( PDF ) Análise da diversidade genética dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e da estrutura da população humana do estado de Minas Gerais, Brasil

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ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS

LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA ESTRUTURA DA

POPULAÇÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS

GERAIS, BRASIL

Belo Horizonte

2009

RAQUEL APARECIDA FABRETI DE OLIVEIRA

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RAQUEL APARECIDA FABRETI DE OLIVEIRA

ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS

LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA ESTRUTURA DA

POPULAÇÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS

GERAIS, BRASIL

Belo Horizonte

Instituto de Ciências Biológicas da UFMG

2009

Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação em

Genética do Departamento de Biologia Geral do Instituto

de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas

Gerais, como pré-requisito parcial à obtenção do título de

Mestre em Genética.

Área de concentração: Genética Evolutiva e de

Populações

Orientadora: Prof

Cleusa Graça da Fonseca

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iii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste

trabalho.

Agradeço de modo especial:

À Universidade Federal de Minas Gerais e ao Programa de Pós-Graduação em

Genética por permitirem a realização deste estudo. A todos os professores do programa

pelos ensinamentos.

À Profa. Dra. Cleusa Graça da Fonseca, pela paciência, confiança, compreensão,

incentivo, orientação e disponibilidade.

Ao Prof. Dr. Evaldo Nascimento por todas as oportunidades que a mim concedeu

propiciando sempre o meu aperfeiçoamento profissional e científico, pelas valiosas

sugestões, pela confiança e, sobretudo, por compartilhar comigo sua brilhante experiência

científica. Enfim, por apoiar inteiramente desde o primeiro dia até hoje a realização deste

estudo.

Ao Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade de Transplantes

IMUNOLABTx pela disponibilização dos dados utilizados nesta dissertação. A toda equipe

desse Laboratório, em especial à Roselia e ao pessoal do setor de Biologia Molecular

por compreenderem minhas necessidades e ausências.

Ao Prof. Dr. Eduardo Tarazona pelos ensinamentos, sugestões e pela significativa

colaboração para a realização deste trabalho.

À equipe do Laboratório de Genética quantitativa e conservação animal. Aos amigos

Leonardo, Gustavo, Pilar e especialmente à Luciene pela disponibilidade para discussões.

À minha irmã Renata pela importante ajuda na parte de História de MG.

À pessoa por quem tenho um carinho e uma ligação muito especial, minha irmã Cíntia, por

tudo que compartilhamos e vivenciamos juntas, por nossas afinidades e diferenças, pela

amizade, compreensão e apoio sempre.

Aos meus pais, João e Maria, por terem direcionado meus primeiros passos na caminhada

educacional e me apoiado durante todas as etapas da minha vida.

Ao Marcos pelo apoio com sua alegria e compreensão nos dias difíceis.

A Deus, por tudo.

“A manutenção na natureza de variantes favoráveis e a

eliminação de variantes prejudiciais eu chamo Seleção

Natural. Variações que não são nem úteis nem

prejudiciais não serão afetadas pela Seleção Natural e

são como variantes flutuantes, como talvez

observemos nas espécies chamadas polimórficas”.

(Charles Darwin)

SUMÁRIO

RESUMO .................................................................................................................. 1

SUMMARY ............................................................................................................... 2

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 3

1.1. COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE .................................. 3

1.1.1. História ............................................................................................................ 3

1.1.2. Organização gênica do MHC ........................................................................... 4

1.1.3. Estrutura das moléculas HLA ........................................................................... 6

1.1.4. Herança dos alelos HLA .................................................................................. 10

1.1.5. Expressão e função imune das moléculas HLA .............................................. 10

1.1.6. Polimorfismo nos loci HLA ............................................................................... 11

1.1.7. Nomenclatura dos alelos HLA ......................................................................... 14

1.1.8. Aspectos clínicos relevantes envolvendo as moléculas HLA ........................... 15

1.1.8.1. HLA e transplante ........................................................................................ 15

1.1.8.2. HLA e doenças ............................................................................................. 16

1.1.8.2.1. Doenças infecciosas ................................................................................. 16

1.1.8.2.2. Doenças autoimunes e outras ................................................................... 16

1.2. História evolutiva do MHC/HLA .......................................................................... 17

1.3. Desequilíbrio de ligação e recombinação intergênica nos loci HLA ..................... 20

1.4. Seleção natural nos loci HLA .............................................................................. 21

1.4.1. Seleção Balanceadora .................................................................................... 23

1.5. Variabilidade HLA dentro e entre as populações humanas ................................. 24

1.6. Origem e formação da população de Minas Gerais ........................................... 25

2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ......................................................................... 28

3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 29

3.1. Objetivo geral ..................................................................................................... 29

3.2. Objetivos específicos . ........................................................................................ 29

4. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 30

4.1 População ........................................................................................................... 30

4.2. Critérios de inclusão ........................................................................................... 30

4.3. Critérios de exclusão .......................................................................................... 30

4.4. Aspectos éticos .................................................................................................. 31

4.5. Coleta de amostras e extração do DNA ............................................................. 31

4.6. Tipificação dos loci HLA ..................................................................................... 31

4.7. Análises estatísticas .......................................................................................... 33

4.7.1. Diversidade e Heterozigosidade ...................................................................... 33

4.7.2. Equilíbrio de Hardy-Weinberg ......................................................................... 33

4.7.3. Frequências haplotípicas ................................................................................. 34

4.7.4. Desequilíbrio de ligação ................................................................................... 34

4.7.5. Teste de homozigosidade de Ewens-Watterson ............................................. 34

4.7.6. Estrutura genética ............................................................................................ 35

4.7.7. Análise filogenética .......................................................................................... 35

5. RESULTADOS ..................................................................................................... 37

5.1. Análise das famílias ............................................................................................ 37

5.1.1. Aspectos gerais ............................................................................................... 37

5.1.2. Frequências alélicas ....................................................................................... 37

5.1.3. Frequências haplotípicas ................................................................................ 37

5.1.4. Desequilíbrio de ligação (DL) ........................................................................... 38

5.1.5. Taxa de recombinação entre os loci HLA-A e HLA-B ...................................... 39

5.2. Análise da amostra de indivíduos não aparentados ............................................ 39

5.2.1. Diversidade e Heterozigosidade ...................................................................... 39

5.2.2. Desequilíbrio de ligação ................................................................................... 47

5.2.3. Seleção natural ............................................................................................... 47

5.2.4. Diferenciação da população ............................................................................. 47

5.2.5. Análise filogenética .......................................................................................... 47

6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 53

6.1. Diversidade genética nos loci HLA ...................................................................... 53

6.2. Desequilíbrio de ligação ...................................................................................... 54

6.3. Seleção Natural .................................................................................................. 54

6.4. Estrutura genética populacional .......................................................................... 55

6.5. Análise filogenética ............................................................................................ 57

7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 59

8. ANEXOS .............................................................................................................. 60

Anexo 1 ..................................................................................................................... 60

Anexo 2 ..................................................................................................................... 61

Anexo 3 ..................................................................................................................... 62

Anexo 4 ..................................................................................................................... 63

Anexo 5 ..................................................................................................................... 64

Anexo 6 ..................................................................................................................... 65

Anexo 7 ..................................................................................................................... 67

Anexo 8 ..................................................................................................................... 68

Anexo 9 ..................................................................................................................... 70

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 84

vii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Mapa gênico esquemático da região do MHC. ........................................ 5

FIGURA 2: Estrutura esquemática das moléculas HLA de classe I e classe II. ......... 8

FIGURA 3: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe I mostrando que o

polimorfismo encontra-se localizado nos domínios α1 e α2. ...................................... 8

FIGURA 4: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe II mostrando que

o polimorfismo encontra-se localizado no domínio β1. ............................................... 9

FIGURA 5: Vista frontal da PBR (Peptide binding Region) das moléculas HLA

de classe I e II.......................................................................................................... 9

FIGURA 6: Descobrimento de novos alelos HLA de classe I e II no período de

1987 a 2009. ............................................................................................................ 12

FIGURA 7: Distribuição do alelo HLA-B 40 na população mundial. ......................... 13

FIGURA 8: Princípios da técnica PCR-SSOP. ........................................................ 33

FIGURA 9: Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos brancos (A), negros (B)

e pardos (C) ............................................................................................................. 44

FIGURA 10: Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos brancos (A), negros (B)

e pardos (C) ............................................................................................................. 45

FIGURA 11: Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos brancos (A),

negros (B) e pardos (C) ........................................................................................... 46

FIGURA 12: Dendograma gerado com base nas frequências alélicas dos loci

HLA-A, -B e –DRB1. ............................................................................................... 52

viii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Principais assuntos sobre HLA discutidos nos WIIH. ............................ 4

TABELA 2: Número de alelos, proteínas e alelos nulos nos loci HLA-A, -B e

DRB1. ........................................................................................................................ 11

TABELA 3: Nomenclatura dos alelos HLA. ............................................................... 15

TABELA 4: Fenótipos e doenças associadas aos loci HLA. ..................................... 17

TABELA 5: Imigração no Brasil, por nacionalidade, de 1500 a 1933. ...................... 25

TABELA 6: Escravos africanos no Brasil de acordo com o período. ......................... 26

TABELA 7: Condições de amplificação para a realização da PCR SSOP para

tipificação HLA-A, -B, -DRB1. ................................................................................... 32

TABELA 8: Frequências alélicas dos loci HLA-A e HLA-B. ....................................... 38

TABELA 9: Heterozigosidade nos loci HLA-A e HLA-B. ............................................ 38

TABELA 10: Frequências de haplótipos HLA-A:HLA-B, estimativas de

desequilíbrio de ligação (D’) e sua significância. ....................................................... 40

TABELA 11: Diversidade, heterozigosidade e resultado do teste de HW para os

loci HLA-A, -B e -DRB1. ............................................................................................. 42

TABELA 12: Distribuição da frequência alélica por locus HLA nos grupos de

Brancos, Negros e Pardos. ....................................................................................... 43

TABELA 13: Desequilíbrio de ligação global entre os pares de loci HLA. ................ 47

TABELA 14: Teste de homozigosidade de Ewens-Watterson. .................................. 49

TABELA 15: Medidas de diferenciação genética entre os grupos. ........................... 50

TABELA 16: Matriz de distância genética obtida pelo método de Nei (1972). .......... 51

TABELA 17: Casamentos intergrupos observados na província de Minas Gerais

de 1818-1838. .......................................................................................................... 56

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1 - Poster: HLA-A, -B, -DRB1 allele and haplotype frequencies in 1000

human samples from mixed population of the Minas Gerais state, Brazil. .................. 60

ANEXO 2 - Poster: Strong linkage disequilibria between HLA-A*2402, B*0720

and DRB1*1601 in 5000 volunteers from mixed population from Minas Gerais

state, Brazil. ............................................................................................................... 61

ANEXO 3 - Poster: Strong linkage disequilibrium between HLA A*0201, B*1804

and DRB1*1104 in 5000 volunteers from mixed population from Minas Gerais

state, Brazil. ............................................................................................................... 62

ANEXO 4 - Poster: Analysis of allelic, haplotype diversity, linkage disequilibrium

and inter-loci recombination rate of the MHC Class I region of 917 families from

Minas Gerais state, Brazil. ......................................................................................... 63

ANEXO 5: Parecer do Prof. Dr. Eduardo Martin Tarazona-Santos referente ao

projeto de Mestrado. .................................................................................................. 64

ANEXO 6: Parecer da Professora. Dra. Maria Raquel Carvalho referente ao

projeto de Mestrado. .................................................................................................. 65

ANEXO 7: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Santa Casa de

Misericórdia de Belo Horizonte. ................................................................................ 67

ANEXO 8: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG. .............................. 68

ANEXO 9: Artigo sob revisão a ser submetido ao periódico Human Immunology. ..... 70

LISTA DE ABREVIATURAS e SIGLAS

AIDS

Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

CAP

Células Apresentadoras de Antígenos

CEDEPLAR

Centro de Desenvolvimento e Planejamento Regional de Minas Gerais

Desequilíbrio de ligação

DNA

Ácido desoxirribonucléico

EDTA

Ácido etilenodiaminotetracético

Expectation Maximization

Ewens-Watterson

Índice de fixação

Fnd

Estatística F normalizada

Medida padronizada da diferenciação genética

Hipótese nula

HGDP-CEPH

Genome Diversity Panel Centre d’Etude du Polymorphisme Humain

HLA

Human Leucocyte Antigen

Hobs

Heterozigosidade observada

HUGO

Gene Nomenclature Committee (HGNC)

Hardy-Weinberg

IBGE

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

Intervalo de confiança

Ile

Isoleucina

IMGT/HLA

IMmunoGeneTic HLA Sequence Database

LSDB

Data Base Specific Locus

Mega base

MCMC

Monte-Carlo Markov Chain

MHC

Major Histocompatibility Complex

Minas Gerais

Mato Grosso do Sul

OMS

Organização Mundial da Saúde

PBR

Peptide Biding Region

PCR

Polymerase Chain Reaction

PCR-SSOP

Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probe

PHYLIP

Phylogeny Inference Package

Piauí

Paraná

PYPOP

Python for Population Genetics

Erro padrão

REDOME

Registro Brasileiro de Doadores Voluntários de Medula Óssea

São Paulo

SMOGD

Software for the Measurement of Genetic Diversity

SNP

Single Nucleotide Polimorphism

TCR

T Cell Receptor

UFMG–COEP

Conselho de ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas

Gerais

WIIH

Workshops Internacionais de Imunogenética e Histocompatibilidade

RESUMO

Análise da diversidade genética dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e da estrutura da

população humana do estado de Minas Gerais, Brasil. Belo Horizonte: UFMG, 2009.

Dissertação (Mestrado em Genética, área Genética de População) – Pós-Graduação em

Genética do Instituto de Ciências Biológicas – UFMG.

Os antígenos leucocitários humanos (HLA) são codificados por um sistema altamente

polimórfico designado complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Os genes HLA são

herdados em blocos chamados haplótipos e expressos codominantemente em cada

indivíduo. Os produtos gênicos dos loci HLA influenciam na rejeição a transplantes de

órgãos e tecidos, suscetibilidade a doenças infecciosas e predisposição a um amplo

espectro de doenças crônicas não infecciosas, como doenças autoimunes e câncer. O

objetivo deste estudo foi analisar a diversidade genética dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e a

estrutura genética da população do Estado de Minas Gerais (MG). A amostra foi constituída

com base em duas amostras distintas: (1) indivíduos de 917 famílias que buscavam um

doador HLA compatível para o transplante de células tronco hematopoiética para um

membro da família que possuída doença hematológica e (2) 2868 indivíduos doadores

voluntários de medula óssea, saudáveis, não relacionados e aleatoriamente alocados para

esta pesquisa. Na amostra de indivíduos não relacionados, foi possível categorizar a

amostra em brancos, pretos e pardos segundo autoclassificação baseado nos critérios do

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). A tipificação dos loci HLA foi feita pela

técnica PCR SSOP (Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probe).

Nas amostras analisadas, foram observados, em média, 20, 37 e 13 diferentes alelos para

os loci HLA-A, -B e -DRB1, respectivamente. Foi observada uma elevada heterozigosidade

para todos os loci HLA analisados, com percentuais chegando a 95,1% de indivíduos

heterozigotos na amostra. Observou-se desequilíbrio de ligação estatisticamente

significativo para todos os pares de loci HLA e, com base no estudo de segregação dos

alelos HLA nas famílias, baixa taxa de recombinação entre os loci HLA-A:HLA-B. Baseado

na diferença estatisticamente significativa da proporção de homozigotos observados e

esperados, a seleção natural balanceadora foi inferida como fator contribuinte para a

manutenção da grande variabilidade alélica e haplotípica observada nestes loci. Além disso,

a seleção balanceadora foi apoiada pela distribuição de alelos HLA com frequências

intermediárias em todos os loci analisados. Com base na análise da diferenciação genética

das amostras, foi observada estruturação genética da população. A partir da análise

filogenética, foi possível observar que a composição genética de MG foi predominantemente

de genes de origem europeia e africana com pouca participação dos genes indígenas.

Palavras chave: MHC, HLA, polimorfismo, frequência alélica, frequência haplotípica, recombinação

inter-loci, desequilíbrio de ligação, seleção natural.

SUMMARY

Analysis of genetic diversity at HLA-A, -B and -DRB1 loci and structure of human

population of Minas Gerais, Brazil. Belo Horizonte: UFMG, 2009. Dissertação (Mestrado

em Genética, área Genética de População) – Pós-Graduação em Genética do Instituto de

Ciências Biológicas – UFMG.

Human leucocyte antigens (HLA) are coded by a highly polymorphic system, the major

histocompatibility complex (MHC). HLA genes are inherited as haplotypes and their

expression is codominant. HLA gene products are related to transplant rejection, infectious

disease resistance and non infectious chronic diseases, like cancer and autoimmune

diseases. This study was conducted to evaluate genetic diversity at HLA-A, -B and -DRB1

loci and to analyse the genetic structure of Minas Gerais population, on the basis of two

distinct samples: (1) individuals from 917 families who sought an HLA compatible donor for

transplantation of hematopoietic stem cells to a family member who owned and hematologic

disease (2) 2868 individuals volunteer donors of bone marrow, healthy, unrelated and

randomly allocated for this research. HLA genotyping was done by PCR-SSOP (Polymerase

Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probe) technique, resulting in the

detection, on average, of 20, 37 and 13 different alleles at HLA-A, -B and -DRB1 loci,

respectively. The proportion of heterozygotes attained high values in the three loci, with a

maximum of 95,1% at the HLA-B locus. The three pairs of loci showed statistically

significant linkage disequilibrium and the estimated recombination rate between HLA-A:HLA-

B loci was smaller than expected. The statistically significant difference between expected

and observed homozygous proportions pointed to balancing natural selection as an

important cause of the large allelic and haplotypic diversity observed in these loci. The

importance of balancing selection was also supported by the intermediate allelic frequencies

at the three analyzed HLA loci. Population structure was supported by genetic differentiation

analysis. A predominantly Caucasian and African genetic constitution and a small

contribution of Native American genes was demonstrated by phylogenetic analysis.

Key words : MHC, HLA, polimorphism, allele frequency, haplotype frequêncy, inter-loci

recombination, likage desequilibrium, natural selection..

1. INTRODUÇÃO

1.1. COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE

1.1.1. História

O MHC (Major Histocompatibility Complex) foi descrito primariamente em

camundongos, na década de 30, por Peter A. Gorer (Gorer, 1936; Gorer, 1937). Estudos

demonstraram a existência de um grupo de antígenos envolvidos nos processos de

rejeições dos transplantes de pele entre diferentes linhagens desses animais. Esses

antígenos responsáveis pela rejeição de tecidos foram denominados antígenos de

histocompatibilidade e a região foi designada de sistema H2 no camundongo estando

localizada no cromossomo 17. Desde a descoberta do MHC em camundongos, o MHC se

tornou uma das regiões gênicas mais estudadas no genoma dos vertebrados (Klein, 1986).

Em 1958, um aloantígeno presente nos leucócitos humanos foi identificado,

tornando-se o “primeiro” antígeno leucocitário humano (HLA) denominado HLA-A2 (Dausset,

1958; Payne e Rolfs, 1958; Van Rood, Eernisse et al., 1958) que mais tarde se denominou

Complexo HLA. O estudo destes autores demonstrava a presença de anticorpos no soro

humano de pacientes politransfundidos ou mulheres multíparas, que reagiam com

leucócitos, mas não de todos os indivíduos testados. Os anticorpos destes soros

detectavam um sistema polimórfico de antígenos nos leucócitos humanos. O crédito da

descoberta do primeiro antígeno HLA foi dado a Jean Dausset, que em 1980, recebeu o

Prêmio Nobel de Medicina. Ele nomeou este antígeno de MAC em homenagem a três

indivíduos voluntários, cujos nomes começavam com M, A e C, respectivamente. O antígeno

MAC, que mais tarde foi denominado HLA-A2, estava presente em 60% da população

francesa. Finalmente, o estudo dos antígenos leucocitários adquiria grande importância em

transplante de tecidos (Thorsby, 2009). Posteriormente, diversos outros investigadores

fizeram identificações originais de antígenos leucocitários e atualmente centenas de novos

alelos continuam a ser descobertos.

Desde a descoberta do HLA-A2, Workshops Internacionais de Imunogenética e

Histocompatibilidade (WIIH) são realizados, quando os investigadores da área se encontram

e comparam seus reagentes, técnicas, resultados e comunicam novas descobertas. O

primeiro WIIH ocorreu em 1964 em Durham, NC, Estados Unidos, e o último em 2008, em

Búzios, RJ, Brasil. Várias descobertas importantes foram discutidas e publicadas nos WIIH,

conforme Tabela 1 (Thorsby, 2009).

Tabela 1: Principais assuntos sobre HLA discutidos nos WIIH.

Workshop

Ano

Principais assuntos discutidos

3º

1967

Demonstração da associação dos antígenos HLA com doenças

1968

Criação de um comitê da Organização Mundial da Saúde (OMS) para

o estabelecimento da nomenclatura para os alelos HLA

4º

1970

Estabelecimento de dois loci HLA, LA (posteriormente HLA-A) e 4

(mais tarde HLA-B) e constatação de que os loci eram ligados e

continham pelo menos sete e oito alelos, respectivamente

5º

1972

Descoberta de que o sistema HLA constituía-se em uma importante

ferramenta para investigações antropológicas devido ao polimorfismo

observado

7º

1977

Mapeamento do MHC no braço curto do cromossomo 6 (já descritos

os loci HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ e -DP)

8º

1980

Papel da compatibilidade HLA em transplantes renais

9º

1984

Introdução de várias técnicas para o estudo do polimorfismo dos loci

HLA

10º

1987

Estabelecimento de um painel de referência de linhagens celulares

tipificadas

13º

2002

Estabelecimento da acessibilidade pública a bancos de dados sobre

HLA

15º

2008

Novos dados e aplicações em medicina, antropologia etc.

Em 1987, o grupo de Wiley (Bjorkman, Saper et al., 1987b), usando a técnica de

cristalografia de raio-X, mostrou que parte da molécula HLA-A2 proximal à membrana

celular continha dois domínios parecidos com imunoglobulinas e que o domínio distal à

membrana era uma plataforma antiparalela de filamentos-β, cobertos por duas α-hélices,

que juntos formavam uma grande fenda que constitui o sítio de ligação para antígenos

processados. O grupo ainda mostrou que um peptídeo foi encontrado neste sítio, no cristal

da molécula HLA-A2. Este mesmo grupo, também, foi o responsável por explicar o

fenômeno da restrição HLA-TCR (Receptores de Células T) (Bjorkman, Saper et al., 1987b;

a), discutido mais adiante.

1.1.2. Organização gênica do MHC

O primeiro mapa do MHC baseado em sequência de DNA, publicado em 1999,

descreveu 224 loci, dos quais 128 (57%) eram expressos (Complete sequence and gene

map of a human major histocompatibility complex. The MHC sequencing consortium, 1999).

A sequência estendida do MHC foi publicada em 2004 como parte do sequenciamento

completo do cromossomo 6, passando a cobrir 7,6 Mb do braço curto deste cromossomo

(Horton, Wilming et al., 2004). Atualmente, os nomes dos genes e dos alelos do MHC são

definidos pelo HUGO - Gene Nomenclature Committee (HGNC) - e IMGT/HLA Sequence

Database (Robinson, Waller et al., 2003).

O MHC é uma região poligênica e polimórfica situada no genoma humano, no

cromossomo 6, na banda 6p21.3. O MHC é constituído por mais de 3,6 milhões de bases

(3,6Mb) (Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex.

The MHC sequencing consortium, 1999; A haplotype map of the human genome, 2005), e o

número de loci identificados tem aumentado desde a primeira publicação dos loci na região

HLA, em 1999. O MHC é dividido de acordo com a estrutura e a função dos produtos

gênicos em três regiões classificadas como: classe I, classe II e classe III (Shiina, Inoko et

al., 2004) (Figura 1).

Figura 1: Mapa esquemático dos genes da região do MHC. Os genes HLA clássicos estão

representados em vermelho, os genes HLA não clássicos em verde, os pseudogenes em

amarelo e os genes em rosa, azul e turquesa são genes relacionados com HLA, como

exemplo, os gene TAP2 envolvido no processamento do peptídeo.

Fonte: “Site do Instituto Anthony Nolan Trust Histocompatibility Laboratories”. http://hla.alleles.org/alleles/index.html. Os loci de

classe III não foram representados nesta figura esquemática.

As regiões de classe I e II são altamente poligênicas e polimórficas e codificam dois

grupos de proteínas estruturalmente distintas. A região de classe III encontra-se localizada

entre as regiões de classe I e II e contém um grupo de genes cujos produtos estão

envolvidos nas respostas inflamatórias, tais como: as proteínas da cascata do complemento

(C2, C4 e Bf), citocinas (TNF-α e TNF-β, LTA e LTB), proteínas do choque térmico e muitos

outros genes relacionados com a função imune e inflamatória. A região de classe III contém

mais de 62 loci distribuídos dentro de 0,9 Mb de DNA (Williams, 2001; Shiina, Inoko et al.,

2004).

A região de classe I ocupa aproximadamente 1,8 Mb e constitui a porção mais

telomérica do MHC. Contém 18 loci HLA entre os quais três são clássicos (HLA-A, HLA-B e

HLA-C), expressos por todas as células nucleadas, três são não clássicos (HLA-E, HLA-F e

HLA-G) e 12 pseudogenes (HLA-S/17, HLA-X, HLA-N/30, HLA-L/92, HLA-J/59, HLA-80,

HLA-21, HLA-K/70, HLA-16, HLA-H/54, HLA-90 e HLA-75) (Williams, 2001; Shiina, Inoko et

al., 2004)

A região de classe II ocupa aproximadamente 0,7Mb de DNA e contém os genes que

codificam as cadeias a e b dos loci clássicos de classe II (HLA-DP, HLA-DQ e HLA DR).

Existem 34 loci identificados dentro da região de classe II com 16 genes expressos, três

genes candidatos e 15 pseudogenes. A região de classe II consiste de uma série de

subregiões, cada uma contendo os genes a e b codificando as cadeias α e β,

respectivamente. A família de gene DR consiste de um único gene DRA e mais de nove

genes DRB. O gene DRA codifica uma cadeia α invariável que se liga a várias cadeias β

codificadas pelos genes DRB. Os haplótipos HLA de certos alelos DRB1 contêm

especificamente os loci DRB3, DRB4 ou DRB5. As famílias DP e DQ têm um gene expresso

para as cadeias α e β e pseudogenes não expressos (Shiina, Inoko et al., 2004).

Apenas nove genes estão envolvidos com a apresentação dos peptídeos e são

chamados de genes HLA clássicos, sendo que na região de classe I se localizam os loci

HLA-A, -B e -C e, na região de classe II, os loci DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRA, DRB1

(Williams, 2001).

1.1.3. Estrutura das moléculas HLA

As moléculas HLA de classe I e II são heterodímeros, com domínios extracelulares

variáveis, domínios transmembrana e intracitoplasmáticos constantes (Williams, 2001)

(Figura 2). Diferentemente dos genes receptores de células T e das imunoglobulinas, a

diversidade não é obtida somaticamente, mas através da manutenção de muitos alelos na

população.

As moléculas HLA de classe I são glicoproteínas constituídas de uma cadeia α

composta por três domínios (α1, α2 e α3) e ligada de forma não covalente a uma molécula

de β-2 microglobulina, codificada fora do MHC por um gene localizado no cromossomo 15.

Os genes que codificam as moléculas HLA de classe I têm uma estrutura característica na

qual os diferentes domínios da proteína são codificados por diferentes exons. O

polimorfismo estrutural na molécula HLA de classe I é observado nos domínios α1 e α2

(Figuras 3 e 5), os quais se ligam ao peptídeo que será apresentado aos receptores dos

linfócitos T (TCR). O domínio α

é codificado pelo exon 2, e o α

pelo

exon 3 (Marsh, S. G.

E., Parham, P., Barber L.D., 2000). Os domínios α1 e α2 contêm as sequências variáveis de

aminoácidos e determinam a especificidade antigênica das moléculas HLA de classe I. O

domínio α3 e β-2 microglobulina, juntos, formam a região constante da molécula HLA. Os

domínios de cadeia pesada α1 e α2 formam a fenda de ligação do peptídeo, que pode

conter de oito a dez resíduos de aminoácidos (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D.,

2000).

Os produtos dos genes de classe II, também, são glicoproteínas, mas formadas por

duas cadeias polipeptídicas não covalentemente associadas, α e β. As cadeias α e β são

transmembrana tendo a mesma estrutura geral. Uma porção extracelular composta por dois

domínios de cadeia α (α1 e α2) e uma cadeia β, também com dois domínios (β1 e β2), é

ancorada na membrana por uma pequena região transmembrana e um domínio

citoplasmático. O polimorfismo de classe II ocorre na região aminoterminal do domínio β1

(Figuras 4 e 5). Os domínios α1 e β1 formam a fenda de ligação para os peptídeos

estranhos, que podem medir mais de 12 resíduos de aminoácidos. Os genes que codificam

as cadeias α são designados A (por exemplo, DRA, DQA) e os genes que codificam as

cadeias β são designados como B (por exemplo, DRB, DQB). Os genes que codificam as

cadeias α e β do HLA-DR são DRA1 e DRB1. Quanto à organização intron-exon, as cadeias

α e β têm estruturas similares, nas quais os exons 2 e 3 codificam os dois domínios

extracelulares(Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D., 2000).

Figura 2: Estrutura esquemática das moléculas HLA de classe I e classe II.

Fonte: (Williams, 2001).

Figura 3: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe I. O polimorfismo estrutural

encontra-se localizado nos domínios α1, α2.

Fonte: (Janeway, 2006).

Figura 4: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe II. O polimorfismo estrutural

encontra-se localizado no domínio β1.

Fonte: (Janeway, 2006).

Figura 5: Vista frontal da PBR (Peptide

binding Region) das moléculas HLA de

classe I e II. Os peptídeos ligados estão

representados em vermelho; pontes

dissulfeto, em amarelo. As linhas

pontilhadas indicam pontes de hidrogênio

conservadas entre aminoácidos da cadeia

lateral da molécula HLA e peptídeos

ligados.

Fonte: (Jensen, 2007).

1.1.4. Herança dos alelos HLA

Os alelos HLA são proximamente ligados no cromossomo, e a região MHC completa

é herdada como um haplótipo, com a exceção de haplótipos que sofreram recombinação, de

modo Mendeliano de cada parental. A segregação dos haplótipos HLA dentro das famílias

pode ser determinada por estudos de HLA nessas famílias. Dois irmãos têm 25% de chance

de serem genotipicamente idênticos nos loci HLA, 50% de chance de serem haploidênticos

(compartilharem 1 haplótipo) e 25% de chance de não compartilharem nenhum haplótipo. A

interação entre os alelos HLA é de codominância.

1.1.5. Expressão e função imunológica das moléculas HLA

Apesar de as moléculas HLA terem sido originalmente estudas devido à sua

habilidade em conferir tolerância aos transplantes de tecidos e órgãos, sua função primária

é fornecer proteção contra os patógenos. Isto é obtido através de sofisticadas vias, nas

quais as moléculas HLA de classe I apresentam antígenos endógenos às células T-CD8+ e

as moléculas HLA de classe II apresentam antígenos exógenos às células T-CD4+ (Jensen,

2007).

A via de apresentação de antígenos das moléculas HLA classe I é ativa em todas as

células nucleadas, fornecendo um mecanismo para apresentação, na superfície das células,

de amostras de peptídeos derivados de proteínas que estão sendo sintetizadas na célula em

um dado tempo. Portanto, o proteoma interno é disponibilizado para a vigilância das células

T-CD8+ citotóxicas, que têm a habilidade para detectar e lisar as células que expressam

proteínas virais ou antígenos de tumor. Desse modo os linfócitos T CD8+ reconhecem

peptídeos endógenos apresentados pela molécula HLA de classe I e, uma vez ativados,

desencadeiam uma reação citotóxica, lisando a célula alvo por meio de proteínas

citoplamáticas como a granzima B e a perforina (Rock, York et al., 2004; Jensen, 2007).

A via de apresentação de antígenos das moléculas HLA classe II é ativa somente

nas CAP (Células Apresentadoras de Antígenos), incluindo células dendríticas, linfócitos B,

macrófagos, células epiteliais do timo e linfócitos T ativados. A geração de complexos

peptídeo-HLA classe II e a expressão de moléculas coestimulatórias e citocinas nas CAP

são altamente regulados, refletindo a importância crucial das células T-CD4+ em regular

quase todos os componentes da imunidade adaptativa. Os peptídeos apresentados pelas

moléculas HLA classe II são derivados de proteínas que obtiveram acesso ao

compartimento endossomal, de modo a fornecer uma forma para as células T-CD4+

responderem aos antígenos processados internamente pelas CAP através da fagocitose,

macropinocitose, endocitose mediada por receptor e outros mecanismos (Watts, 2004;

Jensen, 2007).

As células T-CD4+ secretam citocinas capazes de recrutar e ativar um grande

número de células efetoras, principalmente macrófagos e linfócitos T e B. A ativação dos

linfócitos T-CD4+ tem múltiplos efeitos, propiciando a diferenciação e a proliferação dos

linfócitos B, que levam à produção de anticorpos e permitem que os linfócitos T se

diferenciem para as funções efetoras (Jensen, 2007).

Zinkernagel e Dougherty demonstraram, em 1974, que, para induzir a resposta

imune, os linfócitos T devem ter a mesma molécula HLA que a da célula apresentadora de

antígeno. O fato de que os peptídeos são ligados às moléculas HLA e estes complexos são

reconhecidos na superfície das células pelos TCR ficou conhecido como restrição ao MHC

(Zinkernagel e Doherty, 1974).

Tal descoberta resultou de experimentos mostrando que um linfócito T somente

reconhecerá peptídeos quando eles estiverem ligados a uma molécula MHC específica. O

descobrimento da restrição imunológica pelo MHC desempenhou papel chave na resposta

imune adaptativa e permitiu que seu alto polimorfismo fosse interpretado no contexto

funcional. A combinação específica MHC-peptídeo foi usada para concluir que a resposta

imune de indivíduos heterozigotos nos loci MHC seria mais efetiva por responderem de

forma bem-sucedida a uma maior variedade de patógenos (Hedrick, P. W., 2000).

1.1.6. Polimorfismo nos loci HLA

Uma ampla lista de alelos de cada loci dentro do sistema HLA não é possível de ser

publicada porque novos alelos são descobertos e adicionados continuamente. Para

pesquisar a lista mais atual destes alelos, foi acessado, em novembro de 2009, o site

http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/, com banco de dados - denominado IMGT/HLA - atualizado

regularmente. O IMGT/HLA, um banco de dados locus específico (LSDB) para as

sequências de genes do sistema HLA, fornece os recursos para os interesses clínicos ou

científicos no sistema HLA. Atualmente, armazena mais de 2850 sequências de alelos dos

loci HLA-A, -B e DRB1 (Tabela 2 e Figura 6).

Tabela 2: Número de alelos, proteínas e alelos nulos nos loci HLA-A, -B e DRB1.

Genes

HLA Classe I

HLA Classe II

DRB1

Alelos

853

1249

748

Proteínas

652

1046

595

Alelos nulos

Fonte: (Robinson, Waller et al., 2003).

Figura 6: Descobrimento de novos alelos HLA de classe I e II no período de 1987 a 2009.

Fonte: (Robinson, Waller et al., 2003)

Os genes HLA de classe I e II são altamente polimórficos, com o locus HLA-B sendo

o mais polimórfico gene do genoma humano (Mungall, Palmer et al., 2003). Os SNPs (Single

Nucleotide Polimorphism) são o tipo mais comum de variação. Mas as moléculas HLA

apresentam também polimorfismos de inserção/deleção e originados da conversão gênica

(Mungall, Palmer et al., 2003).

As frequências dos alelos HLA exibem variação entre as regiões e entre os grupos

populacionais (Figura 7), com alguns alelos sendo amplamente distribuídos entre

populações e outros aparecendo quase que exclusivamente dentro de uma região ou grupo

particular.

Imigrantes do Estreito de Bering para as Américas há mais de 100 mil anos,

provavelmente trouxeram o alelo DRB1*0802 com alta frequência. Atualmente, variantes do

alelo DRB1*0802, tais como *0807 e *0811, são encontradas nos nativos americanos, assim

como, o DRB1*0802 (Williams, Wu et al., 1994; Mack e Erlich, 1998). Estas variantes se

originaram por mutações nas linhagens germinativas em indivíduos portadores do

DRB1*0802. Novos alelos aparecem regularmente em altas taxas e se tornam fixados na

população, em teoria, se fornecem uma vantagem seletiva na apresentação de peptídeos de

organismos infecciosos. Novos alelos são gerados via mutação de ponto, recombinação e

conversão gênica (Little e Parham, 1999).

A recombinação intragênica pode ser um mecanismo importante na geração da

diversidade alélica nos loci HLA de classe I e II (Satta, 1997). Enquanto as mutações geram

novas variantes em sítios individuais, a recombinação pode produzir múltiplas substituições

Figura 7: Distribuição do alelo HLA-B 40 na população mundial.

Fonte: (Cavalli-Sforza, 1994).

por evento com o potencial para grandes mudanças no sítio de ligação do antígeno nas

moléculas HLA. Portanto, novas moléculas geradas por recombinação podem ter uma maior

vantagem seletiva (Andersson e Mikko, 1995).

1.1.7. Nomenclatura dos alelos HLA

A nomenclatura dos alelos HLA é amplamente baseada em nomes sorológicos

antigos desde que os grupos de epítopos públicos de antígenos HLA foram originalmente

definidos com base na reação com antissoros em testes de microlinfocitotoxicidade

dependente de complemento. Os alelos dentro de um grupo sorológico podem diferir um do

outro por um ou por diversos nucleotídeos. Os antissoros foram, inicialmente, isolados de

mulheres sensibilizadas durante a gravidez por antígenos HLA codificadas pelos haplótipos

paternos.

A nomenclatura do sistema HLA é formalmente estabelecida pelo Comitê de

Nomenclatura da OMS. O Comitê Internacional da OMS responsável pela normatização da

denominação dos alelos de histocompatibilidade se reúne regularmente em Workshops

Internacionais para determinar os nomes oficiais dos alelos HLA. Uma vez que as

informações das sequências de nucleotídeos dos alelos HLA se tornam disponíveis, a

nomenclatura complementar para os termos sorológicos é elaborada (Tabela 3).

Tornando-se disponível a sequência de nucleotídeos do alelo, a nomenclatura

complementar aos termos sorológicos é necessária. Os primeiros dois dígitos do nome de

um alelo se referem à especificidade sorológica, e o terceiro e o quarto dígitos indicam a

sequência específica desse alelo. Múltipos alelos são encontrados dentro de um sorotipo

conhecido, o B35, por exemplo, tem mais de 40 alelos descritos. Outro exemplo são os

alelos HLA-A*0205 e A*0210, que codificam diferentes polipeptídios dentro do sorotipo A2.

Estes dois alelos codificam um epítopo reconhecido pelo antissoro anti-A2, apesar de terem

cinco nucleotídeos diferentes nos exons 2 e 3 resultando em variações de aminoácidos

(Williams, 2001).

Tabela 3: Nomenclatura dos alelos HLA.

Exemplos de alelos

Comentários

A*24 e A*2404

A*24 se refere a qualquer um dos 33 alelos conhecidos

com sequências proximamente relacionadas aos

antígenos de classe I codificados que usualmente

reagem com o antissoro A24. A*2404 é um alelo

específico dentro deste grupo.

DRB1*0801 e DRB1*0805

Diferem no exon 2 no códon 74: nesta posição o

DRB1*0801 tem CTG e o DRB1*0805 tem GCG

codificando Leu e Ala, respectivamente.

A*01011 e A*01012

Diferem por um polimorfismo silencioso no códon 142:

nesta posição o A*01011 tem ATC e o A*01012 tem

ATT. Ambos codificam Ile (Isoleucina).

B*1501101 e B*1501102N

O alelo B*1501102N (nulo) tem uma deleção de 10 pb

próximo ao final 3´ do intrón 1. O mRNA é

impropriamente recomposto com um polipeptídeo

traduzido truncado.

Fonte: (Robinson, Waller et al., 2003).

1.1.8. Aspectos clínicos relevantes envolvendo as moléculas HLA

1.1.8.1. HLA e transplante

O sistema imune é capaz de responder aos órgãos e tecidos transplantados,

reconhecendo os antígenos HLA incompatíveis do doador. A atual interpretação para a

rejeição de órgãos e tecidos é baseada na interação de receptores de linfócitos T com as

moléculas HLA, e peptídeos associados determinam a especificidade da interação. Então,

se os tecidos ou órgãos transplantados carregam moléculas HLA que são diferentes

daquelas do receptor, os complexos HLA-peptídeos resultantes serão reconhecidos como

estranhos pelos linfócitos T do receptor. A resposta imune, assim, será montada contra o

enxerto, resultando na sua rejeição (Janeway, 2006).

O primeiro transplante renal foi realizado com êxito entre gêmeos univitelinos no ano

de 1958, demonstrando a importância dos estudos de histocompatibilidade HLA na evolução

e sobrevida do enxerto.

1.1.8.2. HLA e doenças

1.1.8.2.1. Doenças infecciosas

Descobertas de associação entre alelos HLA e doenças infecciosas mostram que a

variação no sistema HLA está relacionada à resistência ou à susceptibilidade a doenças

infecciosas. Como: 1) Os estudos de associação HLA e doenças infecciosas mostram casos

em que os patógenos contribuem para a distribuição dos alelos HLA em populações

humanas. No caso da malária, o alelo HLA-B*53 e o HLA-DRB1*1302 são super-

representados entre os indivíduos que são resistentes à malária severa, sugerindo que eles

são alelos protetores para a doença. Além disso, esses alelos são mais frequentes entre os

africanos do oeste (que são expostos ao parasito que causa malária) do que em outros

grupos populacionais, indicando seleção que favorece indivíduos com os alelos protetores e,

desta forma, elevando a frequência de tais alelos na população (Hill, Allsopp et al., 1991;

Hill, Yates et al., 1994; Carrington, Nelson et al., 1999). 2) Heterozigotos para os alelos HLA

podem ser mais resistentes a algumas doenças infecciosas do que os homozigotos. No

estudo de progressão para a AIDS entre indivíduos infectados pelo HIV, o tempo de

manifestação da doença foi significativamente mais demorado em indivíduos heterozigotos

para os alelos HLA de classe I (Carrington, Nelson et al., 1999).

1.1.8.2.2. Doenças autoimunes e outras

Além das doenças infecciosas, muitas doenças autoimunes, câncer e doenças de

outras etiologias mostram associação com HLA. Em alguns casos, a associação com as

moléculas HLA de classe I clássicas reflete o Desequilíbrio de Ligação (DL) com o gene real

de predisposição à doença; por exemplo, a hemocromatose. Entretanto, em um número de

exemplos, os riscos para as doenças estão diretamente relacionados às moléculas clássicas

de classe I ou II (Thorsby e Lie, 2005).

Os genes HLA clássicos de classe I e II estão associados a várias doenças (Thorsby,

1997). As moléculas são consideradas associadas com uma determinada doença se a

frequência de um ou mais alelos HLA aumenta ou diminui significativamente quando os

pacientes são comparados com um grupo controle. Nas doenças associadas aos loci HLA,

incluem-se as doenças neurodegenerativas, psiquiátricas, metabólicas, infecciosas,

dermatológicas, oncológicas e as autoimunes (Tabela 4).

Tabela 4: Fenótipos e doenças associadas aos loci HLA.

Fenótipo ou doença

Classe da doença

Genes associados

Leucemia linfoblástica aguda infantil (LLA)

Câncer

HLA-DRB1

Mieloma múltiplo

Câncer

HLA

Hepatite autoimune

Imune

HLA-DRB1

Psoríase

Imune

HLA classe I

Miastenia de gravis

Imune

HLA classe II

Lupus eritematoso sitêmico

Imune

HLA classe II

Pênfico vulgar

Imune/Dermatológica

HLA DQ beta

Doença de Grave

Imune/Endócrina

HLA-DRB1, -DQA1

Tireoidite de Hashimoto

Imune/Endócrina

HLA-A2

Diabetes mellitus tipo 1

Imune/Endócrina/Meta

-bólica

HLA-DRB1*03/*04

Doença celíaca

Imune/Gastrointestinal

HLA classe II

Doença de Crohn

Imune/Gastrointestinal

HLA-DRB1

Baixa resposta imune à vacina para

hepatite B

Imune/Infecção

HLA-DR14-DR52

Uveíte anterior aguda

Imune/Ocular

HLA-B27

Doenças de Behcet

Imune/Ocular

HLA-B51

Asma

Imune/Respiratória

HLA-DRB1, -DQB1, -

DPB1

Espondilite anquilosante

Imune/Reumatológica

HLA-B27

Doença do enxerto contra o hospedeiro

aguda (DECH)

Inume/Transplante

HLA

Doenças de Alzheimer

Neurodegenerativa

HLA-A2, DRB1

Narcolepsia

Neurológica

HLA-DQB*06

Autismo

Psíquica

HLA-DRB1

Esquizofrenia

Psíquica

HLA

Fonte: Genetic Association Database (GAD) http://geneticassociationdb.nih.gov/cgi-bin/index.cgi.

1.2. História evolutiva do MHC/HLA

O MHC de classe I e II está presente somente nos vertebrados mandibulados, e esta

distribuição filogenética é paralela à das imunoglobulinas e dos receptores de linfócitos T.

Os genes HLA de classe I e II são partes do sistema imune adaptativo, assim como os

receptores dos linfócitos T e as imunoglobulinas (Flajnik e Kasahara, 2001). Pelo menos

quarenta por cento dos loci MHC expressam proteínas envolvidas na resposta imune, o que

pode refletir em coevolução de funções ou em coexpressão de transcritos relacionados

(Meyer e Thomson, 2001).

O MHC é a região mais importante do genoma humano com relação à infecção e

autoimunidade, além de ser crucial na imunidade inata e adaptativa. Esta região gênica é

composta por um grupo de genes ligados envolvidos funcionalmente com o sistema imune

inato e adaptativo. No MHC de mamíferos, existem de dois a cinco diferentes blocos de

duplicações de classe I compreendidos dentro da estrutura dos genes conservados não-

classe I e/ou não-classe II (Flajnik e Kasahara, 2001).

Compreender a história evolutiva dos loci HLA implica compreender uma complexa

estrutura, afinal os loci são compostos por segmentos com diferentes níveis de diversidade

nucleotídica. O comprimento da sequência genômica dos alelos HLA-DRB1 varia

consideravelmente, estendendo-se de 10.278 pb, para o HLA-DRB1*010101, até 15.191 pb,

para o HLA-DRB1*070101. Esta variação pode ser atribuída principalmente a proporções

variáveis de sequências repetidas nos introns (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D.,

2000).

A idade do polimorfismo e a taxa na qual novos alelos são gerados nos loci HLA têm

causado muita controvérsia. Para o locus HLA-DRB1, estudos prévios têm mostrado ser

restrito a 270 pb do exon 2, que representa a parte mais variável do gene. Quando se

excluiu o exon 2 da análise, a diversidade dos sítios sinônimos foi similar à diversidade dos

introns. A diversidade na região não codificante foi, também, similar à média do genoma. O

alelo HLA-DRB1 03 é encontrado em humanos, chimpanzés, bonobos, gorilas e

orangotangos. Quatro alelos HLA-DRB1 01, 04, 07 e 10 são pré-datados da divergência de

humanos e chimpanzés. Com exceção do exon 2, tanto a diversidade na região codificante

quanto a não codificante sugere uma recente origem (<1 milhão de anos atrás) para a

maioria dos alelos no locus DRB1. Os sítios que codificam para os aminoácidos envolvidos

na PBR (Região de ligação do peptídeo) parecem ter uma origem mais remota (Gyllensten,

Sundvall et al., 1991; Gyllensten, Bergstrom et al., 1996).

Tomadas juntas, a recente origem da maioria dos alelos, a alta diversidade entre as

linhagens e a origem mais antiga das sequências motivos do exon-2 são consistentes com a

geração relativamente alta de novos alelos para eventos como conversão gênica. Alguns

dos motivos nas regiões de reconhecimento antigênico podem ter sido preservados como

unidades funcionais por milhões de anos. Mas a idade média da diversidade dentro das

linhagens é, por uma estimativa conservativa, menos que 1 milhão de anos.

Com base na similaridade dos haplótipos entre humanos e chimpanzés, ou na

similaridade da região codificante, tem sido argumentado que novos alelos em muitos loci

MHC são antigos (evolução transespécie) e pré-data dos hominídeos (Arden e Klein, 1982).

Em contraste, outros têm sugerido que realmente existem linhagens alélicas antigas, mas

que novos alelos dentro destas linhagens podem ser gerados rapidamente por eventos

como conversão gênica (Von Salome, Gyllensten et al., 2007).

O MHC é denominado de complexo principalmente porque seus genes em humanos

e roedores foram descobertos agrupados dentro de uma única região genômica ou locus.

Este grupamento gênico é considerado biologicamente e evolutivamente significante e tem

características que permitem inferir que os loci estão sob pressão seletiva, possivelmente

apoiando a expressão coordenada de alelos na forma cis e a baixa taxa de recombinação

(Meyer e Thomson, 2001; Solberg, Mack et al., 2008).

O MHC e o sistema imune adaptativo evoluíram principalmente por translocações,

duplicações e outros eventos de recombinação (Michalova, Murray et al., 2000). Não existe

um candidato definitivo para o gene MHC primordial. Entretanto, baseando-se na

similaridade estrutural e funcional, é geralmente aceito que os genes MHC de classe I e II

têm uma origem comum. Os genes de classe II provavelmente evoluíram dos genes de

classe I por uma série de duplicações em tandem, seguida por divergência estrutural e

funcional (Flajnik, Canel et al., 1991).

A densidade gênica no MHC é estimada de um gene ou pseudogene a cada 16 kb,

existindo diferença na proporção entre genes expressos e pseudogenes entre as regiões.

Em relação à proporção de genes expressos e pseudogenes, tanto a região de classe I

quanto a de classe II parecem ter sido duplicadas muitas vezes, gerando novos membros de

famílias gênicas que têm divergido em novas funções. Uma explicação para manter o alto

nível de pseudogenes pode ser o envolvimento deles na geração de novos alelos por

conversão gênica, fenômeno que foi observado em outros loci do sistema imunológico

humano. Novos alelos são gerados por mutação de ponto, recombinação e eventos de

conversão gênica (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D., 2000).

Cinco por cento do genoma humano pode ser atribuído a duplicações de segmentos

gênicos e que as duplicações em grande e pequena escala podem explicar a distribuição

das famílias de genes humanos (Bailey, Gu et al., 2002). A duplicação de seguimentos no

MHC resulta na formação de clusters de genes do sistema imune. Isto pode explicar por que

nos produtos de genes fisicamente associados, como por exemplo, HLA-DRA e HLA-DRB, a

ligação pode garantir que os componentes protéicos sejam coexpressos em quantidades

apropriadas para a formação do heterodímero. A coordenação na expressão dos genes

pode ser uma possível vantagem deste tipo de clusterização. Os genes MHC de classe I e II

são submetidos a duplicação e deleção periódicas dentro e entre as espécies,

possivelmente em resposta à demanda de taxa de mudança dos patógenos (Horton,

Wilming et al., 2004). Os genes do sistema imune, incluindo os genes do MHC, devem estar

sob forte pressão seletiva para a diversidade a fim de lidar com todas as mudanças dos

epítopos dos patógenos, e a duplicação seguida por diversificação fornece um dos meios de

se obter (Hedrick, P. W., 2000).

1.3. Desequilíbrio de ligação e recombinação intergênica nos loci HLA

Os alelos de diferentes loci na região HLA são frequentemente encontrados nos

cromossomos em combinações que ocorrem em frequências distintas daquelas esperadas

(baseadas na associação aleatória de alelos em loci diferentes, resultando em DL). Os

genes HLA de classe I e II apresentam significativos DL que foram observados em várias

populações do mundo (Trachtenberg, Vinson et al., 2007; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et

al., 2009). O DL é muitas vezes quase completo entre os loci fortemente ligados, enquanto

genes menos fortemente ligados (separados por uma distância física maior) mostram

valores intermediários de DL (Hedrick, P. W., 2000). Desta forma, apesar da grande

quantidade de alelos expressos em cada loci HLA, o número de haplótipos observados na

população é muito menor que o esperado teoricamente (Myers, Bottolo et al., 2005).

Em algumas regiões do MHC a concordância entre a distância física e a taxa de

recombinação é menor que o esperado, dado o padrão de 1% de recombinação por Mb de

DNA na meiose. A taxa de recombinação entre os loci HLA-A e HLA-B, por exemplo, é de

0,31% (Carrington, 1999), o que é menor que o esperado para o segmento de DNA de 1,4

Mb. Esse contraste tem sido atribuído ao DL, que pode estar associado à ocorrência de

sítios de recombinação não aleatórios (Carrington, 1999).

A diversidade haplotípica é inversamente relacionada ao DL entre os loci HLA, e a

diminuição do LD entre os loci é proporcional ao aumento da distância física e genética e, de

uma forma geral, reflete sua probabilidade gradualmente aumentada de recombinação

(Dawson, Abecasis et al., 2002). Sob neutralidade, uma mutação recém-introduzida

inicialmente seria de baixa frequência na população, mas ao mesmo tempo mostra completo

DL com o haplótipo no qual se originou. Com o passar do tempo, a freqüência deve

aumentar para ele ser detectável no restante da população, mas o DL com as variantes

ligadas diminuirá gradualmente devido à recombinação (Hedrick, P. W., 2000). Evidências

empíricas sugerem, entretanto, que esta relação entre DL e distância não é uniforme e que

o genoma humano, ao invés disso, é organizado em blocos regionais de alto DL interno,

com pouco ou nenhum DL entre os blocos. Dentro dos blocos, poucos haplótipos comuns

representam a maioria dos cromossomos até mesmo em diferentes populações, e os

eventos de recombinação são localizados entre os blocos no chamado hotspots de

recombinação (Hedrick, P. W., 2000).

1.4. Seleção natural nos loci HLA

Tem sido postulado que a diversidade HLA tem evoluído sob pressões seletivas em

diferentes áreas geográficas. Isto pode estar relacionado com o papel das moléculas HLA

na apresentação de agentes infecciosos prevalentes em diferentes áreas do mundo

(Solberg, Mack et al., 2008) . Os loci HLA-B e HLA-DRB1 têm, respectivamente, mais que

1029 e 556 alelos conhecidos (Robinson, Waller et al., 2003). O evidente alto polimorfismo

indica que esses genes estão sofrendo algum tipo de seleção, provavelmente seleção

balanceadora. A seleção balanceadora mantém novos alelos e alelos com baixa frequência

em frequências mais uniformemente distribuídas que o esperado sob o modelo de evolução

neutra (Bamshad e Wooding, 2003). Assim, nos loci HLA, a diversidade genética é maior

que a esperada com o espectro de frequência alélica caracterizado por um excesso de

alelos com frequência intermediária. A seleção balanceadora aumenta a diversidade dentro

da população relativa à diversidade total, já que os alelos são conservados em uma

frequência parecida se comparado com o locus neutro. Desta forma, uma região que é

caracterizada por excesso de alelos de frequência intermediária ou por uma diferenciação

entre populações menor que a esperada para aquele marcador (baixos valores de G

) deve

estar sob seleção balanceadora (Bamshad e Wooding, 2003). Sob condições neutras, o

número esperado de alelos é muito menor do que o realmente observado nos loci HLA

(Hedrick, 1983; Hedrick e Thomson, 1983).

A seleção balanceadora envolve a vantagem de alelos raros. Dois tipos de seleção

que caracterizam a vantagem de alelos raros são a seleção dependente de frequência

negativa e a sobredominância. Na seleção dependente de frequência negativa, a adaptação

de um alelo diminui à medida que ele se torna mais comum na população. Na

sobredominância, o heterozigoto mantém uma vantagem seletiva sobre o homozigoto, e,

portanto, um alelo raro se beneficia de sua presença no heterozigoto. Existe uma correlação

positiva entre a riqueza de patógenos, especialmente relacionado aos virais e a

heterozigosidade nos loci HLA, corroborando com o modelo de seleção dirigida por

patógenos na manutenção dos altos níveis de diversidade nos loci HLA (Hedrick, P. W.,

2000).

O número de alelos varia entre as populações, possivelmente na maneira relatada

pela história demográfica e o grau de miscigenação. Populações isoladas (exemplo,

Ameríndios) usualmente têm menos alelos que populações miscigenadas. Populações

africanas comumente têm um maior número de alelos, como é também o caso de outros

genes nucleares (Meyer, Single et al., 2006).

A razão entre substituições não sinônimas (Ka) e sinônimas (Ks) indica se o gene

está sob seleção purificadora (Ka/Ks <1), seleção balanceadora (Ka/Ks >1) ou seleção

neutra (Ka/Ks ~1) (Hedrick, P. W., 2000). De acordo com a teoria neutra, a extensão do

polimorfismo é balanceada pelo input mutacional e pela deriva genética aleatória. Quanto

menor o tamanho efetivo da população (Ne), maior a deriva genética e menor o

polimorfismo. A diversidade nucleotídica sinônima em genes humanos não-HLA é cerca de

0,03% a 0,11% (Li e Sadler, 1991). Por outro lado, Satta (1992) analisou as sequências das

regiões codificadoras completas dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e descobriu que a diversidade

nucleotídica sinônima é cerca de 4% na classe I e 8% no locus DRB1 (Takahata, 1993).

Este valor é 50 a 100 vezes maior que os loci não-HLA. Klein e colaboradores (1992)

concluíram que a diferença não pode ser atribuída à alta taxa de mutação nos loci HLA,

porque a taxa de substituição nucleotídica sinônima estimada de comparações

interespecíficas de genes DRB1 é tão baixa quanto a de outros genes (Satta, 1992).

As substituições de nucleotídeos entre diferentes linhagens alélicas são somente 1,5

vez maior no exon 2 que nos introns, o que eleva a 20 vezes a magnitude em comparação

com os alelos dentro de cada linhagem alélica. Esta característica pode indicar seleção no

exon 2, que codifica a PBR (Peptide Biding Region). De acordo com Takahata (Takahata e

Satta, 1998), (1) a diversidade nucleotídica tanto intra quanto interlinhagem HLA é maior nos

exons que codificam o PBR do que nos exons que codificam o não-PBR; (2) para a maioria

dos exons, a diversidade entre linhagens é muito maior do que a diversidade nucleotídica

dentro das linhagens; (3) a média de diversidade dentro e entre as linhagens é pelo menos

20 vezes maior que em outros loci não-HLA; e (4) a diversidade nucleotídica é estimada em

3,9 + 1,2% no locus HLA-A, 3,4 +1,1% no locus HLA-B e 6,0 +1,1% no locus HLA-DRB1.

A diversidade nucleotídica sinônima é muito maior nos loci HLA do que a observada

nos loci não-HLA. A maior diversidade encontrada nos exons que codificam a PBR fornece

forte evidência para a operação da seleção balanceadora na substituição nucleotídica não

sinônima na PBR. O alto nível de diversidade nucleotídica sinônima nos exons da PBR e até

mesmo em outros exons é um reflexo da ligação entre sítios sinônimos, que são

presumivelmente neutramente selecionados, e sítios não sinônimos nas PBR, que são alvos

da seleção balanceadora.

Diversas evidências apoiam a hipótese de que o polimorfismo HLA é seletivamente

mantido:

1) O grande número de alelos por si só não é suficiente para evidenciar que os

genes MHC estão sob seleção. Entretanto, diversas outras características podem reforçar

esta evidência.

2) O número de sítios polimórficos entre os alelos nos loci HLA é muito grande.

Mutações não silenciosas são observadas no sistema HLA com frequência relativamente

alta, se comparadas a mutações silenciosas, provendo evidência de que o polimorfismo tem

sido ativamente selecionado na evolução do MHC.

3) Poucos alelos são raros e muitos são encontrados com frequências relativamente

similares.

4) A distribuição da variação do gene é proximamente vinculada às funções exibidas

pelas regiões da molécula HLA, com a maior variabilidade sendo observada na PBR. Por

outro lado, mudanças nos sítios que interagem com moléculas invariantes ou que são

críticos para a estrutura terciária serão usualmente prejudiciais à função da molécula. A

seleção, então, eliminará mutantes e conservará tais sítios amplamente constantes, de

modo que os dados de polimorfismos podem ser interpretados à luz de diferentes pressões

seletivas operando em cada região da molécula. Sob neutralidade, a variação deve ser

distribuída aleatoriamente através das regiões genômicas.

1.4.1. Seleção Balanceadora

A sobrevida ao ataque por patógenos requer um grande investimento de muitas e

diferentes estratégias. Isto porque alguns patógenos mudam de alvo por alterar os

antígenos externos (Trowsdale e Parham, 2004). Algumas formas de seleção contribuem

para a manutenção da variação genética na população e aumentam o tempo de vida do

polimorfismo, possivelmente indefinidamente. Estas são coletivamente chamadas de

seleção balanceadora e podem resultar de diversas causas (Hedrick e Thomson, 1983;

Hedrick, P. W., 2000):

1) Vantagem do heterozigoto (sobredominância) - os heterozigotos têm maior adaptação do

que os homozigotos, porque indivíduos que carregam dois alelos nos loci HLA podem

potencialmente responder duas vezes mais peptídeos de patógenos que os homozigotos

sob a hipótese de que cada alelo é capaz de se ligar a diferentes peptídeos patogênicos. A

sobredominância aumenta a proporção de heterozigotos, a heterozigosidade esperada e o

número de alelos no locus e, desta forma, pode contribuir para explicar o polimorfismo HLA

(Hedrick e Thomson, 1983; Hedrick, P. W., 2000).

2) Seleção dependente de frequência - assumindo que os patógenos que sofrem mutação

reduzem as chances de seus peptídeos se ligarem às moléculas HLA, eles são então

favorecidos seletivamente. Mutações nos patógenos que interferem na habilidade de

ligação, como as moléculas HLA, têm maior probabilidade de serem selecionadas,

simplesmente porque a seleção favorecendo tais mudanças de peptídeos nos patógenos

está operando mais frequentemente. Isto resultará em uma diminuição do valor adaptativo

da molécula HLA freqüente. Um alelo HLA novo ou raro, por outro, lado pode ter alto valor

adaptativo, porque poucos patógenos foram expostos e portanto adaptados a eles. Desta

forma, alelos raros favorecidos aumentaram em frequência devido ao seu alto valor

adaptativo. Tornando-se estes alelos frequentes, os patógenos se adaptaram a eles e

diminuirão seus valores adaptativos. Um processo cíclico é então gerado, com alelos

flutuando em frequência ao longo do tempo conforme os patógenos vão se adaptando a eles

(Hedrick e Thomson, 1983; Denniston e Crow, 1990; Hedrick, P. W., 2000).

3) Seleção oscilante - este modelo assume que a intensidade de seleção muda no tempo e

no espaço. Se a frequência do patógeno muda constantemente, diferentes moléculas HLA

serão selecionadas em tempos diferentes. O polimorfismo HLA será então o resultado da

variação HLA acompanhada da variação do patógeno. Este modelo difere do modelo

dependente de frequência porque o valor adaptativo na seleção oscilante muda em função

da frequência do patógeno, enquanto que no modelo dependente de frequência os valores

adaptativos estão realmente mudando com a frequência alélica (Hedrick e Thomson, 1983;

Hedrick, P. W., 2000).

1.5. Variabilidade HLA dentro e entre as populações humanas

O nível de diversidade genética HLA atualmente observado dentro e entre as

populações humanas é o resultado de um complexo mecanismo evolutivo que aconteceu

durante a longa história do Homo sapiens. Nesse mecanismo, seleção natural, deriva

genética, fluxo gênico, isolamentos por distância e expansões demográficas atuaram em

paralelo com a diferenciação cultural no passado da espécie (Hedrick, P. W., 2000; Meyer,

Single et al., 2006).

Os resultados da análise da diversidade genética HLA na população humana

mundial, feita dentro das populações, entre as populações dentro dos continentes e entre

continentes, indicam que os loci HLA A, B e DRB1 exibem uma maior quantidade de

diversidade entre indivíduos da mesma população que o observado pelo polimorfismo

neutro (diversidade média de 90,3% comparada com 84,4%-87,6% para os marcadores

neutros). Além dos resultados da análise de variância, testes de seleção neutra indicam que

os loci HLA-B e HLA-DRB1 são os mais afetados pela seleção balanceada. Este padrão

mostra que as variações nos loci HLA devem ser interpretadas com base tanto na

demografia como nos fatores seletivos (Meyer, Single et al., 2006; Sanchez-Mazas, 2007).

Rosenberg et al, 2002 (Rosenberg, Pritchard et al., 2002) analisaram a diversidade

do genoma humano com 377 loci autossômicos de microssatélites em amostras de 52

populações do HGDP-CEPH (Genome Diversity Panel- Centre d’Etude du Polymorphisme

Humain). No estudo, relatou-se que a população humana mundial encontra-se estruturada

em cinco regiões geográficas: América, África Subsaariana, Ásia oriental, Oceania e um

agrupamento na Europa, Oriente Médio e Ásia central. Também foi observado que o

componente intrapopulacional contribui para 93-95% e que a porção da variação observada

no âmbito interpopulacional foi de 3,6% do total da variância genética.

O polimorfismo dos loci HLA tem sido analisado em populações humanas com o

objetivo de investigar a relação genética e reconstruir eventos de migração ocorridos no

passado (Imanishi, 1992). A aplicação dos dados de HLA em estudos antropológicos é

atrativa porque se trata de loci altamente polimórficos necessários para a comparação de

populações (Sanchez-Mazas, 2001).

1.6. Origem e formação da população de Minas Gerais

A população mineira é miscigenada e representada por indivíduos de diversos

grupos populacionais, incluindo caucasianos imigrantes de vários países da Europa (Itália,

Espanha, Alemanha e principalmente de Portugal) (Tabela 5), população africana (Tabela 6)

e população de nativos americanos. A migração forçada de africanos para o continente

Americano ocorreu do século XV ao século XIX. Os africanos que foram trazidos para o

Brasil como escravos se originaram principalmente de duas regiões geográficas: (1) Centro-

oeste/Sudeste Africano (Angola, Moçambique e Congo) e (2) Oeste Africano, cobrindo todas

as regiões ao norte do Golfo da Guiné (Klein, 2002). A maioria dos escravos de Minas

Gerais veio de Angola. Entretanto, as consideráveis migrações de escravos ocorridas entre

os estados, no século XIX, homogenizaram sua distribuição. Entre os anos de 1500 e 1972,

58% dos imigrantes que chegaram ao Brasil foram europeus, 40% foram africanos e 2%

foram asiáticos de acordo como o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (I.B.G.E,

2000).

Tabela 5: Imigração no Brasil, por nacionalidade, de 1500 a 1933.

Nacionalidade

Efetivos decenais**

1500-1808*

1884-1893

1894-1903

1904-1913

1914-1923

1924-1933

Portugal

465.000

Alemães

22778

6698

33859

29339

61723

Espanhóis

113116

102142

224672

94779

52405

Italianos

510533

537784

196521

86320

70177

Japoneses

11868

20398

110191

Portugueses

170621

155542

384672

201252

233650

Sírios e turcos

7124

45803

20400

Outros

66524

42820

109222

51493

164586

Total

883668

852110

1006617

503981

717223

Fonte: Adaptado de: *(Pena, S. D. J., Carvalho-Silva, D. R. , Alves-Silva, J , Prado, V. F. , Santos, F. R. , 2000) e **(I.B.G.E, 2000).

Tabela 6: Escravos africanos no Brasil de acordo com o período.

PERÍODO

NÚMERO

1551-1700

580.000

1701-1810

1.891.000

1810-1857

1.145.000

TOTAL

3.616.000

Fonte: (Pena, S. D. J., Carvalho-Silva, D. R. , Alves-Silva, J , Prado, V. F. , Santos, F. R. , 2000).

Os primeiros bandeirantes chegaram a Minas Gerais em 1596, mas a colonização

efetiva do Estado somente se deu com a descoberta do ouro, em 1693, e sua exploração

sistemática a partir do início do século XVIII (I.B.G.E, 2000). Assim começou o ciclo do ouro.

Entretanto, a história de Minas Gerais antecede a chegada dos bandeirantes paulistas e

colonizadores europeus o que se comprova pela existência de centenas de sítios

arqueológicos (Campos, 2005). Estudos mais recentes demonstram que o atual território

mineiro foi habitado por mais de cem tribos diferentes de índios. Quatro grupos indígenas

que se localizam em Minas pelo menos desde o período colonial ainda vivem no território

mineiro: Maxakalí, Krenak, Aranã e Xacriabá. Atualmente, restam, além dos quatro grupos

citados acima, apenas alguns povos indígenas entre os quais estão: os Pataxós, os Xucuru-

Kariri, os Pankararu e os Kaxixó (Campos, 2005).

A colonização da Minas Colonial tem sua raiz na busca pelo ouro, prata e pedras

preciosas. Informações sobre as riquezas minerais levaram à organização de bandeiras

paulistas, que iniciaram a exploração do território no final do século XVII. Os primeiros

portugueses chegaram a Minas Gerais ainda no século XVII. A partir de 1710, os

portugueses passaram a monopolizar as minas de ouro, o que atraiu pessoas de todo o

território luso-brasileiro e, principalmente, de Portugal. Os escravos vieram em sua maioria

de Angola, embora pertencessem a diversas etnias. Nesse período, MG tornou-se a região

brasileira com o maior número de escravos, que passaram a compor a maioria da população

mineira no século XVIII (Martins, 1980). Além dos bandeirantes paulistas, também houve

uma corrida de outros brasileiros para a região. Estes eram resultado do processo de

miscigenação ocorrido nos 200 anos anteriores de colonização. Os bandeirantes paulistas,

por exemplo, eram mamelucos, filhos de euro-descendentes e ameríndios. Veio também

grande número de pessoas da Bahia e do Rio de Janeiro. Estes indivíduos, juntamente com

os portugueses, ficaram conhecidos como emboabas, inimigos dos bandeirantes. Os

conflitos entre os dois grupos foram constantes durante todo o período minerador (Souza,

1994).

A partir da metade do século XVIII, o ciclo do ouro atingiu seu auge e, assim, sua

posterior decadência. Apesar de ter ocorrido uma emigração do estado, as atividades da

mineração foram substituídas pela agricultura e pecuária, e parte da população se manteve

no estado dispersando-se pelo interior (Prado, 1999).

Em 1873, mesmo após o fim do tráfico negreiro, a população escrava no estado era

de 380.000. Os imigrantes também contribuíram para a formação da identidade mineira. No

final do século XIX e início do XX, chegaram a Minas Gerais grandes quantidades de

estrangeiros com destaque para imigrantes italianos, destinados principalmente ao trabalho

nas lavouras cafeeiras; os espanhóis; os sírio-libaneses, dedicados ao comércio; e os

alemães (Tabela 5). Atualmente, a maior parte da população mineira é descendente de

colonos portugueses e de escravos africanos que chegaram nos séculos XVIII e XIX. Além

desses, contribuíram para a diversidade da população mineira índios, bandeirantes

paulistas, italianos, espanhóis, alemães e sírio-libaneses. Assim, a formação da população

de Minas Gerais pode ser resumida em três aspectos: imigração de portugueses, brasileiros

e escravos devido ao ciclo do ouro; posterior sustentação do povoamento pela substituição

da mineração pela agricultura e pecuária; imigração europeia nos séculos XIX e XX

(Campos, 2005).

De acordo com a Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios realizada pelo

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em 2005, a população mineira,

estimada em aproximadamente 19,3 milhões de habitantes – naquele ano –, se distribuía da

seguinte forma: 46% de brancos, 46,3% de pardos (cafuzo, mameluco, mulato ou mestiço),

e 7,5% de negros e 0,2% amarelos e indígenas. Em relação à região metropolitana de Belo

Horizonte, a distribuição da população segundo autodeclaração de cor de cada indivíduo foi

da seguinte forma: 40,4% de brancos, 50,5% de pardos, 8,9% de negros e 0,2% de

amarelos/indígenas (I.B.G.E, 2000)

2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

O sistema HLA é altamente informativo em estudos de genética de população e

demografia humana devido ao seu elevado polimorfismo e DL. Estas propriedades permitem

que o sistema HLA seja utilizado como um instrumento de investigação antropológica e

demográfica (bottlenecks e efeito fundador) para caracterizar a composição genética das

diferentes populações, uma vez que a frequência dos alelos HLA e o padrão de haplótipos são

característicos de cada população. Além disso, as diferenças nas frequências alélicas e

haplotípicas entre populações têm sido utilizadas para entender melhor as associações entre

os alelos HLA e algumas doenças infecciosas e autoimunes.

No contexto clínico, o conhecimento da distribuição da frequência alélica em várias

populações é crítico para delinear estratégias de pesquisa em bancos de doadores de medula

óssea, tais como determinação de potenciais compatibilidades de pacientes com o registro de

doadores. Além do que, esses estudos fornecem background essencial para determinar o

desenvolvimento do tamanho ótimo do registro de doadores.

O Registro Brasileiro de Doadores Voluntários de Medula Óssea (REDOME/INCA) tem a

missão de desenvolver, manter e coordenar a reposição de tipificações HLA de doadores para

promover o transplante de células tronco hematopoiéticas entre indivíduos não relacionados.

Para este fim, tem sido feito um pool de doadores de diversos milhões de indivíduos para os

quais a tipificação HLA tem sido realizada. O conhecimento dos parâmetros genéticos

populacionais dos loci HLA assume papel relevante no contexto do transplante de medula

óssea quando se trata de encontrar um doador não relacionado para pacientes que não

encontram um doador compatível em seu núcleo familiar. Para este paciente é efetuada uma

busca de doador no REDOME. Uma classificação dos alelos e haplótipos mais frequentes por

etnia pode diminuir o tempo de procura de um doador ideal, pois a busca inicial poderá ser

efetuada dentro do próprio grupo populacional do paciente, onde há, teoricamente, maiores

chances de se encontrar um doador compatível (Pedron, Duval et al., 2003). Além disso, o

conhecimento destes parâmetros permitirá estimar as reais chances de um paciente, em lista

de espera por transplante, encontrar um doador não relacionado com HLA idêntico.

Ainda no contexto clínico, os estudos envolvendo as moléculas HLA são importantes no

desenvolvimento de vacinas no sentido de melhorar a especificidade da ligação HLA-epítopos

antigênicos. Os alelos HLA-B7, B44, B58 e B62 desempenham um papel na modulação da

resposta imune ao sarampo. Esta informação pode ter um grande valor na construção de

vacina baseadas em epítopos (Ovsyannikova, Jacobson et al., 2007).

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Caracterizar geneticamente a população do Estado de Minas Gerais quanto ao

polimorfismo dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e inferir a estrutura genética da população com base

no polimorfismo destes loci .

3.2. Objetivos específicos

1) Estimar os parâmetros de diversidade genética dos grupos estudados.

2) Verificar se os loci HLA-A, -B e -DRB1 estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW).

3) Estimar o DL entre os pares de loci HLA-A:HLA:B, HLA-A:HLA:DRB1 e HLA-

B:HLA:DRB1 e entre os haplótipos HLA-A:HLA-B.

4) Inferir a atuação da seleção natural nos loci HLA.

5) Estimar a taxa de recombinação homóloga entre os loci HLA-A e HLA-B.

6) Verificar a diferenciação genética entre os grupos previamente definidos com base

na autodeclaração de cor de cada indivíduo.

7) Avaliar as relações filogenéticas entre os grupos do presente estudo e outras

populações brasileiras e mundiais.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. População

O estudo foi realizado com base na análise do banco de dados Nefrodata, gerado a

partir de resultados de tipificação HLA disponibilizados pelo Laboratório IMUNOLABTx (Belo

Horizonte, MG). O laboratório possui um setor de tipificação HLA que realiza um grande

número de exames para a seleção do par doador-receptor com o maior grau de

compatibilidade HLA para transplante de órgãos e tecidos. A amostra foi constituída com base

em duas amostras distintas: (1) indivíduos de 917 famílias que buscavam um doador HLA

compatível para o transplante de células tronco hematopoiética para um membro da família

que possuía doença hematológica e (2) 2868 indivíduos doadores voluntários de medula

óssea, saudáveis, não relacionados e aleatoriamente alocados para esta pesquisa. Para

ambas os indivíduos eram cadastrados no banco de dados Nefrodata do IMUNOLABTx,

juntamente com a respectiva tipificação dos loci HLA-A, -B e -DRB1. Os indivíduos não

relacionados foram assim categorizados: brancos (n=1889), negros (n=327) e pardos (n=652).

Um pequeno grupo de 24 indivíduos se autodeclararam indígenas. As freqüências alélicas dos

loci HLA-A, -B e -DRB1 deste grupo foi utilizada na análise filogenética.

As informações referentes à autodeclaração de cor foram obtidas de todos os 2868

indivíduos não relacionados, de acordo com a classificação adotada pelo IBGE.

4.2. Critérios de inclusão

Foram admitidas no estudo as famílias residentes em Minas Gerais cujos haplótipos

maternos e paternos foram determinados com base nos genótipos da prole.

No grupo de 2868 indivíduos não relacionados, foram admitidos no estudo os

indivíduos saudáveis, de ambos os sexos, residentes em Minas Gerais e que foram ao

laboratório IMUNOLABTx para realizar tipificações dos loci HLA-A, -B e -DRB1 no período

de janeiro de 2005 a junho de 2008.

4.3. Critérios de exclusão

No grupo das famílias, foram excluídas deste estudo aquelas cujos haplótipos não

puderam ser definidos pela análise de segregação dos alelos HLA-A e -B observando-se os

genótipos da prole.

Dos 2868 indivíduos não relacionados, foram excluídos do estudo aqueles que

possuíam grau de parentesco com outros indivíduos deste grupo.

Foram excluídos do estudo todos os indivíduos que não eram residentes no Estado

de Minas Gerais.

4.4. Aspectos éticos

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Santa Casa de

Misericórdia de Belo Horizonte sob o número 073/2007 em 31 de janeiro de 2008 (Anexo 7),

e também pelo COEP-UFMG (Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de

Minas Geras) em 11 de março de 2009, sob o parecer número 675/08 (Anexo 8).

4.5. Coleta de amostras e extração do DNA

Para a tipificação dos loci HLA, o sangue de cada indivíduo foi coletado a vácuo em

tubos Vacuntainer (BD, Brasil) contendo o anticoagulante EDTA (ácido

etilenodiaminotetracético). O DNA genômico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico

a partir de 0,5 ml de sangue total pelo método de Salting-out. Após a extração, o DNA foi

submetido à análise de pureza e acertado para a concentração de 20ng/µl com a razão

A260/A280 de 1,65 -1,80.

4.6. Tipificação dos loci HLA

As regiões polimórficas dos genes HLA de classe I e II foram amplificadas a partir do

DNA genômico por meio da PCR (Polymerase Chain Reaction), usando primers que anelam

em 5’ e 3’ das regiões flanqueadoras que são conservadas entre os indivíduos.

Os alelos HLA foram tipificados pelo método PCR-SSOP (PCR - Sequence-Specific

Oligonucleotide Probe) que se trata de hibridização em fase sólida do produto amplificado

com sondas de alelos HLA. A tipificação HLA pela ténica PCR-SSOP se baseia na detecção

simultânea de múltipos polimorfismos HLA. Este método não envolve o sequenciamento de

genes HLA, mas ao invés disso, baseia-se na genotipagem de diversas regiões polimórficas

dentro dos genes HLA. Cada variante dentro de uma região polimórfica é definida pela

combinação de nucleotídeos e é referida como uma sequência motivo. A combinação de

sequências motivos presentes é usada para determinar o par de alelos de um indivíduo.

Todos os procedimentos foram feitos baseado no protocolo recomendado pelo

fabricante e constituiu-se primeiramente em uma etapa de amplificação da região do gene

de interesse, sendo o produto desta amplificação biotinilado (Figura 8-1). Para a tipificação

HLA de classe I (loci HLA-A e -B) foram amplificados os fragmentos gênicos contendo os

exons 2 e 3 usando primers locus específicos. Para a tipificação HLA de classe II (locus

HLA-DRB1) somente o fragmento contendo o exon 2 foi amplificado.

Os kits comerciais utilizados para a tipificação HLA-A, -B e -DRB1 foram,

respectivamente RSSO1A, RSSO1B e RSSO2B1 (One Lambda, CA-USA). Os primers

foram adquiridos comercialmente da empresa fabricante, juntamente com os kits.

Para a realização da reação de amplificação foi utilizada a Taq DNA polimerase

Cenbiotic (Ludwig Biotec -RS- Brazil); os demais reagentes da mistura de reação (dNTPs,

tampão da enzima, cofatores da enzima) estavam presentes no kit para tipificação HLA. A

realização da amplificação do segmento específico foi realizada no termociclador Applied

Biosystems 9700, e as condições de amplificação são mostradas na tabela 7. Após a

amplificação, o produto de PCR foi aplicado em gel de agarose 2,5% e corado com brometo

de etídeo, com a finalidade de verificar o padrão da amplificação.

O produto de PCR marcado foi então desnaturado e mantido na forma de fita simples

por meio do uso de tampões (Figura 8-2). O produto de PCR em fita simples foi re-

hibridizado com oligonucleotídeos-sonda sequência-específicos dos alelos HLA-A, -B e -

DRB1. Estas sondas estavam conjugadas na superfície de microesferas codificadas por

cores (Figura 8-3). Após a re-hibridização, foi feita a marcação com Estreptavidina

conjugada com Ficoeritrina (SAPE) (Figura 8-4). As reações de fluorescência foram lidas no

citômetro de fluxo LABScan 100™, o qual emprega a tecnologia conhecida como Luminex,

em que um laser na cor vermelha, com comprimento de onda de 633nm, reconhece a cor da

microesfera e outro laser na cor verde, com comprimento de onda de 532nm, reconhece se

esta microesfera está ou não marcada com SAPE, o que determina sua positividade e os

traduz, em tempo-real, em quantidade de dados para cada reação. As análises das

tipificações foram realizadas com o pelo do software HLA Fusion versão 3.0 (One Lambda,

CA-USA), que fez a determinação dos genótipos.

Tabela 7: Condições de amplificação da PCR SSOP para tipificação HLA-A, -B, -DRB1.

Etapas

Temperatura e tempo

Número de cliclos

de incubação

96ºC 03:00

96ºC 00:20

60ºC 00:20

72ºC 00:20

96ºC 00:10

60ºC 00:15

72ºC 00:20

72ºC 10:00

4ºC ∞

Fonte: Bula do Kit fornecida pelo fabricante.

Figura 8: Princípios da técnica PCR-SSOP para tipificação HLA.

Fonte: Website www.onelambda.com. da empresa fabricante do kits para tipificação HLA.

4.7. Análise estatística

4.7.1. Diversidade e Heterozigosidade

A diversidade genética em cada locus HLA foi caracterizada a partir dos seguintes

parâmetros: (a) riqueza de alelos ou número de alelos por locus (b) a riqueza de haplótipos

e (c) a heterozigosidade esperada (H

esp

), definida como a probabilidade de que dois alelos

escolhidos aleatoriamente sejam diferentes na amostra (H

esp

= 1-∑p

4.7.2. Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW)

Para avaliar a significância do desvio do equilíbrio de HW, foi utilizado o

procedimento, análogo ao teste exato de Fisher, descrito por Guo e Thompson (Guo e

Thompson, 1992), adotando-se como limite de significância p=0,05. Para isto, foi usado o

programa Pypop (Python for Population Genetics) versão 0.7.0 (Lancaster, Nelson et al.,

2003). O número total de passos na Cadeia Monte-Carlo Markov foi 1.000.000.

4.7.3. Freqüências haplotípicas

Na amostra das famílias, os haplótipos HLA-A:HLA-B foram obtidos por contagem

direta através da análise da segregação dos alelos HLA-A e -B nos membros das famílias.

4.7.4. Desequilíbrio de Ligação (DL)

O teste exato para o DL foi feito para detectar a presença de associação entre os

pares de loci HLA ou entre haplótipos específicos. O LD global, somando as contribuições

(D´

= D

/ D

max

) de todos os haplótipos em um sistema multialélico de dois loci, pode ser

medido utilizando a estatística D´ (Hedrick, 1987), ponderada pelos produtos das

freqüências alélicas dos loci, p

e q

O DL foi computado e a H

(hipótese nula) de equilíbrio de ligação foi testada entre

todos os pares de loci (HLA-A:HLA-B, HLA-B:HLA-DRB1 e HLA-A:HLA-DRB1). Valores de

D´

= 0 indicam segregação independente; por outro lado, valores de D´

= +1 indicam

completa associação entre alelos de loci diferentes.

4.7.5. Teste de neutralidade de Ewens-Watterson

Desvios da neutralidade foram avaliados para cada locus pelo teste de Ewens-

Watterson (EW) (Watterson, 1977; 1978).

Através da análise de modelos populacionais em

que a seleção opera, Watterson (1977) demonstra que a homozigosidade populacional

constitui um teste estatístico poderoso para verificar afastamentos da neutralidade, tanto em

direção à vantagem quanto à desvantagem do heterozigoto. Neste sentido, o autor propõe a

utilização da estatística que ele denomina homozigosidade observada (F

obs

, definida como a

soma do quadrado das freqüências alélicas) e a compara com a F

exp

, a homozigosidade

esperada sob a evolução neutra, para uma amostra de tamanho 2n e número de alelos k,

obtida por meio de simulação.

A diferença entre F

obs

e F

exp

é descrita pelo desvio da homozigosidade normalizado

) que é a diferença entre a homozigosidade observada e a homozigosidade esperada,

dividida pela raiz quadrada da variância da homozigosidade esperada. Desvios

normalizados significativamente negativos resultam de valores mais baixos de

homozigosidade observada que homozigosidade esperada (F

obs

<< F

exp

) e indicam seleção

balanceadora. O valor de p é a probabilidade de obter a homozigosidade estimada pela

estatística-F sob a evolução neutra. O teste foi executado usando-se o programa Pypop.

4.7.6. Estrutura genética

Para avaliar o grau de diferenciação na distribuição da freqüência alélica HLA em

cada locus entre os grupos previamente definidos, foi adotada a estatística G’

, segundo o

método proposto por Hedrick (Hedrick, 2005) usando o programa SMOGD (Software for the

Measurement of Genetic Diversity) versão 1.2.5 (Crawford, 2009). O G’

é um análogo ao

adaptado para alelos múltiplos e que pode variar entre 0 e 1. O programa SMOGD

calcula os seguintes índices de diversidade: G

ST est

(Nei e Roychoudhury, 1972), G’

(Hedrick, 2005) e D

est

(Jost (Jost, 2008). Ele também gera re-amostragens bootstrap dos

dados e utiliza estas re-amostragens para estimar o erro padrão (SE), variância e o intervalo

de confiança (IC) de 95%.

= H

- H

ST (max)

= 1 - H

1 + H

G’

ST___

ST (max)

4.7.7. Análise filogenética

A análise filogenética foi feita pelo pacote de programas Phylip (Felsenstein, 2004),

versão 3.69. Primeiramente, uma matriz de distância genética baseada nas diferenças das

distribuições das freqüências alélicas HLA-A, -B e -DRB1 foi construída utilizando-se o

método de distância genética proposto por Nei (Nei e Roychoudhury, 1972) por meio do

programa Gendist (Phylip). Posteriormente, uma árvore filogenética foi desenhada a partir

da matriz de distância gerada pelo Gendist utilizando-se o algoritmo Neighbor-Joining

proposto por Saitou e Nei (Saitou e Nei, 1987). O desenho final da árvore foi feito pelo

programa TreeView (Page, 1996). Os dados utilizados para esta análise consistiram de

freqüências alélicas dos loci HLA-A, -B e -DRB1 das seguintes populações: Itália

(n=159311), Espanha (n=407), Portugal (n=562), brancos do Paraná (PR) (n=2775), cafusos

do PR (n=319), mulatos do PR (n=186), pardos de São Paulo (SP) (n=239), mestiços de

Onde:

= Heterozigosidade total dos grupos

= Heterozigosidade dentro dos grupos

G’

= Medida padronizada da diferenciação genética

Teresina-Piauí (PI) (n=97), Guiné-Bissau (n=65), Zimbábue (n=230), negros do PR (n=77),

indígenas da tribo Terena do Mato Grosso do Sul (MS) (n=60) e os grupos previamente

descritos neste estudo. As freqüências HLA das populações citadas acima foram obtidas do

banco de dados de freqüências HLA: New Allele Frequency Database:

http://www.allelefrequencies.net.

5. RESULTADOS

5.1. Análise das famílias

5.1.1. Aspectos gerais

Após encontrar um possível doador com base na compatibilidade HLA-A e -B, a

busca por doador na família pode continuar para 44.7% dos receptores, com base nos

outros loci HLA. Dentre os doadores compatíveis, 95.56% eram irmãos, 2.97% eram

progenitores e 1.47% tinham outros tipos de parentesco com os receptores. Cinco dos 18

doadores potenciais, que não eram irmãos, pertenciam a famílias cujos progenitores eram

primos e compartilhavam um haplótipo.

5.1.2. Frequências alélicas

O número de alelos observados nos loci HLA-A e -B foi 20 e 38, respectivamente

(Tabela 8). Para o locus HLA-A, A2 (0,2394), A3 (0,0913), A1 (0,0900) e A24 (0,0862) foram

os alelos mais frequentes. Para o locus HLA-B, B44 (0,1198), B35 (0,1077), B15 (0,0818) e

B51 (0,0796) foram os alelos mais frequentes. Não se observaram desvios das frequências

genotípicas de Hardy-Weinberg em ambos os loci (p> 0,05) (Tabela 9), com alta

heterozigosidade tanto no locus HLA-A quanto no HLA-B (91,7% e 94,3%), respectivamente.

O teste exato, descrito por Guo and Thompson (1992), foi feito para os haplótipos, e não

foram observados desvios das proporções de Hardy Weinberg (p = 0,70928).

5.1.3. Frequências haplotípicas

De um total de 450 diferentes haplótipos HLA-A:HLA-B observados, 194 (43,1%)

tinham mais de cinco cópias (Tabela 10). Os cinco haplótipos HLA-A:HLA:B mais comuns,

cujas frequências excedem 2% foram A2:B44 (0,037350), A2:B51 (0,032443), A1:B8

(0,029989), A29:B44 (0,022901) e A3:B7 (0,020447). Os 47 haplótipos HLA-A:HLA-B com

20 ou mais cópias correspondem a 50,4% do gene pool. Eventos de recombinação

resultaram em dois novos haplótipos: A25:B38 and A31:B72.

Os 403 haplótipos menos frequentes (<20 copies) responderam por 49,6% do total

de haplótipos. Destes, 137 haplótipos foram representados por apenas uma cópia.

Tabela 8: Frequências alélicas dos loci HLA-A e HLA-B.

Entre parêntese, estão as especificidades amplas do locus HLA-B.

Tabela 9: Heterozigosidade nos loci HLA-A e HLA-B.

Locus

Número de

genótipos

Heterozigosidade

observada

Heterozigosidade

esperada

Valor de

HLA-A

1834

0,91167

0,89630

0,47330

HLA-B

1834

0,94929

0,94412

0,48330

5.1.4. Desequilíbrio de ligação (DL)

Observou-se DL entre os loci HLA-A e -B (p<0,003). A intensidade de associação

(D`) foi significativa para 92 (47,4%) dos 194 haplótipos que tinham cinco ou mais cópias

(Tabela 10). Os alelos B44, B35, B51, B7 e B8 foram os mais frequentes no locus HLA-B e

apresentaram um forte DL com os alelos mais frequentes A2, A3 e A1 do locus HLA-A. O

DL mais intenso foi o observado no haplótipo A2:B48 (D´=0,7371, p<0,0000). De fato, doze

das quinze cópias do alelo B48 estavam associadas com A2. O haplótipo com a menor

intensidade de associação negativa foi o A30:B44 (D´=-0,7930, p<0,0000) (Tabela 10).

Alelos

HLA-A

Frequência

Número

de cópias

Alelos

HLA-B

Frequência

Número

de cópias

Alelos

HLA-B

Frequência

Número

de cópias

0,2394

877

0,1198

439

61 (40)

0,0166

0,0913

335

0,1077

395

0,0164

0,0900

330

0,0796

292

71 (15)

0,0150

0,0862

316

0,0763

280

63 (15)

0,0134

0,0657

241

0,0559

205

0,0120

0,0649

238

65 (14)

0,0540

198

64 (14)

0,0109

0,0641

235

0,0466

171

0,0106

0,0523

192

0,0316

116

0,0087

0,0466

171

0,0297

109

0,0071

0,0420

154

0,0292

107

0,0041

0,0327

120

62 (15)

0,0286

105

0,0041

0,0297

109

0,0275

101

0,0030

0,0262

0,0273

100

0,0030

0,0188

0,0259

0,0019

0,0158

0,0248

75 (15)

0,0014

0,0115

0,0240

0,0011

0,0115

72 (15)

0,0234

0,0003

0,0079

60 (40)

0,0236

0,0003

0,0025

0,0174

0,0011

0,0172

5.1.5. Taxa de recombinação entre os loci HLA-A e HLA-B

O número de meioses informativas foi cerca de 6860 e foram observados 31 eventos

de recombinação entre HLA-A e HLA-B, correspondendo a 0,45%. Em 16 dos 31 casos de

recombinação, os genitores foram genotipados, tornando possível verificar se a

recombinação ocorreu no cromossomo paterno ou materno. Em 56,25% (9/16) dos casos, o

cromossomo recombinante veio da mãe, uma proporção que permitiu aceitar a hipótese nula

de taxas semelhantes de recombinação em cromossomos paternos e maternos (χ

= 0,617,

valor de p=0,432).

Em oito (25,8%) casos de doadores HLA-compatíveis, o evento de recombinação

reduziu de quatro para três as compatibilidades entre receptor e doador. Em oito (25,8%)

casos os eventos de recombinação facilitaram a procura de doador, por que o número de

compatibilidades doador-receptor aumentou de 2 para 3.

5.2. Análise da amostra de indivíduos não aparentados

5.2.1. Diversidade e Heterozigosidade

O número de alelos e a heterozigosidade observados por loci HLA está mostrado na

Tabela 11. A heterozigosidade observada não teve diferença estatisticamente significativa

da heterozigosidade esperada, conforme o resultado do teste de HW (Tabela 11). A

frequência alélica dos loci HLA-A, -B e -DRB1 observada em todos os grupos está mostrada

na Tabela 12. Os alelos mais freqüentes no locus HLA-A foram HLA-A2, seguido de A24,

A1, A3 nos nos brancos, A23, A68, A3 nos negros e A3, A30, A1 nos pardos. O alelo HLA-

A43 foi pouco freqüente e observado somente no grupo branco. No locus HLA-B, os dois

alelos mais freqüentes em todos os grupos foram o B44 e o B35, seguidos de B51, B7, B8

nos brancos, B7, B51, B53 nos negros e B7, B51 e B8 nos pardos. O alelo HLA-B47 foi

observado nos brancos e pardos, o B67 somente nos brancos e o B78 somente nos pardos.

No locus HLA-DRB1, os cinco alelos mais frequentemente observados foram DRB1 3, DRB1

4, DRB1 7, DRB1 11, DRB1 13 e DRB1 15. No locus HLA-DRB1 não foram observados

alelos exclusivos de um grupo.

Tabela 10: Frequências de haplótipos HLA-A:HLA-B, estimativas de desequilíbrio de ligação

(D’) e sua significância.

Haplótipo

Frequência

relativa

Número

de cópias

D´

Valor de

Haplótipo

AB e

Frequência

relativa

Número

cópias

D´

Valor de

2 44

0,037350

137

0,0919

0,0002

1 38

0,002726

0,0843

0,0363

2 51

0,032443

119

0,2211

0,0000

31 62

0,002726

0,0675

0,0002

1 8

0,029989

110

0,4908

0,0000

2 63

0,002454

-0,2327

0,3577

29 44

0,022901

0,4246

0,0000

2 41

0,002454

-0,1455

0,5860

3 7

0,020447

0,1943

0,0000

29 35

0,002454

-0,5084

0,0184

2 35

0,019629

-0,2385

0,0049

23 41

0,002454

0,1494

0,0002

33 65

0,017448

0,3844

0,0000

34 8

0,002454

0,1678

0,0000

3 35

0,017176

0,0901

0,0000

30 72

0,002454

0,0474

0,1007

24 35

0,016085

0,0886

0,0000

68 60

0,002454

0,0581

0,0505

30 42

0,014995

0,5495

0,0000

3 27

0,002454

0,0542

0,1673

2 7

0,014995

-0,1794

0,0798

24 57

0,002454

0,0042

0,8894

2 18

0,013359

0,0620

0,1386

30 45

0,002454

0,0394

0,1572

2 50

0,013359

0,3231

0,0000

33 7

0,002454

-0,2344

0,3929

11 35

0,012541

0,1478

0,0000

68 49

0,002454

0,0198

0,4232

23 44

0,011996

0,0729

0,0017

31 52

0,002454

0,1139

0,0000

2 62

0,009542

0,1364

0,0127

11 8

0,002181

-0,2545

0,3782

2 39

0,008997

0,1621

0,0053

2 42

0,002181

-0,6482

0,0003

2 60

0,008724

0,2389

0,0002

24 38

0,002181

0,0516

0,1891

23 7

0,008451

0,0584

0,0012

30 8

0,002181

-0,4036

0,1156

1 57

0,008179

0,2308

0,0000

36 53

0,002181

0,2541

0,0000

30 18

0,007906

0,1115

0,0000

23 42

0,002181

0,0207

0,4385

2 65

0,007634

-0,3711

0,0036

31 60

0,002181

0,0750

0,0003

2 58

0,007361

-0,0276

0,8654

32 27

0,002181

0,0982

0,0000

2 53

0,007361

0,0171

0,7497

32 51

0,002181

-0,0780

0,8078

26 38

0,007088

0,4184

0,0000

23 50

0,002181

0,0153

0,5535

24 44

0,006816

-0,3449

0,0174

11 52

0,001908

0,0620

0,0346

31 35

0,006543

0,1035

0,0009

26 44

0,001908

-0,3834

0,1628

68 44

0,006543

-0,1544

0,3646

74 7

0,001908

0,0272

0,4277

3 65

0,006270

0,0356

0,1163

32 61

0,001908

0,0876

0,0001

24 62

0,005998

0,1417

0,0000

68 45

0,001908

0,0165

0,5484

23 49

0,005998

0,1465

0,0000

3 57

0,001908

-0,2336

0,4528

74 72

0,005998

0,3033

0,0000

2 57

0,001908

-0,7076

0,0001

11 51

0,005725

0,0323

0,1175

68 57

0,001908

0,0063

0,8060

24 7

0,005725

-0,1294

0,4890

29 45

0,001908

0,0348

0,1338

3 44

0,005725

-0,4810

0,0006

23 65

0,001908

-0,4200

0,1215

25 18

0,005725

0,4756

0,0000

68 58

0,001908

-0,0581

0,8678

2 45

0,005725

-0,0031

0,9870

2 71

0,001908

-0,4683

0,0496

31 39

0,005725

0,2048

0,0000

30 57

0,001908

0,0049

0,8514

2 27

0,005725

0,1167

0,0932

32 60

0,001908

0,0643

0,0012

24 18

0,005453

0,0337

0,1414

1 62

0,001908

-0,2372

0,4449

2 8

0,005453

-0,5924

0,0000

26 35

0,001908

-0,3085

0,2925

68 35

0,005453

-0,2097

0,2484

74 53

0,001908

0,0744

0,0003

1 44

0,005453

-0,4982

0,0004

68 65

0,001908

-0,4126

0,1308

24 51

0,005453

-0,2050

0,2623

23 53

0,001908

0,0006

0,9818

23 45

0,005453

0,1737

0,0000

24 52

0,001908

0,0273

0,4763

2 49

0,005453

-0,2335

0,1651

74 18

0,001908

0,0575

0,0292

3 18

0,005453

0,0282

0,2335

2 38

0,001908

-0,5126

0,0247

1 35

0,005180

-0,4653

0,0021

74 35

0,001908

-0,0579

0,8660

3 51

0,004907

-0,3250

0,0664

68 42

0,001636

-0,0142

0,9707

68 53

0,004907

0,1113

0,0000

2 64

0,001636

-0,3733

0,1829

68 7

0,004907

0,0003

0,9876

3 58

0,001636

-0,4337

0,1324

1 37

0,004907

0,5192

0,0000

31 44

0,001636

-0,5860

0,0156

24 39

0,004635

0,1102

0,0005

30 44

0,001636

-0,7930

0,0000

1 51

0,004635

-0,3529

0,0481

25 51

0,001636

0,0687

0,1277

68 51

0,004635

-0,0913

0,6705

36 35

0,001636

0,1112

0,0836

3 49

0,004635

0,0711

0,0174

33 42

0,001636

0,0221

0,2971

23 58

0,004635

0,0873

0,0003

29 49

0,001636

0,0091

0,6610

32 35

0,004635

0,0541

0,0988

29 65

0,001636

-0,3040

0,3482

2 72

0,004635

-0,1339

0,4915

29 7

0,001636

-0,5376

0,0391

1 7

0,004362

-0,3648

0,0458

68 39

0,001636

0,0020

0,9413

23 72

0,004362

0,1393

0,0000

68 8

0,001636

-0,5432

0,0363

11 44

0,004362

-0,3100

0,1020

11 18

0,001636

-0,3297

0,2994

30 65

0,004362

0,0220

0,2438

66 57

0,001636

0,0783

0,0003

68 71

0,004362

0,2424

0,0000

66 41

0,001636

0,1225

0,0000

33 44

0,004089

-0,1935

0,3632

11 65

0,001636

-0,3837

0,2068

30 53

0,004089

0,0800

0,0015

25 62

0,001636

0,1183

0,0000

30 35

0,004089

-0,4196

0,0195

68 52

0,001636

0,0333

0,3081

24 50

0,003817

0,0574

0,0567

33 51

0,001636

-0,5106

0,0569

66 58

0,003817

0,2166

0,0000

26 55

0,001636

0,2105

0,0000

2 61

0,003817

-0,0412

0,8556

66 44

0,001636

-0,1435

0,6832

26 51

0,003817

0,0753

0,0119

66 35

0,001363

-0,1995

0,5947

31 51

0,003817

0,0403

0,1273

3 50

0,001363

-0,4580

0,1390

30 13

0,003817

0,3141

0,0000

11 60

0,001363

0,0142

0,5949

34 44

0,003544

0,2147

0,0002

23 8

0,001363

-0,6241

0,0154

11 49

0,003544

0,0706

0,0014

11 64

0,001363

0,0767

0,0380

32 44

0,003544

-0,0125

0,9609

33 50

0,001363

0,0078

0,7024

2 52

0,003544

-0,1379

0,5356

1 41

0,001363

0,0260

0,5809

30 58

0,003544

0,0499

0,0390

30 71

0,001363

0,0273

0,4414

1 58

0,003272

0,0148

0,6061

1 50

0,001363

-0,4497

0,1495

2 48

0,003272

0,7371

0,0000

32 64

0,001363

0,0982

0,0004

24 61

0,003272

0,1210

0,0019

68 62

0,001363

-0,2349

0,5291

11 57

0,003272

0,0714

0,0021

1 65

0,001363

-0,7012

0,0020

33 35

0,003272

-0,2764

0,2234

24 13

0,001363

0,0460

0,3467

23 51

0,003272

-0,3666

0,0854

74 41

0,001363

0,0966

0,0000

30 7

0,003272

-0,3450

0,1120

1 49

0,001363

-0,4901

0,1024

24 8

0,003272

-0,3205

0,1470

30 52

0,001363

0,0149

0,6519

24 65

0,002999

-0,3135

0,1778

1 52

0,001363

-0,1178

0,7667

24 45

0,002999

0,0425

0,1886

2 13

0,001363

-0,4644

0,1019

3 8

0,002999

-0,4125

0,0540

31 61

0,001363

0,0509

0,0292

1 63

0,002999

0,1478

0,0009

32 65

0,001363

-0,0954

0,8152

29 51

0,002999

-0,1872

0,4623

3 62

0,001363

-0,4633

0,1325

68 61

0,002726

0,1067

0,0013

3 13

0,001363

0,0406

0,4216

33 53

0,002726

0,0537

0,0071

24 64

0,001363

0,0425

0,3786

11 7

0,002726

-0,3177

0,1936

29 58

0,001363

-0,0700

0,8659

68 63

0,002726

0,1496

0,0001

24 27

0,001363

-0,0932

0,8174

3 71

0,002726

0,0996

0,0189

30 51

0,001363

-0,7383

0,0005

23 35

0,002726

-0,6098

0,0007

23 81

0,001363

0,2871

0,0000

*Nível de significância = 0.05. Em negrito, estão os valores de p estatisticamente significativos.

Tabela 11: Diversidade, heterozigosidade e resultado do teste de HW para os loci HLA-A, -B

e -DRB1.

Locus

Número de alelos

obs

Hardy-Weinberg (valor-p)

Brancos

(n=1889)

Negros

(n=327)

Pardos

(n=652)

Brancos

Negros

Pardos

Brancos

Negros

Pardos

HLA-A

0,886

0,901

0,897

0,7248

0,4137

0,1153

HLA-B

0,945

0,951

0,948

0,8789

0,8224

0,3999

HLA-DRB1

0,896

0,900

0,903

0,6874

0,9610

0,2561

obs

=Heterozigosidade observada.

A distribuição observada dos alelos HLA-A, -B e -DRB1 também foi representada nas

figuras 9 (A,B,C), 10 (A,B,C) e 11 (A,B,C).

Tabela 12: Distribuição da frequência alélica por locus HLA nos grupos de Brancos, Negros

e Pardos.

Alelos

HLA-A

Brancos

Negros

Pardos

Alelos HLA-B

Brancos

Negros

Pardos

0,0993

0,0612

0,0752

0,0188

0,0077

0,0146

0,0514

0,0428

0,0483

0,0453

0,0275

0,0429

0,2568

0,2232

0,2385

0,0230

0,0138

0,0153

0,0498

0,1040

0,0736

0,1122

0,0933

0,0959

0,1022

0,0566

0,0637

0,0117

0,0031

0,0107

0,0122

0,0061

0,0153

0,0212

0,0107

0,0138

0,0323

0,0229

0,0399

0,0246

0,0184

0,0222

0,0543

0,0428

0,0499

0,0169

0,0138

0,0153

0,0990

0,0780

0,1005

0,0127

0,0398

0,0245

0,0450

0,0734

0,0836

0,1144

0,0749

0,1112

0,0323

0,0306

0,0299

0,0281

0,0382

0,0391

0,0320

0,0184

0,0314

0,0011

0,0000

0,0008

0,0334

0,0443

0,0261

0,0042

0,0046

0,0038

0,0106

0,0184

0,0169

0,0363

0,0291

0,0276

0,0037

0,0245

0,0130

0,0304

0,0122

0,0222

0,0003

0,0000

0,0850

0,0688

0,0729

0,0114

0,0184

0,0138

0,0172

0,0291

0,0184

0,0590

0,1025

0,0575

0,0230

0,0658

0,0391

0,0032

0,0031

0,0008

0,0082

0,0077

0,0107

0,0106

0,0260

0,0207

0,0013

0,0015

0,0023

0,0016

0,0031

0,0015

0,0312

0,0367

0,0245

Total

1,000

0,0254

0,0489

0,0414

0,0180

0,0092

0,0169

Alelos HLA-DRB1

Brancos

Negros

Pardos

0,0185

0,0138

0,0215

0,1080

0,0964

0,0966

0,0392

0,0184

0,0299

0,1057

0,1208

0,1104

0,0151

0,0107

0,0161

0,1271

0,0963

0,0989

0,0140

0,0061

0,0130

0,1469

0,1086

0,1204

0,0519

0,0489

0,0368

0,0521

0,0627

0,0713

0,0000

0,0015

0,0008

0,0124

0,0184

0,0215

0,0606

0,0719

0,0882

0,0180

0,0184

0,0215

0,0123

0,0443

0,0245

0,1183

0,1162

0,1104

0,0123

0,0489

0,0291

0,0180

0,0291

0,0146

0,0019

0,0015

0,0008

0,1334

0,1422

0,1411

0,0016

0,0077

0,0023

0,0312

0,0229

0,0261

0,0000

0,0015

0,0940

0,1453

0,1288

0,0574

0,0535

0,0429

0,0347

0,0229

0,0383

0,0045

0,0153

0,0054

Total

1,000

0,0005

0,0031

0,0008

Total

1,000

Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos brancos

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

1 11 2 23 24 25 26 29 3 30 31 32 33 34 36 43 66 68 69 74 80

Alelos HLA-A

Frequência

Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos negros

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

1 11 2 23 24 25 26 29 3 30 31 32 33 34 36 43 66 68 69 74 80

Alelos HLA-A

Frequência

Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos pardos

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

1 11 2 23 24 25 26 29 3 30 31 32 33 34 36 43 66 68 69 74 80

Alelos HLA-A

Frequência

Figura 9: Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos brancos (A), negros (B) e

pardos (C).

Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos brancos

0,0000

0,0200

0,0400

0,0600

0,0800

0,1000

0,1200

0,1400

13 18 27 35 37 38 39 41 42 44 45 47 48 49 50 51 52 53 55 56 57 58 60 61 62 63 64 65 67 7 71 72 73 75 78 8 81 82

Alelos HLA-B

Frequência

Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos negros

0,0000

0,0200

0,0400

0,0600

0,0800

0,1000

13 18 27 35 37 38 39 41 42 44 45 47 48 49 50 51 52 53 55 56 57 58 60 61 62 63 64 65 67 7 71 72 73 75 78 8 81 82

Alelos HLA-B

Frequência

Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos pardos

0,0000

0,0200

0,0400

0,0600

0,0800

0,1000

0,1200

13 18 27 35 37 38 39 41 42 44 45 47 48 49 50 51 52 53 55 56 57 58 60 61 62 63 64 65 67 7 71 72 73 75 78 8 81 82

Alelos HLA-B

Frequência

Figura 10: Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos brancos (A), negros (B)

e pardos (C).

Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos brancos

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

1 0301 0302 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Alelos HLA-DRB1

Frequência

Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos negros

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

1 0301 0302 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Alelos HLA-DRB1

Frequência

Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos pardos

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

1 0301 0302 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Alelos HLA-DRB1

Frequência

Figura 11: Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos brancos (A), negros (B)

e pardos (C).

5.2.2. Desequilíbrio de ligação

Os valores de desequilíbrio de ligação global observados para todos os pares de loci

foram estatisticamente significativos ao nível de 5% (Tabela 13), podendo-se, portanto,

rejeitar a h

de equilíbrio de ligação.

Tabela 13: Desequilíbrio de ligação global entre os pares de loci HLA.

Pares de loci

Valor de p

A:B

0.36603

0.00259

A:DRB1

0.20525

0.00237

B:DRB1

0.41003

0.00340

5.2.3. Seleção natural

Os resultados do teste de neutralidade de EW são mostrados na Tabela 14. Valores

negativos de F

foram observados para todos os loci HLA. Os valores de p para os três loci

nos grupos analisado foram significativamente baixos, consistentes com a ação da seleção

balanceadora nestes loci, e, portanto, rejeita-se a hipótese nula de neutralidade. A mais forte

evidência da seleção foi observada no locus HLA-DRB1 que apresentou os menores valores

de F

em todos os grupos.

5.2.4. Diferenciação da população

As medidas de diferenciação genética entre os grupos considerados indicaram

diferenças genéticas significativas nas frequências alélicas. Como esperado, a medida de

diferenciação genética G’

, que considera, além das frequências alélicas, a existências de

alelos diferentes nas populações, apresentou o maior valor de diferenciação genética entre

os grupos quando comparado com o G

e o D

(Tabela 15).

Com a metodologia empregada na análise dos loci HLA-A, B- e -DRB1, foi

demonstrada a existência de estruturação genética na amostra analisada.

5.2.5. Análise filogenética

O dendograma apresentado na figura 12 e construído com base na matriz de

distância (Tabela 16) mostra as relações evolutivas entre os grupos estudados. O

comprimento dos ramos é diretamente proporcional à distância genética. As populações da

Espanha e Itália formaram um agrupamento separado exibindo maior distância genética em

relação às outras populações analisadas. Os brancos do PR se mostraram mais próximos

das populações de Portugal, Itália e Espanha. Os pardos de SP, MG, PR e PI formaram um

agrupamento intermediário entre os europeus, ameríndios e africanos. Este fato indica que o

grupo dos pardos resulta de miscigenação que envolve também os ameríndios. Os negros

de MG e do PR estão mais próximos geneticamente das populações africanas do Zimbábue

e de Guiné-Bissau.

Baseando-se na análise filogenética, observa-se que a subpopulação brasileira de

origem européia, de uma forma geral, está mais próxima geneticamente das populações

européias. Por outro lado, as subpopulações de origem africana estão mais próximas

geneticamente de populações africanas. As duas populações de índios formam um

agrupamento separado, o que demonstra uma grande distância genética entre eles e as

outras populações analisadas.

Tabela 14: Teste de neutralidade de Ewens–Watterson.

HLA-A

HLA-B

HLA-DRB1

Grupo

Étnico

observado

esperado

Fnd

p-value

observado

esperado

Fnd

p-value

observado

Esperado

Fnd

p-value

BRANCO

0,1143

0,2540

-1,3508

0,0070

0,0555

0,1417

-1,6343

0,0000

0,1038

0,3181

-1,6753

0,0002

NEGRO

0,0990

0,2041

-1,3538

0,0069

0,0492

0,1030

-1,6305

0,0001

0,1004

0,2676

-1,6040

0,0000

PARDO

0,1027

0,2292

-1,4029

0,0046

0,0522

0,1111

-1,5530

0,0006

0,0974

0,2957

-1,6840

0,0000

Significância do valor-p<0.05.

F é a soma do quadrado das freqüências alélicas.

Tabela 15: Medidas de diferenciação genética entre os grupos.

S est

T est

ST est

est

LOCI

S est

IC*

T est

IC*

ST est

IC*

ST est

IC*

est

IC*

HLA-A

585,797

0,895

0,890 - 0,899

0,897

0,892 - 0,901

0,002

0,002 - 0,004

0,030

0,025 - 0,054

0,028

0,023 - 0,050

HLA-B

585,797

0,949

0,946 - 0,949

0,950

0,948 - 0,952

0,002

0,001 - 0,003

0,044

0,042 - 0,083

0,043

0,040 - 0,080

HLA-

DRB1

585,797

0,900

0,897 - 0,902

0,901

0,899 - 0,903

0,001

0,001 - 0,002

0,011

0,010 - 0,032

0,011

0,009 - 0,030

Ñ = média harmônica do tamanho populacional.

IC* Intervalo de confiança a 95% obtido por 1000 reamostragens bootstrap.

est

Estimativa da real diferenciação (Jost, 2008).

Figura 12: Dendograma gerado com base nas frequências alélicas dos loci HLA-A, -B e -DRB1.

6. DISCUSSÃO

6.1. Diversidade genética nos loci HLA

Foi observada uma grande diversidade alélica nos loci HLA conforme tem sido

relatado para outras populações do Brasil e do mundo (Belich, Madrigal et al., 1992; Moraes,

Fernandez-Vina et al., 1993; Petzl-Erler, Luz et al., 1993; Braun-Prado, Vieira Mion et al.,

2000; Middleton, Williams et al., 2000; Williams, Meenagh et al., 2001; Middleton, Menchaca

et al., 2003; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et al., 2009). A heterozigosidade nos três loci

HLA, em razão do grande número de alelos com frequências pouco diferenciadas, foi

superior a 88%.

A probabilidade de se encontrar um doador HLA compatível entre os irmãos,

seguindo as regras de Mendel, é de 25%. Edi et al. (Eid, Miranda et al., 2003) demonstraram

que 43,6% dos pacientes transplantados na Universidade de Campinas (São Paulo, Brasil)

encontraram um doador entre os familiares. Foi observado no presente estudo que esta

proporção é de 44,7% de receptores, bem similar à proporção encontrada por estes autores.

Moraes et al, (Moraes, Alencar et al., 2004) demonstraram que, no Brasil, mais de 50% dos

pacientes que necessitam de um transplante de células tronco hematopoiéticas não

encontram um doador HLA compatível entre os familiares.

A distribuição das freqüências dos loci estudados foi consistente com a observada

em populações brasileiras (Braun-Prado, Vieira Mion et al., 2000; Monte, Moita Neto et al.,

2004). Os quatro alelos mais comuns no locus HLA-A forma HLA-A2, A3, A1 e A24 que

foram também os mais freqüentes nas populações de SP e PR (Middleton, Menchaca et al.,

2003). O mesmo comentário se aplica aos alelos do locus HLA-B que se mostrou o mais

polimórfico entre os três loci analisados com os alelos HLA-B44, B35, B51 e B7 sendo os

mais frequentes. Diversos haplótipos HLA-A:HLA-B comumente observados em outras

populações de outras regiões do mundo foram também observados aqui, embora com

frequências diferentes. Estes haplótipos estão presentes em europeus (A1:B8, A2:B7,

A11:B35, A2:B44 e A3:B7) e africanos (A30:B42, A36:B53, A29:B53, A23:B72). A amostra

estudada também compartilha haplótipos com ameríndios, como A31:B35 e A31:B:39 (Petzl-

Erler, Luz et al., 1993). Os quatro haplótipos mais frequentes são também os quatro mais

comuns de uma população do sul de Portugal (Middleton, Menchaca et al., 2003). Foram

ainda observados haplótipos característicos da população de Taiwan, como A2:B48, e da

população espanhola, como A25: B18 (Middleton, Menchaca et al., 2003). Também foram

observados haplótipos característicos de Zambia, como A30:B42, cuja frequência naquela

população é 11,6%. A diversidade genética dos marcadores estudados sustenta a

conhecida característica miscigenada da população de Minas Gerais.

6.2. Desequilíbrio de ligação

O DL global entre os loci HLA-A, -B e -DRB1, conforme observado neste estudo,

também tem sido verificado em várias populações do mundo sendo relatado por vários

estudos (Trachtenberg, Vinson et al., 2007; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et al., 2009). Por

exemplo, na população Han (Sul da China) (Trachtenberg, Vinson et al., 2007) os valores

observados de DL entre os pares de loci HLA foi: HLA-A:B 0,614, HLA-A-DRB1 0,386, HLA-

B:DRB1 0,51045.

O desequilíbrio de ligação entre os loci HLA pode ser afetado por diversos fatores:

(1) baixa taxa de recombinação observada entre estes loci, (2) seleção natural, (3)

miscigenação e (4) redução do tamanho populacional (bottleneck). Apesar de essas forças

evolutivas atuarem para alterar o equilíbrio de ligação entre loci, é interessante notar que

quanto mais antigo for o aparecimento da mutação, mais próxima a população estará do

equilíbrio.

A taxa de recombinação de 0,45% entre os loci HLA-A e HLA-B é pequena,

comparadada ao valor, considerado padrão, de 1% de recombinação por Mb de DNA por

meiose (13). Deve-se notar que a recombinação originou dois novos haplótipos, ausentes

nos progenitores, mas já observados em outras populações (33). Satta (Satta, 1997) indicou

que a recombinação desempenha um papel importante na geração da diversidade

haplotípica do HLA, que passa a ser mantida pela seleção.

Diferentes padrões de DL podem ser observados em diferentes populações

(Trachtenberg, Vinson et al., 2007; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et al., 2009), uma vez

que a origem, manutenção ou decaimento do DL depende de diversos fatores relacionados

à dinâmica populacional, tais como migrações e miscigenação entre diversas populações

com frequências gênicas diferentes, níveis de endogamia e eventos demográficos. O estudo

dos haplótipos com base na segregação familiar proporciona uma definição mais precisa

dos haplótipos e do DL.

6.3. Seleção Natural

O teste de neutralidade de EW tem sido uma ferramenta útil e amplamente utilizada

para detectar seleção nos loci HLA

em várias populações do mundo (Meyer e Thomson,

2001; Meyer, Single et al., 2006; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et al., 2009). Como

exemplo, os valores F

foram negativos em populações norte americanas descendentes de

europeus do leste e de afro-descendes, respectivamente: HLA-A: -0,2169, -1,2379; HLA-B: -

1,0892, -0,8741 e HLA-DRB1: -1,0000, -1,1456 (Mack, Tu et al., 2009). No presente estudo, o teste

EW também levou à rejeição da hipótese nula de neutralidade.

A história demográfica das populações humanas, em particular a brasileira, também

pode ser uma explicação para a alta proporção de populações com desvio significativo da

neutralidade nos loci HLA. A expansão populacional pode resultar em valores de

homozigosidade que excedem o esperado em equilíbrio neutro (Watterson, 1977; 1978). O

excesso global de alelos com frequência intermediária (Figuras 9 a 11) observado nos três

loci HLA estudados pode também ser atribuído ao regime de seleção balanceadora que atua

nestes loci.

Para explicar a alta diversidade das moléculas HLA, tem sido sugerido que a

apresentação de uma ampla variedade de peptídeos endógenos como, por exemplo, de

virus, pelas moléculas HLA-A e HLA-B, por indivíduos heterozigotos, pode aumentar a

sobrevida, frente à infecção por tais patógenos. Os valores do teste de neutralidade podem

variar entre as populações, de acordo com diferentes pressões seletivas que atuam em

cada população.

6.4. Estrutura genética populacional

Considerando as estimativas G’

(Hedrick, 2005) obtidas para os loci HLA-A, -B e -

DRB1, observa-se que a divergência genética entre populações diferiu estatisticamente de

zero, com o locus HLA-B demonstrando maior diferenciação entre os grupos. Os resultados

são semelhantes ao de Rosenberg et al. (Rosenberg, Pritchard et al., 2002) que, usando

marcadores microssatélites, observaram variação interpopulacional, entre populações de

todos os continentes, de 3,6%. Estes autores também observaram que o componente intra-

populacional explica 93-95% do total da variância genética.

A estimativa da diferenciação genética entre as populações, medida pelo método de

Hedrick (Hedrick, 2005), foi maior que a estimativa de G

(Nei e Chesser, 1983) e D

est

(Jost, 2008). A superioridade na estimativa obtida pelo método de Hedrick (2005) se deve às

peculiaridades do método, que considera não só a frequência dos alelos, como também o

tipo de alelo presente nas populações. O método de Nei (1983), assim como a estatística

clássica F

é muito dependente de níveis de heterozigosidade presentes dentro das

populações e independente do tipo de alelos. O uso de tais estatísticas para loci

polimórficos e com alta heterozigosidade, como é o caso dos loci HLA, pode subestimar a

verdadeira diferenciação genética entre populações, diante daquelas contendo alelos

exclusivos. Os valores de G´

observados indicam baixa divergência entre as populações

que pode ser explicado pela miscigenação crescente observada documentada por Martins et

al. (Martins, 2004) no século XIX (Tabela 17). Segundo estes autores, pode-se verificar um

aumento da frequência de casamentos entre indivíduos de diferentes grupos populacionais,

que se torna cada vez mais relevante nos dias atuais. Também as taxas de migração

aumentaram devido à facilidade de deslocamento com diversos meios de transporte

disponíveis entre as diferentes cidades e países. Segundo Oliveira et al. (Oliveira, 2004) as

maiores causas de migração no Brasil são: a necessidade de acompanhar a família, busca

por trabalhos, melhores oportunidades e salários e busca por melhores serviços sociais e

políticas sociais, como a Saúde e Educação.

A deriva genética está presente em todas as populações reais, ainda que sua

influência seja maior quanto menor for o tamanho efetivo populacional. A análise dos

resultados permite a constatação de que a endogamia não tem sido suficiente para garantir

a diferenciação genética nas sub-regiões e nos grupos analisados.

O G’

associa-se com a medida do quanto a deriva genética tem contribuído para a

diferenciação entre os grupos e do quanto a população total encontra-se estruturada por

suas subdivisões. No entanto, considerando que deriva e fluxo gênico concorrem para

situações distintas no sentido de que a primeira tende a afastar geneticamente as

populações enquanto o último tende a aproximá-las, o balanço entre estas duas forças tem

sido desfavorável ao processo de diferenciação.

Os resultados observados de que os loci HLA analisados tendem a uma maior

heterozigosidade que o esperado sob neutralidade, é consistente com a ação da seleção

balanceadora. Como esperado para os loci que estão sob este tipo de seleção, os valores

de G’

são reduzidos.

Tabela 17: Casamentos intergrupos observados na província de Minas Gerais de 1818-

1838.

1818

1838

Grupo

Branco

Africano

Crioulo

Pardo

Índio

Branco

Africano

Crioulo

Pardo

Índio

Brancos

98,0

5,9

7,3

96,7

4,1

1,3

4,7

3,1

Africano

88,2

2,4

0,2

0,1

80,2

9,0

0,4

Crioulo

78,3

0,5

7,4

76,8

2,2

1,5

Pardo

2,0

5,9

19,3

92,0

3,2

8,3

12,9

92,6

10,8

Índio

100,0

0,1

84,6

Total

100,0

Fonte: (Martins, 2004) XIV Encontro Nacional de Estudos Populacionais, ABEP, realizado em Caxambú- MG – Brasil, de 20-

24 de Setembro de 2004.

A ausência de estruturação da amostra estudada pode ser explicada pel fato de não

ter havido tempo suficiente para a formação de agrupamentos e pela grande mobilidade

humana. A ausência de barreiras físicas e as conseqüentes migrações não permitem que

diferenças genéticas, geradas estocasticamente e selecionadas pelas circunstâncias

ambientais, possam se acumular na espécie humana, apesar da percepção das diferenças,

sobretudo morfológicas (mas também culturais e intelectuais) entre os humanos.

6.5. Análise filogenética

A distância genética baseada na frequência alélica HLA-A, -B e -DRB1, permitiu

construir um dendograma (Figura 12) que demonstra a relação entre as populações

estudadas.

Pena et al. (Alves-Silva, Da Silva Santos et al., 2000; Pena, S. D. J., Carvalho-Silva,

D. R. , Alves-Silva, J , Prado, V. F. , Santos, F. R. , 2000; Hunemeier, Carvalho et al., 2007)

confirmaram que o brasileiro considerado branco é um mestiço tri-híbrido, com 39% de

linhagens européias, 33% ameríndias e 28% africanas, mas variando de região para região,

na dependência dos fatos históricos que nortearam a colonização de cada região. Segundo

os mesmo autores, o DNA dos cromossomos Y dos indivíduos euro-descendentes

brasileiros tem predominantemente origem portuguesa na linhagem masculina

(patrilinhagem). Quanto à linhagem feminina (matrilinhagem), os brasileiros

autodenominados brancos eram predominantemente não euro-descendentes, ou seja, o

DNA das mitocôndrias de homens e mulheres euro-descendentes era uma mistura de DNAs

de linhagens afro-descendentes, indígenas e euro-descendentes. Para a formação atual do

povo brasileiro, colaborou muito o fato bastante comum de os portugueses senhores de

terras terem filhos com índias e, sobretudo com negras, em contraposição à pequena

frequência com que africanos ou índios tinham filhos com mulheres euro-descendentes.

Os dados obtidos no presente estudo consolidam os relatos históricos da

colonização de Minas Gerais. Desta forma, o pool de genes de origem euro-descendente de

Minas Gerais é originário principalmente da população portuguesa. Foi comprovado também

que a população de pardos mostra um padrão de distribuição dos alelos HLA-A, -B e -DRB1

intermediário entre os euro-descendentes e os afro-descendentes. Estes resultados também

confirmam os relatos históricos da colonização do estado de Minas Gerais, no qual o

processo de miscigenação entre os grupos populacionais não foi pacífico. A forma de

ocupação do território mineiro, que praticamente extinguiu as populações indígenas, foi

refletida na maior distância genética observada entre a população de Minas Gerais e os

povos indígenas. Foi observada maior similaridade genética da população de Minas Gerais

com os povos europeus, principalmente a Portuguesa, e com os povos africanos.

A maior proximidade genética da populações do PR com os europeus, mostra que

houve uma menor taxa de miscigenação na população do Paraná do que na de Minas

Gerais. Esta observação pode ser explicada pela história mais recente de ocupação do

território do Paraná quando comparado ao de Minas Gerais. Portanto pode-se observar que

os eurodescendentes do PR são mais parecidos geneticamente com as populações

européias do que os euro-descendentes de MG, confirmando os achados de Pena (Pena, S.

D., 2000) de que o brasileiro da região sul do Brasil, que recebeu grande quantidade de

imigrantes europeus, tem 66% de herança européia, no norte do Brasil 54% ameríndia e no

nordeste do Brasil 46% de afro-descendente. Os pardos de Minas Gerais, São Paulo, Piauí

e Paraná formam um agrupamento intermediário entre as três raízes europeus, africanos e

ameríndios. Os afrodescendentes de Minas Gerais e do Paraná estão mais próximos

geneticamente das populações de países africanos Zimbábue e Guiné Bissau.

A taxa de miscigenação do estado do Paraná é menor do que a de Minas Gerais o

que foi realmente confirmado pela maior proximidade dos Brancos do PR do que de MG

com as populações européias e dos afro-descendentes do PR com as populações africanas

do que as de MG. O grupo cafuso do PR se auto-classificou baseado nas características

morfológicas e da cor, porém, conforme observado pela figura 12, este grupo está mais

próximo dos brancos do que dos afro-descententes e distante dos ameríndios,

Os Terenas são indígenas que chegaram ao estado do Mato Grosso do Sul no

século XVIII vindos do Paraguai. A grande distância genética dos Terenas em relação aos

demais grupos pode ser explicada pelo fato de terem permanecido isolados.

Os resultados deste estudo reforçam o conceito do uso dos genes HLA como

instrumento de investigação da composição étnica de população e permite concluir que a

amostra da população de MG apresenta características genéticas predominantemente de

origem euro-descendente e afro-descendente. Estes dados têm implicações para os

programas de transplante de órgãos com doador não aparentado de MG, que tem como

determinante da distribuição de órgãos a compatibilidade HLA. Uma vez conhecidas as

frequências alélicas HLA dentro de cada grupo populacional do estado, pode-se predizer o

tempo de espera do receptor para os programas de transplante de rim e medula óssea com

doador não aparentado.

Embora existam similaridades entre os resultado aqui relatados e os observados em

outras populações, a distribuição de frequências alélicas e haplotípicas foi diferente em

alguns casos, destacando a variabilidade interpopulacional. Neste sentido, os dados de HLA

apresentados podem contribuir para estudos antropológicos e microevolutivos. Eles também

podem ser usados em estudos de associação com doenças. Além disto, poderão

proporcionar base para estudos imunogenéticos de transplantes, investigação forense e

estudos de epidemiologia genética.

7. CONCLUSÕES

Baseando nos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que a região do

cromossomo 6 humano que codifica para os alelos HLA apresenta várias características

importantes:

1. Os loci HLA apresentam elevado polimorfismo.

2. Existe desequilíbrio de ligação global e alélico e baixa taxa de recombinação entre os

loci HLA-A e -B.

3. A seleção natural balanceadora inferida pode ser um fator para explicar a grande

diversidade observada nos loci HLA.

4. As estimativas G’

, em geral, apresentaram valores de divergência maiores do que

as medidas de divergência genética clássicas, mostrando que os loci HLA são

adequados para estudos de diferenciação populacional.

5. O conhecimento da distribuição dos alelos HLA nos diferentes grupos populacionais

é importante para determinar as chances de encontrar um doador para transplante e

diminuir, portanto o tempo de busca.

8. ANEXOS

Resumos apresentados em Congressos e Simpósios durante o Mestrado

Anexo 1

I Simpósio de Biotecnologia da UFMG e I Encontro de Alunos e Ex-alunos da PG Genética –

Profa. Cleusa Graça da Fonseca (Belo Horizonte – julho 2008)

HLA-A, -B, -DRB1 allele and haplotype frequencies in 1000 human samples

from mixed population of the Minas Gerais state, Brazil

1,2

Raquel A. Fabreti Oliveira,

Cleusa G. Fonseca,

Eliane M. G. Vale,

Roselia M. Carvalho,

2,30

Evaldo Nascimento

1Human Genetics, Department of General Biology, Federal University of Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil.2Laboratory IMUNOLABTx – Transplant

Immunology. 3Transplantation Center, Hospital of Santa Casa, Belo Horizonte, Minas Gerais and Clinical Hospital, Federal University of Minas Gerais,

Minas Gerais, Brazil.

*Correspondent author: [email protected]

Introduction

The human leukocyte antigen (HLA) system is

composed of a cluster of genes on the short arm of

human chromosome 6. HLA plays a central role in

immune responsiveness to pathogens, and its

polymorphism is a causal factor for rejection graft or

grafts versus host disease in organ transplantation.

The HLA genes are highly polymorphic with over 649

alleles identified at the locus A, over 1029 for locus B

and over 556 alleles for the locus DRB1 (June 2008

ImMunoGeneTics/HLA database release)

. Information

on allele an haplotype frequencies of the HLA loci also

provides a better understanding of the origin of human

population and investigation of genetic predisposition

to immune-mediated disorders including emerging

infectious diseases

2-4

Purpose

The goal of this study was to analyze the HLA-A, -B,

-DRB1 alleles and haplotypes frequencies in 1000

unrelated individuals randomly selected from mixed

population of the Minas Gerais state, Brazil.

Materials and Methods

Genomic DNA of each volunteer was prepared by

the standard salting-out method using PMNC (Miller et

al., 1988). HLA typing for HLA-A, -B, and -DRB1 was

done by polymerase chain reaction-sequence-specific

oligonucleotide probe SSOP (One Lambda, USA). All

statistical analyses and haplotype estimations were

performed using the PyPop package 0.6.0 version.

Results

The genotype frequencies of all three HLA loci were in

Hardy-Weinberg equilibrium [Guo and Thomson p values

0.8547 (HLA-A), 0.4590 (HLA-B) and 0.3951 (HLA-

DRB1)]. The number of heterozygotes observed wasn't

significantly different from that results expected (Table

1). Negative F

values for Ewens–Watterson

homozygosis were observed at all three loci, and the F

values were significantly low for all loci (P=0.0031 for the

HLA-A, 0.0011 for B and 0.0000 for DRB1), suggesting

that an action of balancing selection in shaping allelic

diversity at all loci. A total of 20 HLA A alleles were

identified. Four alleles, contributed approximately to 50%

of the allele frequency A*02 (0.2355), A*03 (0.0975),

A*01 (0.0810) and A*24 (0.0805). A total of 44 HLA B

alleles were identified. The most frequent alleles were

B*44 (0.1175), B*35 (0.1150), B*15 (0.0795) and B*51

(0.0715). A total of 15 HLA DRB1 alleles were identified.

The most frequent alleles were DRB1*13 (0.1565),

DRB1*07 (0.1420), DRB1*04 (0.1145), DRB1*11 and

DRB1*15 with the same frequencies (0.1080) and

DRB1*03 (0.1050). The most common ABDRB1

haplotype predicted by EM algorithm was A*01-B*08-

DRB1*03 (0.0274), followed by A*29-B*44-DRB1*07

(0.0150) and A*02-B*44-DRB1*07 (0.0101). The Linkage

Disequilibrium measures of the strength of association

between pairs of HLA loci were calculated. The B:DRB1

(D’=0.4432) associations are stronger than the

associations between other loci, but all pair wise

associations are statistically significant A:B (P=0.0029)

and A:DRB1 (P=0.0027).

Table 1: Heterozigosity at the HLA –A, B and DRB1 loci.

0.9040.8960.893A

0.8000.8970.890DRB

0.6820.9460.934B

PExpected H-W

heterozygotes

Observed

heterozygotes

Locus

References

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complex. Nucleic Acids Res. 31:311-4.

2. Cavalli-Sforza, L.L and Bodmer W.F. 1971 The Genetics of Human Populations.W.H. Freeman, San Francisco.

3. Hartl D.L. and Clark A.G. 1989. Principles of Population Genetics. 2nd edition. Sinauer Associates, Sunderland.

4. B. Tu, S. J. Mack, A. Lazaro, A. Lancaster, G. Thomson, K. Cao, M. Chen, G. Ling, R. Hartzman, J. Ng & C. K. Hurley. 2007. HLA-A, -B, -C, -DRB1

allele and haplotype frequencies in an African American population. Tissue Antigens 69:73-85.

Conclusions

These results provide information that can be used for

future anthropological studies. It also can guides the

search for HLA-matched unrelated hematopoietic stem

cell donor in the bone morrow donor Brazilian bank.

Anexo 2

International Histocompatibility and Immunogenetics Workshop (Búzios –

setembro/2008)

STRONG LINKAGE DISEQUILIBRIUM BETWEEN HLA-A*2402, B*0720 AND DRB1*1601 IN

5000 VOLUNTEERS FROM ADMIXED POPULATION OF THE MINAS GERAIS STATE, BRAZIL

1,2

Raquel A. Fabreti Oliveira,

Cleusa G. Fonseca,

Roselia M. Carvalho,

2,3

Evaldo Nascimento.

Department of General Biology and Genetics, Federal University of

Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil.

IMUNOLABTx – Laboratory of Transplant Immunology, Belo Horizonte, Minas Gerais.

Transplantation Center, Hospital of Santa

Casa, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil. *Correspondent author: nascimentoe@uol.com.br

INTRODUCTION

The HLA-B*0720 allele was first described in a white male of

Cuban origin showing typing HLA-A*2402, 6602, B*0720, 5801,

Cw*07, DRB1*02, 04 (Williams et al. 2001)

. The B*0720 is

considering a rare allele, but it was reported in Caucasoid from

Brazil, France and Portugal (IMGT/HLA)

. The variant allele

most closely aligns with HLA-B*070201 with three nucleotide

changes occurring in exon 3 at positions 216 (G C), 217 (A T)

and 229 (G C)

PURPOSE

The purpose was to study the allele and haplotype

frequencies and the linkage disequilibrium between the HLA

A*2402, B*0720 and DRB1*1601 in 5000 healthy admixed

volunteers, unrelated, randomly selected from Minas Gerais,

state.

MATERIALS AND METHODS

Genomic DNA from the volunteers was extracted from PMNC

using the standard salting-out procedure. The samples were

typed for exon 2 and 3 to class I (HLA-A, -B) and exon 2 to class

II (HLA-DRB1) by Polymerase Chain Reaction (PCR) and

Sequence Specific Oligonucleotide Probes-SSOP (One

Lambda, CA, USA). The Sequencing-Based-Typing (PCR-SBT

Applied Biosystems, USA ABI 3130, USA) for three loci were

done with the same exons in all volunteers with B*0720-positive

in SSOP. The PyPop 0.6.0 version was used to carry out all

statistical calculations and population data analysis

RESULTS

The genotypes frequencies of HLA A, B and DRB1 loci in this

population were in Hardy-Weinberg equilibrium (Guo and Thomson

P values were 0.0745 for HLA A, 0.2313 for HLA-B and 0.2899 for

HLA-DRB1). The A*24 frequency was 0.0795. Six Hundred eighty-

six were found to be B*07 (13.72%). Those 686 volunteers the

frequency of 0.0189 was obtained for the B*0720 allele. The

frequency of the DRB1*16 was 0.0310. The Haplotype frequencies

using EM algorithm and Linkage Disequilibrium (LD) were

performed in the 686 HLA-B*07 volunteers. The association

between A*2402:B*0720:DRB1*1601 was observed in 10 of 13

volunteers (0.7693) B*0720-positive. The LD measures of the

strength of association between pairs of HLA loci were

A*2402:B*0720 (D’=0.8181), A*2402:DRB1*1601 (D’=0.8611) and

B*0720:DRB1*1601 (D’=0.9849), all pair wise associations are

statistically significant (P< 0.002). The others two haplotypes were

A*0301-B*0720-DRB1*1601 (0.1538) and A*0101-B*0720-

DRB1*1001 (0.0769). The haplotype HLA 2402:0720:1601 was

also assigned in one family studied and segregation analysis was

confirmed.

REFERENCES

1.F. Williams, M.D. Curran, M. Paradoa Perez, A. Acosta, D. Middleton. Characterisation of a new HLA-B allele, HLA-B*0720, identified in the Cuban population .

Tissue Antigens 2001: 57: 80–82

2.Robinson J, Waller M.J., Parham P. et al. IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility complex. Nucleic Acids

Res.:2003: 31:311-4.

3.Lancaster A, Nelson MP, Meyer D, Thomson G, Single RM. PyPop: a software framework for population genomics: analyzing large-scale multi-locus genotype

data. Pac Symp Biocomput: 2003 514.

CONCLUSIONS

These data suggested that the strong LD has been selected to

improve the immune response against pathogenes. The LD found

in this population can match with previous data (Williams et al.,

2001)

Anexo 3

International Histocompatibility and Immunogenetics Workshop (Búzios –

setembro/2008)

STRONG LINKAGE DISEQUILIBRIUM BETWEEN HLA A*0201, B*1804 AND DRB1*1104 IN

5000 VOLUNTEERS FROM ADMIXED POPULATION FROM MINAS GERAIS STATE, BRAZIL

1,2

Raquel A. Fabreti Oliveira,

Cleusa G. Fonseca,

Roselia M. Carvalho,

Walter Pereira,

2,3

Evaldo Nascimento

Department of General Biology and Genetics, Federal University of Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil.

IMUNOLABTx – Laboratory of Transplant Immunology, Belo

Horizonte, Minas Gerais.

Transplantation Center, Hospital of Santa Casa, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil.

*Correspondent author: nascimentoe@uol.com.br

INTRODUCTION

The linkage disequilibrium (LD) describe the non-random

association of alleles at different loci. The presence of significant

LD at HLA loci can be due to history for very closely linked

genes and can also indicate he operation of balancing selection

in these loci

1,2

. The B*1804 was considered a rare allele and

have reported in caucasoid population (IMGT/HLA Database)

and had be finding at Australia New South Wales population.

The B*1804 allele differed of HLA-B*180101 by four nucleotides

non-synonymous substitutions on exon 2 at positions 25 (codon

9 C-to-T), 31(codon 11 T-to-G), 34 (codon 12 G-to-A) and 70

(codon 24 T-to-G), resulting in His-to-Tyr, Ser-to-Ala, Val-to-Met

and Ser-to-Ala substitutions, respectively. There is also a silent

mutation on exon 2 at position 69 (codon 23), a C-to-T

nucleotide switch.

PURPOSE

The purpose of this study was to evaluate the allele, haplotype

frequencies and the linkage disequilibrium between the HLA

A*0201, B*1804 and DRB1*1104 in 5000 healthy admixed

volunteers, unrelated, randomly selected from Minas Gerais

state, Brazil.

MATERIALS AND METHODS

Genomic DNA of the volunteers was extracted of the PMNC

using the standard salting-out procedure. The samples were

typed for exon 2 and 3 to class I (HLA-A, -B) and exon 2 to class

II (HLA-DRB1) by Polymerase Chain Reaction (PCR) and

Sequence Specific Oligonucleotide Probes-SSOP (One

Lambda, CA USA). The Sequencing-Based-Typing (PCR-SBT

Applied Biosystems, USA ABI 3130, USA) for the three loci was

done with the same exons in all volunteers with B*1804-positive

in SSOP. The PyPop 0.6.0 version was used to carry out all

statistical and population data analysis

RESULTS

The genotypes frequencies of HLA-A, -B and -DRB1 loci in this

population were in Hardy-Weinberg equilibrium (Guo and Thomson

P values equilibrium p = 0.0745 for locus A, 0.2313 for B and

0.2899 for DRB1). A total of 21 HLA-A alleles were identified, and

the A*02 frequency was 0.2445. For HLA B alleles 48 were

identified. Four hundred fifth-nine (9.18%) of the 5000 volunteers

were found to be B*18, but the B*1804 allele was 0.0196. For HLA

DRB1 17 alleles were identified, and the DRB1*11 allele frequency

was 0.1064. The haplotype frequencies predicted by EM algorithm

and LD were performed among the 459 HLA-B*18 volunteers. The

association between A*0201:B*1804:DRB1*1104 was observed in

all volunteers B*1804-positive. The LD measures of the strength of

association between pairs of HLA loci were D’=1.0000 for

0201:1804 and 1804:1104. The association was D’=0,7000 for

0201:1104. All pair wise associations were statistically significant

(P<0.002). This haplotype was also assigned in families studied

and segregation analysis was confirmed.

REFERENCES

1.Cavalli-Sforza, L.L and Bodmer W.F. The Genetics of Human

Populations.W.H. Freeman, 197: San Francisco.

2.Hartl D.L. and Clark A.G. Principles of Population Genetics. 1989: 2nd edition.

Sinauer Associates, Sunderland.

3.Robinson J, Waller M.J., Parham P. et al. IMGT/HLA and IMGT/MHC:

sequence databases for the study of the major histocompatibility complex.

Nucleic Acids Res.:2003: 31:311-4.

4.Lancaster A, Nelson MP, Meyer D, Thomson G, Single RM. PyPop: a software

framework for population genomics: analyzing large-scale multi-locus

genotype data. Pac Symp Biocomput: 2003 514.

CONCLUSIONS

These data suggested that the strong linkage disequilibrium has

been selected to provide high fitness in the immune response to

pathogens.

Anexo 4

XIII Congresso da Sociedade Brasileira de Transplante de Medula Óssea (Curitiba –

agosto/2009)

Analysis of allelic, haplotype diversity, linkage disequilibrium and inter-loci recombination rate of the

MHC Class I region of 917 families from Minas Gerais state, Brazil

3,4

Oliveira, RAF.,

1,2,4*

Nascimento, E.,

Tarazona, EMS.,

Carvalho, RM.,.

Vale, EMG.,

Oliveira, CKF.,

Goreti, CQ.,

Fonseca, CG.

1Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. 2Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisas, Hospital Santa Casa de Belo Horizonte, MG.

3Departamento de Biologia Geral – ICB/UFMG. 4IMUNOLABTx – Laboratório de Histocompatibilidade e Imunologia de transplantes, Belo Horizonte, MG.

*Corresponding author: [email protected]

RESULTS

The three most common allele lineage in the HLA-A and -B

loci were A2 (0.24), A3 (0.09), A1 (0.09), B44 (0.12), B35

(0.11), B51 (0.08), respectively. Four hundred and fifty

haplotypes were observed with ten founded in 55 or more

copies (Table 1). Deviations of the Hardy–Weinberg

proportion were not observed for both loci analyzed

(p>0,05). Strong individual haplotypic associations (D´ij)

were observed for this pair of loci such as A2:B48

haplotype (D´=0.7371, p<0.0000). The ten more frequents

haplotypes and its statistically significant p-value were

show in the table 1.The global LD was also statistically

significant (p=0.0029). The inter-loci recombination rate

observed was 0.42%.

INTRODUCTION

The HLA loci are highly polymorphic. In multilocus

models the allele frequencies for each locus is insufficient

to describe the genetic variation, instead, the frequency of

multilocus gametes should be used because the

association of alleles may occur in gametes

. The

segregation analysis of haplotypes in families is important

for the accurate calculation of Linkage Disequilibrium

(LD) and estimating of the inter-loci recombination rate

MATERIAL AND METHODS

The sample was consisted of 917 families. The haplotypes

were obtained of HLA-A and -B typing of the parents or

by reconstruction of parents haplotypes based on

offspring genotypes. The polymorphisms at the exons 2

and 3 in these loci were identified using the PCR-SSOP

(One lambda, CA USA). The statistical analysis was

performed using Arlequin program version 3.11

(Approved by Ethic Committee #675/08).

OBJECTIVE

To measure LD between the HLA-A and -B loci based on

haplotypes segregation in families, to estimate the

recombination rate and to evaluate the allele and

haplotype diversity in Minas Gerais state population

CONCLUSIONS

The strong association between these HLA loci and the low

recombination rate in the HLA region has been observed in

many populations in the world and also shown in this study.

REFERENCES

1.Hedrick P. Genetics of Populations. 2nd ed: Jones & Bartlett Pub., 2000.

2.Sanchez-Mazas A, Djoulah S, Busson M, et al. A linkage disequilibrium map of

the MHC region based on the analysis of 14 loci haplotypes in 50 French families.

Eur J Hum Genet. 2000;8:33-41.

Table 1: HLA-A:HLA-B haplotypes frequencies.

0.00000.5495550.01499530 42

0.00000.0886590.01608524 35

0.00000.0901630.0171763 35

0.00000.3844640.01744833 65

0.0049-0.2385720.0196292 35

0.00000.1943750.0204473 7

0.00000.4246840.02290129 44

0.00000.49081100.0299891 8

0.00000.22111190.0324432 51

0.00020.09191370.0373502 44

p-valueD´

# copiesAbsolute

Frequence

HLA-AB

Haplotype

Anexo 5

Projeto de Mestrado: parecer do Prof. Dr. Eduardo Tarazona Santos

Anexo 6

Projeto de Mestrado: parecer do Profa. Dra. Maria Raquel Carvalho

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL

Parecer

Referente ao Projeto de pesquisa (mestrado): IDENTIFICAÇÃO DE NOVOS ALELOS E

ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA

ESTRUTURA GENÉTICA DA POPULACÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS

GERAIS, BRASIL

Autores: Aluna: Raquel Aparecida Fabreti de Oliveira (PG Genética), Orientadora:

Profa. Dra. Cleusa Graça da Fonseca (Departamento de Biologia Geral).

Histórico: O projeto de pesquisa prevê a análise dos resultados da genotipagem dos

loci HLA-A, HLA-B e HLA-DRB1, já disponíveis na base de dados do Nefrodata, o

banco de dados de compatibilidade doador-receptor de transplantes do Laboratório

Imunolab. Serão avaliadas as frequências alélicas, haplotípicas e genotípicas, a

contribuição das diferentes populações fundadoras (conforme auto-definição com

base nos critérios do IBGE) para a constituição da população do Estado, a frequência

de recombinações no intervalo genético em estudo. Serão analisados os resultados

de 5000 doadores e de 1000 famílias de receptores. Esta análise de dados permitirá

estimar a probabilidade, com base nos genótipos destes loci, de que se encontre um

doador compatível para um determinado indivíduo, fora da sua família, na base de

dados de doadores de órgãos e também na população em geral. Esta informação

permitirá aos autores estimarem o tamanho necessário das bases de dados para que

um doador compatível esteja presente nelas, considerando as frequências dos

diferentes genótipos. Além disto, o projeto gerará dados para estudos de associação

HLA-doença.

Mérito: Trata-se de uma situação típica, onde há clara necessidade de atuação da

expertise, disponível nas Universidades públicas, para a solução de problemas

teóricos complexos. A colaboração estabelecida vai permitir responder questões

científicas, relacionadas à estrutura genética da população de Minas Gerais, mas

também questões de ordem prática, resultando em maior eficiência dos sistemas de

identificação de pares de doador-receptor compatíveis para transplante de órgãos do

Estado de Minas Gerais e do Brasil.

Parecer: Por considerar que há mérito científico e que este projeto vai gerar

informações que podem servir de base para um melhor funcionamento dos sistemas

de localização de doadores compatíveis do estado de Minas Gerais e no Brasil,

recomendo à aprovação.

Belo Horizonte, 09 de fevereiro de 2009.

Maria Raquel Carvalho

Prof. Adjunto III

Anexo 7

Aprovação do estudo pelo Comitê de ética em Pesquisa da Santa Casa de Misericórdia de

Belo Horizonte.

Anexo 8

Aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas

Gerais

Anexo 8 (Continuação)

Aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas

Gerais

Anexo 9

Artigo sob revisão a ser submetido ao periódico Human

Immunology

Analysis of allelic, haplotype diversity, linkage disequilibrium and inter-loci

recombination rate of the MHC Class I region of 917 families from Minas Gerais state,

Brazil

Raquel Aparecida Fabreti Oliveira

a, b

, Evaldo Nascimento

2,3

*, Eduardo Tarazona-Santos

, R.

M. Carvalho

, E. M. G. Vale

, C. K. F. Oliveira

, Cleusa G. Fonseca

Department of General Biology, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, MG,

Brazil.

IMUNOLABTx – Lab of Histocompatibility, Immunogenetics and Transplant Immunology,

Belo Horizonte, MG, Brazil.

Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisas do Hospital Santa

Casa, Belo Horizonte, MG, Brazil.

* Corresponding Author: raquel@imunolabtx.com.br

ABSTRACT

Volunteer subjects from 917 Brazilian families were genetically evaluated in the study. The

haplotypes were inferred based on offspring genotypes or by typing HLA-A and -B loci of the

relatives. The three most common allelic lineages in the HLA-A and -B loci were A2 (0.2394),

A3 (0.0913), A1 (0.0900), B44 (0.1198), B35 (0.1077), B51 (0.0796), respectively. Four

hundred and fifty haplotypes were observed with A2:B44 (0.037350), A2:B51 (0.032443) and

A1:B8 (0.029989) being the more frequents. Deviations from the Hardy–Weinberg

proportions were not observed for both loci. The global linkage disequilibrium was statistically

significant (p value=0.0029). Strong individual haplotypic associations, such as A2:B48

haplotype (D´=0.7371, p<0.0000) were observed. The observed inter-loci recombination rate

was 0.45%. The study of haplotypes in a large sample, based on family segregation,

provides accurate definition of haplotypes and the exact pattern of linkage disequilibrium.

Key words: Allele and haplotype frequencies, Brazilian population, HLA, linkage

disequilibrium, recombination rates.

INTRODUCTION

The Major Histocompatibility Complex (MHC) is the most polymorphic region of the

human genome (1). The Human Leukocyte Antigens (HLA) complex spans four Mega bases

(Mb), and is mapped in the chromosome region 6p21.3 within the MHC region. HLA genes

are highly polymorphic, with the HLA-B locus exhibiting the greatest allelic variation and

being considered as the most polymorphic gene of the human genome, with around 86 SNPs

per kb (2, 3). Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) are the most common type of

variation observed across the HLA loci (4), showing marked differences in the distribution of

HLA allele frequencies among human populations (5-8).

HLA molecules present endogenous peptides in the linear form to the T-CD8

lymphocytes after being processed by antigen presenting cells (APC). The HLA molecules

are directly involved in the allorecognition (9). Moreover, the gene products of MHC class I

are involved in the immune response mediated by Natural Killer cells (NK), by interacting

with KIR receptors (Killer Immunoglobulin-like Receptor) of NK cells (10). The specific

combination MHC-peptide indicates that the immune response of heterozygous subjects in

the HLA loci were more effective by responding successfully to a large repertoire of

pathogens (10).

The highest matching probability of HLA haplotypes among close relatives is impaired

by inter-loci recombination events that have been reported in family studies (11).

Recombination occurs at a rate of 0.31% between HLA-A and -B loci, separated by 1.4 Mb

(1). Given the small distance between HLA-A and HLA-B, more than one crossing over in the

same family is very rare. Moreover, maternal recombination is more frequent than the

paternal recombination (12, 13). In general, both inter-loci and intra-locus recombination

contributes to HLA and MHC haplotype diversity.

Inversions, deletions or other chromosomal rearrangements can make pairing of

homologues in the meiosis difficult, reducing the frequency of recombination. As a result of

deletions, insertions and duplications, physical distance between the MHC human loci vary

even from one haplotype to another (14). It is also possible that structural barriers such as

the length of haplotypes and gene organization inhibit the correct alignment of homologous

chromosomes necessary for recombination (14, 15).

Recombination does not occur randomly in the genome and a number of

recombination hotspots has been proposed based on linkage disequilibrium inferred from

family data (16). The low recombination rate among HLA loci may reflect the absence of

sequences motifs that are known as intensifiers of recombination (3). Additionally, the

preservation of HLA-A and -B genes in specific combinations can influence immune

response to foreign antigens and the susceptibility to autoimmune diseases (17).

An important feature of the MHC region is a strong linkage disequilibrium (LD, non-

random association of alleles at two or more loci) (13). The analysis of LD can be a powerful

tool to identify the action of natural selection that maintain certain haplotypes (11). Due to the

low frequency of recombination between HLA-A and -B, a large number of meiosis are

required to properly estimate the frequency of recombination in this region (11). Studies on

families are the most informative approach to define haplotypes and hence, to determine the

pattern of LD in a given population (18).

Our aims in this study were to measure LD between the HLA-A and -B loci based on

haplotypes segregation in families, to estimate the recombination rate and to evaluate allele

and haplotype diversity in the Minas Gerais state population, whose composition received

contributions from European and African, and native Americans (19).

MATERIAL AND METHODS

Sample

We analyzed 917 Brazilian families from the Minas Gerais State, for whom typing of

HLA-A and -B were recommended to find a compatible donor for hematopoietic stem cells

transplantation in family members. These families are usually composed by parents with an

average number of four children (one to 11 children for each family). When parents were

absent in a family, typing a minimum of four relatives, mainly siblings, per family, was

required to determine the haplotypes. In each family with detectable recombination between

the HLA-A and -B loci, the haplotypes were deduced from at least five individuals, of which at

least three had to be relatives with no recombination events. This study was approved by the

Research Ethics Committees for human research from the Federal University of Minas

Gerais, MG (#675/2008), and Hospital Santa Casa of Belo Horizonte, MG, Brasil

(#073/2007).

HLA typing

Genomic DNA was extracted from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) by

Salting-out method (Miller et al., 1988) (20), with modifications. Briefly, 500 μl of whole blood

obtained from anticoagulated blood (EDTA) was resuspendend in 1.5 ml Eppendorf tube and

lysed during 10 min with hypotonic saline buffer (8 mM Tris-HCl, 119 mM NH

Cl and 4 mM

EDTA) to remove red blood cells. The supernatant was discarded after centrifuge for 2

min at 10,000 rpm. The cell lysates were digested at 65°C at 30 min under 100 rpm with 300

μl of sterile water, 150 μl of Guanidine Hydrochloride (Gu-HCl 7,54 M and 12 M Tris-HCl,

pH=7,6) (Invitrogen CA-USA), 150 μl of 10% SDS (Invitrogen CA-USA) to solubilized the

membrane lipid of the cells and 30 μl of a proteinase K solution 10 mg/ml (Ludwig Biotec -

RS- Brazil). After digestion was completed, centrifuged at 14,000 rpm for 4 min. The

precipitated protein pellet was left at the bottom of the tube and the supernatant contained

the DNA was transferred to another 1.5 ml Eppendorf tube with 500 μl of isopropanol P.A

(Merck - Brazil). The tube should be inverted several times until DNA precipitated followed by

centrifuged at 14,000 rpm for 2 min. The pellet of DNA was washing with 500 μl of 70% P.A

ethanol (Merck - Brazil) and centrifuged 14,000 rpm for 2 min. The DNA was allowed

dissolved in sterile water 30 min at 65º C under 100 rpm. The concentration used was 20 to

30 ng/µl A260/A280 nm and the ratio of 1.65 to 1.80 to verify the DNA purity. The HLA-A and

-B typing were performed in all donor family members and in the bone marrow recipient. The

HLA-A and -B typing were performed in all donor family members and in the bone marrow

recipient. We identified polymorphisms at the exons 2 and 3 of the HLA-A and HLA-B loci by

the PCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probe), using commercial kits Labtype

SSO (RSSO1A, RSSO1B - One Lambda, Canova, CA, USA) following the manufacturer

recommendations. All results were converted to serologically defined HLA antigens. The

determination of antigenic splits was based on HLA World Health Organization nomenclature

(2, 21), the database sequences of HLA IMGT/HLA database (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla)

(2) and HLA Dictionary (22).

Statistical analysis

The knowledge of the gametic phase, based on analysis of pedigrees, allows for the

estimation of allele and haplotype frequencies by direct counting. The observed

heterozygosity (H

obs

) was calculated for each locus. It is defined as the proportion of

heterozygote expected under Hardy-Weinberg proportions for allele frequencies observed

obs

= 1-∑p

The exact the test of Guo and Thompson (1992) (23) was used to assess the Hardy-

Weinberg equilibrium for HLA-A and HLA-B loci, using 100,000 steps in the Markov chain

(24).

Linkage disequilibrium

An exact test of linkage disequilibrium was used to detect the presence of association

between loci. We also used the D` statistics for alleles of the pair of loci [Lewontin (25) and

Weir (26)]. D´

= 0 indicates independent segregation. A value of +1 indicates complete

association of a given pair of alleles on a haplotype, thus, that there are at most three

observed two-loci haplotyes and therefore, no evidence of recombination between the loci.

D´

< 1 is indicative of the presence of the various possible two-loci HLA haplotypes. All

these analyses were carried out by Arlequin version 3.11 software (27). Calculation of the

recombination rate was done as the ratio between the number of recombinant chromosomes

to the total number of informative meiosis.

RESULTS

General aspects of population

After finding a possible donor on the basis of the HLA-A and -B matching, the search

for a donor in the family could be continued for 44.7% of recipients, on the basis of other HLA

loci. Among the matched donors, 95.56% were siblings, 2.97% were parents and 1.47%

were other relatives of the recipents. Five of the 18 potential donors, who were not siblings,

belong to families whose parents were cousins and shared one haplotype.

Genetic diversity

Allele frequencies

The observed allelic lineages at HLA-A and -B loci were 20 and 38, respectively

(Table 1). For the HLA-A locus, A2 (0.2394), A3 (0.0913), A1 (0.0900) and A24 (0.0862)

showed the highest frequencies. For the HLA-B locus, B44 (0.1198), B35 (0.1077), B15

(0.0818) and B51 (0.0796) were the most common allelic lineages. No deviations from

Hardy-Weinberg genotype frequencies for both loci were observed (p> 0.05) (Table 2), with

the HLA-A and -B showed high allelic diversity: 91.17% and 94.93%, respectively. The exact

test using the modified version of the Markov chain algorithm, described by Guo and

Thompson (1992), was done for all haplotypes, and deviations from the Hardy Weinberg

proportions were not observed (p = 0.70928).

Haplotype frequencies

A total of 450 different haplotypes HLA-A:HLA-B were observed, of which 194

(43.1%) being observed greater than 5 copies (Table 3). The five most common HLA-

A:HLA:B haplotypes, with frequencies exceeding 2% were A2:B44 (0.037350), A2:B51

(0.032443), A1:B8 (0.029989), A29:B44 (0.022901) and A3:B7 (0.020447). The 47 HLA-

A:HLA-B haplotypes with 20 or more copies in the sample accounted for 50.4% of population

gene pool. The events of recombination resulted in two new haplotypes: A25:B38 and

A31:B72.

The 403 haplotypes that were less frequent in the samples (<20 copies) accounted

for 49.6% frequency of haplotypes. Of these, 137 haplotypes were represented by only one

copy in the sample.

Linkage disequilibrium

We observed LD between the HLA-A and -B loci (p<0.003). The strength of

association (D`) was significant for 92 (47.4%) of 194 haplotypes that have 5 or more copies

in the sample (Table 3). The B44, B35, B51, B7 and B8 alleles were the most frequent in the

HLA-B locus and showed a strong LD with the most frequent A2, A3 and A1 allelic lineages

of the HLA-A locus. The strongest LD was the observed in the A2:B48 haplotype (D´=0.7371,

p<0.0000). In fact, twelve of the fifteen copies of the B48 were associated with A2. The

haplotype with the smallest strength of association was the A30:B44 haplotype (D´=-0.7930,

p<0.0000) (Table 3).

Recombination rate between HLA-A and HLA-B loci

The number of informative meiosis tested was about 6860 and we observed 31

recombination events between HLA-A and HLA-B, for a recombination rate of 0.45%. In 16 of

31 cases of recombination parents were genotyped, making it possible to verify if

recombination occurred in the paternal or maternal chromosome. In 56.25% (9/16) of cases,

the recombinant chromosomes came from the mother, a proportion that does not allow us to

reject the null hypothesis of different recombination rates among paternal and maternal

chromosomes (χ

= 0.617 p=0.432).

In eight (25.8%) cases of HLA-matched donors, the recombination event decreased

from 4 to 3 the matches between the receptor and donor. In eight (25.8%) cases the events

of recombination favored the search for a donor because the number of matches donor-

receptor has increased from 2 to 3.

DISCUSSION

The probability of finding an HLA-matched donor among siblings, following Mendel’s

rules, is 25%. Eid et al., 2003 (28) demonstrated that 43.6% of patients transplanted at the

University of Campinas (São Paulo State, Brazil) found a matched donor in their families.

The proportion of 44.7% of receptors that found a donor in the family, observed in this study,

was similar to the study of Eid et al. Moraes et al., 2004 (29) demonstrated that in Brazil,

more than 50% of patients needing a transplant of hematopoietic stem cells did not find an

HLA matched donor in their families.

The distribution of allele frequencies in the examined loci was consistent with those

observed in Brazilian populations, with HLA-B locus being the most polymorphic (5, 7). The

high heterozygosity in the HLA-A and -B loci provide individuals with better immune

responses (13). The four most common HLA-A (HLA-A2, A3, A1 and A24) and HLA-B (HLA-

B44, B35, B51 and B7) alleles in this sample were the same four most common HLA-A and -

B alleles in other Brazilian population from São Paulo and Paraná states (30). Various HLA-

A:HLA-B haplotypes that were commonly observed in other populations in the world (5-8, 30-

33) were also observed here, although with different frequencies. Those haplotypes were

characteristic of different ethnic groups, such as Europeans (A1:B8, A2:B7, A11:B35, A2:B44

and A3:B7), Black (A30:B42, A36:B53, A29:B53, A23:B72) (5). Our sample also share

haplotypes such as A31:B35 and A31:B:39 with American Indians (34). The four most

frequent haplotypes in the studied sample match with the four most common haplotypes of a

sample from southern Portugal population (30). We observed haplotypes characteristic of the

oriental population from Taiwan such as A2:B48 and haplotypes characteristic from Spanish

population such as A25: B18 (30). Also was observed haplotypes characteristic from Zambia

such A30:B42 whose frequency is 11.6% in that population. The genetic diversity of the

markers studied support the known genetic background of the mixed population of Minas

Gerais.

The study of haplotypes based on family segregation provides a more accurate

definition of haplotypes and of the LD. Consequently, this data may be used as a priori

information for further studies.

The recombination rate of 0.45% observed between the loci HLA-A and HLA-B was

lower than expected given the standard 1% recombination rate per megabase of DNA per

meiosis (17). In particular, recombination originated two new haplotypes that were not

observed in the sample, but were already seen in other populations (32). Satta (1997)

indicates that recombination plays a role in the generation of HLA diversity, which is then

maintained by selection (35). LD between HLA-A and HLA-B loci has been observed in many

populations in the world and in this study (18, 33), which is consistent with the observed low

rate of recombination and admixture.

Although, there are similarities among the reported results and those found in other

populations (29-33), the distribution of allele and haplotypes frequencies was different in

some cases, highlighting the interpopulation variability. Therefore, the present data may

contribute to anthropological and microevolutionary studies of HLA. They can be used as the

basis for further disease association studies and calculation of the possible frequency of

donors for patients from the area. Furthermore, they will provide the ground for studies on

immunogenetics of transplantation, forensic investigations and genetic epidemiology

involving the HLA loci.

Table 1: Allelic lineage frequencies of the loci HLA-A and HLA-B.

In parenthesis are the original broad specificities of the HLA-B.

Allelic lineage

Frequency

Count

Allelic lineage

Frequency

Count

Allelic lineage

Frequency

Count

HLA-A

HLA-B

0.2394

877

0.1198

439

61 (40)

0.0166

0.0913

335

0.1077

395

0.0164

0.0900

330

0.0796

292

71 (15)

0.0150

0.0862

316

0.0763

280

63 (15)

0.0134

0.0657

241

0.0559

205

0.0120

0.0649

238

65 (14)

0.0540

198

64 (14)

0.0109

0.0641

235

0.0466

171

0.0106

0.0523

192

0.0316

116

0.0087

0.0466

171

0.0297

109

0.0071

0.0420

154

0.0292

107

0.0041

0.0327

120

62 (15)

0.0286

105

0.0041

0.0297

109

0.0275

101

0.0030

0.0262

0.0273

100

0.0030

0.0188

0.0259

0.0019

0.0158

0.0248

75 (15)

0.0014

0.0115

0.0240

0.0011

0.0115

72 (15)

0.0234

0.0003

0.0079

60 (40)

0.0236

0.0003

0.0025

0.0174

0.0011

0.0172

Table 2: Heterozygosity in loci HLA-A and HLA-B

Locus

Number of

genotypes

Observed

Heterozygosity

Expected

Heterozygosity

P-value

HLA-A

1834

0.91167

0.89630

0.47330

HLA-B

1834

0.94929

0.94412

0.48330

Table 3: HLA-A:HLA-B haplotype frequencies linkage disequilibrium estimates (D’)

and its significance.

Haplotype

Absolute

Frequence

# copies

D´

p-value*

Haplotype

Absolute

Frequence

# copies

D´

p-value*

2 44

0.037350

137

0.0919

0.0002

1 38

0.002726

0.0843

0.0363

2 51

0.032443

119

0.2211

0.0000

31 62

0.002726

0.0675

0.0002

1 8

0.029989

110

0.4908

0.0000

2 63

0.002454

-0.2327

0.3577

29 44

0.022901

0.4246

0.0000

2 41

0.002454

-0.1455

0.5860

3 7

0.020447

0.1943

0.0000

29 35

0.002454

-0.5084

0.0184

2 35

0.019629

-0.2385

0.0049

23 41

0.002454

0.1494

0.0002

33 65

0.017448

0.3844

0.0000

34 8

0.002454

0.1678

0.0000

3 35

0.017176

0.0901

0.0000

30 72

0.002454

0.0474

0.1007

24 35

0.016085

0.0886

0.0000

68 60

0.002454

0.0581

0.0505

30 42

0.014995

0.5495

0.0000

3 27

0.002454

0.0542

0.1673

2 7

0.014995

-0.1794

0.0798

24 57

0.002454

0.0042

0.8894

2 18

0.013359

0.0620

0.1386

30 45

0.002454

0.0394

0.1572

2 50

0.013359

0.3231

0.0000

33 7

0.002454

-0.2344

0.3929

11 35

0.012541

0.1478

0.0000

68 49

0.002454

0.0198

0.4232

23 44

0.011996

0.0729

0.0017

31 52

0.002454

0.1139

0.0000

2 62

0.009542

0.1364

0.0127

11 8

0.002181

-0.2545

0.3782

2 39

0.008997

0.1621

0.0053

2 42

0.002181

-0.6482

0.0003

2 60

0.008724

0.2389

0.0002

24 38

0.002181

0.0516

0.1891

23 7

0.008451

0.0584

0.0012

30 8

0.002181

-0.4036

0.1156

1 57

0.008179

0.2308

0.0000

36 53

0.002181

0.2541

0.0000

30 18

0.007906

0.1115

0.0000

23 42

0.002181

0.0207

0.4385

2 65

0.007634

-0.3711

0.0036

31 60

0.002181

0.0750

0.0003

2 58

0.007361

-0.0276

0.8654

32 27

0.002181

0.0982

0.0000

2 53

0.007361

0.0171

0.7497

32 51

0.002181

-0.0780

0.8078

26 38

0.007088

0.4184

0.0000

23 50

0.002181

0.0153

0.5535

24 44

0.006816

-0.3449

0.0174

11 52

0.001908

0.0620

0.0346

31 35

0.006543

0.1035

0.0009

26 44

0.001908

-0.3834

0.1628

68 44

0.006543

-0.1544

0.3646

74 7

0.001908

0.0272

0.4277

3 65

0.006270

0.0356

0.1163

32 61

0.001908

0.0876

0.0001

24 62

0.005998

0.1417

0.0000

68 45

0.001908

0.0165

0.5484

23 49

0.005998

0.1465

0.0000

3 57

0.001908

-0.2336

0.4528

74 72

0.005998

0.3033

0.0000

2 57

0.001908

-0.7076

0.0001

11 51

0.005725

0.0323

0.1175

68 57

0.001908

0.0063

0.8060

24 7

0.005725

-0.1294

0.4890

29 45

0.001908

0.0348

0.1338

3 44

0.005725

-0.4810

0.0006

23 65

0.001908

-0.4200

0.1215

25 18

0.005725

0.4756

0.0000

68 58

0.001908

-0.0581

0.8678

2 45

0.005725

-0.0031

0.9870

2 71

0.001908

-0.4683

0.0496

31 39

0.005725

0.2048

0.0000

30 57

0.001908

0.0049

0.8514

2 27

0.005725

0.1167

0.0932

32 60

0.001908

0.0643

0.0012

24 18

0.005453

0.0337

0.1414

1 62

0.001908

-0.2372

0.4449

2 8

0.005453

-0.5924

0.0000

26 35

0.001908

-0.3085

0.2925

68 35

0.005453

-0.2097

0.2484

74 53

0.001908

0.0744

0.0003

1 44

0.005453

-0.4982

0.0004

68 65

0.001908

-0.4126

0.1308

24 51

0.005453

-0.2050

0.2623

23 53

0.001908

0.0006

0.9818

23 45

0.005453

0.1737

0.0000

24 52

0.001908

0.0273

0.4763

2 49

0.005453

-0.2335

0.1651

74 18

0.001908

0.0575

0.0292

3 18

0.005453

0.0282

0.2335

2 38

0.001908

-0.5126

0.0247

1 35

0.005180

-0.4653

0.0021

74 35

0.001908

-0.0579

0.8660

3 51

0.004907

-0.3250

0.0664

68 42

0.001636

-0.0142

0.9707

68 53

0.004907

0.1113

0.0000

2 64

0.001636

-0.3733

0.1829

68 7

0.004907

0.0003

0.9876

3 58

0.001636

-0.4337

0.1324

1 37

0.004907

0.5192

0.0000

31 44

0.001636

-0.5860

0.0156

24 39

0.004635

0.1102

0.0005

30 44

0.001636

-0.7930

0.0000

1 51

0.004635

-0.3529

0.0481

25 51

0.001636

0.0687

0.1277

68 51

0.004635

-0.0913

0.6705

36 35

0.001636

0.1112

0.0836

3 49

0.004635

0.0711

0.0174

33 42

0.001636

0.0221

0.2971

23 58

0.004635

0.0873

0.0003

29 49

0.001636

0.0091

0.6610

32 35

0.004635

0.0541

0.0988

29 65

0.001636

-0.3040

0.3482

2 72

0.004635

-0.1339

0.4915

29 7

0.001636

-0.5376

0.0391

1 7

0.004362

-0.3648

0.0458

68 39

0.001636

0.0020

0.9413

23 72

0.004362

0.1393

0.0000

68 8

0.001636

-0.5432

0.0363

11 44

0.004362

-0.3100

0.1020

11 18

0.001636

-0.3297

0.2994

30 65

0.004362

0.0220

0.2438

66 57

0.001636

0.0783

0.0003

68 71

0.004362

0.2424

0.0000

66 41

0.001636

0.1225

0.0000

33 44

0.004089

-0.1935

0.3632

11 65

0.001636

-0.3837

0.2068

30 53

0.004089

0.0800

0.0015

25 62

0.001636

0.1183

0.0000

30 35

0.004089

-0.4196

0.0195

68 52

0.001636

0.0333

0.3081

24 50

0.003817

0.0574

0.0567

33 51

0.001636

-0.5106

0.0569

66 58

0.003817

0.2166

0.0000

26 55

0.001636

0.2105

0.0000

2 61

0.003817

-0.0412

0.8556

66 44

0.001636

-0.1435

0.6832

26 51

0.003817

0.0753

0.0119

66 35

0.001363

-0.1995

0.5947

31 51

0.003817

0.0403

0.1273

3 50

0.001363

-0.4580

0.1390

30 13

0.003817

0.3141

0.0000

11 60

0.001363

0.0142

0.5949

34 44

0.003544

0.2147

0.0002

23 8

0.001363

-0.6241

0.0154

11 49

0.003544

0.0706

0.0014

11 64

0.001363

0.0767

0.0380

32 44

0.003544

-0.0125

0.9609

33 50

0.001363

0.0078

0.7024

2 52

0.003544

-0.1379

0.5356

1 41

0.001363

0.0260

0.5809

30 58

0.003544

0.0499

0.0390

30 71

0.001363

0.0273

0.4414

1 58

0.003272

0.0148

0.6061

1 50

0.001363

-0.4497

0.1495

2 48

0.003272

0.7371

0.0000

32 64

0.001363

0.0982

0.0004

24 61

0.003272

0.1210

0.0019

68 62

0.001363

-0.2349

0.5291

11 57

0.003272

0.0714

0.0021

1 65

0.001363

-0.7012

0.0020

33 35

0.003272

-0.2764

0.2234

24 13

0.001363

0.0460

0.3467

23 51

0.003272

-0.3666

0.0854

74 41

0.001363

0.0966

0.0000

30 7

0.003272

-0.3450

0.1120

1 49

0.001363

-0.4901

0.1024

24 8

0.003272

-0.3205

0.1470

30 52

0.001363

0.0149

0.6519

24 65

0.002999

-0.3135

0.1778

1 52

0.001363

-0.1178

0.7667

24 45

0.002999

0.0425

0.1886

2 13

0.001363

-0.4644

0.1019

3 8

0.002999

-0.4125

0.0540

31 61

0.001363

0.0509

0.0292

1 63

0.002999

0.1478

0.0009

32 65

0.001363

-0.0954

0.8152

29 51

0.002999

-0.1872

0.4623

3 62

0.001363

-0.4633

0.1325

68 61

0.002726

0.1067

0.0013

3 13

0.001363

0.0406

0.4216

33 53

0.002726

0.0537

0.0071

24 64

0.001363

0.0425

0.3786

11 7

0.002726

-0.3177

0.1936

29 58

0.001363

-0.0700

0.8659

68 63

0.002726

0.1496

0.0001

24 27

0.001363

-0.0932

0.8174

3 71

0.002726

0.0996

0.0189

30 51

0.001363

-0.7383

0.0005

23 35

0.002726

-0.6098

0.0007

23 81

0.001363

0.2871

0.0000

*Significative level = 0.05. In bold are the statistical significant p-values.

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