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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
NÚCLEO DE PESQUISAS DE PRODUTOS NATURAIS
ESTUDO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL E
DA ATIVIDADE ANTI-HERPES DE FLAVONÓIDES DE Ocotea
notata (Nees) Mez (LAURACEAE)
Rafael Garrett da Costa
Rio de Janeiro
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais
Programa de Química de Produtos Naturais
Estudo da composição química do óleo essencial e da atividade
anti-herpes de flavonóides de Ocotea notata (Nees) Mez
(Lauraceae)
RAFAEL GARRETT DA COSTA
Rio de Janeiro
2010
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Química de Produtos Naturais, Núcleo de
Pesquisas de Produtos Naturais da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Jorge Ribeiro da Silva
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais (UFRJ)
Co-orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha
Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais (UFF)
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FICHA CATALOGRÁFICA
Garrett, Rafael.
Estudo da composição química do óleo essencial e da atividade anti-herpes de
flavonóides de Ocotea notata (Nees) Mez (Lauraceae)/ Rafael Garrett da Costa. Rio
de Janeiro: UFRJ/ NPPN, 2010.
107f.:il.; 30 cm
Orientadores: Antonio Jorge Ribeiro da Silva e Leandro Machado Rocha
Dissertação (Mestrado) – UFRJ/ NPPN/ Programa de Pós-graduação em
Química de Produtos Naturais, 2010.
Referências: f. 93-107.
1. Ocotea notata. 2. Restinga de Jurubatiba. 3. Óleo essencial. 4. Flavonóides. 5.
Atividade antiviral. 6. HSV-1. 7. HSV-2. I. da Silva, Antonio Jorge Ribeiro e Rocha,
Leandro. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Núcleo de Pesquisas de
Produtos Naturais, Programa de Pós-graduação em Química de Produtos Naturais.
III. Título.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais - NPPN
Estudo da composição química do óleo essencial e da atividade
anti-herpes de flavonóides de Ocotea notata (Nees) Mez
(Lauraceae)
RAFAEL GARRETT DA COSTA
Dissertação submetida ao Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais da Universidade
Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos à obtenção do grau de Mestre em
Ciências.
Rio de Janeiro, 11 de março de 2010.
Aprovada por:
____________________________________________
Prof. Dr. Antonio Jorge Ribeiro da Silva (Presidente da banca-NPPN/UFRJ)
____________________________________________
Profª. Dra. Gilda Guimarães Leitão (NPPN/UFRJ)
____________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Machado Kuster (NPPN/UFRJ)
____________________________________________
Prof. Dr. Alphonse Kelecom (IB/UFF)
____________________________________________
Prof. Dr. José Luiz Pinto Ferreira (Suplente-FF/UFF)
DEDICATÓRIA
...aos meus pais Moacyr e Sônia por todo carinho e
incentivo, aos meus irmãos Rodrigo e Fernanda por
serem sempre uma referência na minha vida e à minha
noiva Ana Carolina por todo amor e companhia ao
longo desses anos.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Antonio Jorge Ribeiro da Silva pela orientação, dedicação e incentivo na
realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Leandro Machado Rocha pela co-orientação, confiança, e por ter me dado a
primeira oportunidade de trabalhar com plantas medicinais.
À Profª. Dra. Maria Teresa V. Romanos pela realização dos testes antivirais.
Aos membros da banca examinadora por terem aceitado o convite.
Ao Prof. Dr. Marcelo Guerra Santos pela amizade, coleta do material botânico e
confecção da exsicata.
À todos os amigos do NPPN, em especial aos amigos de laboratório Ricardo, Osman,
Vitor e Josiane por toda ajuda, incentivo no desenvolvimento deste trabalho e pelos
momentos de descontração.
Aos amigos do LTPN-UFF, em especial a Rodrigo, Gisele, Hildegardo, Adriana,
Meriane e Leandro.
Ao corpo técnico do NPPN, especialmente ao Francisco, Camila, Maria Cristina, Gisele
e Ari pela obtenção dos espectros, companhia e incentivo.
À todo o corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Química de Produtos
Naturais do NPPN pela contribuição à minha formação acadêmica.
À Coordenação de Pós-graduação, Direção e administração do NPPN por terem
garantido a realização deste trabalho.
À CAPES pelo auxílio financeiro concedido durante a realização deste trabalho.
“Comece fazendo o que é necessário, depois, o
que é possível, e, de repente, você estará fazendo o
impossível”
São Francisco de Assis
RESUMO
Garrett, Rafael. Estudo da composição química do óleo essencial e da atividade anti-
herpes de flavonóides de Ocotea notata (Nees) Mez (Lauraceae). Dissertação
(Mestrado em Ciências) - Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, Universidade
Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2010.
Ocotea notata (Lauraceae) é uma planta popularmente conhecida como “canela-
branca” sendo sua madeira utilizada na marcenaria. No Brasil, apresenta uma ampla
distribuição, ocorrendo principalmente nas áreas de restinga. Apesar do grande número
de trabalhos fitoquímicos e de atividades biológicas com espécies de Ocotea, não foram
encontrados relatos sobre O. notata, o que motivou a realização do presente trabalho.
Foram obtidos os óleos essenciais das folhas e dos galhos de O. notata e sua
análise por CG-EM identificou os monoterpenos α-pineno e β-pineno, e os
sesquiterpenos β-cariofileno e germacreno D como os constituintes majoritários para
ambos os óleos. Das folhas também foi obtida uma mistura de flavonóides. A análise da
mistura através de técnicas analíticas e do isolamento de algumas substâncias levou à
identificação de todos os constituintes majoritários e de alguns minoritários. Pela
técnica de coinjeção de padrões em CLAE foram identificados os flavonóides (+)-
catequina, (-)-epicatequina, miquelianina, quercetina e kaempferol. Após isolamento,
foi identificada por IES-EM
uma proantocianidina trimérica seqüenciada como
(epi)catequina-A-(epi)catequina-(epi)catequina, e por técnicas de RMN 1D e 2D foram
identificados os flavonóides isoquercitrina, reinoutrina, quercitrina e kaempferol-3-O-α-
ramnopiranosídeo.
A mistura de flavonóides foi avaliada quanto à atividade contra os vírus herpes
simples tipos 1 e 2 e foi mais ativa contra o HSV-2. Quando avaliado os mecanismos de
inibição viral, pôde-se observar que a mistura de flavonóides conseguiu inibir os vírus
HSV-1 e HSV-2 em diferentes estágios de sua replicação.
Palavras-chave: Ocotea notata. Óleo essencial. Flavonóides. Atividade anti-herpes
ABSTRACT
Garrett, Rafael. Estudo da composição química do óleo essencial e da atividade anti-
herpes de flavonóides de Ocotea notata (Nees) Mez (Lauraceae). Dissertação
(Mestrado em Ciências) - Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, Universidade
Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2010.
Ocotea notata (Lauraceae) is a plant commonly known as “canela-branca” and
used as timber-tree. It is widespread over the Brazilian territory and grows mainly in
sandy coastal plains (restingas). Despite the large number of papers that describe
phytochemical analyses and biological activities from Ocotea species, no reports were
found about O. notata. This fact was the motivation of this work.
It were obtained the essential oils from leaves and branches of O. notata and the
analysis by GC-MS revealed the monoterpenes α-pinene and β-pinene, and the
sesquiterpenes β-caryophyllene and germacrene D as the major compounds for both
oils. From the leaves, it was also obtained a flavonoid rich fraction. The analyses of this
fraction by analytic techniques and the isolation of some substances provided the
identification of all majority and some minority compounds. By the coinjection
technique of standards compounds in liquid chromatography were identified the
flavonoids (+)-catechin, (-)-epicatechin, miquelianin, quercetin, and kaempferol. After
the isolation, it was possible to identified by ESI-MS
an A-type proanthocyanidin trimer
sequenced as (epi)catechin-A-(epi)catechin-(epi)catechin. By 1D and 2D RMN
techniques were identified the flavonoids isoquercitrin, reynoutrin, quercitrin, and
kaempferol-3-O-α- ramnopyranoside.
The flavonoid rich fraction was tested against Herpes simplex virus types 1 and 2
and showed better action against HSV-2 than HSV-1. When the viral inihition
mecanisms were evaluated, the flavonoid rich fraction inhibited the HSV-1 and HSV-2
virus in different stages of its replication
Keywords: Ocotea notata. Essential oil. Flavonoids. Antiherpetic activity
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba.
21
Figura 2. Vias biossintéticas simplificadas de formação dos terpenos e sua
classificação de acordo com o número de unidades de isopreno e átomos de
carbono.
26
Figura 3. Principais fatores ambientais que podem influenciar na composição
química de óleos essenciais em plantas.
27
Figura 4. Núcleo fundamental dos flavonóides e sua numeração. 28
Figura 5. Esquema simplificado da biossíntese dos flavonóides. 29
Figura 6. Flavonóide (-)-epicatequina (I) isolada das cascas de O. porosa. 30
Figura 7. Flavonóides isolados de O. minarum (II-IX) e O. catharinensis (II). 31
Figura 8. Flavonóides isolados de O. corymbosa (X-XII) e O. elegans (XIII). 31
Figura 9. Modelo estrutural de uma proantocianidina. A linha pontilhada indica
uma ligação do tipo A C2ÆOÆC7 (R pode ser igual a H ou OH).
32
Figura 10. Principais rotas de fragmentação do dímero de proantocianidina tipo A
com m/z 593 ((epi)galocatequina-(epi)catequina) no modo positivo de ionização.
34
Figura 11. Ocotea notata no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba. 35
Figura 12. Estrutura geral do herpervírus. 36
Figura 13. Etapas da replicação viral. 37
Figura 14. Localização geográfica do local onde foi coletada a espécie Ocotea
notata no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba.
44
Figura 15. Aparelho de hidrodestilação do tipo Clevenger utilizado na extração
dos óleos essenciais.
45
Figura 16. Cromatograma de massas de padrões de monossacarídeos reduzidos e
acetilados. A ordem de eluição foi (1) Rha, (2) Fuc, (3) Ara, (4) Xil, (5) Glc e (6)
Gal.
51
Figura 17. Cromatogramas de massas dos óleos essenciais: (a) das folhas; (b) dos
galhos de O. notata.
59
Figura 18. Substâncias presentes nos óleos essenciais das folhas e dos galhos de O.
notata.
61
Figura 19: Cromatograma da mistura de flavonóides a 365nm e os de absorção no
ultravioleta obtido por CLAE.
63
Figura 20. Cromatograma obtido por CLAE após a hidrólise ácida da mistura de
flavonóides (λ = 365nm).
63
Figura 21. Cromatograma da mistura de flavonóides a 280nm e o espectro de
absorção no ultravioleta do pico 3 obtido por CLAE.
64
Figura 22. Espectro de massas da mistura de flavonóides. Os valores de m/z dos
picos representam os íons pseudomoleculares [M-H]
-
.
65
Figura 23. Espetros de IES-EM/EM dos íons pseudomoleculares [M-H]
-
selecionados: (a) m/z 433; (b) m/z 447; (c) m/z 463 e (d) m/z 477. O íon m/z 301
representa a aglicona quercetina.
66
Figura 24. Espectro de massa/massa do íon precursor m/z 863. 68
Figura 25. Proposta de estrutura para o trímero de proantocianidina tipo A e rotas
de fragmentação do íon precursor após experimentos de IES-EM/EM modo
negativo.
69
Figura 26. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 280nm): (a) Coinjeção de
(+)-catequina; (b) Coinjeção de (-)-epicatequina.
70
Figura 27. Estruturas de RAF1 e RAF2. 71
Figura 28. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm) e CG-EM: (a)
Coinjeção de isoquercitrina; (b) Mistura de flavonóides; (c) Cromatograma de
massas da fração glicídica de RAF4. O pico é referente ao açúcar glicose (Glc).
72
Figura 39. Espectro de RMN de
1
H para RAF4 (Bruker DRX, 400 MHz; solvente:
CD
3
OD; referência: TMS).
73
Figura 30. Espectro expandido de RMN de
1
H para RAF4 na região dos
hidrogênios aromáticos e do hidrogênio anomérico (H
1
’’).
74
Figura 31. Espectro expandido de RMN de
1
H para RAF4 na região dos
hidrogênios glicídicos.
74
Figura 32. Estrutura de RAF4 (isoquercitrina). 75
Figura 33. Espectro de RMN de
1
H para RAF5 (Bruker DRX, 400 MHz; solvente:
CD
3
OD; referência: TMS).
76
Figura 34. Espectro expandido de RMN de
1
H para RAF5 na região dos
hidrogênios aromáticos.
77
Figura 35. Cromatograma da fração glicídica de RAF5. O pico é referente ao
açúcar xilose (Xil).
77
Figura 36. Estrutura de RAF5 (reinoutrina). 78
Figura 37. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm): (a) Coinjeção de
miquelianina; (b) Mistura de flavonóides.
79
Figura 38. Estrutura de RAF6 (miquelianina). 79
Figura 39. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm) e CG-EM: (a)
Coinjeção de isoquercitrina; (b) Mistura de flavonóides; (c) Cromatograma por
CG-EM da fração glicídica de RAF4. O pico é referente ao açúcar ramnose (Rha).
80
Figura 40. Espectro de RMN de
1
H de RAF7 (Varian MR, 400 MHz; solvente:
CD
3
OD; referência: TMS).
81
Figura 41. Espectro expandido de RMN de
1
H de RAF7 na região dos hidrogênios
glicídicos.
82
Figura 42. Estrutura de RAF7 (quercitrina). 82
Figura 43. Cromatograma da mistura de flavonóides obtida por CLAE em escala
semipreparativa (λ = 280nm).
83
Figura 44. Espectro de RMN de
1
H de RAF8 (Varian MR, 400 MHz; solvente:
CD
3
OD; referência: TMS).
84
Figura 45. Estrutura de RAF8 (Kaempferol-3-O-α-ramnopiranosídeo). 84
Figura 46. Espectro de RMN 2D – COSY de RAF8 (Varian MR, 400 MHz;
solvente: CD
3
OD; referência: TMS).
85
Figura 47. Espectro de RMN 2D – HSQC de RAF8 (Varian MR, 400 MHz;
solvente: CD
3
OD; referência: TMS).
85
Figura 48. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm): (a) Coinjeção de
quercetina; (b) Mistura de flavonóides
86
Figura 49. Estrutura de RAF9 (quercetina). 86
Figura 50. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm): (a) Coinjeção de
kaempferol; (b) Mistura de flavonóides.
87
Figura 51. Estrutura de RAF10 (kaempferol). 87
Figura 52. Curva dose-resposta para o cálculo da EC
50
(concentração da substância
capaz de reduzir o título viral em 50%) para o HSV-1 e HSV-2.
88
Figura 53. Mecanismo de ação da mistura de flavonóides contra os herpes-vírus
tipos 1 e 2.
90
ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1. Procedimento para obtenção da mistura de flavonóides. 46
Esquema 2. Fracionamento da mistura de flavonóides por Sephadex e obtenção
dos sólidos RAF1-3, RAF5 e RAF7. São mostrados os valores aproximados das
massas obtidas.
48
Esquema 3. Obtenção da mistura de RAF8 e RAF10 por CLAE em escala
semipreparativa e sua posterior separação por Sephadex LH-20.
49
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Algumas espécies de Ocotea que já tiveram seus óleos essenciais
estudados.
27
Tabela 2. Flavonóides com atividade contra HSV-1 e HSV-2. 39
Tabela 3. Composição química e substâncias identificadas nos óleos essenciais das
folhas e dos galhos de Ocotea notata.
60
Tabela 4. Dados obtidos após reações de deslocamento no UV. 78
Tabela 5. Atividade contra os herpes-vírus tipos 1 e 2 da mistura de flavonóides. 89
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
1-D
Monodimensional
2-D
Bidimensional
Ara
L-Arabinose
BFF
Fissão de formação de benzofurano
CCD
Cromatografia em camada delgada
CG-EM
Cromatografia com fase gasosa acoplada à espectrometria de massas
CLAE
Cromatografia líquida de alta eficiência
cm
Centímetro
COSY
Correlated spectroscopy
d
Dupleto
DAD
Detector de feixe de diodos
dd
Dupleto de dupleto
DMAP
4-dimetilaminopiridina
EM
Espectrometria de massas
EM/EM
Espectrometria de massa em tandem
IES
Ionização por eletronebulização
eV
elétron Volt
Fuc
D-Fucose
g
Grama
Gal
D-Galactose
Glc
D-Glicose
HRF
Fissão do anel heterocíclico
HSQC
Heteronuclear single quantum coherence
HSV-1
Vírus herpes simples tipo 1
HSV-2
Vírus herpes simples tipo 2
Hz
Hertz
IR
Índice de retenção
J
Constante de acoplamento
m
Multipleto
m
Metro
m/z
Relação massa/carga
MHz
Megahertz
mL
Mililitro
mm
Milímetro
μm
Micrômetro
NIST
National Institute of Standards and Technology
nm
Nanômetro
NP
Natural products (Reagente)
ºC
Graus Celsius
ODS
Octadecilsilano
P.A.
Para análise
p/p
Peso por peso
ppm
Partes por milhão (expressão)
QM
Quinona metídio
RDA
Fissão retro-Diels-Alder
Rha
L-Ramnose
RMN
Ressonância magnética nuclear
RMN de
1
H
Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RP-18
Fase inversa (ODS)
s
Simpleto
sol.
Solução
t
Tripleto
TFA
Ácido trifluoroacético
TMS
Tetrametilsilano
TOF
Analisador por tempo de vôo
UV
Ultravioleta
V
Volt
v/v
Volume por volume
W
Watt
Xil
L-Xilose
δ
Deslocamento químico
μg
Micrograma
μg/ml
Micrograma por mililitro
μL
Microlitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................
20
1.1 O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba............................................
20
1.2 Considerações sobre a família Lauraceae.....................................................
22
1.3 Considerações sobre o gênero Ocotea............................................................
23
1.4 Os óleos essenciais e sua distribuição no gênero Ocotea..............................
25
1.5 Os flavonóides e sua distribuição no gênero Ocotea.....................................
28
1.6 Proantocianidinas: classificação, funções e análise estrutural....................
32
1.7 Considerações sobre Ocotea notata (Nees) Mez............................................
35
1.8 Considerações sobre o vírus herpes simples tipos 1 e 2...............................
36
1.9 Flavonóides com atividade contra HSV-1 e HSV-2......................................
38
2 OBJETIVOS...........................................................................................................
40
2.1 Objetivos gerais...............................................................................................
40
2.2 Objetivos específicos........................................................................................
40
3 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................
41
3.1 Materiais...........................................................................................................
41
3.1.1 Solventes e Reagentes...............................................................................
41
3.1.2 Fases estacionárias para cromatografia..................................................
41
3.2 Equipamentos..................................................................................................
42
3.2.1 Cromatógrafos..........................................................................................
42
3.2.2 Espectrômetros e espectrofotômetro........................................................
42
3.2.3 Outros equipamentos................................................................................
43
3.3 Metodologias....................................................................................................
43
3.3.1 Obtenção do Material vegetal..................................................................
43
3.3.2 Extração do óleo essencial das folhas e dos galhos de Ocotea notata..
44
3.3.3 Análise dos óleos essenciais por CG-EM................................................
45
3.3.4 Obtenção da mistura de flavonóides e identificação seu perfil químico
por CCD e CLAE........................................................................................................
46
3.3.5 Isolamento e identificação dos componentes da mistura de
flavonóides..................................................................................................................
47
3.3.6 Ensaio antiviral: testes contra o herpes-vírus tipos 1 e 2........................
53
3.3.6.1 Cultura de células.........................................................................
53
3.3.6.2 Vírus..............................................................................................
53
3.3.6.3 Titulação viral...............................................................................
53
3.3.6.4 Citotoxidade..................................................................................
54
3.3.6.5 Avaliação da Atividade Antiviral..................................................
55
3.3.6.6 Estudo dos mecanismos de ação...................................................
56
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................
58
4.1 Óleos essenciais................................................................................................
58
4.1.1 Rendimento e Composição química dos óleos essenciais das folhas e
dos galhos de Ocotea notata......................................................................................
58
4.2 Flavonóides......................................................................................................
62
4.2.1 Rendimento do processo extrativo na obtenção da mistura de
flavonóides e análise do seu perfil químico por CCD e CLAE.................................
62
4.2.2 Análise dos componentes da mistura de flavonóides por EM................
64
4.2.3 Elucidação estrutural das substâncias codificadas como RAF1-10
presentes na mistura...................................................................................................
70
4.2.3.1 Elucidação estrutural de RAF1 e RAF2........................................
70
4.2.3.2 Elucidação estrutural de RAF3.....................................................
71
4.2.3.3 Elucidação estrutural de RAF4.....................................................
71
4.2.3.4 Elucidação estrutural de RAF5.....................................................
75
4.2.3.4 Elucidação estrutural de RAF6.....................................................
79
4.2.3.5 Elucidação estrutural de RAF7.....................................................
80
4.2.3.6 Elucidação estrutural de RAF8.....................................................
83
4.2.3.7 Elucidação estrutural de RAF9.....................................................
86
4.2.3.8 Elucidação estrutural de RAF10...................................................
87
4.3 Testes Antivirais..............................................................................................
88
5 CONCLUSÕES......................................................................................................
91
REFERÊNCIAS..…………………………………………………………………..
93
20
1 INTRODUÇÃO
Os produtos naturais, principalmente os de plantas medicinais, representam uma
rica fonte de substâncias biologicamente ativas que há séculos vêm sendo alvo de
estudos e têm inspirado muitas descobertas científicas. Dentro deste contexto encontra-
se este trabalho, o qual faz parte de um projeto de estudos fitoquímicos e de atividades
biológicas com plantas do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba. Nele o leitor irá
se deparar com temas como a Restinga de Jurubatiba; Ocotea notata, que foi a espécie
de planta estudada e que pertence à família Lauraceae; os flavonóides e os óleos
essenciais, que representam duas classes de metabólitos secundários e se destacam
devido ao grande número de atividades biológicas descritas na literatura; e a atividade
antiviral de flavonóides contra o vírus herpes simples tipos 1 e 2.
1.1 O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba
O Estado do Rio de Janeiro é caracterizado por uma grande diversidade de
ecossistemas. A região litorânea apresenta costões rochosos, manguezais, restingas e
lagoas, enquanto a região continental apresenta uma vasta planície que se estende até
uma área montanhosa composta pela Serra dos Órgãos, das Araras e da Mantiqueira
(KELECOM et al, 2002).
As restingas recobrem cerca de 80% da costa brasileira, onde se estendem desde
estreitas até extensas faixas de areia, como no litoral norte do Estado do Rio de Janeiro.
O bioma das restingas possui uma vegetação muito característica devido a uma
combinação de fatores físico-químicos, tais como elevada temperatura, salinidade,
grande deposição de salsugem e alta exposição à luminosidade (COGLIATTI-
CARVALHO et al, 2001).
Com o objetivo de proteger uma das últimas áreas de restinga remanescentes no
estado do Rio de Janeiro, foi criado em 1998, o Parque Nacional da Restinga de
Jurubatiba, que está localizado na região noroeste do Rio de Janeiro e abrange os
municípios de Macaé, Carapebus e Quissamã (Figura 1).
21
Figura 1. Localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Fonte: http://www.parkswatch.org,
acessado em 04 de abril de 2008).
O parque estende-se por 44 quilômetros de litoral oceânico e abriga dezoito
lagoas costeiras. As diferentes formas geológicas e composição físico-química do
sistema hídrico contribuíram indiscutivelmente para a elevada biodiversidade dos
ecossistemas presentes na restinga.
Desde a década de 80, a região tem sido objeto de diversos estudos científicos.
Um levantamento etnobotânico das espécies utilizadas pela população local registrou o
uso de 117 espécies pertencentes a 47 famílias e 99 gêneros vegetais. Os usos atribuídos
foram comestível, madeireiro, ritualístico, medicinal, ornamental, têxtil, aromatizante,
artesanal e corante (SANTOS et al, 2009).
De maneira geral, pouco se sabe a respeito dos metabólitos secundários de
plantas de restinga. Alguns trabalhos realizados descreveram o isolamento e/ou
atividade biológica de algumas espécies presentes na Restinga de Jurubatiba
(CARVALHO et al, 1998; ARAÚJO et al, 1999; MUSACCHIO et al, 1999, 2000;
KELECOM et al, 2002; CRUZ et al, 2006; CARNEIRO et al, 2007; GARRETT et al,
2007; FRANÇA et al, 2007; BOTAS et al, 2008). Porém devido à grande diversidade
biológica presente no local, ainda há muito a ser explorado.
22
1.2 Considerações sobre a família Lauraceae
As Lauráceas são constituídas atualmente por 50 gêneros no qual estão
subordinadas cerca de 2.500 a 3.000 espécies. Essas espécies estão amplamente
distribuídas pelas regiões tropicais e subtropicais do planeta e são encontradas
predominantemente nas Américas, Ásia tropical, Austrália e Madagascar (ROHWER
1993; WERFF; RICHTER, 1996). No Brasil ocorrem 19 gêneros que habitam em sua
maior parte as florestas pluviais, os cerrados e também as restingas, como por exemplo,
a Restinga de Jurubatiba (BARROSO, 2002). No Estado do Rio de Janeiro já foram
registradas aproximadamente 109 espécies distribuídas em 16 gêneros. Nas restingas do
estado, são reconhecidas 24 espécies distribuídas em nove gêneros (KROPF et al,
2006).
A maior parte das espécies de Lauraceae pertence a somente seis gêneros:
Ocotea, Litsea, Cryptocarya, Cinnamomum, Persea e Beilschmiedia. No Brasil,
destacam-se especialmente as espécies de Ocotea e Nectandra, conhecidas
popularmente como canelas, loureiros ou embuias (QUINET, 2005)
As Lauráceas destacam-se entre as demais famílias pela sua importância
econômica. Os primeiros relatos de utilização de suas espécies ocorreram por volta de
2.800 anos a. C. na Grécia antiga. O nome do gênero Laurus, por exemplo, originou-se
do celta “lauer” (verde) ou ainda “laus” (louvor), o gênero Phoebe, tem o seu nome
relacionado ao deus Apolo, e o Cinnamomum significa “caneleira” em grego
(BARROSO et al, 1978; COE-TEIXEIRA,1980).
Várias espécies de Lauraceae são produtoras de óleos essenciais e possuem alto
valor comercial, tanto para a indústria farmacêutica, quanto para a perfumaria e
indústria química. Dentre elas podemos citar a espécie brasileira Ocotea pretiosa,
também conhecida como canela-sassafrás, que já estava presente na primeira edição da
farmacopéia brasileira em 1926 e na qual se obtêm um óleo essencial semelhante ao
obtido da espécie norte-americana Sassafras albidum (SILVA, 1926).
O fruto de Persea americana, conhecido como abacate, é um dos produtos
alimentícios mais comercializados em toda a América, enquanto as espécies de
Cinnamomum, popularmente conhecidas como canelas, são utilizadas há milênios como
condimento alimentar e na preparação de chás (MARQUES, 2001).
23
1.3 Considerações sobre o gênero Ocotea
Ocotea é um dos maiores gêneros da família Lauraceae e apresenta cerca de 350
espécies com distribuição na Ásia, África e América tropical e subtropical (ROHWER,
1993; WERFF, 2002). No Brasil, encontram-se cerca de 120 a 160 espécies
(BAITELLO, 2001). No Estado do Rio de Janeiro são reconhecidas 52 espécies, porém,
de acordo com Quinet (2002), esse número pode ser reduzido para 29 espécies se for
considerado os sinônimos propostos em 1986 por Rohwer. O gênero Ocotea encontra-se
entre os dez gêneros mais representativos nas restingas fluminenses (KROPF et al,
2006).
Dentre os gêneros que compõem a família Lauraceae, Ocotea se destaca devido
ao grande número de espécies que são utilizadas e para diferentes finalidades. Espécies
como O. porosa, O. acutifolia, O. catharinensis são utilizadas na carpintaria e
construção e produção de papel enquanto espécies como O. aciphylla e O. spectabilis
são utilizada como tônicos e estomáquicos (MARQUES, 2001). Estudos etnobotânicos
realizados com O. aciphylla mostraram que suas folhas eram utilizadas por índios pajés
do Xingu para enrolar os cigarros utilizados em rituais de cura. Estas folhas quando
queimadas produziam um efeito narcótico (EMMERICH; SENNA, 1985).
Uma série de estudos fitoquímicos pioneiros, iniciados por volta de 1970 e
intitulados: “A Química das Lauráceas Brasileiras”, deu uma grande contribuição para a
identificação do perfil de metabólitos secundários de espécies de Ocotea. Várias
neolignanas (AIBA et al, 1973; GOMES et al, 1983; HARAGUCHI et al, 1983;
ROMOFF et al, 1984; DIAS et al, 1986; FELICIO et al, 1986; CARVALHO et al,
1988; SILVA et al, 1989; ISHIGE et al, 1991; MARQUES et al, 1992), alcalóides
(FRANCA et al, 1975; VILEGAS et al, 1989; BOTEGA et al, 1993), dentre outras
substâncias (DEDIAZ et al, 1980; ANDREI et al, 1988; DAVID et al, 1994) foram pela
primeira vez descritas na literatura.
Hoje em dia sabemos que o gênero Ocotea apresenta, predominantemente, três
tipos de metabólitos secundários: alcalóides, com esqueletos dos mais variados tipos
como os benzilisoquinolínicos, bisbenzilisoquinolínicos, aporfínicos, proaporfínicos e
morfinânicos (GARCEZ et al, 1995; LOPEZ et al, 1995, 1996; SILVA et al, 2002;
RIBEIRO et al, 2003; DIAS et al, 2003; ZANIN; LORDELLO, 2007); as lignanas e
principalmente as neolignanas, que foi um termo concebido pelo pesquisador Otto R.
Gottlieb em 1978 (GOTTLIEB, 1978; HARAGUCHI et al, 1983; DREWES et al, 1995;
24
LORDELLO; YOSHIDA, 1997; GARCEZ et al, 2005; OLIVEIRA et al, 2006;
FUNASAKI et al, 2009; CUCA et al, 2009); e os constituintes dos óleos essenciais:
monoterpenos, sesquiterpenos, e em menor quantidade os fenilpropanóides (LORENZO
et al, 2001; BRUNI et al, 2004; SACCHETTI et al, 2006; GUERRINI et al, 2006,
TOGNOLINI et al, 2006; TAKAKU et al, 2007; BALLABENI et al, 2007;
COUTINHO et al, 2007; BARBOSA-FILHO et al, 2008; BALLABENI et al, 2008).
Dentre as atividades biológicas já determinadas para algumas de espécies de
Ocotea, destacam-se as atividades: anti-inflamatória (ZSCHOCKE et al, 2000;
MADUBANYA et al, 2005), antioxidante (Bruni et al, 2004; Guerrini et al, 2006),
antimicrobiana (TERREAUX et al, 1994; BRUNI et al, 2004; SOUZA et al, 2004),
antiprotozoária (FOURNET et al, 2007), antialérgica (SERRA et al, 1997), depressora
do sistema nervoso central (PACHÚ et al, 1993; MORAIS et al, 1998; SOUSA et al,
2005), relaxante muscular (RIBEIRO et al, 2003), hipotensora (DIAS et al, 2004) e
antagonista do fator de agregação plaquetária (CASTRO-FARIANETO et al, 1995a,
1995b; TIBIRIÇÁ et al, 1996).
25
1.4 Os óleos essenciais e sua distribuição no gênero Ocotea
Entende-se por óleo essencial as misturas complexas, de até mais de 1.000
substâncias, que são voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas, que possuem
sabor geralmente acre e picante, coloração ligeiramente amarelada ou incolor e são
instáveis na presença de luz, calor e umidade (SIMOES; SPITZER, 2003).
Os óleos essenciais são usados em diferentes áreas da indústria de aromas e
fragrâncias e fornecem aromas especiais a produtos como perfumes, cosméticos,
sabonetes, condimentos, doces etc. Outros usos consistem em mascarar cheiros
desagradáveis em ambientes de trabalho e instalações sanitárias. Os óleos essenciais são
usados também como solventes, insumos em produtos da indústria de plástico, tintas,
borracha e inseticidas (CRAVEIRO et al, 1981).
Quimicamente são misturas formadas principalmente pelos monoterpenos e
sesquiterpenos, devido ao fato de serem os terpenos mais voláteis, e em menor número
pelos arilpropanóides.
A classificação dos terpenos baseia-se na quantidade de unidades isoprênicas,
isto é, unidades de cinco átomos de carbono que os compõem. Os monoterpenos são
formados por duas unidades isoprênicas e possuem dez átomos de carbono; os
sesquiterpenos são formados por três unidades isoprênicas e possuem quinze átomos de
carbono; os diterpenos são formados por quatro unidades isoprênicas e possuem vinte
átomos de carbono; os sesterpenos são formados por cinco unidades isoprênicas e
possuem vinte e cinco átomos de carbono; já nos triterpenos são seis unidades
isoprênicas, e para os tetraterpenos, somam-se agora mais uma unidade isoprênica
(EVANS, 1991).
Os terpenos podem ser biossintetizados por meio de duas vias: (a) via do
mevalonato, através do intermediário ácido mevalônico; (b) via não mevalônica,
descoberta mais recentemente, através do intermediário 5-fosfato-1-desoxi-D-xilulose
(Figura 2). Ambas as vias encontram-se num ponto comum que é a formação do
difosfato de isopentenila e seu isômero difosfato de dimetilalila (DEWICK, 2001,
DUBEY et al, 2003).
Os arilpropanóides são biossintetizados principalmente a partir do ácido
aminado fenilalanina, que é convertido primeiramente em ácido cinâmico e depois em
ácido p-cumárico pela via do ácido chiquímico, e em menor grau a partir do ácido
aminado tirosina (DEWICK, 2001).
26
Ácido pirúvico
(a) Via mevalônica
(b) Via não mevalônica
O
SCoA
HO
2
C
OH
OH
OPP
OP
O
OH
OH
O
CO
2
H
OPP
C
10
C
15
C
20
C
30
C
25
C
40
IPP
IPP
IPP
IPP
Difosfato de isopentenila (IPP)
Difosfato de dimetilalila (DMAPP)
Acetil Coenzima A
3 x
Ácido mevalônico
5-fosfato-1-desoxi-D-xilulose
Monoterpenos
Sesquiterpenos
Diterpenos
Sesterpenos
Tetraterpenos
Triterpenos
2 x
2 x
Figura 2. Vias biossintéticas simplificadas de formação dos terpenos e sua classificação de acordo com o
número de unidades de isopreno e átomos de carbono (adaptado de DEWICK, 2001).
Apesar da composição química dos óleos essenciais ser determinada
geneticamente, sendo específica para um determinado órgão e característica para o seu
estágio de desenvolvimento, essa composição pode sofrer alterações em decorrência do
ambiente em que as plantas vivem e devido também à ação de fatores ambientais
externos, tais como: temperatura, irradiação solar, ritmo circadiano, sazonalidade,
regime de ventos e micronutrientes presentes no solo (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
A Figura 3 ilustra os principais fatores ambientais que podem influenciar na
composição química de óleos essenciais em plantas.
27
Figura 3. Principais fatores ambientais que podem influenciar na composição química de óleos essenciais
em plantas (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Segundo Coutinho (2006), de todos os gêneros da família Lauraceae em que
foram realizados estudos referentes à composição química de óleo essencial, o gênero
Ocotea destaca-se em segundo lugar em número de espécies estudadas (Tabela 1). Em
geral, os principais constituintes dos óleos essenciais de espécies de Ocotea são os
monoterpenos e sesquiterpenos, seguidos dos fenilpropanóides.
Tabela 1. Algumas espécies de Ocotea que já tiveram seus óleos essenciais estudados.
Espécie Referência Espécie Referência
Ocotea austinii Chaverri; Ciccio, 2005. Ocotea opifera Lorenzo et al, 2001.
Ocotea bofo Guerrini et al, 2006. Ocotea pentalanthera Gottlieb et al, 1981.
Ocotea bractelosa Coutinho et al, 2007. Ocotea pretiosa Hickey, 1948.
Ocotea brenesii Chaverri; Ciccio, 2005. Ocotea pretiosa Mors et al, 1959.
Ocotea caparrapi Brooks; Campbell, 1996. Ocotea puberula Raggi, 2008.
Ocotea comoriensis Menut et al, 2002. Ocotea puberula Farago, 2002.
Ocotea corymbosa Chavez et al, 1995. Ocotea quixos Bruni et al, 2004.
Ocotea cymbarum Shukis; Wachs, 1948. Ocotea quixos Sacchetti et al, 2006.
Ocotea duckei Barbosa-Filho et al, 2008 Ocotea quixos Tognolini et al, 2006.
Ocotea duckei Lacerda, 2004. Ocotea quixos Ballabeni et al, 2007.
Ocotea floribunda Takaku et al, 2007. Ocotea sinuata Takaku et al, 2007.
Ocotea foetens Pino et al, 2004. Ocotea tonduzii Takaku et al, 2007.
Ocotea guaianensis Roque et al, 1978. Ocotea tonduzii Bansal et al, 2007.
Ocotea holdridgeana Takaku et al, 2007. Ocotea usambarensis Terreaux et al, 1994.
Ocotea meziana Takaku et al, 2007. Ocotea valeriana Takaku et al, 2007.
Ocotea nectandrifolia Raggi, 2008. Ocotea veraguensis Takaku et al, 2007.
Ocotea odorifera Oltramari et al, 2004. Ocotea whitei Takaku et al, 2007.
28
1.5 Os flavonóides e sua distribuição no gênero Ocotea
Os flavonóides constituem uma importante classe de polifenóis e são
amplamente encontrados em frutas, flores, folhas, sementes, como também no vinho,
mel, na própolis e nos chás (HARBORNE; WILLIAMS, 2000). Atualmente, estima-se
que existam 10.000 diferentes tipos de flavonóides. Nas plantas, eles possuem funções
variadas: nas flores, são os responsáveis pela atração de polinizadores, nas folhas são os
responsáveis pela proteção contra fungos e os raios UV-B. Além disso, estão envolvidos
com a regulação de fatores de crescimento, respiração e fotossíntese da planta
(GROTEWOLD, 2006).
O emprego terapêutico das plantas que os contêm é vasto e, em muitos casos,
ainda empírico (ZUANAZZI; MONTANHA, 2004). A capacidade de modulação
enzimática é a principal responsável pelo potencial farmacológico que os flavonóides
possuem. Várias atividades biológicas já foram descritas para esta classe, por exemplo:
neuroestimulatória, analgésica, antitumoral, antibacteriana, antiviral, antialérgica,
antiulcerogênica, dentre outras (FORMICA; REGELSON 1995; HARBORNE;
WILLIAMS, 2000; CUSHNIE; LAMB, 2005).
A combinação das vias do chiquimato e do acetato é a responsável pela
biossíntese dos flavonóides (Figura 5), os quais possuem como estrutura básica o núcleo
flavânico (esqueleto C
6
-C
3
-C
6
), ou 2-fenil-benzopirano, que é formado por dois anéis
benzênicos A e B, ligados por um anel pirano heterocíclico C (Figura 4). Os flavonóides
podem ocorrer como agliconas, glicosídeos ou como parte de outras estruturas, como as
flavolignanas. Na maioria dos casos ocorrem como glicosídeos.
O
O
A
C
B
2
3
5
6
7
8
9
10
2'
3'
4'
5'
6'
Figura 4. Núcleo fundamental dos flavonóides e sua numeração.
29
Carboidratos
HO SCoA
OO
3 x malonil-CoA
HO
2
C OH
OH
OH
CoA
O
OH
4-cumaril-CoA
Ácido chiquímico
O
OH
OH
R
HO
Chalconas (R= H ou OH)
O
OH
OHO
5-desóxi-flavanonas
O
OH
O
OH
HO
5-hidróxi-flavanonas
O
OH
O
OH
HO
5-hidróxi-flavonas
OH
OH
O
OH
HO
Flavan-4-óis
O
OH
O
OH
HO
OH
di-hidroflavonóis
O
OH
O
OH
HO
OH
Flavonóis
OH
OH
O
OH
HO
OH
Leucoantocianidinas
OH
O
OH
HO
OH
Catequinas
OH
O
OH
HO
OH
Antocianidinas
Figura 5. Esquema simplificado da biossíntese dos flavonóides (ZUANAZZI; MONTANHA, 2004).
30
Os flavonóides podem ser classificados de acordo com sua origem biossintética.
Algumas classes, como as chalconas, flavanonas, flavan-3-óis e flavan-3,4-diós, são
intermediários biossintéticos e produtos finais que podem acumular-se nos tecidos das
plantas. Outras são somente produtos finais da biossíntese, como por exemplo, as
antocianidinas, proantocianidinas, flavonas e flavonóis, enquanto outras classes são
formadas pela isomerização da fenila B lateral da posição 2 para a posição 3 do anel C,
gerando os isoflavonóides. Os neoflavonóides são formados através de outras
isomerizações da fenila para a posição 4 do anel C.
Existem diferentes maneiras de nomear os flavonóides: através dos nomes
triviais que, às vezes, indicam a planta de origem ou a classe do flavonóide (o nome
quercetina deriva do gênero Quercus); pela nomeação semissistemática baseada nos
nomes triviais (3,5,7,3’,4’-penta-hidróxiflavona, para a quercetina); pela nomeclatura
química sistemática (2-(3,4-di-hidróxifenil)-3,5,7-tri-hidróxi-4H-1-benzopiran-4-ona,
para quercetina) (ZUANAZZI; MONTANHA, 2004; GROTEWOLD, 2006).
Para o gênero Ocotea, os trabalhos que relatam o isolamento de flavonóides são
poucos, visto que os principais metabólitos secundários encontrados para esse gênero
são os alcalóides, as lignanas e os terpenóides.
Em 1994, David e outros descreveram o isolamento do flavonóide
(-)epicatequina (I) das cascas de O. porosa (Figura 6).
Figura 6. Flavonóide (-)-epicatequina (I) isolada das cascas de O. porosa.
Garcez e outros (GARCEZ et al, 1995) conseguiram isolar do fruto de O.
vellosiana os flavonóides afzelina (II), astragalina (III), quercitrina (IV), hirsutrina (V),
e das folhas de O. minarum (GARCEZ et al,, 2005), os flavonóides taxifolina (VI),
quercetina-7-O-β-D-glucopiranosídeo (VII), eriodictiol-3'-O-β-D-glucopiranosídeo
(VIII) e prunina (IX) (Figura 7). Funasaki (2006) em sua tese de doutoramento realizou
um estudo fitoquímico com as folhas de O. catharinensis e também conseguiu isolar o
flavonóide afzelina (II).
O
OH
OH
HO
OH
OH
31
Luca (2001) durante seu mestrado conseguiu isolar das folhas de O. corymbosa
os flavonóides isoquercitrina (X), hiperosídeo (XI) e reinoutrina (XII). Já em seu
doutoramento (LUCA, 2005), a espécie estudada foi O. elegans, onde foi isolado o
flavonóide astilbina (XIII) (Figura 8).
(III)
(II) (IV)
(V)
(VI)
(VII)
(VIII)
(IX)
O
O
OH
OH
O
HO
OH
O
OH
OH
OH
O
O
OH
O
HO
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
HO
OH
OH
O
O
OH
O
HO
O
HO
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
HO
OH
OH
O
O
OH
O
O
HO
HO
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
O
O
HO
HO
OH
OH
OH
O
O
OH
HO
O
HO
HO
OH
OH
OH
O
Figura 7. Flavonóides isolados de O. minarum (II-IX) e O. catharinensis (II).
(X)
(XI)
(XII)
(XIII)
Figura 8. Flavonóides isolados de O. corymbosa (X-XII) e O. elegans (XIII).
O
O
OH
OH
O
HO
O
HO
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
HO
O
HO
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
HO
O
HO
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
HO
OH
O
OH
OH
OH
32
O
OH
HO
R
1
OH
R
2
OH
O
OH
O
R
3
OH
R
4
OH
A
C
B
D
E
F
OHO
OH
OH
OH
R
5
R
6
G
H
I
4
8
7
4
8
2
6
6
6
n
1.6 Proantocianidinas: classificação, funções e análise estrutural
As proantocianidinas, também conhecidas como taninos condensados, são
oligômeros e polímeros formados pela condensação de duas ou mais unidades de
flanvan-3-ol através de ligações do tipo C4ÆC8 e/ou C4ÆC6, chamadas de ligações do
tipo B (Proantocianidinas do tipo B). Quando ocorre além da ligação do tipo B uma
ligação éter do tipo C2ÆOÆC7, essas substâncias são chamadas de proantocianidinas
do tipo A, sendo essa ligação classificada como “A” (Figura 9). Devido ao fato de as
proantocianidinas tipo A possuírem uma ligação (éter) a mais do que o tipo B, estas
podem ser diferenciadas quando analisadas por espectrometria de massas. A primeiras
possuem duas unidades de massa a menos em relação as segundas (SCHOFIELD et al,
2001).
Figura 9. Modelo estrutural de uma proantocianidina. A linha pontilhada indica uma ligação do tipo A
C2ÆOÆC7 (R pode ser igual a H ou OH).
As proantocianidinas foram identificadas pela primeira vez em 1968 e somente
um pequeno número de compostos foi descritos na literatura, provavelmente devido às
dificuldades de isolamento e à baixa estabilidade de muitos delas. Estas substâncias, tais
33
como as antocianidinas, produzem pigmentos avermelhados após degradação com ácido
mineral a quente (LI; DEINZER, 2008).
Quando as proantocianidinas consistem apenas de unidades de (epi)catequina,
são designadas de procianidinas, aquelas que possuem (epi)afzelequina ou
(epi)galocatequina são nomeadas de propelargonidina e prodelfinidina, respectivamente
(APPELDOORN et al, 2009).
As proantocianidinas apresentam uma ampla distribuição no reino vegetal e
podem ser encontradas em diversas frutas, chás, no vinho, onde são determinantes para
o sabor e adstringência dos mesmos. Elas possuem uma potente capacidade antioxidante
além de formarem complexos com proteínas, metais e outras macromoléculas (PRIOR;
GU, 2005).
A espectrometria de massas tornou-se um dos mais populares métodos de análise
de proantocianidinas. A utilização da técnica de eletronebulização e experimentos de
EM/EM geram importantes informações sobre a estrutura dessas substâncias através de
fragmentos dos íons precursores e evidências confirmatórias para o seqüenciamento dos
oligômeros. Existem alguns postulados de fissão estabelecidos para dímeros de
proantocianidinas que ajudam a compreender os íons formados numa análise por EM e
a seqüenciar as unidades formadoras das proantocianidinas. Esses postulados
caracterizam rotas de fragmentação e são baseados em princípios de fissão retro-Diels-
Alder (RDA), fissão do anel heterocíclico (HRF), fissão de formação de benzofurano
(BFF)/H
2
O e quinona metídio (QM) (Figura 10) (LI; DEINZER, 2007, 2008). Além
disso, existem regras de fissão para as proantocianidinas que estabelecem o seguinte:
não podem ocorrer simultaneamente dois ou mais tipos de fragmentações envolvendo as
fissões citadas acima; ocorrem perdas neutras do íon precursor através de fissões de
unidades de (epi)catequina, (epi)afzelequina e (epi)galocatequina (LI; DEINZER, 2007,
2008).
34
Figura 10. Principais rotas de fragmentação do dímero de proantocianidina tipo A com m/z 593
((epi)galocatequina-(epi)catequina) no modo positivo de ionização (adaptado de LI; DEINZER
, 2008).
RDA: fissão retro-Diels-Alder; HRF: fissão do anel heterocíclico; BFF: fissão de formação de
benzofurano; QM: fissão quinona metídio.
35
1.7 Considerações sobre Ocotea notata (Nees) Mez
Ocotea notata (Figura 11) é uma árvore de aproximadamente 15m de altura com
floração entre fevereiro e março e frutificação em maio, junho e novembro. Apresenta
uma distribuição ao longo da costa atlântica brasileira, desde Sergipe até o Paraná,
ocorrendo principalmente nas restingas, mas também na floresta de tabuleiro e na
floresta pluvial Atlântica Montana e Baixo-montana (QUINET, 2002). Rohwer (1986)
considerou O. glaucina (Meisn.) Mez e O. gardneri (Meisn.) Mez como sinônimos de
Ocotea notata. Em 1889, Mez já considerava as espécies afins entre si, diferenciando-
as pela forma das folhas e, principalmente, pelo tipo de habitat; as duas primeiras tidas
como típicas de floresta Atlântica Montana e Baixo-montana e a última restrita às
restingas (QUINET; ANDREATA, 2002).
Figura 11. Ocotea notata no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (fonte: O próprio autor).
O. notata é uma das espécies de Ocotea que se distribui em maior número de
áreas, além de apresentar a maior ocorrência em diferentes formações vegetais nas
restingas. No Estado do Rio de Janeiro, esta espécie pode ser encontrada nas restingas
existentes nas regiões de Macaé, Barra de São João, Cabo Frio, Maricá, Jacarepaguá e
Marambaia. Nestas regiões é popularmente conhecida como canela-branca e sua
madeira é muito utilizada para fazer moirões e também para fins ornamentais (KROPF
et al, 2006).
36
Apesar do grande número de publicações com espécies de Ocotea e também da
utilização de várias espécies na medicina popular, não foram encontrados relatos desse
tipo de utilização para Ocotea notata. O primeiro estudo fitoquímico com esta espécie
refere-se a esta obra.
1.8 Considerações sobre o vírus herpes simples tipos 1 e 2
As infecções pelo herpes-vírus possuem uma ampla distribuição mundial,
estando entre as doenças humanas mais comuns (BRADY et al, 2004). Elas são
causadas pelo vírus Herpes simplex (HSV), da família Herpesviridae e somente os tipos
1 a 8 são patogênicos aos humanos. Estima-se que 60 a 80% da população mundial
apresentem anticorpos séricos contra o vírus herpes simples e que para pacientes com o
vírus da imunodeficiência humana (HIV) este número pode chegar a 95%. Os herpes-
vírus dos tipos 1 (HSV-1) e 2 (HSV-2) são os patógenos mais comuns aos humanos e
possuem um tropismo pelo sistema nervoso. O primeiro contato com o HSV-1 ocorre
geralmente na infância onde o vírus é adquirido principalmente por contato com saliva
contaminada e resulta em infecções orais, enquanto o HSV-2 é adquirido geralmente na
adolescência, coincidindo com o início das atividades sexuais e resulta em infecções
genitais (MEHNERT; CANDEIAS, 2005).
O Herpes simplex é um vírus de genoma DNA fita dupla linear, com capsídeo de
simetria icosaédrica, dotado de envelope lipoprotéico com espículas glicoprotéicas
(Figura 12). O HSV possui a habilidade de permanecer em latência duradoura dentro do
hospedeiro infectado. Esta é uma estratégia eficiente de sobrevivência e sua reativação
ocorre por estímulos físicos, como dano tecidual periférico e irradiação pela luz UV,
estresse emocional ou físico, desequilíbrio hormonal, dentre outros fatores (KHAN et
al, 2005).
Figura 12. Estrutura geral do herpervírus (adaptado de www.biografix.de, acesso em 10 out.
2009).
Envoltório
Nucleoca
p
sídeo
Genoma de DNA fita
37
Em termos gerais, a replicação dos herpes-vírus pode ser resumida nas seguintes
etapas (Figura 13): (1) adsorção da partícula viral às células hospedeiras suscetíveis e
penetração nas células através da fusão direta do envelope viral com a membrana
citoplasmática; (2) liberação do nucleocapsídeo e proteínas virais no citoplasma da
célula e migração para o núcleo; (3) desnudamento do acido nucléico viral; (4)
circularização do DNA viral, com consequente síntese de proteínas reguladoras
precoces, proteínas funcionais (por exemplo, polimerases de ácidos nucléicos) e
proteínas estruturais; (5) replicação do genoma viral pela DNA polimerase viral; (6)
síntese de proteínas reguladoras precoces, proteínas funcionais (por exemplo,
polimerases de ácidos nucléicos) e proteínas estruturais e (7) liberação da célula por
exocitose (MIRANDA, 2002; CAMARGO, 2007).
Figura 13. Etapas da replicação viral (adaptado de CAMARGO, 2007).
38
Dentre os fármacos contra o herpes-vírus, o mais utilizado é o aciclovir. Ele é
um inibidor da síntese de DNA viral que necessita de uma fosforilação intracelular pela
enzima timidinocinase viral para inibir a DNA polimerase viral. No mercado, existem
também vários análogos do aciclovir (HAYDEN, 2003).
1.9 Flavonóides com atividade contra HSV-1 e HSV-2.
Nas últimas duas décadas houve um aumento significativo no número de
trabalhos relatando atividade contra o herpes-vírus tipos 1 e 2 de flavonóides. As
flavonas e os flavonóis são as classes de flavonóides mais testadas. Esse fato pode ser
devido à maior abundância dessas duas classes de substâncias nas plantas, em contraste
com as outras classes, visto que a maioria dos trabalhos relata a atividade de flavonóides
que foram isolados de plantas.
Num estudo em que foram testados 18 flavonóides, adquiridos comercialmente,
observou-se que os flavonóis e flavanóis foram mais ativos do que as flavonas contra o
HSV-1 (LYU et al, 2005). Em geral, os flavonóides são mais ativos contra o HSV-1 do
que contra o HSV-2. Entre os flavonóis, a aglicona do tipo quercetina se destaca como a
mais ativa. Quando ocorre uma combinação entre flavonas e flavonóis, observa-se como
resultado um efeito sinérgico contra o HSV-1 (AMOROS et al, 1992). Comparando
flavonóis glicosilados, a quercetina ligada a hexoses mostrou ser mais ativa do que
ligada a pentoses contra HSV-1 (AMARAL et al, 1999).
Os mecanismos de ação dos flavonóides contra o herpes-vírus são variados e
mesmo flavonóides da mesma classe apresentam mecanismos de ação diferentes. Para
as flavonas, a 5,6,7-trimetóxiflavona apresenta uma atividade viruscida contra o HSV-1
(HAYASHI et al, 1997) enquanto a Ginkgetina (biflavona) inibe a síntese de proteínas
virais (HAYASHI et al, 1997). Para os flavonóis, a rutina inibe a adesão viral
(GONÇALVES et al, 2001), enquanto a isoquercitrina é viruscida e inibe a penetração
viral (GOMES et al, 2008). Já a quercetina é viruscida e também inibe a replicação viral
(CHIANG et al, 2003; LYU et al, 2005). Na Tabela 2 encontra-se uma lista de alguns
flavonóides que apresentam atividade contra HSV-1 e HSV-2, assim como suas
referências bibliográficas. É importante ressaltar que somente foram citados os
flavonóides considerados como ativos, segundo critérios estabelecidos pelos próprios
autores dos trabalhos.
39
Tabela 2. Flavonóides com atividade contra HSV-1 e HSV-2. “X” indica para qual tipo do vírus o
flavonóide foi ativo.
Flavonóides
HSV- 1 HSV- 2
Origem do flavónoide Referências
Flavona
Apigenina X X Ocimum basilium Chiang et al, 2003.
Apigenina X X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Crisina X Própolis Schnitzler et al, 2009.
Crisina X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Luteolina X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Baicalina X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
luteolina-7-O-β-
glucuronídeo
X Chamaescyce thymifolia Amaral et al, 1999.
5,6,7-trimetóxiflavona X Callicarpa japonica Hayashi et al, 1997.
Pectolinarigenina X Chrysosplenium spp Tsuchiya et al, 1985
Amentoflavona X Hypericum connatum Fritz et al, 2007.
Amentoflavona X X Selaginella sinensis Ma et al, 2001.
Ginkgetina (biflavona) X X Cephalotaxus drupacea Hayashi et al, 1992.
Flavonol
Rutina X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Afzelina X Persea americana Almeida et al, 1998.
quercitrina X Persea americana Almeida et al, 1998.
Isoquercitrina X X Hyptis fasciculata Gomes et al, 2008.
Isoquercitrina X Chamaescyce thymifolia Amaral et al, 1999.
Hiperosídeo X Chamaescyce thymifolia Amaral et al, 1999.
Miricetina X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Fisetina X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Galangina X Própolis Schnitzler et al, 2009.
Galangina X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Quercetina X X Caesalpinia pulcherrima Chiang et al, 2003.
Quercetina X X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Kaempferol X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Quercetina/Kaempferol X Própolis Amoros et al, 1992.
Quercetina-3-O-alfa-D-
arabinopiranosídeo
X Persea americana Almeida et al, 1998.
Flavanona
Leachianona G X Morus alba Du et al, 2003.
Naringina X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Naringenina X X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Isoflavona
genisteina X X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Flavanol
Epicatequinagalato X X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Epigalocatequinagalato X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Epigalocatquina X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Flavana
7-O-galoiltricetiflavana X Pithecellobium clypeavia Li et al, 2006.
(-)-Epicatequina
X X Adquirido Comercialmente Lyu et al, 2005.
Luteoforol X Hypericum connatum Fritz et al, 2007.
7,4'-di-O-
galoiltricetiflavana
X Pithecellobium clypeavia Li et al, 2006.
40
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Realizar um estudo fitoquímico e avaliar a atividade biológica de Ocotea notata
(Nees) Mez contribuindo assim para o conhecimento da química e de usos medicinais
de espécies de plantas da restinga, principalmente das espécies presentes no Parque
Nacional da Restinga de Jurubatiba.
2.2 Objetivos específicos
Determinar a composição química do óleo essencial das folhas e dos galhos de
Ocotea notata por cromatografia em fase gasosa com detector de massas.
Desenvolver uma metodologia analítica para obter uma fração rica em
substâncias fenólicas a partir das folhas de Ocotea notata e avaliar sua atividade contra
o HSV-1 e HSV-2.
Isolar e/ou identificar as substâncias presentes nesta fração.
41
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
3.1.1 Solventes e Reagentes
Nas etapas de extração e obtenção da mistura de flavonóides foram utilizados
solventes destilados no próprio laboratório ou de grau analítico (P.A.). Para as análises
de cromatografia em camada delgada e isolamento dos constituintes químicos por
cromatografia em coluna foram utilizados solventes de grau analítico. As análises por
CLAE e CG-EM foram realizadas utilizando solventes de grau espectroscópico e nas
análises por RMN foi utilizado metanol deuterado com 0,05% (v/v) de TMS.
Uma solução a 1% (p/v) em metanol do reagente cromogênico NP (Natural
Products reagent: ácido 2-amino-difenil-borato de etila, Fluka Biochemica
®
) foi
utilizada para a revelação das placas de CCD.
Nas reações de redução e derivação dos açúcares foram utilizados os reagentes
hidreto de boro e sódio (NaBH
4
, Vetec
®
), ácido acético glacial (Vetec
®
), DMAP (4-
dimetilaminopiridina, Fluka Biochemica
®
), anidrido acético (Reagen
®
)
destilado e água
desmineralizada.
Foram utilizados os seguintes padrões de flavonóides para comparação
cromatográfica: (+)-catequina e (-)-epicatequina (Fluka Biochemica
®
); isoquercitrina,
quercitrina, quercetina e kaempferol (Aldrich Chemical Company
®
); e miquelianina
(quercetina-3-O-β-D-glucuronopiranosideo), gentilmente doado pelo Laboratório de
Produtos Naturais Bioativos, NPPN-UFRJ.
Todos os reagentes utilizados para as reações de deslocamento de banda de
absorção no UV possuíam grau analítico, foram preparados momentos antes da análise e
estocados por um período máximo de 1 mês em um ambiente protegido de umidade e
luz direta.
3.1.2 Fases estacionárias para cromatografia
Para a CCD, foram utilizadas placas de alumínio de gel de sílica AL 60 F
254
20 x
20 cm (Merck
®
) e placas de vidro de gel de sílica funcionalizada com grupos
octadecilsilano RP-18 F
254
5 x 10 cm (Merck
®
). Na cromatografia em coluna foi
42
utilizado gel de Sephadex LH-20 (25-100 μm, Sigma
®
) e resina trocadora de cátion
Dowex
®
50W-X8 (Merck
®
).
Para a CLAE foram utilizadas as Colunas Symmetry Shield
TM
(RP-18, 5 μm) de
4,6 x 250 mm (Waters
®
) ligada à coluna guarda preenchida com a mesma fase para
separações analíticas e μ-Bondapak
TM
(RP-18), de 7,8 x 300 mm (Waters
®
) para
separações em escala semipreparativa.
3.2 Equipamentos
3.2.1 Cromatógrafos
Para CLAE em escala analítica utilizou-se um cromatógrafo Shimadzu
®
com
sistema de injeção manual (loop de 20 μl), integrado com um detector de feixes de
diodos (DAD) modelo SPD-M10A VP, uma bomba modelo LC-10AD e um sistema de
controle SCL-10A VP. Já para as separações em escala semipreparativa foi utilizado um
cromatógrafo com sistema injetor com “loop” de 100 μl, duas bombas Shimadzu
®
modelo LC-10AS, um detector de absorção no ultravioleta Shimadzu
®
modelo SPD-
10A e um integrador Chromatopac SHIMADZU
®
modelo C-R6A.
3.2.2 Espectrômetros e espectrofotômetro
Para as análises de RMN foram utilizados os espectrômetros Bruker DRX 400
(
1
H, 400 MHz) e Varian MR-400 (
1
H, 400 MHz;
13
C, 100 MHz).
Para CG-EM foi utilizado um cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro
de massas (CG-EM) Shimadzu
®
modelo GCMS-QP5000 equipado com coluna
Phenomenex
®
ZB-5 MS (30 m x 25 mm, com filme de 0,25 μm de espessura e 5% de
fenilmetilsilicone).
Utilizou-se um espectrômetro híbrido Micromass Q-TOF
®
para as análises de
EM/EM.
Para realização das medidas de absorção no ultravioleta foi utilizado um
espectrofotômetro Shimadzu
®
modelo
UV-1601 com cubetas de quartzo QS Hellma
®
de
caminho ótico igual a 1 cm.
43
3.2.3 Outros equipamentos
Também foi utilizado um aparelho gerador de ultra-som de baixa freqüência
Thornton
®
(T-14); balança analítica Mettler Toledo
®
, AB 204-S; coletor de
fracionamento Bio-Rad
®
modelo nº 2110; compressor Inalamax
®
(frequência: 50/80
Hz); evaporador rotatório Pemem
®
adaptado com bomba de vácuo Cole Parmer
Instrument Company, modelo 7049-50, e banho Fisatom
®
, modelo 550 (1200 W 230
V); destilador de água Fstreem
®
II, mod. A74410, Barnstead; lâmpada ultravioleta
UVSL-58 Mineralight multibanda (254/366 nm; 60 Hz; 0,16 Amps) Ultra-violet
Products, Inc.; liofilizador Labconco
®
com bomba de alto vácuo de dois estágios,
modelo E2M8, Edwards; pistola de ar quente Comala
®
1400 W (temperaturas:
300/500ºC, vol. de ar: 400 L / min.) Steinel; placa de aquecimento Thermolyne 2555
Kerper Boulevard, mod. SP18425, 50/80 Hz, Barnstead; purificador de água Nanopure
Barnstead
®
; vortex Ika tipo lab dancer, IP42; microondas Panasonic
®
modelo NN7809
BH (freqüência de microondas de 2450 MHz); tubo de reação sob pressão Ace Glass
Corporation (15 x 1 cm).
3.3 Metodologias
3.3.1 Obtenção do Material vegetal
Partes aéreas de Ocotea notata (Nees) Mez foram coletadas no Parque Nacional
da Restinga de Jurubatiba (Figura 14) que fica localizado na costa noroeste do estado do
Rio de Janeiro, pela primeira vez em dezembro de 2007, para obtenção da mistura de
flavonóides, e depois em janeiro de 2009, para a obtenção do óleo essencial das folhas e
dos galhos de Ocotea notata. A espécie foi identificada pelo prof. Dr. Marcelo G.
Santos e as exsicatas foram depositadas no Herbário da Faculdade de Formação de
Professores da Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
44
Figura 14. Localização geográfica do local onde foi coletada a espécie Ocotea notata no Parque Nacional
da Restinga de Jurubatiba (mapas obtidos pelo programa Google Earth).
3.3.2 Extração do óleo essencial das folhas e dos galhos de Ocotea notata
Para a obtenção dos óleos essenciais, as folhas e os galhos de O. notata foram
inicialmente turbolizados e depois submetidos à extração por hidrodestilação com
aparelho do tipo Clevenger (Figura 15). A metodologia para extração dos óleos e
cálculo do rendimento foi a seguinte: 300g de material vegetal fresco pesado e
turbolizado foram colocados em um balão de 2 litros contendo núcleos de ebulição e
quantidade de água suficiente para recobrir todo o material vegetal. O balão foi ligado
ao aparelho Clevenger e as amostras foram extraídas por aquecimento da mistura no
balão, coletando os óleos com pentano na coluna de coleta do aparelho. A extração foi
realizada por três horas a partir da condensação de primeira gota do destilado. Ao final,
os óleos essenciais foram recuperados em um frasco de 4 mL, sendo acrescentado
Na
2
SO
4
para secar as amostras. As soluções pentânicas dos óleos foram transferidas
com uma micropipeta do tipo Pasteur a recipientes apropriados e previamente pesados
em balança analítica e as amostras foram concentradas em rotaevaporador. Os frascos
com os óleos concentrados foram pesados em balança analítica e por diferença foram
45
obtidos os pesos dos óleos essenciais. Os rendimentos foram calculados dividindo o
peso do óleo essencial pelo peso do material vegetal e multiplicando o resultado por
100. Sendo assim, o rendimento foi expresso em gramas de óleo por 100g de material
vegetal fresco (SABINO, 2008).
Figura 15. Aparelho de hidrodestilação do tipo Clevenger utilizado na extração dos óleos essenciais
(BANDONI, 2003).
3.3.3 Análise dos óleos essenciais por CG-EM
Os óleos essenciais foram analisados por cromatografia com fase gasosa
acoplada à espectrometria de massas com temperatura do forno do cromatógrafo
programada para variar de 60° até 240°C a 3°C/minuto e depois uma isoterma a 240°C
durante 7 minutos. Hélio foi utilizado como gás de arraste e as temperaturas do injetor e
da interface foram programadas para 260°C e 200°C, respectivamente.
O índice de retenção (IR) foi calculado comparando os tempos de retenção de
cada componente do óleo com os tempos de retenção de uma série homóloga de n-
alcanos (LUCERO et al, 2009). A identificação dos componentes do óleo foi feita
comparando seus índices de retenção e espectros de massa (obtido através da ionização
por impacto de elétrons a 70eV) com os dados presentes na biblioteca NIST do
46
aparelho, como também comparando com dados presentes na literatura (ADAMS,
2001). Para a quantificação dos constituintes foi utilizado o método de normalização.
3.3.4 Obtenção da mistura de flavonóides e identificação seu perfil químico por CCD
e CLAE.
As folhas secas de Ocotea notata (400g) foram trituradas por moinho de facas e
submetidas a extração exaustiva durante 3 dias por extrator do tipo Soxhlet,
inicialmente com hexano para remover as substâncias lipofílicas (extrato hexânico), e
depois com metanol, obtendo-se assim o extrato metanólico. Esse extrato foi
concentrado em evaporador rotatório e depois suspenso em água e particionado com
acetato de etila. Após a total evaporação do acetato de etila em evaporador rotatório
obteve-se um pó amarelado que foi chamado de mistura de flavonóides (Esquema 1).
Esquema 1. Procedimento para obtenção da mistura de flavonóides.
O perfil químico dos constituintes da mistura de flavonóides foi obtido
utilizando as metodologias de cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia
líquida de alta eficiência em escala analítica (CLAE).
Para a CCD foram utilizadas placas de alumínio de gel de sílica com sistema de
eluente acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: água (10:1:1:2), e para as placas
de vidro de gel de sílica RP-18 utilizou-se como sistema de eluente metanol:água (6:4).
Foi utilizado como revelador químico uma solução 1% de NP e as placas foram
Material vegetal
Extra
ç
ão com hexano
Material vegetal
Extrato hexânico
Extra
ç
ão com
m
etanol
Extrato metanólico
Material vegetal residual
Extrato acetato de etila Mistura de flavonóides
- 1˚: Suspensão em água
- 2˚: Partição com acetato de etila
Evaporação do
acetato de etila
47
observadas através da luz de lâmpadas ultravioleta nos comprimentos de onda de 245 e
365nm.
Na análise da mistura de flavonóides por CLAE, utilizou-se o seguinte sistema
de eluente: água purificada por osmose inversa, acidificada com 1% de ácido fórmico, e
acetonitrila grau espectroscópico, ambos previamente filtrados em filtros Millipore
®
e
sonicados por 30 minutos. A fase móvel A foi preparada com 10% de acetonitrila e 90%
de água acidificada com ácido fórmico e a fase móvel B com 80% de acetonitrila e 20%
de água acidificada com ácido fórmico. Foi utilizado um gradiente de eluição com a
seguinte programação: de 0 a 50 minutos a fase B chega a 50%, em 55 minutos a fase B
atinge 100% e em 60 minutos a fase B retorna para o seu valor inicial de 0%.
3.3.5 Isolamento e identificação dos componentes da mistura de flavonóides
O isolamento das substâncias presentes na mistura de flavonóides foi realizado
tanto por cromatografia em coluna, quanto por CLAE em escala semipreparativa. A
identificação foi realizada por comparação cromatográfica (coinjeção com padrões)
utilizando CLAE em escala analítica; reações de deslocamento de banda de absorção
por espectroscopia no UV; análise da mistura por EM/EM; RMN de
1
H e técnicas de
2D; hidrólise dos flavonóides e análise de seus resíduos de açúcar por CG-EM e
agliconas por CLAE.
- Isolamento das substâncias por cromatografia em coluna.
Inicialmente, 400mg da mistura de flavonóides foi submetida à separação por
cromatografia de exclusão molecular utilizando uma coluna com leito de fase
estacionária de gel de Sephadex LH-20 igual a 20,0 x 2,0cm e como fase móvel inicial
etanol, e depois metanol. As frações foram recolhidas em tubos de ensaio (2mL/tubo)
em coletor de frações e agrupadas de acordo com o suas semelhanças cromatográficas
em placas de CCD gerando 6 frações: SEP1, SEP2, SEP3, SEP4, SEP5 e SEP6. A
fração SEP6 resultou num sólido de cor vermelha e foi chamado de RAF3.
A fração SEP3 foi recromatografada nas mesmas condições mostrada
anteriormente e deu origem a sete frações. Dentre essas, três frações resultaram em
sólidos amarelos chamados de RAF2, RAF3 e RAF5 que foram recromatografados nas
mesmas condições até purificação.
48
A fração SEP4 foi cromatografada numa pequena coluna de Sephadex-LH 20
(leito de 10,0 x 2,0 cm, eluente: Etanol) dando origem a uma fração com um sólido
amarelo que foi chamado de RAF9.
O Esquema 2 abaixo mostra como foram obtidas as frações e os sólidos
denominados genericamente de RAF.
Esquema 2. Fracionamento da mistura de flavonóides por Sephadex LH-20 e obtenção dos sólidos RAF1-
3, RAF5 e RAF7. São mostrados os valores aproximados das massas obtidas.
- Isolamento das substâncias por CLAE em escala semipreparativa.
A mistura de flavonóides também foi submetida à cromatografia líquida de alta
eficiência em escala semipreparativa. Nesta análise, a temperatura do forno da coluna
foi mantida a 40ºC e utilizou-se um fluxo de 4,5mL/minuto. Como fase móvel, foi
utilizada água acidificada com 0,03% de ácido trifluoroacético (fase A) e acetonitrila
(fase B). A programação do gradiente de eluição foi a seguinte: de 0 a 40 minutos a fase
B chega a 10%, em 50 minutos a fase B chega a 100% e em 60 minutos a fase B retorna
Mistura de Flavonóides (400mg)
Separação por Sephadex LH-20
SEP1
SEP6 (RAF3)
24mg
SEP2 SEP3
SEP4
SEP5
Sephadex (22mg)
RAF9 (12mg)
Sephadex (95mg)
RAF4 (11mg)
RAF7 (8mg)
RAF5 (4mg)
49
para o seu valor inicial de 0%. O cromatograma foi analisado no comprimento de onda
fixo de 280nm.
Foram feitas aproximadamente 20 injeções de 20mg/mL cada e foi coletado um
pico do cromatograma que apresentou a melhor separação (pico 6) e os outros foram
coletados juntos. Este pico ao ser analisado por CLAE em escala analítica mostrou-se
impuro e foi então purificado por cromatografia em coluna de Sephadex LH-20 (10,0 x
2,0 cm, eluente: Etanol) e originou duas novas substâncias, a RAF8 e RAF10 (Esquema
3).
Esquema 3. Obtenção da mistura de RAF8 e RAF10 por CLAE semipreparativa e sua posterior separação
por Sephadex LH-20.
- Análise da mistura de flavonóides por EM
A mistura de flavonóides foi analisada por espectrometria de massas através da
sua infusão, em solução metanólica, num espectrômetro híbrido Micromass Q-TOF
®
utilizando a técnica de ionização por eletronebulização, no modo negativo, medindo
assim as massas dos íons pseudomoleculares [M-H]
-
. Foram realizados também
experimentos de massa/massa (EM/EM) onde alguns íons pseudomoleculares foram
selecionados inicialmente no analisador do tipo quadrupolo, fragmentados por colisão
(utilizando como gás de colisão o argônio) e depois estes íons selecionados tiveram seus
fragmentos obtidos num analisador do tipo TOF.
Mistura de Flavonóides
20mg/mL (20 injeções)
CLAE semipreparativa
(loop de 100μL)
Coleta do pico 6
(32 mg)
Análise por
CLAE analític
a
Purificação em Coluna
de Se
p
hadex LH-20
RAF8 (22mg)
RAF10 (5mg)
50
- Identificação de substâncias presentes na mistura de flavonóides por comparação
cromatográfica utilizando CLAE em escala analítica.
Algumas substâncias presentes na mistura de flavonóides foram identificadas
através da comparação da retenção cromatográfica com padrões. Para isto, foi feito
inicialmente uma injeção da mistura de flavonóides em CLAE, depois injeção de cada
padrão separadamente e por último a coinjeção de cada padrão com a mistura de
flavonóides, na proporção de 1:1. As condições utilizadas para a cromatografia foram as
mesmas citadas no item 3.2.4. Também foram utilizados para comparação os espectros
de absorção no ultravioleta obtidos através da CLAE.
- Hidrólise dos flavonóides e identificação dos seus resíduos de açúcar por CG-EM
e identificação das agliconas por CLAE.
As hidrólises ácidas dos flavonóides foram realizadas segundo Borges (2006).
Foram pesados 2mg da amostra a ser hidrolisada e adicionados a um tubo de reação
resistente a pressão juntamente com uma solução a 1% de ácido trifluoroacético (TFA)
por 2 minutos em aparelho de microondas doméstico sob potência máxima. Passados os
2 minutos, a aglicona foi separada da porção glicídica através de uma partição da
solução aquosa ácida com acetato de etila. A fração aquosa foi liofilizada e a fração
orgânica contendo a aglicona foi evaporada em evaporador rotatório sob pressão
reduzida e depois foi solubilizada em 1 mL de metanol e analisada por CLAE para
confirmação da completa hidrólise da amostra e identificação da aglicona por
comparação cromatográfica com padrão.
A identificação dos açúcares liofilizados obtidos da reação de hidrólise foi
realizada através da análise por cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria
de massas de seus produtos derivados, os acetatos de alditóis. Inicialmente foi realizada
uma redução dos açúcares provenientes das frações aquosas liofilizadas com uma
solução de hidreto de boro e sódio (NaBH
4
) em água desmineralizada (cerca de 3,0 mg
de NaBH
4
em 1 mL de água). Após 2 horas, o excesso do hidreto foi destruído com
cerca de 100 μL de ácido acético glacial e a solução foi, então, passada em uma coluna
montada com uma pipeta do tipo Pasteur (200 x 5 mm) contendo cerca de 1 mL de
resina catiônica, previamente ativada com 5 mL de ácido clorídrico 1 N, com o objetivo
51
de eliminar o sódio proveniente do NaBH
4
. A solução eluída dessa coluna foi
liofilizada, tratada com metanol e evaporada visando a eliminação do borato residual.
A reação de acetilação dos açúcares reduzidos foi realizada com 2 mL de
anidrido acético destilado e DMAP (4-dimetilaminopiridina) em quantidade catalítica.
As reações foram realizadas por 1 hora a 60 ºC e após esse tempo as reações foram
cessadas com a adição de água e o produto acetilado foi extraído com diclorometano (2
x 1:1 v/v).
Os acetatos de alditóis obtidos foram submetidos à análise por CG-EM sob as
seguintes condições: temperatura do injetor e da interface do cromatógrafo iguais a 270º
e 200ºC, respectivamente, e temperatura da coluna cromatográfica variando de 110º a
290 ºC (2º C/minuto).
Foi preparada também, através do mesmo procedimento descrito para a amostra,
uma mistura de padrões de acetatos de alditóis contendo ramnose (Rha), fucose (Fuc),
arabinose (Ara), xilose (Xil), glicose (Glc) e galactose (Gal), na qual os acetatos de
alditóis da amostra tiveram seus tempos de retenção comparados (Figura 16).
Figura 16. Cromatograma de massas de padrões de monossacarídeos reduzidos e acetilados. A ordem de
eluição foi (1) Rha, (2) Fuc, (3) Ara, (4) Xil, (5) Glc e (6) Gal.
1
2
3
4
5
6
52
- Reações de deslocamento de banda de absorção em espectroscopia no UV.
As reações de deslocamento foram realizadas para identificar o perfil de
substituição presente em uma aglicona de flavonóide quando analisada por
espectroscopia no UV. Soluções do flavonóide a ser testado foram preparadas a fim de
obter uma absorbância, no comprimento de onda de maior absorção, entre 0,6 e 0,8.
Primeiramente foi obtido o espectro no UV do flavonóide em metanol e depois foram
obtidos os espectros no UV das soluções metanólicas do flavonóide após reação com
metóxido de sódio (MeONa; sol. 2,5% p/v), cloreto de alumínio (AlCl
3
; sol. 5% p/v),
ácido clorídrico (HCl; sol. 50% v/v), acetato de sódio (AcONa, pó) e ácido bórico
(H
3
BO
3
, pó). Os espectros obtidos foram interpretados e comparados com dados da
literatura. Para maiores esclarecimentos sobre este experimento, análise dos espectros e
banco de dados de espectros no UV de flavonóides, favor consultar a referência Mabry
e outros (1970).
- Espectros de Ressonância Magnética Nuclear.
Os espectros de RMN foram realizados no espectrômetro Bruker DRX 400 e
Varian MR-400 utilizando metanol deuterado como solvente (CD
3
OD). Os
deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e as
constantes de acoplamento em Hertz (Hz). As áreas relativas dos sinais foram obtidas
por integração eletrônica, a calibração dos espectros foi feita com o sinal do TMS e o
processamento dos espectros foi realizado utilizando o software MestReNova versão
6.0.3.
53
3.3.6 Ensaio antiviral: testes contra os vírus HSV-1 e HSV-2.
Por possuírem um ciclo de replicação exclusivamente intracelular, a infecção e
patogênese viral dependem da maquinaria metabólica das células hospedeiras. Devido a
este fato, os experimentos biológicos que envolvem atividade antiviral necessitam do
emprego de culturas de células como sistema hospedeiro. Para verificação de uma
possível atividade contra o herpes-vírus de um agente teste, inicialmente é avaliado a
sua toxidade frente a uma cultura de células, e depois é verificada sua ação contra uma
cultura de células infectadas com o vírus. Além disso, podem ser realizados ensaios
sobre mecanismos de ação para saber em que etapa(s) da infecção viral o agente possui
atividade.
3.3.6.1 Cultura de células
Para os testes, foi utilizada a cultura de células Vero (rim de macaco verde
africano; Cercopitheccus aethiops). Estas células foram crescidas em meio Mínimo
Essencial de Eagle (MEM-Eeagle) acrescido de 0,03 mg/mL de glutamina, 50 μg/ml de
garamicina, 2,5 mg/ml de fungizona, solução de bicarbonato de sódio a 0,25% e 10% de
soro fetal bovino (SFB). As células em cultura foram incubadas a 37°C por 48 horas,
num ambiente com 5% de CO
2
, de modo a formar uma monocamada confluente.
3.3.6.2 Vírus
As amostras de HSV-1 e HSV-2 foram isoladas a partir do fluido de vesículas
características de herpes labial (HSV-1) e herpes genital (HSV-2) no Departamento de
Virologia do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da UFRJ, e pertencem à
coleção do LEDAC (Laboratório Experimental de Drogas Antivirais e Citotóxicas).
3.3.6.3 Titulação viral
A titulação viral é realizada para se estabelecer a TCID
50
/ml (concentração de
vírus que é capaz de infectar 50% das culturas de células inoculadas). Isso é feito
segundo um cálculo estatístico estabelecido por Reed e Muench (1938). O efeito
54
citopático, ou CPE, é a alteração morfológica em uma célula produzida pela replicação
de um vírus (ALMEIDA, 2005).
São realizadas diluições logarítmicas decimais (10
-1
até 10
-7
) das suspensões
virais, utilizando-se o meio de manutenção celular como diluente. Cada diluição é
inoculada em monocamadas de células confluentes. As células inoculadas são incubadas
a 37°C por 48 horas e num ambiente contendo 5% de CO
2
.
3.3.6.4 Citotoxidade
Para a avaliação da atividade antiviral de um agente, é necessária a determinação
da sua toxidade para os sistemas hospedeiros empregados. A citotoxidade pode ser
determinada baseando-se na alteração morfológica e na viabilidade celular.
- Observação da alteração morfológica celular
O agente a ser testado é submetido a diluições seriadas utilizando-se meio de
manutenção de células como diluente, e colocados em contato com as monocamadas de
células confluentes. Em seguida, as células são incubadas a 37°C por 48 horas num
ambiente com 5% de CO
2
, sendo examinadas diariamente ao microscópio óptico
invertido e comparadas com o controle, na ausência da substância. O efeito citotóxico é
detectado pelo aparecimento de células morfologicamente alteradas, presença de
vacúolos e/ou descolamento da monocamada da superfície suporte. A maior
concentração da substância que não apresenta efeito citotóxico é denominada de
concentração máxima não tóxica (CMNT) e utilizada para os estudos antivirais
(RODRIGUEZ et al, 1990).
- Verificação da viabilidade celular
A citotoxidade de substâncias pode ser determinada através de técnica
denominada “dye-uptake” (NEYNDORFF et al, 1990) com algumas modificações. A
técnica consiste na incorporação do corante Vermelho Neutro pelas células vivas e sua
posterior quantificação por leitura em espectrofotômetro, em comprimento de onda de
492 nm.
55
A percentagem de células viáveis é obtida pela fórmula presente abaixo.
Plotando-se os valores de porcentagem de células viáveis (obtidos para cada
concentração do agente) em um gráfico obtêm-se a concentração capaz de causar efeito
tóxico em 50% das culturas de células (CC
50
). Esse valor de CC
50
é utilizado para
posterior cálculo do Índice Terapêutico (IT), que é a relação entre a concentração
citotóxica 50% (CC
50
) e a concentração efetiva 50% (EC
50
).
3.3.6.5 Avaliação da Atividade Antiviral
- Redução do título viral
As suspensões virais (100 TCID
50
/ml) são inoculadas em cultura de células na
presença do agente na CMNT e depois são tituladas. A titulação também é realizada em
células na ausência da substância (controle de vírus). As culturas de células são
incubadas a 37°C por 48 horas num ambiente com 5% de CO
2
e ao final deste período
são determinados os títulos dos vírus a partir dos sobrenadantes das células que foram
inoculadas na presença e na ausência das substâncias para saber se houve redução no
título viral.
O grau de atividade antiviral é expresso em índice de inibição viral (IIV) e
percentagem de inibição (PI).
O IIV é obtido pela seguinte fórmula: IIV = B – A (LAGROTA, 1978), onde:
B= título do vírus na cultura de células (controle).
A= título do vírus na cultura de células com o agente a ser testado.
A Porcentagem de Inibição (PI) é calculada de acordo com a fórmula
(NISHIMURA et al, 1977):
(DO do agente) - (DO controle de células)
(DO corante) - (DO controle de células)
x 100
DO: Densidade óptica
PI = [1- (antilog T/antilog C)] x100
56
Onde:
T= unidades infecciosas na cultura de células tratadas com o agente.
C= unidades infecciosas na cultura de células não tratadas (controle).
- Cinética de Inibição viral
Nessa metodologia, é avaliada a atividade antiviral do agente teste em diferentes
concentrações a partir da CMNT. Os títulos dos vírus em cada concentração da
substância são determinados e plotados em um gráfico dose/resposta. Através da
cinética de inibição viral é calculado a EC
50
, que é a dose ou concentração da substância
capaz de reduzir o título viral em 50% quando comparado com o controle, na ausência
do agente teste (GOMES et al, 2008).
3.3.6.6 Estudo dos mecanismos de ação
No estudo dos mecanismos de ação, é avaliada a etapa ou etapas da replicação
viral em que o agente possui atividade. Foi utilizada uma concentração de 50μg/ml da
mistura de flavonóides para este experimento.
- Determinação da inibição do vírus extracelularmente (efeito virucida)
O agente é colocado em contato com a suspensão viral, que é incubada e
posteriormente titulada. Também é feito um controle do vírus na ausência do agente,
onde o controle é incubado nas mesmas condições do teste para que se possa fazer uma
comparação e determinar se houve redução do título viral quando na presença do
agente, após titulação das suspensões virais.
- Determinação da ação sobre receptores celulares
O agente teste é colocado em contato com uma monocamada de células em
temperaturas baixas (4
o
C) para que se tenha certeza de que o agente não vai entrar na
célula, e sim interagir com seus receptores. É feito um controle substituindo o agente
por meio de cultura de células. Em seguida a monocamada de células é lavada,
inoculada com 100 TCID
50
/ml da suspensão viral, incubada e, após incubação, o
57
sobrenadante é titulado. Assim, é comparado o título viral nas células que foram
expostas ao agente, com aquelas sem tratamento.
- Determinação da ação na penetração viral
Essa etapa é posterior a adsorção. Nela é avaliado se a substância é capaz de
inibir as etapas de fusão ou endocitose da partícula viral.
Monocamadas de células são inoculadas com 100 TCID
50
/ml da suspensão viral
e incubadas durante uma hora a 4ºC, para que ocorra a adsorção viral. Após este
período, as monocamadas de células são lavadas com meio de cultura gelado (4
o
C) para
retirar as partículas não adsorvidas. A seguir, o agente é adicionado na CMNT e as
células incubadas a 37
o
C/1h. É feito um controle substituindo o agente por meio de
cultura de células. Terminada a incubação, as monocamadas de células são lavadas, o
meio de cultura adicionado e novamente incubadas a 37
o
C por 48 horas. Após
incubação, o sobrenadante é titulado. Assim, é comparado o título viral nas células que
foram expostas ao agente, com aquelas sem tratamento.
- Atividade intracelular
Nessa etapa espera-se a partícula viral penetrar célula, e depois é colocado o
agente. A inibição intracelular pode ocorrer nas etapas de transcrição, tradução ou
replicação.
Monocamadas de células são inoculadas com 100 TCID
50
/ml da suspensão viral
e incubadas por 2h/37
°
C. Após este período, as monocamadas de células são lavadas,
adicionadas do agente e incubadas por 16 horas a 37
°
C. É feito um controle substituindo
o agente por meio de cultura de células. Após incubação, as células são lavadas,
adicionadas de meio de cultura e a incubação prossegue até completar 48 horas. Após
incubação, o sobrenadante é titulado. Assim, é comparado o título viral nas células que
foram expostas ao agente, com aquelas sem tratamento.
58
4 Resultados e Discussão
4.1 Óleos essenciais
4.1.1 Rendimento e Composição química dos óleos essenciais das folhas e dos galhos
de Ocotea notata.
Após o processo de hidrodestilação utilizando aparelho do tipo Clevenger foram
obtidos os óleos essenciais das folhas e dos galhos de O. notata. Os rendimentos dos
processos extrativos foram 0,13% para as folhas e 0,09% para os galhos. A análise
inicial dos cromatogramas obtidos por CG-EM indicou que os perfis de eluição dos
componentes presentes nos óleos essenciais das folhas e dos galhos de O. notata eram
muito semelhantes (Figura 17).
A análise dos dados presentes nos cromatogramas levou à identificação de 34
substâncias presentes nas folhas e 33 substâncias presentes nos galhos, representando
95,85% (folhas) e 90,08% (galhos) do total de componentes presentes nos óleos. O total
de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados nas folhas foi de 20,96% e 74,89%,
respectivamente. Nos galhos, esse total foi de 11,48% para monoterpenos e 78,6% para
sesquiterpenos. Os monoterpenos majoritários para ambos os óleos foram o α-pineno e
o β-pineno, e os sesquiterpenos foram o β-cariofileno e o germacreno D. O perfil
químico dos óleos essenciais das folhas e dos galhos de O. notata estão de acordo com
dados publicados para outras espécies do gênero Ocotea (BARBOSA-FILHO et al,
2008; TAKAKU et al, 2007). Analisando a composição química de ambos os óleos,
pode-se afirmar que a porcentagem das substâncias identificadas foi a principal
diferença encontrada entre eles, visto que a composição química dos óleos é muito
semelhante. Além disso, não foi observada a presença de diterpenos e de
fenilpropanóides, como usual para espécies do gênero Ocotea. A Tabela 3 mostra a
composição química e as substâncias identificadas nos óleos essenciais das folhas e
galhos de Ocotea notata, enquanto a Figura 18 mostra a fórmula estrutural dessas
substâncias identificadas.
59
Figura 17. Cromatogramas obtidos por CG-EM dos óleos essenciais: (a) das folhas; (b) dos galhos de O.
notata.
(a)
(b)
60
Tabela 3. Composição química e substâncias identificadas nos óleos essenciais das folhas e dos galhos de
Ocotea notata.
Substâncias
identificadas
Folhas Galhos
Literatura
IR
calc.
% IR
calc.
%
IR
tab
α-Tujeno 926 0,13 - -
930
α-Pineno 935 6,52 935 2,40
939
Sabineno 973 2,10 973 1,38
975
β-Pineno 978 3,91 978 1,57
979
Mirceno 986 1,66 986 1,06
991
α-Felandreno 1003 0,11 1003 0,29
1003
α-Terpineno 1014 0,53 1015 0,41
1017
Limoneno 1028 1,83 1028 1,06
1029
β-Felandreno 1030 0,81 1030 0,55
1030
(E)-β-Ocimeno - - 1045 0,35
1050
γ-Terpineno 1057 0,84 1058 0,67
1060
Terpinoleno 1083 0,24 1083 0,19
1089
Terpinen-4-ol 1180 2,14 1181 1,55
1177
α-Terpineol 1194 0,14 - -
1189
δ-Elemeno 1335 1,09 1335 1,62
1338
α-Cubebeno 1347 0,23 1347 0,53
1351
α-Ylangeno 1369 0,21 1369 0,50
1375
α-Copaeno 1376 7,92 1376 6,27
1377
β-Bourboneno 1382 0,13 - -
1388
β-Cubebeno 1387 1,05 1387 0,57
1388
β-Elemeno 1389 2,11 1389 2,25
1391
β-Cariofileno 1420 18,27 1420 13,89
1419
α-Humuleno 1457 12,17 1457 8,45
1455
γ-Muroleno 1477 1,06 1477 1,47
1480
Germacreno D 1483 16,94 1483 18,29
1485
Biciclogermacreno 1495 2,78 1496 2,32
1500
α-Muroleno - - 1499 0,93
1500
Germacreno A 1507 0,39 1507 0,45
1509
γ-Cadineno 1514 0,29 1514 1,04
1514
δ-Cadineno 1520 5,68 1521 5,81
1524
Germacreno B 1561 1,18 1561 2,46
1561
Óxido de Cariofileno 1584 0,48 1584 0,74
1583
α-Murolol 1647 0,26 1648 1,94
1646
α-Cadinol 1660 0,87 1662 4,64
1654
(Z).α-Santalol 1682 1,36 1683 3,27
1678
(Z)-α-trans-Bergamotol 1695 0,42 1695 1,16
1691
Total 95,85 90,08
Monoterpenos 20,96 11,48
Sesquiterpenos 74,89 78,6
IR
calc
: Índice de retenção calculado; IR
tab.
: Índice de retenção tabelado (ADAMS, 2001).
61
Figura 18. Substâncias presentes nos óleos essenciais das folhas e dos galhos de O. notata.
α-Tu
j
eno
α-
p
ineno
Sabineno
β
-Pineno
mirceno
γ
-Ter
p
ineno
α-Felandreno
α-Ter
p
ineno
Limoneno
β
-Felandreno
(
E
)
-
β
-Ocimeno
Ter
p
inole
α-Cubebeno
Ter
p
inen-4-ol
α-Ter
p
ineol
δ-Elemeno
α-Ylan
g
eno
α-Co
p
aeno
β
-Bourboneno
β
-Cubebeno
β
-Elemeno
β-Cariofileno
α-Humuleno
γ
-Muroleno
Germacreno D
Biciclogermacreno
α-Muroleno
Germacreno A
Óxido de Cariofileno
(Z).α-Santalol
α-Cadinol
(
Z
)
-α-trans-Ber
g
amotol
α-Murolol
E
OH
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
E
E
E
E
H
H
H
E
E
E
E
H
H
O
H
H
HO
H
H
HO
OH
Z
OH
Z
E
E
γ
-Cadineno
Germacreno B
62
4.2 Flavonóides
4.2.1 Rendimento do processo extrativo na obtenção da mistura de flavonóides e
análise do seu perfil químico por CCD e CLAE.
Foram utilizadas 400g de folhas secas e moídas de Ocotea notata para o
processo de extração com Soxhlet e obteve-se 21g de extrato hexânico, que representou
um rendimento de 5,3%. Após a extração dos componentes de caráter apolar com
hexano, foi feita uma extração com metanol onde foram obtidos 118,8g de extrato
metanólico, representando assim um rendimento de 29,7%. O rendimento do processo
total da extração foi de 35,0%. Como um dos objetivos do trabalho era a busca por
compostos fenólicos, somente o extrato metanólico foi utilizado para o estudo.
Dos 118g de extrato metanólico obtidos através do processo extrativo, 35g
foram suspensos em água e depois particionados com acetato de etila. Após a
evaporação de todo acetato de etila, foram obtidos 3,2g de um pó amarelo, que
representou um rendimento de 7,6%. Este pó foi chamado de mistura de flavonóides,
porque, depois de analisado por CCD utilizando o “NP” como revelador químico, foram
observadas bandas fluorescentes e coloridas na placa cromatográfica, quando exposta a
luz UV no comprimento de onda de 366nm, e também após análise do pó por CLAE
(condições das cromatografias descritas no item 3.3.4), concluiu-se que a maioria das
substâncias presentes na mistura eram flavonóides. Na Figura 19 é mostrado o
cromatograma obtido por CLAE no comprimento de onda de 365nm.
É importante ressaltar que a numeração dos picos nos cromatogramas que
seguem é referente às substâncias que foram identificadas no presente trabalho.
Após análise do cromatograma, observou-se que os picos indicados pelos
números 4-7 e 9 apresentavam espectro de absorção no UV muito semelhantes
indicando a presença de flavonóides da classe flavonóis, onde todos apresentavam a
mesma aglicona. Os picos 8 e 10 também apresentavam espectros de absorção no UV
muito semelhantes e que também eram característicos de flavonóis.
63
Figura 19: Cromatograma da mistura de flavonóides a 365nm e os espectros de absorção no ultravioleta
obtidos por CLAE. (os picos numerados referem-se apenas àquelas substâncias que foram identificadas
no presente trabalho).
A mistura de flavonóides foi então submetida à hidrólise ácida para confirmar se
realmente os picos indicados no cromatograma eram compostos por somente dois tipos
de aglicona. O resultado da hidrólise aparece na Figura 20. Como pode ser observado, a
hidrólise total da mistura resultou em somente 2 picos principais que apresentaram os
mesmos tempos de retenção e espectros de absorção no UV dos picos 9 e 10,
confirmando assim a presença de somente dois tipos de aglicona.
Figura 20. Cromatograma obtido por CLAE após a hidrólise ácida da mistura de flavonóides (λ =
365nm).
Minutes
0
10 20 30 40 50 60
mAU
0
500
1000
1500
2000
mAU
0
500
1000
1500
2000
9
10
Espectro de absorção no
UV do pico 8
Espectro de absorção no UV
dos picos 4-7
64
A análise do cromatograma da mistura de flavonóides em 280nm revelou a
presença de outros picos, e examinando os espectros no UV dos picos indicados como
1, 2 e 3, concluiu-se que esses picos também representavam flavonóides, porém de
aglicona semelhante a classe dos flavanóis (Figura 21).
Figura 21. Cromatograma da mistura de flavonóides a 280nm e o espectro de absorção no ultravioleta do
pico 3 obtido por CLAE (os picos numerados referem-se apenas àquelas substâncias que foram
identificadas nesta obra).
4.2.2 Análise dos componentes da mistura de flavonóides por EM
Após a análise da mistura de flavonóides por EM utilizando ionização por
eletronebulização e modo negativo, foi possível identificar algumas substâncias
presentes na mistura através de seus íons pseudomoleculares [M-H]
-
e dos fragmentos
obtidos destes íons quando selecionados para o experimento de EM/EM em analisador
do tipo TOF. A ionização por eletronebulização é uma técnica de ionização branda que
produz íons pseudomoleculares sem quase nenhuma fragmentação. O espectro de
massas da mistura de flavonóides é mostrado na Figura 22.
Espectro no UV do pico 3
65
Figura 22. Espectro de massas da mistura de flavonóides. Os valores de m/z dos picos representam os
íons pseudomoleculares [M-H]
-
.
Examinando o espectro da mistura de flavonóides, observa-se que os valores dos
íons pseudomoleculares [M-H]
-
como m/z 163, 285, 289 e 301 estão de acordo com
aqueles descritos na literatura (CHARROUF et al, 2007, LA TORRE et al, 2006) para o
ácido p-cumárico (MM = 164) kaempferol (MM = 286), (epi)catequina (MM = 290) e
quercetina (MM = 302). Já para os valores assinalados no espectro como m/z 433, 447,
463, 477 e 863, foi necessária a realização do experimento de EM/EM para se ter uma
idéia das estruturas que estes picos representavam. Os íons m/z 433, 447, 463, 477
apresentaram em comum o íon m/z 301, o que demonstra que a quercetina é a aglicona
comum dos quatro flavonóides, conclusão corroborada pelos resultados da hidrólise
ácida da mistura (ver item 4.2.1, Figura 20).
O primeiro experimento de EM/EM foi realizado com o íon pseudomolecular
m/z 433, e a análise do seu espectro permitiu identificá-lo como sendo o flavonol
quercetina ligada a uma pentose (arabinose ou xilose; são as pentoses mais comuns
ligadas a flavonóides) [M – H - 150]
-
. O íon com m/z 447 representava a quercetina
ligada a um desóxi-açúcar (ramnose) [M – H - 164]
-
. Já o íon m/z 463 estava de acordo
com a estrutura de uma quercetina ligada a uma hexose (glicose ou galactose) [M – H -
180]
-
e o íon m/z 477 representava uma quercetina ligada a um ácido glucurônico ou
galacturônico [M – H - 194]
-
(Figura 23).
66
Figura 23. Espectros de IES-EM/EM dos íons pseudomoleculares [M-H]
-
selecionados: (a) m/z 433; (b)
m/z 447; (c) m/z 463 e (d) m/z 477. O íon m/z 301 representa a aglicona quercetina.
(a) (b)
(d)
(c)
67
O íon pseudomolecular [M-H]
-
m/z 863 e sua fragmentação por EM/EM é
consistente com a estrutura de uma proantocianidina trimérica composta somente por
unidades de (epi)catequina e com uma ligação interflavânica do tipo A entre as unidades
superior e intermediária do trímero (LI; DEINZER, 2008, APPELDOORN et al, 2009).
As proantocianidinas com ligação do tipo A podem ser distinguidas daquelas com
ligação do tipo B pela diferença de duas unidades de massa a menos devido à presença
de uma ligação éter adicional entre os carbonos C2 de uma unidade e o carbono C7 de
outra unidade da proantocianidina. Logo, um íon pseudomolecular referente à estrutura
trimérica que contém ligação interflavânica do tipo B deve ter um m/z igual a 865 [M-
H]
-
(LI; DEINZER, 2008).
Entretanto, somente com os dados de espectrometria de massas não é possível
saber como as unidades condensadas de proantocianidinas estão conectadas umas com
as outras, pois estas ligações podem ser feitas entre os carbonos C4ÆC8 ou C4ÆC6
(ligações do tipo B) além da ligação do tipo A (C2ÆOÆC7). Para obtenção desses
dados, existem reações específicas de clivagem ácida das ligações interflavânicas com
soluções de tolueno-α-tiol ou floroglucinóis, onde o produto dessas clivagens é
analisado por CLAE, comparando os dados de tempo de retenção e espectro no UV com
padrões (SCHOFIELD et al, 2001). O resultado dessas reações também pode ser
analisado por RMN em duas dimensões para obtenção dos dados da estereoquímica. A
análise de proantocianidinas triméricas ou com graus de polimerização maiores do que 3
somente por técnicas de RMN, sem o auxílio das reações de clivagem ácida é uma
tarefa muito árdua, visto que essas substâncias são formadas por condensação de
estruturas muito semelhantes, além de existir um isomerismo conformacional devido ao
impedimento estérico da rotação entre as ligações interflavânicas. Tal fenômeno é muito
comum entre proantocianidinas com ligações interflavânicas rígidas do tipo A, o que
gera múltiplos sinais de RMN com diferentes intensidades. Alguns autores recorrem à
modelagem molecular para tentar elucidar a estrutura desses tipos de substâncias (FOO
et al, 2000).
O espectro de massa/massa do íon pseudomolecular m/z 863 [M-H]
-
mostrou
principalmente as seguintes fragmentações: m/z 711, 573, 531, 451, 411, 289 (Figura
24). O íon m/z 711 [M – H – 152]
-
está de acordo com uma perda neutra de 152 através
de uma fissão do tipo retro Diels-Alder dos anéis E e F da unidade intermediária do
trímero de (epi)catequina. A Figura 25 indica uma possível estrutura para um trímero de
(epi)catequina com uma ligação interflavânica do tipo A e sua rota de fragmentação
68
(HE et al, 2007; LI; DEINZER, 2008). O íon pseudomolecular m/z 573 [M – H – 290]
-
corresponde as unidades superior e intermediária do trímero com uma ligação
interflavânica do tipo A. Essa fragmentação é consistente a perda de uma unidade
terminal de (epi)catequina através da fissão do tipo quinona metídio. O íon m/z 451
corresponde à perda de 122 do íon m/z 573 através fissão de anel heterocíclico onde é
perdido o anel A da unidade superior do trímero. O íon m/z 289 indica a presença da
(epi)catequina. Pela análise desses dados e comparação com dados da literatura pode-se
seqüenciar a proantocianidina isolada como: (epi)catequina-A-(epi)catequina-
(epi)catequina, onde A indica a posição da ligação interflavânica do tipo A entre a
unidade superior e intermediária do trímero.
Figura 24. Espectro de massa/massa do íon precursor m/z 863.
69
Figura 25. Proposta de estrutura para o trímero de proantocianidina tipo A e rotas de fragmentação do íon
precursor após experimentos de IES-EM/EM modo negativo.
O
OH
HO
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
A
C
B
D
E
F
OHO
OH
OH
OH
OH
G
H
I
4
8
7
4
8
2
O
OH
HO
OH
OH
OH
O
OH
OH
A
C
B
D
OHO
OH
OH
OH
OH
G
H
I
4
8
7
4
8
2
O
OH
HO
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
A
C
B
D
E
F
4
8
7
4
2
O
OH
HO
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
A
C
B
D
E
4
8
7
2
HO
OH
O
OH
OH
OH
D
E
F
8
7
4
OH
OH
OH
HO
OH
O
OH
OH
OH
D
E
F
8
7
4
-
-
-
-
-
m/z 863
m/z 573
m/z 451
m/z 531
m/z 289
m/z 711
RDA
QM
HRF
70
Minutes
0
10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
50
100
150
200
250
mAU
0
50
100
150
200
250
Minutes
0
10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
50
100
150
mAU
0
50
100
150
(
a
)
(b)
1
2
4.2.3 Elucidação estrutural das substâncias codificadas como RAF1-10 presentes na
mistura.
Os flavonóides codificados como RAF1-10 correspondem aos picos 1-10
identificados no cromatograma da Figura 22.
4.2.3.1 Elucidação estrutural de RAF1 e RAF2
Após análise do cromatograma obtido em λ= 280nm, observou-se que os picos
assinalados como 1 e 2 apresentavam espectros de absorção no UV muito semelhantes e
que correspondiam à classe dos flavanóis. A presença do íon pseudomolecular m/z 289
[M-H]
-
após o experimento de espectrometria de massas indicou a presença de
(epi)catequina na mistura. Para confirmar a suspeita, foi feito um experimento de
coinjeção em CLAE com a mistura de flavonóides e padrões de (+)-catequina e (-)-
epicatequina (Figura 26).
Figura 26. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 280nm): (a) Coinjeção de (+)-catequina; (b)
Coinjeção de (-)-epicatequina.
71
Após esse experimento foi possível identificar RAF1 como sendo (+)-catequina
e RAF2 como (-)-epicatequina (Figura 27) pelo aumento da intensidade de seus picos,
quando comparados com os picos no cromatograma da mistura de flavonóides (Figura
21).
Figura 27. Estruturas de RAF1 e RAF2.
4.2.3.2 Elucidação estrutural de RAF3
A substância codificada como RAF3 foi isolada após cromatografia em coluna
de Sephadex LH-20 (24mg) e foi identificado como sendo o pico 3 do cromatograma da
mistura de flavonóides. RAF3 apresentou espectro no UV semelhante a um flavanol e
na presença de ácido mineral este sólido fez com que a solução apresentasse uma
coloração vermelha muito intensa. Após sua análise por IES-EM, pôde-se correlacionar
RAF3 com o íon pseudomolecular m/z 863 [M-H]
-
observado após análise da mistura de
flavonóides por IES-EM/EM. Conforme discutido no item 4.2.2, RAF3 foi identificado
como sendo uma proantocianidina trimérica composta por somente unidades de
(epi)catequina e uma ligação interflavânica do tipo A seqüenciada como:
(epi)catequina-A-(epi)catequina-(epi)catequina.
4.2.3.3 Elucidação estrutural de RAF4
O flavonóide codificado como RAF4 foi isolado após cromatografia em coluna
de Sephadex LH-20 (11mg) e foi identificado como sendo o pico 4 no cromatograma da
mistura de flavonóides. Sua estrutura foi elucidada por diferentes métodos: após
experimento de coinjeção de um padrão de isoquercitrina com a mistura de flavonóides
por CLAE, pois foi observada, anteriormente, a presença do íon pseudomolecular m/z
463 no espectro de massas da mistura, e sua fragmentação por EM/EM indicava a perda
O
OH
OH
HO
OH
R
1
R
2
R1 = OH, R2 = H = (+)-catequina
R1 = H, R2 = OH =
(-)-epicatequina
72
de uma hexose de uma unidade de quercetina; após submissão de RAF4 à hidrólise
ácida, onde se confirmou a presença da aglicona quercetina por comparação
cromatográfica com um padrão quando a fração orgânica foi analisada por CLAE, e a
presença do açúcar glicose quando a fração aquosa foi analisada e comparada com a
mistura de padrões de acetato de alditóis por CG-EM (Figura 28).
Figura 28. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm) e CG-EM: (a) Coinjeção de isoquercitrina;
(b) Mistura de flavonóides; (c) Cromatograma de massas da fração glicídica de RAF4. O pico é referente
ao açúcar glicose (Glc). O cromatograma dos padrões de acetatos de alditóis é mostrado na Figura 16 (p.
51) do item 3.2.2.2.
Além disto, também foi obtido o espectro de RMN de
1
H para RAF4 (Figura
29). Na região do espectro entre 6,0 e 8,0 ppm encontram-se os hidrogênios de núcleos
aromáticos, enquanto na região entre 3,0 e 5,5 ppm encontram-se os hidrogênios da
porção glicídica da molécula.
Minut es
0
10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
250
500
750
1000
1250
mAU
0
250
500
750
1000
1250
30 40
(b)
(a)
4
(c)
Glc
(c)
4
73
Figura 29. Espectro de RMN de
1
H de RAF4 (Bruker DRX, 400 MHz; solvente: CD
3
OD; referência:
TMS).
Nas Figuras 30 e 31 encontram-se expandidas as regiões do espectro
correspondente aos hidrogênios aromáticos e glicídicos, respectivamente. Os sinais dos
hidrogênios em 7,7 ppm (d; J = 1,8 Hz (meta); H
2’
), 7,56 ppm (dd; J = 8,5 Hz (orto); J =
1,8 Hz (meta); H
6’
) e 6,85 ppm (d; J = 8,5 Hz (orto); H
5’
) referem-se a um sistema ABX
onde o anel aromático B do flavonóide possui substituição (hidroxilação) nas posições
3’ e 4’. Já os sinais em 6,4 ppm (d; J = 1,8 Hz (meta); H
8
) e 6,2 ppm (d; J = 1,8 Hz
(meta); H
6
), correspondem aos hidrogênios do anel 5,7-di-hidroxilado A. O sinal
presente em 5,25 ppm (d; J = 7,5 Hz) corresponde ao hidrogênio anomérico da porção
glicídica da molécula, confirmando o padrão de O-β-glicosilação.
74
Figura 30. Espectro expandido de RMN de
1
H de RAF4 na região dos hidrogênios aromáticos e do
hidrogênio anomérico (H
1
’’).
A expansão do espectro na região dos hidrogênios glicídicos permite confirmar
os sinais em 3,70 ppm (dd, J = 11,8; 1,9 Hz, H
6a
’’ou H
6b
’’) e 3,57 ppm (dd, J = 11,8; 5,3
Hz, H
6a
’’ ou H
6b
’’), 3,49 ppm (t; H
2
’’), 3,44 ppm (t; H
3
’’), 3,36 ppm (t; H
4
’’) e 3,22
ppm (m; H
5
’’) como sendo de uma glicose.
Figura 31. Espectro expandido de RMN de
1
H de RAF4 na região dos hidrogênios glicídicos.
OH
H
6
HO
H
8
A
H
2
'
H
6
'
H
5
'
OH
OH
B
H
2
’
H
6
’
H
5
’
H
8
H
6
H
1
’’
H
5
’’
H
6a ou 6b
’’
H
6a ou 6b
’’
O
H
HO
H
HO
H
H
OH
H
O
OH
1''
3''
6a/b''
5''
4''
2''
H
2
’’
H
3
’’
H
4
’’
75
Com base nos dados mostrados anteriormente, foi possível identificar RAF4
como sendo a isoquercitrina (quercetina-3-O-β-glucopiranosídeo) (Figura 32).
Figura 32. Estrutura de RAF4 (isoquercitrina).
4.2.3.4 Elucidação estrutural de RAF5
O flavonóide codificado como RAF5 foi isolado após cromatografia em coluna
de Sephadex LH-20 (4mg) e foi identificado como sendo o pico 5 no cromatograma da
mistura de flavonóides. Sua estrutura foi elucidada através das técnicas de RMN de
1
H,
hidrólise ácida, IES-EM/EM, e reações de deslocamento de banda de absorção por
espectroscopia no UV para confirmar o padrão de substituição da aglicona.
O espectro de RMN obtido para RAF5 é semelhante ao obtido para RAF4, a
diferença encontra-se na região dos hidrogênios glicídicos (região entre 3,0 e 5,5 ppm)
(Figura 33). A interpretação do espectro segue a mesma lógica aplicada para a
elucidação de RAF4.
O
O
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
OH
OH
OH
76
Figura 33. Espectro de RMN de
1
H de RAF5 (Bruker DRX, 400 MHz; solvente: CD
3
OD; referência:
TMS).
Devido ao fato de RAF5 estar em concentração baixa, o sinal do metanol
deuterado sobrepôs os sinais dos hidrogênios glicídicos. Os sinais dos hidrogênios em
7,62 ppm (d; J = 1,8 Hz (meta); H
2’
), 7,57 ppm (dd; J = 8,2 Hz (orto); J = 1,8 Hz (meta);
H
6’
) e 6,9 ppm (d; J = 8,2 Hz (orto); H
5’
) referem-se a um sistema ABX onde o anel
aromático B do flavonóide possui substituição (hidroxilação) nas posições 3’ e 4’. Já os
sinais em 6,45 ppm (d; J = 1,9 Hz (meta); H
8
) e 6,25 ppm (d; J = 1,9 Hz (meta); H
6
),
correspondem aos hidrogênios do anel 5,7-di-hidroxilado A (Figura 34). O sinal
presente em 5,12 ppm (d) corresponde ao hidrogênio anomérico da porção glicídica da
molécula e sua constante de acoplamento com valor de 7,28 Hz confirma o padrão de
O-β-glicosilação. Os valores da constante de acoplamento foram obtidos após
experimento no RMN de troca com D
2
O.
77
Figura 34. Espectro expandido de RMN de
1
H de RAF5 na região dos hidrogênios aromáticos.
Com base nos dados obtidos pelo espectro de RMN de
1
H foi possível identificar
a aglicona de RAF5 como sendo quercetina e o padrão de O-glicosilação. A
confirmação da aglicona também foi realizada após o experimento de hidrólise ácida do
flavonóide e comparação da aglicona com um padrão de quercetina por CLAE, e o
açúcar foi identificado como xilose após análise e comparação por CG-EM da fração
aquosa resultante da hidrólise com a mistura de padrões de acetato de alditóis (Figura
35, p. 51).
Figura 35. Cromatograma da fração glicídica de RAF5. O pico é referente ao açúcar xilose (Xil). O
cromatograma dos padrões de acetatos de alditóis é mostrado na Figura 16 do item 3.2.2.2.
Xil
OH
H
6
HO
H
8
A
H
2
'
H
6
'
H
5
'
OH
OH
B
H
2
’
H
6
’
H
5
’
H
8
H
6
78
Além disso, o íon pseudomolecular m/z 433 no espectro de massas da mistura, e
sua fragmentação por EM/EM já indicava a presença de uma quercetina ligada a uma
pentose [M – H - 150]
-
. Para saber em qual posição estava ocorrendo a glicosilação
foram realizadas reações de deslocamento no UV. Os resultados obtidos dessas reações
são apresentados na Tabela 4 e indicam que a glicosilação estava ocorrendo no oxigênio
da posição 3 do anel C da aglicona quercetina (MABRY et al, 1970). Logo, RAF5 foi
identificado como sendo a reinoutrina (quercetina-3-O-β-xilopiranosídeo) (Figura 36).
Tabela 4. Dados obtidos após reações de deslocamento no UV.
Dados dos espectros no UV (λ
max
, nm)
MeOH 256, 352
NaOMe 272, 329, 340
AlCl
3
276, 332,438
AlCl
3
/HCl 270, 354, 405
NaOAc 269, 383
NaOAc/H
3
BO
3
261, 376
Figura 36. Estrutura de RAF5 (reinoutrina).
O
O
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
OH
OH
79
4.2.3.4 Elucidação estrutural de RAF6
O procedimento adotado para a identificação de RAF6 foi o mesmo adotado
para RAF1 e 2 (ver item 4.2.3.1). Após análise do espectro de massas da mistura de
flavonóides e o espectro de massa/massa do íon pseudomolecular m/z 477 [M-H]
-
,
concluiu-se que este íon representava a quercetina ligada a um ácido glucurônico ou
galacturônico [M – H - 194]
-
. Para confirmar a suspeita, foi feito um experimento de
coinjeção em CLAE com a mistura de flavonóides e um padrão de quercetina-3-O-β-
glucuronopiranosídeo. (Figura 37). Como resultado desse experimento e do espectro de
massa/massa do íon m/z 477 foi possível confirmar a presença da quercetina-3-O-β-
glucuronopiranosídeo, também conhecida como miquelianina (Figura 38), na mistura de
flavonóides e identificá-la como o pico 6 do cromatograma obtido por CLAE.
Figura 37. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm): (a) Coinjeção de miquelianina; (b) Mistura
de flavonóides.
Figura 38. Estrutura de RAF6 (miquelianina).
O
O
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
OH
COOH
OH
Minutes
0
10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
100
200
300
400
mAU
0
100
200
300
400
30 40
(a)
(b)
6
6
80
4.2.3.5 Elucidação estrutural de RAF7
O flavonóide codificado como RAF7 foi isolado após cromatografia em coluna
de Sephadex LH-20 (8mg) e foi identificado como sendo o pico 7 no cromatograma da
mistura de flavonóides. Sua estrutura foi elucidada utilizando os mesmos procedimentos
adotados para RAF4. O íon pseudomolecular m/z 447 no espectro de massas da mistura
e sua fragmentação por EM/EM [M – H - 164]
-
foram indicativos da presença da
quercetina ligada a uma ramnose. Após experimento de coinjeção por CLAE de um
padrão de quercitrina (quercetina-3-O-α-ramnopiranosídeo) com a mistura de
flavonóides foi confirmado a presença desse flavonóide na mistura (Figura 39). Sua
hidrólise ácida confirmou a presença da aglicona quercetina, quando a fração orgânica
foi analisada por CLAE e comparada com um padrão, e a presença do açúcar ramnose,
quando a fração aquosa foi analisada e comparada com a mistura de padrões de acetato
de alditóis por CG-EM.
Figura 39. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm) e CG-EM: (a) Coinjeção de isoquercitrina;
(b) Mistura de flavonóides; (c) Cromatograma por CG-EM da fração glicídica de RAF4. O pico é
referente ao açúcar ramnose (Rha). O cromatograma dos padrões de acetatos de alditóis é mostrado na
Figura 16 do item 3.2.2.2.
Minutes
0
10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
200
400
600
mAU
0
200
400
600
30 40
(b)
(c)
(a)
Rha
7
7
81
Além disso, foi obtido o espectro de RMN de
1
H de RAF7. A análise do espectro
expandido na região de 6,2 a 7,4 ppm confirma a presença dos anéis A e B da aglicona
quercetina. Os sinais em 7,36 ppm (d; J = 2 Hz (meta); H
2’
), 7,32 ppm (dd; J = 8,3 Hz
(orto); J = 2 Hz (meta); H
6’
) e 6,94 ppm (d; J = 8,3 Hz (orto); H
5’
) referem-se ao anel
aromático B, e os sinais em 6,41 ppm (d; J = 2 Hz (meta); H
8
) e 6,24 ppm (d; J = 2 Hz
(meta); H
6
), correspondem ao anel A. O sinal em 0,94 ppm (d; J = 6 Hz; integração: 3
H) refere-se a uma metila e indica a presença da ramnose quando também estão
presentes o grupo de sinais entre 3,0 e 5,5 ppm. O sinal presente em 5,33 ppm (d)
corresponde ao hidrogênio anomérico e sua constante de acoplamente com valor de 1,7
Hz confirma o padrão de O-α-glicosilação (Figura 40).
Figura 40. Espectro de RMN de
1
H para RAF7 (Varian MR, 400 MHz; solvente: CD
3
OD; referência:
TMS).
A expansão do espectro na região entre 3,0 e 5,0 ppm (Figura 41) permite
observar o sinal do hidrogênio anomérico da ramnose em 5.33 ppm, além dos sinais em
4,23 ppm (dd, J = 3,4; 1,7 Hz, H
2
’’), 3,76 ppm (dd, J = 9,1; 3,4 Hz, H
3
’’) e 3,45-3,30
ppm (H
4
’’ e H
5
’’).
OH
H
6
HO
H
8
A
H
2
'
H
6
'
H
5
'
OH
OH
B
H
2
’
H
6
’
H
5
’
H
8
H
6
82
Figura 41. Espectro expandido de RMN de
1
H para RAF7 na região dos hidrogênios glicídicos.
Com base nos dados de coinjeção, hidrólise ácida, IES-EM/EM e RMN de
1
H
foi possível identificar RAF7 como quercitrina (quercetina-3-O-α-ramnopiranosídeo).
(Figura 42).
Figura 42. Estrutura de RAF7 (quercitrina).
O
O
OH
OH
O
HO
OH
O
OH
OH
OH
H
1
’
H
2
’
H
3
’
H
4
’’ e H
5
’’
O
OH
O
OH
OH
H
1
''
H
3
''
H
5
''
H
4
''
H
2
''
83
4.2.3.6 Elucidação estrutural de RAF8
O flavonóide codificado como RAF8 refere-se ao pico 8 do cromatograma
obtido por CLAE em escala analítica e foi isolado inicialmente como pico 6 por CLAE
em escala semipreparativa (Figura 43).
Figura 43. Cromatograma da mistura de flavonóides obtida por CLAE em escala semipreparativa (λ =
280nm).
Apesar do cuidado ao coletar somente o pico referente a este flavonóide, RAF8
foi isolado como uma mistura com RAF10. A separação desses flavonóides foi feita por
cromatografia em coluna utilizando gel de Sephadex LH-20, onde foram obtidos 22mg.
A elucidação estrutural de RAF8 foi feita através de experimentos de RMN
1
H,
COSY e HSQC.
Na Figura 44 encontra-se o espectro de RMN de
1
H de RAF8. Na região do
espectro localizada entre 6,0 e 8,0 ppm encontram-se os hidrogênios de núcleos
aromáticos. Os sinais com integração para 2 hidrogênios em 7,77 ppm (d; J = 8,5 Hz
(orto); H
2’
e H
6’
) e 6,92 ppm (d; J = 8,5 Hz (orto); H
3’
e
H
5’
) referem-se a um sistema
AA’XX’ onde o anel aromático B do flavonóide possui substituição (hidroxilação)
somente na posição 4’. Já os sinais em 6,38 ppm (H
8
) e 6,20 ppm (H
6
), correspondem
aos hidrogênios do anel 5,7-di-hidroxilado A. O sinal presente em 5,37 ppm
corresponde ao hidrogênio anomérico da porção glicídica da molécula. Além disso, o
sinal com integração para 3 hidrogênios em 0,91 ppm e os sinais entre 3,2–4,3 ppm
indica um provável ramnose.
RAF8
(Pico 6)
84
Figura 44. Espectro de RMN de
1
H para RAF8 (Varian MR, 400 MHz; solvente: CD
3
OD; referência:
TMS).
A partir da análise do espectro de correlação homonuclear
1
H-
1
H (COSY)
presente na Figura 46, foi possível identificar os acoplamentos seqüenciados dos
hidrogênios do anel aromático B e da porção glicídica de RAF8, confirmando assim a
presença da ramnose.
Para estabelecer a correlação direta heteronuclear
1
H-
13
C entre dos hidrogênios
da porção glicídica e da aglicona de RAF8 com seus carbonos correspondentes, foi
obtido o espectro de HSQC (Figura 47). Através desse experimento, foi possível obter
os deslocamentos químicos destes carbonos e de seus hidrogênios.
Com base nos dados apresentados e da comparação dos valores de deslocamento
químico dos hidrogênios e carbonos de RAF8 (Chen et al, 2005) foi possível identificá-
lo como Kaempferol-3-O-α-ramnopiranosídeo (Figura 45). Sua presença na mistura de
flavonóides também pode ser confirmada pelo íon pseudomolecular [M-H]
-
m/z 431
presente na Figura 23.
Figura 45. Estrutura de RAF8 (Kaempferol-3-O-α-ramnopiranosídeo).
O
O
OH
O
HO
OH
O
OH
OH
OH
OH
H
6
HO
H
8
A
H
2
'
H
6
'
H
5
'
OH
H
3
'
B
H
2
’/ H
6
’
H
3
’/ H
5
’
H
8
H
6
85
H
3
’’
H
1
’’
H
2
’’
H
6
’’
H
4
’’/H
5
’’
H
3
’/H
5
’
H
2
’/H
6
’
H
2
'
H
6
'
H
5
'
OH
H
3
'
B
O
OH
O
OH
OH
6
''
H
1
''
H
3
''
H
5
''
H
4
''
H
2
''
Figura 46. Espectro de RMN 2D – COSY de RAF8 (Varian MR, 400 MHz; solvente: CD
3
OD; referência:
TMS).
Figura 47. Espectro de RMN 2D – HSQC de RAF8 (Varian MR, 400 MHz; solvente: CD
3
OD; referência:
TMS).
86
4.2.3.7 Elucidação estrutural de RAF9
O flavonóide codificado como RAF9 refere-se ao pico 9 do cromatograma
obtido por CLAE. Ele foi isolado por Sephadex LH-20 (12 mg) e sua identificação foi
realizada por coinjeção com padrão e espectrometria de massas. O espectro de absorção
no UV e tempo de retenção deste flavonóide eram semelhantes ao flavonóide
quercetina. Além disso, a presença da quercetina já havia sido observada através do íon
pseudomolecular [M-H]
-
m/z 301 quando a mistura de flavonóides foi analisada por
IES-EM. Logo, fez-se um experimento de coinjeção por CLAE de um padrão de
quercetina com a mistura de flavonóides (Figura 48), onde se confirmou que o pico 9
(RAF9) era a quercetina (Figura 49).
Figura 48. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm): (a) Coinjeção de quercetina; (b) Mistura de
flavonóides
Figura 49. Estrutura de RAF9 (quercetina).
O
O
OH
OH
OH
HO
OH
Minutes
0
10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
200
400
600
mAU
0
200
400
600
30 40 50 60
(b)
(a)
9
9
87
4.2.3.8 Elucidação estrutural de RAF10
O flavonóide codificado como RAF10 refere-se ao pico 10 do cromatograma
obtido por CLAE. Ele foi isolado inicialmente por CLAE em escala semipreparativa
juntamente com RAF8 e depois separado por cromatografia em coluna utilizando gel de
Sephadex, onde foram obtidos 5mg de RAF10. Sua identificação foi realizada por
coinjeção com padrão e espectrometria de massas. O espectro no UV e tempo de
retenção deste flavonóide eram semelhantes ao flavonóide kaempferol. Além disso, a
presença do kaempferol já havia sido observada através do íon pseudomolecular [M-H]
-
m/z 285 quando a mistura de flavonóides foi analisada por IES-EM. Logo, fez-se um
experimento de coinjeção por CLAE de um padrão de kaempferol com a mistura de
flavonóides (Figura 50), onde se confirmou que o pico 10 (RAF10) era o kaempferol
(Figura 51).
Figura 50. Experimento de coinjeção em CLAE (λ = 365nm): (a) Coinjeção de kaempferol; (b) Mistura
de flavonóides
Figura 51. Estrutura de RAF10 (kaempferol).
O
O
OH
OH
HO
OH
Minutes
0
10 20 30 40 50 60 70
mAU
0
500
1000
1500
2000
mAU
0
500
1000
1500
2000
30 40 50 60
(b)
(a)
10
10
88
4.3 Testes Antivirais
A mistura de flavonóides foi avaliada quanto à sua atividade contra os vírus
herpes simples tipos 1 e 2. Inicialmente, foi realizado o teste de citotoxidade da mistura
frente a células do tipo Vero. Este teste é importante para conhecer o efeito da mistura
sobre a cultura de células e evitar resultados falso-positivos em virtude de um efeito
lesivo somente sobre as células. A determinação do efeito citotóxico baseou-se em
alterações morfológicas das células, permitindo estabelecer a Concentração Máxima
Não-Tóxica (CMNT) e avaliou-se também a sua viabilidade, determinando a
porcentagem de células vivas (viáveis) e a CC
50
(concentração citotóxica para 50% das
células em cultura).
Para a mistura de flavonóides, a CMNT foi ≥ 200 μg/mL e a CC
50
> 200 μg/mL.
O valor de EC
50
(concentração da substância capaz de reduzir o título viral em 50%) foi
calculado através de uma curva dose-resposta para os dois tipos de herpes-vírus (Figura
53), e o IT (índice terapêutico) foi calculado pela razão entre a concentração citotóxica
50% (CC
50
) e a concentração efetiva 50% (EC
50
). Estes valores são mostrados na Tabela
5.
Figura 52. Curva dose-resposta para o cálculo da EC
50
(concentração da substância capaz de reduzir o
título viral em 50%) para o HSV-1 e HSV-2.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 3,1 6,2 12,5 25 50
% Inibição
Concentração (μg/mL)
HSV‐1 HSV‐2
89
Tabela 5. Atividade contra os herpes-vírus tipos 1 e 2 da mistura de flavonóides.
Material
testado
CC
50
(μg/mL)
EC
50
(μg/mL)
HSV-1 HSV-2
IT
HSV-1 HSV-2
Mistura de
Flavonóides
>200
37,9 23,5
>5,3 >8,5
Aciclovir*
>200
0,8 1,38 >250 >144,9
CMNT = concentração máxima não-tóxica; CC
50
= concentração citotóxica para 50% das células em
cultura; EC
50
= concentração da substância capaz de reduzir o título viral em 50%; IT = índice terapêutico
(relação entre a concentração citotóxica 50% (CC
50
) e a concentração efetiva 50% (EC
50
); HSV-1 =
Herpes simplex tipo 1; HSV-2 = Herpes simplex tipo 2.
* Substância antiviral padrão
Quando utilizada numa concentração de 100 μg/mL, a mistura de flavonóides
obteve um índice de inibição viral (IIV) ≥ 5,36 e 4,75 para o HSV-1 e HSV-2,
respectivamente. Nesta mesma concentração, a porcentagem de inibição de ambos os
tipos do vírus foi igual a 99,9%.
A mistura de flavonóides apresentou atividade contra ambos os tipos de herpes-
vírus. Estes resultados corroboram a informação que os flavonóides são substâncias
potencialmente antivirais. Ao contrário da maioria dos resultados presentes na literatura
para atividade de flavonóides frente aos vírus herpes simples, a mistura de flavonóides
apresentou atividade maior para o HSV-2 do que para o HSV-1.
Foram realizados testes de mecanismo de ação para avaliar em qual estágio da
replicação viral a mistura de flavonóides possui ação. A Figura 53 mostra que a mistura
de flavonóides teve atividade inibitória em todos os estágios de replicação do HSV-2,
sendo todas as porcentagens de inibição maiores do que 90. Já para o HSV-1, a mistura
de flavonóides apresentou uma atividade menor sobre as partículas virais (60,2%) e não
foi capaz de inibir a infecção viral no estágio de adsorção do vírus à célula hospedeira
através dos receptores virais.
Quando comparado os valores de EC
50
e IT da mistura de flavonoides com os
valores da substância padrão aciclovir, é observada uma melhor atividade para o
aciclovir. Porém, os diferentes mecanismos de ação da mistura de flavonoides
justificam sua utilização como agente anti-herpes tipos 1 e 2, visto que o aciclovir
apresenta somente atividade intracelular. Quanto mais variado os mecanismos de ação
antiviral de uma substância, menor é a probabilidade do aparecimento de uma cepa de
vírus resistente a essa substância.
90
Figura 53. Mecanismo de ação da mistura de flavonóides contra os herpes-vírus tipos 1 e 2.
A etapa da penetração do vírus na célula é um alvo muito atrativo para a terapia
antiviral, visto que a infecção pode ser bloqueada em seu estágio inicial (GOMES et al,
2008). A mistura de flavonóides apresentou uma alta atividade inibitória, maior que
80% no estágio de penetração dos dois tipos de herpes-vírus na célula, além de também
possuir uma atividade inibitória maior que 90% no estágio intracelular do vírus.
91
5 CONCLUSÕES
O presente trabalho revela, pela primeira vez, os resultados de um estudo
fitoquímico e de atividade antiviral com Ocotea notata (Nees) Mez. Este estudo
contribui tanto para o conhecimento do potencial biológico de espécies de plantas da
Restinga de Jurubatiba, e conseqüentemente para a importância da preservação dessa
área de restinga que está constantemente ameaçada pela expansão imobiliária na região,
quanto para a importância do gênero Ocotea.
Neste trabalho foi revelada a composição química dos óleos essenciais das
folhas e dos galhos de O. notata. A comparação cromatográfica destes óleos mostrou
que eles são muito semelhantes em composição, apresentam os mesmos componentes
majoritários, que são os monoterpenos α-pineno e β-pineno, e os sesquiterpenos β-
cariofileno e germacreno D. Portanto, quando se deseja fazer a extração do óleo
essencial das partes aéreas de O. notata, pode-se dar preferência às folhas em relação
aos galhos, visto que as folhas geram um maior rendimento. Estes componentes
majoritários estão de acordo com dados publicados na literatura para outras espécies de
Ocotea.
Através do planejamento e desenvolvimento de uma metodologia de extração e
purificação de substâncias fenólicas, foi obtida de maneira simples, rápida e eficiente,
uma mistura rica em flavonóides. Esta mistura foi analisada por diferentes métodos
analíticos e todos os seus constituintes majoritários, e alguns minoritários, foram
identificados. Algumas substâncias foram isoladas, purificadas e tiveram sua estrutura
elucidada, enquanto outras foram identificadas na mistura.
No total foram identificadas 10 substâncias e todas já tinham sido descritas na
literatura. São elas: (+)-catequina, (-)-epicatequina, uma proantocianidina trimérica
seqüenciada como (epi)catequina-A-(epi)catequina-(epi)catequina, isoquercitrina,
reinoutrina, miquelianina, quercitrina, kaempferol-3-O-α-ramnopiranosídeo, quercetina
e kaempferol.
A mistura de flavonóides foi avaliada quanto à sua capacidade de inibição do
herpes-vírus tipos 1 e 2. Os resultados obtidos mostraram que a mistura possui a
capacidade de inibir os dois tipos de vírus, sendo mais ativa contra o HSV-2. Quando
avaliado o mecanismo de ação antiviral, pode-se observar que a mistura possui ação em
diferentes estágios do ciclo de replicação viral. Estes resultados positivos, juntamente
com a baixa toxidade in vitro da mistura, a sua facilidade de obtenção e a caracterização
92
dos seus constituintes majoritários sugerem uma possível utilização da mistura de
flavonóides como um auxiliar na terapia de combate às infecções por HSV-1 e HSV-2
em humanos.
93
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