ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS
Análise da diversidade genética por marcadores RAPD e SSR em
Fusarium oxysporum f. sp. cubense no Estado de Santa Catarina
Cristiane Maria da Silva
Dissertação apresentada no Programa de Pós-
Graduação em Recursos Genéticos Vegetais da
Universidade Federal de Santa Catarina, como parte
dos requisitos para obtenção do Título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Marciel João Stadnik
Co-orientador: M.Sc. Robert Harri Hinz
FLORIANÓPOLIS
SANTA CATARINA – BRASIL
2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Catalogação na fonte pela Biblioteca Universitária da
Universidade Federal de Santa Catarina
.
S586a Silva, Cristiane Maria da
Análise da diversidade genética por marcadores RAPD
e SSR em Fusarium oxysporum f. sp. cubense no Estado
de Santa Catarina [dissertação] / Cristiane Maria
da Silva ; orientador, Marciel João Stadnik. –
Florianópolis, SC, 2009.
68 p.: il., grafs., tabs., mapas
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa
Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de
Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais.
Inclui referências
1. Recursos genéticos vegetais. 2. Banana. 3. Marcador
molecular. 4. Mal-do-Panamá. I. Stadnik, Marciel Joao. II.
Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-
Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. III. Título.
CDU 631
ii
ads:
iii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Santa Catarina, e ao Programa de Pós-Graduação em
Recursos Genéticos Vegetais,
Ao professor e orientador Marciel João Stadnik pela orientação e conhecimentos a
mim repassados e pela oportunidade;
Ao pesquisador e co-orientador Robert Harri Hinz, pelos ensinamentos a mim
repassados, carinho e incentivo,
A todos os professores e funcionários do Programa em Recursos Genéticos Vegetais
pelos ensinamentos;
Ao Mestre, amigo, conselheiro, Lucas Miura, pelo carinho, incentivo e compreensão
em todas as etapas de minha formação.
A Pesquisadora Adriana Pereira que me acompanhou ao longo do desenvolvimento
deste trabalho, pelos ensinamentos a mim repassados, pelo carinho, e pela amizade construída
Ao Pesquisador Fernando A. Tcacenco, pelo carinho, incentivo e por estar sempre
presente contribuindo com seus conhecimentos,
Ao Pesquisador José Maria Milanez, pela sua compreensão, carinho para que eu
pudesse concluir este mestrado;
Aos Pesquisadores Klaus K. Schermann, Rubens Marchalek, pela atenção e
conhecimentos repassados,
Aos Pesquisadores, José Ângelo Rebelo e Francisco Carlos Deschamps e Gilmar
Roberto Zaffari pelas palavras de incentivo, carinho a amizade
A todos os funcionários da Estação Experimental de Itajaí
A Associação dos Bananicultores de Santa Catarina pela bolsa concedida
A minha grande amiga e mãe Valquiria Merlo da Silva, pela dedicação, incentivo e
apoio em todos os momentos da minha vida. Por ser pai e mãe ao longo desses anos.
Ao meu Pai (in memorian) onde estiver... tenho certeza que torce por mim;
Ao meu esposo Wendell, que sempre me incentivou e me deu todo apoio para
continuar
A minha avó Olga que sempre rezou para que eu conseguisse chegar ate o fim
A todos meus familiares que me incentivaram no decorrer desses anos
Aos amigos Christiane Lazzaris e Henri Stuker, Susana Testoni, Izabel Krieger,
Gabriel Fernandes, Morgana Maciel, Aloisio Coelho pelo incentivo, amizade, apoio e carinho
Aos amigos e colegas, Luciane Malinowski, Camila Cordeiro, Maycon Nicoletti,
Gustavo, Eloi, Max, Gisele, Aline, Juliana, Dilnei, Val, Alexandre, Aurélio, Maria, Alécio
pela ajuda, amizade e companheirismo
A Todos de uma forma geral que contribuíram direta ou indiretamente para realização
deste trabalho.
iv
“Muitas vezes, as pessoas são egocêntricas, ilógicas e
insensatas.
Perdoe-lhes assim mesmo.
Se você é gentil, as pessoas podem acusá-lo de egoísta,
interesseiro.
Seja gentil assim mesmo.
Se você é um vencedor, terá alguns falsos amigos e alguns
inimigos verdadeiros.
Vença assim mesmo.
Se você é honesto e franco, as pessoas podem enganá-lo.
Seja honesto e franco assim mesmo.
O que você levou anos para construir, alguém pode destruir
de uma hora para outra.
Construa assim mesmo.
Se você tem paz e é feliz, as pessoas podem sentir inveja.
Seja feliz assim mesmo.
O bem que você faz hoje pode ser esquecido amanhã.
Faça o bem assim mesmo.
Dê ao mundo o melhor de você, mas isso pode nunca ser o
bastante.
Dê o melhor de você assim mesmo.
Veja você que, no final das contas, é entre você e Deus.
Nunca foi entre você e as outras pessoas”.
Madre Teresa de Calcutá
(1997)
v
Dedico
“A Deus, a minha mãe, pelo Dom da Vida”
vi
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ............................1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................2
2.1 A BANANICULTURA................................................2
2.2 A DOENÇA MAL-DO-PANAMÁ..............................3
2.3 SINTOMAS DA DOENÇA.........................................4
2.4 ETIOLOGIA DA DOENÇA........................................5
2.5 CONTROLE DA DOENÇA........................................7
2.6 VARIABILIDADE EM FUSARIUM OXYSPORUM
.....................................................................................8
2.7 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR
MARCADORES MOLECULARES...........................9
2.7.1 Variabilidade Genética Via RAPD (Polimorfismo de
DNA amplificado ao acaso)......................................10
2.7.2 - Variabilidade Genética Via SSR (sequência
simples repetida).......................................................11
2.8 ANÁLISES DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR
MEIO DE GRUPOS DE COMPATIBILIDADE
VEGETATIVA.........................................................12
3 OBJETIVOS .................................................................14
3.1 OBJETIVO GERAL...................................................14
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.....................................14
4 MATERIAIS E MÉTODOS.........................................15
4.1 AMOSTRAGEM........................................................15
4.2 ISOLAMENTO .........................................................15
4.2.1 Obtenção de culturas monospóricas .......................17
4.2.2 Conservação do patógeno .......................................18
4.3 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA.................18
4.4 - TESTE DE PATOGENICIDADE ..........................18
4.5 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR
MARCADORES MOLECULARES.........................20
4.5.1 Crescimento do fungo em meio líquido..................20
vii
4.5.2 Extração do DNA....................................................20
4.5.3 Amplificação do DNA RAPD.................................21
4.5.4 Amplificação do DNA por SSR (simple sequence
repeats)......................................................................23
4.6 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA
ATRAVÉS DOS GRUPOS DE
COMPATIBILIDADE VEGETATIVA...................24
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA.........................................26
5 RESULTADOS ............................................................27
5.1 TESTE DE PATOGENICIDADE .............................27
5.2 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS...............27
5.3 ANÁLISE VARIABILIDADE GENÉTICA ............29
5.3.1 Marcador Molecular RAPD....................................29
5.3.2 Marcador Molecular SSR........................................34
5.3.3 Compatibilidade Vegetativa....................................37
6 DISCUSSÃO ................................................................39
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................44
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Códigos de identificação e coordenadas
geográficas dos isolados de Fusarium oxysporum f.sp.
cubense coletados em municípios do Estado de Santa
Catarina.....................................................................16
Tabela 2 - Identificação dos iniciadores utilizados para
estudo RAPD seguido da sequência de nucleotídeos
...................................................................................21
Tabela 3 - Iniciadores utilizados para estudo SSR seguido
da sequência de nucleotídeos....................................23
Tabela 4 - Classificação dos isolados de FOC de acordo
com a cor e origem, avaliados no décimo quarto dia
de crescimento em meio de cultura BDA..................28
Tabela 5 - Iniciadores de RAPD selecionados neste estudo
e o número de fragmentos de DNA amplificados de
Fusarium oxysporum f. sp. cubense..........................29
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Etapas de obtenção dos isolados. A)
Identificação de plantas adultas de bananeira da
cultivar Enxerto com sintomas do mal-do-panamá. B)
Corte do pseudocaule próximo a inserção do rizoma.
C) Observação de necroses no rizoma de coloração
pardo avermelhado; sintomas típícos de fusariose. D)
Obtenção de colônia de Fusarium oxysporum f. sp.
cubense isolada em meio de cultura BDA...............17
Figura 2 - Etapas do Teste de patogenicidade. A) Remoção
de mudas dos tubetes. B) Corte das raízes a 5cm de
base. C) Inoculação dos patógenos. D) Transplante
das mudas para sacos plásticos com substrato. E)
Aclimatação das mudas em área de telado protegido.
...................................................................................19
Figura 3 - Fluxograma para determinação dos Grupos de
Compatibilidade Vegetativa: Etapas para obtenção
dos nit mutantes. B) Pareamento dos NitA e NitB de
todos os isolados (A,B,C,D)......................................25
Figura 4 - Avaliação do Teste de Patogenicidade: A)
Testemunha: Rizomas de bananeira da cultivar
Enxerto sem infecção do fungo no sistema vascular. B
e C) Rizomas de bananeira infectado por FOC com
sintomas característicos da doença (pontuações pardo-
avermelhadas e descoloração vascular no rizoma.....27
Figura 5 - Características morfológicas: Coloração das
Colônias de FOC cultivadas por 14 dias em meio de
cultura BDA a 26ºC e fotoperíodo 12h. Variação das
colônias em relação à cor, variando do branco ao
roxo............................................................................28
Figura 6 - Padrões de amplificações de RAPD, em gel de
agarose 1,5%, obtidos com o iniciador R1(A), OPAX
-10 (B), R3 (C) para isolados de FOC. M1: marcador
x
de peso molecular 100pb. M2: marcador de peso
molecular 1kb............................................................30
Figura 7 - Dendograma de similaridade genética dos 64
isolados de Fusarium oxysporum f.sp. cubense e dos
“out groups” Pg.(Pyricularia grisea ) e Fg.
(Fusarium graminianum), utilizando os iniciadores
RAPD R1 e OPF05..................................................32
Figura 8 - Dendograma de similaridade genética dos 64
isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense
utilizando iniciadores RAPD.....................................33
Figura 9 - Padrões de amplificação de SSR, em gel de
poliacrilamida 6%, obtidos com o iniciador MB02
para isolados de FOC coletados dos Municípios de
Corupá (CO) e Jaraguá do Sul (JS). M: marcador de
peso molecular 50pb. Os números assinalados
referem-se aos tamanhos dos fragmentos
amplificados. ............................................................35
Figura 10 - Dendograma de similaridade genética dos 66
isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense
utilizando os iniciadores SSR MB2 e MB11............36
Figura 11 - A) Obtenção de Nit mutantes em meio
mínimo com clorato de potássio. A seta indica a
formação de setores. B) Pareamento dos nit mutantes
dos quatro isolados de FOC selecionados para este
estudo em meio mínimo............................................38
xi
Análise da diversidade genética por marcadores RAPD e SSR em
Fusarium oxysporum f. sp. cubense no Estado de Santa Catarina
RESUMO
O Mal-do-Panamá causado por Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FOC) é
um dos principais problemas fitossanitários da bananicultura. Para esta
doença, o uso da resistência genética é o método de controle recomendável.
Porém, sua eficiência depende tanto de genes de resistência disponíveis
como da presença de patótipos do patógeno. Assim este estudo teve como
objetivo caracterizar a diversidade genética de isolados de FOC por meio de
descritores morfológicos e marcadores moleculares (RAPD, SSR). Para
tanto, foram avaliados 66 isolados coletados em regiões produtoras de Santa
Catarina. Os resultados de patogenicidade revelaram que 100% dos isolados
foram patogênicos à bananeira da cultivar Enxerto. Quanto às características
morfológicas dos isolados não se observou diferenças significativas com
relação à taxa de crescimento das colônias, que variaram de 4,4 a 6,6
mm.dia
-1
. A coloração das colônias sobre meio de cultura BDA variou de
branco, salmão e roxo. Os resultados utilizando marcadores moleculares
RAPD apresentaram uma variabilidade considerável entre os isolados de
FOC, com estimativas de similaridade que variaram de 35 a 98%. Baseado
nos 10 marcadores selecionados de RAPD, os 66 isolados foram agrupados
em cinco grupos distintos, sendo que o número de indivíduos provenientes
das regiões norte e sul do Estado foi igualmente distribuído no primeiro
grupo, onde 58 indivíduos foram agrupados. Nos outros quatro grupos
formados teve-se somente isolados provenientes do norte do Estado, os
quais apresentaram uma maior distância genética quando comparados ao
grupo um. A técnica de marcador molecular SSR separou os isolados em
três grupos distintos. O primeiro grupo foi constituído de 59 indivíduos
provenientes dos diversos municípios onde as coletas foram feitas. O
segundo grupo, composto por dois isolados (CO16, JS23), caracterizou-se
por apresentar alelo nulo para o marcador MB11. Já o terceiro grupo,
formado por quatro isolados (JS26, SI53, SI54, SI55, SI56), apresentou um
alelo extra no marcador MB02. No estudo de compatibilidade vegetativa
não foi possível observar o pareamento entre os quatro isolados testados não
havendo, portanto compatibilidade vegetativa entre os mesmos. Não houve
associação dos agrupamentos RAPD e SSR com origens geográficas e
características morfológicas da colônia de FOC, visto que os isolados foram
distribuídos indistintamente nos grupos.
xii
Analysis of the genetic diversity by RAPD and SSR markers in Fusari-
um oxysporum f. sp. cubense in the State of Santa Catarina
ABSTRACT
Panama disease caused by Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FOC) is one
of the main constraints in banana production. For this disease, the use of ge-
netic resistance has been usually recommended as efficient control method.
However, its efficiency depends on available genes for resistance or pres-
ence of pathogen pathotypes. This study aimed to characterize the genetic
diversity of isolates of FOC by means of morphological descriptors and mo-
lecular markers. For this purpose, 66 isolates were collected in the produ-
cing regions of Santa Catarina state. The pathogenicity of the FOC-isolates
revealed that 100% of them were pathogenic to banana cv. Enxerto. In re-
gard to morphological characteristics, there was no significant difference
among growth rates ranging from 4.4 to 6.6 mm day-1 as well as and color
of colonies on culture medium that were white, salmon or purple. The mo-
lecular markers showed considerable variability among FOC-isolates with
similarity estimates varying between 98 and 35%. Based on 10 RAPD
markers, 66 isolates were grouped into five distinct groups. In the first
group, 58 individuals were grouped with the same number of individuals
from north and south regions. The further four groups were composed only
by isolates from the northern state and showed a higher genetic distance
compared to the first group. SSR analysis separated individuals into three
distinct groups showing low variability among them. The first group con-
sisted of 59 individuals from the various municipalities where the collec-
tions were made. The second group composed of two isolates (CO16, JS23)
was characterized by presenting null allele for the marker MB11. The third
group comprising four strains (JS26, SI53, SI54, SI55, SI56) was character-
ized by presenting an extra marker allele MB02. In the study of vegetative
compatibility was not possible to observe the compatibility among the four
isolates tested. There was no association among groups with RAPD-, -SSR
markers, geographic origins and morphological characteristics of isolates
collected from the different municipalities, since they were indistinctly-
grouped.
xiii
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
Dentre as frutíferas tropicais cultivada a bananeira (Musa spp.) se
destaca apresentando o segundo maior volume de produção e o primeiro
em consumo mundial. Devido ao seu alto valor nutritivo e por estar
disponível durante todo o ano, é uma fruta de suma importância. A
bananicultura é uma das atividades agrícolas de grande importância
social e na geração de empregos. Estima-se que em Santa Catarina esta
atividade seja explorada por, aproximadamente, 25 mil produtores
rurais, sendo que parte destes tem na bananicultura sua principal fonte
de renda. Na posição de terceiro maior produtor de bananas do Brasil, o
Estado tem uma área cultivada de aproximadamente 31 mil hectares e
uma produção anual de 683 mil toneladas. (SÍNTESE ANUAL DA
AGRICULTURA, 2007/2008).
Entre os principais problemas fitossanitários da bananeira,
destaca-se o mal-do-panamá, causado pelo fungo Fusarium oxysporum
f. sp. cubense, que ocorre, principalmente, nos bananais da cultivar Prata
e ultimamente vem atacando cultivares do grupo Cavendish. A doença
causa a morte de plantas e dificulta, e até mesmo impede, a implantação
de novos plantios, pois o fungo pode sobreviver no solo durante muitos
anos (CORDEIRO & MATOS, 2005). Devido às peculiaridades dessa
doença, o uso de fungicidas é pouco eficiente no controle. Assim, tem
sido preconizado o uso de cultivares resistentes como a forma de
controle mais eficiente. Porém, sua eficiência depende tanto dos genes
de resistência disponíveis como da presença de patótipos do patógeno.
Um dos maiores obstáculos para a manutenção da resistência da
bananeira reside na variabilidade dos patógenos. Portanto, é importante
e fundamental conhecer as raças e/ou patótipos predominantes em um
determinado local e sua epidemiologia, para facilitar os programas de
melhoramento. Neste sentido, técnicas de biologia molecular têm sido
apresentadas para diagnosticar e estudar os patógenos, e têm contribuído
para conhecer a sua diversidade.
Os tipos distintos de marcadores moleculares hoje disponíveis
diferenciam-se pela tecnologia utilizada para revelar a variabilidade em
nível de DNA, e assim variam quanto à habilidade de detectar
diferenças entre indivíduos, custo, facilidade de uso, consistência e
repetibilidade (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996).
O objetivo deste trabalho foi estudar a variabilidade genética de
cepas do fungo Fusarium oxysporum f. sp. cubense, isoladas de
bananeiras cv. Enxerto provenientes de diferentes municípios de Santa
1
Catarina.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A BANANICULTURA
A bananeira (Musa spp.) pertence à família botânica Musaceae e
é originaria da região sudoeste da Ásia. A planta se caracteriza por
apresentar caule suculento e subterrâneo (rizoma), cujo "falso" tronco é
formado pelas bases superpostas das folhas, folhas grandes e flores em
cachos que surgem em série à partir do chamado "coração" da
bananeira. É uma planta tipicamente tropical, exige calor constante,
precipitações bem distribuídas e elevada umidade para o seu bom
desenvolvimento e produção. Sua altura pode variar de 1,8m a 8,0m.
Dada a característica de emitir sempre novos rebentos, o bananal é
permanente na área, porém com as plantas se renovando ciclicamente. A
banana é a fruta mais consumida no mundo e no Brasil, sendo um
alimento energético, rico em carboidratos, sais minerais, como sódio,
magnésio, fósforo e, especialmente, potássio. Apresenta predominância
de vitamina A e C, contendo também as vitaminas B1, B2 e B6, contém
pouca proteína e gordura (CROUCH, 1999).
Dentre as frutíferas tropicais explorada em todo o mundo, ela se
destaca apresentando o segundo maior volume de produção e o primeiro
em consumo. Sua produção tornou-se uma atividade principalmente de
subsistência, sendo que maioria dos produtores a produz para consumo
próprio e para venda em mercado locais. Devido ao seu alto valor
nutritivo e por estar disponível durante todo o ano, é uma fruta de suma
importância para qualquer sistema sustentado. Ela constitui o quarto
produto alimentar mais consumido no mundo, precedido pelo arroz,
trigo e milho (SÍNTESE ANUAL DA AGRICULTURA, 2007/2008).
Nos anos mais recentes, a banana tem apresentado um aumento
significativo no volume produzido, com 81,0 milhões de toneladas, é
superada apenas pela melancia 97,5 milhões de toneladas, seguida da
uva com 66,2 milhões de toneladas, maça com 62,2 milhões de
toneladas e laranja com 61,2 milhões de toneladas. O consumo mundial
de banana é de aproximadamente 9,1kg/habitante/ano, e, segundo a
FAO, cresce a cada ano, graças ao empenho do setor produtivo na
qualificação da produção e do setor mercadológico nos aspectos que
envolvem a apresentação do produto e a divulgação dos benefícios para
quem o consome.
2
Santa Catarina é o terceiro maior produtor de bananas do Brasil; a
bananicultura ocupa a maior área cultivada de fruteiras do Estado, com
31.076 hectares e uma produção anual de 683.156 toneladas (SÍNTESE
ANUAL DA AGRICULTURA, 2007/2008). A produtividade média dos
pomares catarinense tem sido sempre crescente, fazendo com que o
Estado continue sendo referência nacional nessa cultura. No Estado, a
exploração da cultura se caracteriza pela utilização do tipo Caturra
(também conhecida como banana d’água). Na Região Norte Catarinense
a um cultivo predominante das cultivares Nanica e Nanicão, enquanto
que na região Sul, as cultivares mais usadas são Enxerto e a Branca,
componentes do tipo Prata. São mais de oitenta municípios que
exploram a cultura da banana no Estado. Entretanto, quinze deles
respondem por cerca 90% da produção catarinense. Desses apenas dois
Corupá com 22,6% e Luis Alves com 17,3% perfazem juntos 40% do
volume total estadual.
2.2 A DOENÇA MAL-DO-PANAMÁ
O mal-do-panamá é uma doença endêmica em todas as regiões
produtoras de banana do mundo, sendo citada como uma das seis mais
importantes doenças de plantas cultivadas e responsável por perdas
econômicas na ordem de bilhões de dólares (PLOETZ, 2006)
A primeira constatação da doença foi em 1876, na Austrália,
seguindo-se relatos de ocorrência da doença no Panamá e na Costa Rica
em 1890. Posteriormente, foi disseminada, para todos os países da
América Central e do Sul (STOVER, 1972; WARDLAW, 1972).
Existem duas hipóteses em relação à origem do fungo. A primeira
é que o fungo teria surgido na Ásia e se dispersado para a África e
Américas através do transporte de rizomas e/ou plantas infectadas. Em
outra hipótese o fungo teria se originado em várias regiões e que co-
evoluíram independentemente. BENTLEY et al. (1998) sugerem que
estas duas hipóteses podem ocorrer pela formação de grupos com
isolamento genético e distribuição geográfica limitada bem como,
grupos que coevoluiram independentemente dentro e fora do centro de
origem do hospedeiro. A ocorrência mundial do fungo, por enquanto,
está localizada de 30° N a 30º S, não havendo ainda registros nas Ilhas
do Pacífico Sul, Somália e Mediterrâneo (PEREZ & VICENTE, 2004;
PLOETZ, 2006).
Sua primeira constatação no Brasil foi em 1930, no município de
Piracicaba, São Paulo, na cultivar Maçã. Em apenas 3-4 anos foram
3
dizimados cerca de um milhão de plantas de banana naquele município
paulista (GOES & MORETO, 2001).
2.3 SINTOMAS DA DOENÇA
A infecção inicia-se pelas radicelas, atingindo o sistema vascular
da bananeira, num processo sistêmico. As radicelas e extremidades das
raízes são os sítios iniciais de infecção. Nos genótipos resistentes, a
infecção é paralisada devido à formação de géis e tiloses nos vasos do
xilema, enquanto nas cultivares suscetíveis, a colonização dos vasos
continua, estendendo-se aos tecidos parenquimatosos anexos. Em
estádios mais avançados da doença, ocorre a colonização do tecido
parenquimatoso adjacente, com a produção de elevada quantidade de
conídios e clamidósporos (STOVER, 1972)
Os sintomas exibidos pelas plantas atacadas iniciam-se de 2 a 5
meses após a infecção e podem ser observados interna ou externamente
no corte do rizoma e do pseudocaule (CODEIRO et al., 2005).
De acordo com VENTURA & HINZ (2002), externamente
observa-se um amarelecimento progressivo, das folhas mais velhas para
as folhas mais novas, começando pelos bordos do limbo em direção à
nervura principal. Progressivamente ao amarelecimento, ocorre murcha,
com posterior quebra do pecíolo junto ao pseudocaule, que dá à planta o
aspecto típico de um guarda-chuva fechado. Além disto, pode ser
observado estreitamento do limbo nas folhas mais novas, engrossamento
das nervuras secundárias da folha e, ocasionalmente, necrose do
cartucho. Um sintoma bastante típico e freqüentemente encontrado é a
rachadura do pseudo-caule, próximo ao solo, cujo tamanho varia com a
área afetada no rizoma. Os sintomas são mais comuns em plantas
adultas, mas podem ser encontrados também em plantas jovens. Como
sintomas internos observam-se pontuações pardo-avermelhadas e
descoloração vascular ao se realizarem cortes transversais ou
longitudinais no pseudocaule ou rizoma. As pontuações pardo-
avermelhadas provavelmente surgem em função da oxidação de fenol
quando na presença do patógeno. A descoloração vascular no
pseudocaule concentra-se mais perifericamente, mantendo-se o centro
claro. No rizoma, a descoloração é mais pronunciada na área de densa
vascularização, onde o estelo se junta ao córtex, podendo-se observar a
evolução dos sintomas do rizoma para as brotações a ele aderidas
4
(VENTURA & HINZ (2002); CORDEIRO et al., 2005). O
desenvolvimento do mal-do-panamá em banana está relacionado com a
interação patógeno e genótipo da planta e parece ser fortemente
influenciado pelas condições ambientais (GROENEWALD et al., 2006).
2.4 ETIOLOGIA DA DOENÇA
O agente etiológico do mal-do-panamá é o fungo Fusarium
oxysporum f. sp. cubense, não se conhecendo seu estádio sexuado. De
um modo geral, as formas speciales de Fusarium oxysporum não podem
ser distinguidas morfologicamente. Devido a plasticidade e variações de
características fenotípicas encontradas neste fungo, a taxonomia baseada
somente em conceitos morfológicos não é confiável (SUMMERELL &
LESLIE, 2003). As colônias crescem 4 a 7mm.dia
-1
sobre agar batata
dextrose a 24ºC, com abundante micélio aéreo, com coloração que vai
do branco ao violeta (PLOETZ, 2006). As duas principais formas de
esporos de Fusarium são os microconídios e os macroconídios. Os
microconídios são unicelulares ovais a reniformes e hialinos e
uninucleados; os macroconídios mais comuns sendo fusiformes,
falcados multicelulares, mas cada célula tem somente um núcleo. Todos
os núcleos de um macroconídio, contudo, são descendentes mitóticos de
um mesmo núcleo progenitor e são, portanto, geneticamente idênticos
(PUHALLA, 1981).
Inúmeros fatores, incluindo a perda da clara distinção das
espécies através de características morfológicas, levam a conceitos que
são amplos e juntamente com a variação e mutação dentro da cultura,
tem conspirado para criar um sistema taxonômico que não reflete a
diversidade das espécies. Isto tem gerado resultados controversos na
aplicação de nomes de espécies para isolados patogênicos e toxigênicos
(GEISER et al., 2004). Devido à plasticidade e variações de
características fenotípicas encontradas neste fungo, a taxonomia baseada
somente em conceitos morfológicos não é confiável (SUMMERELL &
LESLIE, 2003). O gênero ainda apresenta uma série de variações de
características morfológicas e patogênicas, resultando em uma
classificação complexa dividida em seções, formae speciales e raças
(OLIVEIRA & COSTA, 2002). O conceito formae speciales foi
aplicado por SNYDER & HANSEN (1953) para reconhecer isolados
patogênicos que foram morfologicamente semelhantes a isolados
saprofíticos de mesma espécie, mas que diferenciam em sua habilidade
5
para parasitar hospedeiros específicos. Isolados patogênicos de
Fusarium oxysporum estão classificados dentro de mais de 120 formas
speciales e raças.
São conhecidas quatro raças fisiológicas do patógeno, sendo que
as raças 1, 2 e 4 são importantes à bananeira. A raça 3 ocorre apenas em
Heliconia sp. (JONES, 1999). No Brasil, de acordo com a estrutura dos
grupos de compatibilidade vegetativa dos isolados de Fusarium
oxysporum f. sp. cubense analisados, presume-se a prevalência da raça 1
(GOES & MORETTO, 2001). A forma mais simples de diferenciação
das raças seria mediante o uso de variedades indicadoras, onde a
variedade Gros Michel é indicadora da raça 1, a Bluggoe, indicadora da
raça 2 e as variedades do subgrupo Cavendish (Nanica, Nanicão e
Grande Naine) são indicadoras da raça 4 (CORDEIRO et al., 2005).
Recentemente foi reportada a ocorrência de um novo biótipo da
Raça 4, a Raça Tropical 4 ou TR4, que está devastando plantações
comerciais de banana em Taiwan, Malásia, Sumatra, Sulawesi,
Filipinas, Vietnam, China e Austrália. A disseminação da TR4 para os
países produtores de banana dos continentes africano e americano
representa uma séria ameaça para a bananicultura mundial, pois além do
subgrupo Cavendish, afeta as cultivares que geram 80% da produção
mundial de bananas (PLOETZ, 2009).
Baseado no fato de existirem no solo linhagens não patogênicas
de F. oxysporum, morfologicamente idênticas a F. oxysporum f. sp.
cubense, é possível que a sobrevivência ocorra também em estado
saprofítico. Esta hipótese pode ser reforçada pelo fato de que linhagens
não patogênicas são capazes de formar heterocários com linhagens
patogênicas. Assim, os núcleos da forma patogênica persistem no
micélio de crescimento saprofítico, voltando a atuar quando em
presença da planta hospedeira (CORDEIRO & MATOS, 2000).
A disseminação do patógeno pode ocorrer de diversas formas. Os
rizomas, raízes e pseudocaule de plantas doentes liberam grande
quantidade de inóculo na superfície do solo e a transmissão do patógeno
depende do contato de raízes de plantas sadias com este inóculo. Outras
formas freqüentes de disseminação são a água de irrigação, de drenagem
e de inundação, animais, homem, equipamentos, ferramentas e material
de plantio infectado (VENTURA & HINZ, 2002). No Brasil, a
disseminação via mudas infectadas assume grande importância, uma vez
que são utilizadas em novos plantios. São do tipo convencional, sem os
devidos cuidados na seleção do bananal fornecedor. Gradativamente,
tem havido o crescimento no uso de mudas micropropagadas que
6
elimina essa via de disseminação (CORDEIRO et al., 2005). A
disseminação da doença para novas áreas está estritamente relacionada
com a introdução de material propagativo suscetível (STOVER, 1972).
2.5 CONTROLE DA DOENÇA
A busca de variedades resistentes é hoje uma das principais linhas
de ação visando no controle do mal do panamá. De acordo com ALVEZ
(1985), é possível a utilização de novas variedades no melhoramento
genético da bananeira, visando à obtenção de híbridos tetraplóides, não
só com relação à resistência à doença, mas também com boas
características agronômicas, principalmente com nível de nanismo
desejável.
A dificuldade em controlar a fusariose, assim como outras
doenças fúngicas, tem estimulado as pesquisas com controle biológico
em diferentes culturas (HINZ, 1991, CAVAGLIERI et al., 2004;
GARMENDIA et al., 2004; SILVA & BETTIOL, 2005). Os fungos
micorrízicos arbusculares (FMA), importantes componentes da
microbiota do solo, formam associações simbióticas estáveis com as
plantas e podem beneficiá-las de diferentes formas, sendo uma delas a
bioproteção contra fungos patogênicos como Fusarium e Phytophthora.
Este efeito pode ocorrer por meio dos seguintes fatores: melhor nutrição
da planta hospedeira; competição por fotossintatos do hospedeiro;
competição por infecção/competição local; mudanças morfológicas no
sistema radicular; mudanças microbianas na população rizosférica e
indução a mecanismos de defesa da planta (AZCÓN-AGUILAR &
BAREA, 1996; SMITH et al., 1999). Os efeitos protetores da
inoculação de FMA podem ser sistêmicos ou localizados
(LINDERMAN, 1994). A associação micorrízica ocorre naturalmente
em plantios de bananeira (YANO-MELO et al., 1997) e beneficia as
plantas sob diferentes condições (TRINDADE et al., 2003), nas quais a
interação entre FMA e FOC pode ocorrer, representando um potencial a
ser explorado no biocontrole do mal-do-panamá. Vários fatores
necessitam ser estudados nessa interação para permitir sua manipulação.
As mudas micropropagadas no sistema atual podem ir a campo com
diversos porcentuais de colonização micorrízica, eventualmente até sem
a presença do fungo. O estabelecimento do FMA antes do ataque do
patógeno pode induzir aumento da resistência da planta. A efetividade
do potencial de um agente de controle biológico depende da virulência e
do potencial de inóculo dos patógenos no solo (AZCON-AGUILAR &
7
BAREA, 1996). Uma alta densidade de inóculo de patógeno na rizosfera
pode inviabilizar qualquer forma de biocontrole. Assim, o conhecimento
do fator potencial de inóculo de cada microrganismo é importante para a
manipulação correta do sistema. O único controle efetivo para o mal-do-
panamá é o plantio de clones e cultivares tolerantes a essa enfermidade
(CORDEIRO & KIMATI, 1997). Porém, a introdução de fungos
micorrízicos pré-selecionados pode contribuir num programa de
controle integrado da doença.
Os métodos mais utilizados no controle de Fusarium oxysporum
incluem: a utilização de cultivares resistentes, desinfestação do solo com
fungicida químico, e rotação de cultura utilizando plantas não
hospedeiras (AGRIOS, 1988). A utilização de cultivares resistentes seria
uma alternativa, porém dificuldades como a identificação de genes de
resistência ou a habilidade de adaptação dos patógenos e novos
genótipos podem tornar a resistência uma solução temporária
(SUTTON, 2000).
O controle biológico de doenças causadas por fungos de solos
tem sido investigado e, em banana, a utilização de microrganismos
antagonistas constitui-se em uma alternativa promissora para reduzir as
populações destes fitopatógenos no solo (AMORIM et al., 2002). O
controle biológico, considerado como natural, constitui uma estratégia
de grande interesse e importância para viabilizar a redução ou
substituição do uso de pesticidas. Ele pode ser obtido pela manipulação
do ambiente, de forma a favorecer a população dos microrganismos
benéficos presentes, ou pela introdução massal de antagonistas
previamente selecionados. Espécies do gênero Trichoderma/Hypocrea
encontram-se entre os agentes de biocontrole de doenças mais estudados
no mundo, pois não são patogênicos; estão presentes em praticamente
todos os tipos de solos, quando há matéria orgânica; são facilmente
isolados, cultivados e multiplicados; e colonizam com eficiência o
sistema radicular de diversas plantas (BENITEZ et al., 2004).
2.6 VARIABILIDADE EM FUSARIUM OXYSPORUM
O conhecimento da diversidade genética da população do
patógeno é um importante elemento para os programas de
melhoramento genético de plantas que visam resistência às doenças,
pois gera informação sobre o nível e distribuição da variabilidade
genética dos isolados existentes em uma população ou região.
Populações de fungos com alto nível de diversidade genética são difíceis
8
de controlar, uma vez que podem adaptar-se mais rapidamente a
qualquer medida de controle, seja química ou através da introdução de
hospedeiro resistente (CARLIER et al., 2003). Outros fatores, tais como
a natureza de dispersão do patógeno e a seleção imposta pelo hospedeiro
resistente, também podem influenciar a variabilidade genética
encontrada na população dos patógenos.
A resistência à doença vai depender diretamente dos mecanismos
envolvidos no processo de defesa da planta e também da variabilidade
do patógeno. Esta variabilidade torna-se uma característica importante a
ser levada em consideração nos estudos de resistência, uma vez que
alguns patógenos possuem uma grande capacidade de variação através
de recombinações de genes dentro de uma população proporcionando
uma vantagem dos mesmos contra o hospedeiro (LUCAS, 1998).
A agressividade do patógeno também é bastante utilizada na
caracterização da diversidade de Fusarium oxysporum. Este método
deve servir como mais uma alternativa, uma vez que a mesma também
pode ser influenciada por variáveis como temperatura, idade do
hospedeiro e até o método de inoculação empregado (KRAFT &
HAGLUND, 1978). Um dos trabalhos que constataram variação na
agressividade de isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense foi
realizado por WAITE (1977) que verificou, após inoculação de doze
isolados das raças 1 e 2 nas cultivares de banana ‘Gros Michel’ e
‘Bluggoe’, um espectro da severidade da doença variando de leve a
severo.
2.7 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR
MARCADORES MOLECULARES
Marcadores genéticos baseados em polimorfismo do DNA têm
sido utilizados com sucesso na diferenciação de espécies de vários
fitopatógenos e entre as vantagens apresentadas com o uso, destacam-se
a rapidez e precisão na detecção, a confiabilidade e o fato de não serem
influenciados pelas condições ambientais (FALEIRO et al., 2003). A
sua utilização tem aumentado a cada ano, exercendo papel de ferramenta
complementar para o estudo da diversidade em virulência e
possibilitando o conhecimento dos outros aspectos da diversidade
genética dos fitopatógenos (DUTECH et al., 2007).
Nas últimas décadas, várias metodologias moleculares têm sido
desenvolvidas, contribuindo significativamente para um grande avanço
do conhecimento sobre a variabilidade genética de microorganismos. A
9
técnica molecular da reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido
apresentada como uma ferramenta robusta para diagnosticar e detectar
fungos fitopatogênicos e tem contribuído grandemente para o manejo de
doenças de plantas. Dentre as técnicas mais utilizadas destacam-se:
RAPD (Polimorfismo de fragmentos amplificados ao acaso), AFLP
(Polimorfismos do comprimento de fragmentos amplificados) e
Microssatélites (BELABID et al., 2004; ZAMANI et al., 2004;
GROENEWALD et al., 2006; DUTECH et al., 2007).
Marcadores “inter simple sequence repeat” (ISSR) é outra técnica
que vem sendo utilizada, em substituição aos outros métodos,
apresentando vantagem de ser mais eficiente, oferecer um menor custo e
determinar um alto grau de polimorfismo, além de ter alta
reprodutibilidade. Esta técnica tem sido bastante aplicada em estudos de
genética de populações e biologia evolucionária de muitos organismos,
incluindo as espécies fúngicas (MISHRA et al., 2004; BALMAS et al.,
2005).
Medidas de diversidade em fungos com reprodução assexuada
são complicadas e requerem a combinação de ferramentas que avaliem o
fenótipo e o genótipo. Estudos prévios conduzidos em diversas partes do
mundo estudando FOC incluem métodos de PCR como RAPD, DNA
amplificação fingerprinting (DAF) e seqüenciamento de DNA. Embora
estas técnicas apresentem bons resultados de diversidade genética de
FOC, elas nem sempre concordam em termos de parentesco genético
entre linhagens clones destes patógenos que se reproduzem
assexuadamente (GROENEWALD et al., 2006).
2.7.1 Variabilidade Genética Via RAPD (Polimorfismo de DNA
amplificado ao acaso)
A técnica de RAPD é baseada no princípio da PCR (Reação em
Cadeia da Polimerase), escrita por WILLIANS et al. (1990) e WELSH
& MCCLELLEND (1990). Esta técnica envolve a amplificação de
regiões anônimas dispersas pelo genoma, cuja estratégia é a utilização
de iniciadores ou primers curtos e aleatórios que se anelam a diferentes
locais no DNA genômico (FUNGARO, 2000). Os marcadores de RAPD
permitem gerar uma grande quantidade de informações sobre a
diversidade genética. Em geral, os dados são obtidos na forma de matriz
composta por um certo número de genótipos que podem ser variedades,
isolados ou clones, genotipados para dezenas ou centenas de
marcadores RAPD, obtidos com um ou mais primers. O número de
10
marcadores permite uma análise extensiva dos genomas de interesse
diretamente da molécula de DNA, conseqüentemente sem influência do
ambiente (FERREIRA & GRATTAPLAGLIA, 1996).
Esta técnica apresenta a vantagem de ser rápida e de baixo custo,
permitindo uma alta densidade de mapeamento, abrangendo todo o
genoma, sem envolver hibridização ou radioatividade. Além disso, não
há necessidade do conhecimento prévio das seqüências de nucleotídeos
que flanqueiam a região de DNA de interesse para a construção de
iniciadores para a amplificação (MICHELMORE et al., 1991).
Desde a sua descrição o uso de marcadores RAPD tem tido uma
difusão extremamente rápida, sendo utilizado para estudos de
identificação taxonômica (LIU et al., 1995; GUZMAN et al., 1999),
caracterização de raças (BELABID et al., 2004), e também para
diferentes estudos da diversidade genética de fungos
(VAKALOUNAKIS & FRAGKIADAKIS, 1999; MOSTAFA et al.,
2002).
2.7.2 - Variabilidade Genética Via SSR (sequência simples repetida)
Os microssatélites, também chamados de SSR, são regiões do
genoma que possuem repetições em cadeia de mono, di, tri, tetra, penta
ou hexanucleotídeos, que se repetem várias vezes no DNA. As
seqüências de DNA que flanqueiam os microssatélites são geralmente
conservadas entre os indivíduos de uma mesma espécie, ou até mesmo
entre espécies relacionadas. A região genômica que corresponde às
seqüências repetitivas são amplificadas, via PCR (KARAOGLU et al.,
2005). A amplificação é feita utilizando iniciadores específicos de 20-
30 bases, complementares às sequências que flanqueiam uma
determinada sequência repetitiva. Os segmentos amplificados a partir
destes sítios de anelamento de iniciadores apresentam um elevado
polimorfismo, produto da presença de diferenças no número de
elementos repetidos. Desta forma, cada sequência repetitiva,
independentemente do elemento repetitivo (CA, GC, TG, ATC),
constitui-se num locus gênico altamente variável, multialélico e de
grande conteúdo informativo em relação a uma espécie. Cada segmento
amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do
mesmo lócus dentro da população (DUTECH et al., 2007).
Os SSR são muito mais freqüentes e distribuídos ao acaso,
permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma eucarioto.
Estas e outras características fazem com que marcadores baseados em
11
SSR sejam marcadores ideais para mapeamento genético e físico de
genomas, para a identificação e discriminação de genótipos, e para
estudos de genética de populações (FERREIRA & GRATTAPLAGLIA,
1996). As seqüências das regiões que flanqueiam os SSRs são
conservadas em indivíduos da mesma espécie. Dessa maneira, os SSRs
são amplamente distribuídos em todo genoma de eucariotos e podem ser
amplificados por oligos específicos sintetizados a partir destas regiões
flanqueadoras (DUTECH et al., 2007).
É crescente a popularidade de SSR em vista do número de artigos
publicados sobre o isolamento de locos microssatélites em vários
organismos. Embora eles representem uma poderosa ferramenta em
muitos campos da Biologia, microssatélites têm sido isolados em poucas
espécies de fungos. Microssatélites em fungos parecem ser mais difíceis
de isolar e exibem menor polimorfismo do que em outros organismos
(DUTECH et al., 2007). Microssatélites têm sido isolados com
freqüência de diversos organismos, mas poucos trabalhos têm sido
apresentados com fungos (ZANE et al., 2002). BOGALE et al. (2005)
descreveram nove marcadores de SSR desenvolvidos para o estudo de
Fusarium oxysporum.
O maior problema de loci microssatélites é que eles
frequentemente necessitam ser isolados de novo em função de cada
espécie e isto representa maior custo. A amplificação de loci
provenientes de outras espécies, das quais eles foram clonados, é
geralmente possível somente entre espécies do mesmo gênero e em
alguns casos a percentagem de amplificação é baixa, gerando alelos
nulos que podem influenciar na análise genética (DUTECH et al.,
2007).
2.8 ANÁLISES DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR MEIO DE
GRUPOS DE COMPATIBILIDADE VEGETATIVA
Uma técnica bastante utilizada na caracterização de isolados de
F. oxysporum é o estudo de grupamento por compatibilidade vegetativa
(VCG), um método eficiente no estudo de relacionamento entre fungos
assexuais, como no caso de FOC. Foi primeiramente desenvolvido por
PUHALLA (1985) com o objetivo de distinguir por características
genéticas, e não morfológicas ou de patogenicidade, as raças de F.
oxysporum. Em genética, os testes de compatibilidade vegetativa têm
sido úteis para a caracterização da diversidade entre isolados, podendo
diferenciar populações patogênicas e não-patogênicas (ROSALEE et al.,
12
1999). Consistem no pareamento de mutantes incapazes de utilizarem
nitrato como fonte de nitrogênio e a formação do heterocárion.
A fusão de hifas de dois mutantes indica que os isolados
pertencem a um mesmo grupo de compatibilidade. Cerca de vinte e um
VCGs já foram determinados para FOC e são bastante utilizados em
estudos de caracterização genética, são os VCGs 0120, 0121, 0122,
0123, 0124, 0125, 0126, 0127, 0128, 0129, 01210, 01211, 01212,
01213, 01214, 01215, 01216, 01217, 01218, 01219 e 01220.
(PUHALLA, 1985). Alguns destes VCGs encontram-se exclusivamente
em determinados países ou regiões, como no caso do VCG 01210
presente somente na Flórida e Cuba, o VCG 01220 no oeste Australiano
e o VCG 01214 encontrado somente no Malawi (PÉREZ-VICENTE,
2004). Estudos detalhados indicam que isolados de um mesmo grupo de
compatibilidade vegetativa tipicamente possuem multilocus muito
similares ou até idênticos e possivelmente pertencem a uma mesma
linhagem clonal. Por essa razão os VCGs são bons indicadores de
similaridade (KISTLER et al., 1998). BENTLEY et al. (1998)
analisaram 208 isolados pertencentes diferentes regiões e puderam
verificar a ocorrência de 100% de similaridade entre os isolados de
FOC pertencentes a um mesmo VCG. JONES (1995) verificou através
de VCGs que isolados da raça 1 e 2 ocorrem em países asiáticos e que
os da raça 4 concentram-se no sudoeste Asiático e no triângulo Malásia
– Indonésia – Filipinas, onde pôde constatar uma maior diversidade na
Malásia e Indonésia devido a ocorrência do grande número de VCGs.
A ocorrência de determinadas raças também pode estar
relacionada a VCGs. PLOETZ & CORRELL (1988), analisaram
isolados oriundos da Austrália, Ilhas Canárias, Honduras, Jamaica,
Malásia, Filipinas, África do Sul, EUA e Taiwan e constataram onze
VCGs, dos quais seis foram compostos por isolados de uma única raça e
cinco grupos possuíam isolados pertencentes a duas raças.
13
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Estudar a diversidade genética dos isolados de Fusarium
oxysporum f. sp. cubense provenientes de municípios produtores de
banana do Estado de Santa Catarina, através de descritores morfológicos
e marcadores moleculares RAPD e SSR.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar morfologicamente as colônias de isolados de
Fusarium oxysporum f. sp. cubense;
- Analisar a variabilidade genética de isolados através do uso do
marcador molecular RAPD;
- Analisar a variabilidade genética de isolados através do uso do
marcador molecular SSR;
- Verificar a Compatibilidade Vegetativa de quatro isolados de
Fusarium oxysporum f. sp. cubense;
- Identificar o grau de similaridade entre os isolados coletados
no Estado.
14
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Os trabalhos foram conduzidos no período de janeiro de 2008 a
agosto de 2009 nos Laboratórios de Fitopatologia e de Biologia
Molecular da Estação Experimental de Itajaí - Empresa de Pesquisa
Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina (EPAGRI).
4.1 AMOSTRAGEM
Foram coletadas 66 amostras de rizoma de bananeira
provenientes, da cultivar Enxerto, com sintomas do mal-do-panamá em
9 municípios catarinenses (Jacinto Machado, Santa Rosa do Sul,
Siderópolis, situados no Sul do Estado e Corupá, Jaraguá do Sul, Luís
Alves, Massaranduba, São João do Itaperiú, Schroeder, no norte do
Estado). A localização exata da coleta foi registrada utilizando um
aparelho GPS, modelo Garmim. Os isolados utilizados no experimento
estão listados de acordo com seu local de origem na Tabela 1.
As amostras foram retiradas de plantas adultas, antes da floração
e com, no mínimo, duas folhas sadias. Para tanto, o pseudocaule foi
cortado com um facão próximo à inserção no rizoma, retirando-se em
seguida aproximadamente 300g da área sintomática sem encharcamento.
Os fragmentos de rizomas apresentando os sintomas típicos da doença
foram transportados em sacos de papel ao laboratório, onde foram
mantidos à sombra na condição do ambiente por 24 horas até o
isolamento do patógeno (Figura 1).
4.2 ISOLAMENTO
Após a eliminação da sua camada externa, os fragmentos do
rizoma foram imersos em hipoclorito de sódio (1%) durante 10 minutos.
Na câmara de fluxo laminar, com auxílio de um bisturi esterilizado,
removeu-se outra camada externa do fragmento de rizoma e, em
seguida, fragmentos infectados foram transferidos para placas de Petri
contendo meio de cultura BDA (batata, dextrose, Agar). Na preparação
deste meio utilizou-se 39g de BDA (Merck) para 1 litro de água
destilada. As culturas foram incubadas por sete dias a 25 ºC sob luz
contínua (Figura 1).
15
Tabela 1 - Códigos de identificação e coordenadas geográficas dos
isolados de Fusarium oxysporum f.sp. cubense coletados em municípios
do Estado de Santa Catarina.
CI COORDENADAS CI COORDENADAS
LA01 26º39'42,4"S/48º 50'26''O MA34 26º57'48,0"S/48º95'04,6"O
LA02 26°38'27,4''S/48°49'22,8''O LA35 26º41'24,7''S/48º49'9,56''O
LA03 26°40' 51,1"S/48°48'05,3''O LA36 26º39'31,5''S/48º54'30,24''O
LA04 26°39'33,1''S/48°49'42,6''O JM37 29º02'28,7''S/48º 45'87,0"O
LA05 26°39'33,2''S/48°49'42,6''O JM38 29º02'23,1''S/49º45'74,9"O
LA06 26º 74' 17,5"S/48º 84' 46,4"O JM39 29º02'29,4''S/49º48'21,7"O
LA07 26º40'52,0"S/48º 53' 42,5"O JM40 29º04'15,1" S/49º47'68,0"O
LA08 26º43'35,2"S/48º 52' 22,0"O JM41 29º03'79,1"S/49º47' 86,4"O
CO09 26°23'32,11"S/49°13'27,80"O JM42 29º01'37,8"S/49º49' 07,2"O
CO10 26°26'43,62"S/49°19'7,13"O JM43 29º03'03,4"S/49º49' 85,3"O
CO11 26°23'42,72"S/49°16'22,81"O JM44 28º59'75,3"S/49º51'79,6"O
CO12 26°24'34,34"S/49°14'1,83"O SR45 29º07'16, 3"S/49º43' 9,9"O
CO13 26°24'19,60"S/49°17'36,04"O SR46 29º07'14,9"S/49º43'48,7"O
CO14 26°25'37,80"S/49°17'93,6"O SR47 29º06'80,2"S/49º43'40,9"O
CO15 26°25'57,30"S/49°17'12,30"O SR48 29º05'59,9"S/49º44' 47,9"O
CO16 26°28'57,38"S/49°14'35,28"O SR49 29º05'63,6"S/49º43'36,5"O
SJ17 26°35'13,8"S/48º 49'89,4"O SR50 29º06'32,7"S/49º43'35,7"O
SJ18 26°35'12,8"S/48º49'97,2"O SR51 29º06'00,4"S/49º41'75,6"O
SJ19 26°37´10,8"S/48º46'65,4"O SR52 29º06'65,3"S/49º44'84,4"O
SJ20 26°36'62,5"S/48º 51'13,9"O SI53 28º37'29,7"S/49º28' 15,3"O
JS21 26°29'28,39"S/49º10'16,99"O SI54 28º37'32,3"S/49º 27'15,4"O
JS22 26º28'57,26"S/49º1019,93"O SI55 28º32'59,8"S/49º25'17,5"O
JS23 26º30'39,37"S/49º10'03"O SI56 28º33'16,1"S/49º26'15,4"O
JS24 26°24'24,64"S/49º10'08,5"O SI57 28º33'00,2"S/49º26'15,4"O
JS25 26°26'51,98"S/49º03'22,82"O SI58 28º33'00,2"S/49º24'54,8"O
JS26 26°31'04,05"S/49º13'42,44"O SC59 26°23'34,2"S/49º01'17"O
JS27 26°24'24,64"S/49º10'08"O SC60 26°23'14,9"S/49º02'16"O
JS28 26°26'51,98"S/49º03'22,82"O SC61 26°22'36,7"S/49º05'18"O
MA29 26°71'68,7"S/49º03'22,5"O SC62 26°23'34,2"S/49º01'17"O
MA30 26°67'61,0"S/49º01'63,5"O SC63 26°23'14,9"S/49º02'16"O
MA31 26°61'30,0"S/48º87'72,4"O SC64 26°22'31,2"S/49º05'18"O
MA32 26°60'91,0'' S/49º00'29,7''O SC65 26°22'36,7"S/49º05'19"O
MA33 26°59'45, 3" S/48º86'93,2"O SC66 26°22'55,4"S/49º04'12"O
Código dos municípios: LA: Luís Alves, CO: Corupá, SJ: São João Itaperiú, JS: Jaraguá
do Sul, MA: Massaranduba, JM: Jacinto Machado, SR: Santa Rosa do Sul, SI:
Siderópolis, SC: Schroeder.
16
Figura 1- Etapas de obtenção dos isolados. A) Identificação de plantas adultas de bananeira da
cultivar Enxerto com sintomas do mal-do-panamá. B) Corte do pseudocaule próximo a
inserção do rizoma. C) Observação de necroses no rizoma de coloração pardo avermelhado;
sintomas típícos de fusariose. D) Obtenção de colônia de Fusarium oxysporum f. sp. cubense
isolada em meio de cultura BDA.
4.2.1 Obtenção de culturas monospóricas
Fragmentos de colônias crescidas em meio BDA com sete dias de
idade foram transferidos para tubos de ensaio contendo 10ml de água
destilada estéril. Após agitação, 20µl da suspensão de cada isolado
foram transferidos e espalhados com espátula de Drigalsky, na
superfície do meio agar - água (AA) em placas de Petri. As placas foram
mantidas sob temperatura ambiente e luz intermitente (Fotoperíodo
12h). Após 24 horas, sob lupa estereoscópica, transferiu-se um único
17
conídio para uma placa de Petri contendo meio BDA. Colônias crescidas
a partir deste conídio foram consideradas monospóricas e usadas nas
etapas subseqüentes deste trabalho.
4.2.2 Conservação do patógeno
Os fungos foram mantidos em tubo de ensaio contendo meio de
cultura BDA conforme descrito por CASTRO (2007). Durante o
desenvolvimento do trabalho prático, os isolados foram repicados para
meio de cultura líquido BDE (200g batata + 20g dextrose + 20g extrato
de levedura) segundo REBELO (2003), para os estudos moleculares.
Além disso, para possibilitar estudos futuros, os fungos foram
preservados em papel de filtro (LESLIE & SUMMERELL, 2006) e
depositados na micoteca da Estação Experimental de Itajaí – EPAGRI.
4.3 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA
Os isolados monospóricos foram repicados em placas de Petri
com 9cm de diâmetro para meio de cultura BDA em duplicata e
incubados a 26°C e fotoperíodo de 12h. A taxa de crescimento diária foi
obtida com medidas do diâmetro das colônias com auxilio de um
paquímetro no sétimo e no décimo quarto dias de cultivo. No décimo
quarto dia de crescimento, avaliou-se também a coloração utilizando
uma escala de notas variando do branco ao violeta, sendo, branco=0,
salmão=1, violeta=2. Sob microscópio de luz foram observadas também
a formação de clamidósporos, macroconídios e microconídios típicos de
Fusarium oxysporum (NELSON et al., 1983).
4.4 - TESTE DE PATOGENICIDADE
A patogenicidade de cada isolado foi testada em mudas de
bananeira da ‘Enxerto’ com 12 semanas de idade, obtidas no viveiro do
Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da EPAGRI. As plantas
foram removidas dos tubetes e suas raízes foram cortadas a 5cm da base.
A inoculação foi realizada através da imersão do sistema radicular das
plantas numa suspensão de conídios (2 x 10
6
conídios.mL
-1
) por 2 horas
com quatro repetições. O sistema radicular das testemunhas foi imerso
apenas em água destilada estéril. Após este período, as plantas foram
transplantadas em sacos plásticos de 10 x 15cm, contendo como
substrato casca de arroz carbonizada esterilizada. Em seguida, as
18
mesmas foram então, depositadas em caixas de madeira, e acomodadas
sobre o piso da casa de vegetação, forrado com lona plástica, isoladas
entre si através de lona plástica, permanecendo inclinadas num ângulo
de 15º para permitir a drenagem de água excedente. As plantas foram
mantidas em telado protegido durante 35 dias, em temperatura ambiente,
com irrigação controlada (dois ciclos diários de 2 minutos). As plantas
foram mantidas em telado protegido durante 35 dias com auxílio de um
estilete, onde se observou o desenvolvimento de sintomas internos no
rizoma, caracterizados pela necrose no sistema vascular (Figura 2).
Figura 2 - Etapas do Teste de patogenicidade. A) Remoção de
mudas dos tubetes. B) Corte das raízes a 5cm de base. C)
Inoculação dos patógenos. D) Transplante das mudas para sacos
plásticos com substrato. E) Aclimatação das mudas em área de
19
telado protegido.
4.5 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR
MARCADORES MOLECULARES
4.5.1 Crescimento do fungo em meio líquido
Para obtenção de massa micelial e subseqüente DNA fúngico,
transferiu-se para meio BDE batata (200g) + dextrose (20g) + extrato de
levedura (20g), os 66 isolados de FOC e 2 isolados provenientes do
Banco de Cepas da EPAGRI/EEI, utilizados como out groups
(Pyricularia grisea e Fusarium graminearum). Todos os isolados foram
repicados em duplicata e incubados por sete dias a 25ºC, sob agitação
contínua (SM Edmund Buhler). Após este período, a massa micelial de
cada isolado foi filtrada e seca por 2 horas em câmara de fluxo laminar
para a extração do DNA.
4.5.2 Extração do DNA
Um grama da massa micelial foi macerada com nitrogênio
líquido e transferida para cápsulas de plástico do tipo Eppendorf (XML)
onde se procedeu à extração DNA baseada na metodologia de SCOTT
et al. (1993) alterada por TCACENCO et al. (2005) em relação a
concentração de SDS. Para tanto, adicionou-se 700µL de tampão (Tris-
HCl 100mM pH8, EDTA 100mM, NaCl 250mM) e 700µL de SDS 10%
ao micélio triturado. O macerado foi mantido em banho Maria a 65ºC,
sendo agitado a cada 10 minutos por 40 minutos. Para a purificação do
DNA e eliminação de proteínas, polissacarídeos e restos de membrana
celular, acrescentou-se lentamente 300µL de solução de acetato de
potássio (acetato de potássio, 3M e ácido acético, 2M). Esta mistura foi
mantida em freezer comercial a -20ºC por 15 minutos sendo
posteriormente centrifugada durante 15 minutos a 11000 rpm em
Centrífuga Eppendorf 5804R. Foram retirados 750µL do sobrenadante,
aos quais foram adicionados 750µL de Isopropanol gelado. O material
foi incubado em freezer por 10 minutos e centrifugado por 5 minutos a
11000 rpm. Descartou-se o sobrenadante e o pellet (precipitado) foi
lavado com 1mL de etanol 70% e em seguida, centrifugado por 2
minutos a 11000 rpm. Ao final, o etanol foi descartado e o pellet foi
secado em câmara de fluxo laminar por 30 minutos, até ficar com
aspecto transparente. Na sequência, as amostras foram diluídas em 50µL
20
de TE.
Para verificação da qualidade do DNA, utilizou-se gel de agarose
0,8%, corado com brometo de etídeo. A quantidade do DNA foi
estimada por espectrofotometria (FEMTO/700 plus) a 260nm. A partir
de então, realizou-se a diluição e calibrou-se a quantidade de DNA para
20ng µL
-1
.
4.5.3 Amplificação do DNA RAPD
As reações de amplificação pela técnica RAPD (Random
Amplified Polimorphic DNA) foram realizadas em duplicata em volumes
de 25µL contendo tampão PCR 1X, MgCl
2
2mM, dNTP 0,25 mM, 0,4
mM de iniciadores, 20ng de DNA molde, 1 U.µL
-1
da enzima Taq
polimerase. Foram utilizados 29 iniciadores RAPD, de acordo com
MARTINS (2005); MOSTAFA et al. (2002) e VAKALOUNAKIS &
FRAGKIADAKIS (1999), conforme Tabela 2. Todas as reações de
amplificação foram realizadas segundo Martins (2005) em
termociclador (modelo e marca PTC-100) programado para realizar
uma desnaturação inicial de 5 minutos a 94ºC, seguido de 40 ciclos.
Cada ciclo consistiu de uma etapa de desnaturação (1 minuto a 92ºC),
uma etapa de anelamento (1 minuto a 35ºC), e uma etapa de
alongamento (2 minutos a 72ºC), por fim, foi feito uma extensão final (5
minutos a 72ºC).
Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em
gel de agarose 1,5% a 60v, durante 4 horas. Em seguida foram tratados
com brometo de etídeo, visualizados em transluminador de luz
ultravioleta (Vilber Lourmart) e fotografados com fotodocumentador.
Tabela 2 - Identificação dos iniciadores utilizados para estudo RAPD
seguido da sequência de nucleotídeos
Identificação
Iniciador
Sequência
Identificação
Iniciador
Sequência
OPAX 10 5´-CCAGGCTGAC-3´ R3 5’-ACGATCGCGG-3’
OPAX 12 5´-GGTCGGGTCA-3´ PU1 5’-AGATGCAGCC-3’
OPC 06 5´-GAACGGACTC-3´ PU2 5’-ACGGATCCTG-3’
OPP 12 5´-AAGGGCGAGT-3´ PU3 5’ ACTGGGACTC 3’
OPX 11 5´-GGAGCCTCAG-3 OPA-01 5'-CAGGCCCTTC-3'
OPP 16 5´-CCAAGCTGCC-3´ OPB-01 5'-GTTTCGCTCC-3'
OPW 08 5´-GACTGCCTCT-3´ OPB-02 5'-TGATCCCTGG-3'
81 5’-ACGGTCTTGG-3’ OPB-03 5'-CATCCCCCTG-3'
82 5’-GGCGCTAGCA-3’ OPB-04 5'-GGACTGGAGT-3'
171 5’-GAAACAGCGG-3’ OPB-07 5'-GGTGACGCAG-3'
172 5’-GGAGCCCAC-3’ OPB-08 5'-GTCCACACGG-3'
173 5’-GGAGGGTGTT-3’ OPB-14 5'-TCCGCTCTGG-3'
21
174 5’-ACGATCGCGG-3’ OPB-20 5'-GGACCCTTAC-3'
R1 5’-CGGCCACCCT-3’ OPF-05 5'-CCGAATTCCC-3'
R2 5’-CGCGTGCCAG-3’
22
4.5.4 Amplificação do DNA por SSR (simple sequence repeats)
As reações de amplificação pela técnica SSR (simple sequence
repeats) foram realizadas em duplicata em volume de 25uL, seguindo a
metodologia citada por BOGALE et al. (2005) com adição de 2,5mM
de cada dNTP. Os ciclos de PCR foram realizados em termociclador
PTC-100 programado para realizar uma desnaturação inicial de 4
minutos a 94ºC, seguida de 35 ciclos de desnaturação, anelamento e
extensão a 72ºC, cada ciclo de 30 segundos, e por fim uma extensão
final de 10 minutos. As temperaturas de anelamento foram específicas
para cada iniciador (Tabela 3).
Os produtos resultantes da amplificação foram separados por
eletroforese em géis de Poliacrilamida 6%, 3000v, 45w, por 3 horas. Os
fragmentos amplificados foram corados com nitrato de prata seguindo
quatro passos: 3 minutos em solução fixadora (etanol 10% e acido
acético 0,5%), 10 minutos em solução de impregnação (Nitrato de Prata
0,1%), 20 minutos em solução de revelação principal gelada (hidróxido
de sódio 0,1% e formaldeído 0,15%), e 10 minutos em solução de
revelação secundária (carbonato de sódio 0,75%). Após a etapa de
revelação os géis foram fotografados com câmara digital (Panasonic
DMC-FX12)
Tabela 3 - Iniciadores utilizados para estudo SSR seguido da sequência
de nucleotídeos.
Iniciadores Sequência dos nucleotídeos
Temperatura de
anelamento (ºC)
MB2 F: TGCTGTGTATGGATGGATGG 57
R:CATGGTCGATAGCTTGTCTCAG
MB5 F:ACTTGGAGGAAATGGGCTTC 54
R:GGATGGCGTTTAATAAATCTGG
MB9 F:TGGCTGGGATACTGTGTAATTG 51
R:TTAGCTTCAGAGCCCTTTGG
MB11 F:GTGGACGAACACCTGCATC 68
R: AGATCCTCCACCTCCACCTC
MB 13 F:GGAGGATGAGCTCGATGAAG 68
R:CTAAGCCTGCTACACCCTCG
MB17 F:ACTGATTCACCGATCCTTGG 57
R:GCTGGCCTGACTTGTTATCG
23
4.6 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA ATRAVÉS DOS
GRUPOS DE COMPATIBILIDADE VEGETATIVA
O estudo de agrupamento de compatibilidade vegetativa foi
baseado na metodologia descrita por PUHALLA (1985). Utilizaram-se
quatro isolados, sendo dois provenientes da região norte do Estado
(CO16, MA32) e dois coletados na região sul (JM40, SI52).
Os meios de cultura utilizados foram: Meio basal (MB) - 30 g de
sacarose, 1g de KH
2
PO
4
, 0,5g de MgSO
4
.7H
2
O, 0,5g de KCl, 10mg de
FeSO
4
.7H
2
O, 20g de agar, 1000mL de água destilada e 0,2mL de
solução de micronutrientes. A solução de micronutrientes continha para
cada 95mL de água destilada, 5g de ácido cítrico, 5g de ZnSO
4
.7H
2
O, 1g
de Fe(NH
4
)
2
.(SO
4
)
2
.6H
2
O, 250mg de CuSO
4
.5H
2
O, 50mg de
MnSO
4
.H
2
O, 50mg de H
3
BO
4
e 50mg de NaMoO
4
.2H
2
O. O meio
mínimo (MM) continha 2g de NaNO
3
em 1000mL de meio basal (MB) e
o meio de indução da formação de setores (possíveis mutantes) (MMC)
continha 1000mL de meio basal (MB), 15g de KCLO
3,
1,6g de L-
asparagina e 2g de NaNO
3
(23).
Para obtenção e pareamento dos nit mutantes, discos de colônia
fúngica (5mm de diâmetro), removidos dos isolados selecionados para
este estudo, crescidos em meio MM por 3-4 dias a 26C e alternância
luminosa (Fotoperíodo 12h luz/12h escuro), foram transferidos para
placas de Petri contendo MMC (meio mínimo com clorato) e incubados
por 15 dias. Em cada placa foram colocados quatro discos miceliais de
cada isolado. Os cultivos foram observados diariamente para a
verificação do crescimento e formação dos setores. Os setores foram
transferidos para o meio MM (meio mínimo) e incubados por sete dias.
Um setor foi denominado arbitrariamente Nit A, colocado no centro da
placa e os outros distribuídos na placa a uma distância de
aproximadamente 15mm do centro da placa. Outro nit mutante, que
desenvolveu um denso crescimento entrando em contato com o Nit A,
foi designado Nit B. Os quatro isolados de Fusarium testados nesta
etapa do projeto foram pareados sobre o meio mínimo em todas as
possíveis combinações com os Nit mutantes obtidos. A compatibilidade
vegetativa foi inferida quando houve a formação de denso micélio aéreo,
juntando as duas colônias dos isolados (Figura 3).
24
Figura 3 - Fluxograma para determinação dos Grupos de Compatibilidade Vegetativa:
Etapas para obtenção dos nit mutantes. B) Pareamento dos NitA e NitB de todos os
isolados (A,B,C,D).
25
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados de RAPD e SSR foram submetidos à análise de
similaridade e agrupamento utilizando programa NTSYS – PC 2.1
(ROLHF, 2000). Foi gerada uma matriz de dados 0 e 1, a partir da
codificação da presença (1) e ausência (0) de bandas polimórficas
presentes nos isolados. As estimativas de similaridade genética foram
efetuadas pelo coeficiente Jaccard. O dendograma foi obtido por meio
de análise de agrupamento de similaridades, utilizando-se o método da
média das similaridades (UPGMA).
26
5 RESULTADOS
5.1 TESTE DE PATOGENICIDADE
Dos 66 isolados testados, 100% foram patogênicos apresentando
sintomas internos de pontuações pardo-avermelhadas e descoloração
vascular no rizoma, surgidas pela oxidação de fenol (Figura 4). Embora
não se tenha avaliado os níveis de infecção dos isolados testados, pôde-
se observar que a virulência dos isolados foi variável entre os 66
isolados testados, sendo que em alguns infectaram de forma mais
virulenta, ocupando praticamente todo o rizoma da bananeira, enquanto
que outros isolados causaram apenas uma necrose pequena e limitada na
parte basal do rizoma.
Figura 4 - Avaliação do Teste de Patogenicidade: A) Testemunha: Rizomas de bananeira da
cultivar Enxerto sem infecção do fungo no sistema vascular. B e C) Rizomas de bananeira
infectado por FOC com sintomas característicos da doença (pontuações pardo-avermelhadas e
descoloração vascular no rizoma.
5.2 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
O crescimento das colônias variou entre 4,4 a 6,6 mm.dia
-1
, não
havendo diferença significativa (p > 0,05) entre os isolados. Após 14
dias dos isolados em meio de cultivo BDA, foi possível observar a
formação característica de macroconídios e microconídios abundantes.
Avaliou-se também aos 14 dias a coloração de cada isolado
variando do branco, salmão ao roxo, conforme apresentado na Figura 5.
27
Destes 66 isolados, 41 apresentaram cor salmão (sendo 29 isolados do
norte do Estado e 12 região Sul), 19 cor branca (sendo 13 da região
Norte e 06 do Sul), e 6 isolados eram de cor roxa (sendo 3 do norte do
Estado e 3 da região Sul), conforme Tabela 4.
Tabela 4 - Classificação dos isolados de FOC de acordo com a cor e
origem, avaliados no décimo quarto dia de crescimento em meio de
cultura BDA.
Cor Isolado Região
Branco
LA05,CO11,CO13,CO14,CO15,JS21,JS25, MA28,MA31,MA34,LA35,
SC62,SC63
Norte
JM37JM40,JM43, SR46,SR47,SI57 Sul
Salmão
LA01, LA02, LA03, LA04, LA06 LA07,
LA08,CO09,CO10,CO12,CO16,SJ17, SJ18, SJ19, SJ20, SJ22, J23,SJ24,
SJ27,MA30,MA32,MA33,LA36,JM38,SC60,SC62,SC61,SC64,SC65
Norte
,JM39,JM41,JM42,JM44,SR45,SR48,SR49,SR50,SR51,SR52,SI53,SI55 Sul
Roxo
JS26,JS29,SC59 Norte
SI54,SI56,SI58 Sul
Legenda: LA: Luís Alves, CO: Corupá, JS: Jaraguá do Sul, MA: Massaranduba, JM: Jacinto
Machado, SC: Schroeder, SJ: São João Itaperiú, SI: Siderópolis, SR: Santa Rosa Sul
Figura 5 - Características morfológicas: Coloração das Colônias de FOC
cultivadas por 14 dias em meio de cultura BDA a 26ºC e fotoperíodo 12h.
Variação das colônias em relação à cor, variando do branco ao roxo.
28
Identificação
Iniciadores Sequência
Fragmentos
amplificados
Fragmentos
Polimórficos
OPAX 10 5´-CCAGGCTGAC-3´
10 7
OPAX 12 5´-GGTCGGGTCA-3´ 8 8
OPP 16 5´-CCAAGCTGCC-3´
6 6
174 5’-ACGATCGCGG-3’ 14 13
R1 (*) 5’-CGGCCACCCT-3’ 20 17
R3 5’-ACGATCGCGG-3’ 18 16
PU2 5’-ACGGATCCTG-3’ 8 5
OPB-03 5'-CATCCCCCTG-3' 2 1
OPB-04 5'-GGACTGGAGT-3' 5
5
OPF-05 (*) 5'-CCGAATTCCC-3' 8 3
Total 99 81
(*) Iniciadores utilizados também para testes de RAPD nos quais os out groups foram incluidos
5.3 ANÁLISE VARIABILIDADE GENÉTICA
5.3.1 Marcador Molecular RAPD
Dos 66 isolados utilizados para análise RAPD, duas amostras
foram descartadas (SJ18 e SH61) por não amplificarem bandas nos dez
iniciadores. Dos 29 iniciadores utilizados, dez foram selecionados por
exibirem padrões de amplificações definidos e elevado polimorfismo
dentre os 64 isolados de Fusarium analisados. Dois iniciadores foram
utilizados para reações nas quais os out groups foram incluídos.
Os iniciadores utilizados para este estudo amplificaram 99
fragmentos, sendo destes 81 polimórficos, gerando em média 8,1 bandas
polimórficas por iniciador (Tabela 5). O tamanho de fragmentos de
DNA amplificados variou de 0,25 a 2,2 Kb aproximadamente. Os
iniciadores que amplificaram o maior número de bandas polimórficas
foram R1 e R3 e os que amplificaram um menor número foram OPB 03
e OPF 05. Na Figura 6 pode-se visualizar padrões de amplificações de
RAPD, em gel de agarose 1,5%, obtidos através dos iniciadores R1,
OPAX 10 e R3, respectivamente.
Tabela 5 - Iniciadores de RAPD selecionados neste estudo e o número
de fragmentos de DNA amplificados de Fusarium oxysporum f. sp.
cubense.
29
Figura 6 - Padrões de amplificações de RAPD, em gel de agarose 1,5%, obtidos
com o iniciador R1(A), OPAX -10 (B), R3 (C) para isolados de FOC. M1:
marcador de peso molecular 100pb. M2: marcador de peso molecular 1kb.
30
A análise de conglomerados feita com o out groups separou os
isolados de P. grisea e F. gramineanum dos demais isolados em nível de
dissimilaridade de aproximadamente 80% (Figura 7). Isto demonstra a
eficiência desses iniciadores em separar os “out groups” dos demais.
A análise feita com os 64 isolados de FOC e os dez iniciadores
testados, considerando-se apenas as bandas polimórficas, e levando-se
em consideração em nível de similaridade de 85%, separou os isolados
em cinco grupos distintos (Figura 8). O primeiro grupo engloba 58
indivíduos, destes 30 apresentaram similaridade interna de 100% e os
demais componentes do grupo apresentaram variabilidade entre eles de
2 a 15%.
Um segundo grupo, composto por três isolados (SJ19, JS25 e
JS28), apresenta um alto nível interno de similaridade, mas uma
similaridade de apenas 75% com o grupo anterior. Os demais isolados
(CO16, JS23 e JS26) apresentam alto nível de dissimilaridade tanto
entre si quanto com os dois outros grupos formados.
Análises individuais para todos os iniciadores (resultados não
mostrados) indicam um comportamento muito similar ao que foi
exposto acima, particularmente para a separação que ocorreu entre os
três isolados mais distintos (CO16, JS23 e JS26) e os demais, dando
assim um bom nível de confiabilidade nos grupos formados.
31
Figura 7 - Dendograma de similaridade genética dos 64 isolados de Fusarium
oxysporum f.sp. cubense e dos “out groups” Pg.(Pyricularia grisea ) e Fg.
(Fusarium graminianum), utilizando os iniciadores RAPD R1 e OPF05.
32
Figura 8 - Dendograma de similaridade genética dos 64 isolados de
Fusarium oxysporum f. sp. cubense utilizando iniciadores RAPD.
33
5.3.2 Marcador Molecular SSR
Dos seis iniciadores utilizados para a análise de 66 isolados de
FOC, dois foram selecionados por exibirem padrões de amplificações
definidos na literatura. O iniciador MB02 amplificou duas bandas,
sendo uma de tamanho 240 pb nos isolados CO16, SJ23, JS26, SI53,
SI54, SI55, SI56 e uma de tamanho 260 pb para todos os isolados. O
iniciador MB11 amplificou uma única banda de tamanho 175 pb em
todos os isolados analisados, com exceção dos isolados CO16 e SJ23,
nos quais não houve amplificação, sendo considerado alelo nulo. Na
figura 9 pôde-se visualizar padrões de amplificação de SSR, em gel de
poliacrilamida 6%, revelados com nitrato de prata obtidos com o
iniciador MB02.
A análise feita com os 66 isolados de FOC e os dois iniciadores
testados, considerando-se todas as bandas amplificadas, separou os
isolados em três grupos distintos apresentado no dendograma (Figura
10), com similaridade interna de 100%, ou seja, os isolados de cada um
dos grupos foram idênticos entre si. Os dois isolados utilizados como
controle (Pyricularia e Fusarium) formaram um grupo a parte (dados
não apresentados).
O primeiro grupo englobou 59 indivíduos provenientes dos
diversos municípios onde as coletas foram feitas. O segundo grupo,
composto por dois isolados (CO16, JS23), caracteriza-se por apresentar
alelo nulo para o marcador MB11. Já o terceiro grupo, formado por
quatro isolados sendo um isolado proveniente do município de Jaraguá
do Sul e os demais provenientes do município de Siderópolis (JS26,
SI53, SI54, SI55, SI56), caracterizou-se por apresentar um alelo extra no
marcador MB02.
O segundo e terceiro grupo uniram-se entre si a um nível de
similaridade de cerca de 65%, enquanto que este novo conglomerado
uniu-se aos demais isolados a um nível de similaridade de 57%.
34
Figura 9 - Padrões de amplificação de SSR, em gel de poliacrilamida 6%, obtidos com o
iniciador MB02 para isolados de FOC coletados dos Municípios de Corupá (CO) e Jaraguá do
Sul (JS). M: marcador de peso molecular 50pb. Os números assinalados referem-se aos
tamanhos dos fragmentos amplificados.
35
Figura 10 - Dendograma de similaridade genética dos 66 isolados de
Fusarium oxysporum f. sp. cubense utilizando os iniciadores SSR MB2 e
MB11.
36
5.3.3 Compatibilidade Vegetativa
Dos 66 isolados analisados, quatro destes foram selecionados
para o estudo de Compatibilidade Vegetativa. Estes isolados foram
selecionados em função de serem distintos tanto pela origem como pela
virulência assim, dois isolados da região Norte (CO14, MA32) e dois
isolados da região Sul (JM40, SR52) do Estado, sendo um menos
virulento e o outro mais virulento em cada região.
Após os quatro isolados terem sido cultivados em meio mínimo
com clorato (MMC), observou-se a formação de setores, sendo que esta
formação variou entre os isolados. Alguns apresentaram um único setor
por colônia e outros apresentaram mais de um. Foram considerados
mutantes nit os setores que apresentaram crescimento ralo sem micélio
aéreo em MMC, apresentado na Figura 11a.
Neste estudo não foi possível observar o pareamento entre os
quatro isolados testados não havendo com isso compatibilidade
vegetativa entre estes isolados (Figura 11b). Estes resultados obtidos
com VCGs de FOC devem ser considerados preliminares, uma vez que
seria necessário outras tentativas na obtenção de mutantes nit adicionais.
37
Figura 11 - A) Obtenção de Nit mutantes em meio mínimo com clorato de potássio. A seta
indica a formação de setores. B) Pareamento dos nit mutantes dos quatro isolados de FOC
selecionados para este estudo em meio mínimo.
38
6 DISCUSSÃO
Os resultados de patogenicidade dos isolados de Fusarium
oxysporum f. sp. cubense (FOC) revelaram que os 66 isolados
analisados, todos foram patogênicas à bananeira da cultivar Enxerto. O
fungo foi sempre isolado de plantas adultas, antes do período da
floração, com sintomas típicos do mal-do-panamá, ou seja; daquelas
plantas que apresentavam externamente um amarelecimento das folhas
mais velhas para as folhas mais novas, e também rachadura do pseudo-
caule próximo ao solo (CORDEIRO et al., 2005; PLOETZ, 2006). Esses
sintomas, descritos por VENTURA & HINZ (2002), são mais comuns
em plantas adultas, mas podem ser encontrados em plantas jovens. Além
dos sintomas externos, o cuidado na retirada de fragmentos do rizoma
fora da área de encharcamento, durante a coleta das amostras foi
fundamental para a validação da metodologia utilizada neste trabalho.
Nem sempre o método de coleta utilizado resulta no sucesso de
obtenção do patógeno de interesse. APPEL & GORDON (1994)
coletaram 197 amostras de Fusarium oxysporum isolados de solo e de
raízes do hospedeiro de duas propriedades agrícolas, sendo que somente
115 isolados foram identificados como Fusarium oxysporum f.sp.
melonis. Os demais isolados não apresentaram sintomas ao hospedeiro,
sendo considerados não patogênicos. LESLIE & SUMMERELL (2006)
relatam que o protocolo de isolamento tem um significativo impacto
sobre a recuperação de espécies de Fusarium provenientes de plantas
doentes. As técnicas de isolamento selecionadas devem maximizar a
recuperação do patógeno de interesse e restringir a recuperação de
patógenos secundários e saprófitas.
Embora não se tenha avaliado a severidade da doença no teste de
patogenicidade, observou-se uma variação da agressividade dos isolados
patogênicos frente aos clones de bananeira provenientes da cultivar
Enxerto nas mesmas condições. Alguns isolados de maior agressividade
foram provenientes dos municípios de Massaranduba (MA32), Santa
Rosa do Sul (SR52), Siderópolis (SI54) e Schroeder (SC63, SC66). Os
demais isolados, tanto da região Norte quanto da região Sul,
apresentaram uma menor agressividade, causando sintomas de uma
forma menos severa. De acordo com MOORE et al. (1991), o
desenvolvimento da doença do mal-do-panamá depende fortemente da
interação entre patógeno e genótipo da planta, e parece ser influenciado
diretamente pelas condições ambientais. WAITE (1962) observou que
12 isolados de F. oxysporum f. sp. cubense oriundos de Heliconia
39
caribaea apresentaram variações quanto à agressividade em Heliconia
librata Griggs e Heliconia irassa R.R. Smith. Posteriormente, WAITE
(1963) relatou uma variação de agressividade de 12 isolados de F.
oxysporum f.sp. cubense provenientes de Honduras, Filipinas,
Venezuela, Austrália, Jamaica, Costa Rica, Malásia e Tailândia. Quando
inoculados nas cultivares de bananeira Gros Michel e Bluggoe, e os
isolados provocaram sintomas que variaram de leve a severo. CASTRO
et al. (2008) estudando FOC em Helicônia nas regiões produtoras do
Nordeste do Brasil, classificou os isolados analisados em três diferentes
níveis de agressividade, verificando que não ocorreu correlação
geográfica. Isolados de uma mesma região apresentaram níveis de
agressividade diferentes, classificados em maior agressividade,
agressividade intermediária e menor agressividade. Com base nos
relatos de WAITE (1962, 1963); MOORE et al. (1991) e CASTRO et
al. (2008), bem como nas observações relatadas do presente estudo, é
provável que haja diferença nos níveis de agressividade dos isolados de
FOC provenientes de Santa Catarina, porém estudos adicionais devem
ser realizados para complementação e avaliação dos isolados.
Quanto às características morfológicas dos isolados analisados
neste estudo, não se observou diferenças significativas com relação à
taxa de crescimento das colônias que variaram de 4,4 a 6,6mm.dia
-1
.
Quando se avaliou a coloração das colônias em meio de cultura BDA a
24ºC no sétimo e décimo quarto dia, classificou-se os isolados em três
grupos distintos (branco, salmão e violeta), que foram relacionados à
origem (Figura 5). Esses resultados estão de acordo com PLOETZ
(2006) e LESLIE & SUMMERELL (2006), que descreveram que as
colônias crescem de 4 a 7 mm/dia em BDA a 24ºC com abundante
micélio aéreo, de cor variando de branco ao violeta. KUMAR et al.
(2006), estudando a variabilidade genética de Fusarium oxysporum f.
sp. cubense na India, verificaram diferenças consideráveis na taxa de
crescimento de sete isolados analisados, sendo que quatro deles
cresceram mais rápido (8,0 ± 0,2mm/dia
-1
), dois foram intermediários
(7,0 ± 0,2mm/dia
-1
), e um deles foi mais lento (6,6 ± 0,2mm/dia
-1
). Estes
autores também obtiveram coloração das colônias variando de branco a
violeta. Em geral, tipos de Fusarium oxysporum não podem ser
distinguidos morfologicamente, uma vez que as condições ambientais e
nutricionais podem alterar as características das colônias, como
coloração e taxas de crescimento, havendo por isso, a necessidade de
confirmação de diagnósticos com utilização de técnicas moleculares
(PLOETZ, 2006; LEONG et al., 2009).
40
Os resultados por marcadores moleculares RAPD revelaram uma
variabilidade considerável entre os isolados de FOC, com estimativas de
similaridade que variaram de 98 a 35 % (Figura 8). Com base nos 10
marcadores selecionados de RAPD, os 66 isolados foram agrupados em
cinco grupos distintos.
VAKALOUNAKIS & FRAGKIADAKIS (1999), estudando a
diversidade genética de 121 isolados, verificaram que o marcador
molecular RAPD foi efetivo, ou seja, revelou variabilidade para estudos
de população de Fusarium oxysporum em pepino. KURAMAE &
SOUZA (2002) utilizaram marcadores moleculares RAPD para estimar
a variabilidade genética existente entre quatro formas speciales de
Fusarium oxysporum, obtendo resultado satisfatório na diferenciação
dos isolados com o uso 10 iniciadores. Geraram-se um total de 74
fragmentos, dos quais 68 foram polimórfcos e apenas 6 monomórficos.
Como conclusão, estima-se uma variabilidade genética a nível de DNA
genômico entre formas speciales de 50%; os autores concluíram que
este marcador pode servir para diferenciar isolados de espécies de
diferentes hospedeiro. PARK et al. (2006) fazendo análise filogenética
de formae speciales de Fusarium oxysporum provenientes da Corea,
utilizaram dez marcadores RAPD, sendo que estes, geram um total de
125 bandas, das quais, 124 foram polimóficas, relatando ser um bom
marcador para estudo de diversidade genética. Usando também o
marcador RAPD, MOSTAFA et al. (2002) detectaram polimorfismo
entre os oito isolados de Fusarium oxysporum coletados de grão-de-
bico. Estudo realizado por BELABID et al. (2004), com 32 isolados de
Fusarium oxysporum f. sp. lentis verificou que o RAPD tem um
excelente potencial para resolver a dinâmica de população e evolução
deste fungo.
A análise com marcador molecular SSR separou os isolados em
três grupos distintos (Figura 10). Este resultado pode estar relacionado
ao número de iniciadores utilizados, o que gerou um baixo polimorfismo
nos isolados amostrados. Baseado no trabalho realizado por BOGALE
et al. (2005), utilizou-se para este estudo seis iniciadores de SSR, dos
quais obteve-se somente a amplificação com bandas específicas em dois
destes. Embora ultimamente tenha sido relatado com bastante freqüência
o uso de marcadores moleculares SSR em pesquisas, principalmente em
função de seu alto nível de codominância, polimorfismo e lócus
específicos (YANG & ZHONG, 2008), o SSR tem sido muito pouco
utilizado para espécies de fungo, uma vez que a obtenção desses
marcadores com aceitável nível de polimorfismo é geralmente mais
41
difícil em fungos do que em outros organismos (DUTECH et al., 2007).
A formação dos grupos conforme o dendograma de similaridade
ocorreu principalmente porque considerou-se no iniciador MB11 a
presença de alelo nulo e no iniciador MB02, a presença de um alelo
extra em alguns indivíduos. Como se utilizou SSR desenvolvidos para
Fusarium oxysporum, não se esperava a presença de alelos nulos. As
seqüencias de DNA que flanqueiam os microssatélites são geralmente
conservadas entre os indivíduos de uma mesma espécie, ou até mesmo
entre espécies geneticamente relacionadas, permitindo a seleção de
iniciadores específicos que amplificam, via PCR, fragmentos contendo o
DNA repetitivo em todos os genótipos. A grande limitação dos SSR é a
necessidade de serem isolados e desenvolvidos especificamente para
cada espécie. A amplificação de lócus provenientes de outras espécies,
das quais eles foram clonados, é geralmente possível somente entre
espécies do mesmo gênero e em alguns casos, a percentagem de
amplificação é baixa, gerando alelos nulos, que podem influenciar na
análise genética (DUTECH et al., 2007).
Sendo o Fusarium oxysporum f. sp. cubense um fungo haplóide
com reprodução assexuada (BENTLEY et al., 1998), esperava-se que
com o uso da técnica de SSR ocorresse apenas a amplificação de uma
banda para cada isolado em cada iniciador utilizado. A ocorrência da
amplificação de duas bandas para alguns indivíduos pode ter ocorrido
em função da anastomose, ou seja, fusão de hifas que forma
heterocários, onde o mesmo micélio pode conter núcleos de origem
distinta. Esta hipótese é fundamentada pelo trabalho de PUHALLA
(1985), que observou formação de heterocários quando estudou as
características genéticas de raças de Fusarium oxysporum f. sp. cubense.
KISTLER (1997), em sua revisão sobre diversidade genética de
Fusarium oxysporum em plantas, relata também este comportamento do
fungo.
De acordo com a literatura, os microssatélites apresentam
vantagens sobre o marcador RAPD, porque são co-dominantes e
facilmente reproduzíveis. Além destas características, os microssatélites
parecem ter uma distribuição freqüente e aleatória permitindo assim,
uma ampla cobertura do genoma (LEHMANN et al., 1996). Quando se
comparou os resultados obtidos pelas duas técnicas moleculares
utilizadas neste estudo, verificou-se que houve uniformidade dos dados
obtidos, sendo a técnica RAPD também viável para detectar a
variabilidade genética de FOC. Em ambas as metodologias, obteve-se a
formação de um grande grupo com mais de 80% dos isolados
42
originários dos diferentes municípios estudados. Devido os isolados
C016, JS23 e JS26, provenientes da Região Norte do Estado de Santa
Catarina, apresentarem-se mais distantes geneticamente no dendograma
de similaridade, sugere-se estudo mais aprofundado futuramente com os
mesmos.
A história da bananicultura em Santa Catarina apresenta-se de
forma diferente nas regiões Norte e Sul do Estado. No Norte, houve o
predomínio das cultivares Maçã e Prata, que foram substituídas pela
cultivares do sub-grupo Cavendish, Nanica, Nanicão e Grande Naine,
em função do ataque intenso do mal-do-panamá. Já na região Sul do
Estado, há mais de um século, predomina o plantio da cultivar Enxerto
(MOREIRA & CORDEIRO, 2006). Mesmo havendo uma maior
diversidade de hospedeiro na região Norte do Estado, de uma maneira
geral, não ocorreu um aumento da variabilidade do patógeno. Isto pode
ser explicado por GROENEWALD et al. (2006), onde relatam que os
clones de FOC são estáveis e que não ocorre facilmente mutações no
genoma do patógeno, independentemente dos grupos genômicos do
hospedeiro.
Analisando-se os resultados, observa-se que não houve
associação dos agrupamentos RAPD e SSR com origens geográficas,
pois isolados coletados nos municípios selecionados para este estudo,
ficaram distribuídas nos diferentes grupos. Resultados semelhantes
sobre a falta de correlação com a origem geográfica foram obtidos por
SANTOS et al. (2008) estudando a variabilidade genética de FOC nos
bananais do norte de Minas Gerais e por SILVA (2009), estudando a
variabilidade em Heliconia sp. no Estado de Pernambuco.
GHERBAWY (1999) utilizou marcadores RAPD para analisar a
diversidade genética de 20 isolados de 14 formae specialis de F.
oxysporum e também não encontrou correlação com origem geográfica.
No estudo de análise genética através de Grupos de
Compatibilidade Vegetativa, o principal objetivo foi aplicar a
metodologia descrita por PUHALLA (1985) para dar inicio ao
entendimento desta técnica. O estudo de grupos de compatibilidade é
muito importante principalmente para o gênero Fusarium, tendo
bastante aplicabilidade, uma vez que isolados que pertencem a um
mesmo VCG apresentam alta similaridade genética (CASTRO, 2007).
Verificou-se que os quatro isolados foram capazes de produzir nit
mutantes. Segundo CORREL (1987), mutantes nit não são capazes de
assimilar nitrato no meio, apresentando assim, crescimento ralo e só
apresentam crescimento robusto quando ocorre a complementação com
43
outro isolado mutante do mesmo VCG. Por não apresentar forma
sexuada descrita, o VCG de Fusarium busca estabelecer uma relação da
similaridade genética com a possibilidade de fusão das hifas para a
formação de um heterocário entre as linhagens avaliadas (O’DONNEL,
1998). Neste estudo não foi evidenciado crescimento robusto quando
pareamos os nit mutantes, indicando a não compatibilidade vegetativa
entres esses isolados (Figura 11). Os resultados obtidos com VCGs de
F. oxysporum f. sp. cubense são preliminares e devem servir como base
para novos estudos futuramente. LODWIG et al. (1999), trabalhou na
distinção de africanas de FOC e relatou a existência de
compatibilidade na maioria dos isolados, entretanto, destacou dois
isolados como não compatíveis.
Com esse estudo conclui-se que não houve associação dos
agrupamentos por descritores morfológicos e moleculares com a origem
geográfica dos isolados avaliados. As técnicas moleculares RAPD e
SSR aplicadas foram eficientes em separar os isolados em grupos
distintos, os membros de cada grupo, em cada uma das técnicas em
geral foram coincidentes. Três dos isolados (CO16, JS23, JS26),
mostraram-se diferentes dos demais em ambas as técnicas merecendo
estudos futuros.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGRIOS, G.N. Plant Pathology, 3ed. New York. Academic Press, p.
803.1988.
ALVES, E.J. A Variabilidade Genética e o Melhoramento da Banana e
de outras Plantas Cultivadas. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 7,
p. 7-29, 1985.
AMORIM, E.P.R.; MELO, I.S. Ação antagônica de rizobactérias contra
Phytophthora parasítica e P. citrophthora e seu efeito no
desenvolvimento de plântulas de citros. Revista Brasileira de
Fruticultura, v. 24, p. 565-568, 2002.
APPEL, D.J. & GORDON, T.R. Local and Regional Variation in
Populations of Fusarium oxysporum from Agricultural Field Soils.
Phytopathology, v. 84, p. 786-791, 1994.
44
AZCON-AGUILAR, C.; BAREA, J.M. Arbuscular mycorrhizas and
biological control of soil-borne plant pathogens an overview of the
mechanisms involved. Mycorrhiza, v.6, p.457–464, 1996.
BALMAS, V.; SCHERM, B.; PRIMO, P. di, RAU, D.; MARCELLO,
A.; MIGHELI, Q. Molecular characterization of vegetative
compatibility groups in Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici
and f. sp. lycopersici by random amplification of polymorphic DNA and
microssatellite-primed PCR. European Journal of Plant Pathology,
Dordrecht, v. 111, p. 1-8, 2005.
BELABID, L.; BAUM. M.; FORTAS, Z.; BOUZNAD, Z.; EUJAYL,
I. Pathogenic and genetic characterization of Algerian isolates of
Fusarium oxysporum f.sp. lentis by RAPD and AFLP analysis.
American Journal of Biotechnology, v. 3, p. 25-31, 2004.
BENITEZ, T.; RINCÓN, A.M.; LIMÓN, M.C.; CODÓN, A.C.
Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. International.
Microbiology, v.7, p. 249-260, 2004.
BENTLEY, S.; PEGG, K.G.; MOORE, N.Y.; DAVIS, R.D.;
BUDDENHAGEN, I.W. Genetic variation among vegetative
compatibility groups of Fusarium oxysporum f. sp. cubense analyzed by
DNA fingerprinting. Phytopathology, Paul, v. 88, p.1283-1293, 1998.
BOGALE, M.; WINGFIELD, B.D.; WINGFIELD, M.J.; STEEN-
KAMP, E.T. Simple sequence repeat markes for species in the Fusari-
um oxysporum complex. Molecular Ecology, v. 5, p.622-624, 2005.
CARLIER, J.; HAYDEN, H.; RIVAS, G.; ZAPATER, M.-F.; ABADIE,
C.; AITKEN, E. Genetic differentiation in Mycosphaerella leaf spot
pathogens. In: Workshop on Mucosphaerella leaf spot diseases held in
San Jose, 2002, Costa Rica. Mycosphaerella leaf spot diseases of
bananas: present status and outlook, p.123-129, 2003.
CASTRO, N.R. Murcha de Fusarium em Heliconia spp.: ocorrência,
variabilidade e resistência genética. 2007, 98f. Tese (Doutorado em
Fitopatologia) - Universidade Federal Rural de Pernambuco - Recife,
2007.
45
CASTRO, N.R; COELHO, R.S.B.; LARANJEIRA, D.; COUTO, E.F.;
SOUZA, M.B.R. Ocorrência, métodos de inoculação e agressividade de
Fusarium oxysporum f. sp. cubense em Heliconia spp. Summa Phyto-
pathologica, v. 34, p. 127-130, 2008.
CAVAGLIERI, L.R.; PASSONE, A.; ETCHEVERRY, M.G.
Correlation between screening procedures to select root endophytes for
biological control of Fusarium verticillioides in Zea mays L. Biological
Control, v.31, p.259-267, 2004.
CORDEIRO, Z.J.M.; KIMATI, H. Doenças da bananeira (Musa spp).
In: KIMATI, H. et al. Manual de fitopatologia: Doenças de plantas
cultivadas. 3.ed. São Paulo. Agronômica Ceres, v. 2, p.112 -153, 1997.
CORDEIRO, Z.J.M.; MATOS, A.P. Doenças fúngicas e bacterianas. In:
Banana: Fitossanidade. Brasília: Embrapa Comunicação para
Transferência de Tecnologia, p. 36-64, 2000.
CORDEIRO, Z.J.M.; MATOS, A.P.; KIMATI, H. Doenças da
bananeira (Musa spp.) In: Doenças Da Bananeira. In: Kimati, H.;
Amorim, L.; Rezende, J.A.M.; Bergamin Filho, A.; Camargo, L.E.A.
Manual de Fitopatologia. Agronômica Ceres, v. 2, p. 99-117, 2005.
CORRELL, J.C.; KLITTICH, C.J.; LESLIE, J.F. Nitrate nonutilizing
mutants of Fusarium oxysporum and their use in vegetative
compatibility tests. Phytopathology, v. 77, p. 1640-1646, 1987.
CROUCH, J.H.; CROUCH, H.K. TENKOUANO, A.; ORTIZ, R. Based
diversity analysis of 2x and 4x full-sib Musa hybrids. Eletronic Journal
of Biotechnology, v. 2, p. 99-108, 1999.
DUTECH, C.; ENJALBERT, J.; FOURNIER, E.; FRANÇOIS, D.;
BARRES, B.; CARLIER, J.; THARREAU, D.; GIRAUD, T. Challengs
of microssatélite isolation in fungi. Science Direct. Fungal Genetics
and Biology, v. 44, p. 933-949, 2007.
FALEIRO, F.G.; LUZ, E. D. M.N.; CERQUEIRA, A. O.; C. ROCHA,
S.S. Uso de marcadores RAPD na classificação de isolados de
Phytophthora spp. causadores da podridão parda do cacaueiro no Brasil.
Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 28, p. 312-315, 2003.
46
FERREIRA, M.E; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de
marcadores na análise genética. Brasília: Embrapa, Cenargen, p. 220,
1996.
FUNGARO, M.H.P. PCR na micologia. Biotecnologia Ciência &
Desenvolvimento, v. 14, p. 12-16, 2000.
GARMENDIA, I.; GOECOICHEA, N.; AGUIRREOLEA, J. Effective-
ness of three Glomus species in protecting pepper (Capsicum annuum
L.) against Verticillium wilt. Biological Control, v. 31, p. 296-305,
2004.
GEISER, D.M.; JIMÉNEZ-GASCO, M.M.; KANG, S.; MAKA-
LOWSKA, I.; VEERARAGHAVAN, N.; WARD, T.J.; ZHANG, N.;
KULDAU, G. A.; O’DONNELL, K. A DNA sequence database for
identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology, v. 110, p.
473-479, 2004.
GOES, A.; MORETTO, K.C.K. Mal-do-Panamá. In: RUGGIEIRO, C.
Bananicultura. v. 2, p. 122-128, 2001.
GHERBAWY, Y.A.M.H. RAPD analysis of isolates belonging to
different formae speciales of Fusarium oxysporum. Cytologia, v. 64, p.
269-276, 1999.
GROENEWALD, S.; VAN DEN BERG, N.; MARASAS, W.F.O.;
VILJOEN, A. The application of high-throughput, AFLPs in assessing
genetic diversity in Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Mycological
Research, p. 297 -305, 2006.
GUZMAN, P.; GEPTS, P.; TEMPLE, S.; MIKANDAWIRE, A.B.C.;
GILBERTSON, R.L. Detection on differentiation of Phaeoisariopsis
griseola isolates with the polymerase chain reaction and group-specific
primers. Plant Disease, v.83, p.37-42, 1999.
HINZ, R.H. Germinação de microconídios de Fusarium oxysporum f.
sp. cubense (E. F. Smith) Snyder & Hansen em areia incorporada com
manipueira. Botucatu, SP, Dissertação (Mestrado em Agronomia com
Concentração em Proteção de Plantas) – Faculdade de Ciências
Agronômicas do Campus de Botucatu. p.58-65, 1991.
47
JONES, D.R. The characterization of isolates of Fusarium oxysporum f.
sp. cubense from Ásia. Infomusa, Montpellier, v. 4, p. 3-4, 1995.
JONES, D.R. Diseases of banana, abacá and enset. Reading: CABI Pub-
lications, p. 544, 1999.
KARAOGLU, H.; LEE, M.Y.; MEYER, W.; Survey of simple sequence
repeats in completed fungal genomas. Molecular Biology, v.22, p. 639-
649, 2005.
KISTLER, H.C.; ALABOUVETTE C.; BAAYEN R.P.; BENTLEY S.
BRAYFORD D.; CODDINGTON A.; CORRELL J.; DABOUSSI,
M.J.; ELIAS K.; FERNANDEZ D.; GORDON T. R.; KATAN T.; KIM
H. G.; LESLIE J. F.; MARTYN R. D.; MIGHELI Q.; MOORE N. Y.;
O'DNNOEL, K, l, R.; PLOETZ C.; RUTHERFORD M. A.; SUMMER-
ELL B.; WAALWIJK, C. Systematic numbering of vegetative compat-
ibility groups in the plant pathogenic fungus Fusarium oxysporum.
Phytopathology, v. 88, p. 30-32, 1998.
KISTLER, H.C. Genetic Diversity in the Plant: pathogenic fungus
Fusarium oxysporum. Phytopathology, v. 87, p. 474-479, 1997.
KRAFT, J.M.; HAGLUND, W.A. A reappraisal of the race classifica-
tion of Fusarium oxysporum f. sp. pisi, Phytopathology, v. 68, p. 273-
275, 1978.
KUMAR, B.H.; SHANKAR, U.A.C.; KINI, R.K.; PRAKASH, S.H.;
SHETTY, S.H. Genetic variation in Fusarium oxysporum f.sp. cubense
isolates basead on randon amplified polymorphic DNA and intergenic
sapacer. Archives of Phytopathology and Plant Protection, v.39, p.
151-160, 2006.
KURAMAE, E.E.; SOUZA, N.L. Variabilidade genética entre formas
speciales de Fusarium oxysporum e raças 1 e 2 de Fusarium oxysporum
f.sp. lycopersici através de RAPD e sequencias de regiões ITS e rDNA.
Acta Scientiarum, v. 24, p. 1481-1485, 2002.
48
LEHMANN, T.; HAWLEY, W.A.; COLLINS, F.H. An Evaluation of
Evolutionary Constraints on Microssatélite Laci Using Null Alleles. Ge-
netics Society of America. v. 144, p. 1155-1163, 1996.
LEONG, S.K.; LATIFFAH, Z.; BAHARUDDIN, S. Molecular
Characterization of Fusarium oxysporum f. sp. cubense of banana.
American Journal of Applied Sciences, v.6, p. 1301-1307, 2009.
LESLIE, J.F.; SUMMERELL, B.A. The Fusarium Laboratory
Manual. Livro, 2006.
LINDERMAN, R.G. Role of VAM fungi in biocontrol. In: Pfleger, F.L.;
Lindermann, R.G. Mycorrhizae and plant health. p. 1-26. 1994.
LIU, D.; VAN HEESWIJCK, R.; LATCH, G.; LEONFOTTE, T.; PAN-
ACCIO, M.; LANGFORD, C.; CUNNINGHAM, P.; REED, K. Rapid
identification of Acremonium coenophialum endophytes trough arbit-
ranly primed PCR. FEMS Microbiology Letters, v. 133. p. 95-98,
1995.
LODWIG, E.M.; BRIDGE, P.D.; RUTHERFORD, M.A.; KUNG, J.;
JEFFRIERES, P. Molecular differences distinguish clonal lineages with-
in East African populations of Fusarium oxusporum f. sp. cubense.
Journal of Applied Microbiology, v. 86, p. 71-77, 1999.
LUCAS, J.A. Plant pathology and plant pathogens. 3. ed. London:
Blackwell Science, p.274, 1998.
MARTINS, M. K. Variabilidade genética de isolados de Fusarium spp.
e estudo da interação com a planta hospedeira. Tese Doutorado em
Agronomia-Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo, Piracicaba, p.110, 2005.
MICHELMORE, R.W.; PARAN, I.; KESSELI, R.V. Identification of
markes linked to disease-resistence genes by bulked segregant analysis:
A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using
segregating populations. Proceeding of the National Academy of Sci-
ence, v. 88, p. 828-982, 1991.
49
MISHRA, P.K.; TEWARI J.P.; CLEAR, R.M.; TURKINGTON T. K.
Molecular genetic variation and geographical structuring in Fusarium
graminearum. Annals of Applied Biology, v. 145, p. 299-307, 2004.
MOORE, N.Y. HARGREAVES, P.A.; PEGG, K.; IRWIN, J.A.G.
Characterization of strains of Fusarium oxysporum f.sp. cubense by
production of volatiles. Australian Journal of Botany, v. 39, p.61-166,
1991.
MOREIRA, R.S.; CORDEIRO, Z.J.M. A história da banana no Brasil.
XVII Reunião Internacional ACORBAT, v. 1, p. 65-69, 2006.
MOSTAFA, M.; REZA, M.Z.; OMID, J.; JAVAD, H.M. Use of RAPD,
enzyme activity staining, and colony size to differentiate
phytopathogenic Fusarium oxysporum isolates from Iran. Journal
Microbiology, v. 33, p. 299-303, 2002.
NELSON, P.E., TOUSSOUN, T.A., MARASAS, W. F. O. Fusarium
Species. p.142, 1983.
O’DONNELL, K., KISTLER, H.C., CIGELNIK, E., PLOETZ, R.C.
Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of
banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene
genealogis. Applied Biological Sciences, v. 95, p. 2044-2049, 1998.
OLIVEIRA, V.C.; COSTA, J.L.S. Análise de restrição de DNA
ribossomal amplificado (ARDRA) pode diferenciar Fusarium solani f.
sp. phaseoli de F. solani f. sp. glycines. Fitopatologia Brasileira, v. 27,
p. 631-634, 2002.
PARK, J.M.; KIM, G.Y.; LEE, S.J.; HUH, M.K.; LEE, T.H.; LEE, J.D.
Comparison of RAPD, AFLP, and EF-1α Sequences for the
Phylogenetic Analysis of Fusarium oxysporum and formae specials in
Korea. Mycobiology, v. 34, p. 45-55, 2006.
PÉREZ-VICENTE, L. Fusarium wilt (Panama disease) of bananas: an
updating review of the current knowledge on the disease and its causal
agent. In: Reunion International ACORBAT, v. 16, p. 1-15, 2004.
50
PLOETZ, R.C.; CORRELL, J.C. Vegetative compatibility among races
of Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Plant Disease, v. 72, p. 325-328,
1988.
PLOETZ, R.C. Fusarium wilt of banana is caused by several pathogens
referred to as Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Phytopathology, v.
96, p. 653-656, 2006.
PLOETZ, R.C.; Generacion de la raza Tropical 4 del mal de panamá:
Evaluación de riesgo y um plan de acción para evoluar El problema.
Reunion de grupos de interes sobre los riegos de La raza tropical 4
de Fusarium, BBTV y otras plagas de musáceas para La región Del
Oirsa, Amareica Latina y El Caribe. p. 31, 2009.
PUHALLA, J.E. Genetic considerations of the genus Fusarium. In:
Nelson, P.E.; Toussoun, T.A.; Cook, R.J. (Ed) Fusarium: diseases,
biology, and taxonomy. Pennsylvania State University, p. 291-305,
1981.
PUHALLA, J.E. Classification of strains of Fusarium oxysporum on the
basis of vegetative compability. Canadian Journal of Botanic, v. 63, p.
179-183, 1985.
REBELO, J.A. Mancha reticulada Leandria momordicae Rangel em
cucurbitáceas. Porto Alegre, Tese (Doutorado em fitossanidade com
concentração em fitopatologia), Faculdade de Agronomia, Universidade
Federal de Porto Alegre. p. 230, 2003.
ROSALEE, A.; COELHO, N.; DHINGRA, O.D. Grupos de
compatibilidade vegetativa entre insolados de Fusarium oxysporum não
patogênicos ao feijoeiro e de F. oxysporum f. sp. phaseoli. Fitopatolo-
gia Brasileira, v. 24, p. 546-548, 1999.
ROHLF, F.J. Numerical taxonomy and multivariate analysis system.
New York: Exeter Software, p. 38, 2000.
51
SANTOS, T.M.; NIETSCHE, S.; COSTA, M.R.; XAVIER, A.A.;
PEREIRA, G.V.; FERNANDES, T.P. Variabilidade genética de
isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense em bananais do Norte de
Minas Gerais. 2008. XX Congresso brasileiro de Fruticultura. Vitória
Espírito Santo, p. 98-99, 2008.
SILVA, J.C.; BETTIOL, W. Potential of non-pathogenic Fusarium
oxysporum isolates for control of Fusarium wilt of tomato.
Fitopatologia Brasileira, v. 30, p. 409-412, 2005.
SILVA, C. Estudo da variabilidade genética de Fusarium oxysporum f.
sp. cubense em Congresso Brasileiro de Fitopatologia, Heliconia sp.
no Estado de Pernambuco, 2009.
SÍNTESE ANUAL DA AGRICULTURA. 2007/2008.Epagri/Cepa.
Florianópolis Banana p. 56-68, 2008.
SMITH, L.J.; SMITH, M.K.; HAMILL, S.D.; HUNTER, M.N.; PEGG,
K.G.; GALEA, V.J. Towards improving resistance of micropropagated
bananas to Fusarium wilt using bacteria and bacteria and mycorrhizae.
I. Bioassay development. In: Molina, A.B.; Nikmasdek, N.H.; Liew,
K.W. Banana fusarium wilt management: towards sustainable cultiva-
tion. Malásia: Inibap, p. 224-233, 1999.
SNYDER, W.C.; HANSEN, H.N. Species concept, genetics, and patho-
genicity in Hypomyces solani. Phytopathology, Saint Paul, v. 44, p.
338-342, 1953.
SCOTT, R.P.; ZEIGLER, R.S.; NELSON, R.J. A procedurefor mini-
scale preparation of Pyricularia grisea DNA. International Rice Re-
search Notes, v.8, p.47-48, 1993.
STOVER, R.H. Banana Plantain and Abaca Diseases. Commonwelth
Mycological Institute, p. 316, 1972.
SUMMERELL, B.A.; LESLIE, J.F. A Utilitarian approachto Fusarium
identification. Plant Disease, v. 87, p. 117-128, 2003.
SUTTON, J.C. Strategies for biological control of necrotropic pathogens
in perennial crops. Fitopatologia Brasileira, v. 25, p. 235-238, 2000.
52
TCACENCO, F.A.; FERREIRA, A.; NICOLETTI, M.E.; SCOZ, L.B.
Diversidade genética de raças de Pyricularia grisea (Cook) Saac no
estado de Santa Catarina, Brasil. In: Simpósio de recursos genéticos
para America Latina y el Caribe, v. 5, p. 124, 2005.
TRINDADE, A.V.; LINS, G.M. de L.; MAIA, I.C.S. Substratos e fungo
micorrízico arbuscular em mudas micropropagadas de bananeira na fase
de aclimatação. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 25, p. 137-142,
2003.
VAKALOUNAKIS, D.J.; FRAGKIADAKIS G.A. Genetic Diversity of
Fusarium oxysporum Isolados from Cucmber: Differentiation by
Pathogenicity, Vegetative Compatibility, and RAPD Fingerprinting,
America Phytopathological Society, v. 89, p. 161-169, 1999.
VENTURA, J.A.; HINZ, R.H. Controle das doenças da bananeira. In:
Zambolim, L. et al. Controle de doenças de plantas – FRUTEIRAS.
Suprema Gráfica e Editora Ltda. Viçosa, Minas Gerais, v. 2, p. 839-937,
2002.
WAITE, B.H. Fusarium wilt of Heliconia and its relation to Panama
disease of bananas. Phytopathology, Saint Paul, v. 52, p. 287, 1962.
WAITE, B.H. Wilt of Heliconia spp. caused by Fusarium oxysporum f.
sp. cubense race 3. Tropical Agriculture, v. 40, p. 299-305, 1963.
WAITE, B.H. Inoculation studies and natural infection of banana variet-
ies with races 1 and 2 of Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Plant Dis-
ease Report, v. 61, p. 15-19, 1977.
WELSH, J.; MCCLELLAND, M. Fingerprinting genomes using PCR
with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, v. 18, p. 7213-7218,
1990.
WILLIAMS, J.G.K.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A.;
TINGEY, S.V.; DNA polymorphism amplified by arbritary primersare
useful as genetic markers. Nucleic Acids Researche, v. 18, p. 6531-
6535, 1990.
53
YANG, B.J.; ZHONG, S.B. Fourteen polymorphic microssatélite
markes for the fungal banana pathogen Mycosphaerella fijiensis.
Molecular Ecology Resources, v.8, p.910-912, 2008.
YANO-MELO, A.M.; MAIA, L.C.; MORGADO, L.B. Fungos
micorrízicos arbusculares em bananeiras cultivadas no Vale do
Submédio São Francisco. Acta Botanica Brasilica, v. 11, p. 115-121,
1997.
WARDLAW, C.W. Banana diseases, including plantains and abaca.
London: Longman, p. 878, 1972.
ZANE, L.; BARGELLONI, L.; PATARNELLO, T. Strategies for mi-
crosatellite isolation: a review. Molecular Ecology, v. 11, p. 1-16, 2002.
ZAMANI, M.R.; MOTALLEBI, M.; ROSTAMIAN, A. Characteriza-
tion of Iranian Isolates of Fusarium oxysporum on the Basis of RAPD
Analisys, Virulence and Vegetative Compatibility. Phytopathology, v.
152, p. 449-453, 2004.
54
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
