pesados, materiais orgânicos, e materiais inorgânicos armazenado por eles (Hazelton et al.
2001). Assim, podemos supor que os grânulos densos encontrados revestindo a superfície na
lâmina epitelial exerceu um efeito protetor a formulação do XenTari
®
, nas larvas da população
resistente. Este resultado corrobora Pinheiro et al. (2008b) os quais observaram que os esferites
foram mais numerosos no mesêntero de larvas de D. saccharalis parasitadas com Cotesia flavipes
(Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) do que em larvas não parasitadas.
Algumas células colunares apresentaram rica vacuolização quando expostas ao Bt. É sabido
que essa bactéria ocasiona alterações na membrana celular, e de acordo com Al-Jahdali & Bisher
(2007) e Sayım (2007) alterações na fisiologia da membrana podem levar a formação de vacúolos
citoplasmáticos que é uma manifestação comum de degeneração celular.
Quando as larvas suscetíveis foram expostas ao XenTari
®
, por 24 h o mesêntero apresentou
alterações histopatológicas similares, porém menos drásticas aos observados por Sousa (2009)
em estudos com Alabama argillacea (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae) após 20 minutos de
ingestão de cerca de 0,183±0,077ng de Cry1Ac, presente em algodão Bt AcalaDTL/-90B. Já nas
larvas resistentes o mesêntero apresentou-se íntegro mostrando, no entanto protuberâncias nas
células colunares. Segundo Pinheiro et al. (2008a) essas protuberâncias são resultantes do
processo de secreção apócrina de enzimas digestivas para o lúmen, porém Hakim et al. (2010)
mencionam que as protuberâncias podem estar associadas à morte celular, pois quando o
mesêntero é infectado por agentes microbianos, as células colunares incham e formam
protuberâncias apicais, liberando todo seu conteúdo no lúmen.
48
No presente estudo vesículas foram encontradas no lúmen do mesêntero das larvas
resistentes antes da exposição aos inseticidas, o que provavelmente está relacionado à secreção
apócrinas das células colunares, visto que se desprendiam das células e permaneciam no lúmen
intestinal. Oliveira et al. (2009) relataram presença de vesículas basófilas no mesêntero de larvas
Aedes aegypti L., A. albitarsis Lynch-Arribálzaga (Diptera: Culicidae) e Culex quinquefasciatus
Say (Diptera: Culicidae) quando expostas ou não as toxinas das linhagens 2362 e S1116 de B.
sphaericus (Neide).
A hipertrofia celular e de seus núcleos também foram relatadas por Ruiz et al. (2004) e
Pandey et al. (2009), em estudos realizados em larvas de A. aegypti . Anopheles albimanus
Wiedemman (Diptera: Culicidae) e C. quinquefasciatus expostas à toxina Cry11bB de B.
thunrigiensis Medellin, e em larvas de Spodoptera litura Fabricius (Lepidoptera: Noctuidae) após
ingestão de delta toxina do B. thunrigiensis, respectivamente. Segundo Kumar et al. (2004) a
hipertrofia representa uma resposta adaptativa das células ao aumento da exigência funcional,
aumento do estímulo hormonal e em decorrência de infecções por vírus, bactérias ou fungos. Nas
larvas das populações suscetível e resistente, tratadas com Dipel
®
foi observado metaplasia,
porém em decorrência do processo degenerativo da lâmina epitelial evidenciou-se redução do
número de células regenerativas, sendo este evento mais lento nas larvas resistente, pois só foi
visualizado a partir do intervalo de 6 h. A redução significativa das células regenerativas nas
larvas da população resistente exposta ao XenTari
®
no intervalo de 12 h, pode está relacionado a
hipertrofia das células colunares, pois devemos mencionar que através de técnicas de
imunohistoquimica, foi possível determinar que elas são as principais fonte de produção do fator
de diferenciação das células do mesêntero (MDF), e que seus níveis aumentam em culturas de
células colunares tratadas com Bt (Goto et al. 2000, Loeb et al. 2001, Hakim et al. 2010). Dessa
forma, é possível que as células colunares tenham liberado este fator promovendo a diferenciação
49
das células regenerativas levando assim uma redução do seu número. Esse evento não foi
verificado na população suscetível, uma vez que não ocorreu hipertrofia das células colunares.
Em ambas as populações verificaram-se aumento de secreção das células caliciformes,
entretanto, a análise histoquímica mostrou que a natureza de secreção nas larvas suscetíveis é de
carboidratos neutros (P.A.S. positivo) e nas larvas da população resistente é mucosa, pois o
tricrômico de Mallory reage com as mucinas ácidas (sialomucinas e sulfomucinas) presentes no
muco (Behmer et al. 1976, Junqueira &Junqueira 1983, Michalany 1990). Sabe-se que as
mucinas são glicoproteínas poliméricas cuja principal função é proteger o epitélio de agressores
químicos, físicos e biológicos, que podem estar presentes na luz intestinal (Deplancke & Gaskins
2001, Myers et al. 2008). Isto sugere a participação dessa substância na preservação da lâmina
epitelial, pois houve aumento dessa secreção nos intervalos de 1, 6 12 h em relação ao intervalo
de 0 h.
De acordo com os resultados, conclui-se que, embora os inseticidas estudados tenham
ocasionado alterações histopatológicas, de intensidades diferentes, no mesêntero em ambas as
populações, o Dipel
®
mostrou ser mais agressivo independente da população. A presença de
esferites revestindo a lâmina epitelial, a hipertrofia das células colunares e a riqueza de muco,
podem estar envolvidas na preservação do mesêntero em larvas da população resistente, porém
essas características não foram suficientes para impedir a degeneração do epitélio ou induzir a
hiperplasia das células regenerativas.
Agradecimentos
À FACEPE pela concessão da bolsa de estudo ao primeiro autor, possibilitando a realização
deste trabalho.
50
Literatura Citada
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56
Figura 1. Mesêntero de larvas suscetíveis de Plutella xylostella sem exposição aos inseticidas.
(A) Epitélio simples apoiado em duas camadas de músculo. (B) Células epiteliais. (C) Notar
grânulos densos no citoplasma das células colunares e em fragmentos destacando-se para o
lúmen. (D) Células colunares com vacúolos proeminentes. Barras = 25 µm. Mesêntero de larvas
resistentes de P. xylostella sem exposição aos inseticidas. (E) Grânulos densos sobre a borda em
escova e em contato com o alimento. Barra = 25 µm. (F) Vesículas basófilas no lúmen. Barra =
10 µm. Ep – epitélio simples, MC – músculo circular, ML – músculo longitudinal, CC – célula
colunar, CCa – célula caliciforme, BE – borda em escova, N – núcleo, Seta curta – grânulos,
Ponta de seta – vacúolos, Seta longa – vesículas basófilas. Coloração Azul de Toluidina.
E
F
C
CC
BE
N
N
Cr
CCa
CC
B
CC
D
Ep
A
ML
MC
57
Figura 2. Mesêntero de larvas suscetíveis de Plutella xylostella expostas ao XenTari
®
por 24 h.
(A) Área de epitélio íntegro. (B) Células colunares altas e ricamente vacuolizadas. (C) Células
caliciformes com morfologia alterada. (D) Presença de grânulos densos na célula caliciforme e
discreto afastamento entre essa e a célula endócrina. (E) Intensa secreção da célula caliciforme.
(F) Hipertrofia das células regenerativas. Barras = 25 µm. Epi – epitélio íntegro, CC – célula
colunar, CCa – célula caliciforme, Cr – célula regenerativa, Seta curta – vacúolos, Seta longa –
afastamento das células epiteliais, Gd - grânulos densos, S - secreção. Coloração Azul de
Toluidina.
Epi
A
B
CC
C
CCa
CCa
CCa
Gd
Gd
Ce
CCa
D
Cr
Cr
F
S
S
E
58
Figura 3. Mesêntero de larvas resistentes de Plutella xylostella expostas ao XenTari
®
por 24 h.
(A) Epitélio íntegro. (B) Células colunares altas com protuberâncias. Barras = 25 µm. Mesêntero
de larvas suscetíveis de P. xylostella expostas ao Dipel
®
por 24 h (C) Desorganização e
estratificação do epitélio. (D) Afastamento das células epiteliais e presença de grânulos densos
no interior da célula colunar. Barras = 25 µm. Mesêntero de larvas resistentes de P. xylostella
expostas ao Dipel
®
por 24 h (E) Epitélio integro. Barra = 50 µm. (F) Abundância de células
caliciformes e grânulos densos no lúmen. Barra = 25 µm. Epi – epitélio íntegro, Ep – epitélio,
CC – célula colunar, CCa – célula caliciforme, P – protuberância, Seta curta – afastamento das
células epiteliais, Seta longa - grânulos densos. Coloração Azul de Toluidina.
P
Epi
A
P
CC
B
C
Ep
D
CCa
CCa
F
Epi
E
59
Figura 4. Mesêntero de larvas suscetíveis de Plutella xylostella expostas ao XenTari
®
por 24 h.
Intervalo de 1 h. (A) Metaplasia e (B) Núcleo vacuolizado. Barras = 100 µm. Intervalo de 6 h.
(C) Vacuolização e protuberâncias nas células colunares e (D) Intensa secreção das células
caliciformes e afastamento entre as células. Intervalo de 12 h. (E) Parcial degradação do
mesentero. Barras = 25 µm. Mesêntero de larvas suscetível de P. xylostella expostas ao Dipel
®
por 24 h. Intervalo de 1 h. (F) Total degradação do mesentero. (F) Abundância de células
caliciformes e grânulos densos no lúmen. Barras = 25 µm. M – metaplasia, N – núcleo, Epd –
epitélio parcialmente degradado, Etd – epitélio totalmente degradado, CC – célula colunar, S -
secreção, Ponta de Seta – afastamento das células epiteliais, Seta longa – vacúolos, Seta curta –
protuberância. Coloração Azul de Toluidina.
A
M
C
S
S
D
Etd
F
Epd
E
CC
N
N
B
60
Figura 5. Mesêntero de larvas resistentes de Plutella xylostella expostas ao XenTari
®
por 24 h.
Intervalo de 1 h. (A) Grânulos densos revestindo a lâmina epitelial e em detalhe epitélio íntegro.
Barra = 100 µm. (B) Hipertrofia da célula colunar e vacúolos proeminentes. Barra = 25 µm.
Mesêntero de larvas resistentes de P. xylostella expostas ao Dipel
®
por 24 h. Intervalo de 1 h. (C)
Metaplasia epitelial Barra = 100 µm. (D) Célula colunar com núcleo e citoplasma vacuolizado. e
(E) Secreção da célula caliciforme. Intervalo de 12 h. (F) Degradação do mesentero. Barras = 25
µm. Seta curta – grânulos densos, Setas longas – vacúolos M – metaplasia, N – núcleo, Epi –
epitélio íntegro, CC – célula colunar, CCa – célula caliciforme, Epd - epitélio degradado.
Coloração Azul de Toluidina.
A
Epi
C
M
Epd
F
CCa
CCa
E
N
CC
D
CCa
CC
N
B
61
Figura 6. Histoquímica do mesêntero de larvas (A) suscetível e (B) resistente de Plutella
xylostella sem exposição aos inseticidas por 24 h.Observar em ambos presença de muco na
superfície epitelial Barras = 25 µm. (C) mesêntero de larvas resistente de P. xylostella exposta ao
Dipel
®
intervalo 1 h, e (D) mesêntero de larvas resistente de P. xylostella exposta ao XenTari
®
intervalo 6 h. Notar secreção mucosa nas células caliciformes. Barras = 25 µm. (E) Notar reação
positiva pelo P.A.S. no mesêntero de larva suscetível sem exposição aos inseticidas e em (F)
reação negativa pelo P.A.S. no mesêntero de larva resistente sem exposição aos inseticidas.
Barras = 25 µm. CCa – células caliciformes, Setas – muco.
E F
C
CCa
CCa
A B
CCa
CCa
D
62
0
1
612
Tempo (h)
Número de células regener
Figura 7. Número médio (±EP) de células regenerativas da região do mesêntero de larvas
suscetíveis de Plutella xylostella: testemunha (ŷ = média = 22,8 ± 2,18 e após tratadas com
XenTari
®
(ŷ = média = 22,4 ± 1,61) e Dipel
®
(ŷ = 8,975 - 0,942x; F = 7,47; P = 0,0136; R
2
=
0,29) nos intervalos de 0, 1, 6 e 12 h.
Médias com mesma letra dentro de cada intervalo de tempo
não diferem entre os tratamentos pelo teste de Tukey HSD a 5% de probabilidade.
ativas
0
10
20
40
Control
XenTari
Dipel
a
a
a
a
b
a
a
a
a
a
bb
®
®
30
63
Tempo (h)
Núme
Figura 8. Número médio (±EP) de células regenerativas da região do mesêntero de larvas
resistentes de Plutella xylostella, testemunha (ŷ = média = 18,8 ± 1,67) e após tratadas com
XenTari
®
(ŷ = 16,276 - 0,890x; F = 20,88; P = 0,0002; R
2
=0,53 ) e Dipel
®
(ŷ = 20,176 - 1,70x; F
= 79,22; P < 0,0001; R
2
= 0,81) nos intervalos de 0, 1, 6 e 12 h. Médias com mesma letra dentro de
cada intervalo de tempo não diferem entre os tratamentos pelo teste de Tukey HSD a 5% de
probabilidade.
ro de células regenerativas
0
5
10
15
25
30
35
Control
XenTari
Dipel
a
ab
b
a
b
c
01612
a
a
a
a
a
a
®
®
20
64
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