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GERMINAÇÃO, CULTIVO in vitro E TOLERÂNCIA
AO CONGELAMENTO DE SEMENTES DE ANGICO-
VERMELHO (Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan)
FERNANDA CARLOTA NERY
2008
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FERNANDA CARLOTA NERY
GERMINAÇÃO, CULTIVO in vitro E TOLERÂNCIA AO
CONGELAMENTO DE SEMENTES DE ANGICO-VERMELHO
(Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan)
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras
como parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, área de concentração
em Fisiologia Vegetal, para a obtenção do título de
“Doutora”.
Orientador
Prof. Dr. Amauri Alves de Alvarenga
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2008
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Nery, Fernanda Carlota
Germinação, cultivo in vitro e tolerância ao congelamento de
sementes de angico-vermelho (Anadenanthera colubrina (Vell.)
Brenan) / Fernanda Carlota Nery. – Lavras : UFLA, 2008.
217 p. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Lavras, 2008.
Orientador: Amauri Alves de Alvarenga.
Bibliografia.
1. Anadenanthera colubrina. 2. Angico. 3. Semente. 4. Cultura de
tecidos. 5. Criopreservação. I. Universidade Federal de Lavras. II.
Título.
CDD-634.973163
FERNANDA CARLOTA NERY
GERMINAÇÃO, CULTIVO in vitro E TOLERÂNCIA AO
CONGELAMENTO DE SEMENTES DE ANGICO-VERMELHO
(Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan)
Tese apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Agronomia, área de
concentração em Fisiologia Vegetal, para a
obtenção do título de "Doutora".
APROVADA em 29 de agosto de 2008.
Prof. Dr. Breno Régis Santos UNIFAL
Prof. Dr. Renato Mendes Guimarães UFLA
Prof. José Márcio Rocha Faria, PhD UFLA
Prof. Edvaldo Aparecido Amaral da Silva, PhD UFLA
Prof. Dr. Amauri Alves de Alvarenga
Orientador
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2008
A Deus,
A minha mãe, Jane,
A minha irmã gêmea, Marcela,
Aos meus avós, Etelvina (in memoriam) e
Geraldo Carlota (in memoriam).
Wxw|vÉ
TzÜtwxv|ÅxÇàÉá
A Deus, por sempre me dar forças para vencer os obstáculos.
À Universidade Federal de Lavras (UFLA), em especial ao Setor de
Fisiologia Vegetal, pela oportunidade de realização da pós-graduação.
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos, de mestrado e de
doutorado, e ao CNPq e Fapemig, pelas bolsas de iniciação científica.
Ao meu orientador, Prof. Amauri Alves de Alvarenga, por toda atenção,
apoio e amizade.
Aos membros da banca examinadora e aos membros do comitê de co-
orientação, professores Renato Paiva, José Márcio Rocha Faria e Cristina
Filomena Justo, pela valiosa ajuda e inestimável contribuição.
À Profa. Joelma Pereira, pela valiosa convivência e amizade durante
toda a minha formação e por todos os conhecimentos transmitidos.
Ao Setor de Sementes, por sempre estar de portas abertas ao
conhecimento.
À grande amiga, Profa. Cristina Filomena Justo (UFMT), pela
convivência, conselhos e valiosa ajuda na minha formação profissional.
Ao Prof. Hilton Morbeck de Oliveira (UFMT) e família, pela valiosa
amizade e ajuda durante todo o mestrado e doutorado.
À Dra. Fernanda Soares (MAPA) e à Dra. Patrícia Guimarães, pela
amizade incondicional.
Aos funcionários Joel, Odorêncio, Lena, Tanhan, Tina e Celen, por todo
o auxílio.
Aos amigos e colegas da pós-graduação em Fisiologia Vegetal que me
acompanharam no mestrado e no doutorado e que, mesmo distantes, são
presença constante em minha vida.
A todos que, de alguma maneira contribuíram para que eu conseguisse
chegar até aqui, seja com um sorriso, um incentivo ou simplesmente com a força
positiva do pensamento em mim. Agradeço a todos vocês, com muito carinho.
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................................ i
ABSTRACT.................................................................................................... ii
CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO GERAL.................................................... 1
1 INTRODUÇÃO........................................................................................... 2
2 REFERENCIAL TEÓRICO........................................................................ 4
2.1 Importância e características da espécie................................................... 4
2.2 Aspectos fisiológicos da germinação de sementes................................... 7
2.3 Cultivo de embriões in vitro...................................................................... 10
2.4 Criopreservação de sementes.................................................................... 14
3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 22
CAPÍTULO II: ESTUDOS MORFOANATÔMICOS DE FRUTO E
SEMENTE E ALGUNS ASPECTOS FISIOLÓGICOS DA
GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Anadenanthera colubrina (Vell.)
Brenan.............................................................................................................
34
1 RESUMO..................................................................................................... 35
2 ABSTRACT................................................................................................. 36
3 INTRODUÇÃO........................................................................................... 37
4 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 40
4.1 Material vegetal........................................................................................ 40
4.2 Caracterização morfológica de frutos e sementes..................................... 41
4.3 Teste histoquímico das sementes.............................................................. 41
4.4 Caracterização ultraestrutural do eixos embrionários............................... 42
4.5 Composição química das sementes........................................................... 43
4.6 Curva de embebição das sementes............................................................ 46
4.7 Efeito da temperatura e luminosidade na germinação de sementes.......... 47
4.8 Efeito do substrato na germinação de sementes........................................ 49
4.9 Caracterização morfológica das plântulas em diferentes substratos......... 49
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 50
5.1 Morfologia e anatomia dos frutos e sementes........................................... 50
5.2 Composição química de sementes............................................................ 57
5.3 Curva de embebição de sementes.............................................................. 63
5.4 Efeito da temperatura e luminosidade na germinação de sementes.......... 66
5.5 Efeito do substrato na germinação de sementes........................................ 70
6 CONCLUSÕES............................................................................................ 79
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 79
CAPÍTULO III: ASPECTOS DA GERMINAÇÃO in vitro DE EIXOS
EMBRIONÁRIOS, INDUÇÃO DE BROTAÇÕES E CALOGÊNESE
EM EXPLANTES DE Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan.................
87
1 RESUMO..................................................................................................... 88
2 ABSTRACT................................................................................................. 89
3 INTRODUÇÃO................................................................................................... 90
4 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 93
4.1 Material vegetal......................................................................................... 93
4.2 Efeito do tempo de exposição ao hipoclorito de sódio (NaOCl) e a
drágeas de Paraformaldeído na desinfestação de eixos embrionários.............
93
4.3 Germinação in vitro de eixos embrionários.............................................. 95
4.3.1 Efeito de GA
3
e meios de cultura........................................................... 95
4.3.2 Efeito de BAP e meios de cultura.......................................................... 99
4.4 Efeito do BAP e ANA na indução de brotações....................................... 102
4.5 Efeito do 2,4-D na indução de calos em diferentes explantes................... 105
4.6 Efeito do AIB e da caseína hidrolisada no enraizamento in vitro de
brotações..........................................................................................................
106
4.7 Aclimatização de plântulas de A. colubrina.............................................. 107
4.8 Anatomia foliar em plântulas in vitro....................................................... 107
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 108
5.1 Efeito do tempo de exposição ao hipoclorito de sódio (NaOCl) e a
drágeas de Paraformaldeído na desinfestação de eixos embrionários.............
108
5.2 Germinação in vitro de eixos embrionários.............................................. 114
5.2.1 Efeito de GA
3
e meios de cultura........................................................... 114
5.2.2 Efeito de BAP e meios de cultura.......................................................... 124
5.3 Efeito do BAP e ANA na indução de brotações....................................... 132
5.3.1 Comprimento da maior brotação............................................................ 132
5.3.2 Número de brotações por explante......................................................... 134
5.3.3 Número de gemas por explante.............................................................. 137
5.3.4 Formação de calos na base dos explantes.............................................. 139
5.4 Efeito do 2,4-D na indução de calos em diferentes explantes................... 141
5.5 Efeito do AIB e caseína hidrolisada no enraizamento in vitro de
brotações..........................................................................................................
147
5.6 Aclimatização de plântulas in vitro de A. colubrina................................. 149
5.7 Anatomia foliar in vitro............................................................................. 150
6 CONCLUSÕES........................................................................................... 152
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 153
CAPÍTULO IV: TOLERÂNCIA AO CONGELAMENTO DE EIXOS
EMBRIONÁRIOS DE Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan................
159
1 RESUMO..................................................................................................... 160
2 ABSTRACT................................................................................................. 161
3 INTRODUÇÃO........................................................................................... 162
4 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 166
4.1 Material vegetal......................................................................................... 166
4.2 Armazenamento das sementes em câmara fria e em temperaturas
inferiores a zero...............................................................................................
167
4.3 Armazenamento de eixos embrionários em temperaturas inferiores a
zero..................................................................................................................
168
4.4 Quantificação e integridade do DNA nuclear........................................... 170
4.5 Avaliação ultraestrutural de eixos embrionários....................................... 171
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 173
5.1 Armazenamento das sementes em câmara fria......................................... 173
5.2 Armazenamento das sementes em temperaturas inferiores a zero............ 175
5.3 Armazenamento de eixos embrionários em temperaturas inferiores a
zero..................................................................................................................
178
5.4 Quantificação e integridade do DNA nuclear........................................... 184
5.5 Avaliação ultraestrutural de eixos embrionários criopreservados............. 187
6 CONCLUSÕES........................................................................................... 190
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 190
CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................... 199
ANEXOS A..................................................................................................... 200
ANEXOS B..................................................................................................... 213
RESUMO
NERY, Fernanda Carlota. Germinação, cultivo in vitro e tolerância ao
congelamento de sementes de angico-vermelho (Anadenanthera colubrina
(Vell.) Brenan). 2008. 217 p. Tese (Doutorado em Fisiologia Vegetal) -
Universidade Federal de Lavras, Lavras.
*
A espécie Anadenanthera colubrina (Vell). Brenan, angico-vermelho, é uma
Mimosaceae, de porte arbóreo, utilizada na arborização de pastos, madeira,
carvão e em curtumes, devido ao alto teor de tanino de sua casca. Os estudos de
germinação e as técnicas de propagação de sementes de espécie nativas
florestais assumem papel relevante nas pesquisas científicas, objetivando a
preservação e a utilização das plantas potencialmente econômicas e de interesse
diversificado. As técnicas de criopreservação têm sido utilizadas na conservação
a longo prazo de sementes dessas espécies em bancos de germoplasma.
Objetivou-se estudar os aspectos morfoanatômicos e fisiológicos da germinação
de sementes, cultivo in vitro e tolerância ao congelamento de eixos embrionários
de A. colubrina. Concluiu-se que a anatomia seminal de A. colubrina é típica das
leguminosas, especialmente considerando-se a subfamília Mimosoideae. O
número de sementes por fruto é, em média, de 10 e o peso de mil sementes de
118 g. A composição química das sementes se caracteriza pela presença de
elevados teores de proteína, seguidos de extrato etéreo e baixo conteúdo de
amido. As sementes não apresentam dormência tegumentar e a maior
porcentagem de germinação ocorre a 30ºC, 15°C-25ºC e 20°C-30ºC, sendo as
sementes indiferentes à luz. Os substratos areia e Plantmax® são eficientes na
avaliação do desenvolvimento de plântulas. O uso de paraformaldeído por 120
minutos é eficiente na desinfestação de eixos embrionários. Todos os meios de
cultura testados são eficientes para a germinação in vitro de eixos embrionários e
a formação de plântulas normais. No entanto, é observada baixa taxa de
sobrevivência ex vitro. O uso de BAP promove resposta eficiente na indução de
brotações em segmentos nodais. O AIB e a caseína hidrolisada, nas
concentrações testadas, não induzem a rizogênese em brotações. Na ausência de
2,4-D, a calogênese é ausente, comprovando a necessidade da adição do mesmo
no meio de cultura. Segmentos caulinares, foliares e embrionários são explantes
ideiais para a indução de calogênese. Os eixos embrionários de A. colubrina
apresentam comportamento ortodoxo quanto à tolerância ao congelamento,
podendo ser conservados em temperaturas inferiores a zero, por longos períodos.
*
Comitê Orientador: Dr. Amauri Alves de Alvarenga – UFLA (orientador),
Renato Paiva, PhD – UFLA, José Márcio Rocha Faria, PhD – UFLA, Dra.
Cristina Filomena Justo – UFMT (co-orientadores).
i
ABSTRACT
NERY, Fernanda Carlota. Germination, in vitro cultivation and freezing
tolerance of red angico seeds (Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan). 2008.
217 p. Thesis (Doctorate in Plant Physiology) – Federal University of Lavras,
Lavras, MG.
*
The species Anadenanthera colubrina (Vell). Brenan, red angico, is a
Mimosaceae, of tree port , used in the tree planting of pastures, wood, coal and
tannery, because of its high content of tannin in its bark. The seeds germination
studies and propagation techniques of native forest species have a relevant role
in scientific researches, aiming to preserve and use these plants potentially
economic and with diverse interests. The cryopreservation techniques have been
used to the long-term preservation of seeds of these species in germoplasm
banks. It was aimed the study of the morphological anatomical and
physiological aspects of the seeds germination, the in vitro cultivation and the
freezing tolerance of A. colubrine embryonic axes. It was concluded that the
seminal anatomy of A. colubrina is typical of legumes, mainly considering the
subfamily Mimosoideae. The number of seeds in each fruit is in average 10, and
the weight of one thousand seeds is 118 g. The chemical composition of the
seeds is characterized by the presence of high contents of proteins followed by
ether extract, and a low content of starch. The seeds did not presented
tegumentar dormancy and the highest germination percentage was verified at
30ºC, 15°C-25ºC and 20°C-30ºC, being the seeds indifferent to light. The
substrates sand and Plantmax® are effective in assessing the seedlings
development. The use of Paraformaldehyde for 120 minutes is effective to the
desinfestation of embryonic axes. All the culture media are effective to the in
vitro germination of embryonic axes and to the formation of normal seedlings,
however, it is observed a low ex vitro surviving rate. The use of BAP promotes
efficient response of shoots induction in nodal segments. The IBA and
hydrolyzed casein in the concentrations tested, did not induced the shoots
rooting. In the absence of 2,4-D, it is not observed the callus formation,
confirming the necessity of its use in the culture medium. Stem segments, leaves
and embryonic explants are ideal to the callus induction. The embryonic axes of
A. colubrina presents an ortodhox behaviour to freezing, and can be preserved
under temperatures below zero for long periods.
*
Adviser Comitee: Dr. Amauri Alves de Alvarenga – UFLA (Adviser), Renato
Paiva, PhD – UFLA, José Márcio Rocha Faria, PhD – UFLA, Drª. Cristina
Filomena Justo – UFMT (Co-advisers).
ii
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO GERAL
1
1 INTRODUÇÃO
O Brasil, com uma extensa superfície de terras contínuas, dispõe de
diferentes ecossistemas, e é considerado um dos países de maior diversidade
biológica do globo (The United Nations Environment Programme-UNEP, 1992;
Brasil, 2002). Em geral, os recursos naturais do país têm sido pouco estudados,
uma situação indicativa da necessidade de pesquisas que visem o melhor
conhecimento e uso desta diversidade biológica e, conseqüentemente, o
estabelecimento de estratégias de conservação. Isto se faz necessário em função
da destruição dos hábitats pelo homem por meio das queimadas, da poluição das
águas, da expansão das áreas agrícolas e das áreas urbanas (Dias, 1994; Wetzel
et al., 2003).
A conservação da biodiversidade como atividade científica vem sendo
realizada há menos de 40 anos, para reduzir a erosão genética e como reserva de
germoplasma, visando o melhoramento da produtividade agrícola (Internacional
Board for Plant Genetic Resources-IBPGR, 1993) e o desenvolvimento de
técnicas para a conservação de material biológico com a máxima variabilidade
genética possível (Bajaj, 1995).
Dois tipos de conservação que se complementam são reconhecidos e
adotados pela Convenção da Diversidade Biológica (UNEP, 1992): a
conservação in situ, na qual são conservadas as populações de espécies nativas
em seu ambiente natural, e a conservação ex situ, na qual é conservada a
variação genética das espécies fora do seu hábitat. A conservação ex situ,
realizada a curto, médio e longo prazo, é efetuada por meio de coleções de
sementes, propágulos, meristemas e plantas, em câmaras frias, criotanques ou a
campo, de acordo com a característica da espécie.
A crioconservação tem sido utilizada como um método alternativo ao
banco de germoplasma tradicional, uma vez que a conservação das sementes
2
abaixo de -130°C permite que seu metabolismo seja paralisado, impedindo sua
deterioração (Benson et al., 1998). Na afirmação de Villamil (1997), a
crioconservação tem se mostrado um método eficiente, prático e de baixo custo
na preservação de recursos fitogenéticos, além de manter a semente viável por
tempo considerado indetermidado.
O êxito de um bom protocolo de criopreservação está baseado em seis
pontos críticos, segundo Withers (1985): pré-congelamento, que se inicia vários
dias antes do congelamento e consiste em manipular as condições de cultivo in
vitro para aumentar a tolerância ao congelamento, adicionando-se ao meio de
cultura compostos com atividade osmorreguladora ou outros aditivos;
crioproteção, que consiste na adoção de alguns cuidados que permitam que a
célula suporte o congelamento, cuidados esses associados, principalmente, à
toxidez dos crioprotetores; resfriamento, que consiste na diminuição da
temperatura que prepara o explante para o congelamento; conservação, a qual se
dá em nitrogênio líquido a -196ºC, na fase líquida ou a -150ºC, na fase de vapor;
descongelamento, que é a fase de recuperação do material estocado e
crescimento de recuperação, que serve para avaliar a viabilidade do material
após o período de congelamento e conservação.
De acordo com a Internacional Board for Plant Genetic Resources
(IBPGR, 1993), a crioconservação é uma tecnologia especialmente indicada para
as espécies de difícil propagação vegetativa, espécies com sementes
recalcitrantes, germoplasma raro ou, mesmo, espécies ameaçadas de extinção,
em virtude da exploração desordenada e falta de práticas adequadas de manejo
ou de uma política de reflorestamento (Diniz et al., 2003; Paes et al., 2006).
Diante do exposto, objetivou-se estudar alguns aspectos da germinação
das sementes, cultivo in vitro e tolerância ao congelamento de eixos
embrionários de A. colubrina, visando à sua preservação a médio e longo prazo.
3
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Importância e características da espécie
A espécie Anadenanthera colubrina (Vellozo) Brenan é conhecida como
angico-vermelho, com sinonímia botânica de Piptadenia macrocarpa Benth e
Anadenanthera macrocarpa (Benth) Brenam, segundo, respectivamente, Rizzini
(1978) e Carvalho (1994). É a espécie de angico com a maior distribuição
geográfica; ocorre desde o Sul da Bolívia até o Norte da Argentina. No Brasil,
ocorre em todas as regiões, com exceção da região Sul, o que faz com que seja
utilizada em programas de reflorestamento e exploração de madeira (Carvalho,
1994). A. colubrina pertence à família Fabaceae, subfamília Mimosoideae,
sendo conhecida popularmente como angico, angico-branco-liso, angico-
cambuí, angico-côco, angico-escuro, angico-liso, angico-vermelho, aperta-ruão,
cambuí, cambuí-angico, cambuí-vermelho, cauvi, curupaí, jurema-preta e
monjoleiro. A espécie ocorre principalmente em floresta estacional semidecídua
(Lorenzi, 2000; Carvalho, 1994).
É uma planta decídua, heliófita, pioneira, característica da mata secundária
de regiões acima de 400 m de altitude. Anualmente, as plantas produzem grande
quantidade de sementes viáveis (Lorenzi, 2000).
A árvore possui caule mais ou menos tortuoso e mediano, de casca grossa,
muito rugosa, fendida e avermelhada. Suas folhas são compostas bipinadas. As
flores são alvas, dispostas em capítulos globosos, axilares, e suas vagens são
achatadas e grandes. Pode chegar a até 32 m de altura (Braga, 1976). Sua
propagação ocorre por sementes, apresentando também rebrotação de tocos. A
maioria de suas sementes é viável, com ausência de dormência, sendo a
germinação rápida e alta em uma ampla faixa de temperatura (Maia, 2004).
4
As agressões ao meio ambiente, provocadas, sobretudo, por fatores
antrópicos, levam à diminuição da população de árvores do gênero
Anadenanthera (Melo et al., 2005).
Segundo Lorenzi (2002), A. falcata (Benth.) Speg. e A. macrocarpa
(Benth.) Brenan produzem, anualmente, grande quantidade de sementes viáveis.
Todavia, A. colubrina var. cebil apresentou florescimento irregular no Ceará
(Carvalho, 2003), enquanto, em Pernambuco, essa espécie não floresceu durante
um ano, mas floresceu e frutificou no ano seguinte (Machado et al., 1997).
Cada espécie apresenta um padrão de comportamento quanto ao
florescimento, polinização e frutificação; alterações periódicas ou duradouras
nesse padrão afetam a produção de sementes. A baixa eficiência da polinização,
causada pela pequena produção de flores e pela ausência de polinizadores, pode
aumentar a endogamia e, segundo Piña Rodrigues & Piratelli (1993), pode ter
reflexo direto na produção qualitativa e quantitativa de sementes. Costa et al.
(1992) verificaram que Anadenanthera falcata Benth. é preferencialmente
alógama, sendo a polinização cruzada favorecida pelo alto grau de auto-
incompatibilidade genética, associado à defasagem no período de receptividade
dos órgãos masculino e feminino. É provável que A. colubrina também seja
alógama. As duas espécies, A. falcata e A. colubrina, são hermafroditas e
polinizadas por vários insetos pequenos, principalmente abelhas (Carvalho,
2003).
As alterações climáticas ocorridas nos últimos anos podem ter afetado os
eventos biológicos relativos à produção de sementes de angico e o
comportamento dos polinizadores (Marques, 2007). Portanto, são necessários
estudos da conservação de sementes dessa espécie, durante um período mais
prolongado.
Leguminosas como o angico formam simbiose com bactérias fixadoras de
nitrogênio. Essa simbiose converte e transfere esse nutriente para a planta, em
5
formas assimiláveis, mediante a ação do rizóbio, num processo denominado
fixação biológica do nitrogênio (Franco, 1996). Plantas dessa espécie podem
crescer mais rapidamente, além de enriquecer o solo com nitrogênio (Patreze,
2003). Esses efeitos benéficos promovidos pelo crescimento de plantas
leguminosas no solo têm sido observados por séculos (Pereira, 2006).
Além das características descritas por Carvalho (1994) e Lorenzi (1998), a
distribuição nacional de A. colubrina e o seu rápido crescimento têm ampliado
sua utilização, sendo empregada em programas de reflorestamento. Observações
feitas a campo têm demonstrado que o seu bom desempenho pode ser devido ao
seu potencial alelopático que atuaria inibindo o crescimento e o
desenvolvimento de outras plantas, fazendo com que o angico tenha sucesso em
testes de competição (Abreu, 1997).
Até o momento, as indicações das potencialidades alelopáticas do angico-
vermelho são indiretas. Uma delas é a presença de 13,6% a 20% de tanino em
seus frutos e na casca do caule (Carvalho, 1994). A outra é a existência de alta
concentração do alcalóide bufotenina nas sementes e nas partes vegetativas,
segundo Fellows & Bell (1971), podendo ter um papel importante para a
sobrevivência da planta, promovendo, provavelmente, proteção contra animais
ou insetos predadores.
Moretão (2004) destacou, ainda, que a espécie Anadenanthera colubrina é
utilizada com fins medicinais, mais especificamente como imunomoduladora e
antitumoral.
Na Figura 1 observa-se o aspecto geral da planta, bem como suas
principais estruturas.
6
A
A
B
C
D
FIGURA 1. Aspecto geral da planta adulta (A), do tronco (B), do fruto (C) e de
sementes (D) de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan. UFLA,
Lavras, MG, 2008. Autora: Fernanda Carlota Nery.
2.2 Aspectos fisiológicos da germinação de sementes
A propagação de um grande número de espécies florestais de
importância social, econômica e cultural encontra sérias limitações, em razão do
pouco conhecimento das características fisiológicas, morfológicas e ecológicas
de suas sementes (Machado, 2002).
7
A germinação da semente é considerada como a retomada das atividades
metabólicas do eixo embrionário, o qual se encontrava paralisado nas fases
finais do processo de maturação; porém, quando estimulado por condições
ambientais, desenvolve-se, ocorrendo, então, o rompimento do tegumento pela
radícula (Bewley & Black, 1994). Essa é uma etapa crítica do biociclo vegetal
pelo fato de o processo estar associado a vários fatores de natureza extrínseca e
intrínseca, ou seja, a processos fisiometabólicos (Bewley & Black, 1994).
O processo germinativo tem início com a embebição de água pelos
tecidos da semente, seguida da retomada das atividades metabólicas, sobretudo
da síntese de novas enzimas e do aumento da atividade das hidrolases pré-
existentes, visando à mobilização dos compostos de reserva para a retomada de
crescimento do eixo embrionário (Bewley & Black, 1994).
Vários autores afirmam que a embebição representa o passo inicial da
germinação e que este processo é caracterizado pela entrada de água na semente
através do tegumento, promovendo a turgescência das células, aumentando a
permeabilidade ao O
2
, favorecendo o rompimento do tegumento e,
conseqüentemente, facilitando a emergência das estruturas internas das
sementes. A absorção de água pela semente é influenciada, dentre outros fatores,
pela composição química da semente (as proteínas apresentam maior avidez por
água que o amido, portanto, são hidrófilas, enquanto os lipídios são hidrófobos)
e pela permeabilidade do tegumento à água (Carvalho & Nakagawa, 2000;
Bewley & Black, 1994 e Marcos Filho, 2005).
O conhecimento das condições ideais para a germinação da semente de
uma determinada espécie é importante, principalmente, pelas respostas
diferenciadas que a semente pode expressar em função de diversos fatores, como
viabilidade, dormência, condições de ambiente, envolvendo água, luz,
temperatura, oxigênio e ausência de agentes patogênicos (Chachalis & Reddy,
8
2000; Simpson & Dean, 2002; Koger et al., 2004; Chen et al., 2005; Finch-
Savage et al., 2006).
Além dos fatores bioquímicos, aspectos fisiológicos, como a temperatura
e a sensibilidade à luz, dentre outros, exercem papel fundamental na germinação.
Como em qualquer reação química, existe uma temperatura ótima na qual o
processo germinativo se realiza mais rápida e eficientemente, variável entre as
diferentes espécies (Bewley & Black, 1997).
Quanto ao comportamento germinativo de espécies sensíveis à luz,
encontram-se sementes que germinam somente após rápida exposição à luz,
outras que necessitam de período amplo de exposição, outras em que a
germinação é desencadeada somente no escuro (Vidaver, 1980) e sementes
indiferentes à luz (Vázquez-Yanes & Orozco-Segovia, 1991).
Apesar do aumento considerável de conhecimentos relativos à análise de
sementes de espécies florestais, gerado pelas pesquisas nas duas últimas
décadas, a maioria delas carece ainda de subsídios básicos referentes às
exigências quanto às condições ótimas de germinação (Varela et al., 2005).
Diferenças no vigor associadas com as características das sementes são,
geralmente, atribuídas à composição química, principalmente com relação à
quantidade de reservas ou à eficiência no metabolismo (Hampton, 1973). Quanto
maior o teor de reservas das sementes, maior será o vigor das plântulas
originadas. Assim, o suprimento de água durante o período de desenvolvimento
da semente pode influenciar indiretamente seu vigor pelo efeito que exerce sobre
sua composição química (Carvalho & Nakagawa, 2000).
É importante ressaltar que as sementes oleaginosas apresentam menor
potencial de armazenamento que as amiláceas, devido à menor estabilidade
química dos lipídios em relação ao amido. O teor elevado de proteínas também
pode contribuir para a redução do potencial de armazenamento, devido à elevada
afinidade dessa substância com a água (Marcos Filho, 2005).
9
2.3 Cultivo de embriões in vitro
A técnica de cultivo in vitro é uma alternativa para a propagação em
diferentes circunstâncias, tais como a multiplicação de genótipos resistentes a
doenças, mais produtivos, híbridos e organismos geneticamente modificados,
entre outros (Redenbaugh, 1991).
O cultivo de embriões in vitro é uma técnica promissora para avançar nos
conhecimentos de determinadas espécies, uma vez que, a partir dela, é possível
reproduzir e estudar o desenvolvimento embrionário, a quebra da dormência e a
produção de plântulas (Collins & Grosser, 1984; Hu & Ferreira, 1998). Além
disso, acrescenta-se o fato de que tecidos embrionários são excelentes explantes,
visando à propagação clonal in vitro, em virtude de sua natureza juvenil e alto
potencial regenerativo (Pierik, 1990).
Durante o cultivo in vitro, as soluções de macro, micronutrientes e
açúcares constituintes dos meios de cultura não exercem efeito puramente
nutritivo, mas também influenciam o crescimento celular e a morfogênese, por
meio de propriedades osmóticas (George, 1996). Os carboidratos desempenham
importante papel na manutenção de uma osmolaridade adequada do meio de
cultura, além de serem fontes de energia para os explantes. Em geral, quanto
mais jovem for o embrião excisado, mais alta será a osmolaridade requerida do
meio (George, 1996).
Embriões zigóticos ou cotilédones podem ser cultivados com sucesso para
produzir plantas férteis (Mayer & Poljakoff-Mayber, 1989), servindo como fonte
de explantes para a propagação in vitro de diversas espécies florestais, tais como
Ilex spp., Larix spp., Pinus spp., Quercus spp., Santalus spp., entre outras
(Thorpe et al., 1991) e frutíferas, como Garcinia mangostana L. No entanto, os
explantes mais comuns são segmentos nodais e ápices caulinares (Litz &
Jaiswal, 1991).
10
O cultivo de embriões, assim como qualquer outra técnica de cultura de
tecidos, exige cuidados fundamentais para o seu sucesso. A assepsia do material
estudado deve ser rigorosa, de modo a impedir a proliferação de organismos que
possam contaminar os explantes, tais como fungos e bactérias (Wareing et. al.,
1970).
Na etapa de multiplicação in vitro, a capacidade dos explantes de
sobreviverem, desenvolverem-se e multiplicarem-se é conseqüência de vários
fatores, como o genético, o estado fisiológico, as concentrações endógenas de
hormônios nos explantes e as condições ambientais de cultivo. Além disso, o
uso de um meio de cultura apropriado para cada fase do cultivo é condição
básica, devendo estes meios proporcionar os nutrientes necessários ao
metabolismo das células vegetais em cultivo para o seu crescimento e a
diferenciação dos tecidos (Kozay et al., 1997).
Os meios nutritivos atendem, como princípio, as exigências de uma planta
completa (Caldas et al., 1998). A adição dos fitorreguladores ao meio tem a
finalidade de prover possíveis carências endógenas, pois o explante encontra-se
isolado das regiões produtoras de hormônios na planta matriz (Grattapaglia &
Machado, 1990).
Em cultura de tecidos, as citocininas mais comumente usadas são cinetina
(CIN), 6-benzilaminopurina (BAP), zeatina (ZEA), isopenteniladenina (2ip) e
thidiazuron (TDZ) e as auxinas são ácido 3-indolacético (AIA), ácido
naftalenoacético (ANA), ácido indolbutírico (AIB) e ácido 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4-D) (Caldas et al., 1998). As mudanças nos nutrientes
do meio, principalmente alterações envolvidas no balanço de auxina e citocinina,
são essenciais para o desenvolvimento do embrião (Wareing et. al., 1970). A
sacarose está presente como fonte de carbono para a glicólise e o ciclo de Krebs,
pelo fato de o explante (embrião) não ser, ainda, um organismo suficientemente
autotrófico (Cid, 2001).
11
O carvão ativado adsorve fitotoxinas produzidas pelo explante (Fridborg
et al., 1978). Segundo Tilquin (1979), o carvão ativado no meio de cultivo
estimula o enraizamento, reduzindo a quantidade de luz que chega à região de
formação de raízes, promovendo o seu alongamento (Rajore & Batra, 2005).
A organogênese in vitro envolve uma variedade de seqüências complexas
de desenvolvimento, resultantes da manipulação experimental de partes de uma
planta, culminando na formação de primórdios de órgãos ou plantas inteiras
(Hicks, 1980).
Quando a organogênese ocorre a partir de tecidos do explante ou de
pequenas proliferações dos mesmos, ainda sobre o explante inicial, sem a
formação do calo, denomina-se organogênese direta. A via indireta é
caracterizada quando a organogênese ocorre a partir de calos isolados do
explante inicial (Stirmart, 1986). A organogênese envolve a diferenciação de
brotações e raízes durante o desenvolvimento vegetal. As brotações são
induzidas em meio de cultura enriquecido com citocininas e enraizadas em um
meio contendo auxina (Grattapaglia & Machado, 1990). Certas espécies
enraízam com dificuldade, ou não enraízam, mesmo na presença de auxinas. Por
outro lado, para algumas espécies, dispensa-se o uso de auxinas no seu
enraizamento (Rohr & Hanus, 1987).
A etapa que se segue ao enraizamento in vitro das plântulas é a
aclimatização que normalmente ocorre em ambiente com alta luminosidade e
umidade. A aclimatização envolve o transplantio da plântula da condição in vitro
para a casa de vegetação o que, geralmente, é uma fase crítica e que pode ser
fator limitante para o processo de micropropagação de algumas espécies (Torres
et al., 1998). Vários fatores estão envolvidos na morte ou na sobrevivência das
plântulas durante a aclimatização, tais como genótipo, estresse hídrico, alteração
do metabolismo heterotrófico para autotrófico, infecção por patógenos e estresse
pela alteração na radiação. O ambiente de cultivo pode afetar e conduzir a
12
diferentes atividades enzimáticas, resultando em várias mudanças nos processos
metabólicos da planta (Debergh & Maene, 1981).
A desordem estrutural e funcional nas plântulas in vitro é resultado de
complexos e múltiplos fatores do meio de cultura. A conseqüência é uma baixa
taxa de sobrevivência das plantas quando transferidas para condições ex vitro
(Ziv, 1987). Pasqual et al. (1997) afirmam que, durante o processo de
transferência para a condição ex vitro, a cutícula é freqüentemente menos
desenvolvida em razão da umidade relativa no interior dos frascos ser alta.
Como conseqüência, ocorre elevada perda de água durante o processo de
aclimatização. As modificações manifestadas, principalmente nas folhas, afetam
a fotossíntese e as trocas gasosas. O ambiente de cultivo pode afetar e conduzir a
diferentes atividades enzimáticas, resultando em várias mudanças nos processos
metabólicos da planta (Debergh & Maene, 1984).
Poucos são os trabalhos que têm demonstrado o potencial e a viabilidade
de regeneração in vitro de A. colubrina e sua sinonímia Parapiptadenia rigida
(Nascimento, 2007a; Nascimento 2007b, Nascimento, 2008; Nepomuceno
2006). Mesmo com alguns avanços, há limitações ao processo de
micropropagação da espécie que demande soluções para que a técnica possa ser
aplicada comercialmente (Nepomuceno, 2006).
Uma das metodologias para a propagação in vitro mais aplicada é a
calogênese. Calos são definidos como aglomerados de células parenquimáticas
não organizadas, irregularmente diferenciados, que se multiplicam
desordenadamente e se desenvolvem em resposta a injúrias químicas ou físicas.
E podem se diferenciar em tecidos e órgãos (Torres et al., 1998).
Segundo Pierik (1990), o crescimento e o desenvolvimento dessas
células podem ser influenciados pelo próprio material vegetal, pelo meio
nutritivo, acrescido ou não de reguladores de crescimento e por fatores externos,
como luz e temperatura. Esses fatores agem acelerando, retardando ou, mesmo,
13
inibindo a proliferação celular, conseqüentemente, a formação e o crescimento
do calo.
Para a indução de calo, qualquer tecido pode ser utilizado como
explante. Entretanto, procura-se utilizar explantes que contenham maior
proporção de tecido meristemático ou que apresentem maior capacidade de
expressar a totipotência. Pierik (1990) comenta que explantes oriundos de
tecidos jovens, não lignificados são mais apropriados para a cultura de tecidos
por possuírem alta capacidade de regeneração.
De acordo com Vietez & San-José (1996), muitas vezes, é necessário o
suprimento exógeno de reguladores de crescimento para a indução de calos. Essa
indução é regulada pela interação e o balanço entre os reguladores sintéticos
fornecidos e os hormônios produzidos internamente pelo explante.
O efeito produzido in vitro por um determinado regulador de
crescimento depende do ambiente no qual o órgão ou tecido está sendo
cultivado. Concentrações idênticas de um mesmo regulador, em dois meios de
cultura diferentes entre si, podem ter efeitos distintos (Pasqual, 2001).
As auxinas têm sido amplamente utilizadas nos meios de cultivo para a
indução de calos, entretanto, seu efeito difere conforme a situação. Por isso,
concentrações efetivas deste regulador precisam ser ajustadas de acordo com o
genótipo da planta a ser cultivada e o tipo de tecido ou órgão (Pasqual, 2001).
2.4 Criopreservação de sementes
Para muitas espécies, a capacidade de armazenamento é ampliada, quando
a redução do teor de água das sementes está associada à diminuição da
temperatura do ambiente (Walters et al., 1998). Temperaturas baixas conservam
melhor os componentes celulares, como as enzimas, permitindo a
disponibilização de glicose para a respiração da semente, por meio da hidrólise
14
de sacarose ou outros oligossacarídeos, podendo ainda agir em enzimas
sintetizadoras de outros componentes responsáveis pela integridade das
membranas (Peterbauer & Richter, 2001). Contudo, há espécies que não toleram
grande redução da temperatura, principalmente o congelamento (Chin et al.,
1989). Nestas condições, a quantidade de água torna-se mais importante, pois a
água contida nas sementes pode propiciar a formação de cristais de gelo,
acarretando rupturas mecânicas na parede celular e no sistema de membranas,
promovendo a desagregação celular e a conseqüente perda da viabilidade das
sementes (Roberts 1973, Andrade & Pereira, 1997).
A crioconservação é a conservação de material biológico a temperaturas
ultrabaixas, assegurando a conservação ex situ do material biológico por longos
períodos, interrompendo o metabolismo celular. Por isso, a técnica é considerada
promissora para a preservação a longo prazo do germoplasma de espécies
vegetais (Carvalho & Vidal, 2003). Nesse sistema, os problemas que ocorrem
durante o armazenamento convencional, tais como danos no DNA, requerimento
de avaliações periódicas, controle da viabilidade, risco de perda por doenças e
problemas ambientais, são reduzidos ou eliminados (Tarré et al., 2007).
A semente é a forma pela qual a planta sobrevive o máximo de tempo
com o mínimo de atividade fisiológica. Na conservação de sementes, devem-se
considerar as características fisiológicas que afetam a longevidade de cada
espécie, quando submetida a baixos níveis de umidade e a temperaturas abaixo
de zero (Tarré et al., 2007).
Segundo Roberts (1973), as sementes são classificadas em duas
categorias: as que podem ser armazenadas por longos períodos com baixos
teores de água, em baixas temperaturas e são denominadas ortodoxas, e as que
não toleram o dessecamento e o armazenamento em baixas temperaturas, as
recalcitrantes, as quais perdem sua viabilidade, mesmo quando armazenadas por
curtos períodos. Uma terceira categoria foi proposta por Ellis et al. (1990), as
15
intermediárias, cuja definição está baseada na resposta de longevidade ao
ambiente de armazenamento, as quais apresentam tendência para longevidade
crescente, quanto menor o grau de umidade da semente no armazenamento (sob
condição de ar seco). Mas, esta condição é invertida a um grau de umidade
relativamente alto e, a partir desse ponto, a redução do grau de umidade implica
em redução da longevidade.
Desde então, várias outras classificações foram sugeridas. A
classificação de Bonner (1990) é considerada a mais adequada para as sementes
de espécies florestais (Carvalho, 2000), compreendendo 4 grupos: 1) ortodoxas
verdadeiras: sementes que toleram a secagem abaixo de 10% de umidade e,
quando submetidas a temperaturas abaixo de zero, podem ser armazenadas por
período relativamente longo, ou seja, durante 50 anos ou mais; 2) subortodoxas:
são sementes que podem ser armazenadas sob as mesmas condições do grupo
anterior, mas, no máximo, por 6 meses; 3) temperadas recalcitrantes: são
sementes sensíveis à dessecação a baixos níveis de umidade, mas podem ser
armazenadas por vários anos, em temperaturas próximas do congelamento e 4)
tropicais recalcitrantes: são sementes que também devem ser armazenadas em
condições de alta umidade relativa e com troca de gases, porém, apresentam
maior sensibilidade a baixas temperaturas e à dessecação.
Stanwood (1981) dividiu as sementes em três classes, em relação à
criopreservação (congelamento na temperatura de nitrogênio líquido), como uma
alternativa para a preservação a longo prazo: ortodoxas resistentes ao
congelamento (não danificadas pela secagem), ortodoxas sensíveis ao
congelamento e recalcitrantes (danificadas pela secagem). Sementes de mais de
140 espécies foram congeladas e reaquecidas sem danos em sua viabilidade ou
no desenvolvimento subseqüente da planta.
A metodologia convencional de conservação dos recursos genéticos inclui
a coleção de germoplasma sementes (4% a 7% de grau de umidade a -20ºC),
16
exigindo espaço apropriado e avaliações periódicas da sua viabilidade ou, ainda,
conservação em condições de campo, a qual se apresenta muito laboriosa e é
constantemente exposta a estresses climáticos e biológicos, podendo levar à total
perda da coleção de germoplasma (Vieira, 2000, Nóbrega et al, 2001, Santos et
al., 2002, Lopes et al., 2004). Styles et al. (1982) salientaram as vantagens do
armazenamento das sementes em nitrogênio líquido sobre os métodos
convencionais: ausência do controle da temperatura e da umidade relativa,
proteção contra pragas e doenças e preservação infinita com pouca ou nenhuma
alteração genética.
A crionconservação dos eixos embrionários pode ser a metodologia mais
apropriada para a conservação em longo prazo da diversidade genética de várias
espécies, ocupando o mínimo de espaço em bancos de germoplasma (Stushoff &
Seufferheld, 1995; Younge et al., 1997). Em adição, é possível eliminar a
possível presença de microrganimos no armazenamento, os quais reduzem a
germinação das sementes (Moshkin, 1986).
A técnica de crioconservação proporciona o potencial para uma
preservação sem limites de tempo devido à redução do metabolismo a níveis tão
baixos que todos os processos bioquímicos são significativamente reduzidos e a
deterioração é paralisada. Os métodos tradicionais de conservação apenas adiam
a deterioração por um período de tempo determinado e específico, de acordo
com o material e a espécie em questão (Cunha, 1996). A criopreservação tem
enorme potencial para garantir a conservação a longo prazo do germoplasma de
espécies ortodoxas (Buzó et al., 2001).
A utilização do nitrogênio líquido como um meio de armazenamento
pressupõe que as sementes sobrevivam à exposição sem sofrer danos maiores à
sua viabilidade e, para isso, o grau de umidade da semente é, provavelmente, o
fator crítico para o sucesso da criopreservação. Isso porque, se a umidade da
17
semente for muito alta, observa-se a sua morte instantânea durante o processo de
congelamento e ou descongelamento (Cunha, 1996).
O uso de temperaturas ultrabaixas para a preservação de sementes é um
método promissor, usado para conservar ex situ os recursos genéticos e
conservar a diversidade genética de plantas. Prolongar o período de
armazenagem de uma amostra de sementes, tanto quanto possível, mantendo-se
um elevado porcentual de germinação e vigor, são os objetivos da aplicabilidade
da técnica. A perda da viabilidade da semente e a prematura detecção da
deterioração são importantes aspectos fisiológicos a serem considerados no
armazenamento. Sendo assim, o percentual de umidade da semente e a
temperatura de armazenagem são fatores primários que podem ser manipulados
e controlados para minimizar a deterioração das sementes preservadas a longo
prazo (Buzó et al., 2001).
O grande desafio para a aplicação da técnica de criopreservação é realizar
o congelamento sem a formação de cristais de gelo no interior das células. A
formação de gelo no meio intracelular causa ruptura do sistema de membranas
celulares, resultando em perda da semipermeabilidade e da compartimentação
celular. Como conseqüência disso, as células entram em colapso (Buzó et al.,
2001).
Evitar a formação destes cristais não é uma tarefa fácil porque os tecidos
vegetais usados na criopreservação apresentam teores consideráveis de água. A
formação extensiva de cristais de gelo intracelular irá ocorrer caso estes tecidos
sejam congelados no estado hidratado. Dessa maneira, a água precisa ser
previamente removida antes do congelamento, para evitar a injúria causada por
estes cristais (Buzó et al., 2001).
Embora a crioconservação seja uma boa motivação para a formação de
novos bancos de germoplasma, sobretudo em sementes cujos recursos genéticos
devem ser preservados por longos períodos de tempo, muitos estudos ainda são
18
necessários com o objetivo de elaborar protocolos que viabilizem a sua real
implantação. Essa demanda abre grandes perspectivas no campo da pesquisa,
que deverão ser implementadas nesta próxima década (Mata, 2008).
A crioconservação, aliada à biotecnologia moderna, pode ser a solução
chave para a sobrevivência dos recursos genéticos, por evitar a destruição
alarmante de florestas e a erosão genética (Chin, 1994).
A conservação in vitro, seja em condições de crescimento lento ou
criopreservação de eixos embrionários isolados, é o método mais promissor para
a conservação a médio e a longo prazo, respectivamente. Tem sido relatado que
eixos embrinários podem tolerar graus de umidade por volta de 12% e o
subseqüente congelamento em nitrogênio líquido. Eixos embrionários
criopreservados são resgatados usando a cultura de tecidos, sendo que deles se
originam plantas inteiras (Faiad et al., 2005).
Uma alternativa importante para a aplicação desta técnica é submeter o
material a agentes crioprotetores, à base de dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol,
etileno glicol, metanol e propileno glicol, entre outros (Salomão, 2002).
Entretanto, esses crioprotetores podem ser tóxicos ou causar estresse osmótico,
levando as células à morte ou modificando sua resposta morfogenética em
cultura (Sakai, 1995). Portanto, utilizam-se, primeiramente, soluções com baixas
concentrações para que haja entrada dos componentes permeáveis na célula e,
em seguida, soluções concentradas de crioprotetores para promover a
vitrificação. Após esse procedimento, os frascos são transferidos para o
nitrogênio líquido. Os agentes crioprotetores penetrantes são substâncias ou
fármacos que diminuem as lesões de origem química ou mecânica que o
congelamento causa sobre a célula (Gonzalez, 2004).
Os crioprotetores agem reduzindo os danos celulares causados pelos
efeitos da concentração dos sais no meio e possuem estruturas que lhes
permitem fazer ligações de hidrogênio com a molécula de água, diminuindo,
19
assim, a formação de cristais de gelo, não permitindo o aumento de tamanho
desses cristais e diminuindo a concentração de soluto nos meios extra e
intracelular. Estas ligações de hidrogênio também promovem a estabilização da
estrutura quaternária das proteínas de membrana, preservando-as da
desidratação. O uso de crioprotetores para os quais as células têm alta
permeabilidade resulta em boa sobrevivência celular (Gonzalez, 2004).
Entretanto, o ideal é o desenvolvimento de protocolos de criopreservação
que não dependam desses crioprotetores químicos para a sobrevivência do
explante porque eles podem ser tóxicos para as células vegetais, complicam o
procedimento de congelamento e, em muitos casos, não aumentam
significativamente a porcentagem de regeneração (Arakawa et al., 1990; Santos,
2004).
Em um banco de germoplasma a baixas temperaturas, não só o processo
de crioconservação deve ser levado em consideração como também o método de
descongelamento, pois quanto mais rápido ocorrer o descongelamento das
sementes, melhor a preservação de suas características fisiológicas. Portanto, o
método de descongelamento à temperatura ambiente se torna questionável, uma
vez que existe a possibilidade do recongelamento durante este período. Dessa
forma, tem se utilizado o descongelamento em banho-maria (temperatura de
37ºC a 40°C) (Molina et al., 2006).
Os primeiros trabalhos sobre criopreservação de sementes de espécies
florestais nativas do Brasil foram desenvolvidos por Medeiros & Cavallari
(1992) e Medeiros et al. (1992), com Astronuim urundeuva (aroeira). Estes
autores relataram que as sementes mantiveram a capacidade germinativa durante
todo o período de armazenamento de 150 dias e concluíram que a
criopreservação é um método promissor para a conservação das sementes dessa
espécie em bancos de germoplasma e que as sementes devem ser desidratadas a
6,0% de água.
20
Abreu & Medeiros (2005) equilibraram sementes de Sebastiania
commersoniana (branquilho) com teor de água inicial de 8,5% e germinação
inicial de 97% em cinco soluções salinas, a 20ºC, e obtendo teores de água
variando de 2,3% a 17,3%. Após a secagem, as sementes foram embaladas
hermeticamente e armazenadas em câmara fria (5ºC), freezer (-18ºC) e
nitrogênio líquido (-196ºC). Nas avaliações realizadas até 180 dias de
armazenamento nas diferentes temperaturas, o poder germinativo das sementes
se mantêve entre 92% e 95%.
Sementes de Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan, com valores
iniciais de 12,9% de água e 99% de germinação, foram acondicionadas em sacos
de algodão e armazenadas em câmara com temperatura e umidade relativa
controladas (não foram informados os valores), por Gomes et al. (1997). A cada
seis meses foram avaliados o teor de água, a capacidade germinativa e o vigor
das sementes. Após 12 meses, a capacidade germinativa foi reduzida para 68%.
As sementes não germinaram após 20 meses de armazenamento. Mais
recentemente, Dantas et al. (2005) acondicionaram sementes dessa mesma
espécie em sacos plásticos e de papel e as armazenaram, por quatro meses, em
câmara fria e em ambiente não controlado. Foram feitos testes de germinação
em germinador, sobre papel Germitest® e semeadura em bandejas contendo
areia lavada. Os autores não apresentaram nenhum resultado, nem valores
iniciais da qualidade das sementes, mas relataram que não houve diferença
significativa entre os resultados obtidos nos tratamentos testados.
Com relação ao armazenamento em temperatura inferior a zero, Reis &
Cunha (1997) estudaram o comportamento das sementes de Anadenanthera
peregrina (L.) Speg. (angico-vermelho), sob diversas condições de umidade e
armazenamento, visando ao estabelecimento de métodos para a conservação de
seu germoplasma. As sementes foram submetidas a quatro tratamentos:
sementes com teor de água inicial de 5,6% (testemunha), sementes hidratadas a
21
8,3% de água, sementes hidratadas (8,3%) e desidratadas a 4,4% e sementes
hidratadas (8,3%) e desidratadas a 3,5%. Após os tratamentos, as sementes
foram acondicionadas em embalagem impermeável trifoliada
(alumínio/papel/polietileno) e armazenadas, por 72 horas, em ambiente de
laboratório (25±2ºC), freezer (-20ºC) e nitrogênio líquido (-196ºC). A
germinabilidade foi mantida após todos os tratamentos, mas as sementes
hidratadas apresentaram melhores resultados de vigor, principalmente em
nitrogênio líquido. As autoras concluíram que as sementes dessa espécie
apresentam comportamento ortodoxo, pela tolerância a baixo teor de água e ao
congelamento. Resultados semelhantes foram descritos por Cerqueira et al.
(2001), que relataram que sementes dessa mesma espécie, acondicionadas em
sacos plásticos e armazenadas em freezer a -14ºC, contudo, após 10 meses de
armazenamento, obtiveram 67% de germinação.
Entre as 39 espécies estudadas por Carvalho et al. (2006), para verificar a
relação entre a classificação das espécies florestais quanto ao comportamento
fisiológico durante o armazenamento e a classificação quanto ao grupo
ecológico, as sementes de Anadenanthera colubrina recém-beneficiadas, com
29,5% de água e 89% de plântulas emergidas, foram desidratadas a 7,3% de
água e apresentaram 94% de emergência. Após o armazenamento por 90 dias, a
-18ºC, as sementes desidratadas apresentaram 91% de emergência, sendo
classificadas como ortodoxas.
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33
CAPÍTULO II
ESTUDOS MORFOANATÔMICOS DE FRUTO E SEMENTE, E
ALGUNS ASPECTOS FISIOLÓGICOS DA GERMINAÇÃO DE
SEMENTES DE Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan
34
1 RESUMO
NERY, Fernanda Carlota. Estudos morfoanatômicos de fruto e semente e alguns
aspectos fisiológicos da germinação de sementes de Anadenanthera colubrina
(Vell.) Brenan. In:______. Germinação, cultivo in vitro e tolerância ao
congelamento de sementes de angico-vermelho (Anadenanthera colubrina
(Vell.) Brenan). 2008. Cap. 2, p. 34-86. Tese (Doutorado em Fisiologia Vegetal)
- Universidade Federal de Lavras, Lavras.
*
Conhecer aspectos morfoanatômicos, composição química e germinação das
sementes de espécies nativas do Cerrado e de outros biomas, como o angico-
vermelho (A. colubrina), espécie arbórea da família Fabaceae, subfamília
Mimosoideae, pode auxiliar, por exemplo, a produção de mudas de alta
qualidade, buscando a recuperação de áreas degradadas. Dessa maneira,
objetivou-se estudar a morfologia e a anatomia dos frutos e sementes, a
composição química de sementes, bem como as respostas a fatores como
embebição, regimes térmicos e substratos na germinação de sementes. Na
caracterização dos tecidos da semente, foi empregado teste histoquímico com
Sudan III e Lugol. A composição química da semente foi feita avaliando-se as
características: grau de umidade, extrato etéreo, proteína bruta, amido, açúcares
redutores e não redutores, fibra bruta e taninos. As temperaturas testadas no teste
de germinação foram de 25ºC, 30ºC, 15ºC-25ºC e 20ºC-30ºC, em substrato rolo
de papel. Analisaram-se, ainda, diferentes substratos para germinação (rolo de
papel Germitest®, sobre papel Germitest®, Plantmax® e sobre areia), em
condição de presença de luz, a 30ºC. A anatomia seminal de A. colubrina é
típica das leguminosas, especialmente considerando-se a subfamília
Mimosoideae. O número de sementes por fruto é, em média, de 10 e o peso de
mil sementes varia de 117 g a 120 g. A composição química das sementes se
caracteriza pela presença de elevados teores de proteína, seguida de extrato
etéreo e baixo conteúdo de amido. Sementes de A. colubrina não apresentam
dormência tegumentar. A maior porcentagem de germinação ocorre a 30ºC,
15°C-25ºC e 20°C-30ºC, sendo as sementes indiferentes à luz. A temperatura de
25°C contribui para um aumento substancial do percentual de plântulas
anormais e sementes mortas, tanto na ausência como na presença de luz. Os
substratos areia e Plantmax® são eficientes na avaliação do desenvolvimento de
plântulas.
*
Comitê Orientador: Dr. Amauri Alves de Alvarenga – UFLA (orientador),
Renato Paiva, PhD – UFLA, José Márcio Rocha Faria, PhD – UFLA, Drª
Cristina Filomena Justo – UFMT (co-orientadores).
35
2 ABSTRACT
NERY, Fernanda Carlota. Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan seeds and
fruits morphological anatomical studies and some physiological aspects of the
seeds germination. In:______. Germination, in vitro cultivation and freezing
tolerance of red angico seeds (Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan). Chap.
2, p. 34-86. 2008. Thesis (Doctorate in Plant Physiology) – Federal University
of Lavras, Lavras, MG.
*
Knowing the morphological anatomical aspects, chemical composition and
seeds germination of native species of the Cerrado and other biomes as the red
angico (A. colubrina), tree species of the family Fabaceae, subfamily
Mimosoideae, may help, for example, in the production of high quality seedlings
aiming the recovery of degraded areas. Thus, it was aimed to study the seeds and
fruits morphology and anatomy, seeds chemical composition, and the seeds
germination responses to factors such as imbibitions, thermal systems and
substrates. In the characterization of the seeds tissues, it was used the
histochemical test with Sudan III and Lugol. The seeds chemical composition
was made assessing the characteristics: moisture content, ether extract, crude
protein, starch, reducing and not reducing sugars, crude fiber and tannins. The
temperatures tested in the germination test were 25ºC, 30ºC, 15ºC-25ºC and
20ºC-30ºC, in the substrate rolled paper. Also, it was analyzed different
substrates to germination (rolled paper Germitest®, paper Germitest®,
Plantmax® and sand), in the presence of light, at 30ºC. The seminal anatomy of
A. colubrina is typical of legumes, especially considering the subfamily
Mimosoideae. The number of segments in each fruit is in average 10, and the
weight of one thousand seeds varies between 117 g to 120 g. The seeds chemical
composition is characterized by the presence of high contents of protein,
followed by the ether extract, and low contents of starch. A. colubrina seeds did
not showed tegumentar dormancy. The highest germination percentage occurs at
30ºC, 15°C-25ºC and 20°C-30ºC, being the seeds indifferent to light. The
temperature of 25°C contributes to a substantial increase in the percentage of
abnormal seedlings and dead seeds, both in the absence and presence of light.
The substrates sand and Plantmax® are effective in the seedlings development
assessment.
*
Adviser Comitee: Dr. Amauri Alves de Alvarenga – UFLA (Adviser), Renato
Paiva, PhD – UFLA, José Márcio Rocha Faria, PhD – UFLA, Drª Cristina
Filomena Justo – UFMT (Co-advisers).
36
3 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, tem crescido o interesse pela propagação de espécies
florestais nativas, devido à ênfase atual que governos e entidades não
governamentais (ONGS) vêm dando a problemas ambientais, ressaltando-se a
necessidade de recuperação de áreas degradadas e recomposição da paisagem.
Diante dessa problemática, estudos envolvendo tecnologia de sementes, a
ecofisiologia das espécies e os estudos de dinâmica da regeneração, associadas
aos levantamentos florísticos e fitossociológicos são de fundamental importância
para o estabelecimento de modelos que possam ser adotados e aplicados nos
programas de manejo, na condução do processo de regeneração natural e na
recuperação florestal de áreas degradadas (Candiani, 2006).
Diante do exposto, verifica-se a necessidade de se obterem informações
básicas sobre a germinação, cultivo e potencialidade dessas espécies nativas,
visando à sua utilização para os mais diversos fins. Entretanto, o conhecimento
disponível é ainda incipiente, ao considerar aspectos como análise e manejo de
sementes da maioria das espécies potenciais, de modo a fornecerem dados que
possam caracterizar seus atributos físicos e fisiológicos. Como uma dessas
espécies, pouco freqüente, mas amplamente difundida pelo Brasil e países
vizinhos, destaca-se o angico-vermelho (Anadenanthera colubrina (Vellozo)
Brenan var. cebil (Griseb.) Altschul).
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan apresenta-se com várias
sinonímias, Anadenanthera falcata (Benth.) Speg., Piptadenia falcata Benth.,
Anadenanthera peregrina var. falcata e Anadenanthera. macrocarpa (Benth.)
Brenan, conhecidas popularmente como angico-vermelho. São árvores comuns
no Brasil, bastante conhecidas pelo teor de taninos presentes em sua casca.
Possuem caule com casca grossa e rugosa, fendida e avermelhada. Suas folhas
37
são compostas bipinadas, flores em capítulos globosos e suas vagens são
achatadas (Lorenzi, 2000; Chaves et al, 2006; Austrália, 2007). Os angicos, de
modo geral, apresentam regeneração natural por sementes. Sua produção é
anual, com grande quantidade de sementes viáveis, sendo sua dispersão
barocórica.
O estudo da morfologia de sementes e das plântulas, bem como da
germinação de sementes, é de relevância para se conhecer o comportamento das
espécies no tocante à sua produção, o que possibilita prever e estabelecer
condições adequadas de conservação (Oliveira, 1993).
A importância do conhecimento sobre o comportamento germinativo e o
desenvolvimento das plântulas foi demonstrada por Labouriau et al. (1963),
quando utilizaram as características morfológicas de plântulas para estudar a
regeneração natural do cerrado. A partir desses estudos morfológicos de
sementes e de plântulas, puderam-se obter informações sobre a maturação das
sementes, germinação, armazenamento, viabilidade e métodos de semeadura
(Anez et al., 2005; Borges et al., 2005).
A caracterização biométrica de frutos e sementes fornece subsídios
importantes para a diferenciação de espécies pioneiras e não pioneiras em
florestas tropicais e de espécies de um mesmo gênero relacionado às
características de dispersão e estabelecimento de plântulas (Baskin & Baskin,
1998; Cruz et al., 2001; Fenner, 1993; Silva & Filho, 2006).
A diversidade morfológica dentro da família Fabaceae gera uma série de
problemas taxonômicos. Dessa forma, é cada vez maior a procura por
informações a respeito dos frutos, sementes e plântulas de espécies dessa
família, de forma a complementar aquelas provenientes de órgãos vegetativos e
flores (Oliveira, 1999).
Gunn (1984), citado por Oliveira (1999), considerou que o grau de
desenvolvimento da plúmula é um caráter útil na identificação de sementes e no
38
estabelecimento de relações filogenéticas. O autor afirma, ainda, que dados
sobre as plúmulas de leguminosas são raramente encontrados, o que dificulta a
realização de análises taxonômicas e filogenéticas a partir dessas estruturas.
Com relação às espécies tropicais nativas, Araújo Neto et al. (2003)
mostraram que muito pouco se conhece sobre as exigências das sementes quanto
aos efeitos da temperatura, luz e substrato ideal para a germinação, sobretudo
para as espécies típicas de vegetação secundária. Enfocando a germinação como
resultado de uma série de reações bioquímicas e de retomada de crescimento do
embrião, observa-se a existência de estreita dependência da temperatura. Como
em qualquer reação química, existe uma temperatura ótima na qual o processo se
realiza mais rápida e eficientemente, fator esse amplamente variável entre
diferentes espécies (Bewley & Black, 1994).
No tocante ao comportamento germinativo de espécies fotoblásticas,
encontram-se sementes que germinam somente após rápida exposição à luz,
outras que necessitam de período amplo de exposição, enquanto em outras, a
germinação é desencadeada somente no escuro. Destacam-se também as
espécies com sementes indiferentes à luz (Araújo Neto et al., 2003).
Particularmente sobre a espécie A. colubrina, apesar de sua
potencialidade, são escassas as informações sobre os fatores que afetam a
germinação de suas sementes. Dessa maneira, objetivou-se estudar a morfologia
e a anatomia do fruto e das sementes, a composição química de sementes, bem
como as respostas dessas aos fatores como embebição, regimes térmicos e
substratos na germinação.
39
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
Frutos de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan foram coletados em,
aproximadamente, 50 árvores matrizes localizadas no campus da Universidade
Federal de Lavras (UFLA), na época da dispersão, entre os meses de agosto e
setembro de 2007. A região se localiza no município de Lavras, sul do estado de
Minas Gerais, nas coordenadas geográficas 21º13’17’’S e 44º57’47’’W. O clima
da região é do tipo Cwb de Koppen (mesotérmico com verões brandos e
estiagens de inverno), a precipitação e a temperatura média anual são,
respectivamente, de 1.493,2 mm e de 19,3ºC, com 66% da precipitação
ocorrendo no período de novembro a fevereiro (Vilela & Ramalho, 1979).
Posteriormente à coleta, os frutos foram encaminhados ao Laboratório de
Crescimento e Desenvolvimento de Plantas do Setor de Fisiologia Vegetal -
Departamento de Biologia da UFLA para processamento, sendo as sementes
retiradas e divididas em dois lotes de sementes. O primeiro lote foi constituído
de sementes que se dispersaram naturalmente, ou seja, coletadas no chão (lote
A) e sementes obtidas de frutos fechados (lote B). Nessa última condição, os
frutos, de coloração amarronzada, foram dispostos para secar à sombra até a
deiscência natural. As sementes foram acondicionadas em embalagens de
polietileno e armazenadas em câmara fria (8ºC e 45% de umidade relativa),
segundo recomendação de Espinoza (2004). No pré-armazenamento, as
sementes tiveram o seu grau de umidade monitorado em estufa a 105±3ºC, por
24 horas (Brasil, 1992), sendo então armazenadas com 9% e 8% de grau de
umidade, para os lotes A e B, respectivamente.
40
4.2 Caracterização morfológica de frutos e sementes
Foram selecionados, aleatoriamente, 100 frutos maduros, de coloração
amarronzada, procedentes de 50 árvores matrizes. Utilizou-se paquímetro
da
marca Vonder®, com precisão de 0,05 mm, procedendo-se as medições de
comprimento e largura dos frutos e sementes. Por comprimento, entendeu-se a
distância longitudinal entre o ápice e a base e, por largura, a medida
perpendicular à região mediana dos frutos, sendo os mesmos expressos em
centímetros (cm). A determinação da espessura das sementes foi feita utilizando-
se paquímetro digital da marca Mitutoyo Sul Americana Ltda., com precisão de
0,01 mm.
O número de sementes por fruto foi obtido a partir de uma amostra
constituída por 100 frutos e o peso de mil sementes determinado utilizando-se 8
repetições de 100 sementes, pesadas em balança analítica com precisão de 0,001
g, de acordo com Brasil (1992) e a média dos dados expressa em gramas (g).
4.3 Teste histoquímico das sementes
O teste histoquímico foi realizado no Laboratório de Anatomia Vegetal,
no Departamento de Biologia da UFLA.
As sementes foram submetidas a cortes manuais de seções transversais
utilizando navalha de micrótomo e posterior coloração com safranina e
fluoroglucinol. Os cotilédones e os eixos embrionários foram submetidos a
cortes transversais para determinar o tipo de reserva, utilizando-se os seguintes
reagentes: Lugol, para qualificar a presença de amido e Sudan III, para a
identificação de corpos lipídicos (Kraus & Arduin, 1997). Seguiu-se a
montagem de lâminas provisórias e semipermanentes, segundo técnicas descritas
por Johansen (1940). As observações visuais foram realizadas em microscópio
41
Olympus CBB, com documentação fotográfica realizada utilizando-se máquina
digital Canon®, com resolução de 7,0 megapixels e zoom óptico de 8x.
4.4 Caracterização ultra-estrutural de eixos embrionários
Os eixos embrionários foram fixados em Karnovsky modificado:
glutaraldeído (2,5%) e paraformaldeído (2,5%) em tampão cacodilato 0,05 M,
pH 7,2 e CaCl
2
0,001 M (Karnovsky, 1965), sendo mantidos em geladeira, a
10ºC, até posterior processamento.
As amostras foram preparadas de acordo com o protocolo padrão do
Laboratório de Microscopia Eletrônica e Análise Ultra-Estrutural (LME) do
Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras. Para isso,
foram lavadas três vezes em tampão cacodilato 0,05 M, durante 10 minutos e
imersas em glicerol 30%, como crioprotetor, durante 30 minutos. Para a
realização dos cortes transversais, as amostras foram congeladas em nitrogênio
líquido e, em seguida, fraturadas com bisturi em superfície resfriada para expor
os tecidos internos da semente (Alves, 2004). Os eixos embrionários foram
seccionados transversalmente em nitrogênio líquido para a observação ao
microscópio eletrônico de varredura. O material seccionado foi lavado em água
destilada e pós-fixado com tetróxido de ósmio (1%), durante 4 horas, à
temperatura ambiente, em capela, seguindo-se três lavagens com água destilada
durante 5 minutos e desidratação em gradiente crescente de acetona (25%, 50%,
75% e 90%), durante 10 minutos em cada solução e três vezes em acetona pura
(100%). As amostras foram levadas para secagem ao ponto crítico com CO
2
líquido no aparelho CPD 030 (Balzers). As amostras foram, então, montadas em
porta-amostras (stubs). A seguir, receberam uma cobertura de ouro no
evaporador SCD 050 (Balzers). A análise foi realizada em microscópio
42
eletrônico de varredura modelo Leo Evo 40, sendo as imagens digitais obtidas
pelo software Leo User Interface (Alves, 2004).
4.5 Composição química das sementes
A determinação da composição química das sementes foi realizada no
Laboratório de Biologia Molecular, no Setor de Fisiologia Vegetal (DBI), e no
Laboratório de Produtos Vegetais no Departamento de Ciência dos Alimentos,
na UFLA.
As sementes de A. colubrina do lotes A e B tiveram suas partes
(cotilédones e eixo embrionário) separadas manualmente, sendo também
retirado o tegumento. Em seguida, sementes intactas, cotilédones e eixos
embrionários foram secos em estufa, a 60ºC, por 72 horas, sendo,
posteriormente, moídos em graal. Os tratamentos foram distribuídos seguindo
um delineamento inteiramente casualizado e a análise de variância foi efetuada
em arranjo fatorial 3 x 2 (sementes intactas, cotilédones e eixos embrionários x
lotes), com três repetições para cada variável analisada. Os dados obtidos foram
submetidos à análise de variância utilizando-se o programa estatístico Sisvar
(Ferreira, 2000). As médias entre os tratamentos foram comparadas pelo teste de
Tukey, a 5% significância.
Foram realizadas as seguintes determinações:
a) Grau de umidade
Pesaram-se, aproximadamente, 0,5 g de sementes moídas em placas de
Petri de 7 cm previamente secas e taradas. Em seguida, foram secas em estufa
regulada a 105±3ºC, por 24 horas, e os dados expressos em porcentagem,
conforme método descrito pela Association of Official Analitical Chemists
(1990).
43
b) Teor de extrato etéreo
Pesou-se, aproximadamente, 1,0 g de sementes moídas, as quais foram
transferidas quantitativamente para o cartucho de Soxhlet. A extração direta da
amostra com éter etílico foi realizada em extrator contínuo de Soxhlet, utilizando
reboiler previamente seco e tarado. Após a extração, o reboiler contendo o
resíduo foi levado para a estufa a 65ºC, por 24 horas, e este foi posteriormente
pesado, sendo os resultados expressos em percentagem (Association of Official
Analitical Chemists, 1990).
c) Teor de amido
Pesaram-se 0,5 g de sementes moídas em tubo de centrífuga, sendo
adicionado ao tubo 10 mL de etanol 80%. Posteriormente, o tubo foi incubado,
em 40ºC, por 10 minutos. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 5.000 g, por
20 minutos e o sobrenadante separado do precipitado. Esse procedimento foi
repetido mais uma vez e os sobrenadantes unidos e guardados para a
quantificação de aminoácidos. Ao precipitado foram adicionados 10 mL de
ácido perclórico a 30% para a sua ressuspensão e, posteriormente, colocados em
banho de gelo, por 40 minutos. Após tal procedimento, a amostra foi
centrifugada a 5.000 g, por 20 minutos, a solução filtrada e seu volume
completado para 50 mL de água destilada.
A quantificação do teor de amido, em equivalente de glicose, foi
realizada pelo método de antrona, segundo Yemm & Willis (1954).
d) Teores de açúcares solúveis totais, redutores e não redutores
Os açúcares solúveis totais, redutores e não redutores foram extraídos pelo
método de Lane-Enyon (AOAC, 1990) e determinados pela técnica de Somogy,
adaptada anteriormente por Nelson (1944). Foram pesados 5,0 g de sementes
moídas, adicionaram-se 50 mL de etanol 70%, seguindo-se neutralização com
ácido acético glacial e, finalmente, completando-se o volume para 100 mL. Em
44
seguida, foi feita leitura de absorbância em espectrofotômetro (Beckman DU-
640) a 510 nm.
No mesmo extrato, foram determinados os açúcares não redutores, foi
realizada a hidrólise ácida da sacarose, acidificando o filtrado anterior com 0,5
mL de ácido clorídrico concentrado. Em seguida, as amostras foram levadas
para banho-maria fervente, por 15 minutos e, posteriormente, neutralizadas em
solução saturada de carbonato de sódio. Seguiu-se a desproteinização do extrato
com água destilada, solução de hidróxido de bário 0,3 N e solução de sulfato de
zinco 5%. Os tubos foram agitados, filtrados e a leitura de absorbância realizada
em espectrofotômetro, a 510 nm.
A determinação dos açúcares não redutores foi realizada pela diferença
entre o valor apresentado para açúcares totais e açúcares redutores, convertida
para o valor real multiplicado pelo fator 0,95 (Nelson, 1944).
g) Teor de proteína bruta (N total)
Pesaram-se 50 mg de amostra, sendo a mesma transferida para tubo de
digestão; adicionaram-se 1,5 g de sulfato de potássio e 0,3 g de sulfato de cobre,
acrescentando-se, posteriormente, 3,0 mL de ácido sulfúrico concentrado. Os
tubos foram levados para o bloco digestor, a 50ºC, aumentando-se a temperatura
lentamente, até atingir 370ºC. A mistura foi deixada no bloco digestor até que a
solução apresentasse cor verde-clara. Depois de esfriada, adicionaram-se 30 mL
de água destilada, agitando-se até dissolver o resíduo, estando o material pronto
para a determinação do nitrogênio total.
Na determinação do teor de nitrogênio total, utilizou-se o método de
micro-Kjeldahl (AOAC, 1990), aplicando-se o fator 6,25 para o cálculo do teor
de proteína bruta.
e) Teor de aminoácidos
A quantificação de aminoácidos foi realizada pelo método da Ninhidrina
(Yemm & Cocking, 1955), nos sobrenadantes resultantes das duas
45
centrifugações realizadas para a determinação do teor de amido. Utilizou-se
alíquota de 0,1 mL de amostra. A absorvância foi determinada a 570 nm em
espectrofotômetro Beckman DU-640, contra um padrão de glicina. Os dados
foram expressos como μmol de aminoácidos por grama de peso seco de
semente.
f) Teor de fibra bruta
Para a determinação do teor de fibra bruta, pesou-se 0,5 g de material
desengordurado, adicionaram-se 17,5 mL de ácido acético 70%, 0,5 g de ácido
tricloracético (PA.) e 1,2 mL de ácido nítrico (PA.). Deixou-se em repouso por
30 minutos a partir da ebulição (110ºC). Em seguida, os cadinhos foram levados
para estufa a 105±3ºC, por 24 horas. A diferença entre o peso do conjunto e o
peso do cadinho vazio expressou a quantidade de fibra bruta na amostra (Vande
Kamer & Van Ginkel, 1952). A determinação de fibra bruta foi realizada
somente em sementes intactas, para ambos os lotes de sementes.
g) Teor de taninos
Os teores de taninos foram determinados pelo método de Goldstein &
Swain (1963), utilizando como extrator o metanol 50% (u/v) e identificados de
acordo com o método de Folin Denis, descrito pela AOAC (1990). A
determinação de taninos foi realizada somente em sementes intactas, para ambos
os lotes de sementes.
4.6 Curva de embebição de sementes
A construção da curva de embebição das sementes foi realizada nos lotes
A e B de sementes, descritos anteriormente. As sementes foram divididas em
quatro amostras de 25 sementes cada e colocadas em rolo de papel Germtest®
umedecido com quantidade de água destilada equivalente a 2,5 vezes o peso do
papel e, em seguida, transferidas para a câmara de germinação, à temperatura de
46
30°C, na presença de luz. A primeira pesagem foi realizada com as sementes
secas e, posteriormente, a cada 30 minutos, durante as primeiras 12 horas de
embebição; nas 12 horas subseqüentes, as pesagens foram realizadas de hora em
hora e, posteriormente, a cada três horas. O processo de embebição das sementes
foi acompanhado por 48 horas.
A porcentagem de incremento sobre a massa fresca inicial foi calculada
por meio da expressão:
% de incremento sobre a massa fresca inicial (MFI) =
100∗
−
MFI
MFIMFU
em que MFU = massa fresca úmida e MFI = massa fresca inicial.
Para ajuste da curva aos dados de embebição, foi utilizado o modelo não
linear com maior coeficiente de determinação (R²). Procurou-se estabelecer, para
cada tratamento, uma equação de 3° grau que se ajustasse ao padrão trifásico da
germinação e delimitasse o início, o final e a duração das fases do processo
germinativo. Após a derivação da equação de 3° grau, determinaram-se as raízes
da equação derivada de 2° grau e os pontos de inflexão às curvas expressas em
porcentagem de incremento de massa por hora (% h
-1
), considerando o ponto
médio de cada intervalo para o valor de x (Rodrigues et al., 2008).
4.7 Efeito da temperatura e luminosidade na germinação de sementes
Sementes dos lotes A e B foram submetidas a diferentes regimes térmicos,
na ausência ou na presença de luz constante, em ambiente com 100% de
umidade relativa. Os testes de germinação foram conduzidos a temperaturas
constantes (25ºC e 30ºC), em câmara de germinação do tipo Mangelsdorf®,
enquanto os de temperaturas alternadas (15ºC-25ºC e 20ºC-30ºC) foram
conduzidos em câmara de germinação do tipo BOD, com controle fotoperiódico.
47
O substrato utilizado foi o rolo de papel Germtest® umedecido com água
destilada 2,5 vezes o peso do papel, colocado em béqueres de 250 mL contendo
lâmina d’água de 2,0 cm e cobertos com sacos plásticos para uniformizar a
umidade no meio de germinação. Para obter a ausência de luz, os béqueres
foram envoltos com embalagens de polietileno preto.
As avaliações de germinação foram realizadas utilizando-se como critério
a protrusão radicular a ±2,0 mm. As sementes germinadas foram mantidas no
rolo de papel para o acompanhamento do crescimento inicial e a contagem de
plântulas normais, sendo as avaliações feitas aos dez dias. Consideraram-se
como plântulas anormais aquelas com ápice da raiz ou epicótilo escurecidos,
ausência de epicótilo ou de raiz, raiz ou parte aérea atrofiados, ao final do
experimento. Avaliou-se também a porcentagem de sementes mortas, tendo
como critério o amolecimento dos tecidos e a presença de micélio de fungos.
O índice de velocidade de germinação (IVG) foi determinado juntamente
com a germinação e calculado segundo a equação proposta por Maguire (1962).
Os tratamentos foram distribuídos segundo o delineamento inteiramente
casualizado (DIC) e a análise de variância efetuada em arranjo fatorial 2 x 2 x 4
(lotes de sementes x condições de luminosidade x temperaturas), com 4
repetições de 25 sementes cada tratamento.
Os dados de porcentagens de plântulas normais e anormais foram
transformados utilizando-se
x , visando atendimento das pressuposições da
análise de variância. Para as demais variáveis, não houve necessidade de
transformação. Para a comparação das médias, foi aplicado o teste de Tukey a
5% de probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o
programa estatístico Sisvar (Ferreira, 2000).
48
4.8 Efeito do substrato na germinação de sementes
Sementes dos lotes A e B foram submetidas a diferentes substratos para
germinação, rolo de papel Germitest®, sobre papel Germitest®, sobre
Plantmax® e sobre areia, em condição de presença de luz, sob temperatura
constante de 30ºC. O substrato de papel Germitest® foi umedecido com
quantidade de água destilada equivalente a 2,5 vezes o peso do papel; para os
demais substratos, utilizaram-se caixas acrílicas do tipo gerbox, sendo
adicionada água a partir de observações quanto à necessidade ou não. Utilizou-
se câmara de germinação do tipo Mangelsdorf®, sendo mantida a umidade
relativa de 100% (Brasil, 1992). A avaliação da germinação foi realizada
diariamente, utilizando-se, como critério, a protrusão da radícula a ±2,0 mm.
Ao final do experimento, após 10 dias, avaliou-se a porcentagem de
plântulas normais e anormais, bem como de sementes mortas, como descrito no
item 4.7.
O índice de velocidade de germinação (IVG) foi conduzido juntamente
com o teste de germinação, sendo as avaliações realizadas diariamente a partir
da protrusão da radícula, e calculado segundo a equação proposta por Maguire
(1962).
Foi realizado o teste de sanidade, avaliando-se a presença de fungos nas
sementes, com auxílio de lupa e microscópio estereoscópio, em virtude do
aparecimento destes.
4.9 Caracterização morfológica das plântulas em diferentes substratos
As plântulas obtidas no item 4.8 foram avaliadas, após 10 dias, quanto
ao comprimento da parte aérea e do sistema radicular dessas, medidos a partir de
15 plântulas normais de cada repetição, com auxílio de uma régua graduada em
49
milímetro. Para a determinação da matéria seca da parte aérea e do sistema
radicular das plântulas normais, as partes foram separadas e acondicionadas em
sacos de papel previamente identificados e levados à estufa de ventilação
forçada, regulada, a 60ºC, durante 72 horas. Após esse período, as plântulas
foram retiradas da estufa e pesadas em balança analítica com precisão de 0,001
g, sendo os resultados expressos em gramas (g).
Os tratamentos foram distribuídos segundo o delineamento inteiramente
casualizado e a análise de variância foi efetuada em arranjo fatorial 4 x 2
(substratos x lotes de sementes), com quatro repetições de 25 sementes cada
tratamento. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância
utilizando-se o programa estatístico Sisvar (Ferreira, 2000). As médias entre os
tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Morfologia e anatomia dos frutos e sementes
O fruto maduro de A. colubrina é do tipo vagem/legume, deiscente, de cor
marrom (Figura 1A). Os frutos apresentam formato estreito e margens constritas.
O número de sementes por fruto é variável, sendo dez, em média. O
comprimento do fruto varia entre 14 cm e 16 cm e o peso de mil sementes entre
117 g e 120 g. As sementes apresentam comprimento entre 1,43 cm a 1,55 cm,
largura ou diâmetro de 1,61 cm a 1,64 cm e espessura entre 0,77 mm e 0,89
mm, para sementes do lote A e B, respectivamente.
A semente apresenta-se morfologicamente achatada e brilhante, com ala
estreita (Figura 1B). O embrião, de coloração amarela clara, compõe-se de dois
cotilédones planos, foliáceos, de contorno aproximadamente circular, com uma
50
fenda basal que termina no ponto de inserção destes no eixo hipocótilo-radícula
(Figura 1C), que é curto e reto, exposto pela incisão basal dos cotilédones.
Os resultados obtidos neste trabalho estão de acordo com os relatados para
a mesma espécie, por Espinoza (2004), com comprimento dos frutos entre 18 cm
e 20 cm em lotes coletados em anos sucessivos, enquanto a largura média foi de
2,1 cm em amostras procedentes de Cochabamba, Bolívia, em altitudes entre
1.990 m e 2.100 m. Esse mesmo autor relatou que o diâmetro das sementes
variou entre 1,66 cm e 1,72 cm.
A observação do eixo embrionário ao microscópio eletrônico de varredura
mostrou que a plúmula é diferenciada, com folíolos delimitados (Figura 2A). A
plúmula apresenta-se dobrada sobre o longo e arqueado epicótilo, num ângulo de
cerca de 180º, como descrito por Oliveira (1999). Numerosos folíolos
multifoliolulados distinguem-se na plúmula, em que ráquis e foliólulos são
visíveis (Figura 2A). A protoderme é glabra no eixo hipocótilo-radícula e com
numerosos tricomas em diferenciação no epicótilo, do tipo glandular pluricelular
(Figura 2B). A porção hipocótilo-radicular do eixo não demonstra grande
diferenciação (Figura 2C). O procâmbio é constituído por células longas e
indiferenciadas (Figura 3A e 3B). O meristema fundamental cortical é reduzido,
comparado com a ampla medula, composto por células grandes e vacuolizadas
(Figura 3C). Nas extremidades radicular e epicotilar, o grau de vacuolização das
células é menor. É possível visualizar o procâmbio, formado por células mais
alongadas do que as demais (Figura 3A). A medula do eixo embrionário é
constituída por células relativamente grandes, com paredes delgadas e ricas em
lipídios (Figura 3A e 3C). Os cotilédones são delgados e ricos em lipídios
(Figura 4A), não sendo detectada a presença de amido. O eixo embrionário das
sementes de A. colubrina é diferenciado; as células são ricas em lipídios e com
pouca quantidade de grãos de amido (Figuras 4B, 4C e 4D).
51
(A) (B)
(C)
FIGURA 1. Aspecto dos frutos (A), semente inteira com tegumento e eixo
embrionário (B e C) de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan.
Barra (A) = 2,0 cm, barra (B) = 1,0 cm e barra (C) = 0,5 cm.
UFLA, Lavras, MG, 2008. Autora: Fernanda Carlota Nery.
52
R
F
(A)
(B)
(C)
C
FIGURA 2. Eletromicrografia de varredura de eixo embrionário de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan. (A) plúmula, (B)
tricomas na parte inferior do eixo plúmula-hipócotilo, (C) eixo
hipocótilo-radicular (seta: tricomas em diferenciação, F: folíolos,
R: ráquis, C: cotilédones aderidos ao eixo). UFLA, Lavras, MG,
2008.
53
200μm
Pt
M
P
(A)
Pt
Mf
P
c
En
100μm
20μm
Go
En
(B)
(C)
FIGURA 3. Eletromicrografia de varredura de eixo embrionário de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan. (A) visão geral do eixo
embrionário em corte transversal, (B e C) detalhes do eixo
embrionário em corte transversal (Pt: protoderme, M: medula, Pc:
procâmbio, Mf: meristema fundamental, En: endordeme, Go:
células com gotículas lipídicas). UFLA, Lavras, MG, 2008.
54
(A)
(B)
(C)
(D)
M
P
Co
Co
P
M
C
Ma
FIGURA 4. Fotomicrografia de seções transversais do tecido cotiledonar (A) e
longitudinais do eixo embrionário (B, C e D) de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan., coradas com Sudan III
(A e C) e Lugol (B e D) (setas: gotículas de lipídio e grãos de
amido, M: meristema fundamental, P: procâmbio, Co: coifa, C:
córtex, Ma: meristema apical). Barra = 0,5 μm (A e B) e barra = 2,0
μm (C e D). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Oliveira (1999) descreveu os embriões de duas espécies da subfamília
Mimosoideae, especialmente o eixo embrionário de Anadenanthera macrocarpa
(Benth.), como tendo plúmula diferenciada, quando há primórdios foliares
distingüíveis, podendo ocorrer diferenciação foliolar, estipular e ou estipelar. O
55
mesmo autor observou, para Inga urugüensis, a presença de numerosos tricomas
tectores e glandulares já diferenciados, sendo esta última espécie também
tanífera, ocorrendo idioblastos tanto na protoderme quanto no meristema
fundamental, em especial na região cortical.
Araújo Neto et al. (2002), estudando a morfologia de sementes de Acacia
polyphylla DC. (Leguminosae-Mimosoideae), relataram também que a região
embrionária é constituída pelo eixo embrionário e as primeiras estruturas
foliares. O eixo embrionário ocupa uma parte da região central da semente,
assumindo posição axial, sendo composto por dois cotilédones verdes, planos e
foliáceos que, unidos ao eixo embrionário, apresentam coloração amarelo-clara.
A plúmula, situada na extremidade do eixo hipocótilo-radícula, mostra-se
diferenciada e coberta de pêlos. Os primórdios foliares da plúmula são bem
distinguíveis, com seus respectivos folíolos e foliólulos. O embrião é
invaginado, com delimitação na base emarginada dos cotilédones ou pela
invaginação do eixo nos cotilédones. Este tipo de embrião, segundo Damião
Filho (1993), é muito encontrado na subfamília Mimosoideae.
Os resultados obtidos neste trabalho estão de acordo com os de
Nascimento et al. (2007) que observaram, no citoplasma das células dos
cotilédones de sementes germinadas de Anadenanthera colubrina, com 1,0 mm
de comprimento de radícula, a presença de um material inespecífico, reagindo
com o reativo de Schiff, com características globulares. Segundo relato dos
autores, provavelmente, se trata de glicoproteínas e não amido, uma vez que a
reação do lugol não foi positiva para este polissacarídeo. Esse resultado está de
acordo com os obtidos neste trabalho para A. colubrina, uma vez que não foi
detectada presença de amido nos cotilédones.
56
5.2 Composição química das sementes
O teor de fibra bruta e de taninos foi determinado em sementes intactas de
A. colubrina, não tendo sido verificadas diferenças significativas para ambos os
constituintes entre os lotes A e B, com os valores de 6,15±0,29% e 5,62±0,16%
para fibra bruta e de 15,03±0,46% e 18,03±0,93% para taninos, para os lotes A e
B, respectivamente.
Os demais constituintes que compõem a semente intacta, bem como, em
separado, os cotilédones e o eixo embrionário de A. colubrina, encontram-se
descritos na Tabela 1.
O grau de umidade foi menor no eixo embrionário de sementes do lote A
quando comparado ao lote B, não diferindo estatisticamente entre semente
intacta e cotilédones. Sementes do lote A apresentaram menor grau de umidade
no eixo embrionário, sendo observado o contrário para sementes do lote B, uma
vez que essas se encontram ainda imaturas.
Observou-se maior teor de extrato etéreo para o lote A em relação ao lote
B. Com relação às partes das sementes dentro dos lotes, observou-se que os
cotilédones contêm valor superior de extrato etéreo em relação ao eixo
embrionário, para ambos os lotes. Os resultados encontrados foram superiores
aos observados por Mayworm & Salatino (1996a, 1996b), para A. colubrina e A.
falcata, que foram, respectivamente, de 3,1% e 2,1%. Esses autores relataram,
ainda, o predomínio de ácidos graxos insaturados presentes em A. colubrina,
destacando-se o ácido linóleico (C18:2) – 45,6% e o ácido oléico (C18:1) –
21,7%. Sasaki (2008) encontrou, para Anadenanthera peregrina var. falcata,
teor de óleo de 6,97%. Valores bem superiores para o contéudo de lipídios
(50%) foram verificados em sementes de Caesalpinia peltophoroides
(Leguminosae-Caesalpinoideae) (Corte et al., 2006).
57
Foi obtido percentual inferior de teor de amido para o eixo embrionário,
em ambos os lotes de sementes. O baixo conteúdo de amido no eixo embrionário
foi observado também quando se utilizou lugol para a sua detecção (Figura 2B).
Os cotilédones oriundos das sementes coletadas no chão (lote A) apresentaram
maior teor de amido em relação às sementes coletadas de frutos fechados (lote
B).
Baixos teores de amido também foram relatados por Sasaki (2008), para
Anadenanthera peregrina var. falcata, com média de 0,45%. Nascimento et al.
(2007) observaram, para sementes secas de Anadenanthera colubrina, 1,9% de
teor de amido.
Os carboidratos de reserva armazenados em sementes de leguminosas têm
sido aplicados como ferramenta na taxonomia. Muitas Papilonoideae
armazenam grandes quantidades de amido em suas sementes; em outras, sua
ocorrência é pequena ou ausente. Em Caesalpinioideae e Mimosoideae, essa
reserva constitui uma exceção (Hegnauer & Gpayer-Barkmeijer, 1993). Corte et
al. (2006) relataram a presença de menos de 4% de carboidratos em sementes de
Caesalpinia peltophoroides Benth.
Para o conteúdo de açúcares totais, valor superior foi obtido para
cotilédones e eixo embrionário de sementes do lote A. Para o lote A, maior
conteúdo de açúcares totais foi encontrado no eixo embrionário. No lote B, não
foi verificada diferença entre o conteúdo presente nos cotilédones e no eixo
embrionário.
Para o teor de açúcares redutores, verificou-se porcentagem superior nos
cotilédones, em ambos os lotes de sementes, com maior acúmulo em sementes
do lote A. Quanto à porcentagem de açúcares não redutores, maiores valores
foram encontrados nas sementes do lote A e, dentro de cada lote, houve
predomínio no eixo embrionário. O maior conteúdo de açúcares, tanto redutores
quanto não redutores, ou a combinação de ambos, protege as sementes contra
58
danos à dessecação, sendo a aquisição de tolerância à dessecação adquirida com
a maturação da semente.
De acordo com esses dados, os tecidos formados durante a maturação e
tolerantes à dessecação são caracterizados por apresentarem alta quantidade de
sacarose e oligossacarídeos (estaquiose ou rafinose) (Kuo et al., 1988) e por
apresentarem ausência ou, pelo menos, baixa quantidade de monossacarídeos
redutores, como a galactose, manose, glucose e frutose.
Para o teor de proteínas, houve interação significativa entre os lotes de
sementes e as partes que compõem a semente. Verificaram-se teores menores
para os cotilédones e o eixo embrionário em sementes do lote B. Dentro de cada
lote de sementes, notou-se diferença significativa entre as partes da semente. Em
ambos os lotes, verificaram-se maiores teores de proteína depositados nos
cotilédones (Tabela 1).
Os resultados obtidos neste trabalho estão de acordo com os descritos por
Mayworm et al. (1998), para Acacia bahiensis Benth., Acácia farnesiana (l.)
Wild e Mimosa arenosa (Wikl) Poir, todas pertencentes à subfamília
Mimosaceae. Esses autores encontraram valores altos de proteínas, variando de
28% a 55%. Descreveram, ainda, para sementes de Caesalpinia pyramidalis,
teor de proteínas de aproximadamente 40%.
Sasaki (2008), trabalhando com sementes de Anadenanthera peregrina
var. falcata, encontrou teores médios de 8,73% de açúcar e 30,35% de proteína,
semelhantes aos verificados neste trabalho. Os dados obtidos neste trabalho
corroboram também com os relatados por Nascimento et al. (2007) para
sementes de Anadenanthera colubrina, que verificaram a presença de 2,7% de
glicose (açúcar solúvel) e 13,1% de proteína. Segundo Bewley & Black (1994),
as proteínas são mobilizadas durante a germinação e o subseqüente crescimento
das plântulas.
59
Marques (1997) relatou, para sementes de A. peregrina var. falcata e A.
colubrina var. cebil, valores de 31,6% e 33,4%, 17,5% e 17,4%, 6,06% e 6,81%,
para proteína, amido e lipídio, respectivamente. Esses resultados, embora
estejam relativamente diferentes dos obtidos neste trabalho, demonstram o alto
conteúdo de proteína presente em sementes de angico.
Para o conteúdo de aminoácidos nas sementes de A. colubrina,
observaram-se valores inferiores para o lote A em relação ao lote B. Para ambos
os lotes, porcentagens superiores de aminoácidos foram observadas no eixo
embrionário (Tabela 1).
De maneira geral, foram verificados, para A. colubrina, teores superiores
de proteína, seguido de extrato etéreo e amido.
60
TABELA 1. Valores médios em base seca (desvio padrão) dos constituintes
químicos da semente intacta, cotilédones e eixo embrionário de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, do lote A (sementes
coletadas no chão ) e lote B (sementes obtidas de frutos fechados).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Lotes
A B
Constituintes
Grau de umidade (%)
Semente intacta 11,81±0,49 aA 12,42±0,06 aB
Cotilédones 12,34±0,94 aA 13,00±0,19 aB
Eixo embrionário 9,47±0,76 bB 15,01±0,57 aA
CV (%) = 4,76
Extrato etéreo (%)
Semente intacta 15,96±0,19 aB 11,66±0,15 bB
Cotilédones 21,21±0,22 aA 18,38±0,36 bA
Eixo embrionário 8,46±0,00 aC 5,82±0,00 bC
CV (%) = 1,47
Amido (%)
Semente intacta 11,58±4,04 aB 12,79±4,27 aA
Cotilédones 16,32±5,83 aA 10,34±15,74 bB
Eixo embrionário 4,46±3,15 aC 4,50±5,03 aC
CV (%) = 8,77
Açúcar total (%)
Semente intacta 13,16±0,71 aC 12,44±0,86 aB
Cotilédones 18,21±0,29 aB 16,16±0,02 bA
Eixo embrionário 21,76±0,36 aA 16,13±0,52 bA
CV (%) = 1,97
Açúcar redutor (%)
Semente intacta 4,52±0,03 aB 3,55±0,08 bB
Cotilédones 4,98±0,03 bA 6,10±0,29 aA
Eixo embrionário 0,81±0,01 aC 0,64±0,03 bC
CV (%) = 0,73
Açúcar não-redutor (%)
Semente intacta 9,36±0,19 aC 7,96±0,05 bC
Cotilédones 12,80±0,02 aB 9,56±0,06 bB
Eixo embrionário 20,64±0,50 aA 14,83±0,24 bA
CV (%) = 3,65
Proteína bruta (%)
Semente intacta 42,15±0,21 aC 42,70±0,99 aA
Cotilédones 47,07±0,25 aA 43,40±0,00 bA
Eixo embrionário 44,45±0,49 aB 39,37±0,25 bB
CV (%) = 1,12
Aminoácidos (μmol/g)
Semente intacta 339,09±22,93 bB 526,58±69,43 aB
Cotilédones 288,30±32,55 bB 601,80±40,14 aB
Eixo embrionário 692,30±43,82 bA 969,15±71,69 aA
CV (%) = 8,80
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha e maiúscula na coluna não
diferem entre si, pelo teste de Tukey (p≤0,05). CV = coeficiente de variação.
61
Sementes recém-colhidas de Acacia polyphylla DC. (Leguminosae-
Mimosoideae), segundo Araújo Neto et al. (2002), apresentaram altos teores de
carboidratos totais (44 g), seguidos de proteínas (13,1%) e óleo (2,7%).
De acordo com Santos & Buckeridge (2004), a quantidade de reservas nos
cotilédones de A. falcata é muito baixa, pois os cotilédones são foliáceos e se
tornam fotossintetizantes após a germinação. Maciel et al. (1992) relataram que,
para sementes de angico-vermelho, cotieira e jacarandá caviúna, os teores de
fenóis totais nos embriões foram, de maneira geral, inferiores aos quantificados
nos respectivos tegumentos, estando entre 0,016 e 0,495, para o embrião e 0,329
e 1,342, para o tegumento, dados em mg de equivalentes catecol/g de peso seco.
Entre estas espécies, no tegumento de sementes de angico-vermelho
constataram-se os menores níveis de fenóis totais.
Vallilo et al. (2001), estudando a composição química das sementes de
Lonchocarpus muehlbergianus Hassl., pertencente à família Leguminosae-
Faboideae (Papilionoideae), revelaram que essas apresentaram altos teores de
lipídios (26,8%), protídios (25,9%) e fibras alimentares (18,4%).
No entanto, para sementes de baru, também pertencente à família
Leguminosae, Takemoto et al. (2001) encontraram elevados teores de lipídios
(38,2%), proteínas (23,9%) e calorias (502kcal/100g), além de valores
significativos de fibras alimentares (13,4%) e de minerais, como potássio (827
mg/100g), fósforo (358 mg/100g) e magnésio (178 mg/100g), sugerindo seu
emprego na alimentação humana e animal, desde que não contenha substâncias
tóxicas ou alergênicas.
É importante ressaltar que as sementes oleaginosas apresentam menor
potencial de armazenamento que as amiláceas, devido à menor estabilidade
química dos lipídios em relação ao amido; a temperatura necessária para a
degradação do amido é mais elevada que a responsável pelos mesmos efeitos em
62
lipídios. Nessas sementes, uma elevação moderada da temperatura, como
conseqüência do processo respiratório, é suficiente para a decomposição dos
lipídios e a elevação da taxa de deterioração. Por esse motivo, as sementes
oleaginosas devem ser armazenadas com grau de umidade inferior ao
recomendado para as amiláceas. O teor elevado de proteínas também pode
contribuir para a redução do potencial de armazenamento, devido à elevada
afinidade dessa substância com a água (Marcos Filho, 2005).
A composição química é determinada, em última análise, pela herança
genética. Algumas alterações de composição são induzidas por condições
ambientais durante o desenvolvimento das sementes, mas tais mudanças são,
geralmente, insignificantes (Bewley & Black, 1994). Proteínas, amido e lipídios
são as principais formas de reservas nas sementes, sendo utilizados durante o
desenvolvimento da plântula (Buckeridge et al., 2004).
5.3 Curva de embebição de sementes
A embebição foi realizada com sementes dos lotes A e B, por 48 horas,
permitindo a construção da respectiva curva (Figura 5).
O ganho de massa deve-se à absorção de água e a curva de embebição das
sementes de A. colubrina aproxima-se do padrão trifásico (Bewley & Black,
1994).
É provável que o tegumento das sementes de A. colubrina seja bastante
permeável à água, pois, nos lotes A e B, a primeira fase (fase I) de embebição de
água ocorreu durante as primeiras 7,67 horas e 5,57 horas, respectivamente
(Figura 5). Nesta fase, surgem os primeiros sinais de reativação do metabolismo,
com aumento acentuado da atividade respiratória e liberação de energia para a
germinação, ativação de enzimas e síntese de proteínas a partir do RNAm
armazenado ao final do processo de maturação (Bewley & Black, 1994).
63
Na fase II, o ganho de massa foi baixo e contínuo (Figura 5), sendo,
provavelmente, induzido pelo potencial osmótico celular, pois o potencial
matricial torna-se pouco relevante. A ausência de estabilização da massa indica
que o potencial osmótico não foi completamente anulado pelo potencial de
parede (Justo et al., 2007). Essa fase teve duração relativamente curta, ocorrendo
com 17,83 horas e 20,14 horas, para os lotes A e B, respectivamente. Segundo
Marcos Filho (2005), a fase II é caracterizada por atividades constituintes do
processo bioquímico preparatório, sendo necessária para a síntese de enzimas, de
DNA e de RNAm, exauridos durante a fase I.
O início da fase III, tornando visível a retomada de crescimento do
embrião, foi identificado pela protrusão da raiz primária. Notou-se que o ganho
de massa acelerou-se a partir de 19,41 horas e 25,70 horas, para os lotes A e B,
respectivamente, correspondente ao início desta fase.
Os resultados obtidos para os diferentes lotes de sementes de A. colubrina
não indicam a ocorrência de dormência para essa espécie, com o tegumento
sendo permeável à água.
O mesmo foi relatado por Lopes (2007) para sementes escarificadas e não
escarificadas de Bauhinia variegata var. candida e Bauhinia forficata. Esses
autores evidenciaram que, durante o processo de embebição, sementes dessas
espécies apresentaram aumento no peso de matéria fresca, indicando menores
restrições à passagem de água através do tegumento e, conseqüentemente, menor
dureza e impermeabilidade do mesmo à água.
64
y Lote A (linha contínua, ■) = 0,0102x
3
- 0,8277x
2
+ 22,418x + 123,25 R
2
= 0,9828
y Lote B (linha tracejada, ◊) = 0,0076x
3
- 0,6985x
2
+ 21,846x + 100,01 R
2
= 0,986
100
150
200
250
300
350
400
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (horas)
Incremento sobre a MF inicial (%.h
-1
)
FIGURA 5. Incremento em relação à massa fresca inicial (% h
-1
) de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, do lote A (linha contínua)
e do lote B (linha tracejada), ao longo do período de embebição
(setas: 50% de sementes germinadas, com protrusão radicular ± a
2,0 mm; seta cheia: lote A; seta vazia: lote B). UFLA, Lavras, MG,
2008.
A evolução do processo germinativo de sementes de A. colubrina,
evidenciando a protrusão radicular até a formação da plântula, está ilustrada na
Figura 6.
65
Pt
Co
Rp
T
Pt
Co
Rp
T
(
A
)
(
B
)
(
C
)
(
D
)
(
E
)
FIGURA 6. Evolução do processo germinativo de sementes de Anadenanthera
colubrina (Vell.) Brenan, evidenciando a protrusão radicular (seta),
até a formação da plântula. (A) semente seca; (B) 6 horas de
embebição; (C) 12 horas de embebição, semente com tegumento
rompido; (D) 16 horas de embebição e (E) 25 horas de embebição.
(Pt: protófilos, C: cotilédones, Rp: raiz principal, T: tegumento).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
FIGURA 6. Evolução do processo germinativo de sementes de Anadenanthera
colubrina (Vell.) Brenan, evidenciando a protrusão radicular (seta),
até a formação da plântula. (A) semente seca; (B) 6 horas de
embebição; (C) 12 horas de embebição, semente com tegumento
rompido; (D) 16 horas de embebição e (E) 25 horas de embebição.
(Pt: protófilos, C: cotilédones, Rp: raiz principal, T: tegumento).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
5.4 Efeito da temperatura e luminosidade na germinação de sementes 5.4 Efeito da temperatura e luminosidade na germinação de sementes
Não houve efeito significativo para a interação tripla entre lotes de
sementes, condições de luminosidade e regimes térmicos para todas as variáveis
analisadas (Tabela 2). A interação dupla significativa entre condições de
luminosidade e temperatura foi verificada apenas para as porcentagens de
plântulas normais e anormais (Tabela 3).
Não houve efeito significativo para a interação tripla entre lotes de
sementes, condições de luminosidade e regimes térmicos para todas as variáveis
analisadas (Tabela 2). A interação dupla significativa entre condições de
luminosidade e temperatura foi verificada apenas para as porcentagens de
plântulas normais e anormais (Tabela 3).
66
Com relação à germinação, a temperatura constante de 30ºC e os regimes
alternados de 15°C-25ºC e 20°C-30ºC proporcionaram maior percentual de
germinação nas sementes do lote A, não havendo, contudo, efeito das condições
de luminosidade. Nota-se que a temperatura de 25ºC propiciou maior percentual
de sementes mortas, em sementes do lote B (Tabela 2).
Quanto ao índice de velocidade de germinação (IVG), maior vigor foi
verificado em sementes do lote A, a 30ºC, independente da condição de
luminosidade (Tabela 2).
TABELA 2. Valores médios de porcentagem de germinação (G, %), sementes
mortas (M, %) e índice de velocidade de germinação (IVG) de dois
lotes de sementes de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan
submetidas a diferentes condições de luminosidade e regimes
térmicos. UFLA, Lavras, MG, 2008.
G (%) M (%) IVG
Lotes
A 93 a 6 b 19,20 a
B 88 b 10 a 16,16 b
Luminosidade
Presença 90 a 9 a 17,45 a
Ausência 91 a 7 a 17,91 a
Temperaturas (ºC)
25 81 b 17 a 17,16 b
30 96 a 6 b 20,59 a
15-25 91 a 6 b 17,84 b
20-30 93 a 3 b 15,12 c
CV (%) 6,28 40,83 9,33
*Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna, para cada fator e varíavel, não diferem
entre si, pelo teste de Tukey (p≤0,05).
67
A maior porcentagem de plântulas normais foi verificada em sementes do
lote A e o contrário para sementes do lote B (Tabela 3).
TABELA 3. Valores médios de porcentagem de plântulas normais (PN, %) e
plântulas anormais (PA, %), de dois lotes de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, submetidas a diferentes
condições de luminosidade e regimes térmicos. UFLA, Lavras,
MG, 2008.
PN (%) PA (%)
Lotes
A 85 a 10 b
B 69 b 17 a
CV (%) 11,95 6,38
*Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna, para cada fator e varíavel, não diferem
entre si, pelo teste de Tukey (p≤0,05).
Pelos dados obtidos para interação dupla entre as condições de
luminosidade e temperatura, verificou-se que a porcentagem de plântulas
normais foi superior nas temperaturas de 30ºC na presença de luz, e a 20°C-
30ºC, na ausência de luz, não havendo diferenças significativas para os demais
tratamentos. Para a porcentagem de plântulas anormais, menor valor foi
observado na temperatura alternada de 20ºC-30ºC, não diferindo os demais
tratamentos entre si (Tabela 4).
Comparando-se dentro de cada condição de luminosidade, quando as
sementes foram submetidas à presença ou à ausência de luz, menor porcentagem
de plântulas normais ocorreu à temperatura constante de 25ºC (Tabela 4).
Quanto à porcentagem de plântulas anormais, tanto na presença como na
ausência de luz, a maior porcentagem foi observada a 25ºC.
68
TABELA 4. Valores médios de porcentagem de plântulas normais e anormais
para interação entre diferentes condições de luminosidade e
regimes térmicos, em sementes de Anadenanthera colubrina
(Vell.) Brenan. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Luminosidade
Presença Ausência
Temperaturas (ºC)
Plântulas normais (%)
25 62 aB 55 aC
30 85 aA 75 bB
15-25 86 aA 87 aA
20-30 77 bA 88 aA
Plântulas anormais (%)
25 20 aA 28 aA
30 7 aBC 8 aB
15-25 10 aC 5 aB
20-30 18 aAB 9 bB
*Médias seguidas por letras minúsculas na linha e maiúsculas na coluna não diferem
entre si, pelo teste de Tukey (p≤0,05).
O aspecto visual da formação de plântulas normais e anormais de A.
colubrina está ilustrado na Figura 7.
(A)
(B)
FIGURA 7. Aspecto visual de plântulas, normal (A) e anormal (com sistema
radicular atrofiado) (B), obtidas de sementes de Anadenanthera
colubrina (Vell.) Brenan. UFLA, Lavras, MG, 2008.
69
Segundo Ramos & Varela (2003), a temperatura ideal de germinação,
geralmente, varia dentro da faixa de temperatura encontrada no local e na época
ideal para emergência e estabelecimento das plântulas. Varela et al. (2005), ao
estudarem o efeito das temperaturas de 25ºC, 30ºC e 35ºC na germinação de
sementes de angelim-pedra (Dinizia excelsa Benth), não verificaram efeito das
mesmas, porém, a 30ºC e 35ºC, houve maior desenvolvimento do hipocótilo e da
raiz primária.
Em estudos realizados em sabiá (Mimosa caesalpiniaefolia Benth), foi
observado que a temperatura de 25ºC proporcionou maior porcentagem de
germinação e vigor das sementes, em comparação às temperaturas de 20ºC, 30ºC
e alternância de 20ºC-30ºC (Alves et al., 2002).
Insensibilidade de sementes na germinação em relação à luz também foi
demonstrada nos resultados de Perez et al. (2001), testando sementes de
canafístula (Peltophorum dubium (Spreng.) Taub.). Passos et al. (2008)
constataram que diferentes regimes de luz não influenciaram a germinação das
sementes de Cedrela odorata L.
As informações obtidas concordam com as de Nassif et al. (1998), que
citam a existência de sementes que podem ser influenciadas positiva ou
negativamente pela luz ou, ainda, apresentar comportamento indiferente a ela.
Resultados semelhantes foram observados por Ferraz Grande & Takaki (2006)
que, ao estudarem sementes de Caesalpinia peltophoroides Benth, concluíram
que elas não possuem fotossensibilidade.
5.5 Efeito do substrato na germinação de sementes
Em rolo de papel, observou-se maior porcentagem de germinação
(protrusão radicular) e de plântulas normais nas sementes provenientes do lote B
em relação ao lote A. Para os demais substratos não houve diferenças
70
significativas entre os lotes (Tabela 5). Dentro do lote, menor valor foi obtido
para o rolo de papel, para germinação (protrusão radicurlar) e plântulas normais.
Dentro do lote B, não houve diferença significativa entre os substratos (Tabela
5).
Embora tenha sido detectada a presença do fungo patogênico Fusarium
verticilioiodes no substrato sobre papel e de fungos saprófitas, como Aspergillus
niger e Aspergillus flavus, esses não prejudicaram a germinação das sementes de
A. colubrina. Segundo Strapasson et al. (2002), não foram encontrados relatos
anteriores sobre a associação de fungos em sementes de angico, muito embora,
em seu trabalho com angico (Piptadenia paniculata Bentham), os autores
tenham encontrado a presença de fungos potencialmente patogênicos como
Fusarium, Phomopsis, Colletotrichum, Cladosporium e Alternaria) e saprófitas
(Aspergillus, Pestalotia, Monilia, Trichoderma, Penicillium e Geotrichum), em
baixos percentuais de contaminação.
Quanto ao IVG, valor superior foi verificado para as sementes do lote A
em comparação ao lote B, utilizando substratos areia e rolo de papel, não
havendo diferenças entre os demais substratos para ambos os lotes. Dentro do
lote A, maior vigor foi observado quando se utilizaram substratos sobre areia e,
dentro do lote B, também em substrato areia e Plantmax® (Tabela 5).
71
TABELA 5. Valores médios de germinação (protrusão radicular) (%), índice de
velocidade de germinação (IVG) e plântulas normais (%), para
interação entre diferentes lotes e substratos, em sementes de
Anadenanthera colubrina
(Vell.) Brenan. UFLA, Lavras, MG,
2008.
Lotes
A B Substratos
Germinação (%)
Rolo de papel 73 bB 94 aA
Sobre papel 95 aA 100 aA
Plantmax® 96 aA 94 aA
Sobre areia 97 aA 98 aA
CV (%) = 5,88
IVG
Rolo de papel 21,21 aAB 13,46 bB
Sobre papel 14,42 aC 14,00 aB
Plantmax® 17,47 aBC 19,58 aA
Sobre areia 22,79 aA 19,46 bA
CV (%) = 11,51
Plântulas normais (%)
Rolo de papel 67 bB 88 aA
Sobre papel 83 aA 88 aA
Plantmax® 94 aA 91 aA
Sobre areia 93 aA 96 aA
CV (%) = 8,35
*Médias seguidas por letras minúsculas na linha e maiúsculas na coluna, não diferem
entre si, pelo teste de Tukey (p≤0,05).
Para porcentagem de plântulas anormais e sementes mortas não foram
verificadas interações significativas entre lotes de sementes e substratos testados.
Maiores porcentagens de plântulas anormais e sementes mortas ocorreram em
rolo de papel (Tabela 6).
72
TABELA 6. Valores médios de porcentagem de plântulas anormais (PA, %) e
sementes mortas (M, %) de dois lotes de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, submetidos a diferentes
substratos para o teste de germinação. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Substratos PA (%) M (%)
Rolo de papel 7 a 15 a
Sobre papel 0 b 2 b
Plantmax® 3 ab 4 b
Sobre areia 2 ab 2 b
*Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey
(p≤0,05).
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 7, as características
comprimento da parte aérea, comprimento do sistema radicular e matéria seca do
sistema radicular foram influenciadas pela interação dupla entre substratos e
lotes de sementes.
Sementes do lote A, germinadas em rolo de papel e sobre areia, exibiram
maior comprimento da parte aérea, ao contrário do que ocorreu com as plântulas
provenientes de sementes germinadas dos demais substratos. Avaliando-se a
mesma variável dentro do lote B, observou-se melhor comportamento das
plântulas em substrato Plantmax®, provalvelmente devido à constituição física
desse substrato, que permite melhores condições de oxigenação às plantulas.
Quando se compararam os lotes de sementes dentro de cada substrato, verificou-
se maior comprimento da parte aérea em rolo de papel para o lote A e em
Plantmax® para o lote B, não diferindo essa característica para os demais
substratos (Tabela 7).
No que diz respeito ao crescimento do sistema radicular, dentro do lote A
verificou-se maior comprimento em substratos rolo de papel e Plantmax®, e
dentro do lote B, valor superior foi observado em Plantmax®. Na comparação
dos lotes de sementes dentro de cada substrato, verifica-se que no rolo de papel
73
as sementes do lote A apresentaram maior comprimento de raiz que sementes do
lote B, não havendo diferenças significativas para os demais tratamentos (Tabela
7).
Quanto à massa seca do sistema radicular, não houve diferença
significativa entre os diferentes substratos para o lote A e, para o lote B, menor
valor foi observado no rolo de papel, não diferindo os demais tratamentos entre
si. Comparando-se os lotes de sementes dentro de cada substrato, verificou-se
maior massa seca do sistema radicular para sementes do lote A em rolo de papel
e para sementes do lote B em Plantmax®, não havendo diferenças entre os lotes
de sementes dentro dos substratos sobre papel e areia (Tabela 7).
TABELA 7. Valores médios de comprimento (cm) de parte aérea (CPA),
comprimento (cm) de sistema radicular (CSR) e massa seca (mg)
do sistema radicular (MSSR) de plântulas normais de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, em diferentes substratos
e lotes de sementes (A e B), após 10 dias do início da germinação.
UFLA, Lavras, MG, 2008.
CPA CSR MSSR
Lotes
Substratos
A B A B A B
Rolo de papel
13,18 aA 11,27 abB 12,33 aA 7,63 bB 18,2 aA 7,7 bB
Sobre papel
9,92 bA 9,36 bA 7,20 bA 6,35 bA 15,6 aA 15,8 aA
Plantmax®
11,14 bB 12,69 aA 10,73 aA 11,28 aA 12,9 aB 17,4 aA
Sobre areia
9,56 bA 10,71 bA 6,48 bA 6,15 bA 14,8 aA 16,1 aA
CV (%)
38,25 63,78 82,62
*Médias seguidas por letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, para cada
variável, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (p≤0,05).
74
Quanto à massa seca da parte aérea e sua respectiva relação com o sistema
radicular, a interação dupla entre os lotes de sementes e diferentes substratos não
foi significativa. Maior acúmulo de massa seca da parte aérea foi obtido nas
plântulas germinadas em substrato Plantmax®, e menores valores em substrato
sobre papel. A relação entre massa seca do sistema radicular e parte aérea foi
maior em substrato sobre papel em relação aos demais substratos (Tabela 8 e
Figura 8). Esse teste pode ser usado para se avaliar o crescimento da plântula e
determinar, com maior precisão, a transferência de matéria seca dos tecidos de
reserva para o eixo embrionário na fase de germinação, originando plântulas
com maior peso, em função do maior acúmulo de massa seca (Nakagawa, 1999).
TABELA 8. Valores médios de matéria seca (mg) da parte aérea (MSPA) e
relação de matéria seca do sistema radicular/parte aérea
(MSSR/MSPA) de plântulas normais de Anadenanthera colubrina
(Vell.) Brenan, em diferentes substratos, após 10 dias do início da
germinação. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Substratos MSPA MSSR/MSPA
Rolo de papel 74,7 bc 0,1842 b
Sobre papel 72,2 c 0,2852 a
Plantmax® 104,9 a 0,1817 b
Sobre areia 101,3 ab 0,1758 b
CV (%) 91,70 92,52
*Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey
(p≤0,05).
75
-0,03
-0,01
0,01
0,03
0,05
0,07
0,09
0,11
0,13
12345678
MSSR/ MSPA
Parte aérea
Sistema radicular
Areia
Plantmax®
Rolo
de papel
Sobre
papel
Lote A Lote B
Areia
Plantmax®
Rolo
de papel
Sobre
papel
FIGURA 8. Massa seca de sistema radicular/massa seca de parte aérea
(MSSR/MSPA) de plântulas normais de dois lotes de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, em diferentes substratos,
após 10 dias do início da germinação. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Varela et al. (2005), estudando a germinação de sementes de Acosmium
Nitens (Vog.) Yakovlev (Leguminosae-Caesalpinoideae), relataram que o
substrato papel de filtro mostrou-se prejudicial para a germinação das sementes,
sendo essa nula em temperaturas de 30ºC e 35°C. No entanto, quando se utilizou
temperatura de 30°C juntamente com o substrato vermiculita, obtiveram-se alta
taxa de germinação das sementes (97%) e menor tempo médio de germinação (5
dias). Para o substrato areia, as temperaturas de 20ºC, 25ºC e 30°C
76
proporcionaram maiores porcentagens de germinação, comparadas à temperatura
de 35°C.
Passos et al. (2007) estudaram o efeito do substrato sobre a germinação de
sementes de Mimosa caesalpiniifolia Benth e observaram que não ocorreram
diferenças entre os substratos papel de filtro, areia e algodão, ressaltando-se que
os mesmos apresentaram, em média, 80% de germinação. Em substrato
vermiculita, a germinação foi de 52%. Maior índice de velocidade de
germinação foi obtido com o uso do substrato algodão, resultado que pode ser
atribuído ao fato de o mesmo reter mais umidade. Segundo Figliolia et al.
(1993), o uso da vermiculita mostrou-se inadequado para sementes de M.
caesalpiniifolia. Os autores descrevem, ainda, que sementes dessa espécie são
indiferentes à luz durante a germinação, sendo esse último resultado semelhante
ao obtido neste trabalho para sementes de A. colubrina.
Kissmann et al. (2008) desenvolveram trabalhos com o objetivo de avaliar
a temperatura e os substratos ideais para a germinação de sementes de
Adenanthera pavonina L.. Estes autores observaram maiores valores de
germinação nos substratos sobre papel e em rolo de papel, em média de 86%,
não sendo observada diferença significativa no peso seco das plântulas, em
média de 1,08 g, submetidas a diferentes temperaturas e substratos.
Amaro et al. (2006) estudaram a influência da luz e da temperatura na
germinação de sementes de janaguba (Himatanthus drasticus (Mart.) Plumel.) e
verificaram que as sementes apresentam fotoblastismo neutro; as temperaturas
de 20ºC e 25ºC, combinadas com escuro constante e luz/escuro, e as
temperaturas de 30ºC e 20ºC-35ºC, combinadas com luz/escuro, são as
condições mais favoráveis à germinação. A combinação das temperaturas de
25ºC e 30ºC e a ausência de luz aumentam a velocidade e reduzem o tempo
médio de germinação de sementes dessa espécie.
77
De acordo com Barbosa (1980; 2003), as sementes de A. colubrina var.
cebil têm rápida germinação, são fotoblásticas neutras, com faixa ótima de
temperatura entre 30ºC a 40ºC, com 98% a 100% de germinação. Em campo,
Barbosa (1980) conseguiu 70% a 75% de germinação após sete dias de
observação.
Melo et al. (2005) avaliaram o efeito de diferentes substratos na
germinação de sementes de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan em
condições de laboratório e observaram que a maior porcentagem de germinação
de sementes ocorreu nos substratos entre areia e vermiculita, à temperatura de
30ºC e fotoperíodo de 12 horas. Constataram também que o substrato entre
papel Germitest® apresentou o pior desempenho, com o menor número de
sementes germinadas e o maior de plântulas anormais. Esses autores relataram
que, embora todos os substratos utilizados possuam uma característica em
comum, a de restrição parcial da incidência de luz sobre as sementes, a diferença
pode ser explicada pela baixa termocondutividade do papel Germitest®, o que
fez com que o percentual germinativo deste tratamento fosse significantemente
inferior, quando comparado aos outros.
Resultados obtidos neste trabalho para A. colubrina corroboram os
encontrados por Novembre et al. (2007) para sansão-do-campo (Mimosa
caesalpiniaefolia Benth. – Fabaceae - Mimosoideae), em que a condição mais
favorável para o teste de germinação das sementes foi a temperatura de 30°C,
com o uso dos substratos papel ou vermiculita. O mesmo foi relatato por
Mendonça et al. (2008) para sementes de sacambu (Platymiscium floribundum
Vog.- Papilionoideae), cujo substrato de papel na forma de rolo favoreceu a
germinação de sementes e a formação de plântulas normais, nas temperaturas
constantes de 25ºC, 30ºC e 35ºC.
78
6 CONCLUSÕES
A anatomia seminal de A. colubrina é típica das leguminosas,
especialmente considerando-se a subfamília Mimosoideae. O número de
sementes por fruto é, em média, de 10 e o peso de mil sementes varia de 117 g a
120 g.
A composição química das sementes se caracteriza pela presença de
elevados teores de proteína, seguids de extrato etéreo e baixo conteúdo de
amido.
Sementes de A. colubrina não apresentam dormência tegumentar.
A maior porcentagem de germinação ocorre a 30ºC, 15°C-25ºC e 20°C-
30ºC, sendo as sementes indiferentes à luz e o maior vigor verificado a 30ºC.
A temperatura de 25°C constante contribui para o aumento substancial do
porcentual de plântulas anormais e de sementes mortas, tanto na ausência como
na presença de luz.
Os substratos areia e Plantmax® são eficientes na avaliação do
desenvolvimento de plântulas.
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86
CAPÍTULO III
ASPECTOS DA GERMINAÇÃO in vitro DE EIXOS EMBRIONÁRIOS,
INDUÇÃO DE BROTAÇÕES E CALOGÊNESE EM EXPLANTES DE
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan
87
1 RESUMO
NERY, Fernanda Carlota. Aspectos da germinação in vitro de eixos
embrionários, indução de brotações e calogênese em explantes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan. In:______. Germinação, cultivo in
vitro e tolerância ao congelamento de sementes de angico-vermelho
(Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan). 2008. Cap. 3, p. 87-158. Tese
(Doutorado em Fisiologia Vegetal) - Universidade Federal de Lavras, Lavras.
*
Objetivou-se estudar a germinação in vitro de eixos embrionários, a indução de
brotações e a calogênese em explantes de A. colubrina. Foram testados
diferentes tempos de exposição ao hipoclorito de sódio (2,0% de cloro ativo) e
paraformaldeído na desinfestação de eixos embrionários. A germinação in vitro
de eixos embrionários foi avaliada quanto aos efeitos de diferentes
concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
), BAP (0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e
4,0 mg L
-1
) e meios de cultura (MS e WPM). Para a obtenção de brotações,
segmentos caulinares provenientes de plântulas in vitro foram inoculados em
meio WPM, suplementado com diferentes concentrações de BAP (0,0; 1,0; 2,0;
4,0; 8,0 e 10,0 mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01; 0,1 e 1,0 mg L
-1
), 30,0g L
-1
de sacarose
e 7,0 g L
-1
de ágar. O pH foi corrigido para 5,8. Após a inoculação, os explantes
foram mantidos em sala de crescimento com temperatura média de 25±2ºC, sob
fotoperíodo de 16 horas e irradiância de 36 µmol m
-2
s
-1
. Para o enraizamento
das brotações, o meio de cultura WPM foi suplementado com 30,0 g L
-1
de
sacarose, 7,0 g L
-1
de ágar, 0,1% de carvão ativado e diferentes concentrações de
AIB (0,0; 1,0; 2,0; 5,0; 8,0 e 10,0 mg L
-1
) e caseína hidrolisada (0,0; 0,5; 1,0;
2,0; 4,0 g L
-1
). Foram testadas concentrações de 2,4-D (0,0; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 e
40,0 mg L
-1
) na indução de calogênese a partir de segmentos foliares, caulinares,
cotiledonares e eixos embrionários. Para a aclimatização das plântulas, essas
foram transferidas para tubetes contendo Plantmax®, procedendo-se o estudo
anatômico de folíolos. O uso de paraformaldeído por 120 minutos é eficiente na
desinfestação de eixos embrionários. Todos os meios de cultura testados são
eficientes para a germinação in vitro de eixos embrionários, no entanto, é obtida
baixa taxa de sobrevivência ex vitro. A utilização de BAP promove resposta
eficiente na indução de brotações. O AIB e a caseína hidrolisada nas
concentrações testadas não induzem a rizogênese em brotações. Na ausência de
2,4-D, a calogênese é ausente. Segmentos caulinares, foliares e embrionários são
explantes ideiais para a indução de calogênese.
*
Comitê Orientador: Dr. Amauri Alves de Alvarenga – UFLA (Orientador),
Renato Paiva, PhD – UFLA, José Márcio Rocha Faria, PhD – UFLA, Drª
Cristina Filomena Justo – UFMT (Co-orientadores).
88
2 ABSTRACT
NERY, Fernanda Carlota. Aspects of in vitro germination of embryonic axes,
shoots induction and callus formation in explants of Anadenanthera colubrina
(Vell.) Brenan. In:______. Germination, in vitro cultivation and freezing
tolerance of red angico seeds (Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan). Chap.
3, p. 87-158. Thesis (Doctorate in Plant Physiology) – Federal University of
Lavras, Lavras, MG.
*
It was aimed to study the in vitro germination of embryonic axes, the shoots
induction and callus formation in explants of A. colubrina. It was testes different
periods of exposition to sodium hypochlorite (2,0% of active chlorine) and
Paraformaldehyde in the desinfestation of embryonic axes. The in vitro
germination of embryonic axes was evaluated for the effects of different
concentrations of GA
3
(0.0; 2.0; 4.0; 6.0 and 8.0 mg L
-1
), BAP (0.0; 0.5; 1.0; 2.0
and 4.0 mg L
-1
) and culture medium (MS and WPM). To obtain shoots, stem
segments from in vitro plants were inoculated in WPM medium, supplemented
with different concentrations of BAP (0.0; 1.0; 2.0; 4.0; 8.0 and 10.0 mg L
-1
) and
NAA (0.0; 0.01; 0.1 and 1.0 mg L
-1
), 30.0g L
-1
of sucrose and 7.0 g L
-1
of agar.
The pH was adjusted to 5.8. After inoculation, the explants were kept in growth
room with an average temperature of 25 ± 2ºC, photoperiod of 16 h and
irradiance of 36 µmol m
-2
s
-1
. For the shoots rooting the culture medium WPM was
supplemented with 30.0 g L
-1
of sucrose, 7.0 g L
-1
of agar, 0.1% of activated
charcoal and different concentrations of IBA (0.0; 1.0; 2.0; 5.0; 8.0 and 10.0 mg
L
-1
) and hydrolyzed casein (0.0; 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 g L
-1
). It was tested
concentrations of 2,4-D (0.0; 1.0; 5.0; 10.0; 20.0 and 40.0 mg L
-1
) in the callus
induction from leaves segments, cotyledons and embryonic axes. For the
seedlings acclimatization, they were transferred to tubes containing Plantmax®,
following the anatomical studies of the leaflets. The use of Paraformaldehyde
during 120 minutes is effective to the embryonic axes desinfestation. All the
culture medium tested are efficient to the in vitro germination of embryonic
axes, however it is verified a low ex vitro surviving rate. The use of BAP
promotes an effective response of shoots induction. The IBA and hydrolyzed
casein in the concentrations tested, did not induced the shoots rooting. In the
absence of 2,4-D, did not occurred the callus formation. Stem, leaves and
embryonic segments are ideal to induce callus formation.
*
Adviser Comitee: Dr. Amauri Alves de Alvarenga – UFLA (Adviser), Renato
Paiva, PhD – UFLA, José Márcio Rocha Faria, PhD – UFLA, Drª Cristina
Filomena Justo – UFMT (Co-advisers).
89
3 INTRODUÇÃO
O cultivo in vitro de células, tecidos e órgãos vegetais consiste de um
conjunto de técnicas por meio das quais um explante é isolado e cultivado sob
condições assépticas, em um meio nutritivo artificial (Pasqual et al., 1998).
Essas técnicas podem ser importantes ferramentas para uma rápida e eficiente
propagação de espécies, dentre elas a Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan,
pertencente à subfamília Mimosoideae (Fabaceae), conhecida popularmente
como angico-vermelho.
A micropropagação vem sendo utilizada na produção em escala
comercial para a obtenção de mudas uniformes e sadias em curto espaço de
tempo. Contudo, a aplicação em larga escala da propagação in vitro ainda é
limitada para a maioria das espécies lenhosas de interesse econômico, por
apresentar sérios problemas, como contaminação, oxidação do meio de cultura,
baixa taxa de enraizamento (Jordan, 1988), multiplicação dos brotos e abscisão
foliar provocada pelo acúmulo de etileno (Rasai et al., 1994; Zobayed et al.,
2002; Nepomuceno et al., 2007).
A germinação de sementes in vitro tem sido utilizada como técnica de
suporte aos processos de micropropagação, sem perda da variabilidade genética
(Gomes, 2007). Embriões excisados no estádio maduro ou próximo a este são
quase autotróficos. Em geral, dependendo da espécie, não há a necessidade de
suplementação de fonte de energia, uma vez que os embriões podem germinar e
crescer num meio inorgânico, em que os reguladores de crescimento se tornam
dispensáveis (Hu & Ferreira, 1998, Ledo et al., 2007).
Segundo Ferreira (2000), a falta de informações básicas sobre espécies
nativas dificulta o andamento de pesquisas que visam à conservação das
espécies e à multiplicação in vitro. A inclusão das espécies nativas em
programas de conservação ainda é limitada e ajustes de protocolos envolvendo a
90
composição dos meios de cultura, até fatores físicos, como temperatura e
luminosidade, são fundamentais para o favorecimento da germinação in vitro
(Gomes, 2007).
Para que a plântula formada a partir da germinação in vitro possa ser fonte
confiável de explantes, os métodos de desinfestação devem ser eficazes,
proporcionando total ausência de agentes patológicos (Nascimento et al., 2007).
Diversas substânticas com ação germicida podem ser utilizadas para
desinfestação, tais como cloreto de mercúrio, peróxido de hidrogênio,
mertiolate, nitrato de prata e etanol, bem como compostos à base de cloro, como
hipoclorito de sódio (NaOCl) e de cálcio. São necessários estudos sobre agentes
de desinfestação para diminuir os custos e o impacto ambiental do laboratótio de
cultivo vegetal in vitro (Fior et al., 2005).
O paraformaldeído (H-CHO)n, utilizado na desinfestação, é um polímero
sólido do formaldeído comercializado em drágeas, que o liberam em forma
gasosa. O gás (H-CHO) é incolor, caústico para pele e mucosas e possui um
odor característico, mesmo em mínimas concentrações. Sob temperatura
ambiente, a liberação do paraformaldeído é menor, requerendo níveis térmicos
elevados para ampliar o efeito esterilizante (Graziano et al., 1989). Segundo Fior
et al. (2000), poucos são os trabalhos que relacionam o emprego do
paraformaldeído no cultivo de tecidos vegetais.
O metabolismo do nitrogênio está envolvido nos processos fisiológicos e
bioquímicos associados ao controle de crescimento, diferenciação e
morfogênese, sendo o N um nutriente de grande importância para a maioria das
espécies cultivadas in vitro. A caseína hidrolisada é uma das principais fontes de
suplementação deste elemento no cultivo in vitro de orquídeas, cana-de-açúcar e
cravo (Vieira et al., 2007). Segundo De Lucca (2003), a qualidade da cultura é
afetada consideravelmente na ausência de caseína hidrolisada, reduzindo a
91
capacidade regenerativa da planta, quando empregada na indução e na
multiplicação de calos embriogênicos somáticos de milho.
Sistemas de cultura de calos e células vegetais representam uma fonte
potencial de valiosos metabólitos medicinais, flavorizantes, essências e corantes
que não podem ser produzidos por células microbianas ou por síntese química.
Todavia, atualmente, poucas culturas produzem esses compostos em quantidades
úteis comercialmente, sendo necessários estudos sobre a indução de calos,
visando trabalhos futuros na ativação de moléculas secundárias in vitro (Pereira
et al., 2007).
A capacidade de indução da desdiferenciação celular é uma das mais
importantes características exploradas no cultivo in vitro das plantas. A indução
de calos em explantes de A. colubrina poderá ser utilizada para definir uma rota
de multiplicação pela via embriogênica ou morfogênica, visando à sua
conservação, à semelhança do que se tem verificado com outras lenhosas (Jain et
al., 1998). A maximização da produção de calos regenerativos requer a
consideração de vários fatores, como a composição do meio de cultura, a escolha
do tipo de explante e as condições de ambiente de cultivo. Para a proliferação de
calos e a indução de células para qualquer rota morfogenética, é necessária a
utilização de reguladores de crescimento, que atuem na retomada mitótica de
tecidos diferenciados (Sondahl et al., 1985). Dentre as auxinas, o ácido 2,4
diclorofenoxiacético (2,4-D) tem sido reportado como regulador de crescimento
sintético mais adequado à indução e à manutenção de calos, para as mais
diversas espécies vegetais cultivadas in vitro (Gamborg et al., 1976; Nascimento
et al., 2007).
O aprimoramento do protocolo de germinação in vitro e o ajuste de uma
metodologia de multiplicação de plântulas permitirão elevar os percentuais de
plântulas emergidas, viabilizando a produção de mudas. Esta iniciativa pode ser
expandida para várias espécies endêmicas e ou ameaçadas de extinção, nas quais
92
se detecte a necessidade de formas complementares de propagação, de modo a
garantir a conservação dos recursos florestais.
Nesse contexto, objetivou-se, com a realização deste trabalho, estudar
alguns aspectos da germinação in vitro de eixos embrionários e a indução de
brotações e calogênese em explantes de Anadenanthera colubrina (Vell.)
Brenan.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
Sementes de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan foram coletadas no
chão, na época da dispersão, de agosto a setembro de 2007, em,
aproximadamente, 50 árvores matrizes localizadas no campus da Universidade
Federal de Lavras (UFLA). As sementes foram armazenadas em câmara fria
(8ºC e 45%UR), em embalagens de polietileno, no Laboratório de Sementes
Florestais, no Departamento de Ciências Florestais (UFLA). Em seguida, os
experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos, Setor de
Fisiologia Vegetal, no Departamento de Biologia (UFLA).
4.2 Efeito do tempo de exposição ao hipoclorito de sódio (NaOCl) e a
drágeas de paraformaldeído na desinfestação de eixos embrionários
Após a excisão do eixo embrionário das sementes de A. colubrina, esses
foram submetidos a testes de desinfestação.
O procedimento padrão de desinfestação constituiu-se de imersão em
etanol 70%, por 30 segundos, seguida de imersão em NaOCl (água sanitária da
93
marca Qboa, com 2,0% a 2,5% de cloro ativo) em diferentes tempos, 5, 10 e 15
minutos. Posteriormente, os eixos embrionários foram lavados três vezes em
água destilada e autoclavada, em câmara de fluxo laminar.
A desinfestação com paraformaldeído foi realizada à temperatura
ambiente (±26ºC), mantendo-se os eixos embrionários em placas de Petri de 7
cm, estéreis e lacradas, com duas drágeas de 500 mg de paraformaldeío 80%
procedente da empresa Anteres Química e Farmaceútica Ltda. Foram testados
diferentes intervalos de tempos de exposição, de 5, 30, 60 e 120 minutos.
Na seqüência aos tratamentos, os eixos embrionários foram
imediatamente inoculados em tubos de ensaio contendo meio de cultura MS
(Murashige & Skoog, 1962), com metade da concentração dos sais,
suplementado com 30,0 g L
-1
de sacarose. O meio foi solidificado com ágar 4,0
g L
-1
e o pH foi corrigido para 5,8, antes da autoclavagem a 120ºC e pressão de
1,0 atm por 20 minutos.
Após a inoculação, os eixos embrionários foram mantidos em sala de
crescimento sob irradiância de fótons de 36 µmol m
-2
s
-1
, fotoperíodo de 16 horas
e temperatura de 25±2ºC. A avaliação foi realizada após 10 dias de incubação,
sendo contabilizado o número de eixos embrionários contaminados, oxidados e
germinados, tendo como critério de germinação a formação de plântulas
normais, com parte aérea e sistema radicular completamente desenvolvidos.
Os resultados foram analisados utilizando-se o delineamento
inteiramente casualizado, com dez repetições por tratamento, sendo cada
repetição composta por um tubo de ensaio contendo um eixo embrionário.
Foi utilizada a metodologia de modelos lineares generalizados por meio
da procedure GENMOD do pacote estatístico SAS® (1999). Os dados
caracterizaram-se por apresentarem distribuição binomial (presença ou ausência
da característica,) sendo utilizada, como função de ligação, a função logística
(
η
), dada por:
94
12
ln
i
i
ii
tempo
m
μ
ηββ
μ
⎛⎞
==+
⎜⎟
−
⎝⎠
Foram utilizados dois modelos de regressão logística quando se avalia a
presença ou a ausência de contaminação, sendo a equação (1) para os dados
referentes ao uso de drágeas de paraformaldeído e a equação (2), para o uso de
NaOCl.
O modelo logístico para o uso de paraformaldeído foi dado por:
1,1543 0,0342
1,1543 0,0342
11
i
i
tempo
i
tempo
ee
ee
η
η
μ
−
−
==
++
(equação 1)
O modelo logístico para o NaOCl foi dado por:
25,2186 5,3210
25,2186 5,3210
11
i
i
tempo
i
tempo
ee
ee
η
η
μ
−
−
==
++
(equação 2)
Para a ocorrência de oxidação dos eixos embrionários pelo uso de
NaOCl, a proporção de oxidação foi dada pelo modelo exposto na equação 3:
4,1091 0,2626
4,1091 0,2626
11
i
i
tempo
i
tempo
ee
ee
η
η
μ
−
−
==
++
(equação 3)
4.3 Germinação in vitro de eixos embrionários
4.3.1 Efeito de GA
3
e meios de cultura
Os eixos embrionários foram desinfestados por 120 minutos, em placas
de Petri lacradas, contendo duas drágeas de paraformaldeído e inoculados em
tubos de ensaio contendo os diferentes tratamentos.
Foram testadas concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
), em
meios de cultura MS e WPM (Lloyd & McCown, 1980), suplementadas com
95
3,0% de sacarose e solidificadas com ágar 0,4%. O pH foi corrigido para 5,8
antes da autoclavagem a 120°C e pressão de 1,0 atm, durante 20 minutos.
Após a inoculação, os eixos embrionários foram mantidos em sala de
crescimento sob irradiância de 36 μmol m
-2
s
-1
, fotoperíodo de 16 horas e
temperatura de 25±2°C. A avaliação foi realizada aos 35 dias de incubação,
sendo observada a porcentagem de germinação. Como critério de germinação,
considerou-se a protrusão radicular com ±2,0 mm.
A formação de plântulas obtida de eixos embrionários germinados in vitro
em diferentes concentrações de GA
3
foi avaliada observando-se as seguintes
características: comprimento da raiz principal, número de raízes secundárias,
formação de calos na raiz, comprimento da parte aérea, número de brotações,
comprimento da maior brotação, número de gemas e abscisão foliar, em cada
tratamento.
O experimento foi instalado segundo um delineamento inteiramente
casualizado com 15 repetições, em que os tratamentos constituíram-se de dois
meios de cultura (MS e WPM) e diferentes concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0;
6,0 e 8,0 mg L
-1
). Para as características comprimento da raiz principal, número
de raízes secundárias, formação de calos na raiz, comprimento da parte aérea,
número de brotações, comprimento da maior brotação e número de gemas, foi
utilizada a metodologia de modelos lineares generalizados com o procedure
GENMOD do pacote estatístico SAS® (1999).
Os dados de ocorrência de abscisão foliar e formação de calos na raiz
caracterizaram-se por apresentar distribuição binomial (presença ou ausência da
característica), tendo sido utilizada, como função de ligação, a função logística
(
η
), dada por:
ln
i
ii
m
μ
η
μ
⎛⎞
=
⎜⎟
−
⎝⎠
96
Pela análise de Deviance para proporção de abscisão foliar em plântulas in
vitro crescidas nos meios de cultura MS e WPM, obtiveram-se, respectivamente,
os seguintes modelos:
. para o meio de cultura MS:
0,2385 0,0564
0,2385 0,0564
11
i
i
concentraçao
i
concentraçao
ee
ee
η
η
μ
−−
−−
==
+
+
%
%
;
. para o meio de cultura WPM:
1,4679 0,2817
1,4679 0,2817
11
i
i
concentraçao
i
concentraçao
ee
ee
η
η
μ
−+
−+
==
++
%
%
.
No que diz respeito à formação de calos em raiz de plântulas in vitro na
presença de diferentes concentrações de GA
3
, foi utilizado, independente do
meio de cultura utilizado, o seguinte modelo logístico:
0,2835 0,4308
0,2835 0,4308
11
concentraçao
concentraçao
ee
ee
η
η
μ
−−
−−
==
++
%
%
Os dados de número de raízes secundárias, número de brotações e
número de gemas caracterizaram-se por apresentar distribuição de Poisson
(contagem), sendo utilizada, como função de ligação, a função logarítmica (
η
),
dada por:
(
)
ln
i
η
μ
=
Obteve-se, para o meio de cultura MS, o seguinte modelo modelo log-
linear, para o número de raízes secundárias:
2
2,2971 0,4834 0,0485concentraçao concentraçao
ee
η
μ
−+
==
%%
Para a contagem média de número de brotações formadas em plântulas in
vitro, obtiveram-se, para os meios MS e WPM, os seguintes modelos:
Para o meio MS, o modelo log-linear foi dado por:
23
1,0980 1,5407 0,6938 0,0771
i
concentraçao concentraçao concentraçao
i
ee
η
μ
−− + −
==
%% %
%
Para o meio WPM, o modelo log-linear foi dado por:
23
0,6589 0,9324 0,3451 0,0295
i
concentraçao concentraçao concentraçao
i
ee
η
μ
−+ − +
==
%%
97
No que diz respeito ao número de gemas formadas em plântulas in vitro,
foram obtidos os seguintes modelos:
. para o meio MS:
23
0,0645 3,0941 1,4582 0,1648
i
concentraçao concentraçao concentraçao
i
ee
η
μ
−+ −
==
%% %
%
;
. para o meio WPM:
23
1,2482 0,2711 0,1179 0,0104
i
concentraçao concentraçao concentraçao
i
ee
η
μ
+− +
==
%%
.
Os dados de comprimento da raiz principal e comprimento de parte aérea
foram ajustados a um modelo paramétrico segundo um delineamento
inteiramente casualizado com diferentes números de repetições por tratamento.
Os tratamentos foram arranjados em um esquema fatorial 2 x 5 (2 meios de
cultura e 5 concentrações de GA
3
). O modelo estatístico que descreve as
observações foi dado por:
ijk i j ij ijk
ymcmc
μ
ε
=
+++ +
em que:
ijk
y
é o valor da variável dependente na k-ésima repetição que recebeu o i-ésimo
meio de cultura e j-ésima concentração de GA
3
, com k = 1, ..., r;
μ
é uma constante inerente a cada observação;
i
m é o efeito do i-ésimo meio de cultura, com i = 1, 2;
j
c é o efeito da j-ésima concentração de GA
3
, com j = 1, ...,5;
ij
mc é o efeito da interação entre o i-ésimo meio de cultura e a j-ésima
concentração de GA
3
;
ijk
ε
é o erro experimental associado à parcela, independente e identicamente
distribuído de uma Normal com média zero e variância
2
σ
.
Os dados de comprimento da maior brotação foram ajustados a um
modelo paramétrico segundo um delineamento inteiramente casualizado com
98
diferentes números de repetições por tratamento. Os tratamentos foram
arranjados em um esquema hierárquico, em que as concentrações de GA
3
estavam hierarquizadas nos meio de cultura. O modelo estatístico que descreve
as observações foi dado por:
()
ijk i ijk
ji
ymc
μ
ε
=
++ +
em que:
ijk
y
é o valor da variável dependente na k-ésima repetição que recebeu o i-ésimo
meio de cultura e j-ésima concentração de GA
3
, com k = 1, ..., r;
μ
é uma constante inerente a cada observação;
i
m é o efeito do i-ésimo meio de cultura, com i = 1, 2;
()
ji
c
é o efeito da j-ésima concentração de GA
3
dentro do i-ésimo meio de
cultura, com j = 1, ..., J;
ijk
ε
é o erro experimental associado à parcela, independente e identicamente
distribuído de uma Normal com média zero e variância
2
σ
.
4.3.2 Efeito de BAP e meios de cultura
Os eixos embrionários foram desinfestados por 120 minutos, em placas
de Petri lacradas, contendo duas drágeas de paraformaldeído e inoculados em
tubos de ensaio contendo os diferentes tratamentos.
Foram testadas concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg L
-1
) e
os meios de cultura MS e WPM, suplementados com 30,0 g L
-1
de sacarose e
solidificados com ágar 4,0 g L
-1
. O pH foi corrigido para 5,8, antes da
autoclavagem a 120°C e pressão de 1,0 atm, por 20 minutos.
Após a inoculação, os eixos embrionários foram mantidos em sala de
crescimento sob irradiância de 36 μmol m
-2
s
-1
, fotoperíodo de 16 horas e
temperatura de 25±2°C. A avaliação foi realizada aos 35 dias de incubação,
99
sendo observada a porcentagem de germinação. Como critério de germinação,
considerou-se a protrusão radicular com ±2,0 mm.
A formação de plântulas obtidas de eixos embrionários germinados in
vitro em diferentes concentrações de BAP foi avaliada observando-se as
seguintes características: comprimento da raiz principal, número de raízes
secundárias, formação de calos na raiz, comprimento da parte aérea, número de
brotações, comprimento da maior brotação, número de gemas e abscisão foliar,
em cada tratamento.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado,
com 15 repetições por tratamento, sendo cada uma composta por um tubo de
ensaio e cada tubo contendo um eixo embrionário.
Para as variáveis: número de gemas, número de brotações, abscisão
foliar e formação de calos na raiz, foram utilizadas as metodologias de modelos
lineares generalizados com o procedure GENMOD do pacote estatístico SAS®
(1999).
Para o número de brotações, obteve-se o seguinte modelo, independente
do meio de cultura:
2
0,5870 0,6918 0,1494concentraçao concentraçao
ee
η
μ
−+ −
==
%%
Os dados de abscisão foliar e formação de calos na raiz caracterizaram-
se por apresentar distribuição binomial (presença ou ausência da característica),
sendo utilizada, como função de ligação, a função logística (
η
), dada por:
ln
i
ii
m
μ
η
μ
⎛⎞
=
⎜⎟
−
⎝⎠
Para as diferentes concentrações de BAP em meio MS, obteve-se, para a
formação de calos, o seguinte modelo logístico:
2
2
2,6395 2,7791 0,4736
2,6395 2,7791 0,4736
1
1
concentraçao concentraçao
concentraçao concentraçao
ee
e
e
η
η
μ
−+ −
−+ −
==
+
+
%%
%%
100
Os dados de número de gemas e número de brotações caracterizaram-se
por apresentar distribuição de Poisson (contagem), sendo utilizada, como função
de ligação, a função logarítmica (
η
), dada por:
(
)
ln
i
ημ
=
A análise de Deviance para o número de gemas mostra, para os meios de
cultura MS e WPM, os seguintes modelos log-lineares:
Para o meio MS:
23
0,2126 3,5287 1,9764 0,2917
i
concentraçao concentraçao concentraçao
i
ee
η
μ
−+ − +
==
%% %
E para o meio WPM:
2
1,2512 0,3195 0,0894
i
concentraçao concentraçao
i
ee
η
μ
+−
==
%%
Os dados de comprimento da raiz principal, comprimento de parte aérea e
comprimento da maior brotação foram ajustados por modelos paramétricos
segundo um delineamento inteiramente casualizado com diferentes números de
repetições por tratamento. Os tratamentos estavam arranjados em um esquema
fatorial 2 x 5 (2 meios de cultura e 5 concentrações de BAP). O modelo
estatístico que descreve as observações foi dado por:
ijk i j ij ijk
ymcmc
μ
ε
=
+++ +
em que:
ijk
y
é o valor da variável dependente na k-ésima repetição que recebeu o i-ésimo
meio de cultura e j-ésima concentração de BAP, com k = 1, ..., r;
μ
é uma constante inerente a cada observação;
i
m é o efeito do i-ésimo meio de cultura, com i = 1, 2;
j
c é o efeito da j-ésima concentração de BAP, com j = 1, ...,5;
ij
mc
é o efeito da interação entre o i-ésimo meio de cultura e a j-ésima
concentração de BAP;
101
ijk
ε
é o erro experimental associado à parcela, independente e identicamente
distribuído de uma Normal com média zero e variância
2
σ
.
4.4 Efeito do BAP e ANA na indução de brotações
Segmentos nodais de plântulas de A. colubrina obtidas da germinação in
vitro de eixos embrionários, em meio MS, foram utilizados como fonte de
explantes.
Segmentos nodais contendo até duas gemas laterais foram inoculados em
meio de cultura MS, suplementado com diferentes concentrações de BAP (0,0;
1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 10,0 mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01; 0,1 e 1,0 mg L
-1
). Foram
utilizados 30,0 g L
-1
de sacarose e 6,0 g L
-1
de ágar. O pH foi ajustado para 5,8,
antes da autoclavagem a 120°C e pressão de 1,0 atm, por 20 minutos.
Após a inoculação, os tubos foram vedados com tampas e filmes plásticos
e mantidos em sala de crescimento, a 25±2°C, irradiância de fótons de 36 μmol
m
-2
s
-1
e fotoperíodo de 16 horas. A avaliação foi realizada aos 30 dias após a
inoculação, considerando-se as seguintes características: número de brotações e
gemas por explante, comprimento da maior brotação e presença de calos na base
dos explantes.
Os resultados foram analisados utilizando-se o delineamento inteiramente
casualizado com 10 repetições por tratamento, sendo cada repetição composta
por um tubo de ensaio contendo um explante.
Com relação ao número de brotações e gemas produzidas, ajustaram-se
modelos log-lineares, cujas equações descrevem a resposta média de cada
variável analisada.
A análise de Deviance revelou que os dados de número de brotações por
segmento nodal seguem os seguintes modelos log-lineares:
102
Em função das concentrações de BAP:
23
0,9493 0,5114 0,0852 0,0038BAP BAP BAP
ee
η
μ
−+ − +
==
e em função das concentrações de ANA:
0,1400 1,3889
A
NA
ee
η
μ
−−
==
Pela análise de Deviance para o número de gemas por segmento nodal,
obtiveram-se os seguintes modelos log-lineares, em função das concentrações de
BAP:
.para a concentração 0,0 mg L
-1
de ANA:
23
0,2970 1,0780 0,1741 0,0075
i
BAP BAP BAP
i
ee
η
μ
−+ − +
==
;
. para a concentração 0,01 mg L
-1
de ANA:
23
0,4754 0,6280 0,1588 0,0093
i
BAP BAP BAP
i
ee
η
μ
+− +
==
;
.para a concentração 0,1 mg L
-1
de ANA:
23
0,1846 1,0904 0,2883 0,0182
i
BAP BAP BAP
i
ee
η
μ
+− +
==
;
.para a concentração 1,0 mg L
-1
de ANA:
23
0,0604 0,0551 0,0365 0,0035
i
BAP BAP BAP
i
ee
η
μ
−− +
==
Para o número de gemas por explantes, em função das concentrações de
ANA, foram obtidos os seguintes modelos log-lineares:
.para a concentração 0,0 mgL
-1
de BAP:
2
0,3320 1,9432 2,3053
i
ANA ANA
i
ee
η
μ
−+ −
==
;
.para a concentração 1,0 mgL
-1
de BAP:
2
1,1103 0,0178 0,3863
i
A
NA ANA
i
ee
η
μ
+−
==
;
.para a concentração 2,0 mgL
-1
de BAP:
2
1,1054 5,1184 6,9170
i
A
NA ANA
i
ee
η
μ
+−
==
;
103
.para a concentração 4,0 mgL
-1
de BAP:
2
1,4083 8,4752 5,4642
i
A
NA ANA
i
ee
η
μ
−+
==
;
.para a concentração 8,0 mgL
-1
de BAP:
2
0,8415 7,0438 5,8467
i
A
NA ANA
i
ee
η
μ
−+
==
;
.para a concentração 10,0 mgL
-1
de BAP:
2
0,3543 1,1739 0,0958
i
A
NA ANA
i
ee
η
μ
−−
==
.
No que diz respeito à presença de calos na base dos explantes, e por ser a
variável de interesse dicotômica, apresentaram-se dois possíveis resultados
(SIM/NÃO) e realizou-se o ajuste de um modelo de regressão logística. A
qualidade dos modelos foi estimada via teste qui-quadrado de Person e análise
de Deviance
(Balakrishnan, 1992), respectivamente.
O modelo logístico utilizado para a análise estatística da proporção de
formação de calos na base dos explantes foi dado pela equação abaixo, em
função das concentrações de BAP:
0,4402 1,0007
0,4402 1,0007
11
BAP
B
AP
ee
ee
η
η
μ
+
+
==
++
Para a proporção de formação de calos na base do explante, em função
das concentrações de ANA, foi obtido o seguinte modelo logístico:
1,4702 8,5806
1,4702 8,5806
11
ANA
A
NA
ee
ee
η
η
μ
+
+
==
++
Com relação ao comprimento da maior brotação, foi feito o ajuste de um
modelo paramétrico segundo um delineamento inteiramente casualizado com os
tratamentos em esquema fatorial 6 x 4 (6 concentrações de BAP e 4
concentrações de ANA). O modelo estatístico que descreveu os dados foi o
seguinte:
ijk i j ij ijk
yBABA
μ
ε
=+ + + +
104
em que:
ijk
y
é o valor da variável dependente na k-ésima repetição, i-ésima
concentração de BAP e j-ésima concentração de ANA;
μ
é uma constante inerente a cada onservação;
i
B
é o efeito da i-ésima concentração de BAP, com i = 1, ..., 6;
j
A
é o efeito da j-ésima concentração de ANA, com i = 1, ..., 4;
ij
B
A é o efeito da interação entre a i-ésima concentração de BAP e j-ésima
concentração de ANA;
ijk
ε
é o erro experimental associado à parcela independente e
identicamente distribuído de uma Normal com média zero e variância
2
σ
.
4.5 Efeito do 2,4-D na indução de calos em diferentes explantes
Plântulas oriundas da germinação in vitro de eixos embrionários de A.
colubrina serviram como fonte de explantes caulinares e foliares para este
experimento. Foram utilizados, ainda, explantes cotiledonares e eixos
embrionários obtidos de sementes de A. colubrina.
Como protocolo de desinfestação dos cotilédones e eixos embrionários,
foram utilizadas placas de Petri contendo duas drágeas de 500 mg
paraformaldeído 80%, por um tempo de exposição de 120 minutos.
Segmentos foliares, caulinares e cotiledonares, com área de 1,0 cm
2
e
eixos embrionários foram inoculados em tubos de ensaio contendo meio de
cultura WPM (Lloyd & McCown, 1980), suplementados com diferentes
concentrações de 2,4-D (0,0; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 e 40,0 mg L
-1
) e 30,0 g L
-1
de
sacarose. Os meios foram solidificados com 6,0 g L
-1
de ágar e o pH foi
105
corrigido para 5,8, antes da autoclavagem a 120°C e pressão de 1,0 atm, por 20
minutos.
Apenas nos segmentos cotiledonares foram efetuados cortes nas
superfícies adaxial e abaxial dos explantes. A incubação foi realizada no escuro,
sob temperatura de 25±2ºC.
A avaliação (visual) foi realizada 30 dias após a inoculação, observando-
se a percentagem da área dos explantes ocupada por calos nos diferentes
tratamentos.
Os resultados foram analisados utilizando-se o delineamento
inteiramente casualizado, com dez repetições por tratamento, sendo cada
repetição composta por um tubo de ensaio, contendo um explante. Para uma
melhor visualização dos resultados e para comparar quais tratamentos diferiram
entre si, foi utilizada a construção de gráficos do tipo Box-Plot, segundo
recomendação de Bussab & Morettin (1987).
4.6 Efeito do AIB e da caseína hidrolisada no enraizamento in vitro de
brotações
Brotações obtidas de segmentos nodais de plântulas in vitro de A.
colubrina, após um período de 30 dias em meio de cultura MS sem a presença
de fitorreguladores, foram inoculadas em meio de cultura MS contendo
diferentes concentrações de AIB (0,0; 1,0; 2,0; 5,0; 8,0 e 10,0mg L
-1
) e caseína
hidrolisada (0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 g L
-1
), e suplementado com 30,0 g L
-1
de
sacarose e 1,0 g L
-1
de carvão ativado. O meio foi solidificado com 6,0 g L
-1
de
ágar e seu pH foi ajustado para 5,8, antes da autoclavagem a 120°C e pressão de
1,0 atm, por 20 minutos.
Após a inoculação, os explantes foram mantidos em sala de crescimento
à temperatura de 25±2°C e na ausência de luz, por 15 dias. Decorrido esse
106
período, foram transferidos para meio de cultura MS, com metade da
concentração dos sais, sem reguladores de crescimento e ausência de carvão
ativado. Trinta dias depois, a formação de raízes nos diferentes tratamentos foi
avaliada. Foram utilizadas 12 repetições por tratamento, sendo cada repetição
composta por um tubo de ensaio, contendo uma brotação.
4.7 Aclimatização de plântulas de A. colubrina
Plântulas obtidas por meio da germinação in vitro de eixos embrionários
de A. colubrina, com 45 dias de idade, foram transferidas diretamente para
tubetes contendo 250 mL de Plantmax®, envoltas com embalagem plástica
transparente, para a manutenção da umidade relativa no ambiente. As
embalagens plásticas tiveram suas pontas cortadas em intervalos de 7 dias, até a
completa remoção aos 21 dias. Os tubetes foram mantidos em sala de
crescimento sob temperatura controlada de 25±2°C e irradiância de fótons de 67
μmol m
-2
s
-1
. As plântulas foram regadas, de acordo com a necessidade, com
meio líquido MS, com metade das concentrações dos sais.
Aos 30 dias, foi realizada a avaliação de sobrevivência das plântulas. Os
resultados foram analisados seguindo o delineamento inteiramente casualizado
com 30 repetições, sendo cada repetição composta por um tubete contendo uma
plântula.
4.8 Anatomia foliar em plântulas in vitro
Os estudos anatômicos foram realizados no Laboratório de Anatomia
Vegetal no Departamento de Biologia (UFLA), a partir de plântulas cultivadas
em meios de cultura MS. Folíolos completamente expandidos, localizados na
região mediana do terço superior das plântulas cultivadas in vitro, foram
107
coletados e fixados em álcool etílico 70% (v/v), segundo Johansen (1940). Em
seguida, foi realizada a clarificação dos cortes em solução de hipoclorito de
sódio 20% (v/v do produto comercial), por um período de cinco minutos,
seguida de três lavagens em água destilada. A coloração dos cortes anatômicos
foi efetuada utilizando-se uma mistura de azul de astra e safranina na proporção
de 7:3, segundo os métodos descritos por Kraus & Arduin (1997).
Posteriormente, foram preparadas lâminas semipermanentes em água glicerinada
(1:1), lutadas com esmalte sintético.
As seções paradérmicas foram montadas entre lâmina e lamínula,
diretamente com a solução corante (safranina 1% em água glicerinada) e
observadas em microscópio Olympus CBB com auxílio de câmara clara, com
documentação fotográfica realizada utilizando-se máquina digital Cânon®, para
as avaliações da densidade estomática e medições dos diâmetros polar e
equatorial, segundo técnica de Laboriau et al. (1961).
As medições de densidade estomática e diâmetro polar e equatorial dos
estômatos foram realizadas seguindo um delineamento inteiramente casualizado,
com 25 repetições. Cada repetição foi composta por três medidas para a
densidade estomática e diâmetros polar e equatorial dos estômatos.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Efeito do tempo de exposição ao hipoclorito de sódio (NaOCl) e a
drágeas de paraformaldeído na desinfestação de eixos embrionários
Houve diferença significativa quando se avaliou a proporção de
contaminação dos eixos embrionários inoculados in vitro. Essa diferença
108
também foi verificada em função do tempo de exposição do eixo embrionário
aos agentes desinfestantes (Anexo 1A).
Os modelos ajustados com as estimativas das proporções de
contaminação dos eixos embrionários, quando da utilização de NaOCl e
presença de drágeas de paraformaldeído, estão apresentados na Figura 1.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 102030405060708090100110120
Te mpo ( minutos )
Contaminação (proporção)
Paraformaldeído obs. Paraformaldeído est.
N
aOCl obs.
N
aOCl est.
FIGURA 1. Valores observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo logístico
para a probabilidade de contaminação com o uso NaOCl e
paraformaldeído, ao longo do tempo de exposição do eixo
embrionário a cada desinfestante. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Quando se avaliou a ocorrência de oxidação dos eixos embrionários na
presença de paraformaldeído, notou-se uma resposta nula em todos os tempos de
exposição testados. Os modelos ajustados com as estimativas das proporções de
oxidação dos eixos embrionários, quando da utilização de NaOCl, são mostrados
na Figura 2. Pôde-se observar que quanto maior foi o tempo de exposição do
eixo embrionário ao NaOCl, maior foi a proporção de oxidação do material.
109
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
5 6 7 8 9 101112131415
Te mpo (minutos)
Oxidação (proporção)
NaOCl obs. NaOCl est.
FIGURA 2. Valores observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo logístico
quando quando foi utilizado NaOCl na desinfestação de eixos
embrionários, ao longo do tempo de exposição. UFLA, Lavras,
MG, 2008.
Avaliou-se, ainda, a germinação dos eixos embrionários, tendo como
critério a formação de plântulas normais. A produção média de plântulas
normais foi de 82%, quando se utilizou paraformaldeído na desinfestação de
eixos embrionários. Quando foi utilizado NaOCl como desinfestante, não foi
observada nenhuma formação de plântulas normais, ou seja, 100% de ocorrência
de plântulas anormais. Essas respostas não diferiram ao longo do tempo de
exposição em cada desinfestante testado.
Resultados contrários aos obtidos neste trabalho foram relatados por Fior
et al. (2005) que constataram que a incidência de oxidação aumentou com o
tempo de exposição de segmentos nodais de Limonium platyphyllum Lincz. ao
paraformaldeído, tendo sido observado 42% de explantes oxidados, com tempo
de exposição de 20 horas. Esses mesmos autores relataram que as prováveis
110
causas dessa oxidação poderiam ser o efeito prejudicial do tempo prolongado de
exposição ao paraformaldeído e a desidratação do tecido.
Por outro lado, Fior et al. (2001) relataram resultados semelhantes aos
obtidos neste trabalho para A. colubrina. Os autores verificaram que
o uso do
paraformaldeído, por duas horas em
Limonium platyphyllum Lincz., eliminou a
contaminação por fungos, porém, interferiu na regeneração de brotações do
material in vitro. Entretanto, Borges et al. (2005) relataram, ao comparar
esses
mesmos agentes de desinfestação (NaOCl e paraformaldeído), que esse último,
no tempo de exposição de duas horas, causou menores danos genéticos a
sementes de cebola.
Santos (2005) também relata que o uso de NaOCl, apesar de mostrar-se
eficiente, promove oxidação nos explantes de Cariocar brasiliense Camb.
Kikuchi et al. (2001), utilizando NaOCl a 2%, por 10 ou 20 minutos,
constataram a morte dos explantes de camu-camu. O efeito fitotóxico de NaOCl
também foi relatado por Nery et al. (2008), que relataram que o uso desse
desinfestante retarda o processo de germinação
ex vitro de sementes de ipê-
amarelo.
Os aspectos visuais da formação de plântulas normais e anormais
obtidas a partir da germinação in vitro de eixos embrionários desinfestados com
NaOCl e paraformaldeído estão representados na Figura 3.
111
(
A
)
(
B
)
FIGURA 3. Germinação in vitro de eixos embrionários de A. colubrina
submetidos à desinfestação com NaOCl (A) e paraformaldeído
(B), aos 10 dias de cultivo. Barra = 1,0 cm. UFLA, Lavras, MG,
2008.
A formação de uma plântula normal, porém com presença de
contaminação fúngica, pode ser visualizada na Figura 4.
FIGURA 4. Plântula normal com presença de contaminação fúngica, obtida a
partir da germinação in vitro de eixo embrionário de A. colubrina
submetido à desinfestação com paraformaldeído por 30 minutos,
aos 10 dias de cultivo. Barra = 1,0 cm (seta: fungos). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
112
Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que o uso de
paraformaldeído como desinfestante, por 120 minutos, pode reduzir em até 70%
a probabilidade de contaminação do eixo embrionário inoculado in vitro.
Entretanto, este agente desinfestante não tem ação efetiva sobre contaminantes
endógenos. O uso de NaOCl, embora tenha sido eficiente no controle da
contaminação dos eixos embrionários in vitro, na concentração e no tempo de
desinfestação utilizados, prejudica a formação de plântulas normais, por
promover a oxidação dos eixos embrionários.
Observa-se, pelos resultados obtidos, que a ação do paraformaldeído é
dependente do tempo de exposição, confirmando observações de Alasri et al.
(1992, 1993) em atividades antimicrobianas. Segundo Fior et al. (2005), o
paraformaldeído pode ser empregado como agente de desinfestação em
protocolos de micropropragação, também como alternativa aos procedimentos
que requerem imersão, como segmentos nodais.
Alvarez Pardo et al. (2006) observaram, ainda, que, para várias espécies
de orquídeas brasileiras, os tratamentos de desinfestação com solução de NaOCl
0,4% ou 0,8% de cloro, por cinco minutos, ou por vapores de formol ou NaOCl
por até duas horas foram eficientes no controle da contaminação fúngica em
sementes. Esses autores sugerem, ainda, que esses procedimentos podem ser
usados rotineiramente.
As drágeas de paraformaldeído têm baixo preço, podem ser
reaproveitadas, são de manipulação fácil e segura, além de poderem substituir
com vantagens as soluções de desinfestação, principalmente na produção de
plantas in vitro em escala comercial. Porém, o emprego rotineiro do
paraformaldeído no laboratório de cultivo in vitro requer adaptações estruturais
que reduzam a exposição ocupacional humana a níveis mínimos, de preferência
bem inferiores aos estabelecidos pelo Ministério da Saúde e pela Occupational
113
Safety & Heath Administration (0,5 a 2,0 ppm) (Graziano et al., 1989; Fior et al.,
2005).
5.2 Germinação in vitro de eixos embrionários
5.2.1 Efeito de GA
3
e meios de cultura
A porcentagem de germinação avaliada pela protrusão radicular a ±2,0
mm, de eixos embrionários de A. colubrina, não apresentou diferenças,
considerando-se os diferentes meios de cultura e concentrações de GA
3
testados.
Os valores mantiveram-se constantes, em média, 100%.
Conceição (2000), testando diferentes concentrações do meio MS na
germinação de sementes de timbó (Derris urucu), também não encontrou efeito;
fato semelhante constatato por Soares (2005), em mangabeira (Hancornia
speciosa Gomes).
Para a variável comprimento da raiz principal formada, verificou-se efeito
significativo da interação entre os meios de cultura e as concentrações de GA
3
testadas (p=0,0009) (Anexo 2A).
Para a característica comprimento da raiz principal das plântulas
cultivadas in vitro, realizou-se análise de regressão para as diferentes
concentrações de GA
3
, cujos dados constam na Figura 5. Observou-se redução
desta característica em meio MS acrescido de até 6,0 mg L
-1
de GA
3
, enquanto,
para as plântulas in vitro crescidas em meio WPM, não houve efeito,
apresentando valor médio de 3,27cm, independente da concentração de GA
3
testada.
114
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
0246
Conce ntração de GA
3
(mgL-¹)
CMR (cm)
8
MS obs. MS est. WPM. obs. WPM. est.
y (MS) = 6,2377-1,3937x+0,1457x² R²=0,9758
y (WPM) = 3,27 não significativo
FIGURA 5. Valores observados (obs.) e estimados (est.) do comprimento da
maior raiz (CMR), para os meios de cultura (MS e WPM), em
função das concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
)
em plântulas in vitro de A. colubrina. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Os valores médios observados e estimados, para número de raízes
secundárias formadas em plântulas in vitro, crescidos em meio MS, acrescidos
de diferentes concentrações de GA
3
, estão representados na Figura 6.
À medida que aumentou a concentração de GA
3
no meio de cultivo,
observou-se redução em número de raízes secundárias. Não foi verificado efeito
desse fitorregulador sobre o número de raízes secundárias formadas, com a
utilização do meio de cultura WPM (Anexo 3A).
115
0
2
4
6
8
10
12
0246
Concentração de GA
3
(mg L-¹)
Número médio de raízes secundárias
8
MS obs. MS est. WPM obs. WPM est.
FIGURA 6. Valores observados (obs.) e estimados (est.), para o número de
raízes secundárias formadas em plântulas in vitro de A. colubrina,
em diferentes meios de cultura (MS e WPM), em função das
concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
), segundo o
modelo log-linear. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Os valores médios, observados e estimados, de proporção para
formação de calos na raiz de plântulas in vitro de A. colubrina, na presença de
GA
3
, estão representados na Figura 7. Observou-se que concentrações mais
elevadas de GA
3
reduzem a formação de calos na raiz, em ambos os meios de
cultura testados (Anexo 4A).
116
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
02468
Concentração de GA
3
(mgL-¹)
Formação de calos na raiz
(proporção)
Calo obs. Calo est.
FIGURA 7. Valores médios, observados (obs.) e estimados (est.), para a
proporção de formação de calos na raiz de plântulas in vitro de A.
colubrina, em função das concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0
e 8,0 mg L
-1
), segundo o modelo logístico. UFLA, Lavras, MG,
2008.
Quanto ao crescimento da parte aérea de plântulas in vitro de A.
colubrina, verifica-se, no Anexo 5A, que não houve efeito entre os meios de
cultura e concentrações de GA
3
testados, isoladamente ou interagidos (p>0,05).
Os valores médios de comprimento de parte aérea de plântulas in vitro em
função dos meios de cultura são relatados na Tabela 1.
Observou-se um desenvolvimento balanceado da parte aérea e do sistema
radicular das plântulas de A. colubrina, em todos os tratamentos. Segundo Peres
& Kerbauy (2000), o equilíbrio no desenvolvimento entre caule e raízes é
vantajoso, considerando que ambos possuem funções complementares na
sobrevivência geral das plantas.
117
TABELA 1. Valores médios, originais e transformados, de comprimento de
parte aérea (cm) de plântulas in vitro, em função dos diferentes
meios de cultura (MS e WPM). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Meios de cultura
Médias originais
(erro padrão)
Médias transformadas
(erro-padrão)
MS 1,85 (0,18) 1,29 (0,05)
WPM 1,71 (0,20) 1,25 (0,06)
A ausência do efeito de GA
3
, neste trabalho, para o comprimento de parte
aérea, pode estar associado ao fato de que este foi esterilizado por autoclavagem,
o que pode ter causado diminuição na sua concentração. Segundo Caldas et al.
(1990), algumas substâncias orgânicas, como o GA
3
, são degradadas pelo calor e
precisam ser esterilizadas em filtros especiais tipo Milipore. O mesmo efeito não
significativo para o uso de GA
3
foi observado por Rodrigues et al. (2007) na
propragação in vitro de Cattleya loddigesii Lindl.
Pela análise de Deviance representada no Anexo 6A, verifica-se
interação significativa entre os meios de cultura e concentrações de GA
3
para o
número de brotações em plântulas in vitro de A. colubrina.
Os valores médios, observados e estimados da contagem de número de
brotações formadas em plântulas in vitro, para os meios MS e WPM, em função
das concentrações, estão representados na Figura 8. Notam-se oscilações em
número de brotações de plântulas in vitro, para os diferentes meios de cultura e
diferentes concentrações de GA
3
testadas, com maiores valores obtidos no meio
WPM.
118
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0246
Conce ntração de GA
3
(mg L-¹)
Número de brotações
8
MS obs. MS est. WPM obs. WPM est.
FIGURA 8. Valores observados (obs.) e estimados (est.), para a contagem de
número de brotações formadas em plântulas in vitro, em função
das diferentes concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg
L
-1
), para os meios de cultura MS e WPM, segundo o modelo log-
linear. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Pelos dados do Anexo 7A, nota-se que houve efeito significativo dos
meios de cultura (MS e WPM) (p=0,0030) sobre o comprimento da maior
brotação em plântulas in vitro, indenpendente da concentração de GA
3
. Os
valores médios de comprimento da maior brotação em função dos meios de
cultura são relatados na Tabela 2. As brotações de plântulas in vitro foram
maiores em comprimento, quando se utilizou o meio de cultura WPM.
119
TABELA 2. Valores médios, originais e transformados, de comprimento da
maior brotação (cm) de plântulas in vitro, em função dos meios
de cultura (MS e WPM). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Meios de cultura
Médias originais
1
(erro padrão)
Médias transformadas
(erro padrão)
MS 1,88 (0,51) b 1,29 (0,15)
WPM 3,63 (0,31) a 1,84 (0,09)
1
Médias seguidas de diferentes letras minúsculas na coluna diferem entre si, pelo teste t
de Student, a 5% de significância.
No que diz respeito ao número de gemas formadas em plântulas in vitro,
verificou-se interação significativa para os meios de cultura e concentrações de
GA
3
estudadas (Anexo 8A). Os valores médios, observados e estimados, para
essa característica, nos meios de cultura MS e WPM, na presença de diferentes
concentrações de GA
3
estão representados na Figura 9. Os maiores valores de
número de gemas foram obtidos em meio WPM, com oscilações entre as
concentrações de GA
3
testadas.
120
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
02468
Conce ntração de GA
3
(mg L-¹)
Número médio de gemas
MS obs. MS est. WPM obs. WPM est.
FIGURA 9. Valores observados (obs.) e estimados (est.), pelo modelo log-
linear, para o número de gemas formadas em plântulas in vitro de
A. colubrina, em função das concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0;
6,0 e 8,0 mg L
-1
), para os meios de cultura (MS e WPM). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Pelo gráfico da Figura 10, verifica-se que houve interação significativa
para a proporção de abscisão foliar entre os meios de cultura (MS e WPM) e as
concentrações de GA
3
testadas (Anexo 9A). Observou-se que, até a
concentração de 4,0 mg L
-1
de GA
3
, ocorreu aumento na proporção de abscisão
foliar e que, a partir desta concentração, essa proporção foi reduzida
significativamente, em meio MS. Entretanto, em meio WPM, a proporção de
abscisão foliar elevou-se com o aumento da concentração de GA
3
,
possivelmente devido às diferenças de composição mineral dos meios de cultura
(Anexo 1B e 2B).
121
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
02468
Concentração de GA
3
(mgL-¹)
Abscisão foliar (proporção)
MS obs. MS est. WPM. obs. WPM. est.
FIGURA 10. Valores observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo logístico
para a proporção de abscisão foliar em plântulas in vitro em
diferentes meios de cultura (MS e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
A espécie em estudo apresenta um mecanismo fisiológico de adaptação,
em que ocorre abscisão foliar durante o período de seca, fenômeno conhecido
como caducifolia e comum nas plantas da caatinga e cerrado (Nepomuceno et
al., 2007). Algumas espécies lenhosas, quando cultivadas in vitro, apresentam
esse processo em resposta ao ambiente a que são submetidas e, como
conseqüência da abscisão foliar, o crescimento in vitro é reduzido e o explante
torna-se frágil, impossibilitando a continuação do processo de micropropagação
(Lemos & Blake, 1994).
No intuito de reduzir a proporção de abscisão foliar em A. colubrina,
Nepomuceno et al. (2007) testaram o uso de inibidores de etileno (AgNO
3
e
CoCl
2
) e observaram pouca eficiência no controle da abscisão foliar. Em outro
estudo, Nepomuceno (2006) relata, ainda, que a abscisão dos folíolos iniciou-se
122
na segunda semana de cultivo, quando foram utilizados tubos selados com filme
de PVC. Subseqüente à abscisão dos folíolos, aconteceu a abscisão total das
folhas, indicativo da presença de CO
2
e de etileno no interior dos tubos. Segundo
Grattapaglia & Machado (1998), o acúmulo deste regulador de crescimento pode
interferir na morfogênese das culturas, acelerando a senescência das mesmas.
O aspecto visual de uma plântula in vitro, obtida da germinação de eixo
embrionário de sementes de A. colubrina, pode ser visto na Figura 11.
pa
rs
rp
FIGURA 11. Plântula in vitro obtida da germinação de eixo embrionário de
sementes de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, em meio de
cultura WPM, suplementado com GA
3
(pa: parte aérea, rp: raiz
principal, rs: raízes secundárias). Barra = 1,0 cm. UFLA, Lavras,
MG, 2008.
Grattapaglia & Machado (1990) afirmam que, para a maioria das
espécies lenhosas, o meio MS completo não tem se mostrado satisfatório em
alguns casos e que composições mais diluídas, como as do meio WPM, podem
apresentar melhores resultados.
Bertoni et al. (2002) confirmam a eficiência do meio WPM na
germinação de sementes de Zeyheria montana Mart., uma espécie medicinal do
123
Cerrado. Os autores reportam que a utilização desse meio menos concentrado
promoveu um bom desenvolvimento das plântulas, favorecendo o
estabelecimento do protocolo de propagação in vitro da espécie.
Reguladores de crescimento não são normalmente requeridos na cultura
de embriões, exceto na de embriões muito jovens de algumas espécies, na qual
são adicionados para evitar a germinação precoce ou estimular o crescimento
embriônico. Dentre os grupos de reguladores conhecidos, destacam-se, para esta
função, as giberelinas e as citocininas (Norstog, 1972; Custers, 1982).
Observou-se que plântulas de A. colubrina apresentam rápido crescimento
in vitro, promovido pelo alongamento dos entrenós em função da giberelina
endógena, o que promove o crescimento da plântula. Esse fato também foi
relatado por Nepomuceno (2006), em estudo com a mesma espécie.
5.2.2 Efeito de BAP e meios de cultura
A porcentagem de germinação de eixos embrionários de sementes de A.
colubrina nos diferentes meios de cultura (MS e WPM) e diferentes
concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
) testados foi de
100%, não demonstrando efeitos dos tratamentos.
A formação de plântulas obtidas da germinação in vitro de eixos
embrionários em diferentes concentrações de BAP foi avaliada observando-se as
seguintes características: comprimento da raiz principal, número de raízes
secundárias, formação de calos na raiz, comprimento da parte aérea, número de
brotações, comprimento da maior brotação, número de gemas e abscisão foliar.
Pelos resultados, constata-se efeito significativo dos fatores meios de
cultura (p<0,0001) e concentração de BAP (p<0,0001), isoladamente, para a
característica comprimento da raiz principal de plântulas in vitro. A interação
entre meios de cultura e concentrações de BAP não foi significativa (p=0,1076)
124
(Anexo 10A). Os valores observados para o comprimento da raiz principal, em
função dos meios de cultura testados são mostrados na Tabela 3 e, em função
das concentrações de BAP, na Figura 12. As plântulas in vitro cultivadas em
meio MS apresentaram raízes mais longas. Analisando-se as diferentes
concentrações de BAP, observou-se redução no comprimento da raiz principal
com a elevação da concentração de BAP, em comparação ao tratamento sem
fitorregulador, para ambos os meios de cultura testados.
TABELA 3. Valores médios originais e transformados de comprimento da raiz
principal (cm) de plântulas in vitro, em função dos diferentes
meios de cultura estudados (MS e WPM). UFLA, Lavras, MG,
2008.
Meios de cultura
Médias originais
1
(erro padrão)
Médias transformadas
(erro padrão)
MS 4,52 (0,12) a 1,49 (0,03)
WPM 2,58 (0,12) b 1,01 (0,03)
1
Médias seguidas de diferentes letras minúsculas na coluna diferem entre si, pelo teste t
de Student, a 5% de significância.
125
0,90
1,00
1,10
1,20
1,30
1,40
1,50
1,60
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Concentração (mg L-¹)
CRP
CRP obs CRP est.
y=1,4684 -0,5487x+0,3120x² - 0,0493x³ R²=0,8976
FIGURA 12. Valores médios, observados (obs.) e estimados (est.) do
comprimento médio da raiz principal (CRP) (cm), em plântulas
in vitro de A. colubrina, em função das concentrações de BAP
(0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Quanto ao número de raízes secundárias, não foi possível fazer o ajuste de
modelos, uma vez que não houve crescimento de raízes secundárias para as
concentrações de BAP estudadas. No meio MS, na ausência de BAP, verificou-
se a presença de 10 raízes secundárias. Não foram observadas raízes secundárias
para as demais concentrações de BAP adicionadas ao meio de cultura MS. No
meio de cultura WPM, verificou-se a presença de 3 raízes secundárias na
concentração de 0,5 mg L
-1
de BAP e, para as demais concentrações de BAP,
nesse meio de cultura, não houve formação de raízes secundárias nas plântulas
in vitro de A. colubrina.
Para os diferentes meios de cultura e concentrações de BAP testados
houve efeito significativo para a formação de calos nas raízes (Anexo 11A). Os
126
valores médios observados e estimados, de proporção de formação de calos nas
raízes de plântulas in vitro, em função das concentrações de BAP, estão
representados na Figura 13. Com a elevação da concentração de BAP no meio
MS, verificou-se aumento na proporção de formação de calos em raízes de
plântulas in vitro, enquanto no meio WPM não foi observada elevação na
formação de calos nas raízes. Contudo, essa proporção ocorreu em níveis
elevados, comparada à do meio MS.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Concentração de BAP (mg L-¹)
Calo na raiz (proporção)
MS obs. MS est. WPM obs. WPM est.
FIGURA 13. Valores observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo logístico,
de proporção de formação de calos nas raízes de plântulas in vitro,
em função das concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0
mg L
-1
), para os diferentes meios de cultura (MS e WPM) testados.
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Os dados contidos no Anexo 12A evidenciam o efeito significativo da
interação entre meios de cultura e concentrações de BAP (p=0,0125) sobre o
127
crescimento da parte aérea de plântulas in vitro de A. colubrina. Os valores
observados e estimados de comprimento médio da parte aérea em cada meio de
cultura, em função das concentrações de BAP podem ser observados na Figura
14. Maiores médias de comprimento da parte aérea em plântulas in vitro foram
obtidas em meio MS, independente da concentração de BAP testado.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Concentração de BAP (mg L-¹)
CPA (cm)
MS obs. MS est. WPM . obs. WPM . est.
y (MS) =1,1623 +2,2346x-1,3984x²+0,2142x³ R²=0,8650
y (WPM) =1,3391 -0,4524x+0,3477x² -0,0635x³ R²=0,9053
FIGURA 14. Valores médios, observados (obs.) e estimados (est.), do
comprimento médio de parte aérea (CPA) (cm) de plântulas in
vitro de A. colubrina, em função das concentrações de BAP
(0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
), para os meios de cultura
MS e WPM. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Não foram observados efeitos dos meios de culturas e de BAP sobre o
número de brotações em plântulas in vitro (Anexo 13A). Os valores médios
observados e estimados para o número de brotações, em função das
128
concentrações de BAP, são representados na Figura 15. Independente do meio
utilizado, observou-se elevação do número de brotações até a concentração de
2,0 mg L
-1
de BAP, com redução a partir dessa concentração.
Nepomuceno et al. (2007) verificaram a formação de 1,41 brotação por
plântula in vitro de A. colubrina. No entanto, neste estudo, os resultados
apontam para um decréscimo de, aproximadamente, 15% nesse valor.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Conce ntração de BAP (mg L-¹)
Número de brotações
NB obs. NB est.
FIGURA 15. Valores observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo log-
linear para o número de brotações de plântulas in vitro de A.
colubrina, em função das concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0;
1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
O comprimento da maior brotação em plântulas in vitro de A. colubrina
não foi afetado em ambos os meios de cultura e em diferentes concentrações de
BAP (Anexo 14A), com valores variando entre 3,03 cm a 4,03 cm. Os dados
referentes a essa característica podem ser visualizados na Tabela 4.
129
TABELA 4. Valores médios, originais e transformados, de comprimento da
maior brotação (cm) em plântulas in vitro, em função dos meios
de cultura estudados. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Meios de cultura
Médias originais
1
(erro padrão)
Médias transformadas
(erro padrão)
MS 3,03 (0,48) 1,56 (0,12)
WPM 4,03 (0,41) 1,92 (0,10)
Os valores médios observados e estimados para o número de gemas em
plântulas in vitro, em meios MS e WPM, sob diferentes concentrações de BAP,
estão representados na Figura 16 (Anexo 15A).
Os números de gemas por plântula em meio WPM obtidos corroboram
os relatados por Nepomuceno et al. (2007), para mesma espécie, os quais
verificaram, em média, a formação de 3,3 gemas por plântula.
130
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Concentração de BAP (mg L-¹)
Número de gemas
MS obs. MS est. WPM obs. WPM est.
FIGURA 16. Valores observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo log-
linear, para o número de gemas em plântulas in vitro de A.
colubrina, em função das concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0;
1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
), para os meios de cultura (MS e WPM).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
No que diz respeito à proporção de abscisão foliar em plântulas in vitro de
A. colubrina, não foram detectados efeitos dos diferentes meios de cultura e
concentrações de BAP (Tabela 5 e Anexo 16A).
TABELA 5. Proporção média de abscisão foliar em plântulas in vitro de A.
colubrina, em função dos meios de cultura estudados. UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Meios de cultura Proporções
MS 0,36
WPM 0,25
131
Algumas espécies lenhosas, quando cultivadas in vitro, apresentam
abscisão foliar precoce em resposta ao ambiente a que são submetidas; como
conseqüência, o crescimento in vitro é reduzido e o explante torna-se frágil,
impossibilitando a continuação do processo de micropropagação (Lemos &
Blake, 1994).
Além da abscisão foliar, as plântulas de A.colubrina cultivadas in vitro
apresentaram entrenós alongados e, consequentemente, poucas gemas axilares, o
que resulta em baixa produção de explante na fase de multiplicação
(Nepomuceno, 2006).
Segundo Erig & Schuch (2005), o acúmulo de etileno tem efeito adverso
no desenvolvimento das plantas, afetando a diferenciação, o desenvolvimento, a
morfologia e o crescimento das plantas, diminuindo a expansão foliar e o
comprimento dos brotos, inibindo a regeneração de novos brotos e causando
necrose apical, além de promover abscisão foliar nos cultivos in vitro.
Nepomuceno et al. (2007) observaram a ocorrência de abscisão foliar e
relacionaram a hipersensibilidade dos tecidos de A. colubrina ao etileno,
acarretando limites às etapas seguintes do processo de micropropagação para
essa espécie. Na tentativa de atenuar tais efeitos do etileno nessas repostas
fisiológicas, esses mesmo autores sugerem o uso de nitrato de prata como o
primeiro passo para a etapa de multiplicação no processo de micropropagação
dessa espécie.
5.3 Efeito do BAP e ANA na indução de brotações
5.3.1 Comprimento da maior brotação
Pelos resultados, verifica-se que houve efeito significativo das
concentrações de BAP sobre o comprimento da maior brotação obtida a partir de
132
segmento nodal de plântulas in vitro de A. colubrina (Anexo 17A). No entanto,
não houve efeito para as diferentes concentrações de ANA testadas e, tampouco,
interação entre as concentrações de BAP e ANA. Considerando-se que a
concentração de BAP foi um fator quantitativo, a variável foi estudada por meio
de regressão. Os valores observados e estimados de comprimento da maior
brotação estão apresentados na Figura 17.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
0246810
Concentração de BAP (mg L-¹)
Comprimento da maior
brotação (cm)
CMB obs. CMB es t.
Y= 1,2414+0,3322x - 0,1004x²+0,0068x³ R²=0,7334
FIGURA 17. Valores médios, observados (obs.) e estimados (est.), do
comprimento médio da maior brotação (cm) em segmentos
nodais de A. colubrina inoculados em meio de cultura MS, em
função das concentrações de BAP (0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e
10,0mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Pela análise de regressão descrita na Figura 17, observa-se um tipo
senoidal para os níveis crescentes de BAP e seus respectivos efeitos sobre o
comprimento médio das brotações. Melhor resposta foi verificada em meio
suplementado com 2,0 mg L
-1
de BAP.
133
O mesmo modelo senoidal também foi observado para o tamanho de
brotações em Rudgea viburnoides, em meio WPM, suplementado com BAP
(Bonilla, et al., 2007).
Grattapaglia & Machado (1998) relatam que há uma tendência de redução
do comprimento de brotações a partir de determinada concentração de BAP,
devido a um possível efeito fitotóxico da citocinina. Segundo Narayanaswamy
(1977), a toxidez causada pelo excesso de reguladores de crescimento no meio
de cultura, ou por exposição prolongada da cultura, pode provocar alterações
genéticas, fisiológicas e morfológicas, resultando na redução da taxa de
multiplicação e no encurtamento dos caules, dificultando a individualização das
plantas para as etapas posteriores de enraizamento.
A partir dos resultados obtidos neste estudo, pode-se inferir que A.
colubrina é uma espécie que necessita de concentrações relativamente baixas de
BAP para a obtenção de brotações maiores, sendo prejudicial o uso de
concentrações superiores a 2,0 mg L
-1
dessa citocinina. Resultados semelhantes
aos encontrados no presente estudo para essa característica foram obtidos por
Bonilla et al. (2007), para a espécie Rudgea viburnoides (Cham.) Benth.,
evidenciando que a presença de BAP foi importante para o processo de
micropropagação.
5.3.2 Número de brotações por explante
Não houve efeito da interação entre as concentrações de BAP e ANA,
para o número de brotações em segmento nodal de A. colubrina (Anexo 18A).
Os valores médios observados e estimados do número médio de brotações, em
função das concentrações de BAP e ANA, podem ser observados nas Figuras 18
e 19, respectivamente.
134
Para as diferentes concentrações de BAP testadas, verificou-se uma
resposta de modelo log-lineares sobre o número médio de brotações, com valor
máximo atingido na concentração de 4,0 mg L
-1
, seguida de significativa
redução a partir dessa concentração (Figura 18). Quanto às concentrações de
ANA, observou-se acentuada redução no número de brotações na presença
dessa auxina no meio de cultura (Figura 19).
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
0246810
Concentração de BAP (mgL-¹)
Número médio de brotações
NB obs. NB est.
FIGURA 18. Valores observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo log-
linear para o número médio de brotações por segmento nodal de
A. colubrina, inoculado em meio de cultura MS, suplementado
com diferentes concentrações de BAP (0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e
10,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
135
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Concentração de ANA (mgL-¹)
Número médio de brotações
NB obs. NB est.
FIGURA 19. Valores observados e estimados pelo modelo log-linear, para o
número médio de brotações por segmento nodal de A. colubrina,
inoculado em meio de cultura MS, suplementado com diferentes
concentrações de ANA (0,0; 0,01; 0,1 e 1,0 mg L
-1
). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
De acordo com Preece (1995), as citocininas têm função primordial na
divisão celular e atuam também na quebra da dominância apical e na indução e
no crescimento de brotações. Em adição, o tipo de citocinina e a sua
concentração são fatores que definem a resposta das plântulas, bem como o
sucesso da multiplicação in vitro (Grattapaglia & Machado, 1998).
Soares (2005), estudando a espécie Hancornia speciosa, verificou a
maior média de brotações, para explantes cultivados na concentração de 5,0 mg
L
-1
de BAP. No entanto, os resultados obtidos neste trabalho corroboram os
encontrados por Nogueira (2003), que descreve que concentrações acima de 4,0
mg L
-1
de BAP não foram eficientes na indução de brotos axilares em segmentos
nodais de murici-pequeno (Byrsonima intermedia A. Juss.).
136
5.3.3 Número de gemas por explante
Os valores médios observados e estimados para número médio de
gemas por segmento nodal de A. colubrina, em função das concentrações de
BAP, são mostrados na Figura 20. Verificou-se efeito significativo para as
concentrações de BAP e ANA, tendo, na ausência de auxina no meio de cultura,
sido obtido maior número de gemas por segmento nodal de A. colubrina (Anexo
19A).
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0246810
Concentração de BAP (mg L-¹)
Número médio de gemas/explante
ANA 0 obs ANA 0 est. ANA 0,01 obs ANA 0,01 es t.
ANA 0,1 obs ANA 0,1 est. ANA 1,0 obs ANA 1,0 est.
FIGURA 20. Valores médios, observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo
log-linear, para contagem média do número de gemas por
segmento nodal de A. colubrina, em função das concentrações de
BAP (0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 10,0 mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01; 0,1 e
1,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Os valores médios observados e estimados para a contagem média do
número de gemas por explante, em função das concentrações de ANA, são
137
mostrados na Figura 21. Verificaram-se efeitos antagônicos entre concentrações
de BAP e ANA. O número médio de gemas por explante reduziu-se com o
aumento das concentrações combinadas desses fitorreguladores, com valor
próximo a 5 gemas por explante, em concentrações de 2,0 mg L
-1
de BAP e 0,1
mg L
-1
de ANA.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 0,10,20,30,40,50,60,70,80,9 1
Concentração ANA (mgL-¹)
Número médio de gemas/explante
BAP0 obs BAP0 es t. BAP1 obs BAP1 est.
BAP2 obs BAP2 es t. BAP4 obs BAP4 est.
BAP8 obs BAP8 es t. BAP10 obs BAP10 es t.
FIGURA 21. Valores médios e estimados pelo modelo log-linear, da contagem
média do número de gemas por explante, por segmento nodal de
A. colubrina, em função das concentrações de ANA (0,0; 0,01; 0,1
e 1,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Das citocininas utilizadas nos meios de multiplicação, a 6-
benzilaminopurina (BAP) é considerada a mais eficiente e tem contribuído
substancialmente na indução de gemas axilares adventícias durante a
multiplicação de explantes, além de se destacar pelo seu menor custo
(Grattapaglia & Machado, 1998).
138
5.3.4 Formação de calos na base dos explantes
Pela análise de Deviance (Anexo 20A), verifica-se que não houve
interação significativa para a proporção de formação de calos na base dos
segmentos nodais de A. colubrina, em função das concentrações de BAP e ANA
testadas.
Os valores médios observados e estimados para a proproção de
formação de calos na base do explante, em função das concentrações de BAP e
ANA, estão representados nas Figuras 22 e 23. Essa proporção elevou-se com o
aumento das concentrações de BAP e ANA, isoladamente, no meio de cultura.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0246810
Concentração de BAP (mg L-¹)
Calos na base do explante
(proporção)
CaloB obs. CaloB est.
FIGURA 22. Valores observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo logístico,
para a proporção de formação de calos na base do explante, em
função das concentrações de BAP (0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 10,0 mg
L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
139
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Concentração de ANA (mgL-¹)
Ocorrência de calos na base do explante
(proporção)
CaloB obs. CaloB es t.
FIGURA 23. Valores observados (obs.) e estimados (est.) pelo modelo logístico,
para a proporção de formação de calos na base do explante, em
função das concentrações de ANA (0,0; 0,01; 0,1 e 1,0 mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
O aspecto visual dos calos basais formados nos segmentos nodais de A.
colubrina, na presença de BAP e ANA, pode ser observado na Figura 24.
b
c
FIGURA 24. Aspecto visual de calos basais formados em brotações de A.
colubrina cultivadas em meio MS suplementado com 10 mg L
-1
de BAP e 0,01 mg L
-1
de ANA (b: brotação; c: calo basal).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
140
Em pesquisa com Inga vera subsp. affinis, Soares (2003) observou que o
aumentou da concentração de BAP estimulou a formação de calos em segmentos
nodais. As concentrações de 6,0, 9,0 e 12,0 mg L
-1
deste fitorregulador foram as
que apresentaram os resultados mais significativos (70% a 80% de formação de
calos). Efeitos equivalentes foram verificados por Bonilla (2002), em Rudgea
viburnoides. Em estudos in vitro com murici-pequeno (Byrsonima intermedia A.
Juss.), Nogueira (2003) encontrou ocorrência de, aproximadamente, 90% de
calos em brotações em meio de cultivo suplementado com 8,0 mg L
-1
de BAP.
Pelos diversos resultados observados na literatura, verifica-se que a
concentração de BAP mais adequada no meio de cultura varia de espécie para
espécie.
Segundo Fráguas (2003), a formação de calos, neste caso, não é
desejada, já que pode favorecer o surgimento de variações genotípicas no
explante.
Apesar de o fitorregulador ANA ser bastante utilizado na multiplicação de
explantes, o uso de AIA pode ser mais eficiente. Portanto, nas condições
estabelecidas, são necessários novos testes empregando-se esta auxina e outras
citocininas, a fim de aumentar o número de brotações, como sugerem Quoirin et
al. (2008) para a espécie Gypsophila paniculata.
5.4 Efeito do 2,4-D na indução de calos em diferentes explantes
A formação de calos em segmentos caulinares e foliares de A. colubrina
iniciou-se ao longo da segunda semana de cultivo, a partir de pontos que se
expandiam e recobriam a superfície dos explantes.
Na ausência de 2,4-D, a percentagem de calos observada foi inexpressiva,
próxima de zero, nos explantes caulinares e foliares (Figuras 25A e 25B).
141
Em explantes caulinares, nas demais concentrações de 2,4-D, a média da
porcentagem de calos verificada em explantes caulinares foi próxima de 100,
exceto para 40,0 mg L
-1
de 2,4-D no meio, ao reduzir em 50% a formação de
calos (Figura 25A).
Em explantes foliares, observou-se valor superior a 80% para a formação
de calos, nas concentrações de 5,0, 10,0 e 20,0 mg L
-1
de 2,4-D. Em
concentrações de 1,0 e 40,0 mg L
-1
de 2,4-D, a formação de calos em explantes
foliares variou entre 58% a 62% (Figura 25B), sendo viável economicamente a
utilização de baixas concentrações para a indução de calogênese em explantes
foliares.
Na Figura 26 verifica-se o aspecto visual dos calos formados em
explantes caulinares e foliares. Em explantes caulinares, os calos formados
apresentaram coloração amarelada a amarronzada, aspecto rugoso e não friáveis
(Figuras 26A e 26B). Os calos formados a partir de explantes foliares
apresentaram coloração amarela e marrom, com aparência globular e friável
(Figuras 26C e 26D).
Concentrações de 2,4-D (mg L
-1
)
015102040
% Área do explante caulinar coberta por calos
0
20
40
60
80
100
120
Concentrações de 2,4-D (mg L
-1
)
015102040
% Área do explante foliar coberta por calos
0
20
40
60
80
100
120
(A)
(B)
FIGURA 25. Box-plot para porcentagem de área coberta por calos em explantes
caulinares (A) e foliares (B) de A. colubrina, inoculados em meio
WPM, suplementado com 2,4-D, em diferentes concentrações (0,0;
1,0; 5,0; 10,0; 20,0 e 40,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
142
(
D
)
(
C
)
(
A
)
(
B
)
FIGURA 26. Aspecto visual de calos em explantes caulinares e foliares de A.
colubrina em meio WPM suplementado com diferentes
concentrações de 2,4-D; (A e C) explante caulinar e foliar
cultivado na ausência de 2,4-D, (B e D) calos obtidos na presença
de 2,4-D. Barra = 1,0 cm. UFLA, Lavras, MG, 2008.
A formação de calos em explantes cotiledonares foi inexpressiva. Esse
fato pode ter ocorrido devido à oxidação dos explantes e liberação de
metábolitos presentes no material para o meio de cultura, como pode ser
visualizado na Figura 27A. A formação de calos somente foi possível em altas
concentrações de 2,4-D (40,0 mg L
-1
), com média de 32% (Figura 27A). Os
calos formados mostraram-se amarelados, com aspecto rugoso e não friável
(Figura 28A e 28B).
Em eixos embrionários, a formação de calos foi elevada a partir da
concentração de 10,0 mg L
-1
de 2,4-D. Na concentração de 1,0 mg L
-1
de 2,4-D,
143
a formação de calos foi de apenas 24%. Na ausência de 2,4-D, a percentagem de
calos observada foi nula, ocorrendo a regeneração dos eixos embrionários
(formação de parte aérea e sistema radicular) (Figura 28C). Os calos formados
apresentaram coloração amarela e marrom, com aspecto globular e friável
(Figura 28D).
Concentrações de 2,4-D (mg L
-1
)
015102040
% Área do explante cotiledonar coberta por calos
0
20
40
60
80
100
120
Concentrações de 2,4-D (mg L
-1
)
0 1 5 102040
% Área do explante embrionário coberta por calos
0
20
40
60
80
100
120
(A)
(B)
FIGURA 27. Box-plot para porcentagem de área coberta por calos em explantes
cotiledonares (A) e eixo embrionário (B) de A. colubrina,
inoculados em meio WPM, suplementado com diferentes
concentrações de 2,4-D (0,0; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 e 40,0mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
144
FIGURA 28. Aspecto visual de calos formados em explantes cotiledonares e
eixo embrionário de A. colubrina em meio WPM suplementado
com diferentes concentrações de 2,4-D; (A e C) explante
cotiledonar e eixo embrionário cultivados na ausência de 2,4-D;
(B e D) calos obtidos na presença de 2,4-D. Barra = 1,0 cm.
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Por meio desses resultados, também se verificou que os eixos
embrionários apresentam o melhor nível de resposta ao 2,4-D para a formação
de calos. A diferença na resposta ao fitorregulador, provavelmente, está
correlacionada a diferenças na quantidade de células responsivas existentes entre
os dois tipos de explantes testados (eixos embrionários e cotilédones). Segundo
(
A
)
(
D
)
(
B
)
(
C
)
145
dados encontrados na literatura, a epiderme de embriões é um dos tecidos mais
adequados para a formação de calos. No entanto, segundo Meijer et al. (1999), o
desenvolvimento de células e de calos embriogênicos é significativamente
influenciado pela composição do meio de cultura.
Segundo Grattapaglia & Machado (1998), o 2,4-D tende a estimular a
formação de calos, mesmo em baixas concentrações. Este fitorregulador
apresenta efeito no metabolismo do RNA, induzindo a transcrição de mRNAs
capazes de codificar proteínas requisitadas para o crescimento e que podem
induzir a proliferação celular desordenada, ou seja, a formação de calos (George,
1996).
Os resultados obtidos nos levam a acreditar que, para iniciar o cultivo in
vitro de A. colubrina, deve-se ater ao tipo de explante, para permitir uma maior
porcentagem de calos. Esta afirmativa pode ser corroborada pelo fato de que
segmentos caulinares e foliares de plantas in vitro, bem como eixos
embrionários de sementes maduras, podem ser considerados explantes ideais
para a calogênese, devido à alta porcentagem de calos formados, mesmo em
baixas concentrações de 2,4-D (1,0 mg L
-1
). No entanto, altas concentrações
desse fitorregulador não foram favoráveis à formação de calos embriogênicos
neste estudo, durante o período de avaliação adotado.
Segundo Bispo et al. (2007), o comportamento diferencial dos explantes
quanto à porcentagem de formação de calos poderia ser explicado por vários
fatores, como grau de diferenciação, determinação e competência do tecido,
níveis hormonais endógenos e estádio do desenvolvimento do explante.
146
5.5 Efeito do AIB e caseína hidrolisada no enraizamento in vitro de
brotações
As concentrações de AIB e de caseína hidrolisada utilizadas nesse
experimento não foram suficientes para induzir à rizogênese em brotações de A.
colubrina cultivadas in vitro. Segundo Kulescha (1988), o nível das auxinas
endógenas é o que determina a formação de raízes adventícias, ou seja, é o
acúmulo de auxinas endógenas que induz à formação de raízes.
Outro fator que possivelmente contribuiu para o não enraizamento das
brotações foi o escurecimento dos explantes, indicativo de processos oxidativos,
comuns no cultivo in vitro de espécies lenhonas (Castro et al., 2000).
No tratamento controle (ausência de AIB e caseína hidrolisada no meio
de cultura) também não houve o enraizamento. É possível que o explante
apresente concentrações endógenas de citocininas ou residuais dos experimentos
de multiplicação, que podem ter levado a um desiquílibrio hormonal,
prejudicando a indução e a formação de raízes. A rizogênese é, geralmente,
inibida por altas concentrações de citocinina que, utilizada na indução de
brotações, pode afetar negativamente o alongamento dos primórdios radiculares
(Pasqual, 1998).
Pio et al. (2002) comentaram que a formação de raízes bem
desenvolvidas é de grande importância para a sobrevivência e a adaptação das
plântulas cultivadas in vitro. Assim, como o enraizamento é uma etapa essencial
para a continuidade do cultivo de várias espécies, o fato de as brotações de A.
colubrina não terem sido enraizadas in vitro limita a formação de mudas por
meio da micropropagação, sendo necessários mais estudos nesta fase do cultivo
in vitro.
Soares (2005) relata que, para a espécie Hancornia speciosa Gomes, não
foi possível o enraizamento de brotações em meios acrescidos de diferentes
147
concentrações de ANA. No entanto, a formação de raízes em brotações de
mangabeira foi observada quando, ao meio de cultivo, foram acrescidos 3,0 mg
L
-1
de AIB.
Nascimento (2008) observou maior número de raízes em segmentos
nodais cotiledonares inoculados em meio contendo 1,0 mg L
-1
de AIB (2,35
raízes). A maior sobrevivência durante o processo de aclimatização (68%)
ocorreu em plantas regeneradas a partir de segmentos nodais cotiledonares em
meio contendo 1,0 mg L
-1
de AIB. Essa autora relata, ainda, que o segmento
nodal cotilenodar é o tipo de explante mais apropriado para a regeneração in
vitro de Parapiptadenia rigida (Bentham) Brenan, quando comparado ao
segmento nodal.
No que diz respeito ao desenvolvimento vegetativo e radicular de
Oncidium baueri, nenhum efeito foi observado quando da adição de caseína
hidrolisada ao meio de cultura. A suplementação do meio de cultura com caseína
hidrolisada, nas mesmas concentrações utilizadas nestse trabalho para A.
colubrina, não foram benéficas para o crescimento vegetativo e enraizamento in
vitro, bem como para a sobrevivência ex vitro de Oncidium baueri (Faria et al.
2007).
Dantas et al. (2002), trabalhando com embriões de macieira in vitro no
meio MS suplementado com AIA, GA
3
e 500 mg L
-1
de caseína hidrolisada,
observaram que, entre os tratamentos, o comprimento das brotações não foi
afetado. Entretanto, a maior porcentagem de germinação (75%) foi obtida no
tratamento com AIA (14 μM), GA
3
(1,5 μM), caseína hidrolisada (500 mg L
-1
) e
cinetina (5 μM). Raganwamy (1961) relatou que a caseína hidrolisada (400 mg
L
-1
) foi essencial para a germinação de embriões de Citrus microcarpa X
Triticosecale, Oriza sativa e Prunus persica.
O efeito da caseína hidrolizada no meio de cultivo depende em que fase a
propragação ocorre. Por exemplo, há efeito sobre a formação in vitro, mas pode
148
não haver efeito sobre o comprimento das brotações, como citado por Dantas
(2002) e Raganwamy (1961).
5.6 Aclimatização de plântulas in vitro de A. colubrina
Plântulas de A. colubrina apresentaram, após 30 dias em sala de
crescimento, apenas 9% de sobrevivência, mesmo sendo submetidos a uma pré-
aclimatização (Figura 29). Essa baixa taxa de sobrevivência mostra a fragilidade
dos tecidos de A. colubrina, destacando-se a formação de calos nas raízes das
plântulas in vitro, o que, possivelmente, dificultou seu estabelecimento ex vitro.
(A) (B)
FIGURA 29. Aspecto visual de plântulas de A. colubrina em processo de
aclimatização (A) e aclimatizadas em tubetes com substrato
Plantmax® (B). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Segundo Castro et al. (2007), em plantas desenvolvidas in vitro, as
raízes adventícias possuem sistema vascular pouco diferenciado e, em
plantas lenhosas e semilenhosas, o crescimento secundário não é observado.
Como conseqüência, somente uma pequena porcentagem dessas plântulas
sobrevivem à aclimatização.
149
Os resultados obtidos neste trabalho corroboram os relatados por
Nascimento (2008), para a espécie Parapiptadenia rigida (Bentham) Brenan,
cujo valor de sobrevivência de plântulas, após a tranferência para o ambiente
ex vitro, foi de apenas 7%.
5.7 Anatomia foliar in vitro
A presença de estômatos foi verificada na epiderme adaxial e abaxial
das lâminas foliares de plântulas in vitro de A. colubrina, o que caracteriza a
espécie como anfiestomática. Não houve diferença estatística para a densidade
estomática, diâmetro equatorial e polar dos estômatos em ambas as faces
epidérmicas dos folíolos de plântulas in vitro (Tabela 30).
TABELA 30. Valores médios das características estomatais em folíolos de
plântulas in vitro de A. colubrina. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Faces epidérmicas
Número de
estômatos/mm
2
Diâmetro polar
(μm)
Diâmetro equatorial
(μm)
Adaxial 26,48 a 58,75 a 98,68 a
Abaxial 29,79 a 58,53 a 92,94 a
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si, pelo
teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
Na Figura 30 podem ser observadas as variações na morfologia dos
estômatos dos folíolos de plântulas in vitro de A. colubrina.
150
(A) (B)
FIGURA 30. Epiderme adaxial e abaxial de folíolos de plântulas in vitro em
vista paradérmica (A e B). Barra = 30 μm (setas: estômatos).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Castro et al. (2007) relataram diâmetros polar e equatorial bem menores,
com valores de 18,57 μm e 15,98 μm, para folíolos de plantas in vitro de
barbatimão (Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville (Fabaceae –
Papilionoideae). Esses mesmo autores verificaram a presença de estômatos,
distribuídos na face abaxial de folíolos de barbatimão com densidade
aproximada de 215,32 estomâtos/mm
2
. Relataram, ainda que, nessa condição de
cultivo, as dimensões dos estômatos são variáveis, sendo elípticos, com menor
diferença nos diâmetros polar e equatorial, o que é justificado pela fase de
diferenciação em que se encontram.
Além dos estômatos, diferenças no formato das células epidérmicas
também foram verificadas. As células da epiderme das plântulas mantidas in
vitro apresentaram-se sinuosas e dotadas de paredes menos espessas, o que pode
estar relacionado ao fato de essas plântulas não apresentarem, ainda,
características adaptativas contra a perda excessiva de água.
Considerando esses resultados, o conhecimento prévio dos aspectos
relacionados à anatomia foliar de A. colubrina torna promissor e vantajoso o seu
151
cultivo in vitro, garantindo material vegetal em grande escala e com boas
condições assépticas para estudos futuros que venham a explorar suas diversas
potencialidades.
O estudo anatômico de órgãos vegetativos de plântulas cultivadas in vitro
fornece informações importantes para o controle da morfogênese e, no caso das
folhas, indica possíveis alterações em tecidos importantes para rotas metabólicas
primárias, especialmente a fotossínte, além de auxiliar na eficiência de
protocolos de micropropagação (Ziv, 1995).
6 CONCLUSÕES
O uso de paraformaldeído por 120 minutos é eficiente na desinfestação de
eixos embrionários de A. colubrina. A utilização de NaOCl (2,0% de cloro
ativo) como desinfestante não propicia a formação de plântulas normais.
Todos os meios de cultura testados são eficientes na germinação in vitro
de eixos embrionários e na formação de plântulas normais de A. colubrina, no
entanto, obtém-se baixa taxa de sobrevivência ex vitro.
A utilização de BAP promove resposta eficiente na indução de brotações
em segmentos nodais de A. colubrina, sendo prejudicial o uso de concentrações
superiores a 2,0 mg L
-1
dessa citocinina, por induzir a calogênese na base dos
explantes.
O AIB e a caseína hidrolisada nas concentrações testadas não induzem a
rizogênese em brotações de A. colubrina.
Na ausência de 2,4-D, a calogênese é ausente, comprovando a necessidade
da adição do mesmo no meio de cultura. Segmentos caulinares, foliares e
embrionários são explantes ideiais para a indução de calogênese.
152
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207-212, abr./jun. 2007
158
CAPÍTULO IV
TOLERÂNCIA AO CONGELAMENTO DE EIXOS EMBRIONÁRIOS
DE
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan
159
1 RESUMO
NERY, Fernanda Carlota. Tolerância ao congelamento de eixos embrionários de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan. In:______.
Germinação, cultivo in
vitro e tolerância ao congelamento de sementes de angico-vermelho
(
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan). 2008. Cap. 4, p. 159-198. Tese
(Doutorado em Fisiologia Vegetal) - Universidade Federal de Lavras, Lavras,
MG.
*
A preservação ex situ e a utilização racional de A. colubrina demandam
informações conclusivas, entre outros aspectos, quanto ao armazenamento das
sementes por períodos prolongados. Essa prática é de importância,
principalmente para espécies que apresentam dificuldades de propagação e que
estejam ameaçadas de extinção. A criopreservação, isto é, o armazenamento em
nitrogênio líquido (-196°C), oferece potencial para uma preservação sem limites
de tempo, com a redução do metabolismo a níveis tão baixos que todos os
processos bioquímicos são significativamente reduzidos e a deterioração
biológica é paralisada. Considerando a importância de se empregar eixos
embrionários como elemento de conservação dos recursos genéticos de A.
colubrina, foi realizado este trabalho com o objetivo de se desenvolver um
protocolo para a criopreservação de eixos embrionários de sementes dessa
espécie. Foram avaliados a germinação e o vigor de sementes armazenadas em
câmara fria (8ºC e 45% UR), por 12 meses e em temperaturas inferiores a zero
(-20ºC, -80ºC, -196ºC), por 15, 30 e 150 dias de armazenamento. Os eixos
embrionários obtidos de sementes de A. colubrina recém-colhidas foram
armazenados em criotubos de 2,0 mL (10 eixos por criotubo) e submetidos ao
armazenamento nas mesmas temperaturas inferiores a zero e tempos descritos
anteriormente. Foram utilizados também crioprotetores químicos na
crioconservação de eixos embrionários, sendo testados dimetilsulfóxido
(DMSO) e glicerol, em três concentrações (5%, 10% e 15%). O comportamento
das sementes de A. colubrina é ortodoxo quanto à tolerância ao congelamento. A
conservação de eixos embrionários dessa espécie A. colubrina em temperaturas
inferiores a zero não requer uso de crioprotetores químicos e propricia elevada
percentagem de regeneração no cultivo in vitro.
*
Comitê Orientador: Dr. Amauri Alves de Alvarenga – UFLA (orientador),
Renato Paiva, PhD – UFLA, José Márcio Rocha Faria, PhD – UFLA, Drª
Cristina Filomena Justo – UFMT (co-orientadores).
160
2 ABSTRACT
NERY, Fernanda Carlota. Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan embryonic
axes freezing tolerance. In:______.
Germination, in vitro cultivation and
freezing tolerance of red angico seeds (
Anadenanthera colubrina (Vell.)
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Federal University of Lavras, Lavras, MG.
*
The ex situ preservation and rational use of A. colubrina demand conclusive
information, among other things, about the seeds storage for long periods. This
practice is important, mainly for species which presents propagation difficulties
and are endangered of extinction. The cryopreservation, that is, the storage in
liquid nitrogen (-196°C), offers a potential for preservation without limits of
time, reducing the metabolism to levels so low that all the biochemical processes
are significantly reduced and the biological deterioration is paralyzed.
Considering the importance of using embryonic axes as conservation elements
of the genetic resources of A. colubrina, this work was done in order to develop
a cryopreservation protocol of embryonic axes of seeds of this species. It was
evaluated the germination and vigor of seeds stored in cold chamber (8ºC and
45% RM) for 12 months, and in temperatures below zero (-20ºC, -80ºC, -196ºC)
for 15, 30 and 150 days of storage. The embryonic axes from A. colubrina seeds
newly harvested, were stored in cryotubes of 2.0 mL (10 axes in each cryotube)
and subjected to the same storage temperatures below zero and periods,
described above. It was also used chemical cryoprotectors in the conservation of
embryonic axes, being tested dimethilsulfoxide (DMSO) and glycerol, in three
concentrations (5%, 10% and 15%). The behavior of A. colubrina seeds is
orthodox for the freezing tolerance. The conservation of embryonic axes of the
species A. colubrina in temperatures below zero, did not require the use of
chemical cryoprotectors and promotes a high percentage of regeneration at the in
vitro culture.
*
Adviser Comitee: Dr. Amauri Alves de Alvarenga – UFLA (Adviser), Renato
Paiva, PhD – UFLA, José Márcio Rocha Faria, PhD – UFLA, Drª Cristina
Filomena Justo – UFMT (Co-advisers).
161
3 INTRODUÇÃO
O angico-vermelho (Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan) (Fabaceae
– Mimosoideae) é uma espécie de ampla ocorrência, facilmente adaptada a
diversos tipos de ambiente, em vários países da América do Sul. Possui elevado
potencial econômico, sendo bastante utilizada com fins ornamentais, medicinais
e para o fornecimento de tanino, resina, madeira e mel. Devido a esse uso
intenso, aliado aos problemas de degradação ambiental, é considerada como
estando sob risco de extinção (Rodrigues, 2005). Segundo Lorenzi (1992), a
espécie pode ser aproveitada para a arborização de parques, praças e para o
plantio em florestas mistas destinadas à recuperação de áreas degradadas.
A exploração desordenada, a falta de práticas adequadas de manejo ou de
uma política de reflorestamento que vise à reposição das árvores exploradas e,
sobretudo, a falta de outras opções de matéria-prima (espécies produtoras de
taninos) capazes de, em curto prazo, substituírem ou constituírem, com o angico,
misturas para o curtimento de couros e peles, estão colocando em risco a
extinção dessa espécie (Diniz et al., 2003; Paes et al., 2006).
A preservação ex situ e a utilização racional do angico-vermelho
demandam informações conclusivas, entre outros aspectos, quanto ao
armazenamento das sementes por períodos prolongados. Essa prática é de
importância, principalmente para espécies que apresentam dificuldades de
propagação e que, como o angico-vermelho, estejam ameaçadas de extinção. De
maneira geral, a capacidade de armazenamento das sementes está associada à
sua qualidade inicial e às condições de armazenamento (Roberts, 1973, Carvalho
& Nakagawa, 2000).
Uma das mais importantes e difíceis tarefas no processo de conservação é
superar a deterioração fisiológica da semente. Sistemas de refrigeração
162
mecânica, que mantêm a semente desidratada sob temperatura de -20°C,
aumentam seu período de armazenamento (International Board for Plant Genetic
Resources, 1976). Entretanto, a essa temperatura, o metabolismo da semente não
é completamente interrompido e, com o aumento do período de armazenamento,
a deterioração ainda pode ocorrer, resultando na perda de precioso material
genético (Stanwood, 1985).
A criopreservação, ou seja, o armazenamento em nitrogênio líquido
(-196°C), oferece potencial para a preservação sem limites de tempo, com a
redução do metabolismo a níveis tão baixos que todos os processos bioquímicos
são significativamente reduzidos e a deterioração biológica é paralisada (Kartha,
1985). Essa técnica tem sido proposta para a conservação a longo prazo de
germoplasma (Stanwood & Bass, 1981). O aumento na longevidade da semente
reduziria a freqüência das atividades de multiplicação de plantas, diminuindo o
risco de contaminação e de modificações na composição genética do acesso
original (Stanwood & Roos, 1979).
Resultados obtidos após congelamento em nitrogênio líquido de sementes
de espécies florestais nativas de clima tropical e subtropical indicam que
sementes de Albizia lebbeck (L.) Benth. (Fabaceae – Mimosoideae) e de
Anadenanthera macrocarpa Benth., entre outras, podem ser criopreservadas
com sucesso (Wetzel et al., 2003).
Atualmente, a criopreservação de eixos embrionários vem se destacando
como a metodologia mais apropriada para a conservação a longo prazo da
diversidade genética das espécies vegetais. Isso porque os eixos toleram
condições que seriam letais para a semente inteira (Berjak et al., 2000; Santos et
al., 2002), além de ocupar o mínimo de espaço (Stushnofff & Seufferhled, 1995;
Youngjie et al., 1997; Lopes et al., 2004) e reduzir a possível presença de
microrganismos no armazenamento, os quais prejudicam a qualidade fisiológica
das sementes. Além disso, a criopreservação reduz a ação dos radicais livres,
163
que estão entre os agentes causadores de envelhecimento celular (Brandão
Júnior et al., 2002; Rajasekaran et al., 2005). No entanto, estudos recentes
podem colocar em cheque vários pressupostos sobre as causas da deterioração e
da morte das sementes (Chappel Junior, 2008).
González-Benito et al. (1998) resgataram, in vitro, eixos embrionários de
algodoeiro criopreservados com teor de água abaixo de 20%, sem perda da
viabilidade. Santos et al. (2002) avaliaram a criopreservação de eixos
embrionários zigóticos de café (Coffea arabica L.), constatando que eixos que
apresentaram 12,6% de umidade permaneceram viáveis após criopreservação.
Faiad et al. (2004) informaram que eixos embrionários podem tolerar teores de
umidade por volta de 12% e subseqüente congelamento em nitrogênio líquido e
resgatados, após criopreservação, utilizando-se a cultura de tecidos. Deles se
originam plantas inteiras. As técnicas de conservação in vitro podem,
indiscutivelmente, constituir metodologias valiosas para a conservação de
recursos genéticos. Entretanto, existe o potencial risco de instabilidade genética
nas culturas submetidas a essas técnicas (Harding et al., 1997; Withers &
Williams, 1998).
Procedimentos criogênicos simplificados, como vitrificação (Sakai et al.,
1990) e encapsulamento-dessecação (Fabre & Dereuddre, 1990), que eliminam a
necessidade de congeladores programáveis de custo elevado, garantindo fácil
obtenção do material após congelamento com elevadas taxas de recuperação, são
preferidos na criopreservação de germoplasma vegetal (Engelmann, 1997). A
vitrificação é alcançada pela redução da água congelável intra e extracelular, por
meio da exposição dos tecidos das plantas a misturas crioprotetoras muito
concentradas ou pela dessecação física e subseqüente congelamento rápido,
geralmente pela imersão direta no nitrogênio líquido.
Segundo Vieira (2000), dentre os protetores químicos utilizados na
solução de vitrificação, destacam-se dimetilsulfóxido (DMSO), metanol,
164
glicerol, etileno glicol e propileno glicol, dentre outros. No entanto, segundo
Kartha (1985) e Sakai (1995), o emprego de crioprotetores químicos pode causar
citotoxicidade e estresse osmótico, levando à morte das células ou modificando
sua resposta morfogenética em cultura.
A citometria de fluxo é uma técnica que envolve a análise das
propriedades óticas (dispersão da luz e fluorescência) de partículas (células,
núcleos, cromossomos, organelas) que fluem em uma suspensão líquida
(Dolezel, 1997). As partículas em suspensão movem-se imersas num fluido
(tampão de extração) no interior de um capilar dentro de um aparelho
denominado citômetro de fluxo (Dolezel, 1997). Essas partículas atravessam,
uma a uma, um feixe de laser, ocorrendo um processo de dispersão da luz e ou
emissão de fluorescência (Dolezel & Bartos, 2005). A intensidade de dispersão
da luz ou da emissão de fluorescência está relacionada com as propriedades das
partículas que estão sendo analisadas (Dolezel & Bartos, 2005).
Esse princípio pode ser usado, por exemplo, para medir a quantidade de
DNA de uma célula (Dolezel & Bartos, 2005). Em plantas, é possível obter
milhões de núcleos em suspensão a partir de poucos gramas de tecido foliar em
um procedimento relativamente simples que envolve a maceração desse tecido
em uma solução tampão que mantém a integridade nuclear (Galbraith et al.,
1983). A coloração dessa amostra com corantes específicos para o DNA (DAPI,
iodeto de propídeo, brometo de etídeo) permite ao aparelho estimar a quantidade
de DNA. Tais estimativas apresentam uma série de aplicações, desde a pesquisa
básica até o melhoramento de plantas, entre elas, estimação do tamanho do
genoma, avaliação de ploidia, detecção de mixoploidia e aneuploidias, avaliação
de ciclo celular, estudo de eliminação cromossômica, separação de células,
cromossomos ou organelas (Dolezel & Bartos, 2005).
Segundo Wittiman (2001), a citometria de fluxo para a determinação da
quantidade de DNA é um avanço e uma contribuição importantíssima para
165
estudos de melhoramento genético, especialmente no manejo de grandes
coleções de germoplasma.
Considerando a importância de se empregar eixos embrionários como
elemento de conservação dos recursos genéticos de Anadenanthera colubrina,
foi realizado este trabalho, com o objetivo de se desenvolver um protocolo para
a criopreservação de eixos embrionários de sementes dessa espécie.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
Sementes de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan foram coletadas na
época de dispersão, agosto e setembro de 2007, em, aproximadamente, 50
árvores matrizes localizadas no campus da Universidade Federal de Lavras
(UFLA), no Sul do estado de Minas Gerais, nas coordenadas geográficas
21º13’17’’ S e 44º57’47’’ W. O clima da região é do tipo Cwb de Koppen
(mesotérmico com verões brandos e estiagens de inverno), a precipitação e a
temperatura média anual são, respectivamente, de 1.493,2 mm e de 19,3ºC, com
66% da precipitação, ocorrendo no período de novembro a fevereiro (Vilela &
Ramalho, 1979).
Posteriormente à coleta, as sementes foram encaminhadas ao Laboratório
de Crescimento e Desenvolvimento de Plantas, no Setor de Fisiologia Vegetal
no Departamento de Biologia (UFLA), onde foram beneficiadas manualmente e,
em seguida, submetidas às condições de armazenamento, como descrito nos
itens 4.2 e 4.3.
166
4.2 Armazenamento das sementes em câmara fria e em temperaturas
inferiores a zero
As sementes, após o beneficiamento, foram armazenadas em câmara fria
(8ºC e 45% de umidade relativa) em embalagens de polietileno, no Laboratório
de Sementes Florestais, no Departamento de Ciências Florestais da UFLA.
Antes do armazenamento, foi determinado o grau de umidade das sementes em
estufa, a 105±3ºC, por 24 horas (Brasil, 1992).
As sementes armazenadas em câmara fria foram avaliadas quanto à
percentagem de germinação e ao índice de velocidade de germinação. Foi
realizado também um monitoriamento do grau de umidade, por um período de
12 meses, submetidas a avaliações em seis períodos (0, 4, 6, 8, 10 e 12 meses).
O grau de umidade foi determinado com base em massa úmida,
utilizando-se estufa a 105±3ºC, por 24 horas (Brasil, 1992). Os testes de
germinação foram realizados em câmaras de germinação do tipo Mangelsdorf®,
em temperatura constante de 30ºC, na presença de luz e umidade relativa de,
aproximadamente, 100%, sendo utilizado como substrato rolo de papel
Germtest® umedecido com água destilada (2,5 vezes o peso do papel) (Brasil,
1992). As avaliações foram realizadas diariamente a partir da protusão da
radícula a ±2,0 mm.
O índice de velocidade de germinação (IVG) foi conduzido juntamente
com o teste de germinação, sendo as avaliações realizadas diariamente, a partir
da protrusão radicular. Para o cálculo do IVG, foi empregada a equação proposta
por Maguire (1962).
Foi instalado um segundo experimento de armazenamento das sementes
intactas em imersão direta em nitrogênio líquido (-196°C), ultrafreezer (-80°C) e
freezer (-20°C), permanecendo nessas condições por 15, 30 e 150 dias. Após o
quê, foram descongeladas em banho-maria, a 37ºC, por, aproximadamente, 5
167
minutos, e avaliadas quanto à porcentagem de germinação (protrusão radicular a
± 2,0 mm) e ao vigor. Os testes de germinação e de vigor (IVG) foram
realizados como descritos anteriormente.
Os ensaios foram conduzidos seguindo-se o delineamento inteiramente
casualizado, com 4 repetições de 25 sementes para cada tratamento. Os dados de
germinação foram transformados em arcsen (X/100)
0,5
e os dados do índice de
velocidade de germinação foram transformados em (X + 0,5)
0,5
(Bonzatto &
Kronka, 1989).
Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística do software
estatístico Sisvar (Ferreira, 2000). As médias entre os tratamentos foram
comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, sendo os dados
referentes ao tempo de armazenamento estudados pela análise de regressão
polinomial.
4.3 Armazenamento de eixos embrionários em temperaturas inferiores a
zero
Os eixos embrionários obtidos de sementes de A. colubrina recém-
colhidas foram armazenados em criotubos de 2,0 mL (10 eixos por criotubo) e
submetidos ao armazenamento em temperaturas inferiores a zero. Os
tratamentos constituíram de imersão direta em nitrogênio líquido (-196°C),
ultrafreezer (-80°C) e freezer (-20°C), permanecendo nessas condições por 15,
30 e 150 dias.
O grau de umidade dos eixos embrionários foi determinado antes e após
cada período de armazenamento, utilizando-se estufa a 105±3ºC, até peso
constante (Brasil, 1992), empregando-se três repetições de 10 eixos, e o valor
expresso em porcentagem, com base na massa úmida.
168
Após o período de crioconservação, os eixos embrionários foram
retirados e submetidos ao descongelamento em banho-maria, a 37ºC, por 5
minutos. Posteriormente, os eixos foram desinfestados por 120 minutos, em
placas de Petri lacradas, contendo duas drágeas de paraformaldeído 80% e
inoculados, em câmara de fluxo laminar, em tubos de ensaio contendo meio de
cultura WPM (Lloyd & McCown, 1980) suplementado com 30,0 g L
-1
de
sacarose. O meio foi solidificado com 4,0 g L
-1
de ágar e o pH foi corrigido para
5,8, antes da autoclavagem a 120ºC e pressão de 1,0 atm, durante 20 minutos.
Foram utilizadas 15 repetições por tratamento, sendo cada repetição composta
por um tubo de ensaio contendo um eixo embrionário.
Após a inoculação, os eixos embrionários foram mantidos em sala de
crescimento sob irradiância de fótons de 36 µmol m
-2
s
-1
, fotoperíodo de 16 horas
e temperatura de 25±2ºC. A avaliação foi realizada após 30 dias de incubação,
sendo contabilizada a porcentagem de eixos embrionários germinados, tendo
como critério de germinação a formação de plântulas normais, avaliando-se o
comprimento da parte aérea e o sistema radicular, com auxílio de régua
graduada.
Foram testados também crioprotetores químicos na crioconservação de
eixos embrionários, sendo testados dimetilsulfóxido (DMSO) e glicerol, ambos
em três concentrações diferentes (5%, 10% e 15%). Após os períodos de
armazenamento, 15, 30 e 150 dias, os eixos tiveram essas substâncias
crioprotetoras removidas, sendo lavados três vezes com água destilada e, em
seguida, foram inoculados no meio de cultura descrito anteriormente e
submetidos às condições para possível regeneração em plântulas.
Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística do software
estatístico Sisvar (Ferreira, 2000). As médias entre os tratamentos foram
comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, sendo os dados
169
referentes ao tempo de armazenamento analisados pela análise de regressão
polinomial.
4.4 Quantificação e integridade do DNA nuclear
A quantificação de DNA nuclear foi realizada em eixos embrionários
armazenados em nitrogênio líquido (-196ºC). Foram avaliados eixos
embrionários armazenados sem o uso de substâncias crioprotetoras (testemunha)
e criopreservados com a utilização de crioprotetores químicos, DMSO e glicerol,
ambos nas concentrações de 5%, 10% e 15%. A avaliação foi feita em eixos
embrionários armazenados por 30 dias, nessas condições. Como controle,
avaliou-se a quantidade e a integridade do DNA nuclear em eixos embrionários
armazenados em câmara fria por 6 meses.
O preparo das amostras e as análises por citometria de fluxo foram
conduzidos no Laboratório de Genética e Imunologia, na Universidade Federal
de Juiz de Fora (UFJF).
Para cada tratamento, três amostras foram avaliadas, com o objetivo de
estimar a quantidade de DNA nuclear. De 20 mg a 30 mg de eixo embrionário,
juntamente com a mesma quantidade de tecido foliar jovem de Pisum sativum
(2C = 9,09 pg) (padrão interno de referência), foram triturados em placa de Petri
contendo 1,0 mL de tampão LB01 gelado para lise celular e liberação dos
núcleos em suspensão (Dolezel et al., 1997). A suspensão foi aspirada por meio
de duas camadas de gaze e a suspensão nuclear posteriormente filtrada em uma
malha de 50 μm. Os núcleos foram corados adicionando-se, 25 μL de iodeto de
propídio e 5,0 μL de RNase. As amostras foram armazenadas no escuro e
analisadas até 1 hora após preparo. Para cada amostra, foram analisados, pelo
menos, 10 mil núcleos.
170
A análise foi realizada no citômetro Facscalibur (Becton Dickinson) e o
conteúdo de DNA nuclear (pg) do eixo embrionário foi estimado por
comparação com a posição em relação ao pico G1 do padrão interno de
referência (Pisum sativum). A análise estatística foi realizada por meio do
software WinMDI 2.8 (disponível em http://facs.scripps.edu/software.html). O
conteúdo de DNA em (pg) para os tratamentos foi estimado como mostrado a
seguir:
padrãoDNAdeConteúdox
padrãodoGpicodoCanal
amostradaGpicodoCanal
pgCDNA
osembrionárieixosAmostra
1
1
)(2
)(
=
Foi realizada a análise de variância (ANAVA) e o teste de Scott-Knott
(p<0,05) para a comparação das médias entre os tratamentos, utilizando-se o
programa estatístico Sisvar (Ferreira, 2000).
4.5 Avaliação ultraestrutural de eixos embrionários
O preparo das amostras e as observações em microscópio eletrônico de
transmissão foram realizados no Laboratório de Microscopia Eletrônica e
Análise Ultra-Estrutural (LME) no Departamento de Fitopatologia, na UFLA.
Os tratamentos submetidos à visualização constituíram de eixos
embrionários antes de serem armazenados (testemunha) e, após
crioarmazenamento a -196ºC, -80ºC e -20ºC. Avaliaram-se também eixos
embrionários criopreservados a -196ºC com uso de crioprotetores químicos,
DMSO 15% e glicerol 15%. A visualização foi feita em eixos embrionários
submetidos por 30 dias nessas condições.
Os eixos embrionários foram fixados em Karnovsky modificado:
glutaraldeído (2,5%) e paraformaldeído (2,5%) em tampão cacodilato 0,05 M,
171
pH 7,2 e CaCl
2
0,001 M (Karnovsky, 1965), sendo mantidos em geladeira, a
10ºC, até posterior processamento.
Posteriormente, esses fragmentos foram lavados em tampão cacodilato
0,05 M (três vêzes de 10 minutos) e pós-fixados em tetróxido de ósmio 1% em
tampão cacodilato 0,05 M por 4 horas. Em seguida, iniciou-se a desidratação em
gradiente de acetona (25%, 50%, 75%, 90%, por 10 minutos e três vezes por 10
minutos, em 100%). Logo depois, o material foi incluído em gradiente crescente
de acetona e resina Spurr 30%, por 8 horas, a 70% por 12 horas e 2 vezes a
100%, em intervalos de 24 horas. Os tecidos eram emblocados em resina pura e
colocados em estufa, a 70ºC, por 48 horas para a polimerização. Os blocos
obtidos foram desbastados com lâminas de aço para a retirada da resina
excedente.
Foram realizados os cortes em seções semifinas (1,0 μm) e ultrafinas
(<100 nm), utilizando-se um ultramicrotomo Reichrt-Jung, com navalha de
diamante. Os cortes semifinos foram coletados em lâminas de vidro, coloridos
com azul de toluidina (1,0 g azul de toluidina, 1,0 g borato de sódio e 100 mL de
água purificados por meio de filtro Millipore 0,2 μm) e montados
permanentemente em meio Permalt. Os cortes ultrafinos foram coletados em
grades de ouro (golden slot grids) e secos em raques de alumínio cobertos com
formvar (Rowley & Moran, 1975). As seções foram pós-contrastadas em acetato
de uranila, seguido por acetato de chumbo por 3 minutos cada e, em seguida,
examinadas em microscópio eletrônico de transmissão Zeiss, modelo EM 902 a
80Kv (Alves, 2004).
172
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Armazenamento das sementes em câmara fria
O grau de umidade das sementes aumentou de 9% para 11%, quando
armazenados em câmara fria, ao final de 12 meses. Mas, considerando que,
nesse intervalo, a semente possui teor de água do tipo 2, pequenas variações
podem contribuir significativamente para a deterioração das sementes, uma vez
que, para a porcentagem de germinação, houve efeito significativo ao longo do
período de armazenamento das sementes em câmara fria, com redução de 100%
para 66% de germinação, ao final de 12 meses (Figura 1). O mesmo foi
observado quanto ao índice de velocidade de germinação, com redução do vigor
das sementes ao longo do período de armazenamento (Figura 2).
y = -2,6067x + 101,72 R
2
= 0,8771
0
20
40
60
80
100
120
024681012
Tempo de arma zen ament o (mes es )
Germinação (%
)
FIGURA 1. Germinação (%) de sementes de Anadenanthera colubrina (Vell.)
Brenan, armazenadas em câmara fria (8ºC e 45% UR), em
embalagens de polietileno, por 12 meses. UFLA, Lavras, MG,
2008.
173
y = -0,1001x
2
+ 0,4403x + 21,16 R
2
= 0,9610
0
5
10
15
20
25
024681012
Tempo d e a rmazename nto (mes es )
IV
G
FIGURA 2. Índice de velocidade de germinação (IVG) de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, armazenadas em câmara
fria (8ºC e 45% UR), em embalagens de polietileno, por 12 meses.
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Pelos resultados obtidos neste trabalho, ressalta-se que a espécie estudada
apresenta comportamento descrito por Kageyama & Viana (1991) para as
espécies secundárias ou oportunistas, com boas perspectivas de armazenamento
em condições controladas.
O baixo teor de lipídeos das sementes de A. colubrina (capitulo II) pode
ter propriciado a menor deterioração das sementes. Segundo Harrington (1972),
a auto-oxidação de lipídios produz radicais livres, mesmo em sementes com
baixo teor de água, que podem combinar com proteínas e nucleotídeos,
destruindo enzimas, lipoproteínas, DNA e a capacidade reprodutiva das células.
Em sementes com baixo teor de água, uma parte da água monomolecular é
retirada das macromoléculas, removendo a camada que protege as sementes
contra o processo oxidativo. Contendo baixo teor de lipídio, é provável que as
sementes de A. colubrina mantenham sua qualidade fisiológica por um período
174
mais prolongado que o estudado neste trabalho. Esse fato também foi verificado
por Marques (2007) para sementes de angico de duas outras espécies. No
entanto, o teor elevado de proteínas pode contribuir para a redução do potencial
de armazenamento, devido à elevada afinidade dessa substância com a água
(Marcos Filho, 2005).
5.2 Armazenamento das sementes em temperaturas inferiores a zero
O grau de umidade das sementes de A. colubrina não diferiu, ao longo do
período de armazenamento, nas diferentes temperaturas testadas, sendo, em
média, de 11%.
Para a porcentagem de germinação de sementes intactas armazenadas em
temperaturas inferiores a zero, houve diferença significativa entre as
temperaturas testadas e o tempo de armazenamento, com maiores valores no
armazenamento em nitrogênio liquido (-196ºC), seguido do armazenamento em
ultrafreezer (-80ºC) e freezer (-20ºC). Em todos os tratamentos, a porcentagem
de germinação reduziu ao longo do período (Figura 3). O mesmo
comportamento foi verificado quanto ao índice de velocidade de germinação
(IVG) das sementes armazenadas nas diferentes temperaturas inferiores a zero,
ocorrendo redução significativa no vigor dessas, ao longo do período, para todos
os tratamentos testados. Vigor superior foi obtido para sementes armazenadas
em nitrogênio líquido (-196ºC), seguido do armazenamento em ultrafreezer
(-80ºC) e freezer (-20ºC) (Figura 4).
175
0
20
40
60
80
100
120
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Tempo de armazenamento (dias)
Germinação (%)
∆ ——y (-196ºC) ● ---- y (-80ºC) ■ - y (-20ºC)
FIGURA 3. Germinação (%) de sementes de Anadenanthera colubrina (Vell.)
Brenan, em função da temperatura (-196ºC, -80ºC e -20ºC) e do
período de armazenamento (0, 15, 30 e 150 dias). UFLA, Lavras,
MG, 2008.
0
5
10
15
20
25
0 153045607590105120135150
Tempo de armazenamento (dias)
IV
G
∆ ——y (-196ºC) ● ---- y (-80ºC) ■ - y (-20ºC)
FIGURA 4. Índice de velocidade de germinação (IVG) de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, em função da
temperatura (-196ºC, -80ºC e -20ºC) e do período de
armazenamento (0, 15, 30 e 150 dias). UFLA, Lavras, MG, 2008.
176
Com base nos dados das Figuras 3 e 4, pôde-se confirmar a importância
da redução da temperatura de armazenamento para a manutenção da viabilidade
das sementes de A. colubrina, conforme já mostrado por Marques (2007). O
mesmo foi relatado, para sementes de pau-brasil, por Hellman et al. (2006),
quando compararam o armazenamento dessas sementes a -18ºC, 7ºC e 25ºC.
O armazenamento de sementes ortodoxas a -18ºC é adotado pela maioria
dos bancos de sementes, o que permite prolongar a longevidade das sementes
por muitas décadas (Santos, 2000). Contudo, freqüentemente, esta temperatura
está associada a baixos teores de água nas sementes, entre 3% a 7% (Theilade &
Petri, 2003) diferente, portanto, das sementes de A. colubrina estudadas neste
trabalho, que estavam com 11% de teor de água.
Os resultados obtidos neste trabalho estão de acordo com os relatados por
Salomão (2002), para sementes da mesma espécie, A. colubrina, com 7,1% de
grau de umidade. A germinabilidade das sementes não diferiu antes e depois da
imersão em nitrogênio líquido (-196ºC) por 3 dias, com valores acima de 93%.
Os resultados encontrados neste trabalho corroboram também com os obtidos
por Wetzel et al. (2003) para sementes de Cassia ferruginea (Schrader.)
Schrader Ex DC., Sclerolobium aureum (Tul.) Benth. e Platypodium elegans
Vog., tendo ocorrido decréscimo de germinação após a imersão no nitrogênio
líquido. No entanto, esses mesmos autores observaram que, para sementes de
Anadenanthera macrocarpa Benth., Bauhinia sp., Hymenaea stignocarpa Mart.
Ex Hayne e Mimosa setosa Benth., todas da família Fabaceae, ligeiro aumento
na germinação ocorreu após imersão em nitrogênio liquido (-196ºC), por 7 dias.
Segundo Reis & Cunha (1997), o congelamento em nitrogênio líquido
(-196°C) aumenta a absorção de água, a velocidade de germinação e o poder
germinativo das sementes; esse ambiente mostra-se como alternativa para a
conservação, a longo prazo, das sementes de angico-vermelho (Anadenanthera
peregrina (L.) Speg.). Esses autores concluíram, ainda, que as sementes dessa
177
espécie apresentam comportamento ortodoxo, pela tolerância a baixos conteúdos
de umidade e ao congelamento nas temperaturas abaixo de zero grau.
Venzke et al. (2006) relataram redução na porcentagem de germinação de
sementes de Parapiptadenia rígida, quando foram crioconservadas, a -196ºC,
por uma hora. No entanto, esses autores atribuem essa redução ao elevado grau
de umidade das sementes, quando submetidas à temperatura criogênica. Esses
autores relataram, ainda, que a umidade é fator limitante para a manutenção da
qualidade fisiológica e para a integridade metabólica das sementes. Coelho &
Mata (2008) descreveram que, para sementes de algodão, o teor de umidade
crítico para o crioarmazenamento é de 6% a 8%, sem perda da sua viabilidade.
Diniz et al. (1999) observaram que sementes de milho perdem um
percentual significativo de germinabilidade e vigor até 30 dias crioconservadas
e, após este perído, tendem manter sua qualidade fisiológica.
Para Almeida (2006), o grau de umidade das sementes, sua composição
química e as velocidades de congelamento e descongelamento são os fatores
que, habitualmente, consideram-se como determinantes do efeito da
crioconservação sobre as sementes, assim como as sementes de menor tamanho,
uma composição química rica em lipídios ou velocidade de congelamento ou
descongelamento inadequadas podem afetar a viabilidade das sementes.
5.3 Armazenamento de eixos embrionários em temperaturas inferiores a
zero
O grau de umidade do eixo embrionário não diferiu ao longo do período
de armazenamento nas diferentes temperaturas testadas, sendo em média de
11,7%.
Eixos embrionários armazenados sob temperaturas de -196ºC, -80ºC e -
20ºC, imersos em crioprotetores químicos, DMSO ou glicerol, em concentrações
178
de 5%, 10% e 15%, possivelmente, embeberam as soluções crioprotetoras e o
grau de umidade observado foi acima de 65%, para todos os tratamentos
testados (Tabela 1).
TABELA 1. Grau de umidade (%) de eixos embrionários Anadenanthera
colubrina (Vell.) Brenan submetidos a temperaturas de -196ºC, -
80ºC e -20ºC, imersos em crioprotetores químicos, DMSO ou
glicerol, a 5%, 10% e 15%, por 15, 30 e 150 dias de
armazenamento. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Temperaturas
-196ºC -80ºC -20ºC -196ºC -80ºC -20ºC -196ºC -80ºC -20ºC
Tratamentos
15 dias 30 dias 150 dias
Sem
crioprotetor
11,0 8,52 17,2 13,4 18,5 13,6 14,9 12,9 18,6
DMSO 5% 73,1 74,9 70,9 71,2 71,2 74,8 75,0 78,9 73,5
DMSO 10% 73,6 75,4 71,3 70,5 70,5 76,2 74,5 72,8 73,4
DMSO 15% 70,1 76,1 69,2 71,1 71,1 68,9 77,5 72,6 70,9
Glicerol 5% 73,9 71,1 71,4 70,4 70,4 84,7 78,7 73,5 76,6
Glicerol 10% 72,2 70,2 74,3 72,8 87,1 76,0 76,2 72,9 69,9
Glicerol 15% 70,7 68,9 72,9 85,1 73,3 71,5 66,1 76,4 72,4
O teor de água das sementes é, provavelmente, o fator mais crítico para o
sucesso da crioconservação. Se a umidade da semente é muito alta, observa-se a
sua morte instantânea durante o processo de congelamento e de
descongelamento (Venzke et al., 2006). Existe um nível máximo de umidade
(NMU) para o congelamento (High Moisture Freezing Limit) acima do qual a
viabilidade da semente é reduzida (Stanwood, 1985). Este limite crítico é, em
179
geral, uma faixa relativamente estreita de umidade para cada espécie, mas pode
variar entre espécies.
Os resultados obtidos neste trabalho estão de acordo com os relatados por
Molina et al. (2006), para sementes de cebola crioconservadas sem crioprotetor
o teor de água das sementes foi mantido após o descongelamento, não diferindo
da testemunha. No entanto, a crioconservação com crioprotetor aumentou em 42
pontos percentuais do teor de água das sementes após o descongelamento,
evidenciando que o criprotetor utilizado, glicerol a 50%, aumentou
acentuadamente o teor de água das sementes.
Quimicamente, o glicerol é um álcool que contém três grupos funcionais
de hidroxila que podem aceitar um hidrogênio da molécula de água em seis
sítios diferentes (Gonzalez, 2004) e pode ser utilizado para reduzir o dano físico
e favorecer o processo de vitrificação durante a etapa de congelamento a
temperaturas ultrabaixas. Entretanto, é importante observar o comportamento
das sementes de diferentes espécies em presença deste crioprotetor e em
diferentes concentrações (Molina et al., 2006).
Hellman et al. (2006) também relataram que, para sementes de pau-brasil
armazenadas a -18ºC, com teor de água elevado, houve expressiva redução da
capacidade germinativa, com apenas 10% de germinação e 8% produzindo
plântulas normais, após 30 dias de armazenamento, culminando com a perda
total da germinação aos 90 dias de armazenamento. Santos (2002) descreveu
que, nesses casos, pode ocorrer a formação de cristais de gelo a partir da água
livre presente no interior das células, acarretando injúrias e causando a perda da
capacidade germinativa.
A regeneração dos eixos embrionários crioconservados sem uso de
crioprotetores químicos mateve a viabilidade em torno dos 100%, independente
do período de crioarmazenamento. No entanto, quando foram utilizados
crioprotetores químicos, a porcentagem de germinação foi nula, o que pode ser
180
explicado pelo elevado grau de umidade dos eixos embrionários após
descongelamento, reduzindo a viabilidade desses.
Quanto aos eixos embrionários regenerados, verificou-se, para o
comprimento da parte aérea de plântulas in vitro, que não houve diferença
significativa entre a interação dos fatores temperaturas e períodos de
armazenamento. Não houve efeito significativo para o fator temperatura de
armazenamento, isoladamente. No entanto, verifica-se que quanto maior o
período de armazenamento dos eixos embrionários, maior é comprimento médio
da parte aérea (Figura 5). O mesmo comportamento foi verificado para o
comprimento do sistema radicular (Figura 5).
0
1
2
3
4
5
6
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Tempo de armazenamento (dias)
Comprimento (cm)
■ − − − Parte aérea y = -0,0002x
2
+ 0,0573x + 1,85 R
2
= 98,23%
∆ —— Sistema radicular y = 0,067x + 3,98 R
2
= 77,28%
FIGURA 5. Comprimento (cm) de parte aérea e sistema radicular de plântulas in
vitro de Anandenanthera colubrina (Vell.) Brenan, em função de
diferentes temperaturas (-196ºC, -80ºC, -20ºC) e períodos de
armazenamento (0, 15, 30 e 150 dias). UFLA, Lavras, MG, 2008.
181
Lopes et al. (2004) sugeriram a crioconservação de eixos embrionários de
mamona como alternativa viável para a conservação de germoplasma dessa
cultura. No entanto, para sementes de nim (Azadirachata indica), a
crioconservação em nitrogênio líquido (-196ºC) reduziu o valor de 96% de
germinação, no primeiro mês, para 45%, ao final de 12 meses de
armazenamento (Varghese & Naithani, 2008).
Segundo Molina et al. (2006), sementes de cebola crioconservadas com o
uso de crioprotetor (glicerol 50% v/v) apresentaram um decréscimo acentudado
na germinação. No entanto, em sementes de orégano crioconservadas, sob ação
do glicerol como crioprotetor, foram constatados valores de germinação
superiores aos daquelas submetidas ao nitrogênio líquido sem glicerol,
indicando a necessidade do uso de glicerol como crioprotetor para a conservação
dessas sementes (Vargas et al., 2004).
O mesmo foi relatado por Santos (2004) e Cho et al. (2002) que
verificaram que eixos embrionários de Citrus encapsulados com alginato de
sódio e não desidratados não sobreviveram à exposição ao nitrogênio líquido,
sendo possível à regeneração desses com a desidratação em sílica gel das
cápsulas contendo os eixos embrionários.
O estresse de congelamento, com o uso de crioprotetor, pode ter causado a
interrupção e a desestruturação de alguns processos metabólicos, assim como
reportado por Fleck et al. (1999) e Dumet & Benson (2000) com outros sistemas
biológicos. Alguns crioprotetores podem ser tóxicos ou podem causar estresse
osmótico, levando à morte das células ou modificando sua resposta
morfogenética em cultura (Sakai, 1995). Também é possível que os danos
observados na crioconservação possam ter sido causados pela perda da
integridade celular, devido à formação de cristais de gelo e ao emprego do
crioprotetor, que pode danificar membranas, conforme descrito no trabalho
realizado por Martínez-Montero et al. (2002). Entretanto, segundo Winkelmann
182
et al. (2004), o pré-tratamento com 0,6 M de sacarose e 10% DMSO, por 1 hora,
influenciou positivamente a regeneração de calos criopreservados de Cyclamen
persicum Mill. No entanto, Lopes (2005) relatou que concentrações acima de
5% de DMSO afetaram a viabilidade dos explantes caulinares e cotiledonares de
algodoeiro e mamoneira.
Um parâmetro importante que deve ser observado para cada procedimento
de crioconservação é o período pelo qual o material pode ser conservado, de tal
forma que, quando avaliado, mostre pelo menos 60% de sobrevivência (Vieira,
2000). Pelos resultados apresentados nesta pesquisa, observa-se que a
crioconservação, sem uso de crioprotetor, manteve a viabilidade das sementes de
A. colubrina, por 150 dias. Estes resultados são promissores e demostram que
sementes de angico podem ser crioconservadas, com relativa eficiência, se,
conforme Diniz (1999), forem estudados alguns parâmetros, como teor de água
mais adequado, técnicas de congelamento e métodos de descongelamento.
Segundo Taiz & Zeiger (2004), células vegetativas totalmente hidratadas podem
também reter viabilidade, se elas foram esfriadas muito rápidamente, para evitar
a formação de cristais de gelo grandes e de crescimento lento, que poderiam
perfurar e destruir estruturas subcelulares. Os cristais de gelo que se formam
durante congelamento muito rápido são demasiadamente pequenos para
provocar dano. Inversamente, é necessário o rápido aquecimento de tecido
congelado para evitar a transformação de pequenos cristais de gelo em cristais
de tamanhos que possam causar dano ou para evitar a perda de vapor de água
por sublimação, pois ambos ocorrem sob temperaturas intermediárias (-100º a
-10ºC) (Taiz & Zeiger, 2004).
Sror et al. (2003) relataram a existência de proteínas chamadas
crioprotectinas WAX9, que são capazes de estabilizar membranas de tilacóides
congeladas a -20ºC. Essas proteínas explicariam a tolerância ao congelamento de
sementes sem o uso de crioprotetores. Hincha et al. (1993) descreveram, ainda,
183
que há semelhanças na estrutura de crioprotectinas e LEA proteínas, sendo estas
responsáveis pela tolerância à dessecação em sementes.
5.4 Quantificação e integridade do DNA nuclear
Pela análise por citometria de fluxo do conteúdo de DNA nuclear em
células em interfase de eixos embrionários, verificou-se que houve diferença
estatística entre eixos embrionários armazenados em camâra fria e em nitrogênio
líquido (-196ºC) (Tabela 2). Pelos resultados, verifica-se que os percentuais de
sub-G1 são relativamente altos, o que evidencia, de certo modo, que o material
não foi perfeitamente criopreservado, pois esta fração é um indicativo de
fragmentos de núcleos ou núcleos com tamanho inferior ao do padrão utilizado.
No entanto, detectou-se a existência de núcleos intactos em todos os
tratamentos, representada pelos valores em percentuais G1.
Eixos embrionários mantidos em câmara fria apresentaram valor de sub-
G1 igual a 87%, ou seja, apenas 13% dos núcleos permaneceram intactos em
câmara fria (controle). Nota-se que o crioarmazenamento em nitrogênio líquido
(-196ºC) favoreceu a integridade do DNA nuclear dos eixos embrionários, sem a
necessidade de uso de crioprotetores. Entretanto, quando foram utilizados
crioprotetores químicos, foram verificados menores percentuais de núcleos
intactos em eixos embrionários (Tabela 2).
184
TABELA 2. Análise de quantidade de núcleos intactos (% G1) e fragmentos (%
sub-G1) e germinação (%) de eixos embrionários de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, armazenados em câmara
fria por 6 meses e a -196ºC, por 30 dias, em diferentes
concentrações de crioprotetores (DMSO e glicerol). UFLA, Lavras,
MG, 2008.
Tratamentos % G1 % sub-G1 Germinação (%)
Controle (câmara fria) 13+2,56 c 87+3,87 a 86
Sem crioprotetor 45+5,67 b 55+4,78 b 100
5% glicerol 56
+4,34 a 44+4,56 c 0
10% glicerol 56
+5,67 a 44+6,34 c 0
15 % glicerol 61
+6,31 a 39+7,89 c 0
5% DMSO 54
+5,48 a 46+6,78 c 0
10% DMSO 53
+5,71 a 47+5,67 c 0
15% DMSO 56
+4,58 a 44+6,78 c 0
Médias seguidas por uma mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si
(Scott & Knott, p ≤ 0,05).
Pela Figura 6, podem-se visualizar os percentuais de núcleos intactos
(G1), em função dos diferentes crioprotetores e concentrações testadas.
Concentrações mais elevadas de crioprotetor poderiam ser benéficas para a
manuntenção da integridade nuclear em eixos embrionários de A. colubrina.
Entre os crioprotetores testados, nas mesmas concentrações, houve maior
percentual de núcleos em G1 para o glicerol, comparado ao DMSO.
185
30
35
40
45
50
55
60
65
0 5 10 15
Concentração do crioprotetor (%)
Quantidade de núcleos em G1 (%)
DMSO
Glicerol
FIGURA 6. Quantidade de núcleos, em G1(%), em eixos embrionários de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan criopreservados a -196ºC
por 30 dias, em função de diferentes concentrações (0%, 5%, 10%
e 15%) de crioprotetores (DMSO e glicerol). UFLA, Lavras, MG,
2008.
Esta maior freqüência de células interfásicas é esperada, pelo fato de a
interfase ser a fase mais longa do ciclo celular na maioria das células de
organismos eucariotos. O ciclo celular das células somáticas está dividido em
duas fases: a interfase e a divisão celular ou mitose. A interfase é constituída
pelas fases G1 (crescimento celular), S (duplicação dos cromossomos) e G2
(preparo para a divisão celular) (Molina et al., 2006). Como os eixos
embrionários na semente não embebida estão fisiologicamente inativos, espera-
se que não sejam observados núcleos na fase S e G2.
186
Lezcano et al. (2004) também verificaram, pelo uso de citometria de
fluxo, a toxicidez dos crioprotetores, DMSO e glicerol, sobre células
espermáticas de peixes. Esses agentes, em concentrações de 5% a 30%,
reduziram significativamente a viabilidade celular.
5.5 Avaliação ultraestrutural de eixos embrionários criopreservados
Quando se comparam, ultra-estruturalmente, as células de eixos
embrionários antes do armazenamento (Figura 7A), constata-se que nenhum
dano aparente foi visualizado em eixos embrionários, após a criopreservação em
diferentes temperaturas inferiores a zero (Figura 7B, 7C e 7D), sendo possível
distinguir a presença de corpúsculos aproximadamente do mesmo tamanho da
Figura 7a. No entanto, o padrão de distribuição desses corpúsculos alterou-se,
ocorrendo de modo mais aleatório nas células. Talvez o congelamento tenha
afetado o citoesqueleto, causando distúrbio na distribuição dos componentes
celulares.
Embora não fossem evidentes sinais visuais de necrose em eixos
embrionários de A. colubrina, a não regeneração desses, quando se utilizaram
crioprotetores químicos no armazenamento em temperaturas inferiores a zero,
pôde ser confirmada pelas análises ultra-estruturais (Figuras 7E e 7F). As
alterações celulares durante a criopreservação dos eixos embrionários acontecem
pela desorganização do conteúdo celular e vários danos às células, como dobras
na parede celular e fragmentação do citoplasma.
O mesmo foi relatado por Faria et al. (2006), ao estudarem o
armazenamento, a 5ºC, de embriões de Inga vera subsp. affinis.
Wesleysmith et al. (1995) verificaram, em eixos embrionários de Pisum
sativum L. embebidos em água destilada por 24 horas, que a integridade do
tonoplasto e a estrutura interna da matriz mitocondrial foram mantidas após
187
descongelamento, embora anormalidades na plasmalema tenham sido
observadas em 77% das células examinadas, não tendo sido constatada a
regeneração desses eixos embrionários hidratados. Esse fato pode ser explicado,
segundo esses mesmo autores, pelo fato de que, após 24 horas de embebição, os
eixos embrionários tornaram-se sensíveis à dessecação, coincindo com a redução
no conteúdo de oligossacarídeos, que agem como crioprotetores endógenos das
células contra o congelamento.
Apesar de o glicerol ser o crioprotetor mais utilizado no congelamento de
diferentes materiais biológicos, seus efeitos deletérios sobre os espermatozóides
ocorrem, provavelmente, pelas alterações causadas na membrana plasmática
(Soares et al., 2002).
Kyrychenko & Dyubko (2008) sugerem que o efeito citotóxico dos
crioprotetores, como o DMSO e o glicerol, em contato por longos períodos com
a membrana celular, podem resultar em danos irreversíveis na membrana, em
função da perda da integridade da estrutura da bicamada lipídica.
188
e
pc
(D)
(A)
e
p
c
e
pc
(B)
e
pc
(C)
e
pc
(E)
e
pc
(F)
FIGURA 7. Eletromicrografia de eixos embrionários de sementes de
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, antes do
armazenamento (testemunha) (A) e após 30 dias em nitrogênio
líquido (-196ºC) (B), a -80ºC (C), a -20ºC (D) e a -196ºC, com
uso de glicerol a 15% (E) e DMSO a 15% (F). Barra
correspondente a 2,0 μm (pc: parede celular e: espaço
intercelular, setas: gotículas de lipídios). UFLA, Lavras, MG,
2008.
189
6 CONCLUSÕES
O comportamento das sementes de A. colubrina é ortodoxo quanto à
tolerância ao congelamento.
A conservação de eixos embrionários dessa espécie A. colubrina em
temperaturas inferiores a zero não requer uso de crioprotetores químicos e
propricia elevada percentagem de regeneração no cultivo in vitro.
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198
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados obtidos neste trabalho confirmam a possibilidade de
criopreservação como uma alternativa viável para a conservação de eixos
embrionários de sementes de Anandenanthera colubrina.
Este trabalho acrescenta informações novas e relevantes para a fisiologia
da germinação das sementes, que poderão contribuir para a elaboração de
protocolos visando à conservação de germoplasma de espécies nativas.
199
ANEXOS A
Pág.
Tabela 1A Análise de Deviance para as variáveis contaminação,
oxidação e germinação de eixos embrionários expostos a
diferentes tempos aos desinfestantes (NaOCl e
Paraformaldeído). UFLA, Lavras, MG, 2008...................
205
Tabela 2A Análise de variância para comprimento da maior raiz
formada em plântulas in vitro, cultivadas em diferentes
meios de cultura (MS e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG,
2008..................................................................................
205
Tabela 3A Análise de Deviance para o número de raízes
secundárias formadas em plântulas in vitro de A.
colubrina, em diferentes meios de cultura (MS e WPM)
e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.................................................
206
Tabela 4A Análise de Deviance para formação de calos na raiz de
plântulas in vitro em diferentes meios de cultura (MS e
WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0
mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008...................................
206
Tabela 5A Análise de variância para comprimento de parte aérea de
plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura (MS e
WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0
mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008...................................
207
Tabela 6A Análise de Deviance para contagem de número de
brotações formadas em plântulas in vitro, em diferentes
meios de cultura (MS e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG,
2008..................................................................................
207
Tabela 7A Análise de variância para comprimento da maior
brotação de plântulas in vitro, em diferentes meios de
cultura (MS e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0;
4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.............
208
200
Tabela 8A Análise de Deviance para o número de gemas formadas
em plântulas in vitro de A. colubrina, em diferentes
meios de cultura (MS e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG,
2008..................................................................................
208
Tabela 9A Análise de Deviance para a proporção de abscisão foliar
em plântulas in vitro em diferentes meios de cultura
(MS e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0
e 8,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008..........................
209
Tabela 10A Análise de variância para comprimento da raiz principal
de plântulas in vitro em diferentes meios de cultura (MS
e WPM) e concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0
e 4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008..........................
209
Tabela 11A Análise de Deviance para formação de calos nas raízes
de plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura
(MS e WPM) e concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0;
1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.............
210
Tabela 12A Análise de variância para comprimento de parte aérea de
plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura (MS e
WPM) e concentração de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e
4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.............................
210
Tabela 13A Análise de Deviance para contagem de número de
brotações em plântulas in vitro em função dos diferentes
meios de cultura (MS e WPM) e concentrações de BAP
(0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras,
MG, 2008..........................................................................
211
Tabela 14A Análise de variância para comprimento da maior
brotação em plântulas in vitro, em função dos diferentes
meios de cultura (MS e WPM) e concentrações de BAP
(0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras,
MG, 2008..........................................................................
211
Tabela 15A Análise de Deviance para o número de gemas em
plântulas in vitro, em função dos diferentes meios de
cultura (MS e WPM) e concentrações de BAP (0,0; 0,5;
1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG,
2008..................................................................................
212
201
Tabela 16A Análise de Deviance para abscisão foliar em plântulas in
vitro de A. colubrina, em diferentes meios de cultura
(MS e WPM) e concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0;
1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG,
2008..................................................................................
212
Tabela 17A Análise de variância para comprimento da maior
brotação em segmentos nodais de A. colubrina
inoculados em meio de cultura MS, suplementado com
diferentes concentrações de BAP (0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0
e 10,0mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01; 0,1 e 1,0mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.................................................
213
Tabela 18A Análise de Deviance para número de brotações por
segmento nodal de A. colubrina, inoculado em meio de
cultura MS, suplementado com diferentes concentrações
de BAP (0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 10,0 mg L
-1
) e ANA
(0,0; 0,01; 0,1 e 1,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG,
2008..................................................................................
213
Tabela 19A Análise de Deviance para número de gemas por
segmento nodal de A. colubrina, inoculado em meio de
cultura MS, suplementado com concentrações de BAP
(0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 10,0 mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01;
0,1 e 1,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008....................
214
Tabela 20A Análise de deviance para proporção de formação de
calos na base do explante, inoculado em meio de cultura
MS, suplementado com concentrações de BAP (0,0; 1,0;
2,0; 4,0; 8,0; 10,0mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01; 0,1; 1,0mg
L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.........................................
214
202
TABELA 1A. Análise de Deviance para as variáveis contaminação, oxidação e
germinação de eixos embrionários expostos, por diferentes
tempos, aos desinfestantes (NaOCl e paraformaldeído). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Contaminação Oxidação Plântulas
Desinfestantes 1
11,27
(p=0,0008)
56,05
(p<0,0001)
59,71
(p<0,0001)
Tempos de
exposição dentro de
Desinfestantes
5
18,15
(p=0,0028)
6,92
(p=0,2267)
0,57
(p=0,9892)
Resíduo 63 50,38 25,68 36,53
TABELA 2A. Análise de variância para comprimento da maior raiz formada em
plântulas in vitro, cultivadas em diferentes meios de cultura (MS
e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Fontes de variação Graus de liberdade Quadrado médio (valor p)
Meios de cultura (M) 1 29,1218 (p=0,0009)
Concentrações (C) 4 17,6461 (p<0,0001)
M x C 4 12,5740 (p=0,0009)
Erro 139 2,5281
CV (%) 42,72
1
Pr < W 0,0792
1
Teste de normalidade de Shapiro-Wilk.
203
TABELA 3A. Análise de Deviance para o número de raízes secundárias
formadas em plântulas in vitro de A. colubrina, em diferentes
meios de cultura (MS e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0;
2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Número de raízes secundárias
Meios de cultura (M) 1 27,34 (p<0,0001)
Concentrações (C) 4 42,24 (p<0,0001)
M x C 4 46,93 (p<0,0001)
Resíduo 138 580,41
Total 147 696,92
TABELA 4A. Análise de Deviance para formação de calos na raiz de plântulas
in vitro em diferentes meios de cultura (MS e WPM) e
concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Formação de calos na raiz
Meios de cultura (M) 1 41,54 (p<0,0001)
Concentrações (C) 4 31,89 (p<0,0001)
M x D 4 0,0 (p=0,9999)
Resíduo 140 64,91
Total 149 138,34
204
TABELA 5A. Análise de variância para comprimento de parte aérea de
plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura (MS e WPM)
e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Fontes de variação Graus de liberdade
1
Quadrado médio (valor p)
Meios de cultura (M) 1 0,0308 (p=0,6710)
Concentrações (C) 4 0,1093 (p=0,6322)
M x C 4 0,2836 (p=0,1635)
Erro 91 0,1697
CV (%) 32,30
2
Pr < W 0,0781
1
Valores transformados por y ;
2
Teste de normalidade de Shapiro-Wilk.
TABELA 6A. Análise de Deviance para contagem de número de brotações
formadas em plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura
(MS e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0
mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Número de brotações
Meios de cultura (M) 1 21,48 (p<0,0001)
Concentrações (C) 4 6,12 (p=0,1903)
M x C 4 10,87 (p=0,0281)
Resíduo 140 109,37
Total 149 147,84
205
TABELA 7A. Análise de variância para comprimento da maior brotação de
plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura (MS e WPM) e
concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Fontes de variação Graus de liberdade
1
Quadrado médio (valor p)
Meios de cultura 1 2,5724 (p=0,0030)
Concentrações dentro de meio 7 0,1369 (p=0,8073)
Erro 41 0,2588
CV (%) 30,81
2
Pr < W 0,2797
1
Valores transformados por y ;
2
Teste de normalidade de Shapiro-Wilk.
TABELA 8A. Análise de Deviance para o número de gemas formadas em
plântulas in vitro de A. colubrina, em diferentes meios de cultura
(MS e WPM) e concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0
mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Número de gemas
Meios de cultura (M) 1 148,35 (p<0,0001)
Concentrações (C) 4 9,09 (p=0,0591)
M x C 4 50,67 (p<0,0001)
Resíduo 140 214,14
Total 149 451,25
206
TABELA 9A. Análise de Deviance para a proporção de abscisão foliar em
plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura (MS e WPM) e
concentrações de GA
3
(0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 mg L
-1
). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Abscisão foliar
Meios de cultura (M) 1 0,25 (p=0,6180)
Concentrações (C) 4 5,75 (p=0,2189)
M x C 4 11,63 (p=0,0203)
Resíduo 140 185,06
Total 149 202,69
TABELA 10A. Análise de variância para comprimento da raiz principal de
plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura (MS e WPM)
e concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Fontes de variação Graus de liberdade
1
Quadrado médio (valor p)
Meios de cultura (M) 1 7,8697 (p<0,0001)
Concentrações (C) 4 0,5893 (p<0,0001)
M x C 4 0,1109 (p=0,1076)
Erro 130 0,0572
CV (%) 18,78
2
Pr < W 0,2128
1
Valores transformados por log(y);
2
Teste de normalidade de Shapiro-Wilk.
207
TABELA 11A. Análise de Deviance para formação de calos na raízes de
plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura (MS e WPM)
e concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Formação de calos na raiz
Meios de cultura (M) 1 13,41 (p=0,0003)
Concentrações (C) 4 15,83 (p=0,0033)
M x C 4 17,26 (p=0,0017)
Resíduo 140 158,21
Total 149 204,71
TABELA 12A. Análise de variância para comprimento de parte aérea de
plântulas in vitro, em diferentes meios de cultura (MS e WPM)
e concentração de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Fontes de variação Graus de liberdade
1
Quadrado médio (valor p)
Meios de cultura (M) 1 6,9531 (p<0,0001)
Concentrações (C) 4 1,0381 (p=0,0449)
M x C 4 1,3789 (p=0,0125)
Erro 105 0,4106
CV (%) 43,02
2
Pr < W 0,0592
1
Valores transformados por
y
;
2
Teste de normalidade de Shapiro-Wilk.
208
TABELA 13A. Análise de Deviance para contagem de número de brotações em
plântulas in vitro, em função dos diferentes meios de cultura
(MS e WPM) e concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e
4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Número de brotações
Meios de cultura (M) 1 19,09 (<0,0001)
Concentrações (C) 4 10,69 (0,0303)
M x C 4 2,51 (0,6433)
Resíduo 140 171,55
Total 149 203,84
TABELA 14A. Análise de variância para comprimento da maior brotação em
plântulas in vitro, em função dos diferentes meios de cultura
(MS e WPM) e concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e
4,0 mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Fontes de variação Graus de liberdade
1
Quadrado médio (valor p)
Meios de cultura (M) 1 2,4006 (p=0,0303)
Concentrações (C) 4 0,5044 (p=0,3996)
M x C 4 0,1729 (p=0,8418)
Erro 70 0,4912
CV (%) 38,97
2
Pr < W 0,0780
1
Valores transformados por
y
;
2
Teste de normalidade de Shapiro-Wilk.
209
TABELA 15A. Análise de Deviance para o número de gemas em plântulas in
vitro, em função dos diferentes meios de cultura (MS e WPM) e
concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Número de gemas
Meios de cultura (M) 1 8,67 (p=0,0032)
Concentrações (C) 4 40,19 (p<0,0001)
M x C 4 27,91 (p<0,0001)
Resíduo 140 408,52
Total 149 485,30
TABELA 16A. Análise de Deviance para abscisão foliar em plântulas in vitro de
A. colubrina, em diferentes meios de cultura (MS e WPM) e
concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 4,0 mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Abscisão foliar
Meios de cultura (M) 1 2,01 (p=0,1558)
Concentrações (C) 4 4,27 (p=0,3713)
M x C 4 1,05 (p=0,9027)
Resíduo 140 177,80
Total 149 184,92
210
TABELA 17A. Análise de variância para comprimento da maior brotação em
segmentos nodais de A. colubrina inoculados em meio de
cultura MS, suplementado com diferentes concentrações de
BAP (0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 10,0mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01; 0,1
e 1,0mg L
-1
). UFLA, Lavras, MG, 2008.
Fontes de variação Graus de liberdade
1
Quadrado médio (valor p)
BAP 5 0,9726 (p=0,0027)
ANA 3 0,1625 (p=0,5835)
BAP x ANA 15 0,3526 (p=0,1533)
Erro 109 0,24931
CV (%) 37,03
2
Pr < W 0,1475
1
Valores transformados por y ;
2
Teste de normalidade de Shapiro-Wilk.
TABELA 18A. Análise de Deviance para número de brotações por segmento
nodal de A. colubrina, inoculado em meio de cultura MS,
suplementado com diferentes concentrações de BAP (0,0; 1,0;
2,0; 4,0; 8,0 e 10,0 mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01; 0,1 e 1,0 mg L
-1
).
UFLA, Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Número de brotações
BAP 5 15,51 (p=0,0084)
ANA 3 32,84 (p<0,0001)
BAP x ANA 15 18,65 (p=0,2301)
Resíduo 216 148,39
Total 239 215,39
211
TABELA 19A. Análise de Deviance para número de gemas por segmento nodal
de A. colubrina, inoculado em meio de cultura MS,
suplementado com concentrações de BAP (0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0
e 10,0 mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01; 0,1 e 1,0 mg L
-1
). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Número de gemas
BAP 5 94,49 (p<0,0001)
ANA 3 76,94 (p<0,0001)
BAP x ANA 15 59,38 (p<0,0001)
Resíduo 216 485,14
Total 239 686,53
TABELA 20A. Análise de deviance para proporção de formação de calos na
base do explante, inoculado em meio de cultura MS,
suplementado com concentrações de BAP (0,0; 1,0; 2,0; 4,0;
8,0; 10,0mg L
-1
) e ANA (0,0; 0,01; 0,1; 1,0mg L
-1
). UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Deviances (valor p)
Fontes de variação Gl
Formação de calos na base do explante
BAP 5 54,45 (p<0,0001)
ANA 3 27,95 (p<0,0001)
BAP x ANA 15 5,09 (p=0,9913)
Resíduo 216 81,33
Total 239 168,82
212
ANEXOS B
Pág.
Tabela
1B
Composição do meio de cultura MS (Murashige & Shoog,
1962)..............................................................................................
216
Tabela
2B
Composição do meio de cultura WPM (Llody & McCown,
1980)..............................................................................................
217
213
Tabela 1B – Composição do meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962).
214
Tabela 2B – Composição do meio de cultura WPM (Lloyd & McCown, 1980).
215
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